【課題】ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸を構築するための組成物および方法の提供。
【解決手段】組換えウイルスゲノムは多数の組換えおよび／またはトポイソメラーゼ認識部位を含むように構築してよい。組成物には、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む独自の特異性を有する多数の組換え部位を有するベクターが含まれる。方法によって、組換えおよび／またはトポイソメラーゼ媒介クローニングを用いてウイルスゲノムに対象配列を挿入することができ、組換え型ウイルスを構築する方法、ポリペプチドを発現させる方法、および融合ポリペプチドを発現させる方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの組換え部位が、ラムダ組換えにおいて活性な少なくとも一つのタンパク質の存在下で適合性の組換え部位との組換えを受けることができ、核酸分子が原核細胞および真核細胞において複製する、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、互いに実質的に組換えしない少なくとも二つの組換え部位をさらに含む核酸分子。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムおよびアデノ随伴ウイルスゲノムからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
少なくとも一つのレトロウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項４】
レトロウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項3記載の核酸分子。
【請求項５】
ヘルペスウイルスゲノムおよびポックスウイルスゲノムからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項６】
少なくとも一つのRNAウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項７】
RNAウイルスが、フラビウイルスゲノム、トガウイルスゲノム、およびアルファウイルスゲノムからなる群より選択される、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
原核細胞複製起点および選択マーカーを含むプラスミドまたはバクミド（bacmid）である、請求項1記載の核酸分子。
【請求項９】
プロモーター、ウイルス末端反復配列、スプライス部位、パッケージングシグナル、一つまたは複数のウイルスタンパク質に反応性の核酸配列、認識部位、組換え部位、一つまたは複数のマーカータンパク質またはポリペプチドをコードする配列、抗体によって認識されうる一つまたは複数のエピトープをコードする配列、複製起点、介在配列、配列内リボゾーム進入配列、およびポリアデニル化シグナルからなる群より選択される一つまたは複数の特徴をさらに含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項１０】
二つの組換え部位のあいだに対象ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項１１】
対象配列が、一つまたは複数のポリペプチドをコードする配列、一つまたは複数のtRNA配列をコードする配列、一つまたは複数のリボザイム配列をコードする配列、一つまたは複数のプロモーター配列、一つまたは複数のエンハンサー配列、および一つまたは複数のリプレッサー配列からなる群より選択される一つまたは複数の配列を含む、請求項10記載の核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも一つの組換え部位が、ラムダ組換えにおいて活性な少なくとも一つのタンパク質の存在下で適合性の組換え部位との組換えを受けることができる、バキュロウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、一つまたは複数の組換え部位をさらに含む核酸分子。
【請求項１３】
互いに実質的に組換えしない二つの組換え部位を含む、請求項12記載の核酸分子。
【請求項１４】
対象配列が、一つまたは複数のポリペプチドをコードする配列、一つまたは複数のtRNA配列をコードする配列、一つまたは複数のリボザイム配列をコードする配列、一つまたは複数のプロモーター配列、一つまたは複数のエンハンサー配列、および一つまたは複数のリプレッサー配列からなる群より選択される一つまたは複数の配列を含む、請求項13記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項1記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項１６】
請求項12記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項１７】
以下を含む、組換え型ウイルスを構築する方法：
（a）少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部、ならびに互いに実質的に組換えしない少なくとも第一および第二の組換え部位を含む、第一の核酸分子を提供する段階；
（b）組換えが第一と第三の組換え部位のあいだで、および第二と第四の組換え部位のあいだで起こるような条件で、少なくとも第三および第四の組換え部位が隣接する対象配列を含む第二の核酸分子を第一の核酸分子に接触させる段階；ならびに
（c）段階（b）の核酸分子をパッケージングする細胞に、段階（b）の核酸分子を導入する段階。
【請求項１８】
第一の核酸分子が、アデノウイルスゲノムおよびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第一の核酸分子が少なくとも一つのレトロウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
レトロウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
第一の核酸分子が、ヘルペスウイルスゲノムおよびポックスウイルスゲノムからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
第一の核酸分子が少なくとも一つのRNAウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
RNAウイルスが、フラビウイルスゲノム、トガウイルスゲノム、およびアルファウイルスゲノムからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第一の核酸分子が、複製起点および選択マーカーを含むプラスミドまたはバクミドである、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
組換え部位のあいだの第二の核酸分子の一部が、対象ヌクレオチド配列を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
対象配列が、一つまたは複数のポリペプチドをコードする配列、一つまたは複数のtRNA配列をコードする配列、一つまたは複数のリボザイム配列をコードする配列、一つまたは複数のプロモーター配列、一つまたは複数のエンハンサー配列、および一つまたは複数のリプレッサー配列からなる群より選択される一つまたは複数の配列を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
組換え部位のあいだの部位で第一の核酸を切断する制限酵素によって第一の核酸分子を消化することをさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２８】
請求項17記載の方法によって産生された組換え型ウイルス。
【請求項２９】
請求項28記載の組換え型ウイルスを含む組成物。
【請求項３０】
以下を含む、融合ポリペプチドを産生する方法：
配列が、終止コドンを含む配列によって隔てられた少なくとも第一のコード領域と第二のコード領域とを含む、融合ポリペプチドをコードする第一の核酸配列を含む宿主細胞を提供する段階；
終止コドンを抑制する一つまたは複数のサプレッサーtRNAを含む第二の核酸配列を細胞において発現させる段階；ならびに
第一および／または第二の核酸配列の少なくとも一つが、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子上に存在する、第一のコード領域と第二のコード領域とを含む融合ポリペプチドを発現させるために十分な条件で宿主細胞をインキュベートする段階。
【請求項３１】
第一と第二の核酸配列とを含む核酸分子を宿主細胞に導入する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
第二の核酸配列を含む核酸分子が、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
第一のコード領域および終止コドンが、互いに実質的に組換えしない組換え部位に隣接する、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
以下を含む、ポリペプチドを発現させる方法：
核酸分子がウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、プロモーターおよびリプレッサー配列に機能的に結合したポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を細胞に接触させる段階；
リプレッサー配列に結合するタンパク質をコードする核酸分子を細胞に接触させる段階；ならびに
ポリペプチドを発現させるために十分な条件で細胞をインキュベートする段階。
【請求項３５】
ウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスゲノムがHIV-1ゲノムである、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
リプレッサー配列がテトラサイクリンオペレータ配列であって、タンパク質がテトラサイクリンリプレッサー配列である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドを発現させるために十分な条件が、テトラサイクリンの存在下で細胞をインキュベートする段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
以下を含む、ポリペプチドを発現させる方法：
核酸分子がウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、細胞がリプレッサー配列に結合するタンパク質を発現する、プロモーターおよびリプレッサー配列に機能的に結合したポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を細胞に接触させる段階；ならびに
ポリペプチドを発現させるために十分な条件で細胞をインキュベートする段階。
【請求項４０】
ウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスゲノムがHIV-1ゲノムである、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
リプレッサー配列がテトラサイクリンオペレータ配列であって、タンパク質がテトラサイクリンリプレッサータンパク質である、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドを発現させるために十分な条件が、テトラサイクリンの存在下で細胞をインキュベートすることを含む、請求項42記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６Ａ】

【図３６Ｂ】

【図３６Ｃ】

【図３６Ｄ】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３Ａ】

【図４３Ｂ】

【図４４Ａ】

【図４４Ｂ】

【図４５】

【図４６Ａ】

【図４６Ｂ】

【図４６Ｃ】

【図４６Ｄ】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１Ａ】

【図６１Ｂ】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０Ａ】

【図７０Ｂ】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【公開番号】特開２０１１−３６２５６（Ｐ２０１１−３６２５６Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０１５６９（Ｐ２０１０−２０１５６９）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【分割の表示】特願２００５−５０５５２４（Ｐ２００５−５０５５２４）の分割
【原出願日】平成１５年７月１８日（２００３．７．１８）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ　テクノロジーズ　コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】