維管束優先的発現プロモーター
本発明はポリヌクレオチドの転写および／または発現の調節に関する。特に、本発明は、植物細胞での維管束優先的なポリヌクレオチド転写を可能にするＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａから単離されたポリヌクレオチド調節配列に関する。内在的および／または異種由来のポリヌクレオチドの転写を改変するために本発明の調節配列を利用するコンストラクトおよび方法も本発明に含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヌクレオチド転写および／または発現の調節に関する。特に本発明は、ユーカリ・グランディスまたはユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）およびラジアータマツまたはマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）から単離され、植物細胞内におけるポリヌクレオチドの維管束優先発現的転写を行うポリヌクレオチド調節配列に関する。内在性および／または異種由来のポリヌクレオチドの転写を改変するために本発明の調節配列を用いるコンストラクトおよび方法も、本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、米国仮出願第６０／４２８，２８７号（２００２年９月２２日出願）に基づく優先権主張を伴う。
【０００３】
林業および製紙産業の大きな目標は、植物のリグニン含量の制御である。リグニンは、木材の機械強度、着色、防腐性に関与するシンナミルアルコールの複合ポリマーである。木本種は、木材の乾燥重量の２０％ないし３０％を占める大量のリグニンを合成する。剛性を与えることに加えて、リグニンは、細胞壁に疎水性および非透水性を与えて、水の輸送を助ける。したがって、樹木のリグニン濃度を増大させることは、耐病性および建築用の強度の改善を木に与えることのような、一部の用途で有利になることがわかることになる。また、リグニンは燃料としても有用であり、木炭製造用材と、トウモロコシ稈と、バイオ燃料として用いられる柳および成長の早いポプラ雑種とのような燃料用の木材その他のバイオマスにおけるセルロース含量の増大したリグニンは好ましい。
【０００４】
逆に樹木におけるリグニン含量の増大は、製紙産業にとって重大な問題をもたらし、製紙産業はセルロース繊維からリグニンを除去するために多大な資源を費やさなければならない。米国内だけでも、年間約２千万トンのリグニンが除去される。さらにリグニン含量は、飼草作物の消化性の良否の大きな原因であり、植物のリグニン含量のわずかな上昇が消化性の比較的大きな低下につながる。例えば、リグニン含量が低い作物は家畜にとってより効率的な飼草を提供し、飼草作物の消費量に対する乳および肉の生産収量が向上する。リグニン含量は植物の成育中に増大するので、農家は早めの収穫を行って少収量で消化の良い作物を得るか、あるいは遅めに収穫を行って多収量で消化の悪い作物を得るか、のいずれかを選択しなければならない。
【０００５】
かかる理由から、植物の遺伝子改変によるリグニン含量または組成の制御は望ましい。この目標に向けて、リグニン生合成を担う遺伝子の同定および特徴付けと、その発現を調節する配列の決定とに多大な努力が注がれてきた。マツ由来のシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、クマレート３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ＰＮＬ）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）を含む、リグニン生合成に関与する酵素の多くをエンコードするポリヌクレオチドがクローニングされてきた（特許文献１）。
【特許文献１】米国特許第６，２０４，４３４号明細書
【０００６】
これらの遺伝子の発現操作がリグニン含量の改変に利用されてきた。かかる実験は、ＣＡＤ、コニフェリンβ−グルコシダーゼ（ＣＢＧ）、およびカフェイン酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）をエンコードする遺伝子のコピー数の変更を含む（特許文献２、特許文献３および非特許文献１）。さらに、ポプラ、タバコ（Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ）およびマツにおいてＣＡＤをエンコードする配列のアンチセンス発現は、組成の異なるリグニン産生を起こす（それぞれ、非特許文献２、３および４を参照）。
【特許文献２】米国特許第５，４５１，５１４号明細書
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９４／２３０４４号公報
【非特許文献１】Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０巻、３６５−７２頁（１９９９年）
【非特許文献２】Ｇｒａｎｄら、Ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌ．）、１６３巻、２３２−３７頁（１９８５年）
【非特許文献３】Ｙａｈｉａｏｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２９５−３０６頁（１９９８年）
【非特許文献４】Ｂａｕｃｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２巻、１４７９頁（１９９６年）
【０００７】
林産品、紙、植物バイオマスおよび飼草産業のもう１つの大目標は、茎からのセルロース回収を容易化するために、茎のサイズを増大させ、茎のセルロース含量を操作し、あるいは細胞壁の特性を操作することである。例えばセルロースは、パルプ生産では木部繊維から回収され、木部繊維数および管状要素数、細胞壁の厚さ、管腔径、繊維長、セルロース微繊維の角度その他のこれら木部の特性が、回収されるセルロースの質および量を決定する。セルロース生合成に関与する遺伝子の操作は、植物のバイオマス総量および植物からのセルロース収率の増大に有用であり、かかる遺伝子のアンチセンス発現は細胞壁の発達に影響を及ぼすことが示されている（非特許文献５）。また、エンド−１，４−β−グルカナーゼとセルロース結合ドメインとによる多糖類と植物細胞壁の改変が報告されている（非特許文献６）。したがって本発明のポリヌクレオチドは、セルロース生合成を改変し、これによって植物の生育とバイオマスとに影響を及ぼすために、維管束組織内でヌクレオチド配列を発現するのに用いられる場合がある。
【非特許文献５】Ｓｈａｎｉ Ｚ．、Ｓｈｐｉｇｅｌ，Ｅ．、Ｒｏｉｚ Ｌ．、Ｇｏｒｅｎ Ｒ．、Ｖｉｎｏｃｕｒ Ｂ．、Ｔｚｆｉｒａ Ｔ．、 Ａｌｔｍａｎ Ａ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ Ｏ．、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ，ａｎｄ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ、Ａ．Ａｌｔｍａｎ、Ｍ．Ｚｉｖ、Ｓ．Ｉｚｈａｒ共編、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ、２１３−２１８頁、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９年）
【非特許文献６】Ｌｅｖｙ，Ｉ．、Ｓｈａｎｉ，Ｚ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ Ｏ．、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１９巻、１７−３０頁（２００２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記改変植物への全身的な有害な影響を回避するために、生合成経路の遺伝子的調節は狭く限定された組織タイプにおいて実行することが好ましい。例えば、特定の遺伝子産物の発現によりリグニンの含量または組成が特定の遺伝子産物の発現によって影響を受ける場合、前記植物の病気に対する耐性の低下を避けるために、前記遺伝子産物の発現を前記植物の一部のセグメントまたは一部の生育段階に限定することが好ましい場合がある。異種遺伝子は、組織優先発現的プロモーターと操作可能に連結することにより、選択された組織において発現される場合がある。好適な組織優先発現的プロモーターは、維管束組織の原生木部管状要素内で特異的な活性があるマメｇｒｂ１．８プロモーターがある（非特許文献７）。これらのプロモーターは木質化部にて優先的に発現するユーカリＣＡＤプロモーターも含む（非特許文献８）。かかる組織優先発現的プロモーターは、特異的な組織におけるアンチセンス分子の遺伝子発現の調節に用いられてきた（非特許文献９−１１）。
【非特許文献７】Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、８巻、１３０９頁（１９８９年）
【非特許文献８】Ｆｅｕｉｌｌｅｔら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７巻、６５１頁（１９９５年）
【非特許文献９】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、２５３頁（１９９２年）
【非特許文献１０】Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、 ２３巻、９４７頁（１９９３年）
【非特許文献１１】Ｍａｔｓｕｄａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７巻、２１５頁（１９９６年）
【０００９】
組織優先発現的プロモーターは、異なる環境では活性が弱い場合があり、構成的プロモーターで達成されるレベルと常に同じレベルで遺伝子を発現させるとは限らない（非特許文献１２）。さらに、これらのプロモーターが活性を示す発生学的なウィンドウ、またはそれらの活性の空間分布が、それらの有用性を制限する場合がある。したがって、本技術分野では、所望の空間的・時間的な発現パターンを有するさらなる組織優先発現的プロモーター、特に、維管束優先発現的プロモーターの開発する継続的な必要性が存在する。非特許文献１３に総説される。
【非特許文献１２】Ｙａｈｉａｏｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２９５−３０６頁（１９９８年）
【非特許文献１３】Ｇｒｉｍａ−Ｐｅｔｔｅｎａｔｉら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４５巻、５１−６５頁（１９９９年）
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、維管束優先発現的遺伝子発現に関与する単離ポリヌクレオチド調節配列に関する。本発明のポリヌクレオチドは、植物のリグニン含量、セルロース含量、個体のサイズまたは細胞壁の成長の調節に用いることができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、リグニン、セルロース、および植物細胞壁の生合成にも用いられる場合がある。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、維管束優先発現的ポリヌクレオチド転写をさせることが可能なポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。１つの実施態様において、前記単離核酸分子は配列番号１−８５のいずれか１つとその機能変異体とから選択されるポリヌクレオチドを含む。別の実施態様において前記機能変異体は、配列番号１−８５のいずれかの配列との同一性が９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上である。
【００１２】
他の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５およびその機能変異体のいずれか１つに対する相補配列と、（ｂ）配列番号１−８５の配列のいずれかに対する逆相補体の配列と、（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのいずれかと雑種形成する、少なくとも２０個の連続する塩基を含む配列とから選択される配列を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの実施態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドが植物細胞における木部優先発現的の遺伝子発現を実現できるようにすることを意図する。別の実施態様において、本発明は、植物細胞における操作可能に連結した遺伝子の発現を上向き調節または下向き調節することが可能なポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結している植物細胞を提供する。１つの実施態様において、前記所望の遺伝子はポリペプチドまたはタンパクをエンコードする。別の実施態様において、前記タンパクは細胞壁の生合成に関与する酵素である。さらなる実施態様において、前記タンパクはリグニンの生合成に関与する酵素である。さらに別の実施態様において、前記所望の遺伝子はＲＮＡ転写産物を生成する。さらに別の実施態様において、前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞に内在する遺伝子のアンチセンス配列を有する。さらに別の実施態様において、前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞中で正常に発現される遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結している、植物細胞を含む植物を提供する。１つの実施態様において、前記植物は被子植物および裸子植物から選択される。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結しているＤＮＡコンストラクトを含む、植物細胞を含む植物を栽培することを含む、植物のリグニン含量の調節方法を意図する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結しているＤＮＡコンストラクトを含む、植物細胞を含む植物を栽培することを含む、植物の細胞壁の発生の調節方法を意図する。
【００１７】
他の局面において、本発明は、配列番号１−８５およびその機能変異体のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物を提供する。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号１ないし８５およびその機能変異体のいずれかの配列を有するプロモーターと、（ｉｉ）所望の核酸とを含み、前記プロモーターは前記所望の核酸の発現を調節するＤＮＡコンストラクトを木本植物の植物細胞に導入すること、（ｂ）前記形質転換された植物細胞を植物の生育を促進する条件下で培養すること、および、（ｃ）前記植物から木材を得ることとを含む、木材を得る方法を提供する。１つの実施態様において、前記木本植物は、ユーカリ属またはマツ属の植物種から選択される。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１−８５からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド配列と、これらの配列のいずれかに対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドとを意図する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。また、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００２０】
本発明は、表８に挙げたポリヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性がある配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子に関する。本発明はまた、表８に開示されるポリヌクレオチド配列の機能断片も提供する。本発明はさらに、表８に列挙されるポリヌクレオチド配列のいずれかに対する相補的な核酸またはその断片と、表８に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかと雑種形成し、少なくとも１５個の連続する塩基を含む核酸とを提供する。
【００２１】
本発明の核酸のヌクレオチド配列は配列表に示される。ここで、「配列番号（２Ｎ＋１）」とは、例えば１、３、５、７…等の、すべての奇数番号の配列をいう。「配列番号２Ｎ」とは、すべての偶数番号の配列をいう。ある奇数番号の配列とすぐ次の偶数番号の配列（例えば、配列番号１と配列番号２）との間の違いは、前記偶数番号の配列は追加の塩基を有する点である。偶数番号の配列の末端の３塩基は通常ＡＴＧで、（通常、メチオニンをコードする）翻訳の開始コドンを表す。
【００２２】
本発明は当業者に周知の用語および表現を用いる。別の定義が与えられないかぎり、本明細書中で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、ここで用いる用語法と、ここで説明される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および雑種形成法における各実験手順とは、当該技術分野において周知慣用のものである。核酸組換法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、細胞培養、組織培養、形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、分析化学、有機合成化学、化学合成、化学分析および医薬品処方および薬物送達には、標準的な手法が用いられる。一般に、酵素反応、精製および／または単離のステップは製造者の仕様にしたがって行われる。手法および手順は従来の方法論にしたがって実行されるのが一般的である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１年を参照せよ。
【００２３】
アグロバクテリア：当技術分野で周知のとおり、植物細胞の形質転換に用いられるアグロ細菌は、ベクターを含む、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の無毒化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）ビルレントな誘導体であることが一般である。前記ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの境界の間に配置された所望のポリヌクレオチドを含むことが典型的である。
【００２４】
被子植物：種子が子房に被覆されている維管束植物。被子植物は、花を付け、実を結ぶ種子植物である。被子植物は、双子葉植物と単子葉植物とに分類される。
【００２５】
所望のポリヌクレオチド：本発明の所望のポリヌクレオチドとは、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターのような遺伝子エレメントか、ゲノム中に前記所望のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞で転写および／または翻訳されるべき遺伝子またはポリヌクレオチドかをいう。前記所望のポリヌクレオチドがタンパク産物をエンコードする配列を含む場合、そのコーディング領域は、当該所望のポリヌクレオチドによってエンコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写産物および／またはタンパク産物の発現をもたらす、プロモーターおよびターミネーターのような調節エレメントと操作可能に連結している場合がある。したがって、「所望のポリヌクレオチド」は、５’から３’への配向で、プロモーターと、タンパクをエンコードする遺伝子と、ターミネーターとに操作可能に連結する遺伝子を含む場合がある。代替的には、前記所望のポリヌクレオチドは、翻訳されると植物細胞内での内在性遺伝子の発現に影響を与える２次構造を形成するかもしれない核酸を産生するような、「アンチセンス」配向の遺伝子またはその断片を含む場合がある。所望のポリヌクレオチドはまた、転写されると前記所望のポリヌクレオチドが会合する遺伝子のＲＮＡ干渉を引き起こすような、２本鎖ＲＮＡを産生する場合がある。本発明の所望のポリヌクレオチドは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界配列が前記所望のポリヌクレオチドを挟むか、あるいは所望のポリヌクレオチドのいずれか片側に配置されるように、Ｔ−ＤＮＡ内に配置される場合がある。本発明は、少なくとも１個の植物細胞のゲノムに１個または２個以上の所望のポリヌクレオチドを安定的に組み込むことを可能にする。所望のポリヌクレオチドは、突然変異処理されていても、その野生型配列の変異体であってもよい。前記所望のポリヌクレオチドの全部または一部が植物ゲノムに組み込まれ場合があるものと理解されている。また、「所望のポリヌクレオチド」という用語は、かかるポリヌクレオチドの１個または２個以上を包含するものと理解されている。したがって、本発明のＴ−ＤＮＡは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個以上の所望のポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００２６】
双子葉植物：胚が２分割状の種子、すなわち子葉と、分岐した葉脈と、４または５の倍数に分割される花とを持つ顕花植物。双子葉植物の例は、ユーカリ属、ハコヤナギ属、フウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂｅｒ），アカシア属、チーク、マホガニー、ワタ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、トマト、ジャガイモ、テンサイ、ブロッコリ、キャッサバ、サツマイモ、コショウ、ポインセチア、マメ、アルファルファ、ダイズ、ニンジン、イチゴ、レタス、カシ、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、ゼラニウム、アボカド、サボテンがを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
内在性とは、ある植物ゲノムに元々存在する遺伝子を指す。
【００２８】
繊維組成：本明細書で用いられる繊維組成とは、繊維の構造、外観または用途を変更するために改変可能な形質をいう。繊維組成を決定する形質は、繊維長、粗さ、強度、色、断面幅、繊維密度を含むが、これらに限定されない。例えば、繊維長は強度を与え、繊維の粗さは風合いおよび可撓性を決定する要因であることが知られている。
【００２９】
外来性：ある核酸に関して「外来性」とは、その核酸が植物以外の生物に由来するか、形質転換されるべき植物とは異なる植物に由来するか、形質転換されるべき植物と交配できない植物に由来するか、あるいは標的植物の種に属さないことを意味する。本発明によれば、外来性のＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウィルス、哺乳類、魚類または鳥類の遺伝物質中に天然に存在するが、形質転換されるべき植物中には天然には存在しない核酸を含む場合がある。したがって、ある外来性の核酸は、例えば、形質転換された植物によって天然には生産されないポリぺプチドをエンコードするものである。外来性の核酸は、タンパク産物をエンコードする必要はない。
【００３０】
遺伝子：産物、すなわちポリペプチド鎖またはＲＮＡ分子の合成に必要な情報のすべてを含むＤＮＡ分子のセグメントであり、コーディング配列およびノンコーディング配列の双方を含む。
【００３１】
遺伝子エレメント：「遺伝子エレメント」とは、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、イントロン、エンハンサー、スペーサー、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、またはリコンビナーゼ認識部位を含むがこれらに限定されない、離散的なヌクレオチド配列のいずれかをいう。
【００３２】
遺伝子改変：分子細胞生物学的手法を適用することによって、ある生物のゲノムにＤＮＡを安定的に導入すること。
【００３３】
裸子植物：本明細書で用いられる場合には、子房を持たず、種子が露出している種子植物をいう。裸子植物の例は、針葉樹、ソテツ、イチョウおよびマオウを含む。
【００３４】
導入：本明細書で用いられる場合には、感染、トランスフェクション、形質転換またはトランスダクション等の方法により、細胞中に核酸配列を挿入することをいう。
【００３５】
幼若性：若木と成木との間の生理学的差異を説明する。本発明では、幼若性とは、若木と成木との間の微繊維角度、木材密度、セルロース収量、再生能力および生殖能力の差異をいう。例えば、木本植物組織は成熟するにしたがって再生能力を失うことが知られている。
【００３６】
リグニン：本明細書で用いられる場合には、モノリグノールである、コニフェリルアルコール、クマリルアルコールおよびシナピルアルコールの重合誘導体を含む、フェニルプロパノイド単位で構成されるポリマー組成物をいう。リグニンの品質とは、細胞壁マトリクスに強度を与え、水分輸送を助け、および／または細胞壁多糖類の分解に抵抗する、リグニン組成物の能力をいう。リグニン組成物またはリグニン構造物は、各モノリグノールの相対量を変更するか、リグニンのタイプを変更することによって変化される場合がある。例えば、（フェルラ酸から誘導される）グアイアシルリグニンは軟木種では顕著だが、（フェルラ酸およびシナピン酸から誘導される）グアイアシル−シリンギルリグニンは硬木種に特徴的である。マツのような軟木由来のリグニンの分解には、硬木由来のリグニンの除去に比べてかなり大量のアルカリと長いインキュべーション時間とを要する。リグニン組成は、リグニン生合成に関与する酵素の上向き調節または下向き調節のいずれかにより調節される場合がある。例えば、重要なリグニン生合成酵素は、４−クマリン酸：補酵素Ａリガーゼ（４ＣＬ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）およびシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
単子葉植物：１枚の子葉または種葉（ｓｅｅｄｌｅａｆ）を有する胚と、平行な葉脈と、３の倍数に分割される花を有する顕花植物である。単子葉植物の例は、シバ、トウモロコシ、コメ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、ヤシを含むが、これらに限定されない。シバの例としては、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐｐ．（コロニアルベントグラスおよびクリーピングベントグラスを含むベントグラス種）、Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ケンタッキーブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．（１年生ライグラスおよび多年生ライグラス等のライグラス種）、Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｙｔａｃｅａ（トールフェスク）、Ｆｅｓｔｕｃａ ｒｕｂｒａ ｃｏｍｍｕｔａｔａ（ファインフェスク）、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｓ（ティフグリーン、ティフウェイＩＩおよびサンタアナ等のコモンバミューダグラスの変種、並びにその雑種形成種）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎｕｍ（アフリカチカラシバ）、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ（イヌシバ）、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（シバ）、およびＤｉｃｈｏｎｄｒａ ｍｉｃｒａｎｔｈａを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
操作可能に連結した：２個または３個以上の分子を、それらがある植物細胞内で組み合わせて適切に機能するように組み合わせること。例えば、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御するとき、プロモーターは構造遺伝子に操作可能に連結している。
【００３９】
表現型：表現型は、区別できる植物の特徴または特性であって、本発明では１個または２個以上の「所望のポリヌクレオチド」および／またはスクリーニング／選択可能なマーカーを、形質転換された植物の少なくとも１個の細胞のゲノムに組み込むことによって変化させられる場合がある。「（単数または複数の）所望のポリヌクレオチド」および／またはマーカーは、形質転換された植物細胞または植物個体全体の多数の遺伝的、分子的、生化学的、生理学的、形態学的、農業経済学的特徴または特性を改変することにより、形質転換された植物の表現型の変化を可能にする場合がある。したがって、植物ゲノム中に安定に組み込まれた１個または２個以上の所望のポリヌクレオチドの発現は、例えば、干魃耐性の向上、耐寒性および耐霜性強化、活力の向上、色彩の強化、保健栄養的な特性の強化、保存性の向上、収量の増大、耐塩性向上、重金属耐性向上、耐病性の向上、耐虫性の向上、耐乾性の強化、甘味の増強、活力の向上、味の改善、食感の改善、リン酸含量の低減、発芽率の増大、微量栄養素の取込みの増大、デンプン組成の改善、開花寿命の改善、密度の変更、茎強度または茎剛性の変化、寸法安定性の向上およびセルロースまたはリグニン含量の変化からなる群から選択される表現型を与える場合がある。
【００４０】
植物組織：「植物」とは、胚を生産し、葉緑体を含み、セルロース細胞壁を有することを特徴とする、光合成能を有する植物界の真核多細胞生物のいずれかをいう。植物の一部、すなわち「植物組織」は、トランスジェニック植物を作出するために、本発明の方法により形質転換される場合がある。多くの適当な植物組織が、本発明の方法によって形質転換可能で、体細胞胚、花粉、葉、茎、カルス、走根、マイクロチューバーおよび苗条を含むが、これらに限定されない。このように、本発明はシバ、コムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、エンバク、テンサイ、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、キャッサバ、サツマイモ、ゼラニウム、ダイズ、カシ、リンゴ、ブドウ、マツ、モミ、アカシア、ユーカリ、クルミおよびヤシのような被子植物および裸子植物の形質転換を意図する。本発明によると、「植物組織」は植物細胞も包む。植物細胞は、懸濁培養、カルス、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶子、胞子体、花粉、種子および小胞子を含む。植物組織は成熟のいかなる段階にあるものでもよく、液体または固体培地か、土壌か、植木鉢、温室または圃場の適当な培地かで生育されてもよい。植物組織とは、有性的、無性的のいずれによって生じたかを問わず、かかる植物個体、種子、子孫、ムカゴのいずれかのクローンと、切断片や種子のような、これらのいずれかの派生物をもいう。特に興味深いのは、マツ、モミおよびトウヒのような針葉樹と、ケンタッキーブルーグラス、クリーピングベントグラス、トウモロコシおよびコムギのような単子葉植物と、ワタ、トマト、レタス、シロイヌナズナ、タバコ、リンゴおよびゼラニウムのような双子葉植物とである。
【００４１】
植物の形質転換および細胞培養：広義には、植物細胞が遺伝子的に改変され、維持、さらなる成長および／またはさらなる発生のために適当な植物培地に移されるプロセスをいう。これらの方法は、当業者に周知である。
【００４２】
子孫：トランスジェニック植物の子孫のような、本発明の「子孫」とは、植物またはトランスジェニック植物から生まれたか、これらの間に授かったか、これらに由来するものをいう。したがって、「子孫」植物、すなわち「Ｆ１」世代の植物は、本発明の方法により作出されたトランスジェニック植物の子、または子孫である。トランスジェニック植物の子孫は、少なくとも１個、一部、あるいは全ての細胞ゲノムに、本明細書に説明される方法によって親のトランスジェニック植物に組み込まれた所望のポリヌクレオチドを含む場合がある。したがって、所望のポリヌクレオチドは、子孫の植物によって「伝達される（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）」か、「受け継がれる（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）」。そのように子孫植物に受け継がれる所望のポリヌクレオチドは、Ｔ−ＤＮＡコンストラクト中に存在する場合があるが、Ｔ−ＤＮＡコンストラクトもまたその親植物から子孫植物へと受け継がれる。本明細書で用いられる「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」という用語は、ある群の植物の子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）、または子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ）と考えられる場合もある。本発明のトランスジェニック植物は、子孫植物を作出するために無性生殖により繁殖される場合がある。
【００４３】
プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節エレメントに結合する核酸、好ましくはＤＮＡを指す意味で用いられる。あらゆるプロモーターと同様、本発明のプロモーター配列は、該プロモーターと操作可能に連結した核酸分子からｍＲＮＡを生成するために、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写を促進または制御する。上述したように、生成したＲＮＡはタンパクまたはポリペプチドをコードする場合があり、ＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子をコードする場合がある。
【００４４】
本明細書で用いられるプロモーターとは、調節エレメントを含む場合もある。逆に、ある調節因子がプロモーターから分離される場合もある。調節因子は、１つのプロモーター領域に対して多数の重要な性質を与える。ある種の要素は、操作可能に連結した核酸の転写速度を上げる転写因子に結合する。また、別の要素は、転写活性を阻害するレプレッサーに結合する。プロモーター活性に及ぼす転写因子の影響は、そのプロモーター活性が高いか低いか、すなわち、プロモーターが「強い」か「弱い」かを決定する。
【００４５】
植物プロモーターとは、植物細胞由来であるか否かによらず、植物細胞中における転写を開始することができるプロモーターをいう。代表的な植物プロモーターは、植物と、植物ウィルスと、植物細胞で発現される遺伝子を含む、アグロバクテリウム属またはリゾビウム属のような細菌とから得られるものを含むが、これらに限定されない。発生学的な制御下にあるプロモーターの例は、木部、葉、根または種子のような特定の組織で転写を優先的に開始するプロモーターを含む。かかるプロモーターが、組織優先発現的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターと呼ばれる。特定の組織中でのみ転写を開始するプロモーターは、組織特異的プロモーターと呼ばれる。細胞タイプ特異的プロモーターは、例えば根または葉の維管束系細胞のような１種類または２種類以上の器官における特定の細胞タイプでの発現を主として推進する。誘導可能または抑制可能なプロモーターは、環境による制御の下にあるプロモーターである。誘導可能なプロモータによって転写に影響を及ぼし得る環境条件の例は、嫌気的条件および光の存在を含む。組織特異的、組織優先発現的、細胞タイプ特異的、および誘導可能プロモーターは、非構成的プロモーターのクラスを構成する。構成的プロモーターは、ほとんどの環境条件の下で、かつ、ほとんどの植物の部分で活性があるプロモーターである。
【００４６】
ポリヌクレオチドとは、遺伝子をコードする配列または（少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも３０個の連続したヌクレオチド、または少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む）その断片と、プロモーターと、イントロンと、エンハンサー領域と、ポリアデニル化部位と、翻訳開始部位と、５’または３’非翻訳部位と、レポーター遺伝子と、選択可能マーカー等とを含むヌクレオチド配列をいう。ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含む場合がある。ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾されたバックボーンを含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ゲノム由来か、（ｍＲＮＡのような）ＲＮＡ転写産物か、（ｃＤＮＡのような）プロセシングを経たヌクレオチド配列かの場合がある。ポリヌクレオチドは、センス配向またはアンチセンス配向を有する配列を含む場合がある。
【００４７】
単離ポリヌクレオチドは、天然状態ではないポリヌクレオチド配列である。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自然界には存在しないヌクレオチド配列で構成されるか、その近傍に存在するのが典型的なヌクレオチド配列から切り離されているか、あるいは、その近傍には存在しないのが典型的なヌクレオチド配列の近傍に存在する。
【００４８】
再生能力：本明細書で用いられるところでは、脱分化組織から植物が再分化する能力をいう。
【００４９】
種子：「種子」とは、胚を含む熟した植物の胚珠と、塊茎または胞子のような植物の増殖部位として考えられる場合がある。種子は、発芽促進のために、アグロバクテリアを介する形質転換の前に、例えば暗所でインキュベーションされる場合がある。種子はまた、インキュベーションの前に、短時間の漂白剤処理のような処理によって滅菌される場合がある。得られた実生はアグロバクテリアの所望の菌種に曝露できる。
【００５０】
選択可能なマーカー／スクリーニング可能なマーカー：ある遺伝子が植物個体または植物組織において発現している場合に、該植物個体または植物組織を前記遺伝子が発現していない他の植物個体または植物組織と区別することを可能にする遺伝子をいう。スクリーニング手順は、前記スクーニング可能なマーカー遺伝子にエンコードされるタンパクの発現についてのアッセイが必要な場合がある。かかるマーカーの例は、ベータ・グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子と、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）遺伝子とを含む。選択可能なマーカーの例は、カナマイシンおよびジェネチシン耐性をエンコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子と、ハイグロマイシン耐性をエンコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＡＰＨＩＶ）遺伝子と、スルホニル尿素系除草剤耐性をエンコードするアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子と、グルタミンシンターゼの活性を阻害するように作用する、ホスフィノトリシン（ＬｉｂｅｒｔｙまたはＢａｓｔａ）のような除草剤への耐性をコードする遺伝子（ＢＡＲおよび／またはＰＡＴ）と、その他の本技術分野で知られた類似の遺伝子を含む。
【００５１】
配列の同一性：本明細書で用いられる、２個の核酸配列またはポリペプチド配列について「配列の同一性」または「同一性」は、ある特定の領域にわたって前記２個の配列を最大限対応するようにアライメントをとるときに、前記２個の配列中で同一となる残基をさすことを含む。
【００５２】
本明細書で用いられる同一性の百分率は、ある比較ウィンドウにわたって最適なアライメントをとった２個の配列を比較することによって決定される値を意味するが、ここで、前記２個の配列の最適なアライメントのための（（例えばギャップのような）付加または欠失を含まない）基準配列と比較するとき、前記比較ウィンドウ内の前記ポリヌクレオチド配列の一部は付加または欠失を含む場合がある。前記百分率は、両方の配列中に同一の核酸塩基が出現する塩基数を数えることにより一致塩基数を算出し、この一致塩基数を比較ウィンドウ中の総塩基数で除し、この商に１００を乗ずることにより算出される。
【００５３】
転写因子：転写因子とは、遺伝子コード配列を伴う１個または２個以上のヌクレオチド配列に直接結合するか、あるいは、遺伝子をコードする配列を伴う１個または２個以上のヌクレオデチド配列に直接結合する他の（単数または複数の）ポリペプチドの活性に間接的に影響を及ぼすかのいずれかによって、単数または複数の遺伝子の発現を調節するポリペプチド配列をいう。転写因子は、単数または複数の遺伝子の発現を活性化（上向き調節）または抑制（下向き調節）する場合がある。転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインまたはタンパク−タンパク相互作用ドメインとを含む場合がある。本発明では、転写因子は、（１）核酸配列に結合すること、あるいは（２）植物における遺伝子の発現を調節すること、の少なくともいずれかを行うことができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド配列およびこれに対応するポリペプチド配列は、被子植物および裸子植物を含む、いずれかの植物種において転写因子として機能する。
【００５４】
転写および翻訳のターミネーター：本発明の発現ＤＮＡコンストラクトには、典型的には、転写開始調節エレメントの反対側に転写終結領域がある。この転写終結領域は、発現を増強するｍＲＮＡの安定、および／または、遺伝子転写産物にポリアデニル鎖の尾部の付加のために選択される場合がある。
【００５５】
転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）：アグロバクテリアのＴ−ＤＮＡは、その境界内に含まれるヌクレオチド配列を別のゲノムに組み入れることが可能な因子として周知の遺伝子エレメントである。この点で、Ｔ−ＤＮＡは典型的には２つの「境界」配列に挟まれている。本発明の所望のポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーは、あるＴ−ＤＮＡの左側の境界様配列と右側の境界様配列との間に位置する場合がある。Ｔ−ＤＮＡに含まれる前記所望のポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーは、その発現、すなわち前記所望のポリヌクレオチドまたは選択可能なマーカーによってエンコードされるＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を促進するプロモーターおよびターミネーターの調節エレメントのような、さまざまな異なる植物特異的な（すなわち、天然の）、または外来の核酸と操作可能に連結している場合がある。
【００５６】
植物細胞の形質転換：植物細胞のゲノムに核酸を安定に挿入するプロセスをいう。形質転換は当業者に周知のさまざまな方法を用い、自然または人工的な条件下で起こる場合がある。形質転換は、原核または真核宿主細胞へ核酸配列を挿入するいずれかの知られた方法によって行われる場合があり、これら方法としては、アグロバクテリアを介する形質転換法、ウィルス感染法、ウィスカー法、エレクトロポレーション法、顕微注入法、ポリエチレングリコール処理法、熱ショック法、リポフェクション法および微粒子銃法を含む。
【００５７】
トランスジェニック植物：本発明のトランスジェニック植物とは、外来性の核酸が安定に組み込まれた少なくとも１個の細胞ゲノムを含むものをいう。本発明によると、トランスジェニック植物は、遺伝的に改変された細胞および細胞ゲノムを１つだけ含む場合があるか、複数ないし多数の遺伝的に改変された細胞を含む場合があるか、全ての細胞が遺伝的に改変されている場合がある。本発明のトランスジェニック植物は、所望のポリヌクレオチド、すなわち外来性の核酸の発現が、植物個体の特定の部分のみで起こる場合がある。したがって、トランスジェニック植物は、その構造の特定の部分には遺伝的に改変された細胞のみを含む場合がある。
【００５８】
変異体：ここで言う「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、ある特定の遺伝子の基準（すなわち天然、標準、所与の）ヌクレオチド配列から逸脱（ｄｅｖｉａｔｅ）したヌクレオチド配列をいう。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「類似体」という用語もヌクレオチド配列の「変異」した類型を指す。
【００５９】
「変異体」には、Ｍａｘｙｇｅｎに付与された特許に記載されているような「シャッフルされた（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）遺伝子」を指す場合もある。例えば、本発明で言う変異体は、引用によりここに取り込まれる米国特許第６，１３２，９７０号明細書に開示された方法および原理にしたがって改変された配列および所望のポリヌクレオチドの変異体も含む場合がある。
【００６０】
本明細書で用いられるところの木材組成は、木材の構造、外観または用途を変更するために改変可能な形質を指す。木材組成を決定する特性は、細胞壁の厚さと、細胞の長さと、細胞のサイズと、内腔の大きさと、細胞密度と、微繊維の角度と、引張強度と、引裂強度と、木材の色と、細胞分裂の所用時間および頻度とを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
木材パルプとは、さまざまな純度の木材から得られる繊維をいう。木材パルプは、紙、板紙、化学製品の製造に用いることができる。
【００６２】
本発明は、本明細書で説明する特定の方法論、プロトコール、ベクター、試薬等に限定されるものではないことが理解されるが、それは変更が可能だからである。また、本明細書で用いる用語法は特定の実施態様のみを説明する目的で用いられており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解される。また、本明細書および添付する請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、その文脈の中で特に明言しない限り、複数形も包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「遺伝子」というときは、１個または２個以上の遺伝子を指し、当業者等に知られた均等物等を含む。実際、当業者は、植物宿主系でいずれかの天然の（現在または将来知られる）遺伝子を発現させるためにここに説明する方法を利用することができる。
【００６３】
（単数または複数の）「単離された」核酸分子とは、天然の環境から移された核酸分子である、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。例えば、あるベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたものと考えられる。単離ＤＮＡ分子の他の例は、異種宿主細胞内で維持される組み替えＤＮＡ分子か、（部分的または実質的に）精製された溶液中のＤＮＡ分子かを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子の試験管内ＲＮＡ転写産物を含む。本発明の単離核酸分子は、人工合成で製造された分子も含む。
【００６４】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態か、クローニングや人工合成によって製造されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのようなＤＮＡの形態かの場合がある。前記ＤＮＡまたはＲＮＡは２本鎖または１本鎖の場合がある。１本鎖ＤＮＡは、コーディング鎖、別名センス鎖か、ノンコーディング鎖、別名アンチセンス鎖かの場合がある。
【００６５】
特に断らない限り、本明細書でＤＮＡ分子の配列決定により決定されたすべてのヌクレオチド配列は、（アプライド・バイオシステムズ社製、モデル３７００のような）自動シーケンサを用いて決定され、また本明細書で決定されたＤＮＡ分子にエンコードされたポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のとおり決定されたＤＮＡ配列を翻訳することによって予測された。したがって、かかる自動化手法により決定されたいずれかのＤＮＡ配列について当業者に知られているとおり、本明細書で決定されたヌクレオチド配列にはなんらかのエラーが含まれている場合がある。自動的に決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して典型的には少なくとも約９５％、より典型的には少なくとも約９６％ないし約９９．９％の同一性を有する。前記実際の配列は、当業者に周知の手作業によるＤＮＡ配列決定を含むの他のアプローチにより、より正確に決定することができる。当業者に知られているとおり、決定されたヌクレオチド配列中に実際の配列と比較してたった１個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳でフレームシフトを起こし、決定されたヌクレオチド配列によってエンコードされる予測アミノ酸配列が、このような挿入または欠失が生じた塩基から後は、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にエンコードされるアミノ酸配列とは全く異なったものになる。
【００６６】
特に断らない限り、ここに示す「ヌクレオチド配列」のそれぞれは、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔと略記）の配列として提供される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」の語は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドの場合はデオキシリボヌクレオチド配列を指し、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドの場合は、対応するデオキシヌクレオチド配列中における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）がウリジンリボヌクレオチド（Ｕ）に置換された、対応するリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）配列を指す。例えば、デオキシリボヌクレオチドの省略記号を用いて示される配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子への言及は、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが対応するリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣに置換され、各デオキシヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵに置換された配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。
【００６７】
本発明は、本明細書で説明される単離核酸分子の断片にも向けられる。表８に示されるヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子の断片は、以下に詳しく説明される診断プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡ断片を指す。もちろん、従来の雑種形成手法によれば、本発明の核酸分子の全長までの長さを有するより大きな核酸断片もプローブとして診断上有用であり、また、例えば、引用によりここにその開示内容全体が取り込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＪおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｄ．Ｗ．共編（２００１年）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに説明されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅用のプライマーとしても有用である。
【００６８】
例えば、少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有する断片とは、表８に示したヌクレオチド配列由来の２０個以上の連続した塩基を有する断片をいう。表８に列挙されたヌクレオチド配列を含む核酸は、当業者にはルーティン作業であろう従来のＤＮＡ合成法を用いて作成することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる切断または超音波処理による剪断は、さまざまなサイズの断片を作成するために簡単に利用することができる場合がある。代替的に、本発明のＤＮＡ断片は、既知の方法にしたがって、人工合成によって作成できる場合がある。
【００６９】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントな雑種形成条件下で上記の本発明の核酸分子におけるポリヌクレオチドの一部と雑種形成するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。あるポリヌクレオチドの「部分」と雑種形成するポリヌクレオチドとは、前記基準ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、および、３１ヌクレオチド以上と雑種形成する（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの）ポリヌクレオチドをいう。前記基準断片と雑種形成するこれらの断片は、診断プローブおよびプライマーとして有用である。本明細書で用いられるプローブは、表８の１個の核酸の少なくとも約１００個の連続する塩基として定義される。本発明の目的には、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および非特異的キャリアＤＮＡ１００μｇを含む雑種形成溶液中で２個の配列が２本鎖複合体を形成するとき、前記２個の配列は雑種形成するといえる。Ａｕｓｕｂｅｌら、第２．９節、補遺２７（１９９４年）を参照せよ。配列が「中程度のストリンジェンシー」で雑種形成するとは、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および非特異的キャリアＤＮＡ１００μｇを含む雑種形成溶液中で、６０°Ｃの条件をいう。「高度なストリンジェンシー」で雑種形成を行うには、温度を６８°Ｃに上昇させる。かかる中程度のストリンジェンシーの雑種形成反応を行った後、２Ｘ ＳＳＣおよび０．０５％ ＳＤＳの溶液中で室温にて５回、前記ヌクレオチドは洗浄され、さらに０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ溶液を用いて６０°Ｃで１時間洗浄される。「高度なストリンジェンシー」用には、洗浄温度を６８°Ｃに上昇させる。本発明の目的には、雑種形成したヌクレオチドとは、比活性１０，０００ｃｐｍ／ｎｇの放射能標識プローブ１ｎｇを用いて検出されるものであり、前記雑種形成ヌクレオチドは−７０°Ｃ、７２時間以内のＸ線フィルムへの露出の後明瞭に視認できる。
【００７０】
上記のとおり、本出願は、上記の核酸配列との同一性が、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である核酸分子に向けられる。１つの実施態様は、表８に示される核酸配列との同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である核酸分子を包含する。ある基準ヌクレオチド配列に対して例えば少なくとも９５％「同一性がある」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、前記基準ヌクレオチド配列の１００個のヌクレオチドあたり最大５個の点突然変異を含むかもしれないことを除いて、前記基準配列と同一であることを意味する。換言すれば、基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性があるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、前記基準配列のヌクレオチドの最大５％が欠失するかまたは別のヌクレオチドに置換されている場合があるか、前記基準配列のヌクレオチド総数の最大５％の数のヌクレオチドが前記基準配列に挿入されている場合がある。前記基準配列のこれらの突然変異は、前記基準ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に起こるか、あるいは、前記基準配列中のヌクレオチドの間に１個ずつ分散するか、または前記基準配列中の１個または２個以上のグループに分かれて分散してこれら両末端の間の任意の場所で起こる場合がある。
【００７１】
実際問題として、ある特定の核酸分子が基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するか否かは、当該技術分野で周知の標準的なアルゴリズムを用いて２個の分子の間の比較を行うことで判る。配列の同一性の決定にはいかなる配列決定アルゴリズムを用いてもよいが、明確にするために、本発明はＢａｓｉｓ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３−４１０頁（１９９０年））を用いて同一性を決定し、本開示内容に示されるプロモーター配列が、その全長にわたってポリヌクレオチド相同体の同一性の百分率を決定するための基準配列として用いられる。より生物学的に現実性のある結果をもたらすパラメータはいくつか知られているが、一致、不一致、および挿入または欠失のパラメータ値の選択は任意である。
【００７２】
本発明にしたがって、ある特定の配列が基準配列に対して、例えば、９５％の同一性を有しているか否かを決定するためにＢＬＡＳＴその他の配列アライメントプログラムを用いるときには、同一性の百分率が前記基準ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、前記基準配列中のヌクレオチド総数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
【００７３】
２個のポリヌクレオチドの間の関連度（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）は、前記ポリヌクレオチドが雑種形成して相補的塩基対の形成によって２本鎖複合体を形成する能力に関連づけて説明することができる。雑種形成条件については既に説明した。温度の上昇はこれらの複合体を解離するのに利用することができる。２つの配列の構造的な同一性が大きいほど、両者を解離または「融解」させるのに必要な温度は高くなる。２本鎖複合体を融解させるのに必要な温度は「Ｔｍ」と呼ばれる。Ｔｍと他の雑種形成パラメータとの関係は、次式で表される。
Ｔｍ（°Ｃ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ分画）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／ｌ）
前記式で、Ｔｍはプローブとその標的とからなるＤＮＡ２本鎖複合体の融解温度であり、ｌは雑種形成体の長さ（単位：塩基対）、但しｌ＞１００塩基対である。Ｂｏｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４８巻、１３９０頁（１９６２年）を参照せよ。一般に、融解温度が１°Ｃ変化することは、ＤＮＡ配列の類似度に０．７％から３．２％までの相違があることを表す。Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８１巻、１２３−３５頁（１９７３年）；ＭｃＣａｒｔｈｙら、ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｈ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈ編、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏ．２３、Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅａｃｈ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−４３頁（１９７２年）。安定なＤＮＡ２本鎖複合体を６０°Ｃで形成するには、配列の間に少なくとも８０％の配列同一性が必要である。Ｓｉｂｌｅｙら、ＡＣＴＡ、１巻、８３−１２１頁（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｎｉｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、８月１６〜２４日、１９８２年、ソ連科学アカデミー）。
【００７４】
本発明の核酸は、植物の維管束組織においてポリペプチドまたはタンパクを優先的に発現させる。また本発明の核酸は、標的遺伝子の発現を阻害または完全にブロックする目的で使用可能な、アンチセンスＲＮＡの発現、または、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与するＲＮＡの発現を植物の維管束組織において優先的に行わせることができる。
【００７５】
本明細書で用いられる維管束植物組織とは、木部、篩部または維管束の形成層組織をいう。１つの実施態様では、本発明のプロモーターは「木部特異的」、「形成層特異的」および／または「篩部特異的」のいずれかであり、それぞれ木部、形成層および／または篩部におけるある操作可能に連結した核酸セグメントの発現を指令する。本明細書で用いられる「コード産物（ｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、前記プロモーターに操作可能に連結した核酸の最終産物を意味する。例えば、タンパクまたはポリペプチドと、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとはコード産物であり、ｓｉＲＮＡは前記アンチセンスＲＮＡの核酸コーディングの最終産物である。またコード産物は非翻訳ｍＲＮＡの場合がある。本明細書では、ポリペプチドおよびタンパクという用語を互換的に用いる。例えば木部特異的とは、本発明の核酸分子が他のいかなる植物組織におけるよりも木部において活性が高いことを意味する。１つの実施態様において本発明の核酸は、それぞれ植物の木部、形成層、および／または篩部組織でのみ活性があるという意味で、木部、形成層および／または篩部で特異的に活性を示すプロモーターである。換言すれば、例えば「木部特異的」プロモーターは、検出可能なレベルのコード産物は植物の木部組織においてのみ発現するように、前記コード産物を発現させる。しかし、植物個体内での溶質輸送のために、木部、篩部または形成層で特異的に発現するコード産物が植物個体内の他の場所で見出される場合があるため、その存在は必ずしも木部組織には限定されない。一方、維管束優先発現的プロモーターは、木部、篩部または形成層組織のいずれかにおいて、あるいはこれら３つの組織タイプのうち少なくとも２つにおいて優先的に活性を示すことができる。維管束特異的プロモーターは、木部、篩部または形成層のいずれかにおいて、あるいはこれら３つの組織タイプのうち少なくとも２つにおいて特異的に活性を示すことができる。
【００７６】
本明細書で用いられる維管束系は、高等植物において水および光合成産物の輸送に用いられる木部および篩部の各組織と、該木部と篩部との間に位置する維管束形成層とから構成される。維管束系の構成要素としては、木部と篩部とをまとめて維管束組織と呼ぶ。維管束組織は、２つの発生学的に区別される段階で形成される。胚形成段階および／または胚形成後の段階では、頂端分裂組織および前形成層の分化から一次維管束組織が発生する。二次維管束組織は、維管束形成層の分化から発生する。
【００７７】
維管束形成層は、木部と篩部との間に位置する側生分裂組織であり、分化して二次維管束組織を生成する。維管束形成層は、紡錘形原始細胞および木質線原始細胞という２つの細胞タイプで構成され、これらは形成層原始細胞と総称される。紡錘形原始細胞の分裂は、木部および篩部の長手方向、すなわち軸系を形成し、線原始細胞の分裂は、横方向、すなわち線系の発達をもたらす。形成層原始細胞は、木部細胞が長軸の内側に向かって凝集し、篩部細胞が周辺へ向かって凝集するように、軸の接線方向に分裂する。
【００７８】
本明細書で用いられる木部とは、水やミネラルイオンを根系から植物の空中部分へと輸送する伝導組織をいう。一次および二次木部組織の両方とも、異なる３つの細胞タイプ、すなわち、導管要素、繊維および柔細胞を含む。導管要素は、無孔仮導管および有孔導管要素を含み、水の導通機能を果たす。木部繊維は、繊維仮導管および靱皮状繊維を含み、木部の構造に強度および剛性を与える。柔細胞は、軸細胞および放射細胞を含み、デンプン、油その他のエネルギーの豊富な分子の貯蔵に重要である。したがって、本発明の木部特異的プロモーターは、一次および／または二次木部の導管要素、繊維および／または柔細胞で活性がある。
【００７９】
篩部は、光合成産物を成熟した葉から成長および貯蔵を担う領域へと移動させる植物組織である。一次および二次篩部組織の両方を含む主な細胞は、篩要素、柔細胞および繊維を含む。篩要素は、篩部の伝導要素であって、裸子植物に存在する篩細胞か、被子植物に存在する篩管かを含む。篩管要素は篩管と呼ばれる固有の構造を形成し、篩管は、縦方向に配列され、篩板と呼ばれる細胞壁の一部を通じて相互に連絡する一連の篩管要素でできている。これに対し、裸子植物や下等維管束植物に存在する特殊化の程度の低い篩細胞は、相互に連絡して篩板を形成することはない。篩細胞は、篩域と呼ばれる拡大した孔部を通じて伝導が容易になるように、重複したアレイ状に配置される。篩要素は、被子植物では伴細胞、裸子植物では胚乳細胞と呼ばれる特殊な柔細胞と連携し、かつ、依存している。伴細胞および胚乳細胞の両方とも、篩要素の機能に必要なタンパクおよび代謝産物の貯蔵を担う。前記特殊な柔細胞に加え、篩部は、デンプン、脂肪その他の化合物を蓄積し貯蔵する機能がある柔細胞を含む。篩部繊維は篩部構造に強度を与え、場合によりデンプンの貯蔵に寄与する。したがって、本発明の篩部特異的プロモーターは、一次および／または二次篩部の篩要素、柔細胞、および／または繊維で活性がある。
【００８０】
ほとんどの高等植物において維管束組織は、基本組織間に位置する円筒状をしている。根と茎の両方で、髄と皮層とが基本組織を構成する。髄は維管柱の内部に位置し、皮層は表皮と維管束組織との間に位置する。維管束系とこれに付随する基本組織を、維管柱と総称する。
【００８１】
本明細書で用いられるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節エレメントに結合する核酸、好ましくはＤＮＡを意味する。他のいかなるプロモーターと同様、本発明のプロモーターは、該プロモーターと操作可能に連結している核酸分子からｍＲＮＡ分子を生成するために、ＤＮＡまたはＲＮＡを転写することを促進または制御する。前記のとおり、生成されたＲＮＡはタンパクまたはポリペプチドをコードするか、あるいはＲＮＡ干渉、またはアンチセンス分子をコードする場合がある。本明細書で用いられる「操作可能に連結した」とは、ＲＮＡセグメントに転写されるべき核酸配列に対してプロモーター−核酸配列の組合せが適切な配向で形成されるような、化学的融合、連結、またはＤＮＡ合成をいう。本発明のプロモーターは、生成するｍＲＮＡ転写産物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の一部または全部を含む場合がある。一方、本発明のプロモーターは、必ずしも５’ＵＴＲを有している必要はない。
【００８２】
本明細書で用いられるプロモーターは調節エレメントを含む場合もある。逆に、調節エレメントがプロモーターから分離される場合がある。調節エレメントはプロモーター領域に多数の重要な特徴を与える。一部のエレメントは、前記操作可能に連結した核酸の転写速度を増大させる転写因子と結合する。他のエレメントは、転写活性を阻害するリプレッサーと結合する。転写因子がプロモーター活性に総合的に及ぼす影響は、該プロモーター活性が高いか低いか、すなわち、プロモーターが「強い」か「弱い」かを決定する場合がある。調節エレメントと結合する転写因子自身が、他の結合タンパクとの相互作用または細胞外刺激に応答する共有結合による修飾、例えばリン酸化によって調節される場合がある。一部の転写因子は、細胞内代謝産物か、その生物個体にとって外来性の化学物質かのような細胞核と情報交換する情報伝達分子によってモジュレーションされる。細胞環境の変化によって影響を受けないプロモーターは、構成的プロモーターと呼ばれる。
【００８３】
本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクターも提供する。１つの実施態様において、本発明のベクターはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉ−プラスミドである。
【００８４】
本発明の核酸コンストラクトを開発するとき、前記コンストラクトまたはその断片のさまざまな構成要素を便利なクローニングベクター、例えば大腸菌のような細菌宿主内で自己複製能を有するプラスミドに通常の手法で挿入されるのが普通であろう。多数のベクターが文献に記載され、その多くは市販されている。それぞれのクローニングが終了した後、所望のインサートを有するクローニングベクターが単離され、所望の配列の構成要素を仕立てるために、制限消化、新しい断片またはヌクレオチドの挿入、連結、欠失、突然変異、再切断等の他の操作に供される。前記コンストラクトは、完成すると、宿主細胞の形質転換のやり方にしたがってさらなる操作を行うために適当なベクターに移植される場合がある。
【００８５】
本発明の組換えＤＮＡ分子は、形質転換された細胞を容易に同定し、形質転換されていない細胞から選別できるように、選択可能なマーカーを含むのが典型的である。かかるマーカーの例は、カナマイシン耐性を可能にするネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、（１９８５年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９巻、１８３−１８８頁）を含むが、これに限定されない。ｎｐｔＩＩ遺伝子を発現する細胞は、カナマイシンまたはＧ４１８のような適当な抗生物質を用いて選択できる。他の慣用される選択可能なマーカーは、ビアラホス耐性を可能にするｂａｒ遺伝子と、グリホセート耐性を可能にするＥＰＳＰシンターゼ遺伝子突然変異体（Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、９１５−９２２頁（１９８８年））と、ブロモキシニル耐性を可能にするニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒら、（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻、６３１０−６３１４頁）と、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を可能にするアセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）突然変異体（欧州特許第１５４，２０４号、１９８５年）と、メトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻、１２５００−１２５０８頁）とを含む。
【００８６】
さらにベクターは、特定の宿主細胞の複製開始点（レプリコン）を含む場合がある。さまざまな原核生物のレプリコンが当業者に知られており、原核宿主細胞中における組換え分子の自己複製と維持を指令する役割を果たす。
【００８７】
ベクターは、選択可能なマーカーを含むことが好ましい。トランスフェクションされた植物の選択に用いるための多数の選択可能なマーカーはカナマイシン、グリホセート耐性遺伝子を、大腸菌、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓその他の細菌中で培養するための選択可能なマーカーはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ含むが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明の核酸を微粒子銃法によって単子葉植物に導入するのに適したプラスミドベクターは、選択したプロモーターと、Ｈｓｐ７０イントロン（国際公開第ＷＯ９３／１９１８９号公報）のような遺伝子発現を促進するスプライシング部位を提供するイントロンと、ノパリンシンターゼ３’配列（ＮＯＳ３’、Ｆｒａｌｅｙら（１９８３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８０巻、４８０３−４８０７頁）のような３’ポリアデニル化配列とで構成される。この発現カセットは、ＤＮＡの大量生産に適したハイコピーレプリコン上に構築される場合がある。
【００８９】
特に有用な双子葉植物の形質転換用アグロバクテリア利用植物形質転換ベクターは、プラスミドベクターｐＭＯＮ５３０（Ｒｏｇｅｒｓら、（１９８７年）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｅｘｐｒｅｓｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．、Ｒ．Ｗｕおよび Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ共編、２５３−２７７頁、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）である。プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ３１６（Ｒｏｇｅｒｓら、（１９８７年）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．、Ｒ．Ｗｕおよび Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ共編、２５３−２７７頁、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）のＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．３ｋｂ）をｐＭＯＮ５２６に移植して調製されたｐＭＯＮ５０５の誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５２６は、前記ＳｍａＩ部位がＸｍａＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ処理および連結によって除去されたｐＭＯＮ５０５の単純な誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ５０５およびＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ発現カセットの特性のすべてを保持し、プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に唯一のＳｍａＩ切断部位を持つことになる。
【００９０】
バイナリーベクターｐＭＯＮ５０５は、Ｔｉプラスミド相同領域ＬＩＨが、ミニＲＫ２プラスミドｐＴＪＳ７５（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ．、（１９８５年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４−１５５頁）の３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩセグメントに置換されたｐＭＯＮ２００（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８７年）の誘導体である。このセグメントは、トリペアレンタル（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ）交配法によるアグロバクテリアへの接合に用いられるＲＫ２複製開始点ｏｒｉＶと転移起点ｏｒｉＴとを含む（ＨｏｒｓｃｈおよびＫｌｅｅ、（１９８６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ．、８３巻、４４２８−４４３２頁）。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、所望のＤＮＡ断片を挿入するための合成マルチリンカーと、植物細胞におけるカナマイシン耐性ＮＯＳ／ＮＰＴＩＩ’／ＮＯＳキメラ遺伝子と、大腸菌およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける選択用のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定因子と、形質転換体のスコアリングおよび後代での遺伝子保持の確認を容易化するインタクトなノパリンシンターゼ遺伝子と、大腸菌体内でベクターの大量生産を可能とするｐＢＲ３２２複製開始点とを含む、ｐＭＯＮ２００の重要な特徴をすべて保持する。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、ｐＴｉＴ３７ノパリン型Ｔ−ＤＮＡの右端に由来する単一のＴ−ＤＮＡ境界を含む。サザンブロット分析は、プラスミドｐＭＯＮ５０５およびこれに含まれるすべてのＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれていること、すなわち、プラスミド全体が植物ゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡであることを示す。組込みＤＮＡの一端は、右境界配列とノパリンシンターゼ遺伝子との間に位置し、他端は前記境界配列とｐＢＲ３２２配列との間に位置する。
【００９１】
別の特に有用なＴｉプラスミドカセットベクターは、ｐＭＯＮ１７２２７である。このベクターは、国際公開第ＷＯ９２／０４４４９号公報に記載されており、ジャガイモ、トマトを含む多くの植物の優れた選択マーカーである、グリホセート耐性を可能にする酵素（ＣＰ４と命名）をエンコードする遺伝子を含む。この遺伝子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ２）と融合し、選択したプロモーターによって発現する。
【００９２】
小胞体ルーメン、ペリプラズム間隙または細胞外環境へ翻訳されたタンパクを分泌するために、適当な分泌シグナルが発現したポリペプチドに組み込まれる場合がある。前記シグナルは、前記ポリペプチドに内在するものであっても、あるいは、異種シグナルであってもよい。
【００９３】
１つの実施形態では本発明のベクターは、本明細書で説明される核酸が、関心のあるポリペプチドをエンコードするＤＮＡに操作可能に連結した組織特異的プロモーターとなるように設計される。別の実施態様では、関心のあるポリペプチドは植物個体におけるリグニン生合成に関与する酵素である。リグニン生合成に関与する多くの酵素をエンコードするポリヌクレオチドは、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、クマレート３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ＰＮＬ）、Ｏ−メチルランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびマツ由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）（米国特許第６，２０４，４３４号）を含むが、これらに限定されない。他の酵素は、コニフェリンβ−グルコシダーゼ（ＣＢＧ）およびカフェイン酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）を含む（米国特許第５，４５１，５１４号明細書、国際公開第ＷＯ９４／２３０４４号明細書、およびＤｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０巻、３６５−７２頁（１９９９年））。
【００９４】
別の実施態様では、前記プロモーターに操作可能に連結されたコーディング配列は、リグニン生合成に関与する酵素の発現または活性を阻害する遺伝子産物をコードする場合がある。例えば、リグニン生合成の制御にとって特に関心があるのは、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、クマレート３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ＰＮＬ）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびマツ由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）に対するアンチセンス遺伝子である。
【００９５】
さらに別の実施態様では、本発明のベクターは、本発明の核酸が、関心のあるポリペプチドをコードする遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡをエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡに操作可能に連結し、これによって標的遺伝子産物の発現を弱めるように設計される。抑制の標的となる遺伝子産物は、上記のとおり、リグニン生合成に関与する酵素であることが好ましい。遺伝子発現のＲＮＡｉ阻害の利用は、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、１６巻、９４８−９５８頁（２００２年）に概説されており、また遺伝子発現を阻害するためのＲＮＡｉの利用は、国際公開第ＷＯ９９／６１６３１号公報に具体的に記載されており、両文献は、引用によりここに取り込まれる。
【００９６】
特定の植物遺伝子の発現を低減または阻害するためのアンチセンス技術の利用は、例えば欧州出願公開第２７１９８８号公報に記載されている。遺伝子発現の低減は、植物の表現型に変化をもたらし、それは例えば、トマト果実中のリコピン合成欠損のため赤くなるはずの実が黄色くなるといった目に見えるレベルの表現型の差異か、あるいは例えばトマト果実の成熟過程におけるポリガラクトウロナーゼ量の変化およびペクチンの脱重合の低減のような、より微小な生化学的レベルかのいずれかで現れる（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４巻、７２４−７２６頁（１９８８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４巻、３６９−３７９頁（１９９０年））。このように、アンチセンスＲＮＡは植物における遺伝子発現を低下させる上で有用であることが実証されている。
【００９７】
本発明の植物の作成方法の１つの実施態様では、植物個体内で転写されてアンチセンスＲＮＡ転写産物を生成する外来性のＤＮＡは、植物個体内、例えば植物細胞内に導入される。前記外来性ＤＮＡは、例えばそのプロモーターに対する遺伝子配列の配向を反転することにより調製することができる。植物細胞内における前記外来性ＤＮＡの転写は、その遺伝子に対して「アンチセンス」な細胞内ＲＮＡ転写産物を生成する。
【００９８】
例えばアンチセンス技術は、４ＣＬのようなリグニン生合成に関与する酵素をエンコードする遺伝子の発現を抑制するために用いられる場合がある。４ＣＬのアンチセンスＤＮＡ配列を含むコンストラクトは、プロモーターに操作可能に連結された４ＣＬをエンコードする外来性ＤＮＡの配向を反転することにより調製することができる。前記外来性の４ＣＬＤＮＡの植物細胞における転写は、アンチセンス配向の４ＣＬＲＮＡ転写産物を生成する。
【００９９】
また本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で用いられる宿主細胞とは、コード産物が最終的に発現される細胞をいう。したがって宿主細胞は、個々の細胞、細胞培養、または生物個体の一部である複数の細胞であり得る。また宿主細胞は、胚、胚乳、精子または卵子、または受精卵の場合がある。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはベクターは、標的宿主生物への組換えベクターＤＮＡを導入するための当該技術分野で知られた標準的な手順によって宿主細胞に導入される。かかる手順は、トランスフェクション、感染、形質転換、自然取込み、エレクトロポレーション法、微粒子銃法およびアグロバクテリアの使用を含むが、これらに限定されない。生物学的および物理的な植物形質転換プロトコールを含む、外来遺伝子を植物に導入する方法は当該技術分野で知られており、本発明の遺伝子コンストラクトを植物宿主に挿入するために用いられる場合がある。例えば、Ｍｉｋｉら、１９９３年、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ共編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、６７−８８頁を参照せよ。選択される方法は宿主植物によって異なり、リン酸カルシウムのような化学的トランスフェクション法、アグロバクテリアのような微生物を介した遺伝子導入（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７巻、１２２９−３１頁、１９８５年）、エレクトロポレーション法、顕微注入法、および微粒子銃法を含む。
【０１０１】
したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはベクターを含む、植物個体または植物細胞も提供する。１つの実施態様では前記植物は、被子植物または裸子植物である。別の実施態様ではこれら植物は、ユーカリ属およびマツ属の種から選択される。特にトランスジェニック植物は、ユーカリ・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）およびその交雑種、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ Ｌ、ｌｏｂｌｏｌｌｙ ｐｉｎｅ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）、カロリナポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）またはモミジバフウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂｅｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ）に属する植物種の場合がある。通常の植物の意味を超え、本明細書では「植物」の語を植物の果実、種子、花、胞子嚢等も指すものとする。本発明の植物は、直接トランスフェクション体、すなわちベクターがアグロバクテリアを介するやり方のように直接的に導入されるか、あるいはトランスフェクションされた植物の子孫植物の場合がある。前記子孫は、トランスフェクションされた植物の無性生殖によって得られる場合がある。第２世代またはその以降の世代の植物は、有性生殖すなわち受精によって作成される場合も、そうでない場合もある。さらに前記植物個体は、配偶体（単相期）または胞子体（複相期）の場合がある。
【０１０２】
本発明はまた、本発明のベクターを含む植物または種子を栽培することを含む、植物のリグニン含量の制御方法を提供する。本発明の植物または種子の成長または発芽を誘導または維持する適切な栽培法は種特異的であり、本発明の属する技術分野の通常の知識レベルの範囲内である。栽培場所は、植物個体または種子の成長または発芽を促進できるいかなる場所でもよい。さらに、栽培には、葯および／または小胞子内に胚形成を誘導できるストレス処理（例えば、窒素欠乏、熱ショック、ショ糖欠乏）が含まれていてもよいが、ストレス処理はこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明はさらに、転写因子と結合し、組織優先発現的または組織特異的な発現を調節する能力を有する単離調節エレメントも提供する。前記調節エレメントによって実現される調節の程度は、完全、すなわち、前記転写因子無しでは転写が検出できない場合もあるが、部分的、すなわち、前記転写因子の存在下で転写が増強される場合もある。１つの実施態様では、複合プロモーターを用意するために、少なくとも１個の調節エレメントが異種プロモーターに連結される。前記複合プロモーターは、維管束組織内で優先的または特異的に発現させる。本明細書で用いられる異種プロモーターは、前記調節エレメントとの関係で定義される。自然環境で調節エレメントとプロモーターとが互いに協働していない場合は、そのプロモーターはその調節エレメントに対して異種とされる。典型的には、ある調節エレメントのプロモーター領域内での正確な配向はその活性に影響しない。さらに調節エレメントは、異種プロモーター領域に挿入されたときでも正常に機能することができる。したがって、例えば、木部特異的発現または木部優先的発現を実現するために、木部優先発現的調節エレメントが本来のプロモーターから取り出されて異種プロモーター領域に挿入される場合がある。同様に、篩部特異的発現または篩部優先的発現を実現するために、篩部優先発現的調節エレメントがその本来のプロモーターから取り出されて異種プロモーター領域に挿入される場合がある。同様に、形成層特異的発現または形成層優先的発現を実現するために、形成層優先発現的の調節エレメントがその本来のプロモーターから取り出されて異種プロモーター領域に挿入される場合がある。前記異種プロモーターは、例えば最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの場合がある。最小プロモーターに改変するのに適した植物細胞内での発現を指令するプロモーターは、カリフラワーウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻、３９０１−０７頁（１９８７年））、コメのアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２巻、１６３−７１頁（１９９０年））、トウモロコシのユビキチン−１プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５巻、２１３−１８頁（１９９６）年）、およびノパリンシンターゼプロモーター（Ｋｏｎｏｎｏｗｉｃｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、１７−２７頁（１９９２））を含む。
【０１０４】
本発明の核酸を調製するにあたり、さまざまな制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムをばらばらの断片に消化し、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）およびユーカリ・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）からゲノムライブラリが作成された。ゲノムライブラリは、組織選択的プロモーターを得るのに適したいかなる植物種からも同様に構築することができる。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（カリフォルニア州、パロアルト）のＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒシステム（登録商標）用に提供される手順にしたがって、アダプターがこれらゲノム配列の各々に連結された。次にプロモーター配列は、アダプター特異的プライマーと「遺伝子特異的プライマー」とを用いてＰＣＲ法で増幅された。代替的には、このＰＣＲ増幅のステップは、任意的に長鎖でバックグランドが最小の反応生成物を産生する方法であって、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，５６５，３４０号および第５，７５９，８２２号明細書に記載される方法により実行される場合がある。この一般的なＰＣＲ増幅法を用いることにより、本発明のプロモーターの同定およびその組織選択的プロモーターとしての同定は、前記「遺伝子特異的プライマー」の選択よって左右される。
【０１０５】
遺伝子特異的プライマーは、関心のある組織内で高度に発現されるいずれかの転写配列である。本発明では、遺伝子特異的プライマーは、維管束組織中で高度に発現されるｍＲＮＡの断片か、あるいは該ｍＲＮＡに対して相補的である。１つの実施態様では、前記遺伝子特異的プライマーは、特定の維管束組織のタイプにおいて特異的に発現することが知られている遺伝子に対する相同性によって選択される。特に関心のある遺伝子は、ある特定の維管束組織中で高度に発現される遺伝子であり、これは対応するプローモーターの維管束選択的活性の指標となるのが典型的である。
【０１０６】
発現配列タグ（ＥＳＴ）は遺伝子特異的プライマーの別の供給源である。ＥＳＴは、あるライブラリ中に存在する対応ｍＲＮＡのｃＤＮＡ断片である。いずれかの植物ＥＳＴデータベースが、所望の組織タイプで特異的に発現することが知られている遺伝子のセグメントとの同一性があるＥＳＴを捜すために、電子的に検索される場合がある（「インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）スクリーニング」）。したがってこれらのＥＳＴは、あるゲノムライブラリ内の対応する遺伝子のプロモーターの増幅に用いられる遺伝子特異的プライマーを提供する。増幅された遺伝子プロモーターは、ＥＳＴデータベースの構築の元となる植物種と同じ植物種に由来するものである必要はない。前記ＥＳＴが、関心のある遺伝子プロモーターに対して、前記遺伝子の標的セグメントのＰＣＲ増幅用プライマーとして作用するのに十分な配列類似性を備えていることだけが必要である。
【０１０７】
組織特異的プロモーターを同定する代替的な方法は、ある組織タイプ内では発現するが他の組織内では発現しないｍＲＮＡは組織特異的プロモーターから転写されたことを意味するので、かかるｍＲＮＡの検出に基づく。ｍＲＮＡの集団は、例えばサブトラクティブハイブリダイゼーション法により、この原理で区別することができる。かかるサブトラクティブハイブリダイゼーション法の１つの例は、ＣｌｏｎｔｅｃｈによるＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）法である。
【０１０８】
代替的には、組織特異的ｍＲＮＡの分布は、植物組織の薄切片を放射標識プローブとｉｎ ｓｉｔｕで雑種形成させることにより、決定することができる。特定の組織タイプを放射能で反応するプローブは、以下に説明する方法を用いるゲノムライブラリのサザン分析により、ｍＲＮＡと関連するプロモーターを検出するのに用いられる。前記の技術は全て関心のある組織、ここでは維管束組織からのｍＲＮＡライブラリの作成を要する。例えば、木部組織からのｃＤＮＡライブラリの調製は、Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０巻、３６５−７２頁（１９９９年）およびＬｏｏｐｓｔｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７巻、２７７−９１頁（１９９５年）に記載されている。簡潔には、まず伐採した木から活発に分化している木部を剥ぎ取る。常法にしたがって全ＲＮＡが単離され、ポリ（Ａ）ＲＮＡが単離され、木部組織ｃＤＮＡライブラリを構築するために逆転写される。例えばＤｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａ（１９９９年）に説明されているように、前記ｃＤＮＡライブラリは、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ ｃＤＮＡ合成およびＧｉｇａｐａｋＩＩ Ｇｏｌｄ（登録商標）パッケージングキットを用いて、λＺＡＰ−ＸＲベクターで構築された。木部特異的プロモーターは、遺伝子特異的プローブと前記プロモーターの５’末端の配列を認識するプライマーとを用いて、ＰＣＲ法により、かかるｃＤＮＡライブラリからを単離することができる。遺伝子特異的プローブは、前記インシリコのアプローチによって、あるいは、もしｍＲＮＡ配列が既知の場合には、該ｍＲＮＡ配列にもとづく特異的プローブを設計することによって得られる場合がある。さらに、所望の標的遺伝子の５’ＵＴＲに相補的なプライマーが合成できる。代替的には、前記プライマーは、エンコードされたタンパクのアミノ酸配列の一部から、いわゆる縮重プライマーとして設計できる（Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａ（１９９９年）を参照せよ。）。
【０１０９】
関心のあるプロモーターを単離した後は、さまざまな手法がその組織特異的発現パターンやプロモーターの強さを調べるために利用できる。慣用される方法の１つは、前記プロモーターをアッセイの容易なレポーター遺伝子と操作可能に連結させることである。例えば、木部優先発現的プロモーターと、グニーユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕｎｎｉｉ）シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＥｇＣＣＲ）遺伝子（位置：−１４４８〜＋２００、ただし＋１が転写開始部位）の５’ＵＴＲとが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をエンコードする遺伝子と操作可能に連結される（Ｌａｃｏｍｂｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２３巻、６６３−７６頁（２０００年））。適切な発現コンストラクトは、周知の方法にしたがって作出することができる。
【０１１０】
植物の形質転換は、米国特許第６，０５１，７５７号明細書に説明されるアグロバクテリアを介した形質転換法を含む多数の適切な方法のいずれかを用いて行うことができる。樹木を形質転換する当該技術分野における他の方法が、加速粒子による裸子植物の体細胞胚の形質転換を開示する米国特許第６，５１８，４８５号明細書に代表されるように、本発明の技術分野で知られている。他の形質転換法は、微粒子銃法（Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、５５９−６３頁（１９８８年））、エレクトロポレーション法（Ｄｈａｌｌｕｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、１４９５−１５０５頁（１９９２年））、およびポリエチレングリコール処理法（Ｇｏｌｏｖｋｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、９０巻、４１−５２頁（１９９３年））を含む。さらに、米国特許第６，１８７，９９４号明細書は、リコンビナーゼに支援される形で発現コストラクトを植物ゲノム中の特異的選択部位に挿入する方法を提供する。上記の特許および文献はすべて引用によりここに含まれる。
【０１１１】
本発明のＤＮＡ分子は、いずれかの適当な方法を用いて植物のゲノムに挿入できる。好適な植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するものと、例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、２０９頁（１９８３年）と、Ｂｅｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１２巻（２２号）（１９８４年）、８７１１−８７２１頁と、Ｋｌｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３巻（７号）、６３７−６４２頁（１９８５年）と、欧州特許出願公開第１２０，５１６号公報に開示されるものとを含む。アグロバクテリアのＴｉまたは根誘導（Ｒｉ）プラスミドから誘導される植物形質転換ベクターに加えて、代替的な方法が、本発明のＤＮＡコンストラクトを植物細胞に挿入するために利用可能である。かかる方法は、例えば、リポソームの使用と、エレクトロポレーション法と、遊離ＤＮＡの取込みを増大させる化学物質と、微粒子銃による遊離ＤＮＡの送達と、ウィルスまたは花粉を用いる形質転換とを含む場合がある。ＤＮＡは、葉緑体のゲノムに挿入される場合もある（Ｄａｎｉｅｌｌら（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３４５−３４８頁）。
【０１１２】
関心のある核酸を含む細胞（またはプロトプラスト）が適当な数だけ得られると、該細胞（またはプロトプラスト）は完全な植物個体に再生される。再生ステップのための方法論の選択は重要ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバー等）と、セリ科（ニンジン、セロリ、パースニップ）と、アブラナ科（キャベツ、ダイコン、ナタネ等）と、ウリ科（メロンおよびキュウリ）と、イネ科（コムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ等）と、ナス科（ジャガイモ、タバコ、トマト、コショウ）と、ヒマワリのようなさまざまな花卉作物と、アーモンド、カシュー、クルミ、ペカンのようなナッツを産する樹木とに由来する宿主について適切なプロトコルは入手可能である。例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏら、（１９８４年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．と、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．（１９９０年）ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、４月１６〜２２日、１９９０年、コロラド州、キーストーンと、Ｖａｓｉｌら、（１９９０年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻、４２９−４３４頁と、Ｖａｓｉｌら、（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、６６７−６７４頁と、Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９０年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９３巻、８５７−８６３頁と、Ｄａｔｔａら（１９９０年）とを参照せよ。
【０１１３】
プロモーターとレポーター遺伝子とを含むベクターは、該ベクターで形質転換に成功した植物細胞を選択するメカニズムを備え、例えばカナマイシン耐性を有する場合がある。形質転換体中のＧＵＳ遺伝子の有無は、ＧＵＳ特異的ＰＣＲプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト）を用いてＰＣＲ法で確認される場合がある。形質転換された植物細胞の子孫におけるカナマイシン耐性の分離は、安定に挿入された前記ベクターを宿す遺伝子座の数を決定するためにサザン分析と組み合わせて利用される場合がある。プロモーター発現の時間的および空間的パターンは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻、３９０１−０７頁（１９８７年）の記載にしたがって、レポーター遺伝子発現の定量化から推測される。一般にＧＵＳの発現は、先ず９０％アセトンで固定した後、ＧＵＳの基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を含む緩衝液中で固定された植物組織の薄切片中で組織化学的に決定される。ＧＵＳ発現産物の有無は、Ｘ−Ｇｌｕｃを用いる比色定量反応により示される。
【０１１４】
例えば木部特異的な発現は、木部組織中で転写因子と特異的に結合する調節エレメントの存在によって実現される場合がある。木部特異的な発現の程度に影響する転写因子の間の相互作用は、調節エレメントの塩基対のサブセットと前記転写因子のアミノ酸残基とのアライメントに依存する。同様に、例えば篩部特異的または形成層特異的な発現は、それぞれ篩部および形成層組織中で転写因子を特異的に結合する調節エレメントの存在によって実現される場合がある。結合した転写因子と相互作用を行わない塩基対は、組織特異的転写因子を特異的に結合する調節エレメントの全体的な能力は維持したまま、他の塩基対に置換される場合がある。
【０１１５】
いったんプロモータが組織優先発現的または組織特異的と同定された後は、組織優先発現的または組織特異的プロモーターの活性に影響を与える調節エレメントの同定や特徴付けをするためにさまざまな方法論が利用できる。１つの方法では、前記プロモーター領域は５’末端が徐々に短くなるように切断され、切断された一連のプロモーターはそれぞれレポーター遺伝子に操作可能に連結される。調節エレメントが欠失すると、レポーター遺伝子の組織特異的発現が失われることからプロモーター活性への影響が推測される。代替的には、ＣａＭＶ３５Ｓ最小プロモーターのような最小プロモーターを含む発現コンストラクトに調節エレメントと推定される配列を挿入し（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６巻、７４７−５６頁）、前記調節エレメントと推定される配列が組織特異的発現を与えるか否かを確認することができる。最小プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位のような、プロモーター活性に不可欠な要素のみを含む。推定的な調節エレメントの解明についての追加例は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）および４−クマレートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をエンコードする遺伝子の転写を協調的に調節する組織特異的調節エレメントの研究によりもたらされている（Ｈａｔｔｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、７巻、８５９−７６頁（１９９５年）； Ｌｅｙｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、２６３−７１頁（１９９２年）； Ｈａｕｆｆｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４巻、２３５−５３頁（１９９３年）； Ｎｅｕｓｔａｅｄｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１８巻、７７−８８頁（１９９９年））。これらの文献はすべて、引用により本発明に含まれる。
【０１１６】
推定的な調節エレメントの位置決定を行う別の方法は、既知の維管束優先発現的または維管束特異的な調節エレメントの間で配列を比較することである。ヌクレオチド比較により、例えば維管束優先発現的調節エレメントのような既知の組織優先発現的調節エレメントと類似する領域が同定される。例えば、シンナミルＣｏＡレダクターゼと、フェニルプロパノイド産生に関与する他のプロモーターとの間でプロモーター配列を比較することにより、配列ＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣを有する保存されたＡＣリッチな領域の存在が明らかになる。Ｌａｃｏｍｂｅ（２０００年）を参照せよ。フェニルプロパノイド合成に関与するプロモーター中に前記配列が保存されていることは、保存されている前記配列が、複数の植物種でこれまでに同定されている、ＭＹＢのような協調的活性化転写因子に対する結合部位であることを意味する。Ｍａｒｔｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１３巻、６７−７３頁（１９９７年）を参照せよ。例えば、ＭＹＢ結合部位は、トウモロコシでは（［Ｃ／Ａ］ＴＣＣ［Ｔ／Ａ］ＡＣＣ）、ペチュニアでは（ＴＡＡＣ［Ｃ／Ｇ］ＧＴＴまたはＴＡＡＣＴＡＡＣ）と同定されている。同上。
【０１１７】
本発明の核酸配列にもとづいてこのような配列比較を行うことにより、以下の表１に示される一連のモチーフが明らかになる。表１のモチーフは、組織優先発現的または組織特異的転写因子に結合し、異種最小プロモーターの組織優先発現的または組織特異的発現のモジュレーションに利用できることが期待される。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
例えば、ｂＺＩＰタンパクと維管束特異的または維管束優先発現的なプロモーターとの相互作用は、当業者がどのように調節エレメントの特徴付けを行えるかについて、別の方法を提供する。例えば、グリシンリッチなタンパクであるｇｒｐｌ．８をエンコードする遺伝子は、ＧＲＰ１．８−β−グルクロニダーゼ融合タンパクの組織化学的染色から決定されるとおり、木部特異的に発現される。Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、８巻、１３０９−１４頁（１９８９年）。ｇｒｐｌ．８プロモーターの５’欠損試験は、維管束の特異的発現に必須な２０塩基対からなる負の調節エレメントを明らかにした。Ｋｅｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３巻、１０５１−６１頁。プロモーターの負の組織特異的調節によって作用する類似の木部特異的調節エレメントが、マメのｐａｌ２と、パセリの４ＣＬ−１とで同定されている。それぞれ、Ｌｅｙｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、２６３−７１頁（１９９２年）およびＨａｕｆｆｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４巻、２３５−５３頁（１９９３年）を参照せよ。木部の転写因子ＶＳＦ−１は、ｇｒｐｌ．８遺伝子の２０塩基対の前記調節エレメント配列と特異的な相互作用を行う。ＶＳＦ−１と調節エレメントとの相互作用は、結合特異性がＶＳＦ−１結合に関して競合する無標識ＤＮＡ標的によって示される電気泳動移動度シフトアッセイを用いて、ＶＳＦ−１と調節エレメントとによる高分子複合体の形成によって実証された。Ｔｏｒｒｅｓ−Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、 ９巻、２８３−９６頁（１９９６年）。さらにＶＳＦ−１が相互作用を行う正確な残基は、ＤＮａｓｅＩに対する調節エレメントの感受性を測定することによって解明された。簡潔には、ＶＳＦ−１と調節エレメントとの相互作用は、結合した前記転写因子の立体障害のために、ＤＮａｓｅＩがタンパクに接触した一部の残基を分解するのを防止する。典型的には、前記ＤＮＡａｓｅＩ分析は、前記転写因子が結合するときに過敏になる残基も明らかにする。前記推定的な調節エレメントが木部特異的であることを確認するために、前記推定調節領域の単量体または多量体が最小ＣａＭＶ３５Ｓまたは最小ｇｒｐ１．８プロモーターの上流に融合される。改変プロモーターに操作可能に連結され、タバコに安定的にトランスフェクションされた融合β−グルクロニダーゼ遺伝子を用いた組織化学的分析により、前記推定調節領域はこれらのプロモーターに木部特異的発現を可能にすることがわかった。Ｔｏｒｒｅｓ−Ｓｃｈｕｍａｎｎ（１９９６年）を参照せよ。
【０１２０】
本発明のプロモーターの機能変異体または断片
本発明のプロモーターのさらに別の変異体または断片は、前記配列全体にわたって散在する改変を有するものである。本明細書で用いられる機能変異体または断片とは、基準の核酸に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、しかもコード産物の組織特異的発現を依然として可能にする核酸をいう。前記機能変異体の組織特異性または優先発現性は、基準の核酸と同じ組織に対するものでなければならない。しかし、前記機能変異体が前記基準の核酸と同様の優先発現性または特異性を有していない場合でも、前記変異体は依然として本明細書で用いられる機能変異体と考えられる。１つの実施態様では、前記機能変異体または断片の配列は、前記基準の核酸に対して少なくとも約７５％の同一性を有する。別の実施態様では、前記機能変異体または断片の配列は、基準の核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１２１】
機能変異体を作成できる改変は、残基の５’末端からの逐次欠失、または５’ＵＴＲの３’末端からの欠失により作出される場合がある。代替的に内部残基が改変される場合もある。前記プロモーター領域の機能に影響を与えない改変は、転写因子の結合に影響を与えない改変である可能性が最も高い。本発明に含まれる改変は、本発明のプロモーターの対立遺伝子の変異体の形で天然に存在する改変を含む。本発明の変異体は、本明細書に説明される方法を用いてその器官または組織特異的活性、あるいは器官または組織優先発現的活性についてテストされる。
【０１２２】
本発明の核酸の作成方法
本発明の核酸は、周知の合成技術、標準的な組換え方法、精製技術、またはこれらの組合せを用いて得ることができる。例えば本発明の単離ポリヌクレオチドは、固相ホスホアミダイトトリエステル法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．、２２巻、１８５９−１８６２頁（１９８１年））、自動化合成装置（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２巻、６１５９−６１６８頁（１９８４年））、または米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載の固体支持法を用いて、直接的な化学合成により調製することができる。化学合成は１本鎖オリゴヌクレオチドを製造するのが一般的で、該１本鎖オリゴヌクレオチドは、相補的な配列との雑種形成か、あるいは、前記１本鎖オリゴヌクレオチドをテンプレートとして用いる重合かによって、２本鎖オリゴヌクレオチドに変換される場合がある。また、もっと長い配列は、短い配列を連結することによって得られる場合もある。
【０１２３】
代替的には、本発明の核酸は、互いにプライマーとして使用可能なオリゴヌクレオチドを用いる組換え法により得られる場合がある。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９０）を参照せよ。また、Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ、６０巻、１１５頁（１９８７年）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第３版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）も参照せよ。ポリメラーゼ連鎖反応を利用する確立された技術は、少なくとも２キロベースの長さを有するポリヌクレオチドを合成する能力を提供する。Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１巻、１１３１頁（１９９３年）、Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２巻、２６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎら、「Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ」、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１５巻：ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：ＣＵＲＲＥＮＴ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｗｈｉｔｅ編、２６３−２６８頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９３年）、Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、４巻、２９９頁（１９９５年）。
【０１２４】
本発明の核酸の使用方法
本発明の核酸は、植物の性質を変化させるのに有用である。前記核酸は、維管束組織に見出される分子のレベルを増大させるために、関心のある遺伝子と操作可能に連結される場合がある。代替的には、関心のある遺伝子は、最終生成物、例えばセルロースの形成を阻害する場合があるので、本発明の核酸は、維管束組織中の所定の分子のレベルを減小させるために用いられる場合がある。
【０１２５】
かかる発現操作の主な標的の１つは、リグニンの生合成経路である。上記の理由のため、植物個体のリグニン含量を正負いずれかに調節することに大きな関心が寄せられており、前記経路に影響を与える遺伝子産物の発現を通じて達成できる。例えば、米国特許第５，４５１，５１４号明細書および国際公開第ＷＯ９４／２３０４４号公報に記載されているように、ＣＡＤおよびＣＯＭＴのコピー数を操作すると、リグニン含量が改変される。さらに、ポプラまたはマツのＣＡＤをエンコードする配列のアンチセンス発現は、リグニン組成の改変をもたらす。それぞれ、Ｇｒａｎｄら、Ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌ．）、１６３巻、２３２−３７頁（１９８５年）；Ｂａｕｃｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２巻、１４７９頁（１９９６年）。
【０１２６】
変更が重要であるかもしれない他の性質には糖が含まれる。糖産生を担う酵素のレベルを例えば篩部組織で上昇させると、植物個体内の糖含量が増大する可能性がある。糖産生を増大または減少させる酵素は、β−グルコシダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、６−ホスホフルクト−１−キナーゼ、スクロースシンターゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、スクロース輸送体およびインベルターゼを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
さらなる性質は、植物の葉に存在する殺昆虫性、抗ウィルス性または抗菌性タンパクの増加を含むが、これらに限定されない。かかるタンパクは、セクロピン、チオニン、ディフェンシン、脂質輸送タンパク、ヘベイン様ペプチドおよびＧＡＳＡペプチドを含むが、これらに限定されない。さらに他の性質は、干魃耐性、耐寒性、ペルオキシダーゼ活性、耐塩性および窒素輸送を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
以上概説された本発明は、以下の実施例を参照することにより、一層容易に理解されるであろう。ただし、これらの実施例は例示を目的として提供されるものであって、本発明を限定する意図はない。
【実施例１】
【０１２９】
維管束特異的プロモーターの単離
ラジアータマツおよびユーカリ・グランディスのｃＤＮＡライブラリが以下のとおり構築され、スクリーニングされた。若干改変されたＣｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、１１巻、１１３−１１６頁、（１９９３年）のプロトコルを用いて、植物組織からｍＲＮＡが抽出された。具体的には、試料がＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０Ｍ ＮａＣｌ、２％ＣＴＡＢ、２％ＰＶＰおよび０．０５％スペルミジン＊３ＨＣｌ）に溶解され、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出された。
【０１３０】
ＲＮＡはエタノールで沈殿され、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて精製された。精製されたｍＲＮＡから、逆転写酵素（Ｌｏｏｐｓｔｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７巻、２７７−２９１頁（１９９５年））合成の後、得られたｃＤＮＡクローンをメーカー指定のプロトコルにしたがってＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＬａｍｂｄａ ＺＡＰに挿入して、ｃＤＮＡ発現ライブラリが構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスからの試料ＤＮＡを１μｌ用いて、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングされた。ライブラリの大量切り出しは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'細胞およびＸＬＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と併用して行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で希釈され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）とイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）とを含むＬＢ−カナマイシン寒天プレートにプレーティングされた。
【０１３１】
コロニーを採取し、標準的なミニプレップ手法によりＤＮＡを調製した。正しい導入断片を含むコロニーをカナマイシン含有ＮＺＹブロス中で培養し、ｃＤＮＡをアルカリ法とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法とにより精製した。１％アガロースゲルを用い、シーケンシングテンプレートへの染色体の混入の有無をスクリーニングした。Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用い、メーカー指定のプロトコルにしたがってダイターミネーター化学反応を準備した。
【０１３２】
陽性クローンのＤＮＡ配列は、３７００ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはＰｒｉｓｍ３７７シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部門）を用いて得た。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によっては３'末端側からも配列決定した。一部のクローンについては、サブクローニングされた断片を用いて内部配列を得た。サブクローニングは、制限マッピングおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ベクターへのサブクローニングという標準的な手順にしたがって行った。
【０１３３】
選択された遺伝子と相同な植物ＥＳＴを、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）またはユーカリ・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）のｃＤＮＡ発現ライブラリのいずれかから同定し、表２に示した。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、他のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列とアライメントをとることができ、同一の配列を共有する割合は公的に利用可能なコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むアルゴリズムのファミリー、ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの文献「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年に記載されている。本発明のポリヌクレオチド変異体の決定には、上記アルゴリズムの添付書類に記載されたデフォルトパラメータに設定されているＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を用いることが好ましい。
【０１３６】
ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴＲＥＭＢＬＥ配列（２００２年７月９日版）を使用し、２００２年１１月１５日にＢＬＡＳＴＸサーチを実施した。 ＢＬＡＳＴＸを用い、Ｅ値とポリペプチド配列の一致度とに寄与するアライメントと同一性とを決定するには、下記のランニングパラメータが好ましい。ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐ ｂｌａｓｔｘ −ｄ ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ −ｅ１０ −Ｇ０ −Ｅ０ −ＦＦ −ｖ３０ −ｂ ３０ −ｉｑｕｅｒｙｓｅｑ −ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ。また、パラメーターは以下のとおりである。−ｐ プログラム名［文字列］；−ｄ データベース［文字列］；−ｅ 期待値（Ｅ）［実数］；−Ｇ ギャップを空けるためのコスト（ゼロはデフォルト挙動）［整数］；−Ｅ ギャップを拡張するためのコスト（ゼロはデフォルト挙動）［整数］；−Ｆ フィルタークェリー配列［文字列］；−ｖ １行説明の数（ｖ）［整数］；−ｂ 表示するアライメントの数（ｂ）［整数］；−Ｉ クェリーファイル［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］；−ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］オプション。
【０１３７】
プロモーターは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いてクローニングした。これはＰＣＲ法にもとづく方法であり、４本のプライマーを作成することが必要で、その中の２本は遺伝子特異的でなければならない。この遺伝子特異的プライマーは通常、その遺伝子の５’ＵＴＲ内に設計される。断片が増幅され、ＧＵＳレポーター遺伝子の手前のＴ終端ベクター内にクローニングされる。
【実施例２】
【０１３８】
プロモーターの組織特異性の決定方法
実施例１で概説した手順によりプロモーターの同定およびクローニングが終了した後、プロモーターがレポーター遺伝子と操作可能に連結され、プロモーターが活性を示す組織の種類が決定される。このために、エレクトロポレーション法により、本発明のプロモーターを含むコンストラクトがアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換される。簡単に述べると、４０μｌの希釈ＡｇＬ−１コンピテント細胞を氷上に置き、当該プロモーター配列を含むｐＡＲＴ２７ベクター約１０ｎｇと接触させた。エレクトロポレーション法は、下記のパラメーターの設定下で行った。
抵抗＝１２９Ω
印加電圧＝１．４４ｋＶ
電界強度＝１４．４ｋＶ／ｃｍ
パルス持続時間＝５．０ｍｓ
【０１３９】
エレクトロポレーション終了後、４００μｌのＹＥＰ液体培地を添加し、細胞を１時間、室温にて回復させる。次に、細胞を６０００ｒｐｍ、３分間遠心し、約５０μｌのＹＥＰに再懸濁する。細胞試料をＹＥＰ Ｋａｎ５０／Ｒｉｆ５０プレート上にスプレッドし、パラフィルムで密閉し、２９°Ｃで２日間インキュベーションしコロニーを成長させる。
【０１４０】
次に、関心のあるコンストラクトを含むアグロバクテリウムを用い、フローラルディップ浸潤法（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により野生型シロイヌナズナ「コロンビア−０」株の植物個体を形質転換する。簡潔には、アグロバクテリウム培養を２０°Ｃにて約８６００ｒｃｆで１０分間遠心し、光学濃度が約０．７〜０．８となるように再懸濁する。アグロバクテリウムを含む浸潤液に植物個体を５秒間浸漬する。植物個体から余分な液を水切りし、大気条件で生育光下に置く。２４時間後、植物個体を噴霧し、種子を産生できる状態に維持する。Ｔ１種子の表面を市販の５％漂白液で滅菌し、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）とチメンチン（２５０ｍｇ／ｌ）とを含むＭＳ培地上にスプレッドし、推定される形質転換体を選別する。
【０１４１】
アグロバクテリウムを介した葉組織形質転換により、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物個体を、関心のあるコンストラクトを用いて形質転換する（Ｂｕｒｏｗら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、８巻、１２４−１３９頁、１９９０年）。
【０１４２】
形質転換に成功した植物個体は、操作可能に連結されたレポーター遺伝子が発現しているか否か分析される。葉、茎、根および花の各部分を染色液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ Ｘ−グルクロニド、シクロヘキシミド塩（Ｄｕｃｈｅｆｆａ））に浸漬される。５分間の真空吸引を２回行うことによって組織に染色液を浸透させる。前記組織は３７°Ｃで終夜振盪され、呈色させる。前記組織は、組織の呈色を確認するために途中で３回または４回確認され、試料が早期に呈色する場合には、組織の一片が７０％エタノール中で脱染される。次に、光学顕微鏡を用いてＧＵＳの発現について調べるためにこの組織の写真が撮影される。
【実施例３】
【０１４３】
導管要素（ＴＥ）誘導性培地（ＦＫＨ）および非誘導性培地（ＦＫ）中における百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）葉肉細胞の単離および培養
百日草の実生の初生葉および第二葉のペアが８パネットから採集された。葉は０．１７５％次亜塩素酸ナトリウム溶液５００ｍｌ中で１０秒間滅菌された。次に、葉は５００ｍｌの滅菌水中で２回リンスされた。１回当たり２０〜３０枚の葉を用いて、乳鉢および乳棒で２５〜３０ｍｌのＦＫ培地中で粉砕された。細胞が４０μｍのナイロンメッシュで濾過され、このやり方で合計９０ｍｌの葉肉細胞が得られた。前記細胞は２０°Ｃで２００×ｇ、２分間遠心され、生成したペレットは、再度等量のＦＫ培地を用いて洗浄された。２回目の洗浄が終了した後、ペレットは２等分され、一方の半分は４５ｍｌのＦＫ培地で洗浄され、他方の半分は４５ｍｌのＦＫＨ培地で洗浄された。各ペレットは６０ｍｌのＦＫ培地およびＦＫＨ培地にそれぞれ再懸濁された。これらは暗所にて、１２０ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上の２枚の６ウェルプレートで培養された。
【実施例４】
【０１４４】
ＦＫ培地およびＦＫＨ培地中で終夜ないし３日間培養した葉または葉肉細胞からの百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）プロトプラストの単離
滅菌した百日草の初生葉（６〜８枚）は１ｍｍの細片状に切断され、１５ｍｌの細胞壁消化酵素混合液（１％セルラーゼ オノヅカＲ−１０および０．２％ペクトリアーゼ Ｙ２３を含むプロトプラスト単離緩衝液）中に添加された。ＦＫ培地（４０ｍｌ）またはＦＫＨ培地（４０ｍｌ）中で培養された葉肉細胞は、２０°Ｃにて２００×ｇ、２分間遠心してペレット化された。各ペレットは、２００ｍｇのセルラーゼ オノヅカＲ−１０と４０ｍｇのペクトリアーゼＹ２３とを含む滅菌プロトプラスト単離緩衝液２０ｍｌ中に再懸濁された。前記プロトプラストは、前記細胞懸濁液を約７０ｒｐｍ２３°Ｃに設定されたロータリーシェーカー上のＣｅｌｌＳｔａｒ培養プレートで２〜４時間インキュベーションすることによって、単離された。前記プロトプラストは、各内容物を２００×ｇ、２分間遠心してペレット化された。各ぺレットは２０ｍｌの２４％ショ糖溶液中に再懸濁された。
【０１４５】
Ｆｕｋｕｄａ−Ｋｏｍａｍｉｎｅ培地保存液
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
【表４】
【実施例５】
【０１４８】
百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）プロトプラストのトランスフェクション
２４％ショ糖溶液中に懸濁させた百日草プロトプラスト上に１ｍｌのＷ５溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ＫＣ１、５ｍＭ ショ糖、ｐＨ５．６−６）を重層し、２０°Ｃにて７０×ｇ、１０分間の遠心を行い、ブレーキをかけずに停止させた。浮遊するプロトプラストを回収し、Ｗ５溶液１０ｍｌ中に再懸濁させ、２０°Ｃにて７０×ｇ、１０分間の遠心を行い、ペレット化した。プロトプラストのペレットはプロトプラスト濃度が約５×１０６個／ｍｌとなるようにＭａＭｇ培地（４５０ｍＭマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）中に再懸濁され、一定量ずつ別々の１５ｍｌ試験管に分注された（３００μｌ：プロトプラスト１．５×１０６個）。各コンストラクトにつき、上記プロトプラスト懸濁液に５μｇのＤＮＡおよび５０μｇのサケ精巣ＤＮＡが添加、混合され、２０°Ｃで５分間インキューベートされた。３００μｌの４０％ＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ３３４０、１００ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．４５Ｍマンニトール、ｐＨ９．０）が各分注プロトプラストに添加され、２０°Ｃで２０分間インキュベーションされた。５ｍｌのＫ３／０．４Ｍショ糖（溶液１Ｌ当たり：４．３ｇムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩、１００ｍｇミオイノシトール、２５０ｍｇキシロース、１０ｍｇチアミン塩酸塩、１ｍｇニコチン酸、１ｍｇピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ ＮＡＡ、０．２ｍｇカイネチン、１３７ｇショ糖、ｐＨ５．６（ＫＯＨで調整））が、葉由来のトランスフェクションされたプロトプラスト、またはＦＫ培地中で培養した葉肉細胞由来のトランスフェクションされたプロトプラストの各分注に添加、混合された。同様に、５ｍｌのＫ３／０．４Ｍショ糖＋０．ｌｐｐｍ ＮＡＡ＋０．２ｐｐｍ ＢＡが、ＦＫＨ培地で培養された葉肉細胞由来のトランスフェクションされた細胞の各分注に添加、混合された。これらトランスフェクションされたプロトプラスト懸濁液は、暗所で２３°Ｃで終夜インキュベーションされた。
【実施例６】
【０１４９】
トランスフェクション百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）プロトプラストの回収およびレポーター遺伝子解析
トランスフェクションされた百日草プロトプラストを個々に回収するため、実施例５で説明したとおり調製された懸濁液にそれぞれ９．５ｍｌのＷ５溶液が添加され、各試験管の内容物が混合され、２０°Ｃにて７０×ｇ、１０分間遠心された。上清の大部分がデカンテーションにより捨てられ、プロトプラストの体積が９００μｌとされた。９００μｌの各試料のうち、３００μｌのプロトプラストが５ｍｌポリスチレン丸底試験管に分注され、５００μｌのＷ５培地中に再懸濁され、蛍光レポータ遺伝子発現および細胞生存度の分析用に取り置かれた。残り６００μｌのプロトプラストおよび溶液は個々のマイクロチューブに移されて、２０°Ｃにて４２０×ｇ、２分間の遠心によってペレット化された。このプロトプラストペレットは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．、１９８７年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５，３８７頁に記載される方法にしたがって、ＧＵＳレポーター遺伝子発現について検定された。ＧＵＳ（ＭＵＧ）の検定は、Ｗａｌｌａｃ社（テュルク、フィンランド）のＶｉｃｔｏｒ２１４２０マルチラベルカウンターを用いて行われた。ウンベリフェロンは３５５ｎｍ励起光フィルターおよび４６０ｎｍ発光フィルターを用いて１秒間検出された。
【実施例７】
【０１５０】
植物個体内における発現データ
土壌移植３週間後に、形質転換シロイヌナズナおよびタバコ組織はＧＵＳレポーター遺伝子発現について解析される。ＧＵＳ発現を検定するために、実施例２で説明したとおり、葉、根および花の材料がＧＵＳ溶液に浸漬される。組織に染色液を浸透させるために５分間の真空吸引を２回行い、前記組織は発色のため３７°Ｃで終夜インキュベーションされる。終夜のインキュベーションの後、前記組織試料は７０％エタノール中で脱染され、光学顕微鏡下でＧＵＳ発現について検査される。表５は、形質転換されたシロイヌナズナおよびタバコのＧＵＳ発現率（％）を含む。
【０１５１】
土壌移植３ヶ月後のタバコのＴ１植物に由来する組織がパラプラストに包埋され、ミクロトームで切片が作成され、光学顕微鏡下でＧＵＳ発現が検査される。表５に示したＧＵＳの局在と組織鏡検結果（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ ｒｅｓｕｌｔｓ）は、本願明細書に開示された単離ヌクレオチド配列が、維管束の形成層、木部および／または篩部組織に優先的なレポーター遺伝子発現を可能にすることを証明する。
【０１５２】
【表５】
【０１５３】
タバコ組織の試料は、固定液（１００％エタノール、氷酢酸、３７％ホルムアルデヒド、ミリＱ水）を含むバイアルに入れられ、１５分間の真空吸引が２回行われる。前記試料は、確実に組織に浸透させるために固定液中で２時間インキュベーションされる。組織浸透の後、再び１５分間の真空吸引を行い、前記組織は４°Ｃで終夜放置した。
【０１５４】
組織試料は、終夜のインキュベーションの後、エタノール系列のインキュベーションにより脱水されるが、ここでのすべてのインキュベーションは室温で行われる。前記終夜固定された固定液は組織試料を入れたバイアルから除去され、５０％エタノールに置換される。３０分後、前記５０％エタノールはデカンテーションにより除去され、前記組織は５０％エタノールの新しい分注液でインキュベーションされる。５０％エタノールで３０分間経過後、前記溶液は除去されて６０％エタノールに置換される。３０分間のインキュベーション後、６０％エタノールは７０％エタノールに置換される。３０分後にこの７０％エタノールはデカンテーションにより除去され、８５％エタノールで置換される。３０分後、前記８５％エタノールは除去され、前記試料は９５％エタノール中で終夜インキュベーションされる。
【０１５５】
組織の脱水の後、該組織は室温でキシレン溶液系列中でインキュベーションされる。前記終夜処理された９５％エタノールが除去され、上記組織は１００％エタノール中で３０分間インキュベーションされる。３０分後、１００％エタノールが除去され、前記組織は２５％キシレン：７５％エタノール中に懸濁される。３０分間のインキュベーション後、前記溶液は５０％キシレン：５０％エタノールに置換される。次に、前記溶液はデカンテーションにより除去され、７５％キシレン：２５％エタノールに置換される。３０分後、前記組織は１００％キシレンで６０分のインキュベーションを３回される。次に前記組織は、キシレンと２０個のパラプラストチップとを入れたバイアル中で、終夜インキュベーションされる。
【０１５６】
パラフィンを浸潤させるため、前記バイアルは、前記パラプラストチップが溶解するまで４２°Ｃのハイブリダイゼーションオーブンで保温される。８時間の間に、合計６０〜８０個のパラフィンチップがバイアルに添加され、溶解される。前記試料は６２°Ｃのハイブリダイゼーションオーブンで終夜保温される。次の２日間にわたり、パラプラストは１２時間間隔で４回交換される。前記組織を包埋するために、流動パラフィンがカセット内に注入され、組織を適当な向きに配置される。前記カセットは４°Ｃで終夜静置され、パラフィンが硬化される。
【０１５７】
表５に示すとおり、本願明細書に開示される単離ヌクレオチド配列は、維管束の形成層、木部、および／または篩部組織で優先的なＧＵＳレポーター遺伝子発現を可能にする。特に注目すべきは、配列番号２１と配列番号１３とが、配列番号１３の５’末端に４０ｂｐの断片（ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＴＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＴＡＴＴＣＧＣＣ）の挿入を含むことを除いて、実質的な配列相同性を有する点である。この４０ｂｐ断片（配列番号８５）は、配列番号１３では不完全な反復配列として存在するが、配列番号２１には存在しない。興味深いことに、前記４０ｂｐ断片が存在すると（例えば、配列番号１３）ＧＵＳ発現が可能になり、前記断片が存在しないと（例えば、配列番号２１）ＧＵＳ発現は起こらない。このデータは、本願明細書に開示される４０ｂｐ断片（配列番号８５）が維管束優先発現的な遺伝子発現に必要十分な要素を構成する可能性があることを示唆するため、意義深い。
【実施例８】
【０１５８】
維管束特異的プロモーターの利用方法
適当な組織特異的かつ発生段階特異的な発現パターンを有するプロモーターがいったん見つかると、このプロモーターは、トランスジェニック植物で所望の形質を調節するために利用可能である。１つの実施態様では、木部特異的プロモーターが植物のリグニン組成と含量とを調節するために利用される。本実施例では、本発明の木部特異的プロモーターがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）のコーディング領域の一部に対応するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子をエンコードする遺伝子と操作可能に連結される。ＣＡＤは、リグニンモノマー合成の最終段階を触媒し、他のプロモーターを用いてアンチセンス配列を介した植物個体内のリグニンの下向き調節に成功した標的である。Ｙａｈｉａｏｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２９５−３０６頁（１９９８年）と、これに引用されている各文献を参照せよ。ＣＡＤの一部に対応するＲＮＡｉ分子が発現すると、酵素活性が低下し、これに対応してトランスジェニック植物個体内のリグニンのシンナミルアルデヒドの割合が増大する。トランスジェニック植物個体におけるＣＡＤ活性は、Ｂａｕｃｈｅｒら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２巻、１４７９−９０頁（１９９６年））によって改良された、Ｗｙｒａｍｂｉｋら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻、９−１５頁（１９７５年））の方法によって分析された。リグニン含量および組成は、Ｂａｕｃｈｅｒ（１９９６年）の方法によって測定された。ＣＡＤの下向き調節は、木材の色の変化と、抽出がより容易なシンナミルアルデヒドの割合の増大につながり、このことはパルプ産業用の植物にとって商業上重要である。例えば、ＣＡＤ活性を低減させたポプラは赤みを帯び、リグニンがより抽出しやすく、製紙産業の用途でのポプラ材の特性が改善される（Ｂａｕｃｈｅｒら（１９９６年））を参照せよ。
【０１５９】
別の実施例では、ユーカリおよびマツが形質転換される。ユーカリおよびマツは、リグニン含量が多いため、リグニン含量および組成に対する遺伝子調節の効果を研究するための有用なモデル系を提供する。さらに、ユーカリおよびマツは、リグニン含量または組成のモジュレーションが製紙または木材産業にとって有用な特性を与えるような植物の代表例である。
【０１６０】
これらのトランスジェニック植物を作出するために、ＣＡＤのｃＤＮＡの断片が、本発明の木部特異的プロモーターと、ノパリンシンターゼ３’ターミネーターとに適当な配向で操作可能に連結される。前記ＣＡＤのｃＤＮＡは、例えば、遺伝子配列をそのプロモーターに対して反転させることにより調製できる。植物細胞内における前記ＣＡＤのｃＤＮＡの転写は、ＣＡＤ遺伝子に対して「アンチセンス」な細胞内ＲＮＡ転写産物を生成する。コンストラクト全体が、制限断片としてバイナリーベクターｐＢＩ１０１．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、パロアルト）に挿入される。ベクターは、ユーカリまたはマツの形質転換を行うために、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の菌株ＬＢＡ４４０４またはＣ５８ｐＭＰ９０にエレクトロポレーション法により導入される。一般的にはＮｏら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、 １６０巻、７７−８６頁（２０００年）を参照せよ。カナマイシン耐性形質転換体は、ＣＡＤ活性について測定され、導入遺伝子のコピー数がサザン解析により決定され、ＣＡＤのｍＲＮＡ発現がＹａｈｉａｏｕｉ（１９９８年）に説明されるとおりに決定される。好適な形質転換体は発根させて、温室に移植される。
【実施例９】
【０１６１】
インシリコ発現
コンピュータによる遺伝子発現は、コンセンシ（ｃｏｎｓｅｎｓｉ）ＥＳＴライブラリのメンバー資格を決定するために利用できる。各ライブラリについて、いずれかの組織クラスのＥＳＴの数をそのクラスのＥＳＴの総数で割った商に１０００を乗じ、コンセンサスが決定される。これらの値は、あるライブラリからの配列決定の程度に影響されない規格化値である。形成層、木部、篩部、栄養芽、根、生殖組織、葉、茎および果実のライブラリを含む複数のライブラリが、コンセンサス値についてサンプル調査された。下記の表６および表７に示すとおり、多数の本発明のプロモーター配列が維管束優先的発現を示し、樹木関連の発生過程に関与する可能性がある。
【０１６２】
【表６】
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】３種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【図２Ａ】２種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【図２Ｂ】２種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【図３】２種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヌクレオチド転写および／または発現の調節に関する。特に本発明は、ユーカリ・グランディスまたはユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）およびラジアータマツまたはマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）から単離され、植物細胞内におけるポリヌクレオチドの維管束優先発現的転写を行うポリヌクレオチド調節配列に関する。内在性および／または異種由来のポリヌクレオチドの転写を改変するために本発明の調節配列を用いるコンストラクトおよび方法も、本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、米国仮出願第６０／４２８，２８７号（２００２年９月２２日出願）に基づく優先権主張を伴う。
【０００３】
林業および製紙産業の大きな目標は、植物のリグニン含量の制御である。リグニンは、木材の機械強度、着色、防腐性に関与するシンナミルアルコールの複合ポリマーである。木本種は、木材の乾燥重量の２０％ないし３０％を占める大量のリグニンを合成する。剛性を与えることに加えて、リグニンは、細胞壁に疎水性および非透水性を与えて、水の輸送を助ける。したがって、樹木のリグニン濃度を増大させることは、耐病性および建築用の強度の改善を木に与えることのような、一部の用途で有利になることがわかることになる。また、リグニンは燃料としても有用であり、木炭製造用材と、トウモロコシ稈と、バイオ燃料として用いられる柳および成長の早いポプラ雑種とのような燃料用の木材その他のバイオマスにおけるセルロース含量の増大したリグニンは好ましい。
【０００４】
逆に樹木におけるリグニン含量の増大は、製紙産業にとって重大な問題をもたらし、製紙産業はセルロース繊維からリグニンを除去するために多大な資源を費やさなければならない。米国内だけでも、年間約２千万トンのリグニンが除去される。さらにリグニン含量は、飼草作物の消化性の良否の大きな原因であり、植物のリグニン含量のわずかな上昇が消化性の比較的大きな低下につながる。例えば、リグニン含量が低い作物は家畜にとってより効率的な飼草を提供し、飼草作物の消費量に対する乳および肉の生産収量が向上する。リグニン含量は植物の成育中に増大するので、農家は早めの収穫を行って少収量で消化の良い作物を得るか、あるいは遅めに収穫を行って多収量で消化の悪い作物を得るか、のいずれかを選択しなければならない。
【０００５】
かかる理由から、植物の遺伝子改変によるリグニン含量または組成の制御は望ましい。この目標に向けて、リグニン生合成を担う遺伝子の同定および特徴付けと、その発現を調節する配列の決定とに多大な努力が注がれてきた。マツ由来のシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、クマレート３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ＰＮＬ）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）を含む、リグニン生合成に関与する酵素の多くをエンコードするポリヌクレオチドがクローニングされてきた（特許文献１）。
【特許文献１】米国特許第６，２０４，４３４号明細書
【０００６】
これらの遺伝子の発現操作がリグニン含量の改変に利用されてきた。かかる実験は、ＣＡＤ、コニフェリンβ−グルコシダーゼ（ＣＢＧ）、およびカフェイン酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）をエンコードする遺伝子のコピー数の変更を含む（特許文献２、特許文献３および非特許文献１）。さらに、ポプラ、タバコ（Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ）およびマツにおいてＣＡＤをエンコードする配列のアンチセンス発現は、組成の異なるリグニン産生を起こす（それぞれ、非特許文献２、３および４を参照）。
【特許文献２】米国特許第５，４５１，５１４号明細書
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９４／２３０４４号公報
【非特許文献１】Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０巻、３６５−７２頁（１９９９年）
【非特許文献２】Ｇｒａｎｄら、Ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌ．）、１６３巻、２３２−３７頁（１９８５年）
【非特許文献３】Ｙａｈｉａｏｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２９５−３０６頁（１９９８年）
【非特許文献４】Ｂａｕｃｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２巻、１４７９頁（１９９６年）
【０００７】
林産品、紙、植物バイオマスおよび飼草産業のもう１つの大目標は、茎からのセルロース回収を容易化するために、茎のサイズを増大させ、茎のセルロース含量を操作し、あるいは細胞壁の特性を操作することである。例えばセルロースは、パルプ生産では木部繊維から回収され、木部繊維数および管状要素数、細胞壁の厚さ、管腔径、繊維長、セルロース微繊維の角度その他のこれら木部の特性が、回収されるセルロースの質および量を決定する。セルロース生合成に関与する遺伝子の操作は、植物のバイオマス総量および植物からのセルロース収率の増大に有用であり、かかる遺伝子のアンチセンス発現は細胞壁の発達に影響を及ぼすことが示されている（非特許文献５）。また、エンド−１，４−β−グルカナーゼとセルロース結合ドメインとによる多糖類と植物細胞壁の改変が報告されている（非特許文献６）。したがって本発明のポリヌクレオチドは、セルロース生合成を改変し、これによって植物の生育とバイオマスとに影響を及ぼすために、維管束組織内でヌクレオチド配列を発現するのに用いられる場合がある。
【非特許文献５】Ｓｈａｎｉ Ｚ．、Ｓｈｐｉｇｅｌ，Ｅ．、Ｒｏｉｚ Ｌ．、Ｇｏｒｅｎ Ｒ．、Ｖｉｎｏｃｕｒ Ｂ．、Ｔｚｆｉｒａ Ｔ．、 Ａｌｔｍａｎ Ａ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ Ｏ．、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ，ａｎｄ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ、Ａ．Ａｌｔｍａｎ、Ｍ．Ｚｉｖ、Ｓ．Ｉｚｈａｒ共編、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ、２１３−２１８頁、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９年）
【非特許文献６】Ｌｅｖｙ，Ｉ．、Ｓｈａｎｉ，Ｚ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ Ｏ．、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１９巻、１７−３０頁（２００２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記改変植物への全身的な有害な影響を回避するために、生合成経路の遺伝子的調節は狭く限定された組織タイプにおいて実行することが好ましい。例えば、特定の遺伝子産物の発現によりリグニンの含量または組成が特定の遺伝子産物の発現によって影響を受ける場合、前記植物の病気に対する耐性の低下を避けるために、前記遺伝子産物の発現を前記植物の一部のセグメントまたは一部の生育段階に限定することが好ましい場合がある。異種遺伝子は、組織優先発現的プロモーターと操作可能に連結することにより、選択された組織において発現される場合がある。好適な組織優先発現的プロモーターは、維管束組織の原生木部管状要素内で特異的な活性があるマメｇｒｂ１．８プロモーターがある（非特許文献７）。これらのプロモーターは木質化部にて優先的に発現するユーカリＣＡＤプロモーターも含む（非特許文献８）。かかる組織優先発現的プロモーターは、特異的な組織におけるアンチセンス分子の遺伝子発現の調節に用いられてきた（非特許文献９−１１）。
【非特許文献７】Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、８巻、１３０９頁（１９８９年）
【非特許文献８】Ｆｅｕｉｌｌｅｔら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７巻、６５１頁（１９９５年）
【非特許文献９】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、２５３頁（１９９２年）
【非特許文献１０】Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、 ２３巻、９４７頁（１９９３年）
【非特許文献１１】Ｍａｔｓｕｄａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７巻、２１５頁（１９９６年）
【０００９】
組織優先発現的プロモーターは、異なる環境では活性が弱い場合があり、構成的プロモーターで達成されるレベルと常に同じレベルで遺伝子を発現させるとは限らない（非特許文献１２）。さらに、これらのプロモーターが活性を示す発生学的なウィンドウ、またはそれらの活性の空間分布が、それらの有用性を制限する場合がある。したがって、本技術分野では、所望の空間的・時間的な発現パターンを有するさらなる組織優先発現的プロモーター、特に、維管束優先発現的プロモーターの開発する継続的な必要性が存在する。非特許文献１３に総説される。
【非特許文献１２】Ｙａｈｉａｏｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２９５−３０６頁（１９９８年）
【非特許文献１３】Ｇｒｉｍａ−Ｐｅｔｔｅｎａｔｉら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４５巻、５１−６５頁（１９９９年）
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、維管束優先発現的遺伝子発現に関与する単離ポリヌクレオチド調節配列に関する。本発明のポリヌクレオチドは、植物のリグニン含量、セルロース含量、個体のサイズまたは細胞壁の成長の調節に用いることができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、リグニン、セルロース、および植物細胞壁の生合成にも用いられる場合がある。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、維管束優先発現的ポリヌクレオチド転写をさせることが可能なポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。１つの実施態様において、前記単離核酸分子は配列番号１−８５のいずれか１つとその機能変異体とから選択されるポリヌクレオチドを含む。別の実施態様において前記機能変異体は、配列番号１−８５のいずれかの配列との同一性が９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上である。
【００１２】
他の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５およびその機能変異体のいずれか１つに対する相補配列と、（ｂ）配列番号１−８５の配列のいずれかに対する逆相補体の配列と、（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのいずれかと雑種形成する、少なくとも２０個の連続する塩基を含む配列とから選択される配列を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの実施態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドが植物細胞における木部優先発現的の遺伝子発現を実現できるようにすることを意図する。別の実施態様において、本発明は、植物細胞における操作可能に連結した遺伝子の発現を上向き調節または下向き調節することが可能なポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結している植物細胞を提供する。１つの実施態様において、前記所望の遺伝子はポリペプチドまたはタンパクをエンコードする。別の実施態様において、前記タンパクは細胞壁の生合成に関与する酵素である。さらなる実施態様において、前記タンパクはリグニンの生合成に関与する酵素である。さらに別の実施態様において、前記所望の遺伝子はＲＮＡ転写産物を生成する。さらに別の実施態様において、前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞に内在する遺伝子のアンチセンス配列を有する。さらに別の実施態様において、前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞中で正常に発現される遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結している、植物細胞を含む植物を提供する。１つの実施態様において、前記植物は被子植物および裸子植物から選択される。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結しているＤＮＡコンストラクトを含む、植物細胞を含む植物を栽培することを含む、植物のリグニン含量の調節方法を意図する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とが操作可能に連結しているＤＮＡコンストラクトを含む、植物細胞を含む植物を栽培することを含む、植物の細胞壁の発生の調節方法を意図する。
【００１７】
他の局面において、本発明は、配列番号１−８５およびその機能変異体のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物を提供する。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号１ないし８５およびその機能変異体のいずれかの配列を有するプロモーターと、（ｉｉ）所望の核酸とを含み、前記プロモーターは前記所望の核酸の発現を調節するＤＮＡコンストラクトを木本植物の植物細胞に導入すること、（ｂ）前記形質転換された植物細胞を植物の生育を促進する条件下で培養すること、および、（ｃ）前記植物から木材を得ることとを含む、木材を得る方法を提供する。１つの実施態様において、前記木本植物は、ユーカリ属またはマツ属の植物種から選択される。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１−８５からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド配列と、これらの配列のいずれかに対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドとを意図する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。また、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意図する。配列番号１−８５のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００２０】
本発明は、表８に挙げたポリヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性がある配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子に関する。本発明はまた、表８に開示されるポリヌクレオチド配列の機能断片も提供する。本発明はさらに、表８に列挙されるポリヌクレオチド配列のいずれかに対する相補的な核酸またはその断片と、表８に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかと雑種形成し、少なくとも１５個の連続する塩基を含む核酸とを提供する。
【００２１】
本発明の核酸のヌクレオチド配列は配列表に示される。ここで、「配列番号（２Ｎ＋１）」とは、例えば１、３、５、７…等の、すべての奇数番号の配列をいう。「配列番号２Ｎ」とは、すべての偶数番号の配列をいう。ある奇数番号の配列とすぐ次の偶数番号の配列（例えば、配列番号１と配列番号２）との間の違いは、前記偶数番号の配列は追加の塩基を有する点である。偶数番号の配列の末端の３塩基は通常ＡＴＧで、（通常、メチオニンをコードする）翻訳の開始コドンを表す。
【００２２】
本発明は当業者に周知の用語および表現を用いる。別の定義が与えられないかぎり、本明細書中で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、ここで用いる用語法と、ここで説明される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および雑種形成法における各実験手順とは、当該技術分野において周知慣用のものである。核酸組換法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、細胞培養、組織培養、形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、分析化学、有機合成化学、化学合成、化学分析および医薬品処方および薬物送達には、標準的な手法が用いられる。一般に、酵素反応、精製および／または単離のステップは製造者の仕様にしたがって行われる。手法および手順は従来の方法論にしたがって実行されるのが一般的である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１年を参照せよ。
【００２３】
アグロバクテリア：当技術分野で周知のとおり、植物細胞の形質転換に用いられるアグロ細菌は、ベクターを含む、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の無毒化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）ビルレントな誘導体であることが一般である。前記ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの境界の間に配置された所望のポリヌクレオチドを含むことが典型的である。
【００２４】
被子植物：種子が子房に被覆されている維管束植物。被子植物は、花を付け、実を結ぶ種子植物である。被子植物は、双子葉植物と単子葉植物とに分類される。
【００２５】
所望のポリヌクレオチド：本発明の所望のポリヌクレオチドとは、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターのような遺伝子エレメントか、ゲノム中に前記所望のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞で転写および／または翻訳されるべき遺伝子またはポリヌクレオチドかをいう。前記所望のポリヌクレオチドがタンパク産物をエンコードする配列を含む場合、そのコーディング領域は、当該所望のポリヌクレオチドによってエンコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写産物および／またはタンパク産物の発現をもたらす、プロモーターおよびターミネーターのような調節エレメントと操作可能に連結している場合がある。したがって、「所望のポリヌクレオチド」は、５’から３’への配向で、プロモーターと、タンパクをエンコードする遺伝子と、ターミネーターとに操作可能に連結する遺伝子を含む場合がある。代替的には、前記所望のポリヌクレオチドは、翻訳されると植物細胞内での内在性遺伝子の発現に影響を与える２次構造を形成するかもしれない核酸を産生するような、「アンチセンス」配向の遺伝子またはその断片を含む場合がある。所望のポリヌクレオチドはまた、転写されると前記所望のポリヌクレオチドが会合する遺伝子のＲＮＡ干渉を引き起こすような、２本鎖ＲＮＡを産生する場合がある。本発明の所望のポリヌクレオチドは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界配列が前記所望のポリヌクレオチドを挟むか、あるいは所望のポリヌクレオチドのいずれか片側に配置されるように、Ｔ−ＤＮＡ内に配置される場合がある。本発明は、少なくとも１個の植物細胞のゲノムに１個または２個以上の所望のポリヌクレオチドを安定的に組み込むことを可能にする。所望のポリヌクレオチドは、突然変異処理されていても、その野生型配列の変異体であってもよい。前記所望のポリヌクレオチドの全部または一部が植物ゲノムに組み込まれ場合があるものと理解されている。また、「所望のポリヌクレオチド」という用語は、かかるポリヌクレオチドの１個または２個以上を包含するものと理解されている。したがって、本発明のＴ−ＤＮＡは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個以上の所望のポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００２６】
双子葉植物：胚が２分割状の種子、すなわち子葉と、分岐した葉脈と、４または５の倍数に分割される花とを持つ顕花植物。双子葉植物の例は、ユーカリ属、ハコヤナギ属、フウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂｅｒ），アカシア属、チーク、マホガニー、ワタ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、トマト、ジャガイモ、テンサイ、ブロッコリ、キャッサバ、サツマイモ、コショウ、ポインセチア、マメ、アルファルファ、ダイズ、ニンジン、イチゴ、レタス、カシ、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、ゼラニウム、アボカド、サボテンがを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
内在性とは、ある植物ゲノムに元々存在する遺伝子を指す。
【００２８】
繊維組成：本明細書で用いられる繊維組成とは、繊維の構造、外観または用途を変更するために改変可能な形質をいう。繊維組成を決定する形質は、繊維長、粗さ、強度、色、断面幅、繊維密度を含むが、これらに限定されない。例えば、繊維長は強度を与え、繊維の粗さは風合いおよび可撓性を決定する要因であることが知られている。
【００２９】
外来性：ある核酸に関して「外来性」とは、その核酸が植物以外の生物に由来するか、形質転換されるべき植物とは異なる植物に由来するか、形質転換されるべき植物と交配できない植物に由来するか、あるいは標的植物の種に属さないことを意味する。本発明によれば、外来性のＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウィルス、哺乳類、魚類または鳥類の遺伝物質中に天然に存在するが、形質転換されるべき植物中には天然には存在しない核酸を含む場合がある。したがって、ある外来性の核酸は、例えば、形質転換された植物によって天然には生産されないポリぺプチドをエンコードするものである。外来性の核酸は、タンパク産物をエンコードする必要はない。
【００３０】
遺伝子：産物、すなわちポリペプチド鎖またはＲＮＡ分子の合成に必要な情報のすべてを含むＤＮＡ分子のセグメントであり、コーディング配列およびノンコーディング配列の双方を含む。
【００３１】
遺伝子エレメント：「遺伝子エレメント」とは、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、イントロン、エンハンサー、スペーサー、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、またはリコンビナーゼ認識部位を含むがこれらに限定されない、離散的なヌクレオチド配列のいずれかをいう。
【００３２】
遺伝子改変：分子細胞生物学的手法を適用することによって、ある生物のゲノムにＤＮＡを安定的に導入すること。
【００３３】
裸子植物：本明細書で用いられる場合には、子房を持たず、種子が露出している種子植物をいう。裸子植物の例は、針葉樹、ソテツ、イチョウおよびマオウを含む。
【００３４】
導入：本明細書で用いられる場合には、感染、トランスフェクション、形質転換またはトランスダクション等の方法により、細胞中に核酸配列を挿入することをいう。
【００３５】
幼若性：若木と成木との間の生理学的差異を説明する。本発明では、幼若性とは、若木と成木との間の微繊維角度、木材密度、セルロース収量、再生能力および生殖能力の差異をいう。例えば、木本植物組織は成熟するにしたがって再生能力を失うことが知られている。
【００３６】
リグニン：本明細書で用いられる場合には、モノリグノールである、コニフェリルアルコール、クマリルアルコールおよびシナピルアルコールの重合誘導体を含む、フェニルプロパノイド単位で構成されるポリマー組成物をいう。リグニンの品質とは、細胞壁マトリクスに強度を与え、水分輸送を助け、および／または細胞壁多糖類の分解に抵抗する、リグニン組成物の能力をいう。リグニン組成物またはリグニン構造物は、各モノリグノールの相対量を変更するか、リグニンのタイプを変更することによって変化される場合がある。例えば、（フェルラ酸から誘導される）グアイアシルリグニンは軟木種では顕著だが、（フェルラ酸およびシナピン酸から誘導される）グアイアシル−シリンギルリグニンは硬木種に特徴的である。マツのような軟木由来のリグニンの分解には、硬木由来のリグニンの除去に比べてかなり大量のアルカリと長いインキュべーション時間とを要する。リグニン組成は、リグニン生合成に関与する酵素の上向き調節または下向き調節のいずれかにより調節される場合がある。例えば、重要なリグニン生合成酵素は、４−クマリン酸：補酵素Ａリガーゼ（４ＣＬ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）およびシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
単子葉植物：１枚の子葉または種葉（ｓｅｅｄｌｅａｆ）を有する胚と、平行な葉脈と、３の倍数に分割される花を有する顕花植物である。単子葉植物の例は、シバ、トウモロコシ、コメ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、ヤシを含むが、これらに限定されない。シバの例としては、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐｐ．（コロニアルベントグラスおよびクリーピングベントグラスを含むベントグラス種）、Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ケンタッキーブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．（１年生ライグラスおよび多年生ライグラス等のライグラス種）、Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｙｔａｃｅａ（トールフェスク）、Ｆｅｓｔｕｃａ ｒｕｂｒａ ｃｏｍｍｕｔａｔａ（ファインフェスク）、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｓ（ティフグリーン、ティフウェイＩＩおよびサンタアナ等のコモンバミューダグラスの変種、並びにその雑種形成種）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎｕｍ（アフリカチカラシバ）、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ（イヌシバ）、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（シバ）、およびＤｉｃｈｏｎｄｒａ ｍｉｃｒａｎｔｈａを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
操作可能に連結した：２個または３個以上の分子を、それらがある植物細胞内で組み合わせて適切に機能するように組み合わせること。例えば、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御するとき、プロモーターは構造遺伝子に操作可能に連結している。
【００３９】
表現型：表現型は、区別できる植物の特徴または特性であって、本発明では１個または２個以上の「所望のポリヌクレオチド」および／またはスクリーニング／選択可能なマーカーを、形質転換された植物の少なくとも１個の細胞のゲノムに組み込むことによって変化させられる場合がある。「（単数または複数の）所望のポリヌクレオチド」および／またはマーカーは、形質転換された植物細胞または植物個体全体の多数の遺伝的、分子的、生化学的、生理学的、形態学的、農業経済学的特徴または特性を改変することにより、形質転換された植物の表現型の変化を可能にする場合がある。したがって、植物ゲノム中に安定に組み込まれた１個または２個以上の所望のポリヌクレオチドの発現は、例えば、干魃耐性の向上、耐寒性および耐霜性強化、活力の向上、色彩の強化、保健栄養的な特性の強化、保存性の向上、収量の増大、耐塩性向上、重金属耐性向上、耐病性の向上、耐虫性の向上、耐乾性の強化、甘味の増強、活力の向上、味の改善、食感の改善、リン酸含量の低減、発芽率の増大、微量栄養素の取込みの増大、デンプン組成の改善、開花寿命の改善、密度の変更、茎強度または茎剛性の変化、寸法安定性の向上およびセルロースまたはリグニン含量の変化からなる群から選択される表現型を与える場合がある。
【００４０】
植物組織：「植物」とは、胚を生産し、葉緑体を含み、セルロース細胞壁を有することを特徴とする、光合成能を有する植物界の真核多細胞生物のいずれかをいう。植物の一部、すなわち「植物組織」は、トランスジェニック植物を作出するために、本発明の方法により形質転換される場合がある。多くの適当な植物組織が、本発明の方法によって形質転換可能で、体細胞胚、花粉、葉、茎、カルス、走根、マイクロチューバーおよび苗条を含むが、これらに限定されない。このように、本発明はシバ、コムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、エンバク、テンサイ、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、キャッサバ、サツマイモ、ゼラニウム、ダイズ、カシ、リンゴ、ブドウ、マツ、モミ、アカシア、ユーカリ、クルミおよびヤシのような被子植物および裸子植物の形質転換を意図する。本発明によると、「植物組織」は植物細胞も包む。植物細胞は、懸濁培養、カルス、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶子、胞子体、花粉、種子および小胞子を含む。植物組織は成熟のいかなる段階にあるものでもよく、液体または固体培地か、土壌か、植木鉢、温室または圃場の適当な培地かで生育されてもよい。植物組織とは、有性的、無性的のいずれによって生じたかを問わず、かかる植物個体、種子、子孫、ムカゴのいずれかのクローンと、切断片や種子のような、これらのいずれかの派生物をもいう。特に興味深いのは、マツ、モミおよびトウヒのような針葉樹と、ケンタッキーブルーグラス、クリーピングベントグラス、トウモロコシおよびコムギのような単子葉植物と、ワタ、トマト、レタス、シロイヌナズナ、タバコ、リンゴおよびゼラニウムのような双子葉植物とである。
【００４１】
植物の形質転換および細胞培養：広義には、植物細胞が遺伝子的に改変され、維持、さらなる成長および／またはさらなる発生のために適当な植物培地に移されるプロセスをいう。これらの方法は、当業者に周知である。
【００４２】
子孫：トランスジェニック植物の子孫のような、本発明の「子孫」とは、植物またはトランスジェニック植物から生まれたか、これらの間に授かったか、これらに由来するものをいう。したがって、「子孫」植物、すなわち「Ｆ１」世代の植物は、本発明の方法により作出されたトランスジェニック植物の子、または子孫である。トランスジェニック植物の子孫は、少なくとも１個、一部、あるいは全ての細胞ゲノムに、本明細書に説明される方法によって親のトランスジェニック植物に組み込まれた所望のポリヌクレオチドを含む場合がある。したがって、所望のポリヌクレオチドは、子孫の植物によって「伝達される（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）」か、「受け継がれる（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）」。そのように子孫植物に受け継がれる所望のポリヌクレオチドは、Ｔ−ＤＮＡコンストラクト中に存在する場合があるが、Ｔ−ＤＮＡコンストラクトもまたその親植物から子孫植物へと受け継がれる。本明細書で用いられる「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」という用語は、ある群の植物の子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）、または子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ）と考えられる場合もある。本発明のトランスジェニック植物は、子孫植物を作出するために無性生殖により繁殖される場合がある。
【００４３】
プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節エレメントに結合する核酸、好ましくはＤＮＡを指す意味で用いられる。あらゆるプロモーターと同様、本発明のプロモーター配列は、該プロモーターと操作可能に連結した核酸分子からｍＲＮＡを生成するために、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写を促進または制御する。上述したように、生成したＲＮＡはタンパクまたはポリペプチドをコードする場合があり、ＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子をコードする場合がある。
【００４４】
本明細書で用いられるプロモーターとは、調節エレメントを含む場合もある。逆に、ある調節因子がプロモーターから分離される場合もある。調節因子は、１つのプロモーター領域に対して多数の重要な性質を与える。ある種の要素は、操作可能に連結した核酸の転写速度を上げる転写因子に結合する。また、別の要素は、転写活性を阻害するレプレッサーに結合する。プロモーター活性に及ぼす転写因子の影響は、そのプロモーター活性が高いか低いか、すなわち、プロモーターが「強い」か「弱い」かを決定する。
【００４５】
植物プロモーターとは、植物細胞由来であるか否かによらず、植物細胞中における転写を開始することができるプロモーターをいう。代表的な植物プロモーターは、植物と、植物ウィルスと、植物細胞で発現される遺伝子を含む、アグロバクテリウム属またはリゾビウム属のような細菌とから得られるものを含むが、これらに限定されない。発生学的な制御下にあるプロモーターの例は、木部、葉、根または種子のような特定の組織で転写を優先的に開始するプロモーターを含む。かかるプロモーターが、組織優先発現的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターと呼ばれる。特定の組織中でのみ転写を開始するプロモーターは、組織特異的プロモーターと呼ばれる。細胞タイプ特異的プロモーターは、例えば根または葉の維管束系細胞のような１種類または２種類以上の器官における特定の細胞タイプでの発現を主として推進する。誘導可能または抑制可能なプロモーターは、環境による制御の下にあるプロモーターである。誘導可能なプロモータによって転写に影響を及ぼし得る環境条件の例は、嫌気的条件および光の存在を含む。組織特異的、組織優先発現的、細胞タイプ特異的、および誘導可能プロモーターは、非構成的プロモーターのクラスを構成する。構成的プロモーターは、ほとんどの環境条件の下で、かつ、ほとんどの植物の部分で活性があるプロモーターである。
【００４６】
ポリヌクレオチドとは、遺伝子をコードする配列または（少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも３０個の連続したヌクレオチド、または少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む）その断片と、プロモーターと、イントロンと、エンハンサー領域と、ポリアデニル化部位と、翻訳開始部位と、５’または３’非翻訳部位と、レポーター遺伝子と、選択可能マーカー等とを含むヌクレオチド配列をいう。ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含む場合がある。ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾されたバックボーンを含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ゲノム由来か、（ｍＲＮＡのような）ＲＮＡ転写産物か、（ｃＤＮＡのような）プロセシングを経たヌクレオチド配列かの場合がある。ポリヌクレオチドは、センス配向またはアンチセンス配向を有する配列を含む場合がある。
【００４７】
単離ポリヌクレオチドは、天然状態ではないポリヌクレオチド配列である。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自然界には存在しないヌクレオチド配列で構成されるか、その近傍に存在するのが典型的なヌクレオチド配列から切り離されているか、あるいは、その近傍には存在しないのが典型的なヌクレオチド配列の近傍に存在する。
【００４８】
再生能力：本明細書で用いられるところでは、脱分化組織から植物が再分化する能力をいう。
【００４９】
種子：「種子」とは、胚を含む熟した植物の胚珠と、塊茎または胞子のような植物の増殖部位として考えられる場合がある。種子は、発芽促進のために、アグロバクテリアを介する形質転換の前に、例えば暗所でインキュベーションされる場合がある。種子はまた、インキュベーションの前に、短時間の漂白剤処理のような処理によって滅菌される場合がある。得られた実生はアグロバクテリアの所望の菌種に曝露できる。
【００５０】
選択可能なマーカー／スクリーニング可能なマーカー：ある遺伝子が植物個体または植物組織において発現している場合に、該植物個体または植物組織を前記遺伝子が発現していない他の植物個体または植物組織と区別することを可能にする遺伝子をいう。スクリーニング手順は、前記スクーニング可能なマーカー遺伝子にエンコードされるタンパクの発現についてのアッセイが必要な場合がある。かかるマーカーの例は、ベータ・グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子と、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）遺伝子とを含む。選択可能なマーカーの例は、カナマイシンおよびジェネチシン耐性をエンコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子と、ハイグロマイシン耐性をエンコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＡＰＨＩＶ）遺伝子と、スルホニル尿素系除草剤耐性をエンコードするアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子と、グルタミンシンターゼの活性を阻害するように作用する、ホスフィノトリシン（ＬｉｂｅｒｔｙまたはＢａｓｔａ）のような除草剤への耐性をコードする遺伝子（ＢＡＲおよび／またはＰＡＴ）と、その他の本技術分野で知られた類似の遺伝子を含む。
【００５１】
配列の同一性：本明細書で用いられる、２個の核酸配列またはポリペプチド配列について「配列の同一性」または「同一性」は、ある特定の領域にわたって前記２個の配列を最大限対応するようにアライメントをとるときに、前記２個の配列中で同一となる残基をさすことを含む。
【００５２】
本明細書で用いられる同一性の百分率は、ある比較ウィンドウにわたって最適なアライメントをとった２個の配列を比較することによって決定される値を意味するが、ここで、前記２個の配列の最適なアライメントのための（（例えばギャップのような）付加または欠失を含まない）基準配列と比較するとき、前記比較ウィンドウ内の前記ポリヌクレオチド配列の一部は付加または欠失を含む場合がある。前記百分率は、両方の配列中に同一の核酸塩基が出現する塩基数を数えることにより一致塩基数を算出し、この一致塩基数を比較ウィンドウ中の総塩基数で除し、この商に１００を乗ずることにより算出される。
【００５３】
転写因子：転写因子とは、遺伝子コード配列を伴う１個または２個以上のヌクレオチド配列に直接結合するか、あるいは、遺伝子をコードする配列を伴う１個または２個以上のヌクレオデチド配列に直接結合する他の（単数または複数の）ポリペプチドの活性に間接的に影響を及ぼすかのいずれかによって、単数または複数の遺伝子の発現を調節するポリペプチド配列をいう。転写因子は、単数または複数の遺伝子の発現を活性化（上向き調節）または抑制（下向き調節）する場合がある。転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインまたはタンパク−タンパク相互作用ドメインとを含む場合がある。本発明では、転写因子は、（１）核酸配列に結合すること、あるいは（２）植物における遺伝子の発現を調節すること、の少なくともいずれかを行うことができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド配列およびこれに対応するポリペプチド配列は、被子植物および裸子植物を含む、いずれかの植物種において転写因子として機能する。
【００５４】
転写および翻訳のターミネーター：本発明の発現ＤＮＡコンストラクトには、典型的には、転写開始調節エレメントの反対側に転写終結領域がある。この転写終結領域は、発現を増強するｍＲＮＡの安定、および／または、遺伝子転写産物にポリアデニル鎖の尾部の付加のために選択される場合がある。
【００５５】
転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）：アグロバクテリアのＴ−ＤＮＡは、その境界内に含まれるヌクレオチド配列を別のゲノムに組み入れることが可能な因子として周知の遺伝子エレメントである。この点で、Ｔ−ＤＮＡは典型的には２つの「境界」配列に挟まれている。本発明の所望のポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーは、あるＴ−ＤＮＡの左側の境界様配列と右側の境界様配列との間に位置する場合がある。Ｔ−ＤＮＡに含まれる前記所望のポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーは、その発現、すなわち前記所望のポリヌクレオチドまたは選択可能なマーカーによってエンコードされるＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を促進するプロモーターおよびターミネーターの調節エレメントのような、さまざまな異なる植物特異的な（すなわち、天然の）、または外来の核酸と操作可能に連結している場合がある。
【００５６】
植物細胞の形質転換：植物細胞のゲノムに核酸を安定に挿入するプロセスをいう。形質転換は当業者に周知のさまざまな方法を用い、自然または人工的な条件下で起こる場合がある。形質転換は、原核または真核宿主細胞へ核酸配列を挿入するいずれかの知られた方法によって行われる場合があり、これら方法としては、アグロバクテリアを介する形質転換法、ウィルス感染法、ウィスカー法、エレクトロポレーション法、顕微注入法、ポリエチレングリコール処理法、熱ショック法、リポフェクション法および微粒子銃法を含む。
【００５７】
トランスジェニック植物：本発明のトランスジェニック植物とは、外来性の核酸が安定に組み込まれた少なくとも１個の細胞ゲノムを含むものをいう。本発明によると、トランスジェニック植物は、遺伝的に改変された細胞および細胞ゲノムを１つだけ含む場合があるか、複数ないし多数の遺伝的に改変された細胞を含む場合があるか、全ての細胞が遺伝的に改変されている場合がある。本発明のトランスジェニック植物は、所望のポリヌクレオチド、すなわち外来性の核酸の発現が、植物個体の特定の部分のみで起こる場合がある。したがって、トランスジェニック植物は、その構造の特定の部分には遺伝的に改変された細胞のみを含む場合がある。
【００５８】
変異体：ここで言う「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、ある特定の遺伝子の基準（すなわち天然、標準、所与の）ヌクレオチド配列から逸脱（ｄｅｖｉａｔｅ）したヌクレオチド配列をいう。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「類似体」という用語もヌクレオチド配列の「変異」した類型を指す。
【００５９】
「変異体」には、Ｍａｘｙｇｅｎに付与された特許に記載されているような「シャッフルされた（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）遺伝子」を指す場合もある。例えば、本発明で言う変異体は、引用によりここに取り込まれる米国特許第６，１３２，９７０号明細書に開示された方法および原理にしたがって改変された配列および所望のポリヌクレオチドの変異体も含む場合がある。
【００６０】
本明細書で用いられるところの木材組成は、木材の構造、外観または用途を変更するために改変可能な形質を指す。木材組成を決定する特性は、細胞壁の厚さと、細胞の長さと、細胞のサイズと、内腔の大きさと、細胞密度と、微繊維の角度と、引張強度と、引裂強度と、木材の色と、細胞分裂の所用時間および頻度とを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
木材パルプとは、さまざまな純度の木材から得られる繊維をいう。木材パルプは、紙、板紙、化学製品の製造に用いることができる。
【００６２】
本発明は、本明細書で説明する特定の方法論、プロトコール、ベクター、試薬等に限定されるものではないことが理解されるが、それは変更が可能だからである。また、本明細書で用いる用語法は特定の実施態様のみを説明する目的で用いられており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解される。また、本明細書および添付する請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、その文脈の中で特に明言しない限り、複数形も包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「遺伝子」というときは、１個または２個以上の遺伝子を指し、当業者等に知られた均等物等を含む。実際、当業者は、植物宿主系でいずれかの天然の（現在または将来知られる）遺伝子を発現させるためにここに説明する方法を利用することができる。
【００６３】
（単数または複数の）「単離された」核酸分子とは、天然の環境から移された核酸分子である、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。例えば、あるベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたものと考えられる。単離ＤＮＡ分子の他の例は、異種宿主細胞内で維持される組み替えＤＮＡ分子か、（部分的または実質的に）精製された溶液中のＤＮＡ分子かを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子の試験管内ＲＮＡ転写産物を含む。本発明の単離核酸分子は、人工合成で製造された分子も含む。
【００６４】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態か、クローニングや人工合成によって製造されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのようなＤＮＡの形態かの場合がある。前記ＤＮＡまたはＲＮＡは２本鎖または１本鎖の場合がある。１本鎖ＤＮＡは、コーディング鎖、別名センス鎖か、ノンコーディング鎖、別名アンチセンス鎖かの場合がある。
【００６５】
特に断らない限り、本明細書でＤＮＡ分子の配列決定により決定されたすべてのヌクレオチド配列は、（アプライド・バイオシステムズ社製、モデル３７００のような）自動シーケンサを用いて決定され、また本明細書で決定されたＤＮＡ分子にエンコードされたポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のとおり決定されたＤＮＡ配列を翻訳することによって予測された。したがって、かかる自動化手法により決定されたいずれかのＤＮＡ配列について当業者に知られているとおり、本明細書で決定されたヌクレオチド配列にはなんらかのエラーが含まれている場合がある。自動的に決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して典型的には少なくとも約９５％、より典型的には少なくとも約９６％ないし約９９．９％の同一性を有する。前記実際の配列は、当業者に周知の手作業によるＤＮＡ配列決定を含むの他のアプローチにより、より正確に決定することができる。当業者に知られているとおり、決定されたヌクレオチド配列中に実際の配列と比較してたった１個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳でフレームシフトを起こし、決定されたヌクレオチド配列によってエンコードされる予測アミノ酸配列が、このような挿入または欠失が生じた塩基から後は、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にエンコードされるアミノ酸配列とは全く異なったものになる。
【００６６】
特に断らない限り、ここに示す「ヌクレオチド配列」のそれぞれは、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔと略記）の配列として提供される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」の語は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドの場合はデオキシリボヌクレオチド配列を指し、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドの場合は、対応するデオキシヌクレオチド配列中における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）がウリジンリボヌクレオチド（Ｕ）に置換された、対応するリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）配列を指す。例えば、デオキシリボヌクレオチドの省略記号を用いて示される配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子への言及は、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが対応するリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣに置換され、各デオキシヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵに置換された配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。
【００６７】
本発明は、本明細書で説明される単離核酸分子の断片にも向けられる。表８に示されるヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子の断片は、以下に詳しく説明される診断プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡ断片を指す。もちろん、従来の雑種形成手法によれば、本発明の核酸分子の全長までの長さを有するより大きな核酸断片もプローブとして診断上有用であり、また、例えば、引用によりここにその開示内容全体が取り込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＪおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｄ．Ｗ．共編（２００１年）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに説明されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅用のプライマーとしても有用である。
【００６８】
例えば、少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有する断片とは、表８に示したヌクレオチド配列由来の２０個以上の連続した塩基を有する断片をいう。表８に列挙されたヌクレオチド配列を含む核酸は、当業者にはルーティン作業であろう従来のＤＮＡ合成法を用いて作成することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる切断または超音波処理による剪断は、さまざまなサイズの断片を作成するために簡単に利用することができる場合がある。代替的に、本発明のＤＮＡ断片は、既知の方法にしたがって、人工合成によって作成できる場合がある。
【００６９】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントな雑種形成条件下で上記の本発明の核酸分子におけるポリヌクレオチドの一部と雑種形成するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。あるポリヌクレオチドの「部分」と雑種形成するポリヌクレオチドとは、前記基準ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、および、３１ヌクレオチド以上と雑種形成する（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの）ポリヌクレオチドをいう。前記基準断片と雑種形成するこれらの断片は、診断プローブおよびプライマーとして有用である。本明細書で用いられるプローブは、表８の１個の核酸の少なくとも約１００個の連続する塩基として定義される。本発明の目的には、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および非特異的キャリアＤＮＡ１００μｇを含む雑種形成溶液中で２個の配列が２本鎖複合体を形成するとき、前記２個の配列は雑種形成するといえる。Ａｕｓｕｂｅｌら、第２．９節、補遺２７（１９９４年）を参照せよ。配列が「中程度のストリンジェンシー」で雑種形成するとは、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および非特異的キャリアＤＮＡ１００μｇを含む雑種形成溶液中で、６０°Ｃの条件をいう。「高度なストリンジェンシー」で雑種形成を行うには、温度を６８°Ｃに上昇させる。かかる中程度のストリンジェンシーの雑種形成反応を行った後、２Ｘ ＳＳＣおよび０．０５％ ＳＤＳの溶液中で室温にて５回、前記ヌクレオチドは洗浄され、さらに０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ溶液を用いて６０°Ｃで１時間洗浄される。「高度なストリンジェンシー」用には、洗浄温度を６８°Ｃに上昇させる。本発明の目的には、雑種形成したヌクレオチドとは、比活性１０，０００ｃｐｍ／ｎｇの放射能標識プローブ１ｎｇを用いて検出されるものであり、前記雑種形成ヌクレオチドは−７０°Ｃ、７２時間以内のＸ線フィルムへの露出の後明瞭に視認できる。
【００７０】
上記のとおり、本出願は、上記の核酸配列との同一性が、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である核酸分子に向けられる。１つの実施態様は、表８に示される核酸配列との同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である核酸分子を包含する。ある基準ヌクレオチド配列に対して例えば少なくとも９５％「同一性がある」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、前記基準ヌクレオチド配列の１００個のヌクレオチドあたり最大５個の点突然変異を含むかもしれないことを除いて、前記基準配列と同一であることを意味する。換言すれば、基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性があるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、前記基準配列のヌクレオチドの最大５％が欠失するかまたは別のヌクレオチドに置換されている場合があるか、前記基準配列のヌクレオチド総数の最大５％の数のヌクレオチドが前記基準配列に挿入されている場合がある。前記基準配列のこれらの突然変異は、前記基準ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に起こるか、あるいは、前記基準配列中のヌクレオチドの間に１個ずつ分散するか、または前記基準配列中の１個または２個以上のグループに分かれて分散してこれら両末端の間の任意の場所で起こる場合がある。
【００７１】
実際問題として、ある特定の核酸分子が基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するか否かは、当該技術分野で周知の標準的なアルゴリズムを用いて２個の分子の間の比較を行うことで判る。配列の同一性の決定にはいかなる配列決定アルゴリズムを用いてもよいが、明確にするために、本発明はＢａｓｉｓ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３−４１０頁（１９９０年））を用いて同一性を決定し、本開示内容に示されるプロモーター配列が、その全長にわたってポリヌクレオチド相同体の同一性の百分率を決定するための基準配列として用いられる。より生物学的に現実性のある結果をもたらすパラメータはいくつか知られているが、一致、不一致、および挿入または欠失のパラメータ値の選択は任意である。
【００７２】
本発明にしたがって、ある特定の配列が基準配列に対して、例えば、９５％の同一性を有しているか否かを決定するためにＢＬＡＳＴその他の配列アライメントプログラムを用いるときには、同一性の百分率が前記基準ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、前記基準配列中のヌクレオチド総数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
【００７３】
２個のポリヌクレオチドの間の関連度（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）は、前記ポリヌクレオチドが雑種形成して相補的塩基対の形成によって２本鎖複合体を形成する能力に関連づけて説明することができる。雑種形成条件については既に説明した。温度の上昇はこれらの複合体を解離するのに利用することができる。２つの配列の構造的な同一性が大きいほど、両者を解離または「融解」させるのに必要な温度は高くなる。２本鎖複合体を融解させるのに必要な温度は「Ｔｍ」と呼ばれる。Ｔｍと他の雑種形成パラメータとの関係は、次式で表される。
Ｔｍ（°Ｃ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ分画）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／ｌ）
前記式で、Ｔｍはプローブとその標的とからなるＤＮＡ２本鎖複合体の融解温度であり、ｌは雑種形成体の長さ（単位：塩基対）、但しｌ＞１００塩基対である。Ｂｏｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４８巻、１３９０頁（１９６２年）を参照せよ。一般に、融解温度が１°Ｃ変化することは、ＤＮＡ配列の類似度に０．７％から３．２％までの相違があることを表す。Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８１巻、１２３−３５頁（１９７３年）；ＭｃＣａｒｔｈｙら、ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｈ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈ編、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏ．２３、Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅａｃｈ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−４３頁（１９７２年）。安定なＤＮＡ２本鎖複合体を６０°Ｃで形成するには、配列の間に少なくとも８０％の配列同一性が必要である。Ｓｉｂｌｅｙら、ＡＣＴＡ、１巻、８３−１２１頁（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｎｉｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、８月１６〜２４日、１９８２年、ソ連科学アカデミー）。
【００７４】
本発明の核酸は、植物の維管束組織においてポリペプチドまたはタンパクを優先的に発現させる。また本発明の核酸は、標的遺伝子の発現を阻害または完全にブロックする目的で使用可能な、アンチセンスＲＮＡの発現、または、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与するＲＮＡの発現を植物の維管束組織において優先的に行わせることができる。
【００７５】
本明細書で用いられる維管束植物組織とは、木部、篩部または維管束の形成層組織をいう。１つの実施態様では、本発明のプロモーターは「木部特異的」、「形成層特異的」および／または「篩部特異的」のいずれかであり、それぞれ木部、形成層および／または篩部におけるある操作可能に連結した核酸セグメントの発現を指令する。本明細書で用いられる「コード産物（ｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、前記プロモーターに操作可能に連結した核酸の最終産物を意味する。例えば、タンパクまたはポリペプチドと、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとはコード産物であり、ｓｉＲＮＡは前記アンチセンスＲＮＡの核酸コーディングの最終産物である。またコード産物は非翻訳ｍＲＮＡの場合がある。本明細書では、ポリペプチドおよびタンパクという用語を互換的に用いる。例えば木部特異的とは、本発明の核酸分子が他のいかなる植物組織におけるよりも木部において活性が高いことを意味する。１つの実施態様において本発明の核酸は、それぞれ植物の木部、形成層、および／または篩部組織でのみ活性があるという意味で、木部、形成層および／または篩部で特異的に活性を示すプロモーターである。換言すれば、例えば「木部特異的」プロモーターは、検出可能なレベルのコード産物は植物の木部組織においてのみ発現するように、前記コード産物を発現させる。しかし、植物個体内での溶質輸送のために、木部、篩部または形成層で特異的に発現するコード産物が植物個体内の他の場所で見出される場合があるため、その存在は必ずしも木部組織には限定されない。一方、維管束優先発現的プロモーターは、木部、篩部または形成層組織のいずれかにおいて、あるいはこれら３つの組織タイプのうち少なくとも２つにおいて優先的に活性を示すことができる。維管束特異的プロモーターは、木部、篩部または形成層のいずれかにおいて、あるいはこれら３つの組織タイプのうち少なくとも２つにおいて特異的に活性を示すことができる。
【００７６】
本明細書で用いられる維管束系は、高等植物において水および光合成産物の輸送に用いられる木部および篩部の各組織と、該木部と篩部との間に位置する維管束形成層とから構成される。維管束系の構成要素としては、木部と篩部とをまとめて維管束組織と呼ぶ。維管束組織は、２つの発生学的に区別される段階で形成される。胚形成段階および／または胚形成後の段階では、頂端分裂組織および前形成層の分化から一次維管束組織が発生する。二次維管束組織は、維管束形成層の分化から発生する。
【００７７】
維管束形成層は、木部と篩部との間に位置する側生分裂組織であり、分化して二次維管束組織を生成する。維管束形成層は、紡錘形原始細胞および木質線原始細胞という２つの細胞タイプで構成され、これらは形成層原始細胞と総称される。紡錘形原始細胞の分裂は、木部および篩部の長手方向、すなわち軸系を形成し、線原始細胞の分裂は、横方向、すなわち線系の発達をもたらす。形成層原始細胞は、木部細胞が長軸の内側に向かって凝集し、篩部細胞が周辺へ向かって凝集するように、軸の接線方向に分裂する。
【００７８】
本明細書で用いられる木部とは、水やミネラルイオンを根系から植物の空中部分へと輸送する伝導組織をいう。一次および二次木部組織の両方とも、異なる３つの細胞タイプ、すなわち、導管要素、繊維および柔細胞を含む。導管要素は、無孔仮導管および有孔導管要素を含み、水の導通機能を果たす。木部繊維は、繊維仮導管および靱皮状繊維を含み、木部の構造に強度および剛性を与える。柔細胞は、軸細胞および放射細胞を含み、デンプン、油その他のエネルギーの豊富な分子の貯蔵に重要である。したがって、本発明の木部特異的プロモーターは、一次および／または二次木部の導管要素、繊維および／または柔細胞で活性がある。
【００７９】
篩部は、光合成産物を成熟した葉から成長および貯蔵を担う領域へと移動させる植物組織である。一次および二次篩部組織の両方を含む主な細胞は、篩要素、柔細胞および繊維を含む。篩要素は、篩部の伝導要素であって、裸子植物に存在する篩細胞か、被子植物に存在する篩管かを含む。篩管要素は篩管と呼ばれる固有の構造を形成し、篩管は、縦方向に配列され、篩板と呼ばれる細胞壁の一部を通じて相互に連絡する一連の篩管要素でできている。これに対し、裸子植物や下等維管束植物に存在する特殊化の程度の低い篩細胞は、相互に連絡して篩板を形成することはない。篩細胞は、篩域と呼ばれる拡大した孔部を通じて伝導が容易になるように、重複したアレイ状に配置される。篩要素は、被子植物では伴細胞、裸子植物では胚乳細胞と呼ばれる特殊な柔細胞と連携し、かつ、依存している。伴細胞および胚乳細胞の両方とも、篩要素の機能に必要なタンパクおよび代謝産物の貯蔵を担う。前記特殊な柔細胞に加え、篩部は、デンプン、脂肪その他の化合物を蓄積し貯蔵する機能がある柔細胞を含む。篩部繊維は篩部構造に強度を与え、場合によりデンプンの貯蔵に寄与する。したがって、本発明の篩部特異的プロモーターは、一次および／または二次篩部の篩要素、柔細胞、および／または繊維で活性がある。
【００８０】
ほとんどの高等植物において維管束組織は、基本組織間に位置する円筒状をしている。根と茎の両方で、髄と皮層とが基本組織を構成する。髄は維管柱の内部に位置し、皮層は表皮と維管束組織との間に位置する。維管束系とこれに付随する基本組織を、維管柱と総称する。
【００８１】
本明細書で用いられるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節エレメントに結合する核酸、好ましくはＤＮＡを意味する。他のいかなるプロモーターと同様、本発明のプロモーターは、該プロモーターと操作可能に連結している核酸分子からｍＲＮＡ分子を生成するために、ＤＮＡまたはＲＮＡを転写することを促進または制御する。前記のとおり、生成されたＲＮＡはタンパクまたはポリペプチドをコードするか、あるいはＲＮＡ干渉、またはアンチセンス分子をコードする場合がある。本明細書で用いられる「操作可能に連結した」とは、ＲＮＡセグメントに転写されるべき核酸配列に対してプロモーター−核酸配列の組合せが適切な配向で形成されるような、化学的融合、連結、またはＤＮＡ合成をいう。本発明のプロモーターは、生成するｍＲＮＡ転写産物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の一部または全部を含む場合がある。一方、本発明のプロモーターは、必ずしも５’ＵＴＲを有している必要はない。
【００８２】
本明細書で用いられるプロモーターは調節エレメントを含む場合もある。逆に、調節エレメントがプロモーターから分離される場合がある。調節エレメントはプロモーター領域に多数の重要な特徴を与える。一部のエレメントは、前記操作可能に連結した核酸の転写速度を増大させる転写因子と結合する。他のエレメントは、転写活性を阻害するリプレッサーと結合する。転写因子がプロモーター活性に総合的に及ぼす影響は、該プロモーター活性が高いか低いか、すなわち、プロモーターが「強い」か「弱い」かを決定する場合がある。調節エレメントと結合する転写因子自身が、他の結合タンパクとの相互作用または細胞外刺激に応答する共有結合による修飾、例えばリン酸化によって調節される場合がある。一部の転写因子は、細胞内代謝産物か、その生物個体にとって外来性の化学物質かのような細胞核と情報交換する情報伝達分子によってモジュレーションされる。細胞環境の変化によって影響を受けないプロモーターは、構成的プロモーターと呼ばれる。
【００８３】
本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクターも提供する。１つの実施態様において、本発明のベクターはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉ−プラスミドである。
【００８４】
本発明の核酸コンストラクトを開発するとき、前記コンストラクトまたはその断片のさまざまな構成要素を便利なクローニングベクター、例えば大腸菌のような細菌宿主内で自己複製能を有するプラスミドに通常の手法で挿入されるのが普通であろう。多数のベクターが文献に記載され、その多くは市販されている。それぞれのクローニングが終了した後、所望のインサートを有するクローニングベクターが単離され、所望の配列の構成要素を仕立てるために、制限消化、新しい断片またはヌクレオチドの挿入、連結、欠失、突然変異、再切断等の他の操作に供される。前記コンストラクトは、完成すると、宿主細胞の形質転換のやり方にしたがってさらなる操作を行うために適当なベクターに移植される場合がある。
【００８５】
本発明の組換えＤＮＡ分子は、形質転換された細胞を容易に同定し、形質転換されていない細胞から選別できるように、選択可能なマーカーを含むのが典型的である。かかるマーカーの例は、カナマイシン耐性を可能にするネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、（１９８５年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９巻、１８３−１８８頁）を含むが、これに限定されない。ｎｐｔＩＩ遺伝子を発現する細胞は、カナマイシンまたはＧ４１８のような適当な抗生物質を用いて選択できる。他の慣用される選択可能なマーカーは、ビアラホス耐性を可能にするｂａｒ遺伝子と、グリホセート耐性を可能にするＥＰＳＰシンターゼ遺伝子突然変異体（Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、９１５−９２２頁（１９８８年））と、ブロモキシニル耐性を可能にするニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒら、（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻、６３１０−６３１４頁）と、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を可能にするアセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）突然変異体（欧州特許第１５４，２０４号、１９８５年）と、メトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻、１２５００−１２５０８頁）とを含む。
【００８６】
さらにベクターは、特定の宿主細胞の複製開始点（レプリコン）を含む場合がある。さまざまな原核生物のレプリコンが当業者に知られており、原核宿主細胞中における組換え分子の自己複製と維持を指令する役割を果たす。
【００８７】
ベクターは、選択可能なマーカーを含むことが好ましい。トランスフェクションされた植物の選択に用いるための多数の選択可能なマーカーはカナマイシン、グリホセート耐性遺伝子を、大腸菌、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓその他の細菌中で培養するための選択可能なマーカーはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ含むが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明の核酸を微粒子銃法によって単子葉植物に導入するのに適したプラスミドベクターは、選択したプロモーターと、Ｈｓｐ７０イントロン（国際公開第ＷＯ９３／１９１８９号公報）のような遺伝子発現を促進するスプライシング部位を提供するイントロンと、ノパリンシンターゼ３’配列（ＮＯＳ３’、Ｆｒａｌｅｙら（１９８３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８０巻、４８０３−４８０７頁）のような３’ポリアデニル化配列とで構成される。この発現カセットは、ＤＮＡの大量生産に適したハイコピーレプリコン上に構築される場合がある。
【００８９】
特に有用な双子葉植物の形質転換用アグロバクテリア利用植物形質転換ベクターは、プラスミドベクターｐＭＯＮ５３０（Ｒｏｇｅｒｓら、（１９８７年）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｅｘｐｒｅｓｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．、Ｒ．Ｗｕおよび Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ共編、２５３−２７７頁、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）である。プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ３１６（Ｒｏｇｅｒｓら、（１９８７年）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．、Ｒ．Ｗｕおよび Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ共編、２５３−２７７頁、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）のＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．３ｋｂ）をｐＭＯＮ５２６に移植して調製されたｐＭＯＮ５０５の誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５２６は、前記ＳｍａＩ部位がＸｍａＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ処理および連結によって除去されたｐＭＯＮ５０５の単純な誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ５０５およびＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ発現カセットの特性のすべてを保持し、プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に唯一のＳｍａＩ切断部位を持つことになる。
【００９０】
バイナリーベクターｐＭＯＮ５０５は、Ｔｉプラスミド相同領域ＬＩＨが、ミニＲＫ２プラスミドｐＴＪＳ７５（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ．、（１９８５年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４−１５５頁）の３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩセグメントに置換されたｐＭＯＮ２００（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８７年）の誘導体である。このセグメントは、トリペアレンタル（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ）交配法によるアグロバクテリアへの接合に用いられるＲＫ２複製開始点ｏｒｉＶと転移起点ｏｒｉＴとを含む（ＨｏｒｓｃｈおよびＫｌｅｅ、（１９８６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ．、８３巻、４４２８−４４３２頁）。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、所望のＤＮＡ断片を挿入するための合成マルチリンカーと、植物細胞におけるカナマイシン耐性ＮＯＳ／ＮＰＴＩＩ’／ＮＯＳキメラ遺伝子と、大腸菌およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける選択用のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定因子と、形質転換体のスコアリングおよび後代での遺伝子保持の確認を容易化するインタクトなノパリンシンターゼ遺伝子と、大腸菌体内でベクターの大量生産を可能とするｐＢＲ３２２複製開始点とを含む、ｐＭＯＮ２００の重要な特徴をすべて保持する。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、ｐＴｉＴ３７ノパリン型Ｔ−ＤＮＡの右端に由来する単一のＴ−ＤＮＡ境界を含む。サザンブロット分析は、プラスミドｐＭＯＮ５０５およびこれに含まれるすべてのＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれていること、すなわち、プラスミド全体が植物ゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡであることを示す。組込みＤＮＡの一端は、右境界配列とノパリンシンターゼ遺伝子との間に位置し、他端は前記境界配列とｐＢＲ３２２配列との間に位置する。
【００９１】
別の特に有用なＴｉプラスミドカセットベクターは、ｐＭＯＮ１７２２７である。このベクターは、国際公開第ＷＯ９２／０４４４９号公報に記載されており、ジャガイモ、トマトを含む多くの植物の優れた選択マーカーである、グリホセート耐性を可能にする酵素（ＣＰ４と命名）をエンコードする遺伝子を含む。この遺伝子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ２）と融合し、選択したプロモーターによって発現する。
【００９２】
小胞体ルーメン、ペリプラズム間隙または細胞外環境へ翻訳されたタンパクを分泌するために、適当な分泌シグナルが発現したポリペプチドに組み込まれる場合がある。前記シグナルは、前記ポリペプチドに内在するものであっても、あるいは、異種シグナルであってもよい。
【００９３】
１つの実施形態では本発明のベクターは、本明細書で説明される核酸が、関心のあるポリペプチドをエンコードするＤＮＡに操作可能に連結した組織特異的プロモーターとなるように設計される。別の実施態様では、関心のあるポリペプチドは植物個体におけるリグニン生合成に関与する酵素である。リグニン生合成に関与する多くの酵素をエンコードするポリヌクレオチドは、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、クマレート３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ＰＮＬ）、Ｏ−メチルランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびマツ由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）（米国特許第６，２０４，４３４号）を含むが、これらに限定されない。他の酵素は、コニフェリンβ−グルコシダーゼ（ＣＢＧ）およびカフェイン酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）を含む（米国特許第５，４５１，５１４号明細書、国際公開第ＷＯ９４／２３０４４号明細書、およびＤｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０巻、３６５−７２頁（１９９９年））。
【００９４】
別の実施態様では、前記プロモーターに操作可能に連結されたコーディング配列は、リグニン生合成に関与する酵素の発現または活性を阻害する遺伝子産物をコードする場合がある。例えば、リグニン生合成の制御にとって特に関心があるのは、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、クマレート３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ＰＮＬ）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびマツ由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）に対するアンチセンス遺伝子である。
【００９５】
さらに別の実施態様では、本発明のベクターは、本発明の核酸が、関心のあるポリペプチドをコードする遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡをエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡに操作可能に連結し、これによって標的遺伝子産物の発現を弱めるように設計される。抑制の標的となる遺伝子産物は、上記のとおり、リグニン生合成に関与する酵素であることが好ましい。遺伝子発現のＲＮＡｉ阻害の利用は、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、１６巻、９４８−９５８頁（２００２年）に概説されており、また遺伝子発現を阻害するためのＲＮＡｉの利用は、国際公開第ＷＯ９９／６１６３１号公報に具体的に記載されており、両文献は、引用によりここに取り込まれる。
【００９６】
特定の植物遺伝子の発現を低減または阻害するためのアンチセンス技術の利用は、例えば欧州出願公開第２７１９８８号公報に記載されている。遺伝子発現の低減は、植物の表現型に変化をもたらし、それは例えば、トマト果実中のリコピン合成欠損のため赤くなるはずの実が黄色くなるといった目に見えるレベルの表現型の差異か、あるいは例えばトマト果実の成熟過程におけるポリガラクトウロナーゼ量の変化およびペクチンの脱重合の低減のような、より微小な生化学的レベルかのいずれかで現れる（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４巻、７２４−７２６頁（１９８８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４巻、３６９−３７９頁（１９９０年））。このように、アンチセンスＲＮＡは植物における遺伝子発現を低下させる上で有用であることが実証されている。
【００９７】
本発明の植物の作成方法の１つの実施態様では、植物個体内で転写されてアンチセンスＲＮＡ転写産物を生成する外来性のＤＮＡは、植物個体内、例えば植物細胞内に導入される。前記外来性ＤＮＡは、例えばそのプロモーターに対する遺伝子配列の配向を反転することにより調製することができる。植物細胞内における前記外来性ＤＮＡの転写は、その遺伝子に対して「アンチセンス」な細胞内ＲＮＡ転写産物を生成する。
【００９８】
例えばアンチセンス技術は、４ＣＬのようなリグニン生合成に関与する酵素をエンコードする遺伝子の発現を抑制するために用いられる場合がある。４ＣＬのアンチセンスＤＮＡ配列を含むコンストラクトは、プロモーターに操作可能に連結された４ＣＬをエンコードする外来性ＤＮＡの配向を反転することにより調製することができる。前記外来性の４ＣＬＤＮＡの植物細胞における転写は、アンチセンス配向の４ＣＬＲＮＡ転写産物を生成する。
【００９９】
また本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で用いられる宿主細胞とは、コード産物が最終的に発現される細胞をいう。したがって宿主細胞は、個々の細胞、細胞培養、または生物個体の一部である複数の細胞であり得る。また宿主細胞は、胚、胚乳、精子または卵子、または受精卵の場合がある。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはベクターは、標的宿主生物への組換えベクターＤＮＡを導入するための当該技術分野で知られた標準的な手順によって宿主細胞に導入される。かかる手順は、トランスフェクション、感染、形質転換、自然取込み、エレクトロポレーション法、微粒子銃法およびアグロバクテリアの使用を含むが、これらに限定されない。生物学的および物理的な植物形質転換プロトコールを含む、外来遺伝子を植物に導入する方法は当該技術分野で知られており、本発明の遺伝子コンストラクトを植物宿主に挿入するために用いられる場合がある。例えば、Ｍｉｋｉら、１９９３年、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ共編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、６７−８８頁を参照せよ。選択される方法は宿主植物によって異なり、リン酸カルシウムのような化学的トランスフェクション法、アグロバクテリアのような微生物を介した遺伝子導入（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７巻、１２２９−３１頁、１９８５年）、エレクトロポレーション法、顕微注入法、および微粒子銃法を含む。
【０１０１】
したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはベクターを含む、植物個体または植物細胞も提供する。１つの実施態様では前記植物は、被子植物または裸子植物である。別の実施態様ではこれら植物は、ユーカリ属およびマツ属の種から選択される。特にトランスジェニック植物は、ユーカリ・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）およびその交雑種、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ Ｌ、ｌｏｂｌｏｌｌｙ ｐｉｎｅ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）、カロリナポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）またはモミジバフウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂｅｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ）に属する植物種の場合がある。通常の植物の意味を超え、本明細書では「植物」の語を植物の果実、種子、花、胞子嚢等も指すものとする。本発明の植物は、直接トランスフェクション体、すなわちベクターがアグロバクテリアを介するやり方のように直接的に導入されるか、あるいはトランスフェクションされた植物の子孫植物の場合がある。前記子孫は、トランスフェクションされた植物の無性生殖によって得られる場合がある。第２世代またはその以降の世代の植物は、有性生殖すなわち受精によって作成される場合も、そうでない場合もある。さらに前記植物個体は、配偶体（単相期）または胞子体（複相期）の場合がある。
【０１０２】
本発明はまた、本発明のベクターを含む植物または種子を栽培することを含む、植物のリグニン含量の制御方法を提供する。本発明の植物または種子の成長または発芽を誘導または維持する適切な栽培法は種特異的であり、本発明の属する技術分野の通常の知識レベルの範囲内である。栽培場所は、植物個体または種子の成長または発芽を促進できるいかなる場所でもよい。さらに、栽培には、葯および／または小胞子内に胚形成を誘導できるストレス処理（例えば、窒素欠乏、熱ショック、ショ糖欠乏）が含まれていてもよいが、ストレス処理はこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明はさらに、転写因子と結合し、組織優先発現的または組織特異的な発現を調節する能力を有する単離調節エレメントも提供する。前記調節エレメントによって実現される調節の程度は、完全、すなわち、前記転写因子無しでは転写が検出できない場合もあるが、部分的、すなわち、前記転写因子の存在下で転写が増強される場合もある。１つの実施態様では、複合プロモーターを用意するために、少なくとも１個の調節エレメントが異種プロモーターに連結される。前記複合プロモーターは、維管束組織内で優先的または特異的に発現させる。本明細書で用いられる異種プロモーターは、前記調節エレメントとの関係で定義される。自然環境で調節エレメントとプロモーターとが互いに協働していない場合は、そのプロモーターはその調節エレメントに対して異種とされる。典型的には、ある調節エレメントのプロモーター領域内での正確な配向はその活性に影響しない。さらに調節エレメントは、異種プロモーター領域に挿入されたときでも正常に機能することができる。したがって、例えば、木部特異的発現または木部優先的発現を実現するために、木部優先発現的調節エレメントが本来のプロモーターから取り出されて異種プロモーター領域に挿入される場合がある。同様に、篩部特異的発現または篩部優先的発現を実現するために、篩部優先発現的調節エレメントがその本来のプロモーターから取り出されて異種プロモーター領域に挿入される場合がある。同様に、形成層特異的発現または形成層優先的発現を実現するために、形成層優先発現的の調節エレメントがその本来のプロモーターから取り出されて異種プロモーター領域に挿入される場合がある。前記異種プロモーターは、例えば最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの場合がある。最小プロモーターに改変するのに適した植物細胞内での発現を指令するプロモーターは、カリフラワーウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻、３９０１−０７頁（１９８７年））、コメのアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２巻、１６３−７１頁（１９９０年））、トウモロコシのユビキチン−１プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５巻、２１３−１８頁（１９９６）年）、およびノパリンシンターゼプロモーター（Ｋｏｎｏｎｏｗｉｃｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、１７−２７頁（１９９２））を含む。
【０１０４】
本発明の核酸を調製するにあたり、さまざまな制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムをばらばらの断片に消化し、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）およびユーカリ・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）からゲノムライブラリが作成された。ゲノムライブラリは、組織選択的プロモーターを得るのに適したいかなる植物種からも同様に構築することができる。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（カリフォルニア州、パロアルト）のＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒシステム（登録商標）用に提供される手順にしたがって、アダプターがこれらゲノム配列の各々に連結された。次にプロモーター配列は、アダプター特異的プライマーと「遺伝子特異的プライマー」とを用いてＰＣＲ法で増幅された。代替的には、このＰＣＲ増幅のステップは、任意的に長鎖でバックグランドが最小の反応生成物を産生する方法であって、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，５６５，３４０号および第５，７５９，８２２号明細書に記載される方法により実行される場合がある。この一般的なＰＣＲ増幅法を用いることにより、本発明のプロモーターの同定およびその組織選択的プロモーターとしての同定は、前記「遺伝子特異的プライマー」の選択よって左右される。
【０１０５】
遺伝子特異的プライマーは、関心のある組織内で高度に発現されるいずれかの転写配列である。本発明では、遺伝子特異的プライマーは、維管束組織中で高度に発現されるｍＲＮＡの断片か、あるいは該ｍＲＮＡに対して相補的である。１つの実施態様では、前記遺伝子特異的プライマーは、特定の維管束組織のタイプにおいて特異的に発現することが知られている遺伝子に対する相同性によって選択される。特に関心のある遺伝子は、ある特定の維管束組織中で高度に発現される遺伝子であり、これは対応するプローモーターの維管束選択的活性の指標となるのが典型的である。
【０１０６】
発現配列タグ（ＥＳＴ）は遺伝子特異的プライマーの別の供給源である。ＥＳＴは、あるライブラリ中に存在する対応ｍＲＮＡのｃＤＮＡ断片である。いずれかの植物ＥＳＴデータベースが、所望の組織タイプで特異的に発現することが知られている遺伝子のセグメントとの同一性があるＥＳＴを捜すために、電子的に検索される場合がある（「インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）スクリーニング」）。したがってこれらのＥＳＴは、あるゲノムライブラリ内の対応する遺伝子のプロモーターの増幅に用いられる遺伝子特異的プライマーを提供する。増幅された遺伝子プロモーターは、ＥＳＴデータベースの構築の元となる植物種と同じ植物種に由来するものである必要はない。前記ＥＳＴが、関心のある遺伝子プロモーターに対して、前記遺伝子の標的セグメントのＰＣＲ増幅用プライマーとして作用するのに十分な配列類似性を備えていることだけが必要である。
【０１０７】
組織特異的プロモーターを同定する代替的な方法は、ある組織タイプ内では発現するが他の組織内では発現しないｍＲＮＡは組織特異的プロモーターから転写されたことを意味するので、かかるｍＲＮＡの検出に基づく。ｍＲＮＡの集団は、例えばサブトラクティブハイブリダイゼーション法により、この原理で区別することができる。かかるサブトラクティブハイブリダイゼーション法の１つの例は、ＣｌｏｎｔｅｃｈによるＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）法である。
【０１０８】
代替的には、組織特異的ｍＲＮＡの分布は、植物組織の薄切片を放射標識プローブとｉｎ ｓｉｔｕで雑種形成させることにより、決定することができる。特定の組織タイプを放射能で反応するプローブは、以下に説明する方法を用いるゲノムライブラリのサザン分析により、ｍＲＮＡと関連するプロモーターを検出するのに用いられる。前記の技術は全て関心のある組織、ここでは維管束組織からのｍＲＮＡライブラリの作成を要する。例えば、木部組織からのｃＤＮＡライブラリの調製は、Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０巻、３６５−７２頁（１９９９年）およびＬｏｏｐｓｔｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７巻、２７７−９１頁（１９９５年）に記載されている。簡潔には、まず伐採した木から活発に分化している木部を剥ぎ取る。常法にしたがって全ＲＮＡが単離され、ポリ（Ａ）ＲＮＡが単離され、木部組織ｃＤＮＡライブラリを構築するために逆転写される。例えばＤｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａ（１９９９年）に説明されているように、前記ｃＤＮＡライブラリは、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ ｃＤＮＡ合成およびＧｉｇａｐａｋＩＩ Ｇｏｌｄ（登録商標）パッケージングキットを用いて、λＺＡＰ−ＸＲベクターで構築された。木部特異的プロモーターは、遺伝子特異的プローブと前記プロモーターの５’末端の配列を認識するプライマーとを用いて、ＰＣＲ法により、かかるｃＤＮＡライブラリからを単離することができる。遺伝子特異的プローブは、前記インシリコのアプローチによって、あるいは、もしｍＲＮＡ配列が既知の場合には、該ｍＲＮＡ配列にもとづく特異的プローブを設計することによって得られる場合がある。さらに、所望の標的遺伝子の５’ＵＴＲに相補的なプライマーが合成できる。代替的には、前記プライマーは、エンコードされたタンパクのアミノ酸配列の一部から、いわゆる縮重プライマーとして設計できる（Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎａ（１９９９年）を参照せよ。）。
【０１０９】
関心のあるプロモーターを単離した後は、さまざまな手法がその組織特異的発現パターンやプロモーターの強さを調べるために利用できる。慣用される方法の１つは、前記プロモーターをアッセイの容易なレポーター遺伝子と操作可能に連結させることである。例えば、木部優先発現的プロモーターと、グニーユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕｎｎｉｉ）シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＥｇＣＣＲ）遺伝子（位置：−１４４８〜＋２００、ただし＋１が転写開始部位）の５’ＵＴＲとが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をエンコードする遺伝子と操作可能に連結される（Ｌａｃｏｍｂｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２３巻、６６３−７６頁（２０００年））。適切な発現コンストラクトは、周知の方法にしたがって作出することができる。
【０１１０】
植物の形質転換は、米国特許第６，０５１，７５７号明細書に説明されるアグロバクテリアを介した形質転換法を含む多数の適切な方法のいずれかを用いて行うことができる。樹木を形質転換する当該技術分野における他の方法が、加速粒子による裸子植物の体細胞胚の形質転換を開示する米国特許第６，５１８，４８５号明細書に代表されるように、本発明の技術分野で知られている。他の形質転換法は、微粒子銃法（Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、５５９−６３頁（１９８８年））、エレクトロポレーション法（Ｄｈａｌｌｕｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、１４９５−１５０５頁（１９９２年））、およびポリエチレングリコール処理法（Ｇｏｌｏｖｋｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、９０巻、４１−５２頁（１９９３年））を含む。さらに、米国特許第６，１８７，９９４号明細書は、リコンビナーゼに支援される形で発現コストラクトを植物ゲノム中の特異的選択部位に挿入する方法を提供する。上記の特許および文献はすべて引用によりここに含まれる。
【０１１１】
本発明のＤＮＡ分子は、いずれかの適当な方法を用いて植物のゲノムに挿入できる。好適な植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するものと、例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、２０９頁（１９８３年）と、Ｂｅｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１２巻（２２号）（１９８４年）、８７１１−８７２１頁と、Ｋｌｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３巻（７号）、６３７−６４２頁（１９８５年）と、欧州特許出願公開第１２０，５１６号公報に開示されるものとを含む。アグロバクテリアのＴｉまたは根誘導（Ｒｉ）プラスミドから誘導される植物形質転換ベクターに加えて、代替的な方法が、本発明のＤＮＡコンストラクトを植物細胞に挿入するために利用可能である。かかる方法は、例えば、リポソームの使用と、エレクトロポレーション法と、遊離ＤＮＡの取込みを増大させる化学物質と、微粒子銃による遊離ＤＮＡの送達と、ウィルスまたは花粉を用いる形質転換とを含む場合がある。ＤＮＡは、葉緑体のゲノムに挿入される場合もある（Ｄａｎｉｅｌｌら（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３４５−３４８頁）。
【０１１２】
関心のある核酸を含む細胞（またはプロトプラスト）が適当な数だけ得られると、該細胞（またはプロトプラスト）は完全な植物個体に再生される。再生ステップのための方法論の選択は重要ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバー等）と、セリ科（ニンジン、セロリ、パースニップ）と、アブラナ科（キャベツ、ダイコン、ナタネ等）と、ウリ科（メロンおよびキュウリ）と、イネ科（コムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ等）と、ナス科（ジャガイモ、タバコ、トマト、コショウ）と、ヒマワリのようなさまざまな花卉作物と、アーモンド、カシュー、クルミ、ペカンのようなナッツを産する樹木とに由来する宿主について適切なプロトコルは入手可能である。例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏら、（１９８４年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．と、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．（１９９０年）ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、４月１６〜２２日、１９９０年、コロラド州、キーストーンと、Ｖａｓｉｌら、（１９９０年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻、４２９−４３４頁と、Ｖａｓｉｌら、（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、６６７−６７４頁と、Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９０年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９３巻、８５７−８６３頁と、Ｄａｔｔａら（１９９０年）とを参照せよ。
【０１１３】
プロモーターとレポーター遺伝子とを含むベクターは、該ベクターで形質転換に成功した植物細胞を選択するメカニズムを備え、例えばカナマイシン耐性を有する場合がある。形質転換体中のＧＵＳ遺伝子の有無は、ＧＵＳ特異的ＰＣＲプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト）を用いてＰＣＲ法で確認される場合がある。形質転換された植物細胞の子孫におけるカナマイシン耐性の分離は、安定に挿入された前記ベクターを宿す遺伝子座の数を決定するためにサザン分析と組み合わせて利用される場合がある。プロモーター発現の時間的および空間的パターンは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻、３９０１−０７頁（１９８７年）の記載にしたがって、レポーター遺伝子発現の定量化から推測される。一般にＧＵＳの発現は、先ず９０％アセトンで固定した後、ＧＵＳの基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を含む緩衝液中で固定された植物組織の薄切片中で組織化学的に決定される。ＧＵＳ発現産物の有無は、Ｘ−Ｇｌｕｃを用いる比色定量反応により示される。
【０１１４】
例えば木部特異的な発現は、木部組織中で転写因子と特異的に結合する調節エレメントの存在によって実現される場合がある。木部特異的な発現の程度に影響する転写因子の間の相互作用は、調節エレメントの塩基対のサブセットと前記転写因子のアミノ酸残基とのアライメントに依存する。同様に、例えば篩部特異的または形成層特異的な発現は、それぞれ篩部および形成層組織中で転写因子を特異的に結合する調節エレメントの存在によって実現される場合がある。結合した転写因子と相互作用を行わない塩基対は、組織特異的転写因子を特異的に結合する調節エレメントの全体的な能力は維持したまま、他の塩基対に置換される場合がある。
【０１１５】
いったんプロモータが組織優先発現的または組織特異的と同定された後は、組織優先発現的または組織特異的プロモーターの活性に影響を与える調節エレメントの同定や特徴付けをするためにさまざまな方法論が利用できる。１つの方法では、前記プロモーター領域は５’末端が徐々に短くなるように切断され、切断された一連のプロモーターはそれぞれレポーター遺伝子に操作可能に連結される。調節エレメントが欠失すると、レポーター遺伝子の組織特異的発現が失われることからプロモーター活性への影響が推測される。代替的には、ＣａＭＶ３５Ｓ最小プロモーターのような最小プロモーターを含む発現コンストラクトに調節エレメントと推定される配列を挿入し（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６巻、７４７−５６頁）、前記調節エレメントと推定される配列が組織特異的発現を与えるか否かを確認することができる。最小プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位のような、プロモーター活性に不可欠な要素のみを含む。推定的な調節エレメントの解明についての追加例は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）および４−クマレートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をエンコードする遺伝子の転写を協調的に調節する組織特異的調節エレメントの研究によりもたらされている（Ｈａｔｔｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、７巻、８５９−７６頁（１９９５年）； Ｌｅｙｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、２６３−７１頁（１９９２年）； Ｈａｕｆｆｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４巻、２３５−５３頁（１９９３年）； Ｎｅｕｓｔａｅｄｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１８巻、７７−８８頁（１９９９年））。これらの文献はすべて、引用により本発明に含まれる。
【０１１６】
推定的な調節エレメントの位置決定を行う別の方法は、既知の維管束優先発現的または維管束特異的な調節エレメントの間で配列を比較することである。ヌクレオチド比較により、例えば維管束優先発現的調節エレメントのような既知の組織優先発現的調節エレメントと類似する領域が同定される。例えば、シンナミルＣｏＡレダクターゼと、フェニルプロパノイド産生に関与する他のプロモーターとの間でプロモーター配列を比較することにより、配列ＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣを有する保存されたＡＣリッチな領域の存在が明らかになる。Ｌａｃｏｍｂｅ（２０００年）を参照せよ。フェニルプロパノイド合成に関与するプロモーター中に前記配列が保存されていることは、保存されている前記配列が、複数の植物種でこれまでに同定されている、ＭＹＢのような協調的活性化転写因子に対する結合部位であることを意味する。Ｍａｒｔｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１３巻、６７−７３頁（１９９７年）を参照せよ。例えば、ＭＹＢ結合部位は、トウモロコシでは（［Ｃ／Ａ］ＴＣＣ［Ｔ／Ａ］ＡＣＣ）、ペチュニアでは（ＴＡＡＣ［Ｃ／Ｇ］ＧＴＴまたはＴＡＡＣＴＡＡＣ）と同定されている。同上。
【０１１７】
本発明の核酸配列にもとづいてこのような配列比較を行うことにより、以下の表１に示される一連のモチーフが明らかになる。表１のモチーフは、組織優先発現的または組織特異的転写因子に結合し、異種最小プロモーターの組織優先発現的または組織特異的発現のモジュレーションに利用できることが期待される。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
例えば、ｂＺＩＰタンパクと維管束特異的または維管束優先発現的なプロモーターとの相互作用は、当業者がどのように調節エレメントの特徴付けを行えるかについて、別の方法を提供する。例えば、グリシンリッチなタンパクであるｇｒｐｌ．８をエンコードする遺伝子は、ＧＲＰ１．８−β−グルクロニダーゼ融合タンパクの組織化学的染色から決定されるとおり、木部特異的に発現される。Ｋｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、８巻、１３０９−１４頁（１９８９年）。ｇｒｐｌ．８プロモーターの５’欠損試験は、維管束の特異的発現に必須な２０塩基対からなる負の調節エレメントを明らかにした。Ｋｅｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３巻、１０５１−６１頁。プロモーターの負の組織特異的調節によって作用する類似の木部特異的調節エレメントが、マメのｐａｌ２と、パセリの４ＣＬ−１とで同定されている。それぞれ、Ｌｅｙｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻、２６３−７１頁（１９９２年）およびＨａｕｆｆｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４巻、２３５−５３頁（１９９３年）を参照せよ。木部の転写因子ＶＳＦ−１は、ｇｒｐｌ．８遺伝子の２０塩基対の前記調節エレメント配列と特異的な相互作用を行う。ＶＳＦ−１と調節エレメントとの相互作用は、結合特異性がＶＳＦ−１結合に関して競合する無標識ＤＮＡ標的によって示される電気泳動移動度シフトアッセイを用いて、ＶＳＦ−１と調節エレメントとによる高分子複合体の形成によって実証された。Ｔｏｒｒｅｓ−Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、 ９巻、２８３−９６頁（１９９６年）。さらにＶＳＦ−１が相互作用を行う正確な残基は、ＤＮａｓｅＩに対する調節エレメントの感受性を測定することによって解明された。簡潔には、ＶＳＦ−１と調節エレメントとの相互作用は、結合した前記転写因子の立体障害のために、ＤＮａｓｅＩがタンパクに接触した一部の残基を分解するのを防止する。典型的には、前記ＤＮＡａｓｅＩ分析は、前記転写因子が結合するときに過敏になる残基も明らかにする。前記推定的な調節エレメントが木部特異的であることを確認するために、前記推定調節領域の単量体または多量体が最小ＣａＭＶ３５Ｓまたは最小ｇｒｐ１．８プロモーターの上流に融合される。改変プロモーターに操作可能に連結され、タバコに安定的にトランスフェクションされた融合β−グルクロニダーゼ遺伝子を用いた組織化学的分析により、前記推定調節領域はこれらのプロモーターに木部特異的発現を可能にすることがわかった。Ｔｏｒｒｅｓ−Ｓｃｈｕｍａｎｎ（１９９６年）を参照せよ。
【０１２０】
本発明のプロモーターの機能変異体または断片
本発明のプロモーターのさらに別の変異体または断片は、前記配列全体にわたって散在する改変を有するものである。本明細書で用いられる機能変異体または断片とは、基準の核酸に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、しかもコード産物の組織特異的発現を依然として可能にする核酸をいう。前記機能変異体の組織特異性または優先発現性は、基準の核酸と同じ組織に対するものでなければならない。しかし、前記機能変異体が前記基準の核酸と同様の優先発現性または特異性を有していない場合でも、前記変異体は依然として本明細書で用いられる機能変異体と考えられる。１つの実施態様では、前記機能変異体または断片の配列は、前記基準の核酸に対して少なくとも約７５％の同一性を有する。別の実施態様では、前記機能変異体または断片の配列は、基準の核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１２１】
機能変異体を作成できる改変は、残基の５’末端からの逐次欠失、または５’ＵＴＲの３’末端からの欠失により作出される場合がある。代替的に内部残基が改変される場合もある。前記プロモーター領域の機能に影響を与えない改変は、転写因子の結合に影響を与えない改変である可能性が最も高い。本発明に含まれる改変は、本発明のプロモーターの対立遺伝子の変異体の形で天然に存在する改変を含む。本発明の変異体は、本明細書に説明される方法を用いてその器官または組織特異的活性、あるいは器官または組織優先発現的活性についてテストされる。
【０１２２】
本発明の核酸の作成方法
本発明の核酸は、周知の合成技術、標準的な組換え方法、精製技術、またはこれらの組合せを用いて得ることができる。例えば本発明の単離ポリヌクレオチドは、固相ホスホアミダイトトリエステル法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．、２２巻、１８５９−１８６２頁（１９８１年））、自動化合成装置（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２巻、６１５９−６１６８頁（１９８４年））、または米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載の固体支持法を用いて、直接的な化学合成により調製することができる。化学合成は１本鎖オリゴヌクレオチドを製造するのが一般的で、該１本鎖オリゴヌクレオチドは、相補的な配列との雑種形成か、あるいは、前記１本鎖オリゴヌクレオチドをテンプレートとして用いる重合かによって、２本鎖オリゴヌクレオチドに変換される場合がある。また、もっと長い配列は、短い配列を連結することによって得られる場合もある。
【０１２３】
代替的には、本発明の核酸は、互いにプライマーとして使用可能なオリゴヌクレオチドを用いる組換え法により得られる場合がある。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９０）を参照せよ。また、Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ、６０巻、１１５頁（１９８７年）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第３版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）も参照せよ。ポリメラーゼ連鎖反応を利用する確立された技術は、少なくとも２キロベースの長さを有するポリヌクレオチドを合成する能力を提供する。Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１巻、１１３１頁（１９９３年）、Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２巻、２６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎら、「Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ」、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１５巻：ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：ＣＵＲＲＥＮＴ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｗｈｉｔｅ編、２６３−２６８頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９３年）、Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、４巻、２９９頁（１９９５年）。
【０１２４】
本発明の核酸の使用方法
本発明の核酸は、植物の性質を変化させるのに有用である。前記核酸は、維管束組織に見出される分子のレベルを増大させるために、関心のある遺伝子と操作可能に連結される場合がある。代替的には、関心のある遺伝子は、最終生成物、例えばセルロースの形成を阻害する場合があるので、本発明の核酸は、維管束組織中の所定の分子のレベルを減小させるために用いられる場合がある。
【０１２５】
かかる発現操作の主な標的の１つは、リグニンの生合成経路である。上記の理由のため、植物個体のリグニン含量を正負いずれかに調節することに大きな関心が寄せられており、前記経路に影響を与える遺伝子産物の発現を通じて達成できる。例えば、米国特許第５，４５１，５１４号明細書および国際公開第ＷＯ９４／２３０４４号公報に記載されているように、ＣＡＤおよびＣＯＭＴのコピー数を操作すると、リグニン含量が改変される。さらに、ポプラまたはマツのＣＡＤをエンコードする配列のアンチセンス発現は、リグニン組成の改変をもたらす。それぞれ、Ｇｒａｎｄら、Ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌ．）、１６３巻、２３２−３７頁（１９８５年）；Ｂａｕｃｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２巻、１４７９頁（１９９６年）。
【０１２６】
変更が重要であるかもしれない他の性質には糖が含まれる。糖産生を担う酵素のレベルを例えば篩部組織で上昇させると、植物個体内の糖含量が増大する可能性がある。糖産生を増大または減少させる酵素は、β−グルコシダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、６−ホスホフルクト−１−キナーゼ、スクロースシンターゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、スクロース輸送体およびインベルターゼを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
さらなる性質は、植物の葉に存在する殺昆虫性、抗ウィルス性または抗菌性タンパクの増加を含むが、これらに限定されない。かかるタンパクは、セクロピン、チオニン、ディフェンシン、脂質輸送タンパク、ヘベイン様ペプチドおよびＧＡＳＡペプチドを含むが、これらに限定されない。さらに他の性質は、干魃耐性、耐寒性、ペルオキシダーゼ活性、耐塩性および窒素輸送を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
以上概説された本発明は、以下の実施例を参照することにより、一層容易に理解されるであろう。ただし、これらの実施例は例示を目的として提供されるものであって、本発明を限定する意図はない。
【実施例１】
【０１２９】
維管束特異的プロモーターの単離
ラジアータマツおよびユーカリ・グランディスのｃＤＮＡライブラリが以下のとおり構築され、スクリーニングされた。若干改変されたＣｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、１１巻、１１３−１１６頁、（１９９３年）のプロトコルを用いて、植物組織からｍＲＮＡが抽出された。具体的には、試料がＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０Ｍ ＮａＣｌ、２％ＣＴＡＢ、２％ＰＶＰおよび０．０５％スペルミジン＊３ＨＣｌ）に溶解され、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出された。
【０１３０】
ＲＮＡはエタノールで沈殿され、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて精製された。精製されたｍＲＮＡから、逆転写酵素（Ｌｏｏｐｓｔｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７巻、２７７−２９１頁（１９９５年））合成の後、得られたｃＤＮＡクローンをメーカー指定のプロトコルにしたがってＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＬａｍｂｄａ ＺＡＰに挿入して、ｃＤＮＡ発現ライブラリが構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスからの試料ＤＮＡを１μｌ用いて、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングされた。ライブラリの大量切り出しは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'細胞およびＸＬＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と併用して行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で希釈され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）とイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）とを含むＬＢ−カナマイシン寒天プレートにプレーティングされた。
【０１３１】
コロニーを採取し、標準的なミニプレップ手法によりＤＮＡを調製した。正しい導入断片を含むコロニーをカナマイシン含有ＮＺＹブロス中で培養し、ｃＤＮＡをアルカリ法とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法とにより精製した。１％アガロースゲルを用い、シーケンシングテンプレートへの染色体の混入の有無をスクリーニングした。Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用い、メーカー指定のプロトコルにしたがってダイターミネーター化学反応を準備した。
【０１３２】
陽性クローンのＤＮＡ配列は、３７００ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはＰｒｉｓｍ３７７シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部門）を用いて得た。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によっては３'末端側からも配列決定した。一部のクローンについては、サブクローニングされた断片を用いて内部配列を得た。サブクローニングは、制限マッピングおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ベクターへのサブクローニングという標準的な手順にしたがって行った。
【０１３３】
選択された遺伝子と相同な植物ＥＳＴを、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）またはユーカリ・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）のｃＤＮＡ発現ライブラリのいずれかから同定し、表２に示した。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、他のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列とアライメントをとることができ、同一の配列を共有する割合は公的に利用可能なコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むアルゴリズムのファミリー、ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの文献「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年に記載されている。本発明のポリヌクレオチド変異体の決定には、上記アルゴリズムの添付書類に記載されたデフォルトパラメータに設定されているＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を用いることが好ましい。
【０１３６】
ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴＲＥＭＢＬＥ配列（２００２年７月９日版）を使用し、２００２年１１月１５日にＢＬＡＳＴＸサーチを実施した。 ＢＬＡＳＴＸを用い、Ｅ値とポリペプチド配列の一致度とに寄与するアライメントと同一性とを決定するには、下記のランニングパラメータが好ましい。ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐ ｂｌａｓｔｘ −ｄ ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ −ｅ１０ −Ｇ０ −Ｅ０ −ＦＦ −ｖ３０ −ｂ ３０ −ｉｑｕｅｒｙｓｅｑ −ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ。また、パラメーターは以下のとおりである。−ｐ プログラム名［文字列］；−ｄ データベース［文字列］；−ｅ 期待値（Ｅ）［実数］；−Ｇ ギャップを空けるためのコスト（ゼロはデフォルト挙動）［整数］；−Ｅ ギャップを拡張するためのコスト（ゼロはデフォルト挙動）［整数］；−Ｆ フィルタークェリー配列［文字列］；−ｖ １行説明の数（ｖ）［整数］；−ｂ 表示するアライメントの数（ｂ）［整数］；−Ｉ クェリーファイル［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］；−ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］オプション。
【０１３７】
プロモーターは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いてクローニングした。これはＰＣＲ法にもとづく方法であり、４本のプライマーを作成することが必要で、その中の２本は遺伝子特異的でなければならない。この遺伝子特異的プライマーは通常、その遺伝子の５’ＵＴＲ内に設計される。断片が増幅され、ＧＵＳレポーター遺伝子の手前のＴ終端ベクター内にクローニングされる。
【実施例２】
【０１３８】
プロモーターの組織特異性の決定方法
実施例１で概説した手順によりプロモーターの同定およびクローニングが終了した後、プロモーターがレポーター遺伝子と操作可能に連結され、プロモーターが活性を示す組織の種類が決定される。このために、エレクトロポレーション法により、本発明のプロモーターを含むコンストラクトがアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換される。簡単に述べると、４０μｌの希釈ＡｇＬ−１コンピテント細胞を氷上に置き、当該プロモーター配列を含むｐＡＲＴ２７ベクター約１０ｎｇと接触させた。エレクトロポレーション法は、下記のパラメーターの設定下で行った。
抵抗＝１２９Ω
印加電圧＝１．４４ｋＶ
電界強度＝１４．４ｋＶ／ｃｍ
パルス持続時間＝５．０ｍｓ
【０１３９】
エレクトロポレーション終了後、４００μｌのＹＥＰ液体培地を添加し、細胞を１時間、室温にて回復させる。次に、細胞を６０００ｒｐｍ、３分間遠心し、約５０μｌのＹＥＰに再懸濁する。細胞試料をＹＥＰ Ｋａｎ５０／Ｒｉｆ５０プレート上にスプレッドし、パラフィルムで密閉し、２９°Ｃで２日間インキュベーションしコロニーを成長させる。
【０１４０】
次に、関心のあるコンストラクトを含むアグロバクテリウムを用い、フローラルディップ浸潤法（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により野生型シロイヌナズナ「コロンビア−０」株の植物個体を形質転換する。簡潔には、アグロバクテリウム培養を２０°Ｃにて約８６００ｒｃｆで１０分間遠心し、光学濃度が約０．７〜０．８となるように再懸濁する。アグロバクテリウムを含む浸潤液に植物個体を５秒間浸漬する。植物個体から余分な液を水切りし、大気条件で生育光下に置く。２４時間後、植物個体を噴霧し、種子を産生できる状態に維持する。Ｔ１種子の表面を市販の５％漂白液で滅菌し、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）とチメンチン（２５０ｍｇ／ｌ）とを含むＭＳ培地上にスプレッドし、推定される形質転換体を選別する。
【０１４１】
アグロバクテリウムを介した葉組織形質転換により、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物個体を、関心のあるコンストラクトを用いて形質転換する（Ｂｕｒｏｗら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、８巻、１２４−１３９頁、１９９０年）。
【０１４２】
形質転換に成功した植物個体は、操作可能に連結されたレポーター遺伝子が発現しているか否か分析される。葉、茎、根および花の各部分を染色液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ Ｘ−グルクロニド、シクロヘキシミド塩（Ｄｕｃｈｅｆｆａ））に浸漬される。５分間の真空吸引を２回行うことによって組織に染色液を浸透させる。前記組織は３７°Ｃで終夜振盪され、呈色させる。前記組織は、組織の呈色を確認するために途中で３回または４回確認され、試料が早期に呈色する場合には、組織の一片が７０％エタノール中で脱染される。次に、光学顕微鏡を用いてＧＵＳの発現について調べるためにこの組織の写真が撮影される。
【実施例３】
【０１４３】
導管要素（ＴＥ）誘導性培地（ＦＫＨ）および非誘導性培地（ＦＫ）中における百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）葉肉細胞の単離および培養
百日草の実生の初生葉および第二葉のペアが８パネットから採集された。葉は０．１７５％次亜塩素酸ナトリウム溶液５００ｍｌ中で１０秒間滅菌された。次に、葉は５００ｍｌの滅菌水中で２回リンスされた。１回当たり２０〜３０枚の葉を用いて、乳鉢および乳棒で２５〜３０ｍｌのＦＫ培地中で粉砕された。細胞が４０μｍのナイロンメッシュで濾過され、このやり方で合計９０ｍｌの葉肉細胞が得られた。前記細胞は２０°Ｃで２００×ｇ、２分間遠心され、生成したペレットは、再度等量のＦＫ培地を用いて洗浄された。２回目の洗浄が終了した後、ペレットは２等分され、一方の半分は４５ｍｌのＦＫ培地で洗浄され、他方の半分は４５ｍｌのＦＫＨ培地で洗浄された。各ペレットは６０ｍｌのＦＫ培地およびＦＫＨ培地にそれぞれ再懸濁された。これらは暗所にて、１２０ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上の２枚の６ウェルプレートで培養された。
【実施例４】
【０１４４】
ＦＫ培地およびＦＫＨ培地中で終夜ないし３日間培養した葉または葉肉細胞からの百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）プロトプラストの単離
滅菌した百日草の初生葉（６〜８枚）は１ｍｍの細片状に切断され、１５ｍｌの細胞壁消化酵素混合液（１％セルラーゼ オノヅカＲ−１０および０．２％ペクトリアーゼ Ｙ２３を含むプロトプラスト単離緩衝液）中に添加された。ＦＫ培地（４０ｍｌ）またはＦＫＨ培地（４０ｍｌ）中で培養された葉肉細胞は、２０°Ｃにて２００×ｇ、２分間遠心してペレット化された。各ペレットは、２００ｍｇのセルラーゼ オノヅカＲ−１０と４０ｍｇのペクトリアーゼＹ２３とを含む滅菌プロトプラスト単離緩衝液２０ｍｌ中に再懸濁された。前記プロトプラストは、前記細胞懸濁液を約７０ｒｐｍ２３°Ｃに設定されたロータリーシェーカー上のＣｅｌｌＳｔａｒ培養プレートで２〜４時間インキュベーションすることによって、単離された。前記プロトプラストは、各内容物を２００×ｇ、２分間遠心してペレット化された。各ぺレットは２０ｍｌの２４％ショ糖溶液中に再懸濁された。
【０１４５】
Ｆｕｋｕｄａ−Ｋｏｍａｍｉｎｅ培地保存液
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
【表４】
【実施例５】
【０１４８】
百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）プロトプラストのトランスフェクション
２４％ショ糖溶液中に懸濁させた百日草プロトプラスト上に１ｍｌのＷ５溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ＫＣ１、５ｍＭ ショ糖、ｐＨ５．６−６）を重層し、２０°Ｃにて７０×ｇ、１０分間の遠心を行い、ブレーキをかけずに停止させた。浮遊するプロトプラストを回収し、Ｗ５溶液１０ｍｌ中に再懸濁させ、２０°Ｃにて７０×ｇ、１０分間の遠心を行い、ペレット化した。プロトプラストのペレットはプロトプラスト濃度が約５×１０６個／ｍｌとなるようにＭａＭｇ培地（４５０ｍＭマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）中に再懸濁され、一定量ずつ別々の１５ｍｌ試験管に分注された（３００μｌ：プロトプラスト１．５×１０６個）。各コンストラクトにつき、上記プロトプラスト懸濁液に５μｇのＤＮＡおよび５０μｇのサケ精巣ＤＮＡが添加、混合され、２０°Ｃで５分間インキューベートされた。３００μｌの４０％ＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ３３４０、１００ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．４５Ｍマンニトール、ｐＨ９．０）が各分注プロトプラストに添加され、２０°Ｃで２０分間インキュベーションされた。５ｍｌのＫ３／０．４Ｍショ糖（溶液１Ｌ当たり：４．３ｇムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩、１００ｍｇミオイノシトール、２５０ｍｇキシロース、１０ｍｇチアミン塩酸塩、１ｍｇニコチン酸、１ｍｇピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ ＮＡＡ、０．２ｍｇカイネチン、１３７ｇショ糖、ｐＨ５．６（ＫＯＨで調整））が、葉由来のトランスフェクションされたプロトプラスト、またはＦＫ培地中で培養した葉肉細胞由来のトランスフェクションされたプロトプラストの各分注に添加、混合された。同様に、５ｍｌのＫ３／０．４Ｍショ糖＋０．ｌｐｐｍ ＮＡＡ＋０．２ｐｐｍ ＢＡが、ＦＫＨ培地で培養された葉肉細胞由来のトランスフェクションされた細胞の各分注に添加、混合された。これらトランスフェクションされたプロトプラスト懸濁液は、暗所で２３°Ｃで終夜インキュベーションされた。
【実施例６】
【０１４９】
トランスフェクション百日草（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）プロトプラストの回収およびレポーター遺伝子解析
トランスフェクションされた百日草プロトプラストを個々に回収するため、実施例５で説明したとおり調製された懸濁液にそれぞれ９．５ｍｌのＷ５溶液が添加され、各試験管の内容物が混合され、２０°Ｃにて７０×ｇ、１０分間遠心された。上清の大部分がデカンテーションにより捨てられ、プロトプラストの体積が９００μｌとされた。９００μｌの各試料のうち、３００μｌのプロトプラストが５ｍｌポリスチレン丸底試験管に分注され、５００μｌのＷ５培地中に再懸濁され、蛍光レポータ遺伝子発現および細胞生存度の分析用に取り置かれた。残り６００μｌのプロトプラストおよび溶液は個々のマイクロチューブに移されて、２０°Ｃにて４２０×ｇ、２分間の遠心によってペレット化された。このプロトプラストペレットは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．、１９８７年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５，３８７頁に記載される方法にしたがって、ＧＵＳレポーター遺伝子発現について検定された。ＧＵＳ（ＭＵＧ）の検定は、Ｗａｌｌａｃ社（テュルク、フィンランド）のＶｉｃｔｏｒ２１４２０マルチラベルカウンターを用いて行われた。ウンベリフェロンは３５５ｎｍ励起光フィルターおよび４６０ｎｍ発光フィルターを用いて１秒間検出された。
【実施例７】
【０１５０】
植物個体内における発現データ
土壌移植３週間後に、形質転換シロイヌナズナおよびタバコ組織はＧＵＳレポーター遺伝子発現について解析される。ＧＵＳ発現を検定するために、実施例２で説明したとおり、葉、根および花の材料がＧＵＳ溶液に浸漬される。組織に染色液を浸透させるために５分間の真空吸引を２回行い、前記組織は発色のため３７°Ｃで終夜インキュベーションされる。終夜のインキュベーションの後、前記組織試料は７０％エタノール中で脱染され、光学顕微鏡下でＧＵＳ発現について検査される。表５は、形質転換されたシロイヌナズナおよびタバコのＧＵＳ発現率（％）を含む。
【０１５１】
土壌移植３ヶ月後のタバコのＴ１植物に由来する組織がパラプラストに包埋され、ミクロトームで切片が作成され、光学顕微鏡下でＧＵＳ発現が検査される。表５に示したＧＵＳの局在と組織鏡検結果（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ ｒｅｓｕｌｔｓ）は、本願明細書に開示された単離ヌクレオチド配列が、維管束の形成層、木部および／または篩部組織に優先的なレポーター遺伝子発現を可能にすることを証明する。
【０１５２】
【表５】
【０１５３】
タバコ組織の試料は、固定液（１００％エタノール、氷酢酸、３７％ホルムアルデヒド、ミリＱ水）を含むバイアルに入れられ、１５分間の真空吸引が２回行われる。前記試料は、確実に組織に浸透させるために固定液中で２時間インキュベーションされる。組織浸透の後、再び１５分間の真空吸引を行い、前記組織は４°Ｃで終夜放置した。
【０１５４】
組織試料は、終夜のインキュベーションの後、エタノール系列のインキュベーションにより脱水されるが、ここでのすべてのインキュベーションは室温で行われる。前記終夜固定された固定液は組織試料を入れたバイアルから除去され、５０％エタノールに置換される。３０分後、前記５０％エタノールはデカンテーションにより除去され、前記組織は５０％エタノールの新しい分注液でインキュベーションされる。５０％エタノールで３０分間経過後、前記溶液は除去されて６０％エタノールに置換される。３０分間のインキュベーション後、６０％エタノールは７０％エタノールに置換される。３０分後にこの７０％エタノールはデカンテーションにより除去され、８５％エタノールで置換される。３０分後、前記８５％エタノールは除去され、前記試料は９５％エタノール中で終夜インキュベーションされる。
【０１５５】
組織の脱水の後、該組織は室温でキシレン溶液系列中でインキュベーションされる。前記終夜処理された９５％エタノールが除去され、上記組織は１００％エタノール中で３０分間インキュベーションされる。３０分後、１００％エタノールが除去され、前記組織は２５％キシレン：７５％エタノール中に懸濁される。３０分間のインキュベーション後、前記溶液は５０％キシレン：５０％エタノールに置換される。次に、前記溶液はデカンテーションにより除去され、７５％キシレン：２５％エタノールに置換される。３０分後、前記組織は１００％キシレンで６０分のインキュベーションを３回される。次に前記組織は、キシレンと２０個のパラプラストチップとを入れたバイアル中で、終夜インキュベーションされる。
【０１５６】
パラフィンを浸潤させるため、前記バイアルは、前記パラプラストチップが溶解するまで４２°Ｃのハイブリダイゼーションオーブンで保温される。８時間の間に、合計６０〜８０個のパラフィンチップがバイアルに添加され、溶解される。前記試料は６２°Ｃのハイブリダイゼーションオーブンで終夜保温される。次の２日間にわたり、パラプラストは１２時間間隔で４回交換される。前記組織を包埋するために、流動パラフィンがカセット内に注入され、組織を適当な向きに配置される。前記カセットは４°Ｃで終夜静置され、パラフィンが硬化される。
【０１５７】
表５に示すとおり、本願明細書に開示される単離ヌクレオチド配列は、維管束の形成層、木部、および／または篩部組織で優先的なＧＵＳレポーター遺伝子発現を可能にする。特に注目すべきは、配列番号２１と配列番号１３とが、配列番号１３の５’末端に４０ｂｐの断片（ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＴＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＴＡＴＴＣＧＣＣ）の挿入を含むことを除いて、実質的な配列相同性を有する点である。この４０ｂｐ断片（配列番号８５）は、配列番号１３では不完全な反復配列として存在するが、配列番号２１には存在しない。興味深いことに、前記４０ｂｐ断片が存在すると（例えば、配列番号１３）ＧＵＳ発現が可能になり、前記断片が存在しないと（例えば、配列番号２１）ＧＵＳ発現は起こらない。このデータは、本願明細書に開示される４０ｂｐ断片（配列番号８５）が維管束優先発現的な遺伝子発現に必要十分な要素を構成する可能性があることを示唆するため、意義深い。
【実施例８】
【０１５８】
維管束特異的プロモーターの利用方法
適当な組織特異的かつ発生段階特異的な発現パターンを有するプロモーターがいったん見つかると、このプロモーターは、トランスジェニック植物で所望の形質を調節するために利用可能である。１つの実施態様では、木部特異的プロモーターが植物のリグニン組成と含量とを調節するために利用される。本実施例では、本発明の木部特異的プロモーターがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）のコーディング領域の一部に対応するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子をエンコードする遺伝子と操作可能に連結される。ＣＡＤは、リグニンモノマー合成の最終段階を触媒し、他のプロモーターを用いてアンチセンス配列を介した植物個体内のリグニンの下向き調節に成功した標的である。Ｙａｈｉａｏｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２９５−３０６頁（１９９８年）と、これに引用されている各文献を参照せよ。ＣＡＤの一部に対応するＲＮＡｉ分子が発現すると、酵素活性が低下し、これに対応してトランスジェニック植物個体内のリグニンのシンナミルアルデヒドの割合が増大する。トランスジェニック植物個体におけるＣＡＤ活性は、Ｂａｕｃｈｅｒら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２巻、１４７９−９０頁（１９９６年））によって改良された、Ｗｙｒａｍｂｉｋら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻、９−１５頁（１９７５年））の方法によって分析された。リグニン含量および組成は、Ｂａｕｃｈｅｒ（１９９６年）の方法によって測定された。ＣＡＤの下向き調節は、木材の色の変化と、抽出がより容易なシンナミルアルデヒドの割合の増大につながり、このことはパルプ産業用の植物にとって商業上重要である。例えば、ＣＡＤ活性を低減させたポプラは赤みを帯び、リグニンがより抽出しやすく、製紙産業の用途でのポプラ材の特性が改善される（Ｂａｕｃｈｅｒら（１９９６年））を参照せよ。
【０１５９】
別の実施例では、ユーカリおよびマツが形質転換される。ユーカリおよびマツは、リグニン含量が多いため、リグニン含量および組成に対する遺伝子調節の効果を研究するための有用なモデル系を提供する。さらに、ユーカリおよびマツは、リグニン含量または組成のモジュレーションが製紙または木材産業にとって有用な特性を与えるような植物の代表例である。
【０１６０】
これらのトランスジェニック植物を作出するために、ＣＡＤのｃＤＮＡの断片が、本発明の木部特異的プロモーターと、ノパリンシンターゼ３’ターミネーターとに適当な配向で操作可能に連結される。前記ＣＡＤのｃＤＮＡは、例えば、遺伝子配列をそのプロモーターに対して反転させることにより調製できる。植物細胞内における前記ＣＡＤのｃＤＮＡの転写は、ＣＡＤ遺伝子に対して「アンチセンス」な細胞内ＲＮＡ転写産物を生成する。コンストラクト全体が、制限断片としてバイナリーベクターｐＢＩ１０１．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、パロアルト）に挿入される。ベクターは、ユーカリまたはマツの形質転換を行うために、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の菌株ＬＢＡ４４０４またはＣ５８ｐＭＰ９０にエレクトロポレーション法により導入される。一般的にはＮｏら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、 １６０巻、７７−８６頁（２０００年）を参照せよ。カナマイシン耐性形質転換体は、ＣＡＤ活性について測定され、導入遺伝子のコピー数がサザン解析により決定され、ＣＡＤのｍＲＮＡ発現がＹａｈｉａｏｕｉ（１９９８年）に説明されるとおりに決定される。好適な形質転換体は発根させて、温室に移植される。
【実施例９】
【０１６１】
インシリコ発現
コンピュータによる遺伝子発現は、コンセンシ（ｃｏｎｓｅｎｓｉ）ＥＳＴライブラリのメンバー資格を決定するために利用できる。各ライブラリについて、いずれかの組織クラスのＥＳＴの数をそのクラスのＥＳＴの総数で割った商に１０００を乗じ、コンセンサスが決定される。これらの値は、あるライブラリからの配列決定の程度に影響されない規格化値である。形成層、木部、篩部、栄養芽、根、生殖組織、葉、茎および果実のライブラリを含む複数のライブラリが、コンセンサス値についてサンプル調査された。下記の表６および表７に示すとおり、多数の本発明のプロモーター配列が維管束優先的発現を示し、樹木関連の発生過程に関与する可能性がある。
【０１６２】
【表６】
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】３種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【図２Ａ】２種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【図２Ｂ】２種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【図３】２種類のプロモーターが培養３日目に同様の発現プロファイルを示すことを証明する百日草ＴＥ検定結果を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
維管束優先的なポリヌクレオチド転写を可能にするポリヌクレオチドを含む、単離核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドは配列番号１−８５のいずれかと、その機能変異体とから選択される、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記機能変異体は、配列番号１−８５の配列のいずれかとの同一性が、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上である、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
（ａ）請求項２に記載の配列のいずれかに対して相補的な配列と、
（ｂ）請求項２に記載の配列のいずれかに対する逆相補体の配列と、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのいずれかと雑種形成する、少なくとも２０個の連続する塩基を含む配列とから選択される配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは植物細胞内で木部優先的な遺伝子発現を可能にする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドは操作可能に連結した遺伝子の植物細胞内での発現を上向き調節または下向き調節することができる、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とは操作可能に連結されている、植物細胞。
【請求項８】
前記所望の遺伝子はポリペプチドまたはタンパクをエンコードする、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項９】
前記タンパクは細胞壁の生合成に関与する酵素である、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項１０】
前記タンパクはリグニンの生合成に関与する酵素である、請求項８に記載の植物細胞。
【請求項１１】
前記所望の遺伝子はＲＮＡ転写産物を生成する、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞に内在する遺伝子のアンチセンス配列を有する、請求項１１に記載の植物細胞。
【請求項１３】
前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞で正常に発現される遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導する、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１４】
請求項７に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１５】
前記植物は被子植物および裸子植物から選択される、請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の植物を栽培することを含む、植物のリグニン含量を調節する方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の植物を栽培することを含む、植物の細胞壁の形成を調節する方法。
【請求項１８】
配列番号１−８５のいずれかと、その機能変異体とから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物。
【請求項１９】
（ａ）木本植物の植物細胞に、（ｉ）配列番号１−８５のいずれかまたはその機能変異体の配列を有するプロモーターと、（ｉｉ）所望の核酸とを含み、前記プロモーターは前記所望の核酸の発現を調節するＤＮＡコンストラクトを導入すること、（ｂ）形質転換された前記植物細胞を植物の生育を促進する条件下で培養すること、および、（ｃ）前記植物から木材を得ることを含む、木材を得る方法。
【請求項２０】
前記木本植物は、ユーカリ属またはマツ属の植物種から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
維管束優先的なポリヌクレオチド転写を可能にするポリヌクレオチドを含む、単離核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドは配列番号１−８５のいずれかと、その機能変異体とから選択される、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記機能変異体は、配列番号１−８５の配列のいずれかとの同一性が、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上である、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
（ａ）請求項２に記載の配列のいずれかに対して相補的な配列と、
（ｂ）請求項２に記載の配列のいずれかに対する逆相補体の配列と、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのいずれかと雑種形成する、少なくとも２０個の連続する塩基を含む配列とから選択される配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは植物細胞内で木部優先的な遺伝子発現を可能にする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドは操作可能に連結した遺伝子の植物細胞内での発現を上向き調節または下向き調節することができる、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
（ａ）配列番号１−８５のいずれかの配列を有する少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）所望の遺伝子とを含み、前記ポリヌクレオチドと前記所望の遺伝子とは操作可能に連結されている、植物細胞。
【請求項８】
前記所望の遺伝子はポリペプチドまたはタンパクをエンコードする、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項９】
前記タンパクは細胞壁の生合成に関与する酵素である、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項１０】
前記タンパクはリグニンの生合成に関与する酵素である、請求項８に記載の植物細胞。
【請求項１１】
前記所望の遺伝子はＲＮＡ転写産物を生成する、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞に内在する遺伝子のアンチセンス配列を有する、請求項１１に記載の植物細胞。
【請求項１３】
前記ＲＮＡ転写産物は植物細胞で正常に発現される遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導する、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１４】
請求項７に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１５】
前記植物は被子植物および裸子植物から選択される、請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の植物を栽培することを含む、植物のリグニン含量を調節する方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の植物を栽培することを含む、植物の細胞壁の形成を調節する方法。
【請求項１８】
配列番号１−８５のいずれかと、その機能変異体とから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物。
【請求項１９】
（ａ）木本植物の植物細胞に、（ｉ）配列番号１−８５のいずれかまたはその機能変異体の配列を有するプロモーターと、（ｉｉ）所望の核酸とを含み、前記プロモーターは前記所望の核酸の発現を調節するＤＮＡコンストラクトを導入すること、（ｂ）形質転換された前記植物細胞を植物の生育を促進する条件下で培養すること、および、（ｃ）前記植物から木材を得ることを含む、木材を得る方法。
【請求項２０】
前記木本植物は、ユーカリ属またはマツ属の植物種から選択される、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５１５５０９（Ｐ２００６−５１５５０９Ａ）
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５５６１４（Ｐ２００４−５５５６１４）
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７４１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８５９５
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１８６６０３）アーバーゲン エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７４１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８５９５
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１８６６０３）アーバーゲン エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]