組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法
【課題】本発明は組織試料およびパラフィン包埋組織試料からＰＣＲ増幅に適する核酸を迅速且つ効率的に抽出する方法を提供する。
【解決手段】抽出は、緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素を含んで成る組成物を使って、数分以内に達成される。次いでその試料をアルカリ性ｐＨで加熱しそして遠心分離段階の後、上澄液中のＤＮＡを既知の増幅方法、例えばＰＣＲにおいて直接使用することができる。
【解決手段】抽出は、緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素を含んで成る組成物を使って、数分以内に達成される。次いでその試料をアルカリ性ｐＨで加熱しそして遠心分離段階の後、上澄液中のＤＮＡを既知の増幅方法、例えばＰＣＲにおいて直接使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の抽出方法およびそのためのキットに関する。特に、本発明は組織試料およびパラフィン包埋組織試料から核酸を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的診断の分野では、遺伝病、癌および感染症の検出のために、核酸の増幅を含む分子技術の使用が増加してきている。しかしながら、そのような増幅技術を組織または他の重要な臨床試料に適用する際には、核酸調製物中に不純物が存在すると増幅感度や増幅効率を抑制または低下させることがある〔Wilson, I.G., Applied and Environmental Microbiology 63(10):3741-3751, 1997 〕。
【０００３】
古記録（archival）のパラフィン包埋病理学組織試料からのＤＮＡ抽出は、分子診断測定を患者の結果と関連づけることができる追想的研究において特に有用である。CrisanおよびMattson により指摘されたように（DNA and Cell Biology 12:455-464, 1993 ）、追想的ＤＮＡ分析の利点は多数あり、そして(i) ウイルス、細菌または原生動物の物質が病因の役割を果たすと疑われ、潜在的な疫学または予後の相関関係が導き出せるようになる、多数の病気経過の研究；(ii)様々なタイプの悪性に関連する内因性ＤＮＡ異常の研究；(iii) 遺伝病における遺伝したＤＮＡの研究；(iv)古記録試料の使用が、新鮮組織を必要とする予想的研究において可能であるよりも大きな患者研究グループを使用できるようにする、珍しい病気の追想的研究；および(v) 臨床結果が既に知られている場合、特定の病気の有無、形態学的診断またはタイプ、病期、予後、および治療に対する応答と相関関係がある可能性の研究、に適用することができる。
【０００４】
ＤＮＡの増幅について報告された方法は、ＤＮＡポリメラーゼの使用（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）、リガーゼの使用（リガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）または両方の使用（ＧＡＰ−ＬＣＲ）のいずれかに基づいている。それらの方法のうち、ＰＣＲが現在まで最も広く使われている。ＰＣＲは、適当な条件下でＤＮＡ重合剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイズせしめることを含んで成る。その結果は、数サイクルの増幅を通じたプライマー伸長生成物の形成、および元の標的配列の数の指数的増加である。ＰＣＲについての更なる詳細は、米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）明細書を調べることにより得ることができる。
【０００５】
固有の感受性のために、一般に試料間の生成物の持ち越しや汚染がＰＣＲおよび核酸増幅方法に伴う問題である。試料調製中の生成物の持ち越しは深刻な問題である。それは試料が外部環境に暴露される時間の量の関数であり、試料収容装置を開放することによって試料を外部環境に暴露しなければならない回数に関係する。よって、迅速であり且つ外部環境への試料の暴露を減少させるかまたは最小にする試料調製方法を提供することが有利である。特に、試料収容装置を開放しなけれならない回数が最小である核酸抽出方法を提供することが有利である。
【０００６】
多数のヒト癌腫においてras プロトオンコジーン中の点変異が高頻度で起こるので、それは潜在的に重要な診断の標的である（Bos, J.L., Cancer Res. 49:4682-4689, 1989 ）。例えば、膵癌の90％位がＫ-ras遺伝子中に変異を含み、大部分はコドン12において起こる（Almoguera 他, Cell 53:549-554, 1998 ）。ras 変異の存在を検出する方法は多数存在する。１つの方法として、制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）が最近記載されている（WO 96/32500 ）。ＲＥＭＳ−ＰＣＲはＰＣＲ熱循環の間に耐熱性制限酵素を使用することに基づく。ＲＥＭＳ−ＰＣＲは分析と検出を単純化し且つそれに要する時間を大幅に短縮する。
【０００７】
Volenandt 他により指摘されたように、抽出されるＤＮＡの量はＰＣＲ反応の収率に大きく影響を及ぼし得る（Polymerase Chain Reaction Analysis of DNA from Paraffin-Embedded Tissue. Methods in Molecular Biology Vol. 15: Current Methods and Applications, 1993, B.A. White 編, Humana Press Inc., N.J. ）。固定化組織からのＤＮＡを分析する時、添加する抽出試料の容量とＰＣＲ増幅収率との間に反比例関係がしばしば観察される。これは、或る種の固定剤およびTaq ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する他の阻害剤の影響によるものである。更に、固定またはＤＮＡ抽出中に起こる核酸の断片化も、ＤＮＡ増幅の際に問題となり得る（Greer 他, Am. J. Clin. Pathol. 95:117-124, 1991; Crisan 他, Clin. Biochem. 25:99-103, 1992）。
【０００８】
パラフィン組織片または新鮮組織片からのＤＮＡ抽出の場合、典型的には、複雑なＤＮＡ調製方法が用いられる。そのような方法は、ＤＮＡを遊離させそして核酸増幅を妨害し得るタンパク質を分解するために、界面活性剤の存在下でプロテアーゼ酵素と共に長時間インキュベートすることを必要とする。抽出されたＤＮＡの精製の際に行われるその後の別段階として、混入したＲＮＡを除去するためのＲＮアーゼによる処理に続き、タンパク質や他の細胞性物質を除去するためのエタノールのような溶媒またはフェノールとイソアミルアルコールのような溶媒混合物を使ったＤＮＡの沈澱、次いでＤＮＡの水和を含み得る（Volenandt 他, Polymerase Chain Reaction Analysis of DNA from Paraffin-Embedded Tissue. Methods in Molecular Biology Vol. 15: Current Methods and Applications, 1993, B.A. White 編, Humana Press Inc., N.J. ）。パラフィン包埋組織の場合、普通はプロテイナーゼ段階の前に多段階法においてキシレンのような溶媒を使って抽出することにより、パラフィンが除去される。Banerjee他による最近の報告は、パラフィン包埋組織からのＤＮＡ遊離のためのプロトコールを提供している（BioTechniques 18:768-773, 1995）。この方法は次の段階を含む：(1) マイクロウエーブ処理、(2) 遠心分離段階によるパラフィンの除去、(3) プロテイナーゼＫ消化、および(4) プロテアーゼＫ活性を失活させるための加熱段階。
【０００９】
Slebosと彼の仲間は、パラフィン包埋組織からＤＮＡを遊離させる方法であって、３つの10ミクロン切片を使用し、非イオン性界面活性剤と共にインキュベートし、そしてプロテイナーゼＫと共に18〜24時間インキュベートした後、遠心分離することを含んで成る方法を報告している（Diagnostic Molecular Pathology 1(2); 136-141, 1992）。結果として得られた上澄液はそのままＰＣＲ増幅に使われる。
【００１０】
プロテイナーゼＫとの長いインキュベーションの必要性および加熱不活性化段階の必要性を回避するために、ニュージーランド特許NZ 233270 の仮明細書は、細胞タンパク質を消化しそして核酸を遊離させるために、プロテイナーゼＫに代わるものとして耐熱性プロテイナーゼの使用を記載している。この方法は速さと使用容易性の改善を提供する。しかしながら、その方法では、パラフィン包埋組織から遊離される増幅可能なＤＮＡの量が限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、その後の増幅方法に適合する方法で、組織試料から迅速且つ高効率的に核酸を抽出する方法が当業界でまだ要望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上述の課題を解決し、且つその後の増幅方法に適合する方法で組織試料から核酸を抽出する方法を提供する。よって、本発明の目的は、組織試料およびパラフィン包埋組織試料から核酸を抽出する方法並びにそのためのキットを提供することである。
本発明の他の様々な目的および利点は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【００１３】
一態様では、本発明は、組織試料から核酸を抽出する方法に関する。この方法は、組織試料から核酸を遊離させるのに十分な条件下で、組織試料を緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触させることを含んで成る。次いでその試料をプロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時間に渡りアルカリ性ｐＨで加熱する。前記試料を遠心分離することにより、上澄液中に核酸が単離される。
本明細書中に言及される全ての刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抽出された核酸が既知技術を使ったその後の増幅および検出に適するように、組織試料から核酸を抽出する方法に関する。本発明を使って、新鮮な組織試料とパラフィン包埋組織試料の両方のヒト組織試料から、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を抽出することができる。本発明を使って核酸を抽出することができる組織の例としては、正常のおよび癌性の肺組織、結腸組織、膵臓組織、胸部組織、前立腺組織、血液および他の体液、並びに検出することができる核酸を含む細胞性物質が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明では、着目のＤＮＡを含むと思われる組織試料を、緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と同時にまたは連続的に接触せしめる。適当な常用の生物学的緩衝剤としては、ｐＨを約４〜約10、好ましくは約７〜約９で維持する１または複数の有機緩衝剤が挙げられる。有用な緩衝剤としては、非限定的に、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、トリシン、グリシン、トリス（TRIS）、リン酸塩および当業者に容易に明らかな他のものが挙げられる。使用する緩衝剤の量はｐＫａに依存し、そして所望のｐＨを維持するのに十分であるものである。
【００１６】
多数の非イオン性界面活性剤のいずれも本発明に使用できる。本発明において有用な界面活性剤の例としては、非限定的に、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコールエーテル、ペルフルオロアルキルポリオキシエチレン、フッ素化アルキルアルコキシレート、およびフッ素化アルキルエステル化合物が挙げられる。他の有用な界面活性剤の種類および各種類の例は、特に界面活性剤の標準参考文献であるMcCutcheon's Emulsfers and Detergents, 1986 North American Edition, McCutcheon Division Publishing Co., Glen Rock, NJ.を参考にすれば、当業者に容易に明白であろう。典型的な非イオン性界面活性剤は米国特許第5,231,015 号（Cummins 他）明細書中にも与えられており、その内容が参考として本明細書中に組み込まれる。非イオン性界面活性剤の組合せも本発明に用いることができる。
【００１７】
プロテアーゼ酵素は組織およびタンパク質を分解して核酸を遊離させるために用いられる。プロテアーゼは遊離したＤＮＡをより安定にするヌクレアーゼも分解し得る。好ましくは、プロテアーゼ酵素は耐熱性である。多種多様なプロテアーゼが本発明に使用することができ、その例としてはセリンプロテアーゼ（E.C. 3.4.21 、例えばトリプシンおよびキモトリプシン）、チオールプロテアーゼ（E.C. 2.4.22 、例えばパパイン、フィシン）、カルボキシプロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、E.C. 2.4.23 、例えばペプシン）、およびメタロプロテアーゼ（E.C. 2.4.24 、例えばサーモリシン、プロナーゼ）が挙げられる。温度、ｐＨ、イオン強度、および界面活性剤タイプの最適条件は、使用するプロテアーゼによって異なるだろう。好ましいプロテイナーゼとしては、プロテアーゼＫ〔E.C. 3.4.21.64、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）から〕、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）からのプロテアーゼ（P6911, Sigma Chemical Company, St. Louis）およびPRETAQが挙げられる。PRETAQは、Peek, K.他（Purification and characterization of thermostable proteinase, Eur. J. Biochem. 207:1035-1044, 1992）により記載されたように、テルムス（Thermus ）種RT41株から単離された非常に耐熱性のアルカリ性プロテアーゼである。この酵素は70℃で24時間後に全く活性の損失がなく、且つ室温で６か月以上も活性の損失がないと報告された非常に耐熱性の酵素である。PRETAQおよび同様の耐熱性酵素の使用は、75℃付近およびそれ以上の温度でパラフィンが融解することから、パラフィン組織からのＤＮＡの調製に有利である。よってそのような高度の耐熱性プロテアーゼの使用は、プロテアーゼ消化前にパラフィンを除去するための別個の溶媒抽出プロトコールを行う必要性を除去する。溶媒によるパラフィン除去方法は、上記に引用したVolkenandt他、Wright & Manos、およびGreer による参考文献中に記載されており、それはオクタンまたはキシレンを使った処理に続きエタノールもしくは他のアルコールまたはアセトンのような溶媒を使った処理という多段階処理の使用に基づいている。
【００１８】
試料はＤＮＡを遊離させるのに十分な条件下で緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触せしめられる。使用する条件は、使用する組織試料とプロテアーゼによって異なるだろうが、それは当業者により容易に決定することができる。例えば、PRETAQプロテアーゼを使う時、70℃〜100 ℃において、温度によって５分間〜３時間、試料を緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることができる。90℃〜100 ℃で10〜15分間が好ましい。プロテアーゼＫを使う場合、試料を30分〜24時間、緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることができる。30分〜60分間が好ましい。
【００１９】
次いでプロテアーゼを不活性化するのに十分な時間に渡りアルカリ性ｐＨで試料を加熱する。試料のｐＨは、アルカリ性ｐＨが得られるまで試料に水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを添加することにより調整することができる。次いで抽出された核酸を遠心分離により単離することができる。
【００２０】
本発明に開示される方法は多数の利点を有する。本発明の方法は迅速であり、潜在的に毒性の溶媒を使用する必要性をなくし、そして試料収容装置を開放しなければならない操作の回数を最小にする。加熱したアルカリでの処理段階を含めることは、多分二本鎖ＤＮＡを変性させそしてそれをＰＣＲで一層容易に増幅できる一本鎖ＤＮＡの小片に変えることにより、ＰＣＲ増幅を改善する。熱アルカリでの処理はプロテアーゼを変性させ、そのため残余のプロテアーゼ活性がその後の増幅に必要なTaq ポリメラーゼまたは他の酵素を阻害してしまうかもしれないという心配を取り除くと期待される。第三に、ＰＣＲ増幅を阻害することが知られている幾つかの化学物質（ヘパリン、ビリルビン、ヘモグロビン等）が熱アルカリ処理により変性されることも期待される。第四に、熱アルカリ処理は、或るＰＣＲ増幅プロトコールを妨害することがあるＲＮＡを破壊する。最後に、熱アルカリ処理はまた、脂質、脂肪酸および他の重要な細胞膜の可溶化をもたらすと期待されよう。この細胞膜の完全性の破壊は更に、細胞および組織から遊離されるＤＮＡを増加させると期待される。
【００２１】
本発明に従って組織試料から抽出される核酸は、当該技術分野で既知の方法（例えばＰＣＲやＬＣＲ）を使ったその後の増幅に適当である。ＰＣＲを使った核酸の増幅および検出のための一般原理および条件は十分に周知であり、その詳細は多数の刊行物、例えば米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）明細書に提供されている。それらの刊行物は全て参考として本明細書中に組み込まれる。好ましくは、ＰＣＲは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使って実施される。多数の適当な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において報告されており、例えば米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818 号（Gelfand 他）明細書中に詳細に記載されている。その両刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。ＰＣＲにおいて使用することができる他の試薬としては、例えば、増幅前に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを抑制する、該ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体が挙げられる。そのような抗体は米国特許第5,338,671 号（Scalice 他）明細書（その内容は参考として本明細書に組み込まれる）中に記載されたモノクローナル抗体により代表される。
【００２２】
増幅された核酸は、多数の既知方法、例えば米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）明細書に記載されたものにより検出することができる。例えば、増幅された核酸はサザンブロット法、ドットブロット技術、または標識プローブによる非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出法を使って検出することができる。あるいは、適当に標識されたプライマーを使って増幅を実施し、そして前記標識の検出のための手順および装置を使って増幅されたプライマー伸長生成物を検出することができる。よって、当該技術分野の技術と本明細書中に提供される特別な技術を考慮すれば、当業者は、新鮮組織試料またはパラフィン包埋組織試料からその後のＰＣＲ増幅および検出に適当な核酸を抽出するために何ら困難なしに本発明を実施できるだろう。
【００２３】
本明細書中、時間に対して言及する時、「約」という語は、その時間限界値の±10％を指す。温度に対して言及する時、「約」という語は、±５℃を指す。
【００２４】
次の実施例は本発明の幾つかの態様を例証するために提供されるのであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００２５】
材料および方法：
パラフィン包埋組織
パラフィン包埋組織の分析用に、パラフィン塊から10ミクロン片を切り取り、そして1.5 mLの無菌スクリューキャップ付試験管に入れた。試料間の汚染を防止するために、新たなパラフィン塊毎に新しい刃を使った。各切片を切った後、圧縮空気の噴射により、刃とミクロトーム領域を清浄した。新しい木製アプリケーター棒を使って各切片を収容試験管に移した。
【００２６】
制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）変異分析
ＲＥＭＳ−ＰＣＲを使ってＫ−ras 遺伝子のコドン12の１番目と２番目の塩基の変異を検出した。各ＰＣＲ反応は３セットのプライマーを含んだ（表１）。診断プライマーは野性型ras 中にBstN-1制限部位を誘導するが、コドン12の変異は誘導しない。よって、ras 野性型ＤＮＡはＰＣＲ熱循環の間に選択的に開裂され、そしてコドン12のところのras 変異型配列が富化される。ＰＣＲ対照プライマーはＰＣＲ増幅可能ＤＮＡが抽出されることを確かめ、そして酵素対照プライマーは制限酵素が機能していることを確かめるために用いる。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲ用の反応混合物は、12単位／100 μL の組換えTaq ポリメラーゼ、0.842 μL のTaq 阻害抗体TP4-9.2 （５倍過剰）、10 mM HT50緩衝剤（100 mM NaCl および50 mM Tris-HCl, pH 8.3）、0.3 μM のプライマー 5BKITおよび3K2 、0.05μM のプライマー 5BK5, 3K6, 5BK28 および3K29、0.2 mM全ジヌクレオシド三リン酸（dNTPs ）、0.6 単位／μL のBstn1 （New England BioLabs, Beverly, MA）、１mMジチオスレイトール(DTT) 、４mM MgCl2、試料（典型的には３μL ）並びに最終容量100 μL までの脱イオン水を含んだ。典型的には、Taq ポリメラーゼと抗Taq 抗体を混合し、そして10〜15分間インキュベートした後、その他のＰＣＲ反応成分を添加した。Bstn1 制限酵素は、試料の添加の直前に最後に反応混合物に添加した。
【００２９】
上記反応混合物を、米国特許第5,089,233 号、同第5,229,297 号および同第5,380,489 号明細書に記載された核酸増幅および検出のためのオルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティドのパウチ収容システムを使って増幅しそして検出した。簡単に言えば、上述した通りに試料とＰＣＲ試薬を混合し、パウチの膨れ部分（ブリスター）に充填し、そしてパウチをシールした。ビオチン標識診断プライマー、ＰＣＲ対照プライマーおよび酵素対照プライマーを増幅に使った。「ＰＣＲ反応ブリスター」を94℃で１分間加熱し、次いで30サイクル増幅させた。各サイクルは、94℃の融解温度および10秒間のインキュベーションに続き、58℃で75秒間のアニーリングを含んだ。103 ℃で５分間の加熱後インキュベーションの後、反応生成物を検出チャンバーに通過させ、そこで反応生成物がビーズに取り付けた相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ体；表２）とハイブリダイズすることにより、増幅生成物を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）路および洗浄路は55℃であり、一方、検出路では40℃の温度を使った。ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびその後にＨＲＰ−色素基質を検出路に通過させた後、ハイブリダイズした生成物を検出した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
表２の各オリゴヌクレオチドの３′末端に、ポリスチレンビーズへの付着のために次の配列：５５７Ｔを有するリンカーを使用した。ここで塩基＃５はテトラエチレングリコール(TEG) スペーサーであり、そして塩基＃７はアミノジオールリンカー（ADリンカー）であり、そしてＴはチミジン配列である。
【００３２】
各パウチは３つの検出ブリスターを含み、各々が200 μL の液体を有した（ストレプトアビジン−ＨＲＰ 200μL ／ブリスター；洗浄溶液 200μL ／ブリスター；および色素／ゲル 200μL ／ブリスター）。ブリスターの順序はストレプトアビジンブリスター、次に洗浄溶液ブリスター、そして最後に色素／ゲルブリスターであった。
【００３３】
捕捉オリゴ体ビーズは次の順序でパウチ中に配置された（流れの方向で）：INC 26.7a , K-Cap 6M, 無スポット, K-CapD8, 無スポット, K-Cap2E およびINC 26.7a 。
【００３４】
実施例１：Pre-Taq 処理後、NaOHおよび加熱処理の有無のもとでのパラフィン包埋組織からのＤＮＡの抽出
この実施例では、異なる癌試料からの厚さ10ミクロンのパラフィン切片を次のように抽出した。ミクロトーム切断後、切片試料を1.5 mLのスクリューキャップ付超遠心管に入れた。80μL のＴＥＫ緩衝液（10 mM Tris-HCl緩衝剤, pH 8.0および0.5 ％Tween 20）を添加し、次いで10μL の耐熱性プロテアーゼＫ（Pre-Taq ）（0.3 単位／μL, Gibco/BRL Products, Gaithersburg, MD ）を添加した。試験管を100 ℃で５分間加熱した。まだ熱い状態で１セットの複製試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を新しい試験管に移し、分析まで４℃で冷蔵保存した。第二セットの複製試験管に、10μL の250 mM NaOH を加え、そして試験管をヒートブロック中で105 ℃で３分間加熱した。まだ熱い状態でその試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を取り出し、新しい試験管に移し、分析まで４℃で保存した。
【００３５】
各上澄液の５μL を１mLキュベットに添加し、そしてBeckman DU70型分光光度計上で260 nmの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。その結果を下の表３に与える。
【００３６】
【表３】
【００３７】
ここで調べた組織の各々について、NaOH処理を行った時のパラフィン片からはPre-Taq 処理だけのものと比較して、抽出されたＤＮＡ量に約２倍の増加が観察された。
【００３８】
各上澄液の４μL を、上述した「パウチアッセイ」におけるＲＥＭＳ−ＰＣＲに基づいて、コドン12のＫ−ras 変異の検出を目的としたＰＣＲ増幅にかけた。パウチ法での二重反復アッセイの結果を表４に与える。
【００３９】
【表４】
【００４０】
上記結果は、NaOH処理した膵臓組織切片からのＤＮＡ抽出についてのK-12 ras診断用目視評点が、NaOH処理しない対照と比較して、有意な増加を示す。NaOH処理した直腸結腸癌および肺癌切片においても、対照と比較して、わずかではあるが検出可能な評点の改善を示した。扁桃癌試料はNaOH処理をしてもしなくても強力な増幅（目視評点が６）を示した。
【００４１】
実施例２：プロテアーゼＫでの処理後、NaOH処理したまたは処理しないパラフィン包埋組織からのＤＮＡの抽出
この実験では、次のようにして４つの異なるパラフィン包埋結腸直腸片を処理した：ミクロトープ切断後、各切片を1.5 mLのスクリューキャップ付遠心管に入れた。87μL のＴＥＫ緩衝液を添加し、次いで３μL の耐熱性プロテアーゼＫ（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN ）を添加した。試験管をヒートブロック中で65℃で４時間インキュベートした。１セットの複製試験管を100 ℃で５分間ヒートブロック中に置き、そしてまだ熱い状態で14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を新しい試験管に移し、分析まで４℃で保存した。第二セットの複製試験管に、10μL の250 mM NaOH を加え、そして試験管をヒートブロック中で105 ℃で３分間加熱した。まだ熱い状態でその試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を取り出し、新しい試験管に移し、分析まで４℃で保存した。
【００４２】
上述したのと同様に分光光度測定した時、プロテアーゼＫ処理細胞を使った実験の結果は、対照に比較して、NaOHで処理した試料において抽出されるＤＮＡがわずかにしか増加しなかったことを示す。しかしながら、表６に示されるように、NaOHで処理した試料ではＰＣＲ対照プライマーを用いた増幅は強力であり、そしてNaOH処理段階を省略するとＰＣＲ対照プライマーによる増幅は全く検出されなかった。
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の抽出方法およびそのためのキットに関する。特に、本発明は組織試料およびパラフィン包埋組織試料から核酸を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的診断の分野では、遺伝病、癌および感染症の検出のために、核酸の増幅を含む分子技術の使用が増加してきている。しかしながら、そのような増幅技術を組織または他の重要な臨床試料に適用する際には、核酸調製物中に不純物が存在すると増幅感度や増幅効率を抑制または低下させることがある〔Wilson, I.G., Applied and Environmental Microbiology 63(10):3741-3751, 1997 〕。
【０００３】
古記録（archival）のパラフィン包埋病理学組織試料からのＤＮＡ抽出は、分子診断測定を患者の結果と関連づけることができる追想的研究において特に有用である。CrisanおよびMattson により指摘されたように（DNA and Cell Biology 12:455-464, 1993 ）、追想的ＤＮＡ分析の利点は多数あり、そして(i) ウイルス、細菌または原生動物の物質が病因の役割を果たすと疑われ、潜在的な疫学または予後の相関関係が導き出せるようになる、多数の病気経過の研究；(ii)様々なタイプの悪性に関連する内因性ＤＮＡ異常の研究；(iii) 遺伝病における遺伝したＤＮＡの研究；(iv)古記録試料の使用が、新鮮組織を必要とする予想的研究において可能であるよりも大きな患者研究グループを使用できるようにする、珍しい病気の追想的研究；および(v) 臨床結果が既に知られている場合、特定の病気の有無、形態学的診断またはタイプ、病期、予後、および治療に対する応答と相関関係がある可能性の研究、に適用することができる。
【０００４】
ＤＮＡの増幅について報告された方法は、ＤＮＡポリメラーゼの使用（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）、リガーゼの使用（リガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）または両方の使用（ＧＡＰ−ＬＣＲ）のいずれかに基づいている。それらの方法のうち、ＰＣＲが現在まで最も広く使われている。ＰＣＲは、適当な条件下でＤＮＡ重合剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイズせしめることを含んで成る。その結果は、数サイクルの増幅を通じたプライマー伸長生成物の形成、および元の標的配列の数の指数的増加である。ＰＣＲについての更なる詳細は、米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）明細書を調べることにより得ることができる。
【０００５】
固有の感受性のために、一般に試料間の生成物の持ち越しや汚染がＰＣＲおよび核酸増幅方法に伴う問題である。試料調製中の生成物の持ち越しは深刻な問題である。それは試料が外部環境に暴露される時間の量の関数であり、試料収容装置を開放することによって試料を外部環境に暴露しなければならない回数に関係する。よって、迅速であり且つ外部環境への試料の暴露を減少させるかまたは最小にする試料調製方法を提供することが有利である。特に、試料収容装置を開放しなけれならない回数が最小である核酸抽出方法を提供することが有利である。
【０００６】
多数のヒト癌腫においてras プロトオンコジーン中の点変異が高頻度で起こるので、それは潜在的に重要な診断の標的である（Bos, J.L., Cancer Res. 49:4682-4689, 1989 ）。例えば、膵癌の90％位がＫ-ras遺伝子中に変異を含み、大部分はコドン12において起こる（Almoguera 他, Cell 53:549-554, 1998 ）。ras 変異の存在を検出する方法は多数存在する。１つの方法として、制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）が最近記載されている（WO 96/32500 ）。ＲＥＭＳ−ＰＣＲはＰＣＲ熱循環の間に耐熱性制限酵素を使用することに基づく。ＲＥＭＳ−ＰＣＲは分析と検出を単純化し且つそれに要する時間を大幅に短縮する。
【０００７】
Volenandt 他により指摘されたように、抽出されるＤＮＡの量はＰＣＲ反応の収率に大きく影響を及ぼし得る（Polymerase Chain Reaction Analysis of DNA from Paraffin-Embedded Tissue. Methods in Molecular Biology Vol. 15: Current Methods and Applications, 1993, B.A. White 編, Humana Press Inc., N.J. ）。固定化組織からのＤＮＡを分析する時、添加する抽出試料の容量とＰＣＲ増幅収率との間に反比例関係がしばしば観察される。これは、或る種の固定剤およびTaq ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する他の阻害剤の影響によるものである。更に、固定またはＤＮＡ抽出中に起こる核酸の断片化も、ＤＮＡ増幅の際に問題となり得る（Greer 他, Am. J. Clin. Pathol. 95:117-124, 1991; Crisan 他, Clin. Biochem. 25:99-103, 1992）。
【０００８】
パラフィン組織片または新鮮組織片からのＤＮＡ抽出の場合、典型的には、複雑なＤＮＡ調製方法が用いられる。そのような方法は、ＤＮＡを遊離させそして核酸増幅を妨害し得るタンパク質を分解するために、界面活性剤の存在下でプロテアーゼ酵素と共に長時間インキュベートすることを必要とする。抽出されたＤＮＡの精製の際に行われるその後の別段階として、混入したＲＮＡを除去するためのＲＮアーゼによる処理に続き、タンパク質や他の細胞性物質を除去するためのエタノールのような溶媒またはフェノールとイソアミルアルコールのような溶媒混合物を使ったＤＮＡの沈澱、次いでＤＮＡの水和を含み得る（Volenandt 他, Polymerase Chain Reaction Analysis of DNA from Paraffin-Embedded Tissue. Methods in Molecular Biology Vol. 15: Current Methods and Applications, 1993, B.A. White 編, Humana Press Inc., N.J. ）。パラフィン包埋組織の場合、普通はプロテイナーゼ段階の前に多段階法においてキシレンのような溶媒を使って抽出することにより、パラフィンが除去される。Banerjee他による最近の報告は、パラフィン包埋組織からのＤＮＡ遊離のためのプロトコールを提供している（BioTechniques 18:768-773, 1995）。この方法は次の段階を含む：(1) マイクロウエーブ処理、(2) 遠心分離段階によるパラフィンの除去、(3) プロテイナーゼＫ消化、および(4) プロテアーゼＫ活性を失活させるための加熱段階。
【０００９】
Slebosと彼の仲間は、パラフィン包埋組織からＤＮＡを遊離させる方法であって、３つの10ミクロン切片を使用し、非イオン性界面活性剤と共にインキュベートし、そしてプロテイナーゼＫと共に18〜24時間インキュベートした後、遠心分離することを含んで成る方法を報告している（Diagnostic Molecular Pathology 1(2); 136-141, 1992）。結果として得られた上澄液はそのままＰＣＲ増幅に使われる。
【００１０】
プロテイナーゼＫとの長いインキュベーションの必要性および加熱不活性化段階の必要性を回避するために、ニュージーランド特許NZ 233270 の仮明細書は、細胞タンパク質を消化しそして核酸を遊離させるために、プロテイナーゼＫに代わるものとして耐熱性プロテイナーゼの使用を記載している。この方法は速さと使用容易性の改善を提供する。しかしながら、その方法では、パラフィン包埋組織から遊離される増幅可能なＤＮＡの量が限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、その後の増幅方法に適合する方法で、組織試料から迅速且つ高効率的に核酸を抽出する方法が当業界でまだ要望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上述の課題を解決し、且つその後の増幅方法に適合する方法で組織試料から核酸を抽出する方法を提供する。よって、本発明の目的は、組織試料およびパラフィン包埋組織試料から核酸を抽出する方法並びにそのためのキットを提供することである。
本発明の他の様々な目的および利点は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【００１３】
一態様では、本発明は、組織試料から核酸を抽出する方法に関する。この方法は、組織試料から核酸を遊離させるのに十分な条件下で、組織試料を緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触させることを含んで成る。次いでその試料をプロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時間に渡りアルカリ性ｐＨで加熱する。前記試料を遠心分離することにより、上澄液中に核酸が単離される。
本明細書中に言及される全ての刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抽出された核酸が既知技術を使ったその後の増幅および検出に適するように、組織試料から核酸を抽出する方法に関する。本発明を使って、新鮮な組織試料とパラフィン包埋組織試料の両方のヒト組織試料から、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を抽出することができる。本発明を使って核酸を抽出することができる組織の例としては、正常のおよび癌性の肺組織、結腸組織、膵臓組織、胸部組織、前立腺組織、血液および他の体液、並びに検出することができる核酸を含む細胞性物質が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明では、着目のＤＮＡを含むと思われる組織試料を、緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と同時にまたは連続的に接触せしめる。適当な常用の生物学的緩衝剤としては、ｐＨを約４〜約10、好ましくは約７〜約９で維持する１または複数の有機緩衝剤が挙げられる。有用な緩衝剤としては、非限定的に、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、トリシン、グリシン、トリス（TRIS）、リン酸塩および当業者に容易に明らかな他のものが挙げられる。使用する緩衝剤の量はｐＫａに依存し、そして所望のｐＨを維持するのに十分であるものである。
【００１６】
多数の非イオン性界面活性剤のいずれも本発明に使用できる。本発明において有用な界面活性剤の例としては、非限定的に、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコールエーテル、ペルフルオロアルキルポリオキシエチレン、フッ素化アルキルアルコキシレート、およびフッ素化アルキルエステル化合物が挙げられる。他の有用な界面活性剤の種類および各種類の例は、特に界面活性剤の標準参考文献であるMcCutcheon's Emulsfers and Detergents, 1986 North American Edition, McCutcheon Division Publishing Co., Glen Rock, NJ.を参考にすれば、当業者に容易に明白であろう。典型的な非イオン性界面活性剤は米国特許第5,231,015 号（Cummins 他）明細書中にも与えられており、その内容が参考として本明細書中に組み込まれる。非イオン性界面活性剤の組合せも本発明に用いることができる。
【００１７】
プロテアーゼ酵素は組織およびタンパク質を分解して核酸を遊離させるために用いられる。プロテアーゼは遊離したＤＮＡをより安定にするヌクレアーゼも分解し得る。好ましくは、プロテアーゼ酵素は耐熱性である。多種多様なプロテアーゼが本発明に使用することができ、その例としてはセリンプロテアーゼ（E.C. 3.4.21 、例えばトリプシンおよびキモトリプシン）、チオールプロテアーゼ（E.C. 2.4.22 、例えばパパイン、フィシン）、カルボキシプロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、E.C. 2.4.23 、例えばペプシン）、およびメタロプロテアーゼ（E.C. 2.4.24 、例えばサーモリシン、プロナーゼ）が挙げられる。温度、ｐＨ、イオン強度、および界面活性剤タイプの最適条件は、使用するプロテアーゼによって異なるだろう。好ましいプロテイナーゼとしては、プロテアーゼＫ〔E.C. 3.4.21.64、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）から〕、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）からのプロテアーゼ（P6911, Sigma Chemical Company, St. Louis）およびPRETAQが挙げられる。PRETAQは、Peek, K.他（Purification and characterization of thermostable proteinase, Eur. J. Biochem. 207:1035-1044, 1992）により記載されたように、テルムス（Thermus ）種RT41株から単離された非常に耐熱性のアルカリ性プロテアーゼである。この酵素は70℃で24時間後に全く活性の損失がなく、且つ室温で６か月以上も活性の損失がないと報告された非常に耐熱性の酵素である。PRETAQおよび同様の耐熱性酵素の使用は、75℃付近およびそれ以上の温度でパラフィンが融解することから、パラフィン組織からのＤＮＡの調製に有利である。よってそのような高度の耐熱性プロテアーゼの使用は、プロテアーゼ消化前にパラフィンを除去するための別個の溶媒抽出プロトコールを行う必要性を除去する。溶媒によるパラフィン除去方法は、上記に引用したVolkenandt他、Wright & Manos、およびGreer による参考文献中に記載されており、それはオクタンまたはキシレンを使った処理に続きエタノールもしくは他のアルコールまたはアセトンのような溶媒を使った処理という多段階処理の使用に基づいている。
【００１８】
試料はＤＮＡを遊離させるのに十分な条件下で緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触せしめられる。使用する条件は、使用する組織試料とプロテアーゼによって異なるだろうが、それは当業者により容易に決定することができる。例えば、PRETAQプロテアーゼを使う時、70℃〜100 ℃において、温度によって５分間〜３時間、試料を緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることができる。90℃〜100 ℃で10〜15分間が好ましい。プロテアーゼＫを使う場合、試料を30分〜24時間、緩衝剤、非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼと接触させることができる。30分〜60分間が好ましい。
【００１９】
次いでプロテアーゼを不活性化するのに十分な時間に渡りアルカリ性ｐＨで試料を加熱する。試料のｐＨは、アルカリ性ｐＨが得られるまで試料に水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを添加することにより調整することができる。次いで抽出された核酸を遠心分離により単離することができる。
【００２０】
本発明に開示される方法は多数の利点を有する。本発明の方法は迅速であり、潜在的に毒性の溶媒を使用する必要性をなくし、そして試料収容装置を開放しなければならない操作の回数を最小にする。加熱したアルカリでの処理段階を含めることは、多分二本鎖ＤＮＡを変性させそしてそれをＰＣＲで一層容易に増幅できる一本鎖ＤＮＡの小片に変えることにより、ＰＣＲ増幅を改善する。熱アルカリでの処理はプロテアーゼを変性させ、そのため残余のプロテアーゼ活性がその後の増幅に必要なTaq ポリメラーゼまたは他の酵素を阻害してしまうかもしれないという心配を取り除くと期待される。第三に、ＰＣＲ増幅を阻害することが知られている幾つかの化学物質（ヘパリン、ビリルビン、ヘモグロビン等）が熱アルカリ処理により変性されることも期待される。第四に、熱アルカリ処理は、或るＰＣＲ増幅プロトコールを妨害することがあるＲＮＡを破壊する。最後に、熱アルカリ処理はまた、脂質、脂肪酸および他の重要な細胞膜の可溶化をもたらすと期待されよう。この細胞膜の完全性の破壊は更に、細胞および組織から遊離されるＤＮＡを増加させると期待される。
【００２１】
本発明に従って組織試料から抽出される核酸は、当該技術分野で既知の方法（例えばＰＣＲやＬＣＲ）を使ったその後の増幅に適当である。ＰＣＲを使った核酸の増幅および検出のための一般原理および条件は十分に周知であり、その詳細は多数の刊行物、例えば米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）明細書に提供されている。それらの刊行物は全て参考として本明細書中に組み込まれる。好ましくは、ＰＣＲは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使って実施される。多数の適当な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において報告されており、例えば米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818 号（Gelfand 他）明細書中に詳細に記載されている。その両刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。ＰＣＲにおいて使用することができる他の試薬としては、例えば、増幅前に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを抑制する、該ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体が挙げられる。そのような抗体は米国特許第5,338,671 号（Scalice 他）明細書（その内容は参考として本明細書に組み込まれる）中に記載されたモノクローナル抗体により代表される。
【００２２】
増幅された核酸は、多数の既知方法、例えば米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）明細書に記載されたものにより検出することができる。例えば、増幅された核酸はサザンブロット法、ドットブロット技術、または標識プローブによる非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出法を使って検出することができる。あるいは、適当に標識されたプライマーを使って増幅を実施し、そして前記標識の検出のための手順および装置を使って増幅されたプライマー伸長生成物を検出することができる。よって、当該技術分野の技術と本明細書中に提供される特別な技術を考慮すれば、当業者は、新鮮組織試料またはパラフィン包埋組織試料からその後のＰＣＲ増幅および検出に適当な核酸を抽出するために何ら困難なしに本発明を実施できるだろう。
【００２３】
本明細書中、時間に対して言及する時、「約」という語は、その時間限界値の±10％を指す。温度に対して言及する時、「約」という語は、±５℃を指す。
【００２４】
次の実施例は本発明の幾つかの態様を例証するために提供されるのであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００２５】
材料および方法：
パラフィン包埋組織
パラフィン包埋組織の分析用に、パラフィン塊から10ミクロン片を切り取り、そして1.5 mLの無菌スクリューキャップ付試験管に入れた。試料間の汚染を防止するために、新たなパラフィン塊毎に新しい刃を使った。各切片を切った後、圧縮空気の噴射により、刃とミクロトーム領域を清浄した。新しい木製アプリケーター棒を使って各切片を収容試験管に移した。
【００２６】
制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）変異分析
ＲＥＭＳ−ＰＣＲを使ってＫ−ras 遺伝子のコドン12の１番目と２番目の塩基の変異を検出した。各ＰＣＲ反応は３セットのプライマーを含んだ（表１）。診断プライマーは野性型ras 中にBstN-1制限部位を誘導するが、コドン12の変異は誘導しない。よって、ras 野性型ＤＮＡはＰＣＲ熱循環の間に選択的に開裂され、そしてコドン12のところのras 変異型配列が富化される。ＰＣＲ対照プライマーはＰＣＲ増幅可能ＤＮＡが抽出されることを確かめ、そして酵素対照プライマーは制限酵素が機能していることを確かめるために用いる。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲ用の反応混合物は、12単位／100 μL の組換えTaq ポリメラーゼ、0.842 μL のTaq 阻害抗体TP4-9.2 （５倍過剰）、10 mM HT50緩衝剤（100 mM NaCl および50 mM Tris-HCl, pH 8.3）、0.3 μM のプライマー 5BKITおよび3K2 、0.05μM のプライマー 5BK5, 3K6, 5BK28 および3K29、0.2 mM全ジヌクレオシド三リン酸（dNTPs ）、0.6 単位／μL のBstn1 （New England BioLabs, Beverly, MA）、１mMジチオスレイトール(DTT) 、４mM MgCl2、試料（典型的には３μL ）並びに最終容量100 μL までの脱イオン水を含んだ。典型的には、Taq ポリメラーゼと抗Taq 抗体を混合し、そして10〜15分間インキュベートした後、その他のＰＣＲ反応成分を添加した。Bstn1 制限酵素は、試料の添加の直前に最後に反応混合物に添加した。
【００２９】
上記反応混合物を、米国特許第5,089,233 号、同第5,229,297 号および同第5,380,489 号明細書に記載された核酸増幅および検出のためのオルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティドのパウチ収容システムを使って増幅しそして検出した。簡単に言えば、上述した通りに試料とＰＣＲ試薬を混合し、パウチの膨れ部分（ブリスター）に充填し、そしてパウチをシールした。ビオチン標識診断プライマー、ＰＣＲ対照プライマーおよび酵素対照プライマーを増幅に使った。「ＰＣＲ反応ブリスター」を94℃で１分間加熱し、次いで30サイクル増幅させた。各サイクルは、94℃の融解温度および10秒間のインキュベーションに続き、58℃で75秒間のアニーリングを含んだ。103 ℃で５分間の加熱後インキュベーションの後、反応生成物を検出チャンバーに通過させ、そこで反応生成物がビーズに取り付けた相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ体；表２）とハイブリダイズすることにより、増幅生成物を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）路および洗浄路は55℃であり、一方、検出路では40℃の温度を使った。ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびその後にＨＲＰ−色素基質を検出路に通過させた後、ハイブリダイズした生成物を検出した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
表２の各オリゴヌクレオチドの３′末端に、ポリスチレンビーズへの付着のために次の配列：５５７Ｔを有するリンカーを使用した。ここで塩基＃５はテトラエチレングリコール(TEG) スペーサーであり、そして塩基＃７はアミノジオールリンカー（ADリンカー）であり、そしてＴはチミジン配列である。
【００３２】
各パウチは３つの検出ブリスターを含み、各々が200 μL の液体を有した（ストレプトアビジン−ＨＲＰ 200μL ／ブリスター；洗浄溶液 200μL ／ブリスター；および色素／ゲル 200μL ／ブリスター）。ブリスターの順序はストレプトアビジンブリスター、次に洗浄溶液ブリスター、そして最後に色素／ゲルブリスターであった。
【００３３】
捕捉オリゴ体ビーズは次の順序でパウチ中に配置された（流れの方向で）：INC 26.7a , K-Cap 6M, 無スポット, K-CapD8, 無スポット, K-Cap2E およびINC 26.7a 。
【００３４】
実施例１：Pre-Taq 処理後、NaOHおよび加熱処理の有無のもとでのパラフィン包埋組織からのＤＮＡの抽出
この実施例では、異なる癌試料からの厚さ10ミクロンのパラフィン切片を次のように抽出した。ミクロトーム切断後、切片試料を1.5 mLのスクリューキャップ付超遠心管に入れた。80μL のＴＥＫ緩衝液（10 mM Tris-HCl緩衝剤, pH 8.0および0.5 ％Tween 20）を添加し、次いで10μL の耐熱性プロテアーゼＫ（Pre-Taq ）（0.3 単位／μL, Gibco/BRL Products, Gaithersburg, MD ）を添加した。試験管を100 ℃で５分間加熱した。まだ熱い状態で１セットの複製試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を新しい試験管に移し、分析まで４℃で冷蔵保存した。第二セットの複製試験管に、10μL の250 mM NaOH を加え、そして試験管をヒートブロック中で105 ℃で３分間加熱した。まだ熱い状態でその試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を取り出し、新しい試験管に移し、分析まで４℃で保存した。
【００３５】
各上澄液の５μL を１mLキュベットに添加し、そしてBeckman DU70型分光光度計上で260 nmの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。その結果を下の表３に与える。
【００３６】
【表３】
【００３７】
ここで調べた組織の各々について、NaOH処理を行った時のパラフィン片からはPre-Taq 処理だけのものと比較して、抽出されたＤＮＡ量に約２倍の増加が観察された。
【００３８】
各上澄液の４μL を、上述した「パウチアッセイ」におけるＲＥＭＳ−ＰＣＲに基づいて、コドン12のＫ−ras 変異の検出を目的としたＰＣＲ増幅にかけた。パウチ法での二重反復アッセイの結果を表４に与える。
【００３９】
【表４】
【００４０】
上記結果は、NaOH処理した膵臓組織切片からのＤＮＡ抽出についてのK-12 ras診断用目視評点が、NaOH処理しない対照と比較して、有意な増加を示す。NaOH処理した直腸結腸癌および肺癌切片においても、対照と比較して、わずかではあるが検出可能な評点の改善を示した。扁桃癌試料はNaOH処理をしてもしなくても強力な増幅（目視評点が６）を示した。
【００４１】
実施例２：プロテアーゼＫでの処理後、NaOH処理したまたは処理しないパラフィン包埋組織からのＤＮＡの抽出
この実験では、次のようにして４つの異なるパラフィン包埋結腸直腸片を処理した：ミクロトープ切断後、各切片を1.5 mLのスクリューキャップ付遠心管に入れた。87μL のＴＥＫ緩衝液を添加し、次いで３μL の耐熱性プロテアーゼＫ（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN ）を添加した。試験管をヒートブロック中で65℃で４時間インキュベートした。１セットの複製試験管を100 ℃で５分間ヒートブロック中に置き、そしてまだ熱い状態で14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を新しい試験管に移し、分析まで４℃で保存した。第二セットの複製試験管に、10μL の250 mM NaOH を加え、そして試験管をヒートブロック中で105 ℃で３分間加熱した。まだ熱い状態でその試験管を14,000 rpmで２分間遠心分離し、そしてパラフィン層の下の上澄液を取り出し、新しい試験管に移し、分析まで４℃で保存した。
【００４２】
上述したのと同様に分光光度測定した時、プロテアーゼＫ処理細胞を使った実験の結果は、対照に比較して、NaOHで処理した試料において抽出されるＤＮＡがわずかにしか増加しなかったことを示す。しかしながら、表６に示されるように、NaOHで処理した試料ではＰＣＲ対照プライマーを用いた増幅は強力であり、そしてNaOH処理段階を省略するとＰＣＲ対照プライマーによる増幅は全く検出されなかった。
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料から核酸を抽出する方法であって、前記試料から前記核酸を遊離させるのに十分な条件下で、前記試料を緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触させ；
前記プロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時間に渡り、アルカリ性ｐＨで前記試料を加熱し；そして
前記試料を遠心分離して上澄液中に前記核酸を単離する
ことを含んで成る方法。
【請求項１】
組織試料から核酸を抽出する方法であって、前記試料から前記核酸を遊離させるのに十分な条件下で、前記試料を緩衝剤、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤およびプロテアーゼ酵素と接触させ；
前記プロテアーゼ酵素を不活性化するのに十分な時間に渡り、アルカリ性ｐＨで前記試料を加熱し；そして
前記試料を遠心分離して上澄液中に前記核酸を単離する
ことを含んで成る方法。
【公開番号】特開２０１０−２５９４４３（Ｐ２０１０−２５９４４３Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１６６１１７（Ｐ２０１０−１６６１１７）
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【分割の表示】特願平１１−１１９３１７の分割
【原出願日】平成１１年４月２７日（１９９９．４．２７）
【出願人】（５９４１９９３３７）オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６６１１７（Ｐ２０１０−１６６１１７）
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【分割の表示】特願平１１−１１９３１７の分割
【原出願日】平成１１年４月２７日（１９９９．４．２７）
【出願人】（５９４１９９３３７）オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド (14)
【Ｆターム（参考）】
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