繊維状ファージ上でのジスルフィド結合二量体タンパク質の提示
バクテリオファージ粒子の表面上での複合ホモ二量体タンパク質、及び繊維状ファージｐＩＸコートタンパク質との融合ポリペプチドとして提示される、そのようなタンパク質の組み合わせ合成ライブラリの提示のための方法が提供される。本発明の方法を用いて、ヘテロ二量体又はジスルフィド結合した多量体タンパク質のような、更に複合の鎖間結合構造が提示され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１１月１７日に出願された米国出願第６１／２６１，７６７号に対する優先権を請求し、この出願は、参照により全体的に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、二量体抗体断片、全抗体、又は他のジスルフィド結合多量体構築物を産生するために、ｐＩＸファージディスプレイライブラリを生成し、用いるための、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
繊維状ファージディスプレイは、各ファージ粒子が、選択プロセスにおいて一緒にそのコートタンパク質のＮ末端と融合したポリペプチドをコードする核酸を結合させるときの、タンパク質の親和性に基づく選択のために広範に使用される技術である。Ｍ１３バクテリオファージは、５つのコートタンパク質をコードし、このうちマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩ及びｐＶＩのおよそ５つのコピーは、ファージの一方の末端部にあり、同じ数のｐＶＩＩ及びｐＩＸが、ファージの他方の末端部にある。ファージＤＮＡは、メジャーコートタンパク質、ｐＶＩＩＩのおよそ３０００個のコピーによって封入される。異物ポリペプチドの提示はＭ１３の各コートタンパク質によって達成されてきたが、このうち最も一般的な融合パートナーはｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩである。この技術を用いて、ペプチド、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、及び他のタンパク質バインダーのライブラリが構築されており、多様な用途において使用が見出され、かつ高い商業的価値を有する。
【０００４】
ｐＩＩＩコートタンパク質は、そのサイズ、立体配座、少ないコピー数に起因して、ｐＶＩＩＩタンパク質よりも好まれている。ｐＩＩＩマイナーコートタンパク質は、柔軟な可動性ヒンジセグメントによって接続される３つのドメインを含む、大腸菌中へのファージ感染に関与する４０４アミノ酸、４２ｋＤタンパク質である。ｐＩＩＩ Ｎ末端への融合は、ファージ表面から離れて提示されるタンパク質を繋ぎ止め、小さく、高いコピー数のｐＶＩＩＩコートタンパク質への融合よりも、リガンド結合に対して潜在的により高いアクセスを提供する。ｐＩＩＩタンパク質は、感染の最初の工程に必須であり、ほとんどの小さいペプチド及びタンパク質の融合は、このプロセスを干渉し得る。この問題は、例えば、野生型ｐＩＩＩタンパク質の第２のコピー又はヘルパーファージを用いるファージミド系を含有する、ウイルスベクターの使用によって回避される。ｐＩＩＩとは対照的に、かつｐＶＩＩＩと同様に、ｐＶＩＩ及びｐＩＸは、それぞれ、ファージ表面上で密接に詰められた３３及び３２ａａの短いヘリックスタンパク質である。それにもかかわらず、ｓｃＦｖ（Ｇａｏ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９，１２６１２〜１２６１６，２００２）及びＦａｂ（Ｓｈｉ，Ｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７，３８５〜３９６，２０１０、Ｔｏｒｎｅｔｔａ，Ｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ３６０，３９〜４６，２０１０）ライブラリは、ｐＩＸ上で提示及び選択されている。Ｆｖ及びペプチドのヘテロ二量体ディスプレイは、異なるポリペプチドをｐＶＩＩ及び密接に隣接したｐＩＸの両方に融合することによって記載されている（Ｇａｏら、１９９９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９６：６０２５〜６０３０及びＪａｎｄａ米国特許第７０７８１６６号）。加えて、単一特異的なｓｃＦｖのｐＶＩＩディスプレイが報告されている（Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉら、２００５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０７：１３５）。ファージ又はファージミドベクターによってコードされる細胞外タンパク質がコートタンパク質に融合されず、むしろ再操作されたコートタンパク質ｐＩＩＩ及びｐＩＸにジスルフィド結合を通じて共有結合する、代替的なアプローチもまた記載されている（米国特許第６７５３１３６号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ファージ粒子の表面上で二量体タンパク質並びにヘテロ二量体タンパク質を提示する能力は、組み合わせライブラリフォーマットにおけるより複合のタンパク質構造を模倣する際に有利である。分子間ジスルフィド結合を介して接続される重鎖及び軽鎖対（ヘテロ二量体）のホモ二量体である、ヒトＩｇＧのタンパク質のような、複合タンパク質の変異型をスクリーニングする高処理方法を生成するために、当該技術を前進させる要求が引き続き存在する。現在まで、繊維状ファージ上の完全な抗体重鎖の正確なアセンブリ及び提示を実証することは可能でなかった。本発明のライブラリ及び方法は、総合設計、アセンブリ技術、及びファージｐＩＸ Ｆａｂライブラリを組み合わせることにより、これらの要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｍ１３コートタンパク質、ｐＩＸを用いた、繊維状ファージ上での二量体ジスルフィド結合タンパク質及びより複合の構造の提示のための簡易な手段を提供する。本発明において、提示されるタンパク質は、ｐＩＸコートタンパク質を含む融合タンパク質であり、ＣＨ２ドメインのような、折り畳まれたドメインは、ヒンジドメインのような、システイン残基を含む多量体化ドメインに結合される。具体的な実施形態では、二量体タンパク質は、ホモ二量体であり、ここでメンバーは、ジスルフィド結合され、タンパク質は抗体Ｆｃを含む。別の実施形態では、ホモ二量体ジスルフィド結合タンパク質は、ヒト抗体タンパク質を含み、ここで少なくともヒンジドメイン及び定常ドメインは、ホモ二量体を含むポリペプチドの各々において存在し、かつ任意に、ホモ二量体構造は更に、ジスルフィド結合形成によって独立して発現される抗体軽鎖と会合する。
【０００７】
本発明は、ｐＩＸコートタンパク質をコードする配列と融合した外因性ポリペプチドをコードする配列を有する、少なくとも１つの融合タンパク質をコード化する複製可能なベクターを提供し、ここで外因性非ファージタンパク質部分は、ホモ二量体形成ポリペプチド鎖である。一実施形態では、融合したホモ二量体形成ポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質を形成する。別の実施形態では、ホモ二量体構造は更に、ヘテロポリペプチドと会合して、より複合の構造を形成し得る。一態様では、単一のファージ分子における抗体重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の提示は、完全なＩｇＧ分子等であるが、これらに限定されない、ファージ粒子の表面における機能的抗体分子のアセンブリをもたらす。二量体ジスルフィド結合タンパク質として、ファージの表面上で融合ポリペプチドを提示することができる複製可能なベクター及びファージ粒子を含有する宿主細胞が、本発明に含まれる。ベクターは任意に、提示されたポリペプチド−コートタンパク質融合をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に融合した、分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
抗体組成物の選択及び改善のためのアセンブリ、スクリーニング、並びに当該技術分野において実施されるような他の尋問技術に有用な、二量体ジスルフィド結合タンパク質のｐＩＸファージディスプレイのデノボライブラリを構築するための方法及びベクターもまた提供される。一実施形態では、ファージ粒子表面上で多量体構造を形成することができる複数個の異なる融合ポリペプチドを提示するファージ粒子を含有する宿主細胞のライブラリは、ｐＩＸタンパク質に結合される。一態様では、ライブラリは、ファージミド系においてコードされる。
【０００９】
一実施形態では、本発明のライブラリは、重鎖可変領域のライブラリを含み得、それは更に、軽鎖可変領域のライブラリを含み得、それは更に、変異型Ｆｃ領域のライブラリを含み得る。本発明のライブラリは、標的リガンドへの変化した結合、又はエフェクター分子（例えば、ＦｃγＲｓ及び／又はＣ１ｑ）に対する変化した結合を有するような、所望の、増強された、又は軽減された特性を有するタンパク質をコードするライブラリから、ポリヌクレオチドを特定及び単離するために、パンニング、分類、又は他の選択手順に供されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐＩＸで繋ぎ止められたＦａｂを発現するために使用される出発ベクターのダイアグラム。
【図２】Ａ〜Ｂは、ｌａｃＺプロモータ；細菌シグナルペプチド、ｐｅｌＢの上流に付加されたリボソーム結合部位（ＲＩＢＳ）；Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及びファージマイナーコートタンパク質ｐＩＸ又はｐＶＩＩを接続する、可動性リンカー（Ｇ4Ｓ）の位置；並びにｐＩＸ上の完全ＩｇＧ構造の発現のためのジシストロニックなファージミドベクター（Ｂ）の相対的な位置を示す、Ｆｃ形成構築物（Ａ）のためのｐＩＸファージミドベクターの概略図。
【図３】Ａ〜Ｂは、実施例１に記載されるように構築された組み換えファージ粒子に対する、ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであり、組み換えファージ粒子が、抗Ｆｃ Ｍａｂ（Ａ）で又はＣＮＴＯ ３４４３、抗ＥＭＰ１ ｍＡｂ（Ｂ）でコーティングされたプレート上に捕捉され、捕捉されたファージが、ＨＲＰ共役した抗ｐＶＩＩＩ ｍＡｂを用いて検出された、Ｆｃ融合タンパク質（Ａ）又はＥＭＰ−１−Ｆｃ（Ｂ）の増加を実証している。ヘルパーファージは、ＢにおけるＦｃファージと同様に陰性対照であった。この実施例において、ファージの２つの個々の調製物が使用された。
【図４】ファージ上に提示されたＦｃドメインが、プロテインＡに結合できることを示す結合アッセイからのグラフ。
【図５】Ａ〜Ｂは、最適な結合酸性度、ｐＨ ６．０（上部）で、及び非特異的な結合条件下、ｐＨ ７．５（下部）で行われた、ＦｃＲｎ結合アッセイからのグラフ。
【図６】検出のために抗ヒトＦｃ抗体を用いたウェスタンブロットを示し、非還元条件、レーン１、ＮＲ；及び還元条件、レーン２、Ｒの下で、単離及び電気泳動されたタンパク質の二量体的性質を実証し、非還元下でメジャーバンドが、還元条件下でのメジャーバンドのおよそ２倍の分子量であることを示している。
【図７】Ａ〜Ｄは、ファージ上で発現された抗体ドメイン、発現されたＥＭＰ−１−Ｆｃ構築物、又はファージ自体のいずれかに特異的な種々のリガンドを用いて指定の調製物から捕捉され、ｌＡｃ誘導物質ＩＰＴＧである（Ａ）抗ＦＤ（ＣＨ１）抗体捕捉；（Ｂ）抗カッパ抗体；（Ｃ）抗ＣＨ２抗体；及び（Ｄ）抗ＣＨ３抗体を用いて又は用いずに培養された、ファージについての、ＥＬＩＳＡフォーマットで産生されたシグナルを示す棒グラフである。ｐＩＸ上で６−２ Ｆａｂ又は非免疫グロブリンタンパク質を提示するファージが陰性対照として含まれる。
【図８】抗ＩＬ１３ ＩｇＧ ｐＩＸと同じ特異性で競合する可溶性抗ＩＬ１３ ｍＡｂ（格子縞棒）の存在又は不在下で、商業用の抗ＩＬ１３抗体を用いて指定の調製物から捕捉されたファージについての、ＥＬＩＳＡフォーマットで産生されたシグナルを示す棒グラフである。ＥＭＰ−１−Ｆｃ構築物は、陰性対照であり、ＩＬ１３に結合せず、ＩＬ１３特異的６−２ Ｆａｂは、ｐＩＸ融合物が陽性対照として含まれるため、ファージ上でｐＩＸを提示した。
【図９】Ａ〜Ｂは、商業用の抗ＩＬ１３抗体によってプレート中に捕捉され、続いてファージ上で漸増量の競合する抗ＩＬ１３抗体（６−２完全ＩｇＧ）、又はＩＬ１３（抗ＥＭＭＰＲＩＮ）（Ａ）に特異的でない対照抗体を付加され、またＩＬ１３によって、商業用の抗ＩＬ１３抗体によってプレート中に捕捉され、続いてファージ上の６−２ Ｆａｂを付加されたファージについての、ＥＬＩＳＡフォーマットで産生されたシグナルを示す棒グラフである。漸増量の抗ＩＬ１３ ｍＡｂ又は抗ＥＭＭＰＲＩＮ ｍＡｂのいずれかが付加された（Ｂ）。
【図１０】ビオチン化ＩＬ１３又はＩＬ１７Ａ抗原を使用してＩＬ１３又はＩＬ１７Ａの完全ＩｇＧ構築物を提示するファージを捕捉した後に、ドメイン特異的な抗体抗Ｆｄ、抗カッパ、抗ＣＨ２、及び抗ＣＨ３のいずれかによって、及び競合する可溶性抗ＩＬ１３ ｍＡｂ又は抗ＩＬ１７Ａ ｍＡｂの存在又は不在下で捕捉されたファージからのシグナルを示す。ファージは、抗Ｍ１３抗体（ｙ軸）で検出された。
【００１１】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００１２】
略語
ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性、ＡＤＭＣ＝抗体依存性単核細胞媒介型細胞傷害性、ｃ１ｑ＝補体因子１ｑ、ＥＰＯ＝組み換えエリスロポエチン、ＦｃＲ＝Ｆｃ受容体、Ｉｇ＝免疫グロブリン、Ｈｃ＝重鎖、Ｌｃ＝軽鎖、ＩＰＴＧ＝イソプロピルチオ−β−ガラクトシド。
【００１３】
定義
本明細書で使用されるとき、別段の指示がない限り又は文脈から明白でない限り、抗体ドメイン、領域、及び断片は、当該技術分野において周知であるような標準的な定義に従う。本発明のタンパク質は、１つ以上の免疫グロブリンクラスの抗体に由来するか、又はその部分を組み込む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ、またＩｇＧ及びＩｇＡの場合は、それらのサブタイプ、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4。
【００１４】
が含まれる。「シストロン」とは、アミノ酸配列をコード化し、上流及び下流ＤＮＡ発現制御要素を含む、ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドの配列を意味する。
【００１５】
「外因性ポリペプチド」又は「外因性タンパク質」又は「細胞外タンパク質」とは、通常は野生型繊維状ファージゲノムによってコードされず、むしろ通常のファージタンパク質にとって異質であるタンパク質を意味する。典型的な外因性ポリペプチドは、それらがとりわけ、ＣＨ３、ＣＨ２、ヒンジ領域、及び／若しくはＣＨ１ドメイン又はそれらの断片を含み得るＦｃドメインとして、天然に発生するように、抗体免疫グロブリン重鎖（Ｈｃ）ドメイン若しくは免疫グロブリン軽鎖（Ｌｃ）ドメイン、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶH）、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶL）、天然若しくは合成ポリペプチド、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は免疫グロブリンドメインの配列若しくは組み合わせを含む、目的とする任意のポリペプチドである。
【００１６】
「Ｆｃ」により、消化されたＩｇＧの結晶化可能な開裂断片に与えられる標識であり、抗体定常ドメインに由来し、かつジスルフィド結合の鎖間結合を有するポリペプチド鎖の二量体構造を含む、抗体の機能的断片を意味する。ヒトＩｇＧ１において、パパインは、Ｃｙｓ２２６に対する断片Ｃ末端を作り出す（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にあるようなＥＵインデックスを用いて付番される）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基付番を指す。ＦｃのＮ末端残基の定義は、異なり得るが、第１の鎖間結合システイン（Ｋａｂａｔ系におけるＣ２２６）に対してＮ末端の第３残基である、Ｋａｂａｔ付番系における少なくとも残基２２３を含むことが概して理解される。分子のＦｃ部分は、抗体のその特異的な標的抗原との接触に直接に関与しないが、エフェクター機能を媒介する。これらの機能は、次の２つの種類からなる：（１）Ｃ１ｑ結合及び／又はＩｇＧに対するＦｃ受容体γ−タイプ結合、ＩｇＥに対するＦｃ受容体ε結合、及びＩｇＡに対するＦｃ受容体α結合に続く、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性若しくはＡＤＣＣ及びＡＤＭＣのような、抗体の抗原への結合を要求する機能、並びに（２）ＦｃＲｎに結合し、細胞及び組織障壁（腸のような）を越えて経細胞輸送される能力による循環における持続性のような、抗原結合から独立した機能。特に、Ｆｃの融合を介して、抗体分子又は他の分子の血清半減期を有意に増加させる能力は、非常に有利である。より長命の分子は、臨床治療に必要とされる量を低減させ、それによって投与の頻度を低減させ得る。
【００１７】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。ＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスが含まれ、これにはこれらの受容体の対立遺伝子変異型、あるいはスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、それは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＦＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５：２０３〜２３４における概説を参照されたく、ＦｃＲｓは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，９：４５７〜９２、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，１９９４，４：２５〜３４、及びｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９９５，１２６：３３０〜４１において概説され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１８】
「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」とは、操作可能に結合される、それぞれ第１及び第２の核酸配列によってコードされる第１及び第２のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド（タンパク質）を意味する。本明細書で使用されるとき、融合タンパク質は、「操作可能に結合」される構成成分及びドメインを含有し、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの融合した要素が、各々が意図されるように働く又は機能するように結合されることを意味することが理解される。例えば、プロモータ、オペレータ、又はエンハンサのような、発現を調節する要素は、その発現が調節されるべきヌクレオチド配列に操作可能に結合され得る。要素間の及び要素の間の結合は、直接的であっても、又はリンカーを介するような間接的であってもよい。これらの要素は、必ずしも隣接していない。
【００１９】
用語「ライブラリ」は、変異型である、すなわち、ある種の領域が同じであるか又は類似しており、他の領域が異なる、コードされたタンパク質の集積を意味する。変異領域は、指向性又は無作為の変異（確率的又は非確率的変化）によるものであってもよい。ライブラリ又は変異型は、異なる変異型の数又はライブラリの「サイズ」の観点から説明することができる。有用なデノボ抗体ライブラリは、高い多様性（＞１０10）を有し、変化に応じやすく、組立が容易であり、所望でない配列のバックグラウンドが低い。次の方法を組み合わせることにより、ライブラリアセンブリが加速され、低バックグラウンドをもたらされる：（ａ）Ｋｕｎｋｅｌ系単鎖突然変異誘発、（ｂ）制限部位を有するパリンドロームループ、及び（ｃ）メガプライマーアプローチの使用。
【００２０】
「ファージミド」又は「ファージベクター」は、プラスミドに由来するもののような、ファージ染色体及び外因性ＤＮＡの両方に由来する構成成分を含有するクローニング及び発現ベクターである。ファージミドは、ファージゲノムの部分を含有するため、宿主のヘルパーファージとの共感染時に、それはファージ粒子中にパッケージ化され得る。本発明のファージミドは、ファージＭ１３粒子中にパッケージ化され得る。ファージミド又はファージベクターは、本明細書における融合タンパク質をコードする核酸又は本明細書で提供される発現カセットのような、非相同のＤＮＡの挿入又は組み込みによって操られている。そのような発現ベクターは、典型的には、宿主細胞中の挿入された核酸の効率的な転写のためのプロモータ配列を含有する。
【００２１】
概論
二価抗原結合タンパク質である天然抗体は、重鎖の適切な会合のために、Ｆｃ定常ドメイン及びヒンジ領域に依存する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、好ましくは、国際公開第２００５００５６０４号に記載されるもののような、又は天然又は操作された抗体配列の配列を含む検索データベースによって見出され得るもののような、ヒト生殖細胞系配列に由来する。広くは、本発明のタンパク質構築物は、１つ以上の定常ドメイン又はその部分に結合されたヒンジ領域を含む。能力受容体に結合し、体内の持続性を増加させる能力のようなすべての関連する機能を保持するために、Ｆｃにおいて通常存在するすべての定常ドメイン：１つ以上のシステイン残基又は他のスルフィド若しくはセレノスルフィド結合形成残基を含有する、配列番号１〜４に示されるヒンジ又はその部分；配列番号５〜８によって例示されるＣＨ2又はその変異型、及び配列番号９〜１２によって例示されるＣＨ3又はその変異型を組み込むことが通常は所望される。本明細書で提供されるものによって表される配列は、非限定的であり、天然及び変異型抗体ドメイン配列は、インターネット上の種々のデータベースにおいて、又は本発明の実践において有用であり得る多数の公報において見出され得ることが当業者によって理解されよう。加えて、構築物は任意に、ＣＨ１ドメインの幾つか若しくは、すべてを含んでもよく、又は配列番号１３のもののように、抗体可変ドメインの幾つか若しくはすべてがまた存在してもよい。当然のことながら、これらのドメインは、完全ＩｇＧ構築物において存在するであろう。抗体ドメインの適切な発現及び折り畳みに対する必要に応じて、配列番号１４（ｐｅｌＢ）及び１５（ｏｍｐＡ）のアミノ酸配列をコードするもののような、他の抗体配列及び非抗体配列が含まれてもよい。しかしながら、本発明は、ある種の定常ドメインのみを含み、その他を含まない構造、並びに非抗体由来のドメインが存在し得る構造を企図する。
【００２２】
種々のＦｃ機能は、Ｆｃの異なる部分に依存するため、完全未満の機能性が所望される場合、より少ないＣHドメインを重鎖に組み込むことができる。例えば、補体の有意な活性化は、ＩｇＧのＣＨ2又はＩｇＭのＣＨ3を要求する。本発明はまた、修飾されたヒンジ及び重鎖が安定な複合で会合し得る限り、置換、欠失、挿入、又は修飾されたアミノ酸を有し得るＦｃ重鎖ドメインの使用を企図する。
【００２３】
加えて、典型的にはジスルフィド結合構造として形成されるであろう二量体共有結合構造もまた、セレノシステイン結合、ホモシステイン結合、又は混合スルフィド−セレニド結合によって形成され得る。鎖間共有結合残基を含む抗体ヒンジに加えて、他の多量体化ドメインを置換して、二量体又はより高秩序の構造を形成してもよい。これらの多量体化ドメインは、ファージ粒子の表面上での細胞外タンパク質−コートタンパク質融合タンパク質のポリペプチドの会合を補助するために、単独のシステイン若しくはセレノシステイン残基のように天然若しくは人工であってもよく、又はロイシンジッパーモチーフのようにモチーフを含んでもよい。
【００２４】
完全抗体タンパク質の場合は、重鎖−軽鎖ヘテロ二量体は、特定の重鎖定常ドメインを介して会合して、より高秩序の構造を形成する。例えば、ＩｇＧ型抗体は、四量体構造における共有結合によって接合される２つの重鎖−軽鎖ヘテロ二量体を含む。ある種の他の抗体型は、例えば、２個の四量体（ＩｇＡ）又は１０個の四量体（ＩｇＭ）を含む、より高秩序の構造中に組み込まれる類似した四量体構造を含む。
【００２５】
ファージコートタンパク質を用いて大型の細胞外タンパク質分子を提示する際に、提示されるタンパク質は、コートタンパク質の全コピーに結合される場合、組み換えファージ粒子のアセンブリを干渉する可能性がある。アセンブリ干渉を回避するために、ｐＩＸディスプレイについて（Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９：１２６１２〜１２６１６，２００２）によって記載されるようなファージミド系を使用してもよく、それによって野生型及び細胞外タンパク質結合コード配列の両方がベクターにおいて存在し、両方のタンパク質が組み換えファージ粒子中に組み込まれる。
【００２６】
本発明の適用は、予想外に、本明細書に記載されるような抗体のＦｃ部分を形成する抗体構成成分が、繊維状ファージ粒子の表面上のｐＩＸ又はｐＶＩＩコートタンパク質に対する融合タンパク質として、Ｆｃ受容体結合のような、天然抗体のＦｃドメインの既知の生物学的活性を提示するホモ二量体ジスルフィド結合タンパク質として、提示され得、また二価抗原結合タンパク質の形態であるとき、抗原結合の能力があることを見出している。故に、ファージ粒子上での抗体結合断片の単量体一価の提示とは対照的に、多価のタンパク質提示の多量体の提示が企図される。故に、本発明は、天然抗体の機能的特徴のより完全なスペクトルの間の操縦及び選択のための体系を提供する。そのような特徴には、細胞表面上で目的とする特定の抗原を提示する、細胞に対して向けられる免疫反応を促進し、製造される抗体様治療薬の生物活性の重要な構成成分である、Ｆｃ機能が含まれる。免疫系エフェクター細胞には、細胞免疫反応を活性化するＴ細胞のような抗原特異的細胞、並びに細胞免疫反応を媒介するマクロファージ、好中球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような非特異的細胞が含まれる。
【００２７】
本発明を作製する方法
繊維状ファージ粒子上に提示された融合タンパク質において、外因性ポリペプチドと繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質との間の「融合」は、アミド結合によって直接に結合されてもよく、又はリンカーポリペプチド（すなわち、「リンカー」）を含んでもよい。典型的に一続きの長さ約５〜５０のアミノ酸である様々なリンカーのいずれを使用してもよい。特に好ましいリンカーは、そのリンカーの位置で融合タンパク質に対して大きな可動度を付与する。リピートの数が典型的には１〜１２であるＧ４Ｓ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リピート又はＧ３Ｓ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を有するもののような、支配的にグリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）残基からなるもののような、二次構造が欠けているリンカーを、この目的のために使用してもよい。
【００２８】
第１のポリペプチドは、外因性タンパク質であり、第２のポリペプチドは、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質であり、それによって外因性タンパク質は、繊維状ファージタンパク質のアミノ末端に融合される。更に、融合タンパク質が未成熟形態であるとき、すなわち、リーダー配列がプロセス（除去）されていないとき、融合タンパク質はまた、本明細書に記載されるような野生型又は突然変異体ｐｅｌＢ又はｏｍｐＡ配列（それぞれ配列番号１４及び１５）等のような、アミノ末端原核分泌シグナルを含有し得る。
【００２９】
天然抗体において、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチド鎖は、別個にコードされ、発現される。分子の典型的なヘテロの二量体構造ＩｇＧクラスは、分子の４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖及び２つの軽鎖の中で及びそれらの間での、ジスルフィド結合の適切なアセンブリ及びその形成に依存している。故に、本発明において、抗体の二量体Ｆｃ部分のアセンブリ及び／又は軽鎖の会合は、存在するとき、タンパク質の個々のドメインが自己会合し、それらの間にジスルフィド結合を形成する限りにおいて、抗体形成の天然プロセスを再現する。
【００３０】
一実施形態では、繊維状ファージ粒子の表面上に提示されるべきＦｃ含有タンパク質は、天然抗体であり、ジシストロニックなベクターは、Ｆｃ構築物−ｐＩＸ融合タンパク質並びに自己会合するであろう、別個にコードされ、発現された抗体Ｌｃ又は抗原結合ドメインの発現のために構築される。本発明の抗原結合タンパク質は、任意のエピトープ、抗原部位、又はタンパク質のための結合部位を有することができる。好ましい抗原結合タンパク質は、受容体への直接結合によって、又はそれらの同族のリガンド（複数可）への結合によって、受容体タンパク質の活性化を中和する。概して、抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインを含む天然抗体Ｈｃ配列と融合した抗体Ｌｃ及び抗体Ｈｃ可変ドメインから形成されるであろう。別の実施形態では、ｐＩＸ融合タンパク質は、Ｆｃドメインに結合されたｓｃＦｖを含む。本発明の別の態様では、ｓｓｃＦｖを含む重鎖及び軽鎖の抗原結合部位は、２つの異なる結合特異性を提供し、それによってファージ表面に提示された自己組立されたジスルフィド結合構築物タンパク質を、二特異的かつ二価の分子にするように異なってもよい。例えば、ＩｇＧ分子のＶL及びＶHドメインの代わりに置換されるのは、異なる特異性のｓｃＦｖドメインであり、これにより結果として生じる分子が２つの異なるエピトープに同時に結合することができるようになる。本発明の方法を用いてファージ粒子上に提示され得る、多数の可変ドメイン対を有する二特異的な抗体分子を作り出す他の方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００２０１０３３４５Ａ１号に教示される。
【００３１】
一実施形態では抗原結合又は受容体結合ドメインは、抗体ドメインに由来しないが、Ｆｃドメインに融合される既知の又は無作為ペプチド配列である。Ｆｃの代替鎖と結合されて、所望によりその間にリンカー部分を有する生物活性ペプチド類は、同一であっても異なってもよい。生物活性ペプチド類は、最終共役物が所望の生物活性を示すのであれば、介在するリンカーと又はペプチド上のいずれかの残基から生じるＦｃと結合していてもよい。生物活性は、例えば、結合活性についてはインビトロアッセイにより、又は動物の疾病モデルでのようにインビボ活性により、あるいは共役物を投与した後の被験者の反応により、測定することができる。
【００３２】
同時係属中の出願、国際公開第０４／００２４１７号、同第０４／００２４２４号、同第０５／０８１６８７号、及び同第０５／０３２４６０号の出願者は、本明細書でＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造と称される構造を説明し、これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に全体的に組み込まれ、これらの構造は、ｐＩＸ又はｐＶＩＩファージコートタンパク質に融合され、ファージ粒子の外表面上に提示され得る、本発明の二量体ジスルフィド結合構造として含まれる。
【００３３】
一実施形態では、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹは、生物活性ペプチドリンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの対を含み、この対は、会合又は共有結合、具体的には、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合によって結合される。生物活性ペプチドは、任意の長さの上に（長さで？）あってもよく、任意の種に由来する天然産の配列であっても、人工配列であってもよい。ペプチドは概して、ファージミドベクターによってコードされ、ファージ粒子上での提示のために構築物のＦｃ部分に融合されるであろう。そのような組成物の一例としては、生物活性ペプチドとしてのＥＰＯ模倣ペプチドが挙げられる。故に、ＥＰＯ模倣のＣＨ１欠失ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹは、治療用ペプチド及びその本来の又は後天性の生体外、生体内、又はその場での特性又は活性を提示しながら、その本来の特性及び機能により抗体構造を模倣する。ペプチドが既知の生物活性を有さないが、マーカー、タグ、抗原としての機能を呈示するか、又はレポーター基、キレート基等を提供する、類似した構造の他の構築物もまた、本発明によって包含される。
【００３４】
典型的な実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質又は「ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）」は、幾つかの又は全体的な免疫グロブリンＣＨ１ドメインが不在である式（Ｉ）：
Ｖ１o−Ｐｅｐa−Ｆｌｅｘn−Ｖ２m−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3 （Ｉ）を含み、
式中、Ｐｅｐは、標的を特異的に認識することができる生物活性ペプチド又はポリペプチドを表し、Ｆｌｅｘは、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹが代替的な配向及び結合特性を有することを可能にすることによって、構造的な可動性を提供する任意の可動性リンカーポリペプチドであり、Ｖ１及びＶ２は、ブラケティング配列であり、ヒンジは、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、例えば配列番号１〜４であり、ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２定常領域の少なくとも一部分、例えば配列番号５〜８であり、ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３定常領域の少なくとも一部分、例えば配列番号９〜１２であり、ｍ、Ｎ、及びｏは、ゼロであり得るか、又は１〜１０の間の整数であり得、かつ１〜１０までの整数であり得る。Ｐｅｐ配列は、任意に、目的又は安定化、又は任意の数の生物物理学的な機能のための配列を含むことができる。典型的な実施形態では、ブラケティング配列は、Ｖｈフレームワークのような抗体可変（Ｖ）ドメインに由来し、Ｖ１は、配列ＱＩＱであり、Ｖ２は、免疫グロブリンＪ遺伝子ドメインに由来する配列を表し、ＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）である。結果として生じるポリペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合等であるが、これらに限定されない、会合又は共有結合によって他のポリペプチドに結合することができる。
【００３５】
ｐＩＸ融合タンパク質の発現のレベルは、転写レベルにおいて追加的に制御することができる。融合タンパク質は、Ｌａｃ Ｚプロモータ／オペレータ系の誘導可能な制御下にある（図１を参照されたい）。他の誘導可能なプロモータも同様に作動することができ、それらは当業者に既知である。高レベルの表面発現については、サプレッサーライブラリが、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のようなＬａｃ Ｚプロモータの誘導物質中で培養される。誘導可能な制御は、非発現条件下でライブラリを培養することによって、非機能的ｐＩＸ融合タンパク質に対する生物学的選択が最小化され得るため、有益である。次いで発現は、ライブラリ内の抗体の全体的な集団がファージ表面上に正確に表されていることを確実にするためのスクリーニングの時にのみ誘導することができる。
【００３６】
二量体化ポリペプチドファージコートタンパク質融合タンパク質をコードするベクターは、細胞外タンパク質及びファージコートタンパク質コード領域の接合部において、翻訳終止コドンを含み得る。対応する翻訳終止サプレッサーを担持する細菌細胞中で発現されるとき、融合タンパク質が産生される。対応する翻訳終止サプレッサーのない細菌細胞中で発現されるとき、遊離細胞外タンパク質は、産生されない。
【００３７】
本発明の使用方法
本明細書に出発点として例示されたファージベクターを用いて、タンパク質は、分子のライブラリを生成するための指向性突然変異誘発を用いて特異的な個別的な残基位置で、又はＮＸＴ配列と一般的に称されるＮ結合グリコシル化配列のような領域で、多様であってもよい。各々が異なる細胞外タンパク質配列を保有する数十億の大腸菌コロニーを生成するために使用され得る、修飾されたＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法が、特に有用である。効率的である一方で、高度に複合の配列ライブラリを生成するとき、突然変異誘発されていない親ＤＮＡの割合は増加する。加えて、長いオリゴヌクレオチドの合成の技術的制限は、遠位領域において配列多様性を含有するライブラリを作製するために使用されるとき、本方法の有効性を低下させる。これらの制限を克服するために、３５０塩基を超えるオリゴヌクレオチドを生成する追加的な技術を使用することができる。これらの技術には、米国特許第２００５００４８６１７号に記載されるような、標準的なＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７〜３８２）と組み合わせた、メガプライマーの使用及び突然変異誘発テンプレートにおいて制限酵素認識部位を含有するステム−ループ配列の作製が含まれる。制限クローニング（Ｍａｒｋｓら、１９９１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４ ＥＭＢＯ Ｊ．１３，３２４５〜３２６０、Ｈｏｅｔら、２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３４４〜３４８）、ファージ組み換え（Ｇｉｇａｐａｃｋ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び配列特異的組み換えのような他のライブラリ技術と比較して、改善されたＫｕｎｋｅｌに基づく方法は、配列多様なライブラリ（１０9を超える）を生成する際に、有意により有効であり、標的化されたＤＮＡ中の任意の場所に配列多様性を導入するのにより万能である。
【００３８】
Ｆｃ含有タンパク質の繊維状ファージ上での提示は、所望の結合特徴のために、そのような分子の大集団をスクリーニングすることが所望される場合に特に有用である。一実施形態では、Ｆｃ構築物−ｐＩＸタンパク質融合を発現する細菌細胞は、Ｆｃ構築物−ｐＩＸ融合遺伝子を担持するベクターＤＮＡの、ファージ粒子中への優先的なパッケージングを可能にするＭ１３変異型に感染させられる。各々結果として生じるファージ粒子は、特定のＦｃ構築物−ｐＩＸ融合タンパク質を提示し、Ｆｃ構築物−ｐＩＸ融合物をコードするベクターを含有する。そのようなファージ粒子の集団は、パンニング手順によって、所望の結合特徴のために強化することができる。典型的には、所望の粒子は、所望のファージ粒子がそこに結合し得る抗原によりコーティングされた固体表面上に固定化される。結合粒子は、収集され、細菌細胞を更に感染させるために使用される。パンニング手順は、所望の結合特徴のために更に強化するために反復される。
【００３９】
一実施形態では、ファージライブラリは、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃＲｇａｍｍａＩ（ＣＤ６４）のような、天然又は組み換えＦｃ受容体への増強された、減少された、又は変化した結合のために、分子のＦｃ部分の変異型をスクリーニングするために使用される。
【００４０】
ファージ及び他の抗体ディスプレイ方法は、生体外の抗原又は受容体標的に対する選択を操る機会を利用可能にする。生体外選択法の１つの特定の利点は、標的タンパク質上の多様な部位への抗体結合を得るように選択手順を操る能力である。あるいは、全細胞を使用して、バインダーを選択してもよい。
【００４１】
ファージライブラリは、機能的属性に関連する遺伝物質の検索を単純化するが、ライブラリから最良の候補を単離するために多重ステップのパンニング戦略が要求される。ドメイン又はエピトープ指向性パンニングは、標的タンパク質に結合する抗体を選択する日常的な方法となっている。そのような選択は、選択的パンニング、脱選択的（de-selective）パンニング、リガンド捕捉、サブトラクティブパンニング又は道しるべ（pathfinder）選択として多様に知られる方法を利用する抗体のステップによる選択を用いることによって、主に達成されてきた。
【００４２】
サブトラクティブパンニングにおいては、重複するが、完全に同一でない結合部位を有する標的（複数可）を使用して、不必要なバインダーを脱選択することができる。この戦略は、癌細胞に対するバインダーを脱選択するために通常の細胞を使用する際と同様に、未知の抗原さえにも対応するバインダーを特定するために使用されている。あるいは、関連する抗原の間で異なる又は共通の部位への抗体結合を得るために、幾つかの共通のドメイン又は構造を有する天然産のタンパク質が、連続的な又は競合選択において使用される。場合によっては、関連するケモカイン又はタンパク質の突然変異バージョンのような天然産のタンパク質が、サブトラクティブパンニングにおいて使用され得る。
【００４３】
リガンド捕捉指向性パンニングは、無関係の及び隣接していないエピトープに固定化された抗体が、ファージパンニングのために好ましい標的リガンドの結合面を捕捉し、呈示するために使用されるという点で、ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイに類似している（米国特許第６３７６１７０号）。その他のものは、所望の標的ドメイン以外における抗原を選択的にマスクするために競合抗体を使用している（Ｔｓｕｉ，Ｐ．ら、２００２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２６３：１２３〜１３２）。道しるべ技術は、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに西洋ワサビビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接に又は関節に共役させられた天然リガンドを使用する。ビオチンチラミンの存在下で、これらの分子は、標的抗原に極めて接近したファージ結合のビオチン化を触媒し、ストレプトアビジンを用いて全集団からの「タグされた」ファージの特異的な回収を可能にする。このようにして、標的自体に又はそのすぐ近くに結合するファージは、選択的に回収される（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｊ．Ｋ．ら、１９９８．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２９３〜３０２）。これらの方法、方法の変形、及び当業者に既知の他の方法を用いて、本発明のｐＩＸ細胞外タンパク質のライブラリを問い合わせることができる。
【００４４】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００４５】
実施例１．ｐＩＸ上でのＦｃ融合タンパク質の提示
Ａ．ファージミドベクター構築
ファージミドベクター、ｐＣＧＭＴ９（Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：６０２５〜６０３０，１９９９，米国特許第６４７２１４７号）は、ｐＩＸ融合を介したファージディスプレイのために重鎖定常ドメインを挿入することができるファージミドｐＩＸディスプレイベクターの発達のための主鎖としての機能を果たした。このファージミドにおいて、アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子と共に、大腸菌（ｃｏｌＥ１）及び繊維状ファージ（ｆ１）のための複製の源が存在する。
【００４６】
ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）分子を含む、Ｆｃ含有タンパク質を提示するためのｐＩＸファージミドベクターを、国際公開第２００９／０８５４６２号及び図１に開示させるように、２シストロン性の発現、ｐＣＮＴＯ−Ｆａｂ−ｐＩＸのために適合させられたＧａｏベクターに基づいて構築した。それにより可溶性軽鎖が同じ細胞中で発現され、繋ぎ止められたポリペプチドと会合する、Ｆａｂファージディスプレイのために使用された戦略とは異なり、可溶性Ｆｃは、全く発現されなかった（図２Ａ）。
【００４７】
ベクターにおけるＦａｂ軽鎖配列は欠失された。ベクターにおけるＦａｂ重鎖配列を、Ｆｃ又は構築物又はＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構築物のいずれかと置き換えた。コアヒンジを含有するシステイン対を含有するファージミドベクターＦｃ構築を次のように達成した。ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３をコードするＦｃ遺伝子セグメントを、ＰＣＲによってＦｃ含有プラスミドから増幅した。ＮｃｏＩ制限部位を、５’プライマー末端部中に、及びＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を３’プライマー末端部において組み入れた。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片及びファージミドベクター（ｐＣＮＴＯ−Ｆｃ−ｐＩＸコアＨｇ）を、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。消化産物を生成し、迅速ライゲーションキットを用いてライゲートし、ＤＨ１０Ｂ大腸菌に形質転換させた。形質転換したクローンを、ＤＮＡ塩基配列決定法を用いてスクリーニングし、正確な配列を示したものを次いで、ファージ調製のために、ＴＧ−１大腸菌に形質転換した。
【００４８】
制限酵素クローニングを介して、Ｆｃをコードする配列を、完全なＣＮＴＯ５３０融合タンパク質をコードする配列と置き換えることによって、米国特許第７３９３６６２号及びその中の配列番号８８に記載され、「ＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）」又はＣＮＴＯ５３０と称される、ＥＭＰ−１（配列番号１６）Ｆｃ（配列番号１７）構築物をコードするｐＩＸファージミドベクター（ｐ２４６７）を構築した。ＣＮＴＯ５３０コード配列を、ＰＣＲによってプラスミドｐ２４６７から増幅した。制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩを、それぞれ５’末端及び３’末端プライマーに含めた。ＰＣＲ産物及びファージミドベクター、ｐＣＮＴＯ−Ｆｃ−ｐＩＸコアＨｇをＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで消化し、精製し、迅速ライゲーションキットを用いてライゲートし、ＤＨ１０Ｂ大腸菌に形質転換した。形質転換クローンを、ＤＮＡ塩基配列決定法によってスクリーニングし、正確な配列を有するものをファージディスプレイのためにＴＧ−１大腸菌に形質転換した。
【００４９】
Ｂ．組み換えファージの調製及び特徴付け
ファージミドベクターでトランスフェクトしたＴＧ−１大腸菌を、液体培養でＯＤ600＝０．５〜０．６になるまで増殖させた。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージストックを培養物に添加し、感染は、静的インキュベーションとして、３７℃で４５分間進行させた。培養物を遠心分離にかけて、細菌をペレット化し、カルベニシリン、カナマイシン、及びＩＰＴＧを補充した培地中に再懸濁させ、２５０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で１２〜１６時間インキュベートした。一晩の培養物を遠心分離にかけ、ファージ含有上清を未使用の管に移し、そこに１０分の１の容量の塩化ナトリウム／ＰＥＧ溶液（ＮａＣｌ及びＰＥＧの濃度は？又は単に標準的な方法を用いて沈殿させたＰＥＧと述べる（Ｒｅｆ））を添加した。各管を混合し、時折混合しながら氷上でおよそ３時間インキュベートし、その後、この管を遠心分離にかけてファージをペレット化した。ファージペレットを、ＰＢＳ中に注意深く再懸濁させ、新たな管に移し、２回目の遠心分離にかけてあらゆる残存する細胞残屑を除去した。精製しファージを、−８０℃のアリコート中で保管した。スポット滴定を行って、ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）としてファージ力価を推定した。
【００５０】
Ｃ．提示されたタンパク質の特徴付け
Ｆｃ及びペプチド−Ｆｃ構築物の提示の確認
この実施例において、ファージの２つの個々の調製物が使用された。Ｆｃ支持又はＣＮＴＯ５３０支持ファージを検出するために、黒色ＥＬＩＳＡプレートを、抗ヒトＦｃγ特異的ポリクローナル抗体又は抗ＥＭＰ１ペプチドモノクローナル抗体（ＣＮＴＯ ３４４３）のいずれかでコーティングした。コーティングしたプレートを、ＴＢＳＴ中の５％ミルクでブロックし、ＴＢＳＴで洗浄した。ヘルパーファージ、Ｆｃ−又はＣＮＴＯ５３０組み換えファージをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートし、洗浄して非結合ファージを除去した。結合ファージを、ＨＲＰ共役した抗Ｍ１３ ｍＡｂ及び化学発光基質で検出した。捕捉されたファージを、ＨＲＰ共役した抗ｐＶＩＩＩ ｍＡｂを用いて検出した。ヘルパーファージ、及びＣＮＴＯ５３０支持ファージの場合は、ＥＭＰ１ペプチドを有さないＦｃ組み換えファージを、陰性対照として使用した。
【００５１】
プロテインＡ結合。精製した組み換えプロテイン−Ａを、黒色ウェルのＥＬＩＳＡプレート上に一晩、４℃でコーティングした。コーティングしたプレートを、ＴＢＳＴ中の５％ミルクでブロックし、ＴＢＳＴで洗浄した。ヘルパーファージ又はＦｃ提示ファージの適切な希釈物をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄して非結合ファージを除去した。コーティングしたプロテイン−Ａ上のあらゆる残存する非占有のＦｃ結合部位をブロックするために、ヒト抗体由来のＦｃを飽和濃度でプレートに添加した。３０分のインキュベーション後、結合ファージをＨＲＰ共役した抗Ｍ１３ ｍＡｂ及び化学発光基質で検出した。
【００５２】
ＦｃＲｎ結合。ＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）は、抗体再取り込み、区画転座、及び再循環を可能にし、故に、抗体の循環半減期を持続させる。ＦｃＲｎに結合するＦｃは、ｐＨ依存性であり、ＥＬＩＳＡ結合アッセイをそれに応じて行った。ＦｃＲｎ結合ファージを、ニュートラアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート上に捕捉し、ＨＲＰ共役した抗ｐＶＩＩＩ ｍＡｂで検出した。簡潔に述べると、黒色ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ニュートラアビジンでコーティングし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）及びケミブロッカーの５０／５０混合物でブロックした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ビオチン化ＦｃＲｎを１時間捕捉した。ヘルパーファージ又はＦｃ提示ファージの適切な希釈物を、ＴＢＳＴ中、ｐＨ＝６又はｐＨ＝７．５で調製した。非結合ＦｃＲｎを、プレートから洗浄し、ファージを添加し、１時間インキュベートした。あるいは、プレートへの添加前に、ビオチン化ＦｃＲｎをファージと室温で１時間混合した。コーティングしたＦｃＲｎ上の残存する非占有のＦｃ結合部位をブロックするために、ヒト抗体由来のＦｃを飽和濃度でプレートに添加した。結合ファージを、ＨＲＰ共役した抗Ｍ１３ ｍＡｂ及び化学発光基質で検出した。
【００５３】
Ｄ．結果
Ｆｃを提示するファージは、抗Ｆｃ抗体を用いて捕捉し、抗ｐＶＩＩＩ抗体を用いて検出したため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｆｃを提示するファージの比率を示すように設計した（図３Ａ）。Ｆｃ組み換えファージについて観察された強力なシグナル及びヘルパーファージについて観察されたシグナルの欠如は、Ｆｃが効率的にファージ表面上に提示されたことを実証する。ＥＭＰ１融合タンパク質構築物、ＣＮＴＯ５３０、提示を、図３Ｂに示される捕捉リガンドとしてＥＭＰ−１特異的抗体を用いて確認した。Ｆｃ領域が適切な生物学的活性を保持し、故に、二量体であることを確認するために、特異的な結合アッセイを行った：プロテインＡ結合、及びＦｃＲｎ結合。図４に示されるように、その表面上に提示されたＦｃを有するファージは、プロテイン−Ａに結合する一方で、Ｆｃを欠く対照ヘルパーファージは、それに結合しない。プロテインＡ結合についての化学発光シグナルは、ヒト免疫グロブリンγ特異的なポリクローナル抗体で捕捉されたＦｃ提示ファージのそれに類似しており、ファージ提示されたＦｃの大部分が、プロテインＡへの結合に適格な立体配座へと折り畳まれることを示唆する。
【００５４】
Ｆｃは、ｐＨ ６．０でＦｃＲｎに結合するが、ｐＨ ７．５で数桁の結合親和性を失う。ファージを、ｐＨ ６．０（図５Ａ）又はｐＨ ７．５（図５Ｂ）のいずれかで、ビオチン化ＦｃＲｎでインキュベートした。ｐＨ ６．０で観察された強力なシグナルによって実証されるように、Ｆｃ組み換えファージは、ｐＨ ６．０でＦｃＲｎに効率的に結合した。対照的に、同じファージは、試験したすべての濃度で、それよりもはるかに低いシグナルを示した。したがって、ｐＨ依存性結合は、ｐＩＸファージミド系を用いて提示されたＦｃについて保持された。
【００５５】
ＩｇＧ及び他のＦｃ含有分子は、ＣＨ３ドメインの相互作用を介してホモ二量体を形成する。ホモ二量体は、そのコアヒンジ領域における２つのジスルフィド結合によって安定化される。Ｆｃファージミドディスプレイベクターは、Ｆｃ遺伝子の単独コピーのみをコードするため、ウェスタンブロットを介して提示されたＦｃの凝集状態を検査した。濃縮されたファージ粒子を、還元又は非還元条件下でＳＤＳゲル上に直接充填した。図４に示されるように、非還元条件下で、タンパク質の大部分は、二量体Ｆｃ−ｐＩＸ融合タンパク質について予想されたように、約６２ｋＤの分子量を有する二量体として移動した。逆に、還元条件下で、Ｆｃ−ｐＩＸタンパク質の大部分は、３１ｋＤの単量体として移動した。故に、ファージ表面上に提示されたＦｃ分子の大部分は、ホモ二量体であり、ＩｇＧ又は他のＦｃ含有分子と同じ様態で、ジスルフィド結合で共有結合される。
【００５６】
Ｅ．発明の概要
組み換えファージについて観察された強力なシグナルは、ヘルパーファージについてのシグナルの欠如と一緒に、ＥＰＯ受容体作用物質（ＥＭＰ−１）Ｆｃ構築物が、ペプチド並びにファージ粒子上のＦｃの検出によって実証されるように、効率的に提示されることを実証する。データは、Ｆｃ含有タンパク質が、天然リガンドへの結合を可能にする特徴的な立体配座特徴を有するホモ二量体として、ファージ上で効率的に提示されたことを示す。
【００５７】
実施例２：ペプチド−Ｆｃ融合ライブラリ
ペプチド−Ｆｃ融合ライブラリを生成するために、無作為アミノ酸配列の部位においてヘアピンループを含有する、テンプレートファージミドを生成した。ヘアピンが二本鎖ＤＮＡを形成する場所に固有の制限部位、ＸｂａＩが配置されるような方法で、ヘアピンを設計した。これは後に、ＸｂａＩでの制限消化を介してテンプレートＤＮＡを除去し、それによって最終構築されたライブラリにおいてテンプレートファージミドが密接に詰められたファージを還元するために使用される予定であった。この細胞株を通じる継代は、ウラシルのｓｓＤＮＡ中への組み込みを引き起こすため、二本鎖テンプレートプラスミドを、Ｄｕｔ−／ｕＮｇ−大腸菌宿主株、ＣＪ２３６に形質転換した。次いでウラシル含有ｓｓＤＮＡテンプレートを、最終ライブラリ宿主細胞の酵素によって分解した。プラスミドを保有する単独コロニーを、液体培養で増殖させ、それをその後、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージで感染させた。ファージをＰＥＧと生理食塩水で沈殿させ、一本鎖ＤＮＡの精製のために使用した。
【００５８】
ＤＮＡライブラリを、修飾されたＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発プロトコルを用いて生成した。無作為化ライブラリヌクレオチドをコードするオリゴマー、並びに５’及び３’隣接配列を、Ｔ４キナーゼを用いて酵素的にリン酸化した。リン酸化オリゴを、３ステップの温度低下プログラムを用いて、それらのそれぞれのｓｓＤＮＡテンプレートにアニールした。第２のストランド合成を、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを反応混合物に添加して、共有結合閉環状ＤＮＡ（ＣＣＣ−ＤＮＡ）を形成することによって行った。ＣＣＣ−ＤＮＡを精製し、次いでヘアピン配列においてＸｂａＩで消化して、バックグラウンドを低減するためにテンプレートＤＮＡを開裂した。消化前及び後の両方で、ＣＣＣ−ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって検査して、細胞中へのその導入の前にライブラリ調製物の質を評価した。次いでライゲーション混合物を、ＭＣ１０６１Ｆ’宿主細胞株（大腸菌）に形質転換した。
【００５９】
４つのｐＩＸ提示されたライブラリを構築し、ここで７つ（Ａ１及びＡ２）又は８つ（Ｂ３及びＢ４）の無作為アミノ酸ループは、各々２つのＦｃ含有ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構築物（上記の式１を参照されたい）においてジスルフィド結合で拘束され、ここでリンカーは、ＧＧＳＧ又はＧＳであり、Ｖ領域Ｊ−ピース（配列番号１３）は、存在するか又は不在であり、ヒンジは、隣接した配列を有するか又は有さないＣＰＰＣのコアアミノ酸、ＩｇＧ１タイプのヒンジのいずれかを含む。これらの２つの変異型Ｆｃ領域は、下記に示すように表され、それは配列番号１７及び１８によって表され、ここで天然産のＩｇＧ４と異なる残基は下線を引かれている。２つの更なる無作為アミノ酸を、拘束ループの各末端部に付加した。
【００６０】
Ａ．７ＮＮＫライブラリ（ＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸ）
１）Ｆｃ＝Ｖ領域及び完全ヒンジを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１８）。２）Ｆｃ＝ヒンジコアを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１７）
Ｂ．８ＮＮＫライブラリ（ＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸ）
３）Ｆｃ＝Ｖ領域及び完全ヒンジを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１８）
４）Ｆｃ＝ヒンジコアを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１７）
【００６１】
生成された各ライブラリについて、総計３１回の電気穿孔を行った。形質転換効率性を滴定するために小アリコートを除去した後、増殖培養物を即座に、１リットルの培養容量にまでスケールアップし、それを１．０のＯＤ600にまで増殖させた。この時点で、培養物を次のように分割した：培養物の１０分の１を、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させてファージライブラリを生成した一方で、培養物の大半を使用して、細菌ライブラリのグリセロールストックを確立した。ファージ感染された培養物を増加したスケールにまで再び拡張し、一晩増殖させた。ファージライブラリを、氷上のＰＥＧ／ＮＡＣｌ沈殿を用いて培養上清から精製した。結果として生じたファージ力価を、ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）の数を測定するためにスポット滴定を用いて推定した。スポット滴定調製物からの１×１０-9及び１×１０-10希釈物のアリコートを、単独のコロニーを単離するためにグルコース及びカルベニシリンを補充したＬＢ培地プレート上に広げた。各ライブラリについて、最終ファージライブラリの多様性及び機能性を評価するために、９６個の単独のコロニーの配列を決定した。また、これを使用して、提供されたバックグラウンド汚染残留テンプレートの量も決定した。
【００６２】
発明の概要
一方は短い可動性グリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、コアヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を有し（配列番号１７によって表される）、他方は可動性グリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＳ）、Ｖｈドメインの部分、突然変異ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３（配列番号１８によって表される）を有する、２つのＦｃ足場は、約１〜３×１０9の複雑性を有するライブラリを産生した。各ライブラリからの９６個のクローンの配列決定は、クローンのどの配列も同一でないことを示し、ライブラリの多様性が良好であることを示した。
【００６３】
実施例３：ファージ粒子上の完全ＩｇＧディスプレイ
Ａ．ベクター設計。
完全ＩｇＧディスプレイファージミド（ｖＤＲ４７、図２Ｂ）を、図１に示される、また国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されるような、ｐＣＮＴＯ Ｆａｂ ＩＸ構築物を用いて構築し、それは重鎖のＶｈ及びＣＨ１（配列番号１９）ドメインを含んだ。ヒトＩｇＧ１（配列番号２０）のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインをコードする配列、並びに野生型配列、Ｐ６Ｓ（配列番号１４）からの単独突然変異を有する変異型ｐｅｌＢシグナル配列を付加して、ｐＶＩＩマイナーコートタンパク質でのペプチドディスプレイ及びタンパク質分泌における有意な改善を引き起こし（出願人は出願を同時係属中）、このベクターは、ｌａｃＩ遺伝子を有さないが、ｌａｃプロモータを有する。
【００６４】
Ｂ．完全ＩｇＧディスプレイのために使用される構築物の特徴付け。
ｐＩＸ上での完全ＩｇＧの提示を査定するために、試験構築物のパネルを作製した。６〜２及び１６〜７と表記されるＩＬ１３に対する抗体、並びに抗サイトカイン抗体９〜４を、新たな完全ＩｇＧ分子を構築するためのプロトタイプとして選択した。異なるコドン利用の効果を決定するために、２つの構築物を抗ＩＬ１３抗体の各々に対して作製し、このうち１つはヒトコドン最適化を伴い、もう１つは大腸菌コドン最適化を伴った。表１は、５つの完全ＩｇＧ試験構築物についてのベクター表記を列挙する。最適化された遺伝子を合成し、米国特許第６，６７０，１２７号及び同第６，５２１，４２７号に記載されるような二本鎖ＤＮＡに組み立てた。加えて、ｐＩＸと融合したＥＭＰ−１ Ｆｃ（実施例１）を、それがＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含有するが、軽鎖を含有しないため、対照として含めた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
Ｃ．ファージ産生
上記のＢ節に記載される完全ＩｇＧディスプレイ構築物を、標準的なプロトコルに従って２つの異なるＦ’大腸菌株、ＴＧ−１、及びＸＬ−１ブルーに形質転換した。これらの２つの株を試験する理由は、仮説上、完全ＩｇＧ ｐＩＸ融合タンパク質のパッケージング及びディスプレイに影響を及ぼし得る、増殖率におけるそれらの差異である。個々の形質転換体を採取し、カルベニシリンを補充した（常に１００μｇ／ｍＬで使用される）２ＸＹＴ培地中で一晩増殖させた。次いで一晩の培養物（５００μＬ）を使用して、２５ｍＬの２ＸＹＴ／カルベニシリンを接種し、培養物を３７℃、２５０ｒｐｍで、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５に到達するまで増殖させた。振盪を行わずに３７℃で３０分間インキュベーションする間に、細菌を１０１１ｐｆｕ／ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に感染させ、続いて３，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離工程を行った。この工程において、標準的なプロトコルにより、２ＸＹＴ／カルベニシリン／ＩＰＴＧ（１ｍＭ）での細菌培養が求められた。しかしながら、我々は、この体系の漏出性が、その後のファージパッケージングを伴う融合タンパク質を産生するために十分であろうとの仮説により、培養物を２つに分割し、１ｍＭ ＩＰＴＧを一方に添加し、他方には添加しなかった。要約すると、各々の構築物について、４つの異なるファージ調製を作製した：（ｉ）ＩＰＴＧを有するＴＧ−１（ｉｉ）ＩＰＴＧを有さないＴＧ−１（ｉｉｉ）ＩＰＴＧを有するＸＬ−１ブルー（ｉｖ）ＩＰＴＧを有さないＸＬ−１ブルー。培養を３０℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させ、翌日、３，０００ｒｐｍで１５分間遠沈させ、続いてＰＥＧ／ＮＡＣｌ中でファージ上清の沈殿を行った。氷上で２時間後、沈殿したファージを１０，０００ｒｐｍで、１５分間遠沈させ、ファージペレットを２ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。ファージ調製物を更に、１０，０００ｒｐｍで１０分間スピンすることによって、あらゆる残存する細菌ペレットから清澄化し、２ｍＬ管中、４℃で保管した。
【００６７】
Ｄ．ファージ力価
標準的なプロトコルに従ってファージ力価を決定した。簡潔に述べると、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５に到達するまで、ＴＧ−１細胞を２ＸＹＴ中で増殖させた。ファージ調製物を、９６ウェルプレート中のＰＢＳ中に連続的に希釈し、ＴＧ−１細胞をファージに添加し、３７℃でインキュベートして感染可能にした。３０分後、１％グルコース及びカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレートに、２μＬの各ウェルを分与することによって、スポット滴定を行った。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、ファージ濃度を、ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）の観点から決定した。表２は、すべての構築物及び培養条件についてのファージ滴定からの結果を示す。すべてのクローンは、１０＾１１〜１０＾１３ｃｆｕ／ｍＬの間の高いファージ力価を産生し、それは予測範囲内であり、ファージが効率的に産生されることを示した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
Ｅ．機能的提示を査定するためのＩｇＧドメイン−特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
ファージｐＩＸ上での完全ＩｇＧ分子の提示を査定するために、一連のサンドイッチＥＬＩＳＡを設定した。黒色マキシソーププレートを、１μｇ／ｍＬの、ＴＢＳ中に希釈した捕捉抗体；ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ＦＤ、ＣＨ１）抗体（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）、マウス抗ヒトカッパ軽鎖（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ２ドメイン）抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）、及びマウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）のうちの１つでコーティングした。プレートをケミブロッカー（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）でブロックした後、プレートを洗浄し、ファージを２×１０１１ｃｆｕ／ｍＬの濃度（１０％ケミブロッカー／ＴＢＳＴ中に希釈）で添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ共役したマウス抗Ｍ１３抗体をプレートに添加した。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し、化学発光基質をウェルに添加し、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて読み取った。図７Ａ〜Ｄは、それぞれＣＨ１（図７Ａ）、カッパ（図７Ｂ）、ＣＨ２（図７Ｃ）、及びＣＨ３（図７Ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡからの結果を示す。ＥＬＩＳＡで使用した対照は、ｖＤＲ１０中のクローン６−２のＦａｂ−ｐＩＸ融合物（ヒトコドン最適化、ＴＧ−１細胞中で作製、ＩＰＴＧ誘導を伴う）、非特異的な足場タンパク質−ｐＩＸ融合物、又はＣＮＴＯ５３０−ｐＩＸ融合物を提示するファージであった。ＣＨ１及びカッパＥＬＩＳＡにおいて、６−２ Ｆａｂは、陽性対照としての機能を果たす一方で、ＥＭＰ−１構築物（ＣＮＴＯ５３０）分子は、陰性対照としての機能を果たす。ＣＨ２及びＣＨ３ ＥＬＩＳＡにおいて、６−２ Ｆａｂは、陰性対照としての機能を果たし、ＣＮＴＯ５３０分子は、陽性対照としての機能を果たす。足場タンパク質ファージは、それがいかなる抗体ドメインも担持しないため、すべてのＥＬＩＳＡにおいて陰性対照としての機能を果たす。ファージの異なる捕捉抗体への結合を防止するために、可溶性競合物質として、５μｇ／ｍＬの濃度での抗ＩＬ１３完全ＩｇＧ１抗体の添加によるＥＬＩＳＡアッセイもまた行った。
【００７０】
図７Ａ〜Ｄに示されるように、サンドイッチＥＬＩＳＡのすべてにおいてファージを検出し、ファージが実際には、表面上で異なる抗体ドメインを提示しているという証拠を提供した。ＸＬ−１ブルー細胞中で産生されたファージは、最も高いシグナルを有し、ＩＰＴＧの添加は、結合シグナルに対する明白な効果を有した。ファージの結合は、特異的な相互作用を示す、可溶性抗ＩＬ１３抗体の添加によって阻害され得る。しかしながら、可溶性抗ＩＬ１３抗体は、ファージとＣＨ３ドメインとの間の相互作用に完全に勝る（ｃｏｍｐｅｔｅ ｏｆｆ）ことはできなかった（図７Ｄ）。これは、完全ＩｇＧ−ｐＩＸ融合物の両方について、並びにＥＭＰ−１−Ｆｃ−ｐＩＸ融合物（ＣＮＴＯ５３０）について観察された。
【００７１】
Ｆ．ＩＬ１３への完全ＩｇＧ ｐＩＸファージ結合
ＩｇＧ分子のすべてのドメインを、ＥＬＩＳＡによってファージ粒子上で検出できることを実証した後、構築物が、それらのそれぞれの抗原に結合する能力も保持するかどうかを決定することが必要であった。ＩＬ１３結合ＥＬＩＳＡを、黒色マキシソーププレートを、１μｇ／ｍＬの商業用の抗ＩＬ１３抗体（マウス抗ヒトＩＬ１３、ＭＡＢ２１３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングすることによって設定した。ＭＡＢ２１３は、ＩＬ１３への結合をめぐって６−２又は１６−７と競合せず、故に、サンドイッチＥＬＩＳＡ捕捉抗体として理想的である。洗浄及びブロッキング後、ビオチン化ヒトＩＬ１３Ｒ１３０Ｑヒト（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１００ｎＭで添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｐＩＸ上で６−２及び１６−７の完全ＩｇＧバージョンを提示するファージを２×１０11ｃｆｕ／ｍＬで、単独で又は競合のための可溶性抗ＩＬ１３抗体と一緒に添加した。結合ファージを、ＨＲＰ共役したマウス抗Ｍ１３抗体で検出し、化学発光をＥｎｖｉｓｉｏｎ機器において読み取った。図８は、ＩＬ１３ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。結合は、ほとんどの条件において検出され、このうち１ｍＭ ＩＰＴＧを有するＸＬ−１ブルー細胞中で産生されたファージが最も高いシグナルを示した。ペプチド−Ｆｃ−ｐＩＸ及び代替的な足場分子−ｐＩＸ融合物は、予測通り陰性であり、６−２ Ｆａｂ ｐＩＸ対照は、陽性であった。結合は、可溶性抗ＩＬ１３抗体を添加することによって阻害され、相互作用が特異的であることを示した。ＩＬ１３結合を更に検査するために、ＥＬＩＳＡを設定し、そこで可溶性競合抗体を５０μｇ／ｍＬ〜０．０１μｇ／ｍＬまで連続的に希釈した。対照抗体もまた含めた。図９Ａ及びＢは、それぞれ６〜２ ＩｇＧ ｐＩＸ及び６〜２Ｆａｂ ｐＩＸのＩＬ１３結合に及ぼす可溶性抗体競合の効果を示す。結合の阻害は、およそ０．１μｇ／ｍＬのＩＣ５０により、両方の構築物について見られた。しかしながら、完全ＩｇＧ ｐＩＸ構築物については、阻害は、非常に高い競合物質濃度においてさえ不完全であり、あるレベルの非特異的な相互作用が存在することを示唆する。
【００７２】
Ｇ．ＩＬ１３及びＩＬ１７への完全ＩｇＧ ｐＩＸファージ結合
第２の確証的な実験を行った。これは、抗ＩＬ１７Ａ抗体の完全ＩｇＧバージョンをクローニングすることによって行った。構築物をＸＬ−１ブルー細胞に形質転換し、ファージを、上述のように産生した。ＥＬＩＳＡを行って、図６に示されるように、ｐＩＸ上でのＩＬ１７ ＩｇＧの提示、並びにヒトＩＬ１７Ａｍｕｔ６抗原へのその結合を確認した。各ＥＬＩＳＡ（ＦＤ捕捉、カッパ捕捉、ＣＨ２捕捉、ＣＨ３捕捉、ＩＬ１３捕捉、及びＩＬ１７捕捉）について、ファージを単独で又は可溶性抗ＩＬ１３ ｍＡｂ若しくはＡ可溶性抗ＩＬ１７Ａ ｍＡｂと一緒にのいずれかで添加した。競合物質ｍＡｂの添加は、ＥＬＩＳＡの特異性を示す。図１０において明白なように、ＩＬ１７ ＩｇＧは、ＩＬ１３ ＩｇＧよりも低いレベルではあるが、ｐＩＸ上に提示された。これは、これらの構築物の間のＦａｂ発現レベルにおける差異と一致する（データは示されず）。ファージ上の抗ＩＬ１３ ＩｇＧは、ＩＬ１７に結合せず、ファージ上の抗ＩＬ１７ ＩｇＧは、ＩＬ１３に結合しないことから、抗原結合の特異性を見ることができる。加えて、ファージの２つのタイプの各々の結合は、それらの可溶性ｍＡｂ対応物によって阻害され得る。
【００７３】
実施例４：ｐＶＩＩと融合したＦｃ含有タンパク質の提示
追加的に、ｐＶＩＩファージミド系を用いて、Ｆｃ及びＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）タンパク質がファージ表面上に提示され得ることを実証した。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１１月１７日に出願された米国出願第６１／２６１，７６７号に対する優先権を請求し、この出願は、参照により全体的に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、二量体抗体断片、全抗体、又は他のジスルフィド結合多量体構築物を産生するために、ｐＩＸファージディスプレイライブラリを生成し、用いるための、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
繊維状ファージディスプレイは、各ファージ粒子が、選択プロセスにおいて一緒にそのコートタンパク質のＮ末端と融合したポリペプチドをコードする核酸を結合させるときの、タンパク質の親和性に基づく選択のために広範に使用される技術である。Ｍ１３バクテリオファージは、５つのコートタンパク質をコードし、このうちマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩ及びｐＶＩのおよそ５つのコピーは、ファージの一方の末端部にあり、同じ数のｐＶＩＩ及びｐＩＸが、ファージの他方の末端部にある。ファージＤＮＡは、メジャーコートタンパク質、ｐＶＩＩＩのおよそ３０００個のコピーによって封入される。異物ポリペプチドの提示はＭ１３の各コートタンパク質によって達成されてきたが、このうち最も一般的な融合パートナーはｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩである。この技術を用いて、ペプチド、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、及び他のタンパク質バインダーのライブラリが構築されており、多様な用途において使用が見出され、かつ高い商業的価値を有する。
【０００４】
ｐＩＩＩコートタンパク質は、そのサイズ、立体配座、少ないコピー数に起因して、ｐＶＩＩＩタンパク質よりも好まれている。ｐＩＩＩマイナーコートタンパク質は、柔軟な可動性ヒンジセグメントによって接続される３つのドメインを含む、大腸菌中へのファージ感染に関与する４０４アミノ酸、４２ｋＤタンパク質である。ｐＩＩＩ Ｎ末端への融合は、ファージ表面から離れて提示されるタンパク質を繋ぎ止め、小さく、高いコピー数のｐＶＩＩＩコートタンパク質への融合よりも、リガンド結合に対して潜在的により高いアクセスを提供する。ｐＩＩＩタンパク質は、感染の最初の工程に必須であり、ほとんどの小さいペプチド及びタンパク質の融合は、このプロセスを干渉し得る。この問題は、例えば、野生型ｐＩＩＩタンパク質の第２のコピー又はヘルパーファージを用いるファージミド系を含有する、ウイルスベクターの使用によって回避される。ｐＩＩＩとは対照的に、かつｐＶＩＩＩと同様に、ｐＶＩＩ及びｐＩＸは、それぞれ、ファージ表面上で密接に詰められた３３及び３２ａａの短いヘリックスタンパク質である。それにもかかわらず、ｓｃＦｖ（Ｇａｏ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９，１２６１２〜１２６１６，２００２）及びＦａｂ（Ｓｈｉ，Ｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７，３８５〜３９６，２０１０、Ｔｏｒｎｅｔｔａ，Ｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ３６０，３９〜４６，２０１０）ライブラリは、ｐＩＸ上で提示及び選択されている。Ｆｖ及びペプチドのヘテロ二量体ディスプレイは、異なるポリペプチドをｐＶＩＩ及び密接に隣接したｐＩＸの両方に融合することによって記載されている（Ｇａｏら、１９９９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９６：６０２５〜６０３０及びＪａｎｄａ米国特許第７０７８１６６号）。加えて、単一特異的なｓｃＦｖのｐＶＩＩディスプレイが報告されている（Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉら、２００５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０７：１３５）。ファージ又はファージミドベクターによってコードされる細胞外タンパク質がコートタンパク質に融合されず、むしろ再操作されたコートタンパク質ｐＩＩＩ及びｐＩＸにジスルフィド結合を通じて共有結合する、代替的なアプローチもまた記載されている（米国特許第６７５３１３６号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ファージ粒子の表面上で二量体タンパク質並びにヘテロ二量体タンパク質を提示する能力は、組み合わせライブラリフォーマットにおけるより複合のタンパク質構造を模倣する際に有利である。分子間ジスルフィド結合を介して接続される重鎖及び軽鎖対（ヘテロ二量体）のホモ二量体である、ヒトＩｇＧのタンパク質のような、複合タンパク質の変異型をスクリーニングする高処理方法を生成するために、当該技術を前進させる要求が引き続き存在する。現在まで、繊維状ファージ上の完全な抗体重鎖の正確なアセンブリ及び提示を実証することは可能でなかった。本発明のライブラリ及び方法は、総合設計、アセンブリ技術、及びファージｐＩＸ Ｆａｂライブラリを組み合わせることにより、これらの要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｍ１３コートタンパク質、ｐＩＸを用いた、繊維状ファージ上での二量体ジスルフィド結合タンパク質及びより複合の構造の提示のための簡易な手段を提供する。本発明において、提示されるタンパク質は、ｐＩＸコートタンパク質を含む融合タンパク質であり、ＣＨ２ドメインのような、折り畳まれたドメインは、ヒンジドメインのような、システイン残基を含む多量体化ドメインに結合される。具体的な実施形態では、二量体タンパク質は、ホモ二量体であり、ここでメンバーは、ジスルフィド結合され、タンパク質は抗体Ｆｃを含む。別の実施形態では、ホモ二量体ジスルフィド結合タンパク質は、ヒト抗体タンパク質を含み、ここで少なくともヒンジドメイン及び定常ドメインは、ホモ二量体を含むポリペプチドの各々において存在し、かつ任意に、ホモ二量体構造は更に、ジスルフィド結合形成によって独立して発現される抗体軽鎖と会合する。
【０００７】
本発明は、ｐＩＸコートタンパク質をコードする配列と融合した外因性ポリペプチドをコードする配列を有する、少なくとも１つの融合タンパク質をコード化する複製可能なベクターを提供し、ここで外因性非ファージタンパク質部分は、ホモ二量体形成ポリペプチド鎖である。一実施形態では、融合したホモ二量体形成ポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質を形成する。別の実施形態では、ホモ二量体構造は更に、ヘテロポリペプチドと会合して、より複合の構造を形成し得る。一態様では、単一のファージ分子における抗体重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の提示は、完全なＩｇＧ分子等であるが、これらに限定されない、ファージ粒子の表面における機能的抗体分子のアセンブリをもたらす。二量体ジスルフィド結合タンパク質として、ファージの表面上で融合ポリペプチドを提示することができる複製可能なベクター及びファージ粒子を含有する宿主細胞が、本発明に含まれる。ベクターは任意に、提示されたポリペプチド−コートタンパク質融合をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に融合した、分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
抗体組成物の選択及び改善のためのアセンブリ、スクリーニング、並びに当該技術分野において実施されるような他の尋問技術に有用な、二量体ジスルフィド結合タンパク質のｐＩＸファージディスプレイのデノボライブラリを構築するための方法及びベクターもまた提供される。一実施形態では、ファージ粒子表面上で多量体構造を形成することができる複数個の異なる融合ポリペプチドを提示するファージ粒子を含有する宿主細胞のライブラリは、ｐＩＸタンパク質に結合される。一態様では、ライブラリは、ファージミド系においてコードされる。
【０００９】
一実施形態では、本発明のライブラリは、重鎖可変領域のライブラリを含み得、それは更に、軽鎖可変領域のライブラリを含み得、それは更に、変異型Ｆｃ領域のライブラリを含み得る。本発明のライブラリは、標的リガンドへの変化した結合、又はエフェクター分子（例えば、ＦｃγＲｓ及び／又はＣ１ｑ）に対する変化した結合を有するような、所望の、増強された、又は軽減された特性を有するタンパク質をコードするライブラリから、ポリヌクレオチドを特定及び単離するために、パンニング、分類、又は他の選択手順に供されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐＩＸで繋ぎ止められたＦａｂを発現するために使用される出発ベクターのダイアグラム。
【図２】Ａ〜Ｂは、ｌａｃＺプロモータ；細菌シグナルペプチド、ｐｅｌＢの上流に付加されたリボソーム結合部位（ＲＩＢＳ）；Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及びファージマイナーコートタンパク質ｐＩＸ又はｐＶＩＩを接続する、可動性リンカー（Ｇ4Ｓ）の位置；並びにｐＩＸ上の完全ＩｇＧ構造の発現のためのジシストロニックなファージミドベクター（Ｂ）の相対的な位置を示す、Ｆｃ形成構築物（Ａ）のためのｐＩＸファージミドベクターの概略図。
【図３】Ａ〜Ｂは、実施例１に記載されるように構築された組み換えファージ粒子に対する、ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであり、組み換えファージ粒子が、抗Ｆｃ Ｍａｂ（Ａ）で又はＣＮＴＯ ３４４３、抗ＥＭＰ１ ｍＡｂ（Ｂ）でコーティングされたプレート上に捕捉され、捕捉されたファージが、ＨＲＰ共役した抗ｐＶＩＩＩ ｍＡｂを用いて検出された、Ｆｃ融合タンパク質（Ａ）又はＥＭＰ−１−Ｆｃ（Ｂ）の増加を実証している。ヘルパーファージは、ＢにおけるＦｃファージと同様に陰性対照であった。この実施例において、ファージの２つの個々の調製物が使用された。
【図４】ファージ上に提示されたＦｃドメインが、プロテインＡに結合できることを示す結合アッセイからのグラフ。
【図５】Ａ〜Ｂは、最適な結合酸性度、ｐＨ ６．０（上部）で、及び非特異的な結合条件下、ｐＨ ７．５（下部）で行われた、ＦｃＲｎ結合アッセイからのグラフ。
【図６】検出のために抗ヒトＦｃ抗体を用いたウェスタンブロットを示し、非還元条件、レーン１、ＮＲ；及び還元条件、レーン２、Ｒの下で、単離及び電気泳動されたタンパク質の二量体的性質を実証し、非還元下でメジャーバンドが、還元条件下でのメジャーバンドのおよそ２倍の分子量であることを示している。
【図７】Ａ〜Ｄは、ファージ上で発現された抗体ドメイン、発現されたＥＭＰ−１−Ｆｃ構築物、又はファージ自体のいずれかに特異的な種々のリガンドを用いて指定の調製物から捕捉され、ｌＡｃ誘導物質ＩＰＴＧである（Ａ）抗ＦＤ（ＣＨ１）抗体捕捉；（Ｂ）抗カッパ抗体；（Ｃ）抗ＣＨ２抗体；及び（Ｄ）抗ＣＨ３抗体を用いて又は用いずに培養された、ファージについての、ＥＬＩＳＡフォーマットで産生されたシグナルを示す棒グラフである。ｐＩＸ上で６−２ Ｆａｂ又は非免疫グロブリンタンパク質を提示するファージが陰性対照として含まれる。
【図８】抗ＩＬ１３ ＩｇＧ ｐＩＸと同じ特異性で競合する可溶性抗ＩＬ１３ ｍＡｂ（格子縞棒）の存在又は不在下で、商業用の抗ＩＬ１３抗体を用いて指定の調製物から捕捉されたファージについての、ＥＬＩＳＡフォーマットで産生されたシグナルを示す棒グラフである。ＥＭＰ−１−Ｆｃ構築物は、陰性対照であり、ＩＬ１３に結合せず、ＩＬ１３特異的６−２ Ｆａｂは、ｐＩＸ融合物が陽性対照として含まれるため、ファージ上でｐＩＸを提示した。
【図９】Ａ〜Ｂは、商業用の抗ＩＬ１３抗体によってプレート中に捕捉され、続いてファージ上で漸増量の競合する抗ＩＬ１３抗体（６−２完全ＩｇＧ）、又はＩＬ１３（抗ＥＭＭＰＲＩＮ）（Ａ）に特異的でない対照抗体を付加され、またＩＬ１３によって、商業用の抗ＩＬ１３抗体によってプレート中に捕捉され、続いてファージ上の６−２ Ｆａｂを付加されたファージについての、ＥＬＩＳＡフォーマットで産生されたシグナルを示す棒グラフである。漸増量の抗ＩＬ１３ ｍＡｂ又は抗ＥＭＭＰＲＩＮ ｍＡｂのいずれかが付加された（Ｂ）。
【図１０】ビオチン化ＩＬ１３又はＩＬ１７Ａ抗原を使用してＩＬ１３又はＩＬ１７Ａの完全ＩｇＧ構築物を提示するファージを捕捉した後に、ドメイン特異的な抗体抗Ｆｄ、抗カッパ、抗ＣＨ２、及び抗ＣＨ３のいずれかによって、及び競合する可溶性抗ＩＬ１３ ｍＡｂ又は抗ＩＬ１７Ａ ｍＡｂの存在又は不在下で捕捉されたファージからのシグナルを示す。ファージは、抗Ｍ１３抗体（ｙ軸）で検出された。
【００１１】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００１２】
略語
ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性、ＡＤＭＣ＝抗体依存性単核細胞媒介型細胞傷害性、ｃ１ｑ＝補体因子１ｑ、ＥＰＯ＝組み換えエリスロポエチン、ＦｃＲ＝Ｆｃ受容体、Ｉｇ＝免疫グロブリン、Ｈｃ＝重鎖、Ｌｃ＝軽鎖、ＩＰＴＧ＝イソプロピルチオ−β−ガラクトシド。
【００１３】
定義
本明細書で使用されるとき、別段の指示がない限り又は文脈から明白でない限り、抗体ドメイン、領域、及び断片は、当該技術分野において周知であるような標準的な定義に従う。本発明のタンパク質は、１つ以上の免疫グロブリンクラスの抗体に由来するか、又はその部分を組み込む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ、またＩｇＧ及びＩｇＡの場合は、それらのサブタイプ、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4。
【００１４】
が含まれる。「シストロン」とは、アミノ酸配列をコード化し、上流及び下流ＤＮＡ発現制御要素を含む、ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドの配列を意味する。
【００１５】
「外因性ポリペプチド」又は「外因性タンパク質」又は「細胞外タンパク質」とは、通常は野生型繊維状ファージゲノムによってコードされず、むしろ通常のファージタンパク質にとって異質であるタンパク質を意味する。典型的な外因性ポリペプチドは、それらがとりわけ、ＣＨ３、ＣＨ２、ヒンジ領域、及び／若しくはＣＨ１ドメイン又はそれらの断片を含み得るＦｃドメインとして、天然に発生するように、抗体免疫グロブリン重鎖（Ｈｃ）ドメイン若しくは免疫グロブリン軽鎖（Ｌｃ）ドメイン、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶH）、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶL）、天然若しくは合成ポリペプチド、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は免疫グロブリンドメインの配列若しくは組み合わせを含む、目的とする任意のポリペプチドである。
【００１６】
「Ｆｃ」により、消化されたＩｇＧの結晶化可能な開裂断片に与えられる標識であり、抗体定常ドメインに由来し、かつジスルフィド結合の鎖間結合を有するポリペプチド鎖の二量体構造を含む、抗体の機能的断片を意味する。ヒトＩｇＧ１において、パパインは、Ｃｙｓ２２６に対する断片Ｃ末端を作り出す（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にあるようなＥＵインデックスを用いて付番される）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基付番を指す。ＦｃのＮ末端残基の定義は、異なり得るが、第１の鎖間結合システイン（Ｋａｂａｔ系におけるＣ２２６）に対してＮ末端の第３残基である、Ｋａｂａｔ付番系における少なくとも残基２２３を含むことが概して理解される。分子のＦｃ部分は、抗体のその特異的な標的抗原との接触に直接に関与しないが、エフェクター機能を媒介する。これらの機能は、次の２つの種類からなる：（１）Ｃ１ｑ結合及び／又はＩｇＧに対するＦｃ受容体γ−タイプ結合、ＩｇＥに対するＦｃ受容体ε結合、及びＩｇＡに対するＦｃ受容体α結合に続く、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性若しくはＡＤＣＣ及びＡＤＭＣのような、抗体の抗原への結合を要求する機能、並びに（２）ＦｃＲｎに結合し、細胞及び組織障壁（腸のような）を越えて経細胞輸送される能力による循環における持続性のような、抗原結合から独立した機能。特に、Ｆｃの融合を介して、抗体分子又は他の分子の血清半減期を有意に増加させる能力は、非常に有利である。より長命の分子は、臨床治療に必要とされる量を低減させ、それによって投与の頻度を低減させ得る。
【００１７】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。ＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスが含まれ、これにはこれらの受容体の対立遺伝子変異型、あるいはスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、それは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＦＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５：２０３〜２３４における概説を参照されたく、ＦｃＲｓは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，９：４５７〜９２、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，１９９４，４：２５〜３４、及びｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９９５，１２６：３３０〜４１において概説され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１８】
「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」とは、操作可能に結合される、それぞれ第１及び第２の核酸配列によってコードされる第１及び第２のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド（タンパク質）を意味する。本明細書で使用されるとき、融合タンパク質は、「操作可能に結合」される構成成分及びドメインを含有し、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの融合した要素が、各々が意図されるように働く又は機能するように結合されることを意味することが理解される。例えば、プロモータ、オペレータ、又はエンハンサのような、発現を調節する要素は、その発現が調節されるべきヌクレオチド配列に操作可能に結合され得る。要素間の及び要素の間の結合は、直接的であっても、又はリンカーを介するような間接的であってもよい。これらの要素は、必ずしも隣接していない。
【００１９】
用語「ライブラリ」は、変異型である、すなわち、ある種の領域が同じであるか又は類似しており、他の領域が異なる、コードされたタンパク質の集積を意味する。変異領域は、指向性又は無作為の変異（確率的又は非確率的変化）によるものであってもよい。ライブラリ又は変異型は、異なる変異型の数又はライブラリの「サイズ」の観点から説明することができる。有用なデノボ抗体ライブラリは、高い多様性（＞１０10）を有し、変化に応じやすく、組立が容易であり、所望でない配列のバックグラウンドが低い。次の方法を組み合わせることにより、ライブラリアセンブリが加速され、低バックグラウンドをもたらされる：（ａ）Ｋｕｎｋｅｌ系単鎖突然変異誘発、（ｂ）制限部位を有するパリンドロームループ、及び（ｃ）メガプライマーアプローチの使用。
【００２０】
「ファージミド」又は「ファージベクター」は、プラスミドに由来するもののような、ファージ染色体及び外因性ＤＮＡの両方に由来する構成成分を含有するクローニング及び発現ベクターである。ファージミドは、ファージゲノムの部分を含有するため、宿主のヘルパーファージとの共感染時に、それはファージ粒子中にパッケージ化され得る。本発明のファージミドは、ファージＭ１３粒子中にパッケージ化され得る。ファージミド又はファージベクターは、本明細書における融合タンパク質をコードする核酸又は本明細書で提供される発現カセットのような、非相同のＤＮＡの挿入又は組み込みによって操られている。そのような発現ベクターは、典型的には、宿主細胞中の挿入された核酸の効率的な転写のためのプロモータ配列を含有する。
【００２１】
概論
二価抗原結合タンパク質である天然抗体は、重鎖の適切な会合のために、Ｆｃ定常ドメイン及びヒンジ領域に依存する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、好ましくは、国際公開第２００５００５６０４号に記載されるもののような、又は天然又は操作された抗体配列の配列を含む検索データベースによって見出され得るもののような、ヒト生殖細胞系配列に由来する。広くは、本発明のタンパク質構築物は、１つ以上の定常ドメイン又はその部分に結合されたヒンジ領域を含む。能力受容体に結合し、体内の持続性を増加させる能力のようなすべての関連する機能を保持するために、Ｆｃにおいて通常存在するすべての定常ドメイン：１つ以上のシステイン残基又は他のスルフィド若しくはセレノスルフィド結合形成残基を含有する、配列番号１〜４に示されるヒンジ又はその部分；配列番号５〜８によって例示されるＣＨ2又はその変異型、及び配列番号９〜１２によって例示されるＣＨ3又はその変異型を組み込むことが通常は所望される。本明細書で提供されるものによって表される配列は、非限定的であり、天然及び変異型抗体ドメイン配列は、インターネット上の種々のデータベースにおいて、又は本発明の実践において有用であり得る多数の公報において見出され得ることが当業者によって理解されよう。加えて、構築物は任意に、ＣＨ１ドメインの幾つか若しくは、すべてを含んでもよく、又は配列番号１３のもののように、抗体可変ドメインの幾つか若しくはすべてがまた存在してもよい。当然のことながら、これらのドメインは、完全ＩｇＧ構築物において存在するであろう。抗体ドメインの適切な発現及び折り畳みに対する必要に応じて、配列番号１４（ｐｅｌＢ）及び１５（ｏｍｐＡ）のアミノ酸配列をコードするもののような、他の抗体配列及び非抗体配列が含まれてもよい。しかしながら、本発明は、ある種の定常ドメインのみを含み、その他を含まない構造、並びに非抗体由来のドメインが存在し得る構造を企図する。
【００２２】
種々のＦｃ機能は、Ｆｃの異なる部分に依存するため、完全未満の機能性が所望される場合、より少ないＣHドメインを重鎖に組み込むことができる。例えば、補体の有意な活性化は、ＩｇＧのＣＨ2又はＩｇＭのＣＨ3を要求する。本発明はまた、修飾されたヒンジ及び重鎖が安定な複合で会合し得る限り、置換、欠失、挿入、又は修飾されたアミノ酸を有し得るＦｃ重鎖ドメインの使用を企図する。
【００２３】
加えて、典型的にはジスルフィド結合構造として形成されるであろう二量体共有結合構造もまた、セレノシステイン結合、ホモシステイン結合、又は混合スルフィド−セレニド結合によって形成され得る。鎖間共有結合残基を含む抗体ヒンジに加えて、他の多量体化ドメインを置換して、二量体又はより高秩序の構造を形成してもよい。これらの多量体化ドメインは、ファージ粒子の表面上での細胞外タンパク質−コートタンパク質融合タンパク質のポリペプチドの会合を補助するために、単独のシステイン若しくはセレノシステイン残基のように天然若しくは人工であってもよく、又はロイシンジッパーモチーフのようにモチーフを含んでもよい。
【００２４】
完全抗体タンパク質の場合は、重鎖−軽鎖ヘテロ二量体は、特定の重鎖定常ドメインを介して会合して、より高秩序の構造を形成する。例えば、ＩｇＧ型抗体は、四量体構造における共有結合によって接合される２つの重鎖−軽鎖ヘテロ二量体を含む。ある種の他の抗体型は、例えば、２個の四量体（ＩｇＡ）又は１０個の四量体（ＩｇＭ）を含む、より高秩序の構造中に組み込まれる類似した四量体構造を含む。
【００２５】
ファージコートタンパク質を用いて大型の細胞外タンパク質分子を提示する際に、提示されるタンパク質は、コートタンパク質の全コピーに結合される場合、組み換えファージ粒子のアセンブリを干渉する可能性がある。アセンブリ干渉を回避するために、ｐＩＸディスプレイについて（Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９：１２６１２〜１２６１６，２００２）によって記載されるようなファージミド系を使用してもよく、それによって野生型及び細胞外タンパク質結合コード配列の両方がベクターにおいて存在し、両方のタンパク質が組み換えファージ粒子中に組み込まれる。
【００２６】
本発明の適用は、予想外に、本明細書に記載されるような抗体のＦｃ部分を形成する抗体構成成分が、繊維状ファージ粒子の表面上のｐＩＸ又はｐＶＩＩコートタンパク質に対する融合タンパク質として、Ｆｃ受容体結合のような、天然抗体のＦｃドメインの既知の生物学的活性を提示するホモ二量体ジスルフィド結合タンパク質として、提示され得、また二価抗原結合タンパク質の形態であるとき、抗原結合の能力があることを見出している。故に、ファージ粒子上での抗体結合断片の単量体一価の提示とは対照的に、多価のタンパク質提示の多量体の提示が企図される。故に、本発明は、天然抗体の機能的特徴のより完全なスペクトルの間の操縦及び選択のための体系を提供する。そのような特徴には、細胞表面上で目的とする特定の抗原を提示する、細胞に対して向けられる免疫反応を促進し、製造される抗体様治療薬の生物活性の重要な構成成分である、Ｆｃ機能が含まれる。免疫系エフェクター細胞には、細胞免疫反応を活性化するＴ細胞のような抗原特異的細胞、並びに細胞免疫反応を媒介するマクロファージ、好中球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような非特異的細胞が含まれる。
【００２７】
本発明を作製する方法
繊維状ファージ粒子上に提示された融合タンパク質において、外因性ポリペプチドと繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質との間の「融合」は、アミド結合によって直接に結合されてもよく、又はリンカーポリペプチド（すなわち、「リンカー」）を含んでもよい。典型的に一続きの長さ約５〜５０のアミノ酸である様々なリンカーのいずれを使用してもよい。特に好ましいリンカーは、そのリンカーの位置で融合タンパク質に対して大きな可動度を付与する。リピートの数が典型的には１〜１２であるＧ４Ｓ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リピート又はＧ３Ｓ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を有するもののような、支配的にグリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）残基からなるもののような、二次構造が欠けているリンカーを、この目的のために使用してもよい。
【００２８】
第１のポリペプチドは、外因性タンパク質であり、第２のポリペプチドは、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質であり、それによって外因性タンパク質は、繊維状ファージタンパク質のアミノ末端に融合される。更に、融合タンパク質が未成熟形態であるとき、すなわち、リーダー配列がプロセス（除去）されていないとき、融合タンパク質はまた、本明細書に記載されるような野生型又は突然変異体ｐｅｌＢ又はｏｍｐＡ配列（それぞれ配列番号１４及び１５）等のような、アミノ末端原核分泌シグナルを含有し得る。
【００２９】
天然抗体において、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチド鎖は、別個にコードされ、発現される。分子の典型的なヘテロの二量体構造ＩｇＧクラスは、分子の４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖及び２つの軽鎖の中で及びそれらの間での、ジスルフィド結合の適切なアセンブリ及びその形成に依存している。故に、本発明において、抗体の二量体Ｆｃ部分のアセンブリ及び／又は軽鎖の会合は、存在するとき、タンパク質の個々のドメインが自己会合し、それらの間にジスルフィド結合を形成する限りにおいて、抗体形成の天然プロセスを再現する。
【００３０】
一実施形態では、繊維状ファージ粒子の表面上に提示されるべきＦｃ含有タンパク質は、天然抗体であり、ジシストロニックなベクターは、Ｆｃ構築物−ｐＩＸ融合タンパク質並びに自己会合するであろう、別個にコードされ、発現された抗体Ｌｃ又は抗原結合ドメインの発現のために構築される。本発明の抗原結合タンパク質は、任意のエピトープ、抗原部位、又はタンパク質のための結合部位を有することができる。好ましい抗原結合タンパク質は、受容体への直接結合によって、又はそれらの同族のリガンド（複数可）への結合によって、受容体タンパク質の活性化を中和する。概して、抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインを含む天然抗体Ｈｃ配列と融合した抗体Ｌｃ及び抗体Ｈｃ可変ドメインから形成されるであろう。別の実施形態では、ｐＩＸ融合タンパク質は、Ｆｃドメインに結合されたｓｃＦｖを含む。本発明の別の態様では、ｓｓｃＦｖを含む重鎖及び軽鎖の抗原結合部位は、２つの異なる結合特異性を提供し、それによってファージ表面に提示された自己組立されたジスルフィド結合構築物タンパク質を、二特異的かつ二価の分子にするように異なってもよい。例えば、ＩｇＧ分子のＶL及びＶHドメインの代わりに置換されるのは、異なる特異性のｓｃＦｖドメインであり、これにより結果として生じる分子が２つの異なるエピトープに同時に結合することができるようになる。本発明の方法を用いてファージ粒子上に提示され得る、多数の可変ドメイン対を有する二特異的な抗体分子を作り出す他の方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００２０１０３３４５Ａ１号に教示される。
【００３１】
一実施形態では抗原結合又は受容体結合ドメインは、抗体ドメインに由来しないが、Ｆｃドメインに融合される既知の又は無作為ペプチド配列である。Ｆｃの代替鎖と結合されて、所望によりその間にリンカー部分を有する生物活性ペプチド類は、同一であっても異なってもよい。生物活性ペプチド類は、最終共役物が所望の生物活性を示すのであれば、介在するリンカーと又はペプチド上のいずれかの残基から生じるＦｃと結合していてもよい。生物活性は、例えば、結合活性についてはインビトロアッセイにより、又は動物の疾病モデルでのようにインビボ活性により、あるいは共役物を投与した後の被験者の反応により、測定することができる。
【００３２】
同時係属中の出願、国際公開第０４／００２４１７号、同第０４／００２４２４号、同第０５／０８１６８７号、及び同第０５／０３２４６０号の出願者は、本明細書でＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造と称される構造を説明し、これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に全体的に組み込まれ、これらの構造は、ｐＩＸ又はｐＶＩＩファージコートタンパク質に融合され、ファージ粒子の外表面上に提示され得る、本発明の二量体ジスルフィド結合構造として含まれる。
【００３３】
一実施形態では、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹは、生物活性ペプチドリンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの対を含み、この対は、会合又は共有結合、具体的には、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合によって結合される。生物活性ペプチドは、任意の長さの上に（長さで？）あってもよく、任意の種に由来する天然産の配列であっても、人工配列であってもよい。ペプチドは概して、ファージミドベクターによってコードされ、ファージ粒子上での提示のために構築物のＦｃ部分に融合されるであろう。そのような組成物の一例としては、生物活性ペプチドとしてのＥＰＯ模倣ペプチドが挙げられる。故に、ＥＰＯ模倣のＣＨ１欠失ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹは、治療用ペプチド及びその本来の又は後天性の生体外、生体内、又はその場での特性又は活性を提示しながら、その本来の特性及び機能により抗体構造を模倣する。ペプチドが既知の生物活性を有さないが、マーカー、タグ、抗原としての機能を呈示するか、又はレポーター基、キレート基等を提供する、類似した構造の他の構築物もまた、本発明によって包含される。
【００３４】
典型的な実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質又は「ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）」は、幾つかの又は全体的な免疫グロブリンＣＨ１ドメインが不在である式（Ｉ）：
Ｖ１o−Ｐｅｐa−Ｆｌｅｘn−Ｖ２m−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3 （Ｉ）を含み、
式中、Ｐｅｐは、標的を特異的に認識することができる生物活性ペプチド又はポリペプチドを表し、Ｆｌｅｘは、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹが代替的な配向及び結合特性を有することを可能にすることによって、構造的な可動性を提供する任意の可動性リンカーポリペプチドであり、Ｖ１及びＶ２は、ブラケティング配列であり、ヒンジは、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、例えば配列番号１〜４であり、ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２定常領域の少なくとも一部分、例えば配列番号５〜８であり、ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３定常領域の少なくとも一部分、例えば配列番号９〜１２であり、ｍ、Ｎ、及びｏは、ゼロであり得るか、又は１〜１０の間の整数であり得、かつ１〜１０までの整数であり得る。Ｐｅｐ配列は、任意に、目的又は安定化、又は任意の数の生物物理学的な機能のための配列を含むことができる。典型的な実施形態では、ブラケティング配列は、Ｖｈフレームワークのような抗体可変（Ｖ）ドメインに由来し、Ｖ１は、配列ＱＩＱであり、Ｖ２は、免疫グロブリンＪ遺伝子ドメインに由来する配列を表し、ＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）である。結果として生じるポリペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合等であるが、これらに限定されない、会合又は共有結合によって他のポリペプチドに結合することができる。
【００３５】
ｐＩＸ融合タンパク質の発現のレベルは、転写レベルにおいて追加的に制御することができる。融合タンパク質は、Ｌａｃ Ｚプロモータ／オペレータ系の誘導可能な制御下にある（図１を参照されたい）。他の誘導可能なプロモータも同様に作動することができ、それらは当業者に既知である。高レベルの表面発現については、サプレッサーライブラリが、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のようなＬａｃ Ｚプロモータの誘導物質中で培養される。誘導可能な制御は、非発現条件下でライブラリを培養することによって、非機能的ｐＩＸ融合タンパク質に対する生物学的選択が最小化され得るため、有益である。次いで発現は、ライブラリ内の抗体の全体的な集団がファージ表面上に正確に表されていることを確実にするためのスクリーニングの時にのみ誘導することができる。
【００３６】
二量体化ポリペプチドファージコートタンパク質融合タンパク質をコードするベクターは、細胞外タンパク質及びファージコートタンパク質コード領域の接合部において、翻訳終止コドンを含み得る。対応する翻訳終止サプレッサーを担持する細菌細胞中で発現されるとき、融合タンパク質が産生される。対応する翻訳終止サプレッサーのない細菌細胞中で発現されるとき、遊離細胞外タンパク質は、産生されない。
【００３７】
本発明の使用方法
本明細書に出発点として例示されたファージベクターを用いて、タンパク質は、分子のライブラリを生成するための指向性突然変異誘発を用いて特異的な個別的な残基位置で、又はＮＸＴ配列と一般的に称されるＮ結合グリコシル化配列のような領域で、多様であってもよい。各々が異なる細胞外タンパク質配列を保有する数十億の大腸菌コロニーを生成するために使用され得る、修飾されたＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法が、特に有用である。効率的である一方で、高度に複合の配列ライブラリを生成するとき、突然変異誘発されていない親ＤＮＡの割合は増加する。加えて、長いオリゴヌクレオチドの合成の技術的制限は、遠位領域において配列多様性を含有するライブラリを作製するために使用されるとき、本方法の有効性を低下させる。これらの制限を克服するために、３５０塩基を超えるオリゴヌクレオチドを生成する追加的な技術を使用することができる。これらの技術には、米国特許第２００５００４８６１７号に記載されるような、標準的なＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７〜３８２）と組み合わせた、メガプライマーの使用及び突然変異誘発テンプレートにおいて制限酵素認識部位を含有するステム−ループ配列の作製が含まれる。制限クローニング（Ｍａｒｋｓら、１９９１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４ ＥＭＢＯ Ｊ．１３，３２４５〜３２６０、Ｈｏｅｔら、２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３４４〜３４８）、ファージ組み換え（Ｇｉｇａｐａｃｋ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び配列特異的組み換えのような他のライブラリ技術と比較して、改善されたＫｕｎｋｅｌに基づく方法は、配列多様なライブラリ（１０9を超える）を生成する際に、有意により有効であり、標的化されたＤＮＡ中の任意の場所に配列多様性を導入するのにより万能である。
【００３８】
Ｆｃ含有タンパク質の繊維状ファージ上での提示は、所望の結合特徴のために、そのような分子の大集団をスクリーニングすることが所望される場合に特に有用である。一実施形態では、Ｆｃ構築物−ｐＩＸタンパク質融合を発現する細菌細胞は、Ｆｃ構築物−ｐＩＸ融合遺伝子を担持するベクターＤＮＡの、ファージ粒子中への優先的なパッケージングを可能にするＭ１３変異型に感染させられる。各々結果として生じるファージ粒子は、特定のＦｃ構築物−ｐＩＸ融合タンパク質を提示し、Ｆｃ構築物−ｐＩＸ融合物をコードするベクターを含有する。そのようなファージ粒子の集団は、パンニング手順によって、所望の結合特徴のために強化することができる。典型的には、所望の粒子は、所望のファージ粒子がそこに結合し得る抗原によりコーティングされた固体表面上に固定化される。結合粒子は、収集され、細菌細胞を更に感染させるために使用される。パンニング手順は、所望の結合特徴のために更に強化するために反復される。
【００３９】
一実施形態では、ファージライブラリは、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃＲｇａｍｍａＩ（ＣＤ６４）のような、天然又は組み換えＦｃ受容体への増強された、減少された、又は変化した結合のために、分子のＦｃ部分の変異型をスクリーニングするために使用される。
【００４０】
ファージ及び他の抗体ディスプレイ方法は、生体外の抗原又は受容体標的に対する選択を操る機会を利用可能にする。生体外選択法の１つの特定の利点は、標的タンパク質上の多様な部位への抗体結合を得るように選択手順を操る能力である。あるいは、全細胞を使用して、バインダーを選択してもよい。
【００４１】
ファージライブラリは、機能的属性に関連する遺伝物質の検索を単純化するが、ライブラリから最良の候補を単離するために多重ステップのパンニング戦略が要求される。ドメイン又はエピトープ指向性パンニングは、標的タンパク質に結合する抗体を選択する日常的な方法となっている。そのような選択は、選択的パンニング、脱選択的（de-selective）パンニング、リガンド捕捉、サブトラクティブパンニング又は道しるべ（pathfinder）選択として多様に知られる方法を利用する抗体のステップによる選択を用いることによって、主に達成されてきた。
【００４２】
サブトラクティブパンニングにおいては、重複するが、完全に同一でない結合部位を有する標的（複数可）を使用して、不必要なバインダーを脱選択することができる。この戦略は、癌細胞に対するバインダーを脱選択するために通常の細胞を使用する際と同様に、未知の抗原さえにも対応するバインダーを特定するために使用されている。あるいは、関連する抗原の間で異なる又は共通の部位への抗体結合を得るために、幾つかの共通のドメイン又は構造を有する天然産のタンパク質が、連続的な又は競合選択において使用される。場合によっては、関連するケモカイン又はタンパク質の突然変異バージョンのような天然産のタンパク質が、サブトラクティブパンニングにおいて使用され得る。
【００４３】
リガンド捕捉指向性パンニングは、無関係の及び隣接していないエピトープに固定化された抗体が、ファージパンニングのために好ましい標的リガンドの結合面を捕捉し、呈示するために使用されるという点で、ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイに類似している（米国特許第６３７６１７０号）。その他のものは、所望の標的ドメイン以外における抗原を選択的にマスクするために競合抗体を使用している（Ｔｓｕｉ，Ｐ．ら、２００２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２６３：１２３〜１３２）。道しるべ技術は、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに西洋ワサビビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接に又は関節に共役させられた天然リガンドを使用する。ビオチンチラミンの存在下で、これらの分子は、標的抗原に極めて接近したファージ結合のビオチン化を触媒し、ストレプトアビジンを用いて全集団からの「タグされた」ファージの特異的な回収を可能にする。このようにして、標的自体に又はそのすぐ近くに結合するファージは、選択的に回収される（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｊ．Ｋ．ら、１９９８．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２９３〜３０２）。これらの方法、方法の変形、及び当業者に既知の他の方法を用いて、本発明のｐＩＸ細胞外タンパク質のライブラリを問い合わせることができる。
【００４４】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００４５】
実施例１．ｐＩＸ上でのＦｃ融合タンパク質の提示
Ａ．ファージミドベクター構築
ファージミドベクター、ｐＣＧＭＴ９（Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：６０２５〜６０３０，１９９９，米国特許第６４７２１４７号）は、ｐＩＸ融合を介したファージディスプレイのために重鎖定常ドメインを挿入することができるファージミドｐＩＸディスプレイベクターの発達のための主鎖としての機能を果たした。このファージミドにおいて、アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子と共に、大腸菌（ｃｏｌＥ１）及び繊維状ファージ（ｆ１）のための複製の源が存在する。
【００４６】
ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）分子を含む、Ｆｃ含有タンパク質を提示するためのｐＩＸファージミドベクターを、国際公開第２００９／０８５４６２号及び図１に開示させるように、２シストロン性の発現、ｐＣＮＴＯ−Ｆａｂ−ｐＩＸのために適合させられたＧａｏベクターに基づいて構築した。それにより可溶性軽鎖が同じ細胞中で発現され、繋ぎ止められたポリペプチドと会合する、Ｆａｂファージディスプレイのために使用された戦略とは異なり、可溶性Ｆｃは、全く発現されなかった（図２Ａ）。
【００４７】
ベクターにおけるＦａｂ軽鎖配列は欠失された。ベクターにおけるＦａｂ重鎖配列を、Ｆｃ又は構築物又はＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構築物のいずれかと置き換えた。コアヒンジを含有するシステイン対を含有するファージミドベクターＦｃ構築を次のように達成した。ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３をコードするＦｃ遺伝子セグメントを、ＰＣＲによってＦｃ含有プラスミドから増幅した。ＮｃｏＩ制限部位を、５’プライマー末端部中に、及びＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を３’プライマー末端部において組み入れた。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片及びファージミドベクター（ｐＣＮＴＯ−Ｆｃ−ｐＩＸコアＨｇ）を、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。消化産物を生成し、迅速ライゲーションキットを用いてライゲートし、ＤＨ１０Ｂ大腸菌に形質転換させた。形質転換したクローンを、ＤＮＡ塩基配列決定法を用いてスクリーニングし、正確な配列を示したものを次いで、ファージ調製のために、ＴＧ−１大腸菌に形質転換した。
【００４８】
制限酵素クローニングを介して、Ｆｃをコードする配列を、完全なＣＮＴＯ５３０融合タンパク質をコードする配列と置き換えることによって、米国特許第７３９３６６２号及びその中の配列番号８８に記載され、「ＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）」又はＣＮＴＯ５３０と称される、ＥＭＰ−１（配列番号１６）Ｆｃ（配列番号１７）構築物をコードするｐＩＸファージミドベクター（ｐ２４６７）を構築した。ＣＮＴＯ５３０コード配列を、ＰＣＲによってプラスミドｐ２４６７から増幅した。制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩを、それぞれ５’末端及び３’末端プライマーに含めた。ＰＣＲ産物及びファージミドベクター、ｐＣＮＴＯ−Ｆｃ−ｐＩＸコアＨｇをＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで消化し、精製し、迅速ライゲーションキットを用いてライゲートし、ＤＨ１０Ｂ大腸菌に形質転換した。形質転換クローンを、ＤＮＡ塩基配列決定法によってスクリーニングし、正確な配列を有するものをファージディスプレイのためにＴＧ−１大腸菌に形質転換した。
【００４９】
Ｂ．組み換えファージの調製及び特徴付け
ファージミドベクターでトランスフェクトしたＴＧ−１大腸菌を、液体培養でＯＤ600＝０．５〜０．６になるまで増殖させた。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージストックを培養物に添加し、感染は、静的インキュベーションとして、３７℃で４５分間進行させた。培養物を遠心分離にかけて、細菌をペレット化し、カルベニシリン、カナマイシン、及びＩＰＴＧを補充した培地中に再懸濁させ、２５０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で１２〜１６時間インキュベートした。一晩の培養物を遠心分離にかけ、ファージ含有上清を未使用の管に移し、そこに１０分の１の容量の塩化ナトリウム／ＰＥＧ溶液（ＮａＣｌ及びＰＥＧの濃度は？又は単に標準的な方法を用いて沈殿させたＰＥＧと述べる（Ｒｅｆ））を添加した。各管を混合し、時折混合しながら氷上でおよそ３時間インキュベートし、その後、この管を遠心分離にかけてファージをペレット化した。ファージペレットを、ＰＢＳ中に注意深く再懸濁させ、新たな管に移し、２回目の遠心分離にかけてあらゆる残存する細胞残屑を除去した。精製しファージを、−８０℃のアリコート中で保管した。スポット滴定を行って、ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）としてファージ力価を推定した。
【００５０】
Ｃ．提示されたタンパク質の特徴付け
Ｆｃ及びペプチド−Ｆｃ構築物の提示の確認
この実施例において、ファージの２つの個々の調製物が使用された。Ｆｃ支持又はＣＮＴＯ５３０支持ファージを検出するために、黒色ＥＬＩＳＡプレートを、抗ヒトＦｃγ特異的ポリクローナル抗体又は抗ＥＭＰ１ペプチドモノクローナル抗体（ＣＮＴＯ ３４４３）のいずれかでコーティングした。コーティングしたプレートを、ＴＢＳＴ中の５％ミルクでブロックし、ＴＢＳＴで洗浄した。ヘルパーファージ、Ｆｃ−又はＣＮＴＯ５３０組み換えファージをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートし、洗浄して非結合ファージを除去した。結合ファージを、ＨＲＰ共役した抗Ｍ１３ ｍＡｂ及び化学発光基質で検出した。捕捉されたファージを、ＨＲＰ共役した抗ｐＶＩＩＩ ｍＡｂを用いて検出した。ヘルパーファージ、及びＣＮＴＯ５３０支持ファージの場合は、ＥＭＰ１ペプチドを有さないＦｃ組み換えファージを、陰性対照として使用した。
【００５１】
プロテインＡ結合。精製した組み換えプロテイン−Ａを、黒色ウェルのＥＬＩＳＡプレート上に一晩、４℃でコーティングした。コーティングしたプレートを、ＴＢＳＴ中の５％ミルクでブロックし、ＴＢＳＴで洗浄した。ヘルパーファージ又はＦｃ提示ファージの適切な希釈物をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄して非結合ファージを除去した。コーティングしたプロテイン−Ａ上のあらゆる残存する非占有のＦｃ結合部位をブロックするために、ヒト抗体由来のＦｃを飽和濃度でプレートに添加した。３０分のインキュベーション後、結合ファージをＨＲＰ共役した抗Ｍ１３ ｍＡｂ及び化学発光基質で検出した。
【００５２】
ＦｃＲｎ結合。ＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）は、抗体再取り込み、区画転座、及び再循環を可能にし、故に、抗体の循環半減期を持続させる。ＦｃＲｎに結合するＦｃは、ｐＨ依存性であり、ＥＬＩＳＡ結合アッセイをそれに応じて行った。ＦｃＲｎ結合ファージを、ニュートラアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート上に捕捉し、ＨＲＰ共役した抗ｐＶＩＩＩ ｍＡｂで検出した。簡潔に述べると、黒色ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ニュートラアビジンでコーティングし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）及びケミブロッカーの５０／５０混合物でブロックした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ビオチン化ＦｃＲｎを１時間捕捉した。ヘルパーファージ又はＦｃ提示ファージの適切な希釈物を、ＴＢＳＴ中、ｐＨ＝６又はｐＨ＝７．５で調製した。非結合ＦｃＲｎを、プレートから洗浄し、ファージを添加し、１時間インキュベートした。あるいは、プレートへの添加前に、ビオチン化ＦｃＲｎをファージと室温で１時間混合した。コーティングしたＦｃＲｎ上の残存する非占有のＦｃ結合部位をブロックするために、ヒト抗体由来のＦｃを飽和濃度でプレートに添加した。結合ファージを、ＨＲＰ共役した抗Ｍ１３ ｍＡｂ及び化学発光基質で検出した。
【００５３】
Ｄ．結果
Ｆｃを提示するファージは、抗Ｆｃ抗体を用いて捕捉し、抗ｐＶＩＩＩ抗体を用いて検出したため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｆｃを提示するファージの比率を示すように設計した（図３Ａ）。Ｆｃ組み換えファージについて観察された強力なシグナル及びヘルパーファージについて観察されたシグナルの欠如は、Ｆｃが効率的にファージ表面上に提示されたことを実証する。ＥＭＰ１融合タンパク質構築物、ＣＮＴＯ５３０、提示を、図３Ｂに示される捕捉リガンドとしてＥＭＰ−１特異的抗体を用いて確認した。Ｆｃ領域が適切な生物学的活性を保持し、故に、二量体であることを確認するために、特異的な結合アッセイを行った：プロテインＡ結合、及びＦｃＲｎ結合。図４に示されるように、その表面上に提示されたＦｃを有するファージは、プロテイン−Ａに結合する一方で、Ｆｃを欠く対照ヘルパーファージは、それに結合しない。プロテインＡ結合についての化学発光シグナルは、ヒト免疫グロブリンγ特異的なポリクローナル抗体で捕捉されたＦｃ提示ファージのそれに類似しており、ファージ提示されたＦｃの大部分が、プロテインＡへの結合に適格な立体配座へと折り畳まれることを示唆する。
【００５４】
Ｆｃは、ｐＨ ６．０でＦｃＲｎに結合するが、ｐＨ ７．５で数桁の結合親和性を失う。ファージを、ｐＨ ６．０（図５Ａ）又はｐＨ ７．５（図５Ｂ）のいずれかで、ビオチン化ＦｃＲｎでインキュベートした。ｐＨ ６．０で観察された強力なシグナルによって実証されるように、Ｆｃ組み換えファージは、ｐＨ ６．０でＦｃＲｎに効率的に結合した。対照的に、同じファージは、試験したすべての濃度で、それよりもはるかに低いシグナルを示した。したがって、ｐＨ依存性結合は、ｐＩＸファージミド系を用いて提示されたＦｃについて保持された。
【００５５】
ＩｇＧ及び他のＦｃ含有分子は、ＣＨ３ドメインの相互作用を介してホモ二量体を形成する。ホモ二量体は、そのコアヒンジ領域における２つのジスルフィド結合によって安定化される。Ｆｃファージミドディスプレイベクターは、Ｆｃ遺伝子の単独コピーのみをコードするため、ウェスタンブロットを介して提示されたＦｃの凝集状態を検査した。濃縮されたファージ粒子を、還元又は非還元条件下でＳＤＳゲル上に直接充填した。図４に示されるように、非還元条件下で、タンパク質の大部分は、二量体Ｆｃ−ｐＩＸ融合タンパク質について予想されたように、約６２ｋＤの分子量を有する二量体として移動した。逆に、還元条件下で、Ｆｃ−ｐＩＸタンパク質の大部分は、３１ｋＤの単量体として移動した。故に、ファージ表面上に提示されたＦｃ分子の大部分は、ホモ二量体であり、ＩｇＧ又は他のＦｃ含有分子と同じ様態で、ジスルフィド結合で共有結合される。
【００５６】
Ｅ．発明の概要
組み換えファージについて観察された強力なシグナルは、ヘルパーファージについてのシグナルの欠如と一緒に、ＥＰＯ受容体作用物質（ＥＭＰ−１）Ｆｃ構築物が、ペプチド並びにファージ粒子上のＦｃの検出によって実証されるように、効率的に提示されることを実証する。データは、Ｆｃ含有タンパク質が、天然リガンドへの結合を可能にする特徴的な立体配座特徴を有するホモ二量体として、ファージ上で効率的に提示されたことを示す。
【００５７】
実施例２：ペプチド−Ｆｃ融合ライブラリ
ペプチド−Ｆｃ融合ライブラリを生成するために、無作為アミノ酸配列の部位においてヘアピンループを含有する、テンプレートファージミドを生成した。ヘアピンが二本鎖ＤＮＡを形成する場所に固有の制限部位、ＸｂａＩが配置されるような方法で、ヘアピンを設計した。これは後に、ＸｂａＩでの制限消化を介してテンプレートＤＮＡを除去し、それによって最終構築されたライブラリにおいてテンプレートファージミドが密接に詰められたファージを還元するために使用される予定であった。この細胞株を通じる継代は、ウラシルのｓｓＤＮＡ中への組み込みを引き起こすため、二本鎖テンプレートプラスミドを、Ｄｕｔ−／ｕＮｇ−大腸菌宿主株、ＣＪ２３６に形質転換した。次いでウラシル含有ｓｓＤＮＡテンプレートを、最終ライブラリ宿主細胞の酵素によって分解した。プラスミドを保有する単独コロニーを、液体培養で増殖させ、それをその後、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージで感染させた。ファージをＰＥＧと生理食塩水で沈殿させ、一本鎖ＤＮＡの精製のために使用した。
【００５８】
ＤＮＡライブラリを、修飾されたＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発プロトコルを用いて生成した。無作為化ライブラリヌクレオチドをコードするオリゴマー、並びに５’及び３’隣接配列を、Ｔ４キナーゼを用いて酵素的にリン酸化した。リン酸化オリゴを、３ステップの温度低下プログラムを用いて、それらのそれぞれのｓｓＤＮＡテンプレートにアニールした。第２のストランド合成を、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを反応混合物に添加して、共有結合閉環状ＤＮＡ（ＣＣＣ−ＤＮＡ）を形成することによって行った。ＣＣＣ−ＤＮＡを精製し、次いでヘアピン配列においてＸｂａＩで消化して、バックグラウンドを低減するためにテンプレートＤＮＡを開裂した。消化前及び後の両方で、ＣＣＣ−ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって検査して、細胞中へのその導入の前にライブラリ調製物の質を評価した。次いでライゲーション混合物を、ＭＣ１０６１Ｆ’宿主細胞株（大腸菌）に形質転換した。
【００５９】
４つのｐＩＸ提示されたライブラリを構築し、ここで７つ（Ａ１及びＡ２）又は８つ（Ｂ３及びＢ４）の無作為アミノ酸ループは、各々２つのＦｃ含有ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構築物（上記の式１を参照されたい）においてジスルフィド結合で拘束され、ここでリンカーは、ＧＧＳＧ又はＧＳであり、Ｖ領域Ｊ−ピース（配列番号１３）は、存在するか又は不在であり、ヒンジは、隣接した配列を有するか又は有さないＣＰＰＣのコアアミノ酸、ＩｇＧ１タイプのヒンジのいずれかを含む。これらの２つの変異型Ｆｃ領域は、下記に示すように表され、それは配列番号１７及び１８によって表され、ここで天然産のＩｇＧ４と異なる残基は下線を引かれている。２つの更なる無作為アミノ酸を、拘束ループの各末端部に付加した。
【００６０】
Ａ．７ＮＮＫライブラリ（ＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸ）
１）Ｆｃ＝Ｖ領域及び完全ヒンジを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１８）。２）Ｆｃ＝ヒンジコアを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１７）
Ｂ．８ＮＮＫライブラリ（ＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸ）
３）Ｆｃ＝Ｖ領域及び完全ヒンジを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１８）
４）Ｆｃ＝ヒンジコアを有する突然変異体ＩｇＧ４（配列番号１７）
【００６１】
生成された各ライブラリについて、総計３１回の電気穿孔を行った。形質転換効率性を滴定するために小アリコートを除去した後、増殖培養物を即座に、１リットルの培養容量にまでスケールアップし、それを１．０のＯＤ600にまで増殖させた。この時点で、培養物を次のように分割した：培養物の１０分の１を、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させてファージライブラリを生成した一方で、培養物の大半を使用して、細菌ライブラリのグリセロールストックを確立した。ファージ感染された培養物を増加したスケールにまで再び拡張し、一晩増殖させた。ファージライブラリを、氷上のＰＥＧ／ＮＡＣｌ沈殿を用いて培養上清から精製した。結果として生じたファージ力価を、ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）の数を測定するためにスポット滴定を用いて推定した。スポット滴定調製物からの１×１０-9及び１×１０-10希釈物のアリコートを、単独のコロニーを単離するためにグルコース及びカルベニシリンを補充したＬＢ培地プレート上に広げた。各ライブラリについて、最終ファージライブラリの多様性及び機能性を評価するために、９６個の単独のコロニーの配列を決定した。また、これを使用して、提供されたバックグラウンド汚染残留テンプレートの量も決定した。
【００６２】
発明の概要
一方は短い可動性グリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、コアヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を有し（配列番号１７によって表される）、他方は可動性グリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＳ）、Ｖｈドメインの部分、突然変異ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３（配列番号１８によって表される）を有する、２つのＦｃ足場は、約１〜３×１０9の複雑性を有するライブラリを産生した。各ライブラリからの９６個のクローンの配列決定は、クローンのどの配列も同一でないことを示し、ライブラリの多様性が良好であることを示した。
【００６３】
実施例３：ファージ粒子上の完全ＩｇＧディスプレイ
Ａ．ベクター設計。
完全ＩｇＧディスプレイファージミド（ｖＤＲ４７、図２Ｂ）を、図１に示される、また国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されるような、ｐＣＮＴＯ Ｆａｂ ＩＸ構築物を用いて構築し、それは重鎖のＶｈ及びＣＨ１（配列番号１９）ドメインを含んだ。ヒトＩｇＧ１（配列番号２０）のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインをコードする配列、並びに野生型配列、Ｐ６Ｓ（配列番号１４）からの単独突然変異を有する変異型ｐｅｌＢシグナル配列を付加して、ｐＶＩＩマイナーコートタンパク質でのペプチドディスプレイ及びタンパク質分泌における有意な改善を引き起こし（出願人は出願を同時係属中）、このベクターは、ｌａｃＩ遺伝子を有さないが、ｌａｃプロモータを有する。
【００６４】
Ｂ．完全ＩｇＧディスプレイのために使用される構築物の特徴付け。
ｐＩＸ上での完全ＩｇＧの提示を査定するために、試験構築物のパネルを作製した。６〜２及び１６〜７と表記されるＩＬ１３に対する抗体、並びに抗サイトカイン抗体９〜４を、新たな完全ＩｇＧ分子を構築するためのプロトタイプとして選択した。異なるコドン利用の効果を決定するために、２つの構築物を抗ＩＬ１３抗体の各々に対して作製し、このうち１つはヒトコドン最適化を伴い、もう１つは大腸菌コドン最適化を伴った。表１は、５つの完全ＩｇＧ試験構築物についてのベクター表記を列挙する。最適化された遺伝子を合成し、米国特許第６，６７０，１２７号及び同第６，５２１，４２７号に記載されるような二本鎖ＤＮＡに組み立てた。加えて、ｐＩＸと融合したＥＭＰ−１ Ｆｃ（実施例１）を、それがＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含有するが、軽鎖を含有しないため、対照として含めた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
Ｃ．ファージ産生
上記のＢ節に記載される完全ＩｇＧディスプレイ構築物を、標準的なプロトコルに従って２つの異なるＦ’大腸菌株、ＴＧ−１、及びＸＬ−１ブルーに形質転換した。これらの２つの株を試験する理由は、仮説上、完全ＩｇＧ ｐＩＸ融合タンパク質のパッケージング及びディスプレイに影響を及ぼし得る、増殖率におけるそれらの差異である。個々の形質転換体を採取し、カルベニシリンを補充した（常に１００μｇ／ｍＬで使用される）２ＸＹＴ培地中で一晩増殖させた。次いで一晩の培養物（５００μＬ）を使用して、２５ｍＬの２ＸＹＴ／カルベニシリンを接種し、培養物を３７℃、２５０ｒｐｍで、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５に到達するまで増殖させた。振盪を行わずに３７℃で３０分間インキュベーションする間に、細菌を１０１１ｐｆｕ／ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に感染させ、続いて３，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離工程を行った。この工程において、標準的なプロトコルにより、２ＸＹＴ／カルベニシリン／ＩＰＴＧ（１ｍＭ）での細菌培養が求められた。しかしながら、我々は、この体系の漏出性が、その後のファージパッケージングを伴う融合タンパク質を産生するために十分であろうとの仮説により、培養物を２つに分割し、１ｍＭ ＩＰＴＧを一方に添加し、他方には添加しなかった。要約すると、各々の構築物について、４つの異なるファージ調製を作製した：（ｉ）ＩＰＴＧを有するＴＧ−１（ｉｉ）ＩＰＴＧを有さないＴＧ−１（ｉｉｉ）ＩＰＴＧを有するＸＬ−１ブルー（ｉｖ）ＩＰＴＧを有さないＸＬ−１ブルー。培養を３０℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させ、翌日、３，０００ｒｐｍで１５分間遠沈させ、続いてＰＥＧ／ＮＡＣｌ中でファージ上清の沈殿を行った。氷上で２時間後、沈殿したファージを１０，０００ｒｐｍで、１５分間遠沈させ、ファージペレットを２ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。ファージ調製物を更に、１０，０００ｒｐｍで１０分間スピンすることによって、あらゆる残存する細菌ペレットから清澄化し、２ｍＬ管中、４℃で保管した。
【００６７】
Ｄ．ファージ力価
標準的なプロトコルに従ってファージ力価を決定した。簡潔に述べると、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５に到達するまで、ＴＧ−１細胞を２ＸＹＴ中で増殖させた。ファージ調製物を、９６ウェルプレート中のＰＢＳ中に連続的に希釈し、ＴＧ−１細胞をファージに添加し、３７℃でインキュベートして感染可能にした。３０分後、１％グルコース及びカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレートに、２μＬの各ウェルを分与することによって、スポット滴定を行った。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、ファージ濃度を、ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）の観点から決定した。表２は、すべての構築物及び培養条件についてのファージ滴定からの結果を示す。すべてのクローンは、１０＾１１〜１０＾１３ｃｆｕ／ｍＬの間の高いファージ力価を産生し、それは予測範囲内であり、ファージが効率的に産生されることを示した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
Ｅ．機能的提示を査定するためのＩｇＧドメイン−特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
ファージｐＩＸ上での完全ＩｇＧ分子の提示を査定するために、一連のサンドイッチＥＬＩＳＡを設定した。黒色マキシソーププレートを、１μｇ／ｍＬの、ＴＢＳ中に希釈した捕捉抗体；ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ＦＤ、ＣＨ１）抗体（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）、マウス抗ヒトカッパ軽鎖（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ２ドメイン）抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）、及びマウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）のうちの１つでコーティングした。プレートをケミブロッカー（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）でブロックした後、プレートを洗浄し、ファージを２×１０１１ｃｆｕ／ｍＬの濃度（１０％ケミブロッカー／ＴＢＳＴ中に希釈）で添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ共役したマウス抗Ｍ１３抗体をプレートに添加した。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し、化学発光基質をウェルに添加し、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて読み取った。図７Ａ〜Ｄは、それぞれＣＨ１（図７Ａ）、カッパ（図７Ｂ）、ＣＨ２（図７Ｃ）、及びＣＨ３（図７Ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡからの結果を示す。ＥＬＩＳＡで使用した対照は、ｖＤＲ１０中のクローン６−２のＦａｂ−ｐＩＸ融合物（ヒトコドン最適化、ＴＧ−１細胞中で作製、ＩＰＴＧ誘導を伴う）、非特異的な足場タンパク質−ｐＩＸ融合物、又はＣＮＴＯ５３０−ｐＩＸ融合物を提示するファージであった。ＣＨ１及びカッパＥＬＩＳＡにおいて、６−２ Ｆａｂは、陽性対照としての機能を果たす一方で、ＥＭＰ−１構築物（ＣＮＴＯ５３０）分子は、陰性対照としての機能を果たす。ＣＨ２及びＣＨ３ ＥＬＩＳＡにおいて、６−２ Ｆａｂは、陰性対照としての機能を果たし、ＣＮＴＯ５３０分子は、陽性対照としての機能を果たす。足場タンパク質ファージは、それがいかなる抗体ドメインも担持しないため、すべてのＥＬＩＳＡにおいて陰性対照としての機能を果たす。ファージの異なる捕捉抗体への結合を防止するために、可溶性競合物質として、５μｇ／ｍＬの濃度での抗ＩＬ１３完全ＩｇＧ１抗体の添加によるＥＬＩＳＡアッセイもまた行った。
【００７０】
図７Ａ〜Ｄに示されるように、サンドイッチＥＬＩＳＡのすべてにおいてファージを検出し、ファージが実際には、表面上で異なる抗体ドメインを提示しているという証拠を提供した。ＸＬ−１ブルー細胞中で産生されたファージは、最も高いシグナルを有し、ＩＰＴＧの添加は、結合シグナルに対する明白な効果を有した。ファージの結合は、特異的な相互作用を示す、可溶性抗ＩＬ１３抗体の添加によって阻害され得る。しかしながら、可溶性抗ＩＬ１３抗体は、ファージとＣＨ３ドメインとの間の相互作用に完全に勝る（ｃｏｍｐｅｔｅ ｏｆｆ）ことはできなかった（図７Ｄ）。これは、完全ＩｇＧ−ｐＩＸ融合物の両方について、並びにＥＭＰ−１−Ｆｃ−ｐＩＸ融合物（ＣＮＴＯ５３０）について観察された。
【００７１】
Ｆ．ＩＬ１３への完全ＩｇＧ ｐＩＸファージ結合
ＩｇＧ分子のすべてのドメインを、ＥＬＩＳＡによってファージ粒子上で検出できることを実証した後、構築物が、それらのそれぞれの抗原に結合する能力も保持するかどうかを決定することが必要であった。ＩＬ１３結合ＥＬＩＳＡを、黒色マキシソーププレートを、１μｇ／ｍＬの商業用の抗ＩＬ１３抗体（マウス抗ヒトＩＬ１３、ＭＡＢ２１３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングすることによって設定した。ＭＡＢ２１３は、ＩＬ１３への結合をめぐって６−２又は１６−７と競合せず、故に、サンドイッチＥＬＩＳＡ捕捉抗体として理想的である。洗浄及びブロッキング後、ビオチン化ヒトＩＬ１３Ｒ１３０Ｑヒト（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１００ｎＭで添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｐＩＸ上で６−２及び１６−７の完全ＩｇＧバージョンを提示するファージを２×１０11ｃｆｕ／ｍＬで、単独で又は競合のための可溶性抗ＩＬ１３抗体と一緒に添加した。結合ファージを、ＨＲＰ共役したマウス抗Ｍ１３抗体で検出し、化学発光をＥｎｖｉｓｉｏｎ機器において読み取った。図８は、ＩＬ１３ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。結合は、ほとんどの条件において検出され、このうち１ｍＭ ＩＰＴＧを有するＸＬ−１ブルー細胞中で産生されたファージが最も高いシグナルを示した。ペプチド−Ｆｃ−ｐＩＸ及び代替的な足場分子−ｐＩＸ融合物は、予測通り陰性であり、６−２ Ｆａｂ ｐＩＸ対照は、陽性であった。結合は、可溶性抗ＩＬ１３抗体を添加することによって阻害され、相互作用が特異的であることを示した。ＩＬ１３結合を更に検査するために、ＥＬＩＳＡを設定し、そこで可溶性競合抗体を５０μｇ／ｍＬ〜０．０１μｇ／ｍＬまで連続的に希釈した。対照抗体もまた含めた。図９Ａ及びＢは、それぞれ６〜２ ＩｇＧ ｐＩＸ及び６〜２Ｆａｂ ｐＩＸのＩＬ１３結合に及ぼす可溶性抗体競合の効果を示す。結合の阻害は、およそ０．１μｇ／ｍＬのＩＣ５０により、両方の構築物について見られた。しかしながら、完全ＩｇＧ ｐＩＸ構築物については、阻害は、非常に高い競合物質濃度においてさえ不完全であり、あるレベルの非特異的な相互作用が存在することを示唆する。
【００７２】
Ｇ．ＩＬ１３及びＩＬ１７への完全ＩｇＧ ｐＩＸファージ結合
第２の確証的な実験を行った。これは、抗ＩＬ１７Ａ抗体の完全ＩｇＧバージョンをクローニングすることによって行った。構築物をＸＬ−１ブルー細胞に形質転換し、ファージを、上述のように産生した。ＥＬＩＳＡを行って、図６に示されるように、ｐＩＸ上でのＩＬ１７ ＩｇＧの提示、並びにヒトＩＬ１７Ａｍｕｔ６抗原へのその結合を確認した。各ＥＬＩＳＡ（ＦＤ捕捉、カッパ捕捉、ＣＨ２捕捉、ＣＨ３捕捉、ＩＬ１３捕捉、及びＩＬ１７捕捉）について、ファージを単独で又は可溶性抗ＩＬ１３ ｍＡｂ若しくはＡ可溶性抗ＩＬ１７Ａ ｍＡｂと一緒にのいずれかで添加した。競合物質ｍＡｂの添加は、ＥＬＩＳＡの特異性を示す。図１０において明白なように、ＩＬ１７ ＩｇＧは、ＩＬ１３ ＩｇＧよりも低いレベルではあるが、ｐＩＸ上に提示された。これは、これらの構築物の間のＦａｂ発現レベルにおける差異と一致する（データは示されず）。ファージ上の抗ＩＬ１３ ＩｇＧは、ＩＬ１７に結合せず、ファージ上の抗ＩＬ１７ ＩｇＧは、ＩＬ１３に結合しないことから、抗原結合の特異性を見ることができる。加えて、ファージの２つのタイプの各々の結合は、それらの可溶性ｍＡｂ対応物によって阻害され得る。
【００７３】
実施例４：ｐＶＩＩと融合したＦｃ含有タンパク質の提示
追加的に、ｐＶＩＩファージミド系を用いて、Ｆｃ及びＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）タンパク質がファージ表面上に提示され得ることを実証した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状ファージ粒子の表面上での機能的な多量体鎖間ジスルフィド結合タンパク質の表示のための複製可能なファージベクターであって、細胞外タンパク質に由来する第１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列と融合したファージｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記コードされた細胞外タンパク質のアミノ酸配列が、少なくとも１つのシステイン残基を含み、前記システイン残基が、ｐＩＸ又はｐＶＩＩとの細胞外タンパク質融合として発現される第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基に酸化的に結合されるようになることができ、前記第２のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列と同じ若しくはその変異型であるか、又は異なるタンパク質であり、それによって、そのように形成された前記システイン結合が、前記維状ファージ粒子の表面上に提示されている前記機能的多量体構造の鎖間ジスルフィドである、前記ファージベクター。
【請求項２】
前記タンパク質構造の機能的活性が、プロテインＡ結合及びＦｃＲｎ結合から選択される、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項３】
前記コードされたアミノ酸配列が、配列番号１〜３及び４からなる群から選択される抗体ヒンジドメイン、並びに配列番号１〜３、及び４のコア残基を含む、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項４】
前記鎖間ジスルフィドが、前記アミノ酸配列の前記抗体ヒンジドメイン、又はコアヒンジ残基内に位置する、請求項３に記載のファージベクター。
【請求項５】
配列番号５〜１６、及び１７〜２２から選択される配列、又はその中の少なくとも１つの残基が置換されるそれらの変異型を更に含む、請求項４に記載のファージベクター。
【請求項６】
前記核酸が更に、前記細胞外タンパク質コード配列のうちの１つに操作可能に融合された細菌分泌シグナルをコードする、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項７】
前記細菌分泌シグナルが、配列番号１４又は１５に示される、ｐｅｌＢ配列若しくは変異型ｐｅｌＢ配列から選択されるか、又はｏｍｐＡ若しくはｏｍｐＡの変異型である、請求項６に記載のファージベクター。
【請求項８】
誘導可能なプロモータを更に含む、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項９】
前記誘導可能なプロモータが、ｌａｃプロモータ又はｌａｃの突然変異体である、請求項８に記載のファージベクター。
【請求項１０】
融合ポリペプチドをコードするベクターを封入し、表面上に機能的な多量体鎖間ジスルフィド結合タンパク質を有する、繊維状ファージ粒子であって、前記タンパク質が、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端と融合したシステイン残基を有する第１の外因性ポリペプチドを含み、その上で、前記タンパク質が繊維状ファージタンパク質の表面で発現されるとき、前記システイン残基が、ｐＩＸ又はｐＶＩＩと融合した第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基に酸化的に結合されるようになり、前記第２のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列と同じ若しくはその変異型であるか、又は異なるタンパク質であり、それによって、そのように形成された前記システイン結合が、前記繊維状ファージ粒子の表面上に提示されている前記機能的多量体構造の鎖間ジスルフィドである、前記繊維状ファージ粒子。
【請求項１１】
前記タンパク質構造の機能的活性が、プロテインＡ結合及びＦｃＲｎ結合から選択される、請求項１０に記載の繊維状ファージ粒子。
【請求項１２】
請求項１０に記載の繊維状ファージを含む、細菌宿主細胞。
【請求項１３】
前記機能的タンパク質が、原核宿主細胞の培養培地から回収されることができる、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記タンパク質が、繊維状ファージ粒子の表面上に表示される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
測定可能な機能的タンパク質結合活性を有する、請求項１２に記載の細菌宿主細胞によって発現される二量体又は多量体融合タンパク質。
【請求項１６】
前記測定可能なタンパク質結合活性が、プロテインＡ結合又はＦｃＲｎ受容体結合である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１６に記載の多量体タンパク質構造の、生物学的に活性な細胞外タンパク質変異型。
【請求項１８】
請求項４に記載の核酸ファージベクターを含み、前記抗体配列内の個別的な残基又はドメインをコードする前記ベクター内の特異的位置が、多様である、細菌宿主細胞のファージライブラリ。
【請求項１９】
前記核酸が、アミノ酸置換を有するＦｃ形成配列をコードする、請求項１８に記載のファージライブラリ。
【請求項２０】
前記Ｆｃ形成配列が、更に、リガンド結合ドメインを含む、請求項１９に記載のファージライブラリ。
【請求項２１】
前記リガンド結合ドメインが、受容体結合リガンド、受容体細胞外ドメイン、可変ドメイン及び定常ドメインを含む抗体Ｆａｂドメイン、並びに単鎖Ｆｖ構築物からなる群から選択される、請求項２０に記載のファージライブラリ。
【請求項２２】
前記リガンド結合ドメインが、前記結合ドメイン内の特異的残基において互いに異なる配列を含む、請求項２１に記載のファージライブラリ。
【請求項２３】
リガンド結合ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３からなる群から選択される生殖細胞系重鎖相補性決定領域において複数個の多様な変異を含む、請求項２２に記載のファージライブラリ。
【請求項２４】
求項１２に記載の細菌宿主細胞中で、抗体又はＦｃ断片のライブラリを産生するための方法であって、
ａ．集団宿主細胞を、ファージコートタンパク質と融合した組み換え抗体又はその断片をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターのライブラリに感染させること、
ｂ．前記細胞集団をファージ表面上での前記抗体又はそのＦｃ含有断片の発現を可能にする条件下で培養することと、及び
ｃ．所望の又は増強された特性を有する前記抗体又はその断片を提示するファージを選択することを含む、前記方法。
【請求項２５】
改善された特性を有する変異型の選択のために、請求項２０に記載のファージライブラリを使用する方法。
【請求項２６】
前記特性が、改善された標的結合、特異的な標的エピトープへの結合、Ｆｃ受容体結合親和性、減少されたグリコシル化部位、増加されたグリコシル化部位、及び増強された熱安定性からなる群から選択される、請求項２３に記載の変異型を選択する方法。
【請求項２７】
所望の生物活性について選択するために、請求項２３に記載のファージライブラリを使用する方法であって、前記選択が、（ａ）抗体Ｆｃ断片を、請求項１３に記載のファージライブラリから発現させること、及び（ｂ）前記所望の生物活性を有するファージ粒子を選択することを含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法から得られる、核酸をコードするＦｃ含有抗体又は抗体断片。
【請求項２９】
ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＹ、及びＩｇＧからなる群から選択される、請求項２３に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項３０】
前記抗体又はその断片が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項２３に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項３１】
請求項２４又は２５に記載の方法を用いて選択されたＦｃ含有抗体又は抗体断片を含む、医薬組成物。
【請求項１】
繊維状ファージ粒子の表面上での機能的な多量体鎖間ジスルフィド結合タンパク質の表示のための複製可能なファージベクターであって、細胞外タンパク質に由来する第１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列と融合したファージｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記コードされた細胞外タンパク質のアミノ酸配列が、少なくとも１つのシステイン残基を含み、前記システイン残基が、ｐＩＸ又はｐＶＩＩとの細胞外タンパク質融合として発現される第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基に酸化的に結合されるようになることができ、前記第２のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列と同じ若しくはその変異型であるか、又は異なるタンパク質であり、それによって、そのように形成された前記システイン結合が、前記維状ファージ粒子の表面上に提示されている前記機能的多量体構造の鎖間ジスルフィドである、前記ファージベクター。
【請求項２】
前記タンパク質構造の機能的活性が、プロテインＡ結合及びＦｃＲｎ結合から選択される、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項３】
前記コードされたアミノ酸配列が、配列番号１〜３及び４からなる群から選択される抗体ヒンジドメイン、並びに配列番号１〜３、及び４のコア残基を含む、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項４】
前記鎖間ジスルフィドが、前記アミノ酸配列の前記抗体ヒンジドメイン、又はコアヒンジ残基内に位置する、請求項３に記載のファージベクター。
【請求項５】
配列番号５〜１６、及び１７〜２２から選択される配列、又はその中の少なくとも１つの残基が置換されるそれらの変異型を更に含む、請求項４に記載のファージベクター。
【請求項６】
前記核酸が更に、前記細胞外タンパク質コード配列のうちの１つに操作可能に融合された細菌分泌シグナルをコードする、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項７】
前記細菌分泌シグナルが、配列番号１４又は１５に示される、ｐｅｌＢ配列若しくは変異型ｐｅｌＢ配列から選択されるか、又はｏｍｐＡ若しくはｏｍｐＡの変異型である、請求項６に記載のファージベクター。
【請求項８】
誘導可能なプロモータを更に含む、請求項１に記載のファージベクター。
【請求項９】
前記誘導可能なプロモータが、ｌａｃプロモータ又はｌａｃの突然変異体である、請求項８に記載のファージベクター。
【請求項１０】
融合ポリペプチドをコードするベクターを封入し、表面上に機能的な多量体鎖間ジスルフィド結合タンパク質を有する、繊維状ファージ粒子であって、前記タンパク質が、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端と融合したシステイン残基を有する第１の外因性ポリペプチドを含み、その上で、前記タンパク質が繊維状ファージタンパク質の表面で発現されるとき、前記システイン残基が、ｐＩＸ又はｐＶＩＩと融合した第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基に酸化的に結合されるようになり、前記第２のアミノ酸配列が、前記第１のアミノ酸配列と同じ若しくはその変異型であるか、又は異なるタンパク質であり、それによって、そのように形成された前記システイン結合が、前記繊維状ファージ粒子の表面上に提示されている前記機能的多量体構造の鎖間ジスルフィドである、前記繊維状ファージ粒子。
【請求項１１】
前記タンパク質構造の機能的活性が、プロテインＡ結合及びＦｃＲｎ結合から選択される、請求項１０に記載の繊維状ファージ粒子。
【請求項１２】
請求項１０に記載の繊維状ファージを含む、細菌宿主細胞。
【請求項１３】
前記機能的タンパク質が、原核宿主細胞の培養培地から回収されることができる、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記タンパク質が、繊維状ファージ粒子の表面上に表示される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
測定可能な機能的タンパク質結合活性を有する、請求項１２に記載の細菌宿主細胞によって発現される二量体又は多量体融合タンパク質。
【請求項１６】
前記測定可能なタンパク質結合活性が、プロテインＡ結合又はＦｃＲｎ受容体結合である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１６に記載の多量体タンパク質構造の、生物学的に活性な細胞外タンパク質変異型。
【請求項１８】
請求項４に記載の核酸ファージベクターを含み、前記抗体配列内の個別的な残基又はドメインをコードする前記ベクター内の特異的位置が、多様である、細菌宿主細胞のファージライブラリ。
【請求項１９】
前記核酸が、アミノ酸置換を有するＦｃ形成配列をコードする、請求項１８に記載のファージライブラリ。
【請求項２０】
前記Ｆｃ形成配列が、更に、リガンド結合ドメインを含む、請求項１９に記載のファージライブラリ。
【請求項２１】
前記リガンド結合ドメインが、受容体結合リガンド、受容体細胞外ドメイン、可変ドメイン及び定常ドメインを含む抗体Ｆａｂドメイン、並びに単鎖Ｆｖ構築物からなる群から選択される、請求項２０に記載のファージライブラリ。
【請求項２２】
前記リガンド結合ドメインが、前記結合ドメイン内の特異的残基において互いに異なる配列を含む、請求項２１に記載のファージライブラリ。
【請求項２３】
リガンド結合ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３からなる群から選択される生殖細胞系重鎖相補性決定領域において複数個の多様な変異を含む、請求項２２に記載のファージライブラリ。
【請求項２４】
求項１２に記載の細菌宿主細胞中で、抗体又はＦｃ断片のライブラリを産生するための方法であって、
ａ．集団宿主細胞を、ファージコートタンパク質と融合した組み換え抗体又はその断片をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターのライブラリに感染させること、
ｂ．前記細胞集団をファージ表面上での前記抗体又はそのＦｃ含有断片の発現を可能にする条件下で培養することと、及び
ｃ．所望の又は増強された特性を有する前記抗体又はその断片を提示するファージを選択することを含む、前記方法。
【請求項２５】
改善された特性を有する変異型の選択のために、請求項２０に記載のファージライブラリを使用する方法。
【請求項２６】
前記特性が、改善された標的結合、特異的な標的エピトープへの結合、Ｆｃ受容体結合親和性、減少されたグリコシル化部位、増加されたグリコシル化部位、及び増強された熱安定性からなる群から選択される、請求項２３に記載の変異型を選択する方法。
【請求項２７】
所望の生物活性について選択するために、請求項２３に記載のファージライブラリを使用する方法であって、前記選択が、（ａ）抗体Ｆｃ断片を、請求項１３に記載のファージライブラリから発現させること、及び（ｂ）前記所望の生物活性を有するファージ粒子を選択することを含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法から得られる、核酸をコードするＦｃ含有抗体又は抗体断片。
【請求項２９】
ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＹ、及びＩｇＧからなる群から選択される、請求項２３に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項３０】
前記抗体又はその断片が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項２３に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項３１】
請求項２４又は２５に記載の方法を用いて選択されたＦｃ含有抗体又は抗体断片を含む、医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１３−５１０５９１（Ｐ２０１３−５１０５９１Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９９５９（Ｐ２０１２−５３９９５９）
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５６６７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６２８５９
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５６６７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６２８５９
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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