経口免疫寛容を誘導するペプチド組成物及びその製造方法
【課題】Ｂ細胞反応性を除去し、少量の抗原で長期に免疫寛容を誘導できるＴ細胞反応性を有し、ヒトにおいて牛乳アレルギーなどの治療・予防に供することのできる物質を提供する。
【解決手段】牛乳由来のたんぱく質をたんぱく質加水分解酵素で処理することにより得られる、特定のアミノ酸配列を有するペプチド組成物は、Ｂ細胞反応性が低く、かつ免疫寛容を誘導するために重要なＴ細胞反応性を有する。
【解決手段】牛乳由来のたんぱく質をたんぱく質加水分解酵素で処理することにより得られる、特定のアミノ酸配列を有するペプチド組成物は、Ｂ細胞反応性が低く、かつ免疫寛容を誘導するために重要なＴ細胞反応性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物及びその製造方法に関する。さらには、このペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤に関する。本発明のペプチド組成物は特定のアミノ酸配列を有し、牛乳アレルギー等の治療・予防に有用な経口免疫寛容を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
一般に生体は異種（非自己）抗原に対しては免疫反応を示すが、自己を構成する抗原に対しては免疫反応を示さない。一方で、本来は異種抗原であっても免疫反応を示さない場合があり、これを免疫寛容と呼んでいる。特に、経口摂取して腸管を経由して体内に吸収された抗原に関しては、その応答性が著しく低下することが知られており、これを経口免疫寛容と呼んでいる。この経口免疫寛容の作用機序として、現在、クローナルアナジー、クローナルデリーション、アクティブサプレッションという3つの制御機構が働いていると考えられている。クローナルアナジーとは、免疫細胞が抗原に対して不応答化することを指し、アナジー状態になるリンパ球はCD4＋T細胞であることが示されている（非特許文献１参照）。また、クローナルデリーションは抗原に反応するT細胞がアポトーシスを起こして消失する現象である。そして、アクティブサプレッションとは抗炎症性サイトカインであるIL‐10を産生する調節性T細胞が大きな役割を果たしていることが知られている（非特許文献２参照）。このように、T細胞を中心とした制御機構により経口免疫寛容が成立しているため、健常者においては牛乳を摂取しても生体に不利益な免疫反応は惹起されない。しかし、牛乳アレルギー患者においては経口免疫寛容が成立しておらず、牛乳を摂取した後に腸管より吸収され、牛乳たんぱく質がB細胞より放出されるＩgＥと結合し、肥満細胞上に架橋・結合する。その後、肥満細胞からIL‐4等のケミカルメディエーターが放出され、じんましんやアナフィラキシーショック等のアレルギー症状が励起され、死に至る場合もある。
【０００３】
そこで、経口免疫寛容を誘導することによって牛乳アレルギーを予防・治療しようとする試みがなされており、牛乳アレルギーの発症予防にたんぱく質加水分解物を利用したものが開示されている（特許文献１および２参照）。また、薬剤を用いて牛乳たんぱく質を修飾し、免疫細胞の応答性を変化させる試みもなされている（非特許文献３参照）。
【０００４】
しかし、経口免疫寛容を誘導するにはいくつかの問題点がある。まず、経口免疫寛容を誘導する対象の多くは牛乳アレルギー患者であるため、前述の様にアレルギーの引き金となるB細胞反応性が残存していると、アナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こし死に至る場合もある。よって、B細胞反応性が消失していること、もしくは低減されていることが望ましい。さらに、ヒトを対象に経口免疫寛容を誘導する場合に薬品や化学合成したペプチドを用いると、安全性に問題があるうえに非常に高価になってしまうという欠点がある。
【０００５】
次に、特許文献１の様に経口免疫寛容を誘導したとする報告においては通常マウスを用いて実験を行っている。しかし、経口免疫寛容の誘導されやすさに関しては動物の種類によって差があると言われており、特にマウスやラット等のげっ歯類は誘導されやすいとされている。特に、前述の様に経口免疫寛容の成立にはT細胞が非常に重要な役割を果たしているが、T細胞の認識する部位に関してはマウスの系統によってさえ異なることが報告されている（非特許文献４及び５参照）。よって、マウスにおいて経口免疫寛容が誘導されてもヒトで誘導されるとは限らないため、ヒトにおけるT細胞反応性が証明されなければ経口免疫寛容が誘導されたとは言えない。また、従来技術では、高い効果のペプチドの調製方法が不十分であり、特許文献１では分画する分子量が10,000と高く、B細胞反応性も高い。さらに、特許文献２では、T細胞反応性を有する特定のアミノ酸配列の確認については一切検討されていない。
【０００６】
そこで、B細胞反応性を限りなく低減させ、一方でT細胞反応性を有し、より効率的にヒトに対する経口免疫寛容を誘導できるペプチドの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平5−5000号公報
【特許文献２】特開平7−101873号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hirahara, K. et al., J.Immunol.,（1995）
【非特許文献２】清野 宏:医学のあゆみ（2002）
【非特許文献３】Kobayashi, K. et al., Bioconjug. Chem.,（2003）
【非特許文献４】Tsuji, N.M. et al.,Immunol. Lett.,（1993）
【非特許文献５】Totsuka, M. et al.,Cytotechnology, （1997）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、IgEを介してアナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こすB細胞反応性を除去し、少量の抗原で長期に免疫寛容を誘導できるT細胞反応性を有し、ヒトにおいて牛乳アレルギー等の治療・予防に供することのできるペプチド組成物及びその調製法を確立し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、まず牛乳中に含まれるたんぱく質のアレルゲン性を比較した。その結果、牛乳中にはα、β、κ、γ‐カゼイン、α‐ラクトアルブミン及びβ‐ラクトグロブリンなどの各種たんぱく質が存在しているが、β‐ラクトグロブリンの抗原性が最も高く、さらに牛乳アレルギー患者における反応性も高いことが明らかになった。そこで、牛乳中の主要なアレルゲンであるβ‐ラクトグロブリンの全アミノ酸配列を網羅するような合成ペプチドを作製し、ヒトT細胞エピトープの同定を試みた。その結果、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐117番目までの配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu；以下ペプチド2という）を主要なヒトT細胞エピトープとして同定した。そして、この情報に基づき、牛乳由来のたんぱく質をたんぱく質加水分解酵素による分解処理ならびに限外ろ過膜による分画処理方法を鋭意検討し、B細胞反応性が低く、かつ免疫寛容を誘導するために重要なT細胞反応性を有するペプチドの開発に成功した。
【００１１】
本発明のペプチドを得るには、牛乳由来のたんぱく質を基質として、これにたんぱく質加水分解酵素を加えて、所定のpH、温度で必要時間加水分解する。
例えば、β‐ラクトグロブリンWPC水溶液にエンド型酵素を加え、基質濃度0.5〜15%、pH7〜8、温度40〜50℃、1時間〜6時間の範囲において処理する。さらに、より抗原性の高い高分子物質を除去するために平均分画分子量が10,000、5,000または1,000等の限外ろ過膜を用いて精製する事が望ましい。なお限外ろ過膜では、その膜材質や条件により分画できる分子量サイズが表示されている分画分子量サイズと前後することもあるため、平均分画分子量とし分子量サイズの異なる限外ろ過膜を組み合わせて使用することも可能である。さらには、組成物中のペプチドは、これら限界ろ過膜を組み合わせて用いて分子量1,000以上、5,000以下に分画された状態がより望ましい。
【００１２】
このようにして得られたペプチドは、牛乳アレルギー患者T細胞において上述した97‐117番目の合成ペプチド（ペプチド2）と同程度の反応性を示したことから、組成物中のT細胞エピトープの残存という観点から網羅的に解析した結果、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の102‐124番目までの配列（Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg ［式２］；以下ペプチド3という）の全て及び/または一部、ならびに106‐122番目に相当するアミノ酸配列（Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu［式３］；以下ペプチド4という）の全て及び/または一部を含むペプチドを同定した。
よって、合成ペプチド及び今回得られたペプチド組成物の結果から、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg［式１］；以下ペプチド1という）の全て及び/または一部を含むことが重要である可能性が示された。
【発明の効果】
【００１３】
乳幼児に見られる食物アレルギーの原因のひとつとして、食品たんぱく質の一部が消化酵素の分解を受けずに腸管から吸収され、生体免疫系を刺激することが指摘されている。この点に関して、本発明のペプチド組成物はその平均分子量が非常に低いため、もとの未分解の乳たんぱく質の有する抗原性は非常に低減されており、牛乳アレルギー患者の治療に用いることができる。一方、本ペプチド組成物は経口免疫寛容誘導能に関しては非常に高いため、生体の有する潜在的なアレルギー防御機構を十分に活性化できる。
したがって、本発明のペプチド組成物は新しいアレルギー低減化及び予防と治療を目的とした食品素材あるいは経口免疫寛容誘導剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いてBLGのアミノ酸配列の97‐117番目に相当するアミノ酸配列の合成ペプチド（ペプチド2）でT細胞の細胞増殖性を評価した図である（実施例１）。
【図２】ペプチド3含有組成物ならびにペプチド4含有組成物について、牛乳アレルギー患者から得たT細胞反応性をインターフェロンγ産生量にて評価した図である（実施例１、実施例２；試験例１）。
【図３】ペプチド3含有組成物ならびにペプチド4含有組成物について、牛乳アレルギー患者から得たT細胞反応性をリンパ球刺激性試験にて評価した図である（実施例１、実施例２；試験例１）。
【図４】ペプチド4含有組成物ならびに合成ペプチド（ペプチド2）について、牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いて細胞増殖性を評価した図である（実施例１、実施例２；試験例２）。
【図５】ペプチド3含有組成物について、アナフィラキシーショックなど即時型のアレルギー症状を引き起こす可能性のあるB細胞反応性を競合エライザ法にて評価した図である（実施例１；試験例３）。
【図６】ペプチド4含有組成物について、アナフィラキシーショックなど即時型のアレルギー症状を引き起こす可能性のあるB細胞反応性を競合エライザ法にて評価した図である（実施例２、実施例３；試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るペプチドの原料には牛乳たんぱく質を用いるが、特に、β‐ラクトグロブリンを高含有する乳清たんぱく質濃縮物（Whey Protein Concentrate:WPC）又は乳清たんぱく質分離物（Whey Protein Isolate:WPI）が好ましく、さらに、これらのたんぱく質は、より純度が高いものが望ましい。
【００１６】
本発明においては、上述した牛乳由来たんぱく質をたんぱく質加水分解酵素で処理し、低分子ペプチド化する。
たんぱく質加水分解酵素は、ペプチド結合を加水分解する酵素を広く指し、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチターゼ等を広く包含するものであり、植物由来、動物由来、微生物由来の各酵素が存在しているが、本発明に用いる酵素はエンド型酵素、特にトリプシン、キモトリプシン及びアルカリ性プロテアーゼが好ましい。
【００１７】
本発明を実施するには、牛乳由来のたんぱく質を基質としてこれにたんぱく質加水分解酵素を加えて、所定のpH、温度で必要時間加水分解する。
例えば、β‐ラクトグロブリンWPC水溶液にエンド型酵素を加え、基質濃度0.5〜15％、pH7〜8、温度40〜50℃、1時間〜6時間の範囲において処理する。さらに、より抗原性の高い高分子物質を除去するために分子量が10,000、5,000または1,000の限外ろ過膜を用いて精製する事が望ましい。なお限外ろ過膜では、その膜材質や条件により分画できる分子量サイズが表示されている分画分子量サイズと前後することもあるため、平均分画分子量とし分子量サイズの異なる限外ろ過膜を組み合わせて使用することも可能である。さらには、組成物中のペプチドは、これら限界ろ過膜を組み合わせて用いて分子量1,000以上、5,000以下に分画された状態がより望ましい
【００１８】
このようにして得られたペプチドは、牛乳アレルギー患者T細胞において上述した97‐117番目の合成ペプチド（ペプチド2）と同程度の反応性を示したことから、T細胞エピトープの残存という観点から網羅的に解析した結果、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の102‐124番目までの配列（［式２］；ペプチド3）の全て及び/または一部を含むペプチドを同定した。よって、合成ペプチド及び今回得られたペプチド組成物の結果から、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（［式１］；ペプチド1）の全て及び/または一部を含む事が重要であることが示唆された。
【００１９】
以上の結果から、この酵素分解ペプチド組成物は、B細胞反応性が低減しているため抗原性が低く、かつ免疫寛容誘導能は未分解の牛乳由来たんぱく質と同等に優れており、さらにペプチド態であるために耐熱性等の加工特性に優れているため、新規のアレルギー予防・治療食品素材として、単独又は清涼飲料水、ミネラルウォーター、茶などの各種飲料、クッキー、ビスケット、煎餅等の菓子類、または育児用調製粉乳、パン、ゼリー、口腔清涼菓子などの食品とともに自由に使用することができる。
【００２０】
また、本発明に係る酵素分解ペプチド組成物は、後述するようにヒトのT細胞反応性を有し、経口免疫寛容誘導能に優れているため、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、溶液剤など所望する剤型に製剤化して経口投与剤として経口免疫寛容誘導及び／またはそのための補助的処置として用いることができる。本発明に係る分解ペプチド組成物は、本来食品として用いることができるものであるため安全性に問題は無く、その用量も適宜で良い。
【００２１】
以下に実施例および試験例を示し、さらに本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
β‐ラクトグロブリン（以下BLGと略す）全配列を網羅するように、様々な配列の合成ペプチドを作製した。得られた合成ペプチドについて、牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いて細胞増殖性を評価した。その結果、BLGのアミノ酸配列の97‐117番目に相当するアミノ酸配列 Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu（ペプチド2）のペプチドでT細胞の反応性が認められた（図１）。
ペプチド2画分を含むペプチド組成物を得るために、BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）5gをイオン交換水1000mlに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）100 mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の102‐124番目に相当するアミノ酸配列 Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg（［式２］；ペプチド3）のペプチドが確認された。
【実施例２】
【００２３】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）5gをイオン交換水1000mlに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）100 mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の106‐122番目に相当するアミノ酸配列 Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu（［式３］；ペプチド4）のペプチドが確認された。
【実施例３】
【００２４】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）5gをイオン交換水1000mlに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）100mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。平均分画分子量10,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg［式１］；ペプチド１）の全て及び/または一部を含むペプチドが確認された。
【実施例４】
【００２５】
BLG‐WPI（たんぱく質含量87%、ダビスコ社）5gをイオン交換水100 mlに溶解し、基質濃度5.0%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）100 mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（［式１］；ペプチド１）の全て及び/または一部を含むペプチドが確認された。
【実施例５】
【００２６】
BLG‐WPI（たんぱく質含量87%、ダビスコ社）75gをイオン交換水500 mlに溶解し、基質濃度15.0%とした。50mMリン酸緩衝液にてpH7に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit /mg以下）150mg添加し酵素基質比0.2%とし、50℃、1時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量10,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例６】
【００２７】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）2.5 kgをイオン交換水500 Lに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化カリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）5g添加し酵素基質比0.2%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例７】
【００２８】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）2.5 kgをイオン交換水500 Lに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化カリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）50g添加し酵素基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例８】
【００２９】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）50tをイオン交換水500kLに溶解し、基質濃度10.0%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）100kgを添加し酵素基質比0.2%とし、50℃、5時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例９】
【００３０】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）25 kgをイオン交換水1kLに溶解し、基質濃度2.5%とした。水酸化カリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）500g添加し酵素基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得て、さらに平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例１０】
【００３１】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）25 kgをイオン交換水1kLに溶解し、基質濃度2.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）50g添加し酵素基質比0.2%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得て、さらに平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【００３２】
［試験例１］
実施例１で得られたペプチド3含有組成物ならびに実施例２で得られたペプチド4含有組成物について、免疫寛容誘導効果を調べるためアレルギー患者から得たT細胞反応性をインターフェロンγ産生量およびリンパ球刺激試験にて評価した。その結果を、インターフェロンγ産生量の結果を図2に、リンパ球刺激性の結果を図3に示す。
インターフェロンγ産生量、リンパ球刺激性のいずれについても、基質のBLGと同様なT細胞反応性を示し、免疫寛容誘導効果が認められた。
【００３３】
［試験例２］
実施例２で得られたペプチド4含有組成物ならびに実施例１で得られた合成ペプチドのペプチド2について、牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いて細胞増殖性を評価した。その結果を図4に示す。
ペプチド4含有組成物は、ペプチド2と同様なT細胞の反応性が認められた。
【００３４】
［試験例３］
実施例１で得られたペプチド3含有組成物ならびに、実施例２および実施例３で得られたペプチド4含有組成物について、アナフィラキシーショックなど即時型のアレルギー症状を引き起こす可能性のあるB細胞反応性を競合エライザ法にて評価した。その結果を図5、6に示す。
B細胞反応性は、ペプチド3含有ならびにペプチド4含有のいずれの組成物ともに分解反応前の基質のBLGに比べて反応性の減弱が認められた。
【００３５】
以上の結果から、実施例１で得られたペプチド（［式２］；ペプチド3）含有組成物、実施例２および実施例３で得られたペプチド（［式３］；ペプチド4）含有組成物は、いずれも、T細胞反応性を保持し、B細胞反応性が減弱することで、ヒトに対する経口免疫寛容を誘導するという優れた性質を有することが明らかになった。また、BLGのアミノ酸配列の97‐124番目に相当するアミノ酸配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐ Cys‐Leu‐Val‐Arg［式１］；ペプチド1）の全て及び/または一部を含むペプチド組成物についても、T細胞反応性を保持し、B細胞反応性が減弱することで、ヒトに対する経口免疫寛容を誘導するという優れた性質を有することが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物及びその製造方法に関する。さらには、このペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤に関する。本発明のペプチド組成物は特定のアミノ酸配列を有し、牛乳アレルギー等の治療・予防に有用な経口免疫寛容を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
一般に生体は異種（非自己）抗原に対しては免疫反応を示すが、自己を構成する抗原に対しては免疫反応を示さない。一方で、本来は異種抗原であっても免疫反応を示さない場合があり、これを免疫寛容と呼んでいる。特に、経口摂取して腸管を経由して体内に吸収された抗原に関しては、その応答性が著しく低下することが知られており、これを経口免疫寛容と呼んでいる。この経口免疫寛容の作用機序として、現在、クローナルアナジー、クローナルデリーション、アクティブサプレッションという3つの制御機構が働いていると考えられている。クローナルアナジーとは、免疫細胞が抗原に対して不応答化することを指し、アナジー状態になるリンパ球はCD4＋T細胞であることが示されている（非特許文献１参照）。また、クローナルデリーションは抗原に反応するT細胞がアポトーシスを起こして消失する現象である。そして、アクティブサプレッションとは抗炎症性サイトカインであるIL‐10を産生する調節性T細胞が大きな役割を果たしていることが知られている（非特許文献２参照）。このように、T細胞を中心とした制御機構により経口免疫寛容が成立しているため、健常者においては牛乳を摂取しても生体に不利益な免疫反応は惹起されない。しかし、牛乳アレルギー患者においては経口免疫寛容が成立しておらず、牛乳を摂取した後に腸管より吸収され、牛乳たんぱく質がB細胞より放出されるＩgＥと結合し、肥満細胞上に架橋・結合する。その後、肥満細胞からIL‐4等のケミカルメディエーターが放出され、じんましんやアナフィラキシーショック等のアレルギー症状が励起され、死に至る場合もある。
【０００３】
そこで、経口免疫寛容を誘導することによって牛乳アレルギーを予防・治療しようとする試みがなされており、牛乳アレルギーの発症予防にたんぱく質加水分解物を利用したものが開示されている（特許文献１および２参照）。また、薬剤を用いて牛乳たんぱく質を修飾し、免疫細胞の応答性を変化させる試みもなされている（非特許文献３参照）。
【０００４】
しかし、経口免疫寛容を誘導するにはいくつかの問題点がある。まず、経口免疫寛容を誘導する対象の多くは牛乳アレルギー患者であるため、前述の様にアレルギーの引き金となるB細胞反応性が残存していると、アナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こし死に至る場合もある。よって、B細胞反応性が消失していること、もしくは低減されていることが望ましい。さらに、ヒトを対象に経口免疫寛容を誘導する場合に薬品や化学合成したペプチドを用いると、安全性に問題があるうえに非常に高価になってしまうという欠点がある。
【０００５】
次に、特許文献１の様に経口免疫寛容を誘導したとする報告においては通常マウスを用いて実験を行っている。しかし、経口免疫寛容の誘導されやすさに関しては動物の種類によって差があると言われており、特にマウスやラット等のげっ歯類は誘導されやすいとされている。特に、前述の様に経口免疫寛容の成立にはT細胞が非常に重要な役割を果たしているが、T細胞の認識する部位に関してはマウスの系統によってさえ異なることが報告されている（非特許文献４及び５参照）。よって、マウスにおいて経口免疫寛容が誘導されてもヒトで誘導されるとは限らないため、ヒトにおけるT細胞反応性が証明されなければ経口免疫寛容が誘導されたとは言えない。また、従来技術では、高い効果のペプチドの調製方法が不十分であり、特許文献１では分画する分子量が10,000と高く、B細胞反応性も高い。さらに、特許文献２では、T細胞反応性を有する特定のアミノ酸配列の確認については一切検討されていない。
【０００６】
そこで、B細胞反応性を限りなく低減させ、一方でT細胞反応性を有し、より効率的にヒトに対する経口免疫寛容を誘導できるペプチドの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平5−5000号公報
【特許文献２】特開平7−101873号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hirahara, K. et al., J.Immunol.,（1995）
【非特許文献２】清野 宏:医学のあゆみ（2002）
【非特許文献３】Kobayashi, K. et al., Bioconjug. Chem.,（2003）
【非特許文献４】Tsuji, N.M. et al.,Immunol. Lett.,（1993）
【非特許文献５】Totsuka, M. et al.,Cytotechnology, （1997）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、IgEを介してアナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こすB細胞反応性を除去し、少量の抗原で長期に免疫寛容を誘導できるT細胞反応性を有し、ヒトにおいて牛乳アレルギー等の治療・予防に供することのできるペプチド組成物及びその調製法を確立し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、まず牛乳中に含まれるたんぱく質のアレルゲン性を比較した。その結果、牛乳中にはα、β、κ、γ‐カゼイン、α‐ラクトアルブミン及びβ‐ラクトグロブリンなどの各種たんぱく質が存在しているが、β‐ラクトグロブリンの抗原性が最も高く、さらに牛乳アレルギー患者における反応性も高いことが明らかになった。そこで、牛乳中の主要なアレルゲンであるβ‐ラクトグロブリンの全アミノ酸配列を網羅するような合成ペプチドを作製し、ヒトT細胞エピトープの同定を試みた。その結果、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐117番目までの配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu；以下ペプチド2という）を主要なヒトT細胞エピトープとして同定した。そして、この情報に基づき、牛乳由来のたんぱく質をたんぱく質加水分解酵素による分解処理ならびに限外ろ過膜による分画処理方法を鋭意検討し、B細胞反応性が低く、かつ免疫寛容を誘導するために重要なT細胞反応性を有するペプチドの開発に成功した。
【００１１】
本発明のペプチドを得るには、牛乳由来のたんぱく質を基質として、これにたんぱく質加水分解酵素を加えて、所定のpH、温度で必要時間加水分解する。
例えば、β‐ラクトグロブリンWPC水溶液にエンド型酵素を加え、基質濃度0.5〜15%、pH7〜8、温度40〜50℃、1時間〜6時間の範囲において処理する。さらに、より抗原性の高い高分子物質を除去するために平均分画分子量が10,000、5,000または1,000等の限外ろ過膜を用いて精製する事が望ましい。なお限外ろ過膜では、その膜材質や条件により分画できる分子量サイズが表示されている分画分子量サイズと前後することもあるため、平均分画分子量とし分子量サイズの異なる限外ろ過膜を組み合わせて使用することも可能である。さらには、組成物中のペプチドは、これら限界ろ過膜を組み合わせて用いて分子量1,000以上、5,000以下に分画された状態がより望ましい。
【００１２】
このようにして得られたペプチドは、牛乳アレルギー患者T細胞において上述した97‐117番目の合成ペプチド（ペプチド2）と同程度の反応性を示したことから、組成物中のT細胞エピトープの残存という観点から網羅的に解析した結果、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の102‐124番目までの配列（Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg ［式２］；以下ペプチド3という）の全て及び/または一部、ならびに106‐122番目に相当するアミノ酸配列（Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu［式３］；以下ペプチド4という）の全て及び/または一部を含むペプチドを同定した。
よって、合成ペプチド及び今回得られたペプチド組成物の結果から、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg［式１］；以下ペプチド1という）の全て及び/または一部を含むことが重要である可能性が示された。
【発明の効果】
【００１３】
乳幼児に見られる食物アレルギーの原因のひとつとして、食品たんぱく質の一部が消化酵素の分解を受けずに腸管から吸収され、生体免疫系を刺激することが指摘されている。この点に関して、本発明のペプチド組成物はその平均分子量が非常に低いため、もとの未分解の乳たんぱく質の有する抗原性は非常に低減されており、牛乳アレルギー患者の治療に用いることができる。一方、本ペプチド組成物は経口免疫寛容誘導能に関しては非常に高いため、生体の有する潜在的なアレルギー防御機構を十分に活性化できる。
したがって、本発明のペプチド組成物は新しいアレルギー低減化及び予防と治療を目的とした食品素材あるいは経口免疫寛容誘導剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いてBLGのアミノ酸配列の97‐117番目に相当するアミノ酸配列の合成ペプチド（ペプチド2）でT細胞の細胞増殖性を評価した図である（実施例１）。
【図２】ペプチド3含有組成物ならびにペプチド4含有組成物について、牛乳アレルギー患者から得たT細胞反応性をインターフェロンγ産生量にて評価した図である（実施例１、実施例２；試験例１）。
【図３】ペプチド3含有組成物ならびにペプチド4含有組成物について、牛乳アレルギー患者から得たT細胞反応性をリンパ球刺激性試験にて評価した図である（実施例１、実施例２；試験例１）。
【図４】ペプチド4含有組成物ならびに合成ペプチド（ペプチド2）について、牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いて細胞増殖性を評価した図である（実施例１、実施例２；試験例２）。
【図５】ペプチド3含有組成物について、アナフィラキシーショックなど即時型のアレルギー症状を引き起こす可能性のあるB細胞反応性を競合エライザ法にて評価した図である（実施例１；試験例３）。
【図６】ペプチド4含有組成物について、アナフィラキシーショックなど即時型のアレルギー症状を引き起こす可能性のあるB細胞反応性を競合エライザ法にて評価した図である（実施例２、実施例３；試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るペプチドの原料には牛乳たんぱく質を用いるが、特に、β‐ラクトグロブリンを高含有する乳清たんぱく質濃縮物（Whey Protein Concentrate:WPC）又は乳清たんぱく質分離物（Whey Protein Isolate:WPI）が好ましく、さらに、これらのたんぱく質は、より純度が高いものが望ましい。
【００１６】
本発明においては、上述した牛乳由来たんぱく質をたんぱく質加水分解酵素で処理し、低分子ペプチド化する。
たんぱく質加水分解酵素は、ペプチド結合を加水分解する酵素を広く指し、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチターゼ等を広く包含するものであり、植物由来、動物由来、微生物由来の各酵素が存在しているが、本発明に用いる酵素はエンド型酵素、特にトリプシン、キモトリプシン及びアルカリ性プロテアーゼが好ましい。
【００１７】
本発明を実施するには、牛乳由来のたんぱく質を基質としてこれにたんぱく質加水分解酵素を加えて、所定のpH、温度で必要時間加水分解する。
例えば、β‐ラクトグロブリンWPC水溶液にエンド型酵素を加え、基質濃度0.5〜15％、pH7〜8、温度40〜50℃、1時間〜6時間の範囲において処理する。さらに、より抗原性の高い高分子物質を除去するために分子量が10,000、5,000または1,000の限外ろ過膜を用いて精製する事が望ましい。なお限外ろ過膜では、その膜材質や条件により分画できる分子量サイズが表示されている分画分子量サイズと前後することもあるため、平均分画分子量とし分子量サイズの異なる限外ろ過膜を組み合わせて使用することも可能である。さらには、組成物中のペプチドは、これら限界ろ過膜を組み合わせて用いて分子量1,000以上、5,000以下に分画された状態がより望ましい
【００１８】
このようにして得られたペプチドは、牛乳アレルギー患者T細胞において上述した97‐117番目の合成ペプチド（ペプチド2）と同程度の反応性を示したことから、T細胞エピトープの残存という観点から網羅的に解析した結果、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の102‐124番目までの配列（［式２］；ペプチド3）の全て及び/または一部を含むペプチドを同定した。よって、合成ペプチド及び今回得られたペプチド組成物の結果から、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（［式１］；ペプチド1）の全て及び/または一部を含む事が重要であることが示唆された。
【００１９】
以上の結果から、この酵素分解ペプチド組成物は、B細胞反応性が低減しているため抗原性が低く、かつ免疫寛容誘導能は未分解の牛乳由来たんぱく質と同等に優れており、さらにペプチド態であるために耐熱性等の加工特性に優れているため、新規のアレルギー予防・治療食品素材として、単独又は清涼飲料水、ミネラルウォーター、茶などの各種飲料、クッキー、ビスケット、煎餅等の菓子類、または育児用調製粉乳、パン、ゼリー、口腔清涼菓子などの食品とともに自由に使用することができる。
【００２０】
また、本発明に係る酵素分解ペプチド組成物は、後述するようにヒトのT細胞反応性を有し、経口免疫寛容誘導能に優れているため、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、溶液剤など所望する剤型に製剤化して経口投与剤として経口免疫寛容誘導及び／またはそのための補助的処置として用いることができる。本発明に係る分解ペプチド組成物は、本来食品として用いることができるものであるため安全性に問題は無く、その用量も適宜で良い。
【００２１】
以下に実施例および試験例を示し、さらに本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
β‐ラクトグロブリン（以下BLGと略す）全配列を網羅するように、様々な配列の合成ペプチドを作製した。得られた合成ペプチドについて、牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いて細胞増殖性を評価した。その結果、BLGのアミノ酸配列の97‐117番目に相当するアミノ酸配列 Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu（ペプチド2）のペプチドでT細胞の反応性が認められた（図１）。
ペプチド2画分を含むペプチド組成物を得るために、BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）5gをイオン交換水1000mlに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）100 mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の102‐124番目に相当するアミノ酸配列 Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg（［式２］；ペプチド3）のペプチドが確認された。
【実施例２】
【００２３】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）5gをイオン交換水1000mlに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）100 mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の106‐122番目に相当するアミノ酸配列 Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu（［式３］；ペプチド4）のペプチドが確認された。
【実施例３】
【００２４】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）5gをイオン交換水1000mlに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）100mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。平均分画分子量10,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg［式１］；ペプチド１）の全て及び/または一部を含むペプチドが確認された。
【実施例４】
【００２５】
BLG‐WPI（たんぱく質含量87%、ダビスコ社）5gをイオン交換水100 mlに溶解し、基質濃度5.0%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）100 mg添加し酵素/基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列（［式１］；ペプチド１）の全て及び/または一部を含むペプチドが確認された。
【実施例５】
【００２６】
BLG‐WPI（たんぱく質含量87%、ダビスコ社）75gをイオン交換水500 mlに溶解し、基質濃度15.0%とした。50mMリン酸緩衝液にてpH7に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit /mg以下）150mg添加し酵素基質比0.2%とし、50℃、1時間、酵素反応させた。反応終了後、100℃、10分間煮沸し、酵素活性を失活させ、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量10,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例６】
【００２７】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）2.5 kgをイオン交換水500 Lに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化カリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）5g添加し酵素基質比0.2%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例７】
【００２８】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）2.5 kgをイオン交換水500 Lに溶解し、基質濃度0.5%とした。水酸化カリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）50g添加し酵素基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画し透過物を得た。さらに、その透過物を平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例８】
【００２９】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）50tをイオン交換水500kLに溶解し、基質濃度10.0%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）100kgを添加し酵素基質比0.2%とし、50℃、5時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例９】
【００３０】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）25 kgをイオン交換水1kLに溶解し、基質濃度2.5%とした。水酸化カリウムにてpH8に調整した後、トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性1,200 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性300 USP Unit/mg以下）500g添加し酵素基質比2.0%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得て、さらに平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【実施例１０】
【００３１】
BLG‐WPC（たんぱく質含量80%、ドモ社）25 kgをイオン交換水1kLに溶解し、基質濃度2.5%とした。水酸化ナトリウムにてpH8に調整した後、精製トリプシン（豚膵臓由来、トリプシン活性4,500 USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性50 USP Unit/mg以下）50g添加し酵素基質比0.2%とし、40℃、6時間、酵素反応させた。反応終了後、120℃、3秒間加熱し、酵素活性の失活及び殺菌し、酵素分解ペプチド組成物を得た。その後、平均分画分子量5,000の限外ろ過膜にて分画して透過物を得て、さらに平均分画分子量1,000の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。ペプチド組成物中には、β‐ラクトグロブリン全162アミノ酸配列中の97‐124番目の配列の全て及び/または一部を含むペプチド（［式１］；ペプチド１）が確認された。
【００３２】
［試験例１］
実施例１で得られたペプチド3含有組成物ならびに実施例２で得られたペプチド4含有組成物について、免疫寛容誘導効果を調べるためアレルギー患者から得たT細胞反応性をインターフェロンγ産生量およびリンパ球刺激試験にて評価した。その結果を、インターフェロンγ産生量の結果を図2に、リンパ球刺激性の結果を図3に示す。
インターフェロンγ産生量、リンパ球刺激性のいずれについても、基質のBLGと同様なT細胞反応性を示し、免疫寛容誘導効果が認められた。
【００３３】
［試験例２］
実施例２で得られたペプチド4含有組成物ならびに実施例１で得られた合成ペプチドのペプチド2について、牛乳アレルギー患者の血清より樹立したT細胞クローンを用いて細胞増殖性を評価した。その結果を図4に示す。
ペプチド4含有組成物は、ペプチド2と同様なT細胞の反応性が認められた。
【００３４】
［試験例３］
実施例１で得られたペプチド3含有組成物ならびに、実施例２および実施例３で得られたペプチド4含有組成物について、アナフィラキシーショックなど即時型のアレルギー症状を引き起こす可能性のあるB細胞反応性を競合エライザ法にて評価した。その結果を図5、6に示す。
B細胞反応性は、ペプチド3含有ならびにペプチド4含有のいずれの組成物ともに分解反応前の基質のBLGに比べて反応性の減弱が認められた。
【００３５】
以上の結果から、実施例１で得られたペプチド（［式２］；ペプチド3）含有組成物、実施例２および実施例３で得られたペプチド（［式３］；ペプチド4）含有組成物は、いずれも、T細胞反応性を保持し、B細胞反応性が減弱することで、ヒトに対する経口免疫寛容を誘導するという優れた性質を有することが明らかになった。また、BLGのアミノ酸配列の97‐124番目に相当するアミノ酸配列（Thr‐Asp‐Tyr‐Lys‐Lys‐Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐ Cys‐Leu‐Val‐Arg［式１］；ペプチド1）の全て及び/または一部を含むペプチド組成物についても、T細胞反応性を保持し、B細胞反応性が減弱することで、ヒトに対する経口免疫寛容を誘導するという優れた性質を有することが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の［式２］で表されるアミノ酸配列のペプチドであって、経口免疫寛容誘導能を有するペプチドを有効成分とするペプチド組成物。
Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg ［式２］
【請求項２】
次の［式３］で表されるアミノ酸配列のペプチドであって、経口免疫寛容誘導能を有するペプチドを有効成分とするペプチド組成物。
Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu ［式３］
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載のペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤。
【請求項４】
牛乳由来のβ‐ラクトグロブリンを、トリプシン活性４,５００USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性５０USP Unit/mg以下のたんぱく質分解酵素で分解し、分子量５,０００の限外ろ過膜で処理し、透過物として得ることを特徴とする請求項１に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の製造方法。
【請求項５】
牛乳由来のβ‐ラクトグロブリンを、トリプシン活性４,５００USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性５０USP Unit/mg以下のたんぱく質分解酵素で分解し、分子量５,０００の限外ろ過膜で処理し、透過物として得ることを特徴とする請求項１に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載のペプチド組成物を分子量１,０００の限外ろ過膜で処理し、その残渣物として得ることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の製造方法。
【請求項１】
次の［式２］で表されるアミノ酸配列のペプチドであって、経口免疫寛容誘導能を有するペプチドを有効成分とするペプチド組成物。
Tyr‐Leu‐Leu‐Phe‐Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu‐Val‐Arg ［式２］
【請求項２】
次の［式３］で表されるアミノ酸配列のペプチドであって、経口免疫寛容誘導能を有するペプチドを有効成分とするペプチド組成物。
Cys‐Met‐Glu‐Asn‐Ser‐Ala‐Glu‐Pro‐Glu‐Gln‐Ser‐Leu‐Val‐Cys‐Gln‐Cys‐Leu ［式３］
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載のペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤。
【請求項４】
牛乳由来のβ‐ラクトグロブリンを、トリプシン活性４,５００USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性５０USP Unit/mg以下のたんぱく質分解酵素で分解し、分子量５,０００の限外ろ過膜で処理し、透過物として得ることを特徴とする請求項１に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の製造方法。
【請求項５】
牛乳由来のβ‐ラクトグロブリンを、トリプシン活性４,５００USP Unit/mg以上、キモトリプシン活性５０USP Unit/mg以下のたんぱく質分解酵素で分解し、分子量５,０００の限外ろ過膜で処理し、透過物として得ることを特徴とする請求項１に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載のペプチド組成物を分子量１,０００の限外ろ過膜で処理し、その残渣物として得ることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２４６２９３（Ｐ２０１２−２４６２９３Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５３６６３（Ｐ２０１２−１５３６６３）
【出願日】平成２４年７月９日（２０１２．７．９）
【分割の表示】特願２００７−２９６２２（Ｐ２００７−２９６２２）の分割
【原出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０７０４２６４８）ビーンスターク・スノー株式会社 (6)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月９日（２０１２．７．９）
【分割の表示】特願２００７−２９６２２（Ｐ２００７−２９６２２）の分割
【原出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０７０４２６４８）ビーンスターク・スノー株式会社 (6)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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