結腸直腸癌のインビトロ診断のためのアミノアシラーゼ１・アッセイ方法
本発明は、結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物試料のアミノアシラーゼ１腫瘍マーカーの存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法に関する。前記方法は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のために、更に再発診断のために用いられることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌腫学分野に関する。本発明の目的は、より具体的には、ヒト患者から採取された生物試料におけるアミノアシラーゼ１の存在を決定することによる、この患者における結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法であって、早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のため、及び結腸直腸癌に関する再発診断のための両方に使用可能な方法である。
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、主要な公衆衛生の問題である。その全世界的な発病率は、１９９６年では新規事例８７５，０００件と推定された（文献１）。男女両方を考慮して、西洋諸国において、最も頻繁に発生する癌であり、癌による最も多い死因の最初の３つに通常分類される。全てのステージを考慮に入れた５年生存率は、約６０％である。
【０００３】
早期診断だけが、治癒的治療の希望を与える。しかしながら、現時点において、早期では血清学的スクリーニングテストも特異的な診断検査もない。
【０００４】
現在ヨーロッパでは、結腸直腸癌のスクリーニングは、２つの異なったアプローチで実施されている：第１に、糞便中の血液の存在を探すことを含む臨床関連領域のテストを使用するものである（糞便潜血反応、ＦＯＢＴ、例えばＨｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）の名で市販されている）。この技術は、その臨床有用性が証明されている。５０から７４歳の間の個体では２年ごとに使用され、結腸直腸癌による死亡率を１５〜２０％減少できる（文献２）。このためには、該当する集団の半分以上がスクリーニングに定期的に参加し、陽性テストの場合には結腸鏡検査法を実行し、続いて場合により適切な治療をすることが必要である。
【０００５】
それにもかかわらず、このスクリーニング技術は、一定数の不利な条件により劣っている：
・このテストの主な欠点は、あまり良くない感受性であり、それは最もアデノーマ（前癌の形成異常病変）で顕著であり、そのサイズが大きい場合は、１０のうち１の場合で癌の進行に結果としてなる。
・また、このテストはあまり特異的でない。糞便中の血液の出現は、潰瘍性大腸炎、痔核、瘻などの非腫瘍症状に関連する可能性がある。この場合、結腸鏡検査法による検査を行わなければならないが、以下に記載されている欠点を伴う。
・最後に、Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）テストは解釈するのが困難である；従って、それらは資格のある適格なスタッフによって、専門施設で調べられなければならない。
【０００６】
また、ヒト・ヘモグロビンに特異的な免疫学的検査も記載されている（Ｆｅｃａ ＥＩＡ（登録商標）、Ｈｅｍｅ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）等）。それらは多分Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）と比較して向上しているが、基本的に同じ問題を呈する。ＩｎＳｕｒｅＴＭ（Ｅｎｔｅｒｉｘ社によって市販されている）により、ＣＲＣに苦しむ患者の８７％、及び前癌ポリープを有する患者の４７％を検出できる。それは、糞便のヒト・ヘモグロビンを、特にこの分子のグロビン部分を検出するテストである。
【０００７】
第２のスクリーニング・ストラテジーは５０歳以後に結腸鏡検査法を組織的に行うことであり、理論的には結腸直腸癌による死亡率を減少することを可能にする。しかしながら、良い健康状態の個体において、この試験の許容性は、死亡率を減少するために内視鏡検査を使用するスクリーニング方針に対してはあまりにも低い（このスクリーニング・ストラテジーを設けているヨーロッパ諸国の結腸鏡検査法の順守のレベルは、約２％である）。結腸の穿孔と出血及び死亡（１／１００００）は無視できないリスク（０．１％）であり、また公衆衛生のためにはあまりにも高価である。さらにまた、結腸鏡検査法は非常に限定的な前もった結腸調製を必要とし、それが主に低い順守を説明する。
【０００８】
イムノアッセイによって検査されうる腫瘍マーカーは、結腸直腸癌との関係において、長い間記載されてきた。それらは、特に胎児性癌抗原（ＣＥＡ）及びＣＡ１９-９である。
ＣＥＡはフォローアップのために使われている。それは、感受性と特異性が不十分であるので、結腸直腸癌のスクリーニングに、又は早期診断のために使用できない。これは、このマーカーが他の種類の癌によって及び良性病変において発現されるためである。いろいろあるけれども、ＣＥＡと他の腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９-９またはＣＡ７２-４）を組合わせることによって、特異性を失うことなしに感受性を増すことが可能である。
【０００９】
ＣＡ１９-９の生理的変異の原因はまれであるが、他の良性の症状（肝・胆道系の症状、膵臓の症状）、または悪性病状はＣＡ１９-９の増加を誘発する可能性がある。従って、また、このマーカー単独では診断のためには重要でない。それにもかかわらず、その血清濃度が腫瘍のサイズおよび転移癌の存在と相関しているので、フォローアップ治療又は再発の早期証明を可能にしうる。
【００１０】
さらに、市販の試験が提案されている：
・Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤ（Ａｍｂｒｉｌｉａによって市販されている）は、ＣＲＣのための迅速で、比較的非侵襲的スクリーニングテストである。Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）は結腸直腸の病的状態をもつ個体の直腸の粘液のプラスマローゲン（リン脂質の部分である複合脂質のクラス）を検出し、ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤは直腸の粘液のＴ抗原、複合糖類を検出する。Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤテストは試験片に直腸の粘液の塗布することを含み、陽性または陰性の結果はシッフ反応に基づく。Ａｍｂｒｉｌｉａは１７８７個体を研究して、Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤは早期ステージ結腸直腸癌の５４％のケース及び全ステージを合わせて４９％を検出することを証明した。
・ＣＯＬＡＲＩＳ（Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって市販されている）は、血液で、遺伝性非腺腫性大腸癌（ＨＮＰＣＣ症候群）をスクリーニングするためにＭＬＨ１及びＭＳＨ２遺伝子の突然変異を検出するテストである。試験の結果は３週で入手できる。Ｍｙｒｉａｄは現在利用可能な最も感受性があり及び最も特異的なシークエンシング技術を使用する。当該テストは、高価である。
・ＤＲ-７０（登録商標）（ＡＭＤＬによって市販されている）は、様々な種類の癌（肺、結腸、胸部、肝臓、胃、その他）を検査するテストである。従って、ＣＲＣに特異的でない。当該テストの原理は、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術（ＤＲ-７０抗原の分析）に基づく。検出は、酵素反応（ビオチンとストレプトアビジンに結合する抗体）によって実施される。着色した反応は、癌の存在を示す。
【００１１】
出願人は現在、驚くべきことに、癌組織のうち結腸腫瘍によって放出され、且つこれらの腫瘍に特徴的である新規な腫瘍マーカーを示した。それは腫瘍から離れた生物試料及び腫瘍自体の両方において検出できる。
したがって、本発明の第１の目的は結腸直腸癌を有することが疑われる患者から採取された生物試料、好ましくは腫瘍から離れた生物試料のアミノアシラーゼ１の存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法である。
また、本発明は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断、及び再発診断の両方のための当該方法の使用に関する。
【００１２】
本発明の方法は、従って、患者から採取された生物試料、好ましくは潜在的な腫瘍から離れた生物試料のアミノアシラーゼ１の存在を調査することにを含む簡単なテストによって、特異的に早期に結腸直腸癌を診断可能にする。これは、出願人が、以下により詳細に証明されるように、予想外に、結腸腫瘍が特異的にアミノアシラーゼ１を分泌するだけでなく、癌組織から外にそれを放出すること、及び本発明の方法が実施される生物試料中のその濃度が正常患者で決定された基準値と比較して増加することを示したためである。
【００１３】
腫瘍から離れていてもよいか又は離れていなくてもよい生物試料におけるアミノアシラーゼ１の存在の決定は、追求される病的状態に関し結論を出すことを可能にする。そのため、本発明の方法の利点の１つは、組織診断が侵襲的にとられる生検を必要とするのに対して、診断試料として潜在的腫瘍から離れた試料を使用する可能性にあり、それによって、簡単で非侵襲性の診断を可能にする。実際に、組織マーカー、例えば組織切片（免疫組織化学）における研究は、予後診断の興味はあり得るが、結腸直腸癌のスクリーニングまたは診断についての興味はない。
【００１４】
アミノアシラーゼ１マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０３１５４、別名ＥＣ３．５．１．１４、Ｎ-アシル-Ｌ-アミノ酸アミドヒドロラーゼまたはＡＣＹ-１）は、アミノアシラーゼ・ファミリーの一員である。それらは、アシル化されたアミノ酸の加水分解に触媒作用を及ぼし、それにより脂肪酸とアミノ酸を提供する酵素である（文献３）。アミノアシラーゼ酵素活性のための免疫化学的なアッセイが、Ｋ．Ｌｏｒｅｎｔｚによって１９７５年という早い時期に開発され（文献４）、さまざまな組織と血清の分析に使われた（文献５）。研究は、肝臓の病的状態の場合にアミノアシラーゼ活性の増加を示したが、大腸癌の場合にはそうではなかった。さらに、アミノアシラーゼ１遺伝子は、染色体３ｐ２１．１上に同定されている（文献６）。３ｐ２１．１領域は小細胞肺癌ではホモ接合になり、この場合アミノアシラーゼ発現は抑制されるか又は検出できない（文献７）。同様に、Ｓ．Ｂａｌａｂａｎｏｖ（文献８）は、アミノアシラーゼ発現が腎臓癌の場合、抑制されることを示した。しかしながら、アミノアシラーゼ１は結腸直腸癌に関するマーカーとして有用である可能性、特に腫瘍から離れた生物試料中で分析される可能性についてはこれまで記載されていなかった。
【００１５】
「腫瘍マーカーの存在を決定する」なる表現は、タンパク質またはそのメッセンジャーＲＮＡの存在を決定すること、またはコードまたは非コード配列の遺伝子における修飾（例えばメチル化）を検出することを意味することを目的とする。
「結腸腫瘍による放出」なる表現は、機構を問わず、腫瘍細胞自身による、又は腫瘍の進行から生じている細胞表現型の病変または変化に続く隣接非腫瘍細胞による腫瘍マーカーの能動的または受動的な分泌、放出を意味することを目的とする。
「本発明の方法が実施される生物試料」なる表現は、興味がある腫瘍マーカーを含む可能性がある任意の生物試料を意味することを目的とする。腫瘍から離れていない生物試料の例として、腫瘍、この腫瘍の生検、リンパ節または患者の転移ガンに由来する組織のような固体試料、及びこれらの固体試料から精製された細胞を挙げることができる。腫瘍から離れた生物試料の例として、全血またはその派生物（例えば、血清または血漿、尿、唾液と滲出液、骨髄と糞便）のような体液及びこれらの体液から精製された細胞を挙げることができる。血液またはその派生物、更には糞便、滲出液及びこれらの液体試料から精製された細胞が好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、アミノアシラーゼ１に加えて、必要に応じて癌組織のうち結腸腫瘍によって放出される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーで検出することによって改良されうる。このように、少なくとも２つのマーカーの組合せは、結腸直腸癌の診断のためのテストの特異性及び感受性を改良することを可能にする。
【００１７】
このように、また、本発明の他の目的は、以下の２つのグループのマーカーの存在を、単独で又は組合わせて検討して、決定することを含む：
− グループＡ：白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ-プラスチン、これらのマーカーのいくつかは本出願人によって同定された新規マーカーである、
− グループＢ：付加的な診断の興味を有するマーカー、すなわち：β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のＤＮＡ断片の検出、例えばＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス４遺伝子メチル化）またはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡ、糞便ＤＮＡ断片の特異的な修正の検出、例えば糞便ＤＮＡの特異的な変異、糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な修正、ヒト糞便のヘモグロビンの検出。
【００１８】
従って、本発明の方法は、少なくとも２つのマーカーを検出することによって改良されうる。一つはアミノアシラーゼ１であって、他方はグループＡ、すなわち、白血球エラスターゼインヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ-プラスチンから選択される他の腫瘍マーカーである。
【００１９】
「新しく記載された腫瘍マーカー」は、タンパク質またはメッセンジャーＲＮＡまたは対応する遺伝子の特異的な修飾、例えば突然変異やメチル化、を意味することを目的とする。
【００２０】
白血球エラスターゼインヒビター腫瘍マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３０７４０、別名ＬＥＩ、Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１、単球／好中球・エラスターゼインヒビター、Ｍ／ＮＥＩ又はＥＩ）は、１９９２年に配列決定された（文献９）。ＬＥＩは、ＳＤＳの作用下で解離することができない複合体の形成によって、エラスターゼ型又はキモトリプシン型の特性を有するプロテアーゼを特異的に阻害する（文献１０）。従って、ＬＥＩは、好中球によって産生された主なプロテアーゼのうち、白血球エラスターゼ、プロテイナーゼ３及びカテプシンＧの３つを阻害する：これらのプロテアーゼは、免疫系が細胞外又は貧食された基質の蛋白質分解によって生物を防御することを可能にする。しかしながら、これらのプロテアーゼが過度の場合、炎症性反応の原因となる。ＬＥＩは、従って、細胞プロテアーゼによって誘発される炎症性機能を調整及び制限する役割を有するかもしれない。一方で、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者からとられる生物試料であって、腫瘍から離れている前記試料において良好なマーカーであることを示した。
【００２１】
エズリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１５３１１、別名ｐ８１、サイトビリンまたはビリン２）は、特に腸の上皮細胞の微小絨毛において、細胞膜と細胞の細胞骨格のアクチンフィラメントとの間で結合性を提供するタンパク質である（文献１１）。Ｗ．Ｇ．Ｊｉａｎｇ及びＳ．Ｈｉｓｃｏｘ（文献１２）は、インターロイキンＩＬ-２、ＩＬ-８、ＩＬ-１０等がＨＴ２９ヒト結腸直腸癌細胞株のエズリンの発現を阻害することができることを示した。同じ著者（文献１３）は、ＨＴ１１５及びＨＲＴ１８の結腸直腸癌細胞株におけるエズリン発現の阻害は細胞間の粘着力を減少させ、細胞の可動性と侵襲性の行動を増やすことを示した。彼らは、エズリンが細胞接着分子Ｅ-カドヘリン及びβ-カテニンと相互に作用することによって、細胞／細胞及び細胞／細胞間質の粘着力を調整すると結論した。彼らは、エズリンが癌細胞の侵襲能力を制御することにおいて重要な役割を果たすかもしれないことを示唆した。さらに、Ｔ．Ｘｉａｏ等（文献１４）は、肺癌患者の血漿エズリンを定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイを用いた。しかしながら、彼らは、対照個体と比較して何ら違いを観察しなかった。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２２】
肝臓脂肪酸結合タンパク質マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７１４８、別名Ｌ-ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰＬ、Ｚ-タンパク質またはステロール輸送体タンパク質）は、９つのイソフォームを含むＦＡＢＰファミリーに属する。各々のイソフォームは、それが最初に検出された組織に従って名づけられる。これらのイソフォームは共有の機能及び類似した三次元構造を有するが、それらの配列相同性は高くない。Ｌ-ＦＡＢＰは１９８５年に配列決定された（文献１５）。それは、細胞質ゾルに豊富にあり、遊離脂肪酸に、更にビリルビンにも結合する能力を有する１５ｋＤａの小タンパク質である。いくつかの最近の研究では、Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質の発現の障害が腫瘍形成過程を誘導しうることを示すように見える。前立腺癌の場合、腫瘍組織生検におけるＬ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、正常組織よりも１０倍高かった（文献１６）。大腸癌の場合、いくつかのチームは、２次元の電気泳動法技術を用いて、正常な大腸粘膜と比較して腫瘍組織におけるＬ-ＦＡＢＰタンパク質の発現の減少を同定した（文献１７）。また、この結果は免疫組織化学技術によっても確認された。加えて、Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質は、肝臓に転移していた結腸直腸癌患者の予後の肝切除術マーカーである（文献１８）。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２３】
腸脂肪酸結合タンパク質マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１２１０４、別名Ｉ-ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ-２またはＦＡＢＰＩ）は、１９８７年に配列決定された（文献１９）。それは、細胞質ゾルに豊富にあり、遊離脂肪酸に、更にビリルビンにも結合する能力を有する１５ｋＤａの小タンパク質である。Ｉ-ＦＡＢＰタンパク質は、小腸の腸細胞で発現され、この細胞型のタンパク質含有量のほぼ２％を構成しうる。組織レベルで、十二指腸と空腸は、結腸よりかなり高いＩ-ＦＡＢＰの量を含む（空腸：４．８μｇ／ｇ、結腸：０．２５μｇ／ｇ）（文献２０）。Ｉ-ＦＡＢＰは、正常な個体の血漿試料では検出できない。一方では、特定の病理学的背景、例えば腸の虚血、クローン病または原発性胆汁性肝硬変症において、特定の個体の血漿Ｉ-ＦＡＢＰ濃度の増加を示すことが可能である（文献２０）。前立腺癌の場合、腫瘍組織生検におけるＩ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、正常組織よりも７倍高かった（文献１６）。ラットのアゾキシメタンによる結腸直腸腫瘍の誘導のモデルにおいて、癌の発病率を減らす食事（大豆タンパク質または乳漿加水分解産物）を与えた動物の場合は、Ｉ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現のレベルが２．９２から３．９７倍減少する（文献２１）。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２４】
アポリポタンパク質は、極性アミノ酸で構成されるタンパク質のファミリーであり、リポタンパク質と呼ばれている親水性の巨大分子複合体の形成によって血液中の脂質の輸送を可能にする。各々のヒト血漿アポリポタンパク質の場合、遺伝的多型および／または翻訳後修飾に由来するイソフォームがあり、血液中のその存在は特定の病的状態と関連している可能性がある（文献２２）。アポリポタンパクの血漿濃度は、ｍｇ／ｍｌのオーダーで無視できない（文献２３）。
【００２５】
アポリポタンパク質ＡＩマーカー（ＮＣＢＩ Ｎｏ．４９００９８、別名Ａｐｏ Ａ-Ｉ、Ａｐｏ ＡＩ及びＡｐｏ Ａ１）は、２４３アミノ酸、２８ｋＤａのタンパク質である。それは、肝臓及び腸によって基本的に合成される。ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ（文献２４）によって、このタンパク質は、正常な個体と比較して、結腸直腸癌で苦しんでいる患者の血清において十分に豊富でないことが示された。しかしながら、ＣＲＣを有する患者がＡｐｏ ＡＩと他のタンパク質マーカーとを組合わせることによって、正常な個体から区別されることは、この論文において特定されている。さらに、この論文は、他のチームによって実施された免疫比濁法によるＡｐｏ ＡＩの分析がＣＲＣを有する患者の血清において、このタンパク質が十分に豊富でないことを確認していないことを示している（文献２５）。一方で、Ｈａｃｈｅｍ等（文献２６）は、結腸直腸癌転移後の肝癌を有していた患者の血清のＡｐｏ ＡＩを分析した。一方で、本出願人は、驚くべきことに、ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ技術を実施することによってのみ、この減少を証明することが可能だったとＥｎｇｗｅｇｅｎ等（文献２４）によって提案されたことに反して、イムノアッセイによる分析により、結腸直腸癌を有する患者において、このタンパク質の濃度の減少が証明できることを示した。Ｚｈａｎｇ等のチームによって使用されたように、実行されるイムノアッセイによる分析が比濁法でない限り、腫瘍から離れている生物試料のイムノアッセイによってＡｐｏ ＡＩを分析することは結腸直腸癌の診断のための良好な方法である（文献２５）。
【００２６】
アポリポタンパクＡＩＩマーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０２６５２、別名ＡｐｏＡ ＩＩ、Ａｐｏ-ＡＩＩ及びＡｐｏ Ａ２）は、ジスルフィド架橋によって連結される各々７７アミノ酸の２つのポリペプチド鎖から成る１７３８０Ｄａのタンパク質である。アポリポタンパクＡＩのように、アポリポタンパクＡＩＩは、肝臓及び腸によって基本的に合成される。Ｈａｃｈｅｍ等（文献２６）は、結腸直腸癌転移後の肝癌を有していた患者の血清のＡｐｏ ＡＩＩを分析した。しかしながら、結果は有意でなく、求められる病的状態に関しては結論を出すことは可能でない。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２７】
Ｉ-プラスチンマーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ１４６５１、別名腸特異的プラスチン又はプラスチン１）は、３つの代表例、Ｉ-プラスチン、Ｌ-プラスチン及びＴ-プラスチンが知られているヒトのプラスチンのファミリーに属する。一部の研究者はプラスチン類を「フィンブリン」と呼ぶが、他の研究者はフィンブリンの名をＩ-プラスチンのために残している。プラスチンは、アクチンに結合し、それにより細胞骨格（細胞の骨格）を形成するタンパク質である。それらは、真核生物進化の全体にわたって比較的よく保存されている７０ｋＤａのタンパク質である。それらは強い組織特異性を呈し、一度に一つのイソフォームのみが正常組織に存在する（文献２７）。癌に関するプラスチンの使用は特許ＵＳ-Ａ-５３６０７１５にすでに記載されており、細胞が造血性または潰瘍性、すなわち癌性であるかどうかを決定する方法を提案する。この方法は、細胞レベルのＬ-プラスチン及びＴ-プラスチンのアッセイ、より具体的にはそのｍＲＮＡのアッセイを請求する。しかしながら、これらの特性にもかかわらず、従来の研究には、血清または糞便試料を使用した結腸直腸癌の診断に関してプラスチンの重要性を評価することを実施するものはなかった。さらにまた、Ｉ-プラスチンは、潜在的癌マーカーとしてこれまで想定さえされなかった（文献２８）。一方で、出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取される生物試料であって、腫瘍から離れているか又は離れていない前記試料において、優良なマーカーであることを示した。
【００２８】
グループＡから選択される腫瘍マーカーの濃度は、考慮するマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において、正常な患者のために決定される基準値と比較して増減される。
【００２９】
本発明の方法は、また、アミノアシラーゼ１の検出と、グループＢ：β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のＤＮＡ断片の検出、例えばＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス４遺伝子メチル化）またはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡ、糞便ＤＮＡ断片の特異的な修正の検出、例えば糞便ＤＮＡの特異的な変異、糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な修正、ヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される他の一つの腫瘍マーカーの検出を組合わせることによって改良することができる。もちろん、本発明の方法は、また、同じアッセイにおいて、アミノアシラーゼ１の検出、グループＢから選択される少なくとも１つの腫瘍マーカーの検出、及びループＡから選択される少なくとも１つの腫瘍マーカーの検出を実施することができる。
【００３０】
β２-ミクログロブリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ６１７６９、別名β２-ミクログロブリン、β２Ｍ）は、大部分の核を有するヒト細胞の表面に見られる低分子量タンパク質（１１から１２ｋＤａ）である。血清β２-ミクログロブリン・レベルは癌を患っている特定の患者において増加し、この増加は特異性がないか、または腫瘍の性質、疾患のステージまたは重症度と相関する。また、有意な増加は他の疾患、例えば紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、リンパ系の悪性疾患（多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫）、特定のウイルス病（肝炎またはエイズ）において、及び血友病者患者において観察される。β２-ミクログロブリンは腎臓糸球体によってろ過されて、近位尿細管によって再吸収されるので、その血液中濃度は腎臓の病的状態の場合は変更されうる。従って、β２-ミクログロブリンの分析は、最も一般的には、腎臓の病的状態の診断ために、または獲得性の免疫不全ウイルスによる感染のフォローアップ向けである。しかしながら、このマーカーは腫瘍マーカー、特に大腸癌のものとして知られている。
【００３１】
プロテアソーム２０Ｓのマーカー（別名プロソーム）はプロテアソームの中心構造であり、それはそれ自身でユビキチン化タンパク質の細胞内の分解の役割を果たす分子複合体である（文献２９）。プロテアソームは、７つのサブユニットの４つのリングが結合した２８サブユニットで構成される７００ｋＤａの分子複合体である。ヒトにおいて、７つのαユニット（α１、α２、α３、α４、α５、α６及びα７）と１０のβユニット（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β１ｉ、β２ｉ及びβ５ｉ）が知られている。その触媒特性によって、プロテアソームは、細胞増殖、成長、調節とアポトーシスの機構において、従って癌化経路において中心的役割を果たす。ボルテゾミブ（ベルケード）によるプロテアソーム阻害は、多発性骨髄腫で認可された治療である。第二相または三相の治験は、血液癌または腫瘍のために進行中である。Ｔ．Ｌａｖａｂｒｅ-Ｂｅｒｔｒａｎｄ等（文献３０）は、プロテアソームの血清レベルが特定の病的状態、特に癌（骨髄腫、リンパ腫及び充実性腫瘍）の場合に増加する可能であることを示した。
【００３２】
ガレクチン-３マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１７９３１、別名Ｇａｌ-３、ガラクトース特異的レクチン３、ＭＡＣ-２抗原ＩｇＥ結合タンパク質、３５ｋＤａレクチン、炭水化物結合タンパク質３５、ＣＢＰ３５、ラミニン-結合タンパク質、レクチンＬ-２９、Ｌ-３１、ガラクトシド-結合タンパク質またはＧＡＬＢＰ）は、Ｎ-アセチルラクトサミン型のβ-ガラクトシド構造に結合できるレクチンである。それは、腫瘍細胞の付着、増殖、分化、脈管形成、アポトーシス、転移癌進行を含むさまざまな生物学的機能に関係する多数の機能を有するタンパク質である（文献３１）。さまざまな調査は、Ｇａｌ-３が多数の分子と複合体を形成できることを示している：ＣＥＡ、ＩｇＥ、ラミニン、ムチン、Ｍａｃ ２ＢＰ、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、フィブロネクチン等。Ｇａｌ-３の血清分析は、Ｉ．Ｉｕｒｉｓｃｉ等によって記載されている（文献３２）。Ｇａｌ-３は、Ｍａｃ-２-結合タンパク質（Ｇａｌ-３結合タンパク質）によりコートされたマイクロプレート上に捕獲されて、次に抗Ｇａｌ-３ラット抗体により明らかにされた。この研究は、胃腸癌、乳癌、肺癌、卵嚢癌、メラノーマ及び非ホジキンリンパ腫の場合、高い血清Ｇａｌ-３を示した。
【００３３】
Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７１９５、別名ＬＤＨ-Ｂ、ＬＤＨ心臓ユニット、又はＬＤＨ-Ｈ）は、ホモテトラマーの形で複合体を形成することができるタンパク質である。また、このタンパク質は、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ａ鎖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００３３８、別名ＬＤＨ-Ａ、ＬＤＨ筋肉ユニット、またはＬＤＨ-Ｍ）と、ヘテロテトラマーの形で複合体を形成することができる。四量体複合体（ＬＤＨと呼ばれている）の血清量および／または血清酵素活性は、多くの充実性腫瘍の場合、腫瘍質量に比例して血流中で増加する。その使用は、精嚢癌の追跡調査の場合、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（β-ｈＣＧ）と胎盤のアルカリ性ホスファターゼとの組合せが推奨される。ＬＤＨは、リンパ腫、白血病および結腸癌の予後診断の重要なマーカーであると考えられる（文献３３）。
【００３４】
カルレティキュリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２７７９７、別名ＣＲＰ５５、Ｃａｌｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＡＣＢＰ、ＥＲｐ６０またはｇｒｐ６０）は、多機能タンパクである。それは、小胞体の全てのモノグリコシル化タンパク質と、一時的に実質的に相互に作用することができるレクチンである。Ｄ．Ｊ．ＭｃＣｏｏｌ等は、したがって、カルレティキュリンが結腸ムチンＭＵＣ２の成熟に関係していることを示した（文献３４）。組織、糞便または体液のカルレティキュリンの分析を使用するＣＲＣの診断のための方法は、特許出願ＷＯ０３／０６５００３に記載されている。
【００３５】
再生膵島由来タンパク質３α・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０６１４１、別名ＲｅｇＩＩＩ-α、膵臓炎関連タンパク質１、またはＰＡＰ１）は、正常な膵臓においてわずかに発現されるタンパク質である。それは、膵臓炎の急性期の間及び慢性膵炎で苦しんでいる特定の患者に過剰発現する。この場合、それは、膵液に及び血流に現れる（文献３５）。Ｙ．Ｍｏｔｏｏ等（文献３６）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、その大腸癌、胃癌、肝癌または膵臓癌を有する特定の患者において、腎不全症の場合、血液中ＰＡＰ１のレベルが増加することを示した。彼らは、Ｄｙｎａｂｉｏ社（Ｌａ Ｇａｕｄｅ、フランス）によって市販されているＥＬＩＳＡアッセイ分析（ＰＡＮＣＥＰＡＰ）を使用した。
【００３６】
腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１６４２２、別名主要胃腸腫瘍関連タンパク質ＧＡ７３３-２、上皮細胞表面抗原、ＥｐＣＡＭ、上皮糖タンパク質、ＥＧＰ、腺癌関連抗原、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原、細胞表面糖タンパク質Ｔｒｏｐ-１またはＣＤ３２６抗原）が、結腸直腸癌細胞に向かう抗体によって認識されるその能力によって、１９７９年に特徴づけられた（文献３７）。上記のように、このタンパク質はさまざまな名で知られているが、最も一般的に使用されるのはＥｐＣＡＭである。それは、特定の上皮及び多くの癌の細胞の側底面表面で発現する膜貫通タンパク質である（文献３８）。１９８２年という早い時期に、Ｈｅｒｌｙｎ等（文献３９）は、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の注射が結腸直腸癌を有する患者の腫瘍成長を阻害する可能性を示した。これらの結果は、エドレコロマブと呼ばれる抗ＥｐＣＡＭ抗体に基づく抗腫瘍治療の進展に結果としてなった。本治療は、ＰａｎｏｒｅｘＴＭの名で市場に出されている。そのうえ、Ｈ．Ａｂｅ等（文献４０）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＥｐＣＡＭの可溶型（ＭＫ-１と呼ばれている）が、調べられている癌患者の１０％の血流において増加することを示した。
【００３７】
サイトケラチンは、上皮細胞の細胞骨格の中間フィラメントをつくるタンパク質の部分である。現在では、２０以上のヒト・サイトケラチンが同定されている。サイトケラチン８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０５７８７、別名サイトケラチン-８、ＣＫ８、ケラチン-８またはＫ８、１８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０５７８３、別名サイトケラチン-１８、ＣＫ１８、ケラチン-１８、またはＫ１８）及び１９（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０８７２７、別名サイトケラチン-１９、ＣＫ-１９、ケラチン-１９またはＫ１９）は、上皮細胞で最も豊富にあり、癌病理学の診断に役立つツールである（文献４１）。この臨床重要性は、アポトーシスの又は増殖段階の上皮細胞によるサイトケラチンの放出と関連がある。アポトーシスの場合、この放出は、カスパーゼのタンパク質分解活性下で出現するようにみえる可溶性断片の形態で起こる。分解されていないサイトケラチン形態は、血流において、これまで記載されていなかった。臨床的に使われる最も一般的な３つのサイトケラチンアッセイは、組織ポリペプチド抗原アッセイ（ＴＰＡ）、組織ポリペプチド特異性抗原（ＴＰＳ）アッセイ及びＣＹＦＲＡ２１-１アッセイである。ＴＰＡは、サイトケラチン８、１８及び１９を測定する広域スペクトル・テストである。ＴＰＳ及びＣＹＦＲＡ２１-１アッセイはより特異的であり、それぞれサイトケラチン１８及びサイトケラチン１９の断片を測定する。これらの３つのアッセイは、単独で又はタンパク質複合体の形態で存在してもよいサイトケラチン断片を検出する。ＴＰＡ、ＴＰＳまたはＣＹＦＲＡ２１-１が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、膵臓癌、前立腺癌及び特定ＥＮＴ癌のフォローアップ治療のために使われてきた。血液の可溶性サイトケラチン断片を分析することは、実際には再発のためのスクリーニングにおいて、又は使用される治療（放射線療法、化学療法、ホルモン治療）への反応を評価することにおいて臨床価値を有する。定期的な分析により、腫瘍質量の経過を評価することが特に可能である。可溶性血液サイトケラチンの量も、腫瘍段階及び転移癌の形成に関して予後診断の側面を有する。現在、最も一般的に使用されるサイトケラチンの血液検査法は、ＣＹＦＲＡ２１-１である。それは、肺非小細胞癌を有する患者のフォローアップに、非常に推奨される。さまざまな市販のアッセイが、ＴＰＡ（ＡＢ Ｓａｎｇｔｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．、 Ｂｙｋ-Ｒｏｌａｎｄ、その他）、ＴＰＳ（ＩＤＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、ＢＥＫＩ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、その他）及びＣＹＦＲＡ２１-１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、ＣＩＳ Ｂｉｏ-Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、その他）のために存在する。そのうえ、Ｈ．Ｋｉｍ等（文献４２）は、糞便のサイトケラチン１９（ＤｉＮｏｎＡ社）の分析は、糞便潜血アッセイと組合わせて胃腸疾患のためのスクリーニングにおいて役立つ可能性があることを示している。最後に、サイトケラチン２０（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３５９００、別名ケラチン、Ｉ型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０、ＣＫ２０、ケラチン-２０、Ｋ２０、またはＩＴタンパク質）の結腸直腸癌のマーカーとしての使用は、特許出願ＵＳ２００２／０１６０３８２に記載されている。
【００３８】
上皮カドヘリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１２８３０、別名Ｅ-カドヘリン、ウボモルリン、カドヘリン-１、ＣＡＭ１２０／８０またはＣＤ３２４抗原））は、カルシウム依存性細胞接着に介在する膜貫通タンパク質である。それは上皮細胞において特に発現し、それらの表現型を維持することに関係している。Ｅ-カドヘリンの細胞質ドメインは、それ自体が細胞骨格のアクチン・フィラメントネットワークに結合するβ-カテニンに結合する。このＥ-カドヘリン／β-カテニン結合は、上皮組織の細胞／細胞接着を安定させることにおいて不可欠な役割を果たす。従って、Ｅ-カドヘリンの減失は、細胞接着を減少させ、癌細胞の侵襲性能力を増やしうる。Ｅ-カドヘリン又はβ-カテニンの発現の減少は、特に胃腸癌に関して、腫瘍のより高い攻撃性及び脱分化に通常関連している。Ｆ．Ｒｏｃａ等（文献４３）は、したがって結腸直腸癌を有し且つＥ-カドヘリンを過小発現させている患者は、正常な発現レベルを有する患者より好ましくない予後を有することを示した。１９８３年という早い時期に、Ｄａｍｓｋｙ等（文献４４）は、Ｅ-カドヘリンの可溶型がＭＣＦ-７乳がん細胞株によって放出される可能性を示した。この可溶型は、Ｅ-カドヘリンの細胞外部分の切断に相当する。後に、Ｍ．Ｋａｔａｙａｍａ（文献４５）は、Ｅ-カドヘリンの可溶型は癌の場合に血流中に放出される可能性があることを示し、Ｃ．Ｗｉｌｌｍａｎｎｓ等（文献４６）は、血液中のＥ-カドヘリンの量の増加は結腸直腸癌の腫瘍段階と相関していることを示した。さらに、市販のキットは、タカラ・バイオケミカルズ社（東京、日本）によって提案される。
【００３９】
結腸直腸癌の診断のためのＣＥＡ（胎児性癌抗原）の分析は、Ｐ．Ｇｏｌｄ及びＳ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ（文献４７）によって１９６５年以降、提案されてきたが、血液中のこのマーカーのアッセイは比較的進行していない段階の結腸直腸癌の診断では低い感受性を有する。従って、血清ＣＥＡの分析は、特に肝臓転移癌（文献４８）のリスクを評価するために、及びフォローアップ治療のために推薦される。加えて、それは、結腸直腸癌にあまり特異的なマーカーではない；それは、多くの他の癌（肺、胸部、その他）において、実際に増加する可能性がある。一方では、糞便のＣＥＡの分析は、血清ＣＥＡの分析または糞便血の分析よりも、より感受性があって且つより特異的に見える（文献４９）。しかしながら、この分析は、普通には、まだ提唱されない。
【００４０】
反応性の抗原決定基１１１６-ＮＳ-１９-９、より一般にはＣＡ１９-９（炭水化物抗原１９．９）と呼ばれているものは、高分子量タンパク質によって担持される（文献５０）。血液中のＣＡ１９-９の分析は、ＣＥＡのそれよりも特異的である。血液のＣＡ１９-９レベルは、結腸直腸癌、膵臓癌、肝癌（胆管癌）において増加するが、非癌性の病的状態（胆管炎、その他）の場合にも増加する。ＣＥＡと組合わせたその使用は、癌の診断時に、及び病的状態のフォローアップのために推奨される。
【００４１】
Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ等（文献５１）は、血清中のＣＡ５０抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ５０抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。
【００４２】
ＣＡ７２マーカーに関しては、Ｔ．Ｌ．Ｋｌｕｇ（文献５２）は、血清のＣＡ７２抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ７２抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。
【００４３】
同様に、Ｐ．Ｋｕｕｓｅｌａ等（文献５３）は、血清中のＣＡ２４２抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ２４２抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。
【００４４】
結腸直腸癌の診断のためにテストステロンを分析することは、Ｍ．Ｈｏｌｌａｎｄ等（文献５４）によって、男性において提案された。これらの著者は、結腸直腸癌の場合は、血液テストステロンレベルの下落を示した。
【００４５】
ＴＩＭＰ-１マーカー、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ１型の組織阻害物質に関しては、特許出願ＵＳ２００７／００２０７０７は、特に体液の分析によって結腸直腸癌の診断の場合にＴＩＭＰ-１を分析することを記載する。
【００４６】
Ｆ．Ｍｏｄｅｌ等（文献５５）は、２００６年７月に、胃腸癌の国際会議において、結腸直腸癌を有する患者の血漿のセプチン-９遺伝子のメチル化型を検出することが可能だったことを示した。
【００４７】
Ｍ．Ｐ．Ｅｂｅｒｔ等（文献５６）は、ＡＬＸ４遺伝子またはａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス-４遺伝子は、対照血清においてよりも、結腸直腸癌を有する患者の血清において、より頻繁にメチル化されることを示した。限界値４１．４ｐｇ／ｍｌを使用して、彼らは、８３．３％の感受性及び７０％の特異性を得た。
ビリンは、特許出願ＦＲ２５８１４５６において、結腸直腸癌の診断のための血液マーカーとして記載された。
【００４８】
Ｃ．Ｂｉａｎｃｏ等（文献５７）は、血清のＣｒｉｐｔｏ-１の量が結腸直腸癌の場合には増加することを示した。
【００４９】
結腸直腸癌の診断のためのインテレクチン-１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＷＷＡ０、別名腸ラクトフェリン受容体、ガラクトフラノース結合性レクチン、内皮レクチンＨＬ-１またはＯｍｅｎｔｉｎ）の分析は、特許出願ＵＳ２００３／００８２５３３に記載されている。
【００５０】
結腸直腸癌のマーカーとしての、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７２３７、別名ＥＣ５．３．４．１、ＰＤＩ、プロリル４-水酸化酵素サブユニットβ、細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質またはｐ５５）の、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１３６９３、別名ＴＣＴＰ、ｐ２３、ヒスタミン放出因子、ＨＲＦまたはＦｏｒｔｉｌｉｎ）及び（プロ）デフェンシン-Ａ５（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０１５２３）の使用は、それぞれ特許出願ＥＰ１７２４５８６、ＵＳ２００３／０１７２３８８およびＵＳ２００６／０１７９４９６に記載されている。「（プロ）デフェンシン」なる用語は、前駆体、すなわち、切断前のプロデフェンシン、プロペプチド、すなわち切断後のプロデフェンシンのＮ末端部分、切断後のＣ末端部分に対応する成熟したタンパク質、すなわちデフェンシンを意味することを目的とする。
【００５１】
最後に、ヒト糞便ヘモグロビンの分析は知られており、以前記載されたように実施されてもよい。
正常な患者で決定される基準値と比較して、グループＢから選択される腫瘍マーカーの濃度は、考慮されるマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において増減される。
好ましくは、グループＢの腫瘍マーカーは、マーカー：β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される。
【００５２】
もちろん、本発明の方法は、当業者に知られている結腸直腸癌のための他のいかなるマーカーをも検出に含むことができる。
上記のように、興味がある腫瘍マーカーは、タンパク質の形態で、またはメッセンジャーＲＮＡの形態で、または対応するＤＮＡの修正（突然変異またはメチル化の修飾）によって検出される。
生物試料において、興味がある「タンパク質」腫瘍マーカーの存在の決定は、当業者に知られている試料におけるタンパク質の存在を決定する任意の方法、例えばイムノアッセイを含む生化学検査によって、または質量分析法によって行われることができる。
生化学検査は、分子相互作用、すなわち前記腫瘍マーカーと前記腫瘍マーカーに特異的あるいは非特異的な一つ以上の結合性パートナーとの間の反応を含む当該分野の当業者に知られている任意のテストであってもよい。
好ましくは、生化学検査は、当業者に知られているイムノアッセイであり、腫瘍マーカー間の免疫反応を含み、それは抗原と一つ以上の特異的な結合性パートナー、すなわち、この抗原に向かう抗体である。
【００５３】
本発明の方法で求める腫瘍マーカーに特異的な又は特異的でない結合パートナーは、これ又はこれらのマーカーに結合できる任意のパートナーである。高い特異性により又は１００％の特異性でさえも、これらのマーカーに結合できる場合、それらは特異的であると言われる。これらのマーカーへの結合の特異性が低く、他のリガンド（例えばタンパク質）に結合できる場合、それらが非特異的であると言われる。例えば、このマーカーに結合できる抗体、抗体部分、受容体と他の任意の分子をあげることができる。
【００５４】
結合パートナー抗体は、例えば、ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体である。 ポリクローナル抗体は、関心ある腫瘍マーカーによる動物の免疫化、続いて、前記動物から血清を採ること、及び特に抗体によって特異的に認識される抗原、特に前記マーカーが取り付けられたカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーにより血清成分から前記抗体を分離することによって精製された形態での所望の抗体の回収により得られる。
【００５５】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって得ることができ、その一般的原理を以下に示す。
第１に、動物（通常はマウス）は興味がある腫瘍マーカーによって免疫化され、それにより前記動物のＢリンパ球は前記抗原に対して抗体を生じることができる。続いて、これらの抗体産生リンパ球を、「不死の」ミエローマ（例えばマウス）と融合させ、それによりハイブリドーマを産生する。次に、このように得られる細胞の異種混合物を使用して、特定の抗体を産生し、際限なく増殖することができる細胞の選抜を実施する。各々のハイブリドーマは、クローンの形で繁殖し、例えばＥＬＩＳＡによって、一次元あるいは二次元のウエスタンブロットによって、免疫蛍光法によって、またはバイオセンサーによって、前記腫瘍マーカーに関する認識特性が試験されてもよいモノクローナル抗体の産生に結果としてなる。特に、上で記載されているアフィニティークロマトグラフィ技術によれば、このように選択されたモノクローナル抗体は続いて精製される。
また、モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技術によって、遺伝子工学によって得られた組換え抗体であってもよい。
【００５６】
抗白血球エラスターゼ・インヒビター抗体の例は知られおり、特にＡｂｃａｍカタログのウサギ抗-ＬＥＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４７７３１）が入手できる。抗-ＬＥＩモノクローナル抗体（クローンＥＬＡ-１）は、Ｙａｓｕｍａｔｓｕ等（文献５８）の論文に記載されている。
抗-エズリン抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-エズリン・モノクローナル抗体のクローン３Ｃ１２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４０６９）及びウサギ抗-エズリン・ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４７４１８）が入手できる。
抗-アミノアシラーゼ１抗体の例は知られており、特にＡｂｎｏｖａカタログの抗-アミノアシラーゼ１モノクローナル抗体のクローン４Ｆ１-Ｂ７（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ００００００９５-Ｍ０１）及びＡｂｃａｍカタログのチキン抗-アミノアシラーゼ１ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ２６１７３）が入手できる。
抗-肝臓脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体のクローン６Ｂ６（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ１００５９）及びウサギ抗-Ｌ-ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ７８０７）が入手できる。
抗-腸脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にＲ＆Ｄシステムカタログの抗-Ｉ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体のクローン３２３７０１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ３０７８）及びＡｂｃａｍカタログのウサギ抗-Ｉ-ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ７８０５）が入手できる。
抗-アポリポタンパク質ＡＩ抗体の例は知られており、特にＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログの抗-Ａｐｏ ＡＩモノクローナル抗体のクローン４Ａ９０（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ４５４０２Ｍ）及びヤギ抗-Ａｐｏ ＡＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５２５２Ｐ）が入手できる。
抗-アポリポタンパクＡＩＩ抗体の例は知られており、特にＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログの抗-Ａｐｏ ＡＩＩモノクローナル抗体のクローン１４０２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２２９９-３１Ｃ）及び特にＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログのヤギ抗-Ａｐｏ ＡＩＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ７４００１Ｐ）が入手できる。
抗-Ｉ-プラスチン・ポリクローナル抗体の例は知られており、特にサンタクルスバイオテクノロジーカタログにおいて入手できる。ウサギ・ポリクローナル抗体Ｈ-３００（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ-２８５３１）はＩ-プラスチン、Ｌ-プラスチン及びＴ-プラスチンと反応する。出願人はＩ-プラスチンに向かうモノクローナル抗体を開発した。
抗-β２-ミクログロブリン抗体、抗-ＣＥＡ抗体、抗-ＣＡ１９-９抗体及び抗テストステロン抗体の例が知られており、特に出願人のアッセイキット、それぞれＶｉｄａｓ（登録商標）β２-ミクログロブリン、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＥＡ、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＡ１９-９ＴＭ及びＶｉｄａｓ（登録商標）テストステロンが使用される。
抗プロテアソーム２０Ｓの抗体の例は知られており、親和性研究用製品カタログにおいて特に入手できる。
抗-ガレクチン-３抗体、抗-Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖抗体、抗-カルレティキュリン抗体、抗腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１抗体、抗-ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８抗体、抗-Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８抗体、抗-Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９抗体、抗-上皮カドヘリン抗体、抗-ビリン抗体及び抗-ＴＩＭＰ-１抗体は知られており、特にＡｂｃａｍカタログにおいて入手できる。
抗-再生膵島由来タンパク質３α抗体の例は知られており、特にＤｙｎａｂｉｏアッセイキット（Ｌａ Ｇａｕｄｅ、フランス）が使われる。
抗-ＣＡ２４２抗体、抗-ＣＡ５０抗体及び抗-ＣＡ７２-４抗体の例が知られており、特にＦｕｊｉｒｅｂｉｏカタログにおいて入手できる。
抗-インテレクチン-１抗体の例は知られており、アレクシス・バイオケミカルズ・カタログの抗-インテレクチン-１モノクローナル抗体のクローンＳａｌｙ-１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ-８０４-８５０-Ｃ１００）及びウサギ抗-インテレクチン-１ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ-２１０-９４１）が入手できる。
抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-ＰＤＩモノクローナル抗体のクローンＲＬ７７（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ５４８４）及びウサギ抗-ＰＤＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ３６７２）が入手できる。
抗-サイトケラチン２０抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログにおいて、抗-サイトケラチン２０モノクローナル抗体のクローンＫｓ２０．８（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ９６２）及びウサギ抗-サイトケラチン２０ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ３６７５６）が入手できる。
抗-ＴＣＴＰ抗体の例は知られており、特にＡｂｎｏｖａカタログにおいて、抗-ＴＣＴＰモノクローナル抗体のクローン３Ｃ７（Ｎｏ．１５７Ｈ００００７１７８-Ｍ０１）及び抗-ＴＣＴＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５７Ｈ００００７１７８-Ａ０１）が入手できる。
抗-デフェンシン-Ａ５抗体の例は知られており、特にサンタクルス生物工学カタログにおいて、抗-デフェンシン-Ａ５モノクローナル抗体のクローン８Ｃ８（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ-５３９９７）及びＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 社カタログのウサギ抗-デフェンシン-Ａ５ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤＥＦＡ５１-Ａ）が入手できる。
【００５７】
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに特異的あるいは特異的でない結合パートナーが、捕捉試薬として、検出試薬として、又は捕捉及び検出試薬として使用されてもよい。
免疫反応、すなわち腫瘍マーカー／結合性パートナー結合の視覚化は、検出（例えば直接的または間接的な方法）の任意の方法によって実施されてもよい。
直接的検出、すなわち標識の包含なしの場合、免疫反応は、例えば表面プラスモン共鳴によって、または導電性ポリマーを有する電極上のサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
間接的検出は、関心のある腫瘍マーカー自身の又は「検出試薬」結合パートナーのどちらかの標識によって実施される。後者の場合は、これは競合方法として記載されている。
「標識化」なる表現は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができる標識試薬の付加を意味することを目的とする。
【００５８】
これらの標識の非限定的なリストは、
・比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼ；
・蛍光または発光化合物、染料のような発色団；
・３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉのような放射性分子、及び
・アレクサまたはフィコシアニンのような蛍光分子
を含む。
【００５９】
また、間接的な検出システムを使用してもよく、例えば抗リガンドと反応可能なリガンドである。リガンド／抗リガンドの組合せは当業者にとって周知であり、こういう場合では、例えば、以下の組合せである：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドに相補的な配列。この場合、結合パートナーを担持するのは、リガンドである。抗リガンドは、前のパラグラフに記載されている標識試薬によって直接的に検出可能であってもよいか、あるいはそれ自体がリガンド／抗リガンドによって検出可能である。
これらの間接的な検出システムは、特定の条件下でシグナルの増幅を生じることができる。このシグナル増幅技術は当業者にとって周知であり、本出願人により先の特許出願ＦＲ９８／１００８４またはＷＯ-Ａ-９５／０８０００又はＣｈｅｖａｌｉｅｒ等（文献５９）の論文を参照することができる。
使用する標識の種類に応じて、当業者は、標識を視覚化することを可能にする試薬を添加する。
【００６０】
上記の通りイムノアッセイの例として、ＥＬＩＳＡ，ＩＲＭＡ及びＲＩＡのような「サンドイッチ」法、「競合」法、及び免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング及びドットブロッティングのような直接免疫検出法を挙げることができる。
また、質量分析法が、体液において、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを検出するために使用されてもよい。スペクトロメトリーの原理は、当業者に広く知られており、例えばＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ（文献６０）に記載されている。
これを行うため、生物試料（前処理されていても、いなくでもよい）は質量分析計に通され、得られたスペクトルは本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのそれと比較される。試料の前処理の例は、それを本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのための結合パートナーのうちの一つ、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに向かう抗体、を含む免疫捕捉支持体の上に通すことを含む。試料の前処理の他の例は、試料のタンパク質類を互いに分離するための、生物試料の前分画であってもよい。当業者によく知られている技術において、試料中の優勢なタンパク質は、例えば、まず第一に除去されてもよい。
【００６１】
最近の技術進歩によって、ＭＲＭ（多重の反応モニタリング）モードで操作しているトリプル四重極アナライザーを使用して実施されるタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用して、複雑な生物学的媒体中のタンパク質を定量化することが可能になった。この操作モードはダブル選択性（２つのアナライザー、親イオン選択及び生成物イオン選択）を有し、検出感度は他の走査モードと比較して改良されている。
このアプローチの技術的な実現可能性は、非常に大量のタンパク質の免疫除去後、血漿中濃度が１００ｎｇ／ｍｌのほどオーダーのタンパク質を検出することに成功したＡｎｄｅｒｓｏｎ及びＨｕｎｔｅｒ（文献６１）によって、最近証明された。
生物試料において、興味がある「ｍＲＮＡ」腫瘍マーカーの存在の決定は、試料中のｍＲＮＡの存在を決定する任意の方法、すなわちｍＲＮＡの直接的検出またはｍＲＮＡの間接的検出、または試料中のｍＲＮＡの存在を決定する任意の方法であって当業者に知られている方法によって、実施されてもよい。
「ｍＲＮＡの直接的検出」なる表現は、生物試料においてｍＲＮＡ自体を証明することを意味することを目的とする。
生物試料のｍＲＮＡの直接的検出は、例えば好ましくはＰＣＲまたはＮＡＳＢＡ技術によって増幅後、ｍＲＮＡに特異的な結合パートナーとのハイブリダイゼーションによって、当業者に知られている任意手段によって実施されてもよい。
【００６２】
「ハイブリダイゼーション」なる表現は、適切な条件下で、２つのヌクレオチド断片が安定且つ特異的な水素結合により互いに結合し、それにより二本鎖複合体を形成することを意図する。これらの水素結合は、相補的塩基アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（またはウラシル（Ｕ））（Ａ−Ｔ結合と呼ばれる）との間に、または相補的塩基グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）（Ｇ−Ｃ結合と呼ばれる）との間に形成される。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは、完全なものでもよい（従って、リファレンスは相補的ヌクレオチド断片または配列である）、すなわちこのハイブリダイゼーションで得られた二本鎖複合体はＡ−Ｔ結合とＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは部分的あってもよく（従って、リファレンスは十分に相補的ヌクレオチド断片または配列である）、すなわち、得られた二本鎖複合体は、二本鎖複合体の形成を可能にするＡ−Ｔ結合とＣ−Ｇ結合だけでなく、相補的な塩基に結合しない塩基もまた含む。２つのヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、使用する操作条件、特にストリンジェンシーに依存する。
ストリンジェンシーは、２つのヌクレオチド断片の塩基組成の観点から、加えて２つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって、特に定められる。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質と濃度及び／又はハイブリダイゼーション温度のような反応パラメーターに依存する。全てのこれらのデータは知られており、当業者は適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズすることが求められるヌクレオチド断片の長さに応じて、約０．５から１Ｍの濃度の食塩水中で、約２０と７０℃との間、特に３５と６５℃との間にある。ｍＲＮＡに特異的であるかまたは特異的でない結合パートナーは、このｍＲＮＡに結合できる任意のパートナーである。例えば、核酸プローブ、増幅プライマー及びこのｍＲＮＡに結合できる他の任意の分子を挙げることが出来る。
【００６３】
「ハイブリダイゼーション・プローブ」なる表現は、５から１００の核酸単位、特に１０から３５の核酸単位を含み、所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有し、それにより興味の標的遺伝子に特異的な物質とハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド断片を意味することを目的とする。ハイブリダイゼーション・プローブは、その検出を可能にするマーカーを含んでもよい。
【００６４】
本発明の目的において、「増幅プライマー」なる用語は、５から１００核酸単位、好ましくは１５から３０核酸単位を含むヌクレオチド断片であって、酵素ポリメリゼーション、特に酵素増幅反応の開始を可能するものを意味することを目的とする。「酵素増幅反応」なる用語は、少なくとも一つの酵素の作用によってヌクレオチド断片の多数のコピーを生成する方法を意味することを目的とする。
この増幅反応は当業者にとって周知であり、以下の技術を特に挙げることができる：
−ＵＳ特許第４６８３１９５号、ＵＳ４６８３２０２、及びＵＳ４８００１５９に記載されている、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
−特許出願ＷＯ９１／０２８１８の、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づいた増幅）、及び
−ＵＳ特許第５３９９４９１号の、ＴＭＡ（転写媒介増幅）。
【００６５】
「検出」なる用語は、物理的方法又はＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、エチジウムブロマイドのようなインターカレーター色素による化学的方法、又はマーカーによる検出方法を意味すると目的とする。多数の検出方法が、核酸の検出用に存在する（文献６２）。適切な標識は上記の通りある。本発明の目的では、ハイブリダイゼーションプローブは、いわゆる「検出」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「検出」プローブは、上記の標識で標識される。この標識の存在のおかげで、所与の検出プローブと検出される転写産物との間のハイブリダイゼーション反応の存在が検出できる。
【００６６】
検出プローブは、特に「分子ビーコン」検出プローブであってもよい（文献６３）。これらの「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの間、蛍光性になる。それらは、ステム・ループ構造を有しており、フルオロフォアとクエンチャー基を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列との結合によって、ステムの巻き戻しと、適切な波長での励起において蛍光シグナルの放出が生じる。
【００６７】
また、ハイブリダイゼーションプローブは、更に「捕捉」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「捕捉」プローブは、適切な手段で、すなわち直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着によって、固体支持体上に固定されるか又は固定可能である。固体支持体は当業者に知られており、合成物質または天然物質、ラテックス、磁性粒子、金属誘導体、ゲル類などを挙げることができる。固体支持体は、微量滴定プレート、特許出願ＷＯ-Ａ-９４／１２６７０に記載されているようなメンブレン、または粒子の形態であってもよい。また、複数の異なる捕捉プローブが支持体に固定されてもよく、各々の捕捉プローブは１つの標的転写産物に特異的である。
特に、多数のプローブを固定することができるバイオチップを、支持体として使用してもよい。支持体へのプローブの固定もまた当業者に知られており、直接移動、マイクロ蒸着、インサイツ合成及びフォトリソグラフィーによるプローブの配置を挙げることができる。
生物試料において、興味がある腫瘍マーカーをコードする遺伝子における、ＤＮＡ修飾又は変異の証明は、試料中におけるＤＮＡ修正を決定する任意の方法、すなわち突然変異の直接的検出、又は興味のある遺伝子座のメチル化プロフィールの修正の証明、又は試料中のＤＮＡ修正を決定するための、当業者に知られている他の任意の方法によって実施されてもよい。
【００６８】
突然変異は、１つのヌクレオチドの他のものとの点置換、一つ以上のヌクレオチドの欠失、及び一つ以上のヌクレオチドの挿入を含んでもよい。突然変異は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような５’及び３’非コード部分に位置していてもよい。
突然変異を証明するためのストラテジーは、分子生物学的技術に基づいており、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ又は他の増幅技術による増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはシークエンシング工程を含む。結腸直腸癌の場合、以下の方法は、糞便ＤＮＡの突然変異を検出するために成功裏に使用される：沈殿によるＤＮＡ濃縮、磁気ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した標的の濃縮、興味がある遺伝子のＰＣＲ増幅、点突然変異を同定するための固相シークエンシング（文献６４）。欠失は、予想される基準断片と変異した断片のサイズの違いに関して同定された。Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ等（文献６４）は、Ｋ-ｒａｓ、ＡＰＣとｐ５３遺伝子に位置する２１突然変異のパネルを記載しており、それは浸潤性の癌の１６／３１を検出することを可能にする。
【００６９】
使用された他のＤＮＡマーカーはＢＡＴ-２６欠失であり、それはマイクロサテライトの不安定性と長いＤＮＡ（Ｌ-ＤＮＡ）と呼ばれる高度に増幅可能なＤＮＡのためのマーカーであり、それは特異的なマーカーでないが、結腸の内腔に剥脱した腫瘍細胞の無秩序なアポトーシスを反映するように見える（文献６５）。これらのマーカーは、感受性に関して又は特異性に関して、十分でない。
前述のように、ＤＮＡ修正は、また、興味がある腫瘍マーカーに対応する遺伝子のメチル化プロフィールの修飾に相当してもよい。メチル化プロフィールの修飾は、低メチル化（メチル化の数が減少する）にまたはハイパー・メチル化（メチル化の数が増加する）に相当してもよい。修正された部分は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような５’及び３’非コード部分に位置していてもよい。
【００７０】
ＤＮＡメチル化の解析は、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）、亜硫酸水素塩シークエンシング、ＰＣＲと組合わせたメチル化感受性制限酵素による消化、ＣＯＢＲＡ（混合性亜硫酸水素塩切断解析）及びＭｓ-ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）のような質的なおよび／または定量的なＰＣＲに基づいた技術を使用して実施されてもよい。全てのこれらの技術は、方法論の論文（文献６６）に、比較的詳細に概説されている。
【００７１】
文献において、いくつかのハイパーメチル化された遺伝子が、結腸直腸癌の場合に報告されている。例えば、ＡＬＸ４（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス-４）遺伝子（文献５６）、ＴＰＥＦ／ＨＨＰ１（膜貫通タンパク質を含む上皮増殖因子とホリスタチンドメイン）遺伝子のプロモーター領域（文献６７）または他にセプチン-９遺伝子（文献６８）を挙げることができる。
本発明の方法において、少なくとも２つのマーカーを検出する場合、それらは、例えば異なるイムノアッセイ測定を使用して別々に、あるいはマルチプレックスアッセイにおいて同時に証明されてもよい。
本発明の方法において、異なる性質の２つのマーカー、例えばタンパク質マーカー及びｍＲＮＡマーカーが検出される場合、上記の方法から選択される２つの異なる検出方法が使用されてもよい。特許出願ＷＯ０３／１０４４９０に記載したように、それらは同じ検出媒質で、同じ反応条件下で、同時に検出されてもよい。この特許出願に記載されている検出方法の工程は、少なくとも１つの核酸および少なくとも１つの異なる性質の他のリガンドからなる標的分析物を含む試料中のハイブリダイゼーションと免疫反応を同時に検出することを含んでなり：
（ｉ）反応バッファーで希釈された試料の既知の体積量を、前記標的分析物についての捕捉パートナーであって、少なくとも一つの核酸プローブ及び少なくとも１つの抗リガンドを含む前記捕捉パートナーでプレコートした捕捉表面上に置くこと、
（ｉｉ）１５℃と６０℃との間の温度で反応させること、および
（ｉｉｉ）このようにして得られたハイブリダイゼーションと免疫反応を明視化することを含む。
生物試料は、特別な処理を必要としてもよい。なぜなら、それは、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを含んでいるか、あるいは本発明の方法で求められるマーカーを含む循環腫瘍細胞および／または本発明の方法で求められるマーカーを分泌することができる循環腫瘍細胞を含んでいる可能性があるためである。
したがって、本発明のある実施形態によれば、生物試料は、前記液体に含まれる循環腫瘍細胞を分離するために前処理される。
「循環腫瘍細胞を分離する」なる表現は、循環腫瘍細胞が濃縮された細胞分画を得ることを意味することを目的とする。
循環腫瘍細胞を分離するための生物試料の処理は、フロー・サイトメーターの細胞選別によって、フィコール上の濃縮によって、特異的抗体で覆われた磁気ビーズによる濃縮によって、または当業者に知られている特異的な濃縮法の任意の方法によって実行されうる。
【００７２】
生物試料としての血液の場合、循環腫瘍細胞は、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ、ノルウェー）に結合する抗-ＣＤ４５抗体を使用した血球の除去と組合わせたフィコール上の細胞分離の技術によって分離されることができる。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、次にサイトスピンによってスライド上に循環腫瘍細胞を付着させた後に、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに対する抗体により、これらの細胞の免疫細胞化学的な標識化することによって、生物試料から分離される循環腫瘍細胞を使用して直接的に行うことができる。本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、また、Ｍｅｔｅｚｅａｕ等（文献６９）に記載されているフローサイトメトリー法を使用して、循環腫瘍細胞において、直接的に実施されてもよい。
これらの条件下では、前記循環細胞は、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを前記細胞内部で遮断することを可能にする条件で処理されることができる。このような処理は、Ｍａｔｈｉｅｕ等（文献７０）によって記載されている。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、本発明の方法で求められるマーカーのための結合パートナー特異的な侵入を可能にするために細胞膜を透過可能にようにした後に行われる。
【００７３】
また、本発明の方法で使用する腫瘍マーカーの直接的検出は、循環細胞に基づいており、ＥＬＩＳＰＯＴ法によって、例えば出願人による特許出願ＷＯ０３／０７６９４２に記載されている方法によって、実行できる。この方法は生物試料の循環腫瘍細胞を検出および／または定量する方法であり、それは一つ以上の腫瘍マーカーの放出又はインビトロでの分泌を可能にする方法であって：
（ｉ）前記細胞の量を前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの結合性パートナーが取り付けられた培養表面の底に置くこと、
（ｉｉ）前記腫瘍マーカーが放出又は分泌されるような条件下で前記細胞を培養し、培養表面の底に免疫的に捕捉すること、
（ｉｉｉ）洗浄によって細胞を取り除くこと、
（ｉｖ）前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの標識されたコンジュゲートを加えること、および
（ｖ）このように得られた標識を明視化すること
を含む。
【００７４】
また、腫瘍細胞における本発明の方法で使用する腫瘍マーカーの直接的な検出は、本発明の方法で使用する腫瘍マーカーを分泌するような条件下で、それらを培養した後に、前記細胞の培地において実行されることができる。
腫瘍マーカーの放出または発現のための培養条件は、３７℃、湿潤雰囲気下及び５％ＣＯ２のような通常の条件である。
また、生物試料が固体試料である場合、腫瘍マーカーの存在は、腫瘍のインビボ、インサイツで証明されてもよい。
インビボの腫瘍において腫瘍マーカーの存在を示すために、当業者に知られている任意のイメージング方法が使用されてもよい。このために、前記腫瘍マーカーの結合パートナーは、イメージング・トレーサーに結合されてもよい。
「結合パートナーをイメージング・トレーサーに結合させる」なる用語は、当業者に知られている任意のイメージング方法によって検出され、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができるトレーサーの付加を意味することを目的とする。したがって、トレーサーは、テクネチウム-９９のような放射性トレーサーであってもよい。この場合、原発癌または転移癌を有する器官は、腫瘍マーカーとそのトレーサーを結合する。器官によって放出される放射線は、特別なカメラ（例えばガンマ線カメラ）で撮影されうる。計測器は、放射性物質によって生成されるシンチレーションを収集して、これにより器官を視覚化することを可能にする。
本発明の他の方法において、トレーサーは、ポジトロンを放出する放射性物質（フッ素１８）を含んでもよい。画像は、それからポジトロンエミッショントモグラフィーシステムによって得られる。
【００７５】
本発明の他の好適な方法において、腫瘍マーカーのパートナーは、ナノパーティクルに結合することができる。例えば、それらは、超磁性体ナノパーティクルであってもよい；例えば、直接的細胞標識化に用いられるアニオン性磁気ナノパーティクルとＮＭＲ映像法によるインビボ検出である。それらは、金のナノパーティクルであってもよい。
インビボで腫瘍マーカーの検出を可能にする本発明の方法によって、腫瘍マーカー、癌、特に結腸直腸癌を生じている腫瘍マーカーに結合パートナーの結合があった体の部位、更にはそれらの遠隔転移癌と関連しているリンパ節の局在は、視覚化されることができる。
癌細胞だけがアミノアシラーゼ１を分泌し、この産生は癌の悪性度に依存するので、本発明の方法が早期診断だけでなく、結腸直腸癌に関するスクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断のためにも用いられることができる。それは本発明の別の課題を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
本発明は、より非限定的具体例として提供される以下の実施例によって、更には付属の図１から２１によって、より明らかに理解される：
【図１】図１は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＬＥＩのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図２】図２は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、エズリンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図３】図３は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、アミノアシラーゼ１のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図４】図４は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｌ-ＦＡＢＰのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図５】図５は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｉ-ＦＡＢＰのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｐｇ／ｍｌ）。
【図６】図６は、マイクロプレートＥＬＩＳＡ（図６Ａ）、またはＬｉｎｃｏｐｌｅｘキット（図６Ｂ）による、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、アポリポタンパク質ＡＩのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（μｇ／ｍｌ）。
【図７】図７は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、アポリポタンパク質ＡＩＩの、Ｌｉｎｃｏマルチプレックス・キットを用いたアッセイに関するグラフである（μｇ／ｍｌ）。
【図８】図８は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｉ-プラスチンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＦＲＶ：相対的蛍光値）。
【図９】図９は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、β２-マイクログロブリンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１０】図１０は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＣＥＡのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１１】図１１は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＣＡ１９-９のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（Ｕ／ｍｌ）。
【図１２】図１２は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、テストステロンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１３】図１３は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｅ-カドヘリンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１４】図１４は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＰＡＰ１のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１５】図１５は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ガレクチン-３のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＲＦＶ）。
【図１６】図１６は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＬＤＨのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１７】図１７は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、プロテアソーム２０ＳのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１８】図１８は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の糞便における、アミノアシラーゼ１のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１９】図１９は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の糞便における、ガレクチン-３のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＲＦＶ）。
【図２０】図２０は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の糞便における、プロテアソーム２０ＳのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＲＦＶ）。
【図２１】図２１は、ＬＥＩ、エズリン、及びガレクチン-３についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、Ｃａｃｏ-２、ＨＴ-２９及びＨＴ２９-Ｂ６株の１０６の癌細胞ごとのスポット数で表わしたグラフである。
【００７７】
実施例１：腫瘍マーカーをコードしている遺伝子のクローニング及び組換えタンパク質の発現
１． ｃＤＮＡ増幅とクローニング
ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）なしに、Ｃａｃｏ-２結腸直腸癌株を、２ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地中で培養した（全てギブコ）。
ＬＥＩ、Ｌ-ＦＡＢＰ及びＧａｌ-３遺伝子のクローニングの場合、メッセンジャーＲＮＡを、インビトロゲンＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．４５-００１９）を使用して、１０８のＣａｃｏ-２細胞のペレットから、製造業者によって供給されたプロトコルに従って抽出した。逆転写とＰＣＲ工程は、プラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用しているスーパースクリプトＩＩＩ ワンステップＲＴ-ＰＣＲシステム・キット（インビトロゲン Ｃａｔ．Ｎｏ．１２５７４-０１８）で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、４５０ｎｇのＣａｃｏ-２ ｍＲＮＡを使用する一工程で実施した。遺伝子増幅のために使用するＰＣＲプライマーを、表１に示す。
表１
得られたＤＮＡ断片は、Ｂｓｍ ＢＩ及びＸｂａＩで消化後、ＴＡクローニング・キット（インビトロゲンＣａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５２０-０１）のベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（ＬＥＩ及びＧａｌ-３）又はＯｒｉｇｅｎｅ社のベクターｐＣＭＶ６-ＸＬ４（Ｌ-ＦＡＢＰ）にクローニングした。プラスミドは、ｃＤＮＡが実際に期待される配列に合うことを確認するために配列決定された。
アミノアシラーゼ１をコードする遺伝子のクローニングの場合は、キアゲンのＲＮＡ Ｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、１０８のＣａｃｏ-２細胞のペレットから抽出した。逆転写は、スーパースクリプトＩＩ酵素（インビトロゲン）で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、１０ｎｇのＣａｃｏ-２ ＲＮＡを使用して実施した。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）である。
この反応由来のｃＤＮＡは、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘキット（インビトロゲン Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３４４-０２４）を使用して、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＰＣＲプライマーは、次の通りであるＡＣＹ-１ Ｆｗｄ２（配列番号７：５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＴＣＧ−３’）および、ＡＣＹ-１ Ｒｅｖ（配列番号８：５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＣ−３’）。
これらの条件下では、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニング・キット・タイプのクローニングベクターにクローニングされた１．３ｋｂの断片を増幅することが可能である（インビトロゲン Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２８２０-２０）。このプラスミドは、ｃＤＮＡが実際に期待される配列にあっていることを確認するために配列決定された。
Ｉ-ＦＡＢＰ翻訳領域を含む以下のＤＮＡ断片（配列番号９）を、Ｇｅｎｅａｒｔ社によって実施された化学合成によって得た。
配列番号９：
ＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＣＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＣＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣ．
【００７８】
２． 発現ベクター構築
ＬＥＩおよびガレクチン-３をコードする遺伝子は原核生物の発現ベクターｐＭＲ７８（文献７１）にサブクローニングし、Ｌ-ＦＡＢＰ遺伝子はベクターｐＥＴ３ｄ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。クローニングのために必要な制限サイトは、テンプレートとして、プラスミドｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ-ＬＥＩ、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ-Ｇａｌ-３およびｐＣＭＶ６-ＬＦＡＢＰを使用して導入された。ＰＣＲ酵素はプロメガＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲ反応は製造業者の指示により、表２に示されるプライマーで実施した。
表２
ＬＥＩまたはガレクチン-３をコードする翻訳領域を含むＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した。断片は、同じ酵素（プラスミドｐＭＲ-ＬＥＩおよびｐＭＲ-Ｇａｌ-３）によって制限されたベクターｐＭＲ７８に導入された。ベクターｐＭＲ７８はタンパク質が発現されるフレームで６-ヒスチジン配列を含み、それは金属キレート・アフィニティークロマトグラフィーによって精製されることができる。Ｌ-ＦＡＢＰ ＰＣＲ産物は、ベクターｐＥＴ３ｄに、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトで、クローニングした。
アミノアシラーゼ１の場合、ＴＯＰＯクローニングベクターはａｃｙ１翻訳領域を含む１．３ｋｂ断片をつくるためにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって直接消化され、ベクターｐＳｔａｂｙ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に導入された。組換えプラスミドは、ｐＳｔａｂｙ１-ＡＣＹと呼ばれている。
Ｉ-ＦＡＢＰの場合、Ｇｅｎｅａｒｔ社によって提供されるクローニングベクターはコード配列を含むほぼ４００ｂｐの断片を生成するためにＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素によって消化され、それはベクターｐＭＲＣＨ７９（ビオメリューのベクターｐＭＲ７８に由来する）に導入された。組換えプラスミドは、ｐＭＲＣＨ-ＩＦＡＢＰと呼ばれている。
ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）と融合されたエズリンおよびＩ-プラスチンをそれぞれ発現することができるプラスミドｐＧＥＸ-エズリンおよびｐＧＥＸ-Ｉ-プラスチンはキュリー研究所から提供された。
【００７９】
３． 組換えタンパク質発現および精製
組換え腫瘍マーカーを産生するための発現プラスミドは、大腸菌ＢＬ２１バクテリアと派生株（ストラタジーン）に導入される。培養は、振盪により周囲温度で実行される。各々のタンパク質のための正確な培養条件を表３に示す。ＩＰＴＧは、イソプロピル-β-Ｄ-１-チオガラクトシダーゼである。
バクテリアのペレットは、２×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーに溶解され、１．５ｋｂａｒで、細胞分離器にかけた（コンスタントシステム）。溶菌液は、３０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離される。上澄は可溶性タンパク質を含む。ペレットは、封入体を含む。封入体を可溶化するためのバッファーは、タンパク質によって決まる。
ＬＥＩの場合、精製は、５ｍＬのＮｉ-ＮＴＡ-セファロース樹脂（キアゲン）を含むカラムにより、可溶性分画を使用して実行され、タンパク質は４５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５）を含む２×ＰＢＳによって溶出した。
ガレクチン-３の場合、封入体は１Ｍの尿素を含む２×ＰＢＳに溶解されて、５ｍＬのＮｉ-ＮＴＡ-セファロース樹脂（キアゲン）に通され、Ｇａｌ-３タンパク質は４５０ｍＭのイミダゾールと１Ｍの尿素を含む２×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）によって溶出した。
Ｌ-ＦＡＢＰの場合、精製は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ-ＮａｇｅｌのＮｉ-ＩＤＡキットで、可溶性分画を使用して実行される。
表３
ＧＳＴ-エズリンの場合、精製は、ＧＳＴアフィニティークロマトグラフィーによって、８Ｍの尿素と１０ｍＭのＤＴＴを含む１００ｍＭのトリスバッファーに溶解された封入体を使用して実行される。５ｍｌのグルタチオン・セファロース４ファストフローゲル（アマシャム）を含むカラムが用いられる。平衡化と洗浄バッファーは、０．０５％トゥイーン２０含有２ｘＰＢＳである。溶出バッファーは、２０ｍＭの還元グルタチオン（ｐＨ８）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌである。
アミノアシラーゼ１の場合、培養の可溶性分画はアマシャムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラムに通され、ＡＣＹ-１タンパク質は０．３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）によって溶出した。いくつかの他のタンパク質がこれらの条件下で共に溶出されたので、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、アマシャム）における精製を行った。ＡＣＹ-１タンパク質は、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）によって溶出した。
組換えＧＳＴ-Ｉ-プラスチン・タンパク質は、精製された形態でキュリー研究所によって提供された。組換えカルレティキュリン・タンパク質は、工業用プロテウスサービス社（ディジョン、フランス）から提供された。カルレティキュリンをコードしている配列は、化学合成によって得られた。
【００８０】
実施例２：腫瘍マーカーに向かうモノクローナル抗体の産生
１． 動物モデル
免疫化実験は、最初の免疫化時に６〜８週であった雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ-２ｄ）マウスで行った。
２． 免疫原および免疫化
マウスで得られた免疫反応を増強して、モノクローナル抗体を生成することを可能にするために、腫瘍マーカーは実施例１に記載されている手順に従って、組換えタンパク質の形態で産生された。ＬＤＨタンパク質は、ＳｃｉＰａｃ社（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３-１３３）から得られた。これらのタンパク質は、良好な免疫原性の能力を有することが知られている油中水型乳剤の形で調製されたフロイントアジュバント（シグマ）と、同体積により混合された。３匹のマウスは、各々の腫瘍マーカーで免疫化された。マウスは、１０μｇの免疫原を、０、２および４週に３回連続して投与された。全ての注射は、皮下に行われた。最初の注射は完全フロイントアジュバントとの混合物として与えられ、次の２回は不完全フロインドアジュバントとの混合物として与えられる。最初の注射後Ｄ５０とＤ７０との間に、１００μｇの組換えタンパク質の静注によって、体液性応答は再刺激された。
【００８１】
３． 体液性応答の出現のモニタリング
抗体の出現を監視するために、血液サンプルは定期的にマウスから採取される。抗腫瘍マーカー抗体の存在は、ＥＬＩＳＡを使用して試験される。興味があるタンパク質が、捕捉（１μｇ／ウェル）のために用いられる；飽和の後に、抗原は、テスト血清のさまざまな希釈物と反応させられる（３７℃で１時間のインキュベーション）。血清に存在する特異的抗体は、アルカリホスファターゼ（Ｈ＋Ｌ、ジャクソンイムノリサーチ、Ｃａｔ ｎｏ．１１５-０５５-１４６）にコンジュゲートされており、求める抗体と結合するＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって検出される（０．１μｇ／ウェル）。
【００８２】
４． モノクローナル抗体の産生
最後の注射の３日後に、各腫瘍マーカーごとに、免疫マウスのうちの１匹を解剖した。血液および脾臓が取り出された。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（文献７２、７３）によって記載されたプロトコルに従って、脾臓から得られた脾細胞は、バラバラにされ、不死化するために、Ｓｐ２／０-Ａｇ１４ミエローマ細胞によって培養された。
１２−１４日のインキュベーション期間の後に、得られたハイブリドーマの上澄は、この実施例のポイント３に記載されたＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗-腫瘍マーカー抗体の存在を決定するためにスクリーニングされた。免疫原としてＧＳＴ融合タンパクが使われた場合、ＧＳＴに向かうクローンは、捕捉のために、連結していないＧＳＴを有するＥＬＩＳＡスクリーニングを実行することによって除去される。陽性のハイブリドーマ・コロニーは、当業者にとって周知である限界希釈法技術に従って、二回サブクローンをつくった。
【００８３】
５．イムノブロッティングによるモノクローナル抗体の特徴づけ
さまざまな腫瘍マーカーに対して得られたモノクローナル抗体のリストを表４に示す。これらのモノクローナル抗体は、ウェスタン・ブロット法によって分析された。
表４
【００８４】
５．１． 方法論
Ｃａｃｏ-２およびＨＴ-２９株の細胞培養抽出物は、８．３Ｍの尿素と２Ｍのチオ尿素と４％の３-［（３-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-１-プロパンスルホナート （ＣＨＡＰＳ）と１００ｍＭのＤＴＴと２％のセルバライト ４-９（Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルク、ドイツ）と０．１ｇ／ｌのオレンジＧの水溶液の６００μｌで直接溶解し、次にＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル試料調整プロトコル（インビトロゲン）に従って処理した。
組織の抽出物を得るために、患者ＧＨＢＤ００１、ＧＨＢＤ００４およびＣＬＳＰ１０９の腫瘍と粘膜生検をメスで切り出し、次に２．５ｍＭのＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビター（錠剤、ロシュ）を含む１ｍｌのＰＢＳバッファーで５０-μｍ Ｍｅｄｉｃｏｎｓを使用するＭｅｄｉｍａｃｈｉｎｅシステム（ベクトン・ディキンソン）において、１０サイクルの抽出にかけた。これらの細胞懸濁液の１０ｍｌをプールし、２５ｍｌにし、次に６００ｇで１５分間遠心分離した。上澄が、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル試料調整プロトコルに従って処理された組織抽出物に該当する。最終全タンパク質濃度０．４ｍｇ／ｍｌに濃縮された試料が使用される。デポジット体積は、ＭＯＰＳ泳動バッファーのＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘビス‐トリス４−１２％ゲル上にウェルごとに２０μｌである。泳動（２００Ｖ、１時間）およびＰＶＤＦ膜（４００ｍＡ、４５分間）上への移動後、移動の質はアミドブラックによる染色法によって評価される。
膜は、１時間の周囲温度で、ＴＮＴ（１５ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．５％トゥイーン２０、ｐＨ８）の溶液において５％脱脂乳（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）で飽和する。飽和後、膜は、飽和溶液で１０μｇ／ｍｌに希釈されたさまざまなテスト抗体で１時間インキュベートされる。ＴＮＴでリンスした後、膜は、飽和溶液で１：５０００まで希釈された抗-マウス-西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｃａｔ Ｎｏ．１１５-０３５-０６２，ジャクソンイムノリサーチ）のコンジュゲートと共に、周囲温度で１時間インキュベートされる。リンス後、発現は、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄキット（Ｃａｔ Ｎｏ．３４０７６，Ｐｉｅｒｃｅ）により、使用に推奨された情報に従って実施する。
膜上の化学発光シグナルは、Ｂｉｏｒａｄ社のＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステムによって測定された。ウエスタンブロットのイメージに基づいて、さまざまな腫瘍マーカーに該当するバンドの体積は、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェア（バイオラド）によって数値を求められた。体積は、バンドの表面積によって増大する化学発光シグナルの強度に該当する。
【００８５】
５．２． 結果
ウェスタンブロッティング結果は表５に示す。それは、試験されるさまざまな試料に関して、ウェスタン・ブロット解析における、興味がある腫瘍マーカーに対応するバンドの体積を与える。これらの結果は、試験される腫瘍マーカーがＣａｃｏ-２およびＨＴ-２９大腸癌株で実際に発現していること、および患者から得られた腫瘍および粘膜の抽出物で示されるように組織においても実際に発現していることを示す。試料上の抗体によって得られたシグナルの強度は、他の試料および同じ抗体によって得られたシグナルと比較することができる。使用する技術は、組織（非遠隔試料）中のマーカーの有無、およびマーカーについての抗体の特異性を確認することを可能にする。この技術は、遠隔試料のこの実施例においては使用されなかった。
遠隔試料中の腫瘍マーカーの有無に関して結論を出すことができず、また前記腫瘍マーカーの濃度が前記試料において増減するかどうかについても決定できないためである。さらに、使用する実験スキームは、１つの抗体の反応性をもう一方と比較することを可能にするものではない。
表５
【００８６】
５．３． Ｉ-プラスチンに対するモノクローナル抗体
患者ＧＨＢＤ００４において、８Ｃ８Ｃ５抗体は、Ｉ-プラスチンに相当するバンドを光らせないか、又は非常に弱く光らせた。これらの試料のＩ-プラスチンの存在は、例えば、ブロッティングのＩ-プラスチンに対してより良い親和性を有する８Ｇ２Ｄ２抗体を使用して証明されてもよい。
Ｉ-プラスチンが７０％以上の相同性を有する２つの他のイソフォーム（Ｌ-プラスチンとＴ-プラスチン）を含むタンパク質のファミリーのメンバーであるので、ＧＳＴ-プラスチン-ＬとＧＳＴ-プラスチン-Ｔタンパク質（キュリー研究所によって提供された）に関するそれらの反応性について、得られたモノクローナル抗体の全てのクローンを試験した。このスクリーニング終了後、ファミリーの他のメンバーと交差反応性を何ら呈しないクローン３Ｄ１１Ｄ１０、８Ｃ８Ｃ５、３Ａ３Ｈ２および８Ｇ２Ｄ２を選択した。これらの抗体は、Ｉ-プラスチン・イソフォームに実際に特異的である。
【００８７】
実施例３：腫瘍マーカーのための血清分析
１． 患者および標本
血液サンプルは、２つのＨｕｒｉｅｔ法規約の背景において、フランスに分布する８つの臨床センターのネットワークから収集される。血清を得るために、血液サンプルは、乾燥管に採取される。血漿を得るために、血液サンプルは、ＥＤＴＡ管に採取される。凝固の後、管は１０００ｇで１０分間遠心分離され、血清が除去され、等分されて、−８０℃で保存される。血漿の管は、１０００ｇで１０分間直接遠心分離され、血漿は除去され、等分され、−８０℃で保存される。試料は、患者の病歴について完全に文書化される。
【００８８】
２． ＬＥＩ腫瘍マーカーのための血清分析
ＬＥＩタンパク質は、実施例２に記載された抗体およびＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析された。これを行うために、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートの記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の変更を加えて使用した：
１．コーンは、１０μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体１０Ｅ１Ｈ１と感作させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈された、ビオチン結合検出用抗体２１Ｂ１０Ａ５の３００μｌに置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（５０μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）に１／２０まで前もって希釈した後に、あるいはそのまま、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置及びＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【００８９】
標準曲線は、組換えタンパク質の形態の腫瘍マーカーの濃度の範囲を分析することによって定められた。標準曲線は、ｙ軸に沿ってＶｉｄａｓ（登録商標）によって読みとられるシグナル（ＲＦＶまたは相対蛍光値）及びｘ軸に沿って腫瘍マーカーの濃度を記録することによってプロットされた。分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）によって読み取られたＲＦＶシグナルに対応する濃度を記録することによって算出した。
分析された患者で得られた量は、図１に報告される。この図において、ステージＩＶの結腸大腸癌を有する患者の３つの血清及びステージＩＩＩの結腸大腸癌を有する患者の１つの血清は、血清ＬＥＩの量においてはっきりした増加を示す。
【００９０】
３． エズリン腫瘍マーカーのための血清分析
エズリン・タンパク質は、実施例２に記載された抗体及びＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用したＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析した。これを行うため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構築された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートに記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の変更を加えて使用した：
１．コーンは、３０μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体４Ａ９Ｈ５と反応させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈された３００μｌの検出用抗体４Ａ７Ａ６Ｃ１に置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（５０μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を１００サイクル行うＶｉｄａｓ自動化装置及びＶｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応の前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【００９１】
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関するパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。
分析された患者で得られた量は、図２に報告されている。この図において、ステージＩＶの結腸大腸癌を有する患者の３つの血清は、血清エズリンの量においてはっきりした増加を示すことに注目されたい。
【００９２】
４． アミノアシラーゼ１腫瘍マーカーのための血清分析
アミノアシラーゼ１タンパク質は、実施例２に記載されている抗体及びＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用したＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析された。これを行うため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構築された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートに記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の修飾を加えて使用した：
１．コーンは、２０μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体２Ａ７Ｆ６と反応させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈された３００μｌの検出用抗体１１Ｈ７Ｄ９に置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（１００μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４． ＥＬＩＳＡ反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を１００サイクル行うＶｉｄａｓ自動化装置及びＶｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応の前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【００９３】
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関するパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。
表６
表６の続き
分析された患者で得られた値は、図３に報告する。この図において、ステージＩＩの結腸大腸癌を有する患者の１つの血清、ステージＩＩＩの結腸大腸癌を有する患者の１つの血清、及びステージＩＶの結腸大腸癌を有する患者の２つの結成は血清アミノアシラーゼ１の量がはっきりと増加していることに注目されたい。
【００９４】
５． Ｌ-ＦＡＢＰ腫瘍マーカーのための血清分析
我々は、ヒトＬ-ＦＡＢＰタンパク質を分析するために、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＫ４０４）を使用した。このキットは、肝臓の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のＬ-ＦＡＢＰタンパク質を定量化することを可能にする。我々は、製造業者によって推奨される手順に従ったが、２つの変更を加えた：インキュベーションは周囲温度でなく、３７℃で実施し、血清は分析の前に１／１０に希釈した。Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図４に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する１４１人中の４１人の患者は１７ｎｇ／ｍｌを超える血清Ｌ-ＦＡＢＰ濃度を有するが、対照群ではこの値を上回る個体はなかった。これらの４１人の患者は、ステージＩの結腸直腸癌をもつ８人、ステージＩＩの結腸直腸癌を有する８人、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する１３人およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する１２人の患者である。１４１人の結腸直腸癌患者で観察される平均血清Ｌ-ＦＡＢＰ濃度は、１６．６±１．３ｎｇ／ｍｌであった。１１２人の正常な個体（ネガティブ・コントロール）の平均値は、６．６±０．２ｎｇ／ｍｌである。この違いは、統計学的に有意である（Ｐ＜０．０００１、不等分散のためのウェルチの修正による片側ｔ検定）。
【００９５】
６． Ｉ-ＦＡＢＰ腫瘍マーカーのための血清分析
我々は、ヒトＩ-ＦＡＢＰタンパク質を分析するために、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＫ４０６）を使用した。このキットは、小腸の虚血性の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のＩ-ＦＡＢＰタンパク質を定量化することを可能にする。製造業者によって推奨される手順に従った。Ｉ-ＦＡＢＰタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図５に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する４０人中の１５人の患者は４０ｐｇ／ｍｌを超える血清Ｉ-ＦＡＢＰ濃度を有するが、対照群ではこの値を上回たのは２４個体中２個体だけだった。より明らかには、ステージＩの結腸直腸癌を有する患者の３つの血清、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の２つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清が、１００ｐｇ／ｍｌを超える血清Ｉ-ＦＡＢＰ濃度を有する。この値より上の濃度は、ＣＲＣ−対照群では見られなかった。
【００９６】
７． アポリポタンパクＡＩ腫瘍マーカーについての血清分析
血清アポリポタンパクＡＩの分析は、２つの異なるイムノアッセイ技術によって実施された。まず、マイクロプレート・サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。９６ウェル・プレートは、抗-Ａｐｏ ＡＩモノクローナル抗体のクローン１４０４（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ４５４０４）により、ウェルにつき１μｇで被覆された。ＰＢＳ-０．０５％トゥイーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）によって３回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ中の１０％ミルクにより、３７℃で１時間飽和させた。プレートはＰＢＳ−Ｔで更に３回洗浄され、試験血清試料の１／１０００００希釈液の１００μｌ又は基準範囲の希釈の１００μｌがプレート上へ置かれて、そのプレートは３７℃で２時間インキュベートされた。基準範囲は、Ａｐｏ ＡＩタンパク質（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ５０６２０Ｈ）をＰＢＳ−Ｔ（ＢＳＡ１％）（１．６〜１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈することによって調製された。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５４５２Ｐ）に結合するポリクローナル検出抗体をウェルにつき０．１μｇ加えて、そのプレートを３７℃で２時間インキュベートした。更に３回のＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、ＯｐｔＥＩＡ基質（ＢＤ）を１００μｌ／ウェルで加えた。２０分後に、発色が起こった時に、反応を２Ｎの硫酸で停止して、４５０ｎＭの吸光度を測定した。
【００９７】
図６Ａにこの分析の結果を示す。我々は、結腸直腸癌を有する個体のＡｐｏ ＡＩの血清濃度の減少を証明した。ステージＩからＩＶのＣＲＣを有する３８個体の平均濃度は６７５±３６μｇ／ｍｌであるが、２７の正常な個体（対照）ではこれより非常に高い値である：１０４０±３９μｇ／ｍｌ。この相違は、統計学的に非常に有意である（Ｐ＜０．０００１、片側ｔ検定）。比較として、肝癌を有する１３個体では、Ａｐｏ ＡＩの平均血清濃度がサンドイッチＥＬＩＳＡ技術では１１７５±８７μｇ／ｍｌであった。従って、血清濃度の減少は、ＡＰＯ ＡＩが結腸直腸癌の特異的なマーカーであり、この減少はイムノアッセイによって証明することができることを証明した。
【００９８】
使用された第２の分析技術は、Ｌｉｎｃｏ社によって市販されているマルチプレックス・アッセイであり、それは同時に、同じ試料において、ＡＩおよびＡＩＩを含む複数のアポリポタンパク質を同時に分析することができる（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＰＯ-６２Ｋ）。製造業者によって推奨される手順を適用した。
図６Ｂは、この分析の結果を示す。ＣＲＣを有する患者のＡｐｏ ＡＩの血清濃度の減少は、この第２の技術によって確認される。ステージＩからＩＶのＣＲＣを有する３４個体のＡｐｏ ＡＩの平均濃度は７６８±３０μｇ／ｍｌであるが、正常な１７個体においてはこれより非常に高い：１１９４±５１μｇ／ｍｌ。この違いは、統計学的に非常に有意である（Ｐ＜０．０００１、片側ｔ検定）。
【００９９】
８． アポリポタンパクＡＩＩ腫瘍マーカーについての血清分析
血清アポリポタンパクＡＩＩの分析は、Ｌｉｎｃｏマルチプレックス・キットにより実施した。図７は、この分析の結果を示す。我々は、結腸直腸癌を有する個体のＡｐｏ ＡＩＩの血清濃度の減少を証明した。ステージＩからＩＶのＣＲＣを有する３４個体におけるＡｐｏ ＡＩＩの平均濃度は１７０±１１μｇ／ｍｌであるが、正常な１７個体（対照）ではこれより非常に高い２７７±１６μｇ／ｍｌ。この相違は、統計学的に非常に有意である（Ｐ＜０．０００１、片側ｔ検定）。
【０１００】
９． Ｉ-プラスチン腫瘍マーカーについての血清分析
Ｉ-プラスチン・タンパク質は、実施例２に記載の抗体およびＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用して分析された。これを行うために、ＥＬＩＳＡ分析は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートの記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の修飾を加えて使用した：
１．コーンは、１５μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体３Ｄ１１Ｄ１０と感作させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈されたビオチン結合した検出用抗体８Ｃ８Ｃ５の３００μｌに置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（１００μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置及びＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【０１０１】
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関してパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。
分析された患者で得られた量を図８に示す。試験された結腸直腸癌を有する患者の２つの血清は、血清Ｉ-プラスチン量のはっきりした増加を示す。
【０１０２】
１０． グループＢ腫瘍マーカーについての血清分析
β２-ミクログロブリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９およびテストステロン腫瘍マーカーを、出願人のアッセイキット、それぞれＶｉｄａｓ（登録商標）β２-ミクログロブリン， Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＥＡ， Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＡ１９-９ＴＭおよびＶｉｄａｓ（登録商標）テストステロンを使用して、各々のキットに特有の手順に従って分析した。
Ｅ-カドヘリン・タンパク質は、キットの手順に従ってＥ-カドヘリンＥＩＡキット（タカラ・バイオケミカルズ、東京、日本）を使用して分析された。
再生膵島由来タンパク質３αタンパク質、別名膵臓炎関連タンパク質（ＰＡＰ１）は、ＰＡＮＣＲＥＰＡＰ ＥＬＩＳＡキット（ＤｙｎａＢｉｏ、マルセーユ、フランス）を使用して、キットの手順に従って分析した。
【０１０３】
ガレクチン-３およびＬＤＨタンパク質は、実施例２に記載されている抗体を使用して分析した。プロテアソーム２０Ｓは、特許ＥＰ ０４３４６７０に記載されている抗体を使用して分析した。これを行うため、ＥＬＩＳＡ分析は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）とＶｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートに記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の修飾を加えて使用した：
１．コーンは、５から３０μｇ／ｍｌの間の濃度で、捕捉抗体と感作させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、ヤギ血清と１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファーに１μｇ／ｍｌにまで希釈された、ビオチンに結合した３００μｌの検出用抗体に置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４． ＥＬＩＳＡ反応は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置及びＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。捕捉および検出抗体と共に試料をインキュベートする工程は、１４と１００サイクルとの間である。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関してパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。さまざまな腫瘍マーカーのためのアッセイ条件を表７に記載する。
表７
【０１０４】
β２-ミクログロブリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９、テストステロン、Ｅ-カドヘリン、再生膵島由来タンパク質３α、ガレクチン-３、ＬＤＨおよびプロテアソーム２０Ｓ腫瘍マーカーによって分析された患者で得られた値を図９から１７にそれぞれ記録されている。
結腸直腸癌を有する患者の３つの血清は、血清β２-ミクログロブリンの量の増加を示す。結腸直腸癌を有する患者の１０の血清は、血清ＣＥＡの量の増加を示す。より明確には、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の７つの血清が、血清ＣＥＡ量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の９つの血清は、血清ＣＡ１９-９の量の増加を示す。より明確には、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の７つの血清が、血清ＣＡ１９-９量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の１０の血清は、血清テストステロンの量の減少を示す。より明らかには、ステージＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の２つの血清が、血清テストステロン量の下落を示す。
結腸直腸癌を有する患者の２つの血清は、血清再生膵島由来タンパク質３αの量の増加を示す。
ステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の４つの血清、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の２つの血清およびステージＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清は、血清ガレクチン-３の量の明確な増加を示す。
【０１０５】
実施例４：組合せによる腫瘍マーカーの血清分析の使用
出願人は、結腸直腸癌を有する特定の患者の血流において、腫瘍マーカーの異常に上昇した量または異常に減少した量が観察されことを実施例３で示した。驚くべきことに、血液において、２つの所与のマーカー量の増加または減少は、同じ患者において体系的に観察されない。その結果、いくつかの腫瘍マーカーの組合せは、結腸直腸癌を有すると同定される患者数を増加させることが可能である。したがって、患者Ａは一つ以上の腫瘍マーカー（グループＸ）の減少又は増加を示すが、患者ＢではグループＸの前記マーカーで正常である場合がある；この同じ患者Ｂで、一つ以上の他の腫瘍マーカー（グループＹ）は、上昇または減少する場合があり、患者ＡではグループＹの前記マーカーで正常である場合がある。出願人によって分析されるさまざまな腫瘍マーカーは、したがって、当業者によく知られているさまざまな数学的アルゴリズムによって結合されることができる。網羅的な例ではないが、具体的には、以下の方法が実施された：
１．各々の腫瘍マーカーについて、限界値が設定された。
２．結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が増加した場合、所与の患者で得られた血液の量はその限界値によって分割された。結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が減少した場合、所与の患者で得られた血液の量は逆数にされて、その限界値をかけられた。
３．「限界値によって分割された血液中の量」の比率が１より大きい場合、比率は係数（例えば１０）をかけられた。したがって得られる値は、研究される患者について、考慮中の腫瘍マーカーのための「スコア」と呼ばれた。
４．さまざまな腫瘍マーカーで得られたスコアは、各々のマーカーに特異的な係数によって重み付けされて加えられた。下記の実施例の場合、全ての重み付けの係数は１にセットした。
５．スコアの合計は加えられるスコアの総数によって分割され、こうして得られる値に「トータルスコア」という名前をつけた。
６．彼または彼女のトータルスコアが限界値スコアに比例して増加している場合、患者は結腸直腸癌を有すると診断される。
アミノアシラーゼ−１を含む２、４および８つのマーカーの選択のトータルスコアを表８に示す。
アミノアシラーゼ−１とプロテアソーム２０Ｓの腫瘍マーカーの組合せは、２２人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する９人の患者でトータルスコア「２」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−１又はプロテアソーム２０Ｓ単独の分析ではそれぞれ４人および７人の患者のみでの増加が示された。
アミノアシラーゼ１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０ＳおよびＣＡ１９−９腫瘍マーカーの組合せは、２２人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する１３人の患者でトータルスコア「４」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ又はＣＡ１９−９単独の分析ではそれぞれ４人、３人、７人および８人の患者のみでの増加が示された。
アミノアシラーゼ１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＰＡＰ、Ｅ−カドヘリンおよびＣＥＡ腫瘍マーカーの組合せは、２２人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する１８人の患者で増加したトータルスコア「８」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＰＡＰ、Ｅ−カドヘリン又はＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ４人、３人、７人、８人、６人、２人、１人及び１０人の患者のみでの増加が示された。
表８
表８のつづき
【０１０６】
実施例５：糞便腫瘍マーカーアッセイ
糞便は重さ約１ｇの破片を使用して抽出され、それは１ｇ／ｌアジ化合物を含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム・バッファー（ｐＨ７．２）の１０ｍｌに加えられる。混合物は、１分間のボルテックスで均質にされる。次に、試料を氷上で７秒間４サイクルの超音波にかける。不溶性分画は４℃で１０分間、２０００ｇで遠心分離により取り除かれる。上澄は分析されるまで−３０℃で保存される。実施例３に記載のＥＬＩＳＡアッセイが、必要に応じて、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第１ウェルのバッファーに糞便を適切に希釈した後に糞便の腫瘍マーカーを分析するために使用された。
アミノアシラーゼ１、ガレクチン-３およびプロテアソーム２０Ｓによる試験の分析定量は、それぞれ図１８から２０に表わされる。アミノアシラーゼ１、ガレクチン-３およびプロテアソーム２０Ｓの量の増加が、それぞれ結腸直腸癌を有する患者の１０、１４、および８つの糞便で観察された。
【０１０７】
実施例６：ＥＬＩＳＰＯＴ技術による腫瘍マーカーの検出
１． 細胞培養
ＬｎＣＡＰ前立腺癌株は、２ｍＭのＬ-グルタミンと１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１ｍＭピルビン酸ナトリウムと１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養される（全てギブコ）。細胞はネガティブコントロールとして使用される。
Ｃａｃｏ-２結腸大腸癌株は、ＦＣＳを含まず２ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養される（全てギブコ）。
ＨＴ-２９結腸直腸癌株は、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養される（全てギブコ）。
ＨＴ-２９／Ｂ６結腸直腸癌株は、ＦＣＳを含まず４ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養される（全てギブコ）。
細胞は、５％のＣＯ２を有するインキュベーターで３７℃に保たれる。
【０１０８】
２． ＥＬＩＳＰＯＴ技術
この手順は、タンパク質を分泌している細胞数を決定することを可能にする。ＰＶＤＦ膜（マルチスクリーンＩＰ、ミリポア）を有する９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートは、１０μｇ／ｍｌでマウス抗-腫瘍マーカー・モノクローナル抗体（捕捉抗体、ＥＬＩＳＰＯＴで使用した抗体を示す下の表９を参照されたい）で、ウェルにつき１００μｌで、滅菌ＰＢＳ中で、＋４℃で一晩、被覆する。次にプレートはＰＢＳによって洗われて、１０％ＦＣＳを含む培地で飽和する。平行して、細胞は、トリプシン処理され、計数されて、次に１０５細胞／ｍｌまで希釈した。この保存溶液のカスケード希釈として、この細胞懸濁液の２００μｌはウェルに分配された。次に、プレートは５％ＣＯ２の湿性雰囲気において３７℃で２０時間インキュベートされ、次に０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳによって洗浄した。次に残りの細胞は１０分間の氷冷水による処理によって溶解され、次にプレートは再び洗われる。検出抗体（分析される腫瘍マーカーに向かうビオチン化モノクローナル（表９））は、０．１μｇ／ウェルで加えられる（周囲温度で２時間インキュベート）。スポットは、ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ-アルカリホスファターゼ（シグマ）と基質５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル・ホスフェート／ニトロ・ブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｂｉｏｒａｄ）を加えることによって検出される。バックグラウンド・ノイズは、ＬｎＣａｐウェルで測定されるスポット数に相当し、使用した読み取り条件下では０から８スポットの間で変化する。非特異的なスポットの平均数は、特異的なシグナルから減算された。
表９
【０１０９】
３． 結果
インキュベートされた細胞１００万に対する、興味がある腫瘍マーカーを分泌しているＣａｃｏ-２、ＨＴ-２９およびＨＴ-２９／Ｂ６細胞の数を、図２１に示す。ＥＬＩＳＰＯＴ技術は、大腸癌株による腫瘍マーカーの放出または分泌を確認することを可能にする。出願人による特許出願ＷＯ０３／０７６９４２の方法に従い、この技術を使用して患者の循環腫瘍細胞について調査を実施することが可能であろう。
【０１１０】
実施例７：結腸組織を使用した腫瘍マーカーの免疫組織化学検出
１． 方法論
第１に、組織マイクロアレイ・スライドは、脱パラフィンされる。このために、それらは次の溶液バットにおいて、１０分間、連続的にインキュベートされる：メチルシクロヘキサン（２回）、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノールおよび水。次にスライドは、０．１％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで、１０分間、撹拌しながら、リンスした。抗原は、１０ｍＭのクエン酸バッファー中で、４０分間、９０℃まで加熱することによって再活性化し、次に３０分間、周囲温度まで冷却させた。内因性ペルオキシダーゼは３％のＨ２Ｏ２を含むＴＢＳ−Ｔ中でのインキュベートによって阻害される。次に、スライドは３７℃で１時間、湿潤なチャンバーにおいて、３％ＢＳＡのＴＢＳ−Ｔで飽和する。
次に、スライドは、３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔに１０μｇ／ｍｌに希釈した抗-白血球エラスターゼ・インヒビター（クローン３Ｄ９Ｃ２）、抗-エズリン（クローン５Ｇ２Ｄ１２）、抗-アミノアシラーゼ１（クローン８Ａ８Ａ１０）または抗-Ｉ-プラスチン（クローン８Ｄ６Ａ３）一次抗体と共に２時間インキュベートする。ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間３回洗浄後、スライドは、飽和溶液で１／４００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗-マウス二次抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５-０３５-００３ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に、湿潤チャンバーにおいて、３７℃で２時間インキュベートする。スライドは、ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間３回洗浄され、次にＰＢＳ中で１０分間３回洗浄する。スライドは、シグマＦａｓｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ-４１６８，シグマアルドリッチ）によって５分間、発現させる。染色は、ＰＢＳでの洗浄によって停止させる。ハリス・ヘマトキシリン（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＨＳ１６、シグマアルドリッチ）による対比染色は、３０秒間実施する。水およびＰＢＳによる洗浄後、スライドは顕微鏡下に観察のために置かれる。
免疫組織化学の標識化のために使用する抗体は、特に本出願のために、ＥＬＩＳＡでの又はウエスタンブロッティングでのそれらの反応性に独立に選択された。
【０１１１】
２． 白血球エラスターゼ・インヒビターの免疫組織化学検出
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。患者の特徴（結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴）、更には抗-白血球エラスターゼ・インヒビター抗体による免疫標識の結果を、表１０に示す。
表１０
表の結果は正常な結腸粘膜生検において、標識化されたものがないことを示す（１０の陰性）。標識は、また、腺腫においても陰性である（１／１）。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において陽性である（８／１１の患者で＋）。間質では標識されたものがない。
【０１１２】
３． エズリンの免疫組織化学検出
組織マイクロアレイ・スライドは、多数の試料をスクリーニングするために使用した。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。結腸腺癌を有する各患者について、３つの試料は腫瘍の中央から採取され、３つの試料は浸潤前面から採取され、３つの試料は正常な組織から採取された。表１１は、抗-エズリン抗体による免疫標識の結果を示す；示した標識のレベルは、分析した３つの試料についての最大強度である。
表１１
３０人の患者の試料において、２５試料は隣接した正常な組織と比較して、腫瘍（腫瘍中心または浸潤前面）においてエズリンの過剰発現を示す。
【０１１３】
４． アミノアシラーゼ１の免疫組織化学検出
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。結腸腺癌を有する各患者について、３つの試料は腫瘍中央から採取され、３つの試料は浸潤前面から採取され、３つの試料は正常な組織から採取された。表１２は、抗-アミノアシラーゼ抗体による免疫標識の結果を示す；示した標識のレベルは、分析した３つの試料についての最大強度である。
表１２
３０人の患者の試料において、２１試料は隣接した正常な組織と比較して、腫瘍（腫瘍中心または浸潤前面）においてアミノアシラーゼの過剰発現を示す。
【０１１４】
５． Ｉ-プラスチンの免疫組織化学検出
組織マイクロアレイ・スライドを、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置された結腸と直腸の組織である。患者の特徴（結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴）、更には抗-Ｉ-プラスチン抗体による免疫標識の結果を、表１３に示す。
表１３
表１３のつづき
表の結果は：
正常な結腸粘膜生検において、８試料（＋）において標識は弱く、２試料は＋＋である。また、標識は結腸腺腫（１／１）において弱い（＋）。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において強い陽性＋＋である（結腸コロイド腺癌を含めて、６／９の患者で＋＋であり、３人の患者で弱い＋）。間質では標識されたものがない；
正常な直腸粘膜生検において、標識は、非特異的に表面上皮に（３／４）および１試料で＋＋レベルで存在する。標識は、直腸腺腫で強い陽性＋＋（５／９）または弱い＋（４／９）である。さらに、標識は、直腸腺癌の上皮細胞で強い＋＋である（３／４患者において＋＋、１患者で弱い＋）。間質では標識されたものがない
ことを示す。
【０１１５】
実施例８：ＬＣ-ＭＲＭ-ＭＳ技術による腫瘍マーカーの検出
１．方法論
検出限界を数ｎｇ／ｍｌまで下げることを可能にするために、改良されたＭＲＭ-ＭＳ方法が用いられた。この方法の連続した工程は：１）大量のタンパク質の免疫除去、２）トリプシン消化、３）ペプチドのＳＰＥ（固相抽出）分画化、４）ＭＲＭ-ＭＳと組合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。
セッティングは、１０〜２５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＡＣＹ、エズリン、Ｌ-ＦＡＢＰ、ＰＤＩ又はＩ-プラスチン組換えタンパク質を、対照血清プールに加えることによって、スパイク試料上で実施された。アポリポタンパクＡ１とＡ２は、血清に天然に存在する。
免疫除去
血清中の大量のタンパク質の除去は、ビバサイエンスのＶｉｖａｐｕｒｅ抗-ＨＳＡキットを使用して実施された。あるいは、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍのＰｒｏｔｅｏｅｘｔｒａｃｔ アルブミン／ＩｇＧおよびバイオラドのＡｕｒｕｍＴＭ血清タンパク質ミニキットを使用した。製造業者の指示に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ樹脂（アマシャム・バイオサイエンス）に、除去するタンパク質に向かうモノクローナル抗体を結合させることによって、実験室で特異的樹脂を製造することもできる。
酵素消化
除去された血清試料は、３０ｍＭのジチオスレイトールを含有する６Ｍ尿素の１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ８）で、４０℃で４０分間変性され、次に４０分間、暗所、周囲温度で、５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化される。それらは水で６倍希釈され、トリプシン消化は１：３０の酵素／基質比率を使用して３７℃で一晩実施される（プロメガ）。消化は、０．５％の最終濃度でギ酸を加えることによって停止される。消化された試料は、オアシスＨＬＢ ３ｃｃ 逆相カートリッジ（６０ｍｇ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して固相抽出（ＳＰＥ）によって脱塩される。試料の適用の後、カートリッジを０．１％のギ酸１ｍｌによって洗浄し、次に溶出は０．１％のギ酸を含むメタノール／水混合液（８０／２０ ｖ／ｖ）で実施される。溶出液は減圧下で乾燥される。
ＳＰＥ分画
乾燥試料は、１ｍｌの酢酸バッファーに溶解され、酢酸バッファーとメタノールで前もって平衡化されたオアシスＭＣＸ（混合陽イオン交換）６０ｍｇ混合カートリッジ（疎水性および陽イオン交換）（Ｗａｔｅｒｓ）上にロードされる。カートリッジは、１ｍｌの酢酸バッファーと１ｍｌのメタノールによって洗浄される。興味があるペプチド（表１４）は、メタノール／酢酸バッファー混合物（５０／５０ ｖ／ｖ）の１ｍｌによって溶出される。酢酸バッファーのｐＨは、興味があるペプチドの等電点に応じて選択される。溶出液は減圧下で乾燥され、０．１％のギ酸を含むアセトニトリル／水（３／９７ ｖ／ｖ）溶液の２００μｌに溶解する。５０μｌのアリコートは、ＭＳ-ＭＳシステムに接続するＬＣに注入された。
液体クロマトグラフィーおよび質量分析法
ＬＣ-ＭＳ分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ２０００トリプル四重極、またはより感受性のよいＳｃｉｅｘ ＡＰＩ４０００Ｑｔｒａｐ（複合型トリプル四重極-イオントラップＭＳ）（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ）のどちらかの質量分析計に接続されている、バイナリーポンプとインジェクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＨＰ１１００シリーズ高圧クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）において実施された。ＬＣ分離は、３００μｌ／分の溶出流速で、Ｃ１８シンメトリーカラム（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。（溶出液Ａ＝０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ＝０．１％のギ酸アセトニトリル溶液、２５分間で５％Ｂから５０％Ｂ、次に３分間で５０％Ｂから１００％Ｂの直線濃度勾配）。ＭＳ分析は５５００Ｖ電圧で陽性イオン化法で実施され、ニードル電位として適応され、源のイオン化を可能にする。計測器照合とデータ収集は、アナリスト１．４．１ソフトウェアにより実施された。霧状ガス（空気）およびカーテン・ガス（窒素）流は、それぞれ３０と２０ｐｓｉである。ターボＶＴＭイオン源は４００℃に、補助窒素流は４０ｐｓｉに合わせる。各ペプチドで記録されたＭＲＭ遷移を表１４に示す。衝突エネルギー（ＣＥ）、デクラスタリング・ポテンシャル（ＤＰ）およびコリジョンセルエクジットポテンシャル（ＣＸＰ）は、選択されたＭＲＭ遷移について最適化される。
【０１１６】
２． 結果
各々の腫瘍マーカー（表１４のタンパク質）について、理論上のＭＲＭ遷移のリストは、ＭＩＤＡＳ（ＭＲＭ-initiated検出およびシークエンシング）ソフトウェアを使用して生成された。このリストは、８００から３０００Ｄａの質量範囲および全てのあり得るｙまたはｂ型の断片イオンの、理論上のトリプシンペプチドの全ての二重荷電あるいは三重荷電親イオンを含む。各タンパク質について、各々の可能な遷移は、最も感受性があり、最も特異的な遷移を決定するために試験された。この選択の結果を表１４に示す。ＡＱＵＡ型の重ペプチド（シグマ）、あるいは、重組換えタンパク質をアッセイ基準として使用して、複雑な生物媒質において興味がある腫瘍マーカーを絶対値で定量化することが可能である。
表１４
表１４のつづき
表１４のつづき
表１４のつづき
【０１１７】
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は癌腫学分野に関する。本発明の目的は、より具体的には、ヒト患者から採取された生物試料におけるアミノアシラーゼ１の存在を決定することによる、この患者における結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法であって、早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のため、及び結腸直腸癌に関する再発診断のための両方に使用可能な方法である。
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、主要な公衆衛生の問題である。その全世界的な発病率は、１９９６年では新規事例８７５，０００件と推定された（文献１）。男女両方を考慮して、西洋諸国において、最も頻繁に発生する癌であり、癌による最も多い死因の最初の３つに通常分類される。全てのステージを考慮に入れた５年生存率は、約６０％である。
【０００３】
早期診断だけが、治癒的治療の希望を与える。しかしながら、現時点において、早期では血清学的スクリーニングテストも特異的な診断検査もない。
【０００４】
現在ヨーロッパでは、結腸直腸癌のスクリーニングは、２つの異なったアプローチで実施されている：第１に、糞便中の血液の存在を探すことを含む臨床関連領域のテストを使用するものである（糞便潜血反応、ＦＯＢＴ、例えばＨｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）の名で市販されている）。この技術は、その臨床有用性が証明されている。５０から７４歳の間の個体では２年ごとに使用され、結腸直腸癌による死亡率を１５〜２０％減少できる（文献２）。このためには、該当する集団の半分以上がスクリーニングに定期的に参加し、陽性テストの場合には結腸鏡検査法を実行し、続いて場合により適切な治療をすることが必要である。
【０００５】
それにもかかわらず、このスクリーニング技術は、一定数の不利な条件により劣っている：
・このテストの主な欠点は、あまり良くない感受性であり、それは最もアデノーマ（前癌の形成異常病変）で顕著であり、そのサイズが大きい場合は、１０のうち１の場合で癌の進行に結果としてなる。
・また、このテストはあまり特異的でない。糞便中の血液の出現は、潰瘍性大腸炎、痔核、瘻などの非腫瘍症状に関連する可能性がある。この場合、結腸鏡検査法による検査を行わなければならないが、以下に記載されている欠点を伴う。
・最後に、Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）テストは解釈するのが困難である；従って、それらは資格のある適格なスタッフによって、専門施設で調べられなければならない。
【０００６】
また、ヒト・ヘモグロビンに特異的な免疫学的検査も記載されている（Ｆｅｃａ ＥＩＡ（登録商標）、Ｈｅｍｅ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）等）。それらは多分Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）と比較して向上しているが、基本的に同じ問題を呈する。ＩｎＳｕｒｅＴＭ（Ｅｎｔｅｒｉｘ社によって市販されている）により、ＣＲＣに苦しむ患者の８７％、及び前癌ポリープを有する患者の４７％を検出できる。それは、糞便のヒト・ヘモグロビンを、特にこの分子のグロビン部分を検出するテストである。
【０００７】
第２のスクリーニング・ストラテジーは５０歳以後に結腸鏡検査法を組織的に行うことであり、理論的には結腸直腸癌による死亡率を減少することを可能にする。しかしながら、良い健康状態の個体において、この試験の許容性は、死亡率を減少するために内視鏡検査を使用するスクリーニング方針に対してはあまりにも低い（このスクリーニング・ストラテジーを設けているヨーロッパ諸国の結腸鏡検査法の順守のレベルは、約２％である）。結腸の穿孔と出血及び死亡（１／１００００）は無視できないリスク（０．１％）であり、また公衆衛生のためにはあまりにも高価である。さらにまた、結腸鏡検査法は非常に限定的な前もった結腸調製を必要とし、それが主に低い順守を説明する。
【０００８】
イムノアッセイによって検査されうる腫瘍マーカーは、結腸直腸癌との関係において、長い間記載されてきた。それらは、特に胎児性癌抗原（ＣＥＡ）及びＣＡ１９-９である。
ＣＥＡはフォローアップのために使われている。それは、感受性と特異性が不十分であるので、結腸直腸癌のスクリーニングに、又は早期診断のために使用できない。これは、このマーカーが他の種類の癌によって及び良性病変において発現されるためである。いろいろあるけれども、ＣＥＡと他の腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９-９またはＣＡ７２-４）を組合わせることによって、特異性を失うことなしに感受性を増すことが可能である。
【０００９】
ＣＡ１９-９の生理的変異の原因はまれであるが、他の良性の症状（肝・胆道系の症状、膵臓の症状）、または悪性病状はＣＡ１９-９の増加を誘発する可能性がある。従って、また、このマーカー単独では診断のためには重要でない。それにもかかわらず、その血清濃度が腫瘍のサイズおよび転移癌の存在と相関しているので、フォローアップ治療又は再発の早期証明を可能にしうる。
【００１０】
さらに、市販の試験が提案されている：
・Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤ（Ａｍｂｒｉｌｉａによって市販されている）は、ＣＲＣのための迅速で、比較的非侵襲的スクリーニングテストである。Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）は結腸直腸の病的状態をもつ個体の直腸の粘液のプラスマローゲン（リン脂質の部分である複合脂質のクラス）を検出し、ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤは直腸の粘液のＴ抗原、複合糖類を検出する。Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤテストは試験片に直腸の粘液の塗布することを含み、陽性または陰性の結果はシッフ反応に基づく。Ａｍｂｒｉｌｉａは１７８７個体を研究して、Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔＭＤは早期ステージ結腸直腸癌の５４％のケース及び全ステージを合わせて４９％を検出することを証明した。
・ＣＯＬＡＲＩＳ（Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって市販されている）は、血液で、遺伝性非腺腫性大腸癌（ＨＮＰＣＣ症候群）をスクリーニングするためにＭＬＨ１及びＭＳＨ２遺伝子の突然変異を検出するテストである。試験の結果は３週で入手できる。Ｍｙｒｉａｄは現在利用可能な最も感受性があり及び最も特異的なシークエンシング技術を使用する。当該テストは、高価である。
・ＤＲ-７０（登録商標）（ＡＭＤＬによって市販されている）は、様々な種類の癌（肺、結腸、胸部、肝臓、胃、その他）を検査するテストである。従って、ＣＲＣに特異的でない。当該テストの原理は、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術（ＤＲ-７０抗原の分析）に基づく。検出は、酵素反応（ビオチンとストレプトアビジンに結合する抗体）によって実施される。着色した反応は、癌の存在を示す。
【００１１】
出願人は現在、驚くべきことに、癌組織のうち結腸腫瘍によって放出され、且つこれらの腫瘍に特徴的である新規な腫瘍マーカーを示した。それは腫瘍から離れた生物試料及び腫瘍自体の両方において検出できる。
したがって、本発明の第１の目的は結腸直腸癌を有することが疑われる患者から採取された生物試料、好ましくは腫瘍から離れた生物試料のアミノアシラーゼ１の存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法である。
また、本発明は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断、及び再発診断の両方のための当該方法の使用に関する。
【００１２】
本発明の方法は、従って、患者から採取された生物試料、好ましくは潜在的な腫瘍から離れた生物試料のアミノアシラーゼ１の存在を調査することにを含む簡単なテストによって、特異的に早期に結腸直腸癌を診断可能にする。これは、出願人が、以下により詳細に証明されるように、予想外に、結腸腫瘍が特異的にアミノアシラーゼ１を分泌するだけでなく、癌組織から外にそれを放出すること、及び本発明の方法が実施される生物試料中のその濃度が正常患者で決定された基準値と比較して増加することを示したためである。
【００１３】
腫瘍から離れていてもよいか又は離れていなくてもよい生物試料におけるアミノアシラーゼ１の存在の決定は、追求される病的状態に関し結論を出すことを可能にする。そのため、本発明の方法の利点の１つは、組織診断が侵襲的にとられる生検を必要とするのに対して、診断試料として潜在的腫瘍から離れた試料を使用する可能性にあり、それによって、簡単で非侵襲性の診断を可能にする。実際に、組織マーカー、例えば組織切片（免疫組織化学）における研究は、予後診断の興味はあり得るが、結腸直腸癌のスクリーニングまたは診断についての興味はない。
【００１４】
アミノアシラーゼ１マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０３１５４、別名ＥＣ３．５．１．１４、Ｎ-アシル-Ｌ-アミノ酸アミドヒドロラーゼまたはＡＣＹ-１）は、アミノアシラーゼ・ファミリーの一員である。それらは、アシル化されたアミノ酸の加水分解に触媒作用を及ぼし、それにより脂肪酸とアミノ酸を提供する酵素である（文献３）。アミノアシラーゼ酵素活性のための免疫化学的なアッセイが、Ｋ．Ｌｏｒｅｎｔｚによって１９７５年という早い時期に開発され（文献４）、さまざまな組織と血清の分析に使われた（文献５）。研究は、肝臓の病的状態の場合にアミノアシラーゼ活性の増加を示したが、大腸癌の場合にはそうではなかった。さらに、アミノアシラーゼ１遺伝子は、染色体３ｐ２１．１上に同定されている（文献６）。３ｐ２１．１領域は小細胞肺癌ではホモ接合になり、この場合アミノアシラーゼ発現は抑制されるか又は検出できない（文献７）。同様に、Ｓ．Ｂａｌａｂａｎｏｖ（文献８）は、アミノアシラーゼ発現が腎臓癌の場合、抑制されることを示した。しかしながら、アミノアシラーゼ１は結腸直腸癌に関するマーカーとして有用である可能性、特に腫瘍から離れた生物試料中で分析される可能性についてはこれまで記載されていなかった。
【００１５】
「腫瘍マーカーの存在を決定する」なる表現は、タンパク質またはそのメッセンジャーＲＮＡの存在を決定すること、またはコードまたは非コード配列の遺伝子における修飾（例えばメチル化）を検出することを意味することを目的とする。
「結腸腫瘍による放出」なる表現は、機構を問わず、腫瘍細胞自身による、又は腫瘍の進行から生じている細胞表現型の病変または変化に続く隣接非腫瘍細胞による腫瘍マーカーの能動的または受動的な分泌、放出を意味することを目的とする。
「本発明の方法が実施される生物試料」なる表現は、興味がある腫瘍マーカーを含む可能性がある任意の生物試料を意味することを目的とする。腫瘍から離れていない生物試料の例として、腫瘍、この腫瘍の生検、リンパ節または患者の転移ガンに由来する組織のような固体試料、及びこれらの固体試料から精製された細胞を挙げることができる。腫瘍から離れた生物試料の例として、全血またはその派生物（例えば、血清または血漿、尿、唾液と滲出液、骨髄と糞便）のような体液及びこれらの体液から精製された細胞を挙げることができる。血液またはその派生物、更には糞便、滲出液及びこれらの液体試料から精製された細胞が好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、アミノアシラーゼ１に加えて、必要に応じて癌組織のうち結腸腫瘍によって放出される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーで検出することによって改良されうる。このように、少なくとも２つのマーカーの組合せは、結腸直腸癌の診断のためのテストの特異性及び感受性を改良することを可能にする。
【００１７】
このように、また、本発明の他の目的は、以下の２つのグループのマーカーの存在を、単独で又は組合わせて検討して、決定することを含む：
− グループＡ：白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ-プラスチン、これらのマーカーのいくつかは本出願人によって同定された新規マーカーである、
− グループＢ：付加的な診断の興味を有するマーカー、すなわち：β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のＤＮＡ断片の検出、例えばＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス４遺伝子メチル化）またはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡ、糞便ＤＮＡ断片の特異的な修正の検出、例えば糞便ＤＮＡの特異的な変異、糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な修正、ヒト糞便のヘモグロビンの検出。
【００１８】
従って、本発明の方法は、少なくとも２つのマーカーを検出することによって改良されうる。一つはアミノアシラーゼ１であって、他方はグループＡ、すなわち、白血球エラスターゼインヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ-プラスチンから選択される他の腫瘍マーカーである。
【００１９】
「新しく記載された腫瘍マーカー」は、タンパク質またはメッセンジャーＲＮＡまたは対応する遺伝子の特異的な修飾、例えば突然変異やメチル化、を意味することを目的とする。
【００２０】
白血球エラスターゼインヒビター腫瘍マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３０７４０、別名ＬＥＩ、Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１、単球／好中球・エラスターゼインヒビター、Ｍ／ＮＥＩ又はＥＩ）は、１９９２年に配列決定された（文献９）。ＬＥＩは、ＳＤＳの作用下で解離することができない複合体の形成によって、エラスターゼ型又はキモトリプシン型の特性を有するプロテアーゼを特異的に阻害する（文献１０）。従って、ＬＥＩは、好中球によって産生された主なプロテアーゼのうち、白血球エラスターゼ、プロテイナーゼ３及びカテプシンＧの３つを阻害する：これらのプロテアーゼは、免疫系が細胞外又は貧食された基質の蛋白質分解によって生物を防御することを可能にする。しかしながら、これらのプロテアーゼが過度の場合、炎症性反応の原因となる。ＬＥＩは、従って、細胞プロテアーゼによって誘発される炎症性機能を調整及び制限する役割を有するかもしれない。一方で、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者からとられる生物試料であって、腫瘍から離れている前記試料において良好なマーカーであることを示した。
【００２１】
エズリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１５３１１、別名ｐ８１、サイトビリンまたはビリン２）は、特に腸の上皮細胞の微小絨毛において、細胞膜と細胞の細胞骨格のアクチンフィラメントとの間で結合性を提供するタンパク質である（文献１１）。Ｗ．Ｇ．Ｊｉａｎｇ及びＳ．Ｈｉｓｃｏｘ（文献１２）は、インターロイキンＩＬ-２、ＩＬ-８、ＩＬ-１０等がＨＴ２９ヒト結腸直腸癌細胞株のエズリンの発現を阻害することができることを示した。同じ著者（文献１３）は、ＨＴ１１５及びＨＲＴ１８の結腸直腸癌細胞株におけるエズリン発現の阻害は細胞間の粘着力を減少させ、細胞の可動性と侵襲性の行動を増やすことを示した。彼らは、エズリンが細胞接着分子Ｅ-カドヘリン及びβ-カテニンと相互に作用することによって、細胞／細胞及び細胞／細胞間質の粘着力を調整すると結論した。彼らは、エズリンが癌細胞の侵襲能力を制御することにおいて重要な役割を果たすかもしれないことを示唆した。さらに、Ｔ．Ｘｉａｏ等（文献１４）は、肺癌患者の血漿エズリンを定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイを用いた。しかしながら、彼らは、対照個体と比較して何ら違いを観察しなかった。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２２】
肝臓脂肪酸結合タンパク質マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７１４８、別名Ｌ-ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰＬ、Ｚ-タンパク質またはステロール輸送体タンパク質）は、９つのイソフォームを含むＦＡＢＰファミリーに属する。各々のイソフォームは、それが最初に検出された組織に従って名づけられる。これらのイソフォームは共有の機能及び類似した三次元構造を有するが、それらの配列相同性は高くない。Ｌ-ＦＡＢＰは１９８５年に配列決定された（文献１５）。それは、細胞質ゾルに豊富にあり、遊離脂肪酸に、更にビリルビンにも結合する能力を有する１５ｋＤａの小タンパク質である。いくつかの最近の研究では、Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質の発現の障害が腫瘍形成過程を誘導しうることを示すように見える。前立腺癌の場合、腫瘍組織生検におけるＬ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、正常組織よりも１０倍高かった（文献１６）。大腸癌の場合、いくつかのチームは、２次元の電気泳動法技術を用いて、正常な大腸粘膜と比較して腫瘍組織におけるＬ-ＦＡＢＰタンパク質の発現の減少を同定した（文献１７）。また、この結果は免疫組織化学技術によっても確認された。加えて、Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質は、肝臓に転移していた結腸直腸癌患者の予後の肝切除術マーカーである（文献１８）。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２３】
腸脂肪酸結合タンパク質マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１２１０４、別名Ｉ-ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ-２またはＦＡＢＰＩ）は、１９８７年に配列決定された（文献１９）。それは、細胞質ゾルに豊富にあり、遊離脂肪酸に、更にビリルビンにも結合する能力を有する１５ｋＤａの小タンパク質である。Ｉ-ＦＡＢＰタンパク質は、小腸の腸細胞で発現され、この細胞型のタンパク質含有量のほぼ２％を構成しうる。組織レベルで、十二指腸と空腸は、結腸よりかなり高いＩ-ＦＡＢＰの量を含む（空腸：４．８μｇ／ｇ、結腸：０．２５μｇ／ｇ）（文献２０）。Ｉ-ＦＡＢＰは、正常な個体の血漿試料では検出できない。一方では、特定の病理学的背景、例えば腸の虚血、クローン病または原発性胆汁性肝硬変症において、特定の個体の血漿Ｉ-ＦＡＢＰ濃度の増加を示すことが可能である（文献２０）。前立腺癌の場合、腫瘍組織生検におけるＩ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、正常組織よりも７倍高かった（文献１６）。ラットのアゾキシメタンによる結腸直腸腫瘍の誘導のモデルにおいて、癌の発病率を減らす食事（大豆タンパク質または乳漿加水分解産物）を与えた動物の場合は、Ｉ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現のレベルが２．９２から３．９７倍減少する（文献２１）。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２４】
アポリポタンパク質は、極性アミノ酸で構成されるタンパク質のファミリーであり、リポタンパク質と呼ばれている親水性の巨大分子複合体の形成によって血液中の脂質の輸送を可能にする。各々のヒト血漿アポリポタンパク質の場合、遺伝的多型および／または翻訳後修飾に由来するイソフォームがあり、血液中のその存在は特定の病的状態と関連している可能性がある（文献２２）。アポリポタンパクの血漿濃度は、ｍｇ／ｍｌのオーダーで無視できない（文献２３）。
【００２５】
アポリポタンパク質ＡＩマーカー（ＮＣＢＩ Ｎｏ．４９００９８、別名Ａｐｏ Ａ-Ｉ、Ａｐｏ ＡＩ及びＡｐｏ Ａ１）は、２４３アミノ酸、２８ｋＤａのタンパク質である。それは、肝臓及び腸によって基本的に合成される。ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ（文献２４）によって、このタンパク質は、正常な個体と比較して、結腸直腸癌で苦しんでいる患者の血清において十分に豊富でないことが示された。しかしながら、ＣＲＣを有する患者がＡｐｏ ＡＩと他のタンパク質マーカーとを組合わせることによって、正常な個体から区別されることは、この論文において特定されている。さらに、この論文は、他のチームによって実施された免疫比濁法によるＡｐｏ ＡＩの分析がＣＲＣを有する患者の血清において、このタンパク質が十分に豊富でないことを確認していないことを示している（文献２５）。一方で、Ｈａｃｈｅｍ等（文献２６）は、結腸直腸癌転移後の肝癌を有していた患者の血清のＡｐｏ ＡＩを分析した。一方で、本出願人は、驚くべきことに、ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ技術を実施することによってのみ、この減少を証明することが可能だったとＥｎｇｗｅｇｅｎ等（文献２４）によって提案されたことに反して、イムノアッセイによる分析により、結腸直腸癌を有する患者において、このタンパク質の濃度の減少が証明できることを示した。Ｚｈａｎｇ等のチームによって使用されたように、実行されるイムノアッセイによる分析が比濁法でない限り、腫瘍から離れている生物試料のイムノアッセイによってＡｐｏ ＡＩを分析することは結腸直腸癌の診断のための良好な方法である（文献２５）。
【００２６】
アポリポタンパクＡＩＩマーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０２６５２、別名ＡｐｏＡ ＩＩ、Ａｐｏ-ＡＩＩ及びＡｐｏ Ａ２）は、ジスルフィド架橋によって連結される各々７７アミノ酸の２つのポリペプチド鎖から成る１７３８０Ｄａのタンパク質である。アポリポタンパクＡＩのように、アポリポタンパクＡＩＩは、肝臓及び腸によって基本的に合成される。Ｈａｃｈｅｍ等（文献２６）は、結腸直腸癌転移後の肝癌を有していた患者の血清のＡｐｏ ＡＩＩを分析した。しかしながら、結果は有意でなく、求められる病的状態に関しては結論を出すことは可能でない。一方、本出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料が腫瘍から離れていても離れていなくても良好なマーカーであることを示した。
【００２７】
Ｉ-プラスチンマーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ１４６５１、別名腸特異的プラスチン又はプラスチン１）は、３つの代表例、Ｉ-プラスチン、Ｌ-プラスチン及びＴ-プラスチンが知られているヒトのプラスチンのファミリーに属する。一部の研究者はプラスチン類を「フィンブリン」と呼ぶが、他の研究者はフィンブリンの名をＩ-プラスチンのために残している。プラスチンは、アクチンに結合し、それにより細胞骨格（細胞の骨格）を形成するタンパク質である。それらは、真核生物進化の全体にわたって比較的よく保存されている７０ｋＤａのタンパク質である。それらは強い組織特異性を呈し、一度に一つのイソフォームのみが正常組織に存在する（文献２７）。癌に関するプラスチンの使用は特許ＵＳ-Ａ-５３６０７１５にすでに記載されており、細胞が造血性または潰瘍性、すなわち癌性であるかどうかを決定する方法を提案する。この方法は、細胞レベルのＬ-プラスチン及びＴ-プラスチンのアッセイ、より具体的にはそのｍＲＮＡのアッセイを請求する。しかしながら、これらの特性にもかかわらず、従来の研究には、血清または糞便試料を使用した結腸直腸癌の診断に関してプラスチンの重要性を評価することを実施するものはなかった。さらにまた、Ｉ-プラスチンは、潜在的癌マーカーとしてこれまで想定さえされなかった（文献２８）。一方で、出願人は、驚くべきことに、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取される生物試料であって、腫瘍から離れているか又は離れていない前記試料において、優良なマーカーであることを示した。
【００２８】
グループＡから選択される腫瘍マーカーの濃度は、考慮するマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において、正常な患者のために決定される基準値と比較して増減される。
【００２９】
本発明の方法は、また、アミノアシラーゼ１の検出と、グループＢ：β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のＤＮＡ断片の検出、例えばＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス４遺伝子メチル化）またはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡ、糞便ＤＮＡ断片の特異的な修正の検出、例えば糞便ＤＮＡの特異的な変異、糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な修正、ヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される他の一つの腫瘍マーカーの検出を組合わせることによって改良することができる。もちろん、本発明の方法は、また、同じアッセイにおいて、アミノアシラーゼ１の検出、グループＢから選択される少なくとも１つの腫瘍マーカーの検出、及びループＡから選択される少なくとも１つの腫瘍マーカーの検出を実施することができる。
【００３０】
β２-ミクログロブリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ６１７６９、別名β２-ミクログロブリン、β２Ｍ）は、大部分の核を有するヒト細胞の表面に見られる低分子量タンパク質（１１から１２ｋＤａ）である。血清β２-ミクログロブリン・レベルは癌を患っている特定の患者において増加し、この増加は特異性がないか、または腫瘍の性質、疾患のステージまたは重症度と相関する。また、有意な増加は他の疾患、例えば紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、リンパ系の悪性疾患（多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫）、特定のウイルス病（肝炎またはエイズ）において、及び血友病者患者において観察される。β２-ミクログロブリンは腎臓糸球体によってろ過されて、近位尿細管によって再吸収されるので、その血液中濃度は腎臓の病的状態の場合は変更されうる。従って、β２-ミクログロブリンの分析は、最も一般的には、腎臓の病的状態の診断ために、または獲得性の免疫不全ウイルスによる感染のフォローアップ向けである。しかしながら、このマーカーは腫瘍マーカー、特に大腸癌のものとして知られている。
【００３１】
プロテアソーム２０Ｓのマーカー（別名プロソーム）はプロテアソームの中心構造であり、それはそれ自身でユビキチン化タンパク質の細胞内の分解の役割を果たす分子複合体である（文献２９）。プロテアソームは、７つのサブユニットの４つのリングが結合した２８サブユニットで構成される７００ｋＤａの分子複合体である。ヒトにおいて、７つのαユニット（α１、α２、α３、α４、α５、α６及びα７）と１０のβユニット（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β１ｉ、β２ｉ及びβ５ｉ）が知られている。その触媒特性によって、プロテアソームは、細胞増殖、成長、調節とアポトーシスの機構において、従って癌化経路において中心的役割を果たす。ボルテゾミブ（ベルケード）によるプロテアソーム阻害は、多発性骨髄腫で認可された治療である。第二相または三相の治験は、血液癌または腫瘍のために進行中である。Ｔ．Ｌａｖａｂｒｅ-Ｂｅｒｔｒａｎｄ等（文献３０）は、プロテアソームの血清レベルが特定の病的状態、特に癌（骨髄腫、リンパ腫及び充実性腫瘍）の場合に増加する可能であることを示した。
【００３２】
ガレクチン-３マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１７９３１、別名Ｇａｌ-３、ガラクトース特異的レクチン３、ＭＡＣ-２抗原ＩｇＥ結合タンパク質、３５ｋＤａレクチン、炭水化物結合タンパク質３５、ＣＢＰ３５、ラミニン-結合タンパク質、レクチンＬ-２９、Ｌ-３１、ガラクトシド-結合タンパク質またはＧＡＬＢＰ）は、Ｎ-アセチルラクトサミン型のβ-ガラクトシド構造に結合できるレクチンである。それは、腫瘍細胞の付着、増殖、分化、脈管形成、アポトーシス、転移癌進行を含むさまざまな生物学的機能に関係する多数の機能を有するタンパク質である（文献３１）。さまざまな調査は、Ｇａｌ-３が多数の分子と複合体を形成できることを示している：ＣＥＡ、ＩｇＥ、ラミニン、ムチン、Ｍａｃ ２ＢＰ、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、フィブロネクチン等。Ｇａｌ-３の血清分析は、Ｉ．Ｉｕｒｉｓｃｉ等によって記載されている（文献３２）。Ｇａｌ-３は、Ｍａｃ-２-結合タンパク質（Ｇａｌ-３結合タンパク質）によりコートされたマイクロプレート上に捕獲されて、次に抗Ｇａｌ-３ラット抗体により明らかにされた。この研究は、胃腸癌、乳癌、肺癌、卵嚢癌、メラノーマ及び非ホジキンリンパ腫の場合、高い血清Ｇａｌ-３を示した。
【００３３】
Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７１９５、別名ＬＤＨ-Ｂ、ＬＤＨ心臓ユニット、又はＬＤＨ-Ｈ）は、ホモテトラマーの形で複合体を形成することができるタンパク質である。また、このタンパク質は、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ａ鎖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００３３８、別名ＬＤＨ-Ａ、ＬＤＨ筋肉ユニット、またはＬＤＨ-Ｍ）と、ヘテロテトラマーの形で複合体を形成することができる。四量体複合体（ＬＤＨと呼ばれている）の血清量および／または血清酵素活性は、多くの充実性腫瘍の場合、腫瘍質量に比例して血流中で増加する。その使用は、精嚢癌の追跡調査の場合、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（β-ｈＣＧ）と胎盤のアルカリ性ホスファターゼとの組合せが推奨される。ＬＤＨは、リンパ腫、白血病および結腸癌の予後診断の重要なマーカーであると考えられる（文献３３）。
【００３４】
カルレティキュリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２７７９７、別名ＣＲＰ５５、Ｃａｌｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＡＣＢＰ、ＥＲｐ６０またはｇｒｐ６０）は、多機能タンパクである。それは、小胞体の全てのモノグリコシル化タンパク質と、一時的に実質的に相互に作用することができるレクチンである。Ｄ．Ｊ．ＭｃＣｏｏｌ等は、したがって、カルレティキュリンが結腸ムチンＭＵＣ２の成熟に関係していることを示した（文献３４）。組織、糞便または体液のカルレティキュリンの分析を使用するＣＲＣの診断のための方法は、特許出願ＷＯ０３／０６５００３に記載されている。
【００３５】
再生膵島由来タンパク質３α・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０６１４１、別名ＲｅｇＩＩＩ-α、膵臓炎関連タンパク質１、またはＰＡＰ１）は、正常な膵臓においてわずかに発現されるタンパク質である。それは、膵臓炎の急性期の間及び慢性膵炎で苦しんでいる特定の患者に過剰発現する。この場合、それは、膵液に及び血流に現れる（文献３５）。Ｙ．Ｍｏｔｏｏ等（文献３６）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、その大腸癌、胃癌、肝癌または膵臓癌を有する特定の患者において、腎不全症の場合、血液中ＰＡＰ１のレベルが増加することを示した。彼らは、Ｄｙｎａｂｉｏ社（Ｌａ Ｇａｕｄｅ、フランス）によって市販されているＥＬＩＳＡアッセイ分析（ＰＡＮＣＥＰＡＰ）を使用した。
【００３６】
腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１６４２２、別名主要胃腸腫瘍関連タンパク質ＧＡ７３３-２、上皮細胞表面抗原、ＥｐＣＡＭ、上皮糖タンパク質、ＥＧＰ、腺癌関連抗原、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原、細胞表面糖タンパク質Ｔｒｏｐ-１またはＣＤ３２６抗原）が、結腸直腸癌細胞に向かう抗体によって認識されるその能力によって、１９７９年に特徴づけられた（文献３７）。上記のように、このタンパク質はさまざまな名で知られているが、最も一般的に使用されるのはＥｐＣＡＭである。それは、特定の上皮及び多くの癌の細胞の側底面表面で発現する膜貫通タンパク質である（文献３８）。１９８２年という早い時期に、Ｈｅｒｌｙｎ等（文献３９）は、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の注射が結腸直腸癌を有する患者の腫瘍成長を阻害する可能性を示した。これらの結果は、エドレコロマブと呼ばれる抗ＥｐＣＡＭ抗体に基づく抗腫瘍治療の進展に結果としてなった。本治療は、ＰａｎｏｒｅｘＴＭの名で市場に出されている。そのうえ、Ｈ．Ａｂｅ等（文献４０）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＥｐＣＡＭの可溶型（ＭＫ-１と呼ばれている）が、調べられている癌患者の１０％の血流において増加することを示した。
【００３７】
サイトケラチンは、上皮細胞の細胞骨格の中間フィラメントをつくるタンパク質の部分である。現在では、２０以上のヒト・サイトケラチンが同定されている。サイトケラチン８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０５７８７、別名サイトケラチン-８、ＣＫ８、ケラチン-８またはＫ８、１８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０５７８３、別名サイトケラチン-１８、ＣＫ１８、ケラチン-１８、またはＫ１８）及び１９（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０８７２７、別名サイトケラチン-１９、ＣＫ-１９、ケラチン-１９またはＫ１９）は、上皮細胞で最も豊富にあり、癌病理学の診断に役立つツールである（文献４１）。この臨床重要性は、アポトーシスの又は増殖段階の上皮細胞によるサイトケラチンの放出と関連がある。アポトーシスの場合、この放出は、カスパーゼのタンパク質分解活性下で出現するようにみえる可溶性断片の形態で起こる。分解されていないサイトケラチン形態は、血流において、これまで記載されていなかった。臨床的に使われる最も一般的な３つのサイトケラチンアッセイは、組織ポリペプチド抗原アッセイ（ＴＰＡ）、組織ポリペプチド特異性抗原（ＴＰＳ）アッセイ及びＣＹＦＲＡ２１-１アッセイである。ＴＰＡは、サイトケラチン８、１８及び１９を測定する広域スペクトル・テストである。ＴＰＳ及びＣＹＦＲＡ２１-１アッセイはより特異的であり、それぞれサイトケラチン１８及びサイトケラチン１９の断片を測定する。これらの３つのアッセイは、単独で又はタンパク質複合体の形態で存在してもよいサイトケラチン断片を検出する。ＴＰＡ、ＴＰＳまたはＣＹＦＲＡ２１-１が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、膵臓癌、前立腺癌及び特定ＥＮＴ癌のフォローアップ治療のために使われてきた。血液の可溶性サイトケラチン断片を分析することは、実際には再発のためのスクリーニングにおいて、又は使用される治療（放射線療法、化学療法、ホルモン治療）への反応を評価することにおいて臨床価値を有する。定期的な分析により、腫瘍質量の経過を評価することが特に可能である。可溶性血液サイトケラチンの量も、腫瘍段階及び転移癌の形成に関して予後診断の側面を有する。現在、最も一般的に使用されるサイトケラチンの血液検査法は、ＣＹＦＲＡ２１-１である。それは、肺非小細胞癌を有する患者のフォローアップに、非常に推奨される。さまざまな市販のアッセイが、ＴＰＡ（ＡＢ Ｓａｎｇｔｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．、 Ｂｙｋ-Ｒｏｌａｎｄ、その他）、ＴＰＳ（ＩＤＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、ＢＥＫＩ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、その他）及びＣＹＦＲＡ２１-１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、ＣＩＳ Ｂｉｏ-Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、その他）のために存在する。そのうえ、Ｈ．Ｋｉｍ等（文献４２）は、糞便のサイトケラチン１９（ＤｉＮｏｎＡ社）の分析は、糞便潜血アッセイと組合わせて胃腸疾患のためのスクリーニングにおいて役立つ可能性があることを示している。最後に、サイトケラチン２０（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３５９００、別名ケラチン、Ｉ型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０、ＣＫ２０、ケラチン-２０、Ｋ２０、またはＩＴタンパク質）の結腸直腸癌のマーカーとしての使用は、特許出願ＵＳ２００２／０１６０３８２に記載されている。
【００３８】
上皮カドヘリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１２８３０、別名Ｅ-カドヘリン、ウボモルリン、カドヘリン-１、ＣＡＭ１２０／８０またはＣＤ３２４抗原））は、カルシウム依存性細胞接着に介在する膜貫通タンパク質である。それは上皮細胞において特に発現し、それらの表現型を維持することに関係している。Ｅ-カドヘリンの細胞質ドメインは、それ自体が細胞骨格のアクチン・フィラメントネットワークに結合するβ-カテニンに結合する。このＥ-カドヘリン／β-カテニン結合は、上皮組織の細胞／細胞接着を安定させることにおいて不可欠な役割を果たす。従って、Ｅ-カドヘリンの減失は、細胞接着を減少させ、癌細胞の侵襲性能力を増やしうる。Ｅ-カドヘリン又はβ-カテニンの発現の減少は、特に胃腸癌に関して、腫瘍のより高い攻撃性及び脱分化に通常関連している。Ｆ．Ｒｏｃａ等（文献４３）は、したがって結腸直腸癌を有し且つＥ-カドヘリンを過小発現させている患者は、正常な発現レベルを有する患者より好ましくない予後を有することを示した。１９８３年という早い時期に、Ｄａｍｓｋｙ等（文献４４）は、Ｅ-カドヘリンの可溶型がＭＣＦ-７乳がん細胞株によって放出される可能性を示した。この可溶型は、Ｅ-カドヘリンの細胞外部分の切断に相当する。後に、Ｍ．Ｋａｔａｙａｍａ（文献４５）は、Ｅ-カドヘリンの可溶型は癌の場合に血流中に放出される可能性があることを示し、Ｃ．Ｗｉｌｌｍａｎｎｓ等（文献４６）は、血液中のＥ-カドヘリンの量の増加は結腸直腸癌の腫瘍段階と相関していることを示した。さらに、市販のキットは、タカラ・バイオケミカルズ社（東京、日本）によって提案される。
【００３９】
結腸直腸癌の診断のためのＣＥＡ（胎児性癌抗原）の分析は、Ｐ．Ｇｏｌｄ及びＳ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ（文献４７）によって１９６５年以降、提案されてきたが、血液中のこのマーカーのアッセイは比較的進行していない段階の結腸直腸癌の診断では低い感受性を有する。従って、血清ＣＥＡの分析は、特に肝臓転移癌（文献４８）のリスクを評価するために、及びフォローアップ治療のために推薦される。加えて、それは、結腸直腸癌にあまり特異的なマーカーではない；それは、多くの他の癌（肺、胸部、その他）において、実際に増加する可能性がある。一方では、糞便のＣＥＡの分析は、血清ＣＥＡの分析または糞便血の分析よりも、より感受性があって且つより特異的に見える（文献４９）。しかしながら、この分析は、普通には、まだ提唱されない。
【００４０】
反応性の抗原決定基１１１６-ＮＳ-１９-９、より一般にはＣＡ１９-９（炭水化物抗原１９．９）と呼ばれているものは、高分子量タンパク質によって担持される（文献５０）。血液中のＣＡ１９-９の分析は、ＣＥＡのそれよりも特異的である。血液のＣＡ１９-９レベルは、結腸直腸癌、膵臓癌、肝癌（胆管癌）において増加するが、非癌性の病的状態（胆管炎、その他）の場合にも増加する。ＣＥＡと組合わせたその使用は、癌の診断時に、及び病的状態のフォローアップのために推奨される。
【００４１】
Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ等（文献５１）は、血清中のＣＡ５０抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ５０抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。
【００４２】
ＣＡ７２マーカーに関しては、Ｔ．Ｌ．Ｋｌｕｇ（文献５２）は、血清のＣＡ７２抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ７２抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。
【００４３】
同様に、Ｐ．Ｋｕｕｓｅｌａ等（文献５３）は、血清中のＣＡ２４２抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ２４２抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。
【００４４】
結腸直腸癌の診断のためにテストステロンを分析することは、Ｍ．Ｈｏｌｌａｎｄ等（文献５４）によって、男性において提案された。これらの著者は、結腸直腸癌の場合は、血液テストステロンレベルの下落を示した。
【００４５】
ＴＩＭＰ-１マーカー、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ１型の組織阻害物質に関しては、特許出願ＵＳ２００７／００２０７０７は、特に体液の分析によって結腸直腸癌の診断の場合にＴＩＭＰ-１を分析することを記載する。
【００４６】
Ｆ．Ｍｏｄｅｌ等（文献５５）は、２００６年７月に、胃腸癌の国際会議において、結腸直腸癌を有する患者の血漿のセプチン-９遺伝子のメチル化型を検出することが可能だったことを示した。
【００４７】
Ｍ．Ｐ．Ｅｂｅｒｔ等（文献５６）は、ＡＬＸ４遺伝子またはａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス-４遺伝子は、対照血清においてよりも、結腸直腸癌を有する患者の血清において、より頻繁にメチル化されることを示した。限界値４１．４ｐｇ／ｍｌを使用して、彼らは、８３．３％の感受性及び７０％の特異性を得た。
ビリンは、特許出願ＦＲ２５８１４５６において、結腸直腸癌の診断のための血液マーカーとして記載された。
【００４８】
Ｃ．Ｂｉａｎｃｏ等（文献５７）は、血清のＣｒｉｐｔｏ-１の量が結腸直腸癌の場合には増加することを示した。
【００４９】
結腸直腸癌の診断のためのインテレクチン-１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＷＷＡ０、別名腸ラクトフェリン受容体、ガラクトフラノース結合性レクチン、内皮レクチンＨＬ-１またはＯｍｅｎｔｉｎ）の分析は、特許出願ＵＳ２００３／００８２５３３に記載されている。
【００５０】
結腸直腸癌のマーカーとしての、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７２３７、別名ＥＣ５．３．４．１、ＰＤＩ、プロリル４-水酸化酵素サブユニットβ、細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質またはｐ５５）の、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１３６９３、別名ＴＣＴＰ、ｐ２３、ヒスタミン放出因子、ＨＲＦまたはＦｏｒｔｉｌｉｎ）及び（プロ）デフェンシン-Ａ５（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０１５２３）の使用は、それぞれ特許出願ＥＰ１７２４５８６、ＵＳ２００３／０１７２３８８およびＵＳ２００６／０１７９４９６に記載されている。「（プロ）デフェンシン」なる用語は、前駆体、すなわち、切断前のプロデフェンシン、プロペプチド、すなわち切断後のプロデフェンシンのＮ末端部分、切断後のＣ末端部分に対応する成熟したタンパク質、すなわちデフェンシンを意味することを目的とする。
【００５１】
最後に、ヒト糞便ヘモグロビンの分析は知られており、以前記載されたように実施されてもよい。
正常な患者で決定される基準値と比較して、グループＢから選択される腫瘍マーカーの濃度は、考慮されるマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において増減される。
好ましくは、グループＢの腫瘍マーカーは、マーカー：β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される。
【００５２】
もちろん、本発明の方法は、当業者に知られている結腸直腸癌のための他のいかなるマーカーをも検出に含むことができる。
上記のように、興味がある腫瘍マーカーは、タンパク質の形態で、またはメッセンジャーＲＮＡの形態で、または対応するＤＮＡの修正（突然変異またはメチル化の修飾）によって検出される。
生物試料において、興味がある「タンパク質」腫瘍マーカーの存在の決定は、当業者に知られている試料におけるタンパク質の存在を決定する任意の方法、例えばイムノアッセイを含む生化学検査によって、または質量分析法によって行われることができる。
生化学検査は、分子相互作用、すなわち前記腫瘍マーカーと前記腫瘍マーカーに特異的あるいは非特異的な一つ以上の結合性パートナーとの間の反応を含む当該分野の当業者に知られている任意のテストであってもよい。
好ましくは、生化学検査は、当業者に知られているイムノアッセイであり、腫瘍マーカー間の免疫反応を含み、それは抗原と一つ以上の特異的な結合性パートナー、すなわち、この抗原に向かう抗体である。
【００５３】
本発明の方法で求める腫瘍マーカーに特異的な又は特異的でない結合パートナーは、これ又はこれらのマーカーに結合できる任意のパートナーである。高い特異性により又は１００％の特異性でさえも、これらのマーカーに結合できる場合、それらは特異的であると言われる。これらのマーカーへの結合の特異性が低く、他のリガンド（例えばタンパク質）に結合できる場合、それらが非特異的であると言われる。例えば、このマーカーに結合できる抗体、抗体部分、受容体と他の任意の分子をあげることができる。
【００５４】
結合パートナー抗体は、例えば、ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体である。 ポリクローナル抗体は、関心ある腫瘍マーカーによる動物の免疫化、続いて、前記動物から血清を採ること、及び特に抗体によって特異的に認識される抗原、特に前記マーカーが取り付けられたカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーにより血清成分から前記抗体を分離することによって精製された形態での所望の抗体の回収により得られる。
【００５５】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって得ることができ、その一般的原理を以下に示す。
第１に、動物（通常はマウス）は興味がある腫瘍マーカーによって免疫化され、それにより前記動物のＢリンパ球は前記抗原に対して抗体を生じることができる。続いて、これらの抗体産生リンパ球を、「不死の」ミエローマ（例えばマウス）と融合させ、それによりハイブリドーマを産生する。次に、このように得られる細胞の異種混合物を使用して、特定の抗体を産生し、際限なく増殖することができる細胞の選抜を実施する。各々のハイブリドーマは、クローンの形で繁殖し、例えばＥＬＩＳＡによって、一次元あるいは二次元のウエスタンブロットによって、免疫蛍光法によって、またはバイオセンサーによって、前記腫瘍マーカーに関する認識特性が試験されてもよいモノクローナル抗体の産生に結果としてなる。特に、上で記載されているアフィニティークロマトグラフィ技術によれば、このように選択されたモノクローナル抗体は続いて精製される。
また、モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技術によって、遺伝子工学によって得られた組換え抗体であってもよい。
【００５６】
抗白血球エラスターゼ・インヒビター抗体の例は知られおり、特にＡｂｃａｍカタログのウサギ抗-ＬＥＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４７７３１）が入手できる。抗-ＬＥＩモノクローナル抗体（クローンＥＬＡ-１）は、Ｙａｓｕｍａｔｓｕ等（文献５８）の論文に記載されている。
抗-エズリン抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-エズリン・モノクローナル抗体のクローン３Ｃ１２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４０６９）及びウサギ抗-エズリン・ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４７４１８）が入手できる。
抗-アミノアシラーゼ１抗体の例は知られており、特にＡｂｎｏｖａカタログの抗-アミノアシラーゼ１モノクローナル抗体のクローン４Ｆ１-Ｂ７（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ００００００９５-Ｍ０１）及びＡｂｃａｍカタログのチキン抗-アミノアシラーゼ１ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ２６１７３）が入手できる。
抗-肝臓脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体のクローン６Ｂ６（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ１００５９）及びウサギ抗-Ｌ-ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ７８０７）が入手できる。
抗-腸脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にＲ＆Ｄシステムカタログの抗-Ｉ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体のクローン３２３７０１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ３０７８）及びＡｂｃａｍカタログのウサギ抗-Ｉ-ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ７８０５）が入手できる。
抗-アポリポタンパク質ＡＩ抗体の例は知られており、特にＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログの抗-Ａｐｏ ＡＩモノクローナル抗体のクローン４Ａ９０（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ４５４０２Ｍ）及びヤギ抗-Ａｐｏ ＡＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５２５２Ｐ）が入手できる。
抗-アポリポタンパクＡＩＩ抗体の例は知られており、特にＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログの抗-Ａｐｏ ＡＩＩモノクローナル抗体のクローン１４０２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２２９９-３１Ｃ）及び特にＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログのヤギ抗-Ａｐｏ ＡＩＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ７４００１Ｐ）が入手できる。
抗-Ｉ-プラスチン・ポリクローナル抗体の例は知られており、特にサンタクルスバイオテクノロジーカタログにおいて入手できる。ウサギ・ポリクローナル抗体Ｈ-３００（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ-２８５３１）はＩ-プラスチン、Ｌ-プラスチン及びＴ-プラスチンと反応する。出願人はＩ-プラスチンに向かうモノクローナル抗体を開発した。
抗-β２-ミクログロブリン抗体、抗-ＣＥＡ抗体、抗-ＣＡ１９-９抗体及び抗テストステロン抗体の例が知られており、特に出願人のアッセイキット、それぞれＶｉｄａｓ（登録商標）β２-ミクログロブリン、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＥＡ、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＡ１９-９ＴＭ及びＶｉｄａｓ（登録商標）テストステロンが使用される。
抗プロテアソーム２０Ｓの抗体の例は知られており、親和性研究用製品カタログにおいて特に入手できる。
抗-ガレクチン-３抗体、抗-Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖抗体、抗-カルレティキュリン抗体、抗腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１抗体、抗-ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８抗体、抗-Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８抗体、抗-Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９抗体、抗-上皮カドヘリン抗体、抗-ビリン抗体及び抗-ＴＩＭＰ-１抗体は知られており、特にＡｂｃａｍカタログにおいて入手できる。
抗-再生膵島由来タンパク質３α抗体の例は知られており、特にＤｙｎａｂｉｏアッセイキット（Ｌａ Ｇａｕｄｅ、フランス）が使われる。
抗-ＣＡ２４２抗体、抗-ＣＡ５０抗体及び抗-ＣＡ７２-４抗体の例が知られており、特にＦｕｊｉｒｅｂｉｏカタログにおいて入手できる。
抗-インテレクチン-１抗体の例は知られており、アレクシス・バイオケミカルズ・カタログの抗-インテレクチン-１モノクローナル抗体のクローンＳａｌｙ-１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ-８０４-８５０-Ｃ１００）及びウサギ抗-インテレクチン-１ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ-２１０-９４１）が入手できる。
抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-ＰＤＩモノクローナル抗体のクローンＲＬ７７（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ５４８４）及びウサギ抗-ＰＤＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ３６７２）が入手できる。
抗-サイトケラチン２０抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログにおいて、抗-サイトケラチン２０モノクローナル抗体のクローンＫｓ２０．８（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ９６２）及びウサギ抗-サイトケラチン２０ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ３６７５６）が入手できる。
抗-ＴＣＴＰ抗体の例は知られており、特にＡｂｎｏｖａカタログにおいて、抗-ＴＣＴＰモノクローナル抗体のクローン３Ｃ７（Ｎｏ．１５７Ｈ００００７１７８-Ｍ０１）及び抗-ＴＣＴＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５７Ｈ００００７１７８-Ａ０１）が入手できる。
抗-デフェンシン-Ａ５抗体の例は知られており、特にサンタクルス生物工学カタログにおいて、抗-デフェンシン-Ａ５モノクローナル抗体のクローン８Ｃ８（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ-５３９９７）及びＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 社カタログのウサギ抗-デフェンシン-Ａ５ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤＥＦＡ５１-Ａ）が入手できる。
【００５７】
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに特異的あるいは特異的でない結合パートナーが、捕捉試薬として、検出試薬として、又は捕捉及び検出試薬として使用されてもよい。
免疫反応、すなわち腫瘍マーカー／結合性パートナー結合の視覚化は、検出（例えば直接的または間接的な方法）の任意の方法によって実施されてもよい。
直接的検出、すなわち標識の包含なしの場合、免疫反応は、例えば表面プラスモン共鳴によって、または導電性ポリマーを有する電極上のサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
間接的検出は、関心のある腫瘍マーカー自身の又は「検出試薬」結合パートナーのどちらかの標識によって実施される。後者の場合は、これは競合方法として記載されている。
「標識化」なる表現は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができる標識試薬の付加を意味することを目的とする。
【００５８】
これらの標識の非限定的なリストは、
・比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼ；
・蛍光または発光化合物、染料のような発色団；
・３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉのような放射性分子、及び
・アレクサまたはフィコシアニンのような蛍光分子
を含む。
【００５９】
また、間接的な検出システムを使用してもよく、例えば抗リガンドと反応可能なリガンドである。リガンド／抗リガンドの組合せは当業者にとって周知であり、こういう場合では、例えば、以下の組合せである：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドに相補的な配列。この場合、結合パートナーを担持するのは、リガンドである。抗リガンドは、前のパラグラフに記載されている標識試薬によって直接的に検出可能であってもよいか、あるいはそれ自体がリガンド／抗リガンドによって検出可能である。
これらの間接的な検出システムは、特定の条件下でシグナルの増幅を生じることができる。このシグナル増幅技術は当業者にとって周知であり、本出願人により先の特許出願ＦＲ９８／１００８４またはＷＯ-Ａ-９５／０８０００又はＣｈｅｖａｌｉｅｒ等（文献５９）の論文を参照することができる。
使用する標識の種類に応じて、当業者は、標識を視覚化することを可能にする試薬を添加する。
【００６０】
上記の通りイムノアッセイの例として、ＥＬＩＳＡ，ＩＲＭＡ及びＲＩＡのような「サンドイッチ」法、「競合」法、及び免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング及びドットブロッティングのような直接免疫検出法を挙げることができる。
また、質量分析法が、体液において、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを検出するために使用されてもよい。スペクトロメトリーの原理は、当業者に広く知られており、例えばＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ（文献６０）に記載されている。
これを行うため、生物試料（前処理されていても、いなくでもよい）は質量分析計に通され、得られたスペクトルは本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのそれと比較される。試料の前処理の例は、それを本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのための結合パートナーのうちの一つ、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに向かう抗体、を含む免疫捕捉支持体の上に通すことを含む。試料の前処理の他の例は、試料のタンパク質類を互いに分離するための、生物試料の前分画であってもよい。当業者によく知られている技術において、試料中の優勢なタンパク質は、例えば、まず第一に除去されてもよい。
【００６１】
最近の技術進歩によって、ＭＲＭ（多重の反応モニタリング）モードで操作しているトリプル四重極アナライザーを使用して実施されるタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用して、複雑な生物学的媒体中のタンパク質を定量化することが可能になった。この操作モードはダブル選択性（２つのアナライザー、親イオン選択及び生成物イオン選択）を有し、検出感度は他の走査モードと比較して改良されている。
このアプローチの技術的な実現可能性は、非常に大量のタンパク質の免疫除去後、血漿中濃度が１００ｎｇ／ｍｌのほどオーダーのタンパク質を検出することに成功したＡｎｄｅｒｓｏｎ及びＨｕｎｔｅｒ（文献６１）によって、最近証明された。
生物試料において、興味がある「ｍＲＮＡ」腫瘍マーカーの存在の決定は、試料中のｍＲＮＡの存在を決定する任意の方法、すなわちｍＲＮＡの直接的検出またはｍＲＮＡの間接的検出、または試料中のｍＲＮＡの存在を決定する任意の方法であって当業者に知られている方法によって、実施されてもよい。
「ｍＲＮＡの直接的検出」なる表現は、生物試料においてｍＲＮＡ自体を証明することを意味することを目的とする。
生物試料のｍＲＮＡの直接的検出は、例えば好ましくはＰＣＲまたはＮＡＳＢＡ技術によって増幅後、ｍＲＮＡに特異的な結合パートナーとのハイブリダイゼーションによって、当業者に知られている任意手段によって実施されてもよい。
【００６２】
「ハイブリダイゼーション」なる表現は、適切な条件下で、２つのヌクレオチド断片が安定且つ特異的な水素結合により互いに結合し、それにより二本鎖複合体を形成することを意図する。これらの水素結合は、相補的塩基アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（またはウラシル（Ｕ））（Ａ−Ｔ結合と呼ばれる）との間に、または相補的塩基グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）（Ｇ−Ｃ結合と呼ばれる）との間に形成される。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは、完全なものでもよい（従って、リファレンスは相補的ヌクレオチド断片または配列である）、すなわちこのハイブリダイゼーションで得られた二本鎖複合体はＡ−Ｔ結合とＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは部分的あってもよく（従って、リファレンスは十分に相補的ヌクレオチド断片または配列である）、すなわち、得られた二本鎖複合体は、二本鎖複合体の形成を可能にするＡ−Ｔ結合とＣ−Ｇ結合だけでなく、相補的な塩基に結合しない塩基もまた含む。２つのヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、使用する操作条件、特にストリンジェンシーに依存する。
ストリンジェンシーは、２つのヌクレオチド断片の塩基組成の観点から、加えて２つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって、特に定められる。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質と濃度及び／又はハイブリダイゼーション温度のような反応パラメーターに依存する。全てのこれらのデータは知られており、当業者は適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズすることが求められるヌクレオチド断片の長さに応じて、約０．５から１Ｍの濃度の食塩水中で、約２０と７０℃との間、特に３５と６５℃との間にある。ｍＲＮＡに特異的であるかまたは特異的でない結合パートナーは、このｍＲＮＡに結合できる任意のパートナーである。例えば、核酸プローブ、増幅プライマー及びこのｍＲＮＡに結合できる他の任意の分子を挙げることが出来る。
【００６３】
「ハイブリダイゼーション・プローブ」なる表現は、５から１００の核酸単位、特に１０から３５の核酸単位を含み、所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有し、それにより興味の標的遺伝子に特異的な物質とハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド断片を意味することを目的とする。ハイブリダイゼーション・プローブは、その検出を可能にするマーカーを含んでもよい。
【００６４】
本発明の目的において、「増幅プライマー」なる用語は、５から１００核酸単位、好ましくは１５から３０核酸単位を含むヌクレオチド断片であって、酵素ポリメリゼーション、特に酵素増幅反応の開始を可能するものを意味することを目的とする。「酵素増幅反応」なる用語は、少なくとも一つの酵素の作用によってヌクレオチド断片の多数のコピーを生成する方法を意味することを目的とする。
この増幅反応は当業者にとって周知であり、以下の技術を特に挙げることができる：
−ＵＳ特許第４６８３１９５号、ＵＳ４６８３２０２、及びＵＳ４８００１５９に記載されている、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
−特許出願ＷＯ９１／０２８１８の、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づいた増幅）、及び
−ＵＳ特許第５３９９４９１号の、ＴＭＡ（転写媒介増幅）。
【００６５】
「検出」なる用語は、物理的方法又はＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、エチジウムブロマイドのようなインターカレーター色素による化学的方法、又はマーカーによる検出方法を意味すると目的とする。多数の検出方法が、核酸の検出用に存在する（文献６２）。適切な標識は上記の通りある。本発明の目的では、ハイブリダイゼーションプローブは、いわゆる「検出」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「検出」プローブは、上記の標識で標識される。この標識の存在のおかげで、所与の検出プローブと検出される転写産物との間のハイブリダイゼーション反応の存在が検出できる。
【００６６】
検出プローブは、特に「分子ビーコン」検出プローブであってもよい（文献６３）。これらの「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの間、蛍光性になる。それらは、ステム・ループ構造を有しており、フルオロフォアとクエンチャー基を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列との結合によって、ステムの巻き戻しと、適切な波長での励起において蛍光シグナルの放出が生じる。
【００６７】
また、ハイブリダイゼーションプローブは、更に「捕捉」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「捕捉」プローブは、適切な手段で、すなわち直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着によって、固体支持体上に固定されるか又は固定可能である。固体支持体は当業者に知られており、合成物質または天然物質、ラテックス、磁性粒子、金属誘導体、ゲル類などを挙げることができる。固体支持体は、微量滴定プレート、特許出願ＷＯ-Ａ-９４／１２６７０に記載されているようなメンブレン、または粒子の形態であってもよい。また、複数の異なる捕捉プローブが支持体に固定されてもよく、各々の捕捉プローブは１つの標的転写産物に特異的である。
特に、多数のプローブを固定することができるバイオチップを、支持体として使用してもよい。支持体へのプローブの固定もまた当業者に知られており、直接移動、マイクロ蒸着、インサイツ合成及びフォトリソグラフィーによるプローブの配置を挙げることができる。
生物試料において、興味がある腫瘍マーカーをコードする遺伝子における、ＤＮＡ修飾又は変異の証明は、試料中におけるＤＮＡ修正を決定する任意の方法、すなわち突然変異の直接的検出、又は興味のある遺伝子座のメチル化プロフィールの修正の証明、又は試料中のＤＮＡ修正を決定するための、当業者に知られている他の任意の方法によって実施されてもよい。
【００６８】
突然変異は、１つのヌクレオチドの他のものとの点置換、一つ以上のヌクレオチドの欠失、及び一つ以上のヌクレオチドの挿入を含んでもよい。突然変異は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような５’及び３’非コード部分に位置していてもよい。
突然変異を証明するためのストラテジーは、分子生物学的技術に基づいており、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ又は他の増幅技術による増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはシークエンシング工程を含む。結腸直腸癌の場合、以下の方法は、糞便ＤＮＡの突然変異を検出するために成功裏に使用される：沈殿によるＤＮＡ濃縮、磁気ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した標的の濃縮、興味がある遺伝子のＰＣＲ増幅、点突然変異を同定するための固相シークエンシング（文献６４）。欠失は、予想される基準断片と変異した断片のサイズの違いに関して同定された。Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ等（文献６４）は、Ｋ-ｒａｓ、ＡＰＣとｐ５３遺伝子に位置する２１突然変異のパネルを記載しており、それは浸潤性の癌の１６／３１を検出することを可能にする。
【００６９】
使用された他のＤＮＡマーカーはＢＡＴ-２６欠失であり、それはマイクロサテライトの不安定性と長いＤＮＡ（Ｌ-ＤＮＡ）と呼ばれる高度に増幅可能なＤＮＡのためのマーカーであり、それは特異的なマーカーでないが、結腸の内腔に剥脱した腫瘍細胞の無秩序なアポトーシスを反映するように見える（文献６５）。これらのマーカーは、感受性に関して又は特異性に関して、十分でない。
前述のように、ＤＮＡ修正は、また、興味がある腫瘍マーカーに対応する遺伝子のメチル化プロフィールの修飾に相当してもよい。メチル化プロフィールの修飾は、低メチル化（メチル化の数が減少する）にまたはハイパー・メチル化（メチル化の数が増加する）に相当してもよい。修正された部分は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような５’及び３’非コード部分に位置していてもよい。
【００７０】
ＤＮＡメチル化の解析は、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）、亜硫酸水素塩シークエンシング、ＰＣＲと組合わせたメチル化感受性制限酵素による消化、ＣＯＢＲＡ（混合性亜硫酸水素塩切断解析）及びＭｓ-ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）のような質的なおよび／または定量的なＰＣＲに基づいた技術を使用して実施されてもよい。全てのこれらの技術は、方法論の論文（文献６６）に、比較的詳細に概説されている。
【００７１】
文献において、いくつかのハイパーメチル化された遺伝子が、結腸直腸癌の場合に報告されている。例えば、ＡＬＸ４（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス-４）遺伝子（文献５６）、ＴＰＥＦ／ＨＨＰ１（膜貫通タンパク質を含む上皮増殖因子とホリスタチンドメイン）遺伝子のプロモーター領域（文献６７）または他にセプチン-９遺伝子（文献６８）を挙げることができる。
本発明の方法において、少なくとも２つのマーカーを検出する場合、それらは、例えば異なるイムノアッセイ測定を使用して別々に、あるいはマルチプレックスアッセイにおいて同時に証明されてもよい。
本発明の方法において、異なる性質の２つのマーカー、例えばタンパク質マーカー及びｍＲＮＡマーカーが検出される場合、上記の方法から選択される２つの異なる検出方法が使用されてもよい。特許出願ＷＯ０３／１０４４９０に記載したように、それらは同じ検出媒質で、同じ反応条件下で、同時に検出されてもよい。この特許出願に記載されている検出方法の工程は、少なくとも１つの核酸および少なくとも１つの異なる性質の他のリガンドからなる標的分析物を含む試料中のハイブリダイゼーションと免疫反応を同時に検出することを含んでなり：
（ｉ）反応バッファーで希釈された試料の既知の体積量を、前記標的分析物についての捕捉パートナーであって、少なくとも一つの核酸プローブ及び少なくとも１つの抗リガンドを含む前記捕捉パートナーでプレコートした捕捉表面上に置くこと、
（ｉｉ）１５℃と６０℃との間の温度で反応させること、および
（ｉｉｉ）このようにして得られたハイブリダイゼーションと免疫反応を明視化することを含む。
生物試料は、特別な処理を必要としてもよい。なぜなら、それは、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを含んでいるか、あるいは本発明の方法で求められるマーカーを含む循環腫瘍細胞および／または本発明の方法で求められるマーカーを分泌することができる循環腫瘍細胞を含んでいる可能性があるためである。
したがって、本発明のある実施形態によれば、生物試料は、前記液体に含まれる循環腫瘍細胞を分離するために前処理される。
「循環腫瘍細胞を分離する」なる表現は、循環腫瘍細胞が濃縮された細胞分画を得ることを意味することを目的とする。
循環腫瘍細胞を分離するための生物試料の処理は、フロー・サイトメーターの細胞選別によって、フィコール上の濃縮によって、特異的抗体で覆われた磁気ビーズによる濃縮によって、または当業者に知られている特異的な濃縮法の任意の方法によって実行されうる。
【００７２】
生物試料としての血液の場合、循環腫瘍細胞は、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ、ノルウェー）に結合する抗-ＣＤ４５抗体を使用した血球の除去と組合わせたフィコール上の細胞分離の技術によって分離されることができる。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、次にサイトスピンによってスライド上に循環腫瘍細胞を付着させた後に、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに対する抗体により、これらの細胞の免疫細胞化学的な標識化することによって、生物試料から分離される循環腫瘍細胞を使用して直接的に行うことができる。本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、また、Ｍｅｔｅｚｅａｕ等（文献６９）に記載されているフローサイトメトリー法を使用して、循環腫瘍細胞において、直接的に実施されてもよい。
これらの条件下では、前記循環細胞は、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを前記細胞内部で遮断することを可能にする条件で処理されることができる。このような処理は、Ｍａｔｈｉｅｕ等（文献７０）によって記載されている。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、本発明の方法で求められるマーカーのための結合パートナー特異的な侵入を可能にするために細胞膜を透過可能にようにした後に行われる。
【００７３】
また、本発明の方法で使用する腫瘍マーカーの直接的検出は、循環細胞に基づいており、ＥＬＩＳＰＯＴ法によって、例えば出願人による特許出願ＷＯ０３／０７６９４２に記載されている方法によって、実行できる。この方法は生物試料の循環腫瘍細胞を検出および／または定量する方法であり、それは一つ以上の腫瘍マーカーの放出又はインビトロでの分泌を可能にする方法であって：
（ｉ）前記細胞の量を前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの結合性パートナーが取り付けられた培養表面の底に置くこと、
（ｉｉ）前記腫瘍マーカーが放出又は分泌されるような条件下で前記細胞を培養し、培養表面の底に免疫的に捕捉すること、
（ｉｉｉ）洗浄によって細胞を取り除くこと、
（ｉｖ）前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの標識されたコンジュゲートを加えること、および
（ｖ）このように得られた標識を明視化すること
を含む。
【００７４】
また、腫瘍細胞における本発明の方法で使用する腫瘍マーカーの直接的な検出は、本発明の方法で使用する腫瘍マーカーを分泌するような条件下で、それらを培養した後に、前記細胞の培地において実行されることができる。
腫瘍マーカーの放出または発現のための培養条件は、３７℃、湿潤雰囲気下及び５％ＣＯ２のような通常の条件である。
また、生物試料が固体試料である場合、腫瘍マーカーの存在は、腫瘍のインビボ、インサイツで証明されてもよい。
インビボの腫瘍において腫瘍マーカーの存在を示すために、当業者に知られている任意のイメージング方法が使用されてもよい。このために、前記腫瘍マーカーの結合パートナーは、イメージング・トレーサーに結合されてもよい。
「結合パートナーをイメージング・トレーサーに結合させる」なる用語は、当業者に知られている任意のイメージング方法によって検出され、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができるトレーサーの付加を意味することを目的とする。したがって、トレーサーは、テクネチウム-９９のような放射性トレーサーであってもよい。この場合、原発癌または転移癌を有する器官は、腫瘍マーカーとそのトレーサーを結合する。器官によって放出される放射線は、特別なカメラ（例えばガンマ線カメラ）で撮影されうる。計測器は、放射性物質によって生成されるシンチレーションを収集して、これにより器官を視覚化することを可能にする。
本発明の他の方法において、トレーサーは、ポジトロンを放出する放射性物質（フッ素１８）を含んでもよい。画像は、それからポジトロンエミッショントモグラフィーシステムによって得られる。
【００７５】
本発明の他の好適な方法において、腫瘍マーカーのパートナーは、ナノパーティクルに結合することができる。例えば、それらは、超磁性体ナノパーティクルであってもよい；例えば、直接的細胞標識化に用いられるアニオン性磁気ナノパーティクルとＮＭＲ映像法によるインビボ検出である。それらは、金のナノパーティクルであってもよい。
インビボで腫瘍マーカーの検出を可能にする本発明の方法によって、腫瘍マーカー、癌、特に結腸直腸癌を生じている腫瘍マーカーに結合パートナーの結合があった体の部位、更にはそれらの遠隔転移癌と関連しているリンパ節の局在は、視覚化されることができる。
癌細胞だけがアミノアシラーゼ１を分泌し、この産生は癌の悪性度に依存するので、本発明の方法が早期診断だけでなく、結腸直腸癌に関するスクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断のためにも用いられることができる。それは本発明の別の課題を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
本発明は、より非限定的具体例として提供される以下の実施例によって、更には付属の図１から２１によって、より明らかに理解される：
【図１】図１は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＬＥＩのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図２】図２は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、エズリンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図３】図３は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、アミノアシラーゼ１のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図４】図４は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｌ-ＦＡＢＰのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図５】図５は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｉ-ＦＡＢＰのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｐｇ／ｍｌ）。
【図６】図６は、マイクロプレートＥＬＩＳＡ（図６Ａ）、またはＬｉｎｃｏｐｌｅｘキット（図６Ｂ）による、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、アポリポタンパク質ＡＩのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（μｇ／ｍｌ）。
【図７】図７は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、アポリポタンパク質ＡＩＩの、Ｌｉｎｃｏマルチプレックス・キットを用いたアッセイに関するグラフである（μｇ／ｍｌ）。
【図８】図８は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｉ-プラスチンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＦＲＶ：相対的蛍光値）。
【図９】図９は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、β２-マイクログロブリンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１０】図１０は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＣＥＡのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１１】図１１は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＣＡ１９-９のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（Ｕ／ｍｌ）。
【図１２】図１２は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、テストステロンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１３】図１３は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、Ｅ-カドヘリンのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１４】図１４は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＰＡＰ１のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１５】図１５は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ガレクチン-３のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＲＦＶ）。
【図１６】図１６は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、ＬＤＨのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１７】図１７は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の血清における、プロテアソーム２０ＳのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１８】図１８は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の糞便における、アミノアシラーゼ１のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１９】図１９は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の糞便における、ガレクチン-３のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＲＦＶ）。
【図２０】図２０は、結腸直腸癌を有する患者（ＣＲＣ＋）と正常な患者（ＣＲＣ−）の糞便における、プロテアソーム２０ＳのＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである（ＲＦＶ）。
【図２１】図２１は、ＬＥＩ、エズリン、及びガレクチン-３についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、Ｃａｃｏ-２、ＨＴ-２９及びＨＴ２９-Ｂ６株の１０６の癌細胞ごとのスポット数で表わしたグラフである。
【００７７】
実施例１：腫瘍マーカーをコードしている遺伝子のクローニング及び組換えタンパク質の発現
１． ｃＤＮＡ増幅とクローニング
ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）なしに、Ｃａｃｏ-２結腸直腸癌株を、２ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地中で培養した（全てギブコ）。
ＬＥＩ、Ｌ-ＦＡＢＰ及びＧａｌ-３遺伝子のクローニングの場合、メッセンジャーＲＮＡを、インビトロゲンＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．４５-００１９）を使用して、１０８のＣａｃｏ-２細胞のペレットから、製造業者によって供給されたプロトコルに従って抽出した。逆転写とＰＣＲ工程は、プラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用しているスーパースクリプトＩＩＩ ワンステップＲＴ-ＰＣＲシステム・キット（インビトロゲン Ｃａｔ．Ｎｏ．１２５７４-０１８）で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、４５０ｎｇのＣａｃｏ-２ ｍＲＮＡを使用する一工程で実施した。遺伝子増幅のために使用するＰＣＲプライマーを、表１に示す。
表１
得られたＤＮＡ断片は、Ｂｓｍ ＢＩ及びＸｂａＩで消化後、ＴＡクローニング・キット（インビトロゲンＣａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５２０-０１）のベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（ＬＥＩ及びＧａｌ-３）又はＯｒｉｇｅｎｅ社のベクターｐＣＭＶ６-ＸＬ４（Ｌ-ＦＡＢＰ）にクローニングした。プラスミドは、ｃＤＮＡが実際に期待される配列に合うことを確認するために配列決定された。
アミノアシラーゼ１をコードする遺伝子のクローニングの場合は、キアゲンのＲＮＡ Ｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、１０８のＣａｃｏ-２細胞のペレットから抽出した。逆転写は、スーパースクリプトＩＩ酵素（インビトロゲン）で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、１０ｎｇのＣａｃｏ-２ ＲＮＡを使用して実施した。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）である。
この反応由来のｃＤＮＡは、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘキット（インビトロゲン Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３４４-０２４）を使用して、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＰＣＲプライマーは、次の通りであるＡＣＹ-１ Ｆｗｄ２（配列番号７：５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＴＣＧ−３’）および、ＡＣＹ-１ Ｒｅｖ（配列番号８：５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＣ−３’）。
これらの条件下では、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニング・キット・タイプのクローニングベクターにクローニングされた１．３ｋｂの断片を増幅することが可能である（インビトロゲン Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２８２０-２０）。このプラスミドは、ｃＤＮＡが実際に期待される配列にあっていることを確認するために配列決定された。
Ｉ-ＦＡＢＰ翻訳領域を含む以下のＤＮＡ断片（配列番号９）を、Ｇｅｎｅａｒｔ社によって実施された化学合成によって得た。
配列番号９：
ＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＣＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＣＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣ．
【００７８】
２． 発現ベクター構築
ＬＥＩおよびガレクチン-３をコードする遺伝子は原核生物の発現ベクターｐＭＲ７８（文献７１）にサブクローニングし、Ｌ-ＦＡＢＰ遺伝子はベクターｐＥＴ３ｄ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。クローニングのために必要な制限サイトは、テンプレートとして、プラスミドｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ-ＬＥＩ、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ-Ｇａｌ-３およびｐＣＭＶ６-ＬＦＡＢＰを使用して導入された。ＰＣＲ酵素はプロメガＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲ反応は製造業者の指示により、表２に示されるプライマーで実施した。
表２
ＬＥＩまたはガレクチン-３をコードする翻訳領域を含むＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した。断片は、同じ酵素（プラスミドｐＭＲ-ＬＥＩおよびｐＭＲ-Ｇａｌ-３）によって制限されたベクターｐＭＲ７８に導入された。ベクターｐＭＲ７８はタンパク質が発現されるフレームで６-ヒスチジン配列を含み、それは金属キレート・アフィニティークロマトグラフィーによって精製されることができる。Ｌ-ＦＡＢＰ ＰＣＲ産物は、ベクターｐＥＴ３ｄに、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトで、クローニングした。
アミノアシラーゼ１の場合、ＴＯＰＯクローニングベクターはａｃｙ１翻訳領域を含む１．３ｋｂ断片をつくるためにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって直接消化され、ベクターｐＳｔａｂｙ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に導入された。組換えプラスミドは、ｐＳｔａｂｙ１-ＡＣＹと呼ばれている。
Ｉ-ＦＡＢＰの場合、Ｇｅｎｅａｒｔ社によって提供されるクローニングベクターはコード配列を含むほぼ４００ｂｐの断片を生成するためにＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素によって消化され、それはベクターｐＭＲＣＨ７９（ビオメリューのベクターｐＭＲ７８に由来する）に導入された。組換えプラスミドは、ｐＭＲＣＨ-ＩＦＡＢＰと呼ばれている。
ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）と融合されたエズリンおよびＩ-プラスチンをそれぞれ発現することができるプラスミドｐＧＥＸ-エズリンおよびｐＧＥＸ-Ｉ-プラスチンはキュリー研究所から提供された。
【００７９】
３． 組換えタンパク質発現および精製
組換え腫瘍マーカーを産生するための発現プラスミドは、大腸菌ＢＬ２１バクテリアと派生株（ストラタジーン）に導入される。培養は、振盪により周囲温度で実行される。各々のタンパク質のための正確な培養条件を表３に示す。ＩＰＴＧは、イソプロピル-β-Ｄ-１-チオガラクトシダーゼである。
バクテリアのペレットは、２×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーに溶解され、１．５ｋｂａｒで、細胞分離器にかけた（コンスタントシステム）。溶菌液は、３０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離される。上澄は可溶性タンパク質を含む。ペレットは、封入体を含む。封入体を可溶化するためのバッファーは、タンパク質によって決まる。
ＬＥＩの場合、精製は、５ｍＬのＮｉ-ＮＴＡ-セファロース樹脂（キアゲン）を含むカラムにより、可溶性分画を使用して実行され、タンパク質は４５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５）を含む２×ＰＢＳによって溶出した。
ガレクチン-３の場合、封入体は１Ｍの尿素を含む２×ＰＢＳに溶解されて、５ｍＬのＮｉ-ＮＴＡ-セファロース樹脂（キアゲン）に通され、Ｇａｌ-３タンパク質は４５０ｍＭのイミダゾールと１Ｍの尿素を含む２×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）によって溶出した。
Ｌ-ＦＡＢＰの場合、精製は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ-ＮａｇｅｌのＮｉ-ＩＤＡキットで、可溶性分画を使用して実行される。
表３
ＧＳＴ-エズリンの場合、精製は、ＧＳＴアフィニティークロマトグラフィーによって、８Ｍの尿素と１０ｍＭのＤＴＴを含む１００ｍＭのトリスバッファーに溶解された封入体を使用して実行される。５ｍｌのグルタチオン・セファロース４ファストフローゲル（アマシャム）を含むカラムが用いられる。平衡化と洗浄バッファーは、０．０５％トゥイーン２０含有２ｘＰＢＳである。溶出バッファーは、２０ｍＭの還元グルタチオン（ｐＨ８）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌである。
アミノアシラーゼ１の場合、培養の可溶性分画はアマシャムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラムに通され、ＡＣＹ-１タンパク質は０．３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）によって溶出した。いくつかの他のタンパク質がこれらの条件下で共に溶出されたので、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、アマシャム）における精製を行った。ＡＣＹ-１タンパク質は、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）によって溶出した。
組換えＧＳＴ-Ｉ-プラスチン・タンパク質は、精製された形態でキュリー研究所によって提供された。組換えカルレティキュリン・タンパク質は、工業用プロテウスサービス社（ディジョン、フランス）から提供された。カルレティキュリンをコードしている配列は、化学合成によって得られた。
【００８０】
実施例２：腫瘍マーカーに向かうモノクローナル抗体の産生
１． 動物モデル
免疫化実験は、最初の免疫化時に６〜８週であった雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ-２ｄ）マウスで行った。
２． 免疫原および免疫化
マウスで得られた免疫反応を増強して、モノクローナル抗体を生成することを可能にするために、腫瘍マーカーは実施例１に記載されている手順に従って、組換えタンパク質の形態で産生された。ＬＤＨタンパク質は、ＳｃｉＰａｃ社（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３-１３３）から得られた。これらのタンパク質は、良好な免疫原性の能力を有することが知られている油中水型乳剤の形で調製されたフロイントアジュバント（シグマ）と、同体積により混合された。３匹のマウスは、各々の腫瘍マーカーで免疫化された。マウスは、１０μｇの免疫原を、０、２および４週に３回連続して投与された。全ての注射は、皮下に行われた。最初の注射は完全フロイントアジュバントとの混合物として与えられ、次の２回は不完全フロインドアジュバントとの混合物として与えられる。最初の注射後Ｄ５０とＤ７０との間に、１００μｇの組換えタンパク質の静注によって、体液性応答は再刺激された。
【００８１】
３． 体液性応答の出現のモニタリング
抗体の出現を監視するために、血液サンプルは定期的にマウスから採取される。抗腫瘍マーカー抗体の存在は、ＥＬＩＳＡを使用して試験される。興味があるタンパク質が、捕捉（１μｇ／ウェル）のために用いられる；飽和の後に、抗原は、テスト血清のさまざまな希釈物と反応させられる（３７℃で１時間のインキュベーション）。血清に存在する特異的抗体は、アルカリホスファターゼ（Ｈ＋Ｌ、ジャクソンイムノリサーチ、Ｃａｔ ｎｏ．１１５-０５５-１４６）にコンジュゲートされており、求める抗体と結合するＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって検出される（０．１μｇ／ウェル）。
【００８２】
４． モノクローナル抗体の産生
最後の注射の３日後に、各腫瘍マーカーごとに、免疫マウスのうちの１匹を解剖した。血液および脾臓が取り出された。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（文献７２、７３）によって記載されたプロトコルに従って、脾臓から得られた脾細胞は、バラバラにされ、不死化するために、Ｓｐ２／０-Ａｇ１４ミエローマ細胞によって培養された。
１２−１４日のインキュベーション期間の後に、得られたハイブリドーマの上澄は、この実施例のポイント３に記載されたＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗-腫瘍マーカー抗体の存在を決定するためにスクリーニングされた。免疫原としてＧＳＴ融合タンパクが使われた場合、ＧＳＴに向かうクローンは、捕捉のために、連結していないＧＳＴを有するＥＬＩＳＡスクリーニングを実行することによって除去される。陽性のハイブリドーマ・コロニーは、当業者にとって周知である限界希釈法技術に従って、二回サブクローンをつくった。
【００８３】
５．イムノブロッティングによるモノクローナル抗体の特徴づけ
さまざまな腫瘍マーカーに対して得られたモノクローナル抗体のリストを表４に示す。これらのモノクローナル抗体は、ウェスタン・ブロット法によって分析された。
表４
【００８４】
５．１． 方法論
Ｃａｃｏ-２およびＨＴ-２９株の細胞培養抽出物は、８．３Ｍの尿素と２Ｍのチオ尿素と４％の３-［（３-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-１-プロパンスルホナート （ＣＨＡＰＳ）と１００ｍＭのＤＴＴと２％のセルバライト ４-９（Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルク、ドイツ）と０．１ｇ／ｌのオレンジＧの水溶液の６００μｌで直接溶解し、次にＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル試料調整プロトコル（インビトロゲン）に従って処理した。
組織の抽出物を得るために、患者ＧＨＢＤ００１、ＧＨＢＤ００４およびＣＬＳＰ１０９の腫瘍と粘膜生検をメスで切り出し、次に２．５ｍＭのＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビター（錠剤、ロシュ）を含む１ｍｌのＰＢＳバッファーで５０-μｍ Ｍｅｄｉｃｏｎｓを使用するＭｅｄｉｍａｃｈｉｎｅシステム（ベクトン・ディキンソン）において、１０サイクルの抽出にかけた。これらの細胞懸濁液の１０ｍｌをプールし、２５ｍｌにし、次に６００ｇで１５分間遠心分離した。上澄が、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル試料調整プロトコルに従って処理された組織抽出物に該当する。最終全タンパク質濃度０．４ｍｇ／ｍｌに濃縮された試料が使用される。デポジット体積は、ＭＯＰＳ泳動バッファーのＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘビス‐トリス４−１２％ゲル上にウェルごとに２０μｌである。泳動（２００Ｖ、１時間）およびＰＶＤＦ膜（４００ｍＡ、４５分間）上への移動後、移動の質はアミドブラックによる染色法によって評価される。
膜は、１時間の周囲温度で、ＴＮＴ（１５ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．５％トゥイーン２０、ｐＨ８）の溶液において５％脱脂乳（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）で飽和する。飽和後、膜は、飽和溶液で１０μｇ／ｍｌに希釈されたさまざまなテスト抗体で１時間インキュベートされる。ＴＮＴでリンスした後、膜は、飽和溶液で１：５０００まで希釈された抗-マウス-西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｃａｔ Ｎｏ．１１５-０３５-０６２，ジャクソンイムノリサーチ）のコンジュゲートと共に、周囲温度で１時間インキュベートされる。リンス後、発現は、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄキット（Ｃａｔ Ｎｏ．３４０７６，Ｐｉｅｒｃｅ）により、使用に推奨された情報に従って実施する。
膜上の化学発光シグナルは、Ｂｉｏｒａｄ社のＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステムによって測定された。ウエスタンブロットのイメージに基づいて、さまざまな腫瘍マーカーに該当するバンドの体積は、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェア（バイオラド）によって数値を求められた。体積は、バンドの表面積によって増大する化学発光シグナルの強度に該当する。
【００８５】
５．２． 結果
ウェスタンブロッティング結果は表５に示す。それは、試験されるさまざまな試料に関して、ウェスタン・ブロット解析における、興味がある腫瘍マーカーに対応するバンドの体積を与える。これらの結果は、試験される腫瘍マーカーがＣａｃｏ-２およびＨＴ-２９大腸癌株で実際に発現していること、および患者から得られた腫瘍および粘膜の抽出物で示されるように組織においても実際に発現していることを示す。試料上の抗体によって得られたシグナルの強度は、他の試料および同じ抗体によって得られたシグナルと比較することができる。使用する技術は、組織（非遠隔試料）中のマーカーの有無、およびマーカーについての抗体の特異性を確認することを可能にする。この技術は、遠隔試料のこの実施例においては使用されなかった。
遠隔試料中の腫瘍マーカーの有無に関して結論を出すことができず、また前記腫瘍マーカーの濃度が前記試料において増減するかどうかについても決定できないためである。さらに、使用する実験スキームは、１つの抗体の反応性をもう一方と比較することを可能にするものではない。
表５
【００８６】
５．３． Ｉ-プラスチンに対するモノクローナル抗体
患者ＧＨＢＤ００４において、８Ｃ８Ｃ５抗体は、Ｉ-プラスチンに相当するバンドを光らせないか、又は非常に弱く光らせた。これらの試料のＩ-プラスチンの存在は、例えば、ブロッティングのＩ-プラスチンに対してより良い親和性を有する８Ｇ２Ｄ２抗体を使用して証明されてもよい。
Ｉ-プラスチンが７０％以上の相同性を有する２つの他のイソフォーム（Ｌ-プラスチンとＴ-プラスチン）を含むタンパク質のファミリーのメンバーであるので、ＧＳＴ-プラスチン-ＬとＧＳＴ-プラスチン-Ｔタンパク質（キュリー研究所によって提供された）に関するそれらの反応性について、得られたモノクローナル抗体の全てのクローンを試験した。このスクリーニング終了後、ファミリーの他のメンバーと交差反応性を何ら呈しないクローン３Ｄ１１Ｄ１０、８Ｃ８Ｃ５、３Ａ３Ｈ２および８Ｇ２Ｄ２を選択した。これらの抗体は、Ｉ-プラスチン・イソフォームに実際に特異的である。
【００８７】
実施例３：腫瘍マーカーのための血清分析
１． 患者および標本
血液サンプルは、２つのＨｕｒｉｅｔ法規約の背景において、フランスに分布する８つの臨床センターのネットワークから収集される。血清を得るために、血液サンプルは、乾燥管に採取される。血漿を得るために、血液サンプルは、ＥＤＴＡ管に採取される。凝固の後、管は１０００ｇで１０分間遠心分離され、血清が除去され、等分されて、−８０℃で保存される。血漿の管は、１０００ｇで１０分間直接遠心分離され、血漿は除去され、等分され、−８０℃で保存される。試料は、患者の病歴について完全に文書化される。
【００８８】
２． ＬＥＩ腫瘍マーカーのための血清分析
ＬＥＩタンパク質は、実施例２に記載された抗体およびＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析された。これを行うために、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートの記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の変更を加えて使用した：
１．コーンは、１０μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体１０Ｅ１Ｈ１と感作させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈された、ビオチン結合検出用抗体２１Ｂ１０Ａ５の３００μｌに置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（５０μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）に１／２０まで前もって希釈した後に、あるいはそのまま、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置及びＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【００８９】
標準曲線は、組換えタンパク質の形態の腫瘍マーカーの濃度の範囲を分析することによって定められた。標準曲線は、ｙ軸に沿ってＶｉｄａｓ（登録商標）によって読みとられるシグナル（ＲＦＶまたは相対蛍光値）及びｘ軸に沿って腫瘍マーカーの濃度を記録することによってプロットされた。分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）によって読み取られたＲＦＶシグナルに対応する濃度を記録することによって算出した。
分析された患者で得られた量は、図１に報告される。この図において、ステージＩＶの結腸大腸癌を有する患者の３つの血清及びステージＩＩＩの結腸大腸癌を有する患者の１つの血清は、血清ＬＥＩの量においてはっきりした増加を示す。
【００９０】
３． エズリン腫瘍マーカーのための血清分析
エズリン・タンパク質は、実施例２に記載された抗体及びＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用したＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析した。これを行うため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構築された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートに記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の変更を加えて使用した：
１．コーンは、３０μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体４Ａ９Ｈ５と反応させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈された３００μｌの検出用抗体４Ａ７Ａ６Ｃ１に置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（５０μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を１００サイクル行うＶｉｄａｓ自動化装置及びＶｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応の前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【００９１】
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関するパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。
分析された患者で得られた量は、図２に報告されている。この図において、ステージＩＶの結腸大腸癌を有する患者の３つの血清は、血清エズリンの量においてはっきりした増加を示すことに注目されたい。
【００９２】
４． アミノアシラーゼ１腫瘍マーカーのための血清分析
アミノアシラーゼ１タンパク質は、実施例２に記載されている抗体及びＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用したＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析された。これを行うため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構築された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートに記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の修飾を加えて使用した：
１．コーンは、２０μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体２Ａ７Ｆ６と反応させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈された３００μｌの検出用抗体１１Ｈ７Ｄ９に置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（１００μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４． ＥＬＩＳＡ反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を１００サイクル行うＶｉｄａｓ自動化装置及びＶｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応の前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【００９３】
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関するパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。
表６
表６の続き
分析された患者で得られた値は、図３に報告する。この図において、ステージＩＩの結腸大腸癌を有する患者の１つの血清、ステージＩＩＩの結腸大腸癌を有する患者の１つの血清、及びステージＩＶの結腸大腸癌を有する患者の２つの結成は血清アミノアシラーゼ１の量がはっきりと増加していることに注目されたい。
【００９４】
５． Ｌ-ＦＡＢＰ腫瘍マーカーのための血清分析
我々は、ヒトＬ-ＦＡＢＰタンパク質を分析するために、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＫ４０４）を使用した。このキットは、肝臓の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のＬ-ＦＡＢＰタンパク質を定量化することを可能にする。我々は、製造業者によって推奨される手順に従ったが、２つの変更を加えた：インキュベーションは周囲温度でなく、３７℃で実施し、血清は分析の前に１／１０に希釈した。Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図４に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する１４１人中の４１人の患者は１７ｎｇ／ｍｌを超える血清Ｌ-ＦＡＢＰ濃度を有するが、対照群ではこの値を上回る個体はなかった。これらの４１人の患者は、ステージＩの結腸直腸癌をもつ８人、ステージＩＩの結腸直腸癌を有する８人、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する１３人およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する１２人の患者である。１４１人の結腸直腸癌患者で観察される平均血清Ｌ-ＦＡＢＰ濃度は、１６．６±１．３ｎｇ／ｍｌであった。１１２人の正常な個体（ネガティブ・コントロール）の平均値は、６．６±０．２ｎｇ／ｍｌである。この違いは、統計学的に有意である（Ｐ＜０．０００１、不等分散のためのウェルチの修正による片側ｔ検定）。
【００９５】
６． Ｉ-ＦＡＢＰ腫瘍マーカーのための血清分析
我々は、ヒトＩ-ＦＡＢＰタンパク質を分析するために、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＫ４０６）を使用した。このキットは、小腸の虚血性の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のＩ-ＦＡＢＰタンパク質を定量化することを可能にする。製造業者によって推奨される手順に従った。Ｉ-ＦＡＢＰタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図５に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する４０人中の１５人の患者は４０ｐｇ／ｍｌを超える血清Ｉ-ＦＡＢＰ濃度を有するが、対照群ではこの値を上回たのは２４個体中２個体だけだった。より明らかには、ステージＩの結腸直腸癌を有する患者の３つの血清、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の２つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清が、１００ｐｇ／ｍｌを超える血清Ｉ-ＦＡＢＰ濃度を有する。この値より上の濃度は、ＣＲＣ−対照群では見られなかった。
【００９６】
７． アポリポタンパクＡＩ腫瘍マーカーについての血清分析
血清アポリポタンパクＡＩの分析は、２つの異なるイムノアッセイ技術によって実施された。まず、マイクロプレート・サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。９６ウェル・プレートは、抗-Ａｐｏ ＡＩモノクローナル抗体のクローン１４０４（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ４５４０４）により、ウェルにつき１μｇで被覆された。ＰＢＳ-０．０５％トゥイーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）によって３回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ中の１０％ミルクにより、３７℃で１時間飽和させた。プレートはＰＢＳ−Ｔで更に３回洗浄され、試験血清試料の１／１０００００希釈液の１００μｌ又は基準範囲の希釈の１００μｌがプレート上へ置かれて、そのプレートは３７℃で２時間インキュベートされた。基準範囲は、Ａｐｏ ＡＩタンパク質（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ５０６２０Ｈ）をＰＢＳ−Ｔ（ＢＳＡ１％）（１．６〜１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈することによって調製された。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５４５２Ｐ）に結合するポリクローナル検出抗体をウェルにつき０．１μｇ加えて、そのプレートを３７℃で２時間インキュベートした。更に３回のＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、ＯｐｔＥＩＡ基質（ＢＤ）を１００μｌ／ウェルで加えた。２０分後に、発色が起こった時に、反応を２Ｎの硫酸で停止して、４５０ｎＭの吸光度を測定した。
【００９７】
図６Ａにこの分析の結果を示す。我々は、結腸直腸癌を有する個体のＡｐｏ ＡＩの血清濃度の減少を証明した。ステージＩからＩＶのＣＲＣを有する３８個体の平均濃度は６７５±３６μｇ／ｍｌであるが、２７の正常な個体（対照）ではこれより非常に高い値である：１０４０±３９μｇ／ｍｌ。この相違は、統計学的に非常に有意である（Ｐ＜０．０００１、片側ｔ検定）。比較として、肝癌を有する１３個体では、Ａｐｏ ＡＩの平均血清濃度がサンドイッチＥＬＩＳＡ技術では１１７５±８７μｇ／ｍｌであった。従って、血清濃度の減少は、ＡＰＯ ＡＩが結腸直腸癌の特異的なマーカーであり、この減少はイムノアッセイによって証明することができることを証明した。
【００９８】
使用された第２の分析技術は、Ｌｉｎｃｏ社によって市販されているマルチプレックス・アッセイであり、それは同時に、同じ試料において、ＡＩおよびＡＩＩを含む複数のアポリポタンパク質を同時に分析することができる（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＰＯ-６２Ｋ）。製造業者によって推奨される手順を適用した。
図６Ｂは、この分析の結果を示す。ＣＲＣを有する患者のＡｐｏ ＡＩの血清濃度の減少は、この第２の技術によって確認される。ステージＩからＩＶのＣＲＣを有する３４個体のＡｐｏ ＡＩの平均濃度は７６８±３０μｇ／ｍｌであるが、正常な１７個体においてはこれより非常に高い：１１９４±５１μｇ／ｍｌ。この違いは、統計学的に非常に有意である（Ｐ＜０．０００１、片側ｔ検定）。
【００９９】
８． アポリポタンパクＡＩＩ腫瘍マーカーについての血清分析
血清アポリポタンパクＡＩＩの分析は、Ｌｉｎｃｏマルチプレックス・キットにより実施した。図７は、この分析の結果を示す。我々は、結腸直腸癌を有する個体のＡｐｏ ＡＩＩの血清濃度の減少を証明した。ステージＩからＩＶのＣＲＣを有する３４個体におけるＡｐｏ ＡＩＩの平均濃度は１７０±１１μｇ／ｍｌであるが、正常な１７個体（対照）ではこれより非常に高い２７７±１６μｇ／ｍｌ。この相違は、統計学的に非常に有意である（Ｐ＜０．０００１、片側ｔ検定）。
【０１００】
９． Ｉ-プラスチン腫瘍マーカーについての血清分析
Ｉ-プラスチン・タンパク質は、実施例２に記載の抗体およびＶｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）を使用して分析された。これを行うために、ＥＬＩＳＡ分析は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートの記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の修飾を加えて使用した：
１．コーンは、１５μｇ／ｍｌの濃度で、捕捉抗体３Ｄ１１Ｄ１０と感作させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清及び１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファー）で１μｇ／ｍｌにまで希釈されたビオチン結合した検出用抗体８Ｃ８Ｃ５の３００μｌに置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料（１００μｌ）は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置及びＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
【０１０１】
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関してパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。
分析された患者で得られた量を図８に示す。試験された結腸直腸癌を有する患者の２つの血清は、血清Ｉ-プラスチン量のはっきりした増加を示す。
【０１０２】
１０． グループＢ腫瘍マーカーについての血清分析
β２-ミクログロブリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９およびテストステロン腫瘍マーカーを、出願人のアッセイキット、それぞれＶｉｄａｓ（登録商標）β２-ミクログロブリン， Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＥＡ， Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＡ１９-９ＴＭおよびＶｉｄａｓ（登録商標）テストステロンを使用して、各々のキットに特有の手順に従って分析した。
Ｅ-カドヘリン・タンパク質は、キットの手順に従ってＥ-カドヘリンＥＩＡキット（タカラ・バイオケミカルズ、東京、日本）を使用して分析された。
再生膵島由来タンパク質３αタンパク質、別名膵臓炎関連タンパク質（ＰＡＰ１）は、ＰＡＮＣＲＥＰＡＰ ＥＬＩＳＡキット（ＤｙｎａＢｉｏ、マルセーユ、フランス）を使用して、キットの手順に従って分析した。
【０１０３】
ガレクチン-３およびＬＤＨタンパク質は、実施例２に記載されている抗体を使用して分析した。プロテアソーム２０Ｓは、特許ＥＰ ０４３４６７０に記載されている抗体を使用して分析した。これを行うため、ＥＬＩＳＡ分析は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置（ビオメリュー）とＶｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３１５）。試薬は、付随の情報シートに記載（ｒｅｆ．１１７２８Ｄ-ＦＲ-２００５／０５）に従い、以下の修飾を加えて使用した：
１．コーンは、５から３０μｇ／ｍｌの間の濃度で、捕捉抗体と感作させた。
２．ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルの内容物を、ヤギ血清と１ｇ／ｌのアジ化ナトリウムのバッファーに１μｇ／ｍｌにまで希釈された、ビオチンに結合した３００μｌの検出用抗体に置き換えた。
３．血清、血漿または糞便試料は、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第２ウェルのバッファーに直接希釈された。
４． ＥＬＩＳＡ反応は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化装置及びＨＢｓ Ａｇウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。捕捉および検出抗体と共に試料をインキュベートする工程は、１４と１００サイクルとの間である。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前の基質の読取値）の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析される体液（血液、血清、血漿、糞便）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、ＬＥＩを分析することに関してパラグラフ２に記載されている手順に従って算出された。さまざまな腫瘍マーカーのためのアッセイ条件を表７に記載する。
表７
【０１０４】
β２-ミクログロブリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９、テストステロン、Ｅ-カドヘリン、再生膵島由来タンパク質３α、ガレクチン-３、ＬＤＨおよびプロテアソーム２０Ｓ腫瘍マーカーによって分析された患者で得られた値を図９から１７にそれぞれ記録されている。
結腸直腸癌を有する患者の３つの血清は、血清β２-ミクログロブリンの量の増加を示す。結腸直腸癌を有する患者の１０の血清は、血清ＣＥＡの量の増加を示す。より明確には、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の７つの血清が、血清ＣＥＡ量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の９つの血清は、血清ＣＡ１９-９の量の増加を示す。より明確には、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の７つの血清が、血清ＣＡ１９-９量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の１０の血清は、血清テストステロンの量の減少を示す。より明らかには、ステージＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清およびステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の２つの血清が、血清テストステロン量の下落を示す。
結腸直腸癌を有する患者の２つの血清は、血清再生膵島由来タンパク質３αの量の増加を示す。
ステージＩＶの結腸直腸癌を有する患者の４つの血清、ステージＩＩＩの結腸直腸癌を有する患者の２つの血清およびステージＩＩの結腸直腸癌を有する患者の１つの血清は、血清ガレクチン-３の量の明確な増加を示す。
【０１０５】
実施例４：組合せによる腫瘍マーカーの血清分析の使用
出願人は、結腸直腸癌を有する特定の患者の血流において、腫瘍マーカーの異常に上昇した量または異常に減少した量が観察されことを実施例３で示した。驚くべきことに、血液において、２つの所与のマーカー量の増加または減少は、同じ患者において体系的に観察されない。その結果、いくつかの腫瘍マーカーの組合せは、結腸直腸癌を有すると同定される患者数を増加させることが可能である。したがって、患者Ａは一つ以上の腫瘍マーカー（グループＸ）の減少又は増加を示すが、患者ＢではグループＸの前記マーカーで正常である場合がある；この同じ患者Ｂで、一つ以上の他の腫瘍マーカー（グループＹ）は、上昇または減少する場合があり、患者ＡではグループＹの前記マーカーで正常である場合がある。出願人によって分析されるさまざまな腫瘍マーカーは、したがって、当業者によく知られているさまざまな数学的アルゴリズムによって結合されることができる。網羅的な例ではないが、具体的には、以下の方法が実施された：
１．各々の腫瘍マーカーについて、限界値が設定された。
２．結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が増加した場合、所与の患者で得られた血液の量はその限界値によって分割された。結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が減少した場合、所与の患者で得られた血液の量は逆数にされて、その限界値をかけられた。
３．「限界値によって分割された血液中の量」の比率が１より大きい場合、比率は係数（例えば１０）をかけられた。したがって得られる値は、研究される患者について、考慮中の腫瘍マーカーのための「スコア」と呼ばれた。
４．さまざまな腫瘍マーカーで得られたスコアは、各々のマーカーに特異的な係数によって重み付けされて加えられた。下記の実施例の場合、全ての重み付けの係数は１にセットした。
５．スコアの合計は加えられるスコアの総数によって分割され、こうして得られる値に「トータルスコア」という名前をつけた。
６．彼または彼女のトータルスコアが限界値スコアに比例して増加している場合、患者は結腸直腸癌を有すると診断される。
アミノアシラーゼ−１を含む２、４および８つのマーカーの選択のトータルスコアを表８に示す。
アミノアシラーゼ−１とプロテアソーム２０Ｓの腫瘍マーカーの組合せは、２２人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する９人の患者でトータルスコア「２」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−１又はプロテアソーム２０Ｓ単独の分析ではそれぞれ４人および７人の患者のみでの増加が示された。
アミノアシラーゼ１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０ＳおよびＣＡ１９−９腫瘍マーカーの組合せは、２２人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する１３人の患者でトータルスコア「４」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ又はＣＡ１９−９単独の分析ではそれぞれ４人、３人、７人および８人の患者のみでの増加が示された。
アミノアシラーゼ１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＰＡＰ、Ｅ−カドヘリンおよびＣＥＡ腫瘍マーカーの組合せは、２２人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する１８人の患者で増加したトータルスコア「８」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−１、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＰＡＰ、Ｅ−カドヘリン又はＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ４人、３人、７人、８人、６人、２人、１人及び１０人の患者のみでの増加が示された。
表８
表８のつづき
【０１０６】
実施例５：糞便腫瘍マーカーアッセイ
糞便は重さ約１ｇの破片を使用して抽出され、それは１ｇ／ｌアジ化合物を含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム・バッファー（ｐＨ７．２）の１０ｍｌに加えられる。混合物は、１分間のボルテックスで均質にされる。次に、試料を氷上で７秒間４サイクルの超音波にかける。不溶性分画は４℃で１０分間、２０００ｇで遠心分離により取り除かれる。上澄は分析されるまで−３０℃で保存される。実施例３に記載のＥＬＩＳＡアッセイが、必要に応じて、ＨＢｓ Ａｇウルトラ・カートリッジの第１ウェルのバッファーに糞便を適切に希釈した後に糞便の腫瘍マーカーを分析するために使用された。
アミノアシラーゼ１、ガレクチン-３およびプロテアソーム２０Ｓによる試験の分析定量は、それぞれ図１８から２０に表わされる。アミノアシラーゼ１、ガレクチン-３およびプロテアソーム２０Ｓの量の増加が、それぞれ結腸直腸癌を有する患者の１０、１４、および８つの糞便で観察された。
【０１０７】
実施例６：ＥＬＩＳＰＯＴ技術による腫瘍マーカーの検出
１． 細胞培養
ＬｎＣＡＰ前立腺癌株は、２ｍＭのＬ-グルタミンと１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１ｍＭピルビン酸ナトリウムと１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養される（全てギブコ）。細胞はネガティブコントロールとして使用される。
Ｃａｃｏ-２結腸大腸癌株は、ＦＣＳを含まず２ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養される（全てギブコ）。
ＨＴ-２９結腸直腸癌株は、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養される（全てギブコ）。
ＨＴ-２９／Ｂ６結腸直腸癌株は、ＦＣＳを含まず４ｍＭのＬ-グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養される（全てギブコ）。
細胞は、５％のＣＯ２を有するインキュベーターで３７℃に保たれる。
【０１０８】
２． ＥＬＩＳＰＯＴ技術
この手順は、タンパク質を分泌している細胞数を決定することを可能にする。ＰＶＤＦ膜（マルチスクリーンＩＰ、ミリポア）を有する９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートは、１０μｇ／ｍｌでマウス抗-腫瘍マーカー・モノクローナル抗体（捕捉抗体、ＥＬＩＳＰＯＴで使用した抗体を示す下の表９を参照されたい）で、ウェルにつき１００μｌで、滅菌ＰＢＳ中で、＋４℃で一晩、被覆する。次にプレートはＰＢＳによって洗われて、１０％ＦＣＳを含む培地で飽和する。平行して、細胞は、トリプシン処理され、計数されて、次に１０５細胞／ｍｌまで希釈した。この保存溶液のカスケード希釈として、この細胞懸濁液の２００μｌはウェルに分配された。次に、プレートは５％ＣＯ２の湿性雰囲気において３７℃で２０時間インキュベートされ、次に０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０含有ＰＢＳによって洗浄した。次に残りの細胞は１０分間の氷冷水による処理によって溶解され、次にプレートは再び洗われる。検出抗体（分析される腫瘍マーカーに向かうビオチン化モノクローナル（表９））は、０．１μｇ／ウェルで加えられる（周囲温度で２時間インキュベート）。スポットは、ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ-アルカリホスファターゼ（シグマ）と基質５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル・ホスフェート／ニトロ・ブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｂｉｏｒａｄ）を加えることによって検出される。バックグラウンド・ノイズは、ＬｎＣａｐウェルで測定されるスポット数に相当し、使用した読み取り条件下では０から８スポットの間で変化する。非特異的なスポットの平均数は、特異的なシグナルから減算された。
表９
【０１０９】
３． 結果
インキュベートされた細胞１００万に対する、興味がある腫瘍マーカーを分泌しているＣａｃｏ-２、ＨＴ-２９およびＨＴ-２９／Ｂ６細胞の数を、図２１に示す。ＥＬＩＳＰＯＴ技術は、大腸癌株による腫瘍マーカーの放出または分泌を確認することを可能にする。出願人による特許出願ＷＯ０３／０７６９４２の方法に従い、この技術を使用して患者の循環腫瘍細胞について調査を実施することが可能であろう。
【０１１０】
実施例７：結腸組織を使用した腫瘍マーカーの免疫組織化学検出
１． 方法論
第１に、組織マイクロアレイ・スライドは、脱パラフィンされる。このために、それらは次の溶液バットにおいて、１０分間、連続的にインキュベートされる：メチルシクロヘキサン（２回）、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノールおよび水。次にスライドは、０．１％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで、１０分間、撹拌しながら、リンスした。抗原は、１０ｍＭのクエン酸バッファー中で、４０分間、９０℃まで加熱することによって再活性化し、次に３０分間、周囲温度まで冷却させた。内因性ペルオキシダーゼは３％のＨ２Ｏ２を含むＴＢＳ−Ｔ中でのインキュベートによって阻害される。次に、スライドは３７℃で１時間、湿潤なチャンバーにおいて、３％ＢＳＡのＴＢＳ−Ｔで飽和する。
次に、スライドは、３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔに１０μｇ／ｍｌに希釈した抗-白血球エラスターゼ・インヒビター（クローン３Ｄ９Ｃ２）、抗-エズリン（クローン５Ｇ２Ｄ１２）、抗-アミノアシラーゼ１（クローン８Ａ８Ａ１０）または抗-Ｉ-プラスチン（クローン８Ｄ６Ａ３）一次抗体と共に２時間インキュベートする。ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間３回洗浄後、スライドは、飽和溶液で１／４００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗-マウス二次抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５-０３５-００３ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に、湿潤チャンバーにおいて、３７℃で２時間インキュベートする。スライドは、ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間３回洗浄され、次にＰＢＳ中で１０分間３回洗浄する。スライドは、シグマＦａｓｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ-４１６８，シグマアルドリッチ）によって５分間、発現させる。染色は、ＰＢＳでの洗浄によって停止させる。ハリス・ヘマトキシリン（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＨＳ１６、シグマアルドリッチ）による対比染色は、３０秒間実施する。水およびＰＢＳによる洗浄後、スライドは顕微鏡下に観察のために置かれる。
免疫組織化学の標識化のために使用する抗体は、特に本出願のために、ＥＬＩＳＡでの又はウエスタンブロッティングでのそれらの反応性に独立に選択された。
【０１１１】
２． 白血球エラスターゼ・インヒビターの免疫組織化学検出
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。患者の特徴（結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴）、更には抗-白血球エラスターゼ・インヒビター抗体による免疫標識の結果を、表１０に示す。
表１０
表の結果は正常な結腸粘膜生検において、標識化されたものがないことを示す（１０の陰性）。標識は、また、腺腫においても陰性である（１／１）。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において陽性である（８／１１の患者で＋）。間質では標識されたものがない。
【０１１２】
３． エズリンの免疫組織化学検出
組織マイクロアレイ・スライドは、多数の試料をスクリーニングするために使用した。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。結腸腺癌を有する各患者について、３つの試料は腫瘍の中央から採取され、３つの試料は浸潤前面から採取され、３つの試料は正常な組織から採取された。表１１は、抗-エズリン抗体による免疫標識の結果を示す；示した標識のレベルは、分析した３つの試料についての最大強度である。
表１１
３０人の患者の試料において、２５試料は隣接した正常な組織と比較して、腫瘍（腫瘍中心または浸潤前面）においてエズリンの過剰発現を示す。
【０１１３】
４． アミノアシラーゼ１の免疫組織化学検出
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。結腸腺癌を有する各患者について、３つの試料は腫瘍中央から採取され、３つの試料は浸潤前面から採取され、３つの試料は正常な組織から採取された。表１２は、抗-アミノアシラーゼ抗体による免疫標識の結果を示す；示した標識のレベルは、分析した３つの試料についての最大強度である。
表１２
３０人の患者の試料において、２１試料は隣接した正常な組織と比較して、腫瘍（腫瘍中心または浸潤前面）においてアミノアシラーゼの過剰発現を示す。
【０１１４】
５． Ｉ-プラスチンの免疫組織化学検出
組織マイクロアレイ・スライドを、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置された結腸と直腸の組織である。患者の特徴（結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴）、更には抗-Ｉ-プラスチン抗体による免疫標識の結果を、表１３に示す。
表１３
表１３のつづき
表の結果は：
正常な結腸粘膜生検において、８試料（＋）において標識は弱く、２試料は＋＋である。また、標識は結腸腺腫（１／１）において弱い（＋）。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において強い陽性＋＋である（結腸コロイド腺癌を含めて、６／９の患者で＋＋であり、３人の患者で弱い＋）。間質では標識されたものがない；
正常な直腸粘膜生検において、標識は、非特異的に表面上皮に（３／４）および１試料で＋＋レベルで存在する。標識は、直腸腺腫で強い陽性＋＋（５／９）または弱い＋（４／９）である。さらに、標識は、直腸腺癌の上皮細胞で強い＋＋である（３／４患者において＋＋、１患者で弱い＋）。間質では標識されたものがない
ことを示す。
【０１１５】
実施例８：ＬＣ-ＭＲＭ-ＭＳ技術による腫瘍マーカーの検出
１．方法論
検出限界を数ｎｇ／ｍｌまで下げることを可能にするために、改良されたＭＲＭ-ＭＳ方法が用いられた。この方法の連続した工程は：１）大量のタンパク質の免疫除去、２）トリプシン消化、３）ペプチドのＳＰＥ（固相抽出）分画化、４）ＭＲＭ-ＭＳと組合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。
セッティングは、１０〜２５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＡＣＹ、エズリン、Ｌ-ＦＡＢＰ、ＰＤＩ又はＩ-プラスチン組換えタンパク質を、対照血清プールに加えることによって、スパイク試料上で実施された。アポリポタンパクＡ１とＡ２は、血清に天然に存在する。
免疫除去
血清中の大量のタンパク質の除去は、ビバサイエンスのＶｉｖａｐｕｒｅ抗-ＨＳＡキットを使用して実施された。あるいは、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍのＰｒｏｔｅｏｅｘｔｒａｃｔ アルブミン／ＩｇＧおよびバイオラドのＡｕｒｕｍＴＭ血清タンパク質ミニキットを使用した。製造業者の指示に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ樹脂（アマシャム・バイオサイエンス）に、除去するタンパク質に向かうモノクローナル抗体を結合させることによって、実験室で特異的樹脂を製造することもできる。
酵素消化
除去された血清試料は、３０ｍＭのジチオスレイトールを含有する６Ｍ尿素の１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ８）で、４０℃で４０分間変性され、次に４０分間、暗所、周囲温度で、５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化される。それらは水で６倍希釈され、トリプシン消化は１：３０の酵素／基質比率を使用して３７℃で一晩実施される（プロメガ）。消化は、０．５％の最終濃度でギ酸を加えることによって停止される。消化された試料は、オアシスＨＬＢ ３ｃｃ 逆相カートリッジ（６０ｍｇ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して固相抽出（ＳＰＥ）によって脱塩される。試料の適用の後、カートリッジを０．１％のギ酸１ｍｌによって洗浄し、次に溶出は０．１％のギ酸を含むメタノール／水混合液（８０／２０ ｖ／ｖ）で実施される。溶出液は減圧下で乾燥される。
ＳＰＥ分画
乾燥試料は、１ｍｌの酢酸バッファーに溶解され、酢酸バッファーとメタノールで前もって平衡化されたオアシスＭＣＸ（混合陽イオン交換）６０ｍｇ混合カートリッジ（疎水性および陽イオン交換）（Ｗａｔｅｒｓ）上にロードされる。カートリッジは、１ｍｌの酢酸バッファーと１ｍｌのメタノールによって洗浄される。興味があるペプチド（表１４）は、メタノール／酢酸バッファー混合物（５０／５０ ｖ／ｖ）の１ｍｌによって溶出される。酢酸バッファーのｐＨは、興味があるペプチドの等電点に応じて選択される。溶出液は減圧下で乾燥され、０．１％のギ酸を含むアセトニトリル／水（３／９７ ｖ／ｖ）溶液の２００μｌに溶解する。５０μｌのアリコートは、ＭＳ-ＭＳシステムに接続するＬＣに注入された。
液体クロマトグラフィーおよび質量分析法
ＬＣ-ＭＳ分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ２０００トリプル四重極、またはより感受性のよいＳｃｉｅｘ ＡＰＩ４０００Ｑｔｒａｐ（複合型トリプル四重極-イオントラップＭＳ）（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ）のどちらかの質量分析計に接続されている、バイナリーポンプとインジェクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＨＰ１１００シリーズ高圧クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）において実施された。ＬＣ分離は、３００μｌ／分の溶出流速で、Ｃ１８シンメトリーカラム（Ｗａｔｅｒｓ）において実施した。（溶出液Ａ＝０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ＝０．１％のギ酸アセトニトリル溶液、２５分間で５％Ｂから５０％Ｂ、次に３分間で５０％Ｂから１００％Ｂの直線濃度勾配）。ＭＳ分析は５５００Ｖ電圧で陽性イオン化法で実施され、ニードル電位として適応され、源のイオン化を可能にする。計測器照合とデータ収集は、アナリスト１．４．１ソフトウェアにより実施された。霧状ガス（空気）およびカーテン・ガス（窒素）流は、それぞれ３０と２０ｐｓｉである。ターボＶＴＭイオン源は４００℃に、補助窒素流は４０ｐｓｉに合わせる。各ペプチドで記録されたＭＲＭ遷移を表１４に示す。衝突エネルギー（ＣＥ）、デクラスタリング・ポテンシャル（ＤＰ）およびコリジョンセルエクジットポテンシャル（ＣＸＰ）は、選択されたＭＲＭ遷移について最適化される。
【０１１６】
２． 結果
各々の腫瘍マーカー（表１４のタンパク質）について、理論上のＭＲＭ遷移のリストは、ＭＩＤＡＳ（ＭＲＭ-initiated検出およびシークエンシング）ソフトウェアを使用して生成された。このリストは、８００から３０００Ｄａの質量範囲および全てのあり得るｙまたはｂ型の断片イオンの、理論上のトリプシンペプチドの全ての二重荷電あるいは三重荷電親イオンを含む。各タンパク質について、各々の可能な遷移は、最も感受性があり、最も特異的な遷移を決定するために試験された。この選択の結果を表１４に示す。ＡＱＵＡ型の重ペプチド（シグマ）、あるいは、重組換えタンパク質をアッセイ基準として使用して、複雑な生物媒質において興味がある腫瘍マーカーを絶対値で定量化することが可能である。
表１４
表１４のつづき
表１４のつづき
表１４のつづき
【０１１７】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物試料におけるアミノアシラーゼ１マーカーの存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断方法。
【請求項２】
生物試料が腫瘍から離れた試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ-プラスチンマーカーから選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在を更に決定することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、好ましくはＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡまたはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡのような血液中のメチル化ＤＮＡの検出、糞便ＤＮＡの特異的な変異又は糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な修正のような糞便ＤＮＡ断片の特異的な修正の検出、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在の決定を更に含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のための、請求項１から４の何れか一項に記載の方法の使用。
【請求項１】
結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物試料におけるアミノアシラーゼ１マーカーの存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断方法。
【請求項２】
生物試料が腫瘍から離れた試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ-プラスチンマーカーから選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在を更に決定することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、インテレクチン-１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、好ましくはＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡまたはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡのような血液中のメチル化ＤＮＡの検出、糞便ＤＮＡの特異的な変異又は糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な修正のような糞便ＤＮＡ断片の特異的な修正の検出、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在の決定を更に含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のための、請求項１から４の何れか一項に記載の方法の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２０１０−５３３８５０（Ｐ２０１０−５３３８５０Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６５４８（Ｐ２０１０−５１６５４８）
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９３６６
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９３６６
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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