組換えＲＳＶ抗原
本開示は、ＲＳＶ感染の治療及び予防のための免疫原性組成物（たとえば、ワクチン）を含んでなる、組換えの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、及びその作製方法と使用方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１０年、５月１３日に出願された米国特許仮出願番号６１／３３４／５６８及び２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願番号６１／２１９，９５８のより早い出願日の利益を主張する。
【０００２】
本特許文書の開示の一部には著作権防御の対象となるものが含まれる。著作権の所有者は、米国特許商標局の特許ファイル又は記録に出現するような特許文書又は特許開示のファクシミリ再生に反対するものではないが、どんなものであれ、著作権をすべて保有する。
【背景技術】
【０００３】
本開示は免疫学の分野に関する。さらに詳しくは、本開示は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に特異的な免疫応答を誘発する組成物及び方法に関する。
【０００４】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、６ヵ月未満の幼児及び妊娠３５週以内の未熟児における下部気道感染（ＬＲＩ）の世界で最も一般的な原因である。ＲＳＶ疾患のスペクトルには、鼻炎及び耳炎から肺炎及び細気管支炎までの幅広い呼吸器症状が含まれ、後者の２疾患は、考慮すべき罹患率及び死亡率と関連している。ヒトのみがＲＳＶに感染することが知られている。汚染した鼻分泌物からのウイルスの広がりは多量の呼吸器液滴を介して生じるので、感染した個人又は汚染した表面との密接な接触が伝播には必要とされる。ＲＳＶは、おもちゃや他の物体上で数時間生き残り、そのことが、病院での、特に小児科病棟でのＲＳＶ感染の高い比率を説明している。
【０００５】
ＲＳＶに関して推定される世界の年間の感染及び死亡は、それぞれ６４００万人及び１６０，０００人であると概算される。米国のみでは、ＲＳＶは、年間１８，０００〜７５，０００人の入院と９０〜１９００人の死亡に関与していると概算される。温帯気候では、ＲＳＶは細気管支炎及び肺炎を含んでなるＬＲＩの年々の冬期流行の原因として文書で十分に裏付けられている。米国では、ほぼ全員の小児が２歳までにＲＳＶに感染している。健常な小児におけるＲＡＳ関連のＬＲＩの発生率は、２歳までの１０００人の小児当たり３７人（６ヵ月未満の乳児１０００人当たり４５人）であると算出され、１０００人（６ヵ月未満の乳児１０００人当たり）当たり６人に入院のリスクがあると算出された。発生は、心肺疾患を持つ子供及び未熟児で高く、彼らは、米国でのＲＳＶ関連での入院のほぼ半数を構成する。ＲＳＶが原因で生じるさらに重篤なＬＲＩを経験する小児は、後に小児喘息の高い発生を招くことになる。これらの研究は、重篤なＬＲＩ患者及びその後遺症を持つ患者を介護するコストが対応なものである先進国にてＲＳＶワクチン及びその使用の幅広いニーズを明らかにしている。ＲＳＶはまた高齢者におけるインフルエンザ様疾患の罹患率の重要な原因としてますます認識されている。
【０００６】
健常な集団及びリスクのある集団で耐久性のある防御的免疫応答を産生する、安全で且つ有効なＲＳＶワクチンを生成する尽力にて様々なアプローチが試みられている。しかしながら、ＲＳＶ感染を防ぎ、下部呼吸器感染（ＬＲＩ）を含んでなる、ＲＳＶ疾患を軽減する若しくは防ぐ目的でのワクチンとして安全で且つ有効であることが分かっていると今日評価されている候補はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、組換え呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。さらに具体的には、本開示は、三量体の前融合立体構造を安定化するために修飾されている組換えＦタンパク質を含んでなる抗原に関する。開示される組換え抗原は、優れた免疫原性を示し、特に好都合には、ＲＳＶ感染及び／又は疾患に対する防御のための免疫原性組成物（たとえば、ワクチン）の成分として採用される。開示されるのはまた、組換え抗原をコードする核酸、抗原を含有する免疫原性組成物、及び抗原を作出し、使用する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａは、ＲＳＶのＦタンパク質の構造的特徴を強調する模式図であり、図１Ｂは、例となるＲＳＶの前融合Ｆ（ＰｒｅＦ）抗原の模式図である。
【図２】ＰｒｅＦの非対称場流動分画（ＡＦＦ−ＭＡＬＳ）解析の代表的な結果を説明する折れ線グラフである。
【図３】ＰｒｅＦ抗原によるヒト血清の中和阻害を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａ及び図４ＢはＰｒｅＦ抗原に応答してマウスで誘発された血清ＩｇＧ力価を示す棒グラフである。
【図５】図５Ａ及び図５ＢはＰｒｅＦ抗原によって誘発されたＲＳＶ特異的な中和抗体の力価を説明する棒グラフである。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、マウスにおけるＲＳＶのＰｒｅＦ抗原により提供された負荷に対する防御を示すグラフである。
【図７】免疫及び負荷に続くＢＡＬ白血球を評価するグラフである。
【図８】水中油型エマルション（ＡＳ０３）の希釈により製剤化したＰｒｅＦで免疫した後、誘発された血清ＩｇＧを説明する棒グラフである。
【図９】水中油型エマルション（ＡＳ０３）の希釈により製剤化したＰｒｅＦで免疫した後の中和抗体の力価を説明するグラフである。
【図１０】水中油型エマルション（ＡＳ０３）の希釈により製剤化したＰｒｅＦで免疫した後の負荷に対する防御を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
序論
ＲＳＶ感染を防ぐワクチンの開発は、宿主の免疫応答が疾患の病態形成で役割を担うと思われるという事実によって複雑になっている。１９６０年代の初期の研究は、ホルマリンで不活化したＲＳＶワクチンを接種した小児は、接種しなかった対照の被験者に比べてウイルスへのその後の暴露に際してさらに重篤な疾患に罹ることを示した。これらの初期の試験は、ワクチン接種者の８０％の入院と２人の死亡を生じた。重症度が増した疾患は動物モデルで再現され、不適切なレベルの血清中和抗体、局所免疫の欠如、及び肺好酸球とＩＬ−４及びＩＬ−５サイトカインの高い産生による２型ヘルパーＴ細胞様（Ｔｈ２）の免疫応答の過剰な誘導の結果であると考えられる。それに対して、ＲＳＶ感染に対して防御する功を奏したワクチンは、ＩＬ−２及びγ−インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を特徴とするＴｈ１に偏った免疫応答を誘導する。
【００１０】
本開示は、ワクチンにて以前使用されたＲＳＶ抗原で遭遇した課題を解決し、抗原の免疫特性と製造特性を改善する組換え呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。本明細書で開示されるＲＳＶ抗原は、可溶性融合（Ｆ）タンパク質ポリペプチドを含んでなるＦタンパク質類似体を含んでなり、それは、Ｆタンパク質の前融合立体構造、すなわち、宿主細胞の膜との融合に先立った成熟集合Ｆタンパク質の立体構造を安定化させるために修飾されている。これらのＦタンパク質類似体は、明瞭性と単純性の目的で、「ＰｒｅＦ」又は「ＰｒｅＦ抗原」と指名される。本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原は、ヘテロの三量体ドメインの組み入れによって修飾されている可溶性Ｆタンパク質類似体が改善された免疫的特徴を示し、生体内で対象に投与された場合安全で高度に防御的であるという予期しない発見にその基礎を置く。
【００１１】
当該技術で広く受け入れられている用語及び指示を参照してＲＳＶタンパク質の構造の詳細を本明細書で提供し、図１Ａで模式的に説明する。例となるＰｒｅＦ抗原の模式図は図１Ｂに提供する。ＲＳＶタンパク質は、本明細書で提供される教示に従って前融合立体構造を安定化させるために修飾できることが当業者によって理解されるであろう。従って、ＰｒｅＦ抗原の作出を導く原理の理解を円滑にするために、個々の構造的成分は、例となるＦタンパク質を参照して示し、そのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１及び２に提供する。同様に、該当する場合、例となるＧタンパク質を参照してＧタンパク質抗原が記載されるが、そのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３及び４に提供する。
【００１２】
Ｆタンパク質ポリペプチドの一次アミノ酸配列を参照して（ＦＩＧ１Ａ）、以下の用語を利用してＰｒｅＦ抗原の構造的特徴を記載する。
【００１３】
用語、Ｆ０は、完全長の翻訳されたＦタンパク質前駆体を指す。Ｆ０ポリペプチドは、ｐｅｐ２７と命名された介在ペプチドによってＦ２ドメインとＦ１ドメインにさらに分割される。成熟の間に、Ｆ０ポリペプチドは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインと隣接するｐｅｐ２７の間に配置されている２つのフリン部位でタンパク分解切断を受ける。議論を確実にする目的で、Ｆ２ドメインは、アミノ酸１〜１０９の少なくとも一部及び全部を含んでなり、Ｆ１ドメインの可溶性部分は、Ｆタンパク質のアミノ酸番号１３７〜５２６の少なくとも一部及び全部を含んでなる。上記で示したように、これらアミノ酸の位置（及び本明細書で指定される後に続くアミノ酸の位置すべて）は、配列番号２の例となるＦタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）を参照して与えられる。
【００１４】
前融合Ｆ（又は「ＰｒｅＦ」）抗原は、ＲＳＶ抗原がＦタンパク質の前融合立体構造の免疫優勢エピトープを少なくとも１つ保持するように、Ｆタンパク質の前融合立体構造を安定化させる少なくとも１つの修飾を含んでなる可溶性（すなわち、膜に結合しない）Ｆタンパク質類似体である。可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶのＦタンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなる（が、ＲＳＶのＦタンパク質の膜貫通ドメインを含まない）。例となる実施形態では、Ｆ２ドメインはＦタンパク質のアミノ酸番号２６〜１０５を含んでなり、Ｆ１ドメインはアミノ酸番号１３７〜５１６を含んでなる。しかしながら、安定化されたＰｒｅＦ抗原の三次元構造が維持される限り、さらに小さな部分を使用することもできる。同様に、追加の成分が、三次元構造を破壊せず、抗原の安定性、産生又はプロセッシングに有害に影響せず、抗原の免疫原性を低下させない限り、追加の構造的成分（たとえば、融合ポリペプチド）を含んでなるポリペプチドを、例となるＦ２ドメイン及びＦ１ドメインの代わりに使用することができる。Ｆ２ドメインとＦ１ドメインは、Ｆタンパク質類似体の成熟前融合立体構造への折り畳みと集合を複製するように設計されたＮ末端からＣ末端への方向で位置づけられる。産生を高めるために、天然のＦタンパク質のシグナルペプチド又は組換えＰｒｅＦ抗原が発現されるべき宿主細胞における産生と分泌を高めるように選択されるヘテロのシグナルペプチドのようなシグナルペプチドがＦ２ドメインを先導することができる。
【００１５】
ＰｒｅＦ抗原は、たとえば、１以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換のような１以上の修飾を導入することによって安定化される（三量体の前融合立体構造において）。そのような安定化修飾の１つは、ヘテロ安定化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加である。例となる実施形態では、ヘテロ安定化ドメインは、タンパク質多量体化ドメインである。そのようなタンパク質多量体化ドメインの特に好適な一例は、そのようなドメインを有する複数のポリペプチドの三量体化を促進するイソロイシンジッパーのようなコイルドコイルドメインである。例となるイソロイシンジッパードメインを配列番号１１に示す。通常、ヘテロ安定化ドメインは、Ｆ１ドメインのＣ末端に位置する。
【００１６】
任意で、多量体化ドメインは、たとえば、配列ＧＧのような短いアミノ酸リンカー配列を介してＦ１ドメインに接続される。リンカーはさらに長いリンカーであり得る（たとえば、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ：配列番号１４のような配列ＧＧを含んでなる）。ＰｒｅＦ抗原の立体構造を破壊せずに本文脈で使用できる多数の構造的に中性のリンカーが当該技術で既知である。
【００１７】
別の安定化修飾は、天然のＦ０タンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインの間に位置するフリン認識切断部位の排除である。プロテアーゼがＰｒｅＦポリペプチドを構成ドメインに切断できないように、フリン認識部位の１以上のアミノ酸を欠失させる又は置換することによって、１０５〜１０９位及び１１３〜１３６位に位置するフリン認識部位の一方又は双方を消失させることができる。任意で、介在ｐｅｐ２７ペプチドを取り除く、又はたとえば、リンカーペプチドによって置き換えることもできる。さらに又は任意で、融合ペプチドの近傍での非フリン切断部位（たとえば、１１２〜１１３位でのメタロプロテイナーゼ部位）を取り除く又は置き換えることができる。
【００１８】
安定化変異の別の例は、Ｆタンパク質の疎水性ドメインへの親水性アミノ酸の付加又は置換である。通常、疎水性領域にて、リジンのような荷電アミノ酸をロイシンのような中性残基に対して付加又は置換する。たとえば、Ｆタンパク質の細胞外ドメインのＨＲＢコイルドコイルドメイン内で親水性アミノ酸を疎水性又は中性のアミノ酸に対して付加する又は置換することができる。例証として、リジンのような荷電アミノ酸をＦタンパク質の５１２位に存在するロイシンに対して置換することができる。代わりに又は加えて、Ｆタンパク質のＨＲＡドメイン内で親水性アミノ酸を疎水性又は中性のアミノ酸に対して付加する又は置換することができる。たとえば、リジンのような１以上の荷電アミノ酸を１０５〜１０６位にて又はその近傍に挿入することができる（たとえば、ＰｒｅＦ抗原のアミノ酸番号１０５と１０６の間のような参照配列番号２の残基１０５に対応するアミノ酸の後に）。任意で、ＨＲＡ及びＨＲＢの双方のドメインにて親水性アミノ酸を付加又は置換することができる。或いは、ＰｒｅＦ抗原の立体構造全体が有害に影響されない限り、１以上の疎水性残基を付加することができる。
【００１９】
さらに又は代わりに、ＰｒｅＦ抗原のグリコシル化を変化させる１以上の修飾を行ってもよい。たとえば、アミノ酸残基番号５００にて又はその前後で（配列番号２に比べて）天然のＲＳＶのＦタンパク質に存在するグリコシル化部位における１以上のアミノ酸を欠失させて又は置換して（又はグリコシル化部位が破壊されるようにアミノ酸を付加することができる）、ＰｒｅＦ抗原のグリコシル化状況を増減させることができる。たとえば、配列番号２の５００〜５０２位に対応するアミノ酸をＮＧＳ、ＮＫＳ、ＮＧＴ及びＮＫＴから選択することができる。従って、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号２６〜１０５に対応する）とＦ１ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号１３７〜５１６に対応する）を含んでなる可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなり、グリコシル化を変化させる少なくとも１つの修飾が導入されている。ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原は通常、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間に未変化の融合ペプチドを含んでなる。任意で、ＰｒｅＦ抗原はシグナルペプチドを含んでなる。
【００２０】
上記で開示されたように、そのようなＦタンパク質ポリペプチドは、（ｉ）ヘテロ三量体化ドメイン（たとえば、イソロイシンジッパードメインのような）を含んでなるアミノ酸配列の付加、（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つの非フリン切断部位の欠失、（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失、及び（ｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。上記で開示されたように、そのようなグリコシル化修飾されたＲＳＶのＰｒｅＦ抗原は、多量体、たとえば、三量体を形成する。
【００２１】
例となる実施形態では、グリコシル化修飾されたＰｒｅＦ抗原は、（ａ）配列番号２２を含んでなる又はそれから成るポリペプチド、（ｂ）配列番号２１によってコードされるポリペプチド又は配列番号２１の実質的な全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、（ｃ）配列番号２２と少なくとも９５％の配列同一性を持つポリペプチド
の群から選択される。
【００２２】
安定化修飾のいずれか及び／又はすべてを個々に及び／又は本明細書で開示されるそのほかの安定化修飾のいずれかとの組み合わせで用いてＰｒｅＦ抗原を作出することができる。例となる実施形態では、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間に介在性フリン切断部位を伴わず、Ｆ１ドメインのＣ末端に位置するヘテロ安定化ドメイン（たとえば、三量体化ドメイン）を伴ったＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなるポリペプチドを含んでなるＰｒｅＦタンパク質。特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はまた、疎水性のＨＲＡ及び／又はＨＲＢのドメインへの親水性残基の１以上の付加及び／又は置換も含んでなる。任意で、ＰｒｅＦ抗原はたとえば、メタロプロテイナーゼ部位のような少なくとも１つの非フリン切断部位の修飾を有する。
【００２３】
ＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶのＧタンパク質の少なくとも免疫原性部分を含んでなる追加のポリペプチド成分を含んでなる。すなわち、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はＦタンパク質成分とＧタンパク質成分の双方を含んでなるキメラタンパク質である。Ｆタンパク質成分は、上記のＰｒｅＦ抗原のいずれかであることができ、Ｇタンパク質成分はＲＳＶのＧタンパク質の免疫的に活性のある部分（全長までのＧタンパク質、又は全長のＧタンパク質を含んでなる）であるように選択される。例となる実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、Ｇタンパク質（配列番号４で表されるＧタンパク質の配列を参照してアミノ酸の位置が指定される）のアミノ酸番号１４９〜２２９を含んでなる。選択された部分がさらに大きなＧタンパク質断片の優勢な免疫特性を保持する限り、Ｇタンパク質のさらに小さな部分又は断片を使用できることを当業者は十分に理解するであろう。特に、選択される断片は、１８４〜１９８位のアミノ酸の間の免疫的に優勢なエピトープを保持し、免疫優勢エピトープを呈する安定な立体構造に折り畳み、集合するのに十分に長い。たとえば、アミノ酸番号１２８〜アミノ酸番号２２９、完全長のＧタンパク質までのさらに長い断片も使用することができる。キメラタンパク質の文脈で、選択される断片が安定な立体構造に折り畳み、宿主細胞で組換え的に作出する場合、作出、プロセッシング又は安定性を妨害しない限り。任意で、Ｇタンパク質成分は、たとえば、配列ＧＧのような短いアミノ酸のリンカー配列を介してＦタンパク質成分に接続される。リンカーはさらに長いリンカーであり得る（たとえば、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ：配列番号１４）。ＰｒｅＦ抗原の立体構造を破壊せずに本文脈で使用できる多数の構造的に中性のリンカーが当該技術で既知である。
【００２４】
任意で、Ｇタンパク質成分は、ＲＳＶ疾患の動物モデルで増強されたウイルス性疾患を軽減する又は防ぐ１以上のアミノ酸置換を含んでなることができる。すなわち、許容可能な動物モデル（たとえば、ＲＳＶのマウスモデル）から選択される対象に、ＰｒｅＦ−Ｇキメラ抗原を含んでなる免疫原性組成物を投与した場合、非修飾のＧタンパク質を含有するワクチンを受け取った対照動物に比べて、対象がワクチン増強のウイルス性疾患（たとえば、好酸球増多、好中球増多）の軽減又は無症状を示すように、Ｇタンパク質はアミノ酸置換を含んでなることができる。ワクチン増強のウイルス性疾患の軽減及び／又は予防は、免疫原性組成物がアジュバントの非存在下で投与された（しかし、たとえば、抗原が強いＴｈ１誘導アジュバントの存在下で投与される場合ではない）場合、明らかであり得る。さらに、アミノ酸置換は、ヒト対象に投与された場合、ワクチン増強のウイルス性疾患を軽減する又は予防することができる。好適なアミノ酸置換の例は、１９１位のアスパラギンのアラニンによる置き換えである（アミノ酸番号１９１位でのＡｓｎ→Ａｌａ：Ｎ１９１Ａ）。
【００２５】
任意で、上記で記載されるＰｒｅＦ抗原は、精製への補助として役立つ追加の配列を含んでなることができる。一例はヒスチジンタグである。そのようなタグは所望であれば、最終産物から取り除くことができる。
【００２６】
発現される場合、ＰｒｅＦ抗原は、ポリペプチドの多量体を含んでなる成熟タンパク質への分子内折り畳みと集合を経験する。好都合には、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドは、成熟した、処理されたＲＳＶのＦタンパク質の前融合立体構造に似ている三量体を形成する。
【００２７】
本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）のいずれかを、ＲＳＶに対する防御的な免疫応答を誘発する目的で免疫原性組成物にて好都合に使用することができる。そのような免疫原性組成物は通常、緩衝液のような薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤を含んでなる。投与に続いて生じる免疫応答を高めるために、免疫原性組成物は通常アジュバントも包含する。ＲＳＶに対する防御的な免疫応答を誘発するための免疫原性組成物の場合（たとえば、ワクチン）、組成物は好都合に、Ｔｈ１免疫応答を優勢に誘発するアジュバント（Ｔｈ１に偏ったアジュバント）を含んでなる。通常、アジュバントは、組成物が投与される標的集団への投与に好適であるように選択される。従って、適用に応じて、アジュバントは、たとえば、新生児又は高齢者への投与に好適であるように選択される。
【００２８】
本明細書で記載される免疫原性組成物は、ＲＳＶへの投与又は暴露に続く病的応答（たとえば、ワクチン増強のウイルス性疾患）を含んでなることなく、ＲＳＶ感染の軽減又は予防のためのワクチンとして好都合に採用される。
【００２９】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＰｒｅＦ抗原（たとえば、配列番号６によって説明される例となる実施形態）と、Ｇタンパク質成分を含んでなる第２のポリペプチドを含んでなる。Ｇタンパク質成分は通常、Ｇタンパク質の少なくともアミノ酸番号１４９〜２２９を含んでなる。Ｇタンパク質のさらに小さな部分を使用することができるが、そのような断片は、少なくともアミノ酸番号１８４〜１９８の免疫的に優勢なエピトープを含んでなるべきである。或いは、Ｇタンパク質は、任意で、たとえば、完全長のＧタンパク質又はキメラポリペプチドのようなさらに大きな部分の要素としてアミノ酸番号１２８〜２２９又は１３０〜２３０のようなＧタンパク質のさらに大きな部分を含んでなることができる。
【００３０】
他の実施形態では、免疫原性組成物は、Ｇタンパク質成分（配列番号８及び１０で説明される例となる実施形態）も含んでなるキメラタンパク質であるＰｒｅＦ抗原を含んでなる。そのようなキメラＰｒｅＦ（又はＰｒｅＦ−Ｇ）抗原のＧタンパク質は、Ｇタンパク質の少なくともアミノ酸番号１４９〜２２９を通常含んでなる。上記で示したように、免疫優勢エピトープが保持され、ＰｒｅＦ−Ｇの立体構造が有害に影響されない限り、Ｇタンパク質のさらに小さな又はさらに大きな断片（たとえば、アミノ酸番号１２９〜２２９又は１３０〜２３０）も使用することができる。
【００３１】
任意で、免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つの追加の抗原を含んでなることもできる。たとえば、病原性生物は、たとえば、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、又はインフルエンザウイルスのような、ＲＳＶ以外のウイルスである。或いは、病原性生物はジフテリア、破傷風、百日咳、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、及びＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓのような細菌であり得る。
【００３２】
ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）のいずれかをコードする組換え核酸も本開示の特徴である。一部の実施形態では、核酸のＰｒｅＦ抗原をコードする核酸のポリヌクレオチドは、選択される宿主（たとえば、ＣＨＯ細胞、そのほかの哺乳類細胞又は昆虫細胞）での発現について最適化される。従って、発現ベクター（原核細胞又は真核細胞の発現ベクターを含んでなる）を含んでなるベクターは、本開示の特徴である。同様に、そのような核酸及びベクターを含んでなる宿主細胞は本開示の特徴である。ＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発するために対象に投与するための免疫原性組成物の文脈でそのような核酸を使用することもできる。
【００３３】
ＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶ感染の予防及び／又は治療に好都合に使用される。従って、本開示の別の態様は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法に関する。方法には、免疫的に有効な量の、ＰｒｅＦ抗原を含んでなる組成物を（ヒト対象のような）対象に投与することが含まれる。免疫的に有効な量の組成物の投与は、ＰｒｅＦ抗原上に存在するエピトープに特異的な免疫応答を誘発する。そのような免疫応答には、Ｂ細胞応答（たとえば、中和抗体の産生）及び／又はＴ細胞応答（たとえば、サイトカインの産生）を挙げることができる。好都合には、ＰｒｅＦ抗原によって誘発される免疫応答には、ＲＳＶのＦタンパク質の前融合立体構造上に存在する少なくとも１つの立体構造エピトープに特異的である要素が含まれる。ＰｒｅＦ抗原及び組成物は、ＲＳＶとの接触に続くウイルス性疾患を増強することなく対象に投与することができる。好都合に、本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原及び好適に製剤化される免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減する又は予防する及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的応答を軽減する又は予防するＴｈ１に偏った免疫応答を誘発する。
【００３４】
免疫原性組成物は、たとえば、鼻内のような経路を含んでなる種々の経路を介して投与することができ、上部気道の粘膜にＰｒｅＦ抗原を直接接触させる。或いは、たとえば、筋肉内の投与のようなさらに従来の投与経路を採用することができる。
【００３５】
従って、ＲＳＶ感染を治療する（たとえば、ＲＳＶ感染を予防的に治療する又は予防する）ための医薬の調製における、開示されるＲＳＶ抗原（又は核酸）のいずれかの使用も企図される。従って、本開示は、医薬において使用するために、開示される組換えＲＳＶ抗原又は免疫原性組成物、並びにＲＳＶ関連の疾患の予防又は治療のためのそれらの使用を提供する。
【００３６】
ＰｒｅＦ抗原、及びその使用方法に関する追加の詳細は、以下の説明及び実施例で提示される。
【００３７】
用語
本開示の種々の実施形態の再検討を円滑にするために、用語の以下の説明を提供する。本開示の文脈で追加の用語及び説明を提供することができる。
【００３８】
特に説明されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。分子生物学での一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見い出すことができる。
【００３９】
単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に示さない限り、複数の指示対象を含んでなる。同様に、語「又は」は、文脈が明瞭に示さない限り、「及び」を含んでなる。用語「複数の」は、２以上を指す。核酸又はポリペプチドに対して与えられる塩基のサイズ、アミノ酸のサイズはすべて、及び分子量又は分子質量はすべて近似であり、記載に対して提供される。さらに、抗原のような物質の濃度又はレベルに関して与えられる数値限界は近似であることが意図される。従って、濃度が少なくとも（たとえば）、２００ｐｇであると示される場合、濃度は少なくともおよそ（又は約又は〜）２００ｐｇであると理解される。
【００４０】
本明細書で記載されるものに類似の又は同等の方法及び物質が本開示の実践又は試験で使用され得るが、好適な方法及び物質は以下に記載される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」を意味する。従って、文脈が必要としない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及びその変異体「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、言及された化合物若しくは組成物（たとえば、核酸、ポリペプチド、抗原）若しくは工程、又は化合物若しくは工程の群の包含を暗示するように理解されるが、他の化合物、組成物、工程、又はそれらの群の排除を暗示しないように理解される。略記「ｅ．ｇ．」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を指すように使用される。従って、略記「ｅ．ｇ．」は用語「たとえば」と同義である。
【００４１】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ亜科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属の病原性ウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１１のタンパク質をコードするマイナス鎖ＲＮＡ分子である。ウイルスのＮタンパク質とのＥＮＡゲノムの堅い会合によってウイルスのエンベロープ内で包まれるヌクレオカプシドが形成される。Ｇ糖タンパク質の抗原性に基づいて、ヒトＲＳＶ株の２つの群、Ａ群とＢ群が記載されている。多数のＲＳＶ株が今日まで単離されている。ＧｅｎＢａｎｋ及び／又はＥＭＢＬの受入番号で示される例となる株は、ＷＯ２００８／１１４１４９で見つけることができ、それは、ＰｒｅＦ抗原（キメラＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）及びＰｒｅＦ抗原との組み合わせでの使用に好適なＲＳＶにＦタンパク質及びＧタンパク質の核酸配列及びポリペプチド配列を開示する目的で、参照によって本明細書に組み入れられる。追加のＲＳＶ株はＲＳＶの属の範囲内で単離され、包含されそうである。同様に、ＲＳＶの属は、遺伝的浮動、又は人工的な合成及び／又は組換えによる、天然に存在する（たとえば、以前又はその後特定された株）ものから生じる変異体を包含する。
【００４２】
用語「Ｆタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶの融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に用語「Ｇタンパク質」又は「Ｇタンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶの連結タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。多数のＲＳＶの融合及び連結タンパク質ポリペプチドが記載されており、当業者に既知である。ＷＯ２００８１１４１４９は、本開示の提出日時点で公的に利用可能な例となるＲＳＶのＦ及びＧタンパク質の変異体（たとえば、天然に存在する変異体）を提示している。
【００４３】
核酸又はポリペプチド（たとえば、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質の核酸又はポリペプチド又は類似体）を指す場合の「変異体」は、参照の核酸又はポリペプチドとは異なる核酸又はポリペプチドである。普通、変異体と参照の核酸又はポリペプチドとの間の差異は、指示対象に比べて比率的に少数の差異を構成する。
【００４４】
ポリペプチド又はタンパク質のドメインは、ポリペプチド又はタンパク質の中で構造的に定義された要素である。たとえば、「三量体化ドメイン」は、ポリペプチドの三量体への集合を促進するポリペプチド内のアミノ酸配列である。たとえば、三量体化ドメインは他の三量体化ドメイン（同一の又は異なったアミノ酸配列を持つ追加のポリペプチドの）との会合を介して三量体への集合を促進することができる。用語は、そのようなペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すのにも使用される。
【００４５】
用語「天然の」及び「天然に存在する」は、天然のままと同一状態で存在するたとえば、タンパク質、ポリペプチド、又は核酸のような要素を指す。すなわち、要素は人工的に修飾されていない。この開示の文脈で、たとえば、ＲＳＶの天然に存在する株又は単離体から得られるような、ＲＳＶタンパク質又はポリペプチドの多数の天然に存在する変異体があることが理解されるであろう。
【００４６】
用語「ポリペプチド」は、モノマーがアミド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマーを指す。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸配列を包含し、糖タンパク質のような修飾された配列を含んでなることが意図される。用語「ポリペプチド」は特に、組換え的に又は合成的に製造されるものと同様に天然に存在するタンパク質を網羅することが意図される。用語「断片」は、ポリペプチドに関してポリペプチドの一部（すなわち、部分列）を指す。用語「免疫原性の断片」は、完全長の参照のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの優勢な免疫原性のエピトープを保持するポリペプチドの断片を指す。ポリペプチド内の方向は、個々のアミノ酸のアミノ部分とカルボキシ部分の方向によって定義される、Ｃ末端方向に向かうＮ末端にて一般に言及される。ポリペプチドは、Ｎ末端又はアミノ末端からＣ又はカルボキシ末端に向かって翻訳される。
【００４７】
「シグナルペプチド」は、たとえば、小胞体の膜に対して及びそれを介して新しく合成された分泌タンパク質又は膜タンパク質を指示する短いアミノ酸配列（たとえば、およそ１８〜２５アミノ酸の長さ）である。シグナルペプチドはポリペプチドのＮ末端に位置することが多いが、普遍的ではなく、タンパク質が膜を交差した後、シグナルペプチダーゼによって切断されることが多い。シグナル配列は通常、３つの一般的な特徴：Ｎ末端の極性塩基性領域（ｎ−領域）、疎水性コア及び親水性ｃ−領域を含有する。
【００４８】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸配列」は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。該用語は、ＤＮＡの単鎖形態及び二本鎖形態を含んでなる。「単離されたポリヌクレオチド」によって、由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接する（５’末端の１つと３’末端の１つ）コーディング配列の双方と直接隣接しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’及び３’の方向は、個々のヌクレオチド単位の接続性を参照して定義され、デオキシリボース（又はリボース）糖鎖の炭素部分に従って指定される。ポリヌクレオチド配列の情報（コーディング）内容は５’から３’の方向で読み取られる。
【００４９】
「組換え」核酸は、天然に存在しない配列を有し、又は配列の２つの分離した断片の人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学的な合成によって、さらに一般的には、たとえば、遺伝子操作技法による核酸の単離された断片の人工的な操作によって達成することができる。「組換え」タンパク質は、たとえば、細菌細胞又は真核細胞のような宿主細胞に導入された非相同（たとえば、組換え）の核酸によってコードされるものである。核酸は、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現することが可能であるシグナルを有する発現ベクターに導入することができ、又は核酸は宿主細胞の染色体に統合することができる。
【００５０】
用語「非相同の」は、核酸、ポリペプチド又は別の細胞成分に関して、通常天然に見つからない場合、及び／又は異なった供給源若しくは種を起源とする成分が存在することを示す。
【００５１】
用語「精製」（たとえば、病原体又は病原体を含有する組成物に関して）は、望ましくない存在を組成物から取り除く工程を指す。精製は相対的な用語であり、微量な望ましくない成分のすべてが組成物から取り除かれることを必要としない。ワクチン生産の文脈では、精製は、たとえば、遠心、透析、イオン交換クロマトグラフィ、及びサイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティ精製又は沈殿のような工程を含んでなる。従って、用語「精製される」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、たとえば、精製された核酸の調製物は、一般的な環境、たとえば、細胞又は生化学的な反応器における核酸よりも特定のタンパク質が濃縮されるものである。実質的に純粋な核酸又はタンパク質は、所望の核酸が、調製物の全核酸含量の少なくとも５０％を表すように精製することができる。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸は、調製物の全核酸含量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上を表す。
【００５２】
「単離された」生物構成成分（たとえば、核酸分子、タンパク質又は細胞小器官）は、構成成分、たとえば、そのほかの染色体の及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞小器官が天然に存在する生物の細胞におけるそのほかの生物構成成分から実質的に分離され、又は精製されている。「単離された」核酸及びタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸及びタンパク質を含んでなる。該用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製される核酸及びタンパク質、並びに化学的に合成される核酸及びタンパク質も包含する。
【００５３】
「抗原」は、動物に注射される、吸収される又はさもなければ導入される組成物を含んでなる、動物にて抗体の産生及び／又はＴ細胞反応を刺激することができる化合物、組成物又は物質である。用語「抗原」は、関連する抗原性エピトープすべてを含んでなる。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原の部位を指す。「優勢な抗原性エピトープ」又は「優勢なエピトープ」は機能的に有意な宿主の免疫応答、たとえば、抗体反応又はＴ細胞反応が為されるエピトープである。従って、病原体に対する防御免疫応答に関して、優勢な抗原性エピトープは、宿主の免疫系によって認識されると病原体が原因で生じる疾患からの防御を生じる抗原性部分である。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、適切なＭＨＣ分子に結合すると、Ｔ細胞によって（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合されるエピトープを指す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（又はＢ細胞受容体分子）によって特異的に結合されるエピトープである。
【００５４】
「アジュバント」は、非特異的に免疫応答を高める剤である。一般的なアジュバントには、抗原が吸着した鉱物（ミョウバン、水酸化アルミナム、リン酸アルミナム）の懸濁液；油中水及び水中油（及びその変異体、二重エマルション及び逆エマルションを含んでなる）を含んでなるエマルション、リポ糖類、リポ多糖類、免疫賦活核酸（たとえば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬（特に、ＴＬＰ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８、及びＴＬＲ９の作動薬）、並びにそのような成分の種々の組み合わせが挙げられる。
【００５５】
「免疫原性組成物」は、たとえば、ＲＳＶのような病原体に対して特異的な免疫応答を誘発することが可能である、ヒト又は動物対象（たとえば、実験設定で）に投与するのに好適なものの組成物である。そのようなものとして、免疫原性組成物は、１以上の抗原（たとえば、ポリペプチド抗原）又は抗原性エピトープを含んでなる。免疫原性組成物はまた、たとえば、賦形剤、キャリア及び／又はアジュバントのような、免疫応答を誘発する又は高めることが可能である追加の１以上の成分を含んでなることができる。特定の例では、免疫原性組成物を投与して、病原体によって誘導される症状又は状態に対して対象を防御する免疫応答を誘発する。場合によっては、病原体が原因で生じる症状又は疾患は、病原体に対する対象の暴露に続く病原体（たとえば、ＲＳＶ）の複製を阻害ずることによって防がれる（又は軽減される又は改善される）。本開示の文脈では、用語、免疫原性組成物は、病原体に対する予防的な又は緩和的な免疫応答を誘発する目的で対象又は対象の集団への投与を意図される組成物を包含することが理解されるであろう（すなわち、ワクチン組成物又はワクチン）。
【００５６】
「免疫応答」は、免疫系の細胞、たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は単球の刺激への応答である。免疫応答は、抗原特異的な中和抗体のような特異的抗体の産生を生じるＢ細胞の応答であることができる。免疫応答は、たとえば、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋応答のようなＴ細胞の応答であることもできる。場合によっては、応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。抗原が病原体に由来するのであれば、抗原特異的応答は、「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」は、病原体の有害な機能又は活性を抑え、病原体による感染を低減し、病原体による感染の結果生じる症状（死亡を含んでなる）を減らす免疫応答である。防御免疫応答は、たとえば、プラーク低減アッセイ若しくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製若しくはプラーク形成の阻害によって、又は生体内での病原体負荷に対する耐性を測定することによって測定することができる。
【００５７】
「Ｔｈ１」に偏った免疫応答は、ＩＬ−２及びＩＦＮγを産生するのでＩＬ−２及びＩＦＮγの分泌又は存在によるＣＤ４＋ヘルパー細胞の存在を特徴とする。それに対して、「Ｔｈ２」に偏った免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋ヘルパー細胞の優勢を特徴とする。
【００５８】
「免疫学的に有効な量」は、組成物又は組成物中の抗原に対して対象にて免疫応答を誘発するのに使用される組成物（通常、免疫原性組成物）の量である。一般に、所望の成績は、病原体に対して対象を防御することが可能である又はそれに寄与する抗原特異的（たとえば、病原体特異的）免疫応答の産生である。しかしながら、病原体に対する防御免疫応答を得ることは、免疫原性組成物の複数の投与を必要とし得る。従って、本開示の文脈では、用語、免疫学的に有効な量は、前の又は後に続く投与との組み合わせで防御免疫応答を達成することに寄与する小部分の用量を包含する。
【００５９】
形容詞「薬学上許容可能な」は、指示対象が対象（たとえば、ヒト又は動物対象）への投与に好適であることを指す。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版（１９７５）は、免疫原性組成物を含んでなる、治療用及び／又は予防用の組成物の薬学送達に好適な組成物及び製剤（希釈剤を含んでなる）を記載している。
【００６０】
用語「調節する」は、免疫応答のような応答に関して、応答の発症、程度、持続期間又は特徴を変える又は変化させることを意味する。免疫応答を調節する剤は、その投与に続く免疫応答の発症、程度、持続期間又は特徴の少なくとも１つを変える、又は参照剤に比べて発症、程度、持続期間又は特徴の少なくとも１つを変える。
【００６１】
用語「軽減する」は、剤の投与に続いて応答又は状態が定量的に低下するならば、又は参照剤に比べて剤の投与に続いてそれが低下するのであれば、剤が応答又は状態を軽減するように、相対的な用語である。同様に用語「予防する」は、応答又は状態の少なくとも１つの特徴が除去される限り、剤が応答又は状態を完全に除去することを必ずしも意味しない。従って、病的応答、たとえば、ワクチンが増強するウイルス性疾患のような感染又は応答を軽減する又は予防する免疫原性組成物は、感染又は応答が、剤の非存在下での又は参照剤と比べた感染又は応答の、たとえば、少なくとも約５０％、たとえば、少なくとも約７０％、約８０％、さらに約９０％測定上低下する限り、そのような感染又は応答を完全に除去することができるが、必ずしも完全には除去しない。
【００６２】
「対象」は、生きている多細胞の脊椎生物である。本開示の文脈では、対象は、たとえば、非ヒト動物、たとえば、マウス、コットンラット又は非ヒト霊長類のような実験用対象であり得る。或いは、対象はヒト対象であり得る。
【００６３】
ＰｒｅＦ抗原
本来は、ＲＳＶのＦタンパク質は、Ｆ０と命名された単一のポリペプチド前駆体、長さ５７４のアミノ酸として発現される。生体内で、Ｆ０は、小胞体にてオリゴマー化され、２つの保存されたフリンコンセンサス配列（フリン切断部位）、ＲＡＲＲ１０９（配列番号１５）とＲＫＲＲ１３６（配列番号１６）にてフリンプロテアーゼによってタンパク分解処理を受けて、２つのジスルフィド結合断片から成るオリゴマーを生成する。これら断片の小さい方はＦ２と呼ばれ、Ｆ０前駆体のＮ末端を起源とする。略記、Ｆ０、Ｆ１及びＦ２は科学文献では一般にＦ０、Ｆ１及びＦ２と示されることが当業者によって認識されるであろう。大きい方のＣ末端Ｆ１断片は、２４アミノ酸の細胞質尾部に隣接する疎水性アミノ酸の配列を介して膜にてＦタンパク質を固定する。３つのＦ２−Ｆ１二量体が会合して成熟Ｆタンパク質を形成し、それは、標的細胞膜との接触の際、立体構造変化を受けるきっかけとなる準安定的な前融合形成（「前融合」）の立体構造を取る。この立体構造変化は、融合ペプチドとして知られる疎水性配列を剥き出しにし、それは、宿主細胞の膜と会合し、標的細胞膜とのウイルス又は感染細胞の膜の融合を促進する。
【００６４】
Ｆ１断片は、ＨＲＡ及びＨＲＢと命名され、それぞれ融合ペプチド及び膜貫通アンカードメインの近傍に位置する少なくとも２つの７個反復ドメインを含有する。前融合の立体構造では、Ｆ２−Ｆ１二量体は、球形の頭部と茎構造を形成し、そこでＨＲＡドメインは球形の頭部における断片化（伸長した）構成の中にある。それに対して、ＨＲＢドメインは、頭部領域から伸びる三本鎖のコイルドコイルの茎を形成する。前融合から後融合の立体構造への転移の間、ＨＲＡドメインは崩壊し、ＨＲＢドメインの近傍にもたらされ、逆平行の６らせん束を形成する。後融合の状態で、融合タンパク質と膜貫通ドメインは、並置されて膜の融合を円滑にする。
【００６５】
上記で提供された立体構造の記載は、結晶学データの分子モデル化に基づくが、前融合と後融合の立体構造の構造的な識別は、結晶学への手段なしでモニターできる。たとえば、その技術的教示の目的で、参照によって本明細書に組み入れられるＣａｌｄｅｒらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，２７１：１２２−１３１（２０００）及びＭｏｒｔｏｎらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，３１１：２７５−２８８によって明らかにされたように、電子顕微鏡を用いて前融合と後融合（代わりに指定された前融合と融合）の立体構造の間を区別することができる。また、その技術的教示の目的で、参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｎｎｏｌｌｙらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１７９０３−１７９０８（２００６）により記載されたようなリポソーム会合アッセイによって前融合の立体構造を融合（後融合）の立体構造から区別することができる。さらに、ＲＳＶのＦタンパク質の前融合形態又は融合形態の１つ又はその他に存在するが、他の形態には存在しない立体構造エピトープを特異的に認識する抗体（たとえば、モノクローナル抗体）を用いて前融合の立体構造と融合の立体構造を区別することができる。そのような立体構造のエピトープは、分子の表面における抗原決定基の優先的な暴露による。或いは、立体構造のエピトープは、直鎖ポリペプチドで隣接しないアミノ酸の並置から生じ得る。
【００６６】
本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原は、発現されたタンパク質の集団にて、発現されたタンパク質の集団の実質的な部分が、前融合（前融合）の立体構造にあるように（たとえば、構造的な及び／又は熱動態的なモデル化によって予測されるように又は上記で開示された方法の１以上によって評価されるように）、ＲＳＶのＦタンパク質の前融合の立体構造を安定化させ、維持するように設計される。Ｆタンパク質の前融合立体構造の主な免疫原性エピトープが、細胞環境又は細胞外環境（たとえば、対象への投与に続く生体内での）へのＰｒｅＦ抗原の導入に続いて維持されるように、安定化する修飾は、天然（又は合成）のＦタンパク質、たとえば、配列番号２の例となるＦタンパク質のような天然の（又は合成の）Ｆタンパク質に導入される。
【００６７】
先ず、Ｆ０ポリペプチドの膜アンカードメインを置き換えるためにヘテロ安定化ドメインを構築物のＣ末端に置くことができる。この安定化ドメインは、ＨＲＢの不安定性を代償し、前融合の配座異性体を安定化するのを助けると予測される。例となる実施形態では、ヘテロ安定化ドメインはタンパク質多量体化ドメインである。そのようなタンパク質多量体化ドメインの特に好都合な一例は、三量体化ドメインである。例となる三量体化ドメインは、コイルドコイルドメインを有する複数のポリペプチドの三量体への集合を促進するそのようなコイルドコイルに折り畳む。三量体化ドメインの好都合な一例は、イソロイシンジッパーである。例となるイソロイシンジッパーは、ＨａｒｂｕｒｙらのＳｃｉｅｎｃｅ，２６２：１４０１−１４０７（１９９３）によって記載された操作された酵母ＧＣＮ４イソロイシン変異体である。好適なイソロイシンジッパードメインの配列の１つは配列番号１１で表されるが、コイルドコイル安定化ドメインを形成する能力を保持するこの配列の変異体も同様に好適である。代わりの安定化コイルドコイル三量体化ドメインには、ＴＲＡＦ２（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号．Ｑ１２９３３［ｇｉ：２３５０３１０３］；アミノ酸番号２９９−３４８）；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ１（受入番号．ＰＯ７９９６［ｇｉ：１３５７１７］；アミノ酸番号２９１−３１４）；Ｍａｔｒｉｌｉｎ−４（受入番号．Ｏ９５４６０［ｇｉ：１４５４８１１７］；アミノ酸番号５９４−６１８；ＣＭＰ（ｍａｔｒｉｌｉｎ−１）（受入番号．ＮＰ＿００２３７０［ｇｉ：４５０５１１１］；アミノ酸番号４６３−４９６；ＨＳＦ１（受入番号．ＡＡＸ４２２１１［ｇｉ：６１３６２３８６］；アミノ酸番号１６５−１９１；及びＣｕｂｉｌｉｎ（受入番号．ＮＰ＿００１０７２［ｇｉ：４５５７５０３］；アミノ酸番号１０４−１３８が挙げられる。好適な三量体ドメインは、発現されたタンパク質の実質的な部分の三量体への集合を生じることが期待される。たとえば、三量体化ドメインを有する組換えＰｒｅＦポリペプチドの少なくとも５０％が三量体を形成する（たとえば、ＡＦＦ−ＭＡＬＳによって評価されるように）。通常、発現されたポリペプチドの少なくとも６０％、さらに好都合には少なくとも７０％、最も望ましくは少なくとも約７５％が三量体として存在する。
【００６８】
ＨＲＢを一層さらに安定化させるために、ＨＲＢ内の中性残基（たとえば、ロイシン、イソロイシン又はバリン）を極性残基（たとえば、リジン、アルギニン又はグルタミン）で置換することができる。たとえば、ＲＳＶのＦ抗原の文脈では、ＴｒｅＦの５１２位（天然のＦ０タンパク質に対して）に位置するロイシン残基をリジンで置換することができる（配列番号６の例となるＰｒｅＦ抗原のＬ４８２Ｋ）。この置換は、コイルドコイル疎水性残基の周期性を改善する。同様に、１０５位のアミノ酸に続いてリジンを付加することができる。
【００６９】
第２に、ｐｅｐ２７を取り除くことができる。前融合状態でのＲＳＶのＦタンパク質の構造モデルの解析は、ｐｅｐ２７が、Ｆ１とＦ２の間で大きな非拘束のループを創ることを示唆している。このループは、前融合状態の安定化に寄与することはなく、フリンによる天然のタンパク質の切断に続いて取り除かれる。
【００７０】
第３に、フリン切断モチーフの一方又は双方を欠失させることができる。加えて、フリン切断モチーフの欠失（ｈＭＶＰ及びＰＩＶの場合は１つ、ＲＳＶの場合は１つ又は両方）はさらに前融合の配座異性体を安定化する。この設計によって、融合タンパク質はＦ２から切断されず、前融合の配座異性体の球形頭部からの放出を妨げ、すぐ近くの膜への接近性を妨げる。融合タンパク質と膜界面との間の相互作用が前融合状態の不安定性における主な課題であると予測される。融合工程の間、融合ペプチドと標的膜の間の相互作用は、球形頭部構造内からの融合ペプチドの暴露を生じ、前融合状態の不安定性を高め、後融合の配座異性体に折り畳む。この立体構造の変化によって膜融合の工程が可能になる。フリン切断部位の１つ又は両方の除去は、融合ペプチドのＮ末端部分への膜接近性を妨げ、前融合状態を安定化させると予測される。従って、本明細書で開示される例となる実施形態では、フリン切断モチーフの除去は、未変化の融合ペプチドを含んでなるＰｒｅＦ抗原を生じ、それは、プロセッシング及び集合の間又はそれに続いてフリンによって切断されない。
【００７１】
任意で、たとえば、１以上のアミノ酸の置換によって少なくとも１つの非フリン切断部位を取り除くことができる。たとえば、実験的証拠は、特定のメタロプロテイナーゼによる切断につながる条件下では、Ｆタンパク質はアミノ酸番号１１０〜１１８の近傍で切断され得る（たとえば、ＰｒｅＦ抗原のアミノ酸番号１１２と１１３の間；配列番号２の参照Ｆタンパク質ポリペプチドの１４２位のロイシンと１４３位のグリシンの間で切断が生じる）。従って、この領域内での１以上のアミノ酸の修飾は、ＰｒｅＦ抗原の切断を低下させ得る。たとえば、１１２位のロイシンは、たとえば、イソロイシン、グルタミン又はトリプトファン（配列番号２０の例となる実施形態で示されるような）のような異なったアミノ酸で置換することができる。代わりに又はさらに、１１３位のグリシンは、セリン又はアラニンによって置換することができる。
【００７２】
任意で、ＰｒｅＦ抗原は、たとえば、天然のＦタンパク質ポリペプチドに存在する１以上のグリコシル化部位でグリコシル化された分子の比率を上げる又は下げることによって、グリコシル化のパターン又は状況を変える１以上の修飾を含んでなることができる。たとえば、配列番号２の天然のＲＳＶタンパク質ポリペプチドは、２７位、７０位及び５００位（配列番号１０の例となるＰｒｅＦ抗原の２７位、７０位及び４７０位に対応する）でのアミノ酸にてグリコシル化されると予測される。一実施形態では、修飾は、５００位のアミノ酸（Ｎ４７０と命名）でのグリコシル化部位の近傍に導入される。たとえば、５００位（参照配列の、例となるＰｒｅＦ抗原の４７０位の配置に対応する）のアスパラギンの代わりにグルタミン（Ｑ）のようなアミノ酸を置換することによってグリコシル化部位を取り除くことができる。好都合には、このグリコシル化部位でグリコシル化効率を高める修飾が導入される。好適な修飾の例には、５００〜５０２位にて以下のアミノ酸配列：ＮＧＳ；ＮＫＳ；ＮＧＴ；ＮＫＴが挙げられる。興味深いことに、高いグリコシル化を生じるこのグリコシル化部位の修飾はまた実質的に高いＰｒｅＦ産生を生じる。従って、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、参照ＰｒｅＦ配列（配列番号２）のアミノ酸番号５００に対応する位置で、たとえば、配列番号１０によって例示されるＰｒｅＦ抗原の４７０位にて修飾されたグリコシル化部位を有する。好適な修飾には、参照Ｆタンパク質配列の５００〜５０２位に対応するアミノ酸での、配列：ＮＧＳ；ＮＫＳ；ＮＧＴ；ＮＫＴが挙げられる。「ＮＧＴ」の修飾を含んでなる例となる実施形態のアミノ酸は、配列番号１８にて提供される。当業者は、対応するＮＧＳ、ＮＫＳ及びＮＫＴについての同様の修飾を容易に決定することができる。そのような修飾は、本明細書で開示される安定化変異（たとえば、イソロイシンジッパーのようなヘテロコイルドコイル、疎水性領域におけるドメイン及び／又は修飾）、及び／又はｐｅｐ２７の除去、及び／又はフリン切断部位の除去、及び／又は非フリン切断部位の除去、及び／又は非フリン切断部位の除去）のいずれかと好都合に組み合わせられる。たとえば、特定の一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は非フリン切断部位を消失させる置換とグリコシル化を高める修飾を含んでなる。例となる配列は、配列番号２２（例となる実施形態が、「ＮＧＴ」の修飾と１１２位でのロイシンに代わるグルタミンの置換を含んでなる）にて提供される。
【００７３】
さらに一般的には、本明細書で開示される安定化の修飾、たとえば、好ましくは可溶性ＰｒｅＦ抗原のＣ末端に位置する、たとえば、コイルドコイル（たとえば、イソロイシンジッパードメイン）のような非相同の安定化ドメインの付加；疎水性ＨＲＢドメインにおけるロイシンからリジンへのような残基の修飾；ｐｅｐ２７の除去；フリン切断モチーフの一方又は双方の除去；非フリン切断部位の除去；及び／又はグリコシル化部位の修飾のいずれか１つを、ほかの安定化修飾の１以上との組み合わせにて（又は全部くるめた組み合わせまで）採用することができる。たとえば、ヘテロコイルドコイル（又はそのほかのヘテロ安定化ドメイン）を単独で利用することができ、又は疎水性領域の修飾及び／又はｐｅｐ２７の除去及び／又はフリン切断部位の除去及び／又は非フリン切断部位の除去いずれかと組み合わせて利用することができる。特定の特殊な実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、Ｃ末端のコイルドコイル（イソロイシンジッパー）ドメイン、ＨＲＢ疎水性ドメインにおける安定化置換、及びフリン切断部位の一方又は双方の除去を含んでなる。そのような実施形態は、フリン切断によって除去されない未変化の融合ペプチドを含んでなる。特定の一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はまた５００位のアミノ酸にて修飾されたグリコシル化部位を含んでなる。
【００７４】
天然のＦタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶのＡ株又はＲＳＶのＢ株又はその変異体（上記と同義）のＦタンパク質から選択することができる。特定の例となる実施形態では、Ｆタンパク質ポリペプチドは、配列番号２で表されるＦタンパク質である。本開示の理解を円滑にするために、アミノ酸残基の位置は、株にかかわりなく、例となるＦタンパク質の１つのアミノ酸の位置（すなわち、対応するアミノ酸残基の位置に関して与えられる。ほかのＲＳＶのＡ株又はＢ株の匹敵するアミノ酸の位置は、容易に利用でき、周知の配置アルゴリズム（たとえば、ＢＬＡＳＴ、たとえば、初期設定パラメータを用いて）を用いて例となる配列と共に選択されたウイルスのＦタンパク質のアミノ酸配列を並べることによって当業者によって容易に決定することができる。異なったＲＳＶ株に由来するＦタンパク質ポリペプチドの多数の追加の例は、ＷＯ２００８／１１４１４９（ＲＳＶのＦ及びＧのタンパク質配列の追加の例を提供する目的で参照によって本明細書に組み入れられる）に開示されている。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である。
【００７５】
Ｆタンパク質の選択するＦ２及びＦ１のドメインでは、当業者は、Ｆ２及び／又はＦ１のドメイン全体を厳格に含んでなる必要はないことを認識するであろう。通常、Ｆ２ドメインの配列（又は断片）を選択する場合、立体構造の考慮が重要である。従って、Ｆ２ドメインは通常、ポリペプチドの集合と安定性を円滑にするＦ２ドメインの部分を含んでなる。特定の例となる変異体では、Ｆ２ドメインはアミノ酸番号２６〜１０５を含んでなる。しかしながら、長さにおける瑣末な修飾（１以上のアミノ酸の付加又は欠失による）を有する変異体も可能である。
【００７６】
通常、Ｆ１ドメインの少なくとも部分列（又は断片）は、Ｆタンパク質の免疫優勢エピトープを含んでなる安定な立体構造を維持するように選択され、設計される。たとえば、アミノ酸番号２６２〜２７５（パリビツマブ中和）及び４３３〜４３６（Ｃｅｎｔｏｃｏｒのｃｈ１０１ＦＭＡｂ）の領域で抗体を中和することによって認識されるエピトープを含んでなるＦ１ポリペプチドドメインの部分列を選択することが一般に望ましい。さらに、たとえば、アミノ酸番号３２８〜３５５の領域でＴ細胞エピトープを含んでなることが望ましい。最も一般的には、Ｆ１サブユニット（たとえば、貫通アミノ酸番号２６２〜４３６）の単一の隣接部分として、しかし、エピトープは安定な立体構造を形成する不連続な要素としてこれらの免疫優勢エピトープを含んでなる合成配列で保持され得る。従って、Ｆ１ドメインのポリペプチドは、ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも約２６２〜４３６のアミノ酸を含んでなる。非限定の一例では、Ｆ１ドメインは、天然のＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸番号１３７〜５１６を含んでなる。当業者は、追加のさらに短い配列を熟練者の裁量で使用できることを認識するであろう。
【００７７】
立体構造の考慮に加えて、Ｆ２又はＦ１のドメインの部分列を選択する場合（又は特定のＰｒｅＦ−Ｇ抗原のＧタンパク質成分に関して以下で議論するように）、追加の免疫原性エピトープの包含に基づいて配列（たとえば、変異体、部分列まど）を選択することが望ましくてもよい。たとえば、当該技術で既知の、たとえば、神経網又は多項式決定のようなアンカーモチーフ又はそのほかの方法を用いて、追加のＴ細胞エピトープを特定することができ、たとえば、ＲＡＮＫＰＥＰ（ウエブサイト：ｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌで利用可能）；ＰｒｏＰｒｅｄＩ（ウエブサイト：ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄＩ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）；Ｂｉｍａｓ（ウエブサイト：ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）；及びＳＹＦＰＥＩＴＨ（ウエブサイト：ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍで利用可能）を参照のこと。たとえば、アルゴリズムを用いてペプチドの「結合閾値」を決定し、特定の親和性で結合するＭＨＣ又は抗体の高い確率をそれらに与えるスコアを持つものを選択する。アルゴリズムは、特定の位置での特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、特定の位置での特定のアミノ酸の抗体結合に対する効果、又はモチーフを含有するペプチドの特定の置換の結合に対する効果のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの文脈の範囲内で、「保存された残基」は、ペプチドの特定の位置で無作為な分布で予想されるものより有意に高い頻度で出現するものである。アンカー残基はＭＨＣ分子との接触点を提供する保存された残基である。そのような予測方法で特定されるＴ細胞エピトープは、特定のＭＨＣタンパク質への結合を測定することによって、及びＭＨＣタンパク質の背景で提示される場合Ｔ細胞を刺激するその能力によって確認することができる。
【００７８】
好都合には、ＰｒｅＦ抗原（以下で議論されるＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）は、発現系に対応するシグナルペプチド、たとえば、哺乳類又はウイルスのシグナルペプチド、たとえば、ＲＳＶのＦ０の天然のシグナル配列（たとえば、配列番号２のアミノ酸番号１〜２５又は配列番号６のアミノ酸番号１〜２５）を含んでなる。通常、シグナルペプチドは、組換え発現で選択される細胞に適合するように選択される。たとえば、バキュロウイルスのシグナルペプチド又はメリチンシグナルペプチドのようなシグナルペプチドは、昆虫細胞における発現について置換され得る。植物の発現系が好まれるのであれば、好適な植物シグナルペプチドが当該技術で既知である。多数の例となるシグナルペプチドが当該技術で既知であり（たとえば、多数のヒトのシグナルペプチドを記載しているＺｈａｎｇ ＆ Ｈｅｎｚｅｌ, Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ., １３：２８１９‐２８２４ （２００４）を参照）、古細菌、原核生物及び真核生物のシグナル配列を含んでなるＳＰｄｂシグナルペプチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／）にてカタログ化されている。任意で、先行の抗原のいずれかが追加の配列、又はＨｉｓタグのようなタグを含んで精製を円滑にすることができる。
【００７９】
任意で、ＰｒｅＦ抗原は追加の免疫原性成分を含んでなることができる。特定の特に好都合な実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はＲＳＶのＧタンパク質の抗原性成分を含んでなる。ＰｒｅＦ及びＧの成分を有する例となるキメラタンパク質には、以下のＰｒｅＦ＿Ｖ１（配列番号７及び８で表される）及びＰｒｅＦＶ２（配列番号９及び１０で表される）が挙げられる。
【００８０】
ＰｒｅＦ−Ｇ抗原では、Ｇタンパク質（たとえば、アミノ酸残基番号１４９〜２２９のような切り詰めＧタンパク質）の抗原性部分を構築物のＣ末端に付加する。通常、Ｇタンパク質成分は、自由度のあるリンカー配列を介してＦタンパク質成分に連結される。たとえば、例となるＰｒｅＦ＿Ｖ１の設計では、Ｇタンパク質は、−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ−リンカー（配列番号１４）によってＰｒｅＦ成分に連結される。ＰｒｅＦ＿Ｖ２の設計では、リンカーはさらに短い。−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ−リンカー（配列番号１４）の代わりに、ＰｒｅＦ＿Ｖ２は２つのグリシン（−ＧＧ−）をリンカーに有する。
【００８１】
存在する場合、Ｇタンパク質ポリペプチドドメインは、ＲＳＶのＡ株又はＲＳＶのＢ株から選択されるＧタンパク質のすべて又は一部を含んでなることができる。特定の例となる実施形態では、Ｇタンパク質は、配列番号４で表されるＧタンパク質である（又はそれと９５％同一である）。好適なＧタンパク質配列の追加の例は、ＷＯ２００８／１１４１４９（参照によって本明細書に組み入れられる）に見つけることができる。
【００８２】
Ｇタンパク質ポリペプチド成分は、アミノ酸番号１８３〜１９７の領域で免疫優勢なＴ細胞エピトープを保持するＧタンパク質の少なくとも部分列（又は断片）、たとえば、天然のＧタンパク質のアミノ酸番号１５１〜２２９、１４９〜２２９又は１２８〜２２９を含んでなるＧタンパク質の断片を含んでなるように選択される。例となる一実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、天然のＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基番号１４９〜２２９の全部又は一部を含んでなる、天然のＧタンパク質ポリペプチドの部分列（又は断片）である。当業者は、選択される部分が、ＰｒｅＦ−Ｇの発現、折り畳み又はプロセッシングを構造的に不安定化又は破壊しない限り、Ｇタンパク質のさらに長い又は短い部分を使用できることを容易に十分に理解するであろう。任意で、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンと関連する好酸球増多を特徴とする増強された疾患を軽減する及び／又は防ぐことが以前示された１９１位にて、Ｇタンパク質ドメインはアミノ酸置換を含んでなる。天然に存在する及び置換された（Ｎ１９１Ａ）Ｇタンパク質の特性の完全な記載は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００５／００４２２３０に見つけることができる。
【００８３】
たとえば、天然に存在する株に対応する配列の選択に関して、１以上のドメインが、たとえば、Ａ２若しくはロングと命名された一般の研究室単離体、又はそのほかの天然に存在する株若しくは単離体（前述のＷＯ２００８／１１４１４９で開示されたような）のようなＲＳＶのＡ株又はＢ株に配列では対応し得る。そのような天然に存在する又は単離される変異体に加えて、前述の配列と配列類似性を共有する操作された変異体もＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）抗原の文脈で採用され得る。ポリペプチド（及び一般にヌクレオチド配列）に関してＰｒｅＦ抗原ペプチド（及び以下に記載されるポリヌクレオチド配列）間の類似性は、配列同一性を参照して配列間での類似性という点で表現され得る。配列同一性は、同一性（又は類似性）比率という点で測定されることが多く；比率が高ければ高いほど、２つの配列の一次構造はよく類似する。一般に、２つのアミノ酸（又はポリヌクレオチド）の配列の一次構造が似ていれば似ているほど、折り畳み及び集合の結果生じる高次構造も類似する。ＰｒｅＦポリペプチド（又はポリヌクレオチド）配列の変異体は通常、１又は少数のアミノ酸の欠失、付加又は置換を有するが、それでもなお、非常に高い比率でアミノ酸、一般にはそのポリヌクレオチド配列を共有する。さらに重要なことに、変異体は、本明細書で開示される参照配列の構造的な特性、従って立体構造の特性を保持する。
【００８４】
配列同一性を決定する方法は当該技術で周知であり、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチド、並びにそれをコードする核酸に適用可能である（たとえば、下記のように）。種々のプログラム及び配置アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１０８８１，１９８８；並びにＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列配置法と相同性算出の詳細な考察を提示している。ＮＣＢＩ基本的な局在配置検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３, １９９０）は、配列解析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、全米バイオテクノロジー情報センター（ＭＤ州、ベセスダ、ＮＣＢＩ）を含んでなる幾つかの供給源、及びインターネットにて利用可能である。このプログラムを用いて配列同一性の決定の仕方の記載はインターネットのＮＶＢＩウエブサイトで利用可能である。
【００８５】
一部の例では、ＰｒｅＦ抗体は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に比べて１以上のアミノ酸修飾を有する（たとえば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差異は、１以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換であり得る。変異体は通常、アミノ酸残基の約１％又は２％又は５％又は６％又は１０％又は１５％又は２０％以下異なる。たとえば、変異体ＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）ポリペプチド配列は、配列番号６、８、１０，１８、２０及び／又は２２の例となるＰｒｅＦ抗原ポリペプチド配列の例となるＰｒｅＦ抗原と比べて、１又は２又は５までの又は約１０までの、又は約１５までの、又は約５０までの又は約１００までのアミノ酸の差異を含んでなり得る。従って、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質又はＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）の文脈では変異体は、通常、配列番号６、８、１０，１８、２０及び／又は２２で説明される参照タンパク質との、又は本明細書で開示される例となるＰｒｅＦ抗原のいずれかとの、少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には、少なくとも約９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。本開示の特徴として含まれる追加の変異体には、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示された天然に存在する変異体から選択されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の全部又は一部を含んでなるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）である。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である。たとえば、修飾は、得られるＰｒｅＦ抗原の立体構造又は免疫原性エピトープを変化させない１以上の（たとえば、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、１０までのアミノ酸、以上）の置換であり得る。
【００８６】
代わりに又はさらに、修飾は、１以上のアミノ酸の欠失及び／又は１以上のアミノ酸の付加を含んでなることができる。実際、所望であれば、１以上のポリペプチドドメインは、単一株に一致しないが、複数株、又はさらにＲＳＶのポリペプチドの複数の株を並べることによって推定されるコンセンサス配列に由来する成分部分列を含んでなる合成ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、その後の処理又は精製を円滑にするタグを構成するアミノ酸配列の付加によって１以上のポリペプチドドメインが修飾される。そのようなタグは抗原性タグ、又はエピトープタグ、酵素タグ又はポリヒスチジンタグであり得る。通常、タグは、たとえば、抗原又は融合タンパク質のＣ末端又はＮ末端のようなタンパク質の一方又は他方の末端に位置する。
【００８７】
ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸
本開示の別の態様は、上述のようなＰｒｅＦ抗原をコードする組換え核酸に関する。さらに明確には、そのような核酸は、パラミクソウイルスのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなるＦタンパク質ポリペプチド抗原を含んでなるポリペプチドをコードし、それは、（ｉ）ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加、（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、（ｉｉｉ）非フリン切断部位の欠失、（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失及び（ｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。任意で、そのようなポリヌクレオチドはグリコシル化部位で修飾を伴うＰｒｅＦ抗原をコードする。そのようなポリペプチドの性質及び構造の詳細は上記で詳細に開示している。当業者は、配列表で提供される、さもなければ本開示に（たとえば、参照による組み入れによって）含まれる例となる配列を含んでなる本明細書での教示に基づいた記載されるポリペプチド配列のいずれか及びすべてをコードするヌクレオチド配列を容易に決定することができる。
【００８８】
特定の実施形態では、組換え核酸は、選択される原核又は真核の宿主細胞での発現についてコドンが最適化される。たとえば、配列番号５、１２、１７、１９及び２１は、ＰｒｅＦ抗原をコードし、哺乳類、たとえば、ＣＨＯ細胞での発現についてコドンが最適化されている配列の異なった説明の非限定の例である。複製と発現を円滑にするために、核酸を、たとえば、原核又は真核の発現ベクターのようなベクターに組み入れることができる。組換えのＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含んでなる宿主も本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、たとえば、大腸菌のような原核生物（すなわち、細菌）の宿主細胞、並びに真菌（たとえば、酵母）細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ及びＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。
【００８９】
複製と発現を円滑にするために、核酸を、たとえば、原核又は真核の発現ベクターのようなベクターに組み入れることができる。本明細書で開示される核酸を種々のベクター（たとえば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスなどのようなウイルスＤＮＡを含んでなる）に含めることができるが、最も一般的には、ベクターはポリペプチドの発現産物を生成するのに好適な発現ベクターである。発現ベクターでは、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は通常、ｍＲＮＡ合成に向かう適切な転写制御配列（プロモータ及び任意で１以上のエンハンサ）の近傍に且つその方向で配置される。すなわち、当該のポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列に操作可能に連結される。そのようなプロモータの例にはＣＭＶの即時早期プロモータ、ＬＴＲ又はＳＶ４０のプロモータ、バキュロウイルスの多面体プロモータ、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモータ、ファージＴ７及びラムダＰＬプロモータ、及び原核細胞又は真核細胞又はウイルスにおける遺伝子の発現を制御する既知のそのほかのプロモータが挙げられる。発現ベクターは通常、翻訳開始及び転写停止のためのリボソーム結合部位も含有する。ベクターは任意で発現を増幅するための適当な配列を含んでなる。加えて、発現ベクターは任意で、１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んで、形質転換した宿主細胞の表現型形質を提供するが、たとえば、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、又は大腸菌におけるカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性若しくはアンピシリン耐性である。
【００９０】
発現ベクターは、たとえば、翻訳の効率を改善するための追加の発現要素も含んでなることができる。これらのシグナルには、たとえば、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が挙げられる。場合によっては、たとえば、翻訳開始コドン及び関連する配列要素を当該ポリヌクレオチド配列（たとえば、天然の開始コドン）と同時に適当な発現ベクターに挿入する。そのような場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、ポリペプチドをコードする配列又はその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含んでなる外因性の翻訳制御シグナルがＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の翻訳に提供される。開始コドンを正しい読み取りフレームに置いて当該ポリヌクレオチド配列の翻訳を確保する。外因性の転写要素及び開始コドンは種々の起源、天然及び合成由来であってもよい。所望であれば、使用中の細胞系に適したエンハンサを含めることによって発現の効率をさらに高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１２５‐６２ （１９９４）； Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６−５４４ （１９８７））。
【００９１】
一部の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸（たとえば、ベクター）は、宿主に導入された際、ＰｒｅＦをコードする核酸の発現を高める及び／又は最適化するように選択される１以上の追加の配列要素を含んでなる。たとえば、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、たとえば、ヒトのヘルペスウイルス５イントロン配列（たとえば、配列番号１３を参照）のようなイントロン配列を含んでなる。イントロンは、組換え構築物にて適切に配置されると相同性及びヘテロの核酸の発現を高めることが繰り返し明らかにされている。発現を高める別の部類の配列には、マトリクス連結領域（又はＭＡＲ）のような遺伝子外要素、又はＳＴＡＲ要素（たとえば、Ｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ. ２３：８０１‐８０７, ２００７で開示されたようなＳＴＡＲ）のような類似の遺伝子外要素が挙げられる。理論に束縛されないで、ＭＡＲは核マトリクスへの標的ＤＮＡ配列の固定の介在し、ヘテロクロマチンのコアから外に向かって延びるクロマチンループドメインを生成すると考えられている。ＭＡＲは明瞭なコンセンサス配列又は認識可能な配列を含有しないが、その最も一貫した特徴は、全体的に高いＡ／Ｔ含量と一方の鎖で優勢なＣ塩基であると思われる。これらの領域は、鎖を分離する傾向がある湾曲二次構造を形成すると思われ、鎖分離の核生成点として作用し得るコア巻き戻し要素を含んでなり得る。幾つかの単純なＡＴ−リッチ配列モチーフは、ＭＡＲ配列：たとえば、Ａ−ボックス、Ｔ−ボックス、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ−ボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）及び脊椎動物又はショウジョウバエのためのコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位と関連している。例となるＭＡＲ配列は、公開された米国特許出願第２００７０１７８４６９号及び国際特許出願ＷＯ０２／０７４９６９（参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている。ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の発現を高めるのに使用することができる追加のＭＡＲ配列には、ＧｉｒｏｄらのＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：７４７−７５３，２００７で開示されたニワトリのリゾチームＭＡＲ，ＭＡＲｐ１−４２、ＭＡＲｐ１−６、ＭＡＲｐ１−６８及びＭＡＲｐｘ−２９（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号、ＥＡ４２３３０６、ＤＩ１０７０３０、ＤＩ１０６１９６、ＤＩ１０７５６１及びＤＩ１０６５１２）が挙げられる。当業者は、ＭＡＲ１〜９で報告されているように、中程度のレベルの増強を生じるＭＡＲを選択することによって発現をさらに調節できることを十分に理解するであろう。所望であれば、たとえば、ＭＡＲ−ファインダー（ウエブ：ｆｕｔｕｒｅｓｏｆｔ．ｏｒｇ／ＭａｒＦｉｎｄｅｒにて利用可能）、ＭＡＲテスト（ウエブ：ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅで利用可能）又はＳＭＡＲスキャンＩ（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：５８２‐５９２, １９９９）のようなソフトウエアを用いて配列データベースを検索することによって、ＰｒｅＦ抗原の発現を高める代替のＭＡＲ配列を特定することができる。特定の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードする配列と同じ核酸（たとえば、ベクター）上で宿主細胞に導入される（たとえば、形質移入される）。代替の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に同時統合することができる別の核酸（たとえば、トランスで）上で導入される。
【００９２】
組換えＰｒｅＦ抗原核酸の産生を介して当業者を導くのに十分な例となる手順は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１；ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（及び２００３年の補足）；並びにＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９に見い出すことができる。
【００９３】
ＰｒｅＦ抗原をコードする例となる核酸は配列番号５、７，９，１２，１３，１７，１９及び２１によって表される。たとえば、配列番号２の５００位に対応するアミノ酸にてグリコシル化部位に修飾を含んでなる変異体は、１４０８〜１４１４位（たとえば、配列番号１２、たとえば、配列番号１７及び２１のポリヌクレオチドに比べて）の近傍でヌクレオチドを変える（たとえば、変異させる）ことによって作出することができる。グリコシル化の変異体（たとえば、グリコシル化効率を高める）をコードするヌクレオチドの好適な配列には、ａａｃｇｇｇｔ、ａａｃａａｇｔ、ａａｃｇｇｇａ及びａａｃａａｇａが挙げられる。グリコシル化部位を除去する、たとえば、ｃａｇｃａｇｔのような代替配列も可能である。たとえば、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示されたような既知の（若しくはその後）発見されたＲＶＳの株から選択される類似のＦ及びＧのタンパク質ポリペプチド配列を組み合わせることによって追加の変異体を作出することができる。例となる変異体と配列同一性を共有する追加の配列変異体は当業者によって作出することができる。通常、核酸変異体は、アミノ酸残基の１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％以下で異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされたポリペプチドは、配列番号９、１１及び１３の１つと少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には少なくとも９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。ＰｒｅＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの重複性のために自体低い配列同一性を共有することは当業者によって直ちに理解される。一部の例では、ＰｒｅＦ抗原は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に比べて１以上のアミノ酸修飾を有する（たとえば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差異は、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の付加、欠失又は置換であり得る。変異体は通常、ヌクレオチド残基の約１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％以下で異なる。たとえば、変異体ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）の核酸は、配列番号５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２２の例となるＰｒｅＦ抗原核酸と比べて、１又は２、又は５までの、又は約１０までの、又は約１５までの、又は約５０までの、又は約１００までのヌクレオチドの差異を含んでなることができる。従って、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質又はＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）の核酸の文脈における変異体は通常、参照配列、たとえば、配列番号１，３、５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２２で説明される参照配列、又は本明細書で開示されるそのほかの例となるＰｒｅＦ抗原の核酸と少なくとも９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。本開示の特徴として含まれる追加の変異体は、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示された天然に存在する変異体から選択されるヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）である。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である
【００９４】
上述した変異体核酸に加えて、配列番号１，３，５，７、９、１２、１３，１７，１９又は２１によって表される例となる核酸の１以上とハイブリダイズする核酸もＰｒｅＦ抗原をコードするのに使用することができる。当業者は、上記で議論した％配列同一性の測定に加えて、２つの核酸の間の配列類似性の別の証は、ハイブリダイズする能力であることを十分に理解するであろう。２つの核酸の配列が似ていればいるほど、それらがハイブリダイズする条件はさらにストリンジェントである。ハイブリダイズ条件のストリンジェント性は、配列に依存し、異なった環境パラメータのもとで異なる。従って、ストリンジェント性の特定の程度を生じるハイブリダイズ条件は、選択するハイブリダイズ方法の性質及び組成物及びハイブリダイズする核酸配列の長さによって変化する。一般に、洗浄回数もストリンジェント性に影響するが、ハイブリダイズの温度及びハイブリダイズ緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋の濃度）がハイブリダイズのストリンジェント性を決定する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義したイオン強度とｐＨにて特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜２０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく一致したプローブとハイブリダイズする温度（定義したイオン強度とｐＨにて）である。核酸のハイブリダイズの条件及びストリンジェント性の算出は、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ，ＮＹ，１９９３及びＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に見い出すことができる。
【００９５】
本開示の目的で、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズ分子と標的配列の間で２５％未満のミスマッチがある場合ハイブリダイズが生じる条件を包含する。さらに正確な定義のためにストリンジェント性の特定のレベルに「ストリンジェントな条件」を分類することができる。従って、本明細書で使用されるとき、「穏やかなストリンジェント性」の条件は、２５％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものであり、「中程度のストリンジェント性」の条件は、１５％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものであり、「高いストリンジェント性」の条件は、１０％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものである。「非常に高いストリンジェント性」の条件は、６％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものである。それに対して、「低いストリンジェント性」の条件でハイブリダイズする核酸には、非常に低い配列同一性を持つもの又は核酸のほんの短い配列のみの配列同一性を持つものが挙げられる。従って、本開示に包含される核酸の種々の変異体は、少なくとも、Ｆタンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインをコードする部分にわたって、配列番号１、３及び５の少なくとも１つとハイブリダイズできることが理解されるであろう。たとえば、そのような核酸は、配列番号１，３，５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２１の少なくとも１つの実質的に全長にわたってハイブリダイズすることができる。
【００９６】
ＲＳＶ抗原性ポリペプチドの製造方法
組換えタンパク質の発現及び精製について定評のある手順を用いて、本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原及び適宜、Ｇ抗原も含んでなる）を製造する。当業者を導くのに十分な手順は以下の文献で見つけることができる：ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００；及びＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，９９９。追加の及び特定の詳細は以下に提供される。
【００９７】
ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸はベクター及び宿主細胞の選択に応じて、種々の周知の手順、たとえば、エレクトロポレーション、リポソーム介在性形質移入（たとえば、市販のリポソーム形質移入剤、たとえば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００又はＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）を用いた）、リン酸カルシウム沈殿、感染、形質移入などによって、宿主細胞に導入される。ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）をコードする例となる核酸は、配列番号１，３，５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２１に提供される。当業者は、配列番号１，３，５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２１が例示であって、限定を意図しないことを十分に理解するであろう。たとえば、配列番号５，７及び９（たとえば、配列番６，８及び１０で表される）と同じタンパク質をコードするが、遺伝子コードの重複性（たとえば、配列番号１２で示される代替のコドン最適化）によってのみ異なるポリヌクレオチド配列を、配列番号５，７及び９の例となる配列の代わりに容易に使用することができる。同じことが配列番号１７，１９及び２１で当てはまる。同様に、配列番号１３で説明されるような内部に位置するイントロンのような（又はプロモータ、エンハンサ、イントロン若しくは同様の要素の添加によって）発現を高める要素を含んでなるポリヌクレオチド配列を採用することができる。当業者は、そのような修飾の組み合わせが同様に好適であることを認識するであろう。同様に、ＲＳＶのＡ株若しくはＲＳＶのＢ株から選択される相同の配列、及び／又は上記で議論したような実質的な配列同一性を共有するそのほかの配列を用いてＰｒｅＦ抗原を発現させることもできる。実際、以前開示された変異体核酸のいずれかを好適に宿主に導入し、用いてＧタンパク質が適用可能であるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）を作出することができる。
【００９８】
たとえば、特定の例では、たとえば、（配列番号２、たとえば、配列番号１７に関して）５００位のアミノ酸の近傍で１以上のアミノ酸の置換によって上述されるようなグリコシル化パターンを変化させるために変異体の核酸を修飾する。たとえば、切断認識部位を修飾することと組み合わせてグリコシル化パターンを修飾することは、細胞培養にてＰｒｅＦ抗原の産生を高めることが分かっている。そのような場合、組換えＰｒｅＦ抗原を発現させ、単離するために以下で記載される方法は、上述のように、任意で１以上の切断部位（たとえば、非フリン又はフリン切断認識部位）を修飾することと組み合わせてグリコシル化認識部位の１以上のアミノ酸を置換することによってＰｒｅＦ抗原のグリコシル化パターンを変えることによりＰｒｅＦ抗原の産生を高める工程を提供する。
【００９９】
組換えのＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含んでなる宿主細胞も従って本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、たとえば、大腸菌のような原核細胞（たとえば、細菌）宿主細胞、並びに真核細胞（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母）、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞）を含んでなる多数の真核宿主細胞が挙げられる。組換えのＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、たとえば、発現ベクターのようなベクターを介して宿主細胞に導入される（たとえば、形質伝達、形質転換又は形質移入される）。上述のように、ベクターは最も通常ではプラスミドであるが、そのようなベクターは、たとえば、ウイルス粒子やファージ等であり得る。適切な発現宿主の例には、たとえば、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａのような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３又はＢｏｗｅｓメラノーマのような哺乳類細胞；藻類細胞を含んでなる植物細胞が挙げられる。一部の例では、一時的に形質移入した細胞を用いて組換えＰｒｅＦ抗原を産生することができる。特定の実施形態では、安定的に統合されたＰｒｅＦ核酸を有する細胞（たとえば、クローン）を選択し、用いて組換えＰｒｅＦ抗原を産生する。
【０１００】
プロモータを活性化し、形質転換体を選抜し、挿入したポリヌクレオチド配列を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地にて宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、通常、発現のために選択された宿主細胞と共に以前使用されたものであり、たとえば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそれに引用された文献を含んでなる本明細書で引用された文献にて当業者に明らかであろう。任意で、無血清培地及び／又は動物生成物を含まない培地で宿主細胞を培養する。
【０１０１】
本発明の核酸に対応する発現産物は、たとえば、植物、酵母、真菌、細菌等のような非動物細胞での産生することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅらの（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）並びにＡｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬで見つけることができる。
【０１０２】
細菌の系では、発現される産物の用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体の産生について大量のポリペプチド又はその断片を必要とする場合、精製しやすい融合タンパク質の高レベル発現を指向するベクターを好都合に採用する。そのようなベクターには、当該コーディング配列、たとえば、上述のような本発明のポリヌクレオチドがアミノ末端翻訳開始メチオニンと触媒上活性のあるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を生じるβ−ガラクトシダーゼの７残基についての配列を伴ってインフレームでベクターに連結され得るＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能の大腸菌のクローニング及び発現のベクター；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、原核細胞、たとえば、大腸菌細胞での導入と発現に好適なベクターを介して核酸を細胞に導入する。たとえば、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸を、たとえば、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（たとえば、ｐＥＴ９ｂ及びｐＥＴ２ｄ）のような種々の市販の又は独占所有権のあるベクターに導入することができる。コーディング配列の発現はＩＰＴＧによって誘導可能であり、高いレベルのタンパク質発現を生じる。ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモータのもとで転写される。熱誘導可能なラムダｐＬプロモータを含んでなるｐＵＲＶ２２のような代替ベクターも好適である。
【０１０３】
発現ベクターを好適な細菌宿主に導入する（たとえば、エレクトロポレーションによって）。多数の好適な大腸菌株が利用可能であり、当業者によって選択することができる（たとえば、Ｒｏｓｅｔｔａ株及びＢＬ２１（ＤＥ２）株は、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えベクターの発現に好都合であることが分かっている）。
【０１０４】
同様に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的な又は誘導可能なプロモータを含有する多数のベクターが所望の発現産物の製造に使用される。概説については、Ｂｅｒｇｅｒ，Ａｕｓｕｂｅｌ、及びたとえば、Ｇｒａｎｔらの（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４）を参照のこと。哺乳類の宿主細胞では、プラスミド及びウイルスに基づいた系の双方を含んでなる多数の発現系を利用することができる。
【０１０５】
別の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞に導入される。昆虫細胞を感染させることが可能な組換えバキュロウイルスは、たとえば、 ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅからのＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系のような市販のベクター、キット及び／又は系を用いて生成することができる。手短には、抗原をコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｖＳＧ２転移ベクターに挿入する。次いで、ｐＡｖＳＧ２キメラプラスミドと、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）の線状化ゲノムＤＮＡを含有するＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄによって宿主細胞ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に同時形質移入する。形質移入に続いて、ｐＡｖＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが生じて組換えウイルスを生成する。一例では、ＰｒｅＦ抗原は多面体プロモータ（ｐＨ）の通常制御のもとで発現される。他のプロモータ、たとえば、塩基性（Ｂａ）プロモータ及びｐ１０プロモータを用いて同様の転移ベクターを作出することができる。同様に、たとえば、Ｓｆ９に密接に関連するＳＦ２１及びイラクサギンウワバＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来するハイファイブ細胞株のような代替の昆虫細胞を採用することができる。
【０１０６】
さらに通常、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞（たとえば、昆虫細胞又は哺乳類細胞）での導入と発現に好適である発現ベクターに導入される。好都合には、そのような核酸は、選択されるベクター／宿主細胞での発現についてコドンが最適化される（たとえば、配列番号５，７，９，１２，１３，１７，１９及び２１で説明される配列は、ＣＨＯ細胞での発現についてコドンが最適化される）。例となる一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社によって開発されたｐＥＥ１４ベクターのようなベクターに導入される。たとえば、即時早期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモータのような構成的なプロモータのもとでポリペプチドが発現される。ポリペプチドを発現する安定的に形質移入された細胞の選抜は、グルタミン源の非存在下で増殖する形質移入細胞の能力に基づいて為される。上手くｐＥＥ１４を統合した細胞は、ｐＥＥ１４ベクターがＧＳ（グルタミン合成酵素）酵素を発現するので、外因性グルタミンの非存在下で増殖することができる。選抜された細胞はクローンで増殖し、所望のＰｒｅＦポリペプチドの発現を特徴とする。
【０１０７】
挿入した配列の発現を調節する能力又は発現されたタンパク質を所望の方法で処理する能力について宿主細胞を任意で選択する。そのようなタンパク質の修飾には、グリコシル化（同様に、たとえば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化）が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、前駆体形態をタンパク質の成熟形態に切断する（たとえば、フリンプロテアーゼによって）翻訳後プロセッシングは、宿主細胞の文脈で任意で実施される。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等のような様々な宿主細胞はそのような翻訳後活性について特定の細胞性の機構及び特徴的なメカニズムを有し、導入される外来タンパク質の正確な修飾を確保するように選択することができる。
【０１０８】
本明細書で開示される組換えＰｒｅＦＦ抗原の長期間の高収率の産生のために、安定的な発現系が通常使用される。たとえば、ウイルスの複製開始点又は内因性発現要素及び選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを用いて、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドを安定的に発現する細胞株が宿主細胞に導入される。ベクターの導入に続いて、選抜培地に移す前に細胞を強化培地で１〜２日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、その存在によって、導入配列を上手く発現する細胞の増殖と回収が可能になる。たとえば、細胞種に適した組織培養法を用いて、安定的に形質転換された細胞の耐性群又は耐性コロニーを増殖させることができる。細胞培養からのコードしたタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を任意で培養する。上記で示したように、所望であれば、宿主細胞を無血清（及び／又は動物生成物を含まない）培地で培養することができる。
【０１０９】
好適な細胞株の形質伝達と適当な細胞密度への宿主細胞の増殖に続いて、選択したプロモータを適当な手段（たとえば、温度シフト又は化学誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。任意で、培地は、プロテイナーゼによる発現タンパク質の分解を低下させる成分及び／又は添加剤を含んでなる。たとえば、ＰｒｅＦ抗原を産生する細胞を培養するのに使用される培地は、たとえば、キレート剤又は小分子阻害剤（たとえば、ＡＺ１１５５７２７２、ＡＳ１１１７９３等）のようなプロテアーゼ阻害剤を含んで細胞性の又は細胞外（たとえば、マトリクス）のプロテイナーゼによる望ましくない切断を減らす又は消失させることができる。
【０１１０】
分泌されたポリペプチド産物を次いで培養培地から回収する。或いは、遠心によって細胞を回収し、物理的な又は化学的な手段によって粉砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現で採用した真核細胞又は微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、機械的粉砕、又は細胞溶解剤の使用、又は当業者に周知のそのほかの方法を含んでなる従来の方法によって粉砕することができる。
【０１１１】
硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、濾過、限外濾過、遠心分離、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、リンセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（たとえば、本明細書で言及されるタグ方式を使用した）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含んでなる当該技術で周知の多数の方法によって、組換え細胞培養から発現されたＰｒｅＦ抗原を回収し、精製することができる。所望のように、成熟タンパク質の立体構造を完成することにおいてタンパク質の再折り畳み工程を使用することができる。最終的に、最終精製工程にて高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を採用することができる。上記で言及された参考文献に加えて、たとえば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；及びＢｏｌｌａｇらの（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；並びにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪで言及されたものを含んでなる種々の精製方法が当該技術で周知である。
【０１１２】
例となる一実施形態では、ＰｒｅＦタンパク質は、以下の精製スキームに従って細胞から回収される。ＰｒｅＦポリペプチドをコードする組換え核酸のＣＨＯ細胞への導入に続いて、一時的に形質移入された宿主細胞又は導入されたポリヌクレオチドを含んでなる増殖した安定な集団を培地にて、所望の目的に許容できる規模で増殖に好適な条件下で増殖させる（たとえば、一般にＦｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ, ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ, ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそこで引用された文献に記載されたように）。通常、細胞は、振盪フラスコ又は生物反応器にて無血清培地で増殖させ、２〜３日間隔で継代する。これらの条件で増殖した細胞から樹立した新しい培養を通常生物反応器にて無血清培地で実施し、ＰｒｅＦ抗原を産生させるために２０％にて維持されたｐＯ２と共に２７℃にて５〜７日間インキュベートする。
【０１１３】
組換えＰｒｅＦ抗原を回収するには、細胞培養物を遠心し、細胞培養上清をさらなる使用までマイナス７０℃にて保存する。培養上清の融解に続いて、上清をＭｉｌｌｉＱ水にて２倍に希釈し、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整する。２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＢＰＧ１４０／５００カラムに詰めた３ＬＣＭセラミックＨｙｐｅｒＤＦＦ樹脂に希釈した上清を７５ｃｍ／時間で負荷する。試料の負荷後、平衡緩衝液をカラムに通し、ＵＶのベースラインに戻す。２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０のカラム容積（ＣＶ）の５倍で洗浄した後、０．１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１１４】
ＣＭＨｙｐｅｒＤ溶離液を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で３．３倍に希釈し、２０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した２７０ｍｌのハイドロキシアパタイト２型カラム（ＸＫ ５０に詰めた）にて５０ｍＬ／分で処理する。平衡緩衝液（〜３ＣＶ）でカラムを洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１１５】
２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した１５０ｍｌのＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅカラム（ＸＫ２６に詰めた）にてＨＡ溶離液を１５ｍｌ／分（樹脂との１０分間の接触に留意して）で処理する。０．１Ｍのアルギニン緩衝液を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０の５ＣＶで洗浄した後、０．６Ｍのアルギニン緩衝液を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１１６】
次いで、分取用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムで処理するためにＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ溶離液を約１０倍に濃縮する。５０ｋＤのペリコンポリエーテルスルホン膜を用いて濃縮を行う。ＳＥＣカラムで処理する前に、ウイルス清浄工程で用いたＰＬＡＮＯＶＡ ２０Ｎ １００ ｃｍ２のフィルターを介して物質を濾過する。このナノ濾過工程は、ペリコン膜での濃縮の前又は後のいずれかに置くことができる。
【０１１７】
次いで５００ｍＬのＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００カラムと移動相としての１０ｍＭのリン酸塩（Ｎａ／Ｋ２）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ６．５緩衝液（最終緩衝液に対応する）を用いて分取用ＳＥＣを行う。ＳＥＣカラム容積の５％に対応する濃縮ＰｒｅＦの容積を約２．６ｍｌ／分で樹脂に負荷する。通常、１０ｍｌの分画を回収する。ＨＣＰレベルをできるだけ抑える一方で収率を最適化するのが所望であれば、銀染色によるＳＤＳゲル及び抗ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）のウエスタンブロットにて分画の分析プールを分析することができる。
【０１１８】
０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（代わりにＳｔｅｒｉｖｅｘフィルターを使用することができる）での濾過の後、精製されたバルクが得られる。所望であれば、精製したＰｒｅＦ抗原調製物を使用に先立ってマイナス７０℃で保存することができる。
【０１１９】
或いは、ＰｒｅＦタンパク質はポリヒスチジン（たとえば、６個のヒスチジン）を含んでなることができ、それを用いて精製を円滑にすることができる。そのようなヒスチジンのタグを付けたＰｒｅＦポリペプチドについては、以下の精製プロトコールが採用される。固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を用いた精製に先立って、細胞培養上清を緩衝液Ａ（２０ｍＭのビシン、ｐＨ８．５）で２倍に希釈し、ｐＨを８．５に合わせる。予め緩衝液Ａで平衡化した２３ｍｌのカラム容量のＱセファロースＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に得られた溶液を負荷する。一部の宿主細胞の混入と共にＰｒｅＦタンパク質をカラムに捕捉させる。ＩＭＡＣ精製工程を妨害する培養培地成分は保持されず、流水中で排除される。タンパク質は分離され、２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌの段階的溶出によって溶出される。当該のＰｒｅＦタンパク質は、２００ｍＭのＮａＣｌでの最初の段階の間に溶出される。任意で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタグ付いたＰｒｅＦタンパク質を検出する抗Ｈｉｓ−タグ抗体を用いたウエスタンブロットを用いて回収をモニターすることができる。精製を継続するのに先立って分画をプールすることができる。
【０１２０】
（プールされた）ＰｒｅＦタンパク質を含有する溶離液を緩衝液Ｂ（２０ｍＭのビシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で３倍に希釈し、ｐＨを８．３に合わせる。予め緩衝液Ｂで平衡化した（たとえば、５ｍｌのカラム容量）、塩化ニッケルを負荷したＩＭＡＣセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に得られた溶液を負荷する。ＰｒｅＦは樹脂に結合し、宿主細胞の混入物の大半は流水で溶出される。弱く結合した混入物を除くために２０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄する。２５０ｍＭのイミダゾールの一段階でＰｒｅＦタンパク質を溶出する。クマシーブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＨＩｓタグのウエスタンブロットを行って陽性分画を特定する。
【０１２１】
次いでセントリコン濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＩＭＡＣからのプールを少なくとも１５０μｇ／ｍｌの濃度に濃縮することができ、５００ｍＭのＬ−アルギニンを補完したＰＢＳ緩衝液にてタンパク質を透析することができる。得られたタンパク質を、ＲＣＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、使用まで−７０℃又は−８０℃で保存する。
【０１２２】
免疫原性組成物及び方法
提供されるのはまた、上記で開示されたＰｒｅＦ抗原（たとえば、配列番号６，８，１０，１８，２０及び２２によって例示されるもの）と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含んでなる免疫原性組成物である。
【０１２３】
特定の実施形態では、通常、ＰｒｅＦ抗原がＧタンパク質成分（たとえば、配列番号６）を含まない実施形態では、免疫原性組成物は、単離された組換えの及び／又は精製されたＧタンパク質を含んでなることができる。多数の好適なＧタンパク質が当該技術で記載されており、完全長の組換えＧタンパク質及びＧタンパク質の一部（たとえば、アミノ酸番号１２８〜２２９又は１３０〜２３０）で構成されるキメラタンパク質及び融合相手（たとえば、チオレドキシン）又は発現及び／又は精製を円滑にするシグナル配列及び又はリーダー配列が挙げられる。ＰｒｅＦ抗原との混合物で使用するための例となるＲＳＶのＧタンパク質は、ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７、ＷＯ２００８１１４１４９、米国特許第５，１４９，６５０号、同第６，１１３，９１１号、米国公開出願２００８０３００３８２及び米国特許第７，３６８，５３７号にて見つけることができ、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み入れられる。キメラＰｒｅＦ−Ｇタンパク質に関して示されるように、アミノ酸番号１４９〜２２９の間の部分又は約１２８〜約２２９の間の部分のようなＧタンパク質のさらに小さな断片を、ＰｒｅＦ（Ｇを含まない）とＧを含んでなる混合物の文脈にて好都合に採用することができる。上記で議論されたように、重要な配慮は、たとえば、アミノ酸番号１８３〜１９７の領域内に含まれる免疫優勢エピトープである。或いは、そのような組成物に完全長のＧタンパク質が採用され得る。
【０１２４】
薬学上許容可能なキャリア及び賦形剤は当業者に周知であり、当業者によって選択され得る。たとえば、キャリア又は賦形剤は好都合には緩衝液を含んでなることができる。任意で、キャリア又は賦形剤は、溶解性及び又は安定性を安定化させる少なくとも１つの成分も含有する。可溶化剤／安定剤の例には界面活性剤、たとえば、ラウレルサルコシン及び／又はツイーンが挙げられる。代替の可溶化剤／安定剤には、アルギニン及びガラス形成ポリオール（たとえば、スクロース、トレハロース等）が挙げられる。多数の薬学上許容可能なキャリア及び／又は薬学上許容可能な賦形剤が当該技術で既知であり、たとえば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第５版（１９７５）に記載されている。
【０１２５】
従って、好適な賦形剤及びキャリアが当業者によって選択され、選択された投与経路によって対象に送達するために好適な製剤を製造することができる。
【０１２６】
好適な賦形剤には、限定しないで、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、酸化トリメチルアミン、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそのほかの二価のカチオン関連塩、ジチオスレイトール、ジチオエリトール、及びβ−メルカプトエタノールが挙げられる。そのほかの賦形剤は、界面活性剤（ツイーン８０、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０、エンピゲンＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含んでなる）であり得る。
【０１２７】
任意で、免疫原性組成物はアジュバントも含んでなる。ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発する目的で対象に投与するのに好適な免疫原性組成物の文脈で、アジュバントを選択して、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を特徴とする、Ｔｈ１に偏った免疫応答又はＴｈ１／Ｔｈ２の釣り合った免疫応答を誘発する。
【０１２８】
通常、アジュバントを選択して、組成物が投与される対象又は対象において、ＩＦＮ−γの分泌を特徴とするＴｈ１に偏った免疫応答（又は、Ｔｈ１／Ｔｈ２の釣り合った免疫応答）を高める。たとえば、ＲＳＶ感染に感受性の（又はリスクが高い）特定の年齢群の対象に免疫原性組成物を投与すべき場合、対象及び対象の集団にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。従って、高齢者対象（たとえば、６５歳を超える対象）での投与用にＲＳＶのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を製剤化する場合、高齢者対象にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。同様に、ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物が、新生児又は乳児の対象（出生から２歳までの対象）に投与することを意図される場合、新生児及び乳児にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。新生児及び幼児における安全性と有効性のために選択されるアジュバントの場合、成人に通常投与される用量の希釈（たとえば、画分用量）であるアジュバントの用量を選択することができる。
【０１２９】
さらに、免疫原性組成物が投与される投与の経路を介して投与される場合、アジュバントは通常、Ｔｈ１免疫応答を高めるように選択される。たとえば、鼻内投与用にＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を製剤化する場合、プロテオソーム及びプロトリンが好都合なＴｈ１に偏ったアジュバントである。それに対して、免疫原性組成物を筋肉内投与用に製剤化する場合、１以上の３Ｄ−ＭＰＬ、スクワレン（たとえば、ＱＳ２１）、リポソーム及び／又は油と水のエマルションを含んでなるアジュバントが好都合に選択される。
【０１３０】
ＰｒｅＦ抗原との併用で使用するために好適なアジュバントの１つは、非毒性の細菌性リポ多糖類誘導体である。脂質Ａの好適な非度屈性誘導体の例は、モノホスホリル脂質Ａ、さらに詳しくは３−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。３Ｄ−ＭＰＬは、ＭＰＬの名称のもとでＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｎ．Ａ．によって販売され、文書全体を通してＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬと呼ばれる。米国特許第４，４３６，７２７；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号及び同第４，９１２，０９４号を参照のこと。３Ｄ−ＭＰＬは、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１Ａで開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは、３，４，５又は６のアシル化鎖を持つ３−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用することができる。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍのフィルターを介して無菌濾過できるような粒度を有する。そのような調製物はＷＯ９４／２１２９２に記載されている。
【０１３１】
３Ｄ−ＭＰＬのようなリポ多糖類は、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。そのような３Ｄ−ＭＰＬは、約２５μｇのレベルで、たとえば、２０〜３０μｇの間で、好適には２１〜２９μｇの間で、又は２２〜２８μｇの間で、又は２３〜２７μｇの間で、又は２４〜２６μｇの間で、又は２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベルで、たとえば、５〜１５μｇの間で、好適には６〜１４μｇの間で、たとえば、７〜１３μｇの間で、又は８〜１２μｇの間で、又は９〜１１μｇの間で、又は１０μｇのレベルで３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇのレベルで、たとえば、１〜９μｇの間で、又は２〜８μｇの間で、好適には３〜７μｇの間で、又は５μｇのレベルで３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。
【０１３２】
他の実施形態では、リポ多糖類は、米国特許第６，００５，０９９号及び欧州特許第０７２９４７３Ｂ１号に記載されたようにβ（１〜６）グルコサミン二糖類であり得る。当業者は、これらの参考文献の教示に基づいて３Ｄ−ＭＰＬのような種々のリポ多糖類を容易に製造することができる。それにもかかわらず、これら参考文献のそれぞれは、参照によって本明細書に組み入れられる。前述の免疫賦活剤（ＬＰＳ又はＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬに似た構造の）に加えて、ＭＰＬの上記構造の一部であるアシル化された単糖類及び二糖類の誘導体も好適なアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは脂質Ａの合成誘導体であり、その一部は、ＴＬＲ−４作動薬として記載され、ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲノホスフェート）、（ＷＯ９５／１４０２６）；ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール、１，１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）（ＷＯ９９／６４３０１及びＷＯ００／０４６２）；及びＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ｄｉｏｌ、１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）（ＷＯ０１／４６１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
使用することができるそのほかのＴＬＲ４リガンドは、たとえば、ＷＯ９８／５０３９９又は米国特許第６，３０３，３４７号で開示された（ＡＧＰの調製方法も開示されている）もののようなアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰｓ）であり、好適には、ＲＣ５２７若しくはＲＣ５２９、又は米国特許第６，７６４，８４０号で開示されたようなＡＧＳの薬学上許容可能な塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ４の作動薬であり、一部はＴＬＲ４の拮抗剤である。双方共アジュバントとして有用であると思われる。
【０１３４】
ＴＬＲ−４を介したシグナル伝達反応（Ｓａｂｒｏｅ ｅｔ ａｌ, ＪＩ ２００３ ｐ１６３０−５）を起こすことが可能であるそのほかの好適なＴＬＲ−４リガンドは、たとえば、グラム陰性細菌に由来するリポ多糖類及びその誘導体又はその断片、特にＬＰＳの非毒性誘導体（たとえば、３Ｄ−ＭＰＬ）である。そのほかの好適なＴＬＲ作動薬は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５又は９０；界面活性剤プロテインＡ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチド及びｂ−デフェンシン−２、及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である。一実施形態では、ＴＬＲ作動薬はＨＳＰ６０，７０又は９０である。ほかの好適なＴＬＲ−４リガンドは、ＷＯ２００３／０１１２２３及びＷＯ２００３／０９９１９５に記載されており、たとえば、ＷＯ２００３／０１１２２３の４〜５ページ又はＷＯ２００３／０９９１９５の３〜４ページで開示された化合物Ｉ、化合物ＩＩ及び化合物ＩＩＩ、特にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０及びＥＲ８０４７６４としてＷＯ２００３／０１１２２３で開示されたそれら化合物である。たとえば、好適なＴＬＲ−４リガンドの１つはＥＲ８０４０５７である。
【０１３５】
追加のＴＬＲ作動薬もアジュバントとして有用である。用語「ＴＬＲ作動薬」は、直接的なリガンドとして又は内因性若しくは外因性のリガンドの生成を介して間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介したシグナル伝達反応を起こすことが可能である剤を指す。そのような天然の又は合成のＴＬＲ作動薬は、代わりの又は追加のアジュバントとして使用することができる。アジュバント受容体としてのＴＬＲの役割の手短な概説は、Ｋａｉｓｈｏ及びＡｋｉｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５８９：１−１３，２００２に提供されている。これらの潜在的なアジュバントには、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９についての作動薬が挙げられるが、これらに限定されない。従って、一実施形態では、アジュバント及び免疫原性組成物はさらに、ＴＬＲ−１作動薬、ＴＬＲ−２作動薬、ＴＬＲ−３作動薬、ＴＬＲ−４作動薬、ＴＬＲ−５作動薬、ＴＬＲ−６作動薬、ＴＬＲ−７作動薬、ＴＬＲ−８作動薬、ＴＬＲ−９作動薬又はこれらの組み合わせから成る群から選択されるアジュバントを含んでなる。
【０１３６】
本発明の一実施形態では、ＴＬＲを介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲを介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、トリアシル化リポペプチド（ＬＰｓ）；フェノール可溶性モジュリン；結核菌ＬＰ；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ、細菌性リポタンパク質のアシル化アミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰ及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ由来のＯｓｐＡ ＬＰから選択される。
【０１３７】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、Ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ又はＴ ｐａｌｌｉｄｕｍに由来するリポタンパク質、ペプチドグリカン、細菌性リポペプチド；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含んでなる種に由来するペプチドグリカン；リポタイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアポリン、細菌性フィムブリエ、エルシニア毒性因子、ＣＭＶビリオン、麻疹血液凝集素及び酵母由来のザイモサンの１以上である。
【０１３８】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリＩＣ）、ウイルス感染に関連する分子核酸パターンである。
【０１３９】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、細菌性フラジェリンである。
【０１４０】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、抗酸菌性リポタンパク質、脱アシル化ＬＰ、及びフェノール可溶性モジュリンである。追加のＴＬＲ６作動薬はＷＯ２００３／０４３５７２に記載されている。
【０１４１】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、Ｎ７位及びＣ８位におけるグアノシン類似体、又はイミダゾキノリン化合物若しくはその誘導体である。一実施形態では、ＴＬＲ作動薬はイミキモドである。さらなるＴＬＲ７作動薬はＷＯ２００２／０８５９０５に記載されている。
【０１４２】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を持つイミダゾキノリン分子、たとえば、レシキモド（Ｒ８４８）であり；レシキモドもＴＬＲ−７による認識が可能である。使用することができるそのほかのＴＬＲ−８作動薬には、ＷＯ２００４／０７１４５９に記載されたものが挙げられる。
【０１４３】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。一実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、ＨＳＰ９０である。或いは、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、細菌性又はウイルス性のＤＮＡであり、ＤＮＡは、特にＣｐＧモチーフとして知られる配列の文脈にて非メチル化ＣｐＧ分子を含有する。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドはＴｈ１反応を優勢に誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、たとえば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８及び米国特許第６，００８，２００号及び同第５，８５６，４６２号に記載されている。好適には、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物で使用するのに好適なオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ、好適には少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離される２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを任意で含有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧモチーフは、グアニンヌクレオチドが後に続くシトシンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは通常、デオキシヌクレオチドである。特定に実施形態では、ホスホジエステル結合及びそのほかのヌクレオチド間結合は本発明の範囲内であるが、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間はホスホロジチオエート結合又は好適にはホスホロチオエート結合である。また本発明の範囲内に含まれるのは混合されたヌクレオチド間結合を伴うオリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを作製する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号及びＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０１４４】
たとえば、それ自体に又は３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせでＰｒｅＦ抗原を伴う免疫原性組成物で使用することができるそのほかのアジュバントは、たとえば、ＱＳ２１のようなサポニンである。
【０１４５】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ及びＷａｇｎｅｒ，Ｈ．（１９９６. Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ. Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ ３６３‐３８６）にて教示されている。サポニンは、植物界及び海洋動物界に広く分布するステロイド又はトリテルペングリコシドである。サポニンは、振盪すると泡立つコロイド状水溶液を形成し、コレステロールを沈殿させることについて言及される。サポニンは細胞膜の近傍にあると、膜を破裂させる膜における孔様の構造を創る。赤血球の溶血はこの現象の例であり、それは、サポニンすべてではないが、特定のサポニンの特性である。
【０１４６】
サポニンは、全身性投与用のワクチンでアジュバントとして知られる。個々のサポニンのアジュバント活性と溶血活性は当該技術で広範に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、上記）。たとえば、クイルＡ（南米の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来する）及びその分画は米国特許第５，０５７，５４０号及び“Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”、Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）：１−５５；及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている。クイルＡの分画を含んでなる免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒子状の構造は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ, Ｂ., ＥＰ ０ １０９ ９４２ Ｂ１； ＷＯ ９６／１１７１１； ＷＯ ９６／３３７３９）。溶血性のサポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（クイルＡのＨＰＬＣ精製した分画）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されており、それらは参照によって本明細書に組み入れられる。全身性ワクチンの研究で使用されているそのほかのサポニンには、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ及びＳａｐｏｎａｒｉａ（Ｂｏｍｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ., Ｖａｃｃｉｎｅ, １０（９）：５７２‐５７７, １９９２）のような植物種に由来するものが挙げられる。
【０１４７】
ＱＳ２１は、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するＨＰＬＣ精製した非毒性の分画である。ＱＳ２１の製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０に開示されている。ＱＳ２１を含有する非反応源性のアジュバント製剤はＷＯ９６／３３７３９に記載されている。前述の参考文献は参照によって本明細書に組み入れられる。ＱＳ２１のような前記免疫学的に活性のあるサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。有利なことに、ＱＳ２１は、約２５μｇのレベルで、たとえば、２０〜３０μｇの間で、好適には２１〜２９μｇの間で、又は２２〜２８μｇの間で、又は２３〜２７μｇの間で、又は２４〜２６μｇの間で、又は２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベルで、たとえば、５〜１５μｇの間で、好適には６〜１４μｇの間で、たとえば、７〜１３μｇの間で、又は８〜１２μｇの間で、又は９〜１１μｇの間で、又は１０μｇのレベルでＱＳ２１を含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇのレベルで、たとえば、１〜９μｇの間で、又は２〜８μｇの間で、好適には３〜７μｇの間で、又は５μｇのレベルでＱＳ２１を含んでなる。ＱＳ２１とコレステロールを含んでなるそのような製剤は、抗原と共に製剤化されると功を奏するＴｈ１刺激性アジュバントであることが示されている。従って、たとえば、ＱＳ２１とコレステロールの組み合わせを含んでなるアジュバントを伴った免疫原性組成物にてＰｒｅＦポリペプチドを好都合に採用することができる。
【０１４８】
任意で、アジュバントはまた、たとえば、アルミニウム塩又はカルシウム塩、特に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムのような鉱物塩を含んでなることができる。たとえば、アルミニウム塩（たとえば、水酸化アルミニウム又は「ミョウバン」）との組み合わせで３Ｄ−ＭＰＬを含有するアジュバントは、ヒト対象に投与するためのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物での製剤化に好適である。
【０１４９】
ＰｒｅＦ抗原と共に製剤化するのに使用するために好適なＴｈ１に偏ったアジュバントの別の部類には、ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物が挙げられる。ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、たとえば、鼻内投与用の粘膜アジュバントとして特に好適である。ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、細菌性又はウイルス性の抗原のような免疫原のためのキャリアとして又は組成物にて有用である、たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種（たとえば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，ｉｎ “Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”第２版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ，ｐａｇｅ １９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号を参照）のような、しかし、これらに限定されないグラム陰性細菌に由来する外膜タンパク質（一部のポリンを含んでなるＯＭＰ）の調製物に属する。一部のＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、「プロテオソーム」と呼ぶことができ、それは疎水性であり、ヒトでの使用に安全である。プロテオソームは、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの小胞又は小胞様のＯＭＰクラスターに自己集合する能力を有し、タンパク質抗原（Ａｇ）、特に親水性部分を有する抗原と非共有性に取り込み、配位し、会合し（たとえば、静電気的に又は疎水性に）、又はさもなければ共同する。複数の分子膜構造又は１以上のＯＭＰの溶融球状ＯＭＰ組成物を含んでなる小胞形態又は小胞様形態で外膜成分を生じる任意の調製方法は、プロテオソームの定義の範囲内に含まれる。たとえば、当該技術（たとえば、米国特許第５，７２６，２９２号又は同第５，９８５，２８４号）に記載されたようにプロテオソームを調製することができる。プロテオソームはまた、ＯＭＰポリンを製造するのに使用される細菌（たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種）を起源とする内因性のリポ多糖類又はリポオリゴ糖類（ＬＰＳ又はＬＯＳ）を含有することができ、それらは一般にＯＭＰ調製物全体の２％未満である。
【０１５０】
プロテオソームはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓから化学的に抽出された外膜タンパク質（ＯＭＰ）（ほとんど、クラス４のＯＭＰと同様にポリンＡ及びＢ）から主として構成され、界面活性剤によって溶液で維持される（Ｌｏｗｅｌｌ ＧＨ. Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｎａｓａｌ, Ｏｒａｌ, ｏｒ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｉｎ： Ｌｅｖｉｎｅ ＭＭ, Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ, Ｋａｐｅｒ ＪＢ, Ｃｏｂｏｎ ＧＳ, ｅｄｓ, Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｉｎｃ. １９９７； １９３‐２０６）。プロテオソームは、たとえば、透析濾過又は従来の透析工程によって、本明細書で開示されるＰｒｅＦポリペプチドを含んでなるウイルス供給源に由来する精製された又は組換えのタンパク質のような種々の抗原と共に製剤化することができる。界面活性剤を徐々に取り除くことによって約１００〜２００ｎｍの直径の粒子状疎水性の複合体を形成することができる（Ｌｏｗｅｌｌ ＧＨ. Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｎａｓａｌ, Ｏｒａｌ, ｏｒ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｉｎ： Ｌｅｖｉｎｅ ＭＭ, Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ, Ｋａｐｅｒ ＪＢ, Ｃｏｂｏｎ ＧＳ, ｅｄｓ, Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｉｎｃ. １９９７； １９３‐２０６）。
【０１５１】
「プロテオソーム：ＬＰＳ又はプロトリン」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１種のリポ多糖類による外因性添加によって混合されてＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（免疫原性組成物として機能することができる）を提供するプロテオソームの調製物を指す。従って、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物は、（１）たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓのようなグラム陰性細菌から調製されるプロテオソームの外膜タンパク質調製物（たとえば、プロジュバント）と（２）１以上のリポ糖類の調製物を含んでなる、プロトリンの２つの基本成分で構成することができる。リポオリゴ糖は、外因性であることができ（たとえば、ＯＭＰプロテオソーム調製物に天然に含有される）、外因性に調製されたリポオリゴ糖（たとえば、ＯＭＰ調製物とは異なった培養物又は微生物から調製された）と混合することができ又は組み合わせることができ、又はそれらの組み合わせであることができる。そのような外因性に添加されるＬＰＳは、ＯＭＰ調製物が作製されたのと同じグラム陰性細菌に由来することができ、又は異なったグラム陰性細菌に由来することができる。プロトリンはまた、任意で脂質、糖脂質、糖タンパク質、小分子等を含んでなることが理解されるべきである。プロトリンは、たとえば、米国特許出願公開第２００３／００４４４２５号に記載されたように調製することができる。
【０１５２】
上述のもののような異なったアジュバントの組み合わせもＰｒｅＦ抗原との組み合わせで使用することができる。たとえば、すでに言及したように、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬと一緒に製剤化することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は通常、たとえば、１：５〜５：１のような１：１０〜１０：１の桁であり、実質的に１：１であることが多い。通常、比率は、２．５：１〜１：３の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲である。別の組み合わせアジュバントの製剤には、３Ｄ−ＭＰＬと、たとえば、水酸化アルミニウムのようなアルミニウム塩が挙げられる。組み合わせで製剤化する場合、この組み合わせが抗原特異的なＴｈ１免疫応答を高めることができる。
【０１５３】
一部の例では、アジュバント製剤、たとえば、カルシウム塩又はアルミニウム塩（ミョウバン）、たとえば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムのような鉱物塩。ミョウバンが、たとえば、３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせで存在する場合、量は通常、用量当たり、１００μｇ〜１ｍｇの間、たとえば、約１００μｇ、又は約２００μｇ〜約７５０μｇ、たとえば、約５００μｇである。
【０１５４】
一部の実施形態では、アジュバントは、油と水のエマルション、たとえば、水中油型エマルションを含んでなる。水中油型エマルションの一例は、水性キャリア中に代謝可能な油、たとえば、スクアレン、トコフェロールのようなトコール、たとえば、α−トコフェロール、及びたとえば、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５（商標））又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ツイーン８０（商標））のような界面活性剤を含んでなる。特定の実施形態では、水中油型エマルションは、追加の免疫賦活剤を含有しない（特に３Ｄ−ＭＰＬのような非毒性脂質Ａ誘導体又はＱＳ２１のようなサポニンを含有しない）。水性キャリアは、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。さらに、水中油型エマルションは、スパン８５及び／又はレシチン及び／又はトリカプリリンを含有することができる。
【０１５５】
本発明の別の実施形態では、抗原又は抗原組成物と水中油型エマルションを含んでなるアジュバント組成物と任意で１以上のさらなる免疫賦活剤を含んでなるワクチン組成物が提供され、前記水中油型エマルションは、０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（好適にはスクアレン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（好適には、α−トコフェロールのようなトコフェロール）及び０．４〜４ｍｇの乳化剤を含んでなる。
【０１５６】
特定の一実施形態では、アジュバント製剤は、水中油型エマルションのようなエマルション形態で調製された３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。場合によっては、エマルションはＷＯ９４／２１２９２で開示されたように直径２μｍ未満の小さな粒度を有する。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、２２μｍの膜を介して無菌濾過されるのに十分なくらい小さくてもよい（欧州特許第０６８９４５４号に記載されたように）。或いは、３Ｄ−ＭＰＬはリポソーム製剤に調製することができる。任意で、３Ｄ−ＭＰＬ（又はその誘導体）を含有するアジュバントは、追加の免疫賦活成分も含んでなる。
【０１５７】
アジュバントは、免疫原性組成物が投与される集団にて安全で且つ有効であるように選択される。成人集団及び高齢者集団については、製剤は通常、幼児製剤で通常見られるアジュバント成分より多くを含んでなる。特にエマルションのような水中油型エマルションを用いた製剤は、たとえば、コレステロール、スクアレン、α−トコフェロール及び／又はたとえば、ツイーン８０若しくはスパン８５のような界面活性剤のような追加の成分を含んでなることができる。例となる製剤では、そのような成分は、以下の量：約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のα−トコフェロール、０．３〜３％のツイーン８０で存在することができる。通常、スクアレン：α−トコフェロールの比率は、これがさらに安定なエマルションを提供する場合、等しいか又は１未満である。場合によっては、製剤は安定剤も含有することができる。
【０１５８】
ＰｒｅＦポリペプチドを伴う免疫原性組成物を幼児に投与するために製剤化する場合、アジュバントの投与量は、幼児対象で有効であり、相対的に反応源性ではないように決定される。一般に、幼児製剤におけるアジュバントの投与量は、成人（たとえば、６５歳以上の成人）への投与で設計される製剤で使用されるものより低い（たとえば、用量は、成人に投与される製剤で提供される用量の画分であってもよい）。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの量は通常、用量当たり１μｇ〜２００μｇ、たとえば、１０〜１００μｇ又は１０〜５０μｇである。幼児用量は通常、この範囲、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇの低い方の端であり、たとえば、約２μｇ、又は約５μｇ、又は約１０μｇ、又は約２５μｇまで又は約５０μｇまでである。通常、ＱＳ２１が製剤で使用される場合、範囲は同程度である（及び上記比率に従って）。油と水のエマルション（たとえば、水中油型エマルション）の場合、小児又は幼児に提供されるアジュバントの用量は、成人対象に投与される用量の画分であり得る。種々の用量での例となる水中油アジュバントとの組み合わせでＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物の有効性の実証は実施例９に提供される。
【０１５９】
免疫原性組成物は通常、免疫防御量（又はその画分用量）の抗原を含有し、従来の技法で調製することができる。ヒト対象への投与用のものを含んでなる免疫原性組成物の調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｒｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９５．Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の抱合は、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらによる同第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１６０】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象にて重大な有害な副作用なしで免疫防御の応答を誘導する量として選択される。この文脈での免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するものではなく；症状又は疾患、特にウイルスに関連した重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原が採用されるかによって変化し得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば、約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、又は約５０μｇを含んでなることが予想される。免疫原性組成物で利用される量は、対象集団（たとえば、幼児又は高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の任意の量は、対象における抗体力価及びそのほかの応答の所見を含んでなる標準的な検討によって確定することができる。最初のワクチン接種に続いて、約４週間以内に対象は追加免疫を受けることができる。
【０１６１】
選択されるアジュバントにかかわりなく、最終製剤の濃度は、標的集団で安全且つ有効であるように算出されることに留意すべきである。たとえば、ヒトにおいて、たとえば、ＲＳＶに対して免疫応答を誘発するための免疫原性組成物は、好都合には幼児（最初の投与の年齢が、たとえば、出生〜１年の間、たとえば、０〜６ヵ月）に投与される。ＲＳＶに対して免疫応答を誘発するための免疫原性組成物はまた、高齢者のヒトにも好都合に投与される（たとえば、単独で、又はＣＯＰＤに関連する抗原若しくはそのほかの病原体との組み合わせで）。アジュバントの選択は、これらの異なった適用で異なることができ、各状況の最適なアジュバント及び濃度は当業者によって経験的に決定され得ることが十分に理解されるであろう。
【０１６２】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減する又は防ぐワクチンである。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染に続く病理学的応答を軽減する又は防ぐワクチンである。任意で、ＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つの追加の抗原と共に製剤化される。たとえば、病原性生物は、気道の病原体（たとえば、呼吸器感染の原因となるウイルス又は細菌）であることができる。特定の場合、免疫原性組成物は、たとえば、インフルエンザ又はパラインフルエンザのような気道感染を起こすウイルスのような、ＲＳＶ以外の病原性ウイルスに由来する抗原を含有する。他の実施形態では、追加の抗原が選択されて、複数の感染性生物に対して対象を防御するのに必要とされる投与を円滑にする又は接種の回数を減らす。たとえば、抗原は、とりわけ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、溶血性インフルエンザ、ポリオウイルス、球菌又は肺炎球菌の１以上に由来することができる。
【０１６３】
従って、ＲＳＶによる暴露又は感染（その後の治療的な又はそれに先立つ予防的な）を治療するための医薬の調製におけるＰｒｅＦ抗原又はそれをコードする核酸の使用も本開示の特徴である。同様に、対象においてＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法は本開示の特徴である。そのような方法には、免疫的に有効な量の、ＰｒｅＦ抗原を含んでなる組成物をヒト対象のような対象に投与することが含まれる。一般に、組成物はＴｈ１に偏った免疫応答を誘発するアジュバントを含んでなる。組成物は、ＲＳＶとの接触に続くウイルス性疾患を促進することなく、ＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発するように製剤化される。すなわち、組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減する又は予防する、及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的応答を軽減する又は予防するＴｈ１に偏った免疫応答を生じるように製剤化される。組成物は種々の異なった経路によって投与することができるが、最も一般的には免疫原性組成物は、筋肉内又は鼻内の経路によって送達される。
【０１６４】
免疫原性組成物は通常、免疫防御量（又はその画分用量）の抗原を含有し、従来の技法によって調製することができる。ヒト対象への投与用のものを含んでなる免疫原性組成物の調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｒｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９５．Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の抱合は、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらによる同第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１６５】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象にて重大な有害な副作用なしで免疫防御の応答を誘導する量として選択される。この文脈での免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するものではなく；症状又は疾患、特にウイルスに関連した重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原が採用されるかによって変化し得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば、約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、又は約５０μｇを含んでなることが予想される。免疫原性組成物で利用される量は、対象集団（たとえば、幼児又は高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の任意の量は、対象における抗体力価及びそのほかの応答の所見を含んでなる標準的な検討によって確定することができる。最初のワクチン接種に続いて、約４〜１２週間以内に対象は追加免疫を受けることができる。たとえば、ＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を幼児対象に投与する場合、最初の接種とそれに続く接種は、この期間に投与されるワクチンと合うように投与することができる。
【０１６６】
以下の実施例を提供して特定の特別な特徴及び／又は実施形態を説明する。これらの実施例は、記載される特別な特徴又は実施例に本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【０１６７】
実施例
実施例１：例となるＰｒｅＦ抗原
Ｆの前融合立体構造に対して生成される免疫応答が、膜の融合に関与する結合、立体構造シフト及び／又はそのほかの事象を妨げる抗体を優先的に含んでなり、それによって防御的応答の有効性を高めるという予測に基づいて、前融合立体構造でタンパク質を安定化するために天然のＲＳＶのＦタンパク質に比べて、ＰｒｅＦ抗原を修飾した。
【０１６８】
図１ＡとＢは、ＲＡＶのＦ０と例となるＰｒｅＦ組換え抗原の特徴を模式的に説明する。図１ＡはＲＳＶのＦ０タンパク質の説明である。Ｆ０は５７４のアミノ酸から成るプレタンパク質である。Ｆ０プレタンパク質は翻訳に続いてタンパク分解処理され、グリコシル化される。その後シグナルペプチダーゼによって取り除かれるシグナルペプチドは小胞体（ＲＥ）へのＦ０プレタンパク質の翻訳を標的とする。ＲＥにおける初期のペプチドは複数の部位（三角によって示される）で次いでグリコシル化される。Ｆ０のフリン切断はＦ２ペプチドドメインとＦ１ペプチドドメインを生じ、それらは、Ｆ２−Ｆ１へテロ二量体の３量体（すなわち、Ｆ２−Ｆ１の３倍）として一緒に折り畳まれ、集合する。天然の状態では、Ｆタンパク質は、Ｃ末端領域の膜貫通螺旋によって膜に固定される。Ｆ０ポリペプチドのさらなる特徴には、１５システイン残基、４の特徴的な中性エピトープ、２つのコイルドコイル領域、及び脂質化モチーフが挙げられる。図１Ｂは、例となるＰｒｅＦ抗原の特徴を説明する。ＰｒｅＦ抗原を構築するには、Ｆタンパク質の前融合立体構造を安定化するようにＦ０ポリペプチドを修飾し、それによって、宿主細胞に結合及び融合する前にＲＳＶウイルスによって示されるようなＦタンパク質の優勢な免疫原性エピトープを保持する。以下の安定化する変異を、Ｆ０ポリペプチドに対するＰｒｅＦ抗原に導入した。第１に、安定化するコイルドコイルドメインをＦ０ポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に置き、Ｆ０の膜に固定するドメインを置き換えた。第２に、ｐｅｐ２７ペプチド（天然のタンパク質のＦ２とＦ１のドメインの間に位置する）を取り除いた。第３に、双方のフリンモチーフを除いた。代替の実施形態では（ＰｒｅＦ＿Ｖ１及びＰｒｅＦ＿Ｖ２と命名した）、ＲＳＶタンパク質の免疫的に活性のある部分（たとえば、アミノ酸番号１４９〜２２９）をＣ末端ドメインに付加した。
【０１６９】
他の実施形態では、修飾を導入して、グリコシル化を変えた（高めた又は低下させた）、及び／又はフリン以外のプロテアーゼによる切断を減らした。
【０１７０】
実施例２：ＣＨＯ細胞からのＰｒｅＦ組換えタンパク質の産生及び精製
ＰｒｅＦ抗原を産生させるために、例となるＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を宿主ＣＨＯ細胞に導入した。導入されたポリヌクレオチド配列を含んでなる一時的に形質移入した宿主細胞又は増殖させた安定した集団を、所望の目的に許容できる規模で増殖に好適な条件下で培地にて増殖させた（たとえば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそれに引用された参考文献で一般に記載されているように）。通常、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２にて振盪フラスコにおいて又は２０％に維持されたｐＯ２で２９℃にて又は生物反応器において無血清培地で増殖させ、２〜３日間隔で継代した。
【０１７１】
組換えＰｒｅＦ抗原を回収するには、細胞培養物を遠心し、細胞培養上清をさらなる使用まで約−８０℃にて保存する。さらなる解析のために、細胞培養上清の２リットルのアリコートを精製水で×２に希釈し、ＮａＯＨでｐＨ９．５に合わせた。２０ｍＭのピペラジンｐＨ９．５で平衡化したＱセファロースＦＦイオン交換カラム（６０ｃｍ、１１．３ｃｍ）に１４ｍｌ／分の速度で負荷した。出発緩衝液でカラムを洗浄した後、カラム容積の２０倍の０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配で溶出を行った（分画サイズは１０ｍｌ）。銀染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットで分画を解析した。次いでさらなる処理に先立って、実質的なＰｒｅＦタンパク質を含有する分画をプールした。
【０１７２】
ペリコンＸＬ ＰＥＳ Ｂｉｏｍａｘ １００ （ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ）膜カセットを伴った、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の実験台規模のＴＦＦシステムを用いて、１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０への緩衝液交換に、Ｑ工程のプールした溶離液（約１３０ｍｌ）を供した。得られた物質はｐＨ７．０及び１．８ｍＳ／ｃｍの伝導率を有した。１０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した１０ｍｌのヒドロキシアパタイトＩＩ型（ＨＡＩＩ）ゲル（ＸＫ１６、高さ＝５ｃｍ）に５ｍｌ／分にて１００ｍｌのこの試料を負荷した。出発緩衝液でカラムを洗浄した後、カラム容積の２０倍の１０ｍＭ〜２００ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）ｐＨ７．０の勾配で溶出を行った。銀染色とクマシーブルーによるＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画を再び解析し、陽性分画をプールした。
【０１７３】
アフィニティクロマトグラフィに続いて、プールした分画を濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器、１０，０００ＤａのＭＷＣＯを用いて緩衝液をＤＰＢＳ（ｐＨ約７．４）に交換した。最終生成物は約１３ｍｌだった。Ｌｏｗｒｙアッセイで評価したタンパク質濃度は１９５μｇ／ｍｌだった。純度は９５％を超えた。精製したＰｒｅＦ抗原の調製物をフィルターで滅菌し、使用まで−２０℃で保存した。
【０１７４】
実施例３：ＣＨＯ細胞で産生されたＰｒｅＦ組換えタンパク質の性状分析
ＣＨＯ細胞で産生されたＰｒｅＦ組換えタンパク質を非対称場流動分画（ＡＦＦ−ＭＡＬＳ）で特徴づけ、ＲＳＶのＦ及びＧのタンパク質成分を含んでなるキメラ抗原と比較した。ＡＦＦ−ＭＡＬＳによって、最小限のマトリクス相互作用にて液体流中で分子サイズに従ってタンパク質種を分離すること及び正確な分子量決定のための多重角度光散乱によるさらなる解析が可能になる。図２Ａは、精製したＦＧ物質の６５％を超える部分が、最終的なＰＢＳ緩衝液中で高分子量オリゴマー（１０００〜１０００００ｋＤａ）として見い出される一方で３％が単量体形態で残ることを示す。
【０１７５】
図２Ｂは、精製したＰｒｅＦタンパク質がＰＢＳ緩衝液中で７３％の比率まで三量体に折り畳まれることを示す。物質の１０％は、１０００〜２００００ｋＤａのオリゴマーとして見い出される。これらの結果は、ＣＨＯ細胞で発現された組換えＰｒｅＦタンパク質が、天然の状態で予測されるように三量体として折り畳まれることを示す。
【０１７６】
リン酸緩衝液の溶液中でのタンパク質の可溶性の性質を確認し、ＦＧタンパク質による生体内評価での比較用に集合体を生成する（以下の実施例７を参照）という二重の目的のために、精製したＰｒｅＦタンパク質をグルタールアルデヒドで架橋した。グルタールアルデヒドの架橋は、タンパク質の四級構造の良好な評価を提供することで知られ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０２３０−１０２３９（１９９７）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７１：４２８４−４２９２（２００４）に記載されている。
【０１７７】
１％、２％及び５％のグルタールアルデヒド架橋剤と共に４℃にて４時間、タンパク質をインキュベートし、ＮａＢＨ４の添加によって反応を阻止した。ＰＢＳ緩衝液におけるカラム脱塩によって過剰のグルタールアルデヒドを取り除いた。得られたタンパク質を２８０ｎｍでの吸収によって定量し、変性条件及び還元条件にてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。精製した組換えＰｒｅＦの大半は、ＰＢＳ溶液中で三量体として移動すると判定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたように、三量体タンパク質の大半を高分子量集合体に変換するには、インキュベート温度を２３℃に上げることが必要とされた。
【０１７８】
実施例４：ＰｒｅＦ抗原による試験管内の中和阻害
志願者から得たヒト血清をＥＬＩＳＡによってＲＳＶのＡ株に対する反応性についてスクリーニングし、各血清試料について確定された以前のＲＳＶ中和潜在力価に基づいた関連する希釈にて中和阻害（ＮＩ）アッセイに用いた。手短には、０．５％のＦＢＡ、２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴った５０％の１９９−Ｈ培地が入ったＤＭＥＭ中２５μｇ／ｍｌの濃度での阻害剤タンパク質（ＰｒｅＦ又は米国特許第５，１９４，５９５で開示され、Ｒｉｘ（ＦＧ）と名付けられたキメラＦＧに本質的に対応する対照タンパク質）と血清を混合し、回転ホイール上で３７℃にて１．５〜２時間インキュベートした。各血清試料についての阻害範囲を最適化するように滴定したＡＳＶを伴った丸底９６穴プレートにて２０μｌの連続希釈した血清とタンパク質を混合した。ｐＨを維持するような５％ＣＯ２のもとで３３℃にて２０分間、得られた混合物をインキュベートした。
【０１７９】
次いで、予めＶｅｒｏ細胞を播いた平底９６穴プレートに血清／阻害剤／ウイルスの混合物を入れ、１６０μｌの培地を添加する前に３３℃にて２時間インキュベートした。ＮＩ力価検出用の免疫蛍光アッセイまで、プレートをさらに５％ＣＯ２で３３℃にて５〜６日間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％パラホルムアルデヒドで１時間固定した後、２％ミルク／ＰＢＳとブロック緩衝液でプレートをブロックした。すすぐことなく、各ウェルにヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ、１：４００）を加え、室温（ＲＴ）にて２時間インキュベートした。試料をＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキング緩衝液中の抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ、１：４００）をウェルに加えた。プレートを再びＲＴにて２時間インキュベートし、読み取りの前に上記のように２回洗浄した。≧１の蛍光合胞体が検出された場合、ウェルを陽性とみなした。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ（ＳＫ）法を用いて５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）の算出を行い、ＮＩの比率は以下のように算出した：［（０μｇ／ｍｌの阻害剤の中和力価−２５μｇ／ｍｌの阻害剤の中和力価）／０μｇ／ｍｌの阻害剤の中和力価］×１００。図３に示した例となる結果は、調べた１６／２１の供血者におけるＮＩでＰｒｅＦがＦＧより優れることを示している。
【０１８０】
実施例５：ＰｒｅＦ抗原は免疫原性である
ＰｒｅＦ抗原の免疫原性を明らかにするために、ＰｒｅＦ（６．５、３．１、０．６３、０．１３及び０．０２５μｇ／ｍｌ）とヒト用量の１／２０での３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含有するＴｈ１アジュバント（「ＡＳ０１Ｅ」）、又はＰｒｅＦ（１、０．２及び０．０４μｇ／ｍｌ）とヒト用量の１／１０の３Ｄ−ＭＰＬ及びミョウバンを含有するＴｈ１アジュバント（「ＡＳ０４Ｃ」）によって２週間間隔でＩＭにて２回マウスを免疫し、３週間後、血清を回収した。
【０１８１】
標準的な手順に従ってＥＬＩＳＡによって抗原特異的なＩｇＧ抗体の力価をプールした血清試料にて測定した。手短には、精製し、不活化したＲＳＶのＡ、ＲＳＶのＢ及び相同のＰｒｅＦタンパク質で９６穴プレートを被覆し、４℃にて一晩インキュベートした。２００ｎｇ／ｍｌの濃度で出発した精製マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）と共に、１：５０の最初の濃度で出発してブロッキング緩衝液で血清試料を連続希釈し、室温で２時間インキュベートした。西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）によって、結合した抗体を検出した。３，３Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡＴＭ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＮ）をＨＲＰの基質として用いた。５０μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに加えて反応を止めた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）によって４５０ｎｍにて各ウェルについて吸収値を検出した。
【０１８２】
図４Ａ及び４Ｂで詳説した代表的な結果は、ＰｒｅＦ抗原による免疫に続いてＲＳＶのＡ及びＲＳＶのＢに対して強い力価が引き出されることを示している。
【０１８３】
実施例６：ＰｒｅＦは中和抗体を引き出す
実施例５で上述したように免疫したマウスの血清試料にて中和抗体の存在と量を評価した。９６穴プレート（２０μｌ／ウェル）にてＲＳＶ培地での１：８の希釈から出発して、免疫動物のプールした血清を連続希釈した。対照のウェルは、ＲＳＶ培地のみ又は１：５０のヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有した。代表的なＲＳＶのＡ株又はＢ株の５００〜１０００感染用量をウェルに加え、３３℃、５％ＣＯ２にて２０分間インキュベートし、その後、予め１×１０５個／ｍｌのＶｅｒｏ細胞を播いた９６穴平底プレートに混合物を移した。細胞を３３℃、５％ＣＯ２にて約２時間インキュベートし、栄養を再補充し、その後、同じ温度にて５〜６日間インキュベートした。上清を取り除き、プレートをＰＢＳで洗浄し、付着細胞をＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いでヤギ抗ＲＳＶ一次抗体と検出用の抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて間接免疫蛍光（ＩＦＡ）アッセイを行った。
【０１８４】
それぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す代表的な結果は、ＰｒｅＦで免疫した動物の血清では、ＲＳＶ株に対する有意な中和抗体が検出されることを明らかにしている。
【０１８５】
実施例７：ＲＳＶの負荷に対してＰｒｅＦは防御する
上述のように２週間間隔でＩＭにて２回マウスを免疫し、２回目の注射の３週間後、ＲＳＶのＡ株を負荷した。負荷後、肺に存在するウイルスを測定することによってＲＳＶに対する防御を評価した。手短には、安楽死後、免疫した動物から肺を無菌的に取り出し、１５ｍｌの試験管にて１０ｍｌ／肺の２倍容量を用いたＲＳＶ培地で洗浄した。次いで、肺を秤量し、自動Ｐｏｔｔｅｒホモゲナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｎｅｐｅａｎ ＯＮ）によってＲＳＶ培地中でホモジネートし、２６５５×ｇにて４℃で２分間遠心した。予めＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８１）単層を播き、６日間インキュベートした９６穴プレートにて連続希釈（１：１０で出発して８回複製）することによって、上清に存在するウイルスを滴定した。ｐＨ７．２のＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドによる固定後、抗ＲＳＶ一次抗体とＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ二次抗体による間接ＩＦＡによってＲＳＶを検出した。
【０１８６】
図６Ａ及び６Ｂに示す代表的な結果は、アジュバントの存在下で０．０４μｇ以上の容量がＲＳＶに対する強い防御を引き出すことを明らかにしている。
【０１８７】
実施例８：ＰｒｅＦは負荷に続いて肺での好酸球の動員を誘導しない
免疫及びその後の負荷に続いて悪化した疾患を誘発するＰｒｅＦ抗原の可能性を評価するために、（ａ）１０μｇのグルタールアルデヒド処理ＰｒｅＦ、（ｂ）１０μｇのＰｒｅＦ又は（ｃ）アジュバントなしでの１０μｇのＦＧそれぞれによってマウスの群（５匹／群）を２回免疫した。追加免疫の３週間後、ＲＳＶのＡ株でマウスを負荷し、負荷の４日後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＢＡＬ中の全白血球浸潤をマウス当たりで数え、マクロファージ／単球、好中球、好酸球及びリンパ球の形態に基づく白血球百分率を算出した。
【０１８８】
各動物について、全細胞数に好酸球の白血球百分率を乗じた。示すのは、９５％の信頼限界での各群当たりの幾何平均である。図７に示す代表的な結果は、ＰｒｅＦによる免疫と負荷に続いて好酸球は肺に動員されないことを示している。さらに、これらの結果は、故意にＰｒｅＦを凝集させた形態（グルタールアルデヒド処理）又はＦＧ抗原（天然に凝集した）に比べて、ＰｒｅＦ抗原の可溶性の性質は好酸球を好まないことを示唆している。
【０１８９】
実施例９：水中油型エマルションアジュバントの希釈によって製剤化したＰｒｅＦ抗原の免疫原性
１０．７０ｍｇスクアレンのヒト「完全」用量（ＡＳ０３Ａ）の１／１０での例となる水中油アジュバントＡＳ０３Ａ、１１．８８ｍｇＤＬ−α−トコフェロール、４．８５ｍｇポリソルベート８０、１／２用量（ＡＳ０３Ｂ）１／４用量（ＡＳ０３Ｃ）と共に、又はアジュバントなしで製剤化した２５０ｎｇのＰｒｅＦをマウスに与えた。対照マウスにはＡＳ０３Ａのみ又はＰＢＳを与えた。０日目と１４日目にマウスを免疫した。採血、脾細胞の回収及び負荷は３９日目（投与２の２５日後）に行った。負荷の４日後にＲＳＶの滴定にために肺をホモジネートした。
【０１９０】
個々の血清試料にてＥＬＩＳＡによって抗原特異的なＩｇＧ抗体の力価を測定した。手短には、精製し、不活化したＲＳＶのＡ株で９６穴プレートを被覆し、４℃にて一晩インキュベートした。２００ｎｇ／ｍｌの濃度で出発する精製マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）と共に、１：２００で出発してブロッキング緩衝液で血清試料を連続希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）によって、結合した抗体を検出した。３，３Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡＴＭ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＮ）をＨＲＰの基質として用いた。５０μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに加えて反応を止めた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）によって４５０ｎｍにて各ウェルについて吸収値を検出した。結果を図８に示す。ＡＳ０３Ａ、ＡＳ０３Ｂ又はＡＳ０３Ｃと組み合わせたＰｒｅＦで免疫したマウスの血清では、約２５０，０００ｎｇ／ｍｌの抗ＲＳＶＩｇＧ濃度が認められたが、ＰｒｅＦのみで免疫したマウスの血清ではほんの少し（１８２８ｎｇ／ｍｌ）しか認められなかった。
【０１９１】
９６穴プレート（２０μｇ／ウェル）にて１：８の希釈から出発して、免疫動物のプールした血清をＲＳＶ培地で連続希釈した。対照のウェルは、ＲＳＶ培地のみ又は１：５０でのヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有した。ＲＳＶのロング株を加え、プレートを３３℃にて２０分間インキュベートし、１×１０５個／ｍｌのＶｅｒｏ細胞を予め播いた９６穴平底プレートに混合物を移した。同じ温度にて５〜６日後、上清を取り除き、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドで１時間、付着細胞を固定し、その後、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）を実施した。図９は、ＰｒｅＦとの組み合わせで投与したＡＳ０３の量にかかわりなく、ＲＳＶ中和抗体の力価は同じままだった（〜１１ｌｏｇ２）が，ＡＳ０３なしで免疫したマウスにおけるＲＳＶ中和抗体の力価は有意に低かった（〜６ｌｏｇ２）ことを示す。
【０１９２】
安楽死後、免疫した動物から肺を無菌的に取り出し、１５ｍｌの試験管にて１０ｍｌ／肺の２倍容量を用いたＲＳＶ培地で洗浄した。次いで、それらを秤量し、自動Ｐｏｔｔｅｒホモゲナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｎｅｐｅａｎ ＯＮ）によってＲＳＶ培地中でホモジネートし、２６５５×ｇにて４℃で２分間遠心した。上清におけるウイルスの存在を滴定した。手短には、予めＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８１）単層を播き、５〜６日間インキュベートした９６穴プレートにて、１：１０で出発して８回複製で肺ホモジネートを連続希釈した。ＲＳＶは間接ＩＦＡによって検出した。図１０は、ＡＳ０３Ａ、ＡＳ０３Ｂ又はＡＳ０３Ｃと組み合わせたＰｒｅＦで免疫したマウス間では防御に差異は認められなかったが、ＡＳ０３の非存在下で免疫したマウスでは低い防御しか認められなかったことを示す結果を説明している。
【０１９３】
これらの結果は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する組成物を作出するためにアジュバントの広い範囲の濃度にわたってＰｒｅＦ抗原を製剤化することができることを明らかにしている。
【化１】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１０年、５月１３日に出願された米国特許仮出願番号６１／３３４／５６８及び２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願番号６１／２１９，９５８のより早い出願日の利益を主張する。
【０００２】
本特許文書の開示の一部には著作権防御の対象となるものが含まれる。著作権の所有者は、米国特許商標局の特許ファイル又は記録に出現するような特許文書又は特許開示のファクシミリ再生に反対するものではないが、どんなものであれ、著作権をすべて保有する。
【背景技術】
【０００３】
本開示は免疫学の分野に関する。さらに詳しくは、本開示は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に特異的な免疫応答を誘発する組成物及び方法に関する。
【０００４】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、６ヵ月未満の幼児及び妊娠３５週以内の未熟児における下部気道感染（ＬＲＩ）の世界で最も一般的な原因である。ＲＳＶ疾患のスペクトルには、鼻炎及び耳炎から肺炎及び細気管支炎までの幅広い呼吸器症状が含まれ、後者の２疾患は、考慮すべき罹患率及び死亡率と関連している。ヒトのみがＲＳＶに感染することが知られている。汚染した鼻分泌物からのウイルスの広がりは多量の呼吸器液滴を介して生じるので、感染した個人又は汚染した表面との密接な接触が伝播には必要とされる。ＲＳＶは、おもちゃや他の物体上で数時間生き残り、そのことが、病院での、特に小児科病棟でのＲＳＶ感染の高い比率を説明している。
【０００５】
ＲＳＶに関して推定される世界の年間の感染及び死亡は、それぞれ６４００万人及び１６０，０００人であると概算される。米国のみでは、ＲＳＶは、年間１８，０００〜７５，０００人の入院と９０〜１９００人の死亡に関与していると概算される。温帯気候では、ＲＳＶは細気管支炎及び肺炎を含んでなるＬＲＩの年々の冬期流行の原因として文書で十分に裏付けられている。米国では、ほぼ全員の小児が２歳までにＲＳＶに感染している。健常な小児におけるＲＡＳ関連のＬＲＩの発生率は、２歳までの１０００人の小児当たり３７人（６ヵ月未満の乳児１０００人当たり４５人）であると算出され、１０００人（６ヵ月未満の乳児１０００人当たり）当たり６人に入院のリスクがあると算出された。発生は、心肺疾患を持つ子供及び未熟児で高く、彼らは、米国でのＲＳＶ関連での入院のほぼ半数を構成する。ＲＳＶが原因で生じるさらに重篤なＬＲＩを経験する小児は、後に小児喘息の高い発生を招くことになる。これらの研究は、重篤なＬＲＩ患者及びその後遺症を持つ患者を介護するコストが対応なものである先進国にてＲＳＶワクチン及びその使用の幅広いニーズを明らかにしている。ＲＳＶはまた高齢者におけるインフルエンザ様疾患の罹患率の重要な原因としてますます認識されている。
【０００６】
健常な集団及びリスクのある集団で耐久性のある防御的免疫応答を産生する、安全で且つ有効なＲＳＶワクチンを生成する尽力にて様々なアプローチが試みられている。しかしながら、ＲＳＶ感染を防ぎ、下部呼吸器感染（ＬＲＩ）を含んでなる、ＲＳＶ疾患を軽減する若しくは防ぐ目的でのワクチンとして安全で且つ有効であることが分かっていると今日評価されている候補はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、組換え呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。さらに具体的には、本開示は、三量体の前融合立体構造を安定化するために修飾されている組換えＦタンパク質を含んでなる抗原に関する。開示される組換え抗原は、優れた免疫原性を示し、特に好都合には、ＲＳＶ感染及び／又は疾患に対する防御のための免疫原性組成物（たとえば、ワクチン）の成分として採用される。開示されるのはまた、組換え抗原をコードする核酸、抗原を含有する免疫原性組成物、及び抗原を作出し、使用する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａは、ＲＳＶのＦタンパク質の構造的特徴を強調する模式図であり、図１Ｂは、例となるＲＳＶの前融合Ｆ（ＰｒｅＦ）抗原の模式図である。
【図２】ＰｒｅＦの非対称場流動分画（ＡＦＦ−ＭＡＬＳ）解析の代表的な結果を説明する折れ線グラフである。
【図３】ＰｒｅＦ抗原によるヒト血清の中和阻害を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａ及び図４ＢはＰｒｅＦ抗原に応答してマウスで誘発された血清ＩｇＧ力価を示す棒グラフである。
【図５】図５Ａ及び図５ＢはＰｒｅＦ抗原によって誘発されたＲＳＶ特異的な中和抗体の力価を説明する棒グラフである。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、マウスにおけるＲＳＶのＰｒｅＦ抗原により提供された負荷に対する防御を示すグラフである。
【図７】免疫及び負荷に続くＢＡＬ白血球を評価するグラフである。
【図８】水中油型エマルション（ＡＳ０３）の希釈により製剤化したＰｒｅＦで免疫した後、誘発された血清ＩｇＧを説明する棒グラフである。
【図９】水中油型エマルション（ＡＳ０３）の希釈により製剤化したＰｒｅＦで免疫した後の中和抗体の力価を説明するグラフである。
【図１０】水中油型エマルション（ＡＳ０３）の希釈により製剤化したＰｒｅＦで免疫した後の負荷に対する防御を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
序論
ＲＳＶ感染を防ぐワクチンの開発は、宿主の免疫応答が疾患の病態形成で役割を担うと思われるという事実によって複雑になっている。１９６０年代の初期の研究は、ホルマリンで不活化したＲＳＶワクチンを接種した小児は、接種しなかった対照の被験者に比べてウイルスへのその後の暴露に際してさらに重篤な疾患に罹ることを示した。これらの初期の試験は、ワクチン接種者の８０％の入院と２人の死亡を生じた。重症度が増した疾患は動物モデルで再現され、不適切なレベルの血清中和抗体、局所免疫の欠如、及び肺好酸球とＩＬ−４及びＩＬ−５サイトカインの高い産生による２型ヘルパーＴ細胞様（Ｔｈ２）の免疫応答の過剰な誘導の結果であると考えられる。それに対して、ＲＳＶ感染に対して防御する功を奏したワクチンは、ＩＬ−２及びγ−インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を特徴とするＴｈ１に偏った免疫応答を誘導する。
【００１０】
本開示は、ワクチンにて以前使用されたＲＳＶ抗原で遭遇した課題を解決し、抗原の免疫特性と製造特性を改善する組換え呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。本明細書で開示されるＲＳＶ抗原は、可溶性融合（Ｆ）タンパク質ポリペプチドを含んでなるＦタンパク質類似体を含んでなり、それは、Ｆタンパク質の前融合立体構造、すなわち、宿主細胞の膜との融合に先立った成熟集合Ｆタンパク質の立体構造を安定化させるために修飾されている。これらのＦタンパク質類似体は、明瞭性と単純性の目的で、「ＰｒｅＦ」又は「ＰｒｅＦ抗原」と指名される。本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原は、ヘテロの三量体ドメインの組み入れによって修飾されている可溶性Ｆタンパク質類似体が改善された免疫的特徴を示し、生体内で対象に投与された場合安全で高度に防御的であるという予期しない発見にその基礎を置く。
【００１１】
当該技術で広く受け入れられている用語及び指示を参照してＲＳＶタンパク質の構造の詳細を本明細書で提供し、図１Ａで模式的に説明する。例となるＰｒｅＦ抗原の模式図は図１Ｂに提供する。ＲＳＶタンパク質は、本明細書で提供される教示に従って前融合立体構造を安定化させるために修飾できることが当業者によって理解されるであろう。従って、ＰｒｅＦ抗原の作出を導く原理の理解を円滑にするために、個々の構造的成分は、例となるＦタンパク質を参照して示し、そのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１及び２に提供する。同様に、該当する場合、例となるＧタンパク質を参照してＧタンパク質抗原が記載されるが、そのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３及び４に提供する。
【００１２】
Ｆタンパク質ポリペプチドの一次アミノ酸配列を参照して（ＦＩＧ１Ａ）、以下の用語を利用してＰｒｅＦ抗原の構造的特徴を記載する。
【００１３】
用語、Ｆ０は、完全長の翻訳されたＦタンパク質前駆体を指す。Ｆ０ポリペプチドは、ｐｅｐ２７と命名された介在ペプチドによってＦ２ドメインとＦ１ドメインにさらに分割される。成熟の間に、Ｆ０ポリペプチドは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインと隣接するｐｅｐ２７の間に配置されている２つのフリン部位でタンパク分解切断を受ける。議論を確実にする目的で、Ｆ２ドメインは、アミノ酸１〜１０９の少なくとも一部及び全部を含んでなり、Ｆ１ドメインの可溶性部分は、Ｆタンパク質のアミノ酸番号１３７〜５２６の少なくとも一部及び全部を含んでなる。上記で示したように、これらアミノ酸の位置（及び本明細書で指定される後に続くアミノ酸の位置すべて）は、配列番号２の例となるＦタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）を参照して与えられる。
【００１４】
前融合Ｆ（又は「ＰｒｅＦ」）抗原は、ＲＳＶ抗原がＦタンパク質の前融合立体構造の免疫優勢エピトープを少なくとも１つ保持するように、Ｆタンパク質の前融合立体構造を安定化させる少なくとも１つの修飾を含んでなる可溶性（すなわち、膜に結合しない）Ｆタンパク質類似体である。可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶのＦタンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなる（が、ＲＳＶのＦタンパク質の膜貫通ドメインを含まない）。例となる実施形態では、Ｆ２ドメインはＦタンパク質のアミノ酸番号２６〜１０５を含んでなり、Ｆ１ドメインはアミノ酸番号１３７〜５１６を含んでなる。しかしながら、安定化されたＰｒｅＦ抗原の三次元構造が維持される限り、さらに小さな部分を使用することもできる。同様に、追加の成分が、三次元構造を破壊せず、抗原の安定性、産生又はプロセッシングに有害に影響せず、抗原の免疫原性を低下させない限り、追加の構造的成分（たとえば、融合ポリペプチド）を含んでなるポリペプチドを、例となるＦ２ドメイン及びＦ１ドメインの代わりに使用することができる。Ｆ２ドメインとＦ１ドメインは、Ｆタンパク質類似体の成熟前融合立体構造への折り畳みと集合を複製するように設計されたＮ末端からＣ末端への方向で位置づけられる。産生を高めるために、天然のＦタンパク質のシグナルペプチド又は組換えＰｒｅＦ抗原が発現されるべき宿主細胞における産生と分泌を高めるように選択されるヘテロのシグナルペプチドのようなシグナルペプチドがＦ２ドメインを先導することができる。
【００１５】
ＰｒｅＦ抗原は、たとえば、１以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換のような１以上の修飾を導入することによって安定化される（三量体の前融合立体構造において）。そのような安定化修飾の１つは、ヘテロ安定化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加である。例となる実施形態では、ヘテロ安定化ドメインは、タンパク質多量体化ドメインである。そのようなタンパク質多量体化ドメインの特に好適な一例は、そのようなドメインを有する複数のポリペプチドの三量体化を促進するイソロイシンジッパーのようなコイルドコイルドメインである。例となるイソロイシンジッパードメインを配列番号１１に示す。通常、ヘテロ安定化ドメインは、Ｆ１ドメインのＣ末端に位置する。
【００１６】
任意で、多量体化ドメインは、たとえば、配列ＧＧのような短いアミノ酸リンカー配列を介してＦ１ドメインに接続される。リンカーはさらに長いリンカーであり得る（たとえば、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ：配列番号１４のような配列ＧＧを含んでなる）。ＰｒｅＦ抗原の立体構造を破壊せずに本文脈で使用できる多数の構造的に中性のリンカーが当該技術で既知である。
【００１７】
別の安定化修飾は、天然のＦ０タンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインの間に位置するフリン認識切断部位の排除である。プロテアーゼがＰｒｅＦポリペプチドを構成ドメインに切断できないように、フリン認識部位の１以上のアミノ酸を欠失させる又は置換することによって、１０５〜１０９位及び１１３〜１３６位に位置するフリン認識部位の一方又は双方を消失させることができる。任意で、介在ｐｅｐ２７ペプチドを取り除く、又はたとえば、リンカーペプチドによって置き換えることもできる。さらに又は任意で、融合ペプチドの近傍での非フリン切断部位（たとえば、１１２〜１１３位でのメタロプロテイナーゼ部位）を取り除く又は置き換えることができる。
【００１８】
安定化変異の別の例は、Ｆタンパク質の疎水性ドメインへの親水性アミノ酸の付加又は置換である。通常、疎水性領域にて、リジンのような荷電アミノ酸をロイシンのような中性残基に対して付加又は置換する。たとえば、Ｆタンパク質の細胞外ドメインのＨＲＢコイルドコイルドメイン内で親水性アミノ酸を疎水性又は中性のアミノ酸に対して付加する又は置換することができる。例証として、リジンのような荷電アミノ酸をＦタンパク質の５１２位に存在するロイシンに対して置換することができる。代わりに又は加えて、Ｆタンパク質のＨＲＡドメイン内で親水性アミノ酸を疎水性又は中性のアミノ酸に対して付加する又は置換することができる。たとえば、リジンのような１以上の荷電アミノ酸を１０５〜１０６位にて又はその近傍に挿入することができる（たとえば、ＰｒｅＦ抗原のアミノ酸番号１０５と１０６の間のような参照配列番号２の残基１０５に対応するアミノ酸の後に）。任意で、ＨＲＡ及びＨＲＢの双方のドメインにて親水性アミノ酸を付加又は置換することができる。或いは、ＰｒｅＦ抗原の立体構造全体が有害に影響されない限り、１以上の疎水性残基を付加することができる。
【００１９】
さらに又は代わりに、ＰｒｅＦ抗原のグリコシル化を変化させる１以上の修飾を行ってもよい。たとえば、アミノ酸残基番号５００にて又はその前後で（配列番号２に比べて）天然のＲＳＶのＦタンパク質に存在するグリコシル化部位における１以上のアミノ酸を欠失させて又は置換して（又はグリコシル化部位が破壊されるようにアミノ酸を付加することができる）、ＰｒｅＦ抗原のグリコシル化状況を増減させることができる。たとえば、配列番号２の５００〜５０２位に対応するアミノ酸をＮＧＳ、ＮＫＳ、ＮＧＴ及びＮＫＴから選択することができる。従って、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号２６〜１０５に対応する）とＦ１ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号１３７〜５１６に対応する）を含んでなる可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなり、グリコシル化を変化させる少なくとも１つの修飾が導入されている。ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原は通常、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間に未変化の融合ペプチドを含んでなる。任意で、ＰｒｅＦ抗原はシグナルペプチドを含んでなる。
【００２０】
上記で開示されたように、そのようなＦタンパク質ポリペプチドは、（ｉ）ヘテロ三量体化ドメイン（たとえば、イソロイシンジッパードメインのような）を含んでなるアミノ酸配列の付加、（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つの非フリン切断部位の欠失、（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失、及び（ｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。上記で開示されたように、そのようなグリコシル化修飾されたＲＳＶのＰｒｅＦ抗原は、多量体、たとえば、三量体を形成する。
【００２１】
例となる実施形態では、グリコシル化修飾されたＰｒｅＦ抗原は、（ａ）配列番号２２を含んでなる又はそれから成るポリペプチド、（ｂ）配列番号２１によってコードされるポリペプチド又は配列番号２１の実質的な全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、（ｃ）配列番号２２と少なくとも９５％の配列同一性を持つポリペプチド
の群から選択される。
【００２２】
安定化修飾のいずれか及び／又はすべてを個々に及び／又は本明細書で開示されるそのほかの安定化修飾のいずれかとの組み合わせで用いてＰｒｅＦ抗原を作出することができる。例となる実施形態では、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間に介在性フリン切断部位を伴わず、Ｆ１ドメインのＣ末端に位置するヘテロ安定化ドメイン（たとえば、三量体化ドメイン）を伴ったＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなるポリペプチドを含んでなるＰｒｅＦタンパク質。特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はまた、疎水性のＨＲＡ及び／又はＨＲＢのドメインへの親水性残基の１以上の付加及び／又は置換も含んでなる。任意で、ＰｒｅＦ抗原はたとえば、メタロプロテイナーゼ部位のような少なくとも１つの非フリン切断部位の修飾を有する。
【００２３】
ＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶのＧタンパク質の少なくとも免疫原性部分を含んでなる追加のポリペプチド成分を含んでなる。すなわち、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はＦタンパク質成分とＧタンパク質成分の双方を含んでなるキメラタンパク質である。Ｆタンパク質成分は、上記のＰｒｅＦ抗原のいずれかであることができ、Ｇタンパク質成分はＲＳＶのＧタンパク質の免疫的に活性のある部分（全長までのＧタンパク質、又は全長のＧタンパク質を含んでなる）であるように選択される。例となる実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、Ｇタンパク質（配列番号４で表されるＧタンパク質の配列を参照してアミノ酸の位置が指定される）のアミノ酸番号１４９〜２２９を含んでなる。選択された部分がさらに大きなＧタンパク質断片の優勢な免疫特性を保持する限り、Ｇタンパク質のさらに小さな部分又は断片を使用できることを当業者は十分に理解するであろう。特に、選択される断片は、１８４〜１９８位のアミノ酸の間の免疫的に優勢なエピトープを保持し、免疫優勢エピトープを呈する安定な立体構造に折り畳み、集合するのに十分に長い。たとえば、アミノ酸番号１２８〜アミノ酸番号２２９、完全長のＧタンパク質までのさらに長い断片も使用することができる。キメラタンパク質の文脈で、選択される断片が安定な立体構造に折り畳み、宿主細胞で組換え的に作出する場合、作出、プロセッシング又は安定性を妨害しない限り。任意で、Ｇタンパク質成分は、たとえば、配列ＧＧのような短いアミノ酸のリンカー配列を介してＦタンパク質成分に接続される。リンカーはさらに長いリンカーであり得る（たとえば、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ：配列番号１４）。ＰｒｅＦ抗原の立体構造を破壊せずに本文脈で使用できる多数の構造的に中性のリンカーが当該技術で既知である。
【００２４】
任意で、Ｇタンパク質成分は、ＲＳＶ疾患の動物モデルで増強されたウイルス性疾患を軽減する又は防ぐ１以上のアミノ酸置換を含んでなることができる。すなわち、許容可能な動物モデル（たとえば、ＲＳＶのマウスモデル）から選択される対象に、ＰｒｅＦ−Ｇキメラ抗原を含んでなる免疫原性組成物を投与した場合、非修飾のＧタンパク質を含有するワクチンを受け取った対照動物に比べて、対象がワクチン増強のウイルス性疾患（たとえば、好酸球増多、好中球増多）の軽減又は無症状を示すように、Ｇタンパク質はアミノ酸置換を含んでなることができる。ワクチン増強のウイルス性疾患の軽減及び／又は予防は、免疫原性組成物がアジュバントの非存在下で投与された（しかし、たとえば、抗原が強いＴｈ１誘導アジュバントの存在下で投与される場合ではない）場合、明らかであり得る。さらに、アミノ酸置換は、ヒト対象に投与された場合、ワクチン増強のウイルス性疾患を軽減する又は予防することができる。好適なアミノ酸置換の例は、１９１位のアスパラギンのアラニンによる置き換えである（アミノ酸番号１９１位でのＡｓｎ→Ａｌａ：Ｎ１９１Ａ）。
【００２５】
任意で、上記で記載されるＰｒｅＦ抗原は、精製への補助として役立つ追加の配列を含んでなることができる。一例はヒスチジンタグである。そのようなタグは所望であれば、最終産物から取り除くことができる。
【００２６】
発現される場合、ＰｒｅＦ抗原は、ポリペプチドの多量体を含んでなる成熟タンパク質への分子内折り畳みと集合を経験する。好都合には、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドは、成熟した、処理されたＲＳＶのＦタンパク質の前融合立体構造に似ている三量体を形成する。
【００２７】
本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）のいずれかを、ＲＳＶに対する防御的な免疫応答を誘発する目的で免疫原性組成物にて好都合に使用することができる。そのような免疫原性組成物は通常、緩衝液のような薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤を含んでなる。投与に続いて生じる免疫応答を高めるために、免疫原性組成物は通常アジュバントも包含する。ＲＳＶに対する防御的な免疫応答を誘発するための免疫原性組成物の場合（たとえば、ワクチン）、組成物は好都合に、Ｔｈ１免疫応答を優勢に誘発するアジュバント（Ｔｈ１に偏ったアジュバント）を含んでなる。通常、アジュバントは、組成物が投与される標的集団への投与に好適であるように選択される。従って、適用に応じて、アジュバントは、たとえば、新生児又は高齢者への投与に好適であるように選択される。
【００２８】
本明細書で記載される免疫原性組成物は、ＲＳＶへの投与又は暴露に続く病的応答（たとえば、ワクチン増強のウイルス性疾患）を含んでなることなく、ＲＳＶ感染の軽減又は予防のためのワクチンとして好都合に採用される。
【００２９】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＰｒｅＦ抗原（たとえば、配列番号６によって説明される例となる実施形態）と、Ｇタンパク質成分を含んでなる第２のポリペプチドを含んでなる。Ｇタンパク質成分は通常、Ｇタンパク質の少なくともアミノ酸番号１４９〜２２９を含んでなる。Ｇタンパク質のさらに小さな部分を使用することができるが、そのような断片は、少なくともアミノ酸番号１８４〜１９８の免疫的に優勢なエピトープを含んでなるべきである。或いは、Ｇタンパク質は、任意で、たとえば、完全長のＧタンパク質又はキメラポリペプチドのようなさらに大きな部分の要素としてアミノ酸番号１２８〜２２９又は１３０〜２３０のようなＧタンパク質のさらに大きな部分を含んでなることができる。
【００３０】
他の実施形態では、免疫原性組成物は、Ｇタンパク質成分（配列番号８及び１０で説明される例となる実施形態）も含んでなるキメラタンパク質であるＰｒｅＦ抗原を含んでなる。そのようなキメラＰｒｅＦ（又はＰｒｅＦ−Ｇ）抗原のＧタンパク質は、Ｇタンパク質の少なくともアミノ酸番号１４９〜２２９を通常含んでなる。上記で示したように、免疫優勢エピトープが保持され、ＰｒｅＦ−Ｇの立体構造が有害に影響されない限り、Ｇタンパク質のさらに小さな又はさらに大きな断片（たとえば、アミノ酸番号１２９〜２２９又は１３０〜２３０）も使用することができる。
【００３１】
任意で、免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つの追加の抗原を含んでなることもできる。たとえば、病原性生物は、たとえば、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、又はインフルエンザウイルスのような、ＲＳＶ以外のウイルスである。或いは、病原性生物はジフテリア、破傷風、百日咳、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、及びＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓのような細菌であり得る。
【００３２】
ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）のいずれかをコードする組換え核酸も本開示の特徴である。一部の実施形態では、核酸のＰｒｅＦ抗原をコードする核酸のポリヌクレオチドは、選択される宿主（たとえば、ＣＨＯ細胞、そのほかの哺乳類細胞又は昆虫細胞）での発現について最適化される。従って、発現ベクター（原核細胞又は真核細胞の発現ベクターを含んでなる）を含んでなるベクターは、本開示の特徴である。同様に、そのような核酸及びベクターを含んでなる宿主細胞は本開示の特徴である。ＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発するために対象に投与するための免疫原性組成物の文脈でそのような核酸を使用することもできる。
【００３３】
ＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶ感染の予防及び／又は治療に好都合に使用される。従って、本開示の別の態様は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法に関する。方法には、免疫的に有効な量の、ＰｒｅＦ抗原を含んでなる組成物を（ヒト対象のような）対象に投与することが含まれる。免疫的に有効な量の組成物の投与は、ＰｒｅＦ抗原上に存在するエピトープに特異的な免疫応答を誘発する。そのような免疫応答には、Ｂ細胞応答（たとえば、中和抗体の産生）及び／又はＴ細胞応答（たとえば、サイトカインの産生）を挙げることができる。好都合には、ＰｒｅＦ抗原によって誘発される免疫応答には、ＲＳＶのＦタンパク質の前融合立体構造上に存在する少なくとも１つの立体構造エピトープに特異的である要素が含まれる。ＰｒｅＦ抗原及び組成物は、ＲＳＶとの接触に続くウイルス性疾患を増強することなく対象に投与することができる。好都合に、本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原及び好適に製剤化される免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減する又は予防する及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的応答を軽減する又は予防するＴｈ１に偏った免疫応答を誘発する。
【００３４】
免疫原性組成物は、たとえば、鼻内のような経路を含んでなる種々の経路を介して投与することができ、上部気道の粘膜にＰｒｅＦ抗原を直接接触させる。或いは、たとえば、筋肉内の投与のようなさらに従来の投与経路を採用することができる。
【００３５】
従って、ＲＳＶ感染を治療する（たとえば、ＲＳＶ感染を予防的に治療する又は予防する）ための医薬の調製における、開示されるＲＳＶ抗原（又は核酸）のいずれかの使用も企図される。従って、本開示は、医薬において使用するために、開示される組換えＲＳＶ抗原又は免疫原性組成物、並びにＲＳＶ関連の疾患の予防又は治療のためのそれらの使用を提供する。
【００３６】
ＰｒｅＦ抗原、及びその使用方法に関する追加の詳細は、以下の説明及び実施例で提示される。
【００３７】
用語
本開示の種々の実施形態の再検討を円滑にするために、用語の以下の説明を提供する。本開示の文脈で追加の用語及び説明を提供することができる。
【００３８】
特に説明されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。分子生物学での一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見い出すことができる。
【００３９】
単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に示さない限り、複数の指示対象を含んでなる。同様に、語「又は」は、文脈が明瞭に示さない限り、「及び」を含んでなる。用語「複数の」は、２以上を指す。核酸又はポリペプチドに対して与えられる塩基のサイズ、アミノ酸のサイズはすべて、及び分子量又は分子質量はすべて近似であり、記載に対して提供される。さらに、抗原のような物質の濃度又はレベルに関して与えられる数値限界は近似であることが意図される。従って、濃度が少なくとも（たとえば）、２００ｐｇであると示される場合、濃度は少なくともおよそ（又は約又は〜）２００ｐｇであると理解される。
【００４０】
本明細書で記載されるものに類似の又は同等の方法及び物質が本開示の実践又は試験で使用され得るが、好適な方法及び物質は以下に記載される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」を意味する。従って、文脈が必要としない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及びその変異体「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、言及された化合物若しくは組成物（たとえば、核酸、ポリペプチド、抗原）若しくは工程、又は化合物若しくは工程の群の包含を暗示するように理解されるが、他の化合物、組成物、工程、又はそれらの群の排除を暗示しないように理解される。略記「ｅ．ｇ．」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を指すように使用される。従って、略記「ｅ．ｇ．」は用語「たとえば」と同義である。
【００４１】
ヒトの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ亜科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属の病原性ウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１１のタンパク質をコードするマイナス鎖ＲＮＡ分子である。ウイルスのＮタンパク質とのＥＮＡゲノムの堅い会合によってウイルスのエンベロープ内で包まれるヌクレオカプシドが形成される。Ｇ糖タンパク質の抗原性に基づいて、ヒトＲＳＶ株の２つの群、Ａ群とＢ群が記載されている。多数のＲＳＶ株が今日まで単離されている。ＧｅｎＢａｎｋ及び／又はＥＭＢＬの受入番号で示される例となる株は、ＷＯ２００８／１１４１４９で見つけることができ、それは、ＰｒｅＦ抗原（キメラＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）及びＰｒｅＦ抗原との組み合わせでの使用に好適なＲＳＶにＦタンパク質及びＧタンパク質の核酸配列及びポリペプチド配列を開示する目的で、参照によって本明細書に組み入れられる。追加のＲＳＶ株はＲＳＶの属の範囲内で単離され、包含されそうである。同様に、ＲＳＶの属は、遺伝的浮動、又は人工的な合成及び／又は組換えによる、天然に存在する（たとえば、以前又はその後特定された株）ものから生じる変異体を包含する。
【００４２】
用語「Ｆタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶの融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に用語「Ｇタンパク質」又は「Ｇタンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶの連結タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。多数のＲＳＶの融合及び連結タンパク質ポリペプチドが記載されており、当業者に既知である。ＷＯ２００８１１４１４９は、本開示の提出日時点で公的に利用可能な例となるＲＳＶのＦ及びＧタンパク質の変異体（たとえば、天然に存在する変異体）を提示している。
【００４３】
核酸又はポリペプチド（たとえば、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質の核酸又はポリペプチド又は類似体）を指す場合の「変異体」は、参照の核酸又はポリペプチドとは異なる核酸又はポリペプチドである。普通、変異体と参照の核酸又はポリペプチドとの間の差異は、指示対象に比べて比率的に少数の差異を構成する。
【００４４】
ポリペプチド又はタンパク質のドメインは、ポリペプチド又はタンパク質の中で構造的に定義された要素である。たとえば、「三量体化ドメイン」は、ポリペプチドの三量体への集合を促進するポリペプチド内のアミノ酸配列である。たとえば、三量体化ドメインは他の三量体化ドメイン（同一の又は異なったアミノ酸配列を持つ追加のポリペプチドの）との会合を介して三量体への集合を促進することができる。用語は、そのようなペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すのにも使用される。
【００４５】
用語「天然の」及び「天然に存在する」は、天然のままと同一状態で存在するたとえば、タンパク質、ポリペプチド、又は核酸のような要素を指す。すなわち、要素は人工的に修飾されていない。この開示の文脈で、たとえば、ＲＳＶの天然に存在する株又は単離体から得られるような、ＲＳＶタンパク質又はポリペプチドの多数の天然に存在する変異体があることが理解されるであろう。
【００４６】
用語「ポリペプチド」は、モノマーがアミド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマーを指す。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸配列を包含し、糖タンパク質のような修飾された配列を含んでなることが意図される。用語「ポリペプチド」は特に、組換え的に又は合成的に製造されるものと同様に天然に存在するタンパク質を網羅することが意図される。用語「断片」は、ポリペプチドに関してポリペプチドの一部（すなわち、部分列）を指す。用語「免疫原性の断片」は、完全長の参照のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの優勢な免疫原性のエピトープを保持するポリペプチドの断片を指す。ポリペプチド内の方向は、個々のアミノ酸のアミノ部分とカルボキシ部分の方向によって定義される、Ｃ末端方向に向かうＮ末端にて一般に言及される。ポリペプチドは、Ｎ末端又はアミノ末端からＣ又はカルボキシ末端に向かって翻訳される。
【００４７】
「シグナルペプチド」は、たとえば、小胞体の膜に対して及びそれを介して新しく合成された分泌タンパク質又は膜タンパク質を指示する短いアミノ酸配列（たとえば、およそ１８〜２５アミノ酸の長さ）である。シグナルペプチドはポリペプチドのＮ末端に位置することが多いが、普遍的ではなく、タンパク質が膜を交差した後、シグナルペプチダーゼによって切断されることが多い。シグナル配列は通常、３つの一般的な特徴：Ｎ末端の極性塩基性領域（ｎ−領域）、疎水性コア及び親水性ｃ−領域を含有する。
【００４８】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸配列」は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。該用語は、ＤＮＡの単鎖形態及び二本鎖形態を含んでなる。「単離されたポリヌクレオチド」によって、由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接する（５’末端の１つと３’末端の１つ）コーディング配列の双方と直接隣接しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’及び３’の方向は、個々のヌクレオチド単位の接続性を参照して定義され、デオキシリボース（又はリボース）糖鎖の炭素部分に従って指定される。ポリヌクレオチド配列の情報（コーディング）内容は５’から３’の方向で読み取られる。
【００４９】
「組換え」核酸は、天然に存在しない配列を有し、又は配列の２つの分離した断片の人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学的な合成によって、さらに一般的には、たとえば、遺伝子操作技法による核酸の単離された断片の人工的な操作によって達成することができる。「組換え」タンパク質は、たとえば、細菌細胞又は真核細胞のような宿主細胞に導入された非相同（たとえば、組換え）の核酸によってコードされるものである。核酸は、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現することが可能であるシグナルを有する発現ベクターに導入することができ、又は核酸は宿主細胞の染色体に統合することができる。
【００５０】
用語「非相同の」は、核酸、ポリペプチド又は別の細胞成分に関して、通常天然に見つからない場合、及び／又は異なった供給源若しくは種を起源とする成分が存在することを示す。
【００５１】
用語「精製」（たとえば、病原体又は病原体を含有する組成物に関して）は、望ましくない存在を組成物から取り除く工程を指す。精製は相対的な用語であり、微量な望ましくない成分のすべてが組成物から取り除かれることを必要としない。ワクチン生産の文脈では、精製は、たとえば、遠心、透析、イオン交換クロマトグラフィ、及びサイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティ精製又は沈殿のような工程を含んでなる。従って、用語「精製される」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、たとえば、精製された核酸の調製物は、一般的な環境、たとえば、細胞又は生化学的な反応器における核酸よりも特定のタンパク質が濃縮されるものである。実質的に純粋な核酸又はタンパク質は、所望の核酸が、調製物の全核酸含量の少なくとも５０％を表すように精製することができる。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸は、調製物の全核酸含量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上を表す。
【００５２】
「単離された」生物構成成分（たとえば、核酸分子、タンパク質又は細胞小器官）は、構成成分、たとえば、そのほかの染色体の及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞小器官が天然に存在する生物の細胞におけるそのほかの生物構成成分から実質的に分離され、又は精製されている。「単離された」核酸及びタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸及びタンパク質を含んでなる。該用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製される核酸及びタンパク質、並びに化学的に合成される核酸及びタンパク質も包含する。
【００５３】
「抗原」は、動物に注射される、吸収される又はさもなければ導入される組成物を含んでなる、動物にて抗体の産生及び／又はＴ細胞反応を刺激することができる化合物、組成物又は物質である。用語「抗原」は、関連する抗原性エピトープすべてを含んでなる。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原の部位を指す。「優勢な抗原性エピトープ」又は「優勢なエピトープ」は機能的に有意な宿主の免疫応答、たとえば、抗体反応又はＴ細胞反応が為されるエピトープである。従って、病原体に対する防御免疫応答に関して、優勢な抗原性エピトープは、宿主の免疫系によって認識されると病原体が原因で生じる疾患からの防御を生じる抗原性部分である。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、適切なＭＨＣ分子に結合すると、Ｔ細胞によって（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合されるエピトープを指す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（又はＢ細胞受容体分子）によって特異的に結合されるエピトープである。
【００５４】
「アジュバント」は、非特異的に免疫応答を高める剤である。一般的なアジュバントには、抗原が吸着した鉱物（ミョウバン、水酸化アルミナム、リン酸アルミナム）の懸濁液；油中水及び水中油（及びその変異体、二重エマルション及び逆エマルションを含んでなる）を含んでなるエマルション、リポ糖類、リポ多糖類、免疫賦活核酸（たとえば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬（特に、ＴＬＰ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８、及びＴＬＲ９の作動薬）、並びにそのような成分の種々の組み合わせが挙げられる。
【００５５】
「免疫原性組成物」は、たとえば、ＲＳＶのような病原体に対して特異的な免疫応答を誘発することが可能である、ヒト又は動物対象（たとえば、実験設定で）に投与するのに好適なものの組成物である。そのようなものとして、免疫原性組成物は、１以上の抗原（たとえば、ポリペプチド抗原）又は抗原性エピトープを含んでなる。免疫原性組成物はまた、たとえば、賦形剤、キャリア及び／又はアジュバントのような、免疫応答を誘発する又は高めることが可能である追加の１以上の成分を含んでなることができる。特定の例では、免疫原性組成物を投与して、病原体によって誘導される症状又は状態に対して対象を防御する免疫応答を誘発する。場合によっては、病原体が原因で生じる症状又は疾患は、病原体に対する対象の暴露に続く病原体（たとえば、ＲＳＶ）の複製を阻害ずることによって防がれる（又は軽減される又は改善される）。本開示の文脈では、用語、免疫原性組成物は、病原体に対する予防的な又は緩和的な免疫応答を誘発する目的で対象又は対象の集団への投与を意図される組成物を包含することが理解されるであろう（すなわち、ワクチン組成物又はワクチン）。
【００５６】
「免疫応答」は、免疫系の細胞、たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は単球の刺激への応答である。免疫応答は、抗原特異的な中和抗体のような特異的抗体の産生を生じるＢ細胞の応答であることができる。免疫応答は、たとえば、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋応答のようなＴ細胞の応答であることもできる。場合によっては、応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。抗原が病原体に由来するのであれば、抗原特異的応答は、「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」は、病原体の有害な機能又は活性を抑え、病原体による感染を低減し、病原体による感染の結果生じる症状（死亡を含んでなる）を減らす免疫応答である。防御免疫応答は、たとえば、プラーク低減アッセイ若しくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製若しくはプラーク形成の阻害によって、又は生体内での病原体負荷に対する耐性を測定することによって測定することができる。
【００５７】
「Ｔｈ１」に偏った免疫応答は、ＩＬ−２及びＩＦＮγを産生するのでＩＬ−２及びＩＦＮγの分泌又は存在によるＣＤ４＋ヘルパー細胞の存在を特徴とする。それに対して、「Ｔｈ２」に偏った免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋ヘルパー細胞の優勢を特徴とする。
【００５８】
「免疫学的に有効な量」は、組成物又は組成物中の抗原に対して対象にて免疫応答を誘発するのに使用される組成物（通常、免疫原性組成物）の量である。一般に、所望の成績は、病原体に対して対象を防御することが可能である又はそれに寄与する抗原特異的（たとえば、病原体特異的）免疫応答の産生である。しかしながら、病原体に対する防御免疫応答を得ることは、免疫原性組成物の複数の投与を必要とし得る。従って、本開示の文脈では、用語、免疫学的に有効な量は、前の又は後に続く投与との組み合わせで防御免疫応答を達成することに寄与する小部分の用量を包含する。
【００５９】
形容詞「薬学上許容可能な」は、指示対象が対象（たとえば、ヒト又は動物対象）への投与に好適であることを指す。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版（１９７５）は、免疫原性組成物を含んでなる、治療用及び／又は予防用の組成物の薬学送達に好適な組成物及び製剤（希釈剤を含んでなる）を記載している。
【００６０】
用語「調節する」は、免疫応答のような応答に関して、応答の発症、程度、持続期間又は特徴を変える又は変化させることを意味する。免疫応答を調節する剤は、その投与に続く免疫応答の発症、程度、持続期間又は特徴の少なくとも１つを変える、又は参照剤に比べて発症、程度、持続期間又は特徴の少なくとも１つを変える。
【００６１】
用語「軽減する」は、剤の投与に続いて応答又は状態が定量的に低下するならば、又は参照剤に比べて剤の投与に続いてそれが低下するのであれば、剤が応答又は状態を軽減するように、相対的な用語である。同様に用語「予防する」は、応答又は状態の少なくとも１つの特徴が除去される限り、剤が応答又は状態を完全に除去することを必ずしも意味しない。従って、病的応答、たとえば、ワクチンが増強するウイルス性疾患のような感染又は応答を軽減する又は予防する免疫原性組成物は、感染又は応答が、剤の非存在下での又は参照剤と比べた感染又は応答の、たとえば、少なくとも約５０％、たとえば、少なくとも約７０％、約８０％、さらに約９０％測定上低下する限り、そのような感染又は応答を完全に除去することができるが、必ずしも完全には除去しない。
【００６２】
「対象」は、生きている多細胞の脊椎生物である。本開示の文脈では、対象は、たとえば、非ヒト動物、たとえば、マウス、コットンラット又は非ヒト霊長類のような実験用対象であり得る。或いは、対象はヒト対象であり得る。
【００６３】
ＰｒｅＦ抗原
本来は、ＲＳＶのＦタンパク質は、Ｆ０と命名された単一のポリペプチド前駆体、長さ５７４のアミノ酸として発現される。生体内で、Ｆ０は、小胞体にてオリゴマー化され、２つの保存されたフリンコンセンサス配列（フリン切断部位）、ＲＡＲＲ１０９（配列番号１５）とＲＫＲＲ１３６（配列番号１６）にてフリンプロテアーゼによってタンパク分解処理を受けて、２つのジスルフィド結合断片から成るオリゴマーを生成する。これら断片の小さい方はＦ２と呼ばれ、Ｆ０前駆体のＮ末端を起源とする。略記、Ｆ０、Ｆ１及びＦ２は科学文献では一般にＦ０、Ｆ１及びＦ２と示されることが当業者によって認識されるであろう。大きい方のＣ末端Ｆ１断片は、２４アミノ酸の細胞質尾部に隣接する疎水性アミノ酸の配列を介して膜にてＦタンパク質を固定する。３つのＦ２−Ｆ１二量体が会合して成熟Ｆタンパク質を形成し、それは、標的細胞膜との接触の際、立体構造変化を受けるきっかけとなる準安定的な前融合形成（「前融合」）の立体構造を取る。この立体構造変化は、融合ペプチドとして知られる疎水性配列を剥き出しにし、それは、宿主細胞の膜と会合し、標的細胞膜とのウイルス又は感染細胞の膜の融合を促進する。
【００６４】
Ｆ１断片は、ＨＲＡ及びＨＲＢと命名され、それぞれ融合ペプチド及び膜貫通アンカードメインの近傍に位置する少なくとも２つの７個反復ドメインを含有する。前融合の立体構造では、Ｆ２−Ｆ１二量体は、球形の頭部と茎構造を形成し、そこでＨＲＡドメインは球形の頭部における断片化（伸長した）構成の中にある。それに対して、ＨＲＢドメインは、頭部領域から伸びる三本鎖のコイルドコイルの茎を形成する。前融合から後融合の立体構造への転移の間、ＨＲＡドメインは崩壊し、ＨＲＢドメインの近傍にもたらされ、逆平行の６らせん束を形成する。後融合の状態で、融合タンパク質と膜貫通ドメインは、並置されて膜の融合を円滑にする。
【００６５】
上記で提供された立体構造の記載は、結晶学データの分子モデル化に基づくが、前融合と後融合の立体構造の構造的な識別は、結晶学への手段なしでモニターできる。たとえば、その技術的教示の目的で、参照によって本明細書に組み入れられるＣａｌｄｅｒらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，２７１：１２２−１３１（２０００）及びＭｏｒｔｏｎらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，３１１：２７５−２８８によって明らかにされたように、電子顕微鏡を用いて前融合と後融合（代わりに指定された前融合と融合）の立体構造の間を区別することができる。また、その技術的教示の目的で、参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｎｎｏｌｌｙらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１７９０３−１７９０８（２００６）により記載されたようなリポソーム会合アッセイによって前融合の立体構造を融合（後融合）の立体構造から区別することができる。さらに、ＲＳＶのＦタンパク質の前融合形態又は融合形態の１つ又はその他に存在するが、他の形態には存在しない立体構造エピトープを特異的に認識する抗体（たとえば、モノクローナル抗体）を用いて前融合の立体構造と融合の立体構造を区別することができる。そのような立体構造のエピトープは、分子の表面における抗原決定基の優先的な暴露による。或いは、立体構造のエピトープは、直鎖ポリペプチドで隣接しないアミノ酸の並置から生じ得る。
【００６６】
本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原は、発現されたタンパク質の集団にて、発現されたタンパク質の集団の実質的な部分が、前融合（前融合）の立体構造にあるように（たとえば、構造的な及び／又は熱動態的なモデル化によって予測されるように又は上記で開示された方法の１以上によって評価されるように）、ＲＳＶのＦタンパク質の前融合の立体構造を安定化させ、維持するように設計される。Ｆタンパク質の前融合立体構造の主な免疫原性エピトープが、細胞環境又は細胞外環境（たとえば、対象への投与に続く生体内での）へのＰｒｅＦ抗原の導入に続いて維持されるように、安定化する修飾は、天然（又は合成）のＦタンパク質、たとえば、配列番号２の例となるＦタンパク質のような天然の（又は合成の）Ｆタンパク質に導入される。
【００６７】
先ず、Ｆ０ポリペプチドの膜アンカードメインを置き換えるためにヘテロ安定化ドメインを構築物のＣ末端に置くことができる。この安定化ドメインは、ＨＲＢの不安定性を代償し、前融合の配座異性体を安定化するのを助けると予測される。例となる実施形態では、ヘテロ安定化ドメインはタンパク質多量体化ドメインである。そのようなタンパク質多量体化ドメインの特に好都合な一例は、三量体化ドメインである。例となる三量体化ドメインは、コイルドコイルドメインを有する複数のポリペプチドの三量体への集合を促進するそのようなコイルドコイルに折り畳む。三量体化ドメインの好都合な一例は、イソロイシンジッパーである。例となるイソロイシンジッパーは、ＨａｒｂｕｒｙらのＳｃｉｅｎｃｅ，２６２：１４０１−１４０７（１９９３）によって記載された操作された酵母ＧＣＮ４イソロイシン変異体である。好適なイソロイシンジッパードメインの配列の１つは配列番号１１で表されるが、コイルドコイル安定化ドメインを形成する能力を保持するこの配列の変異体も同様に好適である。代わりの安定化コイルドコイル三量体化ドメインには、ＴＲＡＦ２（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号．Ｑ１２９３３［ｇｉ：２３５０３１０３］；アミノ酸番号２９９−３４８）；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ１（受入番号．ＰＯ７９９６［ｇｉ：１３５７１７］；アミノ酸番号２９１−３１４）；Ｍａｔｒｉｌｉｎ−４（受入番号．Ｏ９５４６０［ｇｉ：１４５４８１１７］；アミノ酸番号５９４−６１８；ＣＭＰ（ｍａｔｒｉｌｉｎ−１）（受入番号．ＮＰ＿００２３７０［ｇｉ：４５０５１１１］；アミノ酸番号４６３−４９６；ＨＳＦ１（受入番号．ＡＡＸ４２２１１［ｇｉ：６１３６２３８６］；アミノ酸番号１６５−１９１；及びＣｕｂｉｌｉｎ（受入番号．ＮＰ＿００１０７２［ｇｉ：４５５７５０３］；アミノ酸番号１０４−１３８が挙げられる。好適な三量体ドメインは、発現されたタンパク質の実質的な部分の三量体への集合を生じることが期待される。たとえば、三量体化ドメインを有する組換えＰｒｅＦポリペプチドの少なくとも５０％が三量体を形成する（たとえば、ＡＦＦ−ＭＡＬＳによって評価されるように）。通常、発現されたポリペプチドの少なくとも６０％、さらに好都合には少なくとも７０％、最も望ましくは少なくとも約７５％が三量体として存在する。
【００６８】
ＨＲＢを一層さらに安定化させるために、ＨＲＢ内の中性残基（たとえば、ロイシン、イソロイシン又はバリン）を極性残基（たとえば、リジン、アルギニン又はグルタミン）で置換することができる。たとえば、ＲＳＶのＦ抗原の文脈では、ＴｒｅＦの５１２位（天然のＦ０タンパク質に対して）に位置するロイシン残基をリジンで置換することができる（配列番号６の例となるＰｒｅＦ抗原のＬ４８２Ｋ）。この置換は、コイルドコイル疎水性残基の周期性を改善する。同様に、１０５位のアミノ酸に続いてリジンを付加することができる。
【００６９】
第２に、ｐｅｐ２７を取り除くことができる。前融合状態でのＲＳＶのＦタンパク質の構造モデルの解析は、ｐｅｐ２７が、Ｆ１とＦ２の間で大きな非拘束のループを創ることを示唆している。このループは、前融合状態の安定化に寄与することはなく、フリンによる天然のタンパク質の切断に続いて取り除かれる。
【００７０】
第３に、フリン切断モチーフの一方又は双方を欠失させることができる。加えて、フリン切断モチーフの欠失（ｈＭＶＰ及びＰＩＶの場合は１つ、ＲＳＶの場合は１つ又は両方）はさらに前融合の配座異性体を安定化する。この設計によって、融合タンパク質はＦ２から切断されず、前融合の配座異性体の球形頭部からの放出を妨げ、すぐ近くの膜への接近性を妨げる。融合タンパク質と膜界面との間の相互作用が前融合状態の不安定性における主な課題であると予測される。融合工程の間、融合ペプチドと標的膜の間の相互作用は、球形頭部構造内からの融合ペプチドの暴露を生じ、前融合状態の不安定性を高め、後融合の配座異性体に折り畳む。この立体構造の変化によって膜融合の工程が可能になる。フリン切断部位の１つ又は両方の除去は、融合ペプチドのＮ末端部分への膜接近性を妨げ、前融合状態を安定化させると予測される。従って、本明細書で開示される例となる実施形態では、フリン切断モチーフの除去は、未変化の融合ペプチドを含んでなるＰｒｅＦ抗原を生じ、それは、プロセッシング及び集合の間又はそれに続いてフリンによって切断されない。
【００７１】
任意で、たとえば、１以上のアミノ酸の置換によって少なくとも１つの非フリン切断部位を取り除くことができる。たとえば、実験的証拠は、特定のメタロプロテイナーゼによる切断につながる条件下では、Ｆタンパク質はアミノ酸番号１１０〜１１８の近傍で切断され得る（たとえば、ＰｒｅＦ抗原のアミノ酸番号１１２と１１３の間；配列番号２の参照Ｆタンパク質ポリペプチドの１４２位のロイシンと１４３位のグリシンの間で切断が生じる）。従って、この領域内での１以上のアミノ酸の修飾は、ＰｒｅＦ抗原の切断を低下させ得る。たとえば、１１２位のロイシンは、たとえば、イソロイシン、グルタミン又はトリプトファン（配列番号２０の例となる実施形態で示されるような）のような異なったアミノ酸で置換することができる。代わりに又はさらに、１１３位のグリシンは、セリン又はアラニンによって置換することができる。
【００７２】
任意で、ＰｒｅＦ抗原は、たとえば、天然のＦタンパク質ポリペプチドに存在する１以上のグリコシル化部位でグリコシル化された分子の比率を上げる又は下げることによって、グリコシル化のパターン又は状況を変える１以上の修飾を含んでなることができる。たとえば、配列番号２の天然のＲＳＶタンパク質ポリペプチドは、２７位、７０位及び５００位（配列番号１０の例となるＰｒｅＦ抗原の２７位、７０位及び４７０位に対応する）でのアミノ酸にてグリコシル化されると予測される。一実施形態では、修飾は、５００位のアミノ酸（Ｎ４７０と命名）でのグリコシル化部位の近傍に導入される。たとえば、５００位（参照配列の、例となるＰｒｅＦ抗原の４７０位の配置に対応する）のアスパラギンの代わりにグルタミン（Ｑ）のようなアミノ酸を置換することによってグリコシル化部位を取り除くことができる。好都合には、このグリコシル化部位でグリコシル化効率を高める修飾が導入される。好適な修飾の例には、５００〜５０２位にて以下のアミノ酸配列：ＮＧＳ；ＮＫＳ；ＮＧＴ；ＮＫＴが挙げられる。興味深いことに、高いグリコシル化を生じるこのグリコシル化部位の修飾はまた実質的に高いＰｒｅＦ産生を生じる。従って、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、参照ＰｒｅＦ配列（配列番号２）のアミノ酸番号５００に対応する位置で、たとえば、配列番号１０によって例示されるＰｒｅＦ抗原の４７０位にて修飾されたグリコシル化部位を有する。好適な修飾には、参照Ｆタンパク質配列の５００〜５０２位に対応するアミノ酸での、配列：ＮＧＳ；ＮＫＳ；ＮＧＴ；ＮＫＴが挙げられる。「ＮＧＴ」の修飾を含んでなる例となる実施形態のアミノ酸は、配列番号１８にて提供される。当業者は、対応するＮＧＳ、ＮＫＳ及びＮＫＴについての同様の修飾を容易に決定することができる。そのような修飾は、本明細書で開示される安定化変異（たとえば、イソロイシンジッパーのようなヘテロコイルドコイル、疎水性領域におけるドメイン及び／又は修飾）、及び／又はｐｅｐ２７の除去、及び／又はフリン切断部位の除去、及び／又は非フリン切断部位の除去、及び／又は非フリン切断部位の除去）のいずれかと好都合に組み合わせられる。たとえば、特定の一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は非フリン切断部位を消失させる置換とグリコシル化を高める修飾を含んでなる。例となる配列は、配列番号２２（例となる実施形態が、「ＮＧＴ」の修飾と１１２位でのロイシンに代わるグルタミンの置換を含んでなる）にて提供される。
【００７３】
さらに一般的には、本明細書で開示される安定化の修飾、たとえば、好ましくは可溶性ＰｒｅＦ抗原のＣ末端に位置する、たとえば、コイルドコイル（たとえば、イソロイシンジッパードメイン）のような非相同の安定化ドメインの付加；疎水性ＨＲＢドメインにおけるロイシンからリジンへのような残基の修飾；ｐｅｐ２７の除去；フリン切断モチーフの一方又は双方の除去；非フリン切断部位の除去；及び／又はグリコシル化部位の修飾のいずれか１つを、ほかの安定化修飾の１以上との組み合わせにて（又は全部くるめた組み合わせまで）採用することができる。たとえば、ヘテロコイルドコイル（又はそのほかのヘテロ安定化ドメイン）を単独で利用することができ、又は疎水性領域の修飾及び／又はｐｅｐ２７の除去及び／又はフリン切断部位の除去及び／又は非フリン切断部位の除去いずれかと組み合わせて利用することができる。特定の特殊な実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、Ｃ末端のコイルドコイル（イソロイシンジッパー）ドメイン、ＨＲＢ疎水性ドメインにおける安定化置換、及びフリン切断部位の一方又は双方の除去を含んでなる。そのような実施形態は、フリン切断によって除去されない未変化の融合ペプチドを含んでなる。特定の一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はまた５００位のアミノ酸にて修飾されたグリコシル化部位を含んでなる。
【００７４】
天然のＦタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶのＡ株又はＲＳＶのＢ株又はその変異体（上記と同義）のＦタンパク質から選択することができる。特定の例となる実施形態では、Ｆタンパク質ポリペプチドは、配列番号２で表されるＦタンパク質である。本開示の理解を円滑にするために、アミノ酸残基の位置は、株にかかわりなく、例となるＦタンパク質の１つのアミノ酸の位置（すなわち、対応するアミノ酸残基の位置に関して与えられる。ほかのＲＳＶのＡ株又はＢ株の匹敵するアミノ酸の位置は、容易に利用でき、周知の配置アルゴリズム（たとえば、ＢＬＡＳＴ、たとえば、初期設定パラメータを用いて）を用いて例となる配列と共に選択されたウイルスのＦタンパク質のアミノ酸配列を並べることによって当業者によって容易に決定することができる。異なったＲＳＶ株に由来するＦタンパク質ポリペプチドの多数の追加の例は、ＷＯ２００８／１１４１４９（ＲＳＶのＦ及びＧのタンパク質配列の追加の例を提供する目的で参照によって本明細書に組み入れられる）に開示されている。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である。
【００７５】
Ｆタンパク質の選択するＦ２及びＦ１のドメインでは、当業者は、Ｆ２及び／又はＦ１のドメイン全体を厳格に含んでなる必要はないことを認識するであろう。通常、Ｆ２ドメインの配列（又は断片）を選択する場合、立体構造の考慮が重要である。従って、Ｆ２ドメインは通常、ポリペプチドの集合と安定性を円滑にするＦ２ドメインの部分を含んでなる。特定の例となる変異体では、Ｆ２ドメインはアミノ酸番号２６〜１０５を含んでなる。しかしながら、長さにおける瑣末な修飾（１以上のアミノ酸の付加又は欠失による）を有する変異体も可能である。
【００７６】
通常、Ｆ１ドメインの少なくとも部分列（又は断片）は、Ｆタンパク質の免疫優勢エピトープを含んでなる安定な立体構造を維持するように選択され、設計される。たとえば、アミノ酸番号２６２〜２７５（パリビツマブ中和）及び４３３〜４３６（Ｃｅｎｔｏｃｏｒのｃｈ１０１ＦＭＡｂ）の領域で抗体を中和することによって認識されるエピトープを含んでなるＦ１ポリペプチドドメインの部分列を選択することが一般に望ましい。さらに、たとえば、アミノ酸番号３２８〜３５５の領域でＴ細胞エピトープを含んでなることが望ましい。最も一般的には、Ｆ１サブユニット（たとえば、貫通アミノ酸番号２６２〜４３６）の単一の隣接部分として、しかし、エピトープは安定な立体構造を形成する不連続な要素としてこれらの免疫優勢エピトープを含んでなる合成配列で保持され得る。従って、Ｆ１ドメインのポリペプチドは、ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも約２６２〜４３６のアミノ酸を含んでなる。非限定の一例では、Ｆ１ドメインは、天然のＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸番号１３７〜５１６を含んでなる。当業者は、追加のさらに短い配列を熟練者の裁量で使用できることを認識するであろう。
【００７７】
立体構造の考慮に加えて、Ｆ２又はＦ１のドメインの部分列を選択する場合（又は特定のＰｒｅＦ−Ｇ抗原のＧタンパク質成分に関して以下で議論するように）、追加の免疫原性エピトープの包含に基づいて配列（たとえば、変異体、部分列まど）を選択することが望ましくてもよい。たとえば、当該技術で既知の、たとえば、神経網又は多項式決定のようなアンカーモチーフ又はそのほかの方法を用いて、追加のＴ細胞エピトープを特定することができ、たとえば、ＲＡＮＫＰＥＰ（ウエブサイト：ｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌで利用可能）；ＰｒｏＰｒｅｄＩ（ウエブサイト：ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄＩ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）；Ｂｉｍａｓ（ウエブサイト：ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）；及びＳＹＦＰＥＩＴＨ（ウエブサイト：ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍで利用可能）を参照のこと。たとえば、アルゴリズムを用いてペプチドの「結合閾値」を決定し、特定の親和性で結合するＭＨＣ又は抗体の高い確率をそれらに与えるスコアを持つものを選択する。アルゴリズムは、特定の位置での特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、特定の位置での特定のアミノ酸の抗体結合に対する効果、又はモチーフを含有するペプチドの特定の置換の結合に対する効果のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの文脈の範囲内で、「保存された残基」は、ペプチドの特定の位置で無作為な分布で予想されるものより有意に高い頻度で出現するものである。アンカー残基はＭＨＣ分子との接触点を提供する保存された残基である。そのような予測方法で特定されるＴ細胞エピトープは、特定のＭＨＣタンパク質への結合を測定することによって、及びＭＨＣタンパク質の背景で提示される場合Ｔ細胞を刺激するその能力によって確認することができる。
【００７８】
好都合には、ＰｒｅＦ抗原（以下で議論されるＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）は、発現系に対応するシグナルペプチド、たとえば、哺乳類又はウイルスのシグナルペプチド、たとえば、ＲＳＶのＦ０の天然のシグナル配列（たとえば、配列番号２のアミノ酸番号１〜２５又は配列番号６のアミノ酸番号１〜２５）を含んでなる。通常、シグナルペプチドは、組換え発現で選択される細胞に適合するように選択される。たとえば、バキュロウイルスのシグナルペプチド又はメリチンシグナルペプチドのようなシグナルペプチドは、昆虫細胞における発現について置換され得る。植物の発現系が好まれるのであれば、好適な植物シグナルペプチドが当該技術で既知である。多数の例となるシグナルペプチドが当該技術で既知であり（たとえば、多数のヒトのシグナルペプチドを記載しているＺｈａｎｇ ＆ Ｈｅｎｚｅｌ, Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ., １３：２８１９‐２８２４ （２００４）を参照）、古細菌、原核生物及び真核生物のシグナル配列を含んでなるＳＰｄｂシグナルペプチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／）にてカタログ化されている。任意で、先行の抗原のいずれかが追加の配列、又はＨｉｓタグのようなタグを含んで精製を円滑にすることができる。
【００７９】
任意で、ＰｒｅＦ抗原は追加の免疫原性成分を含んでなることができる。特定の特に好都合な実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はＲＳＶのＧタンパク質の抗原性成分を含んでなる。ＰｒｅＦ及びＧの成分を有する例となるキメラタンパク質には、以下のＰｒｅＦ＿Ｖ１（配列番号７及び８で表される）及びＰｒｅＦＶ２（配列番号９及び１０で表される）が挙げられる。
【００８０】
ＰｒｅＦ−Ｇ抗原では、Ｇタンパク質（たとえば、アミノ酸残基番号１４９〜２２９のような切り詰めＧタンパク質）の抗原性部分を構築物のＣ末端に付加する。通常、Ｇタンパク質成分は、自由度のあるリンカー配列を介してＦタンパク質成分に連結される。たとえば、例となるＰｒｅＦ＿Ｖ１の設計では、Ｇタンパク質は、−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ−リンカー（配列番号１４）によってＰｒｅＦ成分に連結される。ＰｒｅＦ＿Ｖ２の設計では、リンカーはさらに短い。−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ−リンカー（配列番号１４）の代わりに、ＰｒｅＦ＿Ｖ２は２つのグリシン（−ＧＧ−）をリンカーに有する。
【００８１】
存在する場合、Ｇタンパク質ポリペプチドドメインは、ＲＳＶのＡ株又はＲＳＶのＢ株から選択されるＧタンパク質のすべて又は一部を含んでなることができる。特定の例となる実施形態では、Ｇタンパク質は、配列番号４で表されるＧタンパク質である（又はそれと９５％同一である）。好適なＧタンパク質配列の追加の例は、ＷＯ２００８／１１４１４９（参照によって本明細書に組み入れられる）に見つけることができる。
【００８２】
Ｇタンパク質ポリペプチド成分は、アミノ酸番号１８３〜１９７の領域で免疫優勢なＴ細胞エピトープを保持するＧタンパク質の少なくとも部分列（又は断片）、たとえば、天然のＧタンパク質のアミノ酸番号１５１〜２２９、１４９〜２２９又は１２８〜２２９を含んでなるＧタンパク質の断片を含んでなるように選択される。例となる一実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、天然のＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基番号１４９〜２２９の全部又は一部を含んでなる、天然のＧタンパク質ポリペプチドの部分列（又は断片）である。当業者は、選択される部分が、ＰｒｅＦ−Ｇの発現、折り畳み又はプロセッシングを構造的に不安定化又は破壊しない限り、Ｇタンパク質のさらに長い又は短い部分を使用できることを容易に十分に理解するであろう。任意で、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンと関連する好酸球増多を特徴とする増強された疾患を軽減する及び／又は防ぐことが以前示された１９１位にて、Ｇタンパク質ドメインはアミノ酸置換を含んでなる。天然に存在する及び置換された（Ｎ１９１Ａ）Ｇタンパク質の特性の完全な記載は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００５／００４２２３０に見つけることができる。
【００８３】
たとえば、天然に存在する株に対応する配列の選択に関して、１以上のドメインが、たとえば、Ａ２若しくはロングと命名された一般の研究室単離体、又はそのほかの天然に存在する株若しくは単離体（前述のＷＯ２００８／１１４１４９で開示されたような）のようなＲＳＶのＡ株又はＢ株に配列では対応し得る。そのような天然に存在する又は単離される変異体に加えて、前述の配列と配列類似性を共有する操作された変異体もＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）抗原の文脈で採用され得る。ポリペプチド（及び一般にヌクレオチド配列）に関してＰｒｅＦ抗原ペプチド（及び以下に記載されるポリヌクレオチド配列）間の類似性は、配列同一性を参照して配列間での類似性という点で表現され得る。配列同一性は、同一性（又は類似性）比率という点で測定されることが多く；比率が高ければ高いほど、２つの配列の一次構造はよく類似する。一般に、２つのアミノ酸（又はポリヌクレオチド）の配列の一次構造が似ていれば似ているほど、折り畳み及び集合の結果生じる高次構造も類似する。ＰｒｅＦポリペプチド（又はポリヌクレオチド）配列の変異体は通常、１又は少数のアミノ酸の欠失、付加又は置換を有するが、それでもなお、非常に高い比率でアミノ酸、一般にはそのポリヌクレオチド配列を共有する。さらに重要なことに、変異体は、本明細書で開示される参照配列の構造的な特性、従って立体構造の特性を保持する。
【００８４】
配列同一性を決定する方法は当該技術で周知であり、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチド、並びにそれをコードする核酸に適用可能である（たとえば、下記のように）。種々のプログラム及び配置アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１０８８１，１９８８；並びにＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列配置法と相同性算出の詳細な考察を提示している。ＮＣＢＩ基本的な局在配置検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３, １９９０）は、配列解析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、全米バイオテクノロジー情報センター（ＭＤ州、ベセスダ、ＮＣＢＩ）を含んでなる幾つかの供給源、及びインターネットにて利用可能である。このプログラムを用いて配列同一性の決定の仕方の記載はインターネットのＮＶＢＩウエブサイトで利用可能である。
【００８５】
一部の例では、ＰｒｅＦ抗体は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に比べて１以上のアミノ酸修飾を有する（たとえば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差異は、１以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換であり得る。変異体は通常、アミノ酸残基の約１％又は２％又は５％又は６％又は１０％又は１５％又は２０％以下異なる。たとえば、変異体ＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）ポリペプチド配列は、配列番号６、８、１０，１８、２０及び／又は２２の例となるＰｒｅＦ抗原ポリペプチド配列の例となるＰｒｅＦ抗原と比べて、１又は２又は５までの又は約１０までの、又は約１５までの、又は約５０までの又は約１００までのアミノ酸の差異を含んでなり得る。従って、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質又はＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）の文脈では変異体は、通常、配列番号６、８、１０，１８、２０及び／又は２２で説明される参照タンパク質との、又は本明細書で開示される例となるＰｒｅＦ抗原のいずれかとの、少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には、少なくとも約９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。本開示の特徴として含まれる追加の変異体には、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示された天然に存在する変異体から選択されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の全部又は一部を含んでなるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）である。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である。たとえば、修飾は、得られるＰｒｅＦ抗原の立体構造又は免疫原性エピトープを変化させない１以上の（たとえば、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、１０までのアミノ酸、以上）の置換であり得る。
【００８６】
代わりに又はさらに、修飾は、１以上のアミノ酸の欠失及び／又は１以上のアミノ酸の付加を含んでなることができる。実際、所望であれば、１以上のポリペプチドドメインは、単一株に一致しないが、複数株、又はさらにＲＳＶのポリペプチドの複数の株を並べることによって推定されるコンセンサス配列に由来する成分部分列を含んでなる合成ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、その後の処理又は精製を円滑にするタグを構成するアミノ酸配列の付加によって１以上のポリペプチドドメインが修飾される。そのようなタグは抗原性タグ、又はエピトープタグ、酵素タグ又はポリヒスチジンタグであり得る。通常、タグは、たとえば、抗原又は融合タンパク質のＣ末端又はＮ末端のようなタンパク質の一方又は他方の末端に位置する。
【００８７】
ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸
本開示の別の態様は、上述のようなＰｒｅＦ抗原をコードする組換え核酸に関する。さらに明確には、そのような核酸は、パラミクソウイルスのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなるＦタンパク質ポリペプチド抗原を含んでなるポリペプチドをコードし、それは、（ｉ）ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加、（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、（ｉｉｉ）非フリン切断部位の欠失、（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失及び（ｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。任意で、そのようなポリヌクレオチドはグリコシル化部位で修飾を伴うＰｒｅＦ抗原をコードする。そのようなポリペプチドの性質及び構造の詳細は上記で詳細に開示している。当業者は、配列表で提供される、さもなければ本開示に（たとえば、参照による組み入れによって）含まれる例となる配列を含んでなる本明細書での教示に基づいた記載されるポリペプチド配列のいずれか及びすべてをコードするヌクレオチド配列を容易に決定することができる。
【００８８】
特定の実施形態では、組換え核酸は、選択される原核又は真核の宿主細胞での発現についてコドンが最適化される。たとえば、配列番号５、１２、１７、１９及び２１は、ＰｒｅＦ抗原をコードし、哺乳類、たとえば、ＣＨＯ細胞での発現についてコドンが最適化されている配列の異なった説明の非限定の例である。複製と発現を円滑にするために、核酸を、たとえば、原核又は真核の発現ベクターのようなベクターに組み入れることができる。組換えのＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含んでなる宿主も本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、たとえば、大腸菌のような原核生物（すなわち、細菌）の宿主細胞、並びに真菌（たとえば、酵母）細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ及びＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。
【００８９】
複製と発現を円滑にするために、核酸を、たとえば、原核又は真核の発現ベクターのようなベクターに組み入れることができる。本明細書で開示される核酸を種々のベクター（たとえば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスなどのようなウイルスＤＮＡを含んでなる）に含めることができるが、最も一般的には、ベクターはポリペプチドの発現産物を生成するのに好適な発現ベクターである。発現ベクターでは、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は通常、ｍＲＮＡ合成に向かう適切な転写制御配列（プロモータ及び任意で１以上のエンハンサ）の近傍に且つその方向で配置される。すなわち、当該のポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列に操作可能に連結される。そのようなプロモータの例にはＣＭＶの即時早期プロモータ、ＬＴＲ又はＳＶ４０のプロモータ、バキュロウイルスの多面体プロモータ、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモータ、ファージＴ７及びラムダＰＬプロモータ、及び原核細胞又は真核細胞又はウイルスにおける遺伝子の発現を制御する既知のそのほかのプロモータが挙げられる。発現ベクターは通常、翻訳開始及び転写停止のためのリボソーム結合部位も含有する。ベクターは任意で発現を増幅するための適当な配列を含んでなる。加えて、発現ベクターは任意で、１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んで、形質転換した宿主細胞の表現型形質を提供するが、たとえば、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、又は大腸菌におけるカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性若しくはアンピシリン耐性である。
【００９０】
発現ベクターは、たとえば、翻訳の効率を改善するための追加の発現要素も含んでなることができる。これらのシグナルには、たとえば、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が挙げられる。場合によっては、たとえば、翻訳開始コドン及び関連する配列要素を当該ポリヌクレオチド配列（たとえば、天然の開始コドン）と同時に適当な発現ベクターに挿入する。そのような場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、ポリペプチドをコードする配列又はその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含んでなる外因性の翻訳制御シグナルがＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の翻訳に提供される。開始コドンを正しい読み取りフレームに置いて当該ポリヌクレオチド配列の翻訳を確保する。外因性の転写要素及び開始コドンは種々の起源、天然及び合成由来であってもよい。所望であれば、使用中の細胞系に適したエンハンサを含めることによって発現の効率をさらに高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１２５‐６２ （１９９４）； Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６−５４４ （１９８７））。
【００９１】
一部の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸（たとえば、ベクター）は、宿主に導入された際、ＰｒｅＦをコードする核酸の発現を高める及び／又は最適化するように選択される１以上の追加の配列要素を含んでなる。たとえば、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、たとえば、ヒトのヘルペスウイルス５イントロン配列（たとえば、配列番号１３を参照）のようなイントロン配列を含んでなる。イントロンは、組換え構築物にて適切に配置されると相同性及びヘテロの核酸の発現を高めることが繰り返し明らかにされている。発現を高める別の部類の配列には、マトリクス連結領域（又はＭＡＲ）のような遺伝子外要素、又はＳＴＡＲ要素（たとえば、Ｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ. ２３：８０１‐８０７, ２００７で開示されたようなＳＴＡＲ）のような類似の遺伝子外要素が挙げられる。理論に束縛されないで、ＭＡＲは核マトリクスへの標的ＤＮＡ配列の固定の介在し、ヘテロクロマチンのコアから外に向かって延びるクロマチンループドメインを生成すると考えられている。ＭＡＲは明瞭なコンセンサス配列又は認識可能な配列を含有しないが、その最も一貫した特徴は、全体的に高いＡ／Ｔ含量と一方の鎖で優勢なＣ塩基であると思われる。これらの領域は、鎖を分離する傾向がある湾曲二次構造を形成すると思われ、鎖分離の核生成点として作用し得るコア巻き戻し要素を含んでなり得る。幾つかの単純なＡＴ−リッチ配列モチーフは、ＭＡＲ配列：たとえば、Ａ−ボックス、Ｔ−ボックス、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ−ボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）及び脊椎動物又はショウジョウバエのためのコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位と関連している。例となるＭＡＲ配列は、公開された米国特許出願第２００７０１７８４６９号及び国際特許出願ＷＯ０２／０７４９６９（参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている。ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の発現を高めるのに使用することができる追加のＭＡＲ配列には、ＧｉｒｏｄらのＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：７４７−７５３，２００７で開示されたニワトリのリゾチームＭＡＲ，ＭＡＲｐ１−４２、ＭＡＲｐ１−６、ＭＡＲｐ１−６８及びＭＡＲｐｘ−２９（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号、ＥＡ４２３３０６、ＤＩ１０７０３０、ＤＩ１０６１９６、ＤＩ１０７５６１及びＤＩ１０６５１２）が挙げられる。当業者は、ＭＡＲ１〜９で報告されているように、中程度のレベルの増強を生じるＭＡＲを選択することによって発現をさらに調節できることを十分に理解するであろう。所望であれば、たとえば、ＭＡＲ−ファインダー（ウエブ：ｆｕｔｕｒｅｓｏｆｔ．ｏｒｇ／ＭａｒＦｉｎｄｅｒにて利用可能）、ＭＡＲテスト（ウエブ：ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅで利用可能）又はＳＭＡＲスキャンＩ（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：５８２‐５９２, １９９９）のようなソフトウエアを用いて配列データベースを検索することによって、ＰｒｅＦ抗原の発現を高める代替のＭＡＲ配列を特定することができる。特定の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードする配列と同じ核酸（たとえば、ベクター）上で宿主細胞に導入される（たとえば、形質移入される）。代替の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に同時統合することができる別の核酸（たとえば、トランスで）上で導入される。
【００９２】
組換えＰｒｅＦ抗原核酸の産生を介して当業者を導くのに十分な例となる手順は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１；ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（及び２００３年の補足）；並びにＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９に見い出すことができる。
【００９３】
ＰｒｅＦ抗原をコードする例となる核酸は配列番号５、７，９，１２，１３，１７，１９及び２１によって表される。たとえば、配列番号２の５００位に対応するアミノ酸にてグリコシル化部位に修飾を含んでなる変異体は、１４０８〜１４１４位（たとえば、配列番号１２、たとえば、配列番号１７及び２１のポリヌクレオチドに比べて）の近傍でヌクレオチドを変える（たとえば、変異させる）ことによって作出することができる。グリコシル化の変異体（たとえば、グリコシル化効率を高める）をコードするヌクレオチドの好適な配列には、ａａｃｇｇｇｔ、ａａｃａａｇｔ、ａａｃｇｇｇａ及びａａｃａａｇａが挙げられる。グリコシル化部位を除去する、たとえば、ｃａｇｃａｇｔのような代替配列も可能である。たとえば、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示されたような既知の（若しくはその後）発見されたＲＶＳの株から選択される類似のＦ及びＧのタンパク質ポリペプチド配列を組み合わせることによって追加の変異体を作出することができる。例となる変異体と配列同一性を共有する追加の配列変異体は当業者によって作出することができる。通常、核酸変異体は、アミノ酸残基の１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％以下で異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされたポリペプチドは、配列番号９、１１及び１３の１つと少なくとも８０％、又は８５％、さらに一般的には少なくとも９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。ＰｒｅＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの重複性のために自体低い配列同一性を共有することは当業者によって直ちに理解される。一部の例では、ＰｒｅＦ抗原は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に比べて１以上のアミノ酸修飾を有する（たとえば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差異は、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の付加、欠失又は置換であり得る。変異体は通常、ヌクレオチド残基の約１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％以下で異なる。たとえば、変異体ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇを含んでなる）の核酸は、配列番号５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２２の例となるＰｒｅＦ抗原核酸と比べて、１又は２、又は５までの、又は約１０までの、又は約１５までの、又は約５０までの、又は約１００までのヌクレオチドの差異を含んでなることができる。従って、ＲＳＶのＦ又はＧのタンパク質又はＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）の核酸の文脈における変異体は通常、参照配列、たとえば、配列番号１，３、５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２２で説明される参照配列、又は本明細書で開示されるそのほかの例となるＰｒｅＦ抗原の核酸と少なくとも９０％以上、たとえば、９５％又はさらに９８％又は９９％の配列同一性を共有する。本開示の特徴として含まれる追加の変異体は、ＷＯ２００８／１１４１４９で開示された天然に存在する変異体から選択されるヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）である。追加の変異体は、遺伝的浮動によって生じることができ、又は部位特異的若しくは無作為の突然変異誘発を用いて人為的に作出することができ、又は２以上の既存の変異体の組換えによって作出することができる。そのような追加の変異体も本明細書で開示されるＰｒｅＦ（及びＰｒｅＦ−Ｇ）の文脈で好適である
【００９４】
上述した変異体核酸に加えて、配列番号１，３，５，７、９、１２、１３，１７，１９又は２１によって表される例となる核酸の１以上とハイブリダイズする核酸もＰｒｅＦ抗原をコードするのに使用することができる。当業者は、上記で議論した％配列同一性の測定に加えて、２つの核酸の間の配列類似性の別の証は、ハイブリダイズする能力であることを十分に理解するであろう。２つの核酸の配列が似ていればいるほど、それらがハイブリダイズする条件はさらにストリンジェントである。ハイブリダイズ条件のストリンジェント性は、配列に依存し、異なった環境パラメータのもとで異なる。従って、ストリンジェント性の特定の程度を生じるハイブリダイズ条件は、選択するハイブリダイズ方法の性質及び組成物及びハイブリダイズする核酸配列の長さによって変化する。一般に、洗浄回数もストリンジェント性に影響するが、ハイブリダイズの温度及びハイブリダイズ緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋の濃度）がハイブリダイズのストリンジェント性を決定する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義したイオン強度とｐＨにて特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜２０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく一致したプローブとハイブリダイズする温度（定義したイオン強度とｐＨにて）である。核酸のハイブリダイズの条件及びストリンジェント性の算出は、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ，ＮＹ，１９９３及びＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に見い出すことができる。
【００９５】
本開示の目的で、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズ分子と標的配列の間で２５％未満のミスマッチがある場合ハイブリダイズが生じる条件を包含する。さらに正確な定義のためにストリンジェント性の特定のレベルに「ストリンジェントな条件」を分類することができる。従って、本明細書で使用されるとき、「穏やかなストリンジェント性」の条件は、２５％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものであり、「中程度のストリンジェント性」の条件は、１５％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものであり、「高いストリンジェント性」の条件は、１０％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものである。「非常に高いストリンジェント性」の条件は、６％を超える配列ミスマッチを持つ分子はハイブリダイズしないものである。それに対して、「低いストリンジェント性」の条件でハイブリダイズする核酸には、非常に低い配列同一性を持つもの又は核酸のほんの短い配列のみの配列同一性を持つものが挙げられる。従って、本開示に包含される核酸の種々の変異体は、少なくとも、Ｆタンパク質のＦ２ドメインとＦ１ドメインをコードする部分にわたって、配列番号１、３及び５の少なくとも１つとハイブリダイズできることが理解されるであろう。たとえば、そのような核酸は、配列番号１，３，５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２１の少なくとも１つの実質的に全長にわたってハイブリダイズすることができる。
【００９６】
ＲＳＶ抗原性ポリペプチドの製造方法
組換えタンパク質の発現及び精製について定評のある手順を用いて、本明細書で開示されるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原及び適宜、Ｇ抗原も含んでなる）を製造する。当業者を導くのに十分な手順は以下の文献で見つけることができる：ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００；及びＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，９９９。追加の及び特定の詳細は以下に提供される。
【００９７】
ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸はベクター及び宿主細胞の選択に応じて、種々の周知の手順、たとえば、エレクトロポレーション、リポソーム介在性形質移入（たとえば、市販のリポソーム形質移入剤、たとえば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００又はＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）を用いた）、リン酸カルシウム沈殿、感染、形質移入などによって、宿主細胞に導入される。ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）をコードする例となる核酸は、配列番号１，３，５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２１に提供される。当業者は、配列番号１，３，５，７，９，１２，１３，１７，１９及び／又は２１が例示であって、限定を意図しないことを十分に理解するであろう。たとえば、配列番号５，７及び９（たとえば、配列番６，８及び１０で表される）と同じタンパク質をコードするが、遺伝子コードの重複性（たとえば、配列番号１２で示される代替のコドン最適化）によってのみ異なるポリヌクレオチド配列を、配列番号５，７及び９の例となる配列の代わりに容易に使用することができる。同じことが配列番号１７，１９及び２１で当てはまる。同様に、配列番号１３で説明されるような内部に位置するイントロンのような（又はプロモータ、エンハンサ、イントロン若しくは同様の要素の添加によって）発現を高める要素を含んでなるポリヌクレオチド配列を採用することができる。当業者は、そのような修飾の組み合わせが同様に好適であることを認識するであろう。同様に、ＲＳＶのＡ株若しくはＲＳＶのＢ株から選択される相同の配列、及び／又は上記で議論したような実質的な配列同一性を共有するそのほかの配列を用いてＰｒｅＦ抗原を発現させることもできる。実際、以前開示された変異体核酸のいずれかを好適に宿主に導入し、用いてＧタンパク質が適用可能であるＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含んでなる）を作出することができる。
【００９８】
たとえば、特定の例では、たとえば、（配列番号２、たとえば、配列番号１７に関して）５００位のアミノ酸の近傍で１以上のアミノ酸の置換によって上述されるようなグリコシル化パターンを変化させるために変異体の核酸を修飾する。たとえば、切断認識部位を修飾することと組み合わせてグリコシル化パターンを修飾することは、細胞培養にてＰｒｅＦ抗原の産生を高めることが分かっている。そのような場合、組換えＰｒｅＦ抗原を発現させ、単離するために以下で記載される方法は、上述のように、任意で１以上の切断部位（たとえば、非フリン又はフリン切断認識部位）を修飾することと組み合わせてグリコシル化認識部位の１以上のアミノ酸を置換することによってＰｒｅＦ抗原のグリコシル化パターンを変えることによりＰｒｅＦ抗原の産生を高める工程を提供する。
【００９９】
組換えのＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含んでなる宿主細胞も従って本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、たとえば、大腸菌のような原核細胞（たとえば、細菌）宿主細胞、並びに真核細胞（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母）、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞）を含んでなる多数の真核宿主細胞が挙げられる。組換えのＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、たとえば、発現ベクターのようなベクターを介して宿主細胞に導入される（たとえば、形質伝達、形質転換又は形質移入される）。上述のように、ベクターは最も通常ではプラスミドであるが、そのようなベクターは、たとえば、ウイルス粒子やファージ等であり得る。適切な発現宿主の例には、たとえば、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａのような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３又はＢｏｗｅｓメラノーマのような哺乳類細胞；藻類細胞を含んでなる植物細胞が挙げられる。一部の例では、一時的に形質移入した細胞を用いて組換えＰｒｅＦ抗原を産生することができる。特定の実施形態では、安定的に統合されたＰｒｅＦ核酸を有する細胞（たとえば、クローン）を選択し、用いて組換えＰｒｅＦ抗原を産生する。
【０１００】
プロモータを活性化し、形質転換体を選抜し、挿入したポリヌクレオチド配列を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地にて宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、通常、発現のために選択された宿主細胞と共に以前使用されたものであり、たとえば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそれに引用された文献を含んでなる本明細書で引用された文献にて当業者に明らかであろう。任意で、無血清培地及び／又は動物生成物を含まない培地で宿主細胞を培養する。
【０１０１】
本発明の核酸に対応する発現産物は、たとえば、植物、酵母、真菌、細菌等のような非動物細胞での産生することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅらの（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）並びにＡｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬで見つけることができる。
【０１０２】
細菌の系では、発現される産物の用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体の産生について大量のポリペプチド又はその断片を必要とする場合、精製しやすい融合タンパク質の高レベル発現を指向するベクターを好都合に採用する。そのようなベクターには、当該コーディング配列、たとえば、上述のような本発明のポリヌクレオチドがアミノ末端翻訳開始メチオニンと触媒上活性のあるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を生じるβ−ガラクトシダーゼの７残基についての配列を伴ってインフレームでベクターに連結され得るＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能の大腸菌のクローニング及び発現のベクター；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、原核細胞、たとえば、大腸菌細胞での導入と発現に好適なベクターを介して核酸を細胞に導入する。たとえば、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸を、たとえば、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（たとえば、ｐＥＴ９ｂ及びｐＥＴ２ｄ）のような種々の市販の又は独占所有権のあるベクターに導入することができる。コーディング配列の発現はＩＰＴＧによって誘導可能であり、高いレベルのタンパク質発現を生じる。ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモータのもとで転写される。熱誘導可能なラムダｐＬプロモータを含んでなるｐＵＲＶ２２のような代替ベクターも好適である。
【０１０３】
発現ベクターを好適な細菌宿主に導入する（たとえば、エレクトロポレーションによって）。多数の好適な大腸菌株が利用可能であり、当業者によって選択することができる（たとえば、Ｒｏｓｅｔｔａ株及びＢＬ２１（ＤＥ２）株は、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えベクターの発現に好都合であることが分かっている）。
【０１０４】
同様に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的な又は誘導可能なプロモータを含有する多数のベクターが所望の発現産物の製造に使用される。概説については、Ｂｅｒｇｅｒ，Ａｕｓｕｂｅｌ、及びたとえば、Ｇｒａｎｔらの（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４）を参照のこと。哺乳類の宿主細胞では、プラスミド及びウイルスに基づいた系の双方を含んでなる多数の発現系を利用することができる。
【０１０５】
別の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞に導入される。昆虫細胞を感染させることが可能な組換えバキュロウイルスは、たとえば、 ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅからのＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系のような市販のベクター、キット及び／又は系を用いて生成することができる。手短には、抗原をコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｖＳＧ２転移ベクターに挿入する。次いで、ｐＡｖＳＧ２キメラプラスミドと、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）の線状化ゲノムＤＮＡを含有するＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄによって宿主細胞ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に同時形質移入する。形質移入に続いて、ｐＡｖＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが生じて組換えウイルスを生成する。一例では、ＰｒｅＦ抗原は多面体プロモータ（ｐＨ）の通常制御のもとで発現される。他のプロモータ、たとえば、塩基性（Ｂａ）プロモータ及びｐ１０プロモータを用いて同様の転移ベクターを作出することができる。同様に、たとえば、Ｓｆ９に密接に関連するＳＦ２１及びイラクサギンウワバＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来するハイファイブ細胞株のような代替の昆虫細胞を採用することができる。
【０１０６】
さらに通常、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞（たとえば、昆虫細胞又は哺乳類細胞）での導入と発現に好適である発現ベクターに導入される。好都合には、そのような核酸は、選択されるベクター／宿主細胞での発現についてコドンが最適化される（たとえば、配列番号５，７，９，１２，１３，１７，１９及び２１で説明される配列は、ＣＨＯ細胞での発現についてコドンが最適化される）。例となる一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社によって開発されたｐＥＥ１４ベクターのようなベクターに導入される。たとえば、即時早期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモータのような構成的なプロモータのもとでポリペプチドが発現される。ポリペプチドを発現する安定的に形質移入された細胞の選抜は、グルタミン源の非存在下で増殖する形質移入細胞の能力に基づいて為される。上手くｐＥＥ１４を統合した細胞は、ｐＥＥ１４ベクターがＧＳ（グルタミン合成酵素）酵素を発現するので、外因性グルタミンの非存在下で増殖することができる。選抜された細胞はクローンで増殖し、所望のＰｒｅＦポリペプチドの発現を特徴とする。
【０１０７】
挿入した配列の発現を調節する能力又は発現されたタンパク質を所望の方法で処理する能力について宿主細胞を任意で選択する。そのようなタンパク質の修飾には、グリコシル化（同様に、たとえば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化）が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、前駆体形態をタンパク質の成熟形態に切断する（たとえば、フリンプロテアーゼによって）翻訳後プロセッシングは、宿主細胞の文脈で任意で実施される。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等のような様々な宿主細胞はそのような翻訳後活性について特定の細胞性の機構及び特徴的なメカニズムを有し、導入される外来タンパク質の正確な修飾を確保するように選択することができる。
【０１０８】
本明細書で開示される組換えＰｒｅＦＦ抗原の長期間の高収率の産生のために、安定的な発現系が通常使用される。たとえば、ウイルスの複製開始点又は内因性発現要素及び選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを用いて、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドを安定的に発現する細胞株が宿主細胞に導入される。ベクターの導入に続いて、選抜培地に移す前に細胞を強化培地で１〜２日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、その存在によって、導入配列を上手く発現する細胞の増殖と回収が可能になる。たとえば、細胞種に適した組織培養法を用いて、安定的に形質転換された細胞の耐性群又は耐性コロニーを増殖させることができる。細胞培養からのコードしたタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を任意で培養する。上記で示したように、所望であれば、宿主細胞を無血清（及び／又は動物生成物を含まない）培地で培養することができる。
【０１０９】
好適な細胞株の形質伝達と適当な細胞密度への宿主細胞の増殖に続いて、選択したプロモータを適当な手段（たとえば、温度シフト又は化学誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。任意で、培地は、プロテイナーゼによる発現タンパク質の分解を低下させる成分及び／又は添加剤を含んでなる。たとえば、ＰｒｅＦ抗原を産生する細胞を培養するのに使用される培地は、たとえば、キレート剤又は小分子阻害剤（たとえば、ＡＺ１１５５７２７２、ＡＳ１１１７９３等）のようなプロテアーゼ阻害剤を含んで細胞性の又は細胞外（たとえば、マトリクス）のプロテイナーゼによる望ましくない切断を減らす又は消失させることができる。
【０１１０】
分泌されたポリペプチド産物を次いで培養培地から回収する。或いは、遠心によって細胞を回収し、物理的な又は化学的な手段によって粉砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現で採用した真核細胞又は微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、機械的粉砕、又は細胞溶解剤の使用、又は当業者に周知のそのほかの方法を含んでなる従来の方法によって粉砕することができる。
【０１１１】
硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、濾過、限外濾過、遠心分離、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、リンセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（たとえば、本明細書で言及されるタグ方式を使用した）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含んでなる当該技術で周知の多数の方法によって、組換え細胞培養から発現されたＰｒｅＦ抗原を回収し、精製することができる。所望のように、成熟タンパク質の立体構造を完成することにおいてタンパク質の再折り畳み工程を使用することができる。最終的に、最終精製工程にて高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を採用することができる。上記で言及された参考文献に加えて、たとえば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；及びＢｏｌｌａｇらの（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；並びにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪで言及されたものを含んでなる種々の精製方法が当該技術で周知である。
【０１１２】
例となる一実施形態では、ＰｒｅＦタンパク質は、以下の精製スキームに従って細胞から回収される。ＰｒｅＦポリペプチドをコードする組換え核酸のＣＨＯ細胞への導入に続いて、一時的に形質移入された宿主細胞又は導入されたポリヌクレオチドを含んでなる増殖した安定な集団を培地にて、所望の目的に許容できる規模で増殖に好適な条件下で増殖させる（たとえば、一般にＦｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ, ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ, ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそこで引用された文献に記載されたように）。通常、細胞は、振盪フラスコ又は生物反応器にて無血清培地で増殖させ、２〜３日間隔で継代する。これらの条件で増殖した細胞から樹立した新しい培養を通常生物反応器にて無血清培地で実施し、ＰｒｅＦ抗原を産生させるために２０％にて維持されたｐＯ２と共に２７℃にて５〜７日間インキュベートする。
【０１１３】
組換えＰｒｅＦ抗原を回収するには、細胞培養物を遠心し、細胞培養上清をさらなる使用までマイナス７０℃にて保存する。培養上清の融解に続いて、上清をＭｉｌｌｉＱ水にて２倍に希釈し、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整する。２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＢＰＧ１４０／５００カラムに詰めた３ＬＣＭセラミックＨｙｐｅｒＤＦＦ樹脂に希釈した上清を７５ｃｍ／時間で負荷する。試料の負荷後、平衡緩衝液をカラムに通し、ＵＶのベースラインに戻す。２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０のカラム容積（ＣＶ）の５倍で洗浄した後、０．１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１１４】
ＣＭＨｙｐｅｒＤ溶離液を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で３．３倍に希釈し、２０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した２７０ｍｌのハイドロキシアパタイト２型カラム（ＸＫ ５０に詰めた）にて５０ｍＬ／分で処理する。平衡緩衝液（〜３ＣＶ）でカラムを洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１１５】
２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した１５０ｍｌのＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅカラム（ＸＫ２６に詰めた）にてＨＡ溶離液を１５ｍｌ／分（樹脂との１０分間の接触に留意して）で処理する。０．１Ｍのアルギニン緩衝液を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０の５ＣＶで洗浄した後、０．６Ｍのアルギニン緩衝液を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて溶出を行う。
【０１１６】
次いで、分取用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムで処理するためにＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ溶離液を約１０倍に濃縮する。５０ｋＤのペリコンポリエーテルスルホン膜を用いて濃縮を行う。ＳＥＣカラムで処理する前に、ウイルス清浄工程で用いたＰＬＡＮＯＶＡ ２０Ｎ １００ ｃｍ２のフィルターを介して物質を濾過する。このナノ濾過工程は、ペリコン膜での濃縮の前又は後のいずれかに置くことができる。
【０１１７】
次いで５００ｍＬのＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００カラムと移動相としての１０ｍＭのリン酸塩（Ｎａ／Ｋ２）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ６．５緩衝液（最終緩衝液に対応する）を用いて分取用ＳＥＣを行う。ＳＥＣカラム容積の５％に対応する濃縮ＰｒｅＦの容積を約２．６ｍｌ／分で樹脂に負荷する。通常、１０ｍｌの分画を回収する。ＨＣＰレベルをできるだけ抑える一方で収率を最適化するのが所望であれば、銀染色によるＳＤＳゲル及び抗ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）のウエスタンブロットにて分画の分析プールを分析することができる。
【０１１８】
０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（代わりにＳｔｅｒｉｖｅｘフィルターを使用することができる）での濾過の後、精製されたバルクが得られる。所望であれば、精製したＰｒｅＦ抗原調製物を使用に先立ってマイナス７０℃で保存することができる。
【０１１９】
或いは、ＰｒｅＦタンパク質はポリヒスチジン（たとえば、６個のヒスチジン）を含んでなることができ、それを用いて精製を円滑にすることができる。そのようなヒスチジンのタグを付けたＰｒｅＦポリペプチドについては、以下の精製プロトコールが採用される。固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を用いた精製に先立って、細胞培養上清を緩衝液Ａ（２０ｍＭのビシン、ｐＨ８．５）で２倍に希釈し、ｐＨを８．５に合わせる。予め緩衝液Ａで平衡化した２３ｍｌのカラム容量のＱセファロースＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に得られた溶液を負荷する。一部の宿主細胞の混入と共にＰｒｅＦタンパク質をカラムに捕捉させる。ＩＭＡＣ精製工程を妨害する培養培地成分は保持されず、流水中で排除される。タンパク質は分離され、２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌの段階的溶出によって溶出される。当該のＰｒｅＦタンパク質は、２００ｍＭのＮａＣｌでの最初の段階の間に溶出される。任意で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタグ付いたＰｒｅＦタンパク質を検出する抗Ｈｉｓ−タグ抗体を用いたウエスタンブロットを用いて回収をモニターすることができる。精製を継続するのに先立って分画をプールすることができる。
【０１２０】
（プールされた）ＰｒｅＦタンパク質を含有する溶離液を緩衝液Ｂ（２０ｍＭのビシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で３倍に希釈し、ｐＨを８．３に合わせる。予め緩衝液Ｂで平衡化した（たとえば、５ｍｌのカラム容量）、塩化ニッケルを負荷したＩＭＡＣセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に得られた溶液を負荷する。ＰｒｅＦは樹脂に結合し、宿主細胞の混入物の大半は流水で溶出される。弱く結合した混入物を除くために２０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄する。２５０ｍＭのイミダゾールの一段階でＰｒｅＦタンパク質を溶出する。クマシーブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＨＩｓタグのウエスタンブロットを行って陽性分画を特定する。
【０１２１】
次いでセントリコン濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＩＭＡＣからのプールを少なくとも１５０μｇ／ｍｌの濃度に濃縮することができ、５００ｍＭのＬ−アルギニンを補完したＰＢＳ緩衝液にてタンパク質を透析することができる。得られたタンパク質を、ＲＣＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、使用まで−７０℃又は−８０℃で保存する。
【０１２２】
免疫原性組成物及び方法
提供されるのはまた、上記で開示されたＰｒｅＦ抗原（たとえば、配列番号６，８，１０，１８，２０及び２２によって例示されるもの）と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含んでなる免疫原性組成物である。
【０１２３】
特定の実施形態では、通常、ＰｒｅＦ抗原がＧタンパク質成分（たとえば、配列番号６）を含まない実施形態では、免疫原性組成物は、単離された組換えの及び／又は精製されたＧタンパク質を含んでなることができる。多数の好適なＧタンパク質が当該技術で記載されており、完全長の組換えＧタンパク質及びＧタンパク質の一部（たとえば、アミノ酸番号１２８〜２２９又は１３０〜２３０）で構成されるキメラタンパク質及び融合相手（たとえば、チオレドキシン）又は発現及び／又は精製を円滑にするシグナル配列及び又はリーダー配列が挙げられる。ＰｒｅＦ抗原との混合物で使用するための例となるＲＳＶのＧタンパク質は、ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００２２７７、ＷＯ２００８１１４１４９、米国特許第５，１４９，６５０号、同第６，１１３，９１１号、米国公開出願２００８０３００３８２及び米国特許第７，３６８，５３７号にて見つけることができ、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み入れられる。キメラＰｒｅＦ−Ｇタンパク質に関して示されるように、アミノ酸番号１４９〜２２９の間の部分又は約１２８〜約２２９の間の部分のようなＧタンパク質のさらに小さな断片を、ＰｒｅＦ（Ｇを含まない）とＧを含んでなる混合物の文脈にて好都合に採用することができる。上記で議論されたように、重要な配慮は、たとえば、アミノ酸番号１８３〜１９７の領域内に含まれる免疫優勢エピトープである。或いは、そのような組成物に完全長のＧタンパク質が採用され得る。
【０１２４】
薬学上許容可能なキャリア及び賦形剤は当業者に周知であり、当業者によって選択され得る。たとえば、キャリア又は賦形剤は好都合には緩衝液を含んでなることができる。任意で、キャリア又は賦形剤は、溶解性及び又は安定性を安定化させる少なくとも１つの成分も含有する。可溶化剤／安定剤の例には界面活性剤、たとえば、ラウレルサルコシン及び／又はツイーンが挙げられる。代替の可溶化剤／安定剤には、アルギニン及びガラス形成ポリオール（たとえば、スクロース、トレハロース等）が挙げられる。多数の薬学上許容可能なキャリア及び／又は薬学上許容可能な賦形剤が当該技術で既知であり、たとえば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第５版（１９７５）に記載されている。
【０１２５】
従って、好適な賦形剤及びキャリアが当業者によって選択され、選択された投与経路によって対象に送達するために好適な製剤を製造することができる。
【０１２６】
好適な賦形剤には、限定しないで、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、酸化トリメチルアミン、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそのほかの二価のカチオン関連塩、ジチオスレイトール、ジチオエリトール、及びβ−メルカプトエタノールが挙げられる。そのほかの賦形剤は、界面活性剤（ツイーン８０、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０、エンピゲンＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含んでなる）であり得る。
【０１２７】
任意で、免疫原性組成物はアジュバントも含んでなる。ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発する目的で対象に投与するのに好適な免疫原性組成物の文脈で、アジュバントを選択して、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を特徴とする、Ｔｈ１に偏った免疫応答又はＴｈ１／Ｔｈ２の釣り合った免疫応答を誘発する。
【０１２８】
通常、アジュバントを選択して、組成物が投与される対象又は対象において、ＩＦＮ−γの分泌を特徴とするＴｈ１に偏った免疫応答（又は、Ｔｈ１／Ｔｈ２の釣り合った免疫応答）を高める。たとえば、ＲＳＶ感染に感受性の（又はリスクが高い）特定の年齢群の対象に免疫原性組成物を投与すべき場合、対象及び対象の集団にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。従って、高齢者対象（たとえば、６５歳を超える対象）での投与用にＲＳＶのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を製剤化する場合、高齢者対象にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。同様に、ＲＳＶのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物が、新生児又は乳児の対象（出生から２歳までの対象）に投与することを意図される場合、新生児及び乳児にて安全で且つ効果的であるようにアジュバントを選択する。新生児及び幼児における安全性と有効性のために選択されるアジュバントの場合、成人に通常投与される用量の希釈（たとえば、画分用量）であるアジュバントの用量を選択することができる。
【０１２９】
さらに、免疫原性組成物が投与される投与の経路を介して投与される場合、アジュバントは通常、Ｔｈ１免疫応答を高めるように選択される。たとえば、鼻内投与用にＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を製剤化する場合、プロテオソーム及びプロトリンが好都合なＴｈ１に偏ったアジュバントである。それに対して、免疫原性組成物を筋肉内投与用に製剤化する場合、１以上の３Ｄ−ＭＰＬ、スクワレン（たとえば、ＱＳ２１）、リポソーム及び／又は油と水のエマルションを含んでなるアジュバントが好都合に選択される。
【０１３０】
ＰｒｅＦ抗原との併用で使用するために好適なアジュバントの１つは、非毒性の細菌性リポ多糖類誘導体である。脂質Ａの好適な非度屈性誘導体の例は、モノホスホリル脂質Ａ、さらに詳しくは３−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。３Ｄ−ＭＰＬは、ＭＰＬの名称のもとでＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｎ．Ａ．によって販売され、文書全体を通してＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬと呼ばれる。米国特許第４，４３６，７２７；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号及び同第４，９１２，０９４号を参照のこと。３Ｄ−ＭＰＬは、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１Ａで開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは、３，４，５又は６のアシル化鎖を持つ３−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用することができる。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍのフィルターを介して無菌濾過できるような粒度を有する。そのような調製物はＷＯ９４／２１２９２に記載されている。
【０１３１】
３Ｄ−ＭＰＬのようなリポ多糖類は、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。そのような３Ｄ−ＭＰＬは、約２５μｇのレベルで、たとえば、２０〜３０μｇの間で、好適には２１〜２９μｇの間で、又は２２〜２８μｇの間で、又は２３〜２７μｇの間で、又は２４〜２６μｇの間で、又は２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベルで、たとえば、５〜１５μｇの間で、好適には６〜１４μｇの間で、たとえば、７〜１３μｇの間で、又は８〜１２μｇの間で、又は９〜１１μｇの間で、又は１０μｇのレベルで３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇのレベルで、たとえば、１〜９μｇの間で、又は２〜８μｇの間で、好適には３〜７μｇの間で、又は５μｇのレベルで３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。
【０１３２】
他の実施形態では、リポ多糖類は、米国特許第６，００５，０９９号及び欧州特許第０７２９４７３Ｂ１号に記載されたようにβ（１〜６）グルコサミン二糖類であり得る。当業者は、これらの参考文献の教示に基づいて３Ｄ−ＭＰＬのような種々のリポ多糖類を容易に製造することができる。それにもかかわらず、これら参考文献のそれぞれは、参照によって本明細書に組み入れられる。前述の免疫賦活剤（ＬＰＳ又はＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬに似た構造の）に加えて、ＭＰＬの上記構造の一部であるアシル化された単糖類及び二糖類の誘導体も好適なアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは脂質Ａの合成誘導体であり、その一部は、ＴＬＲ−４作動薬として記載され、ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲノホスフェート）、（ＷＯ９５／１４０２６）；ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール、１，１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）（ＷＯ９９／６４３０１及びＷＯ００／０４６２）；及びＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ｄｉｏｌ、１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）（ＷＯ０１／４６１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
使用することができるそのほかのＴＬＲ４リガンドは、たとえば、ＷＯ９８／５０３９９又は米国特許第６，３０３，３４７号で開示された（ＡＧＰの調製方法も開示されている）もののようなアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰｓ）であり、好適には、ＲＣ５２７若しくはＲＣ５２９、又は米国特許第６，７６４，８４０号で開示されたようなＡＧＳの薬学上許容可能な塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ４の作動薬であり、一部はＴＬＲ４の拮抗剤である。双方共アジュバントとして有用であると思われる。
【０１３４】
ＴＬＲ−４を介したシグナル伝達反応（Ｓａｂｒｏｅ ｅｔ ａｌ, ＪＩ ２００３ ｐ１６３０−５）を起こすことが可能であるそのほかの好適なＴＬＲ−４リガンドは、たとえば、グラム陰性細菌に由来するリポ多糖類及びその誘導体又はその断片、特にＬＰＳの非毒性誘導体（たとえば、３Ｄ−ＭＰＬ）である。そのほかの好適なＴＬＲ作動薬は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５又は９０；界面活性剤プロテインＡ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチド及びｂ−デフェンシン−２、及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である。一実施形態では、ＴＬＲ作動薬はＨＳＰ６０，７０又は９０である。ほかの好適なＴＬＲ−４リガンドは、ＷＯ２００３／０１１２２３及びＷＯ２００３／０９９１９５に記載されており、たとえば、ＷＯ２００３／０１１２２３の４〜５ページ又はＷＯ２００３／０９９１９５の３〜４ページで開示された化合物Ｉ、化合物ＩＩ及び化合物ＩＩＩ、特にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０及びＥＲ８０４７６４としてＷＯ２００３／０１１２２３で開示されたそれら化合物である。たとえば、好適なＴＬＲ−４リガンドの１つはＥＲ８０４０５７である。
【０１３５】
追加のＴＬＲ作動薬もアジュバントとして有用である。用語「ＴＬＲ作動薬」は、直接的なリガンドとして又は内因性若しくは外因性のリガンドの生成を介して間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介したシグナル伝達反応を起こすことが可能である剤を指す。そのような天然の又は合成のＴＬＲ作動薬は、代わりの又は追加のアジュバントとして使用することができる。アジュバント受容体としてのＴＬＲの役割の手短な概説は、Ｋａｉｓｈｏ及びＡｋｉｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５８９：１−１３，２００２に提供されている。これらの潜在的なアジュバントには、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９についての作動薬が挙げられるが、これらに限定されない。従って、一実施形態では、アジュバント及び免疫原性組成物はさらに、ＴＬＲ−１作動薬、ＴＬＲ−２作動薬、ＴＬＲ−３作動薬、ＴＬＲ−４作動薬、ＴＬＲ−５作動薬、ＴＬＲ−６作動薬、ＴＬＲ−７作動薬、ＴＬＲ−８作動薬、ＴＬＲ−９作動薬又はこれらの組み合わせから成る群から選択されるアジュバントを含んでなる。
【０１３６】
本発明の一実施形態では、ＴＬＲを介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲを介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、トリアシル化リポペプチド（ＬＰｓ）；フェノール可溶性モジュリン；結核菌ＬＰ；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ、細菌性リポタンパク質のアシル化アミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰ及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ由来のＯｓｐＡ ＬＰから選択される。
【０１３７】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、Ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ又はＴ ｐａｌｌｉｄｕｍに由来するリポタンパク質、ペプチドグリカン、細菌性リポペプチド；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含んでなる種に由来するペプチドグリカン；リポタイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアポリン、細菌性フィムブリエ、エルシニア毒性因子、ＣＭＶビリオン、麻疹血液凝集素及び酵母由来のザイモサンの１以上である。
【０１３８】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリＩＣ）、ウイルス感染に関連する分子核酸パターンである。
【０１３９】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、細菌性フラジェリンである。
【０１４０】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、抗酸菌性リポタンパク質、脱アシル化ＬＰ、及びフェノール可溶性モジュリンである。追加のＴＬＲ６作動薬はＷＯ２００３／０４３５７２に記載されている。
【０１４１】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、Ｎ７位及びＣ８位におけるグアノシン類似体、又はイミダゾキノリン化合物若しくはその誘導体である。一実施形態では、ＴＬＲ作動薬はイミキモドである。さらなるＴＬＲ７作動薬はＷＯ２００２／０８５９０５に記載されている。
【０１４２】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。好適には、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を持つイミダゾキノリン分子、たとえば、レシキモド（Ｒ８４８）であり；レシキモドもＴＬＲ−７による認識が可能である。使用することができるそのほかのＴＬＲ−８作動薬には、ＷＯ２００４／０７１４５９に記載されたものが挙げられる。
【０１４３】
代替の実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬が使用される。一実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、ＨＳＰ９０である。或いは、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を起こすことが可能であるＴＬＲ作動薬は、細菌性又はウイルス性のＤＮＡであり、ＤＮＡは、特にＣｐＧモチーフとして知られる配列の文脈にて非メチル化ＣｐＧ分子を含有する。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドはＴｈ１反応を優勢に誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、たとえば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８及び米国特許第６，００８，２００号及び同第５，８５６，４６２号に記載されている。好適には、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物で使用するのに好適なオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ、好適には少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離される２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを任意で含有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧモチーフは、グアニンヌクレオチドが後に続くシトシンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは通常、デオキシヌクレオチドである。特定に実施形態では、ホスホジエステル結合及びそのほかのヌクレオチド間結合は本発明の範囲内であるが、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間はホスホロジチオエート結合又は好適にはホスホロチオエート結合である。また本発明の範囲内に含まれるのは混合されたヌクレオチド間結合を伴うオリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを作製する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号及びＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０１４４】
たとえば、それ自体に又は３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせでＰｒｅＦ抗原を伴う免疫原性組成物で使用することができるそのほかのアジュバントは、たとえば、ＱＳ２１のようなサポニンである。
【０１４５】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ及びＷａｇｎｅｒ，Ｈ．（１９９６. Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ. Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ ３６３‐３８６）にて教示されている。サポニンは、植物界及び海洋動物界に広く分布するステロイド又はトリテルペングリコシドである。サポニンは、振盪すると泡立つコロイド状水溶液を形成し、コレステロールを沈殿させることについて言及される。サポニンは細胞膜の近傍にあると、膜を破裂させる膜における孔様の構造を創る。赤血球の溶血はこの現象の例であり、それは、サポニンすべてではないが、特定のサポニンの特性である。
【０１４６】
サポニンは、全身性投与用のワクチンでアジュバントとして知られる。個々のサポニンのアジュバント活性と溶血活性は当該技術で広範に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、上記）。たとえば、クイルＡ（南米の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来する）及びその分画は米国特許第５，０５７，５４０号及び“Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”、Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）：１−５５；及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている。クイルＡの分画を含んでなる免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒子状の構造は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ, Ｂ., ＥＰ ０ １０９ ９４２ Ｂ１； ＷＯ ９６／１１７１１； ＷＯ ９６／３３７３９）。溶血性のサポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（クイルＡのＨＰＬＣ精製した分画）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されており、それらは参照によって本明細書に組み入れられる。全身性ワクチンの研究で使用されているそのほかのサポニンには、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ及びＳａｐｏｎａｒｉａ（Ｂｏｍｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ., Ｖａｃｃｉｎｅ, １０（９）：５７２‐５７７, １９９２）のような植物種に由来するものが挙げられる。
【０１４７】
ＱＳ２１は、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するＨＰＬＣ精製した非毒性の分画である。ＱＳ２１の製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０に開示されている。ＱＳ２１を含有する非反応源性のアジュバント製剤はＷＯ９６／３３７３９に記載されている。前述の参考文献は参照によって本明細書に組み入れられる。ＱＳ２１のような前記免疫学的に活性のあるサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。有利なことに、ＱＳ２１は、約２５μｇのレベルで、たとえば、２０〜３０μｇの間で、好適には２１〜２９μｇの間で、又は２２〜２８μｇの間で、又は２３〜２７μｇの間で、又は２４〜２６μｇの間で、又は２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベルで、たとえば、５〜１５μｇの間で、好適には６〜１４μｇの間で、たとえば、７〜１３μｇの間で、又は８〜１２μｇの間で、又は９〜１１μｇの間で、又は１０μｇのレベルでＱＳ２１を含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇのレベルで、たとえば、１〜９μｇの間で、又は２〜８μｇの間で、好適には３〜７μｇの間で、又は５μｇのレベルでＱＳ２１を含んでなる。ＱＳ２１とコレステロールを含んでなるそのような製剤は、抗原と共に製剤化されると功を奏するＴｈ１刺激性アジュバントであることが示されている。従って、たとえば、ＱＳ２１とコレステロールの組み合わせを含んでなるアジュバントを伴った免疫原性組成物にてＰｒｅＦポリペプチドを好都合に採用することができる。
【０１４８】
任意で、アジュバントはまた、たとえば、アルミニウム塩又はカルシウム塩、特に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムのような鉱物塩を含んでなることができる。たとえば、アルミニウム塩（たとえば、水酸化アルミニウム又は「ミョウバン」）との組み合わせで３Ｄ−ＭＰＬを含有するアジュバントは、ヒト対象に投与するためのＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物での製剤化に好適である。
【０１４９】
ＰｒｅＦ抗原と共に製剤化するのに使用するために好適なＴｈ１に偏ったアジュバントの別の部類には、ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物が挙げられる。ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、たとえば、鼻内投与用の粘膜アジュバントとして特に好適である。ＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、細菌性又はウイルス性の抗原のような免疫原のためのキャリアとして又は組成物にて有用である、たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種（たとえば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，ｉｎ “Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”第２版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ，ｐａｇｅ １９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号を参照）のような、しかし、これらに限定されないグラム陰性細菌に由来する外膜タンパク質（一部のポリンを含んでなるＯＭＰ）の調製物に属する。一部のＯＭＰに基づく免疫賦活組成物は、「プロテオソーム」と呼ぶことができ、それは疎水性であり、ヒトでの使用に安全である。プロテオソームは、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの小胞又は小胞様のＯＭＰクラスターに自己集合する能力を有し、タンパク質抗原（Ａｇ）、特に親水性部分を有する抗原と非共有性に取り込み、配位し、会合し（たとえば、静電気的に又は疎水性に）、又はさもなければ共同する。複数の分子膜構造又は１以上のＯＭＰの溶融球状ＯＭＰ組成物を含んでなる小胞形態又は小胞様形態で外膜成分を生じる任意の調製方法は、プロテオソームの定義の範囲内に含まれる。たとえば、当該技術（たとえば、米国特許第５，７２６，２９２号又は同第５，９８５，２８４号）に記載されたようにプロテオソームを調製することができる。プロテオソームはまた、ＯＭＰポリンを製造するのに使用される細菌（たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種）を起源とする内因性のリポ多糖類又はリポオリゴ糖類（ＬＰＳ又はＬＯＳ）を含有することができ、それらは一般にＯＭＰ調製物全体の２％未満である。
【０１５０】
プロテオソームはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓから化学的に抽出された外膜タンパク質（ＯＭＰ）（ほとんど、クラス４のＯＭＰと同様にポリンＡ及びＢ）から主として構成され、界面活性剤によって溶液で維持される（Ｌｏｗｅｌｌ ＧＨ. Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｎａｓａｌ, Ｏｒａｌ, ｏｒ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｉｎ： Ｌｅｖｉｎｅ ＭＭ, Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ, Ｋａｐｅｒ ＪＢ, Ｃｏｂｏｎ ＧＳ, ｅｄｓ, Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｉｎｃ. １９９７； １９３‐２０６）。プロテオソームは、たとえば、透析濾過又は従来の透析工程によって、本明細書で開示されるＰｒｅＦポリペプチドを含んでなるウイルス供給源に由来する精製された又は組換えのタンパク質のような種々の抗原と共に製剤化することができる。界面活性剤を徐々に取り除くことによって約１００〜２００ｎｍの直径の粒子状疎水性の複合体を形成することができる（Ｌｏｗｅｌｌ ＧＨ. Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｎａｓａｌ, Ｏｒａｌ, ｏｒ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｉｎ： Ｌｅｖｉｎｅ ＭＭ, Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ, Ｋａｐｅｒ ＪＢ, Ｃｏｂｏｎ ＧＳ, ｅｄｓ, Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ, Ｉｎｃ. １９９７； １９３‐２０６）。
【０１５１】
「プロテオソーム：ＬＰＳ又はプロトリン」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１種のリポ多糖類による外因性添加によって混合されてＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（免疫原性組成物として機能することができる）を提供するプロテオソームの調製物を指す。従って、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物は、（１）たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓのようなグラム陰性細菌から調製されるプロテオソームの外膜タンパク質調製物（たとえば、プロジュバント）と（２）１以上のリポ糖類の調製物を含んでなる、プロトリンの２つの基本成分で構成することができる。リポオリゴ糖は、外因性であることができ（たとえば、ＯＭＰプロテオソーム調製物に天然に含有される）、外因性に調製されたリポオリゴ糖（たとえば、ＯＭＰ調製物とは異なった培養物又は微生物から調製された）と混合することができ又は組み合わせることができ、又はそれらの組み合わせであることができる。そのような外因性に添加されるＬＰＳは、ＯＭＰ調製物が作製されたのと同じグラム陰性細菌に由来することができ、又は異なったグラム陰性細菌に由来することができる。プロトリンはまた、任意で脂質、糖脂質、糖タンパク質、小分子等を含んでなることが理解されるべきである。プロトリンは、たとえば、米国特許出願公開第２００３／００４４４２５号に記載されたように調製することができる。
【０１５２】
上述のもののような異なったアジュバントの組み合わせもＰｒｅＦ抗原との組み合わせで使用することができる。たとえば、すでに言及したように、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬと一緒に製剤化することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は通常、たとえば、１：５〜５：１のような１：１０〜１０：１の桁であり、実質的に１：１であることが多い。通常、比率は、２．５：１〜１：３の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲である。別の組み合わせアジュバントの製剤には、３Ｄ−ＭＰＬと、たとえば、水酸化アルミニウムのようなアルミニウム塩が挙げられる。組み合わせで製剤化する場合、この組み合わせが抗原特異的なＴｈ１免疫応答を高めることができる。
【０１５３】
一部の例では、アジュバント製剤、たとえば、カルシウム塩又はアルミニウム塩（ミョウバン）、たとえば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムのような鉱物塩。ミョウバンが、たとえば、３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせで存在する場合、量は通常、用量当たり、１００μｇ〜１ｍｇの間、たとえば、約１００μｇ、又は約２００μｇ〜約７５０μｇ、たとえば、約５００μｇである。
【０１５４】
一部の実施形態では、アジュバントは、油と水のエマルション、たとえば、水中油型エマルションを含んでなる。水中油型エマルションの一例は、水性キャリア中に代謝可能な油、たとえば、スクアレン、トコフェロールのようなトコール、たとえば、α−トコフェロール、及びたとえば、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５（商標））又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ツイーン８０（商標））のような界面活性剤を含んでなる。特定の実施形態では、水中油型エマルションは、追加の免疫賦活剤を含有しない（特に３Ｄ−ＭＰＬのような非毒性脂質Ａ誘導体又はＱＳ２１のようなサポニンを含有しない）。水性キャリアは、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。さらに、水中油型エマルションは、スパン８５及び／又はレシチン及び／又はトリカプリリンを含有することができる。
【０１５５】
本発明の別の実施形態では、抗原又は抗原組成物と水中油型エマルションを含んでなるアジュバント組成物と任意で１以上のさらなる免疫賦活剤を含んでなるワクチン組成物が提供され、前記水中油型エマルションは、０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（好適にはスクアレン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（好適には、α−トコフェロールのようなトコフェロール）及び０．４〜４ｍｇの乳化剤を含んでなる。
【０１５６】
特定の一実施形態では、アジュバント製剤は、水中油型エマルションのようなエマルション形態で調製された３Ｄ−ＭＰＬを含んでなる。場合によっては、エマルションはＷＯ９４／２１２９２で開示されたように直径２μｍ未満の小さな粒度を有する。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、２２μｍの膜を介して無菌濾過されるのに十分なくらい小さくてもよい（欧州特許第０６８９４５４号に記載されたように）。或いは、３Ｄ−ＭＰＬはリポソーム製剤に調製することができる。任意で、３Ｄ−ＭＰＬ（又はその誘導体）を含有するアジュバントは、追加の免疫賦活成分も含んでなる。
【０１５７】
アジュバントは、免疫原性組成物が投与される集団にて安全で且つ有効であるように選択される。成人集団及び高齢者集団については、製剤は通常、幼児製剤で通常見られるアジュバント成分より多くを含んでなる。特にエマルションのような水中油型エマルションを用いた製剤は、たとえば、コレステロール、スクアレン、α−トコフェロール及び／又はたとえば、ツイーン８０若しくはスパン８５のような界面活性剤のような追加の成分を含んでなることができる。例となる製剤では、そのような成分は、以下の量：約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のα−トコフェロール、０．３〜３％のツイーン８０で存在することができる。通常、スクアレン：α−トコフェロールの比率は、これがさらに安定なエマルションを提供する場合、等しいか又は１未満である。場合によっては、製剤は安定剤も含有することができる。
【０１５８】
ＰｒｅＦポリペプチドを伴う免疫原性組成物を幼児に投与するために製剤化する場合、アジュバントの投与量は、幼児対象で有効であり、相対的に反応源性ではないように決定される。一般に、幼児製剤におけるアジュバントの投与量は、成人（たとえば、６５歳以上の成人）への投与で設計される製剤で使用されるものより低い（たとえば、用量は、成人に投与される製剤で提供される用量の画分であってもよい）。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの量は通常、用量当たり１μｇ〜２００μｇ、たとえば、１０〜１００μｇ又は１０〜５０μｇである。幼児用量は通常、この範囲、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇの低い方の端であり、たとえば、約２μｇ、又は約５μｇ、又は約１０μｇ、又は約２５μｇまで又は約５０μｇまでである。通常、ＱＳ２１が製剤で使用される場合、範囲は同程度である（及び上記比率に従って）。油と水のエマルション（たとえば、水中油型エマルション）の場合、小児又は幼児に提供されるアジュバントの用量は、成人対象に投与される用量の画分であり得る。種々の用量での例となる水中油アジュバントとの組み合わせでＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物の有効性の実証は実施例９に提供される。
【０１５９】
免疫原性組成物は通常、免疫防御量（又はその画分用量）の抗原を含有し、従来の技法で調製することができる。ヒト対象への投与用のものを含んでなる免疫原性組成物の調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｒｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９５．Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の抱合は、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらによる同第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１６０】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象にて重大な有害な副作用なしで免疫防御の応答を誘導する量として選択される。この文脈での免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するものではなく；症状又は疾患、特にウイルスに関連した重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原が採用されるかによって変化し得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば、約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、又は約５０μｇを含んでなることが予想される。免疫原性組成物で利用される量は、対象集団（たとえば、幼児又は高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の任意の量は、対象における抗体力価及びそのほかの応答の所見を含んでなる標準的な検討によって確定することができる。最初のワクチン接種に続いて、約４週間以内に対象は追加免疫を受けることができる。
【０１６１】
選択されるアジュバントにかかわりなく、最終製剤の濃度は、標的集団で安全且つ有効であるように算出されることに留意すべきである。たとえば、ヒトにおいて、たとえば、ＲＳＶに対して免疫応答を誘発するための免疫原性組成物は、好都合には幼児（最初の投与の年齢が、たとえば、出生〜１年の間、たとえば、０〜６ヵ月）に投与される。ＲＳＶに対して免疫応答を誘発するための免疫原性組成物はまた、高齢者のヒトにも好都合に投与される（たとえば、単独で、又はＣＯＰＤに関連する抗原若しくはそのほかの病原体との組み合わせで）。アジュバントの選択は、これらの異なった適用で異なることができ、各状況の最適なアジュバント及び濃度は当業者によって経験的に決定され得ることが十分に理解されるであろう。
【０１６２】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減する又は防ぐワクチンである。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶによる感染に続く病理学的応答を軽減する又は防ぐワクチンである。任意で、ＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つの追加の抗原と共に製剤化される。たとえば、病原性生物は、気道の病原体（たとえば、呼吸器感染の原因となるウイルス又は細菌）であることができる。特定の場合、免疫原性組成物は、たとえば、インフルエンザ又はパラインフルエンザのような気道感染を起こすウイルスのような、ＲＳＶ以外の病原性ウイルスに由来する抗原を含有する。他の実施形態では、追加の抗原が選択されて、複数の感染性生物に対して対象を防御するのに必要とされる投与を円滑にする又は接種の回数を減らす。たとえば、抗原は、とりわけ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、溶血性インフルエンザ、ポリオウイルス、球菌又は肺炎球菌の１以上に由来することができる。
【０１６３】
従って、ＲＳＶによる暴露又は感染（その後の治療的な又はそれに先立つ予防的な）を治療するための医薬の調製におけるＰｒｅＦ抗原又はそれをコードする核酸の使用も本開示の特徴である。同様に、対象においてＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法は本開示の特徴である。そのような方法には、免疫的に有効な量の、ＰｒｅＦ抗原を含んでなる組成物をヒト対象のような対象に投与することが含まれる。一般に、組成物はＴｈ１に偏った免疫応答を誘発するアジュバントを含んでなる。組成物は、ＲＳＶとの接触に続くウイルス性疾患を促進することなく、ＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発するように製剤化される。すなわち、組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減する又は予防する、及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的応答を軽減する又は予防するＴｈ１に偏った免疫応答を生じるように製剤化される。組成物は種々の異なった経路によって投与することができるが、最も一般的には免疫原性組成物は、筋肉内又は鼻内の経路によって送達される。
【０１６４】
免疫原性組成物は通常、免疫防御量（又はその画分用量）の抗原を含有し、従来の技法によって調製することができる。ヒト対象への投与用のものを含んでなる免疫原性組成物の調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｒｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９５．Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の抱合は、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらによる同第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１６５】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象にて重大な有害な副作用なしで免疫防御の応答を誘導する量として選択される。この文脈での免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するものではなく；症状又は疾患、特にウイルスに関連した重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原が採用されるかによって変化し得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば、約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、又は約５０μｇを含んでなることが予想される。免疫原性組成物で利用される量は、対象集団（たとえば、幼児又は高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の任意の量は、対象における抗体力価及びそのほかの応答の所見を含んでなる標準的な検討によって確定することができる。最初のワクチン接種に続いて、約４〜１２週間以内に対象は追加免疫を受けることができる。たとえば、ＰｒｅＦ抗原を含有する免疫原性組成物を幼児対象に投与する場合、最初の接種とそれに続く接種は、この期間に投与されるワクチンと合うように投与することができる。
【０１６６】
以下の実施例を提供して特定の特別な特徴及び／又は実施形態を説明する。これらの実施例は、記載される特別な特徴又は実施例に本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【０１６７】
実施例
実施例１：例となるＰｒｅＦ抗原
Ｆの前融合立体構造に対して生成される免疫応答が、膜の融合に関与する結合、立体構造シフト及び／又はそのほかの事象を妨げる抗体を優先的に含んでなり、それによって防御的応答の有効性を高めるという予測に基づいて、前融合立体構造でタンパク質を安定化するために天然のＲＳＶのＦタンパク質に比べて、ＰｒｅＦ抗原を修飾した。
【０１６８】
図１ＡとＢは、ＲＡＶのＦ０と例となるＰｒｅＦ組換え抗原の特徴を模式的に説明する。図１ＡはＲＳＶのＦ０タンパク質の説明である。Ｆ０は５７４のアミノ酸から成るプレタンパク質である。Ｆ０プレタンパク質は翻訳に続いてタンパク分解処理され、グリコシル化される。その後シグナルペプチダーゼによって取り除かれるシグナルペプチドは小胞体（ＲＥ）へのＦ０プレタンパク質の翻訳を標的とする。ＲＥにおける初期のペプチドは複数の部位（三角によって示される）で次いでグリコシル化される。Ｆ０のフリン切断はＦ２ペプチドドメインとＦ１ペプチドドメインを生じ、それらは、Ｆ２−Ｆ１へテロ二量体の３量体（すなわち、Ｆ２−Ｆ１の３倍）として一緒に折り畳まれ、集合する。天然の状態では、Ｆタンパク質は、Ｃ末端領域の膜貫通螺旋によって膜に固定される。Ｆ０ポリペプチドのさらなる特徴には、１５システイン残基、４の特徴的な中性エピトープ、２つのコイルドコイル領域、及び脂質化モチーフが挙げられる。図１Ｂは、例となるＰｒｅＦ抗原の特徴を説明する。ＰｒｅＦ抗原を構築するには、Ｆタンパク質の前融合立体構造を安定化するようにＦ０ポリペプチドを修飾し、それによって、宿主細胞に結合及び融合する前にＲＳＶウイルスによって示されるようなＦタンパク質の優勢な免疫原性エピトープを保持する。以下の安定化する変異を、Ｆ０ポリペプチドに対するＰｒｅＦ抗原に導入した。第１に、安定化するコイルドコイルドメインをＦ０ポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に置き、Ｆ０の膜に固定するドメインを置き換えた。第２に、ｐｅｐ２７ペプチド（天然のタンパク質のＦ２とＦ１のドメインの間に位置する）を取り除いた。第３に、双方のフリンモチーフを除いた。代替の実施形態では（ＰｒｅＦ＿Ｖ１及びＰｒｅＦ＿Ｖ２と命名した）、ＲＳＶタンパク質の免疫的に活性のある部分（たとえば、アミノ酸番号１４９〜２２９）をＣ末端ドメインに付加した。
【０１６９】
他の実施形態では、修飾を導入して、グリコシル化を変えた（高めた又は低下させた）、及び／又はフリン以外のプロテアーゼによる切断を減らした。
【０１７０】
実施例２：ＣＨＯ細胞からのＰｒｅＦ組換えタンパク質の産生及び精製
ＰｒｅＦ抗原を産生させるために、例となるＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を宿主ＣＨＯ細胞に導入した。導入されたポリヌクレオチド配列を含んでなる一時的に形質移入した宿主細胞又は増殖させた安定した集団を、所望の目的に許容できる規模で増殖に好適な条件下で培地にて増殖させた（たとえば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそれに引用された参考文献で一般に記載されているように）。通常、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２にて振盪フラスコにおいて又は２０％に維持されたｐＯ２で２９℃にて又は生物反応器において無血清培地で増殖させ、２〜３日間隔で継代した。
【０１７１】
組換えＰｒｅＦ抗原を回収するには、細胞培養物を遠心し、細胞培養上清をさらなる使用まで約−８０℃にて保存する。さらなる解析のために、細胞培養上清の２リットルのアリコートを精製水で×２に希釈し、ＮａＯＨでｐＨ９．５に合わせた。２０ｍＭのピペラジンｐＨ９．５で平衡化したＱセファロースＦＦイオン交換カラム（６０ｃｍ、１１．３ｃｍ）に１４ｍｌ／分の速度で負荷した。出発緩衝液でカラムを洗浄した後、カラム容積の２０倍の０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配で溶出を行った（分画サイズは１０ｍｌ）。銀染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットで分画を解析した。次いでさらなる処理に先立って、実質的なＰｒｅＦタンパク質を含有する分画をプールした。
【０１７２】
ペリコンＸＬ ＰＥＳ Ｂｉｏｍａｘ １００ （ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ）膜カセットを伴った、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の実験台規模のＴＦＦシステムを用いて、１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０への緩衝液交換に、Ｑ工程のプールした溶離液（約１３０ｍｌ）を供した。得られた物質はｐＨ７．０及び１．８ｍＳ／ｃｍの伝導率を有した。１０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した１０ｍｌのヒドロキシアパタイトＩＩ型（ＨＡＩＩ）ゲル（ＸＫ１６、高さ＝５ｃｍ）に５ｍｌ／分にて１００ｍｌのこの試料を負荷した。出発緩衝液でカラムを洗浄した後、カラム容積の２０倍の１０ｍＭ〜２００ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）ｐＨ７．０の勾配で溶出を行った。銀染色とクマシーブルーによるＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画を再び解析し、陽性分画をプールした。
【０１７３】
アフィニティクロマトグラフィに続いて、プールした分画を濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器、１０，０００ＤａのＭＷＣＯを用いて緩衝液をＤＰＢＳ（ｐＨ約７．４）に交換した。最終生成物は約１３ｍｌだった。Ｌｏｗｒｙアッセイで評価したタンパク質濃度は１９５μｇ／ｍｌだった。純度は９５％を超えた。精製したＰｒｅＦ抗原の調製物をフィルターで滅菌し、使用まで−２０℃で保存した。
【０１７４】
実施例３：ＣＨＯ細胞で産生されたＰｒｅＦ組換えタンパク質の性状分析
ＣＨＯ細胞で産生されたＰｒｅＦ組換えタンパク質を非対称場流動分画（ＡＦＦ−ＭＡＬＳ）で特徴づけ、ＲＳＶのＦ及びＧのタンパク質成分を含んでなるキメラ抗原と比較した。ＡＦＦ−ＭＡＬＳによって、最小限のマトリクス相互作用にて液体流中で分子サイズに従ってタンパク質種を分離すること及び正確な分子量決定のための多重角度光散乱によるさらなる解析が可能になる。図２Ａは、精製したＦＧ物質の６５％を超える部分が、最終的なＰＢＳ緩衝液中で高分子量オリゴマー（１０００〜１０００００ｋＤａ）として見い出される一方で３％が単量体形態で残ることを示す。
【０１７５】
図２Ｂは、精製したＰｒｅＦタンパク質がＰＢＳ緩衝液中で７３％の比率まで三量体に折り畳まれることを示す。物質の１０％は、１０００〜２００００ｋＤａのオリゴマーとして見い出される。これらの結果は、ＣＨＯ細胞で発現された組換えＰｒｅＦタンパク質が、天然の状態で予測されるように三量体として折り畳まれることを示す。
【０１７６】
リン酸緩衝液の溶液中でのタンパク質の可溶性の性質を確認し、ＦＧタンパク質による生体内評価での比較用に集合体を生成する（以下の実施例７を参照）という二重の目的のために、精製したＰｒｅＦタンパク質をグルタールアルデヒドで架橋した。グルタールアルデヒドの架橋は、タンパク質の四級構造の良好な評価を提供することで知られ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０２３０−１０２３９（１９９７）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７１：４２８４−４２９２（２００４）に記載されている。
【０１７７】
１％、２％及び５％のグルタールアルデヒド架橋剤と共に４℃にて４時間、タンパク質をインキュベートし、ＮａＢＨ４の添加によって反応を阻止した。ＰＢＳ緩衝液におけるカラム脱塩によって過剰のグルタールアルデヒドを取り除いた。得られたタンパク質を２８０ｎｍでの吸収によって定量し、変性条件及び還元条件にてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。精製した組換えＰｒｅＦの大半は、ＰＢＳ溶液中で三量体として移動すると判定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたように、三量体タンパク質の大半を高分子量集合体に変換するには、インキュベート温度を２３℃に上げることが必要とされた。
【０１７８】
実施例４：ＰｒｅＦ抗原による試験管内の中和阻害
志願者から得たヒト血清をＥＬＩＳＡによってＲＳＶのＡ株に対する反応性についてスクリーニングし、各血清試料について確定された以前のＲＳＶ中和潜在力価に基づいた関連する希釈にて中和阻害（ＮＩ）アッセイに用いた。手短には、０．５％のＦＢＡ、２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴った５０％の１９９−Ｈ培地が入ったＤＭＥＭ中２５μｇ／ｍｌの濃度での阻害剤タンパク質（ＰｒｅＦ又は米国特許第５，１９４，５９５で開示され、Ｒｉｘ（ＦＧ）と名付けられたキメラＦＧに本質的に対応する対照タンパク質）と血清を混合し、回転ホイール上で３７℃にて１．５〜２時間インキュベートした。各血清試料についての阻害範囲を最適化するように滴定したＡＳＶを伴った丸底９６穴プレートにて２０μｌの連続希釈した血清とタンパク質を混合した。ｐＨを維持するような５％ＣＯ２のもとで３３℃にて２０分間、得られた混合物をインキュベートした。
【０１７９】
次いで、予めＶｅｒｏ細胞を播いた平底９６穴プレートに血清／阻害剤／ウイルスの混合物を入れ、１６０μｌの培地を添加する前に３３℃にて２時間インキュベートした。ＮＩ力価検出用の免疫蛍光アッセイまで、プレートをさらに５％ＣＯ２で３３℃にて５〜６日間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％パラホルムアルデヒドで１時間固定した後、２％ミルク／ＰＢＳとブロック緩衝液でプレートをブロックした。すすぐことなく、各ウェルにヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ、１：４００）を加え、室温（ＲＴ）にて２時間インキュベートした。試料をＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキング緩衝液中の抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ、１：４００）をウェルに加えた。プレートを再びＲＴにて２時間インキュベートし、読み取りの前に上記のように２回洗浄した。≧１の蛍光合胞体が検出された場合、ウェルを陽性とみなした。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ（ＳＫ）法を用いて５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）の算出を行い、ＮＩの比率は以下のように算出した：［（０μｇ／ｍｌの阻害剤の中和力価−２５μｇ／ｍｌの阻害剤の中和力価）／０μｇ／ｍｌの阻害剤の中和力価］×１００。図３に示した例となる結果は、調べた１６／２１の供血者におけるＮＩでＰｒｅＦがＦＧより優れることを示している。
【０１８０】
実施例５：ＰｒｅＦ抗原は免疫原性である
ＰｒｅＦ抗原の免疫原性を明らかにするために、ＰｒｅＦ（６．５、３．１、０．６３、０．１３及び０．０２５μｇ／ｍｌ）とヒト用量の１／２０での３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含有するＴｈ１アジュバント（「ＡＳ０１Ｅ」）、又はＰｒｅＦ（１、０．２及び０．０４μｇ／ｍｌ）とヒト用量の１／１０の３Ｄ−ＭＰＬ及びミョウバンを含有するＴｈ１アジュバント（「ＡＳ０４Ｃ」）によって２週間間隔でＩＭにて２回マウスを免疫し、３週間後、血清を回収した。
【０１８１】
標準的な手順に従ってＥＬＩＳＡによって抗原特異的なＩｇＧ抗体の力価をプールした血清試料にて測定した。手短には、精製し、不活化したＲＳＶのＡ、ＲＳＶのＢ及び相同のＰｒｅＦタンパク質で９６穴プレートを被覆し、４℃にて一晩インキュベートした。２００ｎｇ／ｍｌの濃度で出発した精製マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）と共に、１：５０の最初の濃度で出発してブロッキング緩衝液で血清試料を連続希釈し、室温で２時間インキュベートした。西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）によって、結合した抗体を検出した。３，３Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡＴＭ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＮ）をＨＲＰの基質として用いた。５０μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに加えて反応を止めた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）によって４５０ｎｍにて各ウェルについて吸収値を検出した。
【０１８２】
図４Ａ及び４Ｂで詳説した代表的な結果は、ＰｒｅＦ抗原による免疫に続いてＲＳＶのＡ及びＲＳＶのＢに対して強い力価が引き出されることを示している。
【０１８３】
実施例６：ＰｒｅＦは中和抗体を引き出す
実施例５で上述したように免疫したマウスの血清試料にて中和抗体の存在と量を評価した。９６穴プレート（２０μｌ／ウェル）にてＲＳＶ培地での１：８の希釈から出発して、免疫動物のプールした血清を連続希釈した。対照のウェルは、ＲＳＶ培地のみ又は１：５０のヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有した。代表的なＲＳＶのＡ株又はＢ株の５００〜１０００感染用量をウェルに加え、３３℃、５％ＣＯ２にて２０分間インキュベートし、その後、予め１×１０５個／ｍｌのＶｅｒｏ細胞を播いた９６穴平底プレートに混合物を移した。細胞を３３℃、５％ＣＯ２にて約２時間インキュベートし、栄養を再補充し、その後、同じ温度にて５〜６日間インキュベートした。上清を取り除き、プレートをＰＢＳで洗浄し、付着細胞をＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いでヤギ抗ＲＳＶ一次抗体と検出用の抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて間接免疫蛍光（ＩＦＡ）アッセイを行った。
【０１８４】
それぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す代表的な結果は、ＰｒｅＦで免疫した動物の血清では、ＲＳＶ株に対する有意な中和抗体が検出されることを明らかにしている。
【０１８５】
実施例７：ＲＳＶの負荷に対してＰｒｅＦは防御する
上述のように２週間間隔でＩＭにて２回マウスを免疫し、２回目の注射の３週間後、ＲＳＶのＡ株を負荷した。負荷後、肺に存在するウイルスを測定することによってＲＳＶに対する防御を評価した。手短には、安楽死後、免疫した動物から肺を無菌的に取り出し、１５ｍｌの試験管にて１０ｍｌ／肺の２倍容量を用いたＲＳＶ培地で洗浄した。次いで、肺を秤量し、自動Ｐｏｔｔｅｒホモゲナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｎｅｐｅａｎ ＯＮ）によってＲＳＶ培地中でホモジネートし、２６５５×ｇにて４℃で２分間遠心した。予めＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８１）単層を播き、６日間インキュベートした９６穴プレートにて連続希釈（１：１０で出発して８回複製）することによって、上清に存在するウイルスを滴定した。ｐＨ７．２のＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドによる固定後、抗ＲＳＶ一次抗体とＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ二次抗体による間接ＩＦＡによってＲＳＶを検出した。
【０１８６】
図６Ａ及び６Ｂに示す代表的な結果は、アジュバントの存在下で０．０４μｇ以上の容量がＲＳＶに対する強い防御を引き出すことを明らかにしている。
【０１８７】
実施例８：ＰｒｅＦは負荷に続いて肺での好酸球の動員を誘導しない
免疫及びその後の負荷に続いて悪化した疾患を誘発するＰｒｅＦ抗原の可能性を評価するために、（ａ）１０μｇのグルタールアルデヒド処理ＰｒｅＦ、（ｂ）１０μｇのＰｒｅＦ又は（ｃ）アジュバントなしでの１０μｇのＦＧそれぞれによってマウスの群（５匹／群）を２回免疫した。追加免疫の３週間後、ＲＳＶのＡ株でマウスを負荷し、負荷の４日後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＢＡＬ中の全白血球浸潤をマウス当たりで数え、マクロファージ／単球、好中球、好酸球及びリンパ球の形態に基づく白血球百分率を算出した。
【０１８８】
各動物について、全細胞数に好酸球の白血球百分率を乗じた。示すのは、９５％の信頼限界での各群当たりの幾何平均である。図７に示す代表的な結果は、ＰｒｅＦによる免疫と負荷に続いて好酸球は肺に動員されないことを示している。さらに、これらの結果は、故意にＰｒｅＦを凝集させた形態（グルタールアルデヒド処理）又はＦＧ抗原（天然に凝集した）に比べて、ＰｒｅＦ抗原の可溶性の性質は好酸球を好まないことを示唆している。
【０１８９】
実施例９：水中油型エマルションアジュバントの希釈によって製剤化したＰｒｅＦ抗原の免疫原性
１０．７０ｍｇスクアレンのヒト「完全」用量（ＡＳ０３Ａ）の１／１０での例となる水中油アジュバントＡＳ０３Ａ、１１．８８ｍｇＤＬ−α−トコフェロール、４．８５ｍｇポリソルベート８０、１／２用量（ＡＳ０３Ｂ）１／４用量（ＡＳ０３Ｃ）と共に、又はアジュバントなしで製剤化した２５０ｎｇのＰｒｅＦをマウスに与えた。対照マウスにはＡＳ０３Ａのみ又はＰＢＳを与えた。０日目と１４日目にマウスを免疫した。採血、脾細胞の回収及び負荷は３９日目（投与２の２５日後）に行った。負荷の４日後にＲＳＶの滴定にために肺をホモジネートした。
【０１９０】
個々の血清試料にてＥＬＩＳＡによって抗原特異的なＩｇＧ抗体の力価を測定した。手短には、精製し、不活化したＲＳＶのＡ株で９６穴プレートを被覆し、４℃にて一晩インキュベートした。２００ｎｇ／ｍｌの濃度で出発する精製マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）と共に、１：２００で出発してブロッキング緩衝液で血清試料を連続希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＯＮ）によって、結合した抗体を検出した。３，３Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡＴＭ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＮ）をＨＲＰの基質として用いた。５０μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに加えて反応を止めた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）によって４５０ｎｍにて各ウェルについて吸収値を検出した。結果を図８に示す。ＡＳ０３Ａ、ＡＳ０３Ｂ又はＡＳ０３Ｃと組み合わせたＰｒｅＦで免疫したマウスの血清では、約２５０，０００ｎｇ／ｍｌの抗ＲＳＶＩｇＧ濃度が認められたが、ＰｒｅＦのみで免疫したマウスの血清ではほんの少し（１８２８ｎｇ／ｍｌ）しか認められなかった。
【０１９１】
９６穴プレート（２０μｇ／ウェル）にて１：８の希釈から出発して、免疫動物のプールした血清をＲＳＶ培地で連続希釈した。対照のウェルは、ＲＳＶ培地のみ又は１：５０でのヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有した。ＲＳＶのロング株を加え、プレートを３３℃にて２０分間インキュベートし、１×１０５個／ｍｌのＶｅｒｏ細胞を予め播いた９６穴平底プレートに混合物を移した。同じ温度にて５〜６日後、上清を取り除き、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドで１時間、付着細胞を固定し、その後、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）を実施した。図９は、ＰｒｅＦとの組み合わせで投与したＡＳ０３の量にかかわりなく、ＲＳＶ中和抗体の力価は同じままだった（〜１１ｌｏｇ２）が，ＡＳ０３なしで免疫したマウスにおけるＲＳＶ中和抗体の力価は有意に低かった（〜６ｌｏｇ２）ことを示す。
【０１９２】
安楽死後、免疫した動物から肺を無菌的に取り出し、１５ｍｌの試験管にて１０ｍｌ／肺の２倍容量を用いたＲＳＶ培地で洗浄した。次いで、それらを秤量し、自動Ｐｏｔｔｅｒホモゲナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｎｅｐｅａｎ ＯＮ）によってＲＳＶ培地中でホモジネートし、２６５５×ｇにて４℃で２分間遠心した。上清におけるウイルスの存在を滴定した。手短には、予めＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８１）単層を播き、５〜６日間インキュベートした９６穴プレートにて、１：１０で出発して８回複製で肺ホモジネートを連続希釈した。ＲＳＶは間接ＩＦＡによって検出した。図１０は、ＡＳ０３Ａ、ＡＳ０３Ｂ又はＡＳ０３Ｃと組み合わせたＰｒｅＦで免疫したマウス間では防御に差異は認められなかったが、ＡＳ０３の非存在下で免疫したマウスでは低い防御しか認められなかったことを示す結果を説明している。
【０１９３】
これらの結果は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する組成物を作出するためにアジュバントの広い範囲の濃度にわたってＰｒｅＦ抗原を製剤化することができることを明らかにしている。
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメイン及びＦ１ドメインを含んでなる可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなり、前記Ｆタンパク質ポリペプチドがグリコシル化を変化させる少なくとも１つの修飾を含んでなる、組換え呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原。
【請求項２】
前記Ｆタンパク質ポリペプチドが、
（ｉ）ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加、
（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非フリン切断部位の欠失、
（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失、及び
（ｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加
から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる、請求項１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３】
前記グリコシル化を変化させる修飾が、配列番号２の５００位に対応するアミノ酸を含んでなる及び／又はそれに隣接する１以上のアミノ酸の置換を含んでなる、請求項１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項４】
配列番号２の５００〜５０２位に対応するアミノ酸が、ＮＧＳ、ＮＫＳ、ＮＧＴ、ＮＫＴから選択される、請求項１又は３に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項５】
前記グリコシル化を変化させる修飾が、配列番号２の５００位に対応するアミノ酸におけるグルタミン置換を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項６】
前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間に未変化の融合ペプチドを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項７】
前記少なくとも１つの修飾が、ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項８】
前記ヘテロ三量体化ドメインが前記Ｆ１ドメインのＣ末端に位置する、請求項７に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項９】
介在性フリン切断部位を伴わないＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１０】
前記ＲＳＶ抗原が多量体を形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１１】
前記ＲＳＶ抗原が三量体を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１２】
前記Ｆ２ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号２６〜１０５に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１３】
前記Ｆ１ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号１３７〜５１６に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１４】
前記Ｆ２ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号２６〜１０５に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドを含んでなり、及び／又は前記Ｆ１ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号１３７〜５１６に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１５】
前記ＲＳＶ抗原が、
（ａ）配列番号２２を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２１によってコードされるポリペプチド又は配列番号２１にストリンジェントな条件下で実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号２２と少なくとも９５％の配列同一性を持つポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１６】
前記Ｆ２ドメインが、前記ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸番号１〜１０５を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１７】
前記Ｆ２ドメイン及び前記Ｆ１ドメインが未変化の融合ペプチドを伴い、かつ、介在性ｐｅｐ２７ドメインを伴わずに配置されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１８】
前記ヘテロ三量体化ドメインが、コイルドコイルドメインを含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１９】
前記多量体化ドメインが、イソロイシンジッパーを含んでなる、請求項１８に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２０】
前記イソロイシンジッパードメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１９に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２１】
前記ＲＳＶ抗原が、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインの疎水性ドメインにて親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２２】
前記疎水性ドメインが、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＢコイルドコイルドメインである、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２３】
前記ＨＲＢコイルドコイルドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号５１２に対応する位置における中性の残基の荷電残基への置換を含んでなる、請求項２２に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２４】
前記ＨＲＢコイルドコイルドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号５１２に対応する位置におけるロイシンのリジン又はグルタミンへの置換を含んでなる、請求項２３に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２５】
前記疎水性ドメインが、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＡドメインである、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２６】
前記ＨＲＡドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号１０５に対応する位置の次への荷電残基の付加を含んでなる、請求項２５に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２７】
前記ＨＲＡドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号１０５に対応する位置の次へのリジンの付加を含んでなる、請求項２６に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２８】
前記ＲＳＶ抗原が、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＡドメインにおいて親水性アミノ酸の第１の置換又は付加を少なくとも含んでなり、かつ、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＢドメインにおいて親水性アミノ酸の第２の置換又は付加を少なくとも含んでなる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２９】
前記ＲＳＶ抗原が、天然に存在するＦタンパク質前駆体（Ｆ０）に存在するフリン切断部位を消失させる少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３０】
前記ＲＳＶ抗原が、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号１０５〜１０９に対応する位置で、アミノ酸番号１３３〜１３６に対応する位置で、又はアミノ酸番号１０５〜１０９とアミノ酸番号１３３〜１３６に対応する双方の位置においてフリン切断部位を消失させるアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなる、請求項２９に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３１】
前記Ｆ１ポリペプチドドメインと前記Ｆ２ポリペプチドドメインが、順に前記ＲＳＶのＡ型ロング株に対応する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３２】
前記ＲＳＶ抗原が、ポリペプチドの多量体を含んでなる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３３】
前記ＲＳＶ抗原が、ポリペプチドの三量体を含んでなる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤とを含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項３５】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項３４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、水中油型エマルション及びミョウバンのうち少なくとも１つを含んでなる、請求項３５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記アジュバントが水中油型エマルションを含んでなる、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記水中油型エマルションがトコールを含んでなる、請求項３６又は３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記水中油型エマルションが、ヒトの１用量当たり５ｍｇ未満のスクアレンを含んでなる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが、新生児への投与に好適である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
前記免疫原性組成物が請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原を含んでなる場合に、前記免疫原性組成物は、ＲＳＶのＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１４９〜２２９位に対応するアミノ酸配列を含んでなるＧタンパク質ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１以上の追加の抗原をさらに含んでなる、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、組換え核酸。
【請求項４４】
前記ＲＳＶ抗原をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、選択される宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されている、請求項４３に記載の組換え核酸。
【請求項４５】
前記核酸が、
（ａ）配列番号２１を含んでなるポリヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２２をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２１にストリンジェントな条件下で実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号２１と少なくとも９５％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列
から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記ポリヌクレオチド配列は、天然に存在するＲＳＶ株とは一致しない、請求項４３又は４４に記載の組換え核酸。
【請求項４６】
請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の組換え核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項４７】
請求項４３若しくは４４に記載の核酸又は請求項４６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項４８】
ＲＳＶ感染を治療するための医薬の調製における、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のＲＳＶ抗原の使用。
【請求項４９】
前記医薬が、ＲＳＶ感染の予防的治療を目的として投与される、請求項４８に記載のＲＳＶ抗原又は核酸の使用。
【請求項５０】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対して免疫応答を誘発させる方法であって、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原を含んでなる組成物、又は請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含んでなる、方法。
【請求項５１】
前記ＲＳＶ抗原を含んでなる組成物を投与することにより、ＲＳＶとの接触に続くウイルス性疾患を増強することなく、ＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫応答が、ＲＳＶによる感染を軽減する若しくは予防する、及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的応答を軽減する若しくは予防する防御的免疫応答を含んでなる、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象がヒト対象である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
医薬に使用するための請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原、又は請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
ＲＳＶ関連疾患の予防又は治療のための請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原、又は請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
変化したグリコシル化パターンを持つ組換えＲＳＶ抗原の製造方法であって、
（ｉ）宿主細胞において請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の核酸を発現させること、及び
（ｉｉ）それによって発現させた組換えＲＳＶ抗原を単離することを含んでなる、方法。
【請求項５７】
ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドの発現を高める方法であって、宿主細胞においてアミノ酸の付加、欠失又は置換を生じさせる少なくとも１つの変異を含んでなるＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸を発現させることを含んでなる方法（ここで、前記アミノ酸の付加、欠失又は置換は、天然に存在するＲＳＶ融合タンパク質に比べてコードされるＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのグリコシル化部位を変化させ、前記グリコシル化部位を変化させることにより、アミノ酸の付加、欠失又は置換がないＲＳＶ融合タンパク質に比べて前記ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドの発現を高める）。
【請求項５８】
前記ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸が、前記コードされるＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチド内でペプチダーゼ分解部位を消失させるアミノ酸の付加、欠失又は置換を生じさせる追加の変異をさらに含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドが、前融合立体構造で安定化される組換え融合タンパク質ポリペプチドである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項１】
ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメイン及びＦ１ドメインを含んでなる可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなり、前記Ｆタンパク質ポリペプチドがグリコシル化を変化させる少なくとも１つの修飾を含んでなる、組換え呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原。
【請求項２】
前記Ｆタンパク質ポリペプチドが、
（ｉ）ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加、
（ｉｉ）少なくとも１つのフリン切断部位の欠失、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非フリン切断部位の欠失、
（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１以上のアミノ酸の欠失、及び
（ｖ）Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加
から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる、請求項１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３】
前記グリコシル化を変化させる修飾が、配列番号２の５００位に対応するアミノ酸を含んでなる及び／又はそれに隣接する１以上のアミノ酸の置換を含んでなる、請求項１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項４】
配列番号２の５００〜５０２位に対応するアミノ酸が、ＮＧＳ、ＮＫＳ、ＮＧＴ、ＮＫＴから選択される、請求項１又は３に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項５】
前記グリコシル化を変化させる修飾が、配列番号２の５００位に対応するアミノ酸におけるグルタミン置換を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項６】
前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間に未変化の融合ペプチドを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項７】
前記少なくとも１つの修飾が、ヘテロ三量体化ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項８】
前記ヘテロ三量体化ドメインが前記Ｆ１ドメインのＣ末端に位置する、請求項７に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項９】
介在性フリン切断部位を伴わないＦ２ドメインとＦ１ドメインを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１０】
前記ＲＳＶ抗原が多量体を形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１１】
前記ＲＳＶ抗原が三量体を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１２】
前記Ｆ２ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号２６〜１０５に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１３】
前記Ｆ１ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号１３７〜５１６に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１４】
前記Ｆ２ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号２６〜１０５に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドを含んでなり、及び／又は前記Ｆ１ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸番号１３７〜５１６に対応するＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１５】
前記ＲＳＶ抗原が、
（ａ）配列番号２２を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２１によってコードされるポリペプチド又は配列番号２１にストリンジェントな条件下で実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号２２と少なくとも９５％の配列同一性を持つポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１６】
前記Ｆ２ドメインが、前記ＲＳＶのＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸番号１〜１０５を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１７】
前記Ｆ２ドメイン及び前記Ｆ１ドメインが未変化の融合ペプチドを伴い、かつ、介在性ｐｅｐ２７ドメインを伴わずに配置されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１８】
前記ヘテロ三量体化ドメインが、コイルドコイルドメインを含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１９】
前記多量体化ドメインが、イソロイシンジッパーを含んでなる、請求項１８に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２０】
前記イソロイシンジッパードメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１９に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２１】
前記ＲＳＶ抗原が、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインの疎水性ドメインにて親水性アミノ酸の少なくとも１つの置換又は付加を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２２】
前記疎水性ドメインが、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＢコイルドコイルドメインである、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２３】
前記ＨＲＢコイルドコイルドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号５１２に対応する位置における中性の残基の荷電残基への置換を含んでなる、請求項２２に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２４】
前記ＨＲＢコイルドコイルドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号５１２に対応する位置におけるロイシンのリジン又はグルタミンへの置換を含んでなる、請求項２３に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２５】
前記疎水性ドメインが、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＡドメインである、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２６】
前記ＨＲＡドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号１０５に対応する位置の次への荷電残基の付加を含んでなる、請求項２５に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２７】
前記ＨＲＡドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号１０５に対応する位置の次へのリジンの付加を含んでなる、請求項２６に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２８】
前記ＲＳＶ抗原が、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＡドメインにおいて親水性アミノ酸の第１の置換又は付加を少なくとも含んでなり、かつ、前記Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＢドメインにおいて親水性アミノ酸の第２の置換又は付加を少なくとも含んでなる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２９】
前記ＲＳＶ抗原が、天然に存在するＦタンパク質前駆体（Ｆ０）に存在するフリン切断部位を消失させる少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３０】
前記ＲＳＶ抗原が、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）のアミノ酸番号１０５〜１０９に対応する位置で、アミノ酸番号１３３〜１３６に対応する位置で、又はアミノ酸番号１０５〜１０９とアミノ酸番号１３３〜１３６に対応する双方の位置においてフリン切断部位を消失させるアミノ酸の付加、欠失又は置換を含んでなる、請求項２９に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３１】
前記Ｆ１ポリペプチドドメインと前記Ｆ２ポリペプチドドメインが、順に前記ＲＳＶのＡ型ロング株に対応する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３２】
前記ＲＳＶ抗原が、ポリペプチドの多量体を含んでなる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３３】
前記ＲＳＶ抗原が、ポリペプチドの三量体を含んでなる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤とを含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項３５】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項３４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、水中油型エマルション及びミョウバンのうち少なくとも１つを含んでなる、請求項３５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記アジュバントが水中油型エマルションを含んでなる、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記水中油型エマルションがトコールを含んでなる、請求項３６又は３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記水中油型エマルションが、ヒトの１用量当たり５ｍｇ未満のスクアレンを含んでなる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが、新生児への投与に好適である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
前記免疫原性組成物が請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原を含んでなる場合に、前記免疫原性組成物は、ＲＳＶのＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１４９〜２２９位に対応するアミノ酸配列を含んでなるＧタンパク質ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１以上の追加の抗原をさらに含んでなる、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、組換え核酸。
【請求項４４】
前記ＲＳＶ抗原をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、選択される宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されている、請求項４３に記載の組換え核酸。
【請求項４５】
前記核酸が、
（ａ）配列番号２１を含んでなるポリヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２２をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２１にストリンジェントな条件下で実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号２１と少なくとも９５％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列
から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなり、前記ポリヌクレオチド配列は、天然に存在するＲＳＶ株とは一致しない、請求項４３又は４４に記載の組換え核酸。
【請求項４６】
請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の組換え核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項４７】
請求項４３若しくは４４に記載の核酸又は請求項４６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項４８】
ＲＳＶ感染を治療するための医薬の調製における、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のＲＳＶ抗原の使用。
【請求項４９】
前記医薬が、ＲＳＶ感染の予防的治療を目的として投与される、請求項４８に記載のＲＳＶ抗原又は核酸の使用。
【請求項５０】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対して免疫応答を誘発させる方法であって、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原を含んでなる組成物、又は請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含んでなる、方法。
【請求項５１】
前記ＲＳＶ抗原を含んでなる組成物を投与することにより、ＲＳＶとの接触に続くウイルス性疾患を増強することなく、ＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫応答が、ＲＳＶによる感染を軽減する若しくは予防する、及び／又はＲＳＶによる感染に続く病的応答を軽減する若しくは予防する防御的免疫応答を含んでなる、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象がヒト対象である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
医薬に使用するための請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原、又は請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
ＲＳＶ関連疾患の予防又は治療のための請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原、又は請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
変化したグリコシル化パターンを持つ組換えＲＳＶ抗原の製造方法であって、
（ｉ）宿主細胞において請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の核酸を発現させること、及び
（ｉｉ）それによって発現させた組換えＲＳＶ抗原を単離することを含んでなる、方法。
【請求項５７】
ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドの発現を高める方法であって、宿主細胞においてアミノ酸の付加、欠失又は置換を生じさせる少なくとも１つの変異を含んでなるＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸を発現させることを含んでなる方法（ここで、前記アミノ酸の付加、欠失又は置換は、天然に存在するＲＳＶ融合タンパク質に比べてコードされるＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのグリコシル化部位を変化させ、前記グリコシル化部位を変化させることにより、アミノ酸の付加、欠失又は置換がないＲＳＶ融合タンパク質に比べて前記ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドの発現を高める）。
【請求項５８】
前記ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸が、前記コードされるＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチド内でペプチダーゼ分解部位を消失させるアミノ酸の付加、欠失又は置換を生じさせる追加の変異をさらに含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドが、前融合立体構造で安定化される組換え融合タンパク質ポリペプチドである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１０】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５３０５０４（Ｐ２０１２−５３０５０４Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６７４６（Ｐ２０１２−５１６７４６）
【出願日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９００８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９７４５
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【出願人】（５０２２９６９１４）アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９００８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９７４５
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【出願人】（５０２２９６９１４）アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック (9)
【Ｆターム（参考）】
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