【課題】好ましい形態のタンパク質の濃縮および／または回収の向上をもたらす方法、より詳細には、組換え抗体タンパク質をリフォールディングする方法を提供する。
【解決手段】本発明は、組換えIgG抗体を作製する方法を提供し、この方法は、約5から約11までのpHにて、哺乳類細胞により組換え生産されたポリペプチドを、酸化還元カップリング試薬と接触させること；ならびに、場合によりさらに、そのIgG分子を、酸化還元カップリング試薬との接触の前、後、もしくはそれと同時に、カオトロピック剤と接触させることを含んでなる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgG2抗体またはいくつかの別個のIgG2形態のうちの１つについて濃縮されたIgG2抗体フラグメント調製物を製造する方法であって：
哺乳類細胞によって組換え生産されたIgG2抗体またはIgG2抗体フラグメントを、5〜11のpHで酸化還元カップリング試薬と接触させること、
を含んでなり、ここで、前記IgG2抗体またはIgG2抗体フラグメントがRP-HPLCでいくつかの別個の形態として溶出し、前記方法がRP-HPLC上で溶出される形態の数を減少させるか、または、前記RP-HPLCでの前記のいくつかの別個の形態の相対分布を変化させ；
必要に応じて、前記酸化還元カップリング試薬との前記接触の前、後、またはそれと同時に、前記IgG2抗体をカオトロピック剤とさらに接触させること、
を含み、前記カオトロピック剤との前記接触の工程を省略すると、前記いくつかの別個の形態のうちの少なくとも１つが濃縮され；前記カオトロピック剤との前記接触の工程を実施すると、前記いくつかの別個の形態のうちの少なくとも別の１つが濃縮される前記方法。
【請求項２】
前記の濃縮される形態が、前記方法により処理されなかった調製物と比較して、製薬上望ましい特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化還元カップリング試薬のpHが5〜10であるか、7.6〜9.6であるか、または8.6である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化還元カップリング試薬が還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酸化型グルタチオンに対する還元型グルタチオンの比が、1:1〜100:1である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酸化還元カップリング試薬がシステイン／シスチンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記システイン／シスチンが、0.1 mM〜10 mMのシステインを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記システイン／シスチンが、1:1〜10:1のシステイン：シスチン比で存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
システイン／シスチンが6 mMシステインおよび1 mMシスチンを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記システイン／シスチンが6 mMシステインおよび6 mMシスタミンを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触に先立って、前記組換えIgG2抗体が精製されるか、または、前記組換えIgG2抗体が部分精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触が、接触させない同じIgG2抗体と比較して、その生物活性が少なくとも２倍増加したIgG2抗体をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カオトロピック剤が、尿素、アルギニン、SDSおよび塩酸グアニジンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カオトロピック剤が塩酸グアニジンを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
塩酸グアニジンの濃度が0.1 M〜1.0 Mであるか、または0.1 M〜1.5 Mである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
塩酸グアニジンの濃度が0.5 Mであるか、または0.9 Mである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記酸化還元カップリング試薬との前記接触および前記カオトロピック剤との前記のさらなる接触が、接触させない同じIgG2抗体と比較して、その生物活性が少なくとも３倍増加したIgG2抗体をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
望ましいリフォールディングされたコンフォメーションを有する、接触させたIgG2抗体の画分を単離することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離のための手法が、逆相クロマトグラフィーHPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および電気泳動からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
培養液中にIgG2抗体またはIgG2抗体フラグメントを発現および分泌する哺乳類細胞を培養すること；
前記細胞からの抗体の分泌の際に5〜11のpHで酸化還元カップリング試薬を添加すること、ならびに
それにより、前記酸化還元カップリング試薬に曝露されなかったIgG2抗体またはそのフラグメントと比較して、改善された医薬品特性および結晶化特性を有するIgG2抗体またはそのフラグメントを製造すること、
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法であって、ここで、前記IgG2抗体がRP-HPLCでいくつかの別個の形態として溶出し、前記方法がRP-HPLC上で溶出される形態の数を減少させるか、または、前記RP-HPLCでの前記のいくつかの別個の形態の相対分布を変化させる、前記方法。
【請求項２１】
前記酸化還元カップリング試薬が、5〜11のpHで前記IgG2抗体または前記IgG2抗体フラグメントの製造のために使用される培養液に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記酸化還元カップリング試薬との前記接触の前、後またはそれと同時に、前記IgG2抗体をカオトロピック剤とさらに接触させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、RP-HPLCによって決定される前記調製物中の前記いくつかの別個の形態のうち少なくとも１つを優先的に濃縮する、請求項１に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【公開番号】特開２０１３−５５９６１（Ｐ２０１３−５５９６１Ａ）
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２８１２６６（Ｐ２０１２−２８１２６６）
【出願日】平成２４年１２月２５日（２０１２．１２．２５）
【分割の表示】特願２００７−５３８０９８（Ｐ２００７−５３８０９８）の分割
【原出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】