緑のコーヒー粒中のコーヒーフレーバー前駆体レベルの調節
本発明は、システインプロテイナーゼ；システインプロテイナーゼインヒビター；及びアスパラギン酸エンドプロテイナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、形質転換された宿主細胞（特に植物細胞）に関し、この細胞中、これらのポリヌクレオチドの過剰発現又は過少発現は、緑のコーヒー粒中のコーヒーフレーバー前駆体レベル、特に、アミノ基含有分子（例えば、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質）のレベルの変更を生じる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
コーヒーは、フレーバー分子の高度に複雑な混合物を含む。インスタント及び新鮮な粉砕されたコーヒー飲料の組成についての広範な研究は、今日までに８５０を超える化合物を同定しており、これらのうち多くがフレーバー活性分子である（Ｆｌａｍｅｎｔ，Ｉ（２００２）、コーヒーフレーバー化学（Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＵＫ）。しかし、１杯のコーヒー中に見出される最終コーヒーフレーバー分子は、原材料（植物種Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ又はＣｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（ｒｏｂｕｓｔａ）の緑の粒（緑の豆））中にはほとんど存在しない。実際、コーヒーフレーバー化合物の大多数は、熟した赤いコーヒーチェリーの収穫から最終的な焙煎され粉砕されたコーヒー製品又はその抽出物（例えば、可溶性コーヒー製品）までに生じる複数の加工ステップの１つ又は複数の間に生成される。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーの生産における種々のステップが、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｗ．、コーヒー；第１巻：化学（Ｃｏｆｆｅｅ；Ｖｏｌｕｍｅ １：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１−４１頁、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ｊ．及びＭａｃｒｅａ，Ｒ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｃｌａｒｋｅ，Ｒ．Ｊ．、コーヒー：植物学、生化学並びに豆及び飲料の生産（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅａｎｓ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ）、２３０−２５０頁及び３７５−３９３頁；並びにＣｌｉｆｆｏｒｄ，Ｍ．Ｎ．及びＷｉｌｌｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．編、Ｃｒｏｏｍ Ｈｅｌｍ Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ中に記載されている。簡潔に述べると、このプロセスは、成熟して熟した赤いチェリーの収集で開始される。次いで、最も外側の層（すなわち果皮）が、乾式プロセス又は湿式プロセスのいずれかを使用して除去できる。乾式プロセスは最も単純であり、以下を含む：１）チェリーの等級分け（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び洗浄；２）等級付け（ｇｒａｄｉｎｇ）後のチェリーの乾燥（空気乾燥又は機械的乾燥のいずれか）、及び３）乾燥した果皮を除去するための乾燥したチェリーの脱穀（ｄｅｈｕｓｋｉｎｇ）。湿式プロセスは僅かにより複雑であり、より高い品質の緑の豆の生産を一般に導く。湿式プロセスは、Ｃ．ａｒａｂｉｃａチェリーとより頻繁に関連する。湿式プロセスは以下からなる：１）チェリーの等級分け、２）チェリーの脱肉（パルピング）（このステップは、収穫直後に実施され、一般に、成熟チェリーの「パルプ」すなわち果皮の機械的除去を含む）、３）脱肉後にチェリーの粒に付着したままの粘液が、バッチプロセスを使用して粒＋付着した粘液をタンク中で水と共にインキュベートさせることによって除去される、「発酵」。この「発酵」プロセスは８０時間まで継続されるが、発酵、４）乾燥（このステップは、発酵したコーヒー粒の空気乾燥又は機械的な熱気乾燥のいずれかを含む）及び５）「ハリング（ｈｕｌｌｉｎｇ）」（このステップは、乾燥したコーヒー粒（乾燥したパーチメントコーヒー）の「パーチ（ｐａｒｃｈ）」の機械的除去を含み、シルバースキン（銀皮）もまたしばしばこの段階で除去される）の間に増殖する微生物の種々の酵素活性及び代謝作用に起因して、しばしば２４時間が、受容可能な発酵を可能にしかつ約６．８〜６．９から４．２〜４．６までｐＨを低下させるのに一般に充分である。湿式加工又は乾式加工の後に、得られた緑のコーヒー粒はしばしば分類され、ほとんどの分類手順は、粒のサイズ及び／又は形状に基づく。
【０００３】
コーヒー加工における次のステップは、乾式加工したコーヒー又は湿式加工したコーヒーそれぞれの、脱穀（ｄｅｈｕｓｋｉｎｇ）又は脱穀（ｄｅｈｕｌｌｉｎｇ）後の緑の粒の焙煎である。これは、豆における有意な化学変化を誘導する時間依存的なプロセスである。焙煎の第１段階は、供給された熱が粒中に残留する水を追い出す場合に生じる。水の大部分がなくなると、温度が１９０℃〜２００℃まで上昇して、適切な焙煎が開始される。豆の発色によって通常モニタリングされる焙煎の程度は、最終飲料製品のフレーバー特徴を決定するのに主要な役割を果たす。従って、焙煎の時間及び温度は、所望のコーヒーフレーバープロフィールを達成するために厳密に制御される。焙煎後、コーヒーは、コーヒー飲料又はコーヒー抽出物（後者は、インスタントコーヒー製品を製造するために使用される）の生産の間の抽出を容易にするために粉砕される。再度、粉砕のタイプは、飲料の最終的なフレーバーに影響を与え得る。
【０００４】
かなりの量の研究がコーヒー中のフレーバー分子の同定について実施されているが、加工ステップの各々の間にコーヒー粒内で生じる物理反応及び化学反応に関して実施された研究はかなり少ない。この後者の点は焙煎反応について特に明白であり、多数の粒の成分が、熱により誘導される反応の非常に複雑な連続を経る（Ｈｏｍｍａ，Ｓ．２００１、「コーヒー：新事情（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」．Ｒ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ及びＯ．Ｇ．Ｖｉｔｚｔｈｕｍ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｙｅｒｅｔｚｉａｎ，Ｃ．ら（（２００２）Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２１４、９２−１０４；Ｆｌａｍｅｎｔ，Ｉ（２００２）、コーヒーフレーバー化学（Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＵＫ；Ｒｅｉｎｅｃｃｉｕｓ，Ｇ．Ａ．、「メイラード反応及びコーヒーフレーバー（Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ）」Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＡＳＩＣ、１６ｔｈ Ｃｏｌｌｏｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ １９９５）。
【０００５】
コーヒー加工の異なるステップの間に生じる反応のほとんどの詳細は比較的不明のままであるが、コーヒーの芳香に関連するフレーバーの多数を担う重要なフレーバー生成反応は、コーヒー焙煎の間の「メイラード」反応であると考えられている。活発なメイラード反応は、焙煎ステップの間に、粒の還元糖／多糖分解産物とアミノ基含有分子（特に、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸）との間で生じる。
【０００６】
メイラード反応は、コーヒー焙煎の間のコーヒーのフレーバー分子及び芳香分子の生成に重要な貢献を明らかに果しているので、緑の豆中の１次メイラード反応のレベルと焙煎後に発生したフレーバー／芳香の品質との間には関連性がある可能性がある。
【０００７】
上記のように、メイラード反応における基質の重要な群は、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質である。２次元電気泳動を使用して、ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの緑のコーヒー豆中の主要な貯蔵タンパク質のレベル及び量に差異が存在することが示されている。しかし、これらの保存タンパク質の差異とフレーバーの品質との間の関連性は注目されていない（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３７巻、２６１−２７２）。未熟なコーヒー豆と成熟したコーヒー豆（これらは異なるフレーバー品質を有する）との間には貯蔵タンパク質に小さい差異が存在することもまた、最近見出された（Ｍｏｎｔａｖｏｎ，Ｐ．ら、２００３、Ｊ．Ａｇｒｉｃ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第５１巻、２３２８−２３３４）。種子の成熟の間には多数の変化が生じるので、この後者の研究は、成熟によって引き起こされる品質の改善と主要なコーヒーの貯蔵タンパク質の２次元ゲルパターンにおいて見られる差異との間に関連性が存在し得ることを示唆している。
【０００８】
ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの緑の豆から単離されたペプチドのプロフィールにおいて差異が存在することが最近示された（Ｌｕｄｗｉｇら、２０００、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第２１１巻、１１１−１１６）。これらの結果は、ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａのペプチド抽出物がその芳香前駆体プロフィールにおいて異なることを示しているが、この報告中に示されるデータは、抽出物中のどの成分がこれらの芳香プロフィールの差異を担うかを同定していない。これらの研究者はまた、緑のコーヒーの粗製抽出物中に少なくとも２つの異なるプロテイナーゼ活性を検出したが、彼らは、いずれの比活性をも芳香／フレーバーの品質と相関させなかった（Ｌｕｄｗｉｇら、２０００、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第２１１巻、１１１−１１６）。最後に、緑のコーヒー粒の焙煎の後期段階の間に使用される非常に高い温度は、このコーヒー粒中に存在するタンパク質の引き続く切断を引き起こすとも考えられている（Ｈｏｍｍａ，Ｓ．２００１、「コーヒー：新事情（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」．Ｒ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ及びＯ．Ｇ．Ｖｉｔｚｔｈｕｍ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｏｎｔａｖｏｎ，Ｐ．ら、２００３、「焙煎の間の緑のコーヒーのタンパク質プロフィールの変化（Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｃｏｆｆｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｏａｓｔｉｎｇ）」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５１、２３３５−２３４３）。しかし、このタンパク質分解についての全体的スキームは非常に不十分にしか理解されていないが、これはとりわけ、焙煎の開始前の原材料中の主要なコーヒータンパク質の正確な状態におそらく依存する。本発明者らが知る限り、コーヒー中のペプチドプロフィールがコーヒーの芳香／フレーバーの生成に関与する可能性を扱っている他の有意な報告は存在しない。
【０００９】
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（カカオ豆）の発酵した種子の焙煎において、メイラード反応の芳香／フレーバーの発生には、種子のアミノ酸及びペプチドが関与するようである。他の種子と比較すると、Ｔ．ｃａｃａｏの種子は、異常に高いレベルのアスパラギン酸プロテイナーゼ活性を有することが示されている（Ｂｉｅｈｌ，Ｂ．、Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．、Ｖｏｉｇｔ，Ｇ．、Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ，Ｈ．、Ｓｅｎｙｕｋ，Ｖ．及びＢｙｔｏｆ，Ｇ．（１９９４）「生のカカオ豆における芳香前駆体であるオリゴペプチド及びアミノ酸のｐＨ依存的な酵素的形成（ｐＨ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｔｈｅ ａｒｏｍａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｉｎ ｒａｗ ｃｏｃｏａ ｂｅａｎｓ）」．Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｃｏａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９３年７月１８日〜２４日、Ｙａｍｏｕｓｓｏｕｋｒｏ、Ｉｖｏｒｙ Ｃｏａｓｔ）。高レベルのココアフレーバー前駆体を有するカカオ豆を生産するために、天然の発酵ステップを実施することが必要である（未発酵の豆は、焙煎したときにほとんどフレーバーを発生させない）。この発酵ステップの間に、パルプ中の糖が発酵し、高レベルの酸（特に酢酸）を生成する（Ｃａｒｒ，Ｊ．Ｇ．（１９８２）ココア−発酵食品−経済学的微生物学（Ｃｏｃｏａ．Ｉｎ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ Ｆｏｏｄｓ．Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．）第７巻．２７５−２９２頁．（Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ編）．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。発酵が継続するにつれて種子中のｐＨは低下し、細胞構造が破壊される。低いｐＨは、豊富なカカオ種子のアスパラギン酸プロテイナーゼを起動及び／又は活性化させ、細胞性タンパク質の大量分解を生じる（Ｂｉｅｈｌ，Ｂ．、Ｐａｓｓｅｒｎ，Ｄ．及びＳａｇｅｍａｎｎ，Ｗ．（１９８２）「カカオ豆子葉の細胞内構造に対する酢酸の影響（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｃｏａ Ｂｅａｎ Ｃｏｔｙｌｙｄｏｎｓ）」．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．３３、１１０１−１１０９；Ｂｉｅｈｌ，Ｂ．、Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｅ．、Ｐａｓｓｅｒｎ，Ｄ．、Ｑｕｅｓｎｅｌ，Ｖ．Ｃ．及びＡｄｏｍａｋｏ，Ｄ．（１９８５）「カカオ豆の発酵における酸性化、タンパク質分解及びフレーバー潜在能力（Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｕｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｃｏｃｏａ ｂｅａｎｓ）」．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．３６、５８３−５９８）。ペプチド及びアミノ酸は、ココアフレーバー前駆体であることが示されている（Ｒｏｈａｎ，Ｔ．（１９６４）「チョコレート芳香の前駆体：発酵したカカオ豆及び未発酵のカカオ豆の比較研究（Ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｒｏｍａ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｃｏｃｏａ ｂｅａｎｓ）」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．、２９、４５６−４５９；Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．及びＢｉｅｈｌ，Ｂ．（１９９５）「ココア特異的芳香成分の前駆体は、タンパク質分解加工によってココア種子のビシリンクラス（７Ｓ）グロブリンから誘導される（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｏｍａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｃｉｌｉｎ−ｃｌａｓｓ（７Ｓ）ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｂｏｔ．Ａｃｔａ １０８、２８３−２８９）。従って、Ｔ．ｃａｃａｏ種子のアスパラギン酸プロテイナーゼは、種子のセリンカルボキシペプチダーゼと共に、発酵の間のココアフレーバー前駆体の生成に重要であることが提唱されている（Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．及びＢｉｅｈｌ，Ｂ．（１９９５）「ココア特異的芳香成分の前駆体は、タンパク質分解加工によってココア種子のビシリンクラス（７Ｓ）グロブリンから誘導される（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｏｍａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｃｉｌｉｎ−ｃｌａｓｓ（７Ｓ）ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｂｏｔ．Ａｃｔａ １０８、２８３−２８９；Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．、Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ，Ｈ．、Ｖｏｉｇｔ，Ｇ．及びＢｉｅｈｌ，Ｂ．（１９９４）「ココア特異的芳香前駆体は、ココア種子のビシリン様グロブリンのタンパク質分解消化によって生成される（Ｃｏｃｏａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｏｍａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｃｉｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｏｆ ｃｏｃｏａ ｓｅｅｄｓ）」．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５０、１７７−１８４）。豊富なココア種子のアスパラギン酸プロテイナーゼをコードする遺伝子が同定されており、発酵したカカオ豆中のココアフレーバー前駆体のアミノ酸及びペプチドのレベルを増大させることができる、カカオ種子中でこのタンパク質を過剰発現させる方法は、国際特許公開第０２／０４６１７号（この全内容は、本明細書中に参照として組み込まれる）中に最近記載された。しかし、国際特許公開第０２／０４６１７号の教示は、酸発酵ステップを受けないコーヒー粒とは異なり、特定の長さの酸発酵ステップを受けるカカオ種子に関するものである。
【００１０】
重要な液胞システインプロテイナーゼ（ＣＰ）は、ＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼである。このタイプのプロテイナーゼは、いくつかの植物において特徴付けられている。今日まで、Ｃ末端ＫＤＥＬ配列を有するシステインプロテイナーゼをコードする３つの遺伝子がａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて見出されている（Ｇｉｅｔｌ，Ｃ．及びＳｃｈｍｉｄ，Ｍ．２００１、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ８８、４９−５８）。１つは成熟中の胚珠中で発現され、１つは導管中で発現され、３番目は成熟中の長角果において発現される。しかし、このタンパク質についてのより詳細な研究は、他の植物において実施されてきた。例えば、スルフヒドリル−エンドプロテイナーゼ（ＳＨ−ＥＰ）と称されるＣＰが、Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ種子の子葉において特徴付けられている（Ｔｏｙｏｏｋａ，Ｋ．、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．及びＭｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．（２００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４８、４５３−４６３）。ＳＨ−ＥＰは、Ｖ．ｍｕｎｇｏの発芽中の子葉において新たに発現され、タンパク質貯蔵液胞中に蓄積した貯蔵タンパク質の分解に関与すると提唱されている（Ｏｋａｍａｔｏ，Ｔ及びＭｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２、６７５−６８２）。ＳＨ−ＥＰポリペプチドの重要な特徴は、小胞体（ＥＲ）からタンパク質貯蔵液胞までのこのタンパク質の輸送を指図する特異的ＣＯＯＨ末端配列ＫＤＥＬをこれが保有することである（Ｔｏｙｏｏｋａら、２０００）。このＳＨ−ＥＰタンパク質は、そのＫＤＥＬ配列の存在を介して、以前に記載されていない小胞輸送システムにおけるＫＶ（ＫＤＥＬ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と称される特定の小胞の形成に実際に関与することもまた、最近提唱されている（Ｏｋａｍａｔｏ，Ｔ．、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．、Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．及びＭｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１３２、１８９２−１９００）。
【００１１】
関連の提案が、発芽中のトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の実の子葉において見出されたＫＤＥＬ含有ＣＰタンパク質についてなされている。この植物において、著者らは、内胚乳のプログラム細胞死において、発芽中のトウゴマの実の胚に栄養を供給し続けるＫＤＥＬプロテイナーゼを示している（Ｇｉｅｔｌ，Ｃ．及びＳｃｈｍｉｄ，Ｍ．２００１、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ８８、４９−５８）。これらの著者らは、トウゴマの実において、このＫＤＥＬプロテイナーゼが３日目の前に発芽中の種子のＥＲにおいて作製されることを提唱している。種子の皮が脱げると、３日目付近で、ＫＤＥＬ含有ＣＰは、リシノソーム（ｒｉｃｉｎｏｓｏｍｅ）と称される特定の小胞中に詰め込まれる。後に、内胚乳が４日目〜５日目の間に軟化するにつれて、ＫＤＥＬ−ＣＰは、そのアンカー配列（ＫＤＥＬ）が切断して除かれ、このプロテイナーゼは、細胞性タンパク質の全般的な分解においてそれが補助する場所である細胞質に移動する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、コーヒー中のタンパク質／ペプチド／アミノ酸のフレーバー前駆体プールを改変することである。
【００１３】
より具体的には、本発明の目的は、収穫後の処理及び焙煎加工の後に変更されたフレーバーが達成できるように、原材料（緑の粒）中のフレーバー前駆体のレベルを改変することである。理論によって束縛されないが、有意に異なるフレーバーを有するコーヒー間のペプチド及びタンパク質の分解のレベルにバリエーションが存在する場合、これらのバリエーションは、これらの異なる粒中の内因性プロテイナーゼ活性の差異に起因することがあると考えられる。この差異は、特定の種子プロテイナーゼ遺伝子についての発現レベルのバリエーションによって、ｍＲＮＡ発現のレベルで検出可能である場合がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って本発明は、コーヒー粒（種子）特異的プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を同定すること、並びにａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるこれらの遺伝子の発現にバリエーションが実際に存在することを示すことを含む。
【００１５】
より具体的には、本発明は、２つの主要なコーヒーシステインプロテイナーゼ（ＣｃＣＰ−１及びＣｃＣＰ−４）、４つの主要なコーヒーシステインプロテイナーゼインヒビター（ＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＣＰＩ−２、ＣｃＣＰＩ−３及びＣｃＣＰＩ−４）並びに２つのコーヒーアスパラギン酸プロテイナーゼ（ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２）を開示し、これらは全てコーヒーの種子中で発現される。本発明者らは、種子発達における特に後期のこれらのタンパク質の過剰発現又は後期種子発達の間のこれらのタンパク質の低下した発現のいずれかが、成熟豆のアミノ酸／ペプチド／タンパク質のプロフィールを如何に変更できるかをさらに示す。成熟豆のアミノ酸／ペプチド／タンパク質のプロフィールを変更するために開示された遺伝子配列及び遺伝子構築物の１つ又は複数を使用することによって、本発明者らは、成熟コーヒー豆のフレーバー前駆体プロフィールを変更するための新たな方法を開示する。
【００１６】
第１の態様において、本発明は、システインプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２又は１６から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、この相補体はこのヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、この相補体とこのヌクレオチド配列とは１００％相補的である。好ましくは、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２又は１６のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号１又は１５のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号２又は１６のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
第２の態様において、システインプロテイナーゼインヒビター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、この相補体はこのヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、この相補体とこのヌクレオチド配列とは１００％相補的である。好ましくは、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号３、９、１１又は１３から、任意選択で配列番号９、１１又は１３から、さらに任意選択で配列番号９又は１３から選択される；なおさらに任意選択で配列番号９であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号４、１０、１２及び１４から、任意選択で配列番号１０、１２及び１４から選択される、さらに任意選択で配列番号１０又は１４から；なおさらに任意選択で配列番号１０であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
第３の態様において、アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８、好ましくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、この相補体はこのヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、この相補体とこのヌクレオチド配列とは１００％相補的である。好ましくは、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８、好ましくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号５又は７、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号６又は８、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらなる態様において、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２０】
さらなる態様において、調節配列に作動可能に連結された本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物が提供される。この非ネイティブの構築物において、このポリヌクレオチドが非ネイティブであるか、調節配列が非ネイティブであるか、又は両方が非ネイティブであるかのいずれかであることが理解される。
【００２１】
さらなる態様において、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換するステップを含む、細胞を形質転換するための方法が提供される。
【００２２】
さらなる態様において、上記の非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物を含む細胞が提供され、この細胞は好ましくは、原核細胞、真核細胞又は植物細胞、好ましくはコーヒー細胞である。
【００２３】
さらなる態様において、このような形質転換された細胞を含むトランスジェニック植物が提供される。
【００２４】
本願において、コーヒーチェリーとの用語は以下のように規定される：コーヒーチェリー；果実全体；外果皮、皮；果皮、チェリーの多肉質の主要な外側層；及び粒、コーヒーの種子。これらの用語のより完全な説明については、Ｃｌａｒｋｅ，Ｒ．Ｊ．、コーヒー：植物学、生化学並びに豆及び飲料の生産（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅａｎｓ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ）、２３０頁、Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｍ．Ｎ．及びＷｉｌｌｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．編、Ｃｒｏｏｍ Ｈｅｌｍ Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ（その内容は、その全体が参照として組み込まれる）を参照のこと。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、以下の詳細な説明及び本願の一部をなす添付の配列表から理解できる。
【００２６】
表１は、添付の表において使用される通りの対応する配列同定子（配列番号）と共に、本明細書中に記載されるポリペプチドを本明細書中以下に列挙する。
【００２７】
表１：
配列番号１（ＣｃＣＰ１：システインプロテイナーゼ、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号２（ＣｃＣＰ１：システインプロテイナーゼ、アミノ酸）
配列番号３（ＣｃＣＰＩ−１：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号４（ＣｃＣＰＩ−１：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号５（ＣｃＡＰ１：アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ１、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号６（ＣｃＡＰ１：アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ１、アミノ酸）
配列番号７（ＣｃＡＰ２：アスパラギン酸プロテイナーゼ２、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号８（ＣｃＡＰ２：アスパラギン酸プロテイナーゼ２、アミノ酸）
配列番号９（ＣｃＣＰＩ−２：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１０（ＣｃＣＰＩ−２：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号１１（ＣｃＣＰＩ−３：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１２（ＣｃＣＰＩ−３：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号１３（ＣｃＣＰＩ−４：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１４（ＣｃＣＰＩ−４：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号１５（ＣｃＣＰ−４：システインプロテイナーゼ、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１６（ＣｃＣＰ−４：システインプロテイナーゼ、アミノ酸）
【００２８】
この配列表は、ヌクレオチド配列特徴について１文字コードを使用し、アミノ酸について、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Ｓｔａｎｄａｒｄｓのために規定され、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：３０２１−３０３０（１９８５）（これは、本明細書中に参照として組み込まれる）中に記載されるような３文字コードを使用する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、核酸フラグメントのようなヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の任意選択で合成、非天然又は変更されたヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそれらの混合物の１つ又は複数のセグメントを含んでもよい。
【００３０】
本発明において、当業者に一般に使用されるアルゴリズムによって決定されるような、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対する、類似の核酸フラグメントがコードするアミノ酸配列の％同一性によって、この類似の核酸フラグメントが特徴付けられる。適切な核酸フラグメント（すなわち、本発明の第１の態様〜第３の態様に記載の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントが、なおより好ましい。複数の配列アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ法のアラインメントを使用して実施されるべきである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、４６７３−４６８０頁；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ １９８９ Ｃａｂｉｏｓ．５：１５１−１５３）。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「類似の核酸フラグメント」とは、１つ又は複数のヌクレオチド塩基の変化が１つ又は複数のアミノ酸の置換を生じるが、その変化がこのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能に影響を与えないか、又は例えばアンチセンス技術若しくは同時発現技術を介した遺伝子サイレンシングによって核酸フラグメントが遺伝子発現を媒介する能力に影響を与えないかのいずれかである、ポリヌクレオチド配列をいう。用語「類似の核酸フラグメント」とはまた、１つ又は複数のヌクレオチド塩基が欠失又は挿入された改変ポリヌクレオチド配列をいい、但しこの改変は、このヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能に影響を与えないか、又は遺伝子サイレンシングによって核酸フラグメントが遺伝子発現を媒介する能力に影響を与えないかのいずれかである。従って、本発明の範囲が、本明細書中に具体的に開示されたポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を超えて広がることが理解される。類似の核酸フラグメントは、植物又は植物細胞中の改変核酸フラグメントによってコードされるポリペプチドのレベルに影響を与えるそれらの能力について、部分フラグメント又は改変核酸フラグメントの形態の核酸フラグメントをスクリーニングすることによって選択できる。
【００３２】
用語「作動可能に連結された」とは、一方の核酸フラグメントの機能が他方の核酸フラグメントによって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する２つ以上の核酸フラグメントの結合をいう。「調節配列」とは、コード配列の上流、その内部又はその下流に位置し、それに結合したコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、転写終結配列及びポリアデニル化認識配列が含まれてもよい。プロモーターの形態の調節配列がコード配列に作動可能に連結される場合、この調節配列は、コード配列の発現に影響を与えることがある。コード配列は、センス又はアンチセンスの配向で、調節配列に作動可能に連結できる。
【００３３】
用語「発現」とは、本発明の核酸フラグメント由来のセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積をいう。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。過剰発現とは、正常細胞すなわち形質転換されていない細胞における産生レベルを超える、トランスジェニック細胞における遺伝子産物の産生をいう。「変更されたレベル」とは、正常細胞すなわち形質転換されていない細胞のものとは異なる量又は割合の、トランスジェニック細胞における遺伝子産物の産生をいう。
【００３４】
「形質転換」とは、遺伝的に安定な継承を生じる、宿主細胞のゲノムへの核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は、本明細書中で「トランスジェニック細胞」と称される。
【００３５】
本明細書中で使用されるような標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は当該分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９（これは、本明細書中に参照として組み込まれる）中により完全に記載されている。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本発明をこれらの実施例に限定することなく、本発明を例示する。これらの実施例において、他のように特定されない限り、全ての部及び百分率は重量により、度数はセルシウスである。
【００３７】
以下の実施例において、これらの略号が使用されている：
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅
【００３８】
上記の考察及び下記の実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の範囲から逸脱することなく本発明の本質的な特徴を様々に変化及び改変して、本発明を所望に応じて種々の用途及び条件に適合させることができる。
【００３９】
ｃＤＮＡライブラリーの生成及びスクリーニング
種子特異的ＲＮＡの生成
Ｒｏｂｕｓｔａ変種Ｑ１２１のコーヒーチェリーを、ＩＣＣＲＩ（インドネシア）において３０ＷＡＦ（開花後の週）で収穫した。次いで、これらのチェリーの果皮を除去し、残留する外胚乳／内胚乳材料を凍結し、液体窒素中で粉末になるまで粉砕した。ＲＮＡを、カカオ種子のＲＮＡ抽出のための以前に記載された方法を使用して、この凍結粉末材料から抽出した（Ｇｕｉｌｌｏｔｅａｕ，Ｍ．ら、２００３、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ種子中の油体：１５．８ｋＤａ及び１６．９ｋＤａのオレオシンをコードするｃＤＮＡのクローニング及び特徴付け（Ｏｉｌ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ ｓｅｅｄｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ １５．８ ａｎｄ １６．９ ｋＤａ ｏｌｅｏｓｉｎｓ）．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１６４巻、５９７−６０６）。ポリＡ＋ＲＮＡを、ＡＭＢＩＯＮ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．製）の「ＰｏｌｙＡ Ｐｕｒｉｓｔ（商標）」キットをキットの指示書に従って使用して、約２５０μｇの総ＲＮＡから調製した。
【００４０】
種子ｃＤＮＡクローンの第１セットの生成
次いで、約５０ｎｇ〜１００ｎｇのこのポリＡ＋ＲＮＡを、「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ（商標））及び以下のようなＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成において使用した。２μｌの３０ＷＡＦ ポリＡ＋ＲＮＡ、１μＬのＣＤＳオリゴ（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１μＬのＳｍａｒｔ ＩＩオリゴ（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び８μＬの脱イオンＨ２Ｏを含む反応。この混合物を７２℃で５分間加熱し、次いで氷上に置いた。次いで以下を添加した；１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（商標）第１鎖緩衝液及び２μＬのＤＴＴ。この混合物を４２℃で２分間置き、次いで１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（商標）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（２００単位／μＬ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（商標））を添加し、この混合物を空気循環インキュベータ中で４２℃でさらに５０分間インキュベートした。
【００４１】
逆転写反応後、以下のＰＣＲ反応を実施した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ ＰＣＲキット、ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を含むＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に記載される９８μＬのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘを氷上に設置し、次いで３μＬの上記第１鎖ｃＤＮＡ合成反応を添加した。次いで、この１００μＬのＰＣＲ反応を、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１５０ ＨＢ装置中に配置し、以下のＰＣＲ条件を実施した：９５℃で１分間、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で６分間）×１６サイクル。増幅されたＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を供給者の指示に従って使用して精製した。次いで、５０μＬの脱イオン水中に溶出されたＤＮＡを、以下のようなＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に含まれるＰｆｕ−１ポリメラーゼ試薬を使用して「研磨」した；５０μＬのＤＮＡ、５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、６．５μＬの１０×Ｐｆｕ−１研磨緩衝液、５μＬのクローニングされたＰｆｕ−１ ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌ）。次いでこの反応を、加熱されたカバーを有するＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で７２℃で３０分間インキュベートした。ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に記載されるプロトコルを使用して、研磨した（平滑化した）ＰＣＲ産物を、Ｓｒｆ−１酵素の存在下でＳｒｆ−１消化したｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクター中に連結し、この連結反応産物を、ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ（商標）Ｋａｎ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換した。挿入配列を含むプラスミドを有する形質転換についての選択を、ＬＢ−Ａｍｐプレート並びにその表面上に広げられたＩＰＴＧ及びＸｇａｌを使用して、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐキット中に記載されるように実施した。白色コロニーを選択し、これらのクローンをＤａｖｌ−１などと命名した。
【００４２】
サイズ選択されたｃＤＮＡを有する種子ｃＤＮＡクローンの第２セットの生成
種子は、少数のタンパク質（例えば、種子の貯蔵タンパク質）を高度に発現する（Ｗｈｉｔｅら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１２４巻、１５８２−１５９４）。ｃＤＮＡがこのような組織から調製される場合、非常に高いレベルの貯蔵タンパク質及び他の種子特異的タンパク質が、高レベルのｃＤＮＡの「重複」を導く。すなわち、生成されたｃＤＮＡ集団は、高い割合の同じｃＤＮＡを含む。コーヒー種子のｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの重複を低下させるため及び弱く発現された長いｃＤＮＡを選択的に特徴付けるために、第２のｃＤＮＡクローニングストラテジーもまた使用した。上記の逆転写酵素反応の産物を使用して、以下のＰＣＲ反応を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ ＰＣＲキット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）：３μＬの逆転写酵素反応、５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、２μＬのＰＣＲプライマー（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、３９μＬの脱イオン水及び１μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ポリメラーゼミックスを使用して設定した。次いで、このＰＣＲ反応を、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１５０ ＨＢ装置中に配置し、以下のＰＣＲ条件を実施した：９５℃で１分間、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で６分間）×１６サイクル。ＰＣＲの終了時に、１μＬの１０％ ＳＤＳをゲルローディング緩衝液と共に添加し、このサンプルを３７℃で１０分間加熱した。次いで、このサンプルを、エチジウムブロマイドを含まない０．７％アガロースゲル上にロードするために分割し、１０％をＤＮＡマーカーレーンの脇の小さいウェル中にロードし、他の９０％を隣接する大きい調製スケールのウェル中にロードした。このゲルを泳動した後に、サイズマーカーを有するゲル区画＋１０％反応サンプルを、エチジウムブロマイドで染色した。次いで、この染色したゲル区画をテンプレートとして使用して、このゲルの残りの未染色の（調製）部分中に存在するｃＤＮＡとは異なるサイズのＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを含むゲルスライスを生成した。示されたサイズ範囲のＰＣＲフラグメントを有する６つのゲルスライスを生成した；Ａ１Ａ（０．８ｋｂ〜１ｋｂ）、Ａ１Ｂ（１ｋｂ〜１．５ｋｂ）、Ａ２（１．５ｋｂ〜２．２５ｋｂ）、Ａ３（２．２５ｋｂ〜３．２５ｋｂ）、Ａ４（３．２５ｋｂ〜４ｋｂ）及びＡ５（４ｋｂ〜６．５ｋｂ）。
【００４３】
各ゲルスライス中のＤＮＡを、供給業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎのＱＩＡＥＸ ＩＩキットを使用してアガロースから溶出した（サンプル３Ａ、４Ａ及び５Ａについては５０℃で１０分間加熱し、サンプル１Ａ、１Ｂ及び２Ａについては室温で１０分間加熱した）。次いで、精製した二本鎖ｃＤＮＡを、３’Ｔオーバーハングを有するフラグメントを作製する以下のようなＴＡＱ酵素ミックスを用いたＰＣＲによってさらに再増幅した：３０μＬのゲル単離された二本鎖ｃＤＮＡ、５μＬの１０×ＴＡＱ緩衝液（ＴＡＱ ＰＬＵＳ精密ポリメラーゼミックスを補充したもの、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μＬの４０ｍＭ ｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、２μＬのＰＣＲプライマー（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、０．５μＬのＴＡＱ ＰＬＵＳ精密ポリメラーゼミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び１１．５μＬの脱イオン水。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９５℃で１分間、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で１分間、７２℃で８分間）×７サイクル、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で１分間、７２℃で１０分間）×１サイクル。
【００４４】
次いで、生成されたＰＣＲ増幅されたＤＮＡを、ベクターｐＣＲ（商標）−ＴＯＰＯ（商標）中に連結し、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給業者によって記載される通りに使用して、ＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中にクローニングした。これらのクローンを、その単離の順番及びサイジングゲルにおけるそれらの位置によって命名した（例えば、Ａ２−１、Ａ２−２など）。
【００４５】
種子ｃＤＮＡのスクリーニング及び予備的同定
Ｄａｖ−１ライブラリーにおいて得られた白色コロニーの第１セットを、使用したクローニング部位に隣接したＴ３プライマー及びＴ７プライマーを使用して挿入配列をＰＣＲ増幅し、ゲル上のＰＣＲ増幅されたフラグメントを試験することによって、各挿入配列のサイズを最初に決定することによってスクリーニングした。
【００４６】
各白色コロニーを２００μｌの滅菌水中に再懸濁し、このうち１０μｌ〜３０μｌを、５μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、２．５μｌの２０μＭ Ｔ３プライマー、２．５μｌの２０μＭ Ｔ７プライマー、１μｌのＤＭＳＯ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び５０μｌの最終容量までのＨ２Ｏに添加した。使用したＰＣＲ反応プログラムは、９４℃で１分間、次いで（９４℃で１分間、５５℃で１．５分間及び７２℃で３．５分間）×３０サイクル、及び７２℃で７分間の最終サイクルであった。重複を低下させるために、類似のサイズのＰＣＲ挿入配列を、制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩによる消化に供した。同じＨａｅ ＩＩＩ制限パターンを有するＰＣＲフラグメントをさらに研究することはしなかった。次いで、＞５００ｂｐでありかつ独自のＨａｅ ＩＩＩ制限パターンを有したＰＣＲフラグメントを有するクローンのプラスミドを、隣接するベクター配列中にコードされた適切なＴ７配列決定プライマー又はＴ３配列決定プライマーを使用する５’末端ジデオキシ配列決定のために、Ｑｉａｗａｌｌ ８ウルトラプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することによって精製した。これらの挿入配列は方向性をもった様式でクローニングされるわけではないので、精製されたプラスミドＤＮＡのＳｃａ １消化によって各クローンの５’末端を決定することが最初に必要であった（ＣＤＳ ＳＭＡＲＴプライマーは、挿入配列の配向の決定を可能にするＳｃａ １部位を含む）。得られたＤＮＡ配列データを、プログラムＢＬＡＳＴＸ（商標）を使用してＧＥＮＥＢＡＮＫ中の非重複データベースタンパク質に対して引き続いて書き込み、各ｃＤＮＡクローンの予備的注釈を得た。
【００４７】
種子ｃＤＮＡバンクは、高レベルの重複を有する。すなわち、少数の種子ｍＲＮＡ（例えば、種子の貯蔵タンパク質をコードするｍＲＮＡ）が異常に高いレベルの発現を有し、従って、それらのｃＤＮＡは、種子ｃＤＮＡバンク中に非常に豊富である（Ｗｈｉｔｅら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１２４巻、１５８２−１５９４）。従って、コーヒー種子のｃＤＮＡを配列決定する第１ラウンドにおいて主要な重複ｃＤＮＡを同定した直後に、プレスクリーニングステップを、挿入配列のサイズ決定の前に、白色の挿入配列含有コロニーのために付加した。４つの配列が非常に高度に発現され、以下の特異的プライマーセットを、これらの重複配列の各々について作製した。
【００４８】
このプレスクリーニングステップのためのＰＣＲ反応は、以下のように実施した：滅菌Ｈ２Ｏ中の白色コロニー１０μｌ〜３０μｌ、５μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５μｌの各プライマー（２０μＭ）、１μｌのＤＭＳＯ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ １０Ｕ／μｌ）及び滅菌Ｈ２Ｏを添加して、５０μｌの最終反応総容量にした。ＰＣＲプログラムは、９４℃で１分間、次いで（９４℃で１分間、各プライマー対に特異的な温度で１．５分間、７２℃で２．５分間）×３０サイクル、その後の７２℃で７分間であった。
【００４９】
全長ｃＤＮＡ挿入配列の配列決定及び配列分析
その部分配列がプロテイナーゼ及びプロテイナーゼインヒビターに対して最初の相同性を示したｃＤＮＡクローンを、標準的なジデオキシプライマーウォーキングストラテジーを使用して、両方の鎖について完全に配列決定した。これらの配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５の下に示される。得られた全長配列を、ＢＬＡＳＴＸを使用してＧａｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースに対して再度書き込み、予備的注釈を強化した。
【００５０】
配列対の配列の同一性を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（商標）ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）中のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）モジュール中に含まれるＣｌｕｓｔａｌＷ（商標）プログラムを使用して計算した。デフォルトパラメータは以下のように選択した：（１−ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳ−Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６、Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｓ（％）３０、ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ−Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ ＩＵＢ。２−ＰＡＩＲＷＩＳＥ ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳ−Ｓｌｏｗ／Ａｃｃｕｒａｔｅ（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ−Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ−ＩＵＢ）。使用した配列は、各ｃＤＮＡ又は各ｃＤＮＡの完全ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の全長ヌクレオチド配列のいずれかであった。
【００５１】
表２：ＣｃＣＰ−１、ＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２とＧｅｎＢａｎｋの非重複タンパク質データベース中に見出される関連遺伝子及びＷＯ ０２／０４６１７号の関連遺伝子との間の、核酸配列及びアミノ酸配列の同一性の値。
【表１】
【００５２】
５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ
クローンＡ５−８１２のｃＤＮＡ挿入配列はイントロンを含むことが見出された。従って、このタンパク質のコード配列を確認するために、完全コード配列を含む新たなｃＤＮＡを単離することが必要であった。これを、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することによって達成した。５’ＲＡＣＥに使用した第１鎖ｃＤＮＡを、上記のｃＤＮＡライブラリーについてすでに記載した通りに作製した。遺伝子特異的プライマーｒＡＰ２（５’ ＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＡＡ ３’）を設計した。この配列は、Ａ５−８１２クローンのポリ（Ａ）テイルから９２ｐｂに位置する。次いで、この特異的プライマーを、以下の条件下でＰＣＲ反応においてＣＬＯＮＴＥＣＨキット中のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＵＰＭ）と共に使用した；２．５μｌの第１鎖ｃＤＮＡ産物、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１０ｍＭ）、１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、５μｌの「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ」（１０×）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｒＡＰ２（１０μＭ）及び滅菌水を添加して、５０μｌの最終容量にした。ＰＣＲサイクル条件は、（９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間及び７２℃で３分間）×２０サイクルとその後の７２℃で５分間の最終伸張反応であった。約１７００ｐｂのフラグメントが得られ、「ＣＯＮＣＥＲＴ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット」（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用してこれをゲルから切り出した。単離したフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、Ｔｏｐｏ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に形質転換した。次いで、得られたプラスミドを、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して精製し、このプラスミドの挿入配列を二本鎖配列決定した。
【００５３】
クローンＡ５−４４２（ＡＰ１）のＤＮＡは、ｃＤＮＡの５’領域を欠くことが見出された。この領域を単離するために、５’ＲＡＣＥを、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施した。ポリ（Ａ）テイルから３９６ｐｂに位置する配列特異的プライマーｒＡＰ１（５’−ＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧ−３’）を設計した。次いで、この特異的プライマーを、以下の条件下でＰＣＲ反応においてＣＬＯＮＴＥＣＨキット中のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＵＰＭ）と共に使用した；２．５μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１０ｍＭ）、１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、５μｌの「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ」（１０×）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｒＡＰ１及び滅菌水を添加して、５０μｌの最終容量にした。ＰＣＲサイクル条件は、（９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間及び７２℃で３分間）×２０サイクルとその後の７２℃で５分間の最終伸張反応であった。約２，０００ｂｐのフラグメントが得られ、「ＣＯＮＣＥＲＴ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット」（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用してこれをゲルから切り出した。単離したフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、Ｔｏｐｏ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に形質転換した。次いで、得られたプラスミドを、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して精製し、このプラスミドの挿入配列を二本鎖配列決定した。
【００５４】
大きいＥｓｔライブラリーのためのＲＮＡ調製：
ＲＮＡを、以前に記載された方法を使用して、種々の発達段階の解剖した粒組織及び果皮組織並びに若葉から単離した。異なるＥｓｔライブラリーを生成するためのＲＮＡを調製するために使用した変種及び組織は以下の通りであった：（１）若葉、１つの変種（ＦＲＴ−３２）；（２）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の果皮（８つの異なる発達段階）；（３）１つの変種（ＦＲＴ−３１）由来のチェリー全体、受精後２２週（ＷＡＦ）；（４）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の粒、１８＋２２ＷＡＦ；（５）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の粒、３０ＷＡＦ；（６）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の粒、４２ＷＡＦ；並びに（７）２つの変種（ＦＲＴ−３２及びＱ１２１）由来の粒、４６ＷＡＦ。
【００５５】
ｃＤＮＡクローンの生成及びＤＮＡ配列分析。
種々のＥｓｔライブラリーのためのｃＤＮＡクローンを、以下のように調製した：ポリＡ＋ｍＲＮＡを、小規模の単離のための製造業者の指示に従ってＰｏｌｙＡＴｒａｃｋ（商標）ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｓｔｅｍ ＩＶ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。次いで、精製したポリＡ＋ｍＲＮＡを使用して、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（商標）ライブラリー構築キット（カタログ番号２００４５０ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に記載されるように、λファージ中への一方向クローニングのためのｃＤＮＡを調製した。マス切り出しプロトコルは、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターからｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔファージミドを切り出すためのものであり、８０μｌのｘ−ｇａｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）及び１６μｌのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）を含む１５０ｍｍのＬＢ−アンピシリン寒天プレート上にプレートした後に白色コロニーが得られた。単一コロニーをランダムに選択して、ｃＤＮＡ挿入配列の５’末端を配列決定するために次いで使用されるプラスミドＤＮＡを生成した。
【００５６】
得られたＤＮＡ配列は、各クローンについてのＥＳＴ配列（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）を生成した。次いで、７つのライブラリー由来の全てのＥｓｔ配列データを「ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ」でクラスター化し、「ユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）」配列セットと称される独自の群の配列を生成した。従って、各「ユニジーン」配列は、理論的に別個の遺伝子産物に対応する。しかし、多数のユニジーンは部分的ｃＤＮＡ配列を示しているだけなので、いくつかの遺伝子が２つ以上のユニジーンによって示される可能性があることに留意すべきである。次いで、ユニジーンセットの予備的注釈を、各ユニジーン配列が非重複ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースに対して検索される自動ＢＬＡＳＴ検索を用いて実施した。このＢＬＡＳＴ検索アプローチは、「ユニジーン注釈」と称される５つの最良のＢＬＡＳＴ「ヒット」（最低のｅ値を有する「ヒット」）を生じた。
【００５７】
ノザンブロット分析
新たに採取した根、若葉、茎、花並びに異なる発達段階の果実（小さい緑の果実（ＳＧ）、大きい緑の果実（ＬＧ）、黄色い果実（Ｙ）及び赤い果実（Ｒ））を、トゥール（フランス）において温室条件下（２５℃、７０ＲＨ）で成長したＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２及びエクアドル又はＩＣＣＲＩ（インドネシア）のいずれかで成長したＣｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ ＦＲＴ３２から採取した。新たな組織を液体窒素中で即座に凍結し、上記抽出手段を使用して各組織から総ＲＮＡを単離した。合計５μｇのＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１．２％（ｗ／ｖ）の変性ＲＮＡゲル上で泳動した。各植物組織由来の総ＲＮＡサンプルを、７μＬの「ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ」（エチジウムブロマイドを含まない、Ｓｉｇｍａ）の存在下で６５℃で１５分間加熱し、次いで直後に氷上に２分間置き、その後１．２％のＲＮＡゲル上にロードした。このゲルを、６０ボルトで５時間泳動した。次いで、このゲルを１０×ＳＳＣ中に２０分間にわたって２回浸した。ゲル中のＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中で「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＴＭ Ｍｅｍｂｒａｎｅ」（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）にキャピラリートランスファーによって一晩移し、このＲＮＡを、このブロットを８０℃で３０分間加熱することによって固定した。プローブを、（Ｐ３２）ｄＣＴＰの存在下で「Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（商標）ＩＩランダムプライム標識システム」キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して生成した。ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、４０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５％［ｗ／ｖ］のＳＤＳ及び５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液）中で６５℃で２４時間実施した。次いでこのメンブレンを、各々３０分間の間に、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ［ｗ／ｖ］及び１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ［ｗ／ｖ］を使用して６５℃で２回洗浄した。
【００５８】
図１中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのシステインプロテイナーゼ遺伝子ＣｃＣｐ−１遺伝子が、試験した全ての段階でＣ．ａｒａｂｉｃａのコーヒーチェリーにおいて発現され、黄色いチェリーが他の段階よりも僅かに高い発現レベルを示すことを実証する。Ｃ．ａｒａｂｉｃａの根でも茎でも葉でも、この遺伝子の発現は検出されなかった。図２は、ＲＮＡの新たな調製物を使用した、Ｃ．ａｒａｂｉｃａにおけるＣｃＣＰ−１の発現を試験する別のノザンブロット実験を示す。この実験のために、４つの段階についてチェリーを解剖して、各段階のチェリー発達について果皮組織及び粒組織を生成した。次いで、総ＲＮＡをこれらの組織から抽出した。得られた結果は、チェリー発達の間のＣｃＣＰ−１の発現の同じ一時的パターンを示すが、この新たな実験は、ＣｃＣＰ−１が、チェリーの粒組織中のみにおいて高レベルで主に発現されることをさらに示す。ＣｃＣＰ−１遺伝子の有意な発現は、コーヒーチェリーの果皮においては見られない。この後者の結果は、通常の成長条件下でのコーヒー粒のタンパク質、ペプチド及びアミノ酸のプロフィールの全面的な変更におけるこの遺伝子産物の役割を支持する。
【００５９】
本発明者らは、コーヒーの葉並びに異なる段階の発達中のコーヒーチェリーから解剖した種子組織及び果皮組織から、ＥＳＴライブラリーを生成した。異なるライブラリー中のＣｃＣＰ−１ ＥＳＴの検出（以下に示される−表３を参照のこと）もまた、この遺伝子が粒において強く発現されるが、果皮においても葉においても有意には発現されないことを実証する。種子の発達の間のＣｃＣＰ−１の発現パターンは、Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａのその提唱された相同配列（ＣＰＲ４遺伝子：Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．ら、２０００．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３、８３−１０１）について見られる発現パターンと類似である。これらの著者らは、ＣＰＲ４が葉においても根においても茎においてもノザンブロッティングによって検出されないことを示しており、ＣｃＣＰ−１が粒特異的であるという主張をさらに強化している。例えば、ＣｃＣＰ−１のアンチセンス構築物又はＣｃＣＰ−１の過剰発現構築物のために粒特異的プロモーターを使用することによって、本明細書中で示唆されるような粒におけるＣｃＣＰ−１の発現を特異的に変更することは、他の組織において代謝を妨害しないと予測される。
【００６０】
【表２】
【００６１】
ＣｃＣＰ−１についての任意選択のアラインメント（図２Ａ）は、このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼをコードすることを示す。
【００６２】
図３中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのシステインプロテイナーゼインヒビター遺伝子ＣｃＣＰＩ−１遺伝子が、試験した全ての段階でＣ．ａｒａｂｉｃａのコーヒーチェリーにおいて発現されることを実証する。しかし、システインプロテイナーゼＣｃＣＰ−１について見られた発現とは対照的に、ＣｃＣＰＩ−１は、２つの初期段階のコーヒーチェリー発達（小さい緑及び大きい緑）においてより高い発現を示し、この遺伝子は、２つの後期段階のチェリー発達においてより低いレベルで発現される。この発現パターンは、システインプロテイナーゼインヒビタータンパク質（ＣｃＣＰＩ−１）が、種子において特異的に発現されるシステインプロテイナーゼ（例えば、コーヒーチェリー中のＣｃＣＰ−１）の活性レベルを制御するという本発明の仮説と一致する。制御タンパク質（例えば、システインプロテイナーゼインヒビタータンパク質）は、標的タンパク質が発現される時点から連続的にその標的タンパク質の活性レベルを制御する必要がある場合、その標的タンパク質よりも早く発現されることが予測できる。Ｃ．ａｒａｂｉｃａの根でも茎でも葉でも、この遺伝子の発現は検出されなかった。ＣｃＣＰ−１及びＣｃＣＰＩ−１の発現パターンの類似性は、これらのタンパク質が機能的に相互作用し得るという本発明の仮説と一致することが留意される。
【００６３】
ノザンブロッティングの結果（図３）は、ＣｃＣＰＩ−１がコーヒーチェリーにおいて全ての段階で発現されることを示した。しかし、この実験は、この発現がチェリー全体中に存在するのか、又は果皮若しくは粒の中にのみ存在するのかを決定しなかった。葉における発現もまた、試験しなかった。しかし、異なるＥｓｔライブラリーにおけるＣｃＣＰＩ−１の発現（以下の表４中に示される）は、この遺伝子が粒においてのみ特異的に発現され、果皮でも葉でも発現が検出されなかったことを実証する。この結果は、ＣｃＣＰＩ−１が種子において特異的に発現されるシステインプロテイナーゼ（例えば、ＣｃＣＰ−１）の活性レベルを制御することをさらに示唆する。
【００６４】
【表３】
【００６５】
図４中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのシステインプロテイナーゼインヒビター遺伝子ＣｃＣＰＩ−１遺伝子が、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ（ｒｏｂｕｓｔａ）のチェリー 対Ｃ．ａｒａｂｉｃａのチェリーにおいて差示的に発現されることを実証する。第１に、図４のデータは、このＣｃＣＰＩ−１遺伝子が、Ｃ．ａｒａｂｉｃａにおいて僅かにより早く発現されることを示す。第２に、そしてより重要なことに、このＣｃＣＰＩ−１遺伝子は、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａのチェリーにおいて有意により高いレベルで発現される。発現におけるこの差異は、Ｃ．ａｒａｂｉｃａのチェリー 対Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａのチェリーにおいて見出されるシステインプロテイナーゼ活性のレベルにおそらく影響を与える。このクラスのタンパク質は植物における耐虫性と広く関連しているので、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａにおけるＣｃＣＰＩ−１遺伝子の高い発現は、ｒｏｂｕｓｔａ変種 対ａｒａｂｉｃａ変種についてしばしば見られるより高い耐病性に寄与する可能性もある。
【００６６】
粒の発芽の間のＣｃＣＰ−１発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
コーヒー粒の発芽の間のＣｃＣＰ−１の発現を決定するために、コーヒーの果実を成熟段階で収穫し、水でリンスし、その果皮を除去した（各果実は通常２つの粒を含む）。得られた粒を、室温で戸外にて１週間乾燥させた。発芽前に、各粒のパーチメント及び銀皮（種皮）を手動で除去し、次いで粒を１％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム中に１時間配置することによって滅菌し、次いで滅菌脱イオン水によって２回洗浄した。発芽のために、１５０個の滅菌した粒を、１０ｍｌの固体Ｈｅｌｌｅｒ成長培地Ｈ１５（Ｈｅｌｌｅｒの塩（Ｈｅｌｌｅｒ、１９５３）を含む）及び７ｇ／ｌの寒天を含む試験管中に個々に配置し、次いで１日８時間の明期で２５℃でインキュベートした。
【００６７】
１０個の粒の３つのセットを、発芽の２日後、３日後、５日後、１ヵ月後及び２ヵ月後に採取し、液体窒素中で即座に凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。１ヶ月及び２ヶ月の発芽サンプルについて、これらのサンプルに付随した幼根をサンプリング時に摘出し、粒とは別に凍結した。３０個の滅菌した粒を、Ｔ（０）コントロールとして使用するためにＴ＝０で採取して凍結した。
【００６８】
各サンプルから抽出した４μｇのＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のプロトコルに従ってヘキサマーオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡを合成した。コーヒーのリボソームタンパク質Ｌ３９遺伝子のフラグメントを、ｃＤＮＡ合成ステップのためのコントロールとして各ｃＤＮＡサンプルについて増幅した。これらのＰＣＲ反応を、ｃＤＮＡの１／１００希釈物１０μｌ、１μＭの各プライマー、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む５０μｌの反応を使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、その後の（９４℃で１分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２．５分間）×３５サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。以下のプライマーをＰＣＲによる増幅のために使用し、７２６ｂｐのｃＤＮＡ産物を得た：ＣｃＣＰ−１ ｕｐ ５’ ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧ ３’及びＣｃＣＰ−１ ｌｏｗ：５’ ＡＣＧＣＴＴＣＣＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡ ３’。ＲＰＬ３９タンパク質のためのプライマーは、
であった。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、発芽の異なる段階の間のＣｃＣＰ−１の発現を決定した。得られた結果は、ＣｃＣＰ−１転写物が試験した全ての発芽時点において粒全体中で検出されることを実証する（図５）。Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．ら、２０００（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３、８３−１０１）によって、Ｖ．ｓａｔｉｖａ由来の提唱されたＣｃＣＰ−１相同体ＣＰＲ４のＲＮＡもまた、発芽の間にＶ．ｓａｔｉｖａ種子の胚軸及び子葉の両方において発現されることが以前に示されている。
【００７０】
ウエスタンブロット分析
分析した葉組織及びチェリー組織は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２由来であり、使用前にこれらの組織を−８０℃で凍結保存した。異なる発達段階のチェリーの粒組織及び果皮組織を、可能な限り小さい果皮の解凍で、別々に解剖した。次いで、これらの異なる組織を迅速に粉砕して微細粉末にした。これは、例えば、予め凍結した乳鉢及び乳棒を用いて液体窒素を使用して実施できる。タンパク質抽出物を、Ｔａｎａｋａら、１９８６（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、８１ ８０２−８０６）によって記載された抽出手順の改変バージョンを使用してこの組織から調製した。使用した緩衝液は以下であった：
Ｔａｎａｋａ緩衝液：
・スクロース ０．７Ｍ
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８） ０．５Ｍ
・β−メルカプト−エタノール ２％（ｖ／ｖ）
・ＮａＣｌ ０．１Ｍ
そしてこの緩衝液を使用する直前に以下を添加した：
・ＥＤＴＡ ５ｍＭ
・ＰＭＳＦ ２ｍＭ
ゲルローディング緩衝液
・グリセロール １５％（ｖ／ｖ）
・β−メルカプト−エタノール ２％（ｖ／ｖ）
・ＳＤＳ ３％（ｖ／ｖ）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８） ６２．５ｍＭ
【００７１】
数百ミリグラムの凍結粉砕粉末を、６５０μｌのＴａｎａｋａ緩衝液に添加した。タンパク質を、１体積のＴｒｉｓ飽和フェノール（ｐＨ８）（すなわち、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で飽和した）の添加によって抽出した。各サンプルを２０分間激しく混合し、次いで室温で１３０００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離後、これらのタンパク質はフェノール相中に存在する。２０μｌのサンプルを分析（以下を参照のこと）のために維持し、フェノール相中の残留タンパク質を、０．１Ｍの酢酸アンモニウムを含む５体積のメタノールの添加後に、−２０℃で一晩沈殿させた。引き続いて、これらのサンプルを室温で１３０００ｇで２０分間遠心分離し、得られたペレットを、０．１Ｍの酢酸アンモニウムを含む５００μｌのメタノール中で２回洗浄した。得られたペレットを、タンパク質定量まで、３０μｌのゲルローディング緩衝液中に再懸濁した。
【００７２】
フェノール相の２０μｌのサンプル中のタンパク質もまた上記のように沈殿させ、最終ペレットをＢｉｏＲａｄ ＤＣ ＰｒｏｔｅｉｎアッセイＫｉｔのサンプル緩衝液中に再懸濁した。このサンプル中の総タンパク質の定量を、供給業者によって記載されるようにＢｉｏＲａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキットを使用して実施した。引き続いて、全ての主要なサンプルを、ゲルローディング緩衝液の添加によって調整して、５μｇ／μｌにした。
【００７３】
各サンプルの約５０μｇのタンパク質を含むサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％のトリス−グリシン（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））における電気泳動によって分離した。次いで、これらのタンパク質を、標準的なプロトコルを使用したエレクトロブロッティングによってＰＶＤＦメンブレンに移した。このメンブレン上の非特異的結合部位を、ＴＢＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ（商標））中の１０％脱脂乾燥ミルク中でこのメンブレンを室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートすることによってブロッキングした。ブロットされたタンパク質を、Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ由来のＣＰＲ４の予測された相同体に対して惹起されたポリクローナル抗体（ＴＢＳ １０％脱脂乾燥ミルク中、１／５０００ｅ希釈）（Ａ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ及びＫ．Ｍuｎｔｚ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆuｒ Ｐｆｌａｎｚｅｎｇｅｎｅｔｉｋ ｕｎｄ ｋｕｌｔｕｒｐｆｌａｎｚｅｎｆｏｒｃｈｕｎｇ（ＩＰＫ）、Ｇｅｒｍａｎｙ（Ａ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ、Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ、Ｃ．Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ、Ｊ．Ｔｉｅｄｍａｎｎ及びＫ．Ｍuｎｔｚ、２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、５１：１４２３−１４３３）の厚意により寄贈されたもの）を用いて室温で２時間又は４℃で一晩プローブした。次いで、このメンブレンを、ＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０緩衝液中で２０分間にわたって３回洗浄した。このメンブレンを引き続き、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された２次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇ、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標））と共に１時間インキュベートした。次いで、このメンブレンをＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０緩衝液中で２０分間にわたって２回洗浄し、次いでＴＢＳ中で２０分間にわたって１回洗浄した。この２次抗体に連結された酵素の存在を、増強されたＥＣＬ＋（登録商標）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を供給業者によって記載される通りに使用して、化学ルミネセンス検出によって可視化した。
【００７４】
得られた結果は、約４１ｋＤａのポリペプチド（これは、ＣｃＣＰ−１前駆体ポリペプチドの予測された分子量（４３７３５Ｄａ）と密接に対応する）が、試験した粒成熟段階の全てにおいて検出されるが、果皮組織においては検出されないことを示す（図６）。このタンパク質発現パターンは、ＣｃＣＰ−１ ｍＲＮＡについて見られた発現パターン（図２）と類似である。約２２ｋＤａの別のポリペプチドもまた、黄色い段階及び赤い段階の粒において検出されるが、その量は、４１ｋＤａのポリペプチドよりも少ない。この第２のポリペプチドのサイズは、ＣｃＣＰ−１の成熟形態の予測されたサイズ（２５，２３９Ｄａ）と一致する。プロセシング後の成熟ＣｃＣＰ−１の予測されたサイズを、ＣｃＣＰ１の完全ＯＲＦ配列とＣＰＲ４の予測された成熟形態の配列（Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ−登録番号Ｚ９９１７２、ＣｃＣＰ１と６０．９％の同一性）との間のタンパク質アラインメントによって決定した。成熟形態を生成するためのＣＰＲ４ポリペプチドのプロセシングのＮ末端部位を、他のパパイン様ＣＰＲポリペプチドとの配列比較によって予測した（Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ、Ｓ．Ｈｉｌｌｍｅｒ、Ｃ．Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ、Ｂ．Ｎｅｕｂｏｈｎ、Ａ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ、Ｖ．Ｓｅｎｙｕｋ、Ａ．Ｓｈｕｔｏｖ及びＫ．Ｍuｎｔｚ．２０００ Ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４３：８３−１０１）。興味深いことに、ＣｃＣＰ−１の前駆体及び成熟形態の両方が粒の発達の間に検出される本明細書中に示される結果とは対照的に、ＣＰＲ４ポリペプチドの成熟形態のみが発達中の種子において検出され、Ｖ．ｓａｔｉｖａ種子の発芽の間にも検出された（Ｆｉｓｈｅｒら、２０００）。
【００７５】
ｒｏｂｕｓｔａ変種ＦＲＴ−３２についての遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
ＦＲＴ−３２の異なる組織を調製し、総ＲＮＡを、以前に記載された方法によってこれらの組織から抽出した。ｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡから、ａｒａｂｉｃａ ｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ実験について上記したように調製した。次いで、特異的ＰＣＲ反応を、ａｒａｂｉｃａ ｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ実験のための上記の反応条件を使用して実施した。使用した特異的増幅条件及びオリゴヌクレオチドプライマーは、各実験について図の説明文中に与えられる。
【００７６】
ＣｃＣＰＩ−１
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−１についての最適なアラインメント（図６Ａ）。
【００７７】
ｂ）ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるＣｃＣＰＩ−１についてのＲＴ−ＰＣＲ発現データ（図７）。ＰＣＲ反応を以前に記載されたように実施した。使用したサイクル条件及びＰＣＲプライマーは、図の説明文中に与えられる。これらのデータは、ＣｃＣＰＩ−１が粒においてのみ発現され、果皮においては発現されないことを示すので、ａｒａｂｉｃａ発現について以前に示されたデータを補足及び拡張する。この遺伝子の弱い発現が花においても検出され、これは、ノザンブロット分析によって以前に見られなかった結果である。ｒｏｂｕｓｔａにおけるＲＴ−ＰＣＲ発現もまた決定した（図７）。これは、花においても小さい緑の粒においても発現が検出されなかったこと以外、ａｒａｂｉｃａについて見られたのと同じ発現パターンである。ｒｏｂｕｓｔａの小さい緑の段階について見られた発現の非存在は他の遺伝子についても見られ、従って、これはＣｃＣＰＩ−１遺伝子に独自のことではない。
【００７８】
表５：異なるＥｓｔライブラリーにおけるシステインプロテイナーゼインヒビター遺伝子ＣＰＩ−２、ＣＰＩ−３及びＣＰＩ−４についてのＥｓｔの発生。
【表４】
【００７９】
ＣｃＣＰＩ−２
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−２についての最適なアラインメント（図８）。
【００８０】
ｂ）ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるＣｃＣＰＩ−２についてのＲＴ−ＰＣＲ発現データ（図９）。ＰＣＲ反応を以前に記載されたように実施した。使用したＰＣＲプライマーは図の説明文中に与えられる。これらのデータは、ＣｃＣＰ−２が全ての組織において発現されることを示し、従って、この遺伝子のタンパク質産物が、これらの組織中に存在する１つ又は複数のシステインプロテイナーゼを制御することにおいて重要な役割をおそらく果たすことを示す。上記表５中に見られる各ライブラリー中のＥｓｔの数は、ＣＰＩ−２が、葉、果皮又は受粉後４６週の種子よりも、受粉後３０週の粒（種子）においてより多く発現できることを示唆する。
【００８１】
ＣｃＣＰＩ−３
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−３についての最適なアラインメント（図１０）。
【００８２】
ｂ）このシステインプロテイナーゼインヒビターについて現在入手可能なＲＴ−ＰＣＲ発現データは存在しない。しかし、各ライブラリー中に出現するＥｓｔの数（上記表５）によって決定されるようなこの遺伝子の「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」発現は、ＣｃＣＰＩ−３が、コーヒー粒において発現される（「種子３０ｗ」及び「種子４６ｗ」、すなわち３０週及び４６週の種子ライブラリー中に存在する）ことを示す。果皮、葉又はチェリー全体におけるこの遺伝子についてのＥｓｔの非存在は、この遺伝子が粒特異的遺伝子であり得ることを示唆する。
【００８３】
ＣｃＣＰＩ−４
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−４についての最適なアラインメント（図１１）。
【００８４】
ｂ）ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるＣｃＣＰＩ−４についてのＲＴ−ＰＣＲ発現データ（図１２）。ＰＣＲ反応を以前に記載されたように実施した。使用したＰＣＲプライマーは図の説明文中に与えられる。得られたデータは、この遺伝子がａｒａｂｉｃａの葉、花及び赤い段階の粒において有意に発現されることを示す。最初のゲルの綿密な試験（パネルＡ：ａｒａｂｉｃａ）は、小さい緑の粒及び大きい緑の果皮のレーンにおいても弱いバンドが検出されることを示すので、この遺伝子はまた、ａｒａｂｉｃａの研究した全てのチェリー発達段階の粒及び果皮において弱く発現できる。ｒｏｂｕｓｔａについて得られたデータは、この遺伝子が、葉、花、小さい緑の粒及び大きい緑の粒において有意に発現されることを示す。ＣｃＣＰＩ−４についてたった１つのＥｓｔが種子又は果皮のライブラリーにおいて見出され（上記の表５）、このことは、粒及び／又は果皮におけるこの遺伝子の発現が比較的低いか、或いはこれら２つの組織の小さい規定された領域に限定されることを示す。
【００８５】
システインプロテイナーゼインヒビター（ＣＰＩ）遺伝子についての各々の場合において、粒発達の間のこれらの遺伝子の過剰発現又は発現の阻害（すなわち、非常に強い粒特異的プロモーター（例えば、コーヒー１１Ｓプロモーター）の制御下での）は、成熟粒におけるタンパク質、ペプチド及びアミノ酸のプロフィール（並びに従って、フレーバー前駆体のレベル）を変更することが予測される。
【００８６】
発芽及びＲＴ−ＰＣＲ分析
滅菌した乾燥Ｃ．ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２の粒（パーチメント及び銀皮を除去したもの）を、１０ｍｌの固体Ｈｅｌｌｅｒ成長培地Ｈ１５及び７ｇ／ｌの寒天を含む試験管中に個々に配置し、１日８時間の明期で２５℃でインキュベートした。発芽の２日後、３日後、５日後、１ヵ月後及び２ヵ月後に３個の粒を採取し、存在する場合には幼根を除去し、粒及び幼根の両方を液体窒素中で即座に凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。同様に乾燥及び滅菌した非発芽粒（Ｔ０）をコントロールとして使用した。ＲＮＡを、以前に記載されたように粒サンプルから抽出した。各サンプルから抽出したＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のプロトコルに従って、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を使用してｃＤＮＡを合成した。次いで、ＰＣＲ反応を、各ｃＤＮＡ反応のアリコート（１０μｌの１／１０希釈したｃＤＮＡ、１μＭの各プライマー、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ ＰＣＲ緩衝液、２００μｍのｄＮＴＰ及び２単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む５０μｌの反応）を使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、５４℃で１．５分間及び７２℃で２．５分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは以下であった：
【００８７】
ゲノムＰＣＲ及び精製されたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定
５つの異なるコーヒー変種（ＦＲＴ−０７、ＦＲＴ−１９、ＦＲＴ−３２、ＣＣＣＡ２及びＧＰＦＡ５７）のゲノムＤＮＡを、発芽ＲＴ−ＰＣＲ発現研究のために上記のＰＣＲ反応において使用した。予測されたサイズのＰＣＲ産物が得られ、これらのフラグメントをゲルから精製した。次いで、このＰＣＲ増幅されたＤＮＡを第２ラウンドのＰＣＲ増幅に供し、次いで、この配列決定反応から得られたＤＮＡを、増幅のために使用したのと同じプライマーを使用して配列決定した。
【００８８】
システインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４の単離及び特徴付け
１）異なる発達段階のコーヒー粒、異なる発達段階のコーヒーの果皮組織、及び葉から単離されたＲＮＡを用いて作製されたＥｓｔ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）の収集を使用して、本発明者らは、Ｃ末端ＫＤＤＬ配列を有するコーヒーシステインプロテイナーゼをコードする全長ｃＤＮＡを単離した。本発明者らは、このｃＤＮＡをＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）と命名した（図１４）。このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質と他の高度に相同な植物システインプロテイナーゼとのアラインメントが図１５中に示される。このアラインメントデータ及び関連のＢｌａｓｔ検索は、コーヒーＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）配列によってコードされるタンパク質が、植物のＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼファミリーのメンバーであることを明らかに示す（図１５）。ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）と最も相同なデータベース配列との間の正確な同一性は、表６Ａ及び６Ｂ中に与えられる。
【００８９】
表６Ａ：Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）のアミノ酸配列と、最も相同なＧｅｎＢａｎｋ配列のアミノ酸配列との同一性
【表５】
【００９０】
表６Ｂ：Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）の核酸（ｃＤＮＡ）配列と、最も相同なＧｅｎＢａｎｋ配列の核酸配列との同一性
【表６】
【００９１】
明白に、得られたコーヒーＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ配列は、図１５中に示される他のほぼ全ての配列とは異なる１つの重要な差異を有する。すなわち、この配列は、予測された小胞体（ＥＲ）残留配列（Ｃ末端ＫＤＥＬ配列）を有さないが、この配列の変異体（すなわちＫＤＤＬ）を有する。Ｃ末端ＫＤＥＬ配列におけるバリエーションが植物細胞中のＥＲにおける残留を指向する能力を試験することによって、Ｄｅｎｅｃｋｅら（Ｄｅｎｅｃｋｅ，Ｊ．、Ｄｅ Ｒｙｃｋｅ，Ｒ．及びＢｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｊ．１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１、２３４５−２３５５）は、Ｃ末端変異体（例えば、ＳＤＥＬ、ＫＤＤＬ、ＫＤＥＩ及びＫＤＥＶ）が、小胞体残留機能を完全に喪失することもあることを以前に示している。従って、植物ＫＤＥＬシステインプロテイナーゼのコーヒー相同体中のＫＤＤＬ配列の存在は予測されなかった。表７は、ｃＤＮＡ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）を含むユニジーンが２１個のＥｓｔを有することを示す。従って、次いで本発明者らは、このユニジーン中の他のＥｓｔの配列を試験し、これらのＥｓｔのうち７つが、ＫＤＤＬ領域についての良好な配列データを含むことを見出した。これら７つのｃＤＮＡ配列のうち、６つはＫＤＤＬ配列を有し、１つはＫＤＥＬ配列を有した。本発明者らは、ＫＤＥＬ Ｃ末端配列を有するｃＤＮＡクローンを引き続いて単離し、この部分的ｃＤＮＡクローンについての完全配列を得た。得られたＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ、図１６及び図１７中に示される。
【００９２】
表７．全長ｃＤＮＡ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）を含むユニジーン中のＥｓｔの数。
【表７】
【００９３】
図１６中に示されるＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）の配列をコードするｃＤＮＡは、部分的ｃＤＮＡに過ぎない。すなわち、これは、全長ｃＤＮＡクローンＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）についての１３３６ｂｐ長に対してたった８１７ｂｐ長である。部分的ｃＤＮＡ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）は、ｃＤＮＡクローンＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）中に見出される等価な配列からの８個の単一ヌクレオチド残基変化を有するが、これらのヌクレオチド変化のうち２つだけがオープンリーディングフレームのアミノ酸配列の変化を引き起こす（図１７）。３’非翻訳領域中に、３つの明白なヌクレオチド変化が存在する。さらに、マイクロサテライト領域内であるように思われるＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）ｃＤＮＡ配列の３’非翻訳領域中に、１２ヌクレオチドの挿入もまた存在する。このデータは、コーヒーＣｃＣＰ−４遺伝子のこれら２つの対立遺伝子についての未発見の２つの異なる重要な分子マーカーを示したに過ぎず、そのうち一方は、機能的に重要なＫＤＥＬ部位と関連するＳＮＰであり、他方は、この遺伝子の３’非翻訳領域と関連するマイクロサテライトマーカーである。後者の点は、マイクロサテライト配列が高い変動性を有する遺伝子マーカーであると通常みなされるので重要であり、従って、この遺伝子の他の対立遺伝子は、このマイクロサテライト含有領域を使用して見出される可能性がある。
【００９４】
ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの異なる変種において上で同定されたＣｃＣＰ−４遺伝子の２つの対立遺伝子の分布を試験するために、ＣｃＣＰ−４遺伝子を保有するゲノム配列の小さい領域を、５つの異なる遺伝子型からＰＣＲによって増幅した。予測されたサイズ（２０７塩基対）のＰＣＲフラグメントが各ゲノムＤＮＡサンプルから得られ、これらのＰＣＲ産物をゲル精製し、次いで再増幅して、このＰＣＲ産物の直接的ＤＮＡ配列決定に充分なＤＮＡを生成した。配列決定反応から得られた結果が図１８中に示される。５つの配列についての配列決定クロマトグラムは、試験した２つのａｒａｂｉｃａ変種がＫＤＥＬ配列を明らかに有し、試験した３つのｒｏｂｕｓｔａ変種がＫＤＤＬ配列を有することを示す。この結果は、ＫＤＤＬ対立遺伝子がｒｏｂｕｓｔａ変種に限定できること及びこれがａｒａｂｉｃａ変種においては見出されないことを示す。ＫＤＥＬ配列は本明細書中で研究した３つのｒｏｂｕｓｔａ変種においては見出されなかったが、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｅｓｔライブラリーにおける１つのＫＤＥＬ配列の発見は、この対立遺伝子が少なくともいくつかのｒｏｂｕｓｔａクローン中に存在できることを示す。
【００９５】
ＣｃＣＰ−４遺伝子の発現を、ノザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して研究した。図１９は、ａｒａｂｉｃａ変種の異なる発達段階のコーヒーの粒及び果皮から抽出したＲＮＡ並びに根、若葉、茎及び花から単離したＲＮＡを使用したノザンブロット実験から得られた結果を示す。ＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）対立遺伝子の既知のＤＮＡ配列との約９８％の相同性を有するＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）プローブを使用して得られたデータは、ＣｃＣＰ−４が粒においてのみ発現されることを示した。発現は、果皮においても、根、茎、花及び葉においても検出されなかった。２つの対立遺伝子間の非常に高いレベルの同一性に起因して、このＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）プローブは、両方の対立遺伝子由来の転写物にハイブリダイズすると予測される。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用した類似の実験もまた、ＣｃＣＰ−４遺伝子について同じ発現プロフィールを示した。
【００９６】
ＣｃＣＰ−４の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、発芽の間の種子全体においても研究した。この実験は、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＥＬ対立遺伝子及びＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ対立遺伝子の両方に共通するプライマーを使用した。この実験の結果は、図２０中に示される。ＣｃＣＰ−４転写物は試験した全ての発芽段階で検出されたが、これらの転写物のレベルは、３日目に僅かに低下するようであり、次いで発芽が進行するにつれて再度上昇し始めた（１ヶ月目及び２ヶ月目のサンプルにおいて最高レベル）。
【００９７】
Ｌｉｎｇら（Ｌｉｎｇ，Ｊ．−Ｑ．、Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．、Ｓｈｉｒａｉｗａ，Ｍ．及びＴａｋａｈａｒａ，Ｈ．、２００３ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６２７、１２９−１３９）は、ＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼをコードする２つのｃＤＮＡを、ダイズ子葉から単離した。これら２つのｃＤＮＡは、ＤＮＡレベルで９３．５％の類似性を有し、根、花及び種子発達の間に発現された。発達中の種子においても成熟種子においてもノザンブロッティングによって発現は検出されなかったが、成熟した莢において発現が検出された。ＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡは、ニンジンからも単離された（Ｓａｋｕｔａ，Ｃ．、Ｏｄａ，Ａ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．、Ｙａｍａｋａｗａ，Ｓ．、Ｋａｍａｄａ，Ｈ．及びＳａｔｏｈ，Ｓ．２００１ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５、２２４３−２２４８）。この遺伝子の転写物は、成熟した乾燥種子並びに吸水の２日後及び３日後の発芽中の種子全体において検出された。他のニンジン組織におけるこの遺伝子の発現又は種子発達の間のこの遺伝子の発現は示されなかった。別のＫＤＥＬ含有タンパク質及びその対応するｃＤＮＡがＶ．ｓａｔｉｖａから単離されている（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．、Ｈｉｌｌｍｅｒ，Ｓ．、Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ，Ｃ．、Ｎｅｕｂｏｈｎ，Ｂ、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ａ．、Ｓｅｎｙｕｋ，Ｖ．、Ｓｈｕｔｏｖ，Ａ．及びＭｕｎｔｚ，Ｋ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．４３、８３−１０１）。ノザンブロッティングを使用して、この遺伝子の転写物は、発芽の間に子葉において検出されたが、発芽中の種子の胚軸においては検出されなかった。成熟中の種子においても、成熟種子においても、葉及び根においても、転写物は検出されなかった。
【００９８】
本明細書中に示される結果は、コーヒーのＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼが、いくつかの新規かつ予測されなかった特徴を示すことを示す。第１に、本発明者らは、ｒｏｂｕｓｔａコーヒー粒が、ＫＤＥＬ領域をコードする配列中にＫＤＥＬからＫＤＤＬへの変化を生じる単一変異を有するＫＤＥＬ型ＣＰ遺伝子を発現することを発見した。Ｄｅｎｅｃｋｅら（１９９２）のデータに基づいて、この残留配列におけるこの特定の変更は、ｒｏｂｕｓｔａ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）タンパク質の細胞局在及び／又は制御を変更することが予測される。本発明者らは、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ遺伝子の転写されたコピーが存在することにより、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＥＬ配列を有する変種と比較して、コーヒー粒におけるペプチド／アミノ酸のプロフィールの有意な変化を生成できることを提唱する。本発明者らはまた、コーヒーのＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼが、粒の発芽の間に予測された発現を示しつつ、研究した全ての粒の発達段階の間にも予測に反して発現されることを本明細書中で示した。上記のように、これまで、他の植物における種子発達の間のＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼの有意な発現を実証する明確なデータは刊行された文献中には存在しないが、その転写物は、成熟ニンジン種子において検出されている（Ｓａｋｕｔａら、２００１）。
【００９９】
上で示されたコーヒーのＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼの新規特性は、ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの成熟粒におけるペプチドプロフィール及びアミノ酸プロフィールに対して重要な影響をおそらく有し、従って、重要なコーヒーフレーバー前駆体のプールを変更する。ＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼの転写物が成熟粒中に存在することを考慮すると、このＫＤＥＬ型タンパク質はコーヒーの湿式加工の間に活性化でき、それによって湿式プロセスのコーヒー粒のペプチド／アミノ酸のプロフィールをさらに変更することもまた可能である。記載された研究は、ＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼ遺伝子の特定の対立遺伝子を有するコーヒー変種（これは、タンパク質／ペプチド／アミノ酸のプロフィールにおける付随した変更を有する）を得るために古典的選択及び交配作業において使用できる分子マーカー（ＳＮＰ及びマイクロサテライトマーカー）を生成している。例えば、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＥＬ対立遺伝子のみを有するか又は低い発現レベルのＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ対立遺伝子のみを有するｒｏｂｕｓｔａの変種が、選択／交配できる。さらに、遺伝子改変技術を使用して、ＫＤＥＬ型又はＫＤＤＬ型のシステインプロテイナーゼの種子特異的な過剰発現によってコーヒー又は他の植物におけるＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼ活性を変更することが想定できる。或いは、ＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼのレベルは、アンチセンス、センス又はＲＮＡｉの技術を使用して低下できる。両方の場合において、得られた形質転換された植物中のタンパク質／ペプチド／アミノ酸のプールが変更されて、タンパク質／ペプチド／アミノ酸のフレーバー前駆体プールの新たなプロフィールが導かれる。
【０１００】
図１３中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのアスパラギン酸プロテイナーゼＣｃＡＰ−２遺伝子が、試験した全てのチェリー発達段階で、Ｃ．ａｒａｂｉｃａコーヒーチェリーの粒及び果皮の両方において発現されることを実証する。このＣｃＡＰ−２遺伝子はまた、根において比較的高い発現を有する。フィルムをより長く露光させると、ＣｃＡＰ−２発現は、Ｃ．ａｒａｂｉｃａの茎、葉及び花の組織においても検出された。
【０１０１】
ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２
図２１及び２２は、ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２の各々がアスパラギン酸プロテイナーゼをコードすることを示す。
【０１０２】
コーヒー種子におけるＣｃＣＰ−１、ＣｃＣＰ−４、ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２のプロテイナーゼ遺伝子配列並びにＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＣＰＩ−２、ＣｃＣＰＩ−３及びＣｃＣＰＩ−４のプロテイナーゼインヒビターの過剰発現及び過少発現。
主要な貯蔵タンパク質のプロフィール及びアミノ酸／ペプチドのプロフィールは、本明細書中に開示される１つ又は複数の遺伝子の発現を上方又は下方のいずれかで変更することによって、成熟コーヒー粒において変化できることが予測される。
【０１０３】
目的の遺伝子の過剰発現のための方法は当該分野で周知である。このような方法は、以下の３つの主要な成分のキメラ遺伝子を生成するステップからなる：１）遺伝子の５’末端のプロモーター配列、好ましくは本願においてはＭａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９９（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９９、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの完全１１Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子の分子クローニング及びトランスジェニックタバコ植物におけるプロモーター分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ １１Ｓ ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３７巻、２７３−２８２及びＷＯ ９９／０２６８８号）中に記載されるコーヒー種子特異的プロモーターのような種子特異的プロモーター、２）発現されるべき遺伝子の全コード配列、並びに３）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子由来の３’領域のような３’制御領域。次いで、このキメラ遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクター中にクローニングでき、このベクターは、Ｌｅｒｏｙら、２０００、（Ｌｅｒｏｙら、２０００、リーフマイナーに対する抵抗性についてのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子を発現する、遺伝的に変更されたコーヒー植物（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｆｆｅｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙ１Ａｃ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｌｅａｆ ｍｉｎｏｒ）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０００、１９、３８２−３８９）によって詳細に記載されているコーヒー形質転換において使用するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株中に形質転換できる。安定な形質転換挿入配列を有する植物を次いでスクリーニングして、遺伝子の過剰発現又はタンパク質活性の過剰発現の検出のような方法を使用して、モック形質転換した植物由来の種子に対して、形質転換実験において使用する特定の遺伝子を成熟種子において特異的に過剰発現する植物をスクリーニングすることができる。
【０１０４】
例えば、当業者は、以下からなる組換え構築物を生成できる：１）Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら（１９９９）中に記載される最長のコーヒー１１Ｓ遺伝子プロモーター配列、２）ポリＡテイルを有さない、ＣｃＣＰ−１又はＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）の全長ｃＤＮＡ配列、及び３）既知の転写ターミネーター配列（例えば、充分研究されたノパリンターミネーター）。ＣｃＣＰ４若しくは他のｃＤＮＡ配列の５’非コード領域の、コーヒー１１Ｓ遺伝子の５’非コード領域又はコーヒー若しくは他の関連の植物種のいずれかの他の強力な種子特異的プロモーターの５’非コード領域による置換に起因して、より高いレベルの組換え構築物の過剰発現が生じることもまた可能である。次いで、この組換え遺伝子配列を、Ｌｅｒｏｙらにおいて記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ−ＤＮＡベクターの適切な部位中に挿入できる。このように構築されたＴ−ＤＮＡベクターは、適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（例えば、Ｌｅｒｏｙらにおいて記載される株）中に配置することができ、このＴ−ＤＮＡ含有Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｌｅｒｏｙらにおいて詳述される方法に従ってコーヒーを形質転換するために使用できる。
【０１０５】
既知の遺伝子配列の発現が、アンチセンス抑制によって、遺伝子の全コード領域未満を示す核酸フラグメントを使用した遺伝子発現によって、抑制されるべき遺伝子と１００％の配列同一性を共有しない核酸によって、低下又は完全に遮断できることは、当該分野で周知である。この場合、特定のアンチセンス抑制又は共抑制実験のために選択された配列は、上に示したキメラ遺伝子構築スキームにおいて全長遺伝子を置換する。得られたアンチセンス抑制又は共抑制キメラ構築物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクター中に再度クローニングされ、上記のようにコーヒー形質転換において使用するためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株中に形質転換される。次いで、安定な形質転換挿入配列を有する植物は、形質転換された植物の種子において使用される特定の遺伝子配列の発現を低下させたものについてスクリーニングできる。低下された発現は、ノザンブロッティング；半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び／又は定量的ＲＴ−ＰＣＲのような技術によって検出できる。
【０１０６】
植物中の遺伝子発現を低下又は排除するための別の方法は、本明細書中に開示される遺伝子配列の小部分を使用して、ＲＮＡｉの使用を介したＲＮＡサイレンシングを生じることである（Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、第４１８巻、２４４−２５１；Ｔａｎｇら、２００３、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、第１７巻、４９−６３）。このアプローチにおいて、本明細書中に開示される１つ又は複数の配列の小領域が、種子特異的プロモーター及び適切な３’調節領域を有する上記のようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクター中にクローニングされる。ＲＮＡｉのためのこの挿入された新たな配列は、生成されたＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ構造を形成して、形質転換された細胞において小さい二本鎖ＲＮＡの生成を生じ、それによってこれらの小さい二本鎖ＲＮＡ配列がこれらの形質転換された細胞において相同なｍＲＮＡの分解を誘発するように構築されるべきである。
【０１０７】
ＣｃＣＰ−１遺伝子、ＣｃＣＰ−４遺伝子、ＣｃＡＰ−１遺伝子、ＣｃＡＰ−２遺伝子、ＣｃＣＰＩ−１遺伝子、ＣｃＣＰＩ−２遺伝子、ＣｃＣＰＩ−３遺伝子、ＣｃＣＰＩ−４遺伝子における天然に存在するバリエーションについてのスクリーニング及びこれらの遺伝子における新たな変異の生成。
本明細書中に開示される配列は、これらの遺伝子における対立遺伝子変異体について天然の集団をスクリーニングするために使用できる。これは、ＣｃＣＰ−１配列、ＣｃＣＰ−４配列、ＣｃＡＰ−１配列、ＣｃＡＰ−２配列、ＣｃＣＰＩ−１配列、ＣｃＣＰＩ−２配列、ＣｃＣＰＩ−３配列及びＣｃＣＰＩ−４配列を、異なるコーヒー植物変種由来のゲノムＤＮＡ中の天然に存在するＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）についての研究においてプローブとして使用することによって達成できる。対立遺伝子変異体を見出すためのより強力な方法は、ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｔｉｌｌ，Ｂ．Ｊ．ら、２００３、高スループットＴＩＬＬＩＮＧを用いた、誘導された点変異の大規模発見（Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｕｐｕｔ ＴＩＬＬＩＮＧ）．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１３巻、５２４−５３０）に関連する変異スクリーニング技術を使用することである。この場合、特定の遺伝子配列（例えば、本明細書中のＣｃＣＰ−１配列、ＣｃＣＰ−４配列、ＣｃＡＰ−１配列、ＣｃＡＰ−２配列、ＣｃＣＰＩ−１配列、ＣｃＣＰＩ−２配列、ＣｃＣＰＩ−３配列及びＣｃＣＰＩ−４配列）が一旦単離及びクローニングされると、ＴＩＬＬＩＮＧ法に関連する変異スクリーニング技術は、クローニングされた配列と異なる変種中の対応するｃＤＮＡ又はゲノム配列との間で配列変異体を同定するために使用できる。７００塩基対〜１０００塩基対のＤＮＡセグメントをコードするＰＣＲプライマー対を使用して、既知のクローニングされた遺伝子が、異なる変種中の天然に存在する配列バリエーションについてスキャンできる。理想的な状況において、１つ又は複数の配列変異体はまた、特定の表現型バリエーションと相関させることができ、それによってこの表現型変異体に対する遺伝子マーカーを同定する。
【０１０８】
さらに、ＣｃＣＰ−１、ＣｃＣＰ−４、ＣｃＡＰ−１、ＣｃＡＰ−２、ＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＣＰＩ−２、ＣｃＣＰＩ−３及びＣｃＣＰＩ−４についての本明細書中に開示される配列を使用して、完全なＴＩＬＬＩＮＧ法の適用は、これらの遺伝子中の新たな変異を生成及び検出するため、従って、これらの特定の変異を含む植物を生成するために使用できる。例えば、完全なＴＩＬＬＩＮＧ法を使用して、特定の変異（例えば、目的の遺伝子標的を不活化する、コード配列中のミスセンス変異）を有するコーヒー植物が生成できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼ遺伝子のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ：根、Ｓ：茎、Ｌ：若葉；並びにＳＧ、ＬＧ、Ｙ及びＲｅｄはそれぞれ、小さい緑の果実、大きい緑の果実、黄色い果実及び赤い果実由来の粒である。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。ＭＷはＲＮＡサイズラダーである。パネルＢは、試験した組織中のＣｃＣＰ−１ ｍＲＮＡの出現を示す、２４時間の露光後のオートラジオグラムを示し、パネルＡは、ブロッティング前のゲルのエチジウムブロマイド染色を実証する。
【図２】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−１遺伝子の発現のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーの粒から単離されたＲＮＡに対応し、ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）で標識されたレーンはそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーの果皮組織から単離されたＲＮＡに対応する。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。パネルＡは、ローディングコントロールとしてのブロッティング前の大きいリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を実証し、パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＣＰ−１ ｍＲＮＡの出現を示すオートラジオグラムである。
【図２Ａ】ＣｃＣＰ−１ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の完全配列と、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能な他の全長システインプロテイナーゼとのアラインメントの図である。これは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のＣＬＵＳＴＡＬ法によって、Ｍｅｇａｌｉｇｎにおいて実施した。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号は括弧内に与えられる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＹ０７００６３）；Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ（Ｚ９９１７２）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＧＭＣＰ３（Ｚ３２７９５）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＧｍＰＭ３３（ＡＦ１６７９８６）；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｍｏｌｄａｖａｉｎ（Ｚ９９９５５）；Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ＡＦ０８２１８１）；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（ＡＪ２４２９９４）；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｚ１４０２８）；Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ（ＡＹ１６１２７７）。
【図３】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼインヒビター（ＣｃＣＰＩ−１）遺伝子のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ：根、Ｓ：茎、Ｌ：若葉；並びにＳＧ、ＬＧ、Ｙ及びＲｅｄはそれぞれ、小さい緑の果実、大きい緑の果実、黄色い果実及び赤い果実由来の粒について。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。ＭＷはＲＮＡサイズラダーである。パネルＢは、２４時間の露光後のオートラジオグラムを示し、パネルＡは、ブロッティング前のゲルのエチジウムブロマイド染色を実証する。
【図４】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（ＡＲＡ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ（ＲＯＢ）の果実の異なる発達段階におけるシステインプロテイナーゼインヒビター（ＣｃＣＰＩ−１）遺伝子のノザンブロット分析を示す図である。レーンは、小さい緑の果実（ＳＧ）、大きい緑の果実（ＬＧ）、黄色い果実（Ｙ）及び赤い果実（Ｒｅｄ）でそれぞれ標識される。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。ＭＷはＲＮＡサイズラダーである。パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＣＰＩ−１ ｍＲＮＡの出現を示す、２４時間の露光後のオートラジオグラムを示す。パネルＡは、ブロッティング前のゲルのエチジウムブロマイド染色を実証する。
【図５】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ粒の出芽の間のＣｃＣＰ−１の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１００希釈した各ｃＤＮＡ１０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、６１℃で１．５分間及び７２℃で２．５分間）×３５サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、A4-43-upper:5'-ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG-3'、A4-43-lower:5'-ACGCTTCCCCCATGAGTTCTTGA-3'であった。ｍＲＮＡを、異なるテンプレート（それぞれ、滅菌した種子（Ｔ０）並びに出芽の２日後（２ｄ）、３日後（３ｄ）、５日後（５ｄ）、１ヵ月後（１ｍ）及び２ヵ月後（２ｍ）に採取した種子由来のｃＤＮＡ）に対して特異的プライマー（ＣｃＣＰ−１ ｕｐ／ＣｃＣＰ−１ ｌｏｗ）を使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲ産物を、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。ＲＰＬ３９；６０Ｓリボソーム大サブユニットのＬ３９タンパク質をコードするｃＤＮＡの増幅されたフラグメント。
【図６】ＣｃＣＰ１タンパク質の発現のウエスタンブロット分析を示す図である（Ａ）。総タンパク質を、小さい緑（ＳＧ）、大きい緑（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤（Ｒｅｄ）の段階の、発達中のコーヒーチェリーから収集した粒（ｇ）及び果皮（ｐ）から抽出した。パネルＢ−クマシーブルーで染色した１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での５０μｇの総タンパク質の分離。パネルＡ−タンパク質検出を、これらの方法において記載されるように、抗ＣＲＰ４ポリクローナル抗体（ウサギ）を使用して実施した。パネルＢ中のバンドのおおよそのサイズを左側に矢印で示す。各パネル内の大きい矢印は、これらの抗体のうち１つと交差反応する主要な貯蔵タンパク質の存在を示す。
【図６Ａ】ＣｃＣＰＩ−１ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ＡＡＯ１８６３８；４２．３％の同一性）、Ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（ＪＥ０３０８；４１．５％の同一性）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６４９８５；３０％の同一性）及びＲｕｍｅｘ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｓ（ＣＡＤ２１４４１；２９．３％の同一性）。
【図７】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２（Ａ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ ＦＲＴ−３２（Ｂ）の異なる組織におけるＣｃＣＰＩ−１遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１０００希釈した各ｃＤＮＡ １０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で１分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、CcCPI-1(up)5'AGGAAAGTGGGAGCAAGGGAGAAGA3'、CcCPI-1(low)5'TAGTATGAACCCAAGGCCGAACCAC3'.であった。レーンは以下のように標識される：Ｍ、マーカー；＋Ｐ、ＣｃＣＰＩ−１遺伝子を含む希釈したプラスミド；Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。
【図８】ＣｃＣＰＩ−２ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｒｕｍｅｘ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｓ（ＣＡＤ２１４４１；６６．７％の同一性）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（ＡＡＫ３０００４；７１．７％の同一性）、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（ＡＡＦ７２２０２；６５．２％の同一性）。
【図９】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２（Ａ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ ＦＲＴ−３２（Ｂ）の異なる組織におけるＣｃＣＰＩ−２遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１０００希釈した各ｃＤＮＡ１０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、５７℃で１．５分間及び７２℃で１分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、CcCPI-2(up)5'GTGAAGCCATGGTTGAACTT3'、CcCPI-2(low)5'GTAATGATACCTCAAGCCAGA3'.であった。レーンは以下のように標識される：Ｍ、マーカー；＋Ｐ、ＣｃＣＰＩ−２遺伝子を含む希釈したプラスミド；Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。
【図１０】ＣｃＣＰＩ−３ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ（ＡＡＧ３８５２１；４２．４％の同一性）、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ（ＡＡＲ９２２２３；４４．４％の同一性）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６４６６１；４４％の同一性）。
【図１１】ＣｃＣＰＩ−４ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ（ＡＡＧ３８５２１；２３．６％の同一性）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６４６６１；２０％の同一性）。
【図１２】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２（Ａ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ ＦＲＴ−３２（Ｂ）の異なる組織におけるＣｃＣＰＩ−４遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１００希釈した各ｃＤＮＡ１０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で１分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、CcCPI-4(up)5'CTACGGTCGCAGCCAAATC3'、CcCPI-4(low)5'ACAACTGCACCTTCAATGTAC3'.であった。レーンは以下のように標識される：Ｍ、マーカー；＋Ｐ、ＣｃＣＰＩ−４遺伝子を含む希釈したプラスミド；Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。
【図１３】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるアスパラギン酸プロテイナーゼ２（ＣｃＡＰ２）遺伝子のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ：根、Ｓ：茎、Ｌ：若葉；Ｆ：花；ＳＧ（Ｇ）及びＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｇ）及びＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｇ）及びＹ（Ｐ）並びにＲｅｄ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリー由来の粒及び果皮についてであり、ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリー由来の果皮についてである。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。パネルＡは、ローディングコントロールとしてのブロッティング前の大きいリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を実証し、パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＡＰ２ ｍＲＮＡの出現を示すオートラジオグラムである。
【図１４】ＣｃＣＰ−４のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。小文字：５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域；大文字：オープンリーディングフレーム；太字：アミノ酸配列；＊：終止コドン。
【図１５】ＣｃＣＰ−４ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の完全配列と、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能な他の全長システインプロテイナーゼとのアラインメントを示す図である。これは、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）中のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを使用して実施した。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。登録番号は括弧内に与えられる。Ｄａｃｕｓ ｃａｒｒｏｔａ（ＪＣ７７８７）；Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＡＦ０５０７５６）；Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ（Ｚ３４８９５）；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｘ５６７５３）；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ＡＢ１０９１８８）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｃｙｓ１（ＡＢ０９２５５５）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｃｙｓ２（ＡＢ０９２５５７）；Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（Ｐ４９０４６）；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＡＢ００４６４８）；Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ（Ｐ１２４１２）；Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ＡＪ００４９８５）。
【図１６】Ｍｅｇａｌｉｇｎ中のプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用して整列された全長ｃＤＮＡ配列ＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ及び部分的ｃＤＮＡ配列ＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）を示す図である。
【図１７】Ｍｅｇａｌｉｇｎ中のプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用して整列されたＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）の完全オープンリーディングフレーム及びＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）の部分的オープンリーディングフレームを示す図である。
【図１８】ＣｃＣＰ−４遺伝子のＫＤＥＬ／ＫＤＤＬ領域をコードするＰＣＲ増幅されたゲノムＤＮＡについてのＤＮＡ配列クロマトグラムを示す図である。Ｒｏｂはｒｏｂｕｓｔａ変種を示し、Ａｒａｂはａｒａｂｉｃａ変種を示す。
【図１９】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４遺伝子の発現のノザンブロット分析を示す図である。レーンは以下で標識される：Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。パネルＡは、ローディングコントロールとしてのブロッティング前の大きいリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を実証し、パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＣＰ−３ ｍＲＮＡの出現を示すオートラジオグラムである。
【図２０】発芽の間の粒全体におけるＣｃＣＰ−４の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。サンプリング時間は以下であった：０、滅菌処理の直後；２Ｄ、処理の２日後；３Ｄ、処理の３日後；５Ｄ、処理の５日後；１Ｍ、処理の１ヵ月後；２Ｍ、処理の２ヵ月後；−、ＤＮＡなしのコントロール；＋Ｐ、希釈したＣｃＣＰ−４プラスミドＤＮＡ；Ｍ、分子量マーカー。
【図２１】ＣｃＡＰ−１ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長アスパラギン酸プロテイナーゼ配列との最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。データベースの登録番号は括弧内に与えられる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＹ０９９６１７）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＢＡＢ０９３６６）。
【図２２】ＣｃＡＰ−２ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長アスパラギン酸プロテイナーゼ配列との最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。データベースの登録番号は括弧内に与えられる。Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＢＡＢ６４２９６）、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ（ＡＡＫ４８４９４）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｓ７１５９１）及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ（ＢＡＢ２０９７２）。
【技術分野】
【０００１】
コーヒーは、フレーバー分子の高度に複雑な混合物を含む。インスタント及び新鮮な粉砕されたコーヒー飲料の組成についての広範な研究は、今日までに８５０を超える化合物を同定しており、これらのうち多くがフレーバー活性分子である（Ｆｌａｍｅｎｔ，Ｉ（２００２）、コーヒーフレーバー化学（Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＵＫ）。しかし、１杯のコーヒー中に見出される最終コーヒーフレーバー分子は、原材料（植物種Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ又はＣｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（ｒｏｂｕｓｔａ）の緑の粒（緑の豆））中にはほとんど存在しない。実際、コーヒーフレーバー化合物の大多数は、熟した赤いコーヒーチェリーの収穫から最終的な焙煎され粉砕されたコーヒー製品又はその抽出物（例えば、可溶性コーヒー製品）までに生じる複数の加工ステップの１つ又は複数の間に生成される。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーの生産における種々のステップが、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｗ．、コーヒー；第１巻：化学（Ｃｏｆｆｅｅ；Ｖｏｌｕｍｅ １：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１−４１頁、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ｊ．及びＭａｃｒｅａ，Ｒ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｃｌａｒｋｅ，Ｒ．Ｊ．、コーヒー：植物学、生化学並びに豆及び飲料の生産（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅａｎｓ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ）、２３０−２５０頁及び３７５−３９３頁；並びにＣｌｉｆｆｏｒｄ，Ｍ．Ｎ．及びＷｉｌｌｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．編、Ｃｒｏｏｍ Ｈｅｌｍ Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ中に記載されている。簡潔に述べると、このプロセスは、成熟して熟した赤いチェリーの収集で開始される。次いで、最も外側の層（すなわち果皮）が、乾式プロセス又は湿式プロセスのいずれかを使用して除去できる。乾式プロセスは最も単純であり、以下を含む：１）チェリーの等級分け（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び洗浄；２）等級付け（ｇｒａｄｉｎｇ）後のチェリーの乾燥（空気乾燥又は機械的乾燥のいずれか）、及び３）乾燥した果皮を除去するための乾燥したチェリーの脱穀（ｄｅｈｕｓｋｉｎｇ）。湿式プロセスは僅かにより複雑であり、より高い品質の緑の豆の生産を一般に導く。湿式プロセスは、Ｃ．ａｒａｂｉｃａチェリーとより頻繁に関連する。湿式プロセスは以下からなる：１）チェリーの等級分け、２）チェリーの脱肉（パルピング）（このステップは、収穫直後に実施され、一般に、成熟チェリーの「パルプ」すなわち果皮の機械的除去を含む）、３）脱肉後にチェリーの粒に付着したままの粘液が、バッチプロセスを使用して粒＋付着した粘液をタンク中で水と共にインキュベートさせることによって除去される、「発酵」。この「発酵」プロセスは８０時間まで継続されるが、発酵、４）乾燥（このステップは、発酵したコーヒー粒の空気乾燥又は機械的な熱気乾燥のいずれかを含む）及び５）「ハリング（ｈｕｌｌｉｎｇ）」（このステップは、乾燥したコーヒー粒（乾燥したパーチメントコーヒー）の「パーチ（ｐａｒｃｈ）」の機械的除去を含み、シルバースキン（銀皮）もまたしばしばこの段階で除去される）の間に増殖する微生物の種々の酵素活性及び代謝作用に起因して、しばしば２４時間が、受容可能な発酵を可能にしかつ約６．８〜６．９から４．２〜４．６までｐＨを低下させるのに一般に充分である。湿式加工又は乾式加工の後に、得られた緑のコーヒー粒はしばしば分類され、ほとんどの分類手順は、粒のサイズ及び／又は形状に基づく。
【０００３】
コーヒー加工における次のステップは、乾式加工したコーヒー又は湿式加工したコーヒーそれぞれの、脱穀（ｄｅｈｕｓｋｉｎｇ）又は脱穀（ｄｅｈｕｌｌｉｎｇ）後の緑の粒の焙煎である。これは、豆における有意な化学変化を誘導する時間依存的なプロセスである。焙煎の第１段階は、供給された熱が粒中に残留する水を追い出す場合に生じる。水の大部分がなくなると、温度が１９０℃〜２００℃まで上昇して、適切な焙煎が開始される。豆の発色によって通常モニタリングされる焙煎の程度は、最終飲料製品のフレーバー特徴を決定するのに主要な役割を果たす。従って、焙煎の時間及び温度は、所望のコーヒーフレーバープロフィールを達成するために厳密に制御される。焙煎後、コーヒーは、コーヒー飲料又はコーヒー抽出物（後者は、インスタントコーヒー製品を製造するために使用される）の生産の間の抽出を容易にするために粉砕される。再度、粉砕のタイプは、飲料の最終的なフレーバーに影響を与え得る。
【０００４】
かなりの量の研究がコーヒー中のフレーバー分子の同定について実施されているが、加工ステップの各々の間にコーヒー粒内で生じる物理反応及び化学反応に関して実施された研究はかなり少ない。この後者の点は焙煎反応について特に明白であり、多数の粒の成分が、熱により誘導される反応の非常に複雑な連続を経る（Ｈｏｍｍａ，Ｓ．２００１、「コーヒー：新事情（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」．Ｒ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ及びＯ．Ｇ．Ｖｉｔｚｔｈｕｍ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｙｅｒｅｔｚｉａｎ，Ｃ．ら（（２００２）Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２１４、９２−１０４；Ｆｌａｍｅｎｔ，Ｉ（２００２）、コーヒーフレーバー化学（Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＵＫ；Ｒｅｉｎｅｃｃｉｕｓ，Ｇ．Ａ．、「メイラード反応及びコーヒーフレーバー（Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ）」Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＡＳＩＣ、１６ｔｈ Ｃｏｌｌｏｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ １９９５）。
【０００５】
コーヒー加工の異なるステップの間に生じる反応のほとんどの詳細は比較的不明のままであるが、コーヒーの芳香に関連するフレーバーの多数を担う重要なフレーバー生成反応は、コーヒー焙煎の間の「メイラード」反応であると考えられている。活発なメイラード反応は、焙煎ステップの間に、粒の還元糖／多糖分解産物とアミノ基含有分子（特に、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸）との間で生じる。
【０００６】
メイラード反応は、コーヒー焙煎の間のコーヒーのフレーバー分子及び芳香分子の生成に重要な貢献を明らかに果しているので、緑の豆中の１次メイラード反応のレベルと焙煎後に発生したフレーバー／芳香の品質との間には関連性がある可能性がある。
【０００７】
上記のように、メイラード反応における基質の重要な群は、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質である。２次元電気泳動を使用して、ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの緑のコーヒー豆中の主要な貯蔵タンパク質のレベル及び量に差異が存在することが示されている。しかし、これらの保存タンパク質の差異とフレーバーの品質との間の関連性は注目されていない（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３７巻、２６１−２７２）。未熟なコーヒー豆と成熟したコーヒー豆（これらは異なるフレーバー品質を有する）との間には貯蔵タンパク質に小さい差異が存在することもまた、最近見出された（Ｍｏｎｔａｖｏｎ，Ｐ．ら、２００３、Ｊ．Ａｇｒｉｃ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第５１巻、２３２８−２３３４）。種子の成熟の間には多数の変化が生じるので、この後者の研究は、成熟によって引き起こされる品質の改善と主要なコーヒーの貯蔵タンパク質の２次元ゲルパターンにおいて見られる差異との間に関連性が存在し得ることを示唆している。
【０００８】
ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの緑の豆から単離されたペプチドのプロフィールにおいて差異が存在することが最近示された（Ｌｕｄｗｉｇら、２０００、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第２１１巻、１１１−１１６）。これらの結果は、ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａのペプチド抽出物がその芳香前駆体プロフィールにおいて異なることを示しているが、この報告中に示されるデータは、抽出物中のどの成分がこれらの芳香プロフィールの差異を担うかを同定していない。これらの研究者はまた、緑のコーヒーの粗製抽出物中に少なくとも２つの異なるプロテイナーゼ活性を検出したが、彼らは、いずれの比活性をも芳香／フレーバーの品質と相関させなかった（Ｌｕｄｗｉｇら、２０００、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第２１１巻、１１１−１１６）。最後に、緑のコーヒー粒の焙煎の後期段階の間に使用される非常に高い温度は、このコーヒー粒中に存在するタンパク質の引き続く切断を引き起こすとも考えられている（Ｈｏｍｍａ，Ｓ．２００１、「コーヒー：新事情（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」．Ｒ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ及びＯ．Ｇ．Ｖｉｔｚｔｈｕｍ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｏｎｔａｖｏｎ，Ｐ．ら、２００３、「焙煎の間の緑のコーヒーのタンパク質プロフィールの変化（Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｃｏｆｆｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｏａｓｔｉｎｇ）」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５１、２３３５−２３４３）。しかし、このタンパク質分解についての全体的スキームは非常に不十分にしか理解されていないが、これはとりわけ、焙煎の開始前の原材料中の主要なコーヒータンパク質の正確な状態におそらく依存する。本発明者らが知る限り、コーヒー中のペプチドプロフィールがコーヒーの芳香／フレーバーの生成に関与する可能性を扱っている他の有意な報告は存在しない。
【０００９】
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（カカオ豆）の発酵した種子の焙煎において、メイラード反応の芳香／フレーバーの発生には、種子のアミノ酸及びペプチドが関与するようである。他の種子と比較すると、Ｔ．ｃａｃａｏの種子は、異常に高いレベルのアスパラギン酸プロテイナーゼ活性を有することが示されている（Ｂｉｅｈｌ，Ｂ．、Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．、Ｖｏｉｇｔ，Ｇ．、Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ，Ｈ．、Ｓｅｎｙｕｋ，Ｖ．及びＢｙｔｏｆ，Ｇ．（１９９４）「生のカカオ豆における芳香前駆体であるオリゴペプチド及びアミノ酸のｐＨ依存的な酵素的形成（ｐＨ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｔｈｅ ａｒｏｍａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｉｎ ｒａｗ ｃｏｃｏａ ｂｅａｎｓ）」．Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｃｏａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９３年７月１８日〜２４日、Ｙａｍｏｕｓｓｏｕｋｒｏ、Ｉｖｏｒｙ Ｃｏａｓｔ）。高レベルのココアフレーバー前駆体を有するカカオ豆を生産するために、天然の発酵ステップを実施することが必要である（未発酵の豆は、焙煎したときにほとんどフレーバーを発生させない）。この発酵ステップの間に、パルプ中の糖が発酵し、高レベルの酸（特に酢酸）を生成する（Ｃａｒｒ，Ｊ．Ｇ．（１９８２）ココア−発酵食品−経済学的微生物学（Ｃｏｃｏａ．Ｉｎ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ Ｆｏｏｄｓ．Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．）第７巻．２７５−２９２頁．（Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ編）．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。発酵が継続するにつれて種子中のｐＨは低下し、細胞構造が破壊される。低いｐＨは、豊富なカカオ種子のアスパラギン酸プロテイナーゼを起動及び／又は活性化させ、細胞性タンパク質の大量分解を生じる（Ｂｉｅｈｌ，Ｂ．、Ｐａｓｓｅｒｎ，Ｄ．及びＳａｇｅｍａｎｎ，Ｗ．（１９８２）「カカオ豆子葉の細胞内構造に対する酢酸の影響（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｃｏａ Ｂｅａｎ Ｃｏｔｙｌｙｄｏｎｓ）」．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．３３、１１０１−１１０９；Ｂｉｅｈｌ，Ｂ．、Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｅ．、Ｐａｓｓｅｒｎ，Ｄ．、Ｑｕｅｓｎｅｌ，Ｖ．Ｃ．及びＡｄｏｍａｋｏ，Ｄ．（１９８５）「カカオ豆の発酵における酸性化、タンパク質分解及びフレーバー潜在能力（Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｕｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｃｏｃｏａ ｂｅａｎｓ）」．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．３６、５８３−５９８）。ペプチド及びアミノ酸は、ココアフレーバー前駆体であることが示されている（Ｒｏｈａｎ，Ｔ．（１９６４）「チョコレート芳香の前駆体：発酵したカカオ豆及び未発酵のカカオ豆の比較研究（Ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｒｏｍａ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｃｏｃｏａ ｂｅａｎｓ）」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．、２９、４５６−４５９；Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．及びＢｉｅｈｌ，Ｂ．（１９９５）「ココア特異的芳香成分の前駆体は、タンパク質分解加工によってココア種子のビシリンクラス（７Ｓ）グロブリンから誘導される（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｏｍａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｃｉｌｉｎ−ｃｌａｓｓ（７Ｓ）ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｂｏｔ．Ａｃｔａ １０８、２８３−２８９）。従って、Ｔ．ｃａｃａｏ種子のアスパラギン酸プロテイナーゼは、種子のセリンカルボキシペプチダーゼと共に、発酵の間のココアフレーバー前駆体の生成に重要であることが提唱されている（Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．及びＢｉｅｈｌ，Ｂ．（１９９５）「ココア特異的芳香成分の前駆体は、タンパク質分解加工によってココア種子のビシリンクラス（７Ｓ）グロブリンから誘導される（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｏｍａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｃｉｌｉｎ−ｃｌａｓｓ（７Ｓ）ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｃｏａ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｂｏｔ．Ａｃｔａ １０８、２８３−２８９；Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．、Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ，Ｈ．、Ｖｏｉｇｔ，Ｇ．及びＢｉｅｈｌ，Ｂ．（１９９４）「ココア特異的芳香前駆体は、ココア種子のビシリン様グロブリンのタンパク質分解消化によって生成される（Ｃｏｃｏａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｏｍａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｃｉｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｏｆ ｃｏｃｏａ ｓｅｅｄｓ）」．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５０、１７７−１８４）。豊富なココア種子のアスパラギン酸プロテイナーゼをコードする遺伝子が同定されており、発酵したカカオ豆中のココアフレーバー前駆体のアミノ酸及びペプチドのレベルを増大させることができる、カカオ種子中でこのタンパク質を過剰発現させる方法は、国際特許公開第０２／０４６１７号（この全内容は、本明細書中に参照として組み込まれる）中に最近記載された。しかし、国際特許公開第０２／０４６１７号の教示は、酸発酵ステップを受けないコーヒー粒とは異なり、特定の長さの酸発酵ステップを受けるカカオ種子に関するものである。
【００１０】
重要な液胞システインプロテイナーゼ（ＣＰ）は、ＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼである。このタイプのプロテイナーゼは、いくつかの植物において特徴付けられている。今日まで、Ｃ末端ＫＤＥＬ配列を有するシステインプロテイナーゼをコードする３つの遺伝子がａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて見出されている（Ｇｉｅｔｌ，Ｃ．及びＳｃｈｍｉｄ，Ｍ．２００１、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ８８、４９−５８）。１つは成熟中の胚珠中で発現され、１つは導管中で発現され、３番目は成熟中の長角果において発現される。しかし、このタンパク質についてのより詳細な研究は、他の植物において実施されてきた。例えば、スルフヒドリル−エンドプロテイナーゼ（ＳＨ−ＥＰ）と称されるＣＰが、Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ種子の子葉において特徴付けられている（Ｔｏｙｏｏｋａ，Ｋ．、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．及びＭｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．（２００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４８、４５３−４６３）。ＳＨ−ＥＰは、Ｖ．ｍｕｎｇｏの発芽中の子葉において新たに発現され、タンパク質貯蔵液胞中に蓄積した貯蔵タンパク質の分解に関与すると提唱されている（Ｏｋａｍａｔｏ，Ｔ及びＭｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２、６７５−６８２）。ＳＨ−ＥＰポリペプチドの重要な特徴は、小胞体（ＥＲ）からタンパク質貯蔵液胞までのこのタンパク質の輸送を指図する特異的ＣＯＯＨ末端配列ＫＤＥＬをこれが保有することである（Ｔｏｙｏｏｋａら、２０００）。このＳＨ−ＥＰタンパク質は、そのＫＤＥＬ配列の存在を介して、以前に記載されていない小胞輸送システムにおけるＫＶ（ＫＤＥＬ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と称される特定の小胞の形成に実際に関与することもまた、最近提唱されている（Ｏｋａｍａｔｏ，Ｔ．、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．、Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．及びＭｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１３２、１８９２−１９００）。
【００１１】
関連の提案が、発芽中のトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の実の子葉において見出されたＫＤＥＬ含有ＣＰタンパク質についてなされている。この植物において、著者らは、内胚乳のプログラム細胞死において、発芽中のトウゴマの実の胚に栄養を供給し続けるＫＤＥＬプロテイナーゼを示している（Ｇｉｅｔｌ，Ｃ．及びＳｃｈｍｉｄ，Ｍ．２００１、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ８８、４９−５８）。これらの著者らは、トウゴマの実において、このＫＤＥＬプロテイナーゼが３日目の前に発芽中の種子のＥＲにおいて作製されることを提唱している。種子の皮が脱げると、３日目付近で、ＫＤＥＬ含有ＣＰは、リシノソーム（ｒｉｃｉｎｏｓｏｍｅ）と称される特定の小胞中に詰め込まれる。後に、内胚乳が４日目〜５日目の間に軟化するにつれて、ＫＤＥＬ−ＣＰは、そのアンカー配列（ＫＤＥＬ）が切断して除かれ、このプロテイナーゼは、細胞性タンパク質の全般的な分解においてそれが補助する場所である細胞質に移動する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、コーヒー中のタンパク質／ペプチド／アミノ酸のフレーバー前駆体プールを改変することである。
【００１３】
より具体的には、本発明の目的は、収穫後の処理及び焙煎加工の後に変更されたフレーバーが達成できるように、原材料（緑の粒）中のフレーバー前駆体のレベルを改変することである。理論によって束縛されないが、有意に異なるフレーバーを有するコーヒー間のペプチド及びタンパク質の分解のレベルにバリエーションが存在する場合、これらのバリエーションは、これらの異なる粒中の内因性プロテイナーゼ活性の差異に起因することがあると考えられる。この差異は、特定の種子プロテイナーゼ遺伝子についての発現レベルのバリエーションによって、ｍＲＮＡ発現のレベルで検出可能である場合がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って本発明は、コーヒー粒（種子）特異的プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を同定すること、並びにａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるこれらの遺伝子の発現にバリエーションが実際に存在することを示すことを含む。
【００１５】
より具体的には、本発明は、２つの主要なコーヒーシステインプロテイナーゼ（ＣｃＣＰ−１及びＣｃＣＰ−４）、４つの主要なコーヒーシステインプロテイナーゼインヒビター（ＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＣＰＩ−２、ＣｃＣＰＩ−３及びＣｃＣＰＩ−４）並びに２つのコーヒーアスパラギン酸プロテイナーゼ（ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２）を開示し、これらは全てコーヒーの種子中で発現される。本発明者らは、種子発達における特に後期のこれらのタンパク質の過剰発現又は後期種子発達の間のこれらのタンパク質の低下した発現のいずれかが、成熟豆のアミノ酸／ペプチド／タンパク質のプロフィールを如何に変更できるかをさらに示す。成熟豆のアミノ酸／ペプチド／タンパク質のプロフィールを変更するために開示された遺伝子配列及び遺伝子構築物の１つ又は複数を使用することによって、本発明者らは、成熟コーヒー豆のフレーバー前駆体プロフィールを変更するための新たな方法を開示する。
【００１６】
第１の態様において、本発明は、システインプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２又は１６から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、この相補体はこのヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、この相補体とこのヌクレオチド配列とは１００％相補的である。好ましくは、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２又は１６のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号１又は１５のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号２又は１６のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
第２の態様において、システインプロテイナーゼインヒビター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、この相補体はこのヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、この相補体とこのヌクレオチド配列とは１００％相補的である。好ましくは、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号３、９、１１又は１３から、任意選択で配列番号９、１１又は１３から、さらに任意選択で配列番号９又は１３から選択される；なおさらに任意選択で配列番号９であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号４、１０、１２及び１４から、任意選択で配列番号１０、１２及び１４から選択される、さらに任意選択で配列番号１０又は１４から；なおさらに任意選択で配列番号１０であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
第３の態様において、アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８、好ましくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、この相補体はこのヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、この相補体とこのヌクレオチド配列とは１００％相補的である。好ましくは、このポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８、好ましくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号５又は７、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号６又は８、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらなる態様において、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２０】
さらなる態様において、調節配列に作動可能に連結された本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物が提供される。この非ネイティブの構築物において、このポリヌクレオチドが非ネイティブであるか、調節配列が非ネイティブであるか、又は両方が非ネイティブであるかのいずれかであることが理解される。
【００２１】
さらなる態様において、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換するステップを含む、細胞を形質転換するための方法が提供される。
【００２２】
さらなる態様において、上記の非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物を含む細胞が提供され、この細胞は好ましくは、原核細胞、真核細胞又は植物細胞、好ましくはコーヒー細胞である。
【００２３】
さらなる態様において、このような形質転換された細胞を含むトランスジェニック植物が提供される。
【００２４】
本願において、コーヒーチェリーとの用語は以下のように規定される：コーヒーチェリー；果実全体；外果皮、皮；果皮、チェリーの多肉質の主要な外側層；及び粒、コーヒーの種子。これらの用語のより完全な説明については、Ｃｌａｒｋｅ，Ｒ．Ｊ．、コーヒー：植物学、生化学並びに豆及び飲料の生産（Ｃｏｆｆｅｅ：Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅａｎｓ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ）、２３０頁、Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｍ．Ｎ．及びＷｉｌｌｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．編、Ｃｒｏｏｍ Ｈｅｌｍ Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ（その内容は、その全体が参照として組み込まれる）を参照のこと。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、以下の詳細な説明及び本願の一部をなす添付の配列表から理解できる。
【００２６】
表１は、添付の表において使用される通りの対応する配列同定子（配列番号）と共に、本明細書中に記載されるポリペプチドを本明細書中以下に列挙する。
【００２７】
表１：
配列番号１（ＣｃＣＰ１：システインプロテイナーゼ、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号２（ＣｃＣＰ１：システインプロテイナーゼ、アミノ酸）
配列番号３（ＣｃＣＰＩ−１：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号４（ＣｃＣＰＩ−１：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号５（ＣｃＡＰ１：アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ１、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号６（ＣｃＡＰ１：アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ１、アミノ酸）
配列番号７（ＣｃＡＰ２：アスパラギン酸プロテイナーゼ２、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号８（ＣｃＡＰ２：アスパラギン酸プロテイナーゼ２、アミノ酸）
配列番号９（ＣｃＣＰＩ−２：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１０（ＣｃＣＰＩ−２：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号１１（ＣｃＣＰＩ−３：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１２（ＣｃＣＰＩ−３：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号１３（ＣｃＣＰＩ−４：システインプロテイナーゼインヒビター、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１４（ＣｃＣＰＩ−４：システインプロテイナーゼインヒビター、アミノ酸）
配列番号１５（ＣｃＣＰ−４：システインプロテイナーゼ、核酸及びその対応するアミノ酸）
配列番号１６（ＣｃＣＰ−４：システインプロテイナーゼ、アミノ酸）
【００２８】
この配列表は、ヌクレオチド配列特徴について１文字コードを使用し、アミノ酸について、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Ｓｔａｎｄａｒｄｓのために規定され、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：３０２１−３０３０（１９８５）（これは、本明細書中に参照として組み込まれる）中に記載されるような３文字コードを使用する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、核酸フラグメントのようなヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の任意選択で合成、非天然又は変更されたヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそれらの混合物の１つ又は複数のセグメントを含んでもよい。
【００３０】
本発明において、当業者に一般に使用されるアルゴリズムによって決定されるような、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対する、類似の核酸フラグメントがコードするアミノ酸配列の％同一性によって、この類似の核酸フラグメントが特徴付けられる。適切な核酸フラグメント（すなわち、本発明の第１の態様〜第３の態様に記載の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。本明細書中に開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントが、なおより好ましい。複数の配列アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ法のアラインメントを使用して実施されるべきである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、４６７３−４６８０頁；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ １９８９ Ｃａｂｉｏｓ．５：１５１−１５３）。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「類似の核酸フラグメント」とは、１つ又は複数のヌクレオチド塩基の変化が１つ又は複数のアミノ酸の置換を生じるが、その変化がこのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能に影響を与えないか、又は例えばアンチセンス技術若しくは同時発現技術を介した遺伝子サイレンシングによって核酸フラグメントが遺伝子発現を媒介する能力に影響を与えないかのいずれかである、ポリヌクレオチド配列をいう。用語「類似の核酸フラグメント」とはまた、１つ又は複数のヌクレオチド塩基が欠失又は挿入された改変ポリヌクレオチド配列をいい、但しこの改変は、このヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能に影響を与えないか、又は遺伝子サイレンシングによって核酸フラグメントが遺伝子発現を媒介する能力に影響を与えないかのいずれかである。従って、本発明の範囲が、本明細書中に具体的に開示されたポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を超えて広がることが理解される。類似の核酸フラグメントは、植物又は植物細胞中の改変核酸フラグメントによってコードされるポリペプチドのレベルに影響を与えるそれらの能力について、部分フラグメント又は改変核酸フラグメントの形態の核酸フラグメントをスクリーニングすることによって選択できる。
【００３２】
用語「作動可能に連結された」とは、一方の核酸フラグメントの機能が他方の核酸フラグメントによって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する２つ以上の核酸フラグメントの結合をいう。「調節配列」とは、コード配列の上流、その内部又はその下流に位置し、それに結合したコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、転写終結配列及びポリアデニル化認識配列が含まれてもよい。プロモーターの形態の調節配列がコード配列に作動可能に連結される場合、この調節配列は、コード配列の発現に影響を与えることがある。コード配列は、センス又はアンチセンスの配向で、調節配列に作動可能に連結できる。
【００３３】
用語「発現」とは、本発明の核酸フラグメント由来のセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積をいう。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。過剰発現とは、正常細胞すなわち形質転換されていない細胞における産生レベルを超える、トランスジェニック細胞における遺伝子産物の産生をいう。「変更されたレベル」とは、正常細胞すなわち形質転換されていない細胞のものとは異なる量又は割合の、トランスジェニック細胞における遺伝子産物の産生をいう。
【００３４】
「形質転換」とは、遺伝的に安定な継承を生じる、宿主細胞のゲノムへの核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は、本明細書中で「トランスジェニック細胞」と称される。
【００３５】
本明細書中で使用されるような標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は当該分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９（これは、本明細書中に参照として組み込まれる）中により完全に記載されている。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本発明をこれらの実施例に限定することなく、本発明を例示する。これらの実施例において、他のように特定されない限り、全ての部及び百分率は重量により、度数はセルシウスである。
【００３７】
以下の実施例において、これらの略号が使用されている：
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅
【００３８】
上記の考察及び下記の実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の範囲から逸脱することなく本発明の本質的な特徴を様々に変化及び改変して、本発明を所望に応じて種々の用途及び条件に適合させることができる。
【００３９】
ｃＤＮＡライブラリーの生成及びスクリーニング
種子特異的ＲＮＡの生成
Ｒｏｂｕｓｔａ変種Ｑ１２１のコーヒーチェリーを、ＩＣＣＲＩ（インドネシア）において３０ＷＡＦ（開花後の週）で収穫した。次いで、これらのチェリーの果皮を除去し、残留する外胚乳／内胚乳材料を凍結し、液体窒素中で粉末になるまで粉砕した。ＲＮＡを、カカオ種子のＲＮＡ抽出のための以前に記載された方法を使用して、この凍結粉末材料から抽出した（Ｇｕｉｌｌｏｔｅａｕ，Ｍ．ら、２００３、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ種子中の油体：１５．８ｋＤａ及び１６．９ｋＤａのオレオシンをコードするｃＤＮＡのクローニング及び特徴付け（Ｏｉｌ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ ｓｅｅｄｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ １５．８ ａｎｄ １６．９ ｋＤａ ｏｌｅｏｓｉｎｓ）．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１６４巻、５９７−６０６）。ポリＡ＋ＲＮＡを、ＡＭＢＩＯＮ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．製）の「ＰｏｌｙＡ Ｐｕｒｉｓｔ（商標）」キットをキットの指示書に従って使用して、約２５０μｇの総ＲＮＡから調製した。
【００４０】
種子ｃＤＮＡクローンの第１セットの生成
次いで、約５０ｎｇ〜１００ｎｇのこのポリＡ＋ＲＮＡを、「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ（商標））及び以下のようなＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成において使用した。２μｌの３０ＷＡＦ ポリＡ＋ＲＮＡ、１μＬのＣＤＳオリゴ（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１μＬのＳｍａｒｔ ＩＩオリゴ（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び８μＬの脱イオンＨ２Ｏを含む反応。この混合物を７２℃で５分間加熱し、次いで氷上に置いた。次いで以下を添加した；１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（商標）第１鎖緩衝液及び２μＬのＤＴＴ。この混合物を４２℃で２分間置き、次いで１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（商標）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（２００単位／μＬ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（商標））を添加し、この混合物を空気循環インキュベータ中で４２℃でさらに５０分間インキュベートした。
【００４１】
逆転写反応後、以下のＰＣＲ反応を実施した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ ＰＣＲキット、ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を含むＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に記載される９８μＬのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘを氷上に設置し、次いで３μＬの上記第１鎖ｃＤＮＡ合成反応を添加した。次いで、この１００μＬのＰＣＲ反応を、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１５０ ＨＢ装置中に配置し、以下のＰＣＲ条件を実施した：９５℃で１分間、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で６分間）×１６サイクル。増幅されたＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を供給者の指示に従って使用して精製した。次いで、５０μＬの脱イオン水中に溶出されたＤＮＡを、以下のようなＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に含まれるＰｆｕ−１ポリメラーゼ試薬を使用して「研磨」した；５０μＬのＤＮＡ、５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、６．５μＬの１０×Ｐｆｕ−１研磨緩衝液、５μＬのクローニングされたＰｆｕ−１ ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌ）。次いでこの反応を、加熱されたカバーを有するＰＣＲ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で７２℃で３０分間インキュベートした。ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に記載されるプロトコルを使用して、研磨した（平滑化した）ＰＣＲ産物を、Ｓｒｆ−１酵素の存在下でＳｒｆ−１消化したｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクター中に連結し、この連結反応産物を、ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ（商標）Ｋａｎ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換した。挿入配列を含むプラスミドを有する形質転換についての選択を、ＬＢ−Ａｍｐプレート並びにその表面上に広げられたＩＰＴＧ及びＸｇａｌを使用して、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ａｍｐキット中に記載されるように実施した。白色コロニーを選択し、これらのクローンをＤａｖｌ−１などと命名した。
【００４２】
サイズ選択されたｃＤＮＡを有する種子ｃＤＮＡクローンの第２セットの生成
種子は、少数のタンパク質（例えば、種子の貯蔵タンパク質）を高度に発現する（Ｗｈｉｔｅら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１２４巻、１５８２−１５９４）。ｃＤＮＡがこのような組織から調製される場合、非常に高いレベルの貯蔵タンパク質及び他の種子特異的タンパク質が、高レベルのｃＤＮＡの「重複」を導く。すなわち、生成されたｃＤＮＡ集団は、高い割合の同じｃＤＮＡを含む。コーヒー種子のｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの重複を低下させるため及び弱く発現された長いｃＤＮＡを選択的に特徴付けるために、第２のｃＤＮＡクローニングストラテジーもまた使用した。上記の逆転写酵素反応の産物を使用して、以下のＰＣＲ反応を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ ＰＣＲキット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）：３μＬの逆転写酵素反応、５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、２μＬのＰＣＲプライマー（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、３９μＬの脱イオン水及び１μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）２ポリメラーゼミックスを使用して設定した。次いで、このＰＣＲ反応を、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１５０ ＨＢ装置中に配置し、以下のＰＣＲ条件を実施した：９５℃で１分間、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で６分間）×１６サイクル。ＰＣＲの終了時に、１μＬの１０％ ＳＤＳをゲルローディング緩衝液と共に添加し、このサンプルを３７℃で１０分間加熱した。次いで、このサンプルを、エチジウムブロマイドを含まない０．７％アガロースゲル上にロードするために分割し、１０％をＤＮＡマーカーレーンの脇の小さいウェル中にロードし、他の９０％を隣接する大きい調製スケールのウェル中にロードした。このゲルを泳動した後に、サイズマーカーを有するゲル区画＋１０％反応サンプルを、エチジウムブロマイドで染色した。次いで、この染色したゲル区画をテンプレートとして使用して、このゲルの残りの未染色の（調製）部分中に存在するｃＤＮＡとは異なるサイズのＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを含むゲルスライスを生成した。示されたサイズ範囲のＰＣＲフラグメントを有する６つのゲルスライスを生成した；Ａ１Ａ（０．８ｋｂ〜１ｋｂ）、Ａ１Ｂ（１ｋｂ〜１．５ｋｂ）、Ａ２（１．５ｋｂ〜２．２５ｋｂ）、Ａ３（２．２５ｋｂ〜３．２５ｋｂ）、Ａ４（３．２５ｋｂ〜４ｋｂ）及びＡ５（４ｋｂ〜６．５ｋｂ）。
【００４３】
各ゲルスライス中のＤＮＡを、供給業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎのＱＩＡＥＸ ＩＩキットを使用してアガロースから溶出した（サンプル３Ａ、４Ａ及び５Ａについては５０℃で１０分間加熱し、サンプル１Ａ、１Ｂ及び２Ａについては室温で１０分間加熱した）。次いで、精製した二本鎖ｃＤＮＡを、３’Ｔオーバーハングを有するフラグメントを作製する以下のようなＴＡＱ酵素ミックスを用いたＰＣＲによってさらに再増幅した：３０μＬのゲル単離された二本鎖ｃＤＮＡ、５μＬの１０×ＴＡＱ緩衝液（ＴＡＱ ＰＬＵＳ精密ポリメラーゼミックスを補充したもの、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μＬの４０ｍＭ ｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、２μＬのＰＣＲプライマー（ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、０．５μＬのＴＡＱ ＰＬＵＳ精密ポリメラーゼミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び１１．５μＬの脱イオン水。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９５℃で１分間、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で１分間、７２℃で８分間）×７サイクル、次いで（９５℃で１５秒間、６５℃で１分間、７２℃で１０分間）×１サイクル。
【００４４】
次いで、生成されたＰＣＲ増幅されたＤＮＡを、ベクターｐＣＲ（商標）−ＴＯＰＯ（商標）中に連結し、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給業者によって記載される通りに使用して、ＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中にクローニングした。これらのクローンを、その単離の順番及びサイジングゲルにおけるそれらの位置によって命名した（例えば、Ａ２−１、Ａ２−２など）。
【００４５】
種子ｃＤＮＡのスクリーニング及び予備的同定
Ｄａｖ−１ライブラリーにおいて得られた白色コロニーの第１セットを、使用したクローニング部位に隣接したＴ３プライマー及びＴ７プライマーを使用して挿入配列をＰＣＲ増幅し、ゲル上のＰＣＲ増幅されたフラグメントを試験することによって、各挿入配列のサイズを最初に決定することによってスクリーニングした。
【００４６】
各白色コロニーを２００μｌの滅菌水中に再懸濁し、このうち１０μｌ〜３０μｌを、５μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、２．５μｌの２０μＭ Ｔ３プライマー、２．５μｌの２０μＭ Ｔ７プライマー、１μｌのＤＭＳＯ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び５０μｌの最終容量までのＨ２Ｏに添加した。使用したＰＣＲ反応プログラムは、９４℃で１分間、次いで（９４℃で１分間、５５℃で１．５分間及び７２℃で３．５分間）×３０サイクル、及び７２℃で７分間の最終サイクルであった。重複を低下させるために、類似のサイズのＰＣＲ挿入配列を、制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩによる消化に供した。同じＨａｅ ＩＩＩ制限パターンを有するＰＣＲフラグメントをさらに研究することはしなかった。次いで、＞５００ｂｐでありかつ独自のＨａｅ ＩＩＩ制限パターンを有したＰＣＲフラグメントを有するクローンのプラスミドを、隣接するベクター配列中にコードされた適切なＴ７配列決定プライマー又はＴ３配列決定プライマーを使用する５’末端ジデオキシ配列決定のために、Ｑｉａｗａｌｌ ８ウルトラプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することによって精製した。これらの挿入配列は方向性をもった様式でクローニングされるわけではないので、精製されたプラスミドＤＮＡのＳｃａ １消化によって各クローンの５’末端を決定することが最初に必要であった（ＣＤＳ ＳＭＡＲＴプライマーは、挿入配列の配向の決定を可能にするＳｃａ １部位を含む）。得られたＤＮＡ配列データを、プログラムＢＬＡＳＴＸ（商標）を使用してＧＥＮＥＢＡＮＫ中の非重複データベースタンパク質に対して引き続いて書き込み、各ｃＤＮＡクローンの予備的注釈を得た。
【００４７】
種子ｃＤＮＡバンクは、高レベルの重複を有する。すなわち、少数の種子ｍＲＮＡ（例えば、種子の貯蔵タンパク質をコードするｍＲＮＡ）が異常に高いレベルの発現を有し、従って、それらのｃＤＮＡは、種子ｃＤＮＡバンク中に非常に豊富である（Ｗｈｉｔｅら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１２４巻、１５８２−１５９４）。従って、コーヒー種子のｃＤＮＡを配列決定する第１ラウンドにおいて主要な重複ｃＤＮＡを同定した直後に、プレスクリーニングステップを、挿入配列のサイズ決定の前に、白色の挿入配列含有コロニーのために付加した。４つの配列が非常に高度に発現され、以下の特異的プライマーセットを、これらの重複配列の各々について作製した。
【００４８】
このプレスクリーニングステップのためのＰＣＲ反応は、以下のように実施した：滅菌Ｈ２Ｏ中の白色コロニー１０μｌ〜３０μｌ、５μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５μｌの各プライマー（２０μＭ）、１μｌのＤＭＳＯ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ １０Ｕ／μｌ）及び滅菌Ｈ２Ｏを添加して、５０μｌの最終反応総容量にした。ＰＣＲプログラムは、９４℃で１分間、次いで（９４℃で１分間、各プライマー対に特異的な温度で１．５分間、７２℃で２．５分間）×３０サイクル、その後の７２℃で７分間であった。
【００４９】
全長ｃＤＮＡ挿入配列の配列決定及び配列分析
その部分配列がプロテイナーゼ及びプロテイナーゼインヒビターに対して最初の相同性を示したｃＤＮＡクローンを、標準的なジデオキシプライマーウォーキングストラテジーを使用して、両方の鎖について完全に配列決定した。これらの配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５の下に示される。得られた全長配列を、ＢＬＡＳＴＸを使用してＧａｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースに対して再度書き込み、予備的注釈を強化した。
【００５０】
配列対の配列の同一性を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（商標）ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）中のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）モジュール中に含まれるＣｌｕｓｔａｌＷ（商標）プログラムを使用して計算した。デフォルトパラメータは以下のように選択した：（１−ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳ−Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６、Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｓ（％）３０、ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ−Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ ＩＵＢ。２−ＰＡＩＲＷＩＳＥ ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳ−Ｓｌｏｗ／Ａｃｃｕｒａｔｅ（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ−Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ−ＩＵＢ）。使用した配列は、各ｃＤＮＡ又は各ｃＤＮＡの完全ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の全長ヌクレオチド配列のいずれかであった。
【００５１】
表２：ＣｃＣＰ−１、ＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２とＧｅｎＢａｎｋの非重複タンパク質データベース中に見出される関連遺伝子及びＷＯ ０２／０４６１７号の関連遺伝子との間の、核酸配列及びアミノ酸配列の同一性の値。
【表１】
【００５２】
５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ
クローンＡ５−８１２のｃＤＮＡ挿入配列はイントロンを含むことが見出された。従って、このタンパク質のコード配列を確認するために、完全コード配列を含む新たなｃＤＮＡを単離することが必要であった。これを、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することによって達成した。５’ＲＡＣＥに使用した第１鎖ｃＤＮＡを、上記のｃＤＮＡライブラリーについてすでに記載した通りに作製した。遺伝子特異的プライマーｒＡＰ２（５’ ＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＡＡ ３’）を設計した。この配列は、Ａ５−８１２クローンのポリ（Ａ）テイルから９２ｐｂに位置する。次いで、この特異的プライマーを、以下の条件下でＰＣＲ反応においてＣＬＯＮＴＥＣＨキット中のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＵＰＭ）と共に使用した；２．５μｌの第１鎖ｃＤＮＡ産物、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１０ｍＭ）、１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、５μｌの「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ」（１０×）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｒＡＰ２（１０μＭ）及び滅菌水を添加して、５０μｌの最終容量にした。ＰＣＲサイクル条件は、（９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間及び７２℃で３分間）×２０サイクルとその後の７２℃で５分間の最終伸張反応であった。約１７００ｐｂのフラグメントが得られ、「ＣＯＮＣＥＲＴ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット」（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用してこれをゲルから切り出した。単離したフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、Ｔｏｐｏ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に形質転換した。次いで、得られたプラスミドを、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して精製し、このプラスミドの挿入配列を二本鎖配列決定した。
【００５３】
クローンＡ５−４４２（ＡＰ１）のＤＮＡは、ｃＤＮＡの５’領域を欠くことが見出された。この領域を単離するために、５’ＲＡＣＥを、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施した。ポリ（Ａ）テイルから３９６ｐｂに位置する配列特異的プライマーｒＡＰ１（５’−ＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧ−３’）を設計した。次いで、この特異的プライマーを、以下の条件下でＰＣＲ反応においてＣＬＯＮＴＥＣＨキット中のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＵＰＭ）と共に使用した；２．５μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１０ｍＭ）、１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、５μｌの「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ」（１０×）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１μｌのｒＡＰ１及び滅菌水を添加して、５０μｌの最終容量にした。ＰＣＲサイクル条件は、（９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間及び７２℃で３分間）×２０サイクルとその後の７２℃で５分間の最終伸張反応であった。約２，０００ｂｐのフラグメントが得られ、「ＣＯＮＣＥＲＴ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット」（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用してこれをゲルから切り出した。単離したフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、Ｔｏｐｏ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に形質転換した。次いで、得られたプラスミドを、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して精製し、このプラスミドの挿入配列を二本鎖配列決定した。
【００５４】
大きいＥｓｔライブラリーのためのＲＮＡ調製：
ＲＮＡを、以前に記載された方法を使用して、種々の発達段階の解剖した粒組織及び果皮組織並びに若葉から単離した。異なるＥｓｔライブラリーを生成するためのＲＮＡを調製するために使用した変種及び組織は以下の通りであった：（１）若葉、１つの変種（ＦＲＴ−３２）；（２）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の果皮（８つの異なる発達段階）；（３）１つの変種（ＦＲＴ−３１）由来のチェリー全体、受精後２２週（ＷＡＦ）；（４）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の粒、１８＋２２ＷＡＦ；（５）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の粒、３０ＷＡＦ；（６）５つの変種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ−３１、ＦＲＴ−４００、ＦＲＴ−４００１及びＱ１２１）由来の粒、４２ＷＡＦ；並びに（７）２つの変種（ＦＲＴ−３２及びＱ１２１）由来の粒、４６ＷＡＦ。
【００５５】
ｃＤＮＡクローンの生成及びＤＮＡ配列分析。
種々のＥｓｔライブラリーのためのｃＤＮＡクローンを、以下のように調製した：ポリＡ＋ｍＲＮＡを、小規模の単離のための製造業者の指示に従ってＰｏｌｙＡＴｒａｃｋ（商標）ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｓｔｅｍ ＩＶ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。次いで、精製したポリＡ＋ｍＲＮＡを使用して、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（商標）ライブラリー構築キット（カタログ番号２００４５０ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に記載されるように、λファージ中への一方向クローニングのためのｃＤＮＡを調製した。マス切り出しプロトコルは、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターからｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔファージミドを切り出すためのものであり、８０μｌのｘ−ｇａｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）及び１６μｌのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）を含む１５０ｍｍのＬＢ−アンピシリン寒天プレート上にプレートした後に白色コロニーが得られた。単一コロニーをランダムに選択して、ｃＤＮＡ挿入配列の５’末端を配列決定するために次いで使用されるプラスミドＤＮＡを生成した。
【００５６】
得られたＤＮＡ配列は、各クローンについてのＥＳＴ配列（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）を生成した。次いで、７つのライブラリー由来の全てのＥｓｔ配列データを「ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ」でクラスター化し、「ユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）」配列セットと称される独自の群の配列を生成した。従って、各「ユニジーン」配列は、理論的に別個の遺伝子産物に対応する。しかし、多数のユニジーンは部分的ｃＤＮＡ配列を示しているだけなので、いくつかの遺伝子が２つ以上のユニジーンによって示される可能性があることに留意すべきである。次いで、ユニジーンセットの予備的注釈を、各ユニジーン配列が非重複ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースに対して検索される自動ＢＬＡＳＴ検索を用いて実施した。このＢＬＡＳＴ検索アプローチは、「ユニジーン注釈」と称される５つの最良のＢＬＡＳＴ「ヒット」（最低のｅ値を有する「ヒット」）を生じた。
【００５７】
ノザンブロット分析
新たに採取した根、若葉、茎、花並びに異なる発達段階の果実（小さい緑の果実（ＳＧ）、大きい緑の果実（ＬＧ）、黄色い果実（Ｙ）及び赤い果実（Ｒ））を、トゥール（フランス）において温室条件下（２５℃、７０ＲＨ）で成長したＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２及びエクアドル又はＩＣＣＲＩ（インドネシア）のいずれかで成長したＣｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ ＦＲＴ３２から採取した。新たな組織を液体窒素中で即座に凍結し、上記抽出手段を使用して各組織から総ＲＮＡを単離した。合計５μｇのＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１．２％（ｗ／ｖ）の変性ＲＮＡゲル上で泳動した。各植物組織由来の総ＲＮＡサンプルを、７μＬの「ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ」（エチジウムブロマイドを含まない、Ｓｉｇｍａ）の存在下で６５℃で１５分間加熱し、次いで直後に氷上に２分間置き、その後１．２％のＲＮＡゲル上にロードした。このゲルを、６０ボルトで５時間泳動した。次いで、このゲルを１０×ＳＳＣ中に２０分間にわたって２回浸した。ゲル中のＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中で「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＴＭ Ｍｅｍｂｒａｎｅ」（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）にキャピラリートランスファーによって一晩移し、このＲＮＡを、このブロットを８０℃で３０分間加熱することによって固定した。プローブを、（Ｐ３２）ｄＣＴＰの存在下で「Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（商標）ＩＩランダムプライム標識システム」キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して生成した。ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、４０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５％［ｗ／ｖ］のＳＤＳ及び５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液）中で６５℃で２４時間実施した。次いでこのメンブレンを、各々３０分間の間に、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ［ｗ／ｖ］及び１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ［ｗ／ｖ］を使用して６５℃で２回洗浄した。
【００５８】
図１中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのシステインプロテイナーゼ遺伝子ＣｃＣｐ−１遺伝子が、試験した全ての段階でＣ．ａｒａｂｉｃａのコーヒーチェリーにおいて発現され、黄色いチェリーが他の段階よりも僅かに高い発現レベルを示すことを実証する。Ｃ．ａｒａｂｉｃａの根でも茎でも葉でも、この遺伝子の発現は検出されなかった。図２は、ＲＮＡの新たな調製物を使用した、Ｃ．ａｒａｂｉｃａにおけるＣｃＣＰ−１の発現を試験する別のノザンブロット実験を示す。この実験のために、４つの段階についてチェリーを解剖して、各段階のチェリー発達について果皮組織及び粒組織を生成した。次いで、総ＲＮＡをこれらの組織から抽出した。得られた結果は、チェリー発達の間のＣｃＣＰ−１の発現の同じ一時的パターンを示すが、この新たな実験は、ＣｃＣＰ−１が、チェリーの粒組織中のみにおいて高レベルで主に発現されることをさらに示す。ＣｃＣＰ−１遺伝子の有意な発現は、コーヒーチェリーの果皮においては見られない。この後者の結果は、通常の成長条件下でのコーヒー粒のタンパク質、ペプチド及びアミノ酸のプロフィールの全面的な変更におけるこの遺伝子産物の役割を支持する。
【００５９】
本発明者らは、コーヒーの葉並びに異なる段階の発達中のコーヒーチェリーから解剖した種子組織及び果皮組織から、ＥＳＴライブラリーを生成した。異なるライブラリー中のＣｃＣＰ−１ ＥＳＴの検出（以下に示される−表３を参照のこと）もまた、この遺伝子が粒において強く発現されるが、果皮においても葉においても有意には発現されないことを実証する。種子の発達の間のＣｃＣＰ−１の発現パターンは、Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａのその提唱された相同配列（ＣＰＲ４遺伝子：Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．ら、２０００．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３、８３−１０１）について見られる発現パターンと類似である。これらの著者らは、ＣＰＲ４が葉においても根においても茎においてもノザンブロッティングによって検出されないことを示しており、ＣｃＣＰ−１が粒特異的であるという主張をさらに強化している。例えば、ＣｃＣＰ−１のアンチセンス構築物又はＣｃＣＰ−１の過剰発現構築物のために粒特異的プロモーターを使用することによって、本明細書中で示唆されるような粒におけるＣｃＣＰ−１の発現を特異的に変更することは、他の組織において代謝を妨害しないと予測される。
【００６０】
【表２】
【００６１】
ＣｃＣＰ−１についての任意選択のアラインメント（図２Ａ）は、このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼをコードすることを示す。
【００６２】
図３中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのシステインプロテイナーゼインヒビター遺伝子ＣｃＣＰＩ−１遺伝子が、試験した全ての段階でＣ．ａｒａｂｉｃａのコーヒーチェリーにおいて発現されることを実証する。しかし、システインプロテイナーゼＣｃＣＰ−１について見られた発現とは対照的に、ＣｃＣＰＩ−１は、２つの初期段階のコーヒーチェリー発達（小さい緑及び大きい緑）においてより高い発現を示し、この遺伝子は、２つの後期段階のチェリー発達においてより低いレベルで発現される。この発現パターンは、システインプロテイナーゼインヒビタータンパク質（ＣｃＣＰＩ−１）が、種子において特異的に発現されるシステインプロテイナーゼ（例えば、コーヒーチェリー中のＣｃＣＰ−１）の活性レベルを制御するという本発明の仮説と一致する。制御タンパク質（例えば、システインプロテイナーゼインヒビタータンパク質）は、標的タンパク質が発現される時点から連続的にその標的タンパク質の活性レベルを制御する必要がある場合、その標的タンパク質よりも早く発現されることが予測できる。Ｃ．ａｒａｂｉｃａの根でも茎でも葉でも、この遺伝子の発現は検出されなかった。ＣｃＣＰ−１及びＣｃＣＰＩ−１の発現パターンの類似性は、これらのタンパク質が機能的に相互作用し得るという本発明の仮説と一致することが留意される。
【００６３】
ノザンブロッティングの結果（図３）は、ＣｃＣＰＩ−１がコーヒーチェリーにおいて全ての段階で発現されることを示した。しかし、この実験は、この発現がチェリー全体中に存在するのか、又は果皮若しくは粒の中にのみ存在するのかを決定しなかった。葉における発現もまた、試験しなかった。しかし、異なるＥｓｔライブラリーにおけるＣｃＣＰＩ−１の発現（以下の表４中に示される）は、この遺伝子が粒においてのみ特異的に発現され、果皮でも葉でも発現が検出されなかったことを実証する。この結果は、ＣｃＣＰＩ−１が種子において特異的に発現されるシステインプロテイナーゼ（例えば、ＣｃＣＰ−１）の活性レベルを制御することをさらに示唆する。
【００６４】
【表３】
【００６５】
図４中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのシステインプロテイナーゼインヒビター遺伝子ＣｃＣＰＩ−１遺伝子が、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ（ｒｏｂｕｓｔａ）のチェリー 対Ｃ．ａｒａｂｉｃａのチェリーにおいて差示的に発現されることを実証する。第１に、図４のデータは、このＣｃＣＰＩ−１遺伝子が、Ｃ．ａｒａｂｉｃａにおいて僅かにより早く発現されることを示す。第２に、そしてより重要なことに、このＣｃＣＰＩ−１遺伝子は、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａのチェリーにおいて有意により高いレベルで発現される。発現におけるこの差異は、Ｃ．ａｒａｂｉｃａのチェリー 対Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａのチェリーにおいて見出されるシステインプロテイナーゼ活性のレベルにおそらく影響を与える。このクラスのタンパク質は植物における耐虫性と広く関連しているので、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａにおけるＣｃＣＰＩ−１遺伝子の高い発現は、ｒｏｂｕｓｔａ変種 対ａｒａｂｉｃａ変種についてしばしば見られるより高い耐病性に寄与する可能性もある。
【００６６】
粒の発芽の間のＣｃＣＰ−１発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
コーヒー粒の発芽の間のＣｃＣＰ−１の発現を決定するために、コーヒーの果実を成熟段階で収穫し、水でリンスし、その果皮を除去した（各果実は通常２つの粒を含む）。得られた粒を、室温で戸外にて１週間乾燥させた。発芽前に、各粒のパーチメント及び銀皮（種皮）を手動で除去し、次いで粒を１％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム中に１時間配置することによって滅菌し、次いで滅菌脱イオン水によって２回洗浄した。発芽のために、１５０個の滅菌した粒を、１０ｍｌの固体Ｈｅｌｌｅｒ成長培地Ｈ１５（Ｈｅｌｌｅｒの塩（Ｈｅｌｌｅｒ、１９５３）を含む）及び７ｇ／ｌの寒天を含む試験管中に個々に配置し、次いで１日８時間の明期で２５℃でインキュベートした。
【００６７】
１０個の粒の３つのセットを、発芽の２日後、３日後、５日後、１ヵ月後及び２ヵ月後に採取し、液体窒素中で即座に凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。１ヶ月及び２ヶ月の発芽サンプルについて、これらのサンプルに付随した幼根をサンプリング時に摘出し、粒とは別に凍結した。３０個の滅菌した粒を、Ｔ（０）コントロールとして使用するためにＴ＝０で採取して凍結した。
【００６８】
各サンプルから抽出した４μｇのＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のプロトコルに従ってヘキサマーオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡを合成した。コーヒーのリボソームタンパク質Ｌ３９遺伝子のフラグメントを、ｃＤＮＡ合成ステップのためのコントロールとして各ｃＤＮＡサンプルについて増幅した。これらのＰＣＲ反応を、ｃＤＮＡの１／１００希釈物１０μｌ、１μＭの各プライマー、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む５０μｌの反応を使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、その後の（９４℃で１分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２．５分間）×３５サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。以下のプライマーをＰＣＲによる増幅のために使用し、７２６ｂｐのｃＤＮＡ産物を得た：ＣｃＣＰ−１ ｕｐ ５’ ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧ ３’及びＣｃＣＰ−１ ｌｏｗ：５’ ＡＣＧＣＴＴＣＣＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡ ３’。ＲＰＬ３９タンパク質のためのプライマーは、
であった。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、発芽の異なる段階の間のＣｃＣＰ−１の発現を決定した。得られた結果は、ＣｃＣＰ−１転写物が試験した全ての発芽時点において粒全体中で検出されることを実証する（図５）。Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．ら、２０００（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３、８３−１０１）によって、Ｖ．ｓａｔｉｖａ由来の提唱されたＣｃＣＰ−１相同体ＣＰＲ４のＲＮＡもまた、発芽の間にＶ．ｓａｔｉｖａ種子の胚軸及び子葉の両方において発現されることが以前に示されている。
【００７０】
ウエスタンブロット分析
分析した葉組織及びチェリー組織は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２由来であり、使用前にこれらの組織を−８０℃で凍結保存した。異なる発達段階のチェリーの粒組織及び果皮組織を、可能な限り小さい果皮の解凍で、別々に解剖した。次いで、これらの異なる組織を迅速に粉砕して微細粉末にした。これは、例えば、予め凍結した乳鉢及び乳棒を用いて液体窒素を使用して実施できる。タンパク質抽出物を、Ｔａｎａｋａら、１９８６（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、８１ ８０２−８０６）によって記載された抽出手順の改変バージョンを使用してこの組織から調製した。使用した緩衝液は以下であった：
Ｔａｎａｋａ緩衝液：
・スクロース ０．７Ｍ
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８） ０．５Ｍ
・β−メルカプト−エタノール ２％（ｖ／ｖ）
・ＮａＣｌ ０．１Ｍ
そしてこの緩衝液を使用する直前に以下を添加した：
・ＥＤＴＡ ５ｍＭ
・ＰＭＳＦ ２ｍＭ
ゲルローディング緩衝液
・グリセロール １５％（ｖ／ｖ）
・β−メルカプト−エタノール ２％（ｖ／ｖ）
・ＳＤＳ ３％（ｖ／ｖ）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８） ６２．５ｍＭ
【００７１】
数百ミリグラムの凍結粉砕粉末を、６５０μｌのＴａｎａｋａ緩衝液に添加した。タンパク質を、１体積のＴｒｉｓ飽和フェノール（ｐＨ８）（すなわち、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で飽和した）の添加によって抽出した。各サンプルを２０分間激しく混合し、次いで室温で１３０００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離後、これらのタンパク質はフェノール相中に存在する。２０μｌのサンプルを分析（以下を参照のこと）のために維持し、フェノール相中の残留タンパク質を、０．１Ｍの酢酸アンモニウムを含む５体積のメタノールの添加後に、−２０℃で一晩沈殿させた。引き続いて、これらのサンプルを室温で１３０００ｇで２０分間遠心分離し、得られたペレットを、０．１Ｍの酢酸アンモニウムを含む５００μｌのメタノール中で２回洗浄した。得られたペレットを、タンパク質定量まで、３０μｌのゲルローディング緩衝液中に再懸濁した。
【００７２】
フェノール相の２０μｌのサンプル中のタンパク質もまた上記のように沈殿させ、最終ペレットをＢｉｏＲａｄ ＤＣ ＰｒｏｔｅｉｎアッセイＫｉｔのサンプル緩衝液中に再懸濁した。このサンプル中の総タンパク質の定量を、供給業者によって記載されるようにＢｉｏＲａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキットを使用して実施した。引き続いて、全ての主要なサンプルを、ゲルローディング緩衝液の添加によって調整して、５μｇ／μｌにした。
【００７３】
各サンプルの約５０μｇのタンパク質を含むサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％のトリス−グリシン（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））における電気泳動によって分離した。次いで、これらのタンパク質を、標準的なプロトコルを使用したエレクトロブロッティングによってＰＶＤＦメンブレンに移した。このメンブレン上の非特異的結合部位を、ＴＢＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ（商標））中の１０％脱脂乾燥ミルク中でこのメンブレンを室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートすることによってブロッキングした。ブロットされたタンパク質を、Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ由来のＣＰＲ４の予測された相同体に対して惹起されたポリクローナル抗体（ＴＢＳ １０％脱脂乾燥ミルク中、１／５０００ｅ希釈）（Ａ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ及びＫ．Ｍuｎｔｚ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆuｒ Ｐｆｌａｎｚｅｎｇｅｎｅｔｉｋ ｕｎｄ ｋｕｌｔｕｒｐｆｌａｎｚｅｎｆｏｒｃｈｕｎｇ（ＩＰＫ）、Ｇｅｒｍａｎｙ（Ａ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ、Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ、Ｃ．Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ、Ｊ．Ｔｉｅｄｍａｎｎ及びＫ．Ｍuｎｔｚ、２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、５１：１４２３−１４３３）の厚意により寄贈されたもの）を用いて室温で２時間又は４℃で一晩プローブした。次いで、このメンブレンを、ＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０緩衝液中で２０分間にわたって３回洗浄した。このメンブレンを引き続き、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された２次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇ、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標））と共に１時間インキュベートした。次いで、このメンブレンをＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０緩衝液中で２０分間にわたって２回洗浄し、次いでＴＢＳ中で２０分間にわたって１回洗浄した。この２次抗体に連結された酵素の存在を、増強されたＥＣＬ＋（登録商標）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を供給業者によって記載される通りに使用して、化学ルミネセンス検出によって可視化した。
【００７４】
得られた結果は、約４１ｋＤａのポリペプチド（これは、ＣｃＣＰ−１前駆体ポリペプチドの予測された分子量（４３７３５Ｄａ）と密接に対応する）が、試験した粒成熟段階の全てにおいて検出されるが、果皮組織においては検出されないことを示す（図６）。このタンパク質発現パターンは、ＣｃＣＰ−１ ｍＲＮＡについて見られた発現パターン（図２）と類似である。約２２ｋＤａの別のポリペプチドもまた、黄色い段階及び赤い段階の粒において検出されるが、その量は、４１ｋＤａのポリペプチドよりも少ない。この第２のポリペプチドのサイズは、ＣｃＣＰ−１の成熟形態の予測されたサイズ（２５，２３９Ｄａ）と一致する。プロセシング後の成熟ＣｃＣＰ−１の予測されたサイズを、ＣｃＣＰ１の完全ＯＲＦ配列とＣＰＲ４の予測された成熟形態の配列（Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ−登録番号Ｚ９９１７２、ＣｃＣＰ１と６０．９％の同一性）との間のタンパク質アラインメントによって決定した。成熟形態を生成するためのＣＰＲ４ポリペプチドのプロセシングのＮ末端部位を、他のパパイン様ＣＰＲポリペプチドとの配列比較によって予測した（Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ、Ｓ．Ｈｉｌｌｍｅｒ、Ｃ．Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ、Ｂ．Ｎｅｕｂｏｈｎ、Ａ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ、Ｖ．Ｓｅｎｙｕｋ、Ａ．Ｓｈｕｔｏｖ及びＫ．Ｍuｎｔｚ．２０００ Ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４３：８３−１０１）。興味深いことに、ＣｃＣＰ−１の前駆体及び成熟形態の両方が粒の発達の間に検出される本明細書中に示される結果とは対照的に、ＣＰＲ４ポリペプチドの成熟形態のみが発達中の種子において検出され、Ｖ．ｓａｔｉｖａ種子の発芽の間にも検出された（Ｆｉｓｈｅｒら、２０００）。
【００７５】
ｒｏｂｕｓｔａ変種ＦＲＴ−３２についての遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
ＦＲＴ−３２の異なる組織を調製し、総ＲＮＡを、以前に記載された方法によってこれらの組織から抽出した。ｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡから、ａｒａｂｉｃａ ｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ実験について上記したように調製した。次いで、特異的ＰＣＲ反応を、ａｒａｂｉｃａ ｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ実験のための上記の反応条件を使用して実施した。使用した特異的増幅条件及びオリゴヌクレオチドプライマーは、各実験について図の説明文中に与えられる。
【００７６】
ＣｃＣＰＩ−１
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−１についての最適なアラインメント（図６Ａ）。
【００７７】
ｂ）ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるＣｃＣＰＩ−１についてのＲＴ−ＰＣＲ発現データ（図７）。ＰＣＲ反応を以前に記載されたように実施した。使用したサイクル条件及びＰＣＲプライマーは、図の説明文中に与えられる。これらのデータは、ＣｃＣＰＩ−１が粒においてのみ発現され、果皮においては発現されないことを示すので、ａｒａｂｉｃａ発現について以前に示されたデータを補足及び拡張する。この遺伝子の弱い発現が花においても検出され、これは、ノザンブロット分析によって以前に見られなかった結果である。ｒｏｂｕｓｔａにおけるＲＴ−ＰＣＲ発現もまた決定した（図７）。これは、花においても小さい緑の粒においても発現が検出されなかったこと以外、ａｒａｂｉｃａについて見られたのと同じ発現パターンである。ｒｏｂｕｓｔａの小さい緑の段階について見られた発現の非存在は他の遺伝子についても見られ、従って、これはＣｃＣＰＩ−１遺伝子に独自のことではない。
【００７８】
表５：異なるＥｓｔライブラリーにおけるシステインプロテイナーゼインヒビター遺伝子ＣＰＩ−２、ＣＰＩ−３及びＣＰＩ−４についてのＥｓｔの発生。
【表４】
【００７９】
ＣｃＣＰＩ−２
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−２についての最適なアラインメント（図８）。
【００８０】
ｂ）ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるＣｃＣＰＩ−２についてのＲＴ−ＰＣＲ発現データ（図９）。ＰＣＲ反応を以前に記載されたように実施した。使用したＰＣＲプライマーは図の説明文中に与えられる。これらのデータは、ＣｃＣＰ−２が全ての組織において発現されることを示し、従って、この遺伝子のタンパク質産物が、これらの組織中に存在する１つ又は複数のシステインプロテイナーゼを制御することにおいて重要な役割をおそらく果たすことを示す。上記表５中に見られる各ライブラリー中のＥｓｔの数は、ＣＰＩ−２が、葉、果皮又は受粉後４６週の種子よりも、受粉後３０週の粒（種子）においてより多く発現できることを示唆する。
【００８１】
ＣｃＣＰＩ−３
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−３についての最適なアラインメント（図１０）。
【００８２】
ｂ）このシステインプロテイナーゼインヒビターについて現在入手可能なＲＴ−ＰＣＲ発現データは存在しない。しかし、各ライブラリー中に出現するＥｓｔの数（上記表５）によって決定されるようなこの遺伝子の「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」発現は、ＣｃＣＰＩ−３が、コーヒー粒において発現される（「種子３０ｗ」及び「種子４６ｗ」、すなわち３０週及び４６週の種子ライブラリー中に存在する）ことを示す。果皮、葉又はチェリー全体におけるこの遺伝子についてのＥｓｔの非存在は、この遺伝子が粒特異的遺伝子であり得ることを示唆する。
【００８３】
ＣｃＣＰＩ−４
ａ）このｃＤＮＡがシステインプロテイナーゼインヒビターをコードすることを示す、ＣｃＣＰＩ−４についての最適なアラインメント（図１１）。
【００８４】
ｂ）ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａにおけるＣｃＣＰＩ−４についてのＲＴ−ＰＣＲ発現データ（図１２）。ＰＣＲ反応を以前に記載されたように実施した。使用したＰＣＲプライマーは図の説明文中に与えられる。得られたデータは、この遺伝子がａｒａｂｉｃａの葉、花及び赤い段階の粒において有意に発現されることを示す。最初のゲルの綿密な試験（パネルＡ：ａｒａｂｉｃａ）は、小さい緑の粒及び大きい緑の果皮のレーンにおいても弱いバンドが検出されることを示すので、この遺伝子はまた、ａｒａｂｉｃａの研究した全てのチェリー発達段階の粒及び果皮において弱く発現できる。ｒｏｂｕｓｔａについて得られたデータは、この遺伝子が、葉、花、小さい緑の粒及び大きい緑の粒において有意に発現されることを示す。ＣｃＣＰＩ−４についてたった１つのＥｓｔが種子又は果皮のライブラリーにおいて見出され（上記の表５）、このことは、粒及び／又は果皮におけるこの遺伝子の発現が比較的低いか、或いはこれら２つの組織の小さい規定された領域に限定されることを示す。
【００８５】
システインプロテイナーゼインヒビター（ＣＰＩ）遺伝子についての各々の場合において、粒発達の間のこれらの遺伝子の過剰発現又は発現の阻害（すなわち、非常に強い粒特異的プロモーター（例えば、コーヒー１１Ｓプロモーター）の制御下での）は、成熟粒におけるタンパク質、ペプチド及びアミノ酸のプロフィール（並びに従って、フレーバー前駆体のレベル）を変更することが予測される。
【００８６】
発芽及びＲＴ−ＰＣＲ分析
滅菌した乾燥Ｃ．ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２の粒（パーチメント及び銀皮を除去したもの）を、１０ｍｌの固体Ｈｅｌｌｅｒ成長培地Ｈ１５及び７ｇ／ｌの寒天を含む試験管中に個々に配置し、１日８時間の明期で２５℃でインキュベートした。発芽の２日後、３日後、５日後、１ヵ月後及び２ヵ月後に３個の粒を採取し、存在する場合には幼根を除去し、粒及び幼根の両方を液体窒素中で即座に凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。同様に乾燥及び滅菌した非発芽粒（Ｔ０）をコントロールとして使用した。ＲＮＡを、以前に記載されたように粒サンプルから抽出した。各サンプルから抽出したＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のプロトコルに従って、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を使用してｃＤＮＡを合成した。次いで、ＰＣＲ反応を、各ｃＤＮＡ反応のアリコート（１０μｌの１／１０希釈したｃＤＮＡ、１μＭの各プライマー、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ ＰＣＲ緩衝液、２００μｍのｄＮＴＰ及び２単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む５０μｌの反応）を使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、５４℃で１．５分間及び７２℃で２．５分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは以下であった：
【００８７】
ゲノムＰＣＲ及び精製されたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定
５つの異なるコーヒー変種（ＦＲＴ−０７、ＦＲＴ−１９、ＦＲＴ−３２、ＣＣＣＡ２及びＧＰＦＡ５７）のゲノムＤＮＡを、発芽ＲＴ−ＰＣＲ発現研究のために上記のＰＣＲ反応において使用した。予測されたサイズのＰＣＲ産物が得られ、これらのフラグメントをゲルから精製した。次いで、このＰＣＲ増幅されたＤＮＡを第２ラウンドのＰＣＲ増幅に供し、次いで、この配列決定反応から得られたＤＮＡを、増幅のために使用したのと同じプライマーを使用して配列決定した。
【００８８】
システインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４の単離及び特徴付け
１）異なる発達段階のコーヒー粒、異なる発達段階のコーヒーの果皮組織、及び葉から単離されたＲＮＡを用いて作製されたＥｓｔ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）の収集を使用して、本発明者らは、Ｃ末端ＫＤＤＬ配列を有するコーヒーシステインプロテイナーゼをコードする全長ｃＤＮＡを単離した。本発明者らは、このｃＤＮＡをＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）と命名した（図１４）。このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質と他の高度に相同な植物システインプロテイナーゼとのアラインメントが図１５中に示される。このアラインメントデータ及び関連のＢｌａｓｔ検索は、コーヒーＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）配列によってコードされるタンパク質が、植物のＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼファミリーのメンバーであることを明らかに示す（図１５）。ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）と最も相同なデータベース配列との間の正確な同一性は、表６Ａ及び６Ｂ中に与えられる。
【００８９】
表６Ａ：Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）のアミノ酸配列と、最も相同なＧｅｎＢａｎｋ配列のアミノ酸配列との同一性
【表５】
【００９０】
表６Ｂ：Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）の核酸（ｃＤＮＡ）配列と、最も相同なＧｅｎＢａｎｋ配列の核酸配列との同一性
【表６】
【００９１】
明白に、得られたコーヒーＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ配列は、図１５中に示される他のほぼ全ての配列とは異なる１つの重要な差異を有する。すなわち、この配列は、予測された小胞体（ＥＲ）残留配列（Ｃ末端ＫＤＥＬ配列）を有さないが、この配列の変異体（すなわちＫＤＤＬ）を有する。Ｃ末端ＫＤＥＬ配列におけるバリエーションが植物細胞中のＥＲにおける残留を指向する能力を試験することによって、Ｄｅｎｅｃｋｅら（Ｄｅｎｅｃｋｅ，Ｊ．、Ｄｅ Ｒｙｃｋｅ，Ｒ．及びＢｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｊ．１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１、２３４５−２３５５）は、Ｃ末端変異体（例えば、ＳＤＥＬ、ＫＤＤＬ、ＫＤＥＩ及びＫＤＥＶ）が、小胞体残留機能を完全に喪失することもあることを以前に示している。従って、植物ＫＤＥＬシステインプロテイナーゼのコーヒー相同体中のＫＤＤＬ配列の存在は予測されなかった。表７は、ｃＤＮＡ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）を含むユニジーンが２１個のＥｓｔを有することを示す。従って、次いで本発明者らは、このユニジーン中の他のＥｓｔの配列を試験し、これらのＥｓｔのうち７つが、ＫＤＤＬ領域についての良好な配列データを含むことを見出した。これら７つのｃＤＮＡ配列のうち、６つはＫＤＤＬ配列を有し、１つはＫＤＥＬ配列を有した。本発明者らは、ＫＤＥＬ Ｃ末端配列を有するｃＤＮＡクローンを引き続いて単離し、この部分的ｃＤＮＡクローンについての完全配列を得た。得られたＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ、図１６及び図１７中に示される。
【００９２】
表７．全長ｃＤＮＡ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）を含むユニジーン中のＥｓｔの数。
【表７】
【００９３】
図１６中に示されるＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）の配列をコードするｃＤＮＡは、部分的ｃＤＮＡに過ぎない。すなわち、これは、全長ｃＤＮＡクローンＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）についての１３３６ｂｐ長に対してたった８１７ｂｐ長である。部分的ｃＤＮＡ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）は、ｃＤＮＡクローンＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）中に見出される等価な配列からの８個の単一ヌクレオチド残基変化を有するが、これらのヌクレオチド変化のうち２つだけがオープンリーディングフレームのアミノ酸配列の変化を引き起こす（図１７）。３’非翻訳領域中に、３つの明白なヌクレオチド変化が存在する。さらに、マイクロサテライト領域内であるように思われるＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）ｃＤＮＡ配列の３’非翻訳領域中に、１２ヌクレオチドの挿入もまた存在する。このデータは、コーヒーＣｃＣＰ−４遺伝子のこれら２つの対立遺伝子についての未発見の２つの異なる重要な分子マーカーを示したに過ぎず、そのうち一方は、機能的に重要なＫＤＥＬ部位と関連するＳＮＰであり、他方は、この遺伝子の３’非翻訳領域と関連するマイクロサテライトマーカーである。後者の点は、マイクロサテライト配列が高い変動性を有する遺伝子マーカーであると通常みなされるので重要であり、従って、この遺伝子の他の対立遺伝子は、このマイクロサテライト含有領域を使用して見出される可能性がある。
【００９４】
ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの異なる変種において上で同定されたＣｃＣＰ−４遺伝子の２つの対立遺伝子の分布を試験するために、ＣｃＣＰ−４遺伝子を保有するゲノム配列の小さい領域を、５つの異なる遺伝子型からＰＣＲによって増幅した。予測されたサイズ（２０７塩基対）のＰＣＲフラグメントが各ゲノムＤＮＡサンプルから得られ、これらのＰＣＲ産物をゲル精製し、次いで再増幅して、このＰＣＲ産物の直接的ＤＮＡ配列決定に充分なＤＮＡを生成した。配列決定反応から得られた結果が図１８中に示される。５つの配列についての配列決定クロマトグラムは、試験した２つのａｒａｂｉｃａ変種がＫＤＥＬ配列を明らかに有し、試験した３つのｒｏｂｕｓｔａ変種がＫＤＤＬ配列を有することを示す。この結果は、ＫＤＤＬ対立遺伝子がｒｏｂｕｓｔａ変種に限定できること及びこれがａｒａｂｉｃａ変種においては見出されないことを示す。ＫＤＥＬ配列は本明細書中で研究した３つのｒｏｂｕｓｔａ変種においては見出されなかったが、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｅｓｔライブラリーにおける１つのＫＤＥＬ配列の発見は、この対立遺伝子が少なくともいくつかのｒｏｂｕｓｔａクローン中に存在できることを示す。
【００９５】
ＣｃＣＰ−４遺伝子の発現を、ノザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して研究した。図１９は、ａｒａｂｉｃａ変種の異なる発達段階のコーヒーの粒及び果皮から抽出したＲＮＡ並びに根、若葉、茎及び花から単離したＲＮＡを使用したノザンブロット実験から得られた結果を示す。ＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）対立遺伝子の既知のＤＮＡ配列との約９８％の相同性を有するＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）プローブを使用して得られたデータは、ＣｃＣＰ−４が粒においてのみ発現されることを示した。発現は、果皮においても、根、茎、花及び葉においても検出されなかった。２つの対立遺伝子間の非常に高いレベルの同一性に起因して、このＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）プローブは、両方の対立遺伝子由来の転写物にハイブリダイズすると予測される。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用した類似の実験もまた、ＣｃＣＰ−４遺伝子について同じ発現プロフィールを示した。
【００９６】
ＣｃＣＰ−４の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、発芽の間の種子全体においても研究した。この実験は、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＥＬ対立遺伝子及びＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ対立遺伝子の両方に共通するプライマーを使用した。この実験の結果は、図２０中に示される。ＣｃＣＰ−４転写物は試験した全ての発芽段階で検出されたが、これらの転写物のレベルは、３日目に僅かに低下するようであり、次いで発芽が進行するにつれて再度上昇し始めた（１ヶ月目及び２ヶ月目のサンプルにおいて最高レベル）。
【００９７】
Ｌｉｎｇら（Ｌｉｎｇ，Ｊ．−Ｑ．、Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．、Ｓｈｉｒａｉｗａ，Ｍ．及びＴａｋａｈａｒａ，Ｈ．、２００３ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６２７、１２９−１３９）は、ＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼをコードする２つのｃＤＮＡを、ダイズ子葉から単離した。これら２つのｃＤＮＡは、ＤＮＡレベルで９３．５％の類似性を有し、根、花及び種子発達の間に発現された。発達中の種子においても成熟種子においてもノザンブロッティングによって発現は検出されなかったが、成熟した莢において発現が検出された。ＫＤＥＬ含有システインプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡは、ニンジンからも単離された（Ｓａｋｕｔａ，Ｃ．、Ｏｄａ，Ａ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．、Ｙａｍａｋａｗａ，Ｓ．、Ｋａｍａｄａ，Ｈ．及びＳａｔｏｈ，Ｓ．２００１ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５、２２４３−２２４８）。この遺伝子の転写物は、成熟した乾燥種子並びに吸水の２日後及び３日後の発芽中の種子全体において検出された。他のニンジン組織におけるこの遺伝子の発現又は種子発達の間のこの遺伝子の発現は示されなかった。別のＫＤＥＬ含有タンパク質及びその対応するｃＤＮＡがＶ．ｓａｔｉｖａから単離されている（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．、Ｈｉｌｌｍｅｒ，Ｓ．、Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ，Ｃ．、Ｎｅｕｂｏｈｎ，Ｂ、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ａ．、Ｓｅｎｙｕｋ，Ｖ．、Ｓｈｕｔｏｖ，Ａ．及びＭｕｎｔｚ，Ｋ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．４３、８３−１０１）。ノザンブロッティングを使用して、この遺伝子の転写物は、発芽の間に子葉において検出されたが、発芽中の種子の胚軸においては検出されなかった。成熟中の種子においても、成熟種子においても、葉及び根においても、転写物は検出されなかった。
【００９８】
本明細書中に示される結果は、コーヒーのＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼが、いくつかの新規かつ予測されなかった特徴を示すことを示す。第１に、本発明者らは、ｒｏｂｕｓｔａコーヒー粒が、ＫＤＥＬ領域をコードする配列中にＫＤＥＬからＫＤＤＬへの変化を生じる単一変異を有するＫＤＥＬ型ＣＰ遺伝子を発現することを発見した。Ｄｅｎｅｃｋｅら（１９９２）のデータに基づいて、この残留配列におけるこの特定の変更は、ｒｏｂｕｓｔａ ＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）タンパク質の細胞局在及び／又は制御を変更することが予測される。本発明者らは、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ遺伝子の転写されたコピーが存在することにより、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＥＬ配列を有する変種と比較して、コーヒー粒におけるペプチド／アミノ酸のプロフィールの有意な変化を生成できることを提唱する。本発明者らはまた、コーヒーのＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼが、粒の発芽の間に予測された発現を示しつつ、研究した全ての粒の発達段階の間にも予測に反して発現されることを本明細書中で示した。上記のように、これまで、他の植物における種子発達の間のＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼの有意な発現を実証する明確なデータは刊行された文献中には存在しないが、その転写物は、成熟ニンジン種子において検出されている（Ｓａｋｕｔａら、２００１）。
【００９９】
上で示されたコーヒーのＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼの新規特性は、ａｒａｂｉｃａ及びｒｏｂｕｓｔａの成熟粒におけるペプチドプロフィール及びアミノ酸プロフィールに対して重要な影響をおそらく有し、従って、重要なコーヒーフレーバー前駆体のプールを変更する。ＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼの転写物が成熟粒中に存在することを考慮すると、このＫＤＥＬ型タンパク質はコーヒーの湿式加工の間に活性化でき、それによって湿式プロセスのコーヒー粒のペプチド／アミノ酸のプロフィールをさらに変更することもまた可能である。記載された研究は、ＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼ遺伝子の特定の対立遺伝子を有するコーヒー変種（これは、タンパク質／ペプチド／アミノ酸のプロフィールにおける付随した変更を有する）を得るために古典的選択及び交配作業において使用できる分子マーカー（ＳＮＰ及びマイクロサテライトマーカー）を生成している。例えば、ＣｃＣＰ−４ ＫＤＥＬ対立遺伝子のみを有するか又は低い発現レベルのＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ対立遺伝子のみを有するｒｏｂｕｓｔａの変種が、選択／交配できる。さらに、遺伝子改変技術を使用して、ＫＤＥＬ型又はＫＤＤＬ型のシステインプロテイナーゼの種子特異的な過剰発現によってコーヒー又は他の植物におけるＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼ活性を変更することが想定できる。或いは、ＫＤＥＬ型システインプロテイナーゼのレベルは、アンチセンス、センス又はＲＮＡｉの技術を使用して低下できる。両方の場合において、得られた形質転換された植物中のタンパク質／ペプチド／アミノ酸のプールが変更されて、タンパク質／ペプチド／アミノ酸のフレーバー前駆体プールの新たなプロフィールが導かれる。
【０１００】
図１３中に示されるノザンブロット分析は、コーヒーのアスパラギン酸プロテイナーゼＣｃＡＰ−２遺伝子が、試験した全てのチェリー発達段階で、Ｃ．ａｒａｂｉｃａコーヒーチェリーの粒及び果皮の両方において発現されることを実証する。このＣｃＡＰ−２遺伝子はまた、根において比較的高い発現を有する。フィルムをより長く露光させると、ＣｃＡＰ−２発現は、Ｃ．ａｒａｂｉｃａの茎、葉及び花の組織においても検出された。
【０１０１】
ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２
図２１及び２２は、ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２の各々がアスパラギン酸プロテイナーゼをコードすることを示す。
【０１０２】
コーヒー種子におけるＣｃＣＰ−１、ＣｃＣＰ−４、ＣｃＡＰ−１及びＣｃＡＰ−２のプロテイナーゼ遺伝子配列並びにＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＣＰＩ−２、ＣｃＣＰＩ−３及びＣｃＣＰＩ−４のプロテイナーゼインヒビターの過剰発現及び過少発現。
主要な貯蔵タンパク質のプロフィール及びアミノ酸／ペプチドのプロフィールは、本明細書中に開示される１つ又は複数の遺伝子の発現を上方又は下方のいずれかで変更することによって、成熟コーヒー粒において変化できることが予測される。
【０１０３】
目的の遺伝子の過剰発現のための方法は当該分野で周知である。このような方法は、以下の３つの主要な成分のキメラ遺伝子を生成するステップからなる：１）遺伝子の５’末端のプロモーター配列、好ましくは本願においてはＭａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９９（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９９、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの完全１１Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子の分子クローニング及びトランスジェニックタバコ植物におけるプロモーター分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ １１Ｓ ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３７巻、２７３−２８２及びＷＯ ９９／０２６８８号）中に記載されるコーヒー種子特異的プロモーターのような種子特異的プロモーター、２）発現されるべき遺伝子の全コード配列、並びに３）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子由来の３’領域のような３’制御領域。次いで、このキメラ遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクター中にクローニングでき、このベクターは、Ｌｅｒｏｙら、２０００、（Ｌｅｒｏｙら、２０００、リーフマイナーに対する抵抗性についてのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子を発現する、遺伝的に変更されたコーヒー植物（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｆｆｅｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙ１Ａｃ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｌｅａｆ ｍｉｎｏｒ）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０００、１９、３８２−３８９）によって詳細に記載されているコーヒー形質転換において使用するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株中に形質転換できる。安定な形質転換挿入配列を有する植物を次いでスクリーニングして、遺伝子の過剰発現又はタンパク質活性の過剰発現の検出のような方法を使用して、モック形質転換した植物由来の種子に対して、形質転換実験において使用する特定の遺伝子を成熟種子において特異的に過剰発現する植物をスクリーニングすることができる。
【０１０４】
例えば、当業者は、以下からなる組換え構築物を生成できる：１）Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら（１９９９）中に記載される最長のコーヒー１１Ｓ遺伝子プロモーター配列、２）ポリＡテイルを有さない、ＣｃＣＰ−１又はＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）の全長ｃＤＮＡ配列、及び３）既知の転写ターミネーター配列（例えば、充分研究されたノパリンターミネーター）。ＣｃＣＰ４若しくは他のｃＤＮＡ配列の５’非コード領域の、コーヒー１１Ｓ遺伝子の５’非コード領域又はコーヒー若しくは他の関連の植物種のいずれかの他の強力な種子特異的プロモーターの５’非コード領域による置換に起因して、より高いレベルの組換え構築物の過剰発現が生じることもまた可能である。次いで、この組換え遺伝子配列を、Ｌｅｒｏｙらにおいて記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ−ＤＮＡベクターの適切な部位中に挿入できる。このように構築されたＴ−ＤＮＡベクターは、適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（例えば、Ｌｅｒｏｙらにおいて記載される株）中に配置することができ、このＴ−ＤＮＡ含有Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｌｅｒｏｙらにおいて詳述される方法に従ってコーヒーを形質転換するために使用できる。
【０１０５】
既知の遺伝子配列の発現が、アンチセンス抑制によって、遺伝子の全コード領域未満を示す核酸フラグメントを使用した遺伝子発現によって、抑制されるべき遺伝子と１００％の配列同一性を共有しない核酸によって、低下又は完全に遮断できることは、当該分野で周知である。この場合、特定のアンチセンス抑制又は共抑制実験のために選択された配列は、上に示したキメラ遺伝子構築スキームにおいて全長遺伝子を置換する。得られたアンチセンス抑制又は共抑制キメラ構築物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクター中に再度クローニングされ、上記のようにコーヒー形質転換において使用するためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株中に形質転換される。次いで、安定な形質転換挿入配列を有する植物は、形質転換された植物の種子において使用される特定の遺伝子配列の発現を低下させたものについてスクリーニングできる。低下された発現は、ノザンブロッティング；半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び／又は定量的ＲＴ−ＰＣＲのような技術によって検出できる。
【０１０６】
植物中の遺伝子発現を低下又は排除するための別の方法は、本明細書中に開示される遺伝子配列の小部分を使用して、ＲＮＡｉの使用を介したＲＮＡサイレンシングを生じることである（Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、第４１８巻、２４４−２５１；Ｔａｎｇら、２００３、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、第１７巻、４９−６３）。このアプローチにおいて、本明細書中に開示される１つ又は複数の配列の小領域が、種子特異的プロモーター及び適切な３’調節領域を有する上記のようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクター中にクローニングされる。ＲＮＡｉのためのこの挿入された新たな配列は、生成されたＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ構造を形成して、形質転換された細胞において小さい二本鎖ＲＮＡの生成を生じ、それによってこれらの小さい二本鎖ＲＮＡ配列がこれらの形質転換された細胞において相同なｍＲＮＡの分解を誘発するように構築されるべきである。
【０１０７】
ＣｃＣＰ−１遺伝子、ＣｃＣＰ−４遺伝子、ＣｃＡＰ−１遺伝子、ＣｃＡＰ−２遺伝子、ＣｃＣＰＩ−１遺伝子、ＣｃＣＰＩ−２遺伝子、ＣｃＣＰＩ−３遺伝子、ＣｃＣＰＩ−４遺伝子における天然に存在するバリエーションについてのスクリーニング及びこれらの遺伝子における新たな変異の生成。
本明細書中に開示される配列は、これらの遺伝子における対立遺伝子変異体について天然の集団をスクリーニングするために使用できる。これは、ＣｃＣＰ−１配列、ＣｃＣＰ−４配列、ＣｃＡＰ−１配列、ＣｃＡＰ−２配列、ＣｃＣＰＩ−１配列、ＣｃＣＰＩ−２配列、ＣｃＣＰＩ−３配列及びＣｃＣＰＩ−４配列を、異なるコーヒー植物変種由来のゲノムＤＮＡ中の天然に存在するＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）についての研究においてプローブとして使用することによって達成できる。対立遺伝子変異体を見出すためのより強力な方法は、ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｔｉｌｌ，Ｂ．Ｊ．ら、２００３、高スループットＴＩＬＬＩＮＧを用いた、誘導された点変異の大規模発見（Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｕｐｕｔ ＴＩＬＬＩＮＧ）．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１３巻、５２４−５３０）に関連する変異スクリーニング技術を使用することである。この場合、特定の遺伝子配列（例えば、本明細書中のＣｃＣＰ−１配列、ＣｃＣＰ−４配列、ＣｃＡＰ−１配列、ＣｃＡＰ−２配列、ＣｃＣＰＩ−１配列、ＣｃＣＰＩ−２配列、ＣｃＣＰＩ−３配列及びＣｃＣＰＩ−４配列）が一旦単離及びクローニングされると、ＴＩＬＬＩＮＧ法に関連する変異スクリーニング技術は、クローニングされた配列と異なる変種中の対応するｃＤＮＡ又はゲノム配列との間で配列変異体を同定するために使用できる。７００塩基対〜１０００塩基対のＤＮＡセグメントをコードするＰＣＲプライマー対を使用して、既知のクローニングされた遺伝子が、異なる変種中の天然に存在する配列バリエーションについてスキャンできる。理想的な状況において、１つ又は複数の配列変異体はまた、特定の表現型バリエーションと相関させることができ、それによってこの表現型変異体に対する遺伝子マーカーを同定する。
【０１０８】
さらに、ＣｃＣＰ−１、ＣｃＣＰ−４、ＣｃＡＰ−１、ＣｃＡＰ−２、ＣｃＣＰＩ−１、ＣｃＣＰＩ−２、ＣｃＣＰＩ−３及びＣｃＣＰＩ−４についての本明細書中に開示される配列を使用して、完全なＴＩＬＬＩＮＧ法の適用は、これらの遺伝子中の新たな変異を生成及び検出するため、従って、これらの特定の変異を含む植物を生成するために使用できる。例えば、完全なＴＩＬＬＩＮＧ法を使用して、特定の変異（例えば、目的の遺伝子標的を不活化する、コード配列中のミスセンス変異）を有するコーヒー植物が生成できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼ遺伝子のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ：根、Ｓ：茎、Ｌ：若葉；並びにＳＧ、ＬＧ、Ｙ及びＲｅｄはそれぞれ、小さい緑の果実、大きい緑の果実、黄色い果実及び赤い果実由来の粒である。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。ＭＷはＲＮＡサイズラダーである。パネルＢは、試験した組織中のＣｃＣＰ−１ ｍＲＮＡの出現を示す、２４時間の露光後のオートラジオグラムを示し、パネルＡは、ブロッティング前のゲルのエチジウムブロマイド染色を実証する。
【図２】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−１遺伝子の発現のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーの粒から単離されたＲＮＡに対応し、ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）で標識されたレーンはそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーの果皮組織から単離されたＲＮＡに対応する。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。パネルＡは、ローディングコントロールとしてのブロッティング前の大きいリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を実証し、パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＣＰ−１ ｍＲＮＡの出現を示すオートラジオグラムである。
【図２Ａ】ＣｃＣＰ−１ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の完全配列と、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能な他の全長システインプロテイナーゼとのアラインメントの図である。これは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のＣＬＵＳＴＡＬ法によって、Ｍｅｇａｌｉｇｎにおいて実施した。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号は括弧内に与えられる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＹ０７００６３）；Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ（Ｚ９９１７２）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＧＭＣＰ３（Ｚ３２７９５）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＧｍＰＭ３３（ＡＦ１６７９８６）；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｍｏｌｄａｖａｉｎ（Ｚ９９９５５）；Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ＡＦ０８２１８１）；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（ＡＪ２４２９９４）；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｚ１４０２８）；Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ（ＡＹ１６１２７７）。
【図３】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼインヒビター（ＣｃＣＰＩ−１）遺伝子のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ：根、Ｓ：茎、Ｌ：若葉；並びにＳＧ、ＬＧ、Ｙ及びＲｅｄはそれぞれ、小さい緑の果実、大きい緑の果実、黄色い果実及び赤い果実由来の粒について。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。ＭＷはＲＮＡサイズラダーである。パネルＢは、２４時間の露光後のオートラジオグラムを示し、パネルＡは、ブロッティング前のゲルのエチジウムブロマイド染色を実証する。
【図４】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（ＡＲＡ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ（ＲＯＢ）の果実の異なる発達段階におけるシステインプロテイナーゼインヒビター（ＣｃＣＰＩ−１）遺伝子のノザンブロット分析を示す図である。レーンは、小さい緑の果実（ＳＧ）、大きい緑の果実（ＬＧ）、黄色い果実（Ｙ）及び赤い果実（Ｒｅｄ）でそれぞれ標識される。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。ＭＷはＲＮＡサイズラダーである。パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＣＰＩ−１ ｍＲＮＡの出現を示す、２４時間の露光後のオートラジオグラムを示す。パネルＡは、ブロッティング前のゲルのエチジウムブロマイド染色を実証する。
【図５】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ粒の出芽の間のＣｃＣＰ−１の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１００希釈した各ｃＤＮＡ１０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、６１℃で１．５分間及び７２℃で２．５分間）×３５サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、A4-43-upper:5'-ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG-3'、A4-43-lower:5'-ACGCTTCCCCCATGAGTTCTTGA-3'であった。ｍＲＮＡを、異なるテンプレート（それぞれ、滅菌した種子（Ｔ０）並びに出芽の２日後（２ｄ）、３日後（３ｄ）、５日後（５ｄ）、１ヵ月後（１ｍ）及び２ヵ月後（２ｍ）に採取した種子由来のｃＤＮＡ）に対して特異的プライマー（ＣｃＣＰ−１ ｕｐ／ＣｃＣＰ−１ ｌｏｗ）を使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲ産物を、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。ＲＰＬ３９；６０Ｓリボソーム大サブユニットのＬ３９タンパク質をコードするｃＤＮＡの増幅されたフラグメント。
【図６】ＣｃＣＰ１タンパク質の発現のウエスタンブロット分析を示す図である（Ａ）。総タンパク質を、小さい緑（ＳＧ）、大きい緑（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤（Ｒｅｄ）の段階の、発達中のコーヒーチェリーから収集した粒（ｇ）及び果皮（ｐ）から抽出した。パネルＢ−クマシーブルーで染色した１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での５０μｇの総タンパク質の分離。パネルＡ−タンパク質検出を、これらの方法において記載されるように、抗ＣＲＰ４ポリクローナル抗体（ウサギ）を使用して実施した。パネルＢ中のバンドのおおよそのサイズを左側に矢印で示す。各パネル内の大きい矢印は、これらの抗体のうち１つと交差反応する主要な貯蔵タンパク質の存在を示す。
【図６Ａ】ＣｃＣＰＩ−１ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ＡＡＯ１８６３８；４２．３％の同一性）、Ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（ＪＥ０３０８；４１．５％の同一性）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６４９８５；３０％の同一性）及びＲｕｍｅｘ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｓ（ＣＡＤ２１４４１；２９．３％の同一性）。
【図７】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２（Ａ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ ＦＲＴ−３２（Ｂ）の異なる組織におけるＣｃＣＰＩ−１遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１０００希釈した各ｃＤＮＡ １０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で１分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、CcCPI-1(up)5'AGGAAAGTGGGAGCAAGGGAGAAGA3'、CcCPI-1(low)5'TAGTATGAACCCAAGGCCGAACCAC3'.であった。レーンは以下のように標識される：Ｍ、マーカー；＋Ｐ、ＣｃＣＰＩ−１遺伝子を含む希釈したプラスミド；Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。
【図８】ＣｃＣＰＩ−２ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｒｕｍｅｘ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｓ（ＣＡＤ２１４４１；６６．７％の同一性）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（ＡＡＫ３０００４；７１．７％の同一性）、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（ＡＡＦ７２２０２；６５．２％の同一性）。
【図９】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２（Ａ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ ＦＲＴ−３２（Ｂ）の異なる組織におけるＣｃＣＰＩ−２遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１０００希釈した各ｃＤＮＡ１０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、５７℃で１．５分間及び７２℃で１分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、CcCPI-2(up)5'GTGAAGCCATGGTTGAACTT3'、CcCPI-2(low)5'GTAATGATACCTCAAGCCAGA3'.であった。レーンは以下のように標識される：Ｍ、マーカー；＋Ｐ、ＣｃＣＰＩ−２遺伝子を含む希釈したプラスミド；Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。
【図１０】ＣｃＣＰＩ−３ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ（ＡＡＧ３８５２１；４２．４％の同一性）、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ（ＡＡＲ９２２２３；４４．４％の同一性）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６４６６１；４４％の同一性）。
【図１１】ＣｃＣＰＩ−４ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長システインプロテイナーゼとの最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。ＥＭＢＬデータベースの登録番号及び％同一性は、括弧内に与えられる。Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ（ＡＡＧ３８５２１；２３．６％の同一性）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６４６６１；２０％の同一性）。
【図１２】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ ＣＣＣＡ２（Ａ）及びＣｏｆｆｅａ ｒｏｂｕｓｔａ ＦＲＴ−３２（Ｂ）の異なる組織におけるＣｃＣＰＩ−４遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＰＣＲ反応を、１／１００希釈した各ｃＤＮＡ１０μｌを使用して実施した。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で１分間）×４０サイクルであった。最終伸長ステップは７２℃で７分間であった。ＰＣＲプライマーは、CcCPI-4(up)5'CTACGGTCGCAGCCAAATC3'、CcCPI-4(low)5'ACAACTGCACCTTCAATGTAC3'.であった。レーンは以下のように標識される：Ｍ、マーカー；＋Ｐ、ＣｃＣＰＩ−４遺伝子を含む希釈したプラスミド；Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。
【図１３】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるアスパラギン酸プロテイナーゼ２（ＣｃＡＰ２）遺伝子のノザンブロット分析を示す図であり、図中、レーンは以下で標識される：Ｒ：根、Ｓ：茎、Ｌ：若葉；Ｆ：花；ＳＧ（Ｇ）及びＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｇ）及びＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｇ）及びＹ（Ｐ）並びにＲｅｄ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリー由来の粒及び果皮についてであり、ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリー由来の果皮についてである。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。パネルＡは、ローディングコントロールとしてのブロッティング前の大きいリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を実証し、パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＡＰ２ ｍＲＮＡの出現を示すオートラジオグラムである。
【図１４】ＣｃＣＰ−４のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。小文字：５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域；大文字：オープンリーディングフレーム；太字：アミノ酸配列；＊：終止コドン。
【図１５】ＣｃＣＰ−４ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の完全配列と、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能な他の全長システインプロテイナーゼとのアラインメントを示す図である。これは、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）中のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを使用して実施した。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。登録番号は括弧内に与えられる。Ｄａｃｕｓ ｃａｒｒｏｔａ（ＪＣ７７８７）；Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＡＦ０５０７５６）；Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ（Ｚ３４８９５）；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｘ５６７５３）；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ＡＢ１０９１８８）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｃｙｓ１（ＡＢ０９２５５５）；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｃｙｓ２（ＡＢ０９２５５７）；Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（Ｐ４９０４６）；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＡＢ００４６４８）；Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ（Ｐ１２４１２）；Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ＡＪ００４９８５）。
【図１６】Ｍｅｇａｌｉｇｎ中のプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用して整列された全長ｃＤＮＡ配列ＣｃＣＰ−４ ＫＤＤＬ及び部分的ｃＤＮＡ配列ＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）を示す図である。
【図１７】Ｍｅｇａｌｉｇｎ中のプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用して整列されたＣｃＣＰ−４（ＫＤＤＬ）の完全オープンリーディングフレーム及びＣｃＣＰ−４（ＫＤＥＬ）の部分的オープンリーディングフレームを示す図である。
【図１８】ＣｃＣＰ−４遺伝子のＫＤＥＬ／ＫＤＤＬ領域をコードするＰＣＲ増幅されたゲノムＤＮＡについてのＤＮＡ配列クロマトグラムを示す図である。Ｒｏｂはｒｏｂｕｓｔａ変種を示し、Ａｒａｂはａｒａｂｉｃａ変種を示す。
【図１９】Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの異なる組織におけるシステインプロテイナーゼＣｃＣＰ−４遺伝子の発現のノザンブロット分析を示す図である。レーンは以下で標識される：Ｒ、根；Ｓ、茎；Ｌ、若葉；Ｆ、花。ＳＧ（Ｇ）、ＬＧ（Ｇ）、Ｙ（Ｇ）及びＲｅｄ（Ｇ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された粒である。ＳＧ（Ｐ）、ＬＧ（Ｐ）、Ｙ（Ｐ）及びＲｅｄ（Ｐ）はそれぞれ、小さい緑のチェリー、大きい緑のチェリー、黄色いチェリー及び赤いチェリーから単離された果皮組織である。各レーンにおいて５μｇの総ＲＮＡをロードした。パネルＡは、ローディングコントロールとしてのブロッティング前の大きいリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を実証し、パネルＢは、試験した特定の組織中のＣｃＣＰ−３ ｍＲＮＡの出現を示すオートラジオグラムである。
【図２０】発芽の間の粒全体におけるＣｃＣＰ−４の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。サンプリング時間は以下であった：０、滅菌処理の直後；２Ｄ、処理の２日後；３Ｄ、処理の３日後；５Ｄ、処理の５日後；１Ｍ、処理の１ヵ月後；２Ｍ、処理の２ヵ月後；−、ＤＮＡなしのコントロール；＋Ｐ、希釈したＣｃＣＰ−４プラスミドＤＮＡ；Ｍ、分子量マーカー。
【図２１】ＣｃＡＰ−１ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長アスパラギン酸プロテイナーゼ配列との最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。データベースの登録番号は括弧内に与えられる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＹ０９９６１７）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＢＡＢ０９３６６）。
【図２２】ＣｃＡＰ−２ ｃＤＮＡによってコードされる完全タンパク質と、ＮＣＢＩにおいて入手可能な他の相同な全長アスパラギン酸プロテイナーゼ配列との最適なアラインメントを示す図である。影付のブロックは同一のアミノ酸を示す。データベースの登録番号は括弧内に与えられる。Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＢＡＢ６４２９６）、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ（ＡＡＫ４８４９４）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｓ７１５９１）及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ（ＢＡＢ２０９７２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システインプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
システインプロテイナーゼインヒビター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、９、１１及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号４、１０、１２及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８、好ましくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号５又は７、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号６又は８、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
システインプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１６のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１６のアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１８】
調節配列に作動可能に連結された請求項１から１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換するステップを含む、細胞を形質転換するための方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物を含む細胞。
【請求項２１】
原核細胞、真核細胞又は植物細胞、好ましくはコーヒー細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項２３】
緑のコーヒー粒中のコーヒーフレーバー前駆体レベルを調節するための方法であって、請求項１８に記載の非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物をコーヒー植物中に導入するステップを含む方法。
【請求項１】
システインプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
システインプロテイナーゼインヒビター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４、１０、１２及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、９、１１及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号４、１０、１２及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
アスパラギン酸エンドプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号６又は８、好ましくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号５又は７、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号６又は８、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
システインプロテイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１６のアミノ酸配列とは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記相補体は前記ヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドを含み、前記相補体と前記ヌクレオチド配列とは１００％相補的であるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１６のアミノ酸配列とが、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法に基づいて、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１８】
調節配列に作動可能に連結された請求項１から１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換するステップを含む、細胞を形質転換するための方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物を含む細胞。
【請求項２１】
原核細胞、真核細胞又は植物細胞、好ましくはコーヒー細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項２３】
緑のコーヒー粒中のコーヒーフレーバー前駆体レベルを調節するための方法であって、請求項１８に記載の非ネイティブの組換えＤＮＡ構築物をコーヒー植物中に導入するステップを含む方法。
【図１】
【図２】
【図２Ａ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図２Ａ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２００９−５１３１０２（Ｐ２００９−５１３１０２Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６０４０（Ｐ２００６−５１６０４０）
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６８０５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５２０
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【出願人】（５０５２９４４２５）コーネル リサーチ ファウンデイション インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６８０５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５２０
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【出願人】（５０５２９４４２５）コーネル リサーチ ファウンデイション インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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