結合分子
【課題】親和性成熟を受ける機能性重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの製造及びその使用、クラス特異的重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの製造及びその使用並びに抗体重鎖の機能、好ましくは抗体重鎖の結合機能、定常領域のエフェクター活性及び任意選択的に追加のエフェクター機能を有する多価ポリペプチド複合体の製造及び使用、抗原の投与に応答してトランスジェニックマウス中に十分に機能性の重鎖のみ抗体を生成させる方法、特に、任意のクラス又は混合したクラスのヒトの抗原特異的で高アフィニティの重鎖のみ抗体の生成方法及び十分に機能性のＶＨ抗原結合ドメインの単離と発現を提供する。
【解決手段】異種のＶＨ重鎖遺伝子座を発現し、軽鎖を含む内因性抗体産生能力を低減されたトランスジェニック哺乳類を、抗原により免疫する、ＶＨ重鎖のみ抗体を製造する。
【解決手段】異種のＶＨ重鎖遺伝子座を発現し、軽鎖を含む内因性抗体産生能力を低減されたトランスジェニック哺乳類を、抗原により免疫する、ＶＨ重鎖のみ抗体を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性成熟による機能性重鎖のみ抗体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ−ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の多様なレパートリーの製造及びその使用に関する。また本発明はクラス特異的重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの製造と使用、並びに抗体重鎖の機能、好ましくは抗体重鎖の結合機能、定常領域のエフェクター活性及び任意選択的に追加のエフェクター機能を有する多価ポリペプチド複合体の製造と使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、抗原の投与に応答して十分に機能性の重鎖のみ抗体をトランスジェニックマウス中で生成させる方法に関する。特に本発明は、任意のクラス又は混合したクラスのヒトの抗原に特異的で高親和性の重鎖のみ抗体を生成させ、十分に機能性のＶＨ抗原結合ドメインを単離し発現させる方法に関する。
【０００３】
本発明はまた、重鎖の機能、好ましくは重鎖のエフェクター活性及び他の結合機能とエフェクター機能を含む多価ポリペプチド複合体の生成に関する。
【０００４】
本発明の方法を使用することによって生成した重鎖のみ抗体と他の多価結合複合体及びそれらの使用についても述べる。
【背景技術】
【０００５】
モノクローナル抗体又はその異型は、２１世紀に送り出される新薬の高い比率を占めるであろう。モノクローナル抗体療法は、リウマチ様関節炎やクローン病を治療するのに好ましい方法としてすでに容認されており、癌の治療に目覚しく進出している。また心臓血管疾患や感染症を治療するための抗体ベースの製品も開発中である。市販されている大部分のモノクローナル抗体の製品は、標的のリガンド（例えばＴＮＦα）の単一の明確なエピトープを認識してこれと結合する。治療用のヒトモノクローナル抗体は、依然として、哺乳類の細胞を培養する方法で製造されている。二つの重鎖と二つの軽鎖からなる複合体（Ｈ２Ｌ２複合体）の会合と、それに続く翻訳後グリコシル化を行なう工程が、細菌系を使用することを妨げている。哺乳類細胞の培養によって抗体を製造するための製造コストと資本コストは高額なので、容認できる代替手段がないと抗体ベースの治療の可能性を制限してしまう恐れがある。各種のトランスジェニック生物は、十分な機能を有する抗体を発現できる。これらの生物としては植物、昆虫、鶏、ヤギ及びウシがあるが、市販の治療用製品を製造するのに今まで使われていない。
【０００６】
機能性抗体のフラグメントは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で製造できるが、一般に、その製品は、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されないと、製造工程中、血清安定性が低い。
【０００７】
二重特異性抗体の複合体は、同じ又は異なる抗原の二つの異なるエピトープに結合できる遺伝子工学的に処理されたＩｇベースの分子である。抗体を単独で又は他の結合因子と組み合わせて取り入れている二重特異性結合タンパク質は、獲得されたヒトの免疫機能が、治療効果、例えば病原体の排除（Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７９，６６１−６６９；Ｔａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２，４９３４−４９４０；米国特許第５，４８７，８９０号）、癌の治療（Ｇｌｅｎｎｉｅ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｋｅｌ ，（２００３）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，８，５０３−５１００）、及び免疫療法（Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１，３９１−３９７；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８，１−６；Ｌｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，１１９４−１２０１）を引き出す治療法の将来性を示している。
【０００８】
二重特異性抗体の製品が二つ以上のＨ２Ｌ2複合体に基づいていると、製造上の問題が悪化する。例えば、重鎖と軽鎖の遺伝子の二つ以上の組合せが共発現すると、１０種類もの組合わせが生じてそのうち一種類だけが所望のヘテロ二量体であることがある（Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，２１０−２２８）。
【０００９】
この問題を解決するため、重鎖エフェクターの機能を保持している二重特異性ＩｇＧ全長（ＢｓＩｇＧ）を哺乳類の細胞中で産生させる多くの方法が開発されている。ＢｓＩｇＧは、ヘテロ二量体が生成するのを避けるため遺伝子工学的に処理された「ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ」重鎖を必要とし、かつＬ鎖の誤対合を回避するため同じＬ鎖を利用する（Ｃａｒｔｅｒ，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８，７−１５）。化学的に架橋する代替法としては、各々異なる抗原を認識する抗体フラグメントから複合体を製造する方法（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３８，１９０−２００）又は他の結合タンパク質、例えばコレクチン類を抗体フラグメントに架橋させる方法（Ｔａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２，４９３４−４９４０）が記述されている。
【００１０】
一般に重鎖のエフェクター機能を欠いているダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）又はミニ抗体（ＢｓＡｂ）の開発によってもヘテロ二量体の重複が克服されている。これらの抗体は、ＶＨ結合部位とＶＬ結合部位を持つ最小一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、その結合部位はその後折り畳まれてニ量体になり、その抗体の標的抗原各々に対して一価である二価の二重特異性抗体を生成する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ，９０，６４４４−６４４８；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２２，２５９−２６４）。場合によっては、ＣＨ１ドメインとＬ定常ドメインが、二重特異性ミニ抗体を生成するためのヘテロ二量体化ドメインとして使用されている（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９−２６４）。ＢｓＡｂを製造するため、大腸菌発現系に基づいた各種組換え法が開発されているが（Ｈｕｄｓｏｎ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，５４８−５５７）、臨床グレードの多価抗体物質の製造コストと製造規模が依然として臨床的開発に対して主な障害になっている（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８，１−６）。
【００１１】
最近、ＢｓＡｂの概念が拡大されて、Ｈ鎖とＬ鎖のＶＨドメインとＶＬドメインが遺伝子工学的に処理されたｓｃＦｖ結合ドメインで置換されたジ−ダイアボディ（Ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）すなわち四価の二重特異性抗体が含まれる。このような構造体は、遺伝子工学的に処理することは複雑であるが、ヘテロ二量体の重複無しで、培養中の哺乳類細胞中で会合できる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７９，２１９−２３２）。
【００１２】
免疫グロブリンの構造は当分野では周知である。大部分の天然免疫グロブリンは二つの重鎖と二つの軽鎖を含む。これらの重鎖は、各重鎖に沿ってそのほぼ中央に位置するヒンジドメインの間のジスルフィド結合によって互いに連結されている。軽鎖は、上記ヒンジドメインのＮ末端側の各重鎖と会合している。各軽鎖は通常、上記ヒンジドメインの近くのジスルフィド結合によって、それぞれの重鎖に結合している。
【００１３】
Ｉｇ分子が正しく折りたたまれると、各鎖は、より線状のポリペプチド配列によって連結された多数の別個の球状ドメインになる。例えば、軽鎖は折りたたまれて可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）になる。重鎖は、軽鎖の可変ドメインに隣接する単一の可変ドメインＶＨ、第一定常ドメイン、ヒンジドメイン及び二つ又は三つのさらなる定常ドメインを有する。重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）は相互に作用して抗原結合領域（Ｆｖ）を生成する。一般に、ＶＨとＶＬの両者は、抗原と結合するために必要であるが、重鎖の二量体とアミノ末端フラグメントは、軽鎖無しで活性を保持していることが分かっている（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。
【００１４】
新しい分子生物学の技術の出現によって、重鎖のみ抗体（軽鎖が欠落している）が、ヒト及びネズミモデル系のＢ細胞増殖性障害（重鎖病）に存在することが確認された。重鎖病を分子レベルで分析した結果、ゲノムのレベルでの突然変異と欠失が重鎖ＣＨ１ドメインの不適切な発現を起こして、軽鎖と結合する性能が欠けている重鎖のみ抗体の発現を生じることが分かった（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０４，７６１−７６７；Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ／Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４，１２７０−１２７７参照）。
【００１５】
ファージのライブラリーから誘導して単離されたヒトＶＨドメインに関する別の研究は、ＶＨドメインの抗原特異的結合を証明したが、これらのＶＨドメインは溶解性が低いことが証明された。さらに、ファージのアレイにディスプレイされた特異的結合特性を有するヒトＶＨドメインを選択すると、遺伝子工学的に処理された抗体の基本構造を形成できることが示唆された（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６）。
【００１６】
他の脊椎動物の種を使用した研究は、ラクダ類が、自然遺伝子突然変異の結果、ＣＨ１軽鎖結合領域が無いため軽鎖に結合できない機能性ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の重鎖のみ二量体を生成すること（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３，４４６−４４８）及びサメなどの種が、恐らく哺乳類のＴ細胞受容体又は免疫グロブリンの軽鎖に類縁の重鎖のみ様結合タンパク質ファミリーを生成すること（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５，１７７０−１７７３）を示した。ラクダの重鎖のみ抗体の特性を決定する特徴は、ラクダＶＨドメインがヒトＶＨドメインと比べて溶解度が改善されていることである。ヒトＶＨは、遺伝子工学的に処理して溶解度の特性を改善できるであろうし（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（６），５３１−５３７；Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８参照）又は溶解度はインビボで自然選択で獲得されうる（Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２４７７４−２４７８０参照）。しかし、ＶＨ結合ドメインがファージライブラリーから誘導されると、抗原に対する固有親和力は、例えばアフィニティーホットスポットランダマイゼーション（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｏｔ ｓｐｏｔ ｒａｎｄｏｍｉｓａｔｉｏｎ）を含む親和力改善法を適用しても低マイクロモル〜高ナノモルの範囲内に留まっている（Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９７，２１３−２２４）。
【００１７】
また、ラクダのＶＨ抗体は修飾されたＣＤＲ３ループが特徴である。このＣＤＲ３ループは、平均して、非ラクダ抗体に見られるものより長く、抗原の親和力と特異性の全体に対して大きく影響すると考えられる特徴であり、ラクダの重鎖のみ抗体の種にＶＬドメインが無いことを補償している（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３，８０３−８１１；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３，２５−２８）。
【００１８】
ラクダの抗体に関する最近の構造研究は、抗体の多様性が、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え事象と体細胞変異によるインビボ成熟プロセスによりほとんど推進されることを示唆している（Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１４），１４１１４−１４１２１）。
【００１９】
最近、トランスジェニック哺乳類で重鎖のみ抗体を製造する方法が開発された（ＷＯ０２／０８５９４５及びＷＯ０２／０８５９４４参照）。任意の哺乳類（ヒトを含む）から誘導される任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＥ）の機能性重鎖のみ抗体は、抗原を投与することによってトランスジェニック哺乳類（好ましくはマウス）から製造できる。
【００２０】
通常の免疫グロブリン重鎖の遺伝子座は、複数のＶ遺伝子のセグメント、多数のＤ遺伝子のセグメント及び多数のＪ遺伝子のセグメントを含む。各Ｖ遺伝子セグメントは、ＶドメインのＮ末端からほとんどＣ末端までをコードしている。各ＶドメインのＣ末端は、一つのＤ遺伝子のセグメントと一つのＪ遺伝子のセグメントでコードされている。ＶＤＪがＢ細胞中で再構成し、続いて親和性成熟して、ＶＬ結合ドメインとともに抗原を認識する部位すなわち抗原と結合する部位を形成する、ＶH結合ドメインを提供する。重鎖のＣＨ１領域及び軽鎖のκ領域もしくはλ領域によって、重鎖と軽鎖が相互に作用し易くなる。
【００２１】
重鎖のみ抗体を製造するため、生殖細胞系の重鎖遺伝子座は、予定される定常領域のいくらか又は全体をコードする遺伝子セグメントを含む。成熟過程で、再構成したＶＨ結合ドメインは、ＣＨ２定常領域をコードするセグメント中にスプライスされて、ＣＨ１ドメインを欠いた重鎖をコードする再構成遺伝子を提供し、その結果免疫グロブリンの軽鎖と会合できなくなる。
【００２２】
重鎖のみモノクローナル抗体は、標準のクローン化技術で脾臓のＢ細胞から又はファージディスプレイ法でＢ細胞のｍＲＮＡから回収できる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６）。ラクダ又はトランスジェニック動物から誘導される重鎖のみ抗体は高い親和力を有する。通常のＨ２Ｌ２四量体の配列を分析した結果は、多様性が、主として、ＶＤＪの再構成及び体細胞の超変異の組合わせから生じることを示している（Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３，３７−４５）。発現された重鎖のみｍＲＮＡの配列を分析した結果は、ラクダで産生されようと又はトランスジェニック動物で産生されようとも、上記観察結果を支持している（Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，１４１１４−１４１２１）。
【００２３】
天然のラクダ及びヒトのＶＨ領域の重要な共通の特徴は、各領域がモノマーとして結合し、ＶＬ領域との二量体化に依存せずに最適の溶解度と結合親和力が得られることである。これらの特徴は、特にブロッキング剤や組織浸透剤を製造するのに適していることはすでに知られている。
【００２４】
ホモ二量体又はヘテロ二量体は、重鎖のみ抗体を酵素で切断することで又は合成法で製造することもできる（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５及び米国特許願公開第２００３／００５８０７４ Ａ１号）。しかし、抗体のモノマー結合ドメインの利点は、やはり、多量体タンパク質を、試薬、治療剤及び診断剤として設計するときに有効に利用すべきである。
【００２５】
ファージディスプレイ法で製造されるヒトＶＨ又はラクダＶＨＨは、体細胞の突然変異並びに通常の抗体結合部位のＣＤＲ３領域におけるＤとＪの領域組換えによって提供される追加の多様性（Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３，３７−４５）によって改善される特性の利点を欠いている。ラクダのＶＨＨはヒトのＶＨと比べて溶解度の利点を示しているが、ヒトにおいては抗原性なのでラクダを免疫することによって又はファージディスプレイ法によって製造しなければならない。
【００２６】
ＶＨ結合ドメインを取り込むことは、特異性と結合力を失う可能性を伴ってＶＨドメインとＶＬドメインとから遺伝子工学的に製造しなければならないｓｃＦｖを使用するより明らかに有利である。Ｔ細胞などの類縁遺伝子ファミリー又はサメ免疫グロブリンのファミリーから誘導されるＶＨ結合ドメインも、二重又は多重の特異性結合分子を製造するためのｓｃＦｖの代替物を提供する。他の天然産の結合タンパク質及びそのドメイン、例えば可溶性受容体のフラグメントも使用されてもよい。
【００２７】
抗体のクラスはその生理学的機能が異なっている。例えば、ＩｇＧは成熟免疫応答に主要な役割を演じている。ＩｇＭは補体の結合と凝集に関与している。ＩｇＡは分泌物すなわち涙液、唾液、初乳、粘液におけるＩｇの主要クラスであるので、局所免疫で役割を演じている。多価結合複合体を遺伝子工学的に製造するときにクラス特異的な重鎖定常領域を含むことにより、必要な機能に応じて、インビボでエフェクター機能の治療利益を提供する。個々のエフェクター領域を遺伝子工学的に処理して、機能を付加したり又は削除できる（Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（２００１）Ａｕｇ ５（４），３６８−３７４）。親和力の高いＶＨ結合ドメインを含む重鎖のみ抗体を最適に製造し選択することは（その起源がヒト、ラクダ又はその外の起源であろうとも）、代替方法からインビボでの組換えと親和性成熟を促進しない無作為化ファージライブラリーからの選択による方法にまで利益を与えると思われる。
【００２８】
したがって、ＩｇＡの定常ドメインの機能を含むと、病原体に対する粘膜の機能が改善され（Ｌｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．，６９，７５−８４）、一方ＩｇＧ１の定常領域の機能が存在すると、インビボでの血清安定性が向上する。重鎖のＣＨ２とＣＨ３の定常ドメインが存在すると、天然の抗体類に見られるような安定な二量体化のための基盤を提供し、かつ翻訳後グリコシル化のための認識部位を提供する。ＣＨ２とＣＨ３の存在は、二重特異性で多価の複合体が試薬及び診断剤として使用されるとき、二次抗体の認識をも可能にする。
【００２９】
単離されて予め再構成されたラクダの重鎖のみ可変領域の配列は、ヒンジ領域とヒトＩｇＧ１エフェクタードメインの前に予めクローン化され、ベクター中に挿入され、ＣＯＳ細胞中で発現されて抗体を生成する。このインビトロの環境で発現された抗体は、ラクダ中のインビボでクラス（イソタイプ）のスイッチングと親和性成熟（超変異）のプロセスをすでに受けており、抗原に結合できる（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８）。
【００３０】
当分野では、重鎖のみ抗体の多様性とインビボでのＢ細胞応答性を最大にして、特に、多様な臨床、産業及び研究の用途で使用するために、最大の抗原結合能力を保持するクラス特異的ヒト重鎖のみ抗体及び機能性ＶＨ重鎖のみ結合ドメインの機能レパートリーを製造することが依然として要求されている。
【００３１】
また、当分野では、抗体の重鎖の少なくとも一部、抗体重鎖単独、又はこれを生理学的に安定でエフェクター機能を有するエフェクター（軽）鎖と組み合わせて含む、可溶性の二価又は多価のポリペプチド結合複合体を製造することも依然として要求されている。
【発明の概要】
【００３２】
本発明は、ＣＨ１ドメインをコードしていない重鎖定常領域を含み、そして発現されると、定義された単一又は複数のクラスの重鎖のみ抗体を産生できる異種のＶＨ重鎖遺伝子座又はラクダＶＨ（ＶＨＨ）重鎖遺伝子座をトランスジェニック哺乳類内で発現させるステップを含む、トランスジェニック哺乳類内でＶＨ重鎖のみ抗体又はラクダＶＨ（ＶＨＨ）重鎖のみ抗体を製造する方法を提供する。
【００３３】
ＶＨ重鎖遺伝子座又はラクダＶＨ（ＶＨＨ）重鎖遺伝子座は、一つ以上のラクダＶ遺伝子セグメント又は非ラクダＶ遺伝子セグメントを含んでもよい。このＶ遺伝子セグメントは、改善された溶解度特性を示すように選択するか又は遺伝子工学的に処理されることが好ましい。そのＶ遺伝子セグメントはヒト由来であるのが好ましい。
【００３４】
重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、Ｃα１及び／又はＣα２、Ｃε、Ｃδ、Ｃγ及び／又はＣμの重鎖定常領域遺伝子を含んでもよい。さらに、重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、以下の重鎖定常領域：Ｃα１、Ｃα２、Ｃε、Ｃδ、Ｃγ、Ｃμのうちの二つ以上を含んでもよい。
【００３５】
好ましくは、ＶＨ重鎖遺伝子座は、少なくとも一つのヒトもしくはラクダのＶ遺伝子セグメント、少なくとも一つのＤセグメント及び少なくとも一つのＪセグメントを含む可変領域を含み、そのヒトもしくはラクダのＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントは組み替えてＶＤＪコーディング配列を形成させることができる。重鎖遺伝子座は、好ましくは２０個以上のＤ遺伝子セグメント及び／又は５個以上のＪ遺伝子セグメントを含む。好ましくは、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、脊椎動物、好ましくはヒトが起源のものである。ＣＤＲ３ループは、任意の脊椎動物由来のＤ及びＪの遺伝子セグメントを使って作られることができ、ヒトのＤ及びＪ遺伝子セグメントが好ましい。
【００３６】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、Ｊ遺伝子セグメントを重鎖定常領域遺伝子と直接組換えることができる組換え配列（ｒｓｓ）を含んでもよい。
【００３７】
異種重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、起源がヒト又は脊椎動物例えばラクダのものである。あるいは、その定常領域は、免疫グロブリン重鎖が起源でないものでもよい。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法によってほぼ正常のＢ細胞が成熟する。本発明は、本発明の方法で得られるか得ることができる重鎖のみ抗体もしくはそのフラグメント又は重鎖のみ抗体のクラスの混合物を提供する。この重鎖のみ抗体は、モノクローナル抗体又はそのフラグメント、例えばヒトもしくはラクダのＶＨ結合ドメインなどでもよい。本発明のＶＨ結合ドメインは、長く伸びたラクダ様ＣＤＲ３ループを欠いていてもよく、あるいは長く伸びたラクダ様ＣＤＲ３ループを含んでもよい。
【００３９】
本発明は、本発明の異種重鎖遺伝子座を含むベクター及びこのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００４０】
また本発明は、本明細書に記載されている異種の重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニック哺乳類も提供する。好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む抗体を産生する能力が低い。
【００４１】
本発明は、免疫療法用の薬剤を調製における本発明の重鎖のみ抗体又はそのフラグメントの使用も提供する。本発明の重鎖のみ抗体は、診断剤、試薬、抗体酵素又は阻害剤として使用することもできる。本発明はまた、本発明の重鎖のみ抗体もしくはそのフラグメント及び薬理学的に適正な担体を含む医薬組成物も提供する。
【００４２】
本発明は、
（ａ）抗原を、本明細書に記載したようなトランスジェニック哺乳類に注射するステップと、
（ｂ）目的とする抗原特異的の重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞又は組織からハイブリドーマを産生するステップと、
（ｄ）前記ハイブリドーマ由来の重鎖のみ抗体ｍＲＮＡを、次に哺乳類、植物、昆虫、微生物、真菌又は代替の系などの異種発現系中に産生させるため、任意選択的にクローン化するステップと
を含む重鎖のみ抗体を産生させて選択する方法を提供する。
【００４３】
次いで、ＶＨ結合ドメインを、ステップ（ｃ）のクローン化ｍＲＮＡ由来の抗原特異的ＶＨドメインを同定し単離することによって製造できる。
【００４４】
また、本発明のＶＨ結合ドメインは、
（ａ）抗原を本明細書に記載のトランスジェニック哺乳類に注射するステップと、
（ｂ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｃ）上記単離された細胞又は組織から得られたｍＲＮＡからＶＨ遺伝子座をクローン化するステップと、
（ｄ）ファージ又は類似のライブラリーを使ってコード化されたタンパク質をディスプレイするステップと、
（ｅ）一種又は複数種の抗原特異的ＶＨドメインを同定するステップと、
（ｆ）上記一種もしくは複数種のＶＨ結合ドメインだけを、又は融合タンパク質として細菌、酵母又は代替の発現系に発現させるステップと
によって製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】結合ドメイン（ＶＨ）、二量体化ドメイン（任意選択的にＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）並びにエフェクター部分（ＥＭ）を含むポリペプチド複合体を示す。結合ドメインとエフェクター部分は、二量体化ドメインのアミノ末端又はカルボキシ末端に配置できる。可撓性リンカー（＜−）及びヒンジ
【数１】
領域を示す。
【図２】結合ドメインの異なる配置構成及び別の結合ドメインによるエフェクター部分の置換を示す。Ａ．ホモ二量体が産生されるので好ましい選択肢である。産物を分離することは不要である。Ｂ．ホモ二量体とヘテロ二量体の混合物が産生される。産物を分離することが必要である。
【図３】エフェクター鎖と会合する重鎖ポリペプチド複合体を示す。そのエフェククター鎖は、相補的結合ドメイン（ＣＢＤ）とエフェクター部分（ＥＭ）を含む。ＣＢＤは重鎖のＥＭによって認識される。ＣＢＤは、エフェクター例えば酵素、毒素、キレート化剤、造影剤に又はこのエフェクターの一部に融合される。エフェクター鎖は、重鎖とは別個に合成できる。
【図４】Ｊ鎖で連結している二価の分泌ＩｇＡを示す。
【図５】Ｊ鎖で会合されている多価重鎖のみＩｇＭ様ポリペプチド複合体を示す。
【図６】ＩｇＧ遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを生成させ、次いで抗原を投与して、重鎖のみ抗体とＶＨドメインの機能を発生させる方法を示す。
【図７】ＩｇＭ遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを生成させ、次いで抗原を投与して、重鎖のみ抗体とＶＨドメインの機能を発生させる方法を示す。
【図８】ＩｇＡ遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを生成させ、次いで抗原を投与して、重鎖のみ抗体とＶＨドメインの機能を発生させる方法を示す。
【図９】ヒトＣγ２プライマーとＶＨＨ１及びＶＨＨ２のプライマーを組み合わせて使って、ＣＨ１を除くためにラクダのスプライス変異を有する定常領域を含む遺伝子座を持つマウスの骨髄ｃＤＮＡから得たＰＣＲ産物の配列アラインメント。結果は、ＣＨ１が除かれていないことを示している。
【図１０−１３】ＶＨ／ラクダＶＨ（ＶＨＨ）構築物の構造。１−ｎはＶＨ遺伝子又はＤもしくはＪのセグメントの数を表す。ヒト遺伝子座の通常の相補鎖は、５１個のＶ遺伝子、２５個の機能性Ｄセグメント（プラス２個の非機能性Ｄセグメント）及び６個のＪセグメントである。Ｃμ（ＩｇＭ用）又はＣε（ＩｇＥ用）の領域の場合、Ｈ領域は無く、ＣＨ３とＭ１の間に追加のＣＨ４エキソンがある。その単一又は複数のＶＨ遺伝子は変異していて、公有ドメインに、記載されているような可溶性を提供する。ＶＨ遺伝子、ＤとＪのセグメント及びＣエキソンはヒトのものが好ましいが、ラクダを含む他の任意の種由来のものでもよい。後者の場合、ラクダのＶＨ（ＶＨＨ）遺伝子は、天然で可溶性なので変異されない。
【図１４】マウスの免疫のスケジュール及び大腸菌ＨＳＰ７０に対する重鎖のみＩｇＧ生成の抗体検定を示す。
【図１５】トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞に関するフローサイトメトリー分析と免疫組織化学試験の結果を示す。
【図１６】ＤＫＴＰで免疫されたトランスジェニックマウスのＥＬＩＳＡ分析の結果及び生成した抗体ライブラリーの配列分析の結果を示す。
【図１７】免疫されたトランスジェニックマウスにみられる体細胞の変異とＶＤＪの再構成の例を示す。
【図１８】Ａ５抗体を含有する応答プラスミドでトランスフェクトされたＴｅｔ−ｏｎ細胞系の免疫染色検定を行った結果を示す。
【図１９】トランスジェニックマウス系の血清のウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図２０】ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座マウスが産生したヒト一本鎖ＩｇＭと混合したヒトＩｇＭのサイズ分画を行なった結果を示す。
【図２１】ヒトＴＮＦαに対する一本鎖ＩｇＭとＩｇＧの抗体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【図２２】ＨＳＰ７０と抗ＧＡＧに対する結合アフィニティを有するホモ二量体プラスミドを生成させる方法を示す。
【図２３】ホモ二量体ポリペプチド複合体のＣＨＯ細胞内での機能的発現を示す。
【図２４】ホモ二量体ポリペプチド複合体の抗ＧＡＧとＨＳＰ７０に対する同時の機能的結合を示す。二価で二重特異性の抗体を図式的に示す。第二可変領域（ｇａｇに対するＶＨＨ２）を、他の特異性を含有する重鎖のみ抗体（ＨＳＰ７０に対するＶＨＨ１）のカルボキシ末端中にクローン化する。ＣＨ３とＶＨＨ２の間のヒンジ領域は、全てのシステインがプロリンで置換されたリンカー領域（矢印）で置換されている。ＥＬＩＳＡプレートをＧａｇでコートし、１％ミルク／１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックし、まずダイアボディ培地（１：２希釈）でインキュベートし、次にＢＩ２１細胞溶解物（ＨＳＰ７０を含有）（１：２希釈）でインキュベートする。結合したタンパク質を試料緩衝剤＝２−メルカプトエタノールで溶離し次いで８％ゲル上に泳動させる。Ｇａｇ、ダイアボディ及びＨＳＰ７０に対するポリ／モノクローナル抗体で染色する。抗Ｇａｇ：ウサギポリクローナル／ブタ抗ウサギ−ＡＰ（青色）。抗ＨＳＰ７０：モノクローナル／ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（褐色）。ダイアボディ：ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（褐色）。レーン１：Ｇａｇ／ダイアボディ／ＢＩ２１細胞溶解物。レーン２：Ｇａｇ／培養培地（ダイアボディの陰性対照）／ＢＩ２１。レーン３：ミルク−ＢＳＡ／ダイアボディ／ＢＩ２１。レーン４：ミルク−ＢＳＡ／培養培地／ＢＩ２１。レーン５：Ｇａｇ／ダイアボディ／ミルク−ＢＳＡ。レーン６：Ｇａｇ培養培地／ミルク−ＢＳＡ。
【図２５】ＩｇＡエフェクター機能を有するエフェクター鎖と任意選択的に会合しているホモ二量体のポリペプチド複合体を生成させる方法を示す。
【図２６】ＩｇＡエフェクター機能を有するエフェクター鎖と任意選択的に会合しているホモ二量体のポリペプチド複合体を生成させる方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明者らは、従来技術の限界を克服し、トランスジェニック動物の特にマウスに、「マイクロ遺伝子座（ｍｉｃｒｏ ｌｏｃｉ)」を使って、形質細胞又はＢ細胞が分泌するクラス特異的重鎖のみ抗体又は異なるクラスの重鎖のみ抗体の混合物を産生させることができることを示したのである。次にこれらは、確立されたハイブリドーマの技術を使ってクラス特異的重鎖のみ抗体の信頼性の高い供給源を作製させるために使用するか、又は機能性ラクダＶＨ（ＶＨＨ）結合ドメイン、もしくはＶＨ重鎖のみ結合ドメイン、好ましくはヒトが起源の可溶性ＶＨ重鎖のみ結合ドメインの原料として使用することができる(これらの結合ドメインはエフェクター機能は無いが結合機能は保持している)。
【００４７】
本発明の方法で生成させることができる重鎖のみ抗体（ラクダ抗体を含む）は高い結合親和力を示すが、これは、一般に伸長したＣＤＲ３ループ無しのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの再構成と体細胞変異で生じる。本質的に正常なＢ細胞の成熟は、単離された形質細胞中に存在する重鎖のみ抗体のレベルが高いとき（ＣＨ１ドメインが、組換え遺伝子座中に存在する全ての抗体クラスから除かれている場合）に観察される。Ｂ細胞の成熟及び会合された二量体（例えばＩｇＧ）又は多量体（例えばＩｇＭ）の分泌は、軽鎖遺伝子の存在又は発現とは無関係である。
【００４８】
トランスジェニックマウス由来のハイブリドーマから単離された抗原特異的重鎖をコードする抗原特異的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列分析を行なった結果、重鎖抗体の多様性は、主としてＶＤＪ組換えの機能であることが証明された。さらに、本発明者らは、抗体の多様性は、ＶＨドメインの体細胞変異の関与が一層制限された形で重鎖のみ抗体の機能性抗原結合ドメインのＣＤＲ３領域で発生することを示した。本明細書に記載の方法を使って、機能性ＶＨドメインを細菌系にクローン化し発現させて抗原と結合する特異性及び親和力を十分に保持したＶＨ結合ドメインを生成させることができる。さらに、クラス特異的重鎖の二量体及び多量体は、培養中のハイブリドーマ細胞系に分泌させることができる。
【００４９】
本発明はまた、トランスジェニックマウスを、抗原の投与に応答して好ましいクラスの重鎖のみ抗体、例えばＩｇＭのみではなくてＩｇＧのみ又は例えばＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭの混合物を産生するようにプログラムすることができることも教示する。
【００５０】
本発明者らは、ＣＨ１エキソンを欠いて、ヒトのＤ及びＪセグメントによって二つのラマ（ｌｌａｍａ）ＶＨＨ遺伝子に連結された最小のヒトＩｇＧ重鎖定常領域遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスの生成についてすでに述べた（ＷＯ０２／０８５９４５及びＷＯ０２／０８５９４４参照）。これらは、抗原を投与されると、機能性で親和力の高い抗原特異的ＩｇＧ重鎖のみ抗体を産生する。重鎖のみ抗体のクラス混合物（ＩｇＭとＩｇＧ）の混合物は、重鎖定常領域を直列に並べて取り込む遺伝子構造を利用したインビボでのクラススイッチによって得られることができる（全ての定常領域遺伝子がＣＨ１ドメインを欠いていてＣＨ４ドメインが存在している場合）。
【００５１】
本明細書で述べる改善は、ヒトのＤとＪのセグメントによって二つのラマＶＨＨ遺伝子に連結された同じＩｇＧ定常領域遺伝子座、及びＣＨ１エキソンを欠いていて同じヒトＤとＪの遺伝子セグメントによって二つのラマＶＨＨ遺伝子に連結されたヒトＩｇＭ定常領域遺伝子座を組み込んだマウスも、高分子量の（多量体の）ＩｇＭ重鎖のみ抗体及びＩｇＧ（二量体）重鎖のみ抗体を産生することである。驚くべきことには、本質的に正常なＢ細胞の成熟と抗体の産生は、トランスジェニック遺伝子座中に存在する各重鎖定常領域からのＣＨ１配列の完全な欠失によっている。さらに、ＣＨ４エキソンは、存在していても除く必要は全く無い。
【００５２】
したがって、例えば、同じヒトのＤとＪの遺伝子セグメントによって二つのラマＶ遺伝子セグメントに連結された機能性ＣＨ１エキソンを有するヒトＩｇＭ重鎖遺伝子座、及び同じヒトのＤとＪの遺伝子セグメントによって二つのラマＶ遺伝子セグメントに連結されたＣＨ１エキソンを欠いたＩｇＧ定常重鎖領域遺伝子座を保持するトランスジェニック動物は、非常に低いレベルの重鎖のみ抗体を産生し、Ｂ細胞の成熟の証拠を示さない。
【００５３】
ＣＨ４ドメインを含む他のエフェクタードメインは組み込まれても組み込まれなくてもよく、要求されるとおりに、生成する重鎖のみ抗体にエフェクターの特徴を導入するか、又は除くことができる。
【００５４】
本発明者らは、抗体を産生する発現（すなわち、Ｂ細胞の成熟）がその構造中に存在するＶ遺伝子セグメントを利用することから起こり得ることを発見したのである。Ｂ細胞から誘導された抗体ｍＲＮＡを単離して配列を決定することにより、ＤとＪの遺伝子セグメントの組換えがＣＤＲ３の多様性を生み出すことを示している。生成したＶＨドメインの配列を比較すると、体細胞の突然変異が見られ、これは親和性成熟の事象が、前記組換えられたＤとＪの遺伝子セグメントと、発現されて生成した抗体ｍＲＮＡのＶＨドメインにも起こったことを示している。
【００５５】
好ましい構造は、可溶性を改善するために選択又は遺伝子工学的に処理され、組換えを行いＣＤＲ３を生成させるためＤとＪの鎖クラスターに連結されたＶ遺伝子セグメントを組み込む。好ましくは、そのＶＤＪ配列は、各々ＣＨ１エキソンを欠いた好ましい単一又は複数の定常エフェクタードメインに対して直列に並べて連結される。
【００５６】
本発明は、ヒトもしくはラクダのクラス特異的な重鎖のみ抗体又はヒトのＶＨ結合ドメイン（好ましくは可溶性ＶＨ結合ドメイン）（単独又は好ましいエフェクタードメインに連結されたもの）の誘導と産生に限定されず、ＤとＪの遺伝子セグメントに連結された、脊椎動物が起源の任意のＶ遺伝子セグメントのキメラ結合体（溶解度特性を改善するため任意選択的に遺伝子工学的に処理されている）の産生も含む。そのＶ遺伝子セグメントは、ヒトが起源であり、ラクダ由来のＶ遺伝子セグメントでないものが好ましい。生成したＶＨドメインは、そのＤとＪのセグメントがラクダ由来のものである場合を除いては、伸長したラクダ様ＣＤＲ３ループを含有していなくてもよい。その結果、操作的にエフェクター定常領域に作動可能に連結されたＣＤＲ３の多様性と親和性成熟を示すＶＨドメインが得られる。親和性成熟は、好ましい親のトランスジェニック脊椎動物における機能的分泌と任意選択的な会合を確実にし、その後必要な場合に、選択可能なエフェクター機能も提供する。
【００５７】
これらの観察結果は、改善され単純化されたクラス特異的重鎖のみ抗体の遺伝子工学的処理及び体細胞変異により親和性成熟を獲得した高親和力の可溶性ＶＨドメインの誘導に対して重要な影響をもたらす。選択された重鎖定常領域エフェクター機能（ＣＨ１を欠いている）又はその混合物を取り込みにより、抗体の追加の遺伝子工学的処理を必要とすることなく、任意のクラスの重鎖のみ抗体又は任意の重鎖のみ抗体の混合物でも産生させることができる。ＶＨドメインは、単独で細菌などの微生物系中で発現されるか、又は培養中のハイブリドーマ又はトランスフェクトされた細胞が分泌する、エフェクタードメインを取り込んだ機能性重鎖のみ抗体として発現されることができる。ヒトが起源の抗体とＶＨ結合ドメインには、医薬、診断剤及び試薬として健康管理の分野に広範囲の用途があり、平行して農業、環境及び産業向けの用途がある。
【００５８】
したがって、本発明は、第一の態様で、異種ＶＨ重鎖遺伝子座をトランスジェニック哺乳類内で発現させるステップを含むトランスジェニック哺乳類内でＶＨ重鎖のみ抗体を産生させる方法を提供する。好ましくは、そのＶＨ重鎖遺伝子座は、ＣＨ１ドメインをコードしない重鎖定常領域を含み、かつ発現されるとき完全な重鎖のみ抗体の多様なレパートリーを生成できる。
【００５９】
本発明の第一態様は、ラクダＶＨ重鎖遺伝子座をトランスジェニック哺乳類内で発現させるステップを含むトランスジェニック哺乳類内でラクダＶＨ重鎖のみ抗体の製造方法であって、そのＶＨ重鎖遺伝子座はＣＨ１ドメインをコードしない重鎖定常領域を含み、そして発現されると、抗原の投与に応答してＶＤＪが再構成されかつ親和性成熟する完全な重鎖のみ抗体の多様なレパートリーを生成できる方法も提供する。
【００６０】
遺伝子工学的な処理が細胞表面の会合を妨げる分泌機構とそれに続くＢ細胞の成熟に対して影響しないとき、重鎖エフェクター分子は、遺伝子工学的に処理して機能ドメイン（例えばカルボキシ末端ＣＨ４ドメイン）を除かれてもよい。ＣＨ１エキソンだけ異種遺伝子座から除かれているか又はその遺伝子座中に存在しない。例えばグリコシル化を改善し又は機能を付加するため、遺伝子工学的に処理して遺伝子座に特徴を付け加えられてもよい。
【００６１】
好ましくは、上記の異種遺伝子座は、発現されると、機能性のＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＭの分子又はそのイソタイプを生成できる。個々の抗体のクラス又は抗体クラスの混合物又はそのイソタイプも生成できる。
【００６２】
したがって、異種の重鎖遺伝子座は、本質的に正常なＢ細胞の成熟とともに、必要な一種又は複数種の抗体クラスに応じて、重鎖のみ抗体の好ましいクラス又は混合物を生成するように設計される。ラクダのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子のセグメント並びにラクダのエフェクター領域を利用すると、ラクダの独特の特徴を有するラクダ抗体、例えば伸長したＣＤＲ３ループを生成する。無作為に選択された、又は溶解度を高めるために選択もしくは遺伝子工学的に処理されたＶ遺伝子セグメントを含むヒトのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを使用すると、機能性のヒト重鎖のみ抗体を生成する。
【００６３】
本発明で得られる抗体は、本質的に単一の又は知られたクラスの好ましくはヒトが起源の抗体である点で従来技術の抗体を超える利点を有する。これらの抗体は、ＶＤＪの組換え及びインビボでの親和性成熟の組合わせから得られる高い親和力を有する。抗体とそのフラグメントは、当業者に知られている十分に確立された方法を使って単離され、特性を決定され、そして製造できる。
【００６４】
＜異種重鎖遺伝子座＞
本発明の文脈において、用語「異種」は、本明細書に記載されているように、ヌクレオチド配列又は遺伝子座が、それを配置された哺乳類にとって内在性ではないことを意味する。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「ＶＨ重鎖遺伝子座」は、操作して一つ以上の重鎖エフェクター領域（各々ＣＨ１ドメインを欠いている）に連結された、一つ以上のＶ遺伝子セグメント、一つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び一つ以上のＪ遺伝子セグメントを含むＶＨドメインをコードする最小マイクロ遺伝子座に関する。好ましくは、抗体のレパートリーが変化する主な原因は、Ｖ−Ｄ及びＤ−Ｊの結合によるＤとＪの遺伝子セグメントの選択で生成するＣＤＲ３領域である。
【００６６】
本発明の利点は、再構成されたＶＨ遺伝子配列に得られる抗体のレパートリーと多様性は、多数のＤとＪの遺伝子セグメントを使用することによって最大にすることができる点である。その後の体細胞変異は、最小の遺伝子座（マイクロ遺伝子座）を使用しながら、多数のＶ遺伝子セグメント又はＶＬとＬＣ（軽鎖）免疫グロブリン遺伝子座を必要とせずに達成される。
【００６７】
好ましくは、前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、任意の脊椎動物種から誘導される２〜５個（２、３、４又は５個）のＶ遺伝子セグメントを含む。
【００６８】
好ましくは、前記Ｖ遺伝子セグメントは、ヒトが起源であり、溶解度を改善するため任意選択的に選択されるか又は遺伝子工学的に処理される。
【００６９】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、好ましくは、２〜４０個（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０又は４０個）以上のＤ遺伝子セグメントを含む。これらのＤ遺伝子セグメントは、任意の脊椎動物種から誘導できるが、最も好ましくは、そのＤ遺伝子セグメントはヒトのＤ遺伝子セグメント（通常、２５個の機能性Ｄ遺伝子セグメント）である。
【００７０】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、好ましくは、２〜２０個（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０個）以上のＪ遺伝子セグメントを含む。これらのＪ遺伝子セグメントは、任意の脊椎動物種から誘導できるが、最も好ましくは、そのＪ遺伝子セグメントはヒトのＪ遺伝子セグメント（通常、６個のＪ遺伝子セグメント）である。
【００７１】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、好ましくは、２個以上のＶ遺伝子セグメント、２５個の機能性ヒトＤ遺伝子セグメント及び６個のヒトＪ遺伝子セグメントを含む。
【００７２】
用語「Ｖ遺伝子セグメント」には、ラクダ及びヒトを含む脊椎動物から誘導される天然のＶ遺伝子セグメントが含まれており、これらセグメントは、溶解度などの特性を改善するため任意選択的に選択され、変異させ又は遺伝子工学的に処理されている。Ｖ遺伝子セグメントは、サメなどの他の種にも発見されており（Ｋｏｋｕｂｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ．Ｊ．，７，３４１３−３４２２参照）、又は、例えば免疫グロブリン軽鎖ＶＬのレパートリーもしくはＴ細胞受容体ＶＨのレパートリーになる場合、典型的な結合タンパク質の多様なＶＨ様ファミリーを提供するようになる。
【００７３】
ＶＨドメインの溶解度を改善する好ましい方法は、単なる無作為ではなく合理的な手段を取り入れており、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（６），５３１−５３７及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８に例示されている。自然選択が、親和性成熟及びＶＤＪの再構成に続いてＶＨ遺伝子の好ましい変異を取り込むことによってインビボで起こることもある。
【００７４】
Ｖ遺伝子セグメントは、本発明に従って、核酸が発現されたときＶＨ重鎖のみ抗体を生成するために、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常（エフェクター）領域（いくつかのエキソンを含んでもよいがＣＨ１エキソンは除外されている）とで組換え可能でなければならない。
【００７５】
本発明のＶ遺伝子セグメントは、その範囲内に、本発明にしたがって、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常領域（一つ以上のエキソンを含むがＣＨ１エキソンは含んでいない）で組換えて、本明細書で定義する重鎖のみ抗体を生成できるホモログ、誘導体又はタンパク質フラグメントをコードする任意の遺伝子配列も含む。
【００７６】
したがって、ＶＨコーディング配列は、天然の原料由来でも、又は当業者によく知られている方法を使って合成されてもよい。
【００７７】
本発明の文脈において、用語「ＶＨドメイン」は、先に定義したようにＤ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントで組換えられたときのＶ遺伝子セグメントの発現産物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されるこのＶＨドメインは、溶解状態のままであり、そして溶解度を保持するために他の要因を必要とせずに生理的溶媒中で活性である。好ましくは、可溶性ＶＨドメインの抗原への結合能は、ＶＤＪの組換え及び体細胞変異によって改善されている。ラクダ種に独特の伸長したＣＤＲ３ループの有無に対する依存性は全くない。このＶＨドメインは、モノマーとして抗原に結合でき、エフェクターの定常領域と結合すると、使用されるエフェクター分子（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）の選択及び遺伝子工学的処理又は二量体化及び多量体化の別の機構によって、モノ特異性、二重特異性、多重特異性、二価又は多価の形態で産生されてもよい。可溶性の重鎖のみ抗体複合体の一部として発現されるときに、ＶＬドメインと結合する可能性は、ＣＨ１エキソンを除くことによって排除される（Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０参照）。ＶＨドメインを、多様なタンパク質ドメインとともに遺伝子工学的に処理して、標的治療や診断に使用する例えば毒素、酵素及び造影剤を有する融合タンパク質も産生させることもできる。
【００７８】
本発明の文脈において、用語「Ｄ遺伝子セグメント」と「Ｊ遺伝子セグメント」には、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの天然の配列が含まれる。好ましくは、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントの由来と同じ脊椎動物に由来する。例えば、Ｖ遺伝子セグメントがヒト由来で次いで可溶化又は遺伝子工学的に処理される場合は、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントもヒト由来である方が好ましい。あるいは、Ｖ遺伝子セグメントが例えばラクダ由来であり、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントがヒト由来でもよく、又はその逆でもよい。
【００７９】
用語「Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメント」は、生成するセグメントが、本明細書に記載されているような重鎖抗体遺伝子座の保持する成分で組換えて本明細書に記載されているような重鎖のみ抗体を生成する限り、その範囲内に、その誘導体、ホモログ及びフラグメントを含む。Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントは、天然の原料から誘導してもよく、又は当業者にはよく知られていて本明細書に記載されている方法を使って合成してもよい。Ｖ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、組換えることができそして体細胞変異をする方が好ましい。
【００８０】
Ｖ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、単一の脊椎動物種から誘導することが好ましい。これはどの脊椎動物種でもよいがヒトが好ましい。
【００８１】
さらに、本発明の異種重鎖遺伝子座は、インビボでエフェクター機能を提供する重鎖定常領域（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はそのイソタイプ）をコードするＤＮＡの領域を含む。
【００８２】
本発明は、本発明の方法で得られるか又は得ることができる抗原特異的の重鎖のみ抗体も提供する。
【００８３】
＜重鎖定常領域＞
操作的に、重鎖定常領域は、天然又はＢ細胞内でＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントで組換えできる遺伝子工学的に処理された遺伝子セグメントによってコードされている。好ましくは、その重鎖定常領域は、免疫グロブリンの遺伝子座由来である。
【００８４】
本発明のこの態様によって、重鎖定常領域は各々、重鎖のみ抗体を生成できるように機能性ＣＨ１ドメイン無しで発現される少なくとも一つの重鎖定常領域を本質的に含む。各重鎖定常領域は、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、Ｃε及びＣα１−２からなる群から選択される追加の重鎖定常領域のエキソンの一つ以上を、これら追加の重鎖定常領域の遺伝子が機能性ＣＨ１ドメインを発現しないという条件で含んでもよい。その重鎖定常領域の遺伝子セグメントは、必要な抗体クラスの好ましいクラス又は混合物によって選択される。任意選択的に、その異種重鎖遺伝子座はＣμとＣδを欠いている。
【００８５】
例えば、クラスＭのＩｇ分子は、マクロファージの活性化及び補体の経路で重要な役割を演じていることが分かっている。ＩｇＭは、その結合部位が近接しているため、ウイルスを含む病原体に対して高い親和力を有する。しかし、ＩｇＭは、高速免疫検定法に使用することは難しいことが知られているが、一方クラスＧのＩｇはこれらの検定法に容易に使用できる。このような用途に対しては、好ましい抗体のクラスとして、すなわちＩｇＧ又はＩｇＭを選択することが有用である。
【００８６】
ＣＨ１を欠いている異種重鎖Ｃγ遺伝子座の全て又は一部を発現すると、その異種ＩｇＧ遺伝子座中に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のイソタイプによって、いくつかの又は全てのＩｇＧイソタイプが任意選択的に産生される。あるいは、重鎖はＣε遺伝子を含んでもよい。生成するＩｇＥ分子も治療に使用できる。
【００８７】
あるいは、抗体の選択された混合物を得ることができる。例えば、ＩｇＡとＩｇＭは、重鎖定常領域がＣα遺伝子とＣμ遺伝子を含むときに得ることができる。
【００８８】
本発明の重鎖定常領域は、特に重鎖抗体を、ヒトを治療する用途に使用したいとき、ヒトが起源である方が好ましい。重鎖抗体を、診断又は獣医学的用途に使用したい場合、重鎖定常領域は、診断又は獣医学的治療をしたい標的の生物、脊椎動物又は哺乳類由来である方が好ましい。
【００８９】
重鎖定常領域は、発現されたとき、機能性ＣＨ１ドメインを欠いている。そのＣＨ１エキソン及び任意選択的にＣμとＣδの定常領域は、変異、欠失又は置換を行なってもよい。ＣＨ１エキソンは欠失している方が好ましい。例えば機能性ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭが存在するとＢ細胞の成熟を阻害し、Ｂ細胞の成熟が阻害された結果として、同じ遺伝子座中に重鎖のみＩｇＧ（ＣＨ１を欠いている）を産生発現することが制限される。
【００９０】
本明細書で定義する「重鎖定常領域エキソン」（「ＣＨエキソン」）は、天然の脊椎動物であるが特に哺乳類のＣＨエキソンの配列を含む。これはクラス特異的方式で変化する。例えば、ＩｇＧとＩｇＡは、天然に、ＣＨ４ドメインを欠いている。用語「ＣＨエキソン」は、そのＣＨエキソンが、重鎖定常領域の一成分であるとき、本明細書で定義したような機能性重鎖のみ抗体を生成できる限り、その範囲内に、その誘導体、ホモログ及びフラグメントも含む。
【００９１】
ＣＨ４又は他の機能性ドメインは、存在しているとき、細胞内の分泌プロセス、Ｂ細胞の成熟又は生成した抗体ポリペプチドの結合活性を阻害しないならば、任意選択的に導入遺伝子中で遺伝子工学的に処理されたり又は欠失されてもよい。
【００９２】
＜哺乳類＞
本発明の方法に使うトランスジェニック哺乳類はヒトではない。トランスジェニック哺乳類としては、ウサギ、モルモット、ラット又はマウスなどのげっ歯類が好ましい。マウスが特に好ましい。ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ又は他の動物などの代替動物も利用できる。
【００９３】
トランスジェニック動物は、確立された卵母細胞注射法及び確立されたときにはＥＳ細胞技術又はＥＳ細胞クローニング法を利用して生成させる方が好ましい。
【００９４】
有利には、重鎖のみ抗体を本発明の方法によって発現させるとき、その哺乳類に内在している免疫グロブリンの重鎖遺伝子座及び任意選択的に軽鎖遺伝子座は、欠失させるか又は抑止する。
【００９５】
抗体の起源とは異なる起原の脊椎動物種に抗体を投与すると、その投与された抗体に対する免疫応答が始まることが多いので、上記のような重鎖のみ抗体を生成させるこの方法は、ヒトの治療に使う抗体を生成させるのに特に有用であろう。
【００９６】
したがって、別の態様で、本発明は、本発明の異種重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニック哺乳類を提供する。
【００９７】
そのトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む抗体を産生する能力を低減するように遺伝子工学的に処理されてもよい。
【００９８】
抗体産生細胞は、本発明のトランスジェニック動物に由来してもよく、例えば、本明細書に記載したような重鎖のみ抗体を産生するためのハイブリドーマを調製するのに使用できる。加えて、又は別の方法として、核酸配列は、本発明のトランスジェニック哺乳類から単離されてもよく、ＶＨドメイン重鎖のみ鎖抗体又はその二重特異性／二機能複合体を、当業者に公知の組換えＤＮＡ法を使って製造するのに使用されてもよい。
【００９９】
加えて、又は別の方法として、抗原特異的重鎖のみ抗体は、本発明のトランスジェニック動物を免疫することによって生成されてもよい。
【０１００】
したがって、別の態様で、本発明は、本発明のトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによって重鎖のみ抗体を製造する方法を提供する。
【０１０１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、その哺乳類はマウスである。
【０１０２】
＜重鎖のみ抗体及びそのフラグメント＞
もう一つの態様で、本発明は、本発明の方法で得ることができる重鎖のみ抗体及びその機能性フラグメントと誘導体を提供する。ＶＨ結合ドメインを含むフラグメントは、本発明の重鎖のみ抗体すなわち軽鎖を欠いている抗体を、酵素又は臭化シアンで開裂することによって誘導できる（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。
【０１０３】
好ましい機能性フラグメントは、抗原特異的の重鎖のみ結合ドメイン、すなわち、単独のＶ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメント間の組換えと続く体細胞変異で生成するＶＨ遺伝子座によって発現されるＶＨ結合ドメインである。本発明のこの態様によって、ＶＨ遺伝子座は、例えば、上記免疫されたトランスジェニック動物の抗体産生細胞から単離したｍＲＮＡからクローン化できる。次に、クローン化された配列は、ファージ（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６）又は類似のディスプレイライブラリー、例えば酵母ベースの系（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，５５３−７）を使って提示され、抗原特異的ＶＨ結合ドメインが同定される。次に、抗原特異的重鎖結合ドメインは、大規模に量産可能な細菌、酵母又はそれに代わる発現系で、単独又は融合タンパク質として製造できる。またＶＨ結合ドメインをコードする配列は、免疫されたトランスジェニックマウスから古典的な方法で誘導される、特性を決定されたハイブリドーマからクローン化することもできる。これらの配列は、異なるエフェクター機能を有する指定の抗体クラス（例えばＩｇＥ又はＩｇＡ）とその変異体を遺伝子工学的に処理することを含めて、ＶＨ結合ドメインとその誘導体の製造に使用されることができる。
【０１０４】
したがって、本発明はまた、
（ａ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体（好ましくは、対象の可溶性の抗原特異的重鎖のみ抗体）を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｂ）前記単離した細胞又は組織から誘導したｍＲＮＡからＶＨ結合ドメインをコードする配列をクローン化するステップと、
（ｃ）そのコードされたタンパク質を、ファージ又は類似のライブラリーを使ってディスプレイするステップと、
（ｄ）抗原特異的ＶＨ結合ドメインを同定するステップと、
（ｅ）そのＶＨ結合ドメインを、単独で又は融合タンパク質として、細菌、酵母、哺乳類又は代替の発現系で発現させるステップと
を含むＶＨ結合ドメインの製造方法を提供する。
【０１０５】
あるいは、ＶＨドメイン含有フラグメントは、本発明の重鎖のみ抗体から、酵素による開裂法又は化学的開裂法を利用し、次いでその開裂産物からＶＨドメイン含有フラグメントを分離することによって製造できる。
【０１０６】
ＶＨ結合ドメインを、特性を決定されたハイブリドーマから単離する場合は、ｍＲＮＡ由来のクローン化ＶＨ結合ドメイン配列を、ファージなどのディスプレイ系を利用する追加の選択ステップに頼ることなく、発現ベクター中に直接クローン化できる。
【０１０７】
エフェクター領域を取り込んでいる、重鎖のみ抗体の産生系としては、大量飼育法に適した培養中の哺乳類の細胞（例えばＣＨＯ細胞）、植物（例えばトウモロコシ）、トランスジェニックヤギ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、鶏及び昆虫の幼虫がある。ウイルス感染（例えば昆虫の幼虫や細胞系へのバキュロウイルスの感染）を含む他の産生系は、細胞培養法及び生殖細胞法の代わりの系である。その他の産生系も当業者にはよく知られている。重鎖のみＩｇＡ又はＩｇＭの会合が必要な場合は、「Ｊ鎖」を共発現させることが有益である。ラクダの重鎖のみ抗体又はＶＨ結合ドメインだけを産生させるのに適切な方法は当分野では周知である。例えば、ラクダのＶＨ結合ドメインは細菌系で産生されており、ラクダの重鎖のみホモ二量体はハイブリドーマ及びトランスフェクトされた哺乳類細胞で産生されている（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８参照）。
【０１０８】
ファージディスプレイ法を使って誘導された遺伝子工学的処理ヒトＶＨ結合ドメインを発現させる方法も確立されている（Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２４７７４−２４７８０及びこの文献に記載されている引用文献）。
【０１０９】
トランスジェニックハエ系由来の昆虫幼虫が、体腔液中に、哺乳類の細胞が産生する抗体と差異のない特性を有する機能性重鎖のみ抗体フラグメントを産生することが分かっている（ＰＣＴ／ＧＢ２００３／０００３３１９）。本発明はまた、本発明のこの態様の方法によって得られる抗原特異的な単量体又は二量体のＶＨ結合ドメインを提供する。
【０１１０】
本発明はまた、異種の重鎖遺伝子座、本発明の重鎖のみ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド及び異種の重鎖遺伝子座もしくはそのフラグメントを含むベクターからなるポリヌクレオチド配列、又は本発明の重鎖のみ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１１１】
本発明はまた、本発明の異種重鎖遺伝子座もしくはそのフラグメント、又は重鎖のみ抗体もしくは抗体フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１１２】
第二の態様で、本発明は、エフェクター活性を提供するエフェクター部分を結合された本発明の抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むポリペプチド複合体を提供する。このエフェクター活性は、それに加えて重鎖定常領域により提供されてもよく、分子のアミノ末端又はカルボキシ末端に配置されてもよい。これらポリペプチド複合体は、エフェクター部分の追加のターゲッティング機能すなわちエフェクター機能と組み合わせて、抗原特異的ＶＨ結合ドメインが提供する生理機能を保持している。このようなポリペプチド複合体は、機能性モノマーの形態であるか、又はエフェクター部分の構造との相互作用によっては、二量体、四量体、五量体、多量体もしくは異なるＶＨ結合ドメインを取り込んだ他の複合体の形態であり、その結果、多価又は多特異性を付与する。ＶＨ結合ドメインは、結合分子のアミノ末端又はカルボキシ末端に存在し得る（二量体の例の図１参照）。
【０１１３】
エフェクター部分が結合ドメインを含むとき、その結合ドメインは抗原特異的ＶＨ結合ドメインとは異なる特異性を有してもよい。この配列の利点は、そのポリペプチド複合体が異なる標的と容易に架橋できることである。例えば、二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞−細胞間の相互作用と細胞−病原体間の相互作用を高めるのに利用できる。この実施形態では、本発明のポリペプチド複合体は、例えば病原体とマクロファージなどの２種類の細胞型を架橋するのに利用できる（Ｂｉｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４６，１２９９−１３１１参照）。このような二重特異性を設計する際には、ＶＨ結合ドメインを使用する方がｓｃＦＶ結合ドメインを使用するより好ましい。ＶＨ結合ドメインは、結合親和力が高いので、このようなポリペプチド複合体中に最小のベクター構造で、ｓｃＦＶの四量体の親分子に比例した特異性と親和力を保持するための設計上の考慮の必要も無しに組み込むことができる。二量体又は多量体のポリペプチド複合体を考えるとき、例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域由来のＣＨ２とＣＨ３のドメインを含む二量体化ドメインが組み入れられる（図２参照）。
【０１１４】
用語「エフェクター部分」は、本明細書で使用する場合、細胞に対して所望の生物学的効果を仲介する任意の部分を含む。そのエフェクター部分は、好ましくは可溶性であり、そしてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質でもよく、又は非ペプチド構造体でもよい。例えば、エフェクター部分は、酵素、ホルモン、サイトカイン、医薬、プロドラッグ、毒素特にタンパク質毒素、キレート化構造の放射性核種、結合ドメイン、二量体化ドメインもしくは相互作用ドメイン、造影剤、アルブミン又は阻害剤でもよい。
【０１１５】
アルブミンは、抗原特異的ＶＨ結合ドメインの安定性又は薬物動態学的及び／又は薬力学的特性を増大させるためにエフェクター部分として使用できる（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，２３（１）：２５−３６）。あるいは、エフェクター部分は、薬物動態学的特性を改善するため、ペグ化された構造（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）又は天然にグリコシル化された構造でもよい。
【０１１６】
エフェクター部分は、抗原特異的ＶＨ結合ドメインに結合されたペプチドでもよく、又は、例えばマレイミドリンカーのような化学的にリンクする構造体を使って、抗原特異的重鎖ＶＨドメインに化学的に結合されてもよい。あるいは、本発明のプリペプチド複合体は、融合タンパク質として発現されてもよい。したがって、本発明は、異種の重鎖遺伝子座からなるポリヌクレオチド配列又は本発明の重鎖のみ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド（そのポリヌクレオチドはさらに読み取りフレーム中にエフェクター部分をコードする１個以上のエキソンを含む）も含む。このエキソンは、前記ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端に位置していてもよい。例えば、このポリヌクレオチドは、ＶＨと結合ドメイン／エフェクター部分遺伝子セグメントをこの順序で、読み取りフレーム中に含んでもよい。遺伝子融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）の場合、各種ドメインの結合は、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構造体（同じ読取りフレームに配置された各種ドメインがコードされている）を使って達成されてもよい。このような構造体は、診断剤及び治療剤として有用である。診断剤として、そのエフェクタードメインは、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）又は酵素（例えばβ−ｇａｌ）でもよい。あるいは、エフェクタードメインは、基質に対する結合性を高めるためのタグ（例えばポリヒスチジン又はビオチン）、二次抗体に結合する部位を提供する抗原、又は蛍光マーカーが結合する部位として働くロイシンジッパーもしくは類似の結合モチーフでもよい。
【０１１７】
＜ポリペプチド複合体＞
本発明者らは、抗体重鎖の少なくとも一部分を、単独で又は相補的会合ドメインを含みかつ追加のエフェクター活性を有する別のエフェクター（軽）鎖と組み合わせて含む二価又は多価のポリペプチド複合体を産生できることを明らかにした。本発明のポリペプチド複合体は、エフェクター鎖に付随する追加エフェクター部分の機能と組み合わせた重鎖定常領域によって付与された生理学的機能を保持している（図３）。
【０１１８】
したがって、第三の態様では、ポリペプチド複合体は、一つ以上のエフェクター鎖（軽鎖）と組み合わせた重鎖を含む。本発明の第三の態様は一対の重鎖と一対のエフェクター鎖を含むポリペプチド複合体を提供し、
その一対の重鎖は互いに会合し、
一方のエフェクター鎖は一方の重鎖と会合し、他方のエフェクター鎖は他方の重鎖と会合し、
各重鎖は、結合ドメイン、好ましくは少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４の定常領域ドメインを含む二量体化ドメイン並びにエフェクター鎖の相補的会合ドメインに結合できるエフェクター部分を含み、
そのエフェクター鎖は、エフェクター部分に連結された相補的会合ドメインを含み、そして
前記会合ドメインと相補的会合ドメインは非共有相互作用によって互いに会合している。
【０１１９】
好ましくは、上記重鎖のエフェクター部分は、エフェクター鎖のエフェクター部分とは異なっている。
【０１２０】
上記ポリペプチド複合体は、任意選択的に、ＣＨ３ドメイン（又は存在している場合はＣＨ４ドメイン）のカルボキシル末端に、このドメインを会合ドメインに連結する可撓性ヒンジ様ドメインを含む。上記ポリペプチド複合体は、好ましくは、結合ドメインとＣＨ２ドメインの間に、天然のヒンジドメイン又は遺伝子工学的に処理された可撓性ヒンジ様ドメインを含む。ヒンジ領域の存在により、生成したポリペプチド複合体内の結合ドメインとエフェクター部分の独立した機能を高められる。
【０１２１】
第一ポリペプチド重鎖のエフェクター部分は、任意選択的に、第二ポリペプチド重鎖のエフェクター部分の特異性とは異なる特異性を有する。本発明によれば、ポリペプチド複合体のエフェクター部分は結合ドメインで置換されてもよい。好ましくは、その結合ドメインは（本発明の第一態様で定義されたのと同じ）ＶＨドメイン、又は細胞受容体結合ドメインを含む。生成する四価二量体の結合タンパク質（ポリペプチド複合体）は、異なるエフェクター部分を４個まで含むことができる。好ましくは、重鎖のアミノ末端のエフェクター部分は同一であり、そしてカルボキシ末端のエフェクター部分は同一であり（但し、アミノ末端のエフェクター部分とは異なる抗原又はエピトープを認識する）、単一のホモ二量体の会合を促進する。このような分子は、適正な重鎖の機能性ドメイン（例えばＩｇＡ又はＩｇＭ）を含むことによってエフェクター機能が提供されるので、病原体を捕獲するのに有利であることが分かるであろう。
【０１２２】
本発明の第三の態様の代表的ポリペプチド複合体は、細胞化学的ラベリング法、ターゲッティング法、又は治療に有用である。例えば、エフェクター分子が癌細胞の表面マーカーを標的とする抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含みかつエフェクター部分がプロドラッグ変換酵素に対し特異的な結合ドメインを含むならば（エフェクター鎖）、その抗原特異的ＶＨ結合ドメインは、前記標的に結合して前記エフェクター部分をその標的の直近まで運び、その結果、前記エフェクター鎖と結合して、プロドラッグ（例えばＣＢ１９５４を有するニトロレダクターゼ）の存在下、標的に対して生物学的効果を発揮できる。免疫グロブリン重鎖エフェクター機能を二量体化ドメインとして含むことも標的細胞を除くのに有用であろう。
【０１２３】
＜エフェクター鎖＞
エフェクター鎖は、相補結合ドメインとエフェクター部分を含み、重鎖のエフェクター部分を通じて重鎖と結びついて、会合されたポリペプチド結合複合体を形成する。そのエフェクター鎖の相補的会合ドメインは、エフェクター部分の不可欠な成分であってもよいし、又はエフェクター部分に融合もしくは化学的に結合されたタンパク質もしくは別のリガンドでもよい。前記会合されたポリペプチド結合複合体の重鎖は、標的に結合してエフェクター（軽）鎖部分を標的の直近まで運んで標的に生物学的効果を発揮できる。
【０１２４】
＜エフェクター部分＞
用語「エフェクター部分」は、本明細書で使用するときは、細胞に対して望ましい生物学的効果を仲介する任意の部分を含む。そのエフェクタードメインは、細胞例えばＴ細胞、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質でもよく、又は非ペプチド構造体でもよい。例えば、エフェクタードメインは、酵素、医薬、プロドラッグ、毒素特にタンパク質毒素、キレート化構造体の放射性核種又は結合ドメインでもよい。相補的会合ドメインと会合しているエフェクター部分は、所望の効果によって、自然状態で、細胞の、たんぱく質の、有機又は無機の部分でよい。
【０１２５】
用語「結合ドメイン」は、本発明の上記全ての態様について本明細書で使うときは、生理的溶媒中で活性である任意のポリペプチドドメインを含む。また、このような結合ドメインは、生理的条件下、標的に結合する性能を有していなければならない。
【０１２６】
このような結合ドメインは、細胞表面に対する結合又は接着を仲介できるドメインを含む。本発明のポリペプチド複合体に使用できる適切なドメインは、哺乳類、原核生物及びウイルスの細胞接着分子、サイトカイン、成長因子、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、リガンド、細胞表面の受容体、制御因子、構造タンパク質と構造ペプチド、血清タンパク質、分泌タンパク質、細胞膜会合タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、凝固因子、遺伝子工学的に処理された単一鎖Ｆｖｓなどである。その結合ドメインは、好ましくは脊椎動物のＶＨドメインであり、より好ましくはヒトＶＨドメインなどの哺乳類のＶＨドメインである。
【０１２７】
結合ドメインは、ラクダＶＨ（ＶＨＨ）ドメインを含んでもよく、又は非ラクダから得たＶＨドメインを含んでもよい。その結合ドメインは、好ましくはヒトＶＨドメインである。ＶＨ結合ドメインは、合成ファージライブラリーから誘導されたＶＨドメインではなく、トランスジェニック動物又は（上記の）ラクダから誘導したＢ細胞起源ものの方が好ましい。なぜなら、トランスジェニック動物又はラクダから誘導したＢ細胞起源のものが、インビボで抗原の投与に応答しＶＤＪの再構成と体細胞変異によって生成するので親和力が高いためである。
【０１２８】
エフェクター部分が結合ドメインを含むとき、その結合ドメインは重鎖の結合ドメインと異なっている方が好ましい。この構成の利点は、ポリペプチド複合体が、異なる標的の架橋を促進できるか又は標的細胞（例えば病原体）の異なる抗原に結合できる点である。
【０１２９】
第一の重鎖の結合ドメインは、第二の重鎖の結合ドメインの特異性とは異なる特異性を有してもよい。この場合、ポリペプチド複合体は少なくとも二価であるので、異なる標的を架橋することができ、かつそのエフェクタードメインはその効果を両方の抗原に対して発揮できる。多価のポリペプチド複合体は、これら四価の重鎖を、さらに、異なる一種以上の特異性及び機能を有するエフェクタードメインを含むエフェクター鎖と会合させて作製できる。また、第一の重鎖のエフェクター部分は、第二の重鎖のエフェクター部分とは異なる特異性を有してもよく、その結果各々異なる機能を保持する二つ以上のエフェクター鎖を捕獲できる。
【０１３０】
＜相補的会合ドメインはエフェクター部分に結合する＞
重鎖がエフェクター鎖と会合しているとき、用語「エフェクター部分」と「相補的会合ドメイン」は、本明細書で使う場合、少なくとも一つの非共有結合を、互いに形成できる部分を含む。例えば、そのエフェクター部分と相補的会合ドメインは、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン−免疫グロブリン軽鎖の定常領域間、ロイシンジッパー間、ＶＣＡＭ−ＶＬＡ−４間、インテグリン−細胞外マトリックスタンパク質間、インテグリン−ＣＤ５４もしくはＣＤ１０２などの細胞表面分子間、ＡＬＣＡＭ−ＳＲＣＲドメイン間、ｓｃＦｖ−抗原間又はＶＨ結合ドメイン−抗原間などにみられるようなタンパク質−タンパク質相互作用を形成できるタンパク質、ペプチドフラグメント又は共通配列でもよい。
【０１３１】
＜重鎖＞
重鎖の二量体化ドメインが免疫グロブリン重鎖の定常領域を含むときは、その定常領域（ＣＨエキソン）は、さらなる生理的機能をポリペプチド結合複合体に付与してもよい。特に、その免疫グロブリン重鎖の定常ドメインは、その抗体定常ドメインのクラス又はサブクラスに依存して、特に補体の結合、マクロファージの活性化及びＦｃ受容体への結合を提供してもよい。
【０１３２】
先に考察したように、発現された重鎖のクラスは、インビボでのエフェクター機能に重要な役割を持っていることはよく報告されている。樹立細胞系は有用な生物学的ターゲッティング効果を有するポリペプチド複合体を産生するかもしれないが、その重鎖定常領域は、診断上又は治療上望ましくないクラスの場合があるかもしれず、又は有効量を分泌しないこともあり得る。したがって、本発明のポリペプチド複合体の重鎖定常ドメインは、特異的に変えたり又は部分的にもしくは完全に削除して、免疫グロブリン重鎖の成分を導入したり、又は除いてもよい。
【０１３３】
例えば、クラスＭのＩｇ分子が、マクロファージの活性化と補体の経路で重要な役割を演じていることは知られている。その結合部位の近接近により、ＩｇＭは、ウイルスを含む病原体に対して高い親和力を有する。しかしＩｇＭは高速免疫検定法に使用することが難しいが、その一方でクラスＧのＩｇはこの検定法に容易に使用できることも知られている。この用途では、重鎖のクラスをμからγのドメインに切り替えることが有効であろう。
【０１３４】
重鎖のＣγ遺伝子座を単独で発現させると、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のイソタイプを含むＩｇＧを産生し、この内いくつかは補体も活性化する。ＩｇＧ抗体類は、マクロファージ及び顆粒球に結合して活性化したり、また胎盤を通過することもできる。
【０１３５】
各種の抗体クラスの追加の用途はすでに考察されている。
【０１３６】
本発明のポリペプチド複合体の重鎖の定常領域は、先に定義したようなヒト、ウサギ、ラット又はマウスを起源とするものでよい。なかでも、ヒトを起源とするものが好ましい。
【０１３７】
本発明のポリペプチド複合体は、エフェクター機能を全く提供しない二量体化ドメインを利用することによって、リガンドがその受容体に結合するのを遮断するために単独で使用することができる。多種類の受容体を、多重特異性ポリペプチド複合体で遮断できる。
【０１３８】
本発明の第四の態様では、エフェクター分子が、別個のエフェクター分子と会合できるように二量体化ドメインを含んでもよい。この二量体化ドメインは、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４の抗体定常領域ドメイン及び／又はＪ鎖のうち一つ以上を含んでもよい。本発明の本実施形態では、エフェクター分子の二量体又は多量体を産生するために二つ以上のエフェクター分子が会合してもよい。そのエフェクター分子は、同じでも（エフェクター分子のホモ二量体又はホモ多量体を産生できる）異なっていても（エフェクター分子のヘテロ二量体又はヘテロ多量体を産生できる）よい。好ましくは、エフェクター分子の二量体又は多量体は二価又は多価である。好ましくは、前記二つ以上のエフェクター分子の定常領域（すなわち二量体化ドメイン）は同じであるから生成物が異種になる可能性は低い。
【０１３９】
本発明の第四の態様によって、第一ポリペプチド重鎖と第二ポリペプチド重鎖からなる二量体を含むポリペプチド複合体であって、
各ポリペプチド重鎖が、結合ドメイン並びに任意選択的に少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４の抗体定常領域のドメイン及び任意選択的にエフェクター部分を含む二量体化ドメインを含み、
好ましくは第一ポリペプチド重鎖の結合ドメインは、第二ポリペプチド重鎖の結合ドメインと同じ特異性を有し、そして
これら二つのポリペプチド重鎖の定常領域（二量体化ドメイン）は同一である
ポリペプチド複合体が提供される。
【０１４０】
好ましくは、上記第一鎖と第二鎖は同じエフェクター部分を有する。
【０１４１】
好ましくは、上記二量体化ドメインは、少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４の抗体定常領域のドメインを含む。
【０１４２】
また、本発明の第四態様は、複数のポリペプチド重鎖二量体及び一つのＪ鎖を含むポリペプチド複合体であって、
複数のポリペプチド重鎖二量体がＪ鎖によって会合され、
各ポリペプチド重鎖が、結合ドメイン並びに同一のμ、ε、α又はγのＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４のドメインを含み、そして
そのポリペプチド複合体中に、異なる特異性を有する少なくとも二つの結合ドメインが存在している
ポリペプチド複合体を提供する（図４と５参照）。
【０１４３】
上記本発明の第一態様で定義したように、各重鎖の定常領域は、好ましくは、重鎖のみ抗体を生成できるように機能性ＣＨ１ドメイン無しで発現される少なくとも一つの重鎖定常領域の遺伝子を含む。また、各重鎖定常領域は、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、Ｃε及びＣα１−２からなる群から選択される一つ以上の追加の重鎖定常領域の遺伝子を、その追加の重鎖定常領域の遺伝子が機能性ＣＨ１ドメインを発現しないという条件で含んでもよい。その重鎖定常領域の遺伝子は、必要な抗体クラスの好ましいクラス又は混合物によって選択される。
【０１４４】
好ましくは、発現されるＩｇＡとＩｇＭ中には、異なる特異性の結合ドメインが二つだけ存在している。
【０１４５】
一実施形態では、重鎖は各々ＣＨ４ドメインを含み、定常ドメインはαドメインであり、そしてポリペプチド複合体はＪ鎖を含む。
【０１４６】
もう一つの実施形態では、重鎖は各々ＣＨ４ドメインを含み、定常ドメインはμドメインであり、そして抗体はＪ鎖を含む。
【０１４７】
＜ポリペプチド複合体の会合＞
本発明のポリペプチド複合体のモジュールドメインの構成は、その複合体を、多種類の可能な順列で構築することを可能にする。ポリペプチド複合体のドメインの構造及びアミノ酸の配列におけるこのような変更は、配列をコードする対応ＤＮＡの適切な領域を適切に変異させるか又は部分的に合成し及び置換することによって達成されてもよい。置換ドメイン又は付加ドメインは、互換性がある組換えＤＮＡ配列から得られてもよい。例えば、重鎖は、結合ドメインとＣＨ２ドメインのアミノ末端との間及びエフェクタードメインと重鎖のＣ末端（ＣＨ３又はＣＨ４）との間の両方に、天然ヒンジ又は遺伝子工学的に処理された可撓性ポリペプチドドメインを含んでもよい。
【０１４８】
本発明のポリペプチド複合体の重鎖は、融合タンパク質として発現される。本発明のこの態様のポリペプチド複合体のエフェクター鎖は、融合タンパク質として発現されてもよく、又は化学的手段で会合されてもよく、又は自然状態の細胞であれば、血液もしくは組織から単離するかもしくはインビボで捕獲されもてよい（例えばアルブミン）。
【０１４９】
遺伝子融合の場合は、各種ドメインの連結は、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構造体で、同じ読取り枠内に配置されている各種ドメインをコードするＤＮＡを使うことで達成されてもよい。
【０１５０】
エフェクター部分は、融合タンパク質の一部として存在しているときは、相補的会合ドメインのアミノ末端又はカルボキシ末端に位置してもよい。
【０１５１】
あるいはエフェクター鎖のドメインは、融合タンパク質として合成するのではなく当分野で既知の通常のペプチド化学の方法で会合させてもよい。
【０１５２】
結合はペプチド結合又は化学結合を介してもよい。例えば、エフェクター部分は、相補的会合ドメインにペプチド結合されてもよいし、又は例えばマレイミドのリンカーなどの化学的連結構造体を使うことによって、相補的会合ドメインに化学的に結合されてもよい。
【０１５３】
そのエフェクター部分は重鎖のどの位置に配置してもよい。例えば、エフェクター部分は、重鎖のＣ末端に、又はポリペプチド複合体の結合ドメインとＣＨ２ドメインもしくはヒンジドメインとの間に配置されてもよい。上記会合ドメインは、エフェクター機能及び二量体化ドメインを阻害することがあるので、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間には配置しない方がよい。エフェクター部分は、その独立した結合／機能を高めるために、重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端に、ペプチドの可撓性リンカー又はヒンジ様領域によって連結する方が好ましい。
【０１５４】
＜ポリヌクレオチド配列、ベクター及び宿主細胞＞
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体のいずれか一つの重鎖をコードするポリヌクレオチド配列、上記ポリヌクテオチド配列を一つ以上含むベクター及び本発明のポリペプチド複合体の重鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。そのポリヌクレオチドは、好ましくは、発現された重鎖をホモ二量体として、宿主細胞が増殖している培地中に分泌させる配列を含む。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含む任意の起源の細胞でもよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。
【０１５５】
同じ宿主細胞を、異なる標的に対する特異性を有する結合ドメインを含む重鎖をコードする第二ベクターでトランスフェクトすると、二つの構造体及びホモ二量体とヘテロ二量体の混合物の会合物が共発現される。ホモ二量体は同系の抗原に対して特異性を示し、ヘテロ二量体は両方の抗原に結合する。
【０１５６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体の少なくとも一つのエフェクター鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含む任意の起源の細胞でよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。あるいは、エフェクター鎖は、当分野で知られている方法を使って合成されてもよい。
【０１５７】
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体の少なくとも一つの重鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含む任意の起源の細胞でよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。あるいは、上記重鎖は、当分野で知られている方法を使って合成されてもよい。
【０１５８】
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体の少なくとも一つの重鎖及び少なくとも一つのエフェクター鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含むどの起源の細胞でもよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。あるいは、これらの鎖は、当分野で知られている方法を使って、独立して合成され会合されてもよい。
【０１５９】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも一つの重鎖のホモ二量体もしくはヘテロ二量体のポリペプチド複合体を発現するトランスジェニック生物を提供する。そのトランスジェニック生物は、ヒトではない脊椎動物もしくは哺乳類、植物又は昆虫でもよい。
【０１６０】
本発明はまた、本発明の第一態様のクラス特異的重鎖のみ抗体及びそのＶＨドメインを、本発明のトランスジェニック生物を抗原で免疫することによって産生する方法を提供する。
【０１６１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、上記生物はマウスである。
【０１６２】
健康管理の用途で使う抗体及びポリペプチド複合体を産生するには、大量に生産する系が必要であり、その例は先に詳細に考察してある。このような系としては、大量に栽培もしくは飼育する方法に適した植物（例えばトウモロコシ）、トランスジェニックのウシ及びヒツジ、鶏及び昆虫の幼虫がある。細胞培養及び生殖細胞系列の方法に代わるものとしてウイルス感染（例えば昆虫の幼虫や細胞系へのバキュロウイルスの感染）を含む他の産生法も、当業者にはよく知られたものになるだろう。
【０１６３】
これらの方法及び当分野で知られている他の適切な方法は、本発明のポリペプチド結合複合体を製造するのに使用できる。ホモ二量体及び／又はヘテロ二量体の製造はこれらの方法を使って達成できる。
【０１６４】
＜本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド複合体の使用＞
本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド結合複合体には、多数の用途がある。
【０１６５】
例えば、本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド複合体には、二重特異性及び多重特異性のポリペプチド複合体が含まれる。これらの複合体は、例えば、感染症の治療と予防に使う治療剤として特に有利である。
【０１６６】
本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド結合複合体は、細胞化学的ラベリング法、ターゲッティング法、治療及び診断を実施するのに有用である。
【０１６７】
モノ抗体療法では、例えば、単一の結合部位の欠失をもたらす突然変異のために病原体の免疫回避が起こり、抗体の治療効果が消失するであろう。同じ病原体の異なる抗原を認識するヘテロ二量体のポリペプチド複合体を産生すればこの問題を克服できる。本発明のポリペプチド複合体中の異なる特異性を有する少なくとも二つの結合ドメインを、細胞−細胞の相互作用及び細胞／病原体の相互作用の両方を高めるために使用することもできる。
【０１６８】
本実施形態では、本発明のポリペプチド複合体は、例えば、病原体とマクロファージ又は腫瘍細胞とＴ細胞などの二つの細胞型の間をポリペプチド複合体で架橋するのに使用できる。あるいは、そのポリペプチド複合体は、重鎖定常領域だけで提供されているエフェクター機能によって、同じ病原体の二つ以上のエピトープを認識してもよい。
【０１６９】
あるいは、二重特異性ポリペプチド結合複合体はインビボで標的の細胞又は組織に対して使用されてもよく、次いで循環しているエフェクター分子又は造影剤を捕獲できる。例えば、二重特異性腫瘍ターゲッティング剤はプロドラッグ変換複合体を捕獲し次いでプロドラッグを反応剤に部分的に変換するために使用され得る。また、エフェクター剤と組み合わせた二重特異性結合複合体と多重特異性結合複合体は、結合ドメインを選択することによって一種以上の病原体に結合し、破壊するために使用されてもよい。あるいは、同じ病原体の異なる抗原を認識する二種以上の結合ドメインの存在は臨床面で有利であり、病原体内の突然変異が原因の病原体の免疫回避や医薬の余剰が起こる可能性を低める。
【０１７０】
本発明は、本発明の第一態様の重鎖のみ抗体又はそのフラグメント、本発明の第二態様のポリペプチド鎖とポリペプチド複合体、及び本発明の第三態様のエフェクター鎖とポリペプチド複合体を提供する。これらは全て、ヒトの医薬の用途に適しているので、本発明は、本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患の予防及び／又は治療に使う医薬を調製する際の、本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体の使用も提供する。重鎖とエフェクター鎖は、前記医薬の投与方法と作用によって、ともに又は別個に配合されてもよい。
【０１７１】
本発明の医薬組成物と医薬は、一般に、患者に投与する前に配合され得る。
【０１７２】
例えば、重鎖のみ抗体又はポリペプチド複合体は、特に凍結乾燥しなければならないとき、安定剤と混合してもよい。糖類（例えば、マンニトール、スクロース又はトレハロース）を添加すると、一般に、凍結乾燥中、安定性を付与し、好ましい安定剤はマンニトールである。ヒト血清アルブミン（好ましくは組換え体）も安定剤として添加できる。糖類の混合物、例えばスクロースとマンニトール、トレハロースとマンニトールなども使用できる。
【０１７３】
本発明の組成物には緩衝剤を添加してもよく、緩衝剤としては、例えば、トリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、グリシン緩衝剤又は好ましくはリン酸緩衝剤（例えば、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムを含有する）がある。緩衝剤は、ｐＨが７．２から７．８の間、特に約７．５になる量で添加することが好ましい。
【０１７４】
凍結乾燥した後、再構成するために注射用滅菌水が使用されてもよい。凍結乾燥された固形物を、ヒト血清アルブミン（好ましくは組換え体）を含む水性組成物で再構成することもできる。
【０１７５】
一般に、重鎖のみ抗体とポリペプチド複合体は、精製された形態で薬理学的に適正な担体とともに利用され得る。
【０１７６】
したがって、本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与することからなる患者の治療方法を提供する。患者は好ましくはヒトであり、小児（例えば幼児又は乳児）、１０歳台のヒト又は成人でもよいが一般に成人であろう。
【０１７７】
本発明はまた、医薬として使用する本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体を提供する。
【０１７８】
本発明はまた、患者を治療するのに使う医薬を製造する際の本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体の使用も提供する。
【０１７９】
これらの使用、方法及び医薬は、好ましくは以下の疾患及び障害を治療するのに利用され、その疾患及び障害は、創傷の治癒；新生物、黒色腫、肺、結腸直腸、骨肉腫、直腸、卵巣、肉腫、頚管、食道、乳房、膵臓、膀胱、頭部と頚部などの充実性腫瘍を含む細胞増殖傷害；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管新生障害、カポジ肉腫などの骨髄増殖性障害；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬と気道炎症、喘息、免疫障害及び臓器移植拒絶を含む自己免疫／炎症障害；高血圧、水腫、狭心症、アテローム性じゅく状硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流障害及び虚血を含む心血管と脈管の障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗鬆症と肥満症、ＡＩＤＳ及び腎臓病を含む代謝異常；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症；胎盤に関連する病的状態；並びに免疫療法を利用する他の病的状態である。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の重鎖のみ抗体又はポリペプチド結合複合体の診断剤、予後治療剤又は治療用造影剤としての使用方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の重鎖のホモもしくはヘテロの二量体だけ又はこれを本発明の一つ以上のエフェクター（軽）鎖と組み合わせた治療用造影剤、細胞化学の試薬又は診断剤としての使用方法を提供する。
【０１８１】
本発明は、本明細書に記載されている重鎖のみ抗体又はそのフラグメントの細胞内結合試薬又は抗体酵素としての使用方法を提供する。好ましい重鎖のみ抗体のフラグメントは、可溶性の抗原特異的ＶＨ結合ドメインである。
【０１８２】
本発明はまた、本発明の抗原特異的単鎖抗体又はＶＨ結合ドメインの酵素阻害剤又は受容体封鎖剤としての使用方法を提供する。好ましい重鎖のみ抗体のフラグメントは、可溶性の抗原特異的ＶＨ結合ドメインである。
【０１８３】
本発明はまた、エフェクター分子に融合させたＶＨドメインの治療剤、造影剤、診断剤、アブザイム又は試薬としての使用方法を提供する。
【０１８４】
＜一般技術＞
本明細書で使用されている技術用語と科学用語は、特に定義しない限り、当業者（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成技術及び生化学の当業者）が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。分子、遺伝子及び生化学の方法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）並びに化学的方法の標準方法が使用される。さらに、標準の免疫学的方法として、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．がある。
【０１８５】
本発明の二価及び多価のポリペプチド複合体、単一重鎖抗体及びそのフラグメントの製造のために、任意の適切な組換えＤＮＡ技術が使用されてもよい。ポリペプチド複合体又は抗体の鎖各々をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドなどの典型的な発現ベクターが構築される。免疫グロブリンを酵素で及び化学的に細分して生成したフラグメントを分離する確立された適切な任意の方法が使用されてもよい。
【０１８６】
本発明はまた、トランスジェニックマウス内で重鎖のみ抗体を発現する構造体を含み、本発明のポリペプチド複合体を構築し発現するベクターを提供する。
【０１８７】
ポリペプチド鎖以外の鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する単一ベクターが構築されてもよいことは高く評価されるであろう。例えば、二つの異なる重鎖をコードするＤＮＡ配列は、同じプラスミドの異なる位置に挿入されてもよい。
【０１８８】
あるいは、各ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を、個々に一プラスミドに挿入して、各々特定のポリペプチド鎖をコードする多数の構築されたプラスミドを製造してもよい。配列を挿入するプラスミドは互換性のある方が好ましい。
【０１８９】
続いて、各プラスミドは、各宿主細胞がポリペプチド複合体中の各ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を含有するように、宿主細胞を形質転換するのに使用される。
【０１９０】
細菌系内でクローン化するのに適切な発現ベクターとしては、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐｃＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４及びＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ、又はこれらのいずれかの誘導体が使用されてもよい。
【０１９１】
酵母系内にクローン化するのに使用する適切な発現ベクターとしては、２ｍｉｃｒｏｎプラスミドの複製起点に基づいたプラスミドが挙げられる。
【０１９２】
適正な哺乳類の遺伝子のプロモーター配列を含有する任意のプラスミドは、哺乳類系内でのクローン化に使用されてもよい。昆虫又はバキュロウイルスのプロモーター配列は、昆虫細胞の遺伝子を発現させるのに使用されてもよい。このようなベクターとしては、例えばｐＢＲ３２２、ウシ乳頭腫ウイルス、レトロウイルス類、ＤＮＡウイルス類及びワクシニアウイルス類由来のプラスミドがある。
【０１９３】
ポリペプチド複合体又は抗体を発現のために使用されてもよい適切な宿主細胞としては、細菌、酵母及び真核細胞例えば昆虫もしくは哺乳類の細胞系、トランスジェニック植物、昆虫、哺乳類及び他の無脊椎動物もしくは脊椎動物の発現系が挙げられる。
【０１９４】
＜本発明のポリペプチド複合体及び単一重鎖抗体＞
用語：本発明の「ポリペプチド複合体」、「単一重鎖抗体」及び「異種重鎖遺伝子座」は、例えば、類縁の細胞ホモログ、他の種由来のホモログ及びその変異体もしくは誘導体などの任意の供給源から得られる同族のポリペプチド及び核酸配列を含むことは当然明らかであろう。
【０１９５】
したがって、本発明は、本明細書に記載されている上記ポリペプチド複合体と抗体の変異体、ホモログ又は誘導体を含む。
【０１９６】
本発明の文脈では、同族配列は、少なくとも３０個、好ましくは５０、７０、９０又は１００個のアミノ酸を超えるアミノ酸レベルで、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％相同で好ましくは少なくとも９８又は９９％相同であるアミノ酸配列を含むと考えられる。相同性は類似性（すなわち類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）によって検討することもできるが、本発明の文脈では、相同性は配列の同一性で表現する方が好ましい。
【０１９７】
本発明には、本発明のポリペプチド複合体と抗体を製造するのに使う構築された発現ベクター及び形質転換された宿主細胞も含まれる。
【０１９８】
個々の鎖は、同じ宿主細胞内で発現された後、活性型の完全なポリペプチド複合体又は重鎖のみ抗体を提供するために回収されてもよい。本発明の好ましい形態では、個々の重鎖は、宿主細胞によって処理されて、その細胞から有利に分泌される完全なポリペプチド複合体又は抗体を形成すると考えられる。好ましくは、エフェクター鎖は、宿主細胞又は合成手段によって別個に産生される。
【０１９９】
組換え抗体のポリペプチド複合体の調製法は、上記参照文献及び例えばＥＰ−Ａ−０ ６２３ ６７９；ＥＰ−Ａ−０ ３６８ ６８４及びＥＰ−Ａ−０ ４３６ ５９７にも記載されている。
【０２００】
＜トランスジェニック生物の免疫＞
さらなる態様で、本発明は、抗原を、本発明のトランスジェニック生物に投与することを含む本発明の抗体の製造方法を提供する。
【０２０１】
本発明のトランスジェニック生物から産生される抗体及びポリペプチド複合体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそのフラグメントが挙げられる。ポリクローナル抗体が必要なときは、トランスジェニック動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、抗原で免疫し、免疫された動物から血清を集めて、公知の方法で処理されてもよい。ポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する抗体を含有するとき、対象のポリクローナル抗体は、当業者にはよく知られている免疫親和性クロマトグラフィー及びこれに類似の方法で精製できる。また、ポリクローナル抗血清を産生させ処理する技術も、当分野で知られている。
【０２０２】
＜本発明のポリペプチド結合複合体及び抗体の使用方法＞
本発明のポリペプチド複合体及び抗体とそのフラグメントは、インビボでの治療と予防の用途、インビトロとインビボで診断する際の用途、インビトロでの検定と試薬の用途などに利用されてもよい。
【０２０３】
本発明のポリペプチド複合体と抗体を治療と予防に用いる方法には、それらを、ヒトなどの受容哺乳類に投与するステップが含まれる。
【０２０４】
実質的に純粋なポリペプチド複合体及び抗体のそのフラグメントを少なくとも９０〜９５％の均質性で含有しているものが哺乳類に対して投与するのに好ましく、そして特に哺乳類がヒトの場合、医薬の用途には、９８〜９９％以上の均質性が最も好ましい。所望どおりに部分的に又は均質に精製されたならば、本明細書に記載のポリペプチド複合体と重鎖のみ抗体は、診断又は治療（体外の場合を含む）に使うか又は当業者に知られている方法を使って検定法を開発して実施するのに使用されてもよい。
【０２０５】
一般に本発明のポリペプチド複合体と抗体は、精製された形態で、薬理学的に適正な担体とともに利用される。典型的には、これら担体としては、水溶液もしくはアルコール／水溶液、乳濁液もしくは懸濁液があり、これらは生理食塩水及び／又は緩衝媒体を含んでもよい。非経口用の賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム及び乳酸化リンゲル液がある。
【０２０６】
ポリペプチド複合体を懸濁液に保持することが必要な場合、生理的に許容できる適切なアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギネートなどの増粘剤から選択してもよい。
【０２０７】
静脈内用賦形剤としては、流体と栄養素の補充剤及び電解質の補充剤、例えばリンゲルのデキストロースに基づいたものが挙げられる。また、保存剤などの添加剤、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスが存在していてもよい（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０２０８】
本発明のポリペプチド複合体及び抗体とそのフラグメントは、別個に投与される組成物として又は他の試薬とともに使用できる。これらは、各種の免疫治療用薬剤、例えばシクロスポリン、メトトレキサート、アドレアマイシン、シスプラチナム又はイムノトキシンを含んでもよい。あるいは、本発明のポリペプチド複合体は、酵素とともに使用して、プロドラッグをその活性部位で変換できる。
【０２０９】
医薬組成物は、本発明の選択された抗体とともに又は本発明の選択された抗体の組合せとともに、各種の細胞傷害性又は他の試薬の「カクテル」を含んでもよい。
【０２１０】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に公知のどの経路でもよい。特に制限を含まない免疫療法を含む治療法の場合、本発明のポリペプチド複合体又は抗体は、どの患者にも標準の方法で投与できる。その投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺又はカテーテルを使って適切に行う直接注入を含む任意の適切な様式によって行なわれる。投与量と投与の頻度は、臨床医が考慮する患者の年齢、性別及び症状、他の医薬の同時投与、計器の示度などの他のパラメータに依存するであろう。
【０２１１】
本発明のポリペプチド複合体と抗体は、凍結乾燥して貯蔵し、使用する前に適切な担体で再構成することができる。既知の凍結乾燥法と再構成法を利用できる。凍結乾燥と再構成は、機能活性損失を起こし得るので、補償するため使用レベルを上方に調節しなければならないことがあるかもしれないことは当業者には当然明らかである。
【０２１２】
さらに本発明のポリペプチド複合体と抗体は、診断のために使用できる。例えば、本明細書に記載の抗体は、疾患状態中に特異的に発現されるか又はそのレベルが所与の疾患状態中に変化する抗原に対して生成又は発生されてもよい。
【０２１３】
診断又は追跡などの特定の目的のためには、ラベルを付加してもよい。適正なラベルとしては、限定されないが、放射能ラベル、ＮＭＲスピンラベル及び蛍光ラベルのいずれかがある。これらのラベルを検出する手段は、当業者にはよく知られている。
【０２１４】
本発明のポリペプチド複合体と抗体又はそのカクテルを含有する組成物は予防及び／又は治療のために投与できる。
【０２１５】
本発明のポリペプチド複合体又は抗体を一種以上含有する組成物は、予防と治療の段階で、哺乳類中の選択された標的細胞集団を変質させ、不活性化し、殺し又は除去することを促進するのに利用されてもよい。さらに、本明細書に記載されているポリペプチド複合体と抗体の選択されたレパートリーは、細胞の異種コレクション由来の標的細胞集団を殺し、減少させ又は有効に除去するために、体外又はインビトロで選択して使用されてもよい。
【実施例１】
【０２１６】
予備実験で、二つのラマＶＨＨエキソンが、ヒト重鎖の多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）セグメントと連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）（Ｊ）セグメントに連結され、さらにＣμ、Ｃδ、Ｃγ２、Ｃγ３ヒト定常領域遺伝子とヒト重鎖免疫グロブリン３’ＬＣＲがそれに続く重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを準備した。前記ヒトのＣγ２とＣγ３の遺伝子は、Ｇ→Ａのスプライス変異を含有していた。Ｆｒｔ部位が存在していると、Ｆｌｐにより仲介される組換えによって、多コピー導入遺伝子アレイから単一コピートランスジェニックマウスを生成することができる。しかし、Ｇ→Ａスプライス変異を有するトランスジェニック遺伝子座由来の配列は、異所スプライシングであるが不完全なＣＨ１の除去を示した（図９）。
【０２１７】
＜構造体＞
この問題を克服するため、標準の方法を使って、ゲノムコスミドライブラリーをＶＨ遺伝子を含有するクローンについてスクリーニングした。一つ（又は二つ以上）の異なる生殖細胞系ＶＨを、その配列に基づいて無作為に選んだ（ヒトＶＨの場合は五つの属クラス）。親水性アミノ酸のコドンを、ＩＭＧＴナンバリング法（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（１９９９）によって、４２、４９、５０及び５２の位置に導入した。これらのＶＨ遺伝子は、カスタムメイドのリンカーを使う直接クローン化法又は相同的組換え法などの標準法によってＢＡＣベクター中に組み入れられた。
【０２１８】
二つのクローンすなわち、ヒト重鎖のＤとＪのセグメント、Ｃμ（ＩｇＭ）及びＣδ（ＩｇＤ）を含有するクローン １０６５ Ｎ８並びにＣγ３（ＩｇＧ３）遺伝子を含有するクローン１１１５ Ｎ１５を、ヒトゲノムＰａｃライブラリー ＲＰＣＩ−１１（ＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｃｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＳＡ）から選択した。異なるヒトゲノムライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来のＢａｃ ｃｌｏｎｅ １１７７１を、Ｃγ２（ＩｇＧ２）遺伝子及び免疫グロブリン重鎖ＬＣＲの原料として使用した（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５；１８６（６）：８４５−５８）。
【０２１９】
標準法を使って、Ｃγ３とＣγ２の遺伝子を、別個に、ｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローン化した。同様に、残りの任意のＩｇ定常領域をこれらのＢＡＣからクローン化できる（ＩｇＡ、ＩｇＥ）。ＣＨ１エキソンの完全な欠失は、各定常領域のＣＨ１エキソンの隣に位置する配列を使って、相同的組換え法（Ｉｍａｍ ｅｔ ａｌ．，（２００１））によって達成した。Ｆｒｔ部位を、Ｃμスイッチ領域の前に任意選択的に導入し、標準的な手段で（例えばｒｏｓａ−ｆｌｐマウスと交配することにより）インビボにてｆｌｐリコンビナーゼで処理することによって、多コピー遺伝子座から単一コピー遺伝子座を生成させることができた（図１０）。
【０２２０】
別個のＶＨ遺伝子、ＤとＪのセグメント及びＣとＬＣＲのエキソンを、通常の制限消化−連結法又は相同組換え法（又は両方を混合した方法）又は任意の他のクローン化法によって、一つのＢＡＣ中にクローン化した。次いでさらに別の構造体を作製することができた。
【０２２１】
＜ＩｇＭのみ遺伝子座＞
ＩｇＭ構造体を得るため（図１１）、ヒトのＤとＪの重鎖セグメント及びＣμが続く一つ以上のＶＨ遺伝子（好ましくは、可溶性を提供するため遺伝子工学的に処理されたヒトＶＨ遺伝子又はラクダＶＨＨ遺伝子）をＢＡＣ中にクローン化した（本方法については上記を参照のこと）。この場合、Ｃμ領域だけが、最終のＢＡＣ中にクローン化された。
【０２２２】
＜ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座（Ｃδは任意選択的）＞
ＩｇＭプラスＩｇＧ構造体を得るため（図１２）、ヒトのＤとＪの重鎖セグメント、Ｃμ（ＣＨ１エキソンは含有しないがＣＨ４エキソンは含有する）、（任意選択的なＣδ）及び修飾されたヒトＣγ２とＣγ３遺伝子と３’ＬＣＲが続く一つ以上のＶＨ遺伝子（好ましくは、可溶性を提供するため遺伝子工学的に処理されたヒトＶＨセグメント又はラクダＶＨＨ遺伝子）をＢＡＣ中にクローン化した。ＩｇＧのみ遺伝子座を生成させるために、ｌｏｘＰ部位を、標準クローン化ステップ（上記）によって導入し次いでそのＢＡＣを２９４ Ｃｒｅ大腸菌株中で成長させ（Ｂｕｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．）、次いでｃｒｅにより仲介される組換え法によってＩｇＧのみ遺伝子座を産生する細菌を得た。さらなる構築の詳細については先の説明を参照のこと。
【０２２３】
＜ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座（Ｃδは任意選択的）＞
ＩｇＭプラスＩｇＧ構造体を得るため（図１３）、ヒトのＤとＪの重鎖セグメント、Ｃμ（ＣＨ１とＣＨ４を含有する）、（任意選択的なＣδ）及び修飾されたヒトＣγ２とＣγ３遺伝子と３’ＬＣＲが続く一つ以上のＶＨ遺伝子（好ましくは、可溶性を提供するため遺伝子工学的に処理されたヒトＶＨ遺伝子又はラクダＶＨＨ遺伝子）をＢＡＣ中にクローン化した。ＩｇＧのみ遺伝子座を生成させるために、ｌｏｘＰ部位を、標準クローン化ステップ（上記）によって導入し次いでそのＢＡＣを２９４ Ｃｒｅ大腸菌株中で成長させ（Ｂｕｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．）、次いでｃｒｅにより仲介される組換え法によってＩｇＧのみ遺伝子座を産生する細菌を得た。
【０２２４】
＜トランスジェニックマウス、飼育とゲノタイピング＞
受精卵に対する標準マイクロインジェクション法又は胚幹細胞トランスフェクション法によって、前記最終ＢＡＣを、トランスジェニックマウスに導入した。
【０２２５】
５’末端と３’末端の遺伝子座プローブを使って末端ｔａｉｌＤＮＡをサザンブロット分析することによって（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ １９７５）、トランスジェニック遺伝子座を、完全性とコピー数についてチェックした。初代マウス（ｆｏｕｎｄｅｒ）は、μＭＴ−／−バックグランドの系統中で繁殖させた。その遺伝子座の異なる領域各々についてプライマーを使って標準ＰＣＲ分析することによって、ゲノタイピングを実施した。Ｃγ２とＣγ３の両方から全ＣＨ１エキソンを除かれたトランスジェニックマウス（ＨＬＬラインを有するもの及びＣμとＣδの遺伝子を有しないもの）のＢＭ ｃＤＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を分析したところ、そのトランスジェニック遺伝子座は、ＶＤＪを組換えることができるのみならず、そのＩｇＧの転写産物が、ラマやラクダのＨＣＡｂに見られる転写産物に似ていることを示した。
【０２２６】
＜免疫組織化学＞
脾臓をＯＣＴ化合物中に包埋した。クライオスタットによる５μｍの凍結切片をアセトン中で固定し、すでに述べられているようにして（Ｌｅｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８）単一又は二重の標識を行った。モノクローナル抗体抗Ｂ２２０／ＲＡ３−６Ｂ２、モノクローナル抗体抗ＣＤ１１ｃ／Ｎ４１８（Ｓｔｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）にはハイブリドーマ培養上澄み液が用いられた。ペルオキシダーゼを連結したヤギ抗ヒトＩｇＧ及びヤギ抗ヒトＩｇＭをＳｉｇｍａから入手した。第二ステップの試薬は、ペルオキシダーゼの標識をつけた、ヤギ抗ラットＩｇ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）もしくはヤギ抗ハムスターＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）及びヤギ抗ラットＩｇアルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）であった。
【０２２７】
図１５は、μＭＴ−／−バックグランド中のμＭＴ−／−、ＷＴとＨＬＬ及びＨＬＬ−ＭＤのトランスジェニックマウス由来の脾臓の５μｍ凍結切片を免疫組織化学分析した結果を示す。切片を、Ｂ細胞は抗Ｂ２２０（ブルー）で染色し、そして樹枝状細胞は抗ＣＤ１１ｃ／Ｎ４１８（褐色）で染色した。矢印はＢ細胞の小クラスターの位置を示す。
【０２２８】
＜フローサイトメトリー分析＞
単一細胞の懸濁液を、（Ｓｌｉｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３）、ＰＢＳ中のリンパ系器官から調製した。約１×１０６個の細胞を抗体とともに、９６ウェルプレート中のＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内で４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で２回洗浄した。各試料について、ＦＡＣＳｃａｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使って、３×１０４個の細胞を計測した。ＦＡＣＳのデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを使って分析した。四色分析を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで実施した。以下のｍＡｂ：ＦＩＴＣ複合抗Ｂ２２０−ＲＡ３−６Ｂ２及びＰＥ複合抗ＣＤ１９をＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。抗ＣＤ１９及び抗Ｂ２２０で染色した脾臓細胞のＦＡＣＳスキャンデータを図１５の下部のパネルに示した。
【０２２９】
図１５の左側に、ＨＬＬ系−ＦｌｐｅＲトランスジェニック系を交配することによるインビボＦｌｐ組換えを提示してあり、これは組換え体の脾臓細胞に関するＦＡＣＳスキャンデータを支持し、直接生成した元のＨＬＬ−ＭＤ系に見られるようなＢ細胞のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）を示している。右側には、Ｃａｇ Ｃｒｅトランスジェニック系の飼育することによるインビボＣｒｅ組換えと単一コピーの組換え体の脾臓細胞に関するＦＡＣＳデータを示してある。
【０２３０】
＜免疫付与とハイブリドーマの産生（図１４）＞
二つのラマＶＨＨドメイン、ヒトのＤとＪの領域及びＩｇＧ２とＩｇＧ３の定常領域（ＣＨ１ドメインは含まない）からなる重鎖のみ抗体の遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスを作製した。
【０２３１】
８週齢のマウスを、大腸菌熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）で免疫した。Ｓｐｅｃｏｌアジュバント（ＩＤＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄｔ，ＮＬ）を含有する抗原２０μｇ又は５μｇを、それぞれ、０日目、１４日目、２８日目、４２日目に皮下注射し５０日目に腹腔内注射した。０日目、１４日目及び４５日目に採血した。３回ブーストを行った後、Ｈｓｐ７０タンパク質で免疫したＨＬＬ−ＭＤ１マウス３匹のうち１匹に低力価の抗原特異的抗体が検出された（図１４）。
【０２３２】
標準の脾臓細胞を黒色腫細胞系と融合させて、ｈｓｐ７０タンパク質に対するモノクローナル抗体をモノクローナルハイブリドーマ細胞系中に生成させた。その抗ＨＳＰ７０ＨＣＡｂは、ヒトＩｇＨＤ３−１０セグメントに組換えられたＤ領域に最も近いラマＶＨＨセグメント（ＶＨＨ ２）（ａｃｃ．ｎｕｍ．Ｘ１３９７２）及びヒトＩｇＨＪ４−０２セグメント（ａｃｃ．ｎｕｍ．Ｘ８６３５５）からなっている。頻度は高くないが、前記ＶＨＨは、生殖細胞系の配置構成と比べて図９Ａに示すアミノ酸の変化を起こす突然変異を数回行なう。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果もそのハイブリドーマ内に生産的ＩｇＨ転写体を一つだけ示したが、これは他の転写体が全く生成しないことを示唆している。αＨＳＰ７０ ＩｇＧ２抗体は重鎖のみ二量体として分泌される（変性ゲル（二量体）及び非変性ゲル（モノマー）条件下のウエスタンブロット法、図１４）。ＣｌｏｎａｌＣｅｌｌＴＭ−ＨＹ ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を生産者の指示に従って使用し、脾臓細胞を、５６日目に、Ｓｐ２−Ｏ−Ａｇ１４黒色腫細胞（Ｒ．Ｈａｐｅｒｅｎ氏からの寄贈）と融合させた。
【０２３３】
二つのラマＶＨＨドメイン、ヒトのＤとＪの領域、ヒトのＩｇＭ及びＩｇＧ２とＩｇＧ３の定常領域（全てＣＨ１ドメインは含まない、図１２）からなる重鎖のみ抗体の遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスを、ＴＮＦαで免疫してＨＣ−ＩｇＭ抗体を得た。３匹のマウスのうち１匹が、標準ＥＬＩＳＡ検定法で陽性の血清を示した。標準的な黒色腫融合によって陽性のＩｇＭハイブリドーマを得た（図１６）。非還元条件下、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂでゲル濾過した後、カラムの各画分を還元条件下のゲルに負荷し次いで抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰによって検出した（図２０）。非還元条件下での分画は、ＨＣ−ＩｇＭが、ヒトの対照ＩｇＭと同じ大きさ（ＨＣ−ＩｇＭには欠けている軽鎖とＣＨ１ドメインの分子量を差し引いた後）の多量体抗体として分泌されることを示した。各カラム画分の還元条件下でのゲル分画は、図２０に示す予想モノマーを示した。
【０２３４】
＜血清Ｉｇ ＥＬＩＳＡ＞
１５〜２５週齢のマウスから血液を、ＥＤＴＡをコートしたチューブに集めて、室温（ＲＴ）で１５分間遠心し、次いでその上澄み液をＰＢＳで１：５の比率で希釈した。９６ウェルプレートを、５ｍｇ／ｍｌ濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＹＥＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）で２時間コートし、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液（１．５％ＢＳＡ／１．５％粉乳／０．１％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）でＲＴにて１時間ブロックし、次にＰＢＳで３回洗浄した。血清試料と標準液（ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ））の希釈シリーズを負荷して２〜４時間インキュベートし次いでプレートをＰＢＳで６回洗浄した後、第二抗体（ＨＲＰに連結したヤギ抗ヒトＩｇＧ又はヤギ抗ヒトＩｇＭを１：２０００の比率で希釈したもの（Ｓｉｇｍａ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ））を添加した。希釈は全てブロッキング溶液で実施した。ＲＴで１〜２時間インキュベートしてＰＢＳで洗浄した後、ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。
【０２３５】
ＩｇＧ２ファージライブラリーから抗原特異的可溶性ｓｄＡｂを検出するＥＬＩＳＡ試験の結果を図１６に示す。可溶性ｓｄＡｂを、抗原をコートしたプレートに対する第一抗体として使用し続いてマウス抗ｍｙｃ抗体及びＨＲＰ複合ヤギ抗マウス抗体を使った。ＰＯＤを基質として使った。下部のパネルは、制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉによるクローンのフィンガープリンティングを示し、これはＢ．Ｐｅｒｔｕｓｉｓに対するｓｄＡｂをコードする５個の異なるインサートを示している。
【０２３６】
＜抗体ライブラリーの構築とスクリーニング＞
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を使って、ＤＫＴＰで免疫した単一コピーＩｇＧのみマウスの脾臓から全ＲＮＡを単離した（図１２ ｃｒｅ処理をした後）。ｏｌｉｇｏ ｄＴを使ってｃＤＮＡを作製した。ｖｈｌ ｂａｃｋ ＳｆｉＩプライマー（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３）をｈＩｇＧ２ｈｉｎｇｒｅｖプライマー（５’−ＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣ−３’）と組み合わせた特異的プライマーを使用してＰＣＲによって、ＶＨＨのＤＪフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。その増幅されたＶＨＨのＤＪフラグメント（約４００ ｂｐ）を、Ｓｆｉ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで消化し、ゲルで精製し次いでＳｆｉ Ｉ／ＮｏｔＩで消化したファージミドベクターｐＨＥＮ−１中にクローン化した。
【０２３７】
ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞に形質転換して、ヒト単一ドメイン抗体を生産する抗体ライブラリーを得た。プラスティック（希釈されていないワクチンをコートしたイムノチューブ）に吸着させたワクチン抗原にパニングを行なって、２ラウンドの選択を実施した。制限分析と配列決定は標準の方法でおこなった。
【０２３８】
＜重鎖のみ遺伝子座のＲＴ−ＰＣＲ＞
ＨＬＬ−ＭＤ遺伝子座が、多様な抗体レパートリーを産生する際に正常な遺伝子座として機能するかどうかを、パイエル板由来のｃＤＮＡに対してＩｇＧ２とＩｇＧ３の特異的プライマーを使って得たＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を決定することによって試験した。図１７は、免疫されていないマウス（左パネル）と免疫されたマウス（右パネル）由来のクローンの体細胞変異のいくつかの例を示す。これらのマウスは、ＩｇＧのみ遺伝子座、大腸菌ｈｓｐ７０、百日咳菌溶解物、破傷風トキソイドで免疫されたものであった。灰色の影付きの部分はＥＲＫＣＣＶで始まるＩｇＧ２ヒンジ領域である。
【０２３９】
パイエル板のＲＴ−ＰＣＲによる分析は、両ＶＨを使うことを示したが、配列を決定された全ての抗体は、ＶＨ２を再構成していた。レパートリーの多様性の起源は、ＤとＪのセグメントの選択及びＶ−ＤとＤ−Ｊの結合部によって形成されたＣＤＲ３領域である。ヒトＪセグメントを使うことは、ヒトの再構成に見られるのと類似しており、ＪＨ４とＪＨ６のセグメントが最も頻繁に使用される。
【０２４０】
この分析は、多様な抗体のレパートリーに寄与するために、両ＶＨ、異なるヒトＤセグメント及び全てのヒトＪセグメントを使われることを示した。再構成された各遺伝子を、その生殖細胞系のカウンターパートすなわちトランスジェニック構造体中の元のＶＨと比較することによって、ＩｇＧ３をスイッチされたＢ細胞が存在し、体細胞の変異が起こっていることも分かった（図１７参照）。したがって、ヒト重鎖のみＩｇＧ抗原受容体は、Ｂ細胞成熟に必要な信号を提供できる。
【０２４１】
＜免疫染色＞
図１８は、Ａ５抗体（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）を含有する応答プラスミドで追加的にトランスフェクトされたＴｅｔ−ｏｎ細胞系の一つを免疫染色した結果を示す。上のパネルは、ドキシサイクリンによって細胞質中に誘発され産生したＡ５抗体（赤色）及びＤＡＰＩによる細胞核の染色（青色）を示す。下のパネルは、核の中にｒｔＴＡを発現する細胞が、誘発（上のパネル）によってＡ５を産生する細胞であることを示す。下記配列を有するｒｔＴＡに対するヒトＨＣＡｂのうちの一種で染色を実施した（緑色）。ＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧを第二ステップとして使用した。Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３にすでに記載されているようにして、Ａ５を検出した。ｒＴＴＡ抗体は下記配列を有するＩｇＧ３であった。
【化１】
【０２４２】
このＩｇＧ３のヒンジは、アミノ酸１９８ ＥＬＫＴＰＬから始まる。比較のため図１７のＩｇＧ２ヒンジ領域を参照されたい。
【０２４３】
＜ウエスタンブロット分析＞
図１９は、ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座（図１０）を含有する異なるトランスジェニックマウス系の血清の、ｃｒｅ処理を行った後（すなわち、ＩｇＭが欠失しＩｇＧのみ残留）のウエスタンブロットを示す。血清は、ｐｒｏｔ Ｇで精製し次いで還元条件下（図１９の右のパネル）及び非還元条件下（図１９の左のパネル）でゲル分画を行なった。対照は、バックグランドのＫＯマウス及び正常なヒトの血清の試料である。ヒト重鎖のみＩｇＧが二量体であることを示す二つのゲルのサイズ間の差に留意されたい。
【０２４４】
図１９に示した信号は、標準の方法によって抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。
【０２４５】
ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座マウスによって産生されるヒトＩｇＭのサイズ分画
ＩｇＭプラスＩｇＧマウス（図１３）由来の血清を、対照のヒト血清の試料と混合した後、非還元条件下でゲル濾過することによって分画した。結果を図２０に示す。カラムの複合体の分子量は、各レーンについて（各画分を示す）左から右に進むにつれて減少する。これら画分（各レーン）を、還元条件下にてゲル電気泳動法で分析した。
【０２４６】
ヒトＴＮＦαで免疫された、ＩｇＭプラスＩｇＧ（図１３）遺伝子座を含有するマウスから作製した多数のハイブリドーマのＥＬＩＳＡ分析を実施した。結果を図２１に示す。図２１の上部２列は抗ヒトＩｇＧを分析した結果であり、次の２列は抗ヒトＩｇＭを分析した結果である。血清試料（二つの矢印）は、このマウスがＩｇＧ抗ＴＮＦα抗体とＩｇＭ抗ＴＮＦα抗体の両者を産生したことを示している。単一矢印は、陽性ＩｇＭハイブリドーマを示す。それらのウェルは、市販のヒトＴＮＦαでコートした。処理は全て標準法で行なった。
【実施例２】
【０２４７】
二重特異性二価抗体を、二つの重鎖のみモノ特異性抗体を結合させることによって生成させた。その第一抗体は、第一特異性とエフェクター機能（可変領域と定常領域それぞれの）をもたらす骨格を形成する。この第一抗体は、第二特異性を有する第二抗体と、新たに設計されたヒンジによって結合させる。このヒンジは、既存のＩｇＧ２のヒンジの配列と類似しているが、システインをプロリンで置換することによって変化させて、抗体二量体のシステインの架橋を防止し、かつプロリンで追加の可撓性を提供して、機能を阻害することがある第二抗体の立体束縛を防止した。
【０２４８】
最初の骨格抗体は、大腸菌ＨＳＰ７０タンパク質に対する抗体であった。このＨＳＰ７０抗原を、先に述べたようにして（上記図１４参照）、重鎖のみ抗体遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスに注射した。標準のハイブリドーマ融合法によって、これらの動物からモノクローナル抗体を生成させた（上記事項参照）。次に、抗ＨＳＰ抗体をコードするｃＤＮＡを、標準のＲＴ−ＰＣＲ組換えＤＮＡ法によってクローン化して、５’末端から３’末端まで（Ｎ末端からＣＯＯＨ末端までのタンパク質の）、開始コドンＡＴＧ、シグナルペプチドの配列、可変ドメインＶＨＨ１（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ参照）、組換えたＤとＪの領域及びＣγ２の定常領域（ＣＨ１領域を欠いている）を含有するが、ストップコドンとポリＡ部位を含むプラスミドを得た（図２２の左上部）。フォワードプライマーとリバースプライマーを使ってクローン化するため、抗ＨＳＰ７０抗体をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【０２４９】
フォワードプライマーは、クローン化を行なうためのＥｃｏＲＩ部位（下線）、有効な翻訳開始配列（太文字）及び通常の開始コドン（灰色の影付き）を提供する
【化２】
であった。
【０２５０】
リバースプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（下線）を提供し通常のストップコドンを保持する
【化３】
であった。
【０２５１】
したがって、増幅によって、ＥｃｏＲＩ部位（下線）を含有するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに、抗ＨＳＰ抗体遺伝子の有効翻訳開始配列（太字）と通常の開始コドン（灰色の影付き）が導入される。
【０２５２】
リバース３’末端プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（下線）を提供し通常のストップコドンを除く
【化４】
であった。これによって、プロモーター配列中にクローン化するためのＥｃｏＲＩ部位、及び発現プラスミドに対して５’末端を、かつ新たなヒンジ配列に対して３’末端をクローン化するためのＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するフラグメント（図２２の頂部から２行目の左）を得た（下記参照）。最後に、そのフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、クローニングのための適正な単一標準末端を提供した。
【０２５３】
第二特異性をもたらす第二クローン化抗体は、ブタレトロウイルス（ＰＥＲＶ）ｇａｇ抗原に対するラマ抗体のＶＨＨドメインを含んでいた（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７（２２）：１２１３２−９，図２２ 頂部右）。抗ｇａｇは、以下のプライマーすなわちフォワードプライマー：
【化５】
及びリバースプライマー：
【化６】
を使って標準のＰＣＲ増幅法で増幅した。これは、５’末端を新しいヒンジを有するフレームにクローン化するためのＸｈｏＩ部位（灰色の影付き）（下記参照）及び３’末端を発現プラスミド中にクローン化するためのＥｃｏＲＩ部位（下線）（図２２右中央）を有する増幅フラグメント（図２２頂部から２行目の右側）を提供する。最後に、そのフラグメントをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断して、クローン化するための一本鎖末端を生成させた。
【０２５４】
これら二つの抗体の配列を、前記新しいヒンジによって組み合わせて一つのダイアボディにした。その新しいヒンジは、クローン化するための５’と３’のオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）（それぞれＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩコンパティブル）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する二つのオリゴヌクレオチドから作製した。このヒンジは、抗ＨＳＰ７０配列の末端及び抗ｇａｇ配列の開始部分を有するフレーム内に位置するように設計した。ヒトＩｇＧ２ヒンジ中に通常存在しているスルフィド架橋が生成することは、システイン（灰色の影付き）をプロリン（下線）で置換することによって防止した。このプロリンは、ヒンジに追加の可撓性を付加して、第一抗体のＣＯＯＨ末端にヒンジによって接続されることになる第二抗体ドメインを適正に機能させる。
【０２５５】
通常のＩｇＧヒンジの配列（システインコドンは灰色の影付き、プロリンコドンは下線）：
【化７】
及びその相補鎖は、
【化８】
及びその相補鎖：
【化９】
で置換した。またこれは、クローン化するためのＨｉｎｄＩＩＩ部位（太字）とＸｈｏＩ部位（イタリック体）とコンパティブルの二つの一本鎖末端を有するフラグメント（白囲み枠のヒンジ、図２２の中央）を提供する。
【０２５６】
これら三つのフラグメント（抗ＨＳＰ７０ ＩｇＧ２、ヒンジ及び抗ｇａｇ）は、次いで鶏アクチンプロモーターとＣＭＶエンハンサー配列を含有するブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（Ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ１１ ｓｋ＋）発現プラスミド（図２２の発現プラスミド）中に、標準の組換えＤＮＡ技術で連結した。このプラスミドが発現されると（下記参照）、図２２の下部に示すダイアボディが生成する。
【０２５７】
ダイアボディ発現プラスミドを増殖させて、標準の方法（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）によって、ＣＨＯ細胞中に、プラスミドｐＧＫ−ｈｙｇｒｏ（トランスフェクトされた細胞を選択させるため）とともに同時トランスフェクトされた（図２３）。ハイグロマイシンを含有する培地で陽性のクローンを選択し、次いで抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ検出法を使ってＣＨＯ細胞が分泌したダイアボディを含有する増殖培地の抗ｇａｇ ＥＬＩＳＡ標準分析（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３）を実施して、ダイアボディを発現した場合、陽性とした。抗ａｇａ活性を試験して陽性であれば、ｇａｇの特異性はそのダイアボディのバックエンド（ＣＯＯＨ末端）にあるので、所与のクローンは恐らく間違いなく全ダイアボディを発現しているであろう。ＨＳＰ７０に関する次のＥＬＩＳＡ分析の結果も陽性であった。プラスミドから発現されたタンパク質が、１１０ｋＤの二量体（図２３の下部に示す）であったことを示すために、５５ｋＤのモノマー（非還元条件と還元条件でのウエスタンブロット、図２３の右）と比較して、非還元条件下及び還元条件下にてＥＬＩＳＡ法で選択したこれらクローンのウエスタンブロットを実施した。したがって、ＥＬＩＳＡ分析結果とウエスタンブロットはともに、ダイアボディが、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって二量体として発現されて培地中に分泌され（＞７０ｎｇ／ｍｌ）そしてその抗体はＨＳＰ７０及びｇａｇの抗原と結合できることを示している。しかし、その二量体のダイアボディ分子が前記抗原の両方に同時に結合できることは示していない。
【０２５８】
したがって、追跡実験を実施した。まず、ｇａｇ抗原をプラスチック製ウェル（図２４中央の第一ウェル）の底に固定した。次いで、クローン１のＣＨＯ細胞上澄み液を適用した後、ダイアボディ（図２４の頂部）を第一抗原（ｇａｇ）で捕獲した（図２４中央の第二ウェル）。続いて、十分に洗浄し、次いで第二抗原（ＨＳＰ７０、図２４中央の第三ウェル）を適用し続いて再び十分洗浄した。二重特異性抗体分子は、両抗原と同時に結合できたならば、第一抗原（ｇａｇ）と結合し次いで第二抗原（ＨＳＰ７０）を捕獲することによってウェルの底に捕獲されているはずである。次いで全複合体をウェルから溶離したところ（図２４中央の右側ウェル）、ダイアボディ体と両抗原が、ウエスタンブロット上に目視できるようになった（図２４の下部）。
【０２５９】
分泌されたダイアボディを収集するために、ＣＨＯクローンを、同じ標準条件下で、抗体をハイブリドーマから集めるのに使用する培地（ＳＩＧＭＡ ハイブリドーマ培地、血清無し）内で増殖させた。
【０２６０】
方法：Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）のウェルに、精製組換えｇａｇタンパク質（ＰＢＳ中１２．５μｇ／ｕｌ）Ｏ／Ｎ ４Ｃをコートした。１％ミルク／１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２時間ブロックした。ＰＢＳ−ミルク−ＢＳＡで２倍に希釈したＣＨＯ−ＤＢクローン１培地（又は対照）を、室温（ＲＴ）で３時間インキュベートした。ＰＢＳ−ミルク−ＢＳＡで２倍に希釈した細菌Ｂ１２１の溶解物（ＨＰＳ７０タンパク質を含有する）を、ＲＴで３時間インキュベートし次いで洗浄した。結合したタンパク質を、２−メルカプトエタノールを含有するレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の試料緩衝液で溶離した。これら試料をウエスタンブロット法で分析した。したがって１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに泳動させ次いでニトロセルロース膜上にブロットした。そのブロットをＰＢＳ−ミルク−ＢＳＡで２時間ブロックし次いで第一抗体とともにインキュベートした。産生物を、眼に見える染色を実施できる酵素に結合された第二抗体を使う標準法で目視可能にした。使用した試薬は下記の通りである。
抗ｇａｇ：ウサギポリクローナル（１：２０００）２時間ＲＴ
抗ダイアボディ体：ヤギαヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２５００）２時間ＲＴ
抗ＨＳＰ７０：モノクローナルＧ２０−３８０培地（１：２）２時間ＲＴ
二次抗体は、ヤギ抗ウサギーＡＰ（１：２０００）２時間ＲＴ及びＨＳＰ７０モノクローナルに対するヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２５００）２時間ＲＴであった。
【０２６１】
タンパク質のバンドを目視可能にするために、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と反応する第一ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（紫色）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応する第二ＤＡＢ基質（褐色）を使用した。
【０２６２】
洗浄ステップは全て、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で実施した。
【０２６３】
一成分を除外するか又はダイアボディを産生しないＣＨＯ細胞由来の培地を添加することによって対照試験を実施した（図２４）。すなわちダイアボディ無しの適用（トランスフェクトされていないＣＯ細胞由来の培地）を欠いているのでｇａｇのみを有するレーン２；ウェルの底にｇａｇを欠いているので（ミルクタンパク質で置換されている）産生物が全く無いレーン３；ｇａｇとダイアボディを欠いているので産生物が全く無いレーン４；ＨＳＰ７０抗原を欠いているので（ミルク抗原で置換されている）ダイアボディとｇａｇだけを有するレーン５；ＨＳＰ７０とダイアボディを欠いているのでｇａｇだけを有するレーン６を利用して行なった。
【０２６４】
全３成分（ダイアボディ＋両抗原）は、３成分全てを受け取ったレーン１のウェルにのみ存在していることは（図２４の下部の図参照）、単一のダイアボディが両抗原に同時に結合することを示している。
【０２６５】
＜二重特異性ＩｇＡ又は多重特異性ＩｇＭの生成＞
二重特異性ＩｇＡの生成は、ＩｇＧについて先に述べたのとほぼ同じであるが、Ｖｈｓｏｌ、Ｄ及びＪに加えて、ＩｇＡを生成する定常領域Ｃαを使用する（図２５）。
【０２６６】
ＩｇＭの生成はほとんど同じであるが、ＩｇＭ分子は大きい多量体を形成することがあるので（Ｊ鎖があっても無くても）追加の可能性を提供する。したがって、上記分子に類似の分子に加えて（図２６下部右、多量体化配列を除いた後）、異なる特異性を有するＩｇＭを単に同時発現することによって多量体を生成させることもできる（図２６下部左）。
【実施例３】
【０２６７】
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）に結合する結合ドメイン及びＪｕｎのロイシンジッパーモチーフと抗体ヒンジからなる会合ドメインを含む重鎖並びにＦｏｓのロイシンジッパーモチーフからなる相補的会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む軽鎖を含むポリペプチド複合体をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓによって記載されているような分子生物学の技術を使って構築する。
【０２６８】
その発現ベクターを、次に、通常の技術によって、適切な宿主細胞に移行させて、そのベクターを最適に発現するトランスフェクトされた宿主細胞を作製する。前記トランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞を、次に当業者に知られている任意の適切な方法を使って培養して本発明のポリペプチド複合体を産生させる。
【０２６９】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２７０】
次に当業者に知られている技術を使って、３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）からなる可溶性エフェクタードメインを、相補的会合ドメインに融合させる。
【実施例４】
【０２７１】
ＡＦＰ（抗フェトプロテイン）に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメイン並びにＪｕｎのロイシンジッパーモチーフ及び抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の重鎖をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２７２】
本発明のポリペプチド複合体の軽鎖をコードする第二発現ベクターも構築する。これは、Ｆｏｓのロイシンジッパーモチーフからなる相補的会合ドメインを含む。
【０２７３】
次にこれら発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現する同時にトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にこれらのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２７４】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２７５】
次に当業者に知られている技術を使って、３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）からなる可溶性エフェクタードメインを、相補的会合ドメインに融合させる。
【実施例５】
【０２７６】
＜ＶＣＡＭとＶＬＡ−４＞
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）に結合する結合ドメイン及びＶＣＡＭと抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む重鎖；並びにリシンＡ毒素に融合したＶＬＡ−４からなる相補的会合ドメインを含む軽鎖を含むポリペプチド複合体をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２７７】
次にその発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現するトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２７８】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【実施例６】
【０２７９】
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）に結合する結合ドメイン及びＪｕｎのロイシンジッパーモチーフと抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む重鎖；並びにＦｏｓのロイシンジッパーモチーフ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）をコードする可溶性エフェクタードメインからなる相補的会合ドメインを含む軽鎖を含むポリペプチド複合体をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２８０】
次にその発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現するトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２８１】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２８２】
ＰＮＰは、フルダラビンを、ＰＮＰ酵素を含む細胞を殺し次いでさらに拡散して周囲の未感染細胞を殺す毒性代謝産物の２−フルオロアデニンに変換する（局部バイスタンダー効果）。
【実施例７】
【０２８３】
糖タンパク質抗原ｇｐ１２０のＶ３−ＰＮＤ領域に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメイン並びにＪｕｎのロイシンジッパーモチーフ及び抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第一の重鎖をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２８４】
ＧＰ−４１に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメイン並びにＪｕｎのロイシンジッパーモチーフ及び抗体ヒンジ、ＣＨ２とＣＨ３のドメインからなる会合ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第二の重鎖をコードする第二発現ベクターも構築する。
【０２８５】
本発明のポリペプチド複合体の軽鎖をコードする第三発現ベクターも構築する。このベクターはＦｏｓのロイシンジッパーモチーフからなる相補的会合ドメインを含む。
【０２８６】
次にこれら発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現する同時にトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２８７】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２８８】
次いでＨＩＶ−１ ＭＮ Ｖ３（ＰＮＤ）ペプチド免疫原からなる可溶性エフェクタードメインを、当業者に知られている技術を使って、前記相補的会合ドメインに融合させる。
【実施例８】
【０２８９】
糖タンパク質抗原のＶ３−ＰＮＤ領域に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第一の重鎖をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２９０】
ＧＰ−４１に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第二の重鎖をコードする第二発現ベクターも構築する。
【０２９１】
これら二つの重鎖は、これら二つの重鎖の定常領域が同一のμ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４のドメインを含むことが特徴である。
【０２９２】
次にこれらの発現ベクターは、通常の方法でＪ鎖を恒常的に発現する宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現する同時にトランスフェクトされた宿主細胞を産生する。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２９３】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２９４】
次いでＨＩＶ−１ ＭＮ Ｖ３（ＰＮＤ）ペプチド免疫原からなる可溶性エフェクタードメインを、当業者に知られている技術を使って、前記相補的会合ドメインに融合させる。
【０２９５】
本明細書に挙げた刊行物は全て参照により本明細書に組み込まれるものである。
【０２９６】
本発明の前記方法とシステムの各種変形と変化が本発明の範囲と精神から逸脱しないことは、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連させて説明してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと解すべきである。実際に、生化学、分子生物学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者には明らかな、本発明を実施するため述べた方式の各種変形は、特許請求の範囲に含まれるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性成熟による機能性重鎖のみ抗体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ−ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の多様なレパートリーの製造及びその使用に関する。また本発明はクラス特異的重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの製造と使用、並びに抗体重鎖の機能、好ましくは抗体重鎖の結合機能、定常領域のエフェクター活性及び任意選択的に追加のエフェクター機能を有する多価ポリペプチド複合体の製造と使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、抗原の投与に応答して十分に機能性の重鎖のみ抗体をトランスジェニックマウス中で生成させる方法に関する。特に本発明は、任意のクラス又は混合したクラスのヒトの抗原に特異的で高親和性の重鎖のみ抗体を生成させ、十分に機能性のＶＨ抗原結合ドメインを単離し発現させる方法に関する。
【０００３】
本発明はまた、重鎖の機能、好ましくは重鎖のエフェクター活性及び他の結合機能とエフェクター機能を含む多価ポリペプチド複合体の生成に関する。
【０００４】
本発明の方法を使用することによって生成した重鎖のみ抗体と他の多価結合複合体及びそれらの使用についても述べる。
【背景技術】
【０００５】
モノクローナル抗体又はその異型は、２１世紀に送り出される新薬の高い比率を占めるであろう。モノクローナル抗体療法は、リウマチ様関節炎やクローン病を治療するのに好ましい方法としてすでに容認されており、癌の治療に目覚しく進出している。また心臓血管疾患や感染症を治療するための抗体ベースの製品も開発中である。市販されている大部分のモノクローナル抗体の製品は、標的のリガンド（例えばＴＮＦα）の単一の明確なエピトープを認識してこれと結合する。治療用のヒトモノクローナル抗体は、依然として、哺乳類の細胞を培養する方法で製造されている。二つの重鎖と二つの軽鎖からなる複合体（Ｈ２Ｌ２複合体）の会合と、それに続く翻訳後グリコシル化を行なう工程が、細菌系を使用することを妨げている。哺乳類細胞の培養によって抗体を製造するための製造コストと資本コストは高額なので、容認できる代替手段がないと抗体ベースの治療の可能性を制限してしまう恐れがある。各種のトランスジェニック生物は、十分な機能を有する抗体を発現できる。これらの生物としては植物、昆虫、鶏、ヤギ及びウシがあるが、市販の治療用製品を製造するのに今まで使われていない。
【０００６】
機能性抗体のフラグメントは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で製造できるが、一般に、その製品は、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されないと、製造工程中、血清安定性が低い。
【０００７】
二重特異性抗体の複合体は、同じ又は異なる抗原の二つの異なるエピトープに結合できる遺伝子工学的に処理されたＩｇベースの分子である。抗体を単独で又は他の結合因子と組み合わせて取り入れている二重特異性結合タンパク質は、獲得されたヒトの免疫機能が、治療効果、例えば病原体の排除（Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７９，６６１−６６９；Ｔａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２，４９３４−４９４０；米国特許第５，４８７，８９０号）、癌の治療（Ｇｌｅｎｎｉｅ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｋｅｌ ，（２００３）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，８，５０３−５１００）、及び免疫療法（Ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１，３９１−３９７；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８，１−６；Ｌｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，１１９４−１２０１）を引き出す治療法の将来性を示している。
【０００８】
二重特異性抗体の製品が二つ以上のＨ２Ｌ2複合体に基づいていると、製造上の問題が悪化する。例えば、重鎖と軽鎖の遺伝子の二つ以上の組合せが共発現すると、１０種類もの組合わせが生じてそのうち一種類だけが所望のヘテロ二量体であることがある（Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，２１０−２２８）。
【０００９】
この問題を解決するため、重鎖エフェクターの機能を保持している二重特異性ＩｇＧ全長（ＢｓＩｇＧ）を哺乳類の細胞中で産生させる多くの方法が開発されている。ＢｓＩｇＧは、ヘテロ二量体が生成するのを避けるため遺伝子工学的に処理された「ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ」重鎖を必要とし、かつＬ鎖の誤対合を回避するため同じＬ鎖を利用する（Ｃａｒｔｅｒ，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８，７−１５）。化学的に架橋する代替法としては、各々異なる抗原を認識する抗体フラグメントから複合体を製造する方法（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３８，１９０−２００）又は他の結合タンパク質、例えばコレクチン類を抗体フラグメントに架橋させる方法（Ｔａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２，４９３４−４９４０）が記述されている。
【００１０】
一般に重鎖のエフェクター機能を欠いているダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）又はミニ抗体（ＢｓＡｂ）の開発によってもヘテロ二量体の重複が克服されている。これらの抗体は、ＶＨ結合部位とＶＬ結合部位を持つ最小一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、その結合部位はその後折り畳まれてニ量体になり、その抗体の標的抗原各々に対して一価である二価の二重特異性抗体を生成する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ，９０，６４４４−６４４８；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２２，２５９−２６４）。場合によっては、ＣＨ１ドメインとＬ定常ドメインが、二重特異性ミニ抗体を生成するためのヘテロ二量体化ドメインとして使用されている（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９−２６４）。ＢｓＡｂを製造するため、大腸菌発現系に基づいた各種組換え法が開発されているが（Ｈｕｄｓｏｎ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，５４８−５５７）、臨床グレードの多価抗体物質の製造コストと製造規模が依然として臨床的開発に対して主な障害になっている（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８，１−６）。
【００１１】
最近、ＢｓＡｂの概念が拡大されて、Ｈ鎖とＬ鎖のＶＨドメインとＶＬドメインが遺伝子工学的に処理されたｓｃＦｖ結合ドメインで置換されたジ−ダイアボディ（Ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）すなわち四価の二重特異性抗体が含まれる。このような構造体は、遺伝子工学的に処理することは複雑であるが、ヘテロ二量体の重複無しで、培養中の哺乳類細胞中で会合できる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７９，２１９−２３２）。
【００１２】
免疫グロブリンの構造は当分野では周知である。大部分の天然免疫グロブリンは二つの重鎖と二つの軽鎖を含む。これらの重鎖は、各重鎖に沿ってそのほぼ中央に位置するヒンジドメインの間のジスルフィド結合によって互いに連結されている。軽鎖は、上記ヒンジドメインのＮ末端側の各重鎖と会合している。各軽鎖は通常、上記ヒンジドメインの近くのジスルフィド結合によって、それぞれの重鎖に結合している。
【００１３】
Ｉｇ分子が正しく折りたたまれると、各鎖は、より線状のポリペプチド配列によって連結された多数の別個の球状ドメインになる。例えば、軽鎖は折りたたまれて可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）になる。重鎖は、軽鎖の可変ドメインに隣接する単一の可変ドメインＶＨ、第一定常ドメイン、ヒンジドメイン及び二つ又は三つのさらなる定常ドメインを有する。重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）は相互に作用して抗原結合領域（Ｆｖ）を生成する。一般に、ＶＨとＶＬの両者は、抗原と結合するために必要であるが、重鎖の二量体とアミノ末端フラグメントは、軽鎖無しで活性を保持していることが分かっている（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。
【００１４】
新しい分子生物学の技術の出現によって、重鎖のみ抗体（軽鎖が欠落している）が、ヒト及びネズミモデル系のＢ細胞増殖性障害（重鎖病）に存在することが確認された。重鎖病を分子レベルで分析した結果、ゲノムのレベルでの突然変異と欠失が重鎖ＣＨ１ドメインの不適切な発現を起こして、軽鎖と結合する性能が欠けている重鎖のみ抗体の発現を生じることが分かった（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０４，７６１−７６７；Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ／Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４，１２７０−１２７７参照）。
【００１５】
ファージのライブラリーから誘導して単離されたヒトＶＨドメインに関する別の研究は、ＶＨドメインの抗原特異的結合を証明したが、これらのＶＨドメインは溶解性が低いことが証明された。さらに、ファージのアレイにディスプレイされた特異的結合特性を有するヒトＶＨドメインを選択すると、遺伝子工学的に処理された抗体の基本構造を形成できることが示唆された（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６）。
【００１６】
他の脊椎動物の種を使用した研究は、ラクダ類が、自然遺伝子突然変異の結果、ＣＨ１軽鎖結合領域が無いため軽鎖に結合できない機能性ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の重鎖のみ二量体を生成すること（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３，４４６−４４８）及びサメなどの種が、恐らく哺乳類のＴ細胞受容体又は免疫グロブリンの軽鎖に類縁の重鎖のみ様結合タンパク質ファミリーを生成すること（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５，１７７０−１７７３）を示した。ラクダの重鎖のみ抗体の特性を決定する特徴は、ラクダＶＨドメインがヒトＶＨドメインと比べて溶解度が改善されていることである。ヒトＶＨは、遺伝子工学的に処理して溶解度の特性を改善できるであろうし（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（６），５３１−５３７；Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８参照）又は溶解度はインビボで自然選択で獲得されうる（Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２４７７４−２４７８０参照）。しかし、ＶＨ結合ドメインがファージライブラリーから誘導されると、抗原に対する固有親和力は、例えばアフィニティーホットスポットランダマイゼーション（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｏｔ ｓｐｏｔ ｒａｎｄｏｍｉｓａｔｉｏｎ）を含む親和力改善法を適用しても低マイクロモル〜高ナノモルの範囲内に留まっている（Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９７，２１３−２２４）。
【００１７】
また、ラクダのＶＨ抗体は修飾されたＣＤＲ３ループが特徴である。このＣＤＲ３ループは、平均して、非ラクダ抗体に見られるものより長く、抗原の親和力と特異性の全体に対して大きく影響すると考えられる特徴であり、ラクダの重鎖のみ抗体の種にＶＬドメインが無いことを補償している（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３，８０３−８１１；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３，２５−２８）。
【００１８】
ラクダの抗体に関する最近の構造研究は、抗体の多様性が、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え事象と体細胞変異によるインビボ成熟プロセスによりほとんど推進されることを示唆している（Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１４），１４１１４−１４１２１）。
【００１９】
最近、トランスジェニック哺乳類で重鎖のみ抗体を製造する方法が開発された（ＷＯ０２／０８５９４５及びＷＯ０２／０８５９４４参照）。任意の哺乳類（ヒトを含む）から誘導される任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＥ）の機能性重鎖のみ抗体は、抗原を投与することによってトランスジェニック哺乳類（好ましくはマウス）から製造できる。
【００２０】
通常の免疫グロブリン重鎖の遺伝子座は、複数のＶ遺伝子のセグメント、多数のＤ遺伝子のセグメント及び多数のＪ遺伝子のセグメントを含む。各Ｖ遺伝子セグメントは、ＶドメインのＮ末端からほとんどＣ末端までをコードしている。各ＶドメインのＣ末端は、一つのＤ遺伝子のセグメントと一つのＪ遺伝子のセグメントでコードされている。ＶＤＪがＢ細胞中で再構成し、続いて親和性成熟して、ＶＬ結合ドメインとともに抗原を認識する部位すなわち抗原と結合する部位を形成する、ＶH結合ドメインを提供する。重鎖のＣＨ１領域及び軽鎖のκ領域もしくはλ領域によって、重鎖と軽鎖が相互に作用し易くなる。
【００２１】
重鎖のみ抗体を製造するため、生殖細胞系の重鎖遺伝子座は、予定される定常領域のいくらか又は全体をコードする遺伝子セグメントを含む。成熟過程で、再構成したＶＨ結合ドメインは、ＣＨ２定常領域をコードするセグメント中にスプライスされて、ＣＨ１ドメインを欠いた重鎖をコードする再構成遺伝子を提供し、その結果免疫グロブリンの軽鎖と会合できなくなる。
【００２２】
重鎖のみモノクローナル抗体は、標準のクローン化技術で脾臓のＢ細胞から又はファージディスプレイ法でＢ細胞のｍＲＮＡから回収できる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６）。ラクダ又はトランスジェニック動物から誘導される重鎖のみ抗体は高い親和力を有する。通常のＨ２Ｌ２四量体の配列を分析した結果は、多様性が、主として、ＶＤＪの再構成及び体細胞の超変異の組合わせから生じることを示している（Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３，３７−４５）。発現された重鎖のみｍＲＮＡの配列を分析した結果は、ラクダで産生されようと又はトランスジェニック動物で産生されようとも、上記観察結果を支持している（Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，１４１１４−１４１２１）。
【００２３】
天然のラクダ及びヒトのＶＨ領域の重要な共通の特徴は、各領域がモノマーとして結合し、ＶＬ領域との二量体化に依存せずに最適の溶解度と結合親和力が得られることである。これらの特徴は、特にブロッキング剤や組織浸透剤を製造するのに適していることはすでに知られている。
【００２４】
ホモ二量体又はヘテロ二量体は、重鎖のみ抗体を酵素で切断することで又は合成法で製造することもできる（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５及び米国特許願公開第２００３／００５８０７４ Ａ１号）。しかし、抗体のモノマー結合ドメインの利点は、やはり、多量体タンパク質を、試薬、治療剤及び診断剤として設計するときに有効に利用すべきである。
【００２５】
ファージディスプレイ法で製造されるヒトＶＨ又はラクダＶＨＨは、体細胞の突然変異並びに通常の抗体結合部位のＣＤＲ３領域におけるＤとＪの領域組換えによって提供される追加の多様性（Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３，３７−４５）によって改善される特性の利点を欠いている。ラクダのＶＨＨはヒトのＶＨと比べて溶解度の利点を示しているが、ヒトにおいては抗原性なのでラクダを免疫することによって又はファージディスプレイ法によって製造しなければならない。
【００２６】
ＶＨ結合ドメインを取り込むことは、特異性と結合力を失う可能性を伴ってＶＨドメインとＶＬドメインとから遺伝子工学的に製造しなければならないｓｃＦｖを使用するより明らかに有利である。Ｔ細胞などの類縁遺伝子ファミリー又はサメ免疫グロブリンのファミリーから誘導されるＶＨ結合ドメインも、二重又は多重の特異性結合分子を製造するためのｓｃＦｖの代替物を提供する。他の天然産の結合タンパク質及びそのドメイン、例えば可溶性受容体のフラグメントも使用されてもよい。
【００２７】
抗体のクラスはその生理学的機能が異なっている。例えば、ＩｇＧは成熟免疫応答に主要な役割を演じている。ＩｇＭは補体の結合と凝集に関与している。ＩｇＡは分泌物すなわち涙液、唾液、初乳、粘液におけるＩｇの主要クラスであるので、局所免疫で役割を演じている。多価結合複合体を遺伝子工学的に製造するときにクラス特異的な重鎖定常領域を含むことにより、必要な機能に応じて、インビボでエフェクター機能の治療利益を提供する。個々のエフェクター領域を遺伝子工学的に処理して、機能を付加したり又は削除できる（Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（２００１）Ａｕｇ ５（４），３６８−３７４）。親和力の高いＶＨ結合ドメインを含む重鎖のみ抗体を最適に製造し選択することは（その起源がヒト、ラクダ又はその外の起源であろうとも）、代替方法からインビボでの組換えと親和性成熟を促進しない無作為化ファージライブラリーからの選択による方法にまで利益を与えると思われる。
【００２８】
したがって、ＩｇＡの定常ドメインの機能を含むと、病原体に対する粘膜の機能が改善され（Ｌｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．，６９，７５−８４）、一方ＩｇＧ１の定常領域の機能が存在すると、インビボでの血清安定性が向上する。重鎖のＣＨ２とＣＨ３の定常ドメインが存在すると、天然の抗体類に見られるような安定な二量体化のための基盤を提供し、かつ翻訳後グリコシル化のための認識部位を提供する。ＣＨ２とＣＨ３の存在は、二重特異性で多価の複合体が試薬及び診断剤として使用されるとき、二次抗体の認識をも可能にする。
【００２９】
単離されて予め再構成されたラクダの重鎖のみ可変領域の配列は、ヒンジ領域とヒトＩｇＧ１エフェクタードメインの前に予めクローン化され、ベクター中に挿入され、ＣＯＳ細胞中で発現されて抗体を生成する。このインビトロの環境で発現された抗体は、ラクダ中のインビボでクラス（イソタイプ）のスイッチングと親和性成熟（超変異）のプロセスをすでに受けており、抗原に結合できる（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８）。
【００３０】
当分野では、重鎖のみ抗体の多様性とインビボでのＢ細胞応答性を最大にして、特に、多様な臨床、産業及び研究の用途で使用するために、最大の抗原結合能力を保持するクラス特異的ヒト重鎖のみ抗体及び機能性ＶＨ重鎖のみ結合ドメインの機能レパートリーを製造することが依然として要求されている。
【００３１】
また、当分野では、抗体の重鎖の少なくとも一部、抗体重鎖単独、又はこれを生理学的に安定でエフェクター機能を有するエフェクター（軽）鎖と組み合わせて含む、可溶性の二価又は多価のポリペプチド結合複合体を製造することも依然として要求されている。
【発明の概要】
【００３２】
本発明は、ＣＨ１ドメインをコードしていない重鎖定常領域を含み、そして発現されると、定義された単一又は複数のクラスの重鎖のみ抗体を産生できる異種のＶＨ重鎖遺伝子座又はラクダＶＨ（ＶＨＨ）重鎖遺伝子座をトランスジェニック哺乳類内で発現させるステップを含む、トランスジェニック哺乳類内でＶＨ重鎖のみ抗体又はラクダＶＨ（ＶＨＨ）重鎖のみ抗体を製造する方法を提供する。
【００３３】
ＶＨ重鎖遺伝子座又はラクダＶＨ（ＶＨＨ）重鎖遺伝子座は、一つ以上のラクダＶ遺伝子セグメント又は非ラクダＶ遺伝子セグメントを含んでもよい。このＶ遺伝子セグメントは、改善された溶解度特性を示すように選択するか又は遺伝子工学的に処理されることが好ましい。そのＶ遺伝子セグメントはヒト由来であるのが好ましい。
【００３４】
重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、Ｃα１及び／又はＣα２、Ｃε、Ｃδ、Ｃγ及び／又はＣμの重鎖定常領域遺伝子を含んでもよい。さらに、重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、以下の重鎖定常領域：Ｃα１、Ｃα２、Ｃε、Ｃδ、Ｃγ、Ｃμのうちの二つ以上を含んでもよい。
【００３５】
好ましくは、ＶＨ重鎖遺伝子座は、少なくとも一つのヒトもしくはラクダのＶ遺伝子セグメント、少なくとも一つのＤセグメント及び少なくとも一つのＪセグメントを含む可変領域を含み、そのヒトもしくはラクダのＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントは組み替えてＶＤＪコーディング配列を形成させることができる。重鎖遺伝子座は、好ましくは２０個以上のＤ遺伝子セグメント及び／又は５個以上のＪ遺伝子セグメントを含む。好ましくは、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、脊椎動物、好ましくはヒトが起源のものである。ＣＤＲ３ループは、任意の脊椎動物由来のＤ及びＪの遺伝子セグメントを使って作られることができ、ヒトのＤ及びＪ遺伝子セグメントが好ましい。
【００３６】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、Ｊ遺伝子セグメントを重鎖定常領域遺伝子と直接組換えることができる組換え配列（ｒｓｓ）を含んでもよい。
【００３７】
異種重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、起源がヒト又は脊椎動物例えばラクダのものである。あるいは、その定常領域は、免疫グロブリン重鎖が起源でないものでもよい。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法によってほぼ正常のＢ細胞が成熟する。本発明は、本発明の方法で得られるか得ることができる重鎖のみ抗体もしくはそのフラグメント又は重鎖のみ抗体のクラスの混合物を提供する。この重鎖のみ抗体は、モノクローナル抗体又はそのフラグメント、例えばヒトもしくはラクダのＶＨ結合ドメインなどでもよい。本発明のＶＨ結合ドメインは、長く伸びたラクダ様ＣＤＲ３ループを欠いていてもよく、あるいは長く伸びたラクダ様ＣＤＲ３ループを含んでもよい。
【００３９】
本発明は、本発明の異種重鎖遺伝子座を含むベクター及びこのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００４０】
また本発明は、本明細書に記載されている異種の重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニック哺乳類も提供する。好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む抗体を産生する能力が低い。
【００４１】
本発明は、免疫療法用の薬剤を調製における本発明の重鎖のみ抗体又はそのフラグメントの使用も提供する。本発明の重鎖のみ抗体は、診断剤、試薬、抗体酵素又は阻害剤として使用することもできる。本発明はまた、本発明の重鎖のみ抗体もしくはそのフラグメント及び薬理学的に適正な担体を含む医薬組成物も提供する。
【００４２】
本発明は、
（ａ）抗原を、本明細書に記載したようなトランスジェニック哺乳類に注射するステップと、
（ｂ）目的とする抗原特異的の重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞又は組織からハイブリドーマを産生するステップと、
（ｄ）前記ハイブリドーマ由来の重鎖のみ抗体ｍＲＮＡを、次に哺乳類、植物、昆虫、微生物、真菌又は代替の系などの異種発現系中に産生させるため、任意選択的にクローン化するステップと
を含む重鎖のみ抗体を産生させて選択する方法を提供する。
【００４３】
次いで、ＶＨ結合ドメインを、ステップ（ｃ）のクローン化ｍＲＮＡ由来の抗原特異的ＶＨドメインを同定し単離することによって製造できる。
【００４４】
また、本発明のＶＨ結合ドメインは、
（ａ）抗原を本明細書に記載のトランスジェニック哺乳類に注射するステップと、
（ｂ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｃ）上記単離された細胞又は組織から得られたｍＲＮＡからＶＨ遺伝子座をクローン化するステップと、
（ｄ）ファージ又は類似のライブラリーを使ってコード化されたタンパク質をディスプレイするステップと、
（ｅ）一種又は複数種の抗原特異的ＶＨドメインを同定するステップと、
（ｆ）上記一種もしくは複数種のＶＨ結合ドメインだけを、又は融合タンパク質として細菌、酵母又は代替の発現系に発現させるステップと
によって製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】結合ドメイン（ＶＨ）、二量体化ドメイン（任意選択的にＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）並びにエフェクター部分（ＥＭ）を含むポリペプチド複合体を示す。結合ドメインとエフェクター部分は、二量体化ドメインのアミノ末端又はカルボキシ末端に配置できる。可撓性リンカー（＜−）及びヒンジ
【数１】
領域を示す。
【図２】結合ドメインの異なる配置構成及び別の結合ドメインによるエフェクター部分の置換を示す。Ａ．ホモ二量体が産生されるので好ましい選択肢である。産物を分離することは不要である。Ｂ．ホモ二量体とヘテロ二量体の混合物が産生される。産物を分離することが必要である。
【図３】エフェクター鎖と会合する重鎖ポリペプチド複合体を示す。そのエフェククター鎖は、相補的結合ドメイン（ＣＢＤ）とエフェクター部分（ＥＭ）を含む。ＣＢＤは重鎖のＥＭによって認識される。ＣＢＤは、エフェクター例えば酵素、毒素、キレート化剤、造影剤に又はこのエフェクターの一部に融合される。エフェクター鎖は、重鎖とは別個に合成できる。
【図４】Ｊ鎖で連結している二価の分泌ＩｇＡを示す。
【図５】Ｊ鎖で会合されている多価重鎖のみＩｇＭ様ポリペプチド複合体を示す。
【図６】ＩｇＧ遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを生成させ、次いで抗原を投与して、重鎖のみ抗体とＶＨドメインの機能を発生させる方法を示す。
【図７】ＩｇＭ遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを生成させ、次いで抗原を投与して、重鎖のみ抗体とＶＨドメインの機能を発生させる方法を示す。
【図８】ＩｇＡ遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを生成させ、次いで抗原を投与して、重鎖のみ抗体とＶＨドメインの機能を発生させる方法を示す。
【図９】ヒトＣγ２プライマーとＶＨＨ１及びＶＨＨ２のプライマーを組み合わせて使って、ＣＨ１を除くためにラクダのスプライス変異を有する定常領域を含む遺伝子座を持つマウスの骨髄ｃＤＮＡから得たＰＣＲ産物の配列アラインメント。結果は、ＣＨ１が除かれていないことを示している。
【図１０−１３】ＶＨ／ラクダＶＨ（ＶＨＨ）構築物の構造。１−ｎはＶＨ遺伝子又はＤもしくはＪのセグメントの数を表す。ヒト遺伝子座の通常の相補鎖は、５１個のＶ遺伝子、２５個の機能性Ｄセグメント（プラス２個の非機能性Ｄセグメント）及び６個のＪセグメントである。Ｃμ（ＩｇＭ用）又はＣε（ＩｇＥ用）の領域の場合、Ｈ領域は無く、ＣＨ３とＭ１の間に追加のＣＨ４エキソンがある。その単一又は複数のＶＨ遺伝子は変異していて、公有ドメインに、記載されているような可溶性を提供する。ＶＨ遺伝子、ＤとＪのセグメント及びＣエキソンはヒトのものが好ましいが、ラクダを含む他の任意の種由来のものでもよい。後者の場合、ラクダのＶＨ（ＶＨＨ）遺伝子は、天然で可溶性なので変異されない。
【図１４】マウスの免疫のスケジュール及び大腸菌ＨＳＰ７０に対する重鎖のみＩｇＧ生成の抗体検定を示す。
【図１５】トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞に関するフローサイトメトリー分析と免疫組織化学試験の結果を示す。
【図１６】ＤＫＴＰで免疫されたトランスジェニックマウスのＥＬＩＳＡ分析の結果及び生成した抗体ライブラリーの配列分析の結果を示す。
【図１７】免疫されたトランスジェニックマウスにみられる体細胞の変異とＶＤＪの再構成の例を示す。
【図１８】Ａ５抗体を含有する応答プラスミドでトランスフェクトされたＴｅｔ−ｏｎ細胞系の免疫染色検定を行った結果を示す。
【図１９】トランスジェニックマウス系の血清のウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図２０】ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座マウスが産生したヒト一本鎖ＩｇＭと混合したヒトＩｇＭのサイズ分画を行なった結果を示す。
【図２１】ヒトＴＮＦαに対する一本鎖ＩｇＭとＩｇＧの抗体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【図２２】ＨＳＰ７０と抗ＧＡＧに対する結合アフィニティを有するホモ二量体プラスミドを生成させる方法を示す。
【図２３】ホモ二量体ポリペプチド複合体のＣＨＯ細胞内での機能的発現を示す。
【図２４】ホモ二量体ポリペプチド複合体の抗ＧＡＧとＨＳＰ７０に対する同時の機能的結合を示す。二価で二重特異性の抗体を図式的に示す。第二可変領域（ｇａｇに対するＶＨＨ２）を、他の特異性を含有する重鎖のみ抗体（ＨＳＰ７０に対するＶＨＨ１）のカルボキシ末端中にクローン化する。ＣＨ３とＶＨＨ２の間のヒンジ領域は、全てのシステインがプロリンで置換されたリンカー領域（矢印）で置換されている。ＥＬＩＳＡプレートをＧａｇでコートし、１％ミルク／１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックし、まずダイアボディ培地（１：２希釈）でインキュベートし、次にＢＩ２１細胞溶解物（ＨＳＰ７０を含有）（１：２希釈）でインキュベートする。結合したタンパク質を試料緩衝剤＝２−メルカプトエタノールで溶離し次いで８％ゲル上に泳動させる。Ｇａｇ、ダイアボディ及びＨＳＰ７０に対するポリ／モノクローナル抗体で染色する。抗Ｇａｇ：ウサギポリクローナル／ブタ抗ウサギ−ＡＰ（青色）。抗ＨＳＰ７０：モノクローナル／ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（褐色）。ダイアボディ：ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（褐色）。レーン１：Ｇａｇ／ダイアボディ／ＢＩ２１細胞溶解物。レーン２：Ｇａｇ／培養培地（ダイアボディの陰性対照）／ＢＩ２１。レーン３：ミルク−ＢＳＡ／ダイアボディ／ＢＩ２１。レーン４：ミルク−ＢＳＡ／培養培地／ＢＩ２１。レーン５：Ｇａｇ／ダイアボディ／ミルク−ＢＳＡ。レーン６：Ｇａｇ培養培地／ミルク−ＢＳＡ。
【図２５】ＩｇＡエフェクター機能を有するエフェクター鎖と任意選択的に会合しているホモ二量体のポリペプチド複合体を生成させる方法を示す。
【図２６】ＩｇＡエフェクター機能を有するエフェクター鎖と任意選択的に会合しているホモ二量体のポリペプチド複合体を生成させる方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明者らは、従来技術の限界を克服し、トランスジェニック動物の特にマウスに、「マイクロ遺伝子座（ｍｉｃｒｏ ｌｏｃｉ)」を使って、形質細胞又はＢ細胞が分泌するクラス特異的重鎖のみ抗体又は異なるクラスの重鎖のみ抗体の混合物を産生させることができることを示したのである。次にこれらは、確立されたハイブリドーマの技術を使ってクラス特異的重鎖のみ抗体の信頼性の高い供給源を作製させるために使用するか、又は機能性ラクダＶＨ（ＶＨＨ）結合ドメイン、もしくはＶＨ重鎖のみ結合ドメイン、好ましくはヒトが起源の可溶性ＶＨ重鎖のみ結合ドメインの原料として使用することができる(これらの結合ドメインはエフェクター機能は無いが結合機能は保持している)。
【００４７】
本発明の方法で生成させることができる重鎖のみ抗体（ラクダ抗体を含む）は高い結合親和力を示すが、これは、一般に伸長したＣＤＲ３ループ無しのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの再構成と体細胞変異で生じる。本質的に正常なＢ細胞の成熟は、単離された形質細胞中に存在する重鎖のみ抗体のレベルが高いとき（ＣＨ１ドメインが、組換え遺伝子座中に存在する全ての抗体クラスから除かれている場合）に観察される。Ｂ細胞の成熟及び会合された二量体（例えばＩｇＧ）又は多量体（例えばＩｇＭ）の分泌は、軽鎖遺伝子の存在又は発現とは無関係である。
【００４８】
トランスジェニックマウス由来のハイブリドーマから単離された抗原特異的重鎖をコードする抗原特異的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列分析を行なった結果、重鎖抗体の多様性は、主としてＶＤＪ組換えの機能であることが証明された。さらに、本発明者らは、抗体の多様性は、ＶＨドメインの体細胞変異の関与が一層制限された形で重鎖のみ抗体の機能性抗原結合ドメインのＣＤＲ３領域で発生することを示した。本明細書に記載の方法を使って、機能性ＶＨドメインを細菌系にクローン化し発現させて抗原と結合する特異性及び親和力を十分に保持したＶＨ結合ドメインを生成させることができる。さらに、クラス特異的重鎖の二量体及び多量体は、培養中のハイブリドーマ細胞系に分泌させることができる。
【００４９】
本発明はまた、トランスジェニックマウスを、抗原の投与に応答して好ましいクラスの重鎖のみ抗体、例えばＩｇＭのみではなくてＩｇＧのみ又は例えばＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭの混合物を産生するようにプログラムすることができることも教示する。
【００５０】
本発明者らは、ＣＨ１エキソンを欠いて、ヒトのＤ及びＪセグメントによって二つのラマ（ｌｌａｍａ）ＶＨＨ遺伝子に連結された最小のヒトＩｇＧ重鎖定常領域遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスの生成についてすでに述べた（ＷＯ０２／０８５９４５及びＷＯ０２／０８５９４４参照）。これらは、抗原を投与されると、機能性で親和力の高い抗原特異的ＩｇＧ重鎖のみ抗体を産生する。重鎖のみ抗体のクラス混合物（ＩｇＭとＩｇＧ）の混合物は、重鎖定常領域を直列に並べて取り込む遺伝子構造を利用したインビボでのクラススイッチによって得られることができる（全ての定常領域遺伝子がＣＨ１ドメインを欠いていてＣＨ４ドメインが存在している場合）。
【００５１】
本明細書で述べる改善は、ヒトのＤとＪのセグメントによって二つのラマＶＨＨ遺伝子に連結された同じＩｇＧ定常領域遺伝子座、及びＣＨ１エキソンを欠いていて同じヒトＤとＪの遺伝子セグメントによって二つのラマＶＨＨ遺伝子に連結されたヒトＩｇＭ定常領域遺伝子座を組み込んだマウスも、高分子量の（多量体の）ＩｇＭ重鎖のみ抗体及びＩｇＧ（二量体）重鎖のみ抗体を産生することである。驚くべきことには、本質的に正常なＢ細胞の成熟と抗体の産生は、トランスジェニック遺伝子座中に存在する各重鎖定常領域からのＣＨ１配列の完全な欠失によっている。さらに、ＣＨ４エキソンは、存在していても除く必要は全く無い。
【００５２】
したがって、例えば、同じヒトのＤとＪの遺伝子セグメントによって二つのラマＶ遺伝子セグメントに連結された機能性ＣＨ１エキソンを有するヒトＩｇＭ重鎖遺伝子座、及び同じヒトのＤとＪの遺伝子セグメントによって二つのラマＶ遺伝子セグメントに連結されたＣＨ１エキソンを欠いたＩｇＧ定常重鎖領域遺伝子座を保持するトランスジェニック動物は、非常に低いレベルの重鎖のみ抗体を産生し、Ｂ細胞の成熟の証拠を示さない。
【００５３】
ＣＨ４ドメインを含む他のエフェクタードメインは組み込まれても組み込まれなくてもよく、要求されるとおりに、生成する重鎖のみ抗体にエフェクターの特徴を導入するか、又は除くことができる。
【００５４】
本発明者らは、抗体を産生する発現（すなわち、Ｂ細胞の成熟）がその構造中に存在するＶ遺伝子セグメントを利用することから起こり得ることを発見したのである。Ｂ細胞から誘導された抗体ｍＲＮＡを単離して配列を決定することにより、ＤとＪの遺伝子セグメントの組換えがＣＤＲ３の多様性を生み出すことを示している。生成したＶＨドメインの配列を比較すると、体細胞の突然変異が見られ、これは親和性成熟の事象が、前記組換えられたＤとＪの遺伝子セグメントと、発現されて生成した抗体ｍＲＮＡのＶＨドメインにも起こったことを示している。
【００５５】
好ましい構造は、可溶性を改善するために選択又は遺伝子工学的に処理され、組換えを行いＣＤＲ３を生成させるためＤとＪの鎖クラスターに連結されたＶ遺伝子セグメントを組み込む。好ましくは、そのＶＤＪ配列は、各々ＣＨ１エキソンを欠いた好ましい単一又は複数の定常エフェクタードメインに対して直列に並べて連結される。
【００５６】
本発明は、ヒトもしくはラクダのクラス特異的な重鎖のみ抗体又はヒトのＶＨ結合ドメイン（好ましくは可溶性ＶＨ結合ドメイン）（単独又は好ましいエフェクタードメインに連結されたもの）の誘導と産生に限定されず、ＤとＪの遺伝子セグメントに連結された、脊椎動物が起源の任意のＶ遺伝子セグメントのキメラ結合体（溶解度特性を改善するため任意選択的に遺伝子工学的に処理されている）の産生も含む。そのＶ遺伝子セグメントは、ヒトが起源であり、ラクダ由来のＶ遺伝子セグメントでないものが好ましい。生成したＶＨドメインは、そのＤとＪのセグメントがラクダ由来のものである場合を除いては、伸長したラクダ様ＣＤＲ３ループを含有していなくてもよい。その結果、操作的にエフェクター定常領域に作動可能に連結されたＣＤＲ３の多様性と親和性成熟を示すＶＨドメインが得られる。親和性成熟は、好ましい親のトランスジェニック脊椎動物における機能的分泌と任意選択的な会合を確実にし、その後必要な場合に、選択可能なエフェクター機能も提供する。
【００５７】
これらの観察結果は、改善され単純化されたクラス特異的重鎖のみ抗体の遺伝子工学的処理及び体細胞変異により親和性成熟を獲得した高親和力の可溶性ＶＨドメインの誘導に対して重要な影響をもたらす。選択された重鎖定常領域エフェクター機能（ＣＨ１を欠いている）又はその混合物を取り込みにより、抗体の追加の遺伝子工学的処理を必要とすることなく、任意のクラスの重鎖のみ抗体又は任意の重鎖のみ抗体の混合物でも産生させることができる。ＶＨドメインは、単独で細菌などの微生物系中で発現されるか、又は培養中のハイブリドーマ又はトランスフェクトされた細胞が分泌する、エフェクタードメインを取り込んだ機能性重鎖のみ抗体として発現されることができる。ヒトが起源の抗体とＶＨ結合ドメインには、医薬、診断剤及び試薬として健康管理の分野に広範囲の用途があり、平行して農業、環境及び産業向けの用途がある。
【００５８】
したがって、本発明は、第一の態様で、異種ＶＨ重鎖遺伝子座をトランスジェニック哺乳類内で発現させるステップを含むトランスジェニック哺乳類内でＶＨ重鎖のみ抗体を産生させる方法を提供する。好ましくは、そのＶＨ重鎖遺伝子座は、ＣＨ１ドメインをコードしない重鎖定常領域を含み、かつ発現されるとき完全な重鎖のみ抗体の多様なレパートリーを生成できる。
【００５９】
本発明の第一態様は、ラクダＶＨ重鎖遺伝子座をトランスジェニック哺乳類内で発現させるステップを含むトランスジェニック哺乳類内でラクダＶＨ重鎖のみ抗体の製造方法であって、そのＶＨ重鎖遺伝子座はＣＨ１ドメインをコードしない重鎖定常領域を含み、そして発現されると、抗原の投与に応答してＶＤＪが再構成されかつ親和性成熟する完全な重鎖のみ抗体の多様なレパートリーを生成できる方法も提供する。
【００６０】
遺伝子工学的な処理が細胞表面の会合を妨げる分泌機構とそれに続くＢ細胞の成熟に対して影響しないとき、重鎖エフェクター分子は、遺伝子工学的に処理して機能ドメイン（例えばカルボキシ末端ＣＨ４ドメイン）を除かれてもよい。ＣＨ１エキソンだけ異種遺伝子座から除かれているか又はその遺伝子座中に存在しない。例えばグリコシル化を改善し又は機能を付加するため、遺伝子工学的に処理して遺伝子座に特徴を付け加えられてもよい。
【００６１】
好ましくは、上記の異種遺伝子座は、発現されると、機能性のＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＭの分子又はそのイソタイプを生成できる。個々の抗体のクラス又は抗体クラスの混合物又はそのイソタイプも生成できる。
【００６２】
したがって、異種の重鎖遺伝子座は、本質的に正常なＢ細胞の成熟とともに、必要な一種又は複数種の抗体クラスに応じて、重鎖のみ抗体の好ましいクラス又は混合物を生成するように設計される。ラクダのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子のセグメント並びにラクダのエフェクター領域を利用すると、ラクダの独特の特徴を有するラクダ抗体、例えば伸長したＣＤＲ３ループを生成する。無作為に選択された、又は溶解度を高めるために選択もしくは遺伝子工学的に処理されたＶ遺伝子セグメントを含むヒトのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを使用すると、機能性のヒト重鎖のみ抗体を生成する。
【００６３】
本発明で得られる抗体は、本質的に単一の又は知られたクラスの好ましくはヒトが起源の抗体である点で従来技術の抗体を超える利点を有する。これらの抗体は、ＶＤＪの組換え及びインビボでの親和性成熟の組合わせから得られる高い親和力を有する。抗体とそのフラグメントは、当業者に知られている十分に確立された方法を使って単離され、特性を決定され、そして製造できる。
【００６４】
＜異種重鎖遺伝子座＞
本発明の文脈において、用語「異種」は、本明細書に記載されているように、ヌクレオチド配列又は遺伝子座が、それを配置された哺乳類にとって内在性ではないことを意味する。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「ＶＨ重鎖遺伝子座」は、操作して一つ以上の重鎖エフェクター領域（各々ＣＨ１ドメインを欠いている）に連結された、一つ以上のＶ遺伝子セグメント、一つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び一つ以上のＪ遺伝子セグメントを含むＶＨドメインをコードする最小マイクロ遺伝子座に関する。好ましくは、抗体のレパートリーが変化する主な原因は、Ｖ−Ｄ及びＤ−Ｊの結合によるＤとＪの遺伝子セグメントの選択で生成するＣＤＲ３領域である。
【００６６】
本発明の利点は、再構成されたＶＨ遺伝子配列に得られる抗体のレパートリーと多様性は、多数のＤとＪの遺伝子セグメントを使用することによって最大にすることができる点である。その後の体細胞変異は、最小の遺伝子座（マイクロ遺伝子座）を使用しながら、多数のＶ遺伝子セグメント又はＶＬとＬＣ（軽鎖）免疫グロブリン遺伝子座を必要とせずに達成される。
【００６７】
好ましくは、前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、任意の脊椎動物種から誘導される２〜５個（２、３、４又は５個）のＶ遺伝子セグメントを含む。
【００６８】
好ましくは、前記Ｖ遺伝子セグメントは、ヒトが起源であり、溶解度を改善するため任意選択的に選択されるか又は遺伝子工学的に処理される。
【００６９】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、好ましくは、２〜４０個（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０又は４０個）以上のＤ遺伝子セグメントを含む。これらのＤ遺伝子セグメントは、任意の脊椎動物種から誘導できるが、最も好ましくは、そのＤ遺伝子セグメントはヒトのＤ遺伝子セグメント（通常、２５個の機能性Ｄ遺伝子セグメント）である。
【００７０】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、好ましくは、２〜２０個（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０個）以上のＪ遺伝子セグメントを含む。これらのＪ遺伝子セグメントは、任意の脊椎動物種から誘導できるが、最も好ましくは、そのＪ遺伝子セグメントはヒトのＪ遺伝子セグメント（通常、６個のＪ遺伝子セグメント）である。
【００７１】
ＶＨ重鎖遺伝子座は、好ましくは、２個以上のＶ遺伝子セグメント、２５個の機能性ヒトＤ遺伝子セグメント及び６個のヒトＪ遺伝子セグメントを含む。
【００７２】
用語「Ｖ遺伝子セグメント」には、ラクダ及びヒトを含む脊椎動物から誘導される天然のＶ遺伝子セグメントが含まれており、これらセグメントは、溶解度などの特性を改善するため任意選択的に選択され、変異させ又は遺伝子工学的に処理されている。Ｖ遺伝子セグメントは、サメなどの他の種にも発見されており（Ｋｏｋｕｂｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ．Ｊ．，７，３４１３−３４２２参照）、又は、例えば免疫グロブリン軽鎖ＶＬのレパートリーもしくはＴ細胞受容体ＶＨのレパートリーになる場合、典型的な結合タンパク質の多様なＶＨ様ファミリーを提供するようになる。
【００７３】
ＶＨドメインの溶解度を改善する好ましい方法は、単なる無作為ではなく合理的な手段を取り入れており、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（６），５３１−５３７及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８に例示されている。自然選択が、親和性成熟及びＶＤＪの再構成に続いてＶＨ遺伝子の好ましい変異を取り込むことによってインビボで起こることもある。
【００７４】
Ｖ遺伝子セグメントは、本発明に従って、核酸が発現されたときＶＨ重鎖のみ抗体を生成するために、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常（エフェクター）領域（いくつかのエキソンを含んでもよいがＣＨ１エキソンは除外されている）とで組換え可能でなければならない。
【００７５】
本発明のＶ遺伝子セグメントは、その範囲内に、本発明にしたがって、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常領域（一つ以上のエキソンを含むがＣＨ１エキソンは含んでいない）で組換えて、本明細書で定義する重鎖のみ抗体を生成できるホモログ、誘導体又はタンパク質フラグメントをコードする任意の遺伝子配列も含む。
【００７６】
したがって、ＶＨコーディング配列は、天然の原料由来でも、又は当業者によく知られている方法を使って合成されてもよい。
【００７７】
本発明の文脈において、用語「ＶＨドメイン」は、先に定義したようにＤ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントで組換えられたときのＶ遺伝子セグメントの発現産物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されるこのＶＨドメインは、溶解状態のままであり、そして溶解度を保持するために他の要因を必要とせずに生理的溶媒中で活性である。好ましくは、可溶性ＶＨドメインの抗原への結合能は、ＶＤＪの組換え及び体細胞変異によって改善されている。ラクダ種に独特の伸長したＣＤＲ３ループの有無に対する依存性は全くない。このＶＨドメインは、モノマーとして抗原に結合でき、エフェクターの定常領域と結合すると、使用されるエフェクター分子（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）の選択及び遺伝子工学的処理又は二量体化及び多量体化の別の機構によって、モノ特異性、二重特異性、多重特異性、二価又は多価の形態で産生されてもよい。可溶性の重鎖のみ抗体複合体の一部として発現されるときに、ＶＬドメインと結合する可能性は、ＣＨ１エキソンを除くことによって排除される（Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０参照）。ＶＨドメインを、多様なタンパク質ドメインとともに遺伝子工学的に処理して、標的治療や診断に使用する例えば毒素、酵素及び造影剤を有する融合タンパク質も産生させることもできる。
【００７８】
本発明の文脈において、用語「Ｄ遺伝子セグメント」と「Ｊ遺伝子セグメント」には、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの天然の配列が含まれる。好ましくは、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントの由来と同じ脊椎動物に由来する。例えば、Ｖ遺伝子セグメントがヒト由来で次いで可溶化又は遺伝子工学的に処理される場合は、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントもヒト由来である方が好ましい。あるいは、Ｖ遺伝子セグメントが例えばラクダ由来であり、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントがヒト由来でもよく、又はその逆でもよい。
【００７９】
用語「Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメント」は、生成するセグメントが、本明細書に記載されているような重鎖抗体遺伝子座の保持する成分で組換えて本明細書に記載されているような重鎖のみ抗体を生成する限り、その範囲内に、その誘導体、ホモログ及びフラグメントを含む。Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントは、天然の原料から誘導してもよく、又は当業者にはよく知られていて本明細書に記載されている方法を使って合成してもよい。Ｖ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、組換えることができそして体細胞変異をする方が好ましい。
【００８０】
Ｖ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、単一の脊椎動物種から誘導することが好ましい。これはどの脊椎動物種でもよいがヒトが好ましい。
【００８１】
さらに、本発明の異種重鎖遺伝子座は、インビボでエフェクター機能を提供する重鎖定常領域（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はそのイソタイプ）をコードするＤＮＡの領域を含む。
【００８２】
本発明は、本発明の方法で得られるか又は得ることができる抗原特異的の重鎖のみ抗体も提供する。
【００８３】
＜重鎖定常領域＞
操作的に、重鎖定常領域は、天然又はＢ細胞内でＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントで組換えできる遺伝子工学的に処理された遺伝子セグメントによってコードされている。好ましくは、その重鎖定常領域は、免疫グロブリンの遺伝子座由来である。
【００８４】
本発明のこの態様によって、重鎖定常領域は各々、重鎖のみ抗体を生成できるように機能性ＣＨ１ドメイン無しで発現される少なくとも一つの重鎖定常領域を本質的に含む。各重鎖定常領域は、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、Ｃε及びＣα１−２からなる群から選択される追加の重鎖定常領域のエキソンの一つ以上を、これら追加の重鎖定常領域の遺伝子が機能性ＣＨ１ドメインを発現しないという条件で含んでもよい。その重鎖定常領域の遺伝子セグメントは、必要な抗体クラスの好ましいクラス又は混合物によって選択される。任意選択的に、その異種重鎖遺伝子座はＣμとＣδを欠いている。
【００８５】
例えば、クラスＭのＩｇ分子は、マクロファージの活性化及び補体の経路で重要な役割を演じていることが分かっている。ＩｇＭは、その結合部位が近接しているため、ウイルスを含む病原体に対して高い親和力を有する。しかし、ＩｇＭは、高速免疫検定法に使用することは難しいことが知られているが、一方クラスＧのＩｇはこれらの検定法に容易に使用できる。このような用途に対しては、好ましい抗体のクラスとして、すなわちＩｇＧ又はＩｇＭを選択することが有用である。
【００８６】
ＣＨ１を欠いている異種重鎖Ｃγ遺伝子座の全て又は一部を発現すると、その異種ＩｇＧ遺伝子座中に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のイソタイプによって、いくつかの又は全てのＩｇＧイソタイプが任意選択的に産生される。あるいは、重鎖はＣε遺伝子を含んでもよい。生成するＩｇＥ分子も治療に使用できる。
【００８７】
あるいは、抗体の選択された混合物を得ることができる。例えば、ＩｇＡとＩｇＭは、重鎖定常領域がＣα遺伝子とＣμ遺伝子を含むときに得ることができる。
【００８８】
本発明の重鎖定常領域は、特に重鎖抗体を、ヒトを治療する用途に使用したいとき、ヒトが起源である方が好ましい。重鎖抗体を、診断又は獣医学的用途に使用したい場合、重鎖定常領域は、診断又は獣医学的治療をしたい標的の生物、脊椎動物又は哺乳類由来である方が好ましい。
【００８９】
重鎖定常領域は、発現されたとき、機能性ＣＨ１ドメインを欠いている。そのＣＨ１エキソン及び任意選択的にＣμとＣδの定常領域は、変異、欠失又は置換を行なってもよい。ＣＨ１エキソンは欠失している方が好ましい。例えば機能性ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭが存在するとＢ細胞の成熟を阻害し、Ｂ細胞の成熟が阻害された結果として、同じ遺伝子座中に重鎖のみＩｇＧ（ＣＨ１を欠いている）を産生発現することが制限される。
【００９０】
本明細書で定義する「重鎖定常領域エキソン」（「ＣＨエキソン」）は、天然の脊椎動物であるが特に哺乳類のＣＨエキソンの配列を含む。これはクラス特異的方式で変化する。例えば、ＩｇＧとＩｇＡは、天然に、ＣＨ４ドメインを欠いている。用語「ＣＨエキソン」は、そのＣＨエキソンが、重鎖定常領域の一成分であるとき、本明細書で定義したような機能性重鎖のみ抗体を生成できる限り、その範囲内に、その誘導体、ホモログ及びフラグメントも含む。
【００９１】
ＣＨ４又は他の機能性ドメインは、存在しているとき、細胞内の分泌プロセス、Ｂ細胞の成熟又は生成した抗体ポリペプチドの結合活性を阻害しないならば、任意選択的に導入遺伝子中で遺伝子工学的に処理されたり又は欠失されてもよい。
【００９２】
＜哺乳類＞
本発明の方法に使うトランスジェニック哺乳類はヒトではない。トランスジェニック哺乳類としては、ウサギ、モルモット、ラット又はマウスなどのげっ歯類が好ましい。マウスが特に好ましい。ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ又は他の動物などの代替動物も利用できる。
【００９３】
トランスジェニック動物は、確立された卵母細胞注射法及び確立されたときにはＥＳ細胞技術又はＥＳ細胞クローニング法を利用して生成させる方が好ましい。
【００９４】
有利には、重鎖のみ抗体を本発明の方法によって発現させるとき、その哺乳類に内在している免疫グロブリンの重鎖遺伝子座及び任意選択的に軽鎖遺伝子座は、欠失させるか又は抑止する。
【００９５】
抗体の起源とは異なる起原の脊椎動物種に抗体を投与すると、その投与された抗体に対する免疫応答が始まることが多いので、上記のような重鎖のみ抗体を生成させるこの方法は、ヒトの治療に使う抗体を生成させるのに特に有用であろう。
【００９６】
したがって、別の態様で、本発明は、本発明の異種重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニック哺乳類を提供する。
【００９７】
そのトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む抗体を産生する能力を低減するように遺伝子工学的に処理されてもよい。
【００９８】
抗体産生細胞は、本発明のトランスジェニック動物に由来してもよく、例えば、本明細書に記載したような重鎖のみ抗体を産生するためのハイブリドーマを調製するのに使用できる。加えて、又は別の方法として、核酸配列は、本発明のトランスジェニック哺乳類から単離されてもよく、ＶＨドメイン重鎖のみ鎖抗体又はその二重特異性／二機能複合体を、当業者に公知の組換えＤＮＡ法を使って製造するのに使用されてもよい。
【００９９】
加えて、又は別の方法として、抗原特異的重鎖のみ抗体は、本発明のトランスジェニック動物を免疫することによって生成されてもよい。
【０１００】
したがって、別の態様で、本発明は、本発明のトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによって重鎖のみ抗体を製造する方法を提供する。
【０１０１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、その哺乳類はマウスである。
【０１０２】
＜重鎖のみ抗体及びそのフラグメント＞
もう一つの態様で、本発明は、本発明の方法で得ることができる重鎖のみ抗体及びその機能性フラグメントと誘導体を提供する。ＶＨ結合ドメインを含むフラグメントは、本発明の重鎖のみ抗体すなわち軽鎖を欠いている抗体を、酵素又は臭化シアンで開裂することによって誘導できる（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。
【０１０３】
好ましい機能性フラグメントは、抗原特異的の重鎖のみ結合ドメイン、すなわち、単独のＶ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメント間の組換えと続く体細胞変異で生成するＶＨ遺伝子座によって発現されるＶＨ結合ドメインである。本発明のこの態様によって、ＶＨ遺伝子座は、例えば、上記免疫されたトランスジェニック動物の抗体産生細胞から単離したｍＲＮＡからクローン化できる。次に、クローン化された配列は、ファージ（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６）又は類似のディスプレイライブラリー、例えば酵母ベースの系（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，５５３−７）を使って提示され、抗原特異的ＶＨ結合ドメインが同定される。次に、抗原特異的重鎖結合ドメインは、大規模に量産可能な細菌、酵母又はそれに代わる発現系で、単独又は融合タンパク質として製造できる。またＶＨ結合ドメインをコードする配列は、免疫されたトランスジェニックマウスから古典的な方法で誘導される、特性を決定されたハイブリドーマからクローン化することもできる。これらの配列は、異なるエフェクター機能を有する指定の抗体クラス（例えばＩｇＥ又はＩｇＡ）とその変異体を遺伝子工学的に処理することを含めて、ＶＨ結合ドメインとその誘導体の製造に使用されることができる。
【０１０４】
したがって、本発明はまた、
（ａ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体（好ましくは、対象の可溶性の抗原特異的重鎖のみ抗体）を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｂ）前記単離した細胞又は組織から誘導したｍＲＮＡからＶＨ結合ドメインをコードする配列をクローン化するステップと、
（ｃ）そのコードされたタンパク質を、ファージ又は類似のライブラリーを使ってディスプレイするステップと、
（ｄ）抗原特異的ＶＨ結合ドメインを同定するステップと、
（ｅ）そのＶＨ結合ドメインを、単独で又は融合タンパク質として、細菌、酵母、哺乳類又は代替の発現系で発現させるステップと
を含むＶＨ結合ドメインの製造方法を提供する。
【０１０５】
あるいは、ＶＨドメイン含有フラグメントは、本発明の重鎖のみ抗体から、酵素による開裂法又は化学的開裂法を利用し、次いでその開裂産物からＶＨドメイン含有フラグメントを分離することによって製造できる。
【０１０６】
ＶＨ結合ドメインを、特性を決定されたハイブリドーマから単離する場合は、ｍＲＮＡ由来のクローン化ＶＨ結合ドメイン配列を、ファージなどのディスプレイ系を利用する追加の選択ステップに頼ることなく、発現ベクター中に直接クローン化できる。
【０１０７】
エフェクター領域を取り込んでいる、重鎖のみ抗体の産生系としては、大量飼育法に適した培養中の哺乳類の細胞（例えばＣＨＯ細胞）、植物（例えばトウモロコシ）、トランスジェニックヤギ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、鶏及び昆虫の幼虫がある。ウイルス感染（例えば昆虫の幼虫や細胞系へのバキュロウイルスの感染）を含む他の産生系は、細胞培養法及び生殖細胞法の代わりの系である。その他の産生系も当業者にはよく知られている。重鎖のみＩｇＡ又はＩｇＭの会合が必要な場合は、「Ｊ鎖」を共発現させることが有益である。ラクダの重鎖のみ抗体又はＶＨ結合ドメインだけを産生させるのに適切な方法は当分野では周知である。例えば、ラクダのＶＨ結合ドメインは細菌系で産生されており、ラクダの重鎖のみホモ二量体はハイブリドーマ及びトランスフェクトされた哺乳類細胞で産生されている（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，２５−３８参照）。
【０１０８】
ファージディスプレイ法を使って誘導された遺伝子工学的処理ヒトＶＨ結合ドメインを発現させる方法も確立されている（Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２４７７４−２４７８０及びこの文献に記載されている引用文献）。
【０１０９】
トランスジェニックハエ系由来の昆虫幼虫が、体腔液中に、哺乳類の細胞が産生する抗体と差異のない特性を有する機能性重鎖のみ抗体フラグメントを産生することが分かっている（ＰＣＴ／ＧＢ２００３／０００３３１９）。本発明はまた、本発明のこの態様の方法によって得られる抗原特異的な単量体又は二量体のＶＨ結合ドメインを提供する。
【０１１０】
本発明はまた、異種の重鎖遺伝子座、本発明の重鎖のみ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド及び異種の重鎖遺伝子座もしくはそのフラグメントを含むベクターからなるポリヌクレオチド配列、又は本発明の重鎖のみ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１１１】
本発明はまた、本発明の異種重鎖遺伝子座もしくはそのフラグメント、又は重鎖のみ抗体もしくは抗体フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１１２】
第二の態様で、本発明は、エフェクター活性を提供するエフェクター部分を結合された本発明の抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むポリペプチド複合体を提供する。このエフェクター活性は、それに加えて重鎖定常領域により提供されてもよく、分子のアミノ末端又はカルボキシ末端に配置されてもよい。これらポリペプチド複合体は、エフェクター部分の追加のターゲッティング機能すなわちエフェクター機能と組み合わせて、抗原特異的ＶＨ結合ドメインが提供する生理機能を保持している。このようなポリペプチド複合体は、機能性モノマーの形態であるか、又はエフェクター部分の構造との相互作用によっては、二量体、四量体、五量体、多量体もしくは異なるＶＨ結合ドメインを取り込んだ他の複合体の形態であり、その結果、多価又は多特異性を付与する。ＶＨ結合ドメインは、結合分子のアミノ末端又はカルボキシ末端に存在し得る（二量体の例の図１参照）。
【０１１３】
エフェクター部分が結合ドメインを含むとき、その結合ドメインは抗原特異的ＶＨ結合ドメインとは異なる特異性を有してもよい。この配列の利点は、そのポリペプチド複合体が異なる標的と容易に架橋できることである。例えば、二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞−細胞間の相互作用と細胞−病原体間の相互作用を高めるのに利用できる。この実施形態では、本発明のポリペプチド複合体は、例えば病原体とマクロファージなどの２種類の細胞型を架橋するのに利用できる（Ｂｉｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４６，１２９９−１３１１参照）。このような二重特異性を設計する際には、ＶＨ結合ドメインを使用する方がｓｃＦＶ結合ドメインを使用するより好ましい。ＶＨ結合ドメインは、結合親和力が高いので、このようなポリペプチド複合体中に最小のベクター構造で、ｓｃＦＶの四量体の親分子に比例した特異性と親和力を保持するための設計上の考慮の必要も無しに組み込むことができる。二量体又は多量体のポリペプチド複合体を考えるとき、例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域由来のＣＨ２とＣＨ３のドメインを含む二量体化ドメインが組み入れられる（図２参照）。
【０１１４】
用語「エフェクター部分」は、本明細書で使用する場合、細胞に対して所望の生物学的効果を仲介する任意の部分を含む。そのエフェクター部分は、好ましくは可溶性であり、そしてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質でもよく、又は非ペプチド構造体でもよい。例えば、エフェクター部分は、酵素、ホルモン、サイトカイン、医薬、プロドラッグ、毒素特にタンパク質毒素、キレート化構造の放射性核種、結合ドメイン、二量体化ドメインもしくは相互作用ドメイン、造影剤、アルブミン又は阻害剤でもよい。
【０１１５】
アルブミンは、抗原特異的ＶＨ結合ドメインの安定性又は薬物動態学的及び／又は薬力学的特性を増大させるためにエフェクター部分として使用できる（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，２３（１）：２５−３６）。あるいは、エフェクター部分は、薬物動態学的特性を改善するため、ペグ化された構造（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）又は天然にグリコシル化された構造でもよい。
【０１１６】
エフェクター部分は、抗原特異的ＶＨ結合ドメインに結合されたペプチドでもよく、又は、例えばマレイミドリンカーのような化学的にリンクする構造体を使って、抗原特異的重鎖ＶＨドメインに化学的に結合されてもよい。あるいは、本発明のプリペプチド複合体は、融合タンパク質として発現されてもよい。したがって、本発明は、異種の重鎖遺伝子座からなるポリヌクレオチド配列又は本発明の重鎖のみ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド（そのポリヌクレオチドはさらに読み取りフレーム中にエフェクター部分をコードする１個以上のエキソンを含む）も含む。このエキソンは、前記ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端に位置していてもよい。例えば、このポリヌクレオチドは、ＶＨと結合ドメイン／エフェクター部分遺伝子セグメントをこの順序で、読み取りフレーム中に含んでもよい。遺伝子融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）の場合、各種ドメインの結合は、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構造体（同じ読取りフレームに配置された各種ドメインがコードされている）を使って達成されてもよい。このような構造体は、診断剤及び治療剤として有用である。診断剤として、そのエフェクタードメインは、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）又は酵素（例えばβ−ｇａｌ）でもよい。あるいは、エフェクタードメインは、基質に対する結合性を高めるためのタグ（例えばポリヒスチジン又はビオチン）、二次抗体に結合する部位を提供する抗原、又は蛍光マーカーが結合する部位として働くロイシンジッパーもしくは類似の結合モチーフでもよい。
【０１１７】
＜ポリペプチド複合体＞
本発明者らは、抗体重鎖の少なくとも一部分を、単独で又は相補的会合ドメインを含みかつ追加のエフェクター活性を有する別のエフェクター（軽）鎖と組み合わせて含む二価又は多価のポリペプチド複合体を産生できることを明らかにした。本発明のポリペプチド複合体は、エフェクター鎖に付随する追加エフェクター部分の機能と組み合わせた重鎖定常領域によって付与された生理学的機能を保持している（図３）。
【０１１８】
したがって、第三の態様では、ポリペプチド複合体は、一つ以上のエフェクター鎖（軽鎖）と組み合わせた重鎖を含む。本発明の第三の態様は一対の重鎖と一対のエフェクター鎖を含むポリペプチド複合体を提供し、
その一対の重鎖は互いに会合し、
一方のエフェクター鎖は一方の重鎖と会合し、他方のエフェクター鎖は他方の重鎖と会合し、
各重鎖は、結合ドメイン、好ましくは少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４の定常領域ドメインを含む二量体化ドメイン並びにエフェクター鎖の相補的会合ドメインに結合できるエフェクター部分を含み、
そのエフェクター鎖は、エフェクター部分に連結された相補的会合ドメインを含み、そして
前記会合ドメインと相補的会合ドメインは非共有相互作用によって互いに会合している。
【０１１９】
好ましくは、上記重鎖のエフェクター部分は、エフェクター鎖のエフェクター部分とは異なっている。
【０１２０】
上記ポリペプチド複合体は、任意選択的に、ＣＨ３ドメイン（又は存在している場合はＣＨ４ドメイン）のカルボキシル末端に、このドメインを会合ドメインに連結する可撓性ヒンジ様ドメインを含む。上記ポリペプチド複合体は、好ましくは、結合ドメインとＣＨ２ドメインの間に、天然のヒンジドメイン又は遺伝子工学的に処理された可撓性ヒンジ様ドメインを含む。ヒンジ領域の存在により、生成したポリペプチド複合体内の結合ドメインとエフェクター部分の独立した機能を高められる。
【０１２１】
第一ポリペプチド重鎖のエフェクター部分は、任意選択的に、第二ポリペプチド重鎖のエフェクター部分の特異性とは異なる特異性を有する。本発明によれば、ポリペプチド複合体のエフェクター部分は結合ドメインで置換されてもよい。好ましくは、その結合ドメインは（本発明の第一態様で定義されたのと同じ）ＶＨドメイン、又は細胞受容体結合ドメインを含む。生成する四価二量体の結合タンパク質（ポリペプチド複合体）は、異なるエフェクター部分を４個まで含むことができる。好ましくは、重鎖のアミノ末端のエフェクター部分は同一であり、そしてカルボキシ末端のエフェクター部分は同一であり（但し、アミノ末端のエフェクター部分とは異なる抗原又はエピトープを認識する）、単一のホモ二量体の会合を促進する。このような分子は、適正な重鎖の機能性ドメイン（例えばＩｇＡ又はＩｇＭ）を含むことによってエフェクター機能が提供されるので、病原体を捕獲するのに有利であることが分かるであろう。
【０１２２】
本発明の第三の態様の代表的ポリペプチド複合体は、細胞化学的ラベリング法、ターゲッティング法、又は治療に有用である。例えば、エフェクター分子が癌細胞の表面マーカーを標的とする抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含みかつエフェクター部分がプロドラッグ変換酵素に対し特異的な結合ドメインを含むならば（エフェクター鎖）、その抗原特異的ＶＨ結合ドメインは、前記標的に結合して前記エフェクター部分をその標的の直近まで運び、その結果、前記エフェクター鎖と結合して、プロドラッグ（例えばＣＢ１９５４を有するニトロレダクターゼ）の存在下、標的に対して生物学的効果を発揮できる。免疫グロブリン重鎖エフェクター機能を二量体化ドメインとして含むことも標的細胞を除くのに有用であろう。
【０１２３】
＜エフェクター鎖＞
エフェクター鎖は、相補結合ドメインとエフェクター部分を含み、重鎖のエフェクター部分を通じて重鎖と結びついて、会合されたポリペプチド結合複合体を形成する。そのエフェクター鎖の相補的会合ドメインは、エフェクター部分の不可欠な成分であってもよいし、又はエフェクター部分に融合もしくは化学的に結合されたタンパク質もしくは別のリガンドでもよい。前記会合されたポリペプチド結合複合体の重鎖は、標的に結合してエフェクター（軽）鎖部分を標的の直近まで運んで標的に生物学的効果を発揮できる。
【０１２４】
＜エフェクター部分＞
用語「エフェクター部分」は、本明細書で使用するときは、細胞に対して望ましい生物学的効果を仲介する任意の部分を含む。そのエフェクタードメインは、細胞例えばＴ細胞、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質でもよく、又は非ペプチド構造体でもよい。例えば、エフェクタードメインは、酵素、医薬、プロドラッグ、毒素特にタンパク質毒素、キレート化構造体の放射性核種又は結合ドメインでもよい。相補的会合ドメインと会合しているエフェクター部分は、所望の効果によって、自然状態で、細胞の、たんぱく質の、有機又は無機の部分でよい。
【０１２５】
用語「結合ドメイン」は、本発明の上記全ての態様について本明細書で使うときは、生理的溶媒中で活性である任意のポリペプチドドメインを含む。また、このような結合ドメインは、生理的条件下、標的に結合する性能を有していなければならない。
【０１２６】
このような結合ドメインは、細胞表面に対する結合又は接着を仲介できるドメインを含む。本発明のポリペプチド複合体に使用できる適切なドメインは、哺乳類、原核生物及びウイルスの細胞接着分子、サイトカイン、成長因子、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、リガンド、細胞表面の受容体、制御因子、構造タンパク質と構造ペプチド、血清タンパク質、分泌タンパク質、細胞膜会合タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、凝固因子、遺伝子工学的に処理された単一鎖Ｆｖｓなどである。その結合ドメインは、好ましくは脊椎動物のＶＨドメインであり、より好ましくはヒトＶＨドメインなどの哺乳類のＶＨドメインである。
【０１２７】
結合ドメインは、ラクダＶＨ（ＶＨＨ）ドメインを含んでもよく、又は非ラクダから得たＶＨドメインを含んでもよい。その結合ドメインは、好ましくはヒトＶＨドメインである。ＶＨ結合ドメインは、合成ファージライブラリーから誘導されたＶＨドメインではなく、トランスジェニック動物又は（上記の）ラクダから誘導したＢ細胞起源ものの方が好ましい。なぜなら、トランスジェニック動物又はラクダから誘導したＢ細胞起源のものが、インビボで抗原の投与に応答しＶＤＪの再構成と体細胞変異によって生成するので親和力が高いためである。
【０１２８】
エフェクター部分が結合ドメインを含むとき、その結合ドメインは重鎖の結合ドメインと異なっている方が好ましい。この構成の利点は、ポリペプチド複合体が、異なる標的の架橋を促進できるか又は標的細胞（例えば病原体）の異なる抗原に結合できる点である。
【０１２９】
第一の重鎖の結合ドメインは、第二の重鎖の結合ドメインの特異性とは異なる特異性を有してもよい。この場合、ポリペプチド複合体は少なくとも二価であるので、異なる標的を架橋することができ、かつそのエフェクタードメインはその効果を両方の抗原に対して発揮できる。多価のポリペプチド複合体は、これら四価の重鎖を、さらに、異なる一種以上の特異性及び機能を有するエフェクタードメインを含むエフェクター鎖と会合させて作製できる。また、第一の重鎖のエフェクター部分は、第二の重鎖のエフェクター部分とは異なる特異性を有してもよく、その結果各々異なる機能を保持する二つ以上のエフェクター鎖を捕獲できる。
【０１３０】
＜相補的会合ドメインはエフェクター部分に結合する＞
重鎖がエフェクター鎖と会合しているとき、用語「エフェクター部分」と「相補的会合ドメイン」は、本明細書で使う場合、少なくとも一つの非共有結合を、互いに形成できる部分を含む。例えば、そのエフェクター部分と相補的会合ドメインは、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン−免疫グロブリン軽鎖の定常領域間、ロイシンジッパー間、ＶＣＡＭ−ＶＬＡ−４間、インテグリン−細胞外マトリックスタンパク質間、インテグリン−ＣＤ５４もしくはＣＤ１０２などの細胞表面分子間、ＡＬＣＡＭ−ＳＲＣＲドメイン間、ｓｃＦｖ−抗原間又はＶＨ結合ドメイン−抗原間などにみられるようなタンパク質−タンパク質相互作用を形成できるタンパク質、ペプチドフラグメント又は共通配列でもよい。
【０１３１】
＜重鎖＞
重鎖の二量体化ドメインが免疫グロブリン重鎖の定常領域を含むときは、その定常領域（ＣＨエキソン）は、さらなる生理的機能をポリペプチド結合複合体に付与してもよい。特に、その免疫グロブリン重鎖の定常ドメインは、その抗体定常ドメインのクラス又はサブクラスに依存して、特に補体の結合、マクロファージの活性化及びＦｃ受容体への結合を提供してもよい。
【０１３２】
先に考察したように、発現された重鎖のクラスは、インビボでのエフェクター機能に重要な役割を持っていることはよく報告されている。樹立細胞系は有用な生物学的ターゲッティング効果を有するポリペプチド複合体を産生するかもしれないが、その重鎖定常領域は、診断上又は治療上望ましくないクラスの場合があるかもしれず、又は有効量を分泌しないこともあり得る。したがって、本発明のポリペプチド複合体の重鎖定常ドメインは、特異的に変えたり又は部分的にもしくは完全に削除して、免疫グロブリン重鎖の成分を導入したり、又は除いてもよい。
【０１３３】
例えば、クラスＭのＩｇ分子が、マクロファージの活性化と補体の経路で重要な役割を演じていることは知られている。その結合部位の近接近により、ＩｇＭは、ウイルスを含む病原体に対して高い親和力を有する。しかしＩｇＭは高速免疫検定法に使用することが難しいが、その一方でクラスＧのＩｇはこの検定法に容易に使用できることも知られている。この用途では、重鎖のクラスをμからγのドメインに切り替えることが有効であろう。
【０１３４】
重鎖のＣγ遺伝子座を単独で発現させると、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のイソタイプを含むＩｇＧを産生し、この内いくつかは補体も活性化する。ＩｇＧ抗体類は、マクロファージ及び顆粒球に結合して活性化したり、また胎盤を通過することもできる。
【０１３５】
各種の抗体クラスの追加の用途はすでに考察されている。
【０１３６】
本発明のポリペプチド複合体の重鎖の定常領域は、先に定義したようなヒト、ウサギ、ラット又はマウスを起源とするものでよい。なかでも、ヒトを起源とするものが好ましい。
【０１３７】
本発明のポリペプチド複合体は、エフェクター機能を全く提供しない二量体化ドメインを利用することによって、リガンドがその受容体に結合するのを遮断するために単独で使用することができる。多種類の受容体を、多重特異性ポリペプチド複合体で遮断できる。
【０１３８】
本発明の第四の態様では、エフェクター分子が、別個のエフェクター分子と会合できるように二量体化ドメインを含んでもよい。この二量体化ドメインは、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４の抗体定常領域ドメイン及び／又はＪ鎖のうち一つ以上を含んでもよい。本発明の本実施形態では、エフェクター分子の二量体又は多量体を産生するために二つ以上のエフェクター分子が会合してもよい。そのエフェクター分子は、同じでも（エフェクター分子のホモ二量体又はホモ多量体を産生できる）異なっていても（エフェクター分子のヘテロ二量体又はヘテロ多量体を産生できる）よい。好ましくは、エフェクター分子の二量体又は多量体は二価又は多価である。好ましくは、前記二つ以上のエフェクター分子の定常領域（すなわち二量体化ドメイン）は同じであるから生成物が異種になる可能性は低い。
【０１３９】
本発明の第四の態様によって、第一ポリペプチド重鎖と第二ポリペプチド重鎖からなる二量体を含むポリペプチド複合体であって、
各ポリペプチド重鎖が、結合ドメイン並びに任意選択的に少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４の抗体定常領域のドメイン及び任意選択的にエフェクター部分を含む二量体化ドメインを含み、
好ましくは第一ポリペプチド重鎖の結合ドメインは、第二ポリペプチド重鎖の結合ドメインと同じ特異性を有し、そして
これら二つのポリペプチド重鎖の定常領域（二量体化ドメイン）は同一である
ポリペプチド複合体が提供される。
【０１４０】
好ましくは、上記第一鎖と第二鎖は同じエフェクター部分を有する。
【０１４１】
好ましくは、上記二量体化ドメインは、少なくともＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４の抗体定常領域のドメインを含む。
【０１４２】
また、本発明の第四態様は、複数のポリペプチド重鎖二量体及び一つのＪ鎖を含むポリペプチド複合体であって、
複数のポリペプチド重鎖二量体がＪ鎖によって会合され、
各ポリペプチド重鎖が、結合ドメイン並びに同一のμ、ε、α又はγのＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４のドメインを含み、そして
そのポリペプチド複合体中に、異なる特異性を有する少なくとも二つの結合ドメインが存在している
ポリペプチド複合体を提供する（図４と５参照）。
【０１４３】
上記本発明の第一態様で定義したように、各重鎖の定常領域は、好ましくは、重鎖のみ抗体を生成できるように機能性ＣＨ１ドメイン無しで発現される少なくとも一つの重鎖定常領域の遺伝子を含む。また、各重鎖定常領域は、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、Ｃε及びＣα１−２からなる群から選択される一つ以上の追加の重鎖定常領域の遺伝子を、その追加の重鎖定常領域の遺伝子が機能性ＣＨ１ドメインを発現しないという条件で含んでもよい。その重鎖定常領域の遺伝子は、必要な抗体クラスの好ましいクラス又は混合物によって選択される。
【０１４４】
好ましくは、発現されるＩｇＡとＩｇＭ中には、異なる特異性の結合ドメインが二つだけ存在している。
【０１４５】
一実施形態では、重鎖は各々ＣＨ４ドメインを含み、定常ドメインはαドメインであり、そしてポリペプチド複合体はＪ鎖を含む。
【０１４６】
もう一つの実施形態では、重鎖は各々ＣＨ４ドメインを含み、定常ドメインはμドメインであり、そして抗体はＪ鎖を含む。
【０１４７】
＜ポリペプチド複合体の会合＞
本発明のポリペプチド複合体のモジュールドメインの構成は、その複合体を、多種類の可能な順列で構築することを可能にする。ポリペプチド複合体のドメインの構造及びアミノ酸の配列におけるこのような変更は、配列をコードする対応ＤＮＡの適切な領域を適切に変異させるか又は部分的に合成し及び置換することによって達成されてもよい。置換ドメイン又は付加ドメインは、互換性がある組換えＤＮＡ配列から得られてもよい。例えば、重鎖は、結合ドメインとＣＨ２ドメインのアミノ末端との間及びエフェクタードメインと重鎖のＣ末端（ＣＨ３又はＣＨ４）との間の両方に、天然ヒンジ又は遺伝子工学的に処理された可撓性ポリペプチドドメインを含んでもよい。
【０１４８】
本発明のポリペプチド複合体の重鎖は、融合タンパク質として発現される。本発明のこの態様のポリペプチド複合体のエフェクター鎖は、融合タンパク質として発現されてもよく、又は化学的手段で会合されてもよく、又は自然状態の細胞であれば、血液もしくは組織から単離するかもしくはインビボで捕獲されもてよい（例えばアルブミン）。
【０１４９】
遺伝子融合の場合は、各種ドメインの連結は、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構造体で、同じ読取り枠内に配置されている各種ドメインをコードするＤＮＡを使うことで達成されてもよい。
【０１５０】
エフェクター部分は、融合タンパク質の一部として存在しているときは、相補的会合ドメインのアミノ末端又はカルボキシ末端に位置してもよい。
【０１５１】
あるいはエフェクター鎖のドメインは、融合タンパク質として合成するのではなく当分野で既知の通常のペプチド化学の方法で会合させてもよい。
【０１５２】
結合はペプチド結合又は化学結合を介してもよい。例えば、エフェクター部分は、相補的会合ドメインにペプチド結合されてもよいし、又は例えばマレイミドのリンカーなどの化学的連結構造体を使うことによって、相補的会合ドメインに化学的に結合されてもよい。
【０１５３】
そのエフェクター部分は重鎖のどの位置に配置してもよい。例えば、エフェクター部分は、重鎖のＣ末端に、又はポリペプチド複合体の結合ドメインとＣＨ２ドメインもしくはヒンジドメインとの間に配置されてもよい。上記会合ドメインは、エフェクター機能及び二量体化ドメインを阻害することがあるので、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間には配置しない方がよい。エフェクター部分は、その独立した結合／機能を高めるために、重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端に、ペプチドの可撓性リンカー又はヒンジ様領域によって連結する方が好ましい。
【０１５４】
＜ポリヌクレオチド配列、ベクター及び宿主細胞＞
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体のいずれか一つの重鎖をコードするポリヌクレオチド配列、上記ポリヌクテオチド配列を一つ以上含むベクター及び本発明のポリペプチド複合体の重鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。そのポリヌクレオチドは、好ましくは、発現された重鎖をホモ二量体として、宿主細胞が増殖している培地中に分泌させる配列を含む。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含む任意の起源の細胞でもよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。
【０１５５】
同じ宿主細胞を、異なる標的に対する特異性を有する結合ドメインを含む重鎖をコードする第二ベクターでトランスフェクトすると、二つの構造体及びホモ二量体とヘテロ二量体の混合物の会合物が共発現される。ホモ二量体は同系の抗原に対して特異性を示し、ヘテロ二量体は両方の抗原に結合する。
【０１５６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体の少なくとも一つのエフェクター鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含む任意の起源の細胞でよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。あるいは、エフェクター鎖は、当分野で知られている方法を使って合成されてもよい。
【０１５７】
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体の少なくとも一つの重鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含む任意の起源の細胞でよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。あるいは、上記重鎖は、当分野で知られている方法を使って合成されてもよい。
【０１５８】
本発明はまた、本発明のポリペプチド複合体の少なくとも一つの重鎖及び少なくとも一つのエフェクター鎖をコードするベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。その宿主細胞は、細菌及び酵母の細胞を含むどの起源の細胞でもよいが、脊椎動物の宿主細胞が好ましく、哺乳類の宿主細胞が一層好ましい。あるいは、これらの鎖は、当分野で知られている方法を使って、独立して合成され会合されてもよい。
【０１５９】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも一つの重鎖のホモ二量体もしくはヘテロ二量体のポリペプチド複合体を発現するトランスジェニック生物を提供する。そのトランスジェニック生物は、ヒトではない脊椎動物もしくは哺乳類、植物又は昆虫でもよい。
【０１６０】
本発明はまた、本発明の第一態様のクラス特異的重鎖のみ抗体及びそのＶＨドメインを、本発明のトランスジェニック生物を抗原で免疫することによって産生する方法を提供する。
【０１６１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、上記生物はマウスである。
【０１６２】
健康管理の用途で使う抗体及びポリペプチド複合体を産生するには、大量に生産する系が必要であり、その例は先に詳細に考察してある。このような系としては、大量に栽培もしくは飼育する方法に適した植物（例えばトウモロコシ）、トランスジェニックのウシ及びヒツジ、鶏及び昆虫の幼虫がある。細胞培養及び生殖細胞系列の方法に代わるものとしてウイルス感染（例えば昆虫の幼虫や細胞系へのバキュロウイルスの感染）を含む他の産生法も、当業者にはよく知られたものになるだろう。
【０１６３】
これらの方法及び当分野で知られている他の適切な方法は、本発明のポリペプチド結合複合体を製造するのに使用できる。ホモ二量体及び／又はヘテロ二量体の製造はこれらの方法を使って達成できる。
【０１６４】
＜本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド複合体の使用＞
本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド結合複合体には、多数の用途がある。
【０１６５】
例えば、本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド複合体には、二重特異性及び多重特異性のポリペプチド複合体が含まれる。これらの複合体は、例えば、感染症の治療と予防に使う治療剤として特に有利である。
【０１６６】
本発明の重鎖のみ抗体及びポリペプチド結合複合体は、細胞化学的ラベリング法、ターゲッティング法、治療及び診断を実施するのに有用である。
【０１６７】
モノ抗体療法では、例えば、単一の結合部位の欠失をもたらす突然変異のために病原体の免疫回避が起こり、抗体の治療効果が消失するであろう。同じ病原体の異なる抗原を認識するヘテロ二量体のポリペプチド複合体を産生すればこの問題を克服できる。本発明のポリペプチド複合体中の異なる特異性を有する少なくとも二つの結合ドメインを、細胞−細胞の相互作用及び細胞／病原体の相互作用の両方を高めるために使用することもできる。
【０１６８】
本実施形態では、本発明のポリペプチド複合体は、例えば、病原体とマクロファージ又は腫瘍細胞とＴ細胞などの二つの細胞型の間をポリペプチド複合体で架橋するのに使用できる。あるいは、そのポリペプチド複合体は、重鎖定常領域だけで提供されているエフェクター機能によって、同じ病原体の二つ以上のエピトープを認識してもよい。
【０１６９】
あるいは、二重特異性ポリペプチド結合複合体はインビボで標的の細胞又は組織に対して使用されてもよく、次いで循環しているエフェクター分子又は造影剤を捕獲できる。例えば、二重特異性腫瘍ターゲッティング剤はプロドラッグ変換複合体を捕獲し次いでプロドラッグを反応剤に部分的に変換するために使用され得る。また、エフェクター剤と組み合わせた二重特異性結合複合体と多重特異性結合複合体は、結合ドメインを選択することによって一種以上の病原体に結合し、破壊するために使用されてもよい。あるいは、同じ病原体の異なる抗原を認識する二種以上の結合ドメインの存在は臨床面で有利であり、病原体内の突然変異が原因の病原体の免疫回避や医薬の余剰が起こる可能性を低める。
【０１７０】
本発明は、本発明の第一態様の重鎖のみ抗体又はそのフラグメント、本発明の第二態様のポリペプチド鎖とポリペプチド複合体、及び本発明の第三態様のエフェクター鎖とポリペプチド複合体を提供する。これらは全て、ヒトの医薬の用途に適しているので、本発明は、本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患の予防及び／又は治療に使う医薬を調製する際の、本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体の使用も提供する。重鎖とエフェクター鎖は、前記医薬の投与方法と作用によって、ともに又は別個に配合されてもよい。
【０１７１】
本発明の医薬組成物と医薬は、一般に、患者に投与する前に配合され得る。
【０１７２】
例えば、重鎖のみ抗体又はポリペプチド複合体は、特に凍結乾燥しなければならないとき、安定剤と混合してもよい。糖類（例えば、マンニトール、スクロース又はトレハロース）を添加すると、一般に、凍結乾燥中、安定性を付与し、好ましい安定剤はマンニトールである。ヒト血清アルブミン（好ましくは組換え体）も安定剤として添加できる。糖類の混合物、例えばスクロースとマンニトール、トレハロースとマンニトールなども使用できる。
【０１７３】
本発明の組成物には緩衝剤を添加してもよく、緩衝剤としては、例えば、トリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、グリシン緩衝剤又は好ましくはリン酸緩衝剤（例えば、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムを含有する）がある。緩衝剤は、ｐＨが７．２から７．８の間、特に約７．５になる量で添加することが好ましい。
【０１７４】
凍結乾燥した後、再構成するために注射用滅菌水が使用されてもよい。凍結乾燥された固形物を、ヒト血清アルブミン（好ましくは組換え体）を含む水性組成物で再構成することもできる。
【０１７５】
一般に、重鎖のみ抗体とポリペプチド複合体は、精製された形態で薬理学的に適正な担体とともに利用され得る。
【０１７６】
したがって、本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与することからなる患者の治療方法を提供する。患者は好ましくはヒトであり、小児（例えば幼児又は乳児）、１０歳台のヒト又は成人でもよいが一般に成人であろう。
【０１７７】
本発明はまた、医薬として使用する本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体を提供する。
【０１７８】
本発明はまた、患者を治療するのに使う医薬を製造する際の本発明の重鎖のみ抗体、ポリペプチド鎖、エフェクター鎖又はポリペプチド複合体の使用も提供する。
【０１７９】
これらの使用、方法及び医薬は、好ましくは以下の疾患及び障害を治療するのに利用され、その疾患及び障害は、創傷の治癒；新生物、黒色腫、肺、結腸直腸、骨肉腫、直腸、卵巣、肉腫、頚管、食道、乳房、膵臓、膀胱、頭部と頚部などの充実性腫瘍を含む細胞増殖傷害；白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管新生障害、カポジ肉腫などの骨髄増殖性障害；アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬と気道炎症、喘息、免疫障害及び臓器移植拒絶を含む自己免疫／炎症障害；高血圧、水腫、狭心症、アテローム性じゅく状硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再潅流障害及び虚血を含む心血管と脈管の障害；中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症及び疼痛を含む神経障害；発達障害；糖尿病、骨粗鬆症と肥満症、ＡＩＤＳ及び腎臓病を含む代謝異常；ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を含む感染症；胎盤に関連する病的状態；並びに免疫療法を利用する他の病的状態である。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の重鎖のみ抗体又はポリペプチド結合複合体の診断剤、予後治療剤又は治療用造影剤としての使用方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の重鎖のホモもしくはヘテロの二量体だけ又はこれを本発明の一つ以上のエフェクター（軽）鎖と組み合わせた治療用造影剤、細胞化学の試薬又は診断剤としての使用方法を提供する。
【０１８１】
本発明は、本明細書に記載されている重鎖のみ抗体又はそのフラグメントの細胞内結合試薬又は抗体酵素としての使用方法を提供する。好ましい重鎖のみ抗体のフラグメントは、可溶性の抗原特異的ＶＨ結合ドメインである。
【０１８２】
本発明はまた、本発明の抗原特異的単鎖抗体又はＶＨ結合ドメインの酵素阻害剤又は受容体封鎖剤としての使用方法を提供する。好ましい重鎖のみ抗体のフラグメントは、可溶性の抗原特異的ＶＨ結合ドメインである。
【０１８３】
本発明はまた、エフェクター分子に融合させたＶＨドメインの治療剤、造影剤、診断剤、アブザイム又は試薬としての使用方法を提供する。
【０１８４】
＜一般技術＞
本明細書で使用されている技術用語と科学用語は、特に定義しない限り、当業者（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成技術及び生化学の当業者）が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。分子、遺伝子及び生化学の方法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）並びに化学的方法の標準方法が使用される。さらに、標準の免疫学的方法として、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．がある。
【０１８５】
本発明の二価及び多価のポリペプチド複合体、単一重鎖抗体及びそのフラグメントの製造のために、任意の適切な組換えＤＮＡ技術が使用されてもよい。ポリペプチド複合体又は抗体の鎖各々をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドなどの典型的な発現ベクターが構築される。免疫グロブリンを酵素で及び化学的に細分して生成したフラグメントを分離する確立された適切な任意の方法が使用されてもよい。
【０１８６】
本発明はまた、トランスジェニックマウス内で重鎖のみ抗体を発現する構造体を含み、本発明のポリペプチド複合体を構築し発現するベクターを提供する。
【０１８７】
ポリペプチド鎖以外の鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する単一ベクターが構築されてもよいことは高く評価されるであろう。例えば、二つの異なる重鎖をコードするＤＮＡ配列は、同じプラスミドの異なる位置に挿入されてもよい。
【０１８８】
あるいは、各ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を、個々に一プラスミドに挿入して、各々特定のポリペプチド鎖をコードする多数の構築されたプラスミドを製造してもよい。配列を挿入するプラスミドは互換性のある方が好ましい。
【０１８９】
続いて、各プラスミドは、各宿主細胞がポリペプチド複合体中の各ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を含有するように、宿主細胞を形質転換するのに使用される。
【０１９０】
細菌系内でクローン化するのに適切な発現ベクターとしては、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐｃＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４及びＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ、又はこれらのいずれかの誘導体が使用されてもよい。
【０１９１】
酵母系内にクローン化するのに使用する適切な発現ベクターとしては、２ｍｉｃｒｏｎプラスミドの複製起点に基づいたプラスミドが挙げられる。
【０１９２】
適正な哺乳類の遺伝子のプロモーター配列を含有する任意のプラスミドは、哺乳類系内でのクローン化に使用されてもよい。昆虫又はバキュロウイルスのプロモーター配列は、昆虫細胞の遺伝子を発現させるのに使用されてもよい。このようなベクターとしては、例えばｐＢＲ３２２、ウシ乳頭腫ウイルス、レトロウイルス類、ＤＮＡウイルス類及びワクシニアウイルス類由来のプラスミドがある。
【０１９３】
ポリペプチド複合体又は抗体を発現のために使用されてもよい適切な宿主細胞としては、細菌、酵母及び真核細胞例えば昆虫もしくは哺乳類の細胞系、トランスジェニック植物、昆虫、哺乳類及び他の無脊椎動物もしくは脊椎動物の発現系が挙げられる。
【０１９４】
＜本発明のポリペプチド複合体及び単一重鎖抗体＞
用語：本発明の「ポリペプチド複合体」、「単一重鎖抗体」及び「異種重鎖遺伝子座」は、例えば、類縁の細胞ホモログ、他の種由来のホモログ及びその変異体もしくは誘導体などの任意の供給源から得られる同族のポリペプチド及び核酸配列を含むことは当然明らかであろう。
【０１９５】
したがって、本発明は、本明細書に記載されている上記ポリペプチド複合体と抗体の変異体、ホモログ又は誘導体を含む。
【０１９６】
本発明の文脈では、同族配列は、少なくとも３０個、好ましくは５０、７０、９０又は１００個のアミノ酸を超えるアミノ酸レベルで、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％相同で好ましくは少なくとも９８又は９９％相同であるアミノ酸配列を含むと考えられる。相同性は類似性（すなわち類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）によって検討することもできるが、本発明の文脈では、相同性は配列の同一性で表現する方が好ましい。
【０１９７】
本発明には、本発明のポリペプチド複合体と抗体を製造するのに使う構築された発現ベクター及び形質転換された宿主細胞も含まれる。
【０１９８】
個々の鎖は、同じ宿主細胞内で発現された後、活性型の完全なポリペプチド複合体又は重鎖のみ抗体を提供するために回収されてもよい。本発明の好ましい形態では、個々の重鎖は、宿主細胞によって処理されて、その細胞から有利に分泌される完全なポリペプチド複合体又は抗体を形成すると考えられる。好ましくは、エフェクター鎖は、宿主細胞又は合成手段によって別個に産生される。
【０１９９】
組換え抗体のポリペプチド複合体の調製法は、上記参照文献及び例えばＥＰ−Ａ−０ ６２３ ６７９；ＥＰ−Ａ−０ ３６８ ６８４及びＥＰ−Ａ−０ ４３６ ５９７にも記載されている。
【０２００】
＜トランスジェニック生物の免疫＞
さらなる態様で、本発明は、抗原を、本発明のトランスジェニック生物に投与することを含む本発明の抗体の製造方法を提供する。
【０２０１】
本発明のトランスジェニック生物から産生される抗体及びポリペプチド複合体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそのフラグメントが挙げられる。ポリクローナル抗体が必要なときは、トランスジェニック動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、抗原で免疫し、免疫された動物から血清を集めて、公知の方法で処理されてもよい。ポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する抗体を含有するとき、対象のポリクローナル抗体は、当業者にはよく知られている免疫親和性クロマトグラフィー及びこれに類似の方法で精製できる。また、ポリクローナル抗血清を産生させ処理する技術も、当分野で知られている。
【０２０２】
＜本発明のポリペプチド結合複合体及び抗体の使用方法＞
本発明のポリペプチド複合体及び抗体とそのフラグメントは、インビボでの治療と予防の用途、インビトロとインビボで診断する際の用途、インビトロでの検定と試薬の用途などに利用されてもよい。
【０２０３】
本発明のポリペプチド複合体と抗体を治療と予防に用いる方法には、それらを、ヒトなどの受容哺乳類に投与するステップが含まれる。
【０２０４】
実質的に純粋なポリペプチド複合体及び抗体のそのフラグメントを少なくとも９０〜９５％の均質性で含有しているものが哺乳類に対して投与するのに好ましく、そして特に哺乳類がヒトの場合、医薬の用途には、９８〜９９％以上の均質性が最も好ましい。所望どおりに部分的に又は均質に精製されたならば、本明細書に記載のポリペプチド複合体と重鎖のみ抗体は、診断又は治療（体外の場合を含む）に使うか又は当業者に知られている方法を使って検定法を開発して実施するのに使用されてもよい。
【０２０５】
一般に本発明のポリペプチド複合体と抗体は、精製された形態で、薬理学的に適正な担体とともに利用される。典型的には、これら担体としては、水溶液もしくはアルコール／水溶液、乳濁液もしくは懸濁液があり、これらは生理食塩水及び／又は緩衝媒体を含んでもよい。非経口用の賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム及び乳酸化リンゲル液がある。
【０２０６】
ポリペプチド複合体を懸濁液に保持することが必要な場合、生理的に許容できる適切なアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギネートなどの増粘剤から選択してもよい。
【０２０７】
静脈内用賦形剤としては、流体と栄養素の補充剤及び電解質の補充剤、例えばリンゲルのデキストロースに基づいたものが挙げられる。また、保存剤などの添加剤、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスが存在していてもよい（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０２０８】
本発明のポリペプチド複合体及び抗体とそのフラグメントは、別個に投与される組成物として又は他の試薬とともに使用できる。これらは、各種の免疫治療用薬剤、例えばシクロスポリン、メトトレキサート、アドレアマイシン、シスプラチナム又はイムノトキシンを含んでもよい。あるいは、本発明のポリペプチド複合体は、酵素とともに使用して、プロドラッグをその活性部位で変換できる。
【０２０９】
医薬組成物は、本発明の選択された抗体とともに又は本発明の選択された抗体の組合せとともに、各種の細胞傷害性又は他の試薬の「カクテル」を含んでもよい。
【０２１０】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に公知のどの経路でもよい。特に制限を含まない免疫療法を含む治療法の場合、本発明のポリペプチド複合体又は抗体は、どの患者にも標準の方法で投与できる。その投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺又はカテーテルを使って適切に行う直接注入を含む任意の適切な様式によって行なわれる。投与量と投与の頻度は、臨床医が考慮する患者の年齢、性別及び症状、他の医薬の同時投与、計器の示度などの他のパラメータに依存するであろう。
【０２１１】
本発明のポリペプチド複合体と抗体は、凍結乾燥して貯蔵し、使用する前に適切な担体で再構成することができる。既知の凍結乾燥法と再構成法を利用できる。凍結乾燥と再構成は、機能活性損失を起こし得るので、補償するため使用レベルを上方に調節しなければならないことがあるかもしれないことは当業者には当然明らかである。
【０２１２】
さらに本発明のポリペプチド複合体と抗体は、診断のために使用できる。例えば、本明細書に記載の抗体は、疾患状態中に特異的に発現されるか又はそのレベルが所与の疾患状態中に変化する抗原に対して生成又は発生されてもよい。
【０２１３】
診断又は追跡などの特定の目的のためには、ラベルを付加してもよい。適正なラベルとしては、限定されないが、放射能ラベル、ＮＭＲスピンラベル及び蛍光ラベルのいずれかがある。これらのラベルを検出する手段は、当業者にはよく知られている。
【０２１４】
本発明のポリペプチド複合体と抗体又はそのカクテルを含有する組成物は予防及び／又は治療のために投与できる。
【０２１５】
本発明のポリペプチド複合体又は抗体を一種以上含有する組成物は、予防と治療の段階で、哺乳類中の選択された標的細胞集団を変質させ、不活性化し、殺し又は除去することを促進するのに利用されてもよい。さらに、本明細書に記載されているポリペプチド複合体と抗体の選択されたレパートリーは、細胞の異種コレクション由来の標的細胞集団を殺し、減少させ又は有効に除去するために、体外又はインビトロで選択して使用されてもよい。
【実施例１】
【０２１６】
予備実験で、二つのラマＶＨＨエキソンが、ヒト重鎖の多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）セグメントと連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）（Ｊ）セグメントに連結され、さらにＣμ、Ｃδ、Ｃγ２、Ｃγ３ヒト定常領域遺伝子とヒト重鎖免疫グロブリン３’ＬＣＲがそれに続く重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを準備した。前記ヒトのＣγ２とＣγ３の遺伝子は、Ｇ→Ａのスプライス変異を含有していた。Ｆｒｔ部位が存在していると、Ｆｌｐにより仲介される組換えによって、多コピー導入遺伝子アレイから単一コピートランスジェニックマウスを生成することができる。しかし、Ｇ→Ａスプライス変異を有するトランスジェニック遺伝子座由来の配列は、異所スプライシングであるが不完全なＣＨ１の除去を示した（図９）。
【０２１７】
＜構造体＞
この問題を克服するため、標準の方法を使って、ゲノムコスミドライブラリーをＶＨ遺伝子を含有するクローンについてスクリーニングした。一つ（又は二つ以上）の異なる生殖細胞系ＶＨを、その配列に基づいて無作為に選んだ（ヒトＶＨの場合は五つの属クラス）。親水性アミノ酸のコドンを、ＩＭＧＴナンバリング法（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（１９９９）によって、４２、４９、５０及び５２の位置に導入した。これらのＶＨ遺伝子は、カスタムメイドのリンカーを使う直接クローン化法又は相同的組換え法などの標準法によってＢＡＣベクター中に組み入れられた。
【０２１８】
二つのクローンすなわち、ヒト重鎖のＤとＪのセグメント、Ｃμ（ＩｇＭ）及びＣδ（ＩｇＤ）を含有するクローン １０６５ Ｎ８並びにＣγ３（ＩｇＧ３）遺伝子を含有するクローン１１１５ Ｎ１５を、ヒトゲノムＰａｃライブラリー ＲＰＣＩ−１１（ＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｃｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＳＡ）から選択した。異なるヒトゲノムライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来のＢａｃ ｃｌｏｎｅ １１７７１を、Ｃγ２（ＩｇＧ２）遺伝子及び免疫グロブリン重鎖ＬＣＲの原料として使用した（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５；１８６（６）：８４５−５８）。
【０２１９】
標準法を使って、Ｃγ３とＣγ２の遺伝子を、別個に、ｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローン化した。同様に、残りの任意のＩｇ定常領域をこれらのＢＡＣからクローン化できる（ＩｇＡ、ＩｇＥ）。ＣＨ１エキソンの完全な欠失は、各定常領域のＣＨ１エキソンの隣に位置する配列を使って、相同的組換え法（Ｉｍａｍ ｅｔ ａｌ．，（２００１））によって達成した。Ｆｒｔ部位を、Ｃμスイッチ領域の前に任意選択的に導入し、標準的な手段で（例えばｒｏｓａ−ｆｌｐマウスと交配することにより）インビボにてｆｌｐリコンビナーゼで処理することによって、多コピー遺伝子座から単一コピー遺伝子座を生成させることができた（図１０）。
【０２２０】
別個のＶＨ遺伝子、ＤとＪのセグメント及びＣとＬＣＲのエキソンを、通常の制限消化−連結法又は相同組換え法（又は両方を混合した方法）又は任意の他のクローン化法によって、一つのＢＡＣ中にクローン化した。次いでさらに別の構造体を作製することができた。
【０２２１】
＜ＩｇＭのみ遺伝子座＞
ＩｇＭ構造体を得るため（図１１）、ヒトのＤとＪの重鎖セグメント及びＣμが続く一つ以上のＶＨ遺伝子（好ましくは、可溶性を提供するため遺伝子工学的に処理されたヒトＶＨ遺伝子又はラクダＶＨＨ遺伝子）をＢＡＣ中にクローン化した（本方法については上記を参照のこと）。この場合、Ｃμ領域だけが、最終のＢＡＣ中にクローン化された。
【０２２２】
＜ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座（Ｃδは任意選択的）＞
ＩｇＭプラスＩｇＧ構造体を得るため（図１２）、ヒトのＤとＪの重鎖セグメント、Ｃμ（ＣＨ１エキソンは含有しないがＣＨ４エキソンは含有する）、（任意選択的なＣδ）及び修飾されたヒトＣγ２とＣγ３遺伝子と３’ＬＣＲが続く一つ以上のＶＨ遺伝子（好ましくは、可溶性を提供するため遺伝子工学的に処理されたヒトＶＨセグメント又はラクダＶＨＨ遺伝子）をＢＡＣ中にクローン化した。ＩｇＧのみ遺伝子座を生成させるために、ｌｏｘＰ部位を、標準クローン化ステップ（上記）によって導入し次いでそのＢＡＣを２９４ Ｃｒｅ大腸菌株中で成長させ（Ｂｕｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．）、次いでｃｒｅにより仲介される組換え法によってＩｇＧのみ遺伝子座を産生する細菌を得た。さらなる構築の詳細については先の説明を参照のこと。
【０２２３】
＜ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座（Ｃδは任意選択的）＞
ＩｇＭプラスＩｇＧ構造体を得るため（図１３）、ヒトのＤとＪの重鎖セグメント、Ｃμ（ＣＨ１とＣＨ４を含有する）、（任意選択的なＣδ）及び修飾されたヒトＣγ２とＣγ３遺伝子と３’ＬＣＲが続く一つ以上のＶＨ遺伝子（好ましくは、可溶性を提供するため遺伝子工学的に処理されたヒトＶＨ遺伝子又はラクダＶＨＨ遺伝子）をＢＡＣ中にクローン化した。ＩｇＧのみ遺伝子座を生成させるために、ｌｏｘＰ部位を、標準クローン化ステップ（上記）によって導入し次いでそのＢＡＣを２９４ Ｃｒｅ大腸菌株中で成長させ（Ｂｕｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．）、次いでｃｒｅにより仲介される組換え法によってＩｇＧのみ遺伝子座を産生する細菌を得た。
【０２２４】
＜トランスジェニックマウス、飼育とゲノタイピング＞
受精卵に対する標準マイクロインジェクション法又は胚幹細胞トランスフェクション法によって、前記最終ＢＡＣを、トランスジェニックマウスに導入した。
【０２２５】
５’末端と３’末端の遺伝子座プローブを使って末端ｔａｉｌＤＮＡをサザンブロット分析することによって（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ １９７５）、トランスジェニック遺伝子座を、完全性とコピー数についてチェックした。初代マウス（ｆｏｕｎｄｅｒ）は、μＭＴ−／−バックグランドの系統中で繁殖させた。その遺伝子座の異なる領域各々についてプライマーを使って標準ＰＣＲ分析することによって、ゲノタイピングを実施した。Ｃγ２とＣγ３の両方から全ＣＨ１エキソンを除かれたトランスジェニックマウス（ＨＬＬラインを有するもの及びＣμとＣδの遺伝子を有しないもの）のＢＭ ｃＤＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を分析したところ、そのトランスジェニック遺伝子座は、ＶＤＪを組換えることができるのみならず、そのＩｇＧの転写産物が、ラマやラクダのＨＣＡｂに見られる転写産物に似ていることを示した。
【０２２６】
＜免疫組織化学＞
脾臓をＯＣＴ化合物中に包埋した。クライオスタットによる５μｍの凍結切片をアセトン中で固定し、すでに述べられているようにして（Ｌｅｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８）単一又は二重の標識を行った。モノクローナル抗体抗Ｂ２２０／ＲＡ３−６Ｂ２、モノクローナル抗体抗ＣＤ１１ｃ／Ｎ４１８（Ｓｔｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）にはハイブリドーマ培養上澄み液が用いられた。ペルオキシダーゼを連結したヤギ抗ヒトＩｇＧ及びヤギ抗ヒトＩｇＭをＳｉｇｍａから入手した。第二ステップの試薬は、ペルオキシダーゼの標識をつけた、ヤギ抗ラットＩｇ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）もしくはヤギ抗ハムスターＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）及びヤギ抗ラットＩｇアルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）であった。
【０２２７】
図１５は、μＭＴ−／−バックグランド中のμＭＴ−／−、ＷＴとＨＬＬ及びＨＬＬ−ＭＤのトランスジェニックマウス由来の脾臓の５μｍ凍結切片を免疫組織化学分析した結果を示す。切片を、Ｂ細胞は抗Ｂ２２０（ブルー）で染色し、そして樹枝状細胞は抗ＣＤ１１ｃ／Ｎ４１８（褐色）で染色した。矢印はＢ細胞の小クラスターの位置を示す。
【０２２８】
＜フローサイトメトリー分析＞
単一細胞の懸濁液を、（Ｓｌｉｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３）、ＰＢＳ中のリンパ系器官から調製した。約１×１０６個の細胞を抗体とともに、９６ウェルプレート中のＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内で４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で２回洗浄した。各試料について、ＦＡＣＳｃａｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使って、３×１０４個の細胞を計測した。ＦＡＣＳのデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを使って分析した。四色分析を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで実施した。以下のｍＡｂ：ＦＩＴＣ複合抗Ｂ２２０−ＲＡ３−６Ｂ２及びＰＥ複合抗ＣＤ１９をＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。抗ＣＤ１９及び抗Ｂ２２０で染色した脾臓細胞のＦＡＣＳスキャンデータを図１５の下部のパネルに示した。
【０２２９】
図１５の左側に、ＨＬＬ系−ＦｌｐｅＲトランスジェニック系を交配することによるインビボＦｌｐ組換えを提示してあり、これは組換え体の脾臓細胞に関するＦＡＣＳスキャンデータを支持し、直接生成した元のＨＬＬ−ＭＤ系に見られるようなＢ細胞のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）を示している。右側には、Ｃａｇ Ｃｒｅトランスジェニック系の飼育することによるインビボＣｒｅ組換えと単一コピーの組換え体の脾臓細胞に関するＦＡＣＳデータを示してある。
【０２３０】
＜免疫付与とハイブリドーマの産生（図１４）＞
二つのラマＶＨＨドメイン、ヒトのＤとＪの領域及びＩｇＧ２とＩｇＧ３の定常領域（ＣＨ１ドメインは含まない）からなる重鎖のみ抗体の遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスを作製した。
【０２３１】
８週齢のマウスを、大腸菌熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）で免疫した。Ｓｐｅｃｏｌアジュバント（ＩＤＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄｔ，ＮＬ）を含有する抗原２０μｇ又は５μｇを、それぞれ、０日目、１４日目、２８日目、４２日目に皮下注射し５０日目に腹腔内注射した。０日目、１４日目及び４５日目に採血した。３回ブーストを行った後、Ｈｓｐ７０タンパク質で免疫したＨＬＬ−ＭＤ１マウス３匹のうち１匹に低力価の抗原特異的抗体が検出された（図１４）。
【０２３２】
標準の脾臓細胞を黒色腫細胞系と融合させて、ｈｓｐ７０タンパク質に対するモノクローナル抗体をモノクローナルハイブリドーマ細胞系中に生成させた。その抗ＨＳＰ７０ＨＣＡｂは、ヒトＩｇＨＤ３−１０セグメントに組換えられたＤ領域に最も近いラマＶＨＨセグメント（ＶＨＨ ２）（ａｃｃ．ｎｕｍ．Ｘ１３９７２）及びヒトＩｇＨＪ４−０２セグメント（ａｃｃ．ｎｕｍ．Ｘ８６３５５）からなっている。頻度は高くないが、前記ＶＨＨは、生殖細胞系の配置構成と比べて図９Ａに示すアミノ酸の変化を起こす突然変異を数回行なう。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果もそのハイブリドーマ内に生産的ＩｇＨ転写体を一つだけ示したが、これは他の転写体が全く生成しないことを示唆している。αＨＳＰ７０ ＩｇＧ２抗体は重鎖のみ二量体として分泌される（変性ゲル（二量体）及び非変性ゲル（モノマー）条件下のウエスタンブロット法、図１４）。ＣｌｏｎａｌＣｅｌｌＴＭ−ＨＹ ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を生産者の指示に従って使用し、脾臓細胞を、５６日目に、Ｓｐ２−Ｏ−Ａｇ１４黒色腫細胞（Ｒ．Ｈａｐｅｒｅｎ氏からの寄贈）と融合させた。
【０２３３】
二つのラマＶＨＨドメイン、ヒトのＤとＪの領域、ヒトのＩｇＭ及びＩｇＧ２とＩｇＧ３の定常領域（全てＣＨ１ドメインは含まない、図１２）からなる重鎖のみ抗体の遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスを、ＴＮＦαで免疫してＨＣ−ＩｇＭ抗体を得た。３匹のマウスのうち１匹が、標準ＥＬＩＳＡ検定法で陽性の血清を示した。標準的な黒色腫融合によって陽性のＩｇＭハイブリドーマを得た（図１６）。非還元条件下、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂでゲル濾過した後、カラムの各画分を還元条件下のゲルに負荷し次いで抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰによって検出した（図２０）。非還元条件下での分画は、ＨＣ−ＩｇＭが、ヒトの対照ＩｇＭと同じ大きさ（ＨＣ−ＩｇＭには欠けている軽鎖とＣＨ１ドメインの分子量を差し引いた後）の多量体抗体として分泌されることを示した。各カラム画分の還元条件下でのゲル分画は、図２０に示す予想モノマーを示した。
【０２３４】
＜血清Ｉｇ ＥＬＩＳＡ＞
１５〜２５週齢のマウスから血液を、ＥＤＴＡをコートしたチューブに集めて、室温（ＲＴ）で１５分間遠心し、次いでその上澄み液をＰＢＳで１：５の比率で希釈した。９６ウェルプレートを、５ｍｇ／ｍｌ濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＹＥＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）で２時間コートし、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液（１．５％ＢＳＡ／１．５％粉乳／０．１％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）でＲＴにて１時間ブロックし、次にＰＢＳで３回洗浄した。血清試料と標準液（ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ））の希釈シリーズを負荷して２〜４時間インキュベートし次いでプレートをＰＢＳで６回洗浄した後、第二抗体（ＨＲＰに連結したヤギ抗ヒトＩｇＧ又はヤギ抗ヒトＩｇＭを１：２０００の比率で希釈したもの（Ｓｉｇｍａ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ））を添加した。希釈は全てブロッキング溶液で実施した。ＲＴで１〜２時間インキュベートしてＰＢＳで洗浄した後、ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。
【０２３５】
ＩｇＧ２ファージライブラリーから抗原特異的可溶性ｓｄＡｂを検出するＥＬＩＳＡ試験の結果を図１６に示す。可溶性ｓｄＡｂを、抗原をコートしたプレートに対する第一抗体として使用し続いてマウス抗ｍｙｃ抗体及びＨＲＰ複合ヤギ抗マウス抗体を使った。ＰＯＤを基質として使った。下部のパネルは、制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉによるクローンのフィンガープリンティングを示し、これはＢ．Ｐｅｒｔｕｓｉｓに対するｓｄＡｂをコードする５個の異なるインサートを示している。
【０２３６】
＜抗体ライブラリーの構築とスクリーニング＞
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を使って、ＤＫＴＰで免疫した単一コピーＩｇＧのみマウスの脾臓から全ＲＮＡを単離した（図１２ ｃｒｅ処理をした後）。ｏｌｉｇｏ ｄＴを使ってｃＤＮＡを作製した。ｖｈｌ ｂａｃｋ ＳｆｉＩプライマー（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３）をｈＩｇＧ２ｈｉｎｇｒｅｖプライマー（５’−ＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣ−３’）と組み合わせた特異的プライマーを使用してＰＣＲによって、ＶＨＨのＤＪフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。その増幅されたＶＨＨのＤＪフラグメント（約４００ ｂｐ）を、Ｓｆｉ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで消化し、ゲルで精製し次いでＳｆｉ Ｉ／ＮｏｔＩで消化したファージミドベクターｐＨＥＮ−１中にクローン化した。
【０２３７】
ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞に形質転換して、ヒト単一ドメイン抗体を生産する抗体ライブラリーを得た。プラスティック（希釈されていないワクチンをコートしたイムノチューブ）に吸着させたワクチン抗原にパニングを行なって、２ラウンドの選択を実施した。制限分析と配列決定は標準の方法でおこなった。
【０２３８】
＜重鎖のみ遺伝子座のＲＴ−ＰＣＲ＞
ＨＬＬ−ＭＤ遺伝子座が、多様な抗体レパートリーを産生する際に正常な遺伝子座として機能するかどうかを、パイエル板由来のｃＤＮＡに対してＩｇＧ２とＩｇＧ３の特異的プライマーを使って得たＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を決定することによって試験した。図１７は、免疫されていないマウス（左パネル）と免疫されたマウス（右パネル）由来のクローンの体細胞変異のいくつかの例を示す。これらのマウスは、ＩｇＧのみ遺伝子座、大腸菌ｈｓｐ７０、百日咳菌溶解物、破傷風トキソイドで免疫されたものであった。灰色の影付きの部分はＥＲＫＣＣＶで始まるＩｇＧ２ヒンジ領域である。
【０２３９】
パイエル板のＲＴ−ＰＣＲによる分析は、両ＶＨを使うことを示したが、配列を決定された全ての抗体は、ＶＨ２を再構成していた。レパートリーの多様性の起源は、ＤとＪのセグメントの選択及びＶ−ＤとＤ−Ｊの結合部によって形成されたＣＤＲ３領域である。ヒトＪセグメントを使うことは、ヒトの再構成に見られるのと類似しており、ＪＨ４とＪＨ６のセグメントが最も頻繁に使用される。
【０２４０】
この分析は、多様な抗体のレパートリーに寄与するために、両ＶＨ、異なるヒトＤセグメント及び全てのヒトＪセグメントを使われることを示した。再構成された各遺伝子を、その生殖細胞系のカウンターパートすなわちトランスジェニック構造体中の元のＶＨと比較することによって、ＩｇＧ３をスイッチされたＢ細胞が存在し、体細胞の変異が起こっていることも分かった（図１７参照）。したがって、ヒト重鎖のみＩｇＧ抗原受容体は、Ｂ細胞成熟に必要な信号を提供できる。
【０２４１】
＜免疫染色＞
図１８は、Ａ５抗体（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）を含有する応答プラスミドで追加的にトランスフェクトされたＴｅｔ−ｏｎ細胞系の一つを免疫染色した結果を示す。上のパネルは、ドキシサイクリンによって細胞質中に誘発され産生したＡ５抗体（赤色）及びＤＡＰＩによる細胞核の染色（青色）を示す。下のパネルは、核の中にｒｔＴＡを発現する細胞が、誘発（上のパネル）によってＡ５を産生する細胞であることを示す。下記配列を有するｒｔＴＡに対するヒトＨＣＡｂのうちの一種で染色を実施した（緑色）。ＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧを第二ステップとして使用した。Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３にすでに記載されているようにして、Ａ５を検出した。ｒＴＴＡ抗体は下記配列を有するＩｇＧ３であった。
【化１】
【０２４２】
このＩｇＧ３のヒンジは、アミノ酸１９８ ＥＬＫＴＰＬから始まる。比較のため図１７のＩｇＧ２ヒンジ領域を参照されたい。
【０２４３】
＜ウエスタンブロット分析＞
図１９は、ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座（図１０）を含有する異なるトランスジェニックマウス系の血清の、ｃｒｅ処理を行った後（すなわち、ＩｇＭが欠失しＩｇＧのみ残留）のウエスタンブロットを示す。血清は、ｐｒｏｔ Ｇで精製し次いで還元条件下（図１９の右のパネル）及び非還元条件下（図１９の左のパネル）でゲル分画を行なった。対照は、バックグランドのＫＯマウス及び正常なヒトの血清の試料である。ヒト重鎖のみＩｇＧが二量体であることを示す二つのゲルのサイズ間の差に留意されたい。
【０２４４】
図１９に示した信号は、標準の方法によって抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。
【０２４５】
ＩｇＭプラスＩｇＧ遺伝子座マウスによって産生されるヒトＩｇＭのサイズ分画
ＩｇＭプラスＩｇＧマウス（図１３）由来の血清を、対照のヒト血清の試料と混合した後、非還元条件下でゲル濾過することによって分画した。結果を図２０に示す。カラムの複合体の分子量は、各レーンについて（各画分を示す）左から右に進むにつれて減少する。これら画分（各レーン）を、還元条件下にてゲル電気泳動法で分析した。
【０２４６】
ヒトＴＮＦαで免疫された、ＩｇＭプラスＩｇＧ（図１３）遺伝子座を含有するマウスから作製した多数のハイブリドーマのＥＬＩＳＡ分析を実施した。結果を図２１に示す。図２１の上部２列は抗ヒトＩｇＧを分析した結果であり、次の２列は抗ヒトＩｇＭを分析した結果である。血清試料（二つの矢印）は、このマウスがＩｇＧ抗ＴＮＦα抗体とＩｇＭ抗ＴＮＦα抗体の両者を産生したことを示している。単一矢印は、陽性ＩｇＭハイブリドーマを示す。それらのウェルは、市販のヒトＴＮＦαでコートした。処理は全て標準法で行なった。
【実施例２】
【０２４７】
二重特異性二価抗体を、二つの重鎖のみモノ特異性抗体を結合させることによって生成させた。その第一抗体は、第一特異性とエフェクター機能（可変領域と定常領域それぞれの）をもたらす骨格を形成する。この第一抗体は、第二特異性を有する第二抗体と、新たに設計されたヒンジによって結合させる。このヒンジは、既存のＩｇＧ２のヒンジの配列と類似しているが、システインをプロリンで置換することによって変化させて、抗体二量体のシステインの架橋を防止し、かつプロリンで追加の可撓性を提供して、機能を阻害することがある第二抗体の立体束縛を防止した。
【０２４８】
最初の骨格抗体は、大腸菌ＨＳＰ７０タンパク質に対する抗体であった。このＨＳＰ７０抗原を、先に述べたようにして（上記図１４参照）、重鎖のみ抗体遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスに注射した。標準のハイブリドーマ融合法によって、これらの動物からモノクローナル抗体を生成させた（上記事項参照）。次に、抗ＨＳＰ抗体をコードするｃＤＮＡを、標準のＲＴ−ＰＣＲ組換えＤＮＡ法によってクローン化して、５’末端から３’末端まで（Ｎ末端からＣＯＯＨ末端までのタンパク質の）、開始コドンＡＴＧ、シグナルペプチドの配列、可変ドメインＶＨＨ１（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ参照）、組換えたＤとＪの領域及びＣγ２の定常領域（ＣＨ１領域を欠いている）を含有するが、ストップコドンとポリＡ部位を含むプラスミドを得た（図２２の左上部）。フォワードプライマーとリバースプライマーを使ってクローン化するため、抗ＨＳＰ７０抗体をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【０２４９】
フォワードプライマーは、クローン化を行なうためのＥｃｏＲＩ部位（下線）、有効な翻訳開始配列（太文字）及び通常の開始コドン（灰色の影付き）を提供する
【化２】
であった。
【０２５０】
リバースプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（下線）を提供し通常のストップコドンを保持する
【化３】
であった。
【０２５１】
したがって、増幅によって、ＥｃｏＲＩ部位（下線）を含有するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに、抗ＨＳＰ抗体遺伝子の有効翻訳開始配列（太字）と通常の開始コドン（灰色の影付き）が導入される。
【０２５２】
リバース３’末端プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（下線）を提供し通常のストップコドンを除く
【化４】
であった。これによって、プロモーター配列中にクローン化するためのＥｃｏＲＩ部位、及び発現プラスミドに対して５’末端を、かつ新たなヒンジ配列に対して３’末端をクローン化するためのＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するフラグメント（図２２の頂部から２行目の左）を得た（下記参照）。最後に、そのフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、クローニングのための適正な単一標準末端を提供した。
【０２５３】
第二特異性をもたらす第二クローン化抗体は、ブタレトロウイルス（ＰＥＲＶ）ｇａｇ抗原に対するラマ抗体のＶＨＨドメインを含んでいた（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７（２２）：１２１３２−９，図２２ 頂部右）。抗ｇａｇは、以下のプライマーすなわちフォワードプライマー：
【化５】
及びリバースプライマー：
【化６】
を使って標準のＰＣＲ増幅法で増幅した。これは、５’末端を新しいヒンジを有するフレームにクローン化するためのＸｈｏＩ部位（灰色の影付き）（下記参照）及び３’末端を発現プラスミド中にクローン化するためのＥｃｏＲＩ部位（下線）（図２２右中央）を有する増幅フラグメント（図２２頂部から２行目の右側）を提供する。最後に、そのフラグメントをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断して、クローン化するための一本鎖末端を生成させた。
【０２５４】
これら二つの抗体の配列を、前記新しいヒンジによって組み合わせて一つのダイアボディにした。その新しいヒンジは、クローン化するための５’と３’のオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）（それぞれＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩコンパティブル）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する二つのオリゴヌクレオチドから作製した。このヒンジは、抗ＨＳＰ７０配列の末端及び抗ｇａｇ配列の開始部分を有するフレーム内に位置するように設計した。ヒトＩｇＧ２ヒンジ中に通常存在しているスルフィド架橋が生成することは、システイン（灰色の影付き）をプロリン（下線）で置換することによって防止した。このプロリンは、ヒンジに追加の可撓性を付加して、第一抗体のＣＯＯＨ末端にヒンジによって接続されることになる第二抗体ドメインを適正に機能させる。
【０２５５】
通常のＩｇＧヒンジの配列（システインコドンは灰色の影付き、プロリンコドンは下線）：
【化７】
及びその相補鎖は、
【化８】
及びその相補鎖：
【化９】
で置換した。またこれは、クローン化するためのＨｉｎｄＩＩＩ部位（太字）とＸｈｏＩ部位（イタリック体）とコンパティブルの二つの一本鎖末端を有するフラグメント（白囲み枠のヒンジ、図２２の中央）を提供する。
【０２５６】
これら三つのフラグメント（抗ＨＳＰ７０ ＩｇＧ２、ヒンジ及び抗ｇａｇ）は、次いで鶏アクチンプロモーターとＣＭＶエンハンサー配列を含有するブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（Ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ１１ ｓｋ＋）発現プラスミド（図２２の発現プラスミド）中に、標準の組換えＤＮＡ技術で連結した。このプラスミドが発現されると（下記参照）、図２２の下部に示すダイアボディが生成する。
【０２５７】
ダイアボディ発現プラスミドを増殖させて、標準の方法（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）によって、ＣＨＯ細胞中に、プラスミドｐＧＫ−ｈｙｇｒｏ（トランスフェクトされた細胞を選択させるため）とともに同時トランスフェクトされた（図２３）。ハイグロマイシンを含有する培地で陽性のクローンを選択し、次いで抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ検出法を使ってＣＨＯ細胞が分泌したダイアボディを含有する増殖培地の抗ｇａｇ ＥＬＩＳＡ標準分析（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３）を実施して、ダイアボディを発現した場合、陽性とした。抗ａｇａ活性を試験して陽性であれば、ｇａｇの特異性はそのダイアボディのバックエンド（ＣＯＯＨ末端）にあるので、所与のクローンは恐らく間違いなく全ダイアボディを発現しているであろう。ＨＳＰ７０に関する次のＥＬＩＳＡ分析の結果も陽性であった。プラスミドから発現されたタンパク質が、１１０ｋＤの二量体（図２３の下部に示す）であったことを示すために、５５ｋＤのモノマー（非還元条件と還元条件でのウエスタンブロット、図２３の右）と比較して、非還元条件下及び還元条件下にてＥＬＩＳＡ法で選択したこれらクローンのウエスタンブロットを実施した。したがって、ＥＬＩＳＡ分析結果とウエスタンブロットはともに、ダイアボディが、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって二量体として発現されて培地中に分泌され（＞７０ｎｇ／ｍｌ）そしてその抗体はＨＳＰ７０及びｇａｇの抗原と結合できることを示している。しかし、その二量体のダイアボディ分子が前記抗原の両方に同時に結合できることは示していない。
【０２５８】
したがって、追跡実験を実施した。まず、ｇａｇ抗原をプラスチック製ウェル（図２４中央の第一ウェル）の底に固定した。次いで、クローン１のＣＨＯ細胞上澄み液を適用した後、ダイアボディ（図２４の頂部）を第一抗原（ｇａｇ）で捕獲した（図２４中央の第二ウェル）。続いて、十分に洗浄し、次いで第二抗原（ＨＳＰ７０、図２４中央の第三ウェル）を適用し続いて再び十分洗浄した。二重特異性抗体分子は、両抗原と同時に結合できたならば、第一抗原（ｇａｇ）と結合し次いで第二抗原（ＨＳＰ７０）を捕獲することによってウェルの底に捕獲されているはずである。次いで全複合体をウェルから溶離したところ（図２４中央の右側ウェル）、ダイアボディ体と両抗原が、ウエスタンブロット上に目視できるようになった（図２４の下部）。
【０２５９】
分泌されたダイアボディを収集するために、ＣＨＯクローンを、同じ標準条件下で、抗体をハイブリドーマから集めるのに使用する培地（ＳＩＧＭＡ ハイブリドーマ培地、血清無し）内で増殖させた。
【０２６０】
方法：Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）のウェルに、精製組換えｇａｇタンパク質（ＰＢＳ中１２．５μｇ／ｕｌ）Ｏ／Ｎ ４Ｃをコートした。１％ミルク／１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２時間ブロックした。ＰＢＳ−ミルク−ＢＳＡで２倍に希釈したＣＨＯ−ＤＢクローン１培地（又は対照）を、室温（ＲＴ）で３時間インキュベートした。ＰＢＳ−ミルク−ＢＳＡで２倍に希釈した細菌Ｂ１２１の溶解物（ＨＰＳ７０タンパク質を含有する）を、ＲＴで３時間インキュベートし次いで洗浄した。結合したタンパク質を、２−メルカプトエタノールを含有するレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の試料緩衝液で溶離した。これら試料をウエスタンブロット法で分析した。したがって１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに泳動させ次いでニトロセルロース膜上にブロットした。そのブロットをＰＢＳ−ミルク−ＢＳＡで２時間ブロックし次いで第一抗体とともにインキュベートした。産生物を、眼に見える染色を実施できる酵素に結合された第二抗体を使う標準法で目視可能にした。使用した試薬は下記の通りである。
抗ｇａｇ：ウサギポリクローナル（１：２０００）２時間ＲＴ
抗ダイアボディ体：ヤギαヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２５００）２時間ＲＴ
抗ＨＳＰ７０：モノクローナルＧ２０−３８０培地（１：２）２時間ＲＴ
二次抗体は、ヤギ抗ウサギーＡＰ（１：２０００）２時間ＲＴ及びＨＳＰ７０モノクローナルに対するヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２５００）２時間ＲＴであった。
【０２６１】
タンパク質のバンドを目視可能にするために、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と反応する第一ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（紫色）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応する第二ＤＡＢ基質（褐色）を使用した。
【０２６２】
洗浄ステップは全て、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で実施した。
【０２６３】
一成分を除外するか又はダイアボディを産生しないＣＨＯ細胞由来の培地を添加することによって対照試験を実施した（図２４）。すなわちダイアボディ無しの適用（トランスフェクトされていないＣＯ細胞由来の培地）を欠いているのでｇａｇのみを有するレーン２；ウェルの底にｇａｇを欠いているので（ミルクタンパク質で置換されている）産生物が全く無いレーン３；ｇａｇとダイアボディを欠いているので産生物が全く無いレーン４；ＨＳＰ７０抗原を欠いているので（ミルク抗原で置換されている）ダイアボディとｇａｇだけを有するレーン５；ＨＳＰ７０とダイアボディを欠いているのでｇａｇだけを有するレーン６を利用して行なった。
【０２６４】
全３成分（ダイアボディ＋両抗原）は、３成分全てを受け取ったレーン１のウェルにのみ存在していることは（図２４の下部の図参照）、単一のダイアボディが両抗原に同時に結合することを示している。
【０２６５】
＜二重特異性ＩｇＡ又は多重特異性ＩｇＭの生成＞
二重特異性ＩｇＡの生成は、ＩｇＧについて先に述べたのとほぼ同じであるが、Ｖｈｓｏｌ、Ｄ及びＪに加えて、ＩｇＡを生成する定常領域Ｃαを使用する（図２５）。
【０２６６】
ＩｇＭの生成はほとんど同じであるが、ＩｇＭ分子は大きい多量体を形成することがあるので（Ｊ鎖があっても無くても）追加の可能性を提供する。したがって、上記分子に類似の分子に加えて（図２６下部右、多量体化配列を除いた後）、異なる特異性を有するＩｇＭを単に同時発現することによって多量体を生成させることもできる（図２６下部左）。
【実施例３】
【０２６７】
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）に結合する結合ドメイン及びＪｕｎのロイシンジッパーモチーフと抗体ヒンジからなる会合ドメインを含む重鎖並びにＦｏｓのロイシンジッパーモチーフからなる相補的会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む軽鎖を含むポリペプチド複合体をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓによって記載されているような分子生物学の技術を使って構築する。
【０２６８】
その発現ベクターを、次に、通常の技術によって、適切な宿主細胞に移行させて、そのベクターを最適に発現するトランスフェクトされた宿主細胞を作製する。前記トランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞を、次に当業者に知られている任意の適切な方法を使って培養して本発明のポリペプチド複合体を産生させる。
【０２６９】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２７０】
次に当業者に知られている技術を使って、３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）からなる可溶性エフェクタードメインを、相補的会合ドメインに融合させる。
【実施例４】
【０２７１】
ＡＦＰ（抗フェトプロテイン）に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメイン並びにＪｕｎのロイシンジッパーモチーフ及び抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の重鎖をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２７２】
本発明のポリペプチド複合体の軽鎖をコードする第二発現ベクターも構築する。これは、Ｆｏｓのロイシンジッパーモチーフからなる相補的会合ドメインを含む。
【０２７３】
次にこれら発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現する同時にトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にこれらのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２７４】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２７５】
次に当業者に知られている技術を使って、３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）からなる可溶性エフェクタードメインを、相補的会合ドメインに融合させる。
【実施例５】
【０２７６】
＜ＶＣＡＭとＶＬＡ−４＞
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）に結合する結合ドメイン及びＶＣＡＭと抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む重鎖；並びにリシンＡ毒素に融合したＶＬＡ−４からなる相補的会合ドメインを含む軽鎖を含むポリペプチド複合体をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２７７】
次にその発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現するトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２７８】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【実施例６】
【０２７９】
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）に結合する結合ドメイン及びＪｕｎのロイシンジッパーモチーフと抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む重鎖；並びにＦｏｓのロイシンジッパーモチーフ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）をコードする可溶性エフェクタードメインからなる相補的会合ドメインを含む軽鎖を含むポリペプチド複合体をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２８０】
次にその発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現するトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２８１】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２８２】
ＰＮＰは、フルダラビンを、ＰＮＰ酵素を含む細胞を殺し次いでさらに拡散して周囲の未感染細胞を殺す毒性代謝産物の２−フルオロアデニンに変換する（局部バイスタンダー効果）。
【実施例７】
【０２８３】
糖タンパク質抗原ｇｐ１２０のＶ３−ＰＮＤ領域に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメイン並びにＪｕｎのロイシンジッパーモチーフ及び抗体ヒンジからなる会合ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第一の重鎖をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２８４】
ＧＰ−４１に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメイン並びにＪｕｎのロイシンジッパーモチーフ及び抗体ヒンジ、ＣＨ２とＣＨ３のドメインからなる会合ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第二の重鎖をコードする第二発現ベクターも構築する。
【０２８５】
本発明のポリペプチド複合体の軽鎖をコードする第三発現ベクターも構築する。このベクターはＦｏｓのロイシンジッパーモチーフからなる相補的会合ドメインを含む。
【０２８６】
次にこれら発現ベクターは、通常の技術によって適切な宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現する同時にトランスフェクトされた宿主細胞が産生される。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２８７】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２８８】
次いでＨＩＶ−１ ＭＮ Ｖ３（ＰＮＤ）ペプチド免疫原からなる可溶性エフェクタードメインを、当業者に知られている技術を使って、前記相補的会合ドメインに融合させる。
【実施例８】
【０２８９】
糖タンパク質抗原のＶ３−ＰＮＤ領域に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第一の重鎖をコードする発現ベクターを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている分子生物学の技術を使って構築する。
【０２９０】
ＧＰ−４１に結合する可溶性ＶＨＨ結合ドメインを含む本発明のポリペプチド複合体の第二の重鎖をコードする第二発現ベクターも構築する。
【０２９１】
これら二つの重鎖は、これら二つの重鎖の定常領域が同一のμ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４のドメインを含むことが特徴である。
【０２９２】
次にこれらの発現ベクターは、通常の方法でＪ鎖を恒常的に発現する宿主細胞に移され、そのベクターを最適に発現する同時にトランスフェクトされた宿主細胞を産生する。次にそのトランスフェクトされたか又は形質転換された宿主細胞は、当業者に知られている任意の適切な技術を使って培養されて、本発明のポリペプチド複合体を産生する。
【０２９３】
ポリペプチド複合体は、産生されたならば、クロスフロー濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法及びアフィニティカラムクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ）を含む当分野の標準方法で精製する。
【０２９４】
次いでＨＩＶ−１ ＭＮ Ｖ３（ＰＮＤ）ペプチド免疫原からなる可溶性エフェクタードメインを、当業者に知られている技術を使って、前記相補的会合ドメインに融合させる。
【０２９５】
本明細書に挙げた刊行物は全て参照により本明細書に組み込まれるものである。
【０２９６】
本発明の前記方法とシステムの各種変形と変化が本発明の範囲と精神から逸脱しないことは、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連させて説明してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと解すべきである。実際に、生化学、分子生物学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者には明らかな、本発明を実施するため述べた方式の各種変形は、特許請求の範囲に含まれるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）異種のＶＨ重鎖遺伝子座を発現するヒトを除くトランスジェニック哺乳類を提供するステップと、ここで、
（ｉ）ＶＨ重鎖遺伝子座は、少なくとも一つのＶＨ遺伝子セグメントと、少なくとも一つのＤ遺伝子セグメントと、少なくとも一つのＪ遺伝子セグメントと、少なくとも一つの重鎖定常領域とを含む可変領域を含み、
（ｉｉ）各定常領域は機能性ＣＨ１ドメインをコードしておらず、
（ｉｉｉ）Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントは、組み換えられてＶＤＪコーディング配列を生成でき、
（ｉｖ）前記組み換えられたＶＨ重鎖遺伝子座は、発現されると、機能性ＣＨ１ドメインを欠いた定常エフェクター領域と抗原特異的可溶性ＶＨドメインとを含む可溶性の重鎖のみ抗体を生成でき、
（ｂ）前記ヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原により免疫するステップと
を含む、ＶＨ重鎖のみ抗体を製造する方法。
【請求項２】
前記ヒトを除くトランスジェニック哺乳類の免疫後、前記ＶＨ重鎖のみ抗体をコードする前記ＶＨ遺伝子座は体細胞変異によって親和性成熟を獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む内因性抗体を産生する能力を低減するように遺伝子工学的に処理されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類に内在している免疫グロブリンの重鎖遺伝子座は、欠失又は抑止されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記免疫は、トランスジェニック哺乳類に抗原を注射するステップを含み、さらに、前記方法は、
（ｃ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞又は組織からハイブリドーマを産生するステップと、
（ｅ）前記ハイブリドーマ由来の重鎖のみ抗体ｍＲＮＡをクローニングするステップと、
（ｆ）前記重鎖のみ抗体を異種発現系中で産生するステップと
を含む方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のステップを含む抗原特異的可溶性ＶＨドメインを製造する方法であって、前記免疫は、トランスジェニック哺乳類に抗原を注射するステップを含み、さらに、前記方法は、
（ｃ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞又は組織からハイブリドーマを産生するステップと、
（ｅ）前記ハイブリドーマ由来の重鎖のみ抗体ｍＲＮＡをクローニングするステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）のクローニングされたｍＲＮＡから抗原特異的可溶性ＶＨドメインを単離同定するステップと、
（ｇ）前記抗原特異的可溶性ＶＨドメインを異種発現系中で産生するステップと
を含む方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のステップを含む抗原特異的可溶性ＶＨドメインを製造する方法であって、前記免疫は、トランスジェニック哺乳類に抗原を注射するステップを含み、さらに、前記方法は、
（ｃ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｄ）前記単離された細胞又は組織由来のｍＲＮＡからＶＨ遺伝子座をクローニングするステップと、
（ｅ）ファージ又は類似のライブラリーを用いてコードされたタンパク質をディスプレイするステップと、
（ｆ）抗原特異的可溶性ＶＨドメインを同定するステップと、
（ｇ）前記抗原特異的可溶性ＶＨドメインを単独で、または融合体として発現させるステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、哺乳類のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、ヒトのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各重鎖定常領域がヒト起源のものである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
各重鎖定常領域がヒトでない脊椎動物起源のものである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、複数のＶ遺伝子セグメントと、複数のＤ遺伝子セグメントと、複数のＪ遺伝子セグメントとを含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｖ遺伝子セグメントは、改善された溶解度を示すように選択、変異又は遺伝子工学的に処理されている請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５又は８〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる重鎖のみ抗体。
【請求項１５】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる抗原特異的可溶性ＶＨドメイン。
【請求項１６】
治療に使用するための、請求項１４に記載の重鎖のみ抗体又は請求項１５に記載の抗原特異的可溶性ＶＨドメイン。
【請求項１７】
請求項１５に記載の一以上の抗原特異的可溶性ＶＨドメインの、単独又は相補的会合ドメインを含みかつ追加のエフェクター活性を有する別のエフェクター鎖と組み合わせた、二価又は多価のポリペプチド複合体の産生のための使用。
【請求項１】
（ａ）異種のＶＨ重鎖遺伝子座を発現するヒトを除くトランスジェニック哺乳類を提供するステップと、ここで、
（ｉ）ＶＨ重鎖遺伝子座は、少なくとも一つのＶＨ遺伝子セグメントと、少なくとも一つのＤ遺伝子セグメントと、少なくとも一つのＪ遺伝子セグメントと、少なくとも一つの重鎖定常領域とを含む可変領域を含み、
（ｉｉ）各定常領域は機能性ＣＨ１ドメインをコードしておらず、
（ｉｉｉ）Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントは、組み換えられてＶＤＪコーディング配列を生成でき、
（ｉｖ）前記組み換えられたＶＨ重鎖遺伝子座は、発現されると、機能性ＣＨ１ドメインを欠いた定常エフェクター領域と抗原特異的可溶性ＶＨドメインとを含む可溶性の重鎖のみ抗体を生成でき、
（ｂ）前記ヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原により免疫するステップと
を含む、ＶＨ重鎖のみ抗体を製造する方法。
【請求項２】
前記ヒトを除くトランスジェニック哺乳類の免疫後、前記ＶＨ重鎖のみ抗体をコードする前記ＶＨ遺伝子座は体細胞変異によって親和性成熟を獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む内因性抗体を産生する能力を低減するように遺伝子工学的に処理されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類に内在している免疫グロブリンの重鎖遺伝子座は、欠失又は抑止されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記免疫は、トランスジェニック哺乳類に抗原を注射するステップを含み、さらに、前記方法は、
（ｃ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞又は組織からハイブリドーマを産生するステップと、
（ｅ）前記ハイブリドーマ由来の重鎖のみ抗体ｍＲＮＡをクローニングするステップと、
（ｆ）前記重鎖のみ抗体を異種発現系中で産生するステップと
を含む方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のステップを含む抗原特異的可溶性ＶＨドメインを製造する方法であって、前記免疫は、トランスジェニック哺乳類に抗原を注射するステップを含み、さらに、前記方法は、
（ｃ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞又は組織からハイブリドーマを産生するステップと、
（ｅ）前記ハイブリドーマ由来の重鎖のみ抗体ｍＲＮＡをクローニングするステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）のクローニングされたｍＲＮＡから抗原特異的可溶性ＶＨドメインを単離同定するステップと、
（ｇ）前記抗原特異的可溶性ＶＨドメインを異種発現系中で産生するステップと
を含む方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のステップを含む抗原特異的可溶性ＶＨドメインを製造する方法であって、前記免疫は、トランスジェニック哺乳類に抗原を注射するステップを含み、さらに、前記方法は、
（ｃ）目的とする抗原特異的重鎖のみ抗体を発現する細胞又は組織を単離するステップと、
（ｄ）前記単離された細胞又は組織由来のｍＲＮＡからＶＨ遺伝子座をクローニングするステップと、
（ｅ）ファージ又は類似のライブラリーを用いてコードされたタンパク質をディスプレイするステップと、
（ｆ）抗原特異的可溶性ＶＨドメインを同定するステップと、
（ｇ）前記抗原特異的可溶性ＶＨドメインを単独で、または融合体として発現させるステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、哺乳類のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、ヒトのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各重鎖定常領域がヒト起源のものである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
各重鎖定常領域がヒトでない脊椎動物起源のものである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＶＨ重鎖遺伝子座は、複数のＶ遺伝子セグメントと、複数のＤ遺伝子セグメントと、複数のＪ遺伝子セグメントとを含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｖ遺伝子セグメントは、改善された溶解度を示すように選択、変異又は遺伝子工学的に処理されている請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５又は８〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる重鎖のみ抗体。
【請求項１５】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる抗原特異的可溶性ＶＨドメイン。
【請求項１６】
治療に使用するための、請求項１４に記載の重鎖のみ抗体又は請求項１５に記載の抗原特異的可溶性ＶＨドメイン。
【請求項１７】
請求項１５に記載の一以上の抗原特異的可溶性ＶＨドメインの、単独又は相補的会合ドメインを含みかつ追加のエフェクター活性を有する別のエフェクター鎖と組み合わせた、二価又は多価のポリペプチド複合体の産生のための使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
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【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１２−２４０８７（Ｐ２０１２−２４０８７Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６６５６２（Ｐ２０１１−１６６５６２）
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【分割の表示】特願２００７−５２２０３４（Ｐ２００７−５２２０３４）の分割
【原出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【出願人】（５０７０２１７３５）エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム (6)
【出願人】（５０７０２１９９７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【分割の表示】特願２００７−５２２０３４（Ｐ２００７−５２２０３４）の分割
【原出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【出願人】（５０７０２１７３５）エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム (6)
【出願人】（５０７０２１９９７）
【Ｆターム（参考）】
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