組織産生のための方法および手段ならびに得られる組織
本発明は、組織産生（再生、再建、補強および／または若返り）の分野に関する。より正確には、本発明は、特定の組織または細胞を再生するための、好ましくは、骨、脂肪、腱、筋肉、軟骨および骨髄間質のような間葉系組織、ならびに、血液学的な組織または細胞（ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板、リンパ球、血液学的幹細胞（ＨＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）など）を再生するための方法に関連する。本発明はまた、損傷または疾患のある組織または細胞の再建、再生、若返りまたは補強を、本発明の方法によって得られる（再生された）組織または細胞を使用して哺乳動物対象において、好ましくはヒト患者において行うための方法に関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織産生（再生、再建、補強および／または若返り）の分野に関する。
【０００２】
より正確には、本発明は、特定の組織または細胞を再生するための、好ましくは、骨、脂肪、腱、筋肉、軟骨および骨髄間質のような間葉系組織、ならびに、血液学的な組織または細胞（ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板、リンパ球、血液学的幹細胞（ＨＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）など）を再生するための方法および手段（製造物およびデバイス）に関連する。
【０００３】
本発明はまた、損傷または疾患のある組織または細胞の再建、再生、若返りまたは補強を、本発明の方法によって得られる（再生された）組織または細胞を使用して哺乳動物対象において、好ましくはヒト患者において行うための方法および手段（製造物およびデバイス）に関連する。
【背景技術】
【０００４】
損傷または疾患のある組織、すなわち、骨を再建するための種々の技術が存在する。細胞媒介再生技術がそれらの１つである。
【０００５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＨＳＣは、「間充織」として知られている骨髄間質において見出され、また、脂肪組織においてもまた見出される幹細胞に対応する。
【０００６】
ＭＳＣおよびＨＳＣは、適切な数の細胞を得るためにエクスビボ培養で拡大することができる。しかしながら、大量の骨髄の採取および長時間の培養が、十分な量の幹細胞を得るために要求される。幹細胞のインビトロ培養はその増殖能力を変化させ、また、その分化能を低下させる。これらの細胞は分化および増殖についての多能性を示し、また、適切なサイトカインおよび増殖因子、ならびに、ＥＰＣを含む血液学的細胞を使用して様々なタイプの細胞（例えば、筋肉、血管系、ニューロン組織、肝臓、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、ケラチノブラストおよび線維芽細胞など）に分化させることができる。
【０００７】
これらのＭＳＣを細胞媒介再生技術において使用することがこれまで長い間提案されている。
【０００８】
さらには、老化は幹細胞の特性およびその分化能力を変化させることが知られている。
【０００９】
実際、骨再生方法では、ＭＳＣが患者から取り出され、適切な骨増殖因子を使用してインビトロで増殖させられ、骨芽細胞に分化させられる。このように、骨組織が生じさせられ、その後、再建方法において患者への埋め込みのためにインプラントとして使用される。心臓発作後、患者は、大量の骨髄サンプルを集めるために局所麻酔され、その後、骨髄サンプルは、全量または一部が、すなわち、細胞分取後に再注入される。ガン治療では、幹細胞を単離し、刺激し、そして、場合により、患者へのその再注入の前に、エクスビボでトランスフェクションすることができる。白血病を処置するための移植のための補助剤として、多量の異種ＭＳＣがドナーの骨髄と一緒に注入される。
【００１０】
組織再生および組織再建における血小板富化血漿（「ＰＲＰ」と略記される）の潜在的使用のための研究が既に開始されている。
【００１１】
ＰＲＰは間質幹細胞のインビトロ増殖を誘導する能力があることが立証されている（Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ Ｅ．他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４（２００３）、３０９５頁〜３１００頁）。
【００１２】
近年の科学的研究はまた、骨再建においてＭＳＣとともにグラフト材料として使用される血小板富化血漿（「ＰＲＰ」と略記される）の有益な効果に関する最初の結果を与えている（Ｋｉｔｏｈ Ｈ．他、Ｃｌｉｎ．Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓ．、第１５（５）巻（２００４）、５８９頁〜５９７頁；Ｙａｍａｄａ Ｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第６８Ａ（４）巻（２００４）、７４７頁〜７５５頁）。
【００１３】
それにもかかわらず、ＭＳＣ−ＨＳＣを使用する組織再生の現在の方法、および、ＨＳＣ細胞では、いくつかの欠点がもたらされる。具体的には、生じた骨組織に、適切な形状を与えることが、これらの方法および細胞に関して困難である。埋め込みに耐えるための十分な機械的強度を有する骨組織を得ることもまた困難である。その上、インビトロ培養では、骨組織を十分な量で得るために非常に時間がかかる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、（ヒト胚性でない）幹細胞（好ましくはＭＳＣおよびＥＰＣ、場合により、ＨＳＣを除いて）を得ること、および／または、（ヒト胚性でない）幹細胞（好ましくはＭＳＣおよびＥＰＣ、場合により、ＨＳＣを除いて）の増殖を誘導することのための、また、哺乳動物の組織または細胞の「産生」（再生、再建、補強および／または若返り）のための、先行技術の欠点を示さない改善された、また、代替となり得る方法および手段を提供する。
【００１５】
好ましくは、ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０からなる群から選択される１つ、２つまたは（好ましくは）３つの陽性マーカーを（その細胞表面に）発現し、かつ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは（好ましくは）５つのマーカーの（その細胞表面における）発現を有しないとして定義される。
【００１６】
代替として（または加えて）、ＭＳＣは、標準的な培養条件で維持されるとき、プラスチック接着性の細胞である。
【００１７】
代替として（または加えて）、ＭＳＣは、骨芽細胞、脂肪細胞および／または軟骨細胞にインビトロで分化することができる。
【００１８】
好ましくは、ＥＰＣは、ＣＤ１３３およびＣＤ３４の両方を（その細胞表面に）発現するとして定義され、好ましくは、ＣＤ３１および／またはＣＤ１４４をさらに発現し、しかし、場合により、ＣＤ４５を発現しない。
【００１９】
代替として（または加えて）、ＥＰＣは、コロニーをインビトロで形成するその能力によって定義され、この場合、好ましくは、コロニーは、より多くの細長い出芽細胞が周辺部に存在する丸い細胞の中央コアとして定義される。
【００２０】
代替として（または加えて）、ＥＰＣは、ＶＥＧＦの存在下でのマトリゲルアッセイにおいて置床されるときのその血管形成性によって定義される。
【００２１】
好ましくは、ＨＳＣは、ＣＤ３４マーカーおよびＣＤ４５マーカーを発現するとして定義される。
【００２２】
本発明は、哺乳動物対象（ヒト患者を含む）における起こり得る移植片対宿主拒絶および宿主対移植片拒絶を軽減または回避し、同様にまた、哺乳動物対象（ヒト患者を含む）における、損傷組織または疾患組織の、組織または細胞の再生、再建または補強の後での感染の欠点を軽減または回避する方法および手段を提案する。
【００２３】
本発明はさらに、高齢患者の場合には、あるいは、心臓発作または心臓障害に苦しむ人々の場合にはとりわけ有害である全身麻酔を何ら必要としないかもしれない、改善および簡略化された方法および手段を提案する。
【００２４】
好都合なことに、本発明の製造物、方法および手段は、組織または細胞を再生するために使用される。
【００２５】
具体的には、本発明は、（骨）再建のための満足できる構造的特徴および物理的特徴を有する新しい（骨）組織を得ることを可能にする方法および手段を提供する。これらの物理的特徴には、すなわち、形状、機械的強度および弾力性が含まれる。生物学的特徴には、すなわち、骨、皮膚、脂肪または筋肉のようないくつかの成熟組織における、増殖、委任および分化の高い可能性を有する未成熟な細胞の高い割合および濃度が含まれる。
【００２６】
本発明はまた、ＭＳＣと、場合により、ＥＰＣ（場合により、ＨＳＣを除いて）とを含む高濃度の未成熟な幹細胞を骨髄において誘導することによって、および／または、高濃度のＥＰＣ細胞を血液において誘導することによって幹細胞を動員する、心臓発作を処置するための方法および手段を提供する。
【００２７】
実際、手術手技後のようなすべての炎症性状態、または、炎症性疾患もまた、本発明の方法および手段から利益を受けることができる。これは、炎症は、当然のことながら、幹細胞を動員するからであり、また、幹細胞における増大は、当然のことながら、必要性がある分化した細胞に変換され得るからである。
【００２８】
本発明はまた、インビトロ培養時間を短くするか、または抑え、かつ、必要とされる集められた骨髄の量を少なくする簡便化された方法および手段を提供する。
【００２９】
本発明は、幹細胞（好ましくはＭＳＣ−ＥＰＣ、場合により、ＨＳＣを除いて）を得るための、また、場合により、（ａ）哺乳動物対象の組織または細胞の再生、再建、補強および／または若返りのための、好ましくは、（ａ）ヒト患者の組織または細胞の再生、再建、補強および／または若返りのための方法および手段に関連し、この場合、この方法は下記の工程を含む：
ａ）（液体）血液サンプルをこの哺乳動物対象から、好ましくはヒト患者から集める工程；
ｂ）自己ＰＲＰをこの血液の血漿サンプルから調製する工程、ただし、ＰＲＰの血小板割合の濃縮が好ましくは、この哺乳動物対象の全血の約１００％〜約１０００％の間で、好ましくはこのヒト患者の全血の約１００％〜約１０００％の間で含まれ、より好ましくは、この哺乳動物対象の全血の約２００％〜約５００％の間で、好ましくはこのヒト患者の全血の約２００％〜約５００％の間で含まれる；
ｃ）この自己ＰＲＰを、
・トロンビン（異種トロンビン、自己トロンビン、あるいは、組換え型のヒトトロンビンまたはウシトロンビン）、これには、（活性化型または非活性化型である）組換えトロンビン（ＦＩＩ）が含まれる；
・トロンビン、とりわけ、トロンボプラスチン（組織因子）、好ましくは組換えトロンボプラスチン（ｒＴＦ）、より好ましくはヒト組織因子（ｈＴＦ）、一層より好ましくは組換えヒト組織因子（ｒｈＴＦ）、より具体的には組換え可溶性ヒト組織因子（ｒｓｈＴＦ）を産生することができる化合物（凝固因子）、これは、場合により、リン脂質（ＰＬ）（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど）の添加と組み合わせられる；
・ＣａＣｌ２、
・（組換え）ヒト第ＶＩＩ因子またはヒト第ＶＩＩａ因子（例えば、化合物ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）など）、
・（組換え）ヒト第Ｘ（ａ）因子、
・（組換え）組織因子または（組換え）第ＶＩＩ因子または（組換え）第ＶＩＩａ因子、
・（組換え）組織因子および第Ｘａ因子、
・（組換え）組織因子／第ＶＩＩａ因子／第Ｘａ因子、
・（組換え）第ＶＩＩＩ因子、
・（組換え）第ＩＸ因子、あるいは
・上記化合物の組合せ
からなる群から選択される効果的な量の（活性な）哺乳動物化合物、好ましくは、（活性な）ヒト化合物により活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第１の流体（溶液）を得る工程；
ｄ）胚性でない（好ましくはＭＳＣ、ＥＰＣ）幹細胞が多い目標注入領域（好ましくは胸骨または腸骨稜に由来する骨髄）または脂肪組織を同じ哺乳動物対象において、好ましくは同じヒト患者において選択する工程；
ｅ）この第１の流体（溶液）を哺乳動物対象のこの目標注入領域に、好ましくはヒト患者のこの目標注入領域に注入して、その結果、（好ましくはＭＳＣ−ＥＰＣ）幹細胞のインビボ増殖をこの哺乳動物対象において、好ましくはこのヒト患者において局所的に誘導する工程；
ｆ）場合により、十分なインキュベーション時間の後で、同じ哺乳動物対象から、好ましくは同じヒト患者から、この目標注入領域からの、（ＭＳＣ、ＥＰＣ）細胞が多い骨髄（液）サンプル、または、この哺乳動物からの血液サンプル、または、この哺乳動物からの脂肪サンプルのどれかを集め、幹細胞をこのサンプルから回収する工程；
場合により、工程ａ）〜工程ｅ）、または、工程ａ）〜工程ｆ）を、規定された時間間隔で数回（好ましくは少なくとも２回、３回または４回）（好ましくは毎週）繰り返す工程；
ｇ）場合により、第２の血液サンプルを集める工程；
ｈ）場合により、第２の自己血小板富化血漿をこの第２の血液サンプルから調製する工程；
ｉ）場合により、この自己血小板富化血漿を、工程ｃ）において添加される上記の活性化合物の効果的な量の添加によって活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第２の流体（溶液）をこの第２の血液サンプルから得る工程；
ｊ）場合により、この第２の流体（溶液）と、幹細胞が多い、以前に集められた骨髄サンプルまたは血液サンプルまたは脂肪サンプルとを混合して、その結果、活性化された濃縮自己血小板富化血漿および幹細胞を含む組成物を得る工程；
ｋ）場合により、分化補助剤をこれらの幹細胞に加えて、好ましくは（活性化された濃縮自己ＰＲＰおよび幹細胞を含む）組成物に加えて、その結果、（場合により、ＨＳＣを除いて、ＭＳＣ、ＥＰＣ）幹細胞の「事前に規定された」分化した組織細胞への分化を誘導し、場合により、所望される組織の再生を得る工程、ただし、これらの補助剤は、工程ｃ）において使用される上記の活性化合物、ならびに／あるいは、細胞固定のための少なくとも１つのマトリックス、および、特定の細胞（例えば、骨芽細胞系細胞（骨細胞、骨芽細胞など）、筋肉細胞、内皮細胞、ニューロン細胞、肝細胞または線維芽細胞およびケラチノサイトなど）への幹細胞の分化を得る（誘導する）ための１つまたは複数の要素を含み、この場合、これらの要素は好ましくは、ビタミン（ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ビタミン））、コルチゾン（またはコルチゾン誘導体、例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾンなど）、および、場合により、β−グリセロホスファート（これらの要素は好ましくは、これらの要素の遅い放出を可能にする、ポリＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸および／またはポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、アルギン酸塩の足場（例えば、マイクロビーズなど）に存在する）、ならびに／あるいは、ＢＭＰ２（これはＭＥＤＴＲＯＮＩＣＳから得られるかもしれない）、または、上皮増殖因子、または、神経増殖因子、または、当業者によって知られている任意の他のサイトカイン、増殖因子もしくは分化因子からなる群から選択される；および
ｌ）場合により、活性化された濃縮自己血小板富化血漿およびＭＳＣを含む組成物に、適切なゲル化剤（このゲル化剤は好ましくは、工程ｃ）において添加される活性化合物の十分な量から得られる）を加えて、ゲルを得る工程；および
ｍ）場合により、そのようにして得られたゲルを、哺乳動物対象の目標再建部位（例えば、自己採取骨、同種移植片、異種移植片またはコラーゲンリーフなど）の内部／表面に、好ましくはヒト患者の目標再建部位（例えば、自己採取骨、同種移植片、異種移植片またはコラーゲンリーフなど）の内部／表面に場合により適用することによって、得られたゲルをインプラントとして使用して、その結果、組織再建がこの再建部位において生じ得るようにする工程。
これらの工程ａ）〜工程ｍ）を、十分な量の幹細胞を得るように、規定された時間間隔で数回（好ましくは少なくとも２回、３回または４回）（好ましくは毎週）繰り返すことができる。
【００３０】
本発明はさらに、下記の工程を含む、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るための方法に関連する：
・必要な場合には、骨髄幹細胞を、好ましくは本発明の方法によって、かつ／または、ＰＲＰおよび凝固因子の添加によって活性化する工程；
・活性化された骨髄のサンプルを得る工程；
・必要な場合には、このサンプルの幹細胞を富化する工程。
【００３１】
好ましくは、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、（インビトロで成長させられるときに）コロニー（ＣＦＵ−Ｆ）を形成するこれらのＭＳＣの能力が増大しており、より好ましくは少なくとも約３０％（少なくとも約５０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約１００％）増大している。
【００３２】
好都合なことに、または、加えて、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、少なくとも約１３個のコロニー（より好ましくは少なくとも約１５個のコロニー、なおさらにより好ましくは少なくとも約２０個のコロニー）（ＣＦＵ−Ｆ）が、この活性化骨髄に由来するサンプルから得られる１００００００個の単核細胞のインビトロ培養のときに形成される。
【００３３】
好都合なことに、または、加えて、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、ＭＳＣの（インビトロ）培養のときに形成されるコロニー（ＣＦＵ−Ｆ）の少なくとも約３５％（より好ましくは少なくとも約４０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約５０％）が骨原性マーカー（例えば、アルカリホスファターゼなど）を発現する。
【００３４】
好ましくは、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、幹細胞の富化が、骨髄サンプルの遠心分離（これにより、上清液、非ＭＳＣ細胞および破片が富化されたペレット、ならびに、（活性化）ＭＳＣ細胞が富化された中間画分がもたらされる）、および、この中間画分の回収によって行われる。
【００３５】
本発明の別の局面が、活性化ＭＳＣの（増大した）集団を含む骨髄サンプルに関連し、この場合、好ましくは、（インビトロで成長させられるときに）コロニー（ＣＦＵ−Ｆ）を形成するこの（活性化）ＭＳＣの能力が増大しており、より好ましくは少なくとも約３０％（より好ましくは少なくとも約５０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約１００％）増大している。
【００３６】
好都合なことに（または加えて）、活性化ＭＳＣの（増大した）集団を含むこの骨髄サンプルにおいて、少なくとも約１３個のコロニー（少なくとも約１５個のコロニー、なおさらにより好ましくは少なくとも約２０個のコロニー）（ＣＦＵ−Ｆ）が、このサンプルから得られる１００００００個の単核細胞のインビトロ培養（好ましくは、この活性化骨髄から得られる１００００００個の単核細胞のインビトロ培養）のときに形成される。
【００３７】
好都合なことに（または加えて）、活性化ＭＳＣ集団が富化されたこの骨髄サンプルにおいて、ＭＳＣの培養によって形成されるコロニー（ＣＦＵ−Ｆ）の少なくとも約３５％（より好ましくは少なくとも約４０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約５０％）が骨原性マーカー（例えば、アルカリホスファターゼなど）を発現する。
【００３８】
場合により、活性化ＭＳＣが富化されたＭＳＣ集団を得るためのこの方法において、および／または、活性化ＭＳＣが富化されたこの骨髄サンプルにおいて、ＥＰＣの（相対的）含有量が増大せず、かつ／または、ＨＳＣの含有量が低下する。
【００３９】
本発明の方法によって得られるＭＳＣ細胞は好都合なことに、哺乳動物対象に対して、好ましくはヒト患者に対して、好ましくは再生させるための部位の近く（またはその部位）に注入され、または、代替として、輸血によって注入される。
【００４０】
本発明による方法は、損傷組織もしくは疾患組織の組織を再生するために、または、毒性化合物の影響を特徴づけるためのスクリーニング細胞として使用される特定の幹細胞を回収するために、あるいは、自己または異種であろうとも、将来の使用のために（バンクにおいて）保管するために使用することができる。
【００４１】
本発明によれば、用語「組織再生」は、新しい組織を幹細胞から再生することを示し、用語「再建」または用語「補強」は、この得られた再生組織を、組織修復または組織成長刺激が必要とされる哺乳動物対象に、好ましくは、組織修復または組織成長刺激が必要とされるヒト患者に埋め込み、一体化させることを示す。組織修復または刺激が、患者の組織に影響を及ぼすか、または、患者の全体的な全身的健康状態に影響を及ぼす損傷、疾患または衰弱（加齢状態）のために要求されるかもしれない。組織再生が、ガン、心筋症、先天性心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、心内膜炎、心筋梗塞、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中、脳血管障害、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病、エリテマトーデス、骨再建、骨萎縮、骨粗鬆症および骨補強、ならびに、場合により、アテローム性動脈硬化および心筋炎の場合には特に必要とされる。
【００４２】
したがって、用語「再建部位」は、修復目的または補強目的のための組織再建が要求される哺乳動物体内組織の特定の部位を示す。
【００４３】
本発明によれば、「血小板富化血漿（ＰＲＰ）」は、血小板の濃度が、処置された哺乳動物対象（ヒト患者）のベースライン静脈カウント数に対して少なくとも約１００％の割合で増大しており、好ましくは約２００％〜１０００％の間の割合で増大しており、かつ、（１マイクロリットル（μＬ）あたり）少なくとも６０００００個の血小板濃度、または、１μＬあたり少なくとも８０００００個の血小板濃度、または、１μＬあたり少なくとも１００００００個の血小板の血小板濃度に達し、好ましくは、１μＬあたり約８０００００個（または約１５０００００個の血小板）〜１μＬあたり約６００００００個（または約８００００００個の血小板）の間の血小板濃度に達し、より好ましくは、１μＬあたり約２００００００個の血小板〜１μＬあたり約５００００００個の血小板の間の血小板濃度に達する流体（溶液）を意味する。ＰＲＰは、遠心分離デバイスを用いて、例えば、米国特許第６７１９９０１号、国際公開ＷＯ０２／０８０９９１、米国特許第６８５５１１９号、国際公開ＷＯ０３／１０６０４０、国際公開ＷＯ００／６１２５６および国際公開ＷＯ２００４／０２４１９８に記載される遠心分離デバイスなどを用いて、都合よく得られる。
【００４４】
Ｇｒａｚｉａｎｉ Ｆ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｒａｌ ｉｍｐｌａｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１７巻、第２号、２１２頁〜２１９頁（２００６）は、細胞増殖に対する種々のＰＲＰ濃度の影響を調べている。最大の効果が２．５倍の濃度で達成され、より高濃度では、細胞増殖における低下がもたらされたようである。細胞増殖に対するＰＲＰの最も注目すべき影響が約７２時間で特徴づけられた。このときの血小板濃度は、得ることができた最大濃度のおよそ半分であった。しかしながら、一部の細胞増殖については、ＰＲＰのより高い濃度が好まれ得るかもしれない。
【００４５】
トロンビンは、好都合には、自己トロンビン、異種トロンビンまたは組換えトロンビンが可能であり、好ましくは組換えトロンビンが可能であり、例えば、ＺＹＭＯＧＥＮＥＴＩＣＳ社（ｗｗｗ．ｚｇｉ．ｃｏｍ）によって製造される組換えトロンビンなどが可能である。
【００４６】
好ましくは、約１０単位〜約２００単位の（組換え型、ウシ型または自己）トロンビンが、より好ましくは、約１０単位〜約７５単位の（組換え）トロンビンが、６ｍｌ〜２０ｍｌの抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００４７】
したがって、ＰＲＰの非常に遅い凝固を誘導するために、（組換え型、ウシ型または自己）トロンビンが、約０．５単位／ｍｌ〜約３３単位／ｍｌで、好ましくは約０．５単位／ｍｌ〜約３．７５単位／ｍｌで、より好ましくは約１．５単位／ｍｌ〜約３．７５単位／ｍｌで抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００４８】
代替では、ＰＲＰの遅い凝固を誘導するために、（組換え型、ウシ型または自己）トロンビンが、約０．５単位／ｍｌ〜約１０単位／ｍｌで、好ましくは約１．５単位／ｍｌ〜約１０単位／ｍｌで抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００４９】
トロンビン単位は、１ｍｌのシュウ酸塩添加血漿を３７℃において３０秒で凝固する物質である。
【００５０】
哺乳動物の血液凝固に関与する他の凝固因子（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子（Ｎｏｖｏｎｏｒｄｉｓｋから得られるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子など）もまた使用することができ、あるいは、血液凝固に関与する（またはトロンビンを生じさせることができる）どのような化合物もまた使用することができる。しかしながら、トロンボプラスチン（ヒト組織因子：ｈＴＦまたはｈＴｆ）が好ましい。これは、トロンボプラスチンは安全であり、かつ、可溶性形態で提供することができ、また、トロンビンに反して、凝固カスケードが制御可能であり、かつ、血液凝固があまり急速に得られないからである。組成物に存在するかもしれない関連脂質および他の分子の例が欧州特許ＥＰ１２３９８９４に記載される。
【００５１】
好ましくは、ＰＲＰおよび凝固因子（凝固因子はより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ）である）が、患者への注入の前（直前）に混合される。
【００５２】
好都合には、ＰＲＰおよび凝固因子（凝固因子はより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ）である）が、（好ましくは、約２０℃〜約３７℃の間に含まれる温度で）混合され、これらは、（約２０℃〜約３７℃の間に含まれる温度で）好ましくは数分間、可溶性のままである。
【００５３】
より好ましくは、ＰＲＰは、凝固因子（凝固因子はより好ましくはｓｈＴｆである）と混合されたとき、非常にゆっくり凝固し、好ましくは、混合されたときには、１分間を越えて、より好ましくは、２分間を越えて、３分間を越えて、４分間を越えて、または、５分間を越えてさえ、液体（可溶性）のままである（または、液体（可溶性）のままであることができる）（この場合、温度は約２０℃〜約３７℃の間に含まれる）。
【００５４】
一層より好ましくは、ＰＲＰは、凝固因子（凝固因子はより好ましくはｓｈＴｆである）と混合されたとき、非常にゆっくり凝固し、好ましくは、哺乳動物対象（ヒト患者）に注入されたとき、３０秒間を越えて、より好ましくは、１分間を越えて、２分間を越えて、３分間を越えて、４分間を越えて、または、５分間を越えてさえ、液体（可溶性）のままである（または、液体（可溶性）のままであることができる）。
【００５５】
好ましくは、約６００単位〜約１２００００単位の（活性化）第ＶＩＩａ因子（約１２μｇ〜約２４００μｇ）が、より好ましくは、約６００単位〜約６００００単位の（活性化）第ＶＩＩａ因子（約１２μｇ〜約１２００μｇ）が、なおさらにより好ましくは、約６００単位〜約６０００単位の（活性化）第ＶＩＩａ因子（約１２μｇ〜約１２０μｇ）が、６ｍｌ〜２０ｍｌの抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００５６】
したがって、（ＰＲＰの遅い凝固を誘導するために）、（活性化）第ＶＩＩａ因子が、約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約２００００単位／ｍｌ（４００μｇ／ｍｌ）で、好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約１００００単位／ｍｌ（２００μｇ／ｍｌ）で、より好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約１０００単位／ｍｌ（２０μｇ／ｍｌ）で抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００５７】
代替では、（ＰＲＰの非常に遅い凝固を誘導するために）、（活性化）第ＶＩＩａ因子が、約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約６０００単位／ｍｌ（１２０μｇ／ｍｌ）で、好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約３０００単位／ｍｌ（６０μｇ／ｍｌ）で、より好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約３００単位／ｍｌ（６μｇ／ｍｌ）で、なおさらにより好ましくは約１００単位／ｍｌ（２μｇ／ｍｌ）〜約３００単位／ｍｌ（６μｇ／ｍｌ）で抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００５８】
種々のリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよび／またはホスファチジルセリン）の添加を伴うヒト組織因子（ｈＴＦ）が、ヒトトロンボプラスチンによって意味される。このｈＴｆは、（完全な）ｈＴｆの２６３個のアミノ酸から、２４３個のアミノ酸（組織因子の細胞質外テールおよび膜部分）のポリペプチドまたは単に（短縮された）（可溶性）組織因子である短縮型ｈＴｆから、２１９個または２０６個のアミノ酸（細胞質外テールのみ）のポリペプチドから、あるいは、それらの任意の変化体から作製することができる。
【００５９】
好ましくは、１００μｇ〜３０００μｇの可溶性組織因子が、より好ましくは、約３００μｇ〜約９００μｇの可溶性組織因子が、約６ｍｌ〜約２０ｍｌの抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００６０】
したがって、（非常に遅い凝固を誘導するために）、約２μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、好ましくは、約１５μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、なおさらにより好ましくは、約１５μｇ／ｍｌ〜約４５μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００６１】
代替では、（ＰＲＰの遅い凝固を誘導するために）、約１５μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、好ましくは、約５０μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００６２】
（非修飾）ｈＴｆの変化体は、非修飾分子の機能的活性（ＰＲＰの活性化）に影響を及ぼさない、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加または置換を含むことができる。
【００６３】
ＰＲＰの活性化はまた、凝固カスケードに関与する他の分子によって得ることができ、好ましくは、上記方法の工程ｃ）において使用される活性化合物の１つによって得ることができる。
【００６４】
これらの様々な活性化合物は、とりわけ、凝固因子は、１つまたは複数の混入物（とりわけ、細菌またはウイルス）の伝播を避けるために、１つまたは複数の不活性化工程に付すことができる。この不活性化工程は、溶媒／界面活性剤、乾熱、ＵＶＣ不活性化などを加えることに基づくことができる。
【００６５】
本発明の方法では、とりわけ、上記方法の工程ｋ）において、マイクロビーズが、媒体層がアスコルビン酸を含有し、かつ、内層被覆がβ−グリセロホスファートを含む薬物送達システムとして使用される。
【００６６】
これらのマイクロビーズの他の改変を、選択された部位へのその補充、および、所望される細胞（例えば、筋肉細胞、血管細胞、ニューロン細胞、肝細胞、骨芽細胞、線維芽細胞など）へのその委任、分化のためには特に、幹細胞の分化を改善するための本発明による方法において使用することができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明による方法では、工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）が行われず、工程ｄ）および工程ｅ）が下記のように変更される：
ｄ）幹細胞が多い目標注入領域（好ましくは、哺乳動物の胸骨または腸骨稜）を哺乳動物対象において、好ましくはヒト患者の骨髄において選択すること、
ｅ）十分な量の幹細胞活性化流体または工程ｃ）で使用される活性化合物を哺乳動物対象（ヒト患者）のこの目標注入領域に注入して、その結果、自己ＰＲＰを加えることなく、（間葉系）幹細胞のインビボ増殖を直接、哺乳動物対象（好ましくはヒト患者）において局所的に誘導すること。
【００６８】
本方法のこの好ましい実施形態の他の工程、すなわち、工程ｆ）〜工程ｍ）は、上記で記載される工程に対応し得る。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、工程ｆ）〜工程ｍ）が行われず、工程ａ）〜工程ｅ）が、哺乳動物対象（ヒト患者）の身体において、とりわけ、幹細胞の濃度が低い高齢者（５０歳を超える高齢者、好ましくは、約６０歳の高齢者または６５歳を超える高齢者）において、幹細胞の増殖を得るために使用される。幹細胞の刺激によるこの若返り工程が、組織または細胞の再生、再建、補強または若返りを改善するために、とりわけ、このヒト患者身体における損傷または疾患のある組織または細胞の再生、再建、補強または若返りを改善するために、好ましくは（ヒト）患者の身体に対する可能な外科手術の前に行われる。
【００７０】
必要ならば、前記刺激を、工程ａ）〜工程ｃ）を使用することなく、前記実施形態において記載されるように得ることができ、また、ＰＲＰの添加を伴うことなく、上記で提案されるように工程ｄ）および工程ｅ）を選択することによって得ることができる。
【００７１】
本発明による方法では、十分なインキュベーション時間の後、当業者は、幹細胞が多い骨髄（液）サンプルを、好ましくは目標注入領域から集めることができ、または、（ＥＰＣ、ＭＳＣ）幹細胞が同様に多い血液サンプルを集めることができる。
【００７２】
この回収工程（ｆ）は、幹細胞のインビボ増殖がまた、哺乳動物対象の血液へのこれらの幹細胞の増殖を誘導しているという事実のために、血液サンプルに対して行うことができる。したがって、当業者によって広く知られている方法によって、例えば、古典的なプラスマフェレーシス透析法およびプラスマフェレーシス透析手段などによって、血液サンプルから直接、幹細胞を回収することが可能である。
【００７３】
本発明は、（非凝固および／または可溶性）ＰＲＰおよび（十分な量の）凝固因子、または、それらを含む（医薬用）組成物を、医薬品として、好ましくはＰＲＰおよび凝固因子の非凝固および／または可溶性の混合物の形態で提供する。
【００７４】
好ましくは、ＰＲＰおよび凝固因子（凝固因子は好ましくはｓｈＴｆである）が、患者への注入の前（直前）に混合される。
【００７５】
より好ましくは、ＰＲＰは、凝固因子（凝固因子は好ましくはｓｈＴｆである）と混合されたとき、非常にゆっくり凝固し、好ましくは、１分間を越えて、より好ましくは、２分間を越えて、３分間を越えて、４分間を越えて、または、５分間を越えてさえ、液体（非凝固および／または可溶性）のままである（または、液体（非凝固および／または可溶性）のままであることができる）。
【００７６】
凝固因子の十分な量によって、（不活性化）ＰＲＰの（非常に）遅い凝固を可能にする量が意味される。
【００７７】
より好ましくは、本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（血液凝固に関与する化合物）（の非凝固および／または可溶性の混合物）（ただし、凝固因子は、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（ＴＦ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される）、または、それらを含む（医薬用）組成物を医薬品として提供する。
【００７８】
なおさらにより好ましくは、本発明は、ＰＲＰおよびこの凝固因子（血液凝固に関与する化合物）（の非凝固および／または可溶性の混合物）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、哺乳動物対象の幹細胞プール、好ましくはヒト患者の幹細胞プール、好ましくはＥＰＣおよび／またはＭＳＣを、より好ましくはＨＳＣプールを変化させることなく、または、止血を変化させることなく富化するための医薬品としての使用のために提供する。
【００７９】
代替では、本発明は、凝固因子、好ましくは、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴＦ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、哺乳動物対象の幹細胞プール、好ましくはヒト患者の幹細胞プール、好ましくはＥＰＣおよび／またはＭＳＣを、より好ましくはＨＳＣプールを変化させることなく、または、止血を変化させることなく富化するための医薬品としての使用のために提供する。
【００８０】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、医薬品としての使用のために、とりわけ、心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患、好ましくは、（変性）心筋症、（先天性）心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎および心筋梗塞からなる群から選択される心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患の処置および／または防止のための医薬品としてのそれらの使用のために提供する。
【００８１】
代替では、本発明は、凝固因子、好ましくは、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患、好ましくは、（変性）心筋症、（先天性）心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎および心筋梗塞からなる群から選択される心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８２】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、神経学的疾患、好ましくは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中および脳血管障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８３】
代替では、本発明は、凝固因子、好ましくは、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、（哺乳動物対象の）神経学的疾患、好ましくは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中および脳血管障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される（哺乳動物対象の）神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８４】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）を、変性（自己免疫）疾患、好ましくは、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病およびエリテマトーデスからなる群から選択される変性（自己免疫）疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８５】
代替では、本発明は、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、変性（自己免疫）疾患、好ましくは、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病およびエリテマトーデスからなる群から選択される変性（自己免疫）疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８６】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、ガン（白血病）および／または感染性疾患（ＡＩＤＳ）の処置のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８７】
代替では、本発明は、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、ガン（白血病）の処置のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８８】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、骨変性関連疾患、好ましくは、骨萎縮、骨粗鬆症からなる群から選択される骨変性関連疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために、また、場合により、骨再建または骨補強のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８９】
代替では、本発明のＰＲＰおよび凝固因子は、哺乳動物対象の腸骨稜、胸骨の中、および／または、脂肪組織に、好ましくはヒト患者の腸骨稜、胸骨の中、および／または、脂肪組織に、より好ましくは、前記ヒト患者の腸骨稜の骨髄に、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態で）同時に（または別々に）注入される。
【００９０】
好都合には、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態での）約６ｍｌ〜約２０ｍｌのＰＲＰにおける約２μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの（可溶性）ｈＴｆが、好ましくは対象または患者の腸骨稜、胸骨および／または脂肪組織に注入される本発明の医薬品において使用される。
【００９１】
代替では、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態での）約６ｍｌ〜約２０ｍｌのＰＲＰにおける約５単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌの第Ｘａ因子が、好ましくは対象または患者の腸骨稜または胸骨および／または脂肪組織に注入される本発明の医薬品において使用される。
【００９２】
代替では、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態での）約６ｍｌ〜約２０ｍｌのＰＲＰにおける約３０単位／ｍｌ〜約２００００単位／ｍｌの第ＶＩＩａ因子が、好ましくは対象または患者の腸骨稜または胸骨および／または脂肪組織に注入される本発明の医薬品において使用される。
【００９３】
本発明の別の局面が、場合により、適切な医薬用のキャリアまたは希釈剤と、効果的な量のＰＲＰと、下記からなる群から選択される、効果的な量の凝固因子とを含む（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物であって、心臓血管疾患、神経学的疾患、自己免疫疾患、炎症、肝臓傷害および／または骨粗鬆症からなる群から選択される疾患の処置および／または防止のための（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物である：
・トロンボプラスチン（組織因子）、好ましくは組換えトロンボプラスチン（ｒＴｆ）、好ましくはヒト組織因子（ｈＴｆ）、より好ましくは組換えヒト組織因子（ｒｈＴｆ）、より好ましくは組換え可溶性ヒト組織因子（ｒｓｈＴｆ）、これらは、より好ましくは、リン脂質（ＰＬ）、より具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンの添加を伴う；または
・第ＶＩＩ（ａ）因子、
・第Ｘ（ａ）因子、
・組織因子−第ＶＩＩ（ａ）因子、
・組織因子−第ＶＩＩ（ａ）因子−第Ｘ（ａ）因子、
・第ＶＩＩＩ（ａ）因子、
・第ＩＸ（ａ）因子、あるいは、上記化合物の組合せ（ただし、これらの因子は活性化型または非活性化型である）。
【００９４】
好ましくは、本発明による（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物は心臓病学において使用され、ただし、この場合、心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患が、好ましくは、アテローム性動脈硬化、心筋症、先天性心臓疾患、心筋炎、冠状動脈疾患、心臓血管障害、拡張期機能不全、心内膜炎、虚血および心筋梗塞からなる群から選択される。
【００９５】
好ましくは、本発明による（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物は神経学において使用され、ただし、この場合、神経学的疾患が、好ましくは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中、脳血管障害、再生不良性貧血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または多発性硬化症からなる群から選択される。
【００９６】
本発明の別の局面が、幹細胞のインビトロ増殖のための、（非凝固（可溶性））ＰＲＰおよび凝固因子（好ましくはｈＴｆ）の（混合物の）使用である。
【００９７】
最後に、本発明の１つの局面が、本発明による方法の種々の実施形態を行うための様々な要素および手段を含む、構成要素のキットに関連し、とりわけ、下記のものを含むキットに関連する：
・自己ＰＲＰを集めるための遠心分離デバイス、および、場合により、自己トロンビンまたは異種トロンビンを哺乳動物の血漿から得るための手段；
・１つまたは複数の哺乳動物活性化合物（凝固因子）、好ましくは、１つまたは複数のヒト活性化合物（凝固因子）、あるいは、上記方法の工程ｃ）において使用される前記１つまたは複数の化合物を含む１つまたは複数の流体（溶液）（ただし、これらは１つまたは複数のバイアルに存在するかもしれない）；
・場合により、血液サンプルおよび／または骨髄サンプルおよび／または脂肪サンプルを哺乳動物対象から集めるための手段；および
・場合により、この自己ＰＲＰおよび／またはこの活性化合物を、ＭＳＣが多い目標注入領域において哺乳動物対象に再注入するための手段（シリンジ、ニードル、管類など）。
【００９８】
好ましくは、これらの手段は、ＭＳＣ活性化化合物（凝固因子）またはＭＳＣ活性化化合物（凝固因子）を含む流体と一緒での（自己）ＰＲＰの注入のために十分であり、これらの手段はまた、幹細胞が多いこの目標注入領域から、これらの幹細胞を含む骨髄液サンプルを集めるためにも十分である。
【００９９】
好都合なことに、これらの手段はまた、遠心分離デバイスへの接続を得るために、また、得られた自己ＰＲＰ（および、場合により、自己トロンビン）を集めるために、また、集められた血小板富化血漿液（および、場合により、自己トロンビン）を、（間葉系）幹細胞が多い目標部位（胸骨、腸骨稜または脂肪組織）において、同じ患者に（同時に）注入するために十分である。これらの手段はまた、この目標注入領域から、同じ哺乳動物に由来する骨髄液サンプルを集めるために使用され（ただし、この場合、この骨髄液サンプルは、インビトロ増殖の後で幹細胞が多くなっている）、また、場合により、これらの幹細胞を、好ましくは（場合により、本発明のキットの遠心分離デバイスによる）遠心分離によって、または、米国特許出願公開第２００７／０２７６３５２号に記載される手段によってそれらの混入物から分離するために使用される。
【０１００】
これらの手段はまた、（間葉系）幹細胞が多い血液サンプルを集めるための好適な要素、および、これらの幹細胞を当業者によって広く知られている手段によって血液サンプルから分離するための好適な要素、ならびに、場合により、これらの幹細胞を、好ましくは（場合により、本発明のキットの遠心分離デバイスによる）遠心分離によってそれらの混入物から分離するための好適な要素を含むことができる。
【０１０１】
好ましくは、これらの手段は、注入シリンジおよび採取用シリンジ、あるいは、骨髄もしくは血液への流体の注入、および／または、骨髄もしくは血液からの流体の採取のための専用デバイス、好ましくは、上記で記載される本発明によるデバイス、好都合には遠心分離デバイスに連結される上記で記載される本発明によるデバイス、好ましくは、国際公開ＷＯ０３／１０６０４０、米国特許第６８５５１１９号、国際公開ＷＯ０２／０８０９９１および米国特許第６７１９９０１号の各文書に記載されるような遠心分離デバイスを含む。
【０１０２】
本発明による、構成要素のキットにおいて、幹細胞活性化化合物は好都合には、急速な凝固を避けるために、ＰＲＰを含む注入シリンジとは別にされるバイアルまたはシリンジに、あるいは、骨髄への流体の注入および／または骨髄からの流体の採取のための専用デバイスに、好ましくは、上記で記載される本発明によるデバイスに存在する。幹細胞が多い目標注入領域におけるＰＲＰおよび活性化化合物（凝固因子）の同時注入を可能にする二重注入シリンジ（すなわち、ｔｈｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｈａｒｖｅｓｔ（登録商標）ＵＳＡによって販売されるＳｍａｒｊｅｔ（商標）液体・噴霧送達システム、ＰＲＰ・トロンビン製剤ＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）（Ｈａｒｖｅｓｔ（登録商標）ＵＳＡ）の作製のために使用される他のシステム、自己血小板分離装置Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）血小板濃縮システム（Ｄｅｐｕｙ）、Ａｃｒｏｍｅｄ（登録商標）デバイス（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（登録商標））、Ａｎｇｅｌ（登録商標）（ＳＯＲＩＮ−ＤＩＤＥＣＯ）、血液銀行において使用される３ｉ血小板濃縮デバイスまたは他のデバイス）を使用することもまた可能である。
【０１０３】
本発明の、構成要素のキットはまた、緩衝剤および分化化合物、または、これらの化合物を含む流体などを含めて、注入のための種々の活性化合物または流体を有する異なるバイアルを含むことができる。
【０１０４】
本発明による注入シリンジまたはデバイスは哺乳動物対象の胸骨または腸骨稜における注入のために十分であり、好ましくはヒト患者の胸骨または腸骨稜における注入のために十分である。
【０１０５】
本発明の、構成要素のキットはまた、他の要素、例えば、好適な注入を可能にするための管類、ポンプ、バルブなどを、哺乳動物の身体からの十分な採取のために、また、本発明によるプロセスの自動化を可能にするために含むことができる。これらの要素は好都合には、当業者によって広く知られている好適な自己輸血手順によって手術部位から採取し、生物学的化合物を患者に再注入するための自己輸血システムにおいて一体化される。
【０１０６】
構成要素のこのキットはまた、好適なコンピューターおよび適切なソフトウエアによって実施および／または制御され得る本発明による連続する工程を行うための指示手段を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、内皮前駆体細胞の数を、本発明の方法による注入の前または後において患者の血液または患者の骨髄に存在する１０６個の非接着性細胞について表す。
【０１０８】
【図２】図２は、処置前および処置後のＥＰＣである。
【０１０９】
【図３】図３は、エクスビボ培養の有無に関して、本発明の方法による注入の前または後におけるＭＳＣの数を表す。
【０１１０】
【図４】図４は、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の前（０日目）、３日後および７日後に患者の血液または骨髄から得られる、コロニーを形成することができるＥＰＣの数を表す。これは、処置による血液におけるＥＰＣの動員を強調する。
【０１１１】
【図５】図５は、ＰＲＰ注入後のＭＳＣのインビトロ培養を表す。
【０１１２】
【図６】図６は、刺激域におけるコロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の増大を表す。
【０１１３】
【図７】図７は、注入部位（左側）または反対側部位（右側）において、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の前（０日目）に得られるＭＳＣ、または、７日後に得られるＭＳＣのインビトロ増加を表す。ＭＳＣの拡大特性が処置によって増大するが（左側の７日目および０日目を比較のこと）、反対側部位では減少する。
【０１１４】
【図８】図８は、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処置の前、３日後および７日後における血液細胞集団を表す。ＣＤ３４およびＣＤ１３３について陽性である細胞（幹細胞）が、処置の３日後および７日後ではるかにより多く存在する。これは骨髄からの動員を反映する。
【０１１５】
【図９】図９は、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処置の前および７日後に処置部位（左側）または反対側部位において得られる骨髄細胞集団を表す。ＣＤ３４およびＣＤ１３３のレベルが両方の部位において処置によって維持される。これは、幹細胞含有量を補充する骨髄の能力を強調する。ＣＤ３１細胞が両方の部位においてはるかにより多く存在する。
【０１１６】
【図１０】図１０は、間葉系前駆体としてコロニーを形成することができる細胞（ＣＦＵ−Ｆ）、および、前骨芽細胞マーカーと見なされるアルカリホスファターゼを発現する間葉系前駆体としてコロニーを形成することができる細胞（ＣＦＵ−Ｏ）の相対数を表す。細胞を、処置前（Ｇ０）、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処理の３日後に処置部位（Ｇ３およびＲＧ３）または反対側部位（Ｄ３およびＲＤ３）において骨髄から採取した。細胞の一部はまた、間葉系細胞を富化するために処理された（ＲＧ３およびＲＤ３）。
【０１１７】
【図１１】図１１は、カルシウムおよびアルカリホスファターゼの測定とともに、骨組織に向かう分化を表す。細胞を、処置前（Ｇ０）、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処置の３日後に処理部位（Ｇ３）または反対側部位（Ｄ３）において骨髄から採取し、示された時間、ペトリ皿で成長させた。
【０１１８】
【図１２】図１２は、図１０の場合のように処理されたが、２８日までの間成長させられた細胞のインシトゥーカルシウム標識化を表す。
【０１１９】
【図１３】図１３は、本発明に従って得られた幹細胞を（より大きな量で）使用する患者の顎の骨再建を表す。左側：処置後１週間、１２ｃｍ３の異種骨で満たされるインプラントを示す；右側：５４日の処置の後、インプラントを再び覆う、同種組織の再形成および新形成された骨組織を開示する。下段パネル：再建された顎が生組織から作製されること（血管形成）を立証する処置後９０日での９９Ｔｃシンチグラフィー。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
本発明の方法では、ヒト患者が、移植片について、提供者として、また、宿主として、両方で使用される。
【０１２１】
本発明の方法の独創性は、増殖細胞工程が、その部位において、すなわち、インビボで行われ、先行技術による技術で行われるようなインビトロではもはや行われないことである。しかしながら、本発明に従って刺激される幹細胞は、（刺激されていない幹細胞と比較して）インビトロでの増大した成長を有する。ヒト患者によって産生される幹細胞の量は、生まれた直後のヒトでは極めて重要であるが、年とともに急激に減少することが知られている。
【０１２２】
したがって、幹細胞を患者から回収すること、とりわけ、高齢者の患者から回収することは、極めて困難である。
【０１２３】
したがって、本発明による方法および手段は、患者に対する限定された危険性により、大量の幹細胞をインビボで迅速に得るために、また、これらの得られた幹細胞を回収するために使用することができる。
【０１２４】
活性化された自己ＰＲＰの使用と組み合わされるこの技術的特徴は、本発明の方法および手段に、効率の点で先行技術を上回る実際の利点をもたらす。
【０１２５】
実際、移植片拒絶の危険性がこのように最小限に抑えられ、本方法の安全性が最大化される。これは、インビトロ操作が最小限に抑えられる（または、最小限に抑えられ得る）からである。
【０１２６】
加えて、本発明者らは、好都合なことに、白血球数が、本方法適用時、ならびに／または、ＰＲＰおよび凝固因子を本発明に従って使用した後、患者の血液においてほとんど変化しないことを認めた。
【０１２７】
しかしながら、数工程が、とりわけ、細胞の分化がインビトロで実現され得る。
【０１２８】
ＰＲＰおよび可溶性ｈＴｆが富化される細胞培地が、幹細胞の増殖をインビトロで誘導することにおいて、同様にまた、幹細胞を未分化状態で保つことにおいてより大きい効力を有することもまた明らかにされる。
【０１２９】
約２０ｍｌ〜約２００ｍｌの血液サンプル、好ましくは、ヒト患者からの約６０ｍｌの血液が集められる。この採血サンプルから、（ヒト患者の全血における元の濃度の約１００％〜約１０００％またはそれ以上の間での）濃度の血小板を含む自己血小板富化血漿（自己ＰＲＰ）の調製物（約６ｍｌまたは約７ｍｌ〜約４０ｍｌのＰＲＰ、好ましくは約７ｍｌ〜約１０ｍｌのＰＲＰ）を最新技術（国際公開ＷＯ０３１０６０４０、国際公開ＷＯ００／６１２５６、国際公開ＷＯ２００４／０２４１９８、米国特許第６８５５１１９号、国際公開ＷＯ０２／０８０９９１および米国特許第６７１９９０１号）において記載されるＭａｇｅｌｌａｎ（商標）Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（登録商標）法および装置またはデバイスによって得ることが可能である。
【０１３０】
得られた自己血小板富化血漿が、濃縮された活性化自己ＰＲＰを含有する第１の溶液を形成するために、１マイクロリットルあたり、乾燥形態での凝固因子（約２００単位〜約１００００単位のトロンビン、または、約１ｍｇの組換えヒト組織因子（トロンボプラスチン））に加えられる。
【０１３１】
血小板濃度が、血小板の生存性を約３７℃で保証するように適合化される。
【０１３２】
代替では、トロンビンまたは組換え可溶性ヒト組織因子（トロンボプラスチン）を前記の自己血小板富化血漿に加える代わりに、自己ＰＲＰを、好ましくは、流体を骨髄腔に送達すること、および／または、流体を骨髄腔から抜き取ることのために好適な本発明の永続的な埋め込み可能な手段を使用して、同じヒト患者の腸骨稜、胸骨または脂肪組織に再注入することができる。
【０１３３】
凝固因子（またはＣａＣｌ２）が、注入直前のＰＲＰのシリンジに加えられる。
【０１３４】
この溶液が、同じヒト患者の腸骨稜、胸骨または脂肪組織に再注入され、その結果、（間葉系前駆細胞および／または内皮前駆細胞の）インビボ増殖が、ＨＳＣ幹細胞の増殖を好都合には誘導することなく、前記患者において局所的に誘導される。
【０１３５】
注入後の約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日から、約２１日までで、（間葉系）幹細胞が多い骨髄サンプルが、（同じ目標注入部位において）集められた。３日後および７日後に、１０ｍｌの血液サンプルおよび骨髄サンプルが、血液学的パラメーター（ヘマトクリット、ヘモグロビン、白血球）の最終的変化を推定するために集められた。３日後および７日後に、骨髄サンプルが、ＥＰＣおよびＭＳＣを比較するために、また、末梢血における幹細胞の動員を立証するために、互いに向かい合わせで行われる２回の穿刺によって集められた。
【０１３６】
この採取工程が、例えば、整形外科的処置法または外科的処置法のために、提案されるのと同じ日に行われる。
【０１３７】
これらの採取工程は好ましくは、十分な幹細胞濃度を得るように、規定された時間間隔で数回（好ましくは毎週）繰り返される。
【０１３８】
血小板は、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、血小板由来上皮増殖因子、血小板由来血管形成因子、インスリン様増殖因子１および血小板増殖因子４を含めて、数多くの分子を放出することが知られている。これらの分子は、局所的な間葉系細胞および内皮細胞に、遊走、分裂、ならびに、コラーゲン合成およびマトリックス合成の増大を行うためのシグナルを送る。
【０１３９】
さらに、以前に集められた骨髄サンプルが、活性化および濃縮された自己ＰＲＰおよびＭＳＣを含む組成物を得るように、（好ましくは、約１ｍｇの量の組換えヒト組織因子（トロンボプラスチン）、または、十分な量の上記凝固因子の１つに加えて）、血小板富化血漿と混合される。
【０１４０】
さらに、約８０ｍｇ／ｍｌの量のビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ビタミン）、および、約１０−８Ｍの濃度のデキサメタゾンを、増殖、分化およびマトリックス産生を誘導するために、この濃縮物に加えることができる。デキサメタゾンは好ましくは、カプセル化された化合物の（遅延）放出を可能にする、ＰＬＧＡ（ポリＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ＰＧＡ（ｖｐ８）（ポリグリコール酸）、ＰＬＬＡ（ポリ−Ｌ−乳酸）および／またはアルギン酸塩の足場（例えば、マイクロビーズなど）と一緒に調製される。他のポリマー化合物を、これらの好ましい化合物の効率的なカプセル化および放出を得るために使用することができる。
【０１４１】
骨形成を強化するための活性な化合物を含むそのような足場は、科学文献において既に記載された足場と類似している（Ｍａｒｉａｎｉ Ｍ．他、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、１２（３）、５４７頁〜５５８頁（２００６）、および、Ｉｎａｎｅ Ｂ．他、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、１２（２）、２５７頁〜２６６頁（２００６））。
【０１４２】
得られた組成物は、骨組織の再生のために直接に使用され得るペーストを形成するように、十分なゲル化剤（例えば、アルギン酸塩またはＣａＣｌ２溶液など）を同様に含むゲルと類似している（国際公開ＷＯ２００４／０２４１９８を参照のこと）。これは、効率的な拡大および／または分化を得るために当業者によって適合化することができる。
【０１４３】
さらに、種々の段階で細胞によって発現されるいくつかの表現型マーカー（産生されるＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＮＧＦ−Ｒ、サイトカインなど）を、幹細胞の発現、および／または、未成熟な細胞（未成熟な骨前駆体細胞）、成熟した骨前駆体細胞、前骨芽細胞、成熟した骨芽細胞、骨細胞などへの幹細胞の分化を追跡するために使用することができる。
【０１４４】
他の化合物、例えば、転写調節因子（Ｃｂｆａ−１、Ｍｓｘ−２、ｃ−ｆｏｓ、ｆｒａ−２、Ｄｉｘ−５など）、リンホカイン（ＩＬ−１）、増殖因子（ＴＧＦ−β）、（ＥＧＦ）などもまた、本発明の方法および組成物において使用することができる。
【０１４５】
骨髄においてＣＤ３４＋およびＣＤ３１＋である第１のタイプの幹細胞が得られた。図１および図２は、本発明の方法に関して、骨髄および末梢血においてＥＰＣのインビボでの刺激を（ＰＲＰおよび組織因子の添加によって、例えば、２０μｇ〜１０００μｇの可溶性組織因子（ｓＴＦ）／６ｍｌのＰＲＰ、好ましくは１００μｇ〜７００μｇのｓＴＦ／６ｍｌのＰＲＰ、より好ましくは３３４μｇのｓＴＦ／６ｍｌのＰＲＰの添加によって）得ることが可能であることを示す。さらに、ＭＳＣはまた、初回培養の前後で、著しく、かつ、予想外に増幅される（図７）。
表１から、処置後７日目で、「娘細胞」含有量（例えば、ＷＢＣおよびＣＦＵ−Ｆなど）が骨髄の注入側では強く高められる。実際には、この影響は一層より大きい。実際、この定量では、注入の反対側でのＣＦＵ−Ｆ含有量およびＣＦＵ−Ｃ含有量の減少によって例示されるような、また、図３および図７において実証されるような血液への細胞の動員が計数されない。動員のこの最初の証拠は、健康な患者の場合でさえ、治療目的のための可能性を示す。そのうえ、他の「娘細胞」、すなわち、図１において明らかにされるようなＥＰＣが血液において動員され、また、骨髄に驚くほど（より）多く存在したままであり（図２を参照のこと）、このことは、刺激（増加）、それに続く、分化および動員の複雑な速度論を反映している。
【０１４６】
その後、本発明者は、コロニーを形成する処置された細胞の能力を測定した。図３に示されるように、細胞が血液および骨髄から得られる。上記で示されるように、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆを注入した３日後、ＥＰＣコロニーの数が２倍を超えて増大する。この影響が７日目までずっと持続する。しかしながら、骨髄では、ＥＰＣコロニーの数が７日目において低下した。これはそれらの動員を反映する。
【０１４７】
ＭＳＣを７日間のＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の後で骨髄から採取し、その後、ペトリ皿で成長させた（図５）。はるかにより多くのＣＦＵ−Ｆが、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の後で骨髄から得られた。
【０１４８】
本発明者は、７日間の処置の前または後で骨髄から採取された単核細胞（ＭＮＣ）を精製し、コロニーを形成するその能力が３倍増大していることを測定した（図６）。
【０１４９】
ＭＳＣを７日間のＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の前または後で骨髄から採取し、その後、成長させた（図７）。処置部位から採取された細胞は、より多く存在することのほかに、インビトロで成長する増大した能力を獲得していた。
【０１５０】
その後、本発明者は血液中の細胞（図８）および骨髄中の細胞（図９）の特徴づけを行った。血液において、ＣＤ３４細胞およびＣＤ１３３細胞が処置によって増大した。このことは、幹細胞の成長および動員に対する処置の正の影響を開示する。一方、それらの相対的存在量が骨髄において一定のままであった。このことは、幹細胞含有量を一定に保つ骨髄の能力を反映する。本発明者はさらに、処置後、ＣＤ３１細胞が骨髄により多く存在することを認めた。この速度論は、細胞タイプおよび階層に関連づけられる：「母」のＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋についてはより迅速であり（それらのレベルが７日目でベースラインにほぼ戻った）、「娘」のＥＰＣおよびＣＦＵ−Ｆ幹細胞についてはより遅く（それらのレベルが注入側では７日目においてより大きい）、そして、分化したＷＢＣについては一層より遅いかもしれない。
【０１５１】
異種移植片、同種移植片または自己移植片から得られる無機質型マトリックスもまた、骨再生組織を改善するためのゲル組成物において使用することができる。
【０１５２】
特定の組織への幹細胞の分化を得るために、特定の組織の再生を得るためのいくつかの特異的な増殖因子を使用することが可能である（皮膚組織を得るための上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨または軟骨の形成を誘導するためのＢＭＰファミリーの化合物、造血系分化を誘導するためのＧ−ＣＳＦまたはＡＭＤ３００、その他）。
【０１５３】
ゲル組成物はまた、（骨芽細胞系細胞を得るために、）連続する増殖、分化、成熟化、および、場合により、鉱物化を伴う事象の複雑なカスケードを介して、幹細胞を拡大し、要求される組織細胞に分化させるために、他の要素を含むことができる。このゲル組成物はまた、（異栄養性無機質沈着物形成を誘導するための）β−グリセロホスファート、いくつかのより特異的なヒト増殖因子、または、カルシウム含有化合物（例えば、ＣａＣｌ２、β−リン酸三カルシウム、骨粒子（変性骨由来または非変性骨由来）、アパタイト、アスピジン（ａｓｐｉｄｉｎｅ）、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、グルコノ乳酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔａｔｅ）、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、カルシウムグルトニアート（ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｔｏｎｉａｔｅ）およびそれらの混合物）を含む場合があり、そのような化合物の例が欧州特許ＥＰ１２３９８９４に記載される。
【０１５４】
本発明者は幹細胞を上記のように刺激し、その後、コロニーを形成するその増大した能力、アルカリホスファターゼを発現するその増大した能力、カルシウムを利用および固定するその増大した能力を測定した（図１０〜図１２）。
【０１５５】
その後、本発明者は、得られた細胞を使用して、自己インプラントを作製し、完全な骨を再構成した。
【０１５６】
図１３に示されるように、本発明者はまた、骨髄へのＰＲＰおよび可溶性ｈＴｆの注入によって幹細胞を活性化し、その後、幹細胞を活性化後３日目に得た後で、生組織を再構成することができた。３日間の活性化の後、内皮前駆体細胞の７倍の増大が血液において認められ、一方、骨髄では２倍の増大であった。このことは、処置後３日での幹細胞の増加および動員の両方を反映する。これらの幹細胞を、患者の損傷した顎に設置されるために適合化されたチタンの網状物に沈着させた。これらの活性化幹細胞は、９９Ｔｃシンチグラフィーによって示されるように、成長、分化、および、生組織の再構成（新しい血管の産生を含む）を行うことができた。
【０１５７】
その後、本発明者は、本発明に従って処置された１３名の患者において、サイトカインの血中濃度における何らかの変化について探索した。かなりの増大が、ＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を前記患者の腸骨稜の骨髄に注入した後の３日および７日で、ＦＧＦ−２（約４倍）、ＶＥＧＦ（約２倍）、Ｒａｎｔｅｓ（約２倍）およびＢＤＮＦ（＋５０パーセント）において認められた。
【０１５８】
その後、本発明者は、神経変性（神経学的）疾患に罹患している患者において、疾患を遅らせるか、または、それどころか、疾患を停止させるつもりで、ＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）の注入を試験した。本発明者は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）罹患患者を選択し、腸骨稜由来の骨髄におけるＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を左側に注入した。その後、４日後に、本発明者は、同じ注入を右側において再び行い、このプロトコルを１ヶ月間繰り返し、そして、患者を、そのような注入を行うことなく１ヶ月間回復させた。その後、この注入プロトコルを繰り返した。疾患の悪化における軽減が得られ、また、ある程度の改善さえ得られた。
【０１５９】
その後、本発明者はさらに、患者の骨髄の幹細胞を、ＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を注入した３日後に回収し、その後、（ＭＳＣ富化）幹細胞を、富化された幹細胞（ＭＳＣ）を患者の心臓に再注入する前に５分間の２０００ｇ×分での遠心分離によって活性化骨髄から精製することによって心臓病学（心筋梗塞罹患患者）において本発明を評価した。全体的には、本発明者は、本発明の教示に従って処置された患者における改善を認めた。
【０１６０】
本発明者はさらに、適合し得る提供者の腸骨稜に由来する骨髄においてＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を注入することによって幹細胞の増殖および活性化を刺激した。その後、本発明者は、骨髄が放射線照射されている白血病罹患患者への再注入の前に、（活性化）骨髄サンプルをこの提供者から単離した。
【０１６１】
その後、本発明者は、感染性疾患（ＡＩＤＳ）において本発明を評価した。
【０１６２】
しかしながら、本発明の方法および／または医薬用製造物によって引き起こされる幹細胞および／またはサイトカインの増大を考えると、いくつかの他の疾患が当業者によって処置され得ることが明らかである（この場合、前記疾患は好ましくは、ガン、炎症、骨粗鬆症、肝臓傷害、自己免疫疾患および／または感染性疾患を含めて、心臓病学的疾患、神経学的疾患、変性疾患からなる群から選択される）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織産生（再生、再建、補強および／または若返り）の分野に関する。
【０００２】
より正確には、本発明は、特定の組織または細胞を再生するための、好ましくは、骨、脂肪、腱、筋肉、軟骨および骨髄間質のような間葉系組織、ならびに、血液学的な組織または細胞（ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板、リンパ球、血液学的幹細胞（ＨＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）など）を再生するための方法および手段（製造物およびデバイス）に関連する。
【０００３】
本発明はまた、損傷または疾患のある組織または細胞の再建、再生、若返りまたは補強を、本発明の方法によって得られる（再生された）組織または細胞を使用して哺乳動物対象において、好ましくはヒト患者において行うための方法および手段（製造物およびデバイス）に関連する。
【背景技術】
【０００４】
損傷または疾患のある組織、すなわち、骨を再建するための種々の技術が存在する。細胞媒介再生技術がそれらの１つである。
【０００５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＨＳＣは、「間充織」として知られている骨髄間質において見出され、また、脂肪組織においてもまた見出される幹細胞に対応する。
【０００６】
ＭＳＣおよびＨＳＣは、適切な数の細胞を得るためにエクスビボ培養で拡大することができる。しかしながら、大量の骨髄の採取および長時間の培養が、十分な量の幹細胞を得るために要求される。幹細胞のインビトロ培養はその増殖能力を変化させ、また、その分化能を低下させる。これらの細胞は分化および増殖についての多能性を示し、また、適切なサイトカインおよび増殖因子、ならびに、ＥＰＣを含む血液学的細胞を使用して様々なタイプの細胞（例えば、筋肉、血管系、ニューロン組織、肝臓、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、ケラチノブラストおよび線維芽細胞など）に分化させることができる。
【０００７】
これらのＭＳＣを細胞媒介再生技術において使用することがこれまで長い間提案されている。
【０００８】
さらには、老化は幹細胞の特性およびその分化能力を変化させることが知られている。
【０００９】
実際、骨再生方法では、ＭＳＣが患者から取り出され、適切な骨増殖因子を使用してインビトロで増殖させられ、骨芽細胞に分化させられる。このように、骨組織が生じさせられ、その後、再建方法において患者への埋め込みのためにインプラントとして使用される。心臓発作後、患者は、大量の骨髄サンプルを集めるために局所麻酔され、その後、骨髄サンプルは、全量または一部が、すなわち、細胞分取後に再注入される。ガン治療では、幹細胞を単離し、刺激し、そして、場合により、患者へのその再注入の前に、エクスビボでトランスフェクションすることができる。白血病を処置するための移植のための補助剤として、多量の異種ＭＳＣがドナーの骨髄と一緒に注入される。
【００１０】
組織再生および組織再建における血小板富化血漿（「ＰＲＰ」と略記される）の潜在的使用のための研究が既に開始されている。
【００１１】
ＰＲＰは間質幹細胞のインビトロ増殖を誘導する能力があることが立証されている（Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ Ｅ．他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４（２００３）、３０９５頁〜３１００頁）。
【００１２】
近年の科学的研究はまた、骨再建においてＭＳＣとともにグラフト材料として使用される血小板富化血漿（「ＰＲＰ」と略記される）の有益な効果に関する最初の結果を与えている（Ｋｉｔｏｈ Ｈ．他、Ｃｌｉｎ．Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓ．、第１５（５）巻（２００４）、５８９頁〜５９７頁；Ｙａｍａｄａ Ｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第６８Ａ（４）巻（２００４）、７４７頁〜７５５頁）。
【００１３】
それにもかかわらず、ＭＳＣ−ＨＳＣを使用する組織再生の現在の方法、および、ＨＳＣ細胞では、いくつかの欠点がもたらされる。具体的には、生じた骨組織に、適切な形状を与えることが、これらの方法および細胞に関して困難である。埋め込みに耐えるための十分な機械的強度を有する骨組織を得ることもまた困難である。その上、インビトロ培養では、骨組織を十分な量で得るために非常に時間がかかる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、（ヒト胚性でない）幹細胞（好ましくはＭＳＣおよびＥＰＣ、場合により、ＨＳＣを除いて）を得ること、および／または、（ヒト胚性でない）幹細胞（好ましくはＭＳＣおよびＥＰＣ、場合により、ＨＳＣを除いて）の増殖を誘導することのための、また、哺乳動物の組織または細胞の「産生」（再生、再建、補強および／または若返り）のための、先行技術の欠点を示さない改善された、また、代替となり得る方法および手段を提供する。
【００１５】
好ましくは、ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０からなる群から選択される１つ、２つまたは（好ましくは）３つの陽性マーカーを（その細胞表面に）発現し、かつ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは（好ましくは）５つのマーカーの（その細胞表面における）発現を有しないとして定義される。
【００１６】
代替として（または加えて）、ＭＳＣは、標準的な培養条件で維持されるとき、プラスチック接着性の細胞である。
【００１７】
代替として（または加えて）、ＭＳＣは、骨芽細胞、脂肪細胞および／または軟骨細胞にインビトロで分化することができる。
【００１８】
好ましくは、ＥＰＣは、ＣＤ１３３およびＣＤ３４の両方を（その細胞表面に）発現するとして定義され、好ましくは、ＣＤ３１および／またはＣＤ１４４をさらに発現し、しかし、場合により、ＣＤ４５を発現しない。
【００１９】
代替として（または加えて）、ＥＰＣは、コロニーをインビトロで形成するその能力によって定義され、この場合、好ましくは、コロニーは、より多くの細長い出芽細胞が周辺部に存在する丸い細胞の中央コアとして定義される。
【００２０】
代替として（または加えて）、ＥＰＣは、ＶＥＧＦの存在下でのマトリゲルアッセイにおいて置床されるときのその血管形成性によって定義される。
【００２１】
好ましくは、ＨＳＣは、ＣＤ３４マーカーおよびＣＤ４５マーカーを発現するとして定義される。
【００２２】
本発明は、哺乳動物対象（ヒト患者を含む）における起こり得る移植片対宿主拒絶および宿主対移植片拒絶を軽減または回避し、同様にまた、哺乳動物対象（ヒト患者を含む）における、損傷組織または疾患組織の、組織または細胞の再生、再建または補強の後での感染の欠点を軽減または回避する方法および手段を提案する。
【００２３】
本発明はさらに、高齢患者の場合には、あるいは、心臓発作または心臓障害に苦しむ人々の場合にはとりわけ有害である全身麻酔を何ら必要としないかもしれない、改善および簡略化された方法および手段を提案する。
【００２４】
好都合なことに、本発明の製造物、方法および手段は、組織または細胞を再生するために使用される。
【００２５】
具体的には、本発明は、（骨）再建のための満足できる構造的特徴および物理的特徴を有する新しい（骨）組織を得ることを可能にする方法および手段を提供する。これらの物理的特徴には、すなわち、形状、機械的強度および弾力性が含まれる。生物学的特徴には、すなわち、骨、皮膚、脂肪または筋肉のようないくつかの成熟組織における、増殖、委任および分化の高い可能性を有する未成熟な細胞の高い割合および濃度が含まれる。
【００２６】
本発明はまた、ＭＳＣと、場合により、ＥＰＣ（場合により、ＨＳＣを除いて）とを含む高濃度の未成熟な幹細胞を骨髄において誘導することによって、および／または、高濃度のＥＰＣ細胞を血液において誘導することによって幹細胞を動員する、心臓発作を処置するための方法および手段を提供する。
【００２７】
実際、手術手技後のようなすべての炎症性状態、または、炎症性疾患もまた、本発明の方法および手段から利益を受けることができる。これは、炎症は、当然のことながら、幹細胞を動員するからであり、また、幹細胞における増大は、当然のことながら、必要性がある分化した細胞に変換され得るからである。
【００２８】
本発明はまた、インビトロ培養時間を短くするか、または抑え、かつ、必要とされる集められた骨髄の量を少なくする簡便化された方法および手段を提供する。
【００２９】
本発明は、幹細胞（好ましくはＭＳＣ−ＥＰＣ、場合により、ＨＳＣを除いて）を得るための、また、場合により、（ａ）哺乳動物対象の組織または細胞の再生、再建、補強および／または若返りのための、好ましくは、（ａ）ヒト患者の組織または細胞の再生、再建、補強および／または若返りのための方法および手段に関連し、この場合、この方法は下記の工程を含む：
ａ）（液体）血液サンプルをこの哺乳動物対象から、好ましくはヒト患者から集める工程；
ｂ）自己ＰＲＰをこの血液の血漿サンプルから調製する工程、ただし、ＰＲＰの血小板割合の濃縮が好ましくは、この哺乳動物対象の全血の約１００％〜約１０００％の間で、好ましくはこのヒト患者の全血の約１００％〜約１０００％の間で含まれ、より好ましくは、この哺乳動物対象の全血の約２００％〜約５００％の間で、好ましくはこのヒト患者の全血の約２００％〜約５００％の間で含まれる；
ｃ）この自己ＰＲＰを、
・トロンビン（異種トロンビン、自己トロンビン、あるいは、組換え型のヒトトロンビンまたはウシトロンビン）、これには、（活性化型または非活性化型である）組換えトロンビン（ＦＩＩ）が含まれる；
・トロンビン、とりわけ、トロンボプラスチン（組織因子）、好ましくは組換えトロンボプラスチン（ｒＴＦ）、より好ましくはヒト組織因子（ｈＴＦ）、一層より好ましくは組換えヒト組織因子（ｒｈＴＦ）、より具体的には組換え可溶性ヒト組織因子（ｒｓｈＴＦ）を産生することができる化合物（凝固因子）、これは、場合により、リン脂質（ＰＬ）（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど）の添加と組み合わせられる；
・ＣａＣｌ２、
・（組換え）ヒト第ＶＩＩ因子またはヒト第ＶＩＩａ因子（例えば、化合物ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）など）、
・（組換え）ヒト第Ｘ（ａ）因子、
・（組換え）組織因子または（組換え）第ＶＩＩ因子または（組換え）第ＶＩＩａ因子、
・（組換え）組織因子および第Ｘａ因子、
・（組換え）組織因子／第ＶＩＩａ因子／第Ｘａ因子、
・（組換え）第ＶＩＩＩ因子、
・（組換え）第ＩＸ因子、あるいは
・上記化合物の組合せ
からなる群から選択される効果的な量の（活性な）哺乳動物化合物、好ましくは、（活性な）ヒト化合物により活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第１の流体（溶液）を得る工程；
ｄ）胚性でない（好ましくはＭＳＣ、ＥＰＣ）幹細胞が多い目標注入領域（好ましくは胸骨または腸骨稜に由来する骨髄）または脂肪組織を同じ哺乳動物対象において、好ましくは同じヒト患者において選択する工程；
ｅ）この第１の流体（溶液）を哺乳動物対象のこの目標注入領域に、好ましくはヒト患者のこの目標注入領域に注入して、その結果、（好ましくはＭＳＣ−ＥＰＣ）幹細胞のインビボ増殖をこの哺乳動物対象において、好ましくはこのヒト患者において局所的に誘導する工程；
ｆ）場合により、十分なインキュベーション時間の後で、同じ哺乳動物対象から、好ましくは同じヒト患者から、この目標注入領域からの、（ＭＳＣ、ＥＰＣ）細胞が多い骨髄（液）サンプル、または、この哺乳動物からの血液サンプル、または、この哺乳動物からの脂肪サンプルのどれかを集め、幹細胞をこのサンプルから回収する工程；
場合により、工程ａ）〜工程ｅ）、または、工程ａ）〜工程ｆ）を、規定された時間間隔で数回（好ましくは少なくとも２回、３回または４回）（好ましくは毎週）繰り返す工程；
ｇ）場合により、第２の血液サンプルを集める工程；
ｈ）場合により、第２の自己血小板富化血漿をこの第２の血液サンプルから調製する工程；
ｉ）場合により、この自己血小板富化血漿を、工程ｃ）において添加される上記の活性化合物の効果的な量の添加によって活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第２の流体（溶液）をこの第２の血液サンプルから得る工程；
ｊ）場合により、この第２の流体（溶液）と、幹細胞が多い、以前に集められた骨髄サンプルまたは血液サンプルまたは脂肪サンプルとを混合して、その結果、活性化された濃縮自己血小板富化血漿および幹細胞を含む組成物を得る工程；
ｋ）場合により、分化補助剤をこれらの幹細胞に加えて、好ましくは（活性化された濃縮自己ＰＲＰおよび幹細胞を含む）組成物に加えて、その結果、（場合により、ＨＳＣを除いて、ＭＳＣ、ＥＰＣ）幹細胞の「事前に規定された」分化した組織細胞への分化を誘導し、場合により、所望される組織の再生を得る工程、ただし、これらの補助剤は、工程ｃ）において使用される上記の活性化合物、ならびに／あるいは、細胞固定のための少なくとも１つのマトリックス、および、特定の細胞（例えば、骨芽細胞系細胞（骨細胞、骨芽細胞など）、筋肉細胞、内皮細胞、ニューロン細胞、肝細胞または線維芽細胞およびケラチノサイトなど）への幹細胞の分化を得る（誘導する）ための１つまたは複数の要素を含み、この場合、これらの要素は好ましくは、ビタミン（ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ビタミン））、コルチゾン（またはコルチゾン誘導体、例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾンなど）、および、場合により、β−グリセロホスファート（これらの要素は好ましくは、これらの要素の遅い放出を可能にする、ポリＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸および／またはポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、アルギン酸塩の足場（例えば、マイクロビーズなど）に存在する）、ならびに／あるいは、ＢＭＰ２（これはＭＥＤＴＲＯＮＩＣＳから得られるかもしれない）、または、上皮増殖因子、または、神経増殖因子、または、当業者によって知られている任意の他のサイトカイン、増殖因子もしくは分化因子からなる群から選択される；および
ｌ）場合により、活性化された濃縮自己血小板富化血漿およびＭＳＣを含む組成物に、適切なゲル化剤（このゲル化剤は好ましくは、工程ｃ）において添加される活性化合物の十分な量から得られる）を加えて、ゲルを得る工程；および
ｍ）場合により、そのようにして得られたゲルを、哺乳動物対象の目標再建部位（例えば、自己採取骨、同種移植片、異種移植片またはコラーゲンリーフなど）の内部／表面に、好ましくはヒト患者の目標再建部位（例えば、自己採取骨、同種移植片、異種移植片またはコラーゲンリーフなど）の内部／表面に場合により適用することによって、得られたゲルをインプラントとして使用して、その結果、組織再建がこの再建部位において生じ得るようにする工程。
これらの工程ａ）〜工程ｍ）を、十分な量の幹細胞を得るように、規定された時間間隔で数回（好ましくは少なくとも２回、３回または４回）（好ましくは毎週）繰り返すことができる。
【００３０】
本発明はさらに、下記の工程を含む、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るための方法に関連する：
・必要な場合には、骨髄幹細胞を、好ましくは本発明の方法によって、かつ／または、ＰＲＰおよび凝固因子の添加によって活性化する工程；
・活性化された骨髄のサンプルを得る工程；
・必要な場合には、このサンプルの幹細胞を富化する工程。
【００３１】
好ましくは、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、（インビトロで成長させられるときに）コロニー（ＣＦＵ−Ｆ）を形成するこれらのＭＳＣの能力が増大しており、より好ましくは少なくとも約３０％（少なくとも約５０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約１００％）増大している。
【００３２】
好都合なことに、または、加えて、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、少なくとも約１３個のコロニー（より好ましくは少なくとも約１５個のコロニー、なおさらにより好ましくは少なくとも約２０個のコロニー）（ＣＦＵ−Ｆ）が、この活性化骨髄に由来するサンプルから得られる１００００００個の単核細胞のインビトロ培養のときに形成される。
【００３３】
好都合なことに、または、加えて、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、ＭＳＣの（インビトロ）培養のときに形成されるコロニー（ＣＦＵ−Ｆ）の少なくとも約３５％（より好ましくは少なくとも約４０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約５０％）が骨原性マーカー（例えば、アルカリホスファターゼなど）を発現する。
【００３４】
好ましくは、活性化ＭＳＣが富化された（単核）細胞（ＭＳＣ）集団を得るためのこの方法では、幹細胞の富化が、骨髄サンプルの遠心分離（これにより、上清液、非ＭＳＣ細胞および破片が富化されたペレット、ならびに、（活性化）ＭＳＣ細胞が富化された中間画分がもたらされる）、および、この中間画分の回収によって行われる。
【００３５】
本発明の別の局面が、活性化ＭＳＣの（増大した）集団を含む骨髄サンプルに関連し、この場合、好ましくは、（インビトロで成長させられるときに）コロニー（ＣＦＵ−Ｆ）を形成するこの（活性化）ＭＳＣの能力が増大しており、より好ましくは少なくとも約３０％（より好ましくは少なくとも約５０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約１００％）増大している。
【００３６】
好都合なことに（または加えて）、活性化ＭＳＣの（増大した）集団を含むこの骨髄サンプルにおいて、少なくとも約１３個のコロニー（少なくとも約１５個のコロニー、なおさらにより好ましくは少なくとも約２０個のコロニー）（ＣＦＵ−Ｆ）が、このサンプルから得られる１００００００個の単核細胞のインビトロ培養（好ましくは、この活性化骨髄から得られる１００００００個の単核細胞のインビトロ培養）のときに形成される。
【００３７】
好都合なことに（または加えて）、活性化ＭＳＣ集団が富化されたこの骨髄サンプルにおいて、ＭＳＣの培養によって形成されるコロニー（ＣＦＵ−Ｆ）の少なくとも約３５％（より好ましくは少なくとも約４０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約５０％）が骨原性マーカー（例えば、アルカリホスファターゼなど）を発現する。
【００３８】
場合により、活性化ＭＳＣが富化されたＭＳＣ集団を得るためのこの方法において、および／または、活性化ＭＳＣが富化されたこの骨髄サンプルにおいて、ＥＰＣの（相対的）含有量が増大せず、かつ／または、ＨＳＣの含有量が低下する。
【００３９】
本発明の方法によって得られるＭＳＣ細胞は好都合なことに、哺乳動物対象に対して、好ましくはヒト患者に対して、好ましくは再生させるための部位の近く（またはその部位）に注入され、または、代替として、輸血によって注入される。
【００４０】
本発明による方法は、損傷組織もしくは疾患組織の組織を再生するために、または、毒性化合物の影響を特徴づけるためのスクリーニング細胞として使用される特定の幹細胞を回収するために、あるいは、自己または異種であろうとも、将来の使用のために（バンクにおいて）保管するために使用することができる。
【００４１】
本発明によれば、用語「組織再生」は、新しい組織を幹細胞から再生することを示し、用語「再建」または用語「補強」は、この得られた再生組織を、組織修復または組織成長刺激が必要とされる哺乳動物対象に、好ましくは、組織修復または組織成長刺激が必要とされるヒト患者に埋め込み、一体化させることを示す。組織修復または刺激が、患者の組織に影響を及ぼすか、または、患者の全体的な全身的健康状態に影響を及ぼす損傷、疾患または衰弱（加齢状態）のために要求されるかもしれない。組織再生が、ガン、心筋症、先天性心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、心内膜炎、心筋梗塞、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中、脳血管障害、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病、エリテマトーデス、骨再建、骨萎縮、骨粗鬆症および骨補強、ならびに、場合により、アテローム性動脈硬化および心筋炎の場合には特に必要とされる。
【００４２】
したがって、用語「再建部位」は、修復目的または補強目的のための組織再建が要求される哺乳動物体内組織の特定の部位を示す。
【００４３】
本発明によれば、「血小板富化血漿（ＰＲＰ）」は、血小板の濃度が、処置された哺乳動物対象（ヒト患者）のベースライン静脈カウント数に対して少なくとも約１００％の割合で増大しており、好ましくは約２００％〜１０００％の間の割合で増大しており、かつ、（１マイクロリットル（μＬ）あたり）少なくとも６０００００個の血小板濃度、または、１μＬあたり少なくとも８０００００個の血小板濃度、または、１μＬあたり少なくとも１００００００個の血小板の血小板濃度に達し、好ましくは、１μＬあたり約８０００００個（または約１５０００００個の血小板）〜１μＬあたり約６００００００個（または約８００００００個の血小板）の間の血小板濃度に達し、より好ましくは、１μＬあたり約２００００００個の血小板〜１μＬあたり約５００００００個の血小板の間の血小板濃度に達する流体（溶液）を意味する。ＰＲＰは、遠心分離デバイスを用いて、例えば、米国特許第６７１９９０１号、国際公開ＷＯ０２／０８０９９１、米国特許第６８５５１１９号、国際公開ＷＯ０３／１０６０４０、国際公開ＷＯ００／６１２５６および国際公開ＷＯ２００４／０２４１９８に記載される遠心分離デバイスなどを用いて、都合よく得られる。
【００４４】
Ｇｒａｚｉａｎｉ Ｆ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｒａｌ ｉｍｐｌａｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１７巻、第２号、２１２頁〜２１９頁（２００６）は、細胞増殖に対する種々のＰＲＰ濃度の影響を調べている。最大の効果が２．５倍の濃度で達成され、より高濃度では、細胞増殖における低下がもたらされたようである。細胞増殖に対するＰＲＰの最も注目すべき影響が約７２時間で特徴づけられた。このときの血小板濃度は、得ることができた最大濃度のおよそ半分であった。しかしながら、一部の細胞増殖については、ＰＲＰのより高い濃度が好まれ得るかもしれない。
【００４５】
トロンビンは、好都合には、自己トロンビン、異種トロンビンまたは組換えトロンビンが可能であり、好ましくは組換えトロンビンが可能であり、例えば、ＺＹＭＯＧＥＮＥＴＩＣＳ社（ｗｗｗ．ｚｇｉ．ｃｏｍ）によって製造される組換えトロンビンなどが可能である。
【００４６】
好ましくは、約１０単位〜約２００単位の（組換え型、ウシ型または自己）トロンビンが、より好ましくは、約１０単位〜約７５単位の（組換え）トロンビンが、６ｍｌ〜２０ｍｌの抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００４７】
したがって、ＰＲＰの非常に遅い凝固を誘導するために、（組換え型、ウシ型または自己）トロンビンが、約０．５単位／ｍｌ〜約３３単位／ｍｌで、好ましくは約０．５単位／ｍｌ〜約３．７５単位／ｍｌで、より好ましくは約１．５単位／ｍｌ〜約３．７５単位／ｍｌで抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００４８】
代替では、ＰＲＰの遅い凝固を誘導するために、（組換え型、ウシ型または自己）トロンビンが、約０．５単位／ｍｌ〜約１０単位／ｍｌで、好ましくは約１．５単位／ｍｌ〜約１０単位／ｍｌで抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００４９】
トロンビン単位は、１ｍｌのシュウ酸塩添加血漿を３７℃において３０秒で凝固する物質である。
【００５０】
哺乳動物の血液凝固に関与する他の凝固因子（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子（Ｎｏｖｏｎｏｒｄｉｓｋから得られるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子など）もまた使用することができ、あるいは、血液凝固に関与する（またはトロンビンを生じさせることができる）どのような化合物もまた使用することができる。しかしながら、トロンボプラスチン（ヒト組織因子：ｈＴＦまたはｈＴｆ）が好ましい。これは、トロンボプラスチンは安全であり、かつ、可溶性形態で提供することができ、また、トロンビンに反して、凝固カスケードが制御可能であり、かつ、血液凝固があまり急速に得られないからである。組成物に存在するかもしれない関連脂質および他の分子の例が欧州特許ＥＰ１２３９８９４に記載される。
【００５１】
好ましくは、ＰＲＰおよび凝固因子（凝固因子はより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ）である）が、患者への注入の前（直前）に混合される。
【００５２】
好都合には、ＰＲＰおよび凝固因子（凝固因子はより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ）である）が、（好ましくは、約２０℃〜約３７℃の間に含まれる温度で）混合され、これらは、（約２０℃〜約３７℃の間に含まれる温度で）好ましくは数分間、可溶性のままである。
【００５３】
より好ましくは、ＰＲＰは、凝固因子（凝固因子はより好ましくはｓｈＴｆである）と混合されたとき、非常にゆっくり凝固し、好ましくは、混合されたときには、１分間を越えて、より好ましくは、２分間を越えて、３分間を越えて、４分間を越えて、または、５分間を越えてさえ、液体（可溶性）のままである（または、液体（可溶性）のままであることができる）（この場合、温度は約２０℃〜約３７℃の間に含まれる）。
【００５４】
一層より好ましくは、ＰＲＰは、凝固因子（凝固因子はより好ましくはｓｈＴｆである）と混合されたとき、非常にゆっくり凝固し、好ましくは、哺乳動物対象（ヒト患者）に注入されたとき、３０秒間を越えて、より好ましくは、１分間を越えて、２分間を越えて、３分間を越えて、４分間を越えて、または、５分間を越えてさえ、液体（可溶性）のままである（または、液体（可溶性）のままであることができる）。
【００５５】
好ましくは、約６００単位〜約１２００００単位の（活性化）第ＶＩＩａ因子（約１２μｇ〜約２４００μｇ）が、より好ましくは、約６００単位〜約６００００単位の（活性化）第ＶＩＩａ因子（約１２μｇ〜約１２００μｇ）が、なおさらにより好ましくは、約６００単位〜約６０００単位の（活性化）第ＶＩＩａ因子（約１２μｇ〜約１２０μｇ）が、６ｍｌ〜２０ｍｌの抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００５６】
したがって、（ＰＲＰの遅い凝固を誘導するために）、（活性化）第ＶＩＩａ因子が、約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約２００００単位／ｍｌ（４００μｇ／ｍｌ）で、好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約１００００単位／ｍｌ（２００μｇ／ｍｌ）で、より好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約１０００単位／ｍｌ（２０μｇ／ｍｌ）で抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００５７】
代替では、（ＰＲＰの非常に遅い凝固を誘導するために）、（活性化）第ＶＩＩａ因子が、約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約６０００単位／ｍｌ（１２０μｇ／ｍｌ）で、好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約３０００単位／ｍｌ（６０μｇ／ｍｌ）で、より好ましくは約３０単位／ｍｌ（０．６μｇ／ｍｌ）〜約３００単位／ｍｌ（６μｇ／ｍｌ）で、なおさらにより好ましくは約１００単位／ｍｌ（２μｇ／ｍｌ）〜約３００単位／ｍｌ（６μｇ／ｍｌ）で抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００５８】
種々のリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよび／またはホスファチジルセリン）の添加を伴うヒト組織因子（ｈＴＦ）が、ヒトトロンボプラスチンによって意味される。このｈＴｆは、（完全な）ｈＴｆの２６３個のアミノ酸から、２４３個のアミノ酸（組織因子の細胞質外テールおよび膜部分）のポリペプチドまたは単に（短縮された）（可溶性）組織因子である短縮型ｈＴｆから、２１９個または２０６個のアミノ酸（細胞質外テールのみ）のポリペプチドから、あるいは、それらの任意の変化体から作製することができる。
【００５９】
好ましくは、１００μｇ〜３０００μｇの可溶性組織因子が、より好ましくは、約３００μｇ〜約９００μｇの可溶性組織因子が、約６ｍｌ〜約２０ｍｌの抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００６０】
したがって、（非常に遅い凝固を誘導するために）、約２μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、好ましくは、約１５μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、なおさらにより好ましくは、約１５μｇ／ｍｌ〜約４５μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００６１】
代替では、（ＰＲＰの遅い凝固を誘導するために）、約１５μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、好ましくは、約５０μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌの可溶性組織因子が、抗凝固処理（不活性化）ＰＲＰに加えられる。
【００６２】
（非修飾）ｈＴｆの変化体は、非修飾分子の機能的活性（ＰＲＰの活性化）に影響を及ぼさない、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加または置換を含むことができる。
【００６３】
ＰＲＰの活性化はまた、凝固カスケードに関与する他の分子によって得ることができ、好ましくは、上記方法の工程ｃ）において使用される活性化合物の１つによって得ることができる。
【００６４】
これらの様々な活性化合物は、とりわけ、凝固因子は、１つまたは複数の混入物（とりわけ、細菌またはウイルス）の伝播を避けるために、１つまたは複数の不活性化工程に付すことができる。この不活性化工程は、溶媒／界面活性剤、乾熱、ＵＶＣ不活性化などを加えることに基づくことができる。
【００６５】
本発明の方法では、とりわけ、上記方法の工程ｋ）において、マイクロビーズが、媒体層がアスコルビン酸を含有し、かつ、内層被覆がβ−グリセロホスファートを含む薬物送達システムとして使用される。
【００６６】
これらのマイクロビーズの他の改変を、選択された部位へのその補充、および、所望される細胞（例えば、筋肉細胞、血管細胞、ニューロン細胞、肝細胞、骨芽細胞、線維芽細胞など）へのその委任、分化のためには特に、幹細胞の分化を改善するための本発明による方法において使用することができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明による方法では、工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）が行われず、工程ｄ）および工程ｅ）が下記のように変更される：
ｄ）幹細胞が多い目標注入領域（好ましくは、哺乳動物の胸骨または腸骨稜）を哺乳動物対象において、好ましくはヒト患者の骨髄において選択すること、
ｅ）十分な量の幹細胞活性化流体または工程ｃ）で使用される活性化合物を哺乳動物対象（ヒト患者）のこの目標注入領域に注入して、その結果、自己ＰＲＰを加えることなく、（間葉系）幹細胞のインビボ増殖を直接、哺乳動物対象（好ましくはヒト患者）において局所的に誘導すること。
【００６８】
本方法のこの好ましい実施形態の他の工程、すなわち、工程ｆ）〜工程ｍ）は、上記で記載される工程に対応し得る。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、工程ｆ）〜工程ｍ）が行われず、工程ａ）〜工程ｅ）が、哺乳動物対象（ヒト患者）の身体において、とりわけ、幹細胞の濃度が低い高齢者（５０歳を超える高齢者、好ましくは、約６０歳の高齢者または６５歳を超える高齢者）において、幹細胞の増殖を得るために使用される。幹細胞の刺激によるこの若返り工程が、組織または細胞の再生、再建、補強または若返りを改善するために、とりわけ、このヒト患者身体における損傷または疾患のある組織または細胞の再生、再建、補強または若返りを改善するために、好ましくは（ヒト）患者の身体に対する可能な外科手術の前に行われる。
【００７０】
必要ならば、前記刺激を、工程ａ）〜工程ｃ）を使用することなく、前記実施形態において記載されるように得ることができ、また、ＰＲＰの添加を伴うことなく、上記で提案されるように工程ｄ）および工程ｅ）を選択することによって得ることができる。
【００７１】
本発明による方法では、十分なインキュベーション時間の後、当業者は、幹細胞が多い骨髄（液）サンプルを、好ましくは目標注入領域から集めることができ、または、（ＥＰＣ、ＭＳＣ）幹細胞が同様に多い血液サンプルを集めることができる。
【００７２】
この回収工程（ｆ）は、幹細胞のインビボ増殖がまた、哺乳動物対象の血液へのこれらの幹細胞の増殖を誘導しているという事実のために、血液サンプルに対して行うことができる。したがって、当業者によって広く知られている方法によって、例えば、古典的なプラスマフェレーシス透析法およびプラスマフェレーシス透析手段などによって、血液サンプルから直接、幹細胞を回収することが可能である。
【００７３】
本発明は、（非凝固および／または可溶性）ＰＲＰおよび（十分な量の）凝固因子、または、それらを含む（医薬用）組成物を、医薬品として、好ましくはＰＲＰおよび凝固因子の非凝固および／または可溶性の混合物の形態で提供する。
【００７４】
好ましくは、ＰＲＰおよび凝固因子（凝固因子は好ましくはｓｈＴｆである）が、患者への注入の前（直前）に混合される。
【００７５】
より好ましくは、ＰＲＰは、凝固因子（凝固因子は好ましくはｓｈＴｆである）と混合されたとき、非常にゆっくり凝固し、好ましくは、１分間を越えて、より好ましくは、２分間を越えて、３分間を越えて、４分間を越えて、または、５分間を越えてさえ、液体（非凝固および／または可溶性）のままである（または、液体（非凝固および／または可溶性）のままであることができる）。
【００７６】
凝固因子の十分な量によって、（不活性化）ＰＲＰの（非常に）遅い凝固を可能にする量が意味される。
【００７７】
より好ましくは、本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（血液凝固に関与する化合物）（の非凝固および／または可溶性の混合物）（ただし、凝固因子は、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（ＴＦ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される）、または、それらを含む（医薬用）組成物を医薬品として提供する。
【００７８】
なおさらにより好ましくは、本発明は、ＰＲＰおよびこの凝固因子（血液凝固に関与する化合物）（の非凝固および／または可溶性の混合物）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、哺乳動物対象の幹細胞プール、好ましくはヒト患者の幹細胞プール、好ましくはＥＰＣおよび／またはＭＳＣを、より好ましくはＨＳＣプールを変化させることなく、または、止血を変化させることなく富化するための医薬品としての使用のために提供する。
【００７９】
代替では、本発明は、凝固因子、好ましくは、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴＦ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、哺乳動物対象の幹細胞プール、好ましくはヒト患者の幹細胞プール、好ましくはＥＰＣおよび／またはＭＳＣを、より好ましくはＨＳＣプールを変化させることなく、または、止血を変化させることなく富化するための医薬品としての使用のために提供する。
【００８０】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、医薬品としての使用のために、とりわけ、心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患、好ましくは、（変性）心筋症、（先天性）心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎および心筋梗塞からなる群から選択される心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患の処置および／または防止のための医薬品としてのそれらの使用のために提供する。
【００８１】
代替では、本発明は、凝固因子、好ましくは、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患、好ましくは、（変性）心筋症、（先天性）心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎および心筋梗塞からなる群から選択される心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８２】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、神経学的疾患、好ましくは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中および脳血管障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８３】
代替では、本発明は、凝固因子、好ましくは、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、（哺乳動物対象の）神経学的疾患、好ましくは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中および脳血管障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される（哺乳動物対象の）神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８４】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）を、変性（自己免疫）疾患、好ましくは、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病およびエリテマトーデスからなる群から選択される変性（自己免疫）疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８５】
代替では、本発明は、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、変性（自己免疫）疾患、好ましくは、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病およびエリテマトーデスからなる群から選択される変性（自己免疫）疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８６】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、ガン（白血病）および／または感染性疾患（ＡＩＤＳ）の処置のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８７】
代替では、本発明は、（好ましくは可溶性）トロンボプラスチン（または組織因子（Ｔｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物（より好ましくは可溶性組織因子（ｓＴｆ）、なおさらにより好ましくは可溶性ヒト組織因子（ｓｈＴｆ））を、ガン（白血病）の処置のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８８】
本発明は、ＰＲＰおよび凝固因子（の非凝固および／または可溶性の混合物）（凝固因子は、好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆ）、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子からなる群から選択され、より好ましくは可溶性ｈＴｆである）、または、それらを含む（医薬用）組成物を、骨変性関連疾患、好ましくは、骨萎縮、骨粗鬆症からなる群から選択される骨変性関連疾患の処置および／または防止のための医薬品としての使用のために、また、場合により、骨再建または骨補強のための医薬品としての使用のために提供する。
【００８９】
代替では、本発明のＰＲＰおよび凝固因子は、哺乳動物対象の腸骨稜、胸骨の中、および／または、脂肪組織に、好ましくはヒト患者の腸骨稜、胸骨の中、および／または、脂肪組織に、より好ましくは、前記ヒト患者の腸骨稜の骨髄に、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態で）同時に（または別々に）注入される。
【００９０】
好都合には、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態での）約６ｍｌ〜約２０ｍｌのＰＲＰにおける約２μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの（可溶性）ｈＴｆが、好ましくは対象または患者の腸骨稜、胸骨および／または脂肪組織に注入される本発明の医薬品において使用される。
【００９１】
代替では、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態での）約６ｍｌ〜約２０ｍｌのＰＲＰにおける約５単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌの第Ｘａ因子が、好ましくは対象または患者の腸骨稜または胸骨および／または脂肪組織に注入される本発明の医薬品において使用される。
【００９２】
代替では、（非凝固および／または可溶性の混合物の形態での）約６ｍｌ〜約２０ｍｌのＰＲＰにおける約３０単位／ｍｌ〜約２００００単位／ｍｌの第ＶＩＩａ因子が、好ましくは対象または患者の腸骨稜または胸骨および／または脂肪組織に注入される本発明の医薬品において使用される。
【００９３】
本発明の別の局面が、場合により、適切な医薬用のキャリアまたは希釈剤と、効果的な量のＰＲＰと、下記からなる群から選択される、効果的な量の凝固因子とを含む（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物であって、心臓血管疾患、神経学的疾患、自己免疫疾患、炎症、肝臓傷害および／または骨粗鬆症からなる群から選択される疾患の処置および／または防止のための（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物である：
・トロンボプラスチン（組織因子）、好ましくは組換えトロンボプラスチン（ｒＴｆ）、好ましくはヒト組織因子（ｈＴｆ）、より好ましくは組換えヒト組織因子（ｒｈＴｆ）、より好ましくは組換え可溶性ヒト組織因子（ｒｓｈＴｆ）、これらは、より好ましくは、リン脂質（ＰＬ）、より具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンの添加を伴う；または
・第ＶＩＩ（ａ）因子、
・第Ｘ（ａ）因子、
・組織因子−第ＶＩＩ（ａ）因子、
・組織因子−第ＶＩＩ（ａ）因子−第Ｘ（ａ）因子、
・第ＶＩＩＩ（ａ）因子、
・第ＩＸ（ａ）因子、あるいは、上記化合物の組合せ（ただし、これらの因子は活性化型または非活性化型である）。
【００９４】
好ましくは、本発明による（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物は心臓病学において使用され、ただし、この場合、心臓血管（心臓関連または心臓性）疾患が、好ましくは、アテローム性動脈硬化、心筋症、先天性心臓疾患、心筋炎、冠状動脈疾患、心臓血管障害、拡張期機能不全、心内膜炎、虚血および心筋梗塞からなる群から選択される。
【００９５】
好ましくは、本発明による（非凝固および／または可溶性の）医薬組成物は神経学において使用され、ただし、この場合、神経学的疾患が、好ましくは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中、脳血管障害、再生不良性貧血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または多発性硬化症からなる群から選択される。
【００９６】
本発明の別の局面が、幹細胞のインビトロ増殖のための、（非凝固（可溶性））ＰＲＰおよび凝固因子（好ましくはｈＴｆ）の（混合物の）使用である。
【００９７】
最後に、本発明の１つの局面が、本発明による方法の種々の実施形態を行うための様々な要素および手段を含む、構成要素のキットに関連し、とりわけ、下記のものを含むキットに関連する：
・自己ＰＲＰを集めるための遠心分離デバイス、および、場合により、自己トロンビンまたは異種トロンビンを哺乳動物の血漿から得るための手段；
・１つまたは複数の哺乳動物活性化合物（凝固因子）、好ましくは、１つまたは複数のヒト活性化合物（凝固因子）、あるいは、上記方法の工程ｃ）において使用される前記１つまたは複数の化合物を含む１つまたは複数の流体（溶液）（ただし、これらは１つまたは複数のバイアルに存在するかもしれない）；
・場合により、血液サンプルおよび／または骨髄サンプルおよび／または脂肪サンプルを哺乳動物対象から集めるための手段；および
・場合により、この自己ＰＲＰおよび／またはこの活性化合物を、ＭＳＣが多い目標注入領域において哺乳動物対象に再注入するための手段（シリンジ、ニードル、管類など）。
【００９８】
好ましくは、これらの手段は、ＭＳＣ活性化化合物（凝固因子）またはＭＳＣ活性化化合物（凝固因子）を含む流体と一緒での（自己）ＰＲＰの注入のために十分であり、これらの手段はまた、幹細胞が多いこの目標注入領域から、これらの幹細胞を含む骨髄液サンプルを集めるためにも十分である。
【００９９】
好都合なことに、これらの手段はまた、遠心分離デバイスへの接続を得るために、また、得られた自己ＰＲＰ（および、場合により、自己トロンビン）を集めるために、また、集められた血小板富化血漿液（および、場合により、自己トロンビン）を、（間葉系）幹細胞が多い目標部位（胸骨、腸骨稜または脂肪組織）において、同じ患者に（同時に）注入するために十分である。これらの手段はまた、この目標注入領域から、同じ哺乳動物に由来する骨髄液サンプルを集めるために使用され（ただし、この場合、この骨髄液サンプルは、インビトロ増殖の後で幹細胞が多くなっている）、また、場合により、これらの幹細胞を、好ましくは（場合により、本発明のキットの遠心分離デバイスによる）遠心分離によって、または、米国特許出願公開第２００７／０２７６３５２号に記載される手段によってそれらの混入物から分離するために使用される。
【０１００】
これらの手段はまた、（間葉系）幹細胞が多い血液サンプルを集めるための好適な要素、および、これらの幹細胞を当業者によって広く知られている手段によって血液サンプルから分離するための好適な要素、ならびに、場合により、これらの幹細胞を、好ましくは（場合により、本発明のキットの遠心分離デバイスによる）遠心分離によってそれらの混入物から分離するための好適な要素を含むことができる。
【０１０１】
好ましくは、これらの手段は、注入シリンジおよび採取用シリンジ、あるいは、骨髄もしくは血液への流体の注入、および／または、骨髄もしくは血液からの流体の採取のための専用デバイス、好ましくは、上記で記載される本発明によるデバイス、好都合には遠心分離デバイスに連結される上記で記載される本発明によるデバイス、好ましくは、国際公開ＷＯ０３／１０６０４０、米国特許第６８５５１１９号、国際公開ＷＯ０２／０８０９９１および米国特許第６７１９９０１号の各文書に記載されるような遠心分離デバイスを含む。
【０１０２】
本発明による、構成要素のキットにおいて、幹細胞活性化化合物は好都合には、急速な凝固を避けるために、ＰＲＰを含む注入シリンジとは別にされるバイアルまたはシリンジに、あるいは、骨髄への流体の注入および／または骨髄からの流体の採取のための専用デバイスに、好ましくは、上記で記載される本発明によるデバイスに存在する。幹細胞が多い目標注入領域におけるＰＲＰおよび活性化化合物（凝固因子）の同時注入を可能にする二重注入シリンジ（すなわち、ｔｈｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｈａｒｖｅｓｔ（登録商標）ＵＳＡによって販売されるＳｍａｒｊｅｔ（商標）液体・噴霧送達システム、ＰＲＰ・トロンビン製剤ＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）（Ｈａｒｖｅｓｔ（登録商標）ＵＳＡ）の作製のために使用される他のシステム、自己血小板分離装置Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）血小板濃縮システム（Ｄｅｐｕｙ）、Ａｃｒｏｍｅｄ（登録商標）デバイス（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（登録商標））、Ａｎｇｅｌ（登録商標）（ＳＯＲＩＮ−ＤＩＤＥＣＯ）、血液銀行において使用される３ｉ血小板濃縮デバイスまたは他のデバイス）を使用することもまた可能である。
【０１０３】
本発明の、構成要素のキットはまた、緩衝剤および分化化合物、または、これらの化合物を含む流体などを含めて、注入のための種々の活性化合物または流体を有する異なるバイアルを含むことができる。
【０１０４】
本発明による注入シリンジまたはデバイスは哺乳動物対象の胸骨または腸骨稜における注入のために十分であり、好ましくはヒト患者の胸骨または腸骨稜における注入のために十分である。
【０１０５】
本発明の、構成要素のキットはまた、他の要素、例えば、好適な注入を可能にするための管類、ポンプ、バルブなどを、哺乳動物の身体からの十分な採取のために、また、本発明によるプロセスの自動化を可能にするために含むことができる。これらの要素は好都合には、当業者によって広く知られている好適な自己輸血手順によって手術部位から採取し、生物学的化合物を患者に再注入するための自己輸血システムにおいて一体化される。
【０１０６】
構成要素のこのキットはまた、好適なコンピューターおよび適切なソフトウエアによって実施および／または制御され得る本発明による連続する工程を行うための指示手段を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、内皮前駆体細胞の数を、本発明の方法による注入の前または後において患者の血液または患者の骨髄に存在する１０６個の非接着性細胞について表す。
【０１０８】
【図２】図２は、処置前および処置後のＥＰＣである。
【０１０９】
【図３】図３は、エクスビボ培養の有無に関して、本発明の方法による注入の前または後におけるＭＳＣの数を表す。
【０１１０】
【図４】図４は、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の前（０日目）、３日後および７日後に患者の血液または骨髄から得られる、コロニーを形成することができるＥＰＣの数を表す。これは、処置による血液におけるＥＰＣの動員を強調する。
【０１１１】
【図５】図５は、ＰＲＰ注入後のＭＳＣのインビトロ培養を表す。
【０１１２】
【図６】図６は、刺激域におけるコロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の増大を表す。
【０１１３】
【図７】図７は、注入部位（左側）または反対側部位（右側）において、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の前（０日目）に得られるＭＳＣ、または、７日後に得られるＭＳＣのインビトロ増加を表す。ＭＳＣの拡大特性が処置によって増大するが（左側の７日目および０日目を比較のこと）、反対側部位では減少する。
【０１１４】
【図８】図８は、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処置の前、３日後および７日後における血液細胞集団を表す。ＣＤ３４およびＣＤ１３３について陽性である細胞（幹細胞）が、処置の３日後および７日後ではるかにより多く存在する。これは骨髄からの動員を反映する。
【０１１５】
【図９】図９は、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処置の前および７日後に処置部位（左側）または反対側部位において得られる骨髄細胞集団を表す。ＣＤ３４およびＣＤ１３３のレベルが両方の部位において処置によって維持される。これは、幹細胞含有量を補充する骨髄の能力を強調する。ＣＤ３１細胞が両方の部位においてはるかにより多く存在する。
【０１１６】
【図１０】図１０は、間葉系前駆体としてコロニーを形成することができる細胞（ＣＦＵ−Ｆ）、および、前骨芽細胞マーカーと見なされるアルカリホスファターゼを発現する間葉系前駆体としてコロニーを形成することができる細胞（ＣＦＵ−Ｏ）の相対数を表す。細胞を、処置前（Ｇ０）、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処理の３日後に処置部位（Ｇ３およびＲＧ３）または反対側部位（Ｄ３およびＲＤ３）において骨髄から採取した。細胞の一部はまた、間葉系細胞を富化するために処理された（ＲＧ３およびＲＤ３）。
【０１１７】
【図１１】図１１は、カルシウムおよびアルカリホスファターゼの測定とともに、骨組織に向かう分化を表す。細胞を、処置前（Ｇ０）、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆによる処置の３日後に処理部位（Ｇ３）または反対側部位（Ｄ３）において骨髄から採取し、示された時間、ペトリ皿で成長させた。
【０１１８】
【図１２】図１２は、図１０の場合のように処理されたが、２８日までの間成長させられた細胞のインシトゥーカルシウム標識化を表す。
【０１１９】
【図１３】図１３は、本発明に従って得られた幹細胞を（より大きな量で）使用する患者の顎の骨再建を表す。左側：処置後１週間、１２ｃｍ３の異種骨で満たされるインプラントを示す；右側：５４日の処置の後、インプラントを再び覆う、同種組織の再形成および新形成された骨組織を開示する。下段パネル：再建された顎が生組織から作製されること（血管形成）を立証する処置後９０日での９９Ｔｃシンチグラフィー。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
本発明の方法では、ヒト患者が、移植片について、提供者として、また、宿主として、両方で使用される。
【０１２１】
本発明の方法の独創性は、増殖細胞工程が、その部位において、すなわち、インビボで行われ、先行技術による技術で行われるようなインビトロではもはや行われないことである。しかしながら、本発明に従って刺激される幹細胞は、（刺激されていない幹細胞と比較して）インビトロでの増大した成長を有する。ヒト患者によって産生される幹細胞の量は、生まれた直後のヒトでは極めて重要であるが、年とともに急激に減少することが知られている。
【０１２２】
したがって、幹細胞を患者から回収すること、とりわけ、高齢者の患者から回収することは、極めて困難である。
【０１２３】
したがって、本発明による方法および手段は、患者に対する限定された危険性により、大量の幹細胞をインビボで迅速に得るために、また、これらの得られた幹細胞を回収するために使用することができる。
【０１２４】
活性化された自己ＰＲＰの使用と組み合わされるこの技術的特徴は、本発明の方法および手段に、効率の点で先行技術を上回る実際の利点をもたらす。
【０１２５】
実際、移植片拒絶の危険性がこのように最小限に抑えられ、本方法の安全性が最大化される。これは、インビトロ操作が最小限に抑えられる（または、最小限に抑えられ得る）からである。
【０１２６】
加えて、本発明者らは、好都合なことに、白血球数が、本方法適用時、ならびに／または、ＰＲＰおよび凝固因子を本発明に従って使用した後、患者の血液においてほとんど変化しないことを認めた。
【０１２７】
しかしながら、数工程が、とりわけ、細胞の分化がインビトロで実現され得る。
【０１２８】
ＰＲＰおよび可溶性ｈＴｆが富化される細胞培地が、幹細胞の増殖をインビトロで誘導することにおいて、同様にまた、幹細胞を未分化状態で保つことにおいてより大きい効力を有することもまた明らかにされる。
【０１２９】
約２０ｍｌ〜約２００ｍｌの血液サンプル、好ましくは、ヒト患者からの約６０ｍｌの血液が集められる。この採血サンプルから、（ヒト患者の全血における元の濃度の約１００％〜約１０００％またはそれ以上の間での）濃度の血小板を含む自己血小板富化血漿（自己ＰＲＰ）の調製物（約６ｍｌまたは約７ｍｌ〜約４０ｍｌのＰＲＰ、好ましくは約７ｍｌ〜約１０ｍｌのＰＲＰ）を最新技術（国際公開ＷＯ０３１０６０４０、国際公開ＷＯ００／６１２５６、国際公開ＷＯ２００４／０２４１９８、米国特許第６８５５１１９号、国際公開ＷＯ０２／０８０９９１および米国特許第６７１９９０１号）において記載されるＭａｇｅｌｌａｎ（商標）Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（登録商標）法および装置またはデバイスによって得ることが可能である。
【０１３０】
得られた自己血小板富化血漿が、濃縮された活性化自己ＰＲＰを含有する第１の溶液を形成するために、１マイクロリットルあたり、乾燥形態での凝固因子（約２００単位〜約１００００単位のトロンビン、または、約１ｍｇの組換えヒト組織因子（トロンボプラスチン））に加えられる。
【０１３１】
血小板濃度が、血小板の生存性を約３７℃で保証するように適合化される。
【０１３２】
代替では、トロンビンまたは組換え可溶性ヒト組織因子（トロンボプラスチン）を前記の自己血小板富化血漿に加える代わりに、自己ＰＲＰを、好ましくは、流体を骨髄腔に送達すること、および／または、流体を骨髄腔から抜き取ることのために好適な本発明の永続的な埋め込み可能な手段を使用して、同じヒト患者の腸骨稜、胸骨または脂肪組織に再注入することができる。
【０１３３】
凝固因子（またはＣａＣｌ２）が、注入直前のＰＲＰのシリンジに加えられる。
【０１３４】
この溶液が、同じヒト患者の腸骨稜、胸骨または脂肪組織に再注入され、その結果、（間葉系前駆細胞および／または内皮前駆細胞の）インビボ増殖が、ＨＳＣ幹細胞の増殖を好都合には誘導することなく、前記患者において局所的に誘導される。
【０１３５】
注入後の約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日から、約２１日までで、（間葉系）幹細胞が多い骨髄サンプルが、（同じ目標注入部位において）集められた。３日後および７日後に、１０ｍｌの血液サンプルおよび骨髄サンプルが、血液学的パラメーター（ヘマトクリット、ヘモグロビン、白血球）の最終的変化を推定するために集められた。３日後および７日後に、骨髄サンプルが、ＥＰＣおよびＭＳＣを比較するために、また、末梢血における幹細胞の動員を立証するために、互いに向かい合わせで行われる２回の穿刺によって集められた。
【０１３６】
この採取工程が、例えば、整形外科的処置法または外科的処置法のために、提案されるのと同じ日に行われる。
【０１３７】
これらの採取工程は好ましくは、十分な幹細胞濃度を得るように、規定された時間間隔で数回（好ましくは毎週）繰り返される。
【０１３８】
血小板は、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、血小板由来上皮増殖因子、血小板由来血管形成因子、インスリン様増殖因子１および血小板増殖因子４を含めて、数多くの分子を放出することが知られている。これらの分子は、局所的な間葉系細胞および内皮細胞に、遊走、分裂、ならびに、コラーゲン合成およびマトリックス合成の増大を行うためのシグナルを送る。
【０１３９】
さらに、以前に集められた骨髄サンプルが、活性化および濃縮された自己ＰＲＰおよびＭＳＣを含む組成物を得るように、（好ましくは、約１ｍｇの量の組換えヒト組織因子（トロンボプラスチン）、または、十分な量の上記凝固因子の１つに加えて）、血小板富化血漿と混合される。
【０１４０】
さらに、約８０ｍｇ／ｍｌの量のビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ビタミン）、および、約１０−８Ｍの濃度のデキサメタゾンを、増殖、分化およびマトリックス産生を誘導するために、この濃縮物に加えることができる。デキサメタゾンは好ましくは、カプセル化された化合物の（遅延）放出を可能にする、ＰＬＧＡ（ポリＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ＰＧＡ（ｖｐ８）（ポリグリコール酸）、ＰＬＬＡ（ポリ−Ｌ−乳酸）および／またはアルギン酸塩の足場（例えば、マイクロビーズなど）と一緒に調製される。他のポリマー化合物を、これらの好ましい化合物の効率的なカプセル化および放出を得るために使用することができる。
【０１４１】
骨形成を強化するための活性な化合物を含むそのような足場は、科学文献において既に記載された足場と類似している（Ｍａｒｉａｎｉ Ｍ．他、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、１２（３）、５４７頁〜５５８頁（２００６）、および、Ｉｎａｎｅ Ｂ．他、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、１２（２）、２５７頁〜２６６頁（２００６））。
【０１４２】
得られた組成物は、骨組織の再生のために直接に使用され得るペーストを形成するように、十分なゲル化剤（例えば、アルギン酸塩またはＣａＣｌ２溶液など）を同様に含むゲルと類似している（国際公開ＷＯ２００４／０２４１９８を参照のこと）。これは、効率的な拡大および／または分化を得るために当業者によって適合化することができる。
【０１４３】
さらに、種々の段階で細胞によって発現されるいくつかの表現型マーカー（産生されるＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＮＧＦ−Ｒ、サイトカインなど）を、幹細胞の発現、および／または、未成熟な細胞（未成熟な骨前駆体細胞）、成熟した骨前駆体細胞、前骨芽細胞、成熟した骨芽細胞、骨細胞などへの幹細胞の分化を追跡するために使用することができる。
【０１４４】
他の化合物、例えば、転写調節因子（Ｃｂｆａ−１、Ｍｓｘ−２、ｃ−ｆｏｓ、ｆｒａ−２、Ｄｉｘ−５など）、リンホカイン（ＩＬ−１）、増殖因子（ＴＧＦ−β）、（ＥＧＦ）などもまた、本発明の方法および組成物において使用することができる。
【０１４５】
骨髄においてＣＤ３４＋およびＣＤ３１＋である第１のタイプの幹細胞が得られた。図１および図２は、本発明の方法に関して、骨髄および末梢血においてＥＰＣのインビボでの刺激を（ＰＲＰおよび組織因子の添加によって、例えば、２０μｇ〜１０００μｇの可溶性組織因子（ｓＴＦ）／６ｍｌのＰＲＰ、好ましくは１００μｇ〜７００μｇのｓＴＦ／６ｍｌのＰＲＰ、より好ましくは３３４μｇのｓＴＦ／６ｍｌのＰＲＰの添加によって）得ることが可能であることを示す。さらに、ＭＳＣはまた、初回培養の前後で、著しく、かつ、予想外に増幅される（図７）。
表１から、処置後７日目で、「娘細胞」含有量（例えば、ＷＢＣおよびＣＦＵ−Ｆなど）が骨髄の注入側では強く高められる。実際には、この影響は一層より大きい。実際、この定量では、注入の反対側でのＣＦＵ−Ｆ含有量およびＣＦＵ−Ｃ含有量の減少によって例示されるような、また、図３および図７において実証されるような血液への細胞の動員が計数されない。動員のこの最初の証拠は、健康な患者の場合でさえ、治療目的のための可能性を示す。そのうえ、他の「娘細胞」、すなわち、図１において明らかにされるようなＥＰＣが血液において動員され、また、骨髄に驚くほど（より）多く存在したままであり（図２を参照のこと）、このことは、刺激（増加）、それに続く、分化および動員の複雑な速度論を反映している。
【０１４６】
その後、本発明者は、コロニーを形成する処置された細胞の能力を測定した。図３に示されるように、細胞が血液および骨髄から得られる。上記で示されるように、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆを注入した３日後、ＥＰＣコロニーの数が２倍を超えて増大する。この影響が７日目までずっと持続する。しかしながら、骨髄では、ＥＰＣコロニーの数が７日目において低下した。これはそれらの動員を反映する。
【０１４７】
ＭＳＣを７日間のＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の後で骨髄から採取し、その後、ペトリ皿で成長させた（図５）。はるかにより多くのＣＦＵ−Ｆが、ＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の後で骨髄から得られた。
【０１４８】
本発明者は、７日間の処置の前または後で骨髄から採取された単核細胞（ＭＮＣ）を精製し、コロニーを形成するその能力が３倍増大していることを測定した（図６）。
【０１４９】
ＭＳＣを７日間のＰＲＰ＋可溶性ｈＴｆの注入の前または後で骨髄から採取し、その後、成長させた（図７）。処置部位から採取された細胞は、より多く存在することのほかに、インビトロで成長する増大した能力を獲得していた。
【０１５０】
その後、本発明者は血液中の細胞（図８）および骨髄中の細胞（図９）の特徴づけを行った。血液において、ＣＤ３４細胞およびＣＤ１３３細胞が処置によって増大した。このことは、幹細胞の成長および動員に対する処置の正の影響を開示する。一方、それらの相対的存在量が骨髄において一定のままであった。このことは、幹細胞含有量を一定に保つ骨髄の能力を反映する。本発明者はさらに、処置後、ＣＤ３１細胞が骨髄により多く存在することを認めた。この速度論は、細胞タイプおよび階層に関連づけられる：「母」のＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋についてはより迅速であり（それらのレベルが７日目でベースラインにほぼ戻った）、「娘」のＥＰＣおよびＣＦＵ−Ｆ幹細胞についてはより遅く（それらのレベルが注入側では７日目においてより大きい）、そして、分化したＷＢＣについては一層より遅いかもしれない。
【０１５１】
異種移植片、同種移植片または自己移植片から得られる無機質型マトリックスもまた、骨再生組織を改善するためのゲル組成物において使用することができる。
【０１５２】
特定の組織への幹細胞の分化を得るために、特定の組織の再生を得るためのいくつかの特異的な増殖因子を使用することが可能である（皮膚組織を得るための上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨または軟骨の形成を誘導するためのＢＭＰファミリーの化合物、造血系分化を誘導するためのＧ−ＣＳＦまたはＡＭＤ３００、その他）。
【０１５３】
ゲル組成物はまた、（骨芽細胞系細胞を得るために、）連続する増殖、分化、成熟化、および、場合により、鉱物化を伴う事象の複雑なカスケードを介して、幹細胞を拡大し、要求される組織細胞に分化させるために、他の要素を含むことができる。このゲル組成物はまた、（異栄養性無機質沈着物形成を誘導するための）β−グリセロホスファート、いくつかのより特異的なヒト増殖因子、または、カルシウム含有化合物（例えば、ＣａＣｌ２、β−リン酸三カルシウム、骨粒子（変性骨由来または非変性骨由来）、アパタイト、アスピジン（ａｓｐｉｄｉｎｅ）、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、グルコノ乳酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔａｔｅ）、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、カルシウムグルトニアート（ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｔｏｎｉａｔｅ）およびそれらの混合物）を含む場合があり、そのような化合物の例が欧州特許ＥＰ１２３９８９４に記載される。
【０１５４】
本発明者は幹細胞を上記のように刺激し、その後、コロニーを形成するその増大した能力、アルカリホスファターゼを発現するその増大した能力、カルシウムを利用および固定するその増大した能力を測定した（図１０〜図１２）。
【０１５５】
その後、本発明者は、得られた細胞を使用して、自己インプラントを作製し、完全な骨を再構成した。
【０１５６】
図１３に示されるように、本発明者はまた、骨髄へのＰＲＰおよび可溶性ｈＴｆの注入によって幹細胞を活性化し、その後、幹細胞を活性化後３日目に得た後で、生組織を再構成することができた。３日間の活性化の後、内皮前駆体細胞の７倍の増大が血液において認められ、一方、骨髄では２倍の増大であった。このことは、処置後３日での幹細胞の増加および動員の両方を反映する。これらの幹細胞を、患者の損傷した顎に設置されるために適合化されたチタンの網状物に沈着させた。これらの活性化幹細胞は、９９Ｔｃシンチグラフィーによって示されるように、成長、分化、および、生組織の再構成（新しい血管の産生を含む）を行うことができた。
【０１５７】
その後、本発明者は、本発明に従って処置された１３名の患者において、サイトカインの血中濃度における何らかの変化について探索した。かなりの増大が、ＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を前記患者の腸骨稜の骨髄に注入した後の３日および７日で、ＦＧＦ−２（約４倍）、ＶＥＧＦ（約２倍）、Ｒａｎｔｅｓ（約２倍）およびＢＤＮＦ（＋５０パーセント）において認められた。
【０１５８】
その後、本発明者は、神経変性（神経学的）疾患に罹患している患者において、疾患を遅らせるか、または、それどころか、疾患を停止させるつもりで、ＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）の注入を試験した。本発明者は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）罹患患者を選択し、腸骨稜由来の骨髄におけるＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を左側に注入した。その後、４日後に、本発明者は、同じ注入を右側において再び行い、このプロトコルを１ヶ月間繰り返し、そして、患者を、そのような注入を行うことなく１ヶ月間回復させた。その後、この注入プロトコルを繰り返した。疾患の悪化における軽減が得られ、また、ある程度の改善さえ得られた。
【０１５９】
その後、本発明者はさらに、患者の骨髄の幹細胞を、ＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を注入した３日後に回収し、その後、（ＭＳＣ富化）幹細胞を、富化された幹細胞（ＭＳＣ）を患者の心臓に再注入する前に５分間の２０００ｇ×分での遠心分離によって活性化骨髄から精製することによって心臓病学（心筋梗塞罹患患者）において本発明を評価した。全体的には、本発明者は、本発明の教示に従って処置された患者における改善を認めた。
【０１６０】
本発明者はさらに、適合し得る提供者の腸骨稜に由来する骨髄においてＰＲＰおよび凝固因子（ｓｈＴｆ）を注入することによって幹細胞の増殖および活性化を刺激した。その後、本発明者は、骨髄が放射線照射されている白血病罹患患者への再注入の前に、（活性化）骨髄サンプルをこの提供者から単離した。
【０１６１】
その後、本発明者は、感染性疾患（ＡＩＤＳ）において本発明を評価した。
【０１６２】
しかしながら、本発明の方法および／または医薬用製造物によって引き起こされる幹細胞および／またはサイトカインの増大を考えると、いくつかの他の疾患が当業者によって処置され得ることが明らかである（この場合、前記疾患は好ましくは、ガン、炎症、骨粗鬆症、肝臓傷害、自己免疫疾患および／または感染性疾患を含めて、心臓病学的疾患、神経学的疾患、変性疾患からなる群から選択される）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品としての血小板富化血漿（ＰＲＰ）および凝固因子。
【請求項２】
非凝固性（可溶性）の混合物である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
幹細胞プール、好ましくは、哺乳動物対象の内皮前駆体細胞および／または間葉系幹細胞のプールを富化するための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項４】
心臓血管疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項５】
前記心臓血管疾患が、（変性）心筋症、（先天性）心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎および／または心筋梗塞からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項７】
前記神経学的疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中、脳血管障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項９】
前記自己免疫疾患が、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病および／またはエリテマトーデスからなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
骨変性疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項１１】
前記骨変性疾患が、骨萎縮、骨粗鬆症、骨再建および骨補強からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬品が可溶性混合物の形態である、請求項３〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記血小板富化血漿および前記凝固因子が哺乳動物対象の骨髄および／または脂肪組織に注入され、好ましくは、前記哺乳動物対象の腸骨稜または胸骨の骨髄に注入される、請求項３〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記哺乳動物対象がヒト患者である、請求項３〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記凝固因子が、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆまたはヒト組織因子）、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１または２に記載の医薬品。
【請求項１６】
・自己ＰＲＰと、場合により、自己トロンビンとを哺乳動物対象（好ましくはヒト患者）の血漿から得るための遠心分離デバイス；
・１つまたは複数の哺乳動物（好ましくはヒト）活性化合物、あるいは、前記化合物を含む流体（ただし、これらはバイアルに存在するかもしれない）；
・自己ＰＲＰと、ＭＳＣ活性化化合物または前記化合物を含む流体とにおける注入手段；および
・場合により、血液サンプルまたは骨髄液サンプルからの幹細胞の採取手段
を含む、構成要素のキット。
【請求項１７】
前記活性化合物が、
・効果的な量のトロンボプラスチン（組織因子またはＴｆ）、好ましくは組換えトロンボプラスチン（組換え組織因子またはｒＴｆ）、好ましくはヒト組織因子（ｈＴｆ）、より好ましくは組換えヒト組織因子（ｒｈＴｆ）、より好ましくは組換え可溶性ヒト組織因子（ｒｓｈＴｆ）、ただし、これらはより好ましくは、リン脂質（より具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）の添加を伴う；または
・効果的な量のヒト第ＶＩＩ因子、
・効果的な量のヒト第Ｘ因子、
・効果的な量の組織因子−第ＶＩＩａ因子、
・効果的な量の組織第Ｘａ因子、
・効果的な量の組織因子−第ＶＩＩａ因子−第Ｘａ因子、
・効果的な量の第ＶＩＩＩ因子、
・効果的な量の第ＩＸ因子、あるいは
・上記因子の組合せ（ただし、前記因子は活性化型または非活性化型である）
からなる群から選択される、請求項１６に記載の構成要素のキット。
【請求項１８】
活性化ＭＳＣが富化された集団を含む骨髄サンプル。
【請求項１９】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が増大している、請求項１８に記載の骨髄サンプル。
【請求項２０】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が少なくとも約３０％増大し、かつ／または、少なくとも１３個のコロニー（ＣＦＵ−Ｆ）が、前記骨髄サンプルの１００００００個の単核細胞を培養するときに得られる、請求項１８または１９に記載の骨髄サンプル。
【請求項２１】
哺乳動物対象の幹細胞プールを富化するための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２２】
心臓血管疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２３】
哺乳動物対象の神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２４】
自己免疫疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２５】
ガンおよび／または感染性疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２６】
前記凝固因子が、組織因子（Ｔｆ）、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２１〜２５のいずれかに記載される医薬品。
【請求項２７】
前記凝固因子が可溶性ヒト組織因子である、請求項２１〜２５のいずれかに記載される医薬品。
【請求項２８】
十分な量のＰＲＰと、凝固因子（好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ヒト組織因子（ｈＴｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子）とを使用する、ヒト胚性でない幹細胞のインビトロ培養のための方法。
【請求項２９】
活性化された骨髄からサンプルを得る工程（１つまたは複数）を含む、活性化ＭＳＣが富化された細胞集団を得るための方法。
【請求項３０】
前記骨髄が、ＰＲＰおよび凝固因子の添加によって（前もって）活性化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記骨髄サンプルに存在する幹細胞を富化する工程をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
幹細胞の前記富化が、前記骨髄サンプルの遠心分離および中間画分の回収によって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が増大している、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が少なくとも約３０％増大し、かつ／または、少なくとも１３個のコロニーが、活性化された骨髄から得られるサンプルの１００００００個の単核細胞を培養するときに得られる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
非胚性ヒト幹細胞を得るための、そして、場合により、組織（好ましくはヒト患者の組織）または細胞を再生するための方法であって、下記の工程：
ｂ）血液サンプルを哺乳動物対象から集める工程；
ｃ）自己ＰＲＰを前記血漿から調製する工程；
ｄ）前記自己ＰＲＰを、
・効果的な量のトロンビン、
・効果的な量のトロンボプラスチン、または
・効果的な量のＣａＣｌ２、
・効果的な量の第ＶＩＩ因子、
・効果的な量の第Ｘ因子、
・効果的な量の組織因子および第ＶＩＩａ因子、
・効果的な量の第Ｘａ因子、
・効果的な量の組織因子、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子、
・効果的な量の第ＶＩＩＩ因子、
・効果的な量の第ＩＸ因子、あるいは
・上記因子の組合せ
からなる群から選択される哺乳動物活性要素、好ましくはヒト活性要素の添加によって活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第１の流体を得る工程；
ｅ）非胚性幹細胞が多い目標注入領域を同じ哺乳動物対象において選択する工程；
ｆ）前記第１の流体を前記哺乳動物対象の前記目標注入領域に注入して、その結果、幹細胞のインビボ増殖を前記哺乳動物対象において局所的に誘導する工程；
ｇ）場合により、十分なインキュベーション時間の後で、同じ哺乳動物対象から、細胞が多い血液サンプルおよび／または骨髄サンプルを集め、そして、得られた幹細胞を回収し、好ましくは非胚性ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３１＋幹細胞を回収し、場合により、
工程ａ）〜工程ｅ）、または、工程ａ）〜工程ｆ）を数回繰り返す工程；
ｈ）場合により、第２の血液サンプルを集める工程；
ｉ）場合により、第２の自己ＰＲＰを前記第２の血液サンプルから調製する工程；
ｊ）場合により、前記自己ＰＲＰを、
・効果的な量のトロンビン、
・効果的な量のトロンボプラスチン、または
・効果的な量のＣａＣｌ２、
・効果的な量のヒト第ＶＩＩ因子、
・効果的な量のヒト第Ｘ因子、
・効果的な量の組織因子および第ＶＩＩａ因子、
・効果的な量の組織因子および第Ｘａ因子、
・効果的な量の組織因子、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子、
・効果的な量の第ＶＩＩＩ因子、
・効果的な量の第ＩＸ因子、あるいは
・上記因子の組合せ
からなる群から選択される活性な要素によって活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第２の流体を得る工程；
ｋ）場合により、前記第２の流体と、以前に集められた前記血液サンプルまたは骨髄液サンプルとを混合して、その結果、活性化された濃縮されている自己ＰＲＰおよびＭＳＣを含む組成物を得る工程；
ｌ）場合により、細胞固定のための少なくとも１つのマトリックスと、好ましくは、ビタミン、コルチゾンもしくはコルチゾン誘導体（デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン）および／またはβ−グリセロホスファートからなる群から選択される他の要素とを含む分化補助剤を前記幹細胞に、好ましくは、活性化された濃縮されている自己ＰＲＰおよびＭＳＣを含む前記組成物に加えて、その結果、分化した（骨）組織細胞への前記幹細胞の分化を誘導し、そして、場合により、前記組織の再生を得る工程；および
ｍ）場合により、活性化された濃縮されている自己ＰＲＰおよび幹細胞を含む前記組成物に、適切なゲル化剤を加えて、ゲル組成物を形成する工程；および
ｎ）場合により、そのようにして得られた前記ゲル組成物を前記哺乳動物（好ましくはヒト患者）の目標組織再建部位の内部／表面に適用して、その結果、組織再建が前記再建部位において生じ得るようにする工程
を含む方法。
【請求項３６】
インキュベーション時間が３日〜３ヶ月の間で含まれ、好ましくは１５日〜１ヶ月の間で含まれ、より好ましくは３週間である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＲＰが、１マイクロリットルあたり６０００００個の血小板〜１マイクロリットルあたり８００００００個の血小板の間で含まれる、血小板における濃度を与える、請求項３５または３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
組織再建のための、場合により、請求項２８〜３７のいずれかに記載される方法によって得られるゲル組成物であって、十分な量のトロンボプラスチンと、ヒト胚性でない幹細胞と、少なくとも１つの適切なゲル化剤と、場合により、ビタミン、コルチゾン誘導体（デキサメタゾン）またはそれらの混合物からなる群から選択される補助剤とによる活性化された濃縮されている自己ＰＲＰを含むゲル組成物。
【請求項３９】
哺乳動物対象由来のサイトカインの血中濃度を好ましくは少なくとも５０％増大させるための方法であって、ＰＲＰおよび凝固因子を前記哺乳動物において注入する工程を含む方法。
【請求項４０】
前記ＰＲＰおよび前記凝固因子が骨髄に注入され、好ましくは、哺乳動物対象の腸骨稜の骨髄に注入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サイトカインが、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＲａｎｔｅｓおよびＢＤＮＦからなる群から選択される２つまたは３つまたは４つの異なるサイトカインである、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＲａｎｔｅｓおよびＢＤＮＦとは異なるサイトカインは影響を受けない、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記サイトカインが、ＩＧＦ−１、ＳＤＦ−１アルファ、ＭＩＰ−１アルファおよびＰＤＧＦまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項１】
医薬品としての血小板富化血漿（ＰＲＰ）および凝固因子。
【請求項２】
非凝固性（可溶性）の混合物である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
幹細胞プール、好ましくは、哺乳動物対象の内皮前駆体細胞および／または間葉系幹細胞のプールを富化するための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項４】
心臓血管疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項５】
前記心臓血管疾患が、（変性）心筋症、（先天性）心臓疾患、冠状動脈疾患、虚血、拡張期機能不全、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎および／または心筋梗塞からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項７】
前記神経学的疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、脊髄傷害、脳卒中、脳血管障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項９】
前記自己免疫疾患が、再生不良性貧血、多発性硬化症、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、グレーヴズ病および／またはエリテマトーデスからなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
骨変性疾患の処置および／または防止のための医薬品を製造するための、ＰＲＰおよび凝固因子の使用。
【請求項１１】
前記骨変性疾患が、骨萎縮、骨粗鬆症、骨再建および骨補強からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬品が可溶性混合物の形態である、請求項３〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記血小板富化血漿および前記凝固因子が哺乳動物対象の骨髄および／または脂肪組織に注入され、好ましくは、前記哺乳動物対象の腸骨稜または胸骨の骨髄に注入される、請求項３〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記哺乳動物対象がヒト患者である、請求項３〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記凝固因子が、（可溶性）トロンボプラスチン（ｈＴｆまたはヒト組織因子）、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１または２に記載の医薬品。
【請求項１６】
・自己ＰＲＰと、場合により、自己トロンビンとを哺乳動物対象（好ましくはヒト患者）の血漿から得るための遠心分離デバイス；
・１つまたは複数の哺乳動物（好ましくはヒト）活性化合物、あるいは、前記化合物を含む流体（ただし、これらはバイアルに存在するかもしれない）；
・自己ＰＲＰと、ＭＳＣ活性化化合物または前記化合物を含む流体とにおける注入手段；および
・場合により、血液サンプルまたは骨髄液サンプルからの幹細胞の採取手段
を含む、構成要素のキット。
【請求項１７】
前記活性化合物が、
・効果的な量のトロンボプラスチン（組織因子またはＴｆ）、好ましくは組換えトロンボプラスチン（組換え組織因子またはｒＴｆ）、好ましくはヒト組織因子（ｈＴｆ）、より好ましくは組換えヒト組織因子（ｒｈＴｆ）、より好ましくは組換え可溶性ヒト組織因子（ｒｓｈＴｆ）、ただし、これらはより好ましくは、リン脂質（より具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）の添加を伴う；または
・効果的な量のヒト第ＶＩＩ因子、
・効果的な量のヒト第Ｘ因子、
・効果的な量の組織因子−第ＶＩＩａ因子、
・効果的な量の組織第Ｘａ因子、
・効果的な量の組織因子−第ＶＩＩａ因子−第Ｘａ因子、
・効果的な量の第ＶＩＩＩ因子、
・効果的な量の第ＩＸ因子、あるいは
・上記因子の組合せ（ただし、前記因子は活性化型または非活性化型である）
からなる群から選択される、請求項１６に記載の構成要素のキット。
【請求項１８】
活性化ＭＳＣが富化された集団を含む骨髄サンプル。
【請求項１９】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が増大している、請求項１８に記載の骨髄サンプル。
【請求項２０】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が少なくとも約３０％増大し、かつ／または、少なくとも１３個のコロニー（ＣＦＵ−Ｆ）が、前記骨髄サンプルの１００００００個の単核細胞を培養するときに得られる、請求項１８または１９に記載の骨髄サンプル。
【請求項２１】
哺乳動物対象の幹細胞プールを富化するための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２２】
心臓血管疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２３】
哺乳動物対象の神経学的疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２４】
自己免疫疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２５】
ガンおよび／または感染性疾患の処置および／または防止のための医薬品として使用される凝固因子。
【請求項２６】
前記凝固因子が、組織因子（Ｔｆ）、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２１〜２５のいずれかに記載される医薬品。
【請求項２７】
前記凝固因子が可溶性ヒト組織因子である、請求項２１〜２５のいずれかに記載される医薬品。
【請求項２８】
十分な量のＰＲＰと、凝固因子（好ましくは、（可溶性）トロンボプラスチン（ヒト組織因子（ｈＴｆ））、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子またはそれらの混合物からなる群から選択される凝固因子）とを使用する、ヒト胚性でない幹細胞のインビトロ培養のための方法。
【請求項２９】
活性化された骨髄からサンプルを得る工程（１つまたは複数）を含む、活性化ＭＳＣが富化された細胞集団を得るための方法。
【請求項３０】
前記骨髄が、ＰＲＰおよび凝固因子の添加によって（前もって）活性化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記骨髄サンプルに存在する幹細胞を富化する工程をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
幹細胞の前記富化が、前記骨髄サンプルの遠心分離および中間画分の回収によって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が増大している、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
コロニーを形成する前記ＭＳＣの能力が少なくとも約３０％増大し、かつ／または、少なくとも１３個のコロニーが、活性化された骨髄から得られるサンプルの１００００００個の単核細胞を培養するときに得られる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
非胚性ヒト幹細胞を得るための、そして、場合により、組織（好ましくはヒト患者の組織）または細胞を再生するための方法であって、下記の工程：
ｂ）血液サンプルを哺乳動物対象から集める工程；
ｃ）自己ＰＲＰを前記血漿から調製する工程；
ｄ）前記自己ＰＲＰを、
・効果的な量のトロンビン、
・効果的な量のトロンボプラスチン、または
・効果的な量のＣａＣｌ２、
・効果的な量の第ＶＩＩ因子、
・効果的な量の第Ｘ因子、
・効果的な量の組織因子および第ＶＩＩａ因子、
・効果的な量の第Ｘａ因子、
・効果的な量の組織因子、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子、
・効果的な量の第ＶＩＩＩ因子、
・効果的な量の第ＩＸ因子、あるいは
・上記因子の組合せ
からなる群から選択される哺乳動物活性要素、好ましくはヒト活性要素の添加によって活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第１の流体を得る工程；
ｅ）非胚性幹細胞が多い目標注入領域を同じ哺乳動物対象において選択する工程；
ｆ）前記第１の流体を前記哺乳動物対象の前記目標注入領域に注入して、その結果、幹細胞のインビボ増殖を前記哺乳動物対象において局所的に誘導する工程；
ｇ）場合により、十分なインキュベーション時間の後で、同じ哺乳動物対象から、細胞が多い血液サンプルおよび／または骨髄サンプルを集め、そして、得られた幹細胞を回収し、好ましくは非胚性ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３１＋幹細胞を回収し、場合により、
工程ａ）〜工程ｅ）、または、工程ａ）〜工程ｆ）を数回繰り返す工程；
ｈ）場合により、第２の血液サンプルを集める工程；
ｉ）場合により、第２の自己ＰＲＰを前記第２の血液サンプルから調製する工程；
ｊ）場合により、前記自己ＰＲＰを、
・効果的な量のトロンビン、
・効果的な量のトロンボプラスチン、または
・効果的な量のＣａＣｌ２、
・効果的な量のヒト第ＶＩＩ因子、
・効果的な量のヒト第Ｘ因子、
・効果的な量の組織因子および第ＶＩＩａ因子、
・効果的な量の組織因子および第Ｘａ因子、
・効果的な量の組織因子、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子、
・効果的な量の第ＶＩＩＩ因子、
・効果的な量の第ＩＸ因子、あるいは
・上記因子の組合せ
からなる群から選択される活性な要素によって活性化して、その結果、濃縮された活性化自己血小板富化血漿を含有する第２の流体を得る工程；
ｋ）場合により、前記第２の流体と、以前に集められた前記血液サンプルまたは骨髄液サンプルとを混合して、その結果、活性化された濃縮されている自己ＰＲＰおよびＭＳＣを含む組成物を得る工程；
ｌ）場合により、細胞固定のための少なくとも１つのマトリックスと、好ましくは、ビタミン、コルチゾンもしくはコルチゾン誘導体（デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン）および／またはβ−グリセロホスファートからなる群から選択される他の要素とを含む分化補助剤を前記幹細胞に、好ましくは、活性化された濃縮されている自己ＰＲＰおよびＭＳＣを含む前記組成物に加えて、その結果、分化した（骨）組織細胞への前記幹細胞の分化を誘導し、そして、場合により、前記組織の再生を得る工程；および
ｍ）場合により、活性化された濃縮されている自己ＰＲＰおよび幹細胞を含む前記組成物に、適切なゲル化剤を加えて、ゲル組成物を形成する工程；および
ｎ）場合により、そのようにして得られた前記ゲル組成物を前記哺乳動物（好ましくはヒト患者）の目標組織再建部位の内部／表面に適用して、その結果、組織再建が前記再建部位において生じ得るようにする工程
を含む方法。
【請求項３６】
インキュベーション時間が３日〜３ヶ月の間で含まれ、好ましくは１５日〜１ヶ月の間で含まれ、より好ましくは３週間である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＲＰが、１マイクロリットルあたり６０００００個の血小板〜１マイクロリットルあたり８００００００個の血小板の間で含まれる、血小板における濃度を与える、請求項３５または３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
組織再建のための、場合により、請求項２８〜３７のいずれかに記載される方法によって得られるゲル組成物であって、十分な量のトロンボプラスチンと、ヒト胚性でない幹細胞と、少なくとも１つの適切なゲル化剤と、場合により、ビタミン、コルチゾン誘導体（デキサメタゾン）またはそれらの混合物からなる群から選択される補助剤とによる活性化された濃縮されている自己ＰＲＰを含むゲル組成物。
【請求項３９】
哺乳動物対象由来のサイトカインの血中濃度を好ましくは少なくとも５０％増大させるための方法であって、ＰＲＰおよび凝固因子を前記哺乳動物において注入する工程を含む方法。
【請求項４０】
前記ＰＲＰおよび前記凝固因子が骨髄に注入され、好ましくは、哺乳動物対象の腸骨稜の骨髄に注入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サイトカインが、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＲａｎｔｅｓおよびＢＤＮＦからなる群から選択される２つまたは３つまたは４つの異なるサイトカインである、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＲａｎｔｅｓおよびＢＤＮＦとは異なるサイトカインは影響を受けない、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記サイトカインが、ＩＧＦ−１、ＳＤＦ−１アルファ、ＭＩＰ−１アルファおよびＰＤＧＦまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５１６８７７（Ｐ２０１２−５１６８７７Ａ）
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８６９６（Ｐ２０１１−５４８６９６）
【出願日】平成２２年２月５日（２０１０．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５１４４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９３７９
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５１１１９２０２３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月５日（２０１０．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５１４４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９３７９
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５１１１９２０２３）
【Ｆターム（参考）】
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