緑茶の品質予測方法
【課題】緑茶の品質、特に従来困難であった製品緑茶の総合品質を、簡便にかつ精度よく予測する方法を提供すること。
【解決手段】本発明の緑茶の品質予測方法は、緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および得られた解析結果から、品質を予測する工程を含む。好ましくは、品質既知の複数の緑茶の機器分析結果について多変量解析としてＰＬＳ回帰分析を行うことにより品質予測モデルが作成され、品質未知の緑茶についての解析結果を品質予測モデルと照合する。
【解決手段】本発明の緑茶の品質予測方法は、緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および得られた解析結果から、品質を予測する工程を含む。好ましくは、品質既知の複数の緑茶の機器分析結果について多変量解析としてＰＬＳ回帰分析を行うことにより品質予測モデルが作成され、品質未知の緑茶についての解析結果を品質予測モデルと照合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶の品質予測方法に関する。より詳細には、緑茶の代謝物または分解物の機器分析による品質予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶は最も普及している飲料であり、Camellia sinensisという植物の葉から製造される。酸化反応の長さおよび葉の加工方法に基づいて、紅茶、ウーロン茶、および緑茶の３つの種類に分類される。このうち緑茶は、まず加熱によって酸化酵素が不活性化されるので、酸化されておらず、そして発酵させていない。そのため、緑茶の味は、茶木の種類、摘採時間、栽培方法などによって決定される。
【０００３】
現在、緑茶の最終品質は、熟練者による葉の外観、芳香、色、および味に基づく官能検査により決定されている。これらの技能を獲得するには経験年数がかかる。また、客観性や再現性が低いという欠点がある。そのため、製造工程管理や製品品質管理のためには、簡便な機械化された品質予測方法が必要である。これまで、緑茶の品質予測方法として、近赤外分光法を用いた方法（特許文献１および２）ならびに茶葉の性状に基づく方法（特許文献３〜５）が開示されている。
【０００４】
特許文献１には、可視光および近赤外線を用いて茶葉、特に加工前の生茶葉、の品質を測定する方法が記載されている。可視光から茶葉の色を、そして近赤外線から茶葉の成分を測定すると記載されているが、近赤外線から具体的にどのような成分を測定し、どのように品質を予測するのかについては記載されていない。特許文献２には、近赤外分光法を用いて、茶葉中の遊離アミノ酸の含有率と中性デタージェント繊維の含有率とを求めることによって品質評価する方法が記載されている。しかし、これらの近赤外分光に基づく方法は、生葉の品質予測には効力を発するが、製品緑茶の品質予測の実績はほとんどない。
【０００５】
特許文献３〜５には、生茶葉の含水量、含繊維量、含窒素量、外観などの性状を測定することによって、品質を評価することが記載されている。しかし、含水量などの性状に基づく方法は、簡便であるが、精度に乏しい。
【特許文献１】特開２０００−３４６７９７号公報
【特許文献２】特開平８−１１４５４３号公報
【特許文献３】特開２０００−２２８９５０号公報
【特許文献４】特開平１１−３１３６０８号公報
【特許文献５】特開平９−２２４５７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
化学分析は、緑茶の品質を評価するために最も信頼性のある方法であると思われる。機器分析法と強力なコンピュータ駆動パターン認識技術との組み合わせから、複雑な材料の品質制御および特徴づけのための新たな可能性が実現されている。そこで、本発明は、緑茶の品質、特に従来困難であった製品緑茶の総合品質を、簡便に予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
緑茶の味は、アミノ酸、特に茶葉中の約６０〜７０％のアミノ酸を占める独特のテアニンに起因する。その収歛性の味は、カテキン（タンニン）によるものであり、苦味はカフェインによるものである。また、揮発性化合物は、主として茶の香りの差に寄与する。栽培品種の差、環境的効果、加工方法などにより、中間経路代謝物の見かけの定常状態の量および／または最終代謝物の末端蓄積も変動する。また、加熱処理による分解物も緑茶の味に影響を与える。したがって、茶葉中の代謝物や分解物を、空間的および時間的の両方でモニターすることは、品質の評価に重要である。
【０００８】
クロマトグラフィーにおいて、パターン認識方法に基づくフィンガープリンティングは、種々の分析領域、例えば、食品および栄養分野で加工モニタリングおよび制御（生材料の等級付け、日常的なオンライン品質チェック、または製品が製造される工程の測定）、地理的起源（成分の化学組成による供与源の測定、風味および芳香成分による最終製品の起源の追跡）の分析に使用されている。
【０００９】
そこで、本発明は、医用目的の抗酸化化合物、ならびに呈味および芳香用のカテキンおよび他のフェノール性化合物などの、特定の機能に重要であると考えられる特定の群の限られた数の個々の化合物の特徴づけの代わりに、代謝物や分解物に注目し、これらについての化学的フィンガープリントと多変量解析と組み合わせることによって、総合的にかつ迅速に緑茶を分析できることに基づいて完成された。
【００１０】
本発明は、緑茶の品質予測方法を提供し、該方法は、
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果から、品質を予測する工程を含む。
【００１１】
本発明はまた、品質既知の複数の緑茶を前処理して個別の分析サンプルを得る工程；
該個別の分析サンプルを機器分析に供して個別の分析結果を得る工程；および
該個別の分析結果と該品質との関係を数値データに変換して多変量解析する工程；
によって得られる、緑茶の品質予測モデルを提供する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記多変量解析は、ＰＬＳ回帰分析である。
【００１３】
好適な実施態様では、上記前処理は、上記緑茶を熱分解処理する工程を含み、そして前記機器分析が、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである。より好適な実施態様では、上記解析結果は、保持時間に基づいて品質予測される。
【００１４】
他の好適な実施態様では、上記前処理は、上記緑茶から親水性化合物を抽出して抽出物を得る工程を含む。
【００１５】
より好適な実施態様では、上記機器分析は、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせであり、そして上記前処理はさらに上記抽出物をシリル化する工程を含む。
【００１６】
さらに好適な実施態様では、上記分析結果の中で、アラビノース、グルタミン、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、イノシトール、シキミ酸、リン酸、フルクトース、テアニン、リンゴ酸、カフェイン、キナ酸、グルコース、マンノース、リボース、およびスクロースのデータが解析される。
【００１７】
別の好適な実施態様では、上記機器分析は、液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ（特に、高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、または超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ）、または核磁気共鳴分析（特に、フーリエ変換核磁気共鳴分析）である。
【００１８】
他の好適な実施態様では、上記前処理は、上記緑茶を粉砕して粉末を得る工程および該粉末を溶媒でペースト状にする工程を含む。
【００１９】
より好適な実施態様では、上記機器分析は、赤外分光分析または近赤外分光分析（特に、フーリエ変換赤外分光分析またはフーリエ変換近赤外分光分析）である。
【００２０】
さらに好適な実施態様では、上記機器分析は、フーリエ変換近赤外分光分析であり、上記多変量解析する工程において、上記分析結果の中で５５００〜５２００ｃｍ−１の結果についてデータ変換し、変換されたデータをさらに二次微分する。
【００２１】
別の好適な実施態様では、上記分析結果は、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、フーリエ変換赤外・近赤外分光分析、およびフーリエ変換核磁気共鳴分析からなる群より選択される少なくとも２つの機器分析の分析結果である。
【００２２】
本発明はさらに、緑茶の品質予測方法を提供し、該方法は
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果を、上記のいずれか品質予測モデルと照合する工程を含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、従来困難であった製品緑茶の総合品質を、より精度よくかつ簡便な方法で予測することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
緑茶は、生茶葉を加熱して酵素活性を失わせ、成分の酸化を防ぎ、緑色を保持させた不発酵茶である。本発明において品質予測の対象となる緑茶は、加工前の生茶葉であってもよいが、好ましくは、荒茶、仕上げ茶（すなわち、製品緑茶）のような緑茶としての加工が施された緑茶の葉である。本発明においては、より好ましくは、製品緑茶を品質予測の対象とする。
【００２５】
本発明において、緑茶は、以下で述べる機器分析に応じて適切に前処理された後、種々の機器分析に供される。
【００２６】
本発明において、機器分析とは、分析機器を用いる分析・測定手段をいい、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ））、質量分析（ＭＳ）、赤外分光分析（ＩＲ）（例えば、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ））、近赤外分光分析（ＮＩＲ）（例えば、フーリエ変換近赤外分光分析（ＦＴ−ＮＩＲ））、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）（例えば、フーリエ変換核磁気共鳴分析（ＦＴ−ＮＭＲ））などが挙げられる。これらの機器分析は組み合わせてもよく、例えば、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ（特に、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＵＰＬＣ／ＭＳ）などの組み合わせが挙げられる。これらの機器分析に用いられる装置は、特に限定されず、緑茶中に含まれる代謝物（例えば、アミノ酸、有機酸、糖）を測定することが可能であれば、通常用いられている装置が用いられ得る。また、測定条件は、これらの物質の測定に適切なように当業者によって適宜設定され得る。
【００２７】
前処理は、緑茶中の分析対象物質を機器分析に供するに適した形態にするために、上述のように機器分析に応じて行われる。前処理としては、乾燥、切断、粉砕、抽出などの処理が挙げられる。例えば、粉砕については、ブレンダー、ボールミルなどの適切な器具を用いて行われ得る。また、抽出については、水、有機溶媒、またはこれらの溶媒の混合液を用いて行われ得る。抽出に使用され得る有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、クロロホルムなどが挙げられる。抽出操作としては、緑茶を水および／または有機溶媒中で加熱して、熱分解物を抽出してもよい。加熱温度は、使用される溶媒に応じて適宜決定され得、通常は、常圧下で溶媒の沸点付近の温度である。加熱時間も適宜設定される。これらの単位操作を単独でまたは組み合わせて適切な前処理条件を設定する。
【００２８】
例えば、機器分析としてＧＣを行う場合、好ましくは、前処理は、緑茶からの抽出物をシリル化する工程をさらに含む。シリル化は、当業者が通常用いるＧＣ用のシリル化試薬を用いて行われ得る。あるいは、前処理として、緑茶を、例えば、粉砕した後、熱分解処理のみ施したものも、分析対象試料となり得る。この場合、熱分解物を、抽出することなく直接ＧＣに導入することができる。熱分解は、市販の熱分解装置を用いて行うことができる。
【００２９】
機器分析としてＩＲ・ＮＩＲを行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶の粉末を溶媒でペースト状にする工程を含む。粉末を得る工程は、上記のとおりである。ペーストにするための溶媒は、例えば、ＩＲ測定用試料の調製のために、試料に応じて通常選択される溶媒が用いられる。
【００３０】
機器分析としてＮＭＲを行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトンなどが挙げられる。
【００３１】
機器分析としてＬＣ、特にＨＰＬＣを行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。用いるカラムとしては、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、およびイオン交換カラムが挙げられる。ＨＰＬＣの条件（例えば、流速、検出器、移動相など）は、試料に応じて適宜選択される。
【００３２】
機器分析として超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。ＵＰＬＣは、微小なカラム粒子に高い線速度の移動相を通過させて、速い分析スピード、高い分離能、および高感度が達成される。ＵＰＬＣに用いられるカラム粒子は、ＨＰＬＣに用いるカラム粒子（例えば、５μｍまたは３．５μｍ）よりも小さい直径（例えば、１．７μｍ）を有するカラム粒子であり、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、およびイオン交換カラムが挙げられる。ＵＰＬＣの条件（例えば、流速、検出器、移動相など）は、試料に応じて適宜選択される。
【００３３】
上記の前処理が施された緑茶サンプルは、任意の機器分析に供され、分析結果が得られる。得られた分析結果は、緑茶サンプルのフィンガープリントであり得る。このフィンガープリントを数値データに変換して多変量解析が行われる。分析により得られる結果（変数）としては、保持時間、波長（または波数）、ならびにシグナル強度（またはイオン強度）、吸光度などのスペクトルデータが挙げられる。さらに、変数としては、緑茶サンプルのランキング（等級）も挙げられる。
【００３４】
多変量解析としては、機器分析データの解析に、特にケモメトリックスにおいて通常用いられる解析ツールが採用される。例えば、ＰＣＡ（主成分分析：principal component analysis）、ＨＣＡ（階層クラスター分析：hierarchical cluster analysis）、ＰＬＳ回帰分析（潜在的構造に対する射影：Projection to Latent Structure）、判別分析（discriminate analysis）などの種々の多変量ツールが挙げられる。さらに、部分最小二乗によるＰＬＳ（Partial least square projection to Latent Structure）を用いて、関連の変量の２群間の関係；例えば、緑茶の代謝物とその品質との間の関係、が確認される。必要に応じて、スペクトルフィルタリング法、例えば、妨害成分を取り除くための直交シグナル補正（orthogonal signal correction：ＯＳＣ）と組み合わせて多変量解析が行われてもよい。これらの解析ツールは、ソフトウエアとして多数市販されており、任意のものが入手可能である。このような市販のツールは、一般的に、難しい数学・統計学の知識がなくても、多変量解析を行うことができるように操作マニュアルが備えられている。
【００３５】
多変量解析は、得られた全データではなく、品質予測に重要な一定の範囲のデータを選択して行ってもよい。例えば、緑茶の粉末をペースト状にしてＦＴ−ＮＩＲで分析する場合、５５００〜５２００ｃｍ−１の波数域のデータについてＰＣＡを行うことが好ましい。
【００３６】
本発明において好適に採用されるＰＬＳ回帰分析は、変数（例えば、波数、波長）間に相関を有するスペクトルデータからの検量線作成に有効な手法である。通常、変数間に相関があると、用いる変数の組み合わせによっては回帰精度が著しく低下するが、これを避けるためにＰＬＳでは変数を互いに無相関な変数（潜在変数）に変換し、この潜在変数を用いて回帰を行う。すなわち、ＰＬＳとはデータの変数を直交変換し、その新たな変数を用いて（重）回帰分析を行う解析手法である。
【００３７】
具体的には、複数の品質既知の緑茶サンプルから親水性低分子代謝物を抽出してあるいは緑茶の熱分解物についてＧＣ／ＭＳにより定量解析を行う場合には、得られたＧＣ／ＭＳクロマトグラムから保持時間インデックスを独立変数、質量分析シグナル強度を従属変数としてマトリクスデータを作成する。ランキング既知の複数の緑茶サンプルのランキング順位を説明変数として、既知サンプルをトレーニングセットとしてＰＬＳ法によりランキング予測モデルを作成できる。例えば、品質未知の緑茶サンプルから同様に機器分析して得られたデータを多変量解析し、その解析結果を予測モデルと比較・照合することによって、どのランキングに位置するかがわかるため、品質を予測することができる。
【００３８】
例えば、緑茶から代謝物を抽出してＧＣ／ＭＳで分析した場合、得られる分析結果は、種々の代謝物の保持時間、マススペクトル、イオン強度などがある。この場合、特に、アラビノース、グルタミン、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、イノシトール、シキミ酸、リン酸、フルクトース、テアニン、リンゴ酸、カフェイン、キナ酸、グルコース、マンノース、リボース、およびスクロースのデータは、緑茶の品質予測（等級分類）に重要な役割を果たす。本発明により、高いランキングの緑茶サンプル中には、代謝物として、アミノ酸、キナ酸、リン酸、リボース、およびアラビノースの量が比較的多く、低いランキングの緑茶サンプル中には、フルクトース、グルコース、マンノースなどの糖が主代謝物として存在する傾向があることが、明らかになっている。
【００３９】
また、上記の方法によって得られる予測モデルは、データの蓄積により、精度が上昇し得る。したがって、例えば、緑茶中の代謝物の相対量の傾向がより明確になれば、品質未知の緑茶の分析結果からフィンガープリントを得、このフィンガープリントに基づいて品質予測をすることも可能となる。
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ＧＣ／ＭＳ用の分析サンプルの調製）
２００５年の品評会でランキング（格付け）された５３種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。市販茶品評会に記載されたこれらの茶サンプルは、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。茶のランキングは、官能試験の総合スコアによって決定され、これは、葉の外観、入れた茶の芳香、色、および味であり、専門の茶の鑑定人によって鑑定された。なお、ランキングの高い方から順に、１番から５３番まで順位をつけた。
【００４１】
まず、２ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（３０ｍｇ）を凍結乾燥し、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１分間）で粉砕した。この茶葉に、メタノール、水、およびクロロホルムの混液（２．５：１：１、v/v/v）を１ｍＬ加え、さらに内部標準として６０μＬのリビトール（和光純薬工業株式会社：脱イオン水で０．２ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈）を加えて、５分間振盪し、そして４℃にて１６０００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、９００μＬの上清を、１．５ｍＬ容のエッペンドルフ管に移した。Millipore Milli-Qシステム（Berdford、MA）を用いて精製された４００μＬの水を添加して、ボルテックスおよび遠心分離し、次いで４００μＬの極性相を、穴あきキャップでキャップした他の１．５ｍＬ容のエッペンドルフ管に移した。得られた抽出物（親水性化合物）を、乾燥するまで（一晩）真空遠心分離乾燥機中で乾燥させた。
【００４２】
次いで、この抽出物に５０μＬの塩酸メトキシアミン（Sigma）のピリジン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、第１の誘導体化剤として添加した。混合物を３０℃にて９０分間インキュベートした。さらに、第２の誘導体化剤である１００μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド（ＭＳＴＦＡ：GL sciences Inc.）を添加して、３０℃にて３０分間インキュベートすることにより抽出物を誘導体化して、分析サンプルを得た。
【００４３】
（実施例２：ＧＣ／ＭＳによる緑茶サンプルの分析）
上記実施例１で得られた１μＬの分析サンプルを、スプリットモードでＧＣ／ＭＳに注入した（２５：１、v/v）。本実施例で使用したＧＣ／ＭＳ装置は、Pegasus III TOF質量分析器（LEGO）ならびにオートサンプラーとして７６８３Ｂシリーズインジェクター（Agilent Co.）を連結した０．２５μｍ CP-SIL 8 CB低ブリード（Varian Inc.）でコーティングされた３０ｍ×０．２５ｍｍ i.d.のフューズドシリカキャピラリーカラムを装着した６８９ＣＮ（Agilent Co.）であった。注入温度は２３０℃であった。カラムを通るヘリウムガスの流速は、１ｍＬ／分であった。カラム温度は、２分間８０℃で等温に保ち、次いで１５℃／分で３３０℃まで上昇させ、そして６分間等温に保った。搬送ラインおよびイオンソース温度は、それぞれ２５０℃および２００℃であった。イオンを、７０ｋＶ電子衝撃（ＥＩ）によって生成し、そして１秒当たり２０スキャンを、８５〜６５０ｍ／ｚの質量範囲にわたって記録した。加速電圧は、２５０秒の溶媒遅延後に作動した。
【００４４】
（実施例３：ＧＣ／ＭＳによるデータの解析および緑茶の代謝物のフィンガープリンティング）
上記実施例２においてＧＣ／ＭＳにより得られたデータの前処理については、得られた生のクロマトグラフデータ（Pegasusファイル、*.peg）を、ANDIファイル（分析データ交換プロトコル、*.cdf）に変換した。ANDIフォーマットを用いると、異なるマススペクトルデータシステム間のデータの変換および転送を行うことができた。変換したファイル（ANDI）を、データ前処理手順に供し、データ点を詳細に再処理した。さらに、データ変換も、最良のクロマトグラフデータを得るために行った。次いで、トータルイオンクロマトグラフデータを抽出し、そしてフラグメントデータなしのANDIフォーマットとして保存した。これらのファイルを、保持時間のマルチプルアライメント用の市販のソフトウエアのLineUp（Informatrix, Inc.）に移行した。ミスアライメントピークを、相関最適化ワーピングアルゴリズムを用いてアライメントした。
【００４５】
次いで、多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。市販のソフトウエアであるPirouette（登録商標）（Informatrix, Inc.）をこの目的に適用した。
【００４６】
５３種のランキングされた一番茶サンプルを、それらの等級に従ってランキングされた３群に分けたが、これらの３群の分類は明瞭ではなかった。各所定の群に約２０サンプルがあるので各群のサンプルの変動が非常に高すぎたため、高いランキングのサンプルは、低いランキングのサンプルとは別の明らかな集団を示さなかった。次いで、低いランキング（５１番）および高いランキング（１番）のサンプルについて、再度、データを変換せずに平均中央で前処理した。その結果、これらの群間で、ある程度の差があることがわかった（図１）。
【００４７】
顕著な化合物を、そのマススペクトルとライブラリー（NISTライブラリーおよび認証された標準化学物質から調製された内部ライブラリー）中のスペクトルとを比較することによって同定した。さらに、the Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology、Germanyによって提供されたライブラリーも、この目的に用いた（http://www.mpimp-golm.mpg.de/mms-library/index-e.htlm）。高いランキングのサンプル中には、アミノ酸、キナ酸、リン酸、リボース、およびアラビノースの量が比較的多いが、低いランキングのサンプルでは、主として糖（フルクトース、グルコース、およびマンノース）であった。これは、メタボロミクス解析が、緑茶の品質測定に有用であり得ることを示した。
【００４８】
次いで、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択して、予測モデルを作成した。ＰＬＳにより、２セットの変量（測定値および応答値）間の関係が見出される。すなわち、得られたＧＣ／ＭＳクロマトグラムから保持時間インデックスを独立変数、質量分析シグナル強度を従属変数としてマトリクスデータを作成し、各サンプルの品評会ランキング順位を説明変数として、既知サンプルをトレーニングセットとしてＰＬＳ法によりランキング予測モデルを作成した。
【００４９】
サンプルの代謝物フィンガープリント（マトリクスＸ）とその品質（マトリクスＹ）との間の関係を観察した。まず、分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。２番、１２番、２２番、３２番、４２番、および５２番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。変換した変数はなかった；変数の全てを集約し、そしてパレート分散にスケールして、クロマトグラフデータノイズ効果を減少させた。モデルの完全性、すなわち、ＰＬＳモデルにおける潜在的ファクターの数は、クロスバリデーションによって決定され得、最適な数は、（モデルに対する）適合と予測能との間のバランスで見られた。さらに、ＰＬＳモデルは、テストセットでバリデートされ、予測値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＰ）をコンピュータ計算した。２つの顕著な成分を抽出し、クロスバリデーションに従って、Ｙの８０．７％の変動を記述し（Ｒ２Ｙ＝０．８０７）そしてＹの３１．３％の変動を予測した（Ｑ２Ｙ＝０．３１３）（図２参照）。次いで、テストセットについて、ＰＬＳモデルで予測し、トレーニングセットサンプル（ＲＭＳＥＰ＝６．９１）に基づくモデル評価に関して、テストサンプル（ＲＭＳＥＰ＝１０．２３）の予測精度が得られた（図３）。このＰＬＳモデルにより、ある程度の予測が得られた。
【００５０】
さらに、ＰＬＳモデルの予測力を増強するために、スペクトルフィルタリング技術を適用した。ＯＳＣは、ＰＬＳベースの解決手段であり、Ｙのモデリングに関連のないＸデータ変動値を除去する。ＯＳＣでは、１つの成分を、非線形反復部分最小二乗法（ＮＩＰＡＬＳ）アルゴリズムを用いるマトリクスＸから１つずつ除去する。上記のＰＬＳモデルから２つのＯＳＣ成分を除去することにより、Ｑ２Ｙは、０．５００まで上昇した。二乗の残余合計は４１．４０％であった。したがって、５８．６０％のＸの変動値は、Ｙに関連せず、除去された（図４参照）。テストセットをモデルに供した後の予測値は、トレーニングサンプル（ＲＭＳＥＰ＝６．５７）に基づくモデル評価とよく一致するテストサンプル（ＲＭＳＥＥ＝８．１３）についての予測精度になった（図５）。さらに、高い関連を有する説明変数Ｙも、ＶＩＰ（投影における変数重要性）値から同定した。１を超える大きなＶＩＰ値は、最も関連がある説明変数Ｙである。このように、キナ酸、アミノ酸（特にテアニン）、および糖類が、緑茶についての品質予測モデルを作成するために重要であることを見出した（図６）。
【００５１】
（実施例４：ＧＣ／ＭＳによる緑茶代謝プロファイリング）
高い等級の茶として受け入れられている大和茶を、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。緑茶サンプルの前処理方法およびＧＣ／ＭＳによる分析条件は、上記実施例１および２と同じであった。クロマトグラムの分離度は満足のいくものであるため、各代謝物のピーク面積を、総イオンカウント（ＴＩＣ）により算出した。続いて、同定した代謝物の全てのピークを内部標準のリビトールに対して標準化した。この分析から、緑茶の乾燥葉は、以下の表１に示すような、多くの化合物、主として有機酸、アミノ酸 および糖類（単糖類および二糖類の両方）を含むことがわかった。最高量で検出した化合物は、糖類であり、特にスクロースおよびフルクトースが多かった。茶の独特の呈味に寄与する重要なアミノ酸であるテアニンも検出した。抽出物中にいくつかの他のアミノ酸を同定できたが、少量であった。約２３の同定した代謝物は、クロマトグラムから同定した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
このことから、上記実施例３で得られたケモメトリクスと組み合わせたＧＣ／ＭＳを用いるメタボロミクス解析が、緑茶の研究において有用な情報を提供することが証明された。
【００５４】
（実施例５：１Ｈ−ＮＭＲ用の分析サンプルの調製および分析）
上記実施例１と同様に、２００５年の品評会でランキング（格付け）された５３種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。
【００５５】
まず、１ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（５０ｍｇ）を凍結乾燥し、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１分間）で粉砕した。この茶葉に、１ｍＬの重水（重水素原子９９．９％：Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）を加えた。この混合物を、Thermomixer comfort（Eppendorf）で６０℃および１４００ｒｐｍにて３０分間インキュベートし、２５℃および１６０００×ｇにて１０分間遠心分離した（遠心分離機5415R：Eppendorf）。親水性代謝物を含む上清を、０．４５μｍのＰＴＦＥメンブレン（Advantec）を通して濾過した。次いで、４００μＬの濾液を、内部標準として３ｍＭの３−（トリメチルシリル）−１−プロパン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ：Aldrich）を含む２００μＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。なお、サンプル調製は、１Ｈ−ＮＭＲ測定の１日前に行った。
【００５６】
得られた分析サンプルを、１Ｈ−ＮＭＲによって測定した。本実施例では、７５０ＭＨｚ Varian Inova 750スペクトロメーターを使用し、５ｍｍの１Ｈ｛１３Ｃ／１５Ｎ｝三重共鳴間接検出プローブを用いて２５℃にてスペクトルを記録した。１Ｈ−ＮＭＲ測定は、６４トランジエントおよび１３１Ｋ複合データポイントで行った。捕捉時間およびリサイクル遅延は、３０°パルス角を用いて、１スキャン当たりそれぞれ６．２５７秒および３．７４３秒であった。予備飽和パルスシーケンスを適用して、残存水のシグナルを抑制した。すべてのスペクトルは、データ処理前に０．１Ｈｚ線幅広がりでフーリエ変換した。
【００５７】
（実施例６：１Ｈ−ＮＭＲのデータの解析、緑茶の代謝物のフィンガープリンティング、および緑茶代謝プロファイリング）
１Ｈ−ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルは、まず、Chenomx NMR Suite4.6ソフトウエアプロフェッショナル版（Chenomx Inc., Canada）によって位相およびベースライン補正した。１．０〜８．０ｐｐｍの範囲にわたって、０．０４ｐｐｍのサイズで積分した。一方、４．６〜５．０ｐｐｍの水のシグナルは削除した。すべての測定値は、ＤＳＳのメチルのピーク面積に対して標準化した。
【００５８】
最高品質の茶から抽出した水溶性化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図７に示す。代謝物由来のシグナルを、同条件下で分析した公知の標準化合物由来のシグナルならびにChenomx NMR Suite4.6の７５０ＭＨｚ（ｐＨ４〜９）ライブラリデータベースとの比較によって帰属した。このうち、約１０の主要な化合物を同定することができた。テアニン、アミノ酸、およびキナ酸が高磁場領域（δ０．５〜３．０ｐｐｍ：図７Ａ）で主として観察された。中磁場領域（δ３．０〜４．５ｐｐｍ：図７Ｂ）においては、スクロースおよびフルクトース以外では、カフェイン、アルギニン、ミオイノシトール、クロロゲン酸、およびキナ酸が明確に観察された。低磁場領域（δ５．０〜８．０ｐｐｍ：図７Ｃ）には、２−Ｏ−β−Ｌ−アラビノピラノシル−ミオイノシトール、ｐ−クマリル−キナ酸またはケイ皮酸、（−）−エピガロカテキン−３−没食子酸（ＥＧＣＧ）、および（−）−エピカテキン−３−没食子酸（ＥＣＧ）が主に観察された。（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）および（−）−エピカテキン（ＥＣ）は、水溶性が低いため、あまり顕著には観察されなかった。
【００５９】
図８に、５３種のランキングされた一番茶サンプルについて得られたすべての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを重ねて示す。高磁場領域（図８Ａ）および低磁場領域（図８Ｃ）では顕著な差は見られなかったが、中磁場領域（図８Ｂ）では、いくつかの差が観察された。特に、δ３．２７および３．４３ｐｐｍのカフェインのシグナルが、高品質の茶サンプルで強かった。カフェインは、茶の苦味に寄与し、茶の品質に重要であることが知られている。したがって、ＮＭＲでの測定においても、品質予測モデルを作成するために重要な因子であることが示された。
【００６０】
次に、多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、Pirouette（登録商標）ソフトウエア（Informatrix, Inc.）を用いて、高磁場領域（δ１．０〜２．５ｐｐｍ）、中磁場領域（δ３．１２〜４．３４ｐｐｍ）、および低磁場領域（δ６．１５〜６．３５ｐｐｍ）についてそれぞれ主成分分析（ＰＣＡ）を行った。まず、５３種のサンプルを、それらの等級に従ってランキングされた２群に分けた（高品質：１〜２５番、および低品質：２６〜５３番）。スコアプロットにおいて、高磁場領域では、２群間の差は明瞭には見られなかったが、中磁場領域および低磁場領域では、高品質および低品質の２群に大まかに分けることが可能であった（データは示さず）。また、ローディングプロットでは、カフェイン、テアニン、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、およびＥＣ由来のシグナルが、クラスタ分離に寄与することがわかった（データは示さず）。
【００６１】
さらに、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択して、独立（予測）変数Ｘから従属（応答）変数Ｙを予測するための回帰モデルを作成した。回帰は、システム行動に基づく数学的モデルを作成することによって行われ、トレーニングサンプルに関するモデルパラメータに最適な値を決定する。次いで、未知の独立変数の値を、得られたトレーニングモデルを用いて予測する。本実施例では、品評会ランキング順位を従属変数として用いた。分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。５番、１５番、２５番、３５番、および４５番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとした。分析前に変換した変数はなく、データを集約し、そしてユニット分散にスケールした。
【００６２】
緑茶サンプルの測定値と予測値との間のＰＬＳ関係を図９に示す。なお、２番および８番のサンプルについては、ノイズが大きいため、モデル作成から除外した。ＰＬＳ回帰モデルの性能を、相関係数Ｒ２およびクロスバリデートした相関係数Ｑ２ならびに予測値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＰ）という測定値と予測値との間のバリデーション誤差によって検証した。緑茶のＰＬＳ回帰モデルは、Ｒ２＝０．９８７およびＱ２＝０．６７１（ＲＭＳＥＰ＝１．８２）を示した（図９）。これは、適合および予測力に優れることを示している。緑茶のランキング順位を予測するためのモデルの予測性を、テストセットによって試験した（図１１において丸で囲む）。予測結果は、理想的な対角線上から分散していた（ＲＭＳＥＰ＝９．２２）。このＰＬＳモデルにより、ある程度の予測が得られた。
【００６３】
さらに、ＰＬＳモデルの予測力を、直交シグナル補正（ＯＳＣ）を用いて変動を単純化することによって改善した。上記ＰＬＳモデルから２つのＯＳＣ成分を除去することにより、Ｑ２は０．６７１から０．９８２に上昇し、予測性は３１％改善した（図１０）。ＰＬＳ−ＯＳＣ回帰モデルの予測性を、再度テストセットによって検証した（図１０において丸で囲む）。ＲＭＳＥＰ値は９．２２から５．９１に顕著に減少した。図１０に示す回帰プロットによれば、Ｑ２の上昇およびＲＭＳＥＰの低下が、シグナル補正によって予測モデルの能力が劇的に改善されたことを示す。
【００６４】
ウェーブレット変換は、複雑なシグナルを圧縮してノイズを除き、関連のある情報のみを抽出するために用いられるシグナル処理のツールである。ＯＳＣとの組み合わせにより、予測力を損なうことなく多変量検定の質を改善できることが知られている。そこで、本実施例においても、ＯＳＣとウェーブレット変換との組み合わせ（ＯＳＣＷ）を適用した。１成分ＯＳＣフィルタリングにより、６３．４２％の非関連Ｘ変数が除去された。５０６ウェーブレット係数を用いて、二乗の合計の９９．５０％を保持した。得られたＰＬＳ−ＯＳＣＷ回帰を図１１に示す。Ｒ２およびＱ２はそれぞれ０．９８２および０．９４４であった。ＰＬＳ回帰モデルの予測能は、ＯＳＣＷの実行により改善され、テストセットでの検証では、ＲＭＳＥＰが５．９１から５．５３に低下していた（図１１において丸で囲む）。有益な変数を捕捉するためにＰＬＳモデルで用いられたウェーブレット係数の数は非常に高く、そして０．５％の非関連変数のみが除去された。これは、ほとんどすべてのＹ変数がＯＳＣフィルタリングによって捕捉され、ノイズから生じた一部の変動のみが残ったことを示す。ウェーブレット解析は、予測能を損失することなく残りの変数を除去することによって予備加工性能を増強する。
【００６５】
このように、ＰＬＳ、ＰＬＳ−ＯＳＣ、およびＰＬＳ−ＯＳＣＷ回帰のＲ２、Ｑ２、およびＲＭＳＥＰ値を比較すると、Ｒ２およびＱ２値は両方ともすべてのモデルについて０．９より大きく、非常に良好な適合性および優れた予測性で緑茶の品質を予測するために使用できることを示す。
【００６６】
（実施例７：ＦＴ−ＮＩＲ用の分析サンプルの調製および分析）
２００５年の品評会でランキング（格付け）された６４種の一番茶から選択された１３種の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。これらの茶は、４、８、１４、１８、２４、２８、３４、３８、４４、４８、５４、５８、および６４番のランキングのサンプルである。市販茶品評会に記載されたこれらの茶サンプルは、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。茶のランキングは、官能試験の総合スコアによって決定され、これは、葉の外観、入れた茶の芳香、色、および味であり、専門の茶の鑑定人によって鑑定された。
【００６７】
２ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（２００ｍｇ）を、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１０分間）で粉砕し、６００μＬのグリセロール、ヘキサン、アセトニトリル、または鉱油を加えた。これらの各混合物を再度ボールミルで（２０Ｈｚ、１０分間）でホモジナイズして、ペースト状の分析サンプルを得た。これらの分析サンプルを、それぞれ２ｍＬ容のガラスバイアルに移した。
【００６８】
得られたペースト状の分析サンプルを、ＦＴ−ＮＩＲによって測定した。本実施例で使用したＦＴ−ＮＩＲ測定装置は、Smart Near-IR UpDRIFT、CaF2ビームスプリッタ、および冷却InGaAs検出器を装着したNICOLET 6700 FT-IR（サーモエレクトロン株式会社）であった。ＦＴ−ＮＩＲスペクトルは、３．８５７ｃｍ−１の間隔で１００００〜４０００ｃｍ−１まで記録した。ミラー速度は１．２６５９ｃｍ／ｓであり、そして分解能は８ｃｍ−１であった。データポイントの総数は、各スペクトルにつき１５５７であった。各サンプルについて４回ずつ測定した。
【００６９】
種々の溶媒を用いて調製したサンプルについてＦＴ−ＮＩＲを測定したところ、グリセロール（Ｂ）を用いた場合に測定データの変動が最小であった（図１２）。したがって、グリセロールを用いて調製したサンプルについて以下の解析を行った。
【００７０】
（実施例８：ＦＴ−ＮＩＲのデータの解析、緑茶の代謝物のフィンガープリンティング、および緑茶の品質予測）
ＦＴ−ＮＩＲにより得られた各データ（すなわち、測定値）は、平均して１００，０００を乗じた。全データを、二次微分および標準正規変量（ＳＮＶ）によって前処理して変換した。
【００７１】
市販のソフトウエアであるPirouette（登録商標）（Informatrix, Inc.）を用いて主成分分析（ＰＣＡ）を行った。ＰＣＡのファクター３において、１３種の茶サンプルを、それらの等級に従ってランキングされた３群に分けることができた。ファクター３での変動は、総変動の２．３８％であり、非常に低かった。このファクター３のローディングプロットから、５５００〜５２００ｃｍ−１の波数域が、茶の等級に関連すると予測された（図１３）。そこで、５５００〜５２００ｃｍ−１の波数域のデータについて再度ＰＣＡを行った。その結果、ファクター１によって群分けが可能であり、この波数域が茶の等級と非常に関連することがわかった（図１４）。
【００７２】
次いで、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）を選択して、茶サンプルの品質の予測モデルを作成した。分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。１４番、３４番、および５４番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。５５００〜５２００ｃｍ−１のスペクトル域の全データについて、二次微分および標準正規変量（ＳＮＶ）を行った。ＰＬＳモデルにおける潜在的ファクターの数は、クロスバリデーションによって決定した。最適な数は、トレーニングセットのモデルにおいて５であった。トレーニングセットの予測値の標準誤差（ＳＥＰ）は１．５９であり、テストセットのＳＥＰは、３．０５であった（図１５）。トレーニングセットのスチューデント化残差は０．９９７であり、テストセットでは０．９９８であった。これらの数値は、予測モデルの精度を示す。すなわち、値が「１」に近い場合は、結果が正確であることをいう。これらの事実は、予測モデルが非常に正確であることを示唆する。テストセットの結果から、このモデルは、低品質サンプルの予測について正確であるが、高品質サンプルの予測ではあまり正確ではなかった（図１５）。この結果は、茶品質が高い場合には品質の差が小さいため、予測が困難になることを示唆する。この研究は、ＦＴ−ＮＩＲを用いる代謝物フィンガープリンティングによる茶の品質予測が正確であり現実的であることを示した。
【００７３】
（実施例９：ＧＣ／ＭＳ用の熱分解処理分析サンプルの調製および分析）
上記実施例１と同様に、２００５年の品評会でランキング（格付け）された５３種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。これらの茶葉を、葉および葉柄を均一にするためにブレンダーを用いて粉末に粉砕し、−２０℃にて保存した。
【００７４】
粉砕したサンプルの１±０．００５ｍｇを秤量し、そしてEco-cup S（フロンティア・ラボ株式会社）に入れ、PY-2020iDダブルショット・パイロライザー（フロンティア・ラボ株式会社）に導入した。パイロライザーのオーブン温度を５００℃に、そしてインターフェースは２５０℃に設定した。熱分解時間は、各サンプルについて５分に設定した。
【００７５】
ＧＣ／ＭＳ装置を、ＧＣ注入口を介してパイロライザーと直接連結した。本実施例で使用したＧＣ／ＭＳ装置は、THERMO TR-WaxMSカラム（６０ｍ×０．２５ｍｍi.d.×０．２５μｍ）（Thermo electron Co.）を装着し、TRACE DSQマススペクトロメータ（Thermo electron Co.）と連結されたTRACE GCガスクロマトグラフ（Thermo electron Co.）であった。注入温度は２３０℃であった。キャリアガスとして、高純度ヘリウムガスを、流速１ｍＬ／分で用いた。ＧＣ注入口のスプリット比は２０：１であった。分析は、以下のオーブン温度プログラムで行った：２分間７０℃で等温に保ち、次いで７℃／分で７０℃から２６０℃まで上昇させ、そして２０分間２６０℃に保った。搬送ラインおよびイオンソース温度は、両方とも２５０℃であった。イオンを、７０ｋＶ電子衝撃（ＥＩ）によって生成し、そして１秒当たり２０スキャンを、５０〜６５０ｍ／ｚの質量範囲にわたって記録した。加速電圧は、すべてのＧＣ走査時間後に作動した。
【００７６】
（実施例１０：熱分解処理緑茶サンプルのＧＣ／ＭＳのデータ解析、緑茶の代謝物のフィンガープリンティング、および緑茶代謝プロファイリング）
上記実施例９においてＧＣ／ＭＳにより得られたデータの前処理については、得られた生のクロマトグラフデータ（Xcaliburファイルタイプ、*.raw）を、Xcaliburソフトウエア（Thermofinnigan）のファイル変換メニューを用いてANDIファイル（分析データ交換プロトコル、*.cdf）に変換した。クロマトグラムのデータポイントを、自動的に０．０１秒毎に強度をスキャンするように調節して、フラグメントデータを含まずにAIAデータとして保存した。データを、保持時間のアライメント用の市販のソフトウエアのLineUp（Informatrix, Inc.）に移行して、相関最適化ワーピングアルゴリズムを用いてアライメントした。
【００７７】
サンプルの代謝物フィンガープリント（マトリクスＸ）とその品質（マトリクスＹ）との間の関係を観察した。まず、分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。２番、１２番、２２番、３２番、４２番、および５２番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を、スペクトルフィルタリング技術である直交シグナル補正（ＯＳＣ）とともに用いて回帰モデルを作成し、緑茶の代謝物プロファイル（Ｘ変数）と品質ランキング（Ｙ変数）との関係を検討した。ＰＬＳ回帰モデルの有効性および信頼性を、モデル（Ｒ２Ｙ）、予測性パラメータ（Ｑ２）、トレーニングセットの推定値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＥ）、およびテストセットの予測値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＰ）によって説明される変動割合によって評価した。ＰＬＳ回帰モデルの有効性および信頼性は、トレーニングセットによって検証し、そしてテストセットでバリデートした。
【００７８】
２つのＯＳＣ成分を除去して、モデル中でＹ変数に対して関連するＸ変数の５２．１１％を残した。ＰＬＳモデルを構築した後、クロスバリデーションに従って、Ｙの７７．９％の変動を反映し（Ｒ２Ｙ＝０．７７９）そしてＹの６６．９％の変動を予測した（Ｑ２＝０．６６９）。このトレーニングセットによって作成したモデルは、７．５７のＲＭＳＥＥ値であった。Ｘ（ｔ１）およびＹ（ｕ１）の第１のサマリー間のプロットにより、良好な相関が観察された。しかし、４６番のサンプルについては、予測値が非常に大きく乖離していたので、除外した。４６番を除外して再度予測モデルを構築すると、Ｒ２Ｙ＝０．８７６およびＱ２＝０．７７８に改善され、ＸとＹとの間に良好な相関が見られた（図１６）。ＲＭＳＥＥも５．３６に低下していた。次いで、テストセットで検証したところ、品質のランキングに非常に良く一致していた（図１６）。
【００７９】
さらに、モデル構築に重要な高い関連を有する説明変数Ｙを、ＶＩＰ（投影における変数重要性）値からコンピュータ解析により同定した。１を超える大きなＶＩＰ値は、最も関連がある説明変数Ｙである。分子はランダムに破壊されるので、クロマトグラムから代謝物を同定することは実行不可能であるが、ＶＩＰ値から判断して、重要な代謝物を保持時間として特徴づけることができた（図１７）。保持時間に対する変数は、元のクロマトグラムでは、高いランキングの緑茶と低いランキングの緑茶との間に強度差を示した。したがって、最終的なモデルに対する貢献度（例えば、保持時間）の順に予測変数をランク付けすることによって、緑茶の品質予測が可能であることがわかった。
【００８０】
（実施例１１：ＵＰＬＣ／ＭＳ用の分析サンプルの調製および分析）
２００６年の品評会でランキング（格付け）された５６種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。市販茶品評会に記載されたこれらの茶サンプルは、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。茶のランキングは、官能試験の総合スコアによって決定され、これは、葉の外観、入れた茶の芳香、色、および味であり、専門の茶の鑑定人によって鑑定された。なお、ランキングの高い方から順に、１番から５６番まで順位をつけた。
【００８１】
まず、２ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（１０ｍｇ）を凍結乾燥し、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１分間）で粉砕した。緑茶の親水性一次代謝物を、メタノール、水、およびクロロホルムの混液（２．５：１：１、v/v/v）を用いて抽出した。得られた混合物を、サーモミキサー中で３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、溶液を４℃にて１６０００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、２００μＬの上清を、穴あきキャップでキャップした１．５ｍＬ容のエッペンドルフ管に移した。得られた抽出物を、乾燥するまで（一晩）真空遠心分離乾燥機中で乾燥させた。得られた乾燥物に２００μＬのメタノール／水（４：１、v/v）（０．１％(v/v)のギ酸を含む）を加えて、ＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、分析サンプルとした。
【００８２】
分析サンプルの４μＬを、ＵＰＬＣ／ＭＳに供した。本実施例では、バイナリーソルベントマネージャ、カラムヒータ、およびサンプルマネージャを装着したACQUITY UPLCTMシステム（Waters）を用い、そして検出を、LCT premierTM XEマススペクトロメトリー（Waters）を用いて行った。この装置には、２．１×１５０ｍｍ，１．７μｍのAcquity UPLC BEH C18カラムを装着し、４０℃で操作した。移動相の条件としては、０．３ｍＬ／分の流速で、移動相Ａとして水（０．１％(v/v)のギ酸を含む）および移動相Ｂとしてアセトニトリル（０．１％(v/v)のギ酸を含む）を用い、移動相Ｂを０％(v/v)から１００％(v/v) に７分間で増加させる直線グラジエントを行い、次いで７分間維持させた。ＭＳは、ネガティブモードでエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを用いた。イオン化パラメータは、キャピラリー電圧：２．０ｋＶ、コーン電圧：０．０３５ｋＶ、脱溶媒和ガス流量５００Ｌ／時間、脱溶媒和温度：３５０℃、およびソース温度：１００℃であった。
【００８３】
（実施例１２：緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳのデータ解析および緑茶代謝プロファイリング）
上記実施例１１においてＵＰＬＣ／ＭＳにより得られたデータの前処理については、得られた生のクロマトグラフデータを、ANDIファイル（分析データ交換プロトコル、*.cdf）に変換した。変換したファイル（AIA）を、ピーク検出、アラインメント、ギャップフィルタリング、および標準化についてデータ処理ソフトウェアMZmineを用いてデータの前処理を行った。
【００８４】
ランキングされた一番茶サンプルのうち、１番のランキングの緑茶サンプルのトータルイオンクロマトグラムを図１８に示す。すべてのランクのサンプルが、同様のクロマトグラムパターンを示した。しかし、図１９に示すように、茶の品質の違いによりピーク強度の差が見られた。
【００８５】
次いで、この複雑なデータから重要な化合物および情報を明らかにするために、多変量分析を行った。多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、主成分分析（ＰＣＡ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択した。全体を把握するためにUnsupervised ＰＣＡを行った。９つの主成分では、Ｒ２Ｘ＝０．７６７およびＱ２＝０．５０８であり、低い等級の茶および高い等級の茶は、ＰＣ１軸に沿って別々に分かれた（図２０）。すなわち、高品質の緑茶サンプルはＰＣ１のネガティブ側に、そして低品質の緑茶サンプルは、ＰＣ１のポジティブ側に集まった。スコアプロットに対応するローディングプロットを図２１に示す。予測品質の差によって緑茶サンプルの代謝プロファイリングの差が示された。
【００８６】
次いで、緑茶品質とそのメタボロームとの関係を検討するために、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択して、予測モデルを作成した。実施例１１で得られた５６種の分析サンプルを、トレーニングセット（５０サンプル）およびテストセット（６サンプル）の群に分けた。２番、１２番、２２番、３２番、４２番、および５２番のサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。すべての変数のＸマトリクスを、中心にスケールした。２つの顕著な成分を抽出し、クロスバリデーションに従って、Ｙの８３．３％の変動を記述し（Ｒ２Ｙ＝０．８３３）そしてＹの７１．４％の変動を予測した（Ｑ２Ｙ＝０．７１４）（図２２）。次いで、テストセットについて、ＰＬＳモデルで予測し、トレーニングセットサンプル（ＲＭＳＥＥ＝６．７５）に基づくモデル評価に関して、テストサンプル（ＲＭＳＥＰ＝７．２２）の予測精度が得られた（図２２）。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、従来困難であった製品緑茶の総合品質を簡便な方法で予測することが可能である。すなわち、緑茶を、クロマトグラフィーや分光分析などの種々の機器分析によりスクリーニングすることによって、迅速かつ有益に品質予測し得る。
【００８８】
従来の緑茶の機器分析は、医用目的の抗酸化化合物、ならびに呈味および芳香用のカテキンおよび他のフェノール性化合物などの、特定の機能に重要であると考えられる特定の群の化合物に焦点が当てられていた。しかし、緑茶の特徴づけは、単一の代謝物に由来するのではなく組み合わせに由来し得る。したがって、複数の成分を一度に分析することによる本発明の方法を用いれば、より精度よい品質予測が可能であり、緑茶製造工程あるいは緑茶流通保管工程のさらなる改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＰＣＡ解析結果を示す図であり、高いおよび低いランキングの緑茶サンプルについてのスコアプロットである。
【図２】トレーニングセットとしての４６種の緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図３】テストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５３種の全ての緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図４】直交シグナル補正（ＯＳＣ）を用いたトレーニングセットとしての４６種の緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図５】直交シグナル補正（ＯＳＣ）を用いたテストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５３種の全ての緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図６】緑茶の品質予測値を生成するために用いた変数の影響を示すグラフである。
【図７】最高品質の茶から抽出したサンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（７５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）を示す。
【図８】５３種のランキングされた一番茶サンプルのすべてについて得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを重ねて示す。
【図９】トレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の両方の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１０】トレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の両方の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳ−ＯＳＣモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１１】トレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の両方の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳ−ＯＳＣＷモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１２】種々の溶媒で調製したサンプルについてのＦＴ−ＮＩＲスペクトルであり、図中、Ａはブランク、Ｂはグリセロール、Ｃは鉱油、Ｄはヘキサン、およびＥはアセトニトリルの場合を示す。
【図１３】ＰＣＡ解析結果を示す図であり、ファクター３のローディングプロットである。
【図１４】５５００〜５２００ｃｍ−１のスペクトル域のデータについてのＰＣＡ解析結果を示す図であり、高いおよび低いランキングの緑茶サンプルについてのスコアプロットである。
【図１５】テストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５３種の全ての緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１６】４６番のサンプルを除くトレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳ−ＯＳＣモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１７】重要な代謝を特徴づける保持時間ごとのＶＩＰ値を示すグラフである。
【図１８】１番のランキングの緑茶サンプルのＵＰＬＣのトータルイオンクロマトグラムである。
【図１９】高品質緑茶（Ｎｏ．１および２）および低品質緑茶（Ｎｏ．５５および５６）のＵＰＬＣのイオン強度を示すクロマトグラムである。
【図２０】すべてのランキングの緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳ分析によるＰＣＡスコアプロットである。
【図２１】緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳ分析のＰＣＡ解析結果を示す図であり、ＰＣ１のローディングプロットである。
【図２２】テストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５６種の全ての緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳ分析でのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶の品質予測方法に関する。より詳細には、緑茶の代謝物または分解物の機器分析による品質予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶は最も普及している飲料であり、Camellia sinensisという植物の葉から製造される。酸化反応の長さおよび葉の加工方法に基づいて、紅茶、ウーロン茶、および緑茶の３つの種類に分類される。このうち緑茶は、まず加熱によって酸化酵素が不活性化されるので、酸化されておらず、そして発酵させていない。そのため、緑茶の味は、茶木の種類、摘採時間、栽培方法などによって決定される。
【０００３】
現在、緑茶の最終品質は、熟練者による葉の外観、芳香、色、および味に基づく官能検査により決定されている。これらの技能を獲得するには経験年数がかかる。また、客観性や再現性が低いという欠点がある。そのため、製造工程管理や製品品質管理のためには、簡便な機械化された品質予測方法が必要である。これまで、緑茶の品質予測方法として、近赤外分光法を用いた方法（特許文献１および２）ならびに茶葉の性状に基づく方法（特許文献３〜５）が開示されている。
【０００４】
特許文献１には、可視光および近赤外線を用いて茶葉、特に加工前の生茶葉、の品質を測定する方法が記載されている。可視光から茶葉の色を、そして近赤外線から茶葉の成分を測定すると記載されているが、近赤外線から具体的にどのような成分を測定し、どのように品質を予測するのかについては記載されていない。特許文献２には、近赤外分光法を用いて、茶葉中の遊離アミノ酸の含有率と中性デタージェント繊維の含有率とを求めることによって品質評価する方法が記載されている。しかし、これらの近赤外分光に基づく方法は、生葉の品質予測には効力を発するが、製品緑茶の品質予測の実績はほとんどない。
【０００５】
特許文献３〜５には、生茶葉の含水量、含繊維量、含窒素量、外観などの性状を測定することによって、品質を評価することが記載されている。しかし、含水量などの性状に基づく方法は、簡便であるが、精度に乏しい。
【特許文献１】特開２０００−３４６７９７号公報
【特許文献２】特開平８−１１４５４３号公報
【特許文献３】特開２０００−２２８９５０号公報
【特許文献４】特開平１１−３１３６０８号公報
【特許文献５】特開平９−２２４５７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
化学分析は、緑茶の品質を評価するために最も信頼性のある方法であると思われる。機器分析法と強力なコンピュータ駆動パターン認識技術との組み合わせから、複雑な材料の品質制御および特徴づけのための新たな可能性が実現されている。そこで、本発明は、緑茶の品質、特に従来困難であった製品緑茶の総合品質を、簡便に予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
緑茶の味は、アミノ酸、特に茶葉中の約６０〜７０％のアミノ酸を占める独特のテアニンに起因する。その収歛性の味は、カテキン（タンニン）によるものであり、苦味はカフェインによるものである。また、揮発性化合物は、主として茶の香りの差に寄与する。栽培品種の差、環境的効果、加工方法などにより、中間経路代謝物の見かけの定常状態の量および／または最終代謝物の末端蓄積も変動する。また、加熱処理による分解物も緑茶の味に影響を与える。したがって、茶葉中の代謝物や分解物を、空間的および時間的の両方でモニターすることは、品質の評価に重要である。
【０００８】
クロマトグラフィーにおいて、パターン認識方法に基づくフィンガープリンティングは、種々の分析領域、例えば、食品および栄養分野で加工モニタリングおよび制御（生材料の等級付け、日常的なオンライン品質チェック、または製品が製造される工程の測定）、地理的起源（成分の化学組成による供与源の測定、風味および芳香成分による最終製品の起源の追跡）の分析に使用されている。
【０００９】
そこで、本発明は、医用目的の抗酸化化合物、ならびに呈味および芳香用のカテキンおよび他のフェノール性化合物などの、特定の機能に重要であると考えられる特定の群の限られた数の個々の化合物の特徴づけの代わりに、代謝物や分解物に注目し、これらについての化学的フィンガープリントと多変量解析と組み合わせることによって、総合的にかつ迅速に緑茶を分析できることに基づいて完成された。
【００１０】
本発明は、緑茶の品質予測方法を提供し、該方法は、
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果から、品質を予測する工程を含む。
【００１１】
本発明はまた、品質既知の複数の緑茶を前処理して個別の分析サンプルを得る工程；
該個別の分析サンプルを機器分析に供して個別の分析結果を得る工程；および
該個別の分析結果と該品質との関係を数値データに変換して多変量解析する工程；
によって得られる、緑茶の品質予測モデルを提供する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記多変量解析は、ＰＬＳ回帰分析である。
【００１３】
好適な実施態様では、上記前処理は、上記緑茶を熱分解処理する工程を含み、そして前記機器分析が、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである。より好適な実施態様では、上記解析結果は、保持時間に基づいて品質予測される。
【００１４】
他の好適な実施態様では、上記前処理は、上記緑茶から親水性化合物を抽出して抽出物を得る工程を含む。
【００１５】
より好適な実施態様では、上記機器分析は、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせであり、そして上記前処理はさらに上記抽出物をシリル化する工程を含む。
【００１６】
さらに好適な実施態様では、上記分析結果の中で、アラビノース、グルタミン、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、イノシトール、シキミ酸、リン酸、フルクトース、テアニン、リンゴ酸、カフェイン、キナ酸、グルコース、マンノース、リボース、およびスクロースのデータが解析される。
【００１７】
別の好適な実施態様では、上記機器分析は、液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ（特に、高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、または超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ）、または核磁気共鳴分析（特に、フーリエ変換核磁気共鳴分析）である。
【００１８】
他の好適な実施態様では、上記前処理は、上記緑茶を粉砕して粉末を得る工程および該粉末を溶媒でペースト状にする工程を含む。
【００１９】
より好適な実施態様では、上記機器分析は、赤外分光分析または近赤外分光分析（特に、フーリエ変換赤外分光分析またはフーリエ変換近赤外分光分析）である。
【００２０】
さらに好適な実施態様では、上記機器分析は、フーリエ変換近赤外分光分析であり、上記多変量解析する工程において、上記分析結果の中で５５００〜５２００ｃｍ−１の結果についてデータ変換し、変換されたデータをさらに二次微分する。
【００２１】
別の好適な実施態様では、上記分析結果は、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、フーリエ変換赤外・近赤外分光分析、およびフーリエ変換核磁気共鳴分析からなる群より選択される少なくとも２つの機器分析の分析結果である。
【００２２】
本発明はさらに、緑茶の品質予測方法を提供し、該方法は
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果を、上記のいずれか品質予測モデルと照合する工程を含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、従来困難であった製品緑茶の総合品質を、より精度よくかつ簡便な方法で予測することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
緑茶は、生茶葉を加熱して酵素活性を失わせ、成分の酸化を防ぎ、緑色を保持させた不発酵茶である。本発明において品質予測の対象となる緑茶は、加工前の生茶葉であってもよいが、好ましくは、荒茶、仕上げ茶（すなわち、製品緑茶）のような緑茶としての加工が施された緑茶の葉である。本発明においては、より好ましくは、製品緑茶を品質予測の対象とする。
【００２５】
本発明において、緑茶は、以下で述べる機器分析に応じて適切に前処理された後、種々の機器分析に供される。
【００２６】
本発明において、機器分析とは、分析機器を用いる分析・測定手段をいい、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ））、質量分析（ＭＳ）、赤外分光分析（ＩＲ）（例えば、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ））、近赤外分光分析（ＮＩＲ）（例えば、フーリエ変換近赤外分光分析（ＦＴ−ＮＩＲ））、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）（例えば、フーリエ変換核磁気共鳴分析（ＦＴ−ＮＭＲ））などが挙げられる。これらの機器分析は組み合わせてもよく、例えば、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ（特に、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＵＰＬＣ／ＭＳ）などの組み合わせが挙げられる。これらの機器分析に用いられる装置は、特に限定されず、緑茶中に含まれる代謝物（例えば、アミノ酸、有機酸、糖）を測定することが可能であれば、通常用いられている装置が用いられ得る。また、測定条件は、これらの物質の測定に適切なように当業者によって適宜設定され得る。
【００２７】
前処理は、緑茶中の分析対象物質を機器分析に供するに適した形態にするために、上述のように機器分析に応じて行われる。前処理としては、乾燥、切断、粉砕、抽出などの処理が挙げられる。例えば、粉砕については、ブレンダー、ボールミルなどの適切な器具を用いて行われ得る。また、抽出については、水、有機溶媒、またはこれらの溶媒の混合液を用いて行われ得る。抽出に使用され得る有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、クロロホルムなどが挙げられる。抽出操作としては、緑茶を水および／または有機溶媒中で加熱して、熱分解物を抽出してもよい。加熱温度は、使用される溶媒に応じて適宜決定され得、通常は、常圧下で溶媒の沸点付近の温度である。加熱時間も適宜設定される。これらの単位操作を単独でまたは組み合わせて適切な前処理条件を設定する。
【００２８】
例えば、機器分析としてＧＣを行う場合、好ましくは、前処理は、緑茶からの抽出物をシリル化する工程をさらに含む。シリル化は、当業者が通常用いるＧＣ用のシリル化試薬を用いて行われ得る。あるいは、前処理として、緑茶を、例えば、粉砕した後、熱分解処理のみ施したものも、分析対象試料となり得る。この場合、熱分解物を、抽出することなく直接ＧＣに導入することができる。熱分解は、市販の熱分解装置を用いて行うことができる。
【００２９】
機器分析としてＩＲ・ＮＩＲを行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶の粉末を溶媒でペースト状にする工程を含む。粉末を得る工程は、上記のとおりである。ペーストにするための溶媒は、例えば、ＩＲ測定用試料の調製のために、試料に応じて通常選択される溶媒が用いられる。
【００３０】
機器分析としてＮＭＲを行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトンなどが挙げられる。
【００３１】
機器分析としてＬＣ、特にＨＰＬＣを行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。用いるカラムとしては、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、およびイオン交換カラムが挙げられる。ＨＰＬＣの条件（例えば、流速、検出器、移動相など）は、試料に応じて適宜選択される。
【００３２】
機器分析として超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を行う場合については、好ましくは、前処理は、緑茶から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。ＵＰＬＣは、微小なカラム粒子に高い線速度の移動相を通過させて、速い分析スピード、高い分離能、および高感度が達成される。ＵＰＬＣに用いられるカラム粒子は、ＨＰＬＣに用いるカラム粒子（例えば、５μｍまたは３．５μｍ）よりも小さい直径（例えば、１．７μｍ）を有するカラム粒子であり、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、およびイオン交換カラムが挙げられる。ＵＰＬＣの条件（例えば、流速、検出器、移動相など）は、試料に応じて適宜選択される。
【００３３】
上記の前処理が施された緑茶サンプルは、任意の機器分析に供され、分析結果が得られる。得られた分析結果は、緑茶サンプルのフィンガープリントであり得る。このフィンガープリントを数値データに変換して多変量解析が行われる。分析により得られる結果（変数）としては、保持時間、波長（または波数）、ならびにシグナル強度（またはイオン強度）、吸光度などのスペクトルデータが挙げられる。さらに、変数としては、緑茶サンプルのランキング（等級）も挙げられる。
【００３４】
多変量解析としては、機器分析データの解析に、特にケモメトリックスにおいて通常用いられる解析ツールが採用される。例えば、ＰＣＡ（主成分分析：principal component analysis）、ＨＣＡ（階層クラスター分析：hierarchical cluster analysis）、ＰＬＳ回帰分析（潜在的構造に対する射影：Projection to Latent Structure）、判別分析（discriminate analysis）などの種々の多変量ツールが挙げられる。さらに、部分最小二乗によるＰＬＳ（Partial least square projection to Latent Structure）を用いて、関連の変量の２群間の関係；例えば、緑茶の代謝物とその品質との間の関係、が確認される。必要に応じて、スペクトルフィルタリング法、例えば、妨害成分を取り除くための直交シグナル補正（orthogonal signal correction：ＯＳＣ）と組み合わせて多変量解析が行われてもよい。これらの解析ツールは、ソフトウエアとして多数市販されており、任意のものが入手可能である。このような市販のツールは、一般的に、難しい数学・統計学の知識がなくても、多変量解析を行うことができるように操作マニュアルが備えられている。
【００３５】
多変量解析は、得られた全データではなく、品質予測に重要な一定の範囲のデータを選択して行ってもよい。例えば、緑茶の粉末をペースト状にしてＦＴ−ＮＩＲで分析する場合、５５００〜５２００ｃｍ−１の波数域のデータについてＰＣＡを行うことが好ましい。
【００３６】
本発明において好適に採用されるＰＬＳ回帰分析は、変数（例えば、波数、波長）間に相関を有するスペクトルデータからの検量線作成に有効な手法である。通常、変数間に相関があると、用いる変数の組み合わせによっては回帰精度が著しく低下するが、これを避けるためにＰＬＳでは変数を互いに無相関な変数（潜在変数）に変換し、この潜在変数を用いて回帰を行う。すなわち、ＰＬＳとはデータの変数を直交変換し、その新たな変数を用いて（重）回帰分析を行う解析手法である。
【００３７】
具体的には、複数の品質既知の緑茶サンプルから親水性低分子代謝物を抽出してあるいは緑茶の熱分解物についてＧＣ／ＭＳにより定量解析を行う場合には、得られたＧＣ／ＭＳクロマトグラムから保持時間インデックスを独立変数、質量分析シグナル強度を従属変数としてマトリクスデータを作成する。ランキング既知の複数の緑茶サンプルのランキング順位を説明変数として、既知サンプルをトレーニングセットとしてＰＬＳ法によりランキング予測モデルを作成できる。例えば、品質未知の緑茶サンプルから同様に機器分析して得られたデータを多変量解析し、その解析結果を予測モデルと比較・照合することによって、どのランキングに位置するかがわかるため、品質を予測することができる。
【００３８】
例えば、緑茶から代謝物を抽出してＧＣ／ＭＳで分析した場合、得られる分析結果は、種々の代謝物の保持時間、マススペクトル、イオン強度などがある。この場合、特に、アラビノース、グルタミン、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、イノシトール、シキミ酸、リン酸、フルクトース、テアニン、リンゴ酸、カフェイン、キナ酸、グルコース、マンノース、リボース、およびスクロースのデータは、緑茶の品質予測（等級分類）に重要な役割を果たす。本発明により、高いランキングの緑茶サンプル中には、代謝物として、アミノ酸、キナ酸、リン酸、リボース、およびアラビノースの量が比較的多く、低いランキングの緑茶サンプル中には、フルクトース、グルコース、マンノースなどの糖が主代謝物として存在する傾向があることが、明らかになっている。
【００３９】
また、上記の方法によって得られる予測モデルは、データの蓄積により、精度が上昇し得る。したがって、例えば、緑茶中の代謝物の相対量の傾向がより明確になれば、品質未知の緑茶の分析結果からフィンガープリントを得、このフィンガープリントに基づいて品質予測をすることも可能となる。
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ＧＣ／ＭＳ用の分析サンプルの調製）
２００５年の品評会でランキング（格付け）された５３種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。市販茶品評会に記載されたこれらの茶サンプルは、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。茶のランキングは、官能試験の総合スコアによって決定され、これは、葉の外観、入れた茶の芳香、色、および味であり、専門の茶の鑑定人によって鑑定された。なお、ランキングの高い方から順に、１番から５３番まで順位をつけた。
【００４１】
まず、２ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（３０ｍｇ）を凍結乾燥し、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１分間）で粉砕した。この茶葉に、メタノール、水、およびクロロホルムの混液（２．５：１：１、v/v/v）を１ｍＬ加え、さらに内部標準として６０μＬのリビトール（和光純薬工業株式会社：脱イオン水で０．２ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈）を加えて、５分間振盪し、そして４℃にて１６０００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、９００μＬの上清を、１．５ｍＬ容のエッペンドルフ管に移した。Millipore Milli-Qシステム（Berdford、MA）を用いて精製された４００μＬの水を添加して、ボルテックスおよび遠心分離し、次いで４００μＬの極性相を、穴あきキャップでキャップした他の１．５ｍＬ容のエッペンドルフ管に移した。得られた抽出物（親水性化合物）を、乾燥するまで（一晩）真空遠心分離乾燥機中で乾燥させた。
【００４２】
次いで、この抽出物に５０μＬの塩酸メトキシアミン（Sigma）のピリジン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、第１の誘導体化剤として添加した。混合物を３０℃にて９０分間インキュベートした。さらに、第２の誘導体化剤である１００μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド（ＭＳＴＦＡ：GL sciences Inc.）を添加して、３０℃にて３０分間インキュベートすることにより抽出物を誘導体化して、分析サンプルを得た。
【００４３】
（実施例２：ＧＣ／ＭＳによる緑茶サンプルの分析）
上記実施例１で得られた１μＬの分析サンプルを、スプリットモードでＧＣ／ＭＳに注入した（２５：１、v/v）。本実施例で使用したＧＣ／ＭＳ装置は、Pegasus III TOF質量分析器（LEGO）ならびにオートサンプラーとして７６８３Ｂシリーズインジェクター（Agilent Co.）を連結した０．２５μｍ CP-SIL 8 CB低ブリード（Varian Inc.）でコーティングされた３０ｍ×０．２５ｍｍ i.d.のフューズドシリカキャピラリーカラムを装着した６８９ＣＮ（Agilent Co.）であった。注入温度は２３０℃であった。カラムを通るヘリウムガスの流速は、１ｍＬ／分であった。カラム温度は、２分間８０℃で等温に保ち、次いで１５℃／分で３３０℃まで上昇させ、そして６分間等温に保った。搬送ラインおよびイオンソース温度は、それぞれ２５０℃および２００℃であった。イオンを、７０ｋＶ電子衝撃（ＥＩ）によって生成し、そして１秒当たり２０スキャンを、８５〜６５０ｍ／ｚの質量範囲にわたって記録した。加速電圧は、２５０秒の溶媒遅延後に作動した。
【００４４】
（実施例３：ＧＣ／ＭＳによるデータの解析および緑茶の代謝物のフィンガープリンティング）
上記実施例２においてＧＣ／ＭＳにより得られたデータの前処理については、得られた生のクロマトグラフデータ（Pegasusファイル、*.peg）を、ANDIファイル（分析データ交換プロトコル、*.cdf）に変換した。ANDIフォーマットを用いると、異なるマススペクトルデータシステム間のデータの変換および転送を行うことができた。変換したファイル（ANDI）を、データ前処理手順に供し、データ点を詳細に再処理した。さらに、データ変換も、最良のクロマトグラフデータを得るために行った。次いで、トータルイオンクロマトグラフデータを抽出し、そしてフラグメントデータなしのANDIフォーマットとして保存した。これらのファイルを、保持時間のマルチプルアライメント用の市販のソフトウエアのLineUp（Informatrix, Inc.）に移行した。ミスアライメントピークを、相関最適化ワーピングアルゴリズムを用いてアライメントした。
【００４５】
次いで、多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。市販のソフトウエアであるPirouette（登録商標）（Informatrix, Inc.）をこの目的に適用した。
【００４６】
５３種のランキングされた一番茶サンプルを、それらの等級に従ってランキングされた３群に分けたが、これらの３群の分類は明瞭ではなかった。各所定の群に約２０サンプルがあるので各群のサンプルの変動が非常に高すぎたため、高いランキングのサンプルは、低いランキングのサンプルとは別の明らかな集団を示さなかった。次いで、低いランキング（５１番）および高いランキング（１番）のサンプルについて、再度、データを変換せずに平均中央で前処理した。その結果、これらの群間で、ある程度の差があることがわかった（図１）。
【００４７】
顕著な化合物を、そのマススペクトルとライブラリー（NISTライブラリーおよび認証された標準化学物質から調製された内部ライブラリー）中のスペクトルとを比較することによって同定した。さらに、the Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology、Germanyによって提供されたライブラリーも、この目的に用いた（http://www.mpimp-golm.mpg.de/mms-library/index-e.htlm）。高いランキングのサンプル中には、アミノ酸、キナ酸、リン酸、リボース、およびアラビノースの量が比較的多いが、低いランキングのサンプルでは、主として糖（フルクトース、グルコース、およびマンノース）であった。これは、メタボロミクス解析が、緑茶の品質測定に有用であり得ることを示した。
【００４８】
次いで、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択して、予測モデルを作成した。ＰＬＳにより、２セットの変量（測定値および応答値）間の関係が見出される。すなわち、得られたＧＣ／ＭＳクロマトグラムから保持時間インデックスを独立変数、質量分析シグナル強度を従属変数としてマトリクスデータを作成し、各サンプルの品評会ランキング順位を説明変数として、既知サンプルをトレーニングセットとしてＰＬＳ法によりランキング予測モデルを作成した。
【００４９】
サンプルの代謝物フィンガープリント（マトリクスＸ）とその品質（マトリクスＹ）との間の関係を観察した。まず、分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。２番、１２番、２２番、３２番、４２番、および５２番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。変換した変数はなかった；変数の全てを集約し、そしてパレート分散にスケールして、クロマトグラフデータノイズ効果を減少させた。モデルの完全性、すなわち、ＰＬＳモデルにおける潜在的ファクターの数は、クロスバリデーションによって決定され得、最適な数は、（モデルに対する）適合と予測能との間のバランスで見られた。さらに、ＰＬＳモデルは、テストセットでバリデートされ、予測値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＰ）をコンピュータ計算した。２つの顕著な成分を抽出し、クロスバリデーションに従って、Ｙの８０．７％の変動を記述し（Ｒ２Ｙ＝０．８０７）そしてＹの３１．３％の変動を予測した（Ｑ２Ｙ＝０．３１３）（図２参照）。次いで、テストセットについて、ＰＬＳモデルで予測し、トレーニングセットサンプル（ＲＭＳＥＰ＝６．９１）に基づくモデル評価に関して、テストサンプル（ＲＭＳＥＰ＝１０．２３）の予測精度が得られた（図３）。このＰＬＳモデルにより、ある程度の予測が得られた。
【００５０】
さらに、ＰＬＳモデルの予測力を増強するために、スペクトルフィルタリング技術を適用した。ＯＳＣは、ＰＬＳベースの解決手段であり、Ｙのモデリングに関連のないＸデータ変動値を除去する。ＯＳＣでは、１つの成分を、非線形反復部分最小二乗法（ＮＩＰＡＬＳ）アルゴリズムを用いるマトリクスＸから１つずつ除去する。上記のＰＬＳモデルから２つのＯＳＣ成分を除去することにより、Ｑ２Ｙは、０．５００まで上昇した。二乗の残余合計は４１．４０％であった。したがって、５８．６０％のＸの変動値は、Ｙに関連せず、除去された（図４参照）。テストセットをモデルに供した後の予測値は、トレーニングサンプル（ＲＭＳＥＰ＝６．５７）に基づくモデル評価とよく一致するテストサンプル（ＲＭＳＥＥ＝８．１３）についての予測精度になった（図５）。さらに、高い関連を有する説明変数Ｙも、ＶＩＰ（投影における変数重要性）値から同定した。１を超える大きなＶＩＰ値は、最も関連がある説明変数Ｙである。このように、キナ酸、アミノ酸（特にテアニン）、および糖類が、緑茶についての品質予測モデルを作成するために重要であることを見出した（図６）。
【００５１】
（実施例４：ＧＣ／ＭＳによる緑茶代謝プロファイリング）
高い等級の茶として受け入れられている大和茶を、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。緑茶サンプルの前処理方法およびＧＣ／ＭＳによる分析条件は、上記実施例１および２と同じであった。クロマトグラムの分離度は満足のいくものであるため、各代謝物のピーク面積を、総イオンカウント（ＴＩＣ）により算出した。続いて、同定した代謝物の全てのピークを内部標準のリビトールに対して標準化した。この分析から、緑茶の乾燥葉は、以下の表１に示すような、多くの化合物、主として有機酸、アミノ酸 および糖類（単糖類および二糖類の両方）を含むことがわかった。最高量で検出した化合物は、糖類であり、特にスクロースおよびフルクトースが多かった。茶の独特の呈味に寄与する重要なアミノ酸であるテアニンも検出した。抽出物中にいくつかの他のアミノ酸を同定できたが、少量であった。約２３の同定した代謝物は、クロマトグラムから同定した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
このことから、上記実施例３で得られたケモメトリクスと組み合わせたＧＣ／ＭＳを用いるメタボロミクス解析が、緑茶の研究において有用な情報を提供することが証明された。
【００５４】
（実施例５：１Ｈ−ＮＭＲ用の分析サンプルの調製および分析）
上記実施例１と同様に、２００５年の品評会でランキング（格付け）された５３種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。
【００５５】
まず、１ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（５０ｍｇ）を凍結乾燥し、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１分間）で粉砕した。この茶葉に、１ｍＬの重水（重水素原子９９．９％：Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）を加えた。この混合物を、Thermomixer comfort（Eppendorf）で６０℃および１４００ｒｐｍにて３０分間インキュベートし、２５℃および１６０００×ｇにて１０分間遠心分離した（遠心分離機5415R：Eppendorf）。親水性代謝物を含む上清を、０．４５μｍのＰＴＦＥメンブレン（Advantec）を通して濾過した。次いで、４００μＬの濾液を、内部標準として３ｍＭの３−（トリメチルシリル）−１−プロパン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ：Aldrich）を含む２００μＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。なお、サンプル調製は、１Ｈ−ＮＭＲ測定の１日前に行った。
【００５６】
得られた分析サンプルを、１Ｈ−ＮＭＲによって測定した。本実施例では、７５０ＭＨｚ Varian Inova 750スペクトロメーターを使用し、５ｍｍの１Ｈ｛１３Ｃ／１５Ｎ｝三重共鳴間接検出プローブを用いて２５℃にてスペクトルを記録した。１Ｈ−ＮＭＲ測定は、６４トランジエントおよび１３１Ｋ複合データポイントで行った。捕捉時間およびリサイクル遅延は、３０°パルス角を用いて、１スキャン当たりそれぞれ６．２５７秒および３．７４３秒であった。予備飽和パルスシーケンスを適用して、残存水のシグナルを抑制した。すべてのスペクトルは、データ処理前に０．１Ｈｚ線幅広がりでフーリエ変換した。
【００５７】
（実施例６：１Ｈ−ＮＭＲのデータの解析、緑茶の代謝物のフィンガープリンティング、および緑茶代謝プロファイリング）
１Ｈ−ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルは、まず、Chenomx NMR Suite4.6ソフトウエアプロフェッショナル版（Chenomx Inc., Canada）によって位相およびベースライン補正した。１．０〜８．０ｐｐｍの範囲にわたって、０．０４ｐｐｍのサイズで積分した。一方、４．６〜５．０ｐｐｍの水のシグナルは削除した。すべての測定値は、ＤＳＳのメチルのピーク面積に対して標準化した。
【００５８】
最高品質の茶から抽出した水溶性化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図７に示す。代謝物由来のシグナルを、同条件下で分析した公知の標準化合物由来のシグナルならびにChenomx NMR Suite4.6の７５０ＭＨｚ（ｐＨ４〜９）ライブラリデータベースとの比較によって帰属した。このうち、約１０の主要な化合物を同定することができた。テアニン、アミノ酸、およびキナ酸が高磁場領域（δ０．５〜３．０ｐｐｍ：図７Ａ）で主として観察された。中磁場領域（δ３．０〜４．５ｐｐｍ：図７Ｂ）においては、スクロースおよびフルクトース以外では、カフェイン、アルギニン、ミオイノシトール、クロロゲン酸、およびキナ酸が明確に観察された。低磁場領域（δ５．０〜８．０ｐｐｍ：図７Ｃ）には、２−Ｏ−β−Ｌ−アラビノピラノシル−ミオイノシトール、ｐ−クマリル−キナ酸またはケイ皮酸、（−）−エピガロカテキン−３−没食子酸（ＥＧＣＧ）、および（−）−エピカテキン−３−没食子酸（ＥＣＧ）が主に観察された。（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）および（−）−エピカテキン（ＥＣ）は、水溶性が低いため、あまり顕著には観察されなかった。
【００５９】
図８に、５３種のランキングされた一番茶サンプルについて得られたすべての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを重ねて示す。高磁場領域（図８Ａ）および低磁場領域（図８Ｃ）では顕著な差は見られなかったが、中磁場領域（図８Ｂ）では、いくつかの差が観察された。特に、δ３．２７および３．４３ｐｐｍのカフェインのシグナルが、高品質の茶サンプルで強かった。カフェインは、茶の苦味に寄与し、茶の品質に重要であることが知られている。したがって、ＮＭＲでの測定においても、品質予測モデルを作成するために重要な因子であることが示された。
【００６０】
次に、多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、Pirouette（登録商標）ソフトウエア（Informatrix, Inc.）を用いて、高磁場領域（δ１．０〜２．５ｐｐｍ）、中磁場領域（δ３．１２〜４．３４ｐｐｍ）、および低磁場領域（δ６．１５〜６．３５ｐｐｍ）についてそれぞれ主成分分析（ＰＣＡ）を行った。まず、５３種のサンプルを、それらの等級に従ってランキングされた２群に分けた（高品質：１〜２５番、および低品質：２６〜５３番）。スコアプロットにおいて、高磁場領域では、２群間の差は明瞭には見られなかったが、中磁場領域および低磁場領域では、高品質および低品質の２群に大まかに分けることが可能であった（データは示さず）。また、ローディングプロットでは、カフェイン、テアニン、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、およびＥＣ由来のシグナルが、クラスタ分離に寄与することがわかった（データは示さず）。
【００６１】
さらに、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択して、独立（予測）変数Ｘから従属（応答）変数Ｙを予測するための回帰モデルを作成した。回帰は、システム行動に基づく数学的モデルを作成することによって行われ、トレーニングサンプルに関するモデルパラメータに最適な値を決定する。次いで、未知の独立変数の値を、得られたトレーニングモデルを用いて予測する。本実施例では、品評会ランキング順位を従属変数として用いた。分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。５番、１５番、２５番、３５番、および４５番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとした。分析前に変換した変数はなく、データを集約し、そしてユニット分散にスケールした。
【００６２】
緑茶サンプルの測定値と予測値との間のＰＬＳ関係を図９に示す。なお、２番および８番のサンプルについては、ノイズが大きいため、モデル作成から除外した。ＰＬＳ回帰モデルの性能を、相関係数Ｒ２およびクロスバリデートした相関係数Ｑ２ならびに予測値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＰ）という測定値と予測値との間のバリデーション誤差によって検証した。緑茶のＰＬＳ回帰モデルは、Ｒ２＝０．９８７およびＱ２＝０．６７１（ＲＭＳＥＰ＝１．８２）を示した（図９）。これは、適合および予測力に優れることを示している。緑茶のランキング順位を予測するためのモデルの予測性を、テストセットによって試験した（図１１において丸で囲む）。予測結果は、理想的な対角線上から分散していた（ＲＭＳＥＰ＝９．２２）。このＰＬＳモデルにより、ある程度の予測が得られた。
【００６３】
さらに、ＰＬＳモデルの予測力を、直交シグナル補正（ＯＳＣ）を用いて変動を単純化することによって改善した。上記ＰＬＳモデルから２つのＯＳＣ成分を除去することにより、Ｑ２は０．６７１から０．９８２に上昇し、予測性は３１％改善した（図１０）。ＰＬＳ−ＯＳＣ回帰モデルの予測性を、再度テストセットによって検証した（図１０において丸で囲む）。ＲＭＳＥＰ値は９．２２から５．９１に顕著に減少した。図１０に示す回帰プロットによれば、Ｑ２の上昇およびＲＭＳＥＰの低下が、シグナル補正によって予測モデルの能力が劇的に改善されたことを示す。
【００６４】
ウェーブレット変換は、複雑なシグナルを圧縮してノイズを除き、関連のある情報のみを抽出するために用いられるシグナル処理のツールである。ＯＳＣとの組み合わせにより、予測力を損なうことなく多変量検定の質を改善できることが知られている。そこで、本実施例においても、ＯＳＣとウェーブレット変換との組み合わせ（ＯＳＣＷ）を適用した。１成分ＯＳＣフィルタリングにより、６３．４２％の非関連Ｘ変数が除去された。５０６ウェーブレット係数を用いて、二乗の合計の９９．５０％を保持した。得られたＰＬＳ−ＯＳＣＷ回帰を図１１に示す。Ｒ２およびＱ２はそれぞれ０．９８２および０．９４４であった。ＰＬＳ回帰モデルの予測能は、ＯＳＣＷの実行により改善され、テストセットでの検証では、ＲＭＳＥＰが５．９１から５．５３に低下していた（図１１において丸で囲む）。有益な変数を捕捉するためにＰＬＳモデルで用いられたウェーブレット係数の数は非常に高く、そして０．５％の非関連変数のみが除去された。これは、ほとんどすべてのＹ変数がＯＳＣフィルタリングによって捕捉され、ノイズから生じた一部の変動のみが残ったことを示す。ウェーブレット解析は、予測能を損失することなく残りの変数を除去することによって予備加工性能を増強する。
【００６５】
このように、ＰＬＳ、ＰＬＳ−ＯＳＣ、およびＰＬＳ−ＯＳＣＷ回帰のＲ２、Ｑ２、およびＲＭＳＥＰ値を比較すると、Ｒ２およびＱ２値は両方ともすべてのモデルについて０．９より大きく、非常に良好な適合性および優れた予測性で緑茶の品質を予測するために使用できることを示す。
【００６６】
（実施例７：ＦＴ−ＮＩＲ用の分析サンプルの調製および分析）
２００５年の品評会でランキング（格付け）された６４種の一番茶から選択された１３種の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。これらの茶は、４、８、１４、１８、２４、２８、３４、３８、４４、４８、５４、５８、および６４番のランキングのサンプルである。市販茶品評会に記載されたこれらの茶サンプルは、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。茶のランキングは、官能試験の総合スコアによって決定され、これは、葉の外観、入れた茶の芳香、色、および味であり、専門の茶の鑑定人によって鑑定された。
【００６７】
２ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（２００ｍｇ）を、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１０分間）で粉砕し、６００μＬのグリセロール、ヘキサン、アセトニトリル、または鉱油を加えた。これらの各混合物を再度ボールミルで（２０Ｈｚ、１０分間）でホモジナイズして、ペースト状の分析サンプルを得た。これらの分析サンプルを、それぞれ２ｍＬ容のガラスバイアルに移した。
【００６８】
得られたペースト状の分析サンプルを、ＦＴ−ＮＩＲによって測定した。本実施例で使用したＦＴ−ＮＩＲ測定装置は、Smart Near-IR UpDRIFT、CaF2ビームスプリッタ、および冷却InGaAs検出器を装着したNICOLET 6700 FT-IR（サーモエレクトロン株式会社）であった。ＦＴ−ＮＩＲスペクトルは、３．８５７ｃｍ−１の間隔で１００００〜４０００ｃｍ−１まで記録した。ミラー速度は１．２６５９ｃｍ／ｓであり、そして分解能は８ｃｍ−１であった。データポイントの総数は、各スペクトルにつき１５５７であった。各サンプルについて４回ずつ測定した。
【００６９】
種々の溶媒を用いて調製したサンプルについてＦＴ−ＮＩＲを測定したところ、グリセロール（Ｂ）を用いた場合に測定データの変動が最小であった（図１２）。したがって、グリセロールを用いて調製したサンプルについて以下の解析を行った。
【００７０】
（実施例８：ＦＴ−ＮＩＲのデータの解析、緑茶の代謝物のフィンガープリンティング、および緑茶の品質予測）
ＦＴ−ＮＩＲにより得られた各データ（すなわち、測定値）は、平均して１００，０００を乗じた。全データを、二次微分および標準正規変量（ＳＮＶ）によって前処理して変換した。
【００７１】
市販のソフトウエアであるPirouette（登録商標）（Informatrix, Inc.）を用いて主成分分析（ＰＣＡ）を行った。ＰＣＡのファクター３において、１３種の茶サンプルを、それらの等級に従ってランキングされた３群に分けることができた。ファクター３での変動は、総変動の２．３８％であり、非常に低かった。このファクター３のローディングプロットから、５５００〜５２００ｃｍ−１の波数域が、茶の等級に関連すると予測された（図１３）。そこで、５５００〜５２００ｃｍ−１の波数域のデータについて再度ＰＣＡを行った。その結果、ファクター１によって群分けが可能であり、この波数域が茶の等級と非常に関連することがわかった（図１４）。
【００７２】
次いで、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）を選択して、茶サンプルの品質の予測モデルを作成した。分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。１４番、３４番、および５４番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。５５００〜５２００ｃｍ−１のスペクトル域の全データについて、二次微分および標準正規変量（ＳＮＶ）を行った。ＰＬＳモデルにおける潜在的ファクターの数は、クロスバリデーションによって決定した。最適な数は、トレーニングセットのモデルにおいて５であった。トレーニングセットの予測値の標準誤差（ＳＥＰ）は１．５９であり、テストセットのＳＥＰは、３．０５であった（図１５）。トレーニングセットのスチューデント化残差は０．９９７であり、テストセットでは０．９９８であった。これらの数値は、予測モデルの精度を示す。すなわち、値が「１」に近い場合は、結果が正確であることをいう。これらの事実は、予測モデルが非常に正確であることを示唆する。テストセットの結果から、このモデルは、低品質サンプルの予測について正確であるが、高品質サンプルの予測ではあまり正確ではなかった（図１５）。この結果は、茶品質が高い場合には品質の差が小さいため、予測が困難になることを示唆する。この研究は、ＦＴ−ＮＩＲを用いる代謝物フィンガープリンティングによる茶の品質予測が正確であり現実的であることを示した。
【００７３】
（実施例９：ＧＣ／ＭＳ用の熱分解処理分析サンプルの調製および分析）
上記実施例１と同様に、２００５年の品評会でランキング（格付け）された５３種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。これらの茶葉を、葉および葉柄を均一にするためにブレンダーを用いて粉末に粉砕し、−２０℃にて保存した。
【００７４】
粉砕したサンプルの１±０．００５ｍｇを秤量し、そしてEco-cup S（フロンティア・ラボ株式会社）に入れ、PY-2020iDダブルショット・パイロライザー（フロンティア・ラボ株式会社）に導入した。パイロライザーのオーブン温度を５００℃に、そしてインターフェースは２５０℃に設定した。熱分解時間は、各サンプルについて５分に設定した。
【００７５】
ＧＣ／ＭＳ装置を、ＧＣ注入口を介してパイロライザーと直接連結した。本実施例で使用したＧＣ／ＭＳ装置は、THERMO TR-WaxMSカラム（６０ｍ×０．２５ｍｍi.d.×０．２５μｍ）（Thermo electron Co.）を装着し、TRACE DSQマススペクトロメータ（Thermo electron Co.）と連結されたTRACE GCガスクロマトグラフ（Thermo electron Co.）であった。注入温度は２３０℃であった。キャリアガスとして、高純度ヘリウムガスを、流速１ｍＬ／分で用いた。ＧＣ注入口のスプリット比は２０：１であった。分析は、以下のオーブン温度プログラムで行った：２分間７０℃で等温に保ち、次いで７℃／分で７０℃から２６０℃まで上昇させ、そして２０分間２６０℃に保った。搬送ラインおよびイオンソース温度は、両方とも２５０℃であった。イオンを、７０ｋＶ電子衝撃（ＥＩ）によって生成し、そして１秒当たり２０スキャンを、５０〜６５０ｍ／ｚの質量範囲にわたって記録した。加速電圧は、すべてのＧＣ走査時間後に作動した。
【００７６】
（実施例１０：熱分解処理緑茶サンプルのＧＣ／ＭＳのデータ解析、緑茶の代謝物のフィンガープリンティング、および緑茶代謝プロファイリング）
上記実施例９においてＧＣ／ＭＳにより得られたデータの前処理については、得られた生のクロマトグラフデータ（Xcaliburファイルタイプ、*.raw）を、Xcaliburソフトウエア（Thermofinnigan）のファイル変換メニューを用いてANDIファイル（分析データ交換プロトコル、*.cdf）に変換した。クロマトグラムのデータポイントを、自動的に０．０１秒毎に強度をスキャンするように調節して、フラグメントデータを含まずにAIAデータとして保存した。データを、保持時間のアライメント用の市販のソフトウエアのLineUp（Informatrix, Inc.）に移行して、相関最適化ワーピングアルゴリズムを用いてアライメントした。
【００７７】
サンプルの代謝物フィンガープリント（マトリクスＸ）とその品質（マトリクスＹ）との間の関係を観察した。まず、分析サンプルを、トレーニングセットおよびテストセットの群に分けた。２番、１２番、２２番、３２番、４２番、および５２番のランキングのサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を、スペクトルフィルタリング技術である直交シグナル補正（ＯＳＣ）とともに用いて回帰モデルを作成し、緑茶の代謝物プロファイル（Ｘ変数）と品質ランキング（Ｙ変数）との関係を検討した。ＰＬＳ回帰モデルの有効性および信頼性を、モデル（Ｒ２Ｙ）、予測性パラメータ（Ｑ２）、トレーニングセットの推定値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＥ）、およびテストセットの予測値の平均二乗誤差（ＲＭＳＥＰ）によって説明される変動割合によって評価した。ＰＬＳ回帰モデルの有効性および信頼性は、トレーニングセットによって検証し、そしてテストセットでバリデートした。
【００７８】
２つのＯＳＣ成分を除去して、モデル中でＹ変数に対して関連するＸ変数の５２．１１％を残した。ＰＬＳモデルを構築した後、クロスバリデーションに従って、Ｙの７７．９％の変動を反映し（Ｒ２Ｙ＝０．７７９）そしてＹの６６．９％の変動を予測した（Ｑ２＝０．６６９）。このトレーニングセットによって作成したモデルは、７．５７のＲＭＳＥＥ値であった。Ｘ（ｔ１）およびＹ（ｕ１）の第１のサマリー間のプロットにより、良好な相関が観察された。しかし、４６番のサンプルについては、予測値が非常に大きく乖離していたので、除外した。４６番を除外して再度予測モデルを構築すると、Ｒ２Ｙ＝０．８７６およびＱ２＝０．７７８に改善され、ＸとＹとの間に良好な相関が見られた（図１６）。ＲＭＳＥＥも５．３６に低下していた。次いで、テストセットで検証したところ、品質のランキングに非常に良く一致していた（図１６）。
【００７９】
さらに、モデル構築に重要な高い関連を有する説明変数Ｙを、ＶＩＰ（投影における変数重要性）値からコンピュータ解析により同定した。１を超える大きなＶＩＰ値は、最も関連がある説明変数Ｙである。分子はランダムに破壊されるので、クロマトグラムから代謝物を同定することは実行不可能であるが、ＶＩＰ値から判断して、重要な代謝物を保持時間として特徴づけることができた（図１７）。保持時間に対する変数は、元のクロマトグラムでは、高いランキングの緑茶と低いランキングの緑茶との間に強度差を示した。したがって、最終的なモデルに対する貢献度（例えば、保持時間）の順に予測変数をランク付けすることによって、緑茶の品質予測が可能であることがわかった。
【００８０】
（実施例１１：ＵＰＬＣ／ＭＳ用の分析サンプルの調製および分析）
２００６年の品評会でランキング（格付け）された５６種の一番茶の加工後の乾燥葉をサンプルとして用いた。市販茶品評会に記載されたこれらの茶サンプルは、奈良県農業総合センター茶業振興センターから入手した。茶のランキングは、官能試験の総合スコアによって決定され、これは、葉の外観、入れた茶の芳香、色、および味であり、専門の茶の鑑定人によって鑑定された。なお、ランキングの高い方から順に、１番から５６番まで順位をつけた。
【００８１】
まず、２ｍＬ容のエッペンドルフ管中で乾燥茶葉（１０ｍｇ）を凍結乾燥し、Retschボールミル（２０Ｈｚ、１分間）で粉砕した。緑茶の親水性一次代謝物を、メタノール、水、およびクロロホルムの混液（２．５：１：１、v/v/v）を用いて抽出した。得られた混合物を、サーモミキサー中で３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、溶液を４℃にて１６０００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、２００μＬの上清を、穴あきキャップでキャップした１．５ｍＬ容のエッペンドルフ管に移した。得られた抽出物を、乾燥するまで（一晩）真空遠心分離乾燥機中で乾燥させた。得られた乾燥物に２００μＬのメタノール／水（４：１、v/v）（０．１％(v/v)のギ酸を含む）を加えて、ＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、分析サンプルとした。
【００８２】
分析サンプルの４μＬを、ＵＰＬＣ／ＭＳに供した。本実施例では、バイナリーソルベントマネージャ、カラムヒータ、およびサンプルマネージャを装着したACQUITY UPLCTMシステム（Waters）を用い、そして検出を、LCT premierTM XEマススペクトロメトリー（Waters）を用いて行った。この装置には、２．１×１５０ｍｍ，１．７μｍのAcquity UPLC BEH C18カラムを装着し、４０℃で操作した。移動相の条件としては、０．３ｍＬ／分の流速で、移動相Ａとして水（０．１％(v/v)のギ酸を含む）および移動相Ｂとしてアセトニトリル（０．１％(v/v)のギ酸を含む）を用い、移動相Ｂを０％(v/v)から１００％(v/v) に７分間で増加させる直線グラジエントを行い、次いで７分間維持させた。ＭＳは、ネガティブモードでエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを用いた。イオン化パラメータは、キャピラリー電圧：２．０ｋＶ、コーン電圧：０．０３５ｋＶ、脱溶媒和ガス流量５００Ｌ／時間、脱溶媒和温度：３５０℃、およびソース温度：１００℃であった。
【００８３】
（実施例１２：緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳのデータ解析および緑茶代謝プロファイリング）
上記実施例１１においてＵＰＬＣ／ＭＳにより得られたデータの前処理については、得られた生のクロマトグラフデータを、ANDIファイル（分析データ交換プロトコル、*.cdf）に変換した。変換したファイル（AIA）を、ピーク検出、アラインメント、ギャップフィルタリング、および標準化についてデータ処理ソフトウェアMZmineを用いてデータの前処理を行った。
【００８４】
ランキングされた一番茶サンプルのうち、１番のランキングの緑茶サンプルのトータルイオンクロマトグラムを図１８に示す。すべてのランクのサンプルが、同様のクロマトグラムパターンを示した。しかし、図１９に示すように、茶の品質の違いによりピーク強度の差が見られた。
【００８５】
次いで、この複雑なデータから重要な化合物および情報を明らかにするために、多変量分析を行った。多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、主成分分析（ＰＣＡ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択した。全体を把握するためにUnsupervised ＰＣＡを行った。９つの主成分では、Ｒ２Ｘ＝０．７６７およびＱ２＝０．５０８であり、低い等級の茶および高い等級の茶は、ＰＣ１軸に沿って別々に分かれた（図２０）。すなわち、高品質の緑茶サンプルはＰＣ１のネガティブ側に、そして低品質の緑茶サンプルは、ＰＣ１のポジティブ側に集まった。スコアプロットに対応するローディングプロットを図２１に示す。予測品質の差によって緑茶サンプルの代謝プロファイリングの差が示された。
【００８６】
次いで、緑茶品質とそのメタボロームとの関係を検討するために、部分最小二乗法による潜在的構造に対する射影（ＰＬＳ）（SIMCA-P version 11.0：Umetrics）を選択して、予測モデルを作成した。実施例１１で得られた５６種の分析サンプルを、トレーニングセット（５０サンプル）およびテストセット（６サンプル）の群に分けた。２番、１２番、２２番、３２番、４２番、および５２番のサンプルを、モデルのバリデーション用のテストセットとして除外した。すべての変数のＸマトリクスを、中心にスケールした。２つの顕著な成分を抽出し、クロスバリデーションに従って、Ｙの８３．３％の変動を記述し（Ｒ２Ｙ＝０．８３３）そしてＹの７１．４％の変動を予測した（Ｑ２Ｙ＝０．７１４）（図２２）。次いで、テストセットについて、ＰＬＳモデルで予測し、トレーニングセットサンプル（ＲＭＳＥＥ＝６．７５）に基づくモデル評価に関して、テストサンプル（ＲＭＳＥＰ＝７．２２）の予測精度が得られた（図２２）。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、従来困難であった製品緑茶の総合品質を簡便な方法で予測することが可能である。すなわち、緑茶を、クロマトグラフィーや分光分析などの種々の機器分析によりスクリーニングすることによって、迅速かつ有益に品質予測し得る。
【００８８】
従来の緑茶の機器分析は、医用目的の抗酸化化合物、ならびに呈味および芳香用のカテキンおよび他のフェノール性化合物などの、特定の機能に重要であると考えられる特定の群の化合物に焦点が当てられていた。しかし、緑茶の特徴づけは、単一の代謝物に由来するのではなく組み合わせに由来し得る。したがって、複数の成分を一度に分析することによる本発明の方法を用いれば、より精度よい品質予測が可能であり、緑茶製造工程あるいは緑茶流通保管工程のさらなる改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＰＣＡ解析結果を示す図であり、高いおよび低いランキングの緑茶サンプルについてのスコアプロットである。
【図２】トレーニングセットとしての４６種の緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図３】テストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５３種の全ての緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図４】直交シグナル補正（ＯＳＣ）を用いたトレーニングセットとしての４６種の緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図５】直交シグナル補正（ＯＳＣ）を用いたテストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５３種の全ての緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図６】緑茶の品質予測値を生成するために用いた変数の影響を示すグラフである。
【図７】最高品質の茶から抽出したサンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（７５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）を示す。
【図８】５３種のランキングされた一番茶サンプルのすべてについて得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを重ねて示す。
【図９】トレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の両方の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１０】トレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の両方の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳ−ＯＳＣモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１１】トレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の両方の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳ−ＯＳＣＷモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１２】種々の溶媒で調製したサンプルについてのＦＴ−ＮＩＲスペクトルであり、図中、Ａはブランク、Ｂはグリセロール、Ｃは鉱油、Ｄはヘキサン、およびＥはアセトニトリルの場合を示す。
【図１３】ＰＣＡ解析結果を示す図であり、ファクター３のローディングプロットである。
【図１４】５５００〜５２００ｃｍ−１のスペクトル域のデータについてのＰＣＡ解析結果を示す図であり、高いおよび低いランキングの緑茶サンプルについてのスコアプロットである。
【図１５】テストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５３種の全ての緑茶サンプルについてのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１６】４６番のサンプルを除くトレーニングセットおよびテストセット（丸で示す）の緑茶サンプルの１Ｈ−ＮＭＲデータから算出したＰＬＳ−ＯＳＣモデルについての実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【図１７】重要な代謝を特徴づける保持時間ごとのＶＩＰ値を示すグラフである。
【図１８】１番のランキングの緑茶サンプルのＵＰＬＣのトータルイオンクロマトグラムである。
【図１９】高品質緑茶（Ｎｏ．１および２）および低品質緑茶（Ｎｏ．５５および５６）のＵＰＬＣのイオン強度を示すクロマトグラムである。
【図２０】すべてのランキングの緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳ分析によるＰＣＡスコアプロットである。
【図２１】緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳ分析のＰＣＡ解析結果を示す図であり、ＰＣ１のローディングプロットである。
【図２２】テストセット（丸で示す）およびトレーニングセットの両方の５６種の全ての緑茶サンプルのＵＰＬＣ／ＭＳ分析でのＰＬＳモデルの実測および予測の緑茶品質（ランキング）間の関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑茶の品質予測方法であって、
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果から、品質を予測する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記多変量解析が、ＰＬＳ回帰分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前処理が、前記緑茶を熱分解処理する工程を含み、そして前記機器分析が、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記解析結果が、保持時間に基づいて品質予測される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記前処理が、前記緑茶から親水性化合物を抽出して抽出物を得る工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記機器分析が、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせであり、そして前記前処理がさらに前記抽出物をシリル化する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分析結果の中で、アラビノース、グルタミン、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、イノシトール、シキミ酸、リン酸、フルクトース、テアニン、リンゴ酸、カフェイン、キナ酸、グルコース、マンノース、リボース、およびスクロースのデータが解析される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記機器分析が、液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、または核磁気共鳴分析である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記前処理が、前記緑茶を粉砕して粉末を得る工程および該粉末を溶媒でペースト状にする工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記機器分析が、赤外分光分析または近赤外分光分析である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記機器分析が、フーリエ変換近赤外分光分析であり、そして前記多変量解析する工程において、前記分析結果の中で５５００〜５２００ｃｍ−１の結果についてデータ変換し、該変換されたデータをさらに二次微分する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
品質既知の複数の緑茶を前処理して個別の分析サンプルを得る工程；
該個別の分析サンプルを機器分析に供して個別の分析結果を得る工程；および
該個別の分析結果と該品質との関係を数値データに変換して多変量解析する工程；
によって得られる、緑茶の品質予測モデル。
【請求項１３】
緑茶の品質予測方法であって、
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果を、請求項１２に記載の品質予測モデルと照合する工程；
を含む、方法。
【請求項１】
緑茶の品質予測方法であって、
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果から、品質を予測する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記多変量解析が、ＰＬＳ回帰分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前処理が、前記緑茶を熱分解処理する工程を含み、そして前記機器分析が、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記解析結果が、保持時間に基づいて品質予測される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記前処理が、前記緑茶から親水性化合物を抽出して抽出物を得る工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記機器分析が、ガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせであり、そして前記前処理がさらに前記抽出物をシリル化する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分析結果の中で、アラビノース、グルタミン、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、イノシトール、シキミ酸、リン酸、フルクトース、テアニン、リンゴ酸、カフェイン、キナ酸、グルコース、マンノース、リボース、およびスクロースのデータが解析される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記機器分析が、液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、または核磁気共鳴分析である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記前処理が、前記緑茶を粉砕して粉末を得る工程および該粉末を溶媒でペースト状にする工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記機器分析が、赤外分光分析または近赤外分光分析である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記機器分析が、フーリエ変換近赤外分光分析であり、そして前記多変量解析する工程において、前記分析結果の中で５５００〜５２００ｃｍ−１の結果についてデータ変換し、該変換されたデータをさらに二次微分する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
品質既知の複数の緑茶を前処理して個別の分析サンプルを得る工程；
該個別の分析サンプルを機器分析に供して個別の分析結果を得る工程；および
該個別の分析結果と該品質との関係を数値データに変換して多変量解析する工程；
によって得られる、緑茶の品質予測モデル。
【請求項１３】
緑茶の品質予測方法であって、
緑茶を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果を、請求項１２に記載の品質予測モデルと照合する工程；
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２００９−１４７００（Ｐ２００９−１４７００Ａ）
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０４５８（Ｐ２００８−２０４５８）
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月３日 社団法人 日本生物工学会発行の「第５８回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００２２５１４２）奈良県 (42)
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月３日 社団法人 日本生物工学会発行の「第５８回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００２２５１４２）奈良県 (42)
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【Ｆターム（参考）】
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