繰り返し塩基配列の配列数測定方法および繰り返し塩基配列の配列数測定キット
【課題】多数の標的核酸中から、繰り返し塩基配列の反復数を同時に迅速かつ定量的に測定する方法、および測定キットを提供する。
【解決手段】繰り返し塩基配列内の塩基配列と、繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第１の工程と、前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とから、それぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から、繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と、繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識の標識量の量比を求める、第２の工程とを含む、繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【解決手段】繰り返し塩基配列内の塩基配列と、繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第１の工程と、前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とから、それぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から、繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と、繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識の標識量の量比を求める、第２の工程とを含む、繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繰り返し塩基配列の配列数の測定方法および繰り返し塩基配列の配列数の測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列上の差異は、核酸の置換、挿入、欠質あるいは組み替えにより生ずる。この核酸の塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異は、特に遺伝子多型と呼ばれている。遺伝子多型には、１個の塩基が他の塩基に置換されている一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」という）、繰り返し単位が２〜４塩基であるマイクロサテライト多型、繰り返し単位が数塩基から数十塩基であるＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）多型などが知られている。
【０００３】
遺伝子多型は、一定の頻度である集団内に広がっている。このため、生存（生殖）に不利な影響を与えるのではなく、全く形質の変化を伴わない体質を左右する要因として注目されている。例えば、糖尿病、高血圧症、肥満等の生活習慣病、リュウマチ、アレルギー等の免疫疾患、あるいは癌等の疾患に対する罹りやすさが、遺伝子多型に起因することが知られている。また、薬剤代謝（薬の効き方）やヒト白血球組織適合型抗原等も遺伝子多型によって支配されていると考えられている。さらに、繰り返し単位の繰り返し頻度は、ヒトによって異なるので、個人の同定を行うことができる。
【０００４】
ハンチントン病では、４番染色体短腕の第一遺伝子に存在するマイクロサテライト多型（繰り返し単位：ＣＡｇ）の繰り返し反復数が３６回以上と、異常に多い。この配列はグルタミンをコードする。このため、グルタミンの長大な鎖を生じ、これが転写機構を阻害するため、ハンチントン病を発症すると考えられている。また、血糖値をコントロールするインスリン遺伝子の近傍には、１４塩基の繰り返し単位を有するＶＮＴＲ多型（繰り返し単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類）が存在する。この繰り返し単位の反復数が多い場合は、少ない場合に比べて、インスリンの分泌量が多くなることが知られている。すなわち、インスリンの発現量は、ＶＴＮＲの繰り返し単位の反復数によって調節されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このような繰り返し塩基配列を検出する方法としては、ゲノム中に存在する繰り返し塩基配列を含む標的核酸をゲノムから増幅し、電気泳動法を用いて繰り返し検出し、その配列長から反復数を測定する方法が知られている。あるいは、ゲノム中の繰り返し塩基配列を、標識したプローブを用いて検出する方法が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。特許文献１では、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの標識シグナルを測定して、テロメアサイズを測定する。また、特許文献２では、標的核酸にハイブリダイゼージョンさせた標識プローブに励起光を照射し、標識プローブの蛍光のゆらぎを検出して反復配列長を検出している。
【非特許文献１】ジョン ディ．エイチ．ステッド（Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｈ．Ｓｔｅａｄ）、他１名、「インスリンミニサテライトアレルの構造的な分析は、アフリカ人と非アフリカ人との間の異常に大きな相違を明らかにする（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ａｌｌｅｌｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ Ｌａｒｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｆｒｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ａｆｒｉｃａｎｓ）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、米国、アメリカン・ソサイティ・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００２年、第７１巻、ｐ．１２７３−１２８４
【特許文献１】特開２００１−９５５８６号公報
【特許文献２】特開２００５−２３７３３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの従来の繰り返し塩基配列（ＶＮＴＲおよびマイクロサテライト）の検出方法では、繰り返し領域を増幅した後に、サザンハイブリダイゼーションなどにより検出する。このため、検出時間が１〜２日要するので、迅速な検出が行えないという問題がある。
【０００７】
また、特許文献１、２に記載の方法では、溶液中で標識分子を測定する。このため、１つの検体について、一つの反応系で測定を行う必要があり、多くの検体を同時に測定するのは容易でない。また、１つの検体を用いて多項目を検出することができない。
【０００８】
近年、遺伝子診断、病原菌の特定などの際に、多検体・多項目の検出をするために、ＤＮＡチップ法が頻繁に用いられるようになってきた。この方法では、多数のプローブ核酸が同一の担体に固定化されたＤＮＡチップを用いる。固定化されたプローブ核酸がそれぞれ多項目の標的核酸と選択的にハイブリダイズする。これにより、複数の標的核酸を検出することができる。しかし、ＤＮＡチップは、定量性が低い。このため、繰り返し塩基配列の反復数を求めるなどの定量性の高さが求められる検出には適さないという問題がある。
【０００９】
さらに、従来の検出方法では、多数の遺伝子多型を同時に検査することが容易ではない。特に、ＳＮＰｓと繰り返し塩基配列とは密接な関係がある。したがって、これらを同時に検査診断することは、より正確な遺伝子診断をするために要求される。
【００１０】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、複数の標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出する方法および検出キットを提供することにある。
【００１１】
また、本発明の別な目的は、ＳＮＰｓと繰り返し多型とを同時に検出する方法および検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、繰り返し配列単位に相補的な塩基配列鎖をハイブリダイズした後に、繰り返し配列単位内の核酸を標識するとともに、内部標準として繰り返し塩基配列外の核酸を標識し、標識量を測定し、比較することで、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
本発明の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法は、繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第１の工程と、前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とからそれぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識の標識量の量比を求める第２の工程とを含む。
【００１４】
前記前記第１の工程の前に、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含むと、好ましい。この工程の前にプライマーを用いて繰り返し配列を有する標的核酸を増幅する工程を含めてもよい。前記プライマーには、標識が導入されていてもよい。この場合に、前記第1の工程が、前記ハイブリダイズした相補的塩基鎖の末端に標識塩基を伸長するものであってもよい。また、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせてもよい。あるいは、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせてもよい。さらに、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列以外の部分にハイブリダイズさせるものであってもよい。この場合に、前記標識塩基が付加された相補的塩基鎖を、前記複合体から解離させた後に、前記相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定するとよい。あるいは、相補的塩基鎖を前記複合体から解離させずに標識核酸ごと標識量を測定してもよい。前記相補的塩基鎖または標的核酸は、タグ配列を有するものであってもよい。また、前記タグ配列は、非天然型核酸を含んでいてもよい。本発明の方法を用いると、繰り返し塩基配列の反復数の測定と、一塩基多型の検出とを同時に行うこともできる。
【００１５】
本発明の繰り返し塩基配列の反復数測定キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記標的核酸または相補的塩基鎖を固定する固定化担体とを含むものである。前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有していてもよい。さらに、前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含んでいてもよく、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖であってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明では、繰り返し部位とそれ以外の部位に異なる標識を導入する。それぞれの標識の標識量を測定し、両者の量比を求める。この量比から、繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、迅速にかつ定量的に繰り返し塩基配列の反復数を検出する方法および検出キットを提供することができる。本発明では、繰り返し部位とそれ以外の部位に導入された、異なる標識の標識量の量比から繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、反復数の異なる検体、異なる種類の繰り返し配列など、従来は別個に行っていた多項目の測定を、同時にＤＮＡチップ上で行うことができる。また、ＳＮＰｓについても、同時に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
[原理]
本発明の繰り返し塩基配列の反復数を検出する方法および検出キットは、繰り返し塩基配列が一般に有する以下のような規則性を利用したものである。図１は、繰り返し塩基配列を有する核酸を模式的に示す図である。この図の例では、繰り返し塩基配列を有する核酸は、ｎ個の繰り返し配列単位１を有している。図１（ａ）に示すように各繰り返し配列単位の３’末端の核酸（この図の例では、Ｔ）と繰り返し配列の５’末端外に存在する核酸（この図の例では、Ａ）とは、一般に核酸の種類が異なる。各繰り返し配列単位１に相補的な塩基鎖をハイブリダイズする。図１（ｂ）に示す例では、相補的塩基鎖２として、少なくとも繰り返し配列単位の５’末端側の一部に相補的であるものを用いる。次に、標識核酸を導入する。図１（ｃ）に示すように、繰り返し配列単位の１〜（ｎ−１）番目に結合した相補的塩基鎖には標識核酸Ａが導入され、繰り返し配列単位のｎ番目に結合した相補的塩基鎖には標識核酸Ｔが導入される。あるいは、相補的塩基鎖の末端に標識核酸としてＡまたはＴが結合しているものを用いても、同様に標識核酸が導入される。標識核酸ＡまたはＴが導入された相補的塩基鎖を異なる標識で検出し、両者の標識量の比をとる。この図の例では、Ａが導入された相補的塩基鎖の信号強度は、内部標準であるＴが導入された相補的塩基鎖の信号強度で割るので、ｎ個の繰り返し単位を持つ標的核酸からは、（ｎ−１）個分の信号強度となる。したがって、繰り返し配列の配列数が異なる標的核酸であっても、同時に反復数を測定することができる。
【００１８】
上記の例では、ｎ番目の繰り返し配列単位に内部標準を導入する例を説明した。内部標準を導入するのは、繰り返し配列単位に限られず、例えば、図２（ａ）に示すように、標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位であってもよい。この図の例では、標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位に相補的な配列２’を用いて、これに標識核酸を導入する。あるいは、図２（ｂ）に示すように標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位に、標識１４を導入することによってもよい。図２（ｂ）の例では、標的核酸を固定化して繰り返し配列の配列数を測定する場合に適する。なお、図２に示す例では、ｎ個の繰り返し単位を持つ標的核酸からは、ｎ個分あるいは（ｎ−１）個分の信号強度となる。また、繰り返し配列単位に対する相補的な塩基鎖は、繰り返し配列単位の一部でなく全部であってもよい。
【００１９】
本発明を用いれば、例えば、インスリン遺伝子の近傍に存在するＶＮＴＲ配列には、繰り返し配列単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類のものが存在する。この場合であっても、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識を導入すれば、同時に繰り返し塩基配列の反復数を測定することができる。
【００２０】
［繰り返し塩基配列］
本発明で検出対象となる繰り返し塩基配列は、ゲノム中に存在する、繰り返し配列単位が数塩基から数十塩基であるＶＮＴＲ、繰り返し配列単位が２〜４塩基であるマイクロサテライト多型などである。
【００２１】
［標的核酸］
標的核酸は、繰り返し塩基配列を有するものであれば、特に制限はなく、細胞等から抽出されるゲノム遺伝子やゲノム遺伝子から酵素反応を利用して目的領域を増幅したものを用いてもよい。遺伝子の量を考慮すると、目的領域を増幅したものを用いるのが好ましい。目的領域の増幅方法は、特に制限はなく、公知の増幅方法を用いることができる。好ましい増幅方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ反応」という）である。ＰＣＲ反応を用いると、増幅効率が優れ、標識を導入することが容易になる。前記繰り返し塩基配列３を有する標的核酸４は、図３に示すように、プライマー５を用いて、ゲノム中のアニール部位６から、増幅される（塩基伸長部分）。使用されるプライマー５は、特に制限はなく、検出しようとする繰り返し塩基配列を増幅できるものであればよい。また、フォワードプライマー、リバースプライマーの２種類のプライマーを用いてもよい。さらに、プライマーは、２種以上の繰り返し配列を有する標的核酸を増幅できるものであってもよい。
【００２２】
［相補的塩基鎖］
本発明で用いる相補的塩基鎖とは、標的核酸中の繰り返し塩基配列とハイブリダイズして、二重鎖を形成できる核酸集合体をいう。相補的塩基鎖７、８は、図４に示すように、標的核酸４中の繰り返し塩基配列内の繰り返し配列単位９と結合し、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する。相補的塩基鎖７、８は、繰り返し配列単位９の全部または一部とハイブリダイズするものであればよい。また、相補的塩基鎖７は、１種類に限らず、２種以上用いてもよい。例えば、内部標準となる相補的塩基鎖８は、標的核酸４の繰り返し塩基配列以外の部分にハイブリダイズさせるものであってもよい。この場合には、繰り返し配列単位９にハイブリダイズする相補的塩基鎖７と、標的核酸の繰り返し塩基配列以外の部分にハイブリダイズする内部標準となる相補的塩基鎖８のハイブリダイズ効率が等しいことが要求される。相補的塩基鎖７、８の長さ・配列は、特に制限はないが、好ましくは６０℃以下で標的核酸とハイブリダイズし、９５℃で十分解離する特性を有する配列であればよい。二重鎖の安定性が向上するからである。また、相補的塩基鎖７、８は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの集合体であればよい。好ましい相補的塩基鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００２３】
［標識塩基の導入］
標識塩基１０の導入は、（１）非標識の相補的塩基鎖をハイブリダイズした後、標識塩基を酵素反応などによって伸長して塩基鎖末端に標識を導入する、（２）標識をした相補的塩基鎖を用いてハイブリダイズする、（３）標識塩基を有するプライマーを用いて、相補的塩基鎖を遺伝子増幅して標識を導入する（内部標準を導入する場合）、などの方法により行えばよい。具体的には、塩基伸長反応、塩基連結反応、核酸の３’末端を選択的に標識するターミナルデオキシクレオチジルトランスフェラーゼ反応などを用いる。より好ましくは、酵素ポリメラーゼを用いる伸長反応である。この反応を行う場合には、ジデオキシヌクレオチドを標識塩基として用いればよい。ポリメラーゼは、塩基選択性が高く、正確に標識を導入できる。この結果、繰り返し塩基配列の配列数の検出が正確に行える。標識塩基としてジデオキシヌクレオチドを用いると、１塩基のみが伸長される。この結果、より定量性の高い検出が可能となる。標識塩基への標識を付加するのは、標識が付加された塩基または相補的塩基鎖を用いる、あるいは塩基を伸長した後または相補的塩基鎖をハイブリダイズした後に標識を付加してもよい。
【００２４】
［標識の定量］
上記標識塩基は、繰り返し配列内および繰り返し配列外の塩基または塩基配列を、それぞれ異なる標識で検出できるものであればよい。使用できる標識としては、色素標識、放射線同位体標識、蛍光色素、りん光色素、発光色素など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、安全性・検出感度に優れ、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７などの公知の蛍光色素が挙げられる。これらの蛍光色素は、いずれの蛍光色素であっても使用できる。好ましいのは、構造の違いにより、認識が容易なシアニン系蛍光色素である。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いる。また、標識として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、シルバーインジウム硫化亜鉛（ＡｇＩｎＺｎＳ）、シリコン（Ｓｉ）などが挙げられる。異なる標識を用いる場合には、同一装置で測定できるものを用いるのが好ましい。また、標識を付加した塩基または塩基配列を相補的塩基鎖に結合させるためには、相補的塩基鎖に結合可能な構造が要求される。
【００２５】
［標識強度の測定］
標識強度は、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体から解離した相補的塩基鎖を用いて測定してもよく、繰り返し配列−相補的塩基鎖複合体の全体で測定してもよい。解離した相補的塩基鎖の標識強度は、溶液中で測定してもよく、固定化担体に固定化して測定してもよい。繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体の全体で標識強度を測定する場合には、固定化担体に固定化して測定する。複数の標識の信号を高密度に検出する場合には、ＤＮＡチップなどの固定化担体に固定化して測定するのが、好ましい。固定化担体への固定化は、図５に示すように、タグ配列を付加した相補的塩基鎖のタグ配列と、基板１２上に固定化した固定化担体１３とを、ハイブリダイズすることにより行う。タグ配列１１は、あらかじめ相補的塩基鎖７、８にタグ配列を付加した相補的塩基鎖を用いて複合体を形成してもよく、標識繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体から相補的塩基鎖を解離した後にタグ配列を付加してもよい。また、繰り返し配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する場合にも、標的核酸にタグ配列を付加しておけば、同様に基板に固定化できる。
【００２６】
［固定化担体］
固定化担体は、基板やビーズなどの基材に固定化されていればよい。相補的塩基鎖を基板上に固定化すると、多検体の処理が可能となるので、好ましい。
【００２７】
固定化担体は、核酸集合体であればよい。核酸であれば、上記相補的塩基鎖あるいは標的核酸の一部（タグ配列を含む）と相補的に結合できるからである。固定化担体および上記相補的塩基鎖あるいは標的核酸のいずれかの一部（タグ配列を含む）は、天然型核酸であってもよく、非天然型核酸であってもよい。天然型核酸とは、自然界に存在する核酸を意味し、核酸に含まれる糖がすべてＤ体である核酸をいう。非天然型核酸とは、自然界には存在しない核酸を意味し、核酸に含まれる糖の少なくとも１つがＬ体である、あるいは糖の一部が修飾されている核酸をいう。特に、核酸に含まれる糖の少なくとも１つがＬ体である核酸をＬ型核酸という。非天然型核酸を用いると、選択性の高いハイブリダイゼーションが可能となる。
【００２８】
固定化担体およびこれに相補的に結合する配列（タグ配列を含む）において、天然型のＤ型の糖を有する核酸を用いると、検査したい配列以外の部分がハイブリダイゼーション（クロスハイブリ）を起こす場合がある。このため、ＤＮＡチップなどを用いて解析を行う場合に、固定化されている核酸の配列を決定するのに、細心の注意が必要であった。非天然型核酸の中には、天然型核酸とはハイブリダイゼーションをしないものがある。したがって、非天然型核酸を用いると、クロスハイブリを起こすおそれのないタグ配列の設計が可能となる。
【００２９】
固定化担体を基材に担持させる方法としては、特に制限されず、例えば以下に示すような公知の方法を用いることができる。例えば、ナイロンシートなどの上にＤＮＡをスポッターと呼ばれる装置を用いて点着することにより高密度に固定する。あるいは、特開平１−５０５１４４号公報などに記載されているように、オリゴ核酸を、スポッターと呼ばれる装置を用いて、スライドガラスなどの平坦な基板の上に、点着することもできる。また、特開２０００−５０８５４２号公報などに記載されているように、フォトリソグラフ法という半導体製造に用いられる技術を基にして、チップ上でオリゴ核酸を合成してもよい。さらに、特開２００５−２３３７０３号公報などに記載されているように、特定の構造を有するポリマー表面に官能基を生成させ、この官能基を介して、末端アミノ核酸を共有結合により固定化することとしてもよい。
【００３０】
［標識強度の測定］
担体上にハイブリダイズした標的核酸あるいは標識付加相補塩基鎖の標識の信号強度を測定することによって、繰り返し塩基配列数の定量を行う。検出器の仕様によらない定量性を実現するためには、２種以上の相補塩基鎖のハイブリダイゼーション効率の指標と標識を導入する際のポリメラーゼ伸長反応の標準化との指標となるように、濃度が既知である標識ポリヌクレオチド、あるいは濃度既知の標的核酸および相補的塩基鎖を添加して、信号強度を測定すればよい。
【００３１】
本発明の検出方法を用いると、標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することができる。繰り返し塩基配列としては、繰り返し塩基配列を有するものであれば特に制限されず、例えば、インスリン発現調節に関する繰り返し塩基配列などが検出できる。インスリン遺伝子の近傍に存在するＶＮＴＲ配列には、繰り返し単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類のものが存在する。この場合に、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識体を用いて相補的塩基鎖を標識して、ＶＮＴＲ配列を検出すれば、同時に異なる種類の繰り返し塩基配列の反復数を検出することができる。本発明を用いれば、標的核酸中に異なる種類の繰り返し塩基配列である繰り返し塩基配列を有する場合にも、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することができる。
【００３２】
［ＳＮＰｓの検出］
本発明を用いれば、繰り返し塩基の反復数の測定とＳＮＰｓの測定を１つの固定化担体上で行うことができる。すなわち、本発明を用いれば、少量の検体量で、複数の標的核酸を用いて複数の標識化を同時に行うことができる。この結果、１つの固定化担体上で、繰り返し塩基配列の反復数の測定とＳＮＰｓタイプの検出とを行うことができる。また、繰り返し塩基配列とＳＮＰｓとが近傍に存在する場合には、１種類のプライマーセットから１種類の標的核酸を増幅し、多種類の相補的塩基鎖を用いて繰り返し塩基配列とＳＮＰｓとを同一の標的核酸から検出することができる。ＳＮＰｓの検出は、例えば、ＳＰＲ法を用いて、上記繰り返し塩基配列中に含まれる１塩基のミスマッチを検出することで、ＳＮＰｓを測定することができる（参考文献１：アレキサンダー ダブリュ．ペーターソン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｗ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、他２名、「表面でのミスマッチまたは部分マッチＤＮＡのハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｎ ｏｆ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｏｒ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ＤＮＡ ａｔ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」、ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国、アメリカン ケミカル ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、２００２年、第１２４巻、ｐ．１４６０１−１４６０７）。あるいは、塩基伸長法により塩基配列を決定して、ＳＮＰｓを測定する（参考文献２：トミ パスチネン（Ｔｏｍｉ Ｐａｓｔｉｎｅｎ）、他４名、「ミニシークエンシング：オリゴヌクレオチドアレイ上でのＤＮＡ分析と診断のための特別なツール（Ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ）」、ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年、第７巻、ｐ．６０６−６１４）。
【００３３】
［検出キット］
本発明の繰り返し塩基配列反復数測定キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記相補的塩基鎖を固定する固定化担体とを含んでいる。前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有していてもよい。前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含む、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖であってもよい。また、前記固定化担体が、すでに基板上に固定されている測定キットであってもよい。このような繰り返し塩基配列の反復数測定キットを用いることで、繰り返し塩基配列の反復数を容易に検出することができる。
【実施例】
【００３４】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
［ヒトＩＬ１ＲＮ（ＩＬ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）に含まれるＶＮＴＲの反復数検出］（相補的塩基鎖を解離させる場合）
（ポリヌクレオチドの合成）
ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ領域（配列番号１）を増幅するため、この配列番号１の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー、リバースプライマーを合成した。このプライマーは、反復数が２〜６回のいずれのＶＮＴＲを持つ領域であっても増幅可能である。また、繰り返し配列単位に対する相補的塩基鎖（配列番号２）を合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託してD型核酸を用いて行った。
配列番号２の相補的塩基鎖はＶＮＴＲの反復数検出用と同時に、内部標準検出用にも用いることが可能なように設計した。
【表１】
【００３６】
（ＰＣＲによるＶＮＴＲ配列を含む領域の増幅）
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）細胞およびＨＬ６０（ヒト前骨髄性白血病細胞由来）細胞を用いて、核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（（株）キアゲン製）で、ゲノムＤＮＡを抽出した。該ゲノムDNAに、下記試薬１を添加して、下記条件１により、ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ配列を増幅した。
＜試薬１＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
フォワードプライマー １５ ｐｍｏｌ
リバースプライマー １５ ｐｍｏｌ
緩衝液 ５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２ μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ） １ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 ５０ ｎｇ
＜増幅条件１＞
95℃・5分
95℃・30秒、55℃・30秒、68℃・30秒（35サイクル）
【００３７】
（アガロースゲル電気泳動による評価）
上記ＰＣＲ反応後増幅された部分の長さを電気泳動により評価した。電気泳動の条件は、２％アガロースゲルを、２０×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ（（株）インビトロジェン製）を２０倍希釈した展開液を用いて、１００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液で核酸を染色し、増幅した標的核酸の長さを求めた。その結果、ＨＥＫ２９３細胞由来の標的核酸断片は８５１ｂｐ／１０２３ｂｐに、ＨＬ６０細胞由来の標的核酸断片は１０２３ｂｐであった。このことから、それぞれの反復数は２回と４回のヘテロおよび４回のホモであると見積もられた。
【００３８】
（標識塩基を用いた標識塩基の取り込み）
上記ＰＣＲ反応物は、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を用いて精製した。該精製物に下記試薬２を添加して、下記条件２にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。ポリヌクレオチド３、４はそれぞれ、Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰが正常に取り込まれるかどうかを確認するためのポリヌクレオチドである。標準化用ポリヌクレオチド５、６はポリヌクレオチド３、４に結合し、３、４を鋳型として一塩基伸長反応させ、それぞれ標準化用ポリヌクレオチド５、６の末端を標識化し、反応が正常に進行していることを確認するためのポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチド３〜６の塩基配列は、それぞれ表２の配列番号３から６に対応する塩基配列である。
【００３９】
なお、標識塩基を取り込ませた後、サーマルサイクラーを用いて、９５℃に保ち、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を解離させた。この操作により標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖を得た。
＜試薬２＞
以下の試薬を含む20μｌ溶液を、それぞれのサンプルに対して調製した。
ＰＣＲ精製物（標的核酸） １００ ｎｇ
タグ配列付相補的塩基鎖 ２０．３ ｐｍｏｌ
１０ｍＭ Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＧＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＣＴＰ １ μｌ
緩衝液 ２ μｌ
Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８ Ｕ
ポリヌクレオチド３ １２．５ ｎｇ
ポリヌクレオチド４ １２．５ ｎｇ
標準化用ポリヌクレオチド５ ０．３ ｐｍｏｌ
標準化用ポリヌクレオチド６ ０．３ ｐｍｏｌ
＜反応条件２＞
95℃・2分
95℃・20秒、60℃・15秒（30サイクル）
95℃・5分
0℃・3分
【表２】
【００４０】
（ＤＮＡ固定化担体の作成）
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基板（コスモグラス押し出し板、厚さ：１ｍｍ、（株）クラレ製）を、温度６５℃の１０Ｎの水酸化ナトリウム溶液に１２時間浸漬した。このＰＭＭＡ基板を、純水、０．１Ｎの塩酸水溶液、純水の順で洗浄した。
【００４１】
各アンチタグ配列同士のクロスハイブリがないように設計した、５’末端がアミノ化された４種類のアンチタグ配列のD型核酸相補鎖を合成し、固定化担体（アンチタグ配列）とした。
【００４２】
合成した４種類のアンチタグ配列の相補鎖ＤＮＡをそれぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度に溶かした後、リン酸緩衝液（ｐＨ ５．５）を用いて０．０３ｎｍｏｌ／μＬに希釈した。また、基板表面のカルボン酸と固定化ＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるために、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を、終濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。
【００４３】
（ハイブリダイゼーション溶液の調製）
標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖と上記固定化されたアンチタグ配列とのハイブリダイズは以下のように行った。以下に用いる１５×ＳＳＣは、２０×ＳＳＣ（０．３Ｍ クエン酸ナトリウム二水和物、３Ｍ ＮａＣｌ溶液：シグマ社製）を純水にて３／４に希釈したものを意味する。
【００４４】
３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１５×ＳＳＣ、０．３ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１ｗｔ％サケ精子ＤＮＡ（上記各濃度は、いずれも終濃度）を含む水溶液を作製した。これと上記標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖溶液を３：１で混合し、このタグ配列と同一のタグ配列である、Ｃｙ３標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド７）またはＣｙ５標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド８）をそれぞれ０．０１ｐｍｏｌ添加し、全量が４０μＬとなるように調製した。
【００４５】
（固定化担体への固定化）
上記固定化担体が担持された基板上に、上記ハイブリダイゼーション溶液４０μＬを載せ、カバーグラスで覆い、４２℃で４時間インキュベートした後、カバーグラスを剥離して洗浄・乾燥した。
【００４６】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド７および８で検出される、Ｃｙ３およびＣｙ５の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表３に示す。
【表３】
【００４７】
表３から、ＨＥＫ２９３細胞由来の信号強度比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）は２であり、理論値との比較より、その繰り返し塩基配列の反復数は３回もしくは２回と４回のヘテロであると判断できる。同様に、ＨＬ６０細胞由来の信号強度比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）は３であり、理論値との比較より、その繰り返し数は４回であると判断できる。この表から、繰り返し配列単位−相補的鎖複合体形成後に、相補的塩基鎖に標識核酸を導入すると、繰り返し塩基配列の反復数が、正確に定量できることがわかった。
【００４８】
（実施例２）
［標識付プライマーを用いたヒトＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲの反復数検出］（標識核酸を固定して分析する場合）
（ポリヌクレオチドの合成）
ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ領域（配列番号１）を増幅するため、この配列番号１の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー、リバースプライマーおよび繰り返し配列単位に対する相補的塩基配列ポリヌクレオチド（配列番号２）を合成した。
【００４９】
フォワードプライマーには非天然型核酸（Ｌ型核酸）を用いたタグ配列を付加した。また、フォワードプライマーの５’末端には、Ｃｙ３標識を導入した。リバースプライマーは、Ｄ型核酸で合成した。このプライマーは、反復数が２〜６回のいずれのＶＮＴＲを持つ領域であっても増幅可能である。
【００５０】
相補的塩基は、５’末端にＣｙ５標識を導入した。
【００５１】
Ｌ型核酸を含むＤＮＡの合成は、ＤＮＡ／ＲＮＡ ＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。また、Ｌ型核酸として、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ｃｙｔｉｄｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｉｂｕ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ｔｈｍｉｄｉｎｅ ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を、Ｄ型核酸としてｄｅｏｘｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ｄｅｏｘｙ Ｃｙｔｉｄｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ｄｅｏｘｙ Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｉｂｕ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ｄｅｏｘｙ Ｔｈｍｉｄｉｎｅ ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。
【００５２】
リバースプライマーおよび、５’末端にＣｙ３標識を導入したフォワードプライマー、５’末端にＣｙ５標識を導入した相補的塩基鎖は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。
【００５３】
（ＰＣＲによるＶＮＴＲ配列を含む領域の増幅）
実施例１と同様に抽出したヒトゲノムＤＮＡに、下記試薬３を添加して、上記条件１により、ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ配列を増幅した。
＜試薬３＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
Ｃｙ３標識タグ付フォワードプライマー ２０ ｐｍｏｌ
リバースプライマー ０．２ ｐｍｏｌ
緩衝液 ５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２ μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ） １ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 ５０ ｎｇ
【００５４】
さらに、実施例１と同様に電気泳動を行った。泳動後、反復数が２回である標的核酸を抽出した。
【００５５】
（繰り返し塩基配列―相補鎖複合体の形成）
上記ＰＣＲ反応物はＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を用いて精製した。
【００５６】
精製した標的核酸１００ngに、１００μＭに溶解した前記Ｃｙ５標識相補的塩基鎖を１μＬ添加し、全量が２０μＬとなるように、純水で希釈した５×ＳＳＣを加えた。この溶液を９５℃、５分インキュベート後、氷上で５分静置した。
【００５７】
（固定化担体への固定化）
タグ配列に相補的な配列を、Ｌ型核酸を用いて合成した。また、得られた各タグ配列に相補的な配列は５’末端にアミノ基を付加しており、実施例１に記載した手法を用いて基板に固定化した。
【００５８】
前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体溶液１０μＬを、実施例１に記載したハイブリダイゼーション試薬３０μＬ、Ｃｙ３標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド７）またはＣｙ５標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド８）をそれぞれ０．０１ｐｍｏｌ添加し、混合した。
【００５９】
Ｌ型のタグ配列に相補的な配列を固定化した基板に、上記ハイブリダイゼーション溶液を添加し、実施例１に記載した手法で固定化を行った。
【００６０】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド７および８で検出される、Ｃｙ３およびＣｙ５の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表４に示す。
【表４】
【００６１】
表４より、標識付プライマーを用いた標的核酸−相補的塩基鎖複合体による反復数の測定においても、繰り返し塩基配列の反復数に伴った蛍光強度比の増加が測定されることが示された。また、Ｌ型核酸を用いたタグ配列であっても、Ｄ型と同程度の感度が得られることがわかった。
【００６２】
（実施例３）
［ＶＮＴＲ反復数とＳＮＰｓの同時検出］
（ポリヌクレオチドの合成）
ＳＮＰｓ検出用ポリヌクレオチドとして、４箇所のＳＮＰｓ領域が増幅可能なプライマーをそれぞれ合成した。また、各ＳＮＰｓの検出には公知の手法である一塩基伸長法（参考文献２）を用い、この手法に適したポリヌクレオチドを合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。
【００６３】
それぞれのプライマーおよび繰り返し塩基配列の配列数測定用相補的塩基鎖はＤ型核酸によって合成し、さらに相補的塩基鎖にはタグ配列間のクロスハイブリがないように設計されたＤ型核酸タグ配列を付加した。
【００６４】
（ＰＣＲによるＳＮＰｓを含む領域の増幅）
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）細胞のゲノムＤＮＡを実施例１に記載した手法で抽出した。下記試薬４を添加して、実施例１に記載の条件１により、ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ配列および、４箇所のＳＮＰｓを含む領域をそれぞれに増幅した。
＜試薬４＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製し、計５本の反応液を得た。
フォワードプライマー １５ ｐｍｏｌ
リバースプライマー １５ ｐｍｏｌ
緩衝液 ５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２ μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ） １ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 ５０ ｎｇ
【００６５】
（標識塩基を用いた相補塩基の取り込み）
上記ＰＣＲ反応物はＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を用いてそれぞれ精製した。
【００６６】
得られた精製物に下記試薬５を添加して、実施例１に記載の条件２にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。
＜試薬５＞
以下の試薬を含む20μｌ溶液を、それぞれのサンプルに対して調製し、計５本の反応液を得た。
ＰＣＲ精製物（標的核酸） １００ ｎｇ
タグ付相補的塩基鎖 ０．３ ｐｍｏｌ
１０ｍＭ Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＧＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＣＴＰ １ μｌ
緩衝液 ２ μｌ
Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８ Ｕ
ポリヌクレオチド３ １２．５ ｎｇ
ポリヌクレオチド４ １２．５ ｎｇ
標準化用ポリヌクレオチド５ ０．３ ｐｍｏｌ
標準化用ポリヌクレオチド６ ０．３ ｐｍｏｌ
【００６７】
（固定化担体への固定化）
５’末端にアミノ基を付加したＤ型核酸により、タグ配列に相補的な鎖を合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。次に、実施例１に記載の手法を用いて、これらのタグ配列に相補的な鎖を固定化した基板を作製した。
【００６８】
上記反応液を各サンプル２μＬずつ混合し、１０μＬの標識ポリヌクレオチド溶液を調製し、これに実施例１に記載したハイブリダイゼーション試薬３０μＬと、ポリヌクレオチド７および８をそれぞれ０．０１ｐｍｏｌ混合した、ハイブリダイゼーション溶液を作製した。
【００６９】
上記ＤＮＡ固定化基板に、上記ハイブリダイゼーション溶液を添加し、実施例１に記載した手法で固定化を行った。
【００７０】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド７および８で検出される、Ｃｙ３およびＣｙ５の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表５に示す。
【表５】
【００７１】
ＳＮＰタイプは、相補的な標識塩基との相補的に結合する。表５の結果より、ＳＮＰ１および、ＳＮＰ２のＳＮＰタイプはＡ／Ｔのヘテロ、ＳＮＰ３および、ＳＮＰ４のＳＮＰタイプはＡのホモであると判断される。この結果は、公知の手法であるシークエンス法の結果と整合性を得た。さらに、ＶＮＴＲ反復数の判断においても、前述の結果と同様に蛍光強度比が2となり、その反復数は３回もしくは２回と４回のヘテロと判別できた。このことから、タグ配列を固定化した固定化担体を用いることで、ＳＮＰｓとＶＮＴＲ配列の同時検出が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本発明の原理を説明するための模式図である。
【図２】図２は、標識核酸の繰り返し配列以外の部位に内部標準の導入方法を説明するための模式図である。
【図３】図３は、ＰＣＲ産物を用いた標的核酸の調製法を説明するための概念図である。
【図４】図４は、標的核酸中の繰り返し配列単位に、相補的塩基鎖が結合する機構を説明する概念図である。
【図５】図５は、固定化担体を用いて標識核酸を検出・定量する機構を説明する概念図である
【符号の説明】
【００７３】
１ 繰り返し配列単位
２ 相補的塩基鎖
３ 繰り返し塩基配列
４ 標的核酸
５ プライマー
６ アニール部位
７、８ 相補的塩基鎖
９ 繰り返し塩基配列
１０ 標識塩基
１１ タグ配列
１２ 基板
１３ 固定化担体
１４ 標識
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繰り返し塩基配列の配列数の測定方法および繰り返し塩基配列の配列数の測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列上の差異は、核酸の置換、挿入、欠質あるいは組み替えにより生ずる。この核酸の塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異は、特に遺伝子多型と呼ばれている。遺伝子多型には、１個の塩基が他の塩基に置換されている一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」という）、繰り返し単位が２〜４塩基であるマイクロサテライト多型、繰り返し単位が数塩基から数十塩基であるＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）多型などが知られている。
【０００３】
遺伝子多型は、一定の頻度である集団内に広がっている。このため、生存（生殖）に不利な影響を与えるのではなく、全く形質の変化を伴わない体質を左右する要因として注目されている。例えば、糖尿病、高血圧症、肥満等の生活習慣病、リュウマチ、アレルギー等の免疫疾患、あるいは癌等の疾患に対する罹りやすさが、遺伝子多型に起因することが知られている。また、薬剤代謝（薬の効き方）やヒト白血球組織適合型抗原等も遺伝子多型によって支配されていると考えられている。さらに、繰り返し単位の繰り返し頻度は、ヒトによって異なるので、個人の同定を行うことができる。
【０００４】
ハンチントン病では、４番染色体短腕の第一遺伝子に存在するマイクロサテライト多型（繰り返し単位：ＣＡｇ）の繰り返し反復数が３６回以上と、異常に多い。この配列はグルタミンをコードする。このため、グルタミンの長大な鎖を生じ、これが転写機構を阻害するため、ハンチントン病を発症すると考えられている。また、血糖値をコントロールするインスリン遺伝子の近傍には、１４塩基の繰り返し単位を有するＶＮＴＲ多型（繰り返し単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類）が存在する。この繰り返し単位の反復数が多い場合は、少ない場合に比べて、インスリンの分泌量が多くなることが知られている。すなわち、インスリンの発現量は、ＶＴＮＲの繰り返し単位の反復数によって調節されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このような繰り返し塩基配列を検出する方法としては、ゲノム中に存在する繰り返し塩基配列を含む標的核酸をゲノムから増幅し、電気泳動法を用いて繰り返し検出し、その配列長から反復数を測定する方法が知られている。あるいは、ゲノム中の繰り返し塩基配列を、標識したプローブを用いて検出する方法が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。特許文献１では、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの標識シグナルを測定して、テロメアサイズを測定する。また、特許文献２では、標的核酸にハイブリダイゼージョンさせた標識プローブに励起光を照射し、標識プローブの蛍光のゆらぎを検出して反復配列長を検出している。
【非特許文献１】ジョン ディ．エイチ．ステッド（Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｈ．Ｓｔｅａｄ）、他１名、「インスリンミニサテライトアレルの構造的な分析は、アフリカ人と非アフリカ人との間の異常に大きな相違を明らかにする（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ａｌｌｅｌｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ Ｌａｒｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｆｒｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ａｆｒｉｃａｎｓ）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、米国、アメリカン・ソサイティ・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００２年、第７１巻、ｐ．１２７３−１２８４
【特許文献１】特開２００１−９５５８６号公報
【特許文献２】特開２００５−２３７３３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの従来の繰り返し塩基配列（ＶＮＴＲおよびマイクロサテライト）の検出方法では、繰り返し領域を増幅した後に、サザンハイブリダイゼーションなどにより検出する。このため、検出時間が１〜２日要するので、迅速な検出が行えないという問題がある。
【０００７】
また、特許文献１、２に記載の方法では、溶液中で標識分子を測定する。このため、１つの検体について、一つの反応系で測定を行う必要があり、多くの検体を同時に測定するのは容易でない。また、１つの検体を用いて多項目を検出することができない。
【０００８】
近年、遺伝子診断、病原菌の特定などの際に、多検体・多項目の検出をするために、ＤＮＡチップ法が頻繁に用いられるようになってきた。この方法では、多数のプローブ核酸が同一の担体に固定化されたＤＮＡチップを用いる。固定化されたプローブ核酸がそれぞれ多項目の標的核酸と選択的にハイブリダイズする。これにより、複数の標的核酸を検出することができる。しかし、ＤＮＡチップは、定量性が低い。このため、繰り返し塩基配列の反復数を求めるなどの定量性の高さが求められる検出には適さないという問題がある。
【０００９】
さらに、従来の検出方法では、多数の遺伝子多型を同時に検査することが容易ではない。特に、ＳＮＰｓと繰り返し塩基配列とは密接な関係がある。したがって、これらを同時に検査診断することは、より正確な遺伝子診断をするために要求される。
【００１０】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、複数の標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出する方法および検出キットを提供することにある。
【００１１】
また、本発明の別な目的は、ＳＮＰｓと繰り返し多型とを同時に検出する方法および検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、繰り返し配列単位に相補的な塩基配列鎖をハイブリダイズした後に、繰り返し配列単位内の核酸を標識するとともに、内部標準として繰り返し塩基配列外の核酸を標識し、標識量を測定し、比較することで、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
本発明の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法は、繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第１の工程と、前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とからそれぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識の標識量の量比を求める第２の工程とを含む。
【００１４】
前記前記第１の工程の前に、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含むと、好ましい。この工程の前にプライマーを用いて繰り返し配列を有する標的核酸を増幅する工程を含めてもよい。前記プライマーには、標識が導入されていてもよい。この場合に、前記第1の工程が、前記ハイブリダイズした相補的塩基鎖の末端に標識塩基を伸長するものであってもよい。また、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせてもよい。あるいは、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせてもよい。さらに、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列以外の部分にハイブリダイズさせるものであってもよい。この場合に、前記標識塩基が付加された相補的塩基鎖を、前記複合体から解離させた後に、前記相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定するとよい。あるいは、相補的塩基鎖を前記複合体から解離させずに標識核酸ごと標識量を測定してもよい。前記相補的塩基鎖または標的核酸は、タグ配列を有するものであってもよい。また、前記タグ配列は、非天然型核酸を含んでいてもよい。本発明の方法を用いると、繰り返し塩基配列の反復数の測定と、一塩基多型の検出とを同時に行うこともできる。
【００１５】
本発明の繰り返し塩基配列の反復数測定キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記標的核酸または相補的塩基鎖を固定する固定化担体とを含むものである。前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有していてもよい。さらに、前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含んでいてもよく、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖であってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明では、繰り返し部位とそれ以外の部位に異なる標識を導入する。それぞれの標識の標識量を測定し、両者の量比を求める。この量比から、繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、迅速にかつ定量的に繰り返し塩基配列の反復数を検出する方法および検出キットを提供することができる。本発明では、繰り返し部位とそれ以外の部位に導入された、異なる標識の標識量の量比から繰り返し塩基配列の反復数を検出する。この結果、反復数の異なる検体、異なる種類の繰り返し配列など、従来は別個に行っていた多項目の測定を、同時にＤＮＡチップ上で行うことができる。また、ＳＮＰｓについても、同時に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
[原理]
本発明の繰り返し塩基配列の反復数を検出する方法および検出キットは、繰り返し塩基配列が一般に有する以下のような規則性を利用したものである。図１は、繰り返し塩基配列を有する核酸を模式的に示す図である。この図の例では、繰り返し塩基配列を有する核酸は、ｎ個の繰り返し配列単位１を有している。図１（ａ）に示すように各繰り返し配列単位の３’末端の核酸（この図の例では、Ｔ）と繰り返し配列の５’末端外に存在する核酸（この図の例では、Ａ）とは、一般に核酸の種類が異なる。各繰り返し配列単位１に相補的な塩基鎖をハイブリダイズする。図１（ｂ）に示す例では、相補的塩基鎖２として、少なくとも繰り返し配列単位の５’末端側の一部に相補的であるものを用いる。次に、標識核酸を導入する。図１（ｃ）に示すように、繰り返し配列単位の１〜（ｎ−１）番目に結合した相補的塩基鎖には標識核酸Ａが導入され、繰り返し配列単位のｎ番目に結合した相補的塩基鎖には標識核酸Ｔが導入される。あるいは、相補的塩基鎖の末端に標識核酸としてＡまたはＴが結合しているものを用いても、同様に標識核酸が導入される。標識核酸ＡまたはＴが導入された相補的塩基鎖を異なる標識で検出し、両者の標識量の比をとる。この図の例では、Ａが導入された相補的塩基鎖の信号強度は、内部標準であるＴが導入された相補的塩基鎖の信号強度で割るので、ｎ個の繰り返し単位を持つ標的核酸からは、（ｎ−１）個分の信号強度となる。したがって、繰り返し配列の配列数が異なる標的核酸であっても、同時に反復数を測定することができる。
【００１８】
上記の例では、ｎ番目の繰り返し配列単位に内部標準を導入する例を説明した。内部標準を導入するのは、繰り返し配列単位に限られず、例えば、図２（ａ）に示すように、標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位であってもよい。この図の例では、標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位に相補的な配列２’を用いて、これに標識核酸を導入する。あるいは、図２（ｂ）に示すように標識核酸中の繰り返し配列部分以外の部位に、標識１４を導入することによってもよい。図２（ｂ）の例では、標的核酸を固定化して繰り返し配列の配列数を測定する場合に適する。なお、図２に示す例では、ｎ個の繰り返し単位を持つ標的核酸からは、ｎ個分あるいは（ｎ−１）個分の信号強度となる。また、繰り返し配列単位に対する相補的な塩基鎖は、繰り返し配列単位の一部でなく全部であってもよい。
【００１９】
本発明を用いれば、例えば、インスリン遺伝子の近傍に存在するＶＮＴＲ配列には、繰り返し配列単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類のものが存在する。この場合であっても、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識を導入すれば、同時に繰り返し塩基配列の反復数を測定することができる。
【００２０】
［繰り返し塩基配列］
本発明で検出対象となる繰り返し塩基配列は、ゲノム中に存在する、繰り返し配列単位が数塩基から数十塩基であるＶＮＴＲ、繰り返し配列単位が２〜４塩基であるマイクロサテライト多型などである。
【００２１】
［標的核酸］
標的核酸は、繰り返し塩基配列を有するものであれば、特に制限はなく、細胞等から抽出されるゲノム遺伝子やゲノム遺伝子から酵素反応を利用して目的領域を増幅したものを用いてもよい。遺伝子の量を考慮すると、目的領域を増幅したものを用いるのが好ましい。目的領域の増幅方法は、特に制限はなく、公知の増幅方法を用いることができる。好ましい増幅方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ反応」という）である。ＰＣＲ反応を用いると、増幅効率が優れ、標識を導入することが容易になる。前記繰り返し塩基配列３を有する標的核酸４は、図３に示すように、プライマー５を用いて、ゲノム中のアニール部位６から、増幅される（塩基伸長部分）。使用されるプライマー５は、特に制限はなく、検出しようとする繰り返し塩基配列を増幅できるものであればよい。また、フォワードプライマー、リバースプライマーの２種類のプライマーを用いてもよい。さらに、プライマーは、２種以上の繰り返し配列を有する標的核酸を増幅できるものであってもよい。
【００２２】
［相補的塩基鎖］
本発明で用いる相補的塩基鎖とは、標的核酸中の繰り返し塩基配列とハイブリダイズして、二重鎖を形成できる核酸集合体をいう。相補的塩基鎖７、８は、図４に示すように、標的核酸４中の繰り返し塩基配列内の繰り返し配列単位９と結合し、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する。相補的塩基鎖７、８は、繰り返し配列単位９の全部または一部とハイブリダイズするものであればよい。また、相補的塩基鎖７は、１種類に限らず、２種以上用いてもよい。例えば、内部標準となる相補的塩基鎖８は、標的核酸４の繰り返し塩基配列以外の部分にハイブリダイズさせるものであってもよい。この場合には、繰り返し配列単位９にハイブリダイズする相補的塩基鎖７と、標的核酸の繰り返し塩基配列以外の部分にハイブリダイズする内部標準となる相補的塩基鎖８のハイブリダイズ効率が等しいことが要求される。相補的塩基鎖７、８の長さ・配列は、特に制限はないが、好ましくは６０℃以下で標的核酸とハイブリダイズし、９５℃で十分解離する特性を有する配列であればよい。二重鎖の安定性が向上するからである。また、相補的塩基鎖７、８は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの集合体であればよい。好ましい相補的塩基鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００２３】
［標識塩基の導入］
標識塩基１０の導入は、（１）非標識の相補的塩基鎖をハイブリダイズした後、標識塩基を酵素反応などによって伸長して塩基鎖末端に標識を導入する、（２）標識をした相補的塩基鎖を用いてハイブリダイズする、（３）標識塩基を有するプライマーを用いて、相補的塩基鎖を遺伝子増幅して標識を導入する（内部標準を導入する場合）、などの方法により行えばよい。具体的には、塩基伸長反応、塩基連結反応、核酸の３’末端を選択的に標識するターミナルデオキシクレオチジルトランスフェラーゼ反応などを用いる。より好ましくは、酵素ポリメラーゼを用いる伸長反応である。この反応を行う場合には、ジデオキシヌクレオチドを標識塩基として用いればよい。ポリメラーゼは、塩基選択性が高く、正確に標識を導入できる。この結果、繰り返し塩基配列の配列数の検出が正確に行える。標識塩基としてジデオキシヌクレオチドを用いると、１塩基のみが伸長される。この結果、より定量性の高い検出が可能となる。標識塩基への標識を付加するのは、標識が付加された塩基または相補的塩基鎖を用いる、あるいは塩基を伸長した後または相補的塩基鎖をハイブリダイズした後に標識を付加してもよい。
【００２４】
［標識の定量］
上記標識塩基は、繰り返し配列内および繰り返し配列外の塩基または塩基配列を、それぞれ異なる標識で検出できるものであればよい。使用できる標識としては、色素標識、放射線同位体標識、蛍光色素、りん光色素、発光色素など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、安全性・検出感度に優れ、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７などの公知の蛍光色素が挙げられる。これらの蛍光色素は、いずれの蛍光色素であっても使用できる。好ましいのは、構造の違いにより、認識が容易なシアニン系蛍光色素である。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いる。また、標識として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、シルバーインジウム硫化亜鉛（ＡｇＩｎＺｎＳ）、シリコン（Ｓｉ）などが挙げられる。異なる標識を用いる場合には、同一装置で測定できるものを用いるのが好ましい。また、標識を付加した塩基または塩基配列を相補的塩基鎖に結合させるためには、相補的塩基鎖に結合可能な構造が要求される。
【００２５】
［標識強度の測定］
標識強度は、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体から解離した相補的塩基鎖を用いて測定してもよく、繰り返し配列−相補的塩基鎖複合体の全体で測定してもよい。解離した相補的塩基鎖の標識強度は、溶液中で測定してもよく、固定化担体に固定化して測定してもよい。繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体の全体で標識強度を測定する場合には、固定化担体に固定化して測定する。複数の標識の信号を高密度に検出する場合には、ＤＮＡチップなどの固定化担体に固定化して測定するのが、好ましい。固定化担体への固定化は、図５に示すように、タグ配列を付加した相補的塩基鎖のタグ配列と、基板１２上に固定化した固定化担体１３とを、ハイブリダイズすることにより行う。タグ配列１１は、あらかじめ相補的塩基鎖７、８にタグ配列を付加した相補的塩基鎖を用いて複合体を形成してもよく、標識繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体から相補的塩基鎖を解離した後にタグ配列を付加してもよい。また、繰り返し配列−相補的塩基鎖複合体を固定化する場合にも、標的核酸にタグ配列を付加しておけば、同様に基板に固定化できる。
【００２６】
［固定化担体］
固定化担体は、基板やビーズなどの基材に固定化されていればよい。相補的塩基鎖を基板上に固定化すると、多検体の処理が可能となるので、好ましい。
【００２７】
固定化担体は、核酸集合体であればよい。核酸であれば、上記相補的塩基鎖あるいは標的核酸の一部（タグ配列を含む）と相補的に結合できるからである。固定化担体および上記相補的塩基鎖あるいは標的核酸のいずれかの一部（タグ配列を含む）は、天然型核酸であってもよく、非天然型核酸であってもよい。天然型核酸とは、自然界に存在する核酸を意味し、核酸に含まれる糖がすべてＤ体である核酸をいう。非天然型核酸とは、自然界には存在しない核酸を意味し、核酸に含まれる糖の少なくとも１つがＬ体である、あるいは糖の一部が修飾されている核酸をいう。特に、核酸に含まれる糖の少なくとも１つがＬ体である核酸をＬ型核酸という。非天然型核酸を用いると、選択性の高いハイブリダイゼーションが可能となる。
【００２８】
固定化担体およびこれに相補的に結合する配列（タグ配列を含む）において、天然型のＤ型の糖を有する核酸を用いると、検査したい配列以外の部分がハイブリダイゼーション（クロスハイブリ）を起こす場合がある。このため、ＤＮＡチップなどを用いて解析を行う場合に、固定化されている核酸の配列を決定するのに、細心の注意が必要であった。非天然型核酸の中には、天然型核酸とはハイブリダイゼーションをしないものがある。したがって、非天然型核酸を用いると、クロスハイブリを起こすおそれのないタグ配列の設計が可能となる。
【００２９】
固定化担体を基材に担持させる方法としては、特に制限されず、例えば以下に示すような公知の方法を用いることができる。例えば、ナイロンシートなどの上にＤＮＡをスポッターと呼ばれる装置を用いて点着することにより高密度に固定する。あるいは、特開平１−５０５１４４号公報などに記載されているように、オリゴ核酸を、スポッターと呼ばれる装置を用いて、スライドガラスなどの平坦な基板の上に、点着することもできる。また、特開２０００−５０８５４２号公報などに記載されているように、フォトリソグラフ法という半導体製造に用いられる技術を基にして、チップ上でオリゴ核酸を合成してもよい。さらに、特開２００５−２３３７０３号公報などに記載されているように、特定の構造を有するポリマー表面に官能基を生成させ、この官能基を介して、末端アミノ核酸を共有結合により固定化することとしてもよい。
【００３０】
［標識強度の測定］
担体上にハイブリダイズした標的核酸あるいは標識付加相補塩基鎖の標識の信号強度を測定することによって、繰り返し塩基配列数の定量を行う。検出器の仕様によらない定量性を実現するためには、２種以上の相補塩基鎖のハイブリダイゼーション効率の指標と標識を導入する際のポリメラーゼ伸長反応の標準化との指標となるように、濃度が既知である標識ポリヌクレオチド、あるいは濃度既知の標的核酸および相補的塩基鎖を添加して、信号強度を測定すればよい。
【００３１】
本発明の検出方法を用いると、標的核酸中から繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することができる。繰り返し塩基配列としては、繰り返し塩基配列を有するものであれば特に制限されず、例えば、インスリン発現調節に関する繰り返し塩基配列などが検出できる。インスリン遺伝子の近傍に存在するＶＮＴＲ配列には、繰り返し単位：５’−ＡＣＡｇｇｇｇＴｇＴｇｇｇｇ−３’など数種類のものが存在する。この場合に、繰り返し塩基配列に対応して異なる相補的塩基鎖を用い、異なる標識体を用いて相補的塩基鎖を標識して、ＶＮＴＲ配列を検出すれば、同時に異なる種類の繰り返し塩基配列の反復数を検出することができる。本発明を用いれば、標的核酸中に異なる種類の繰り返し塩基配列である繰り返し塩基配列を有する場合にも、繰り返し塩基配列の反復数を迅速にかつ定量的に検出することができる。
【００３２】
［ＳＮＰｓの検出］
本発明を用いれば、繰り返し塩基の反復数の測定とＳＮＰｓの測定を１つの固定化担体上で行うことができる。すなわち、本発明を用いれば、少量の検体量で、複数の標的核酸を用いて複数の標識化を同時に行うことができる。この結果、１つの固定化担体上で、繰り返し塩基配列の反復数の測定とＳＮＰｓタイプの検出とを行うことができる。また、繰り返し塩基配列とＳＮＰｓとが近傍に存在する場合には、１種類のプライマーセットから１種類の標的核酸を増幅し、多種類の相補的塩基鎖を用いて繰り返し塩基配列とＳＮＰｓとを同一の標的核酸から検出することができる。ＳＮＰｓの検出は、例えば、ＳＰＲ法を用いて、上記繰り返し塩基配列中に含まれる１塩基のミスマッチを検出することで、ＳＮＰｓを測定することができる（参考文献１：アレキサンダー ダブリュ．ペーターソン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｗ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、他２名、「表面でのミスマッチまたは部分マッチＤＮＡのハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｎ ｏｆ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｏｒ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ＤＮＡ ａｔ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」、ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国、アメリカン ケミカル ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、２００２年、第１２４巻、ｐ．１４６０１−１４６０７）。あるいは、塩基伸長法により塩基配列を決定して、ＳＮＰｓを測定する（参考文献２：トミ パスチネン（Ｔｏｍｉ Ｐａｓｔｉｎｅｎ）、他４名、「ミニシークエンシング：オリゴヌクレオチドアレイ上でのＤＮＡ分析と診断のための特別なツール（Ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ）」、ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年、第７巻、ｐ．６０６−６１４）。
【００３３】
［検出キット］
本発明の繰り返し塩基配列反復数測定キットは、繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、前記相補的塩基鎖を固定する固定化担体とを含んでいる。前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有していてもよい。前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含む、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖であってもよい。また、前記固定化担体が、すでに基板上に固定されている測定キットであってもよい。このような繰り返し塩基配列の反復数測定キットを用いることで、繰り返し塩基配列の反復数を容易に検出することができる。
【実施例】
【００３４】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
［ヒトＩＬ１ＲＮ（ＩＬ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）に含まれるＶＮＴＲの反復数検出］（相補的塩基鎖を解離させる場合）
（ポリヌクレオチドの合成）
ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ領域（配列番号１）を増幅するため、この配列番号１の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー、リバースプライマーを合成した。このプライマーは、反復数が２〜６回のいずれのＶＮＴＲを持つ領域であっても増幅可能である。また、繰り返し配列単位に対する相補的塩基鎖（配列番号２）を合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託してD型核酸を用いて行った。
配列番号２の相補的塩基鎖はＶＮＴＲの反復数検出用と同時に、内部標準検出用にも用いることが可能なように設計した。
【表１】
【００３６】
（ＰＣＲによるＶＮＴＲ配列を含む領域の増幅）
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）細胞およびＨＬ６０（ヒト前骨髄性白血病細胞由来）細胞を用いて、核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（（株）キアゲン製）で、ゲノムＤＮＡを抽出した。該ゲノムDNAに、下記試薬１を添加して、下記条件１により、ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ配列を増幅した。
＜試薬１＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
フォワードプライマー １５ ｐｍｏｌ
リバースプライマー １５ ｐｍｏｌ
緩衝液 ５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２ μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ） １ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 ５０ ｎｇ
＜増幅条件１＞
95℃・5分
95℃・30秒、55℃・30秒、68℃・30秒（35サイクル）
【００３７】
（アガロースゲル電気泳動による評価）
上記ＰＣＲ反応後増幅された部分の長さを電気泳動により評価した。電気泳動の条件は、２％アガロースゲルを、２０×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ（（株）インビトロジェン製）を２０倍希釈した展開液を用いて、１００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液で核酸を染色し、増幅した標的核酸の長さを求めた。その結果、ＨＥＫ２９３細胞由来の標的核酸断片は８５１ｂｐ／１０２３ｂｐに、ＨＬ６０細胞由来の標的核酸断片は１０２３ｂｐであった。このことから、それぞれの反復数は２回と４回のヘテロおよび４回のホモであると見積もられた。
【００３８】
（標識塩基を用いた標識塩基の取り込み）
上記ＰＣＲ反応物は、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を用いて精製した。該精製物に下記試薬２を添加して、下記条件２にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。ポリヌクレオチド３、４はそれぞれ、Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰが正常に取り込まれるかどうかを確認するためのポリヌクレオチドである。標準化用ポリヌクレオチド５、６はポリヌクレオチド３、４に結合し、３、４を鋳型として一塩基伸長反応させ、それぞれ標準化用ポリヌクレオチド５、６の末端を標識化し、反応が正常に進行していることを確認するためのポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチド３〜６の塩基配列は、それぞれ表２の配列番号３から６に対応する塩基配列である。
【００３９】
なお、標識塩基を取り込ませた後、サーマルサイクラーを用いて、９５℃に保ち、繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体を解離させた。この操作により標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖を得た。
＜試薬２＞
以下の試薬を含む20μｌ溶液を、それぞれのサンプルに対して調製した。
ＰＣＲ精製物（標的核酸） １００ ｎｇ
タグ配列付相補的塩基鎖 ２０．３ ｐｍｏｌ
１０ｍＭ Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＧＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＣＴＰ １ μｌ
緩衝液 ２ μｌ
Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８ Ｕ
ポリヌクレオチド３ １２．５ ｎｇ
ポリヌクレオチド４ １２．５ ｎｇ
標準化用ポリヌクレオチド５ ０．３ ｐｍｏｌ
標準化用ポリヌクレオチド６ ０．３ ｐｍｏｌ
＜反応条件２＞
95℃・2分
95℃・20秒、60℃・15秒（30サイクル）
95℃・5分
0℃・3分
【表２】
【００４０】
（ＤＮＡ固定化担体の作成）
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基板（コスモグラス押し出し板、厚さ：１ｍｍ、（株）クラレ製）を、温度６５℃の１０Ｎの水酸化ナトリウム溶液に１２時間浸漬した。このＰＭＭＡ基板を、純水、０．１Ｎの塩酸水溶液、純水の順で洗浄した。
【００４１】
各アンチタグ配列同士のクロスハイブリがないように設計した、５’末端がアミノ化された４種類のアンチタグ配列のD型核酸相補鎖を合成し、固定化担体（アンチタグ配列）とした。
【００４２】
合成した４種類のアンチタグ配列の相補鎖ＤＮＡをそれぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度に溶かした後、リン酸緩衝液（ｐＨ ５．５）を用いて０．０３ｎｍｏｌ／μＬに希釈した。また、基板表面のカルボン酸と固定化ＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるために、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を、終濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。
【００４３】
（ハイブリダイゼーション溶液の調製）
標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖と上記固定化されたアンチタグ配列とのハイブリダイズは以下のように行った。以下に用いる１５×ＳＳＣは、２０×ＳＳＣ（０．３Ｍ クエン酸ナトリウム二水和物、３Ｍ ＮａＣｌ溶液：シグマ社製）を純水にて３／４に希釈したものを意味する。
【００４４】
３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１５×ＳＳＣ、０．３ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１ｗｔ％サケ精子ＤＮＡ（上記各濃度は、いずれも終濃度）を含む水溶液を作製した。これと上記標識核酸が付加されたタグ配列付相補的塩基鎖溶液を３：１で混合し、このタグ配列と同一のタグ配列である、Ｃｙ３標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド７）またはＣｙ５標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド８）をそれぞれ０．０１ｐｍｏｌ添加し、全量が４０μＬとなるように調製した。
【００４５】
（固定化担体への固定化）
上記固定化担体が担持された基板上に、上記ハイブリダイゼーション溶液４０μＬを載せ、カバーグラスで覆い、４２℃で４時間インキュベートした後、カバーグラスを剥離して洗浄・乾燥した。
【００４６】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド７および８で検出される、Ｃｙ３およびＣｙ５の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表３に示す。
【表３】
【００４７】
表３から、ＨＥＫ２９３細胞由来の信号強度比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）は２であり、理論値との比較より、その繰り返し塩基配列の反復数は３回もしくは２回と４回のヘテロであると判断できる。同様に、ＨＬ６０細胞由来の信号強度比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）は３であり、理論値との比較より、その繰り返し数は４回であると判断できる。この表から、繰り返し配列単位−相補的鎖複合体形成後に、相補的塩基鎖に標識核酸を導入すると、繰り返し塩基配列の反復数が、正確に定量できることがわかった。
【００４８】
（実施例２）
［標識付プライマーを用いたヒトＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲの反復数検出］（標識核酸を固定して分析する場合）
（ポリヌクレオチドの合成）
ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ領域（配列番号１）を増幅するため、この配列番号１の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー、リバースプライマーおよび繰り返し配列単位に対する相補的塩基配列ポリヌクレオチド（配列番号２）を合成した。
【００４９】
フォワードプライマーには非天然型核酸（Ｌ型核酸）を用いたタグ配列を付加した。また、フォワードプライマーの５’末端には、Ｃｙ３標識を導入した。リバースプライマーは、Ｄ型核酸で合成した。このプライマーは、反復数が２〜６回のいずれのＶＮＴＲを持つ領域であっても増幅可能である。
【００５０】
相補的塩基は、５’末端にＣｙ５標識を導入した。
【００５１】
Ｌ型核酸を含むＤＮＡの合成は、ＤＮＡ／ＲＮＡ ＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。また、Ｌ型核酸として、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ｃｙｔｉｄｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｉｂｕ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ Ｔｈｍｉｄｉｎｅ ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を、Ｄ型核酸としてｄｅｏｘｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ｄｅｏｘｙ Ｃｙｔｉｄｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ｄｅｏｘｙ Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｉｂｕ）ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、ｄｅｏｘｙ Ｔｈｍｉｄｉｎｅ ＣＥＤ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。
【００５２】
リバースプライマーおよび、５’末端にＣｙ３標識を導入したフォワードプライマー、５’末端にＣｙ５標識を導入した相補的塩基鎖は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。
【００５３】
（ＰＣＲによるＶＮＴＲ配列を含む領域の増幅）
実施例１と同様に抽出したヒトゲノムＤＮＡに、下記試薬３を添加して、上記条件１により、ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ配列を増幅した。
＜試薬３＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
Ｃｙ３標識タグ付フォワードプライマー ２０ ｐｍｏｌ
リバースプライマー ０．２ ｐｍｏｌ
緩衝液 ５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２ μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ） １ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 ５０ ｎｇ
【００５４】
さらに、実施例１と同様に電気泳動を行った。泳動後、反復数が２回である標的核酸を抽出した。
【００５５】
（繰り返し塩基配列―相補鎖複合体の形成）
上記ＰＣＲ反応物はＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を用いて精製した。
【００５６】
精製した標的核酸１００ngに、１００μＭに溶解した前記Ｃｙ５標識相補的塩基鎖を１μＬ添加し、全量が２０μＬとなるように、純水で希釈した５×ＳＳＣを加えた。この溶液を９５℃、５分インキュベート後、氷上で５分静置した。
【００５７】
（固定化担体への固定化）
タグ配列に相補的な配列を、Ｌ型核酸を用いて合成した。また、得られた各タグ配列に相補的な配列は５’末端にアミノ基を付加しており、実施例１に記載した手法を用いて基板に固定化した。
【００５８】
前記繰り返し塩基配列−相補的塩基鎖複合体溶液１０μＬを、実施例１に記載したハイブリダイゼーション試薬３０μＬ、Ｃｙ３標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド７）またはＣｙ５標識ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド８）をそれぞれ０．０１ｐｍｏｌ添加し、混合した。
【００５９】
Ｌ型のタグ配列に相補的な配列を固定化した基板に、上記ハイブリダイゼーション溶液を添加し、実施例１に記載した手法で固定化を行った。
【００６０】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド７および８で検出される、Ｃｙ３およびＣｙ５の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表４に示す。
【表４】
【００６１】
表４より、標識付プライマーを用いた標的核酸−相補的塩基鎖複合体による反復数の測定においても、繰り返し塩基配列の反復数に伴った蛍光強度比の増加が測定されることが示された。また、Ｌ型核酸を用いたタグ配列であっても、Ｄ型と同程度の感度が得られることがわかった。
【００６２】
（実施例３）
［ＶＮＴＲ反復数とＳＮＰｓの同時検出］
（ポリヌクレオチドの合成）
ＳＮＰｓ検出用ポリヌクレオチドとして、４箇所のＳＮＰｓ領域が増幅可能なプライマーをそれぞれ合成した。また、各ＳＮＰｓの検出には公知の手法である一塩基伸長法（参考文献２）を用い、この手法に適したポリヌクレオチドを合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。
【００６３】
それぞれのプライマーおよび繰り返し塩基配列の配列数測定用相補的塩基鎖はＤ型核酸によって合成し、さらに相補的塩基鎖にはタグ配列間のクロスハイブリがないように設計されたＤ型核酸タグ配列を付加した。
【００６４】
（ＰＣＲによるＳＮＰｓを含む領域の増幅）
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）細胞のゲノムＤＮＡを実施例１に記載した手法で抽出した。下記試薬４を添加して、実施例１に記載の条件１により、ＩＬ１ＲＮに含まれるＶＮＴＲ配列および、４箇所のＳＮＰｓを含む領域をそれぞれに増幅した。
＜試薬４＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製し、計５本の反応液を得た。
フォワードプライマー １５ ｐｍｏｌ
リバースプライマー １５ ｐｍｏｌ
緩衝液 ５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５ μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２ μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ） １ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 ５０ ｎｇ
【００６５】
（標識塩基を用いた相補塩基の取り込み）
上記ＰＣＲ反応物はＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を用いてそれぞれ精製した。
【００６６】
得られた精製物に下記試薬５を添加して、実施例１に記載の条件２にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。
＜試薬５＞
以下の試薬を含む20μｌ溶液を、それぞれのサンプルに対して調製し、計５本の反応液を得た。
ＰＣＲ精製物（標的核酸） １００ ｎｇ
タグ付相補的塩基鎖 ０．３ ｐｍｏｌ
１０ｍＭ Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＧＴＰ １ μｌ
１０ｍＭ ｄｄＣＴＰ １ μｌ
緩衝液 ２ μｌ
Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８ Ｕ
ポリヌクレオチド３ １２．５ ｎｇ
ポリヌクレオチド４ １２．５ ｎｇ
標準化用ポリヌクレオチド５ ０．３ ｐｍｏｌ
標準化用ポリヌクレオチド６ ０．３ ｐｍｏｌ
【００６７】
（固定化担体への固定化）
５’末端にアミノ基を付加したＤ型核酸により、タグ配列に相補的な鎖を合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託した。次に、実施例１に記載の手法を用いて、これらのタグ配列に相補的な鎖を固定化した基板を作製した。
【００６８】
上記反応液を各サンプル２μＬずつ混合し、１０μＬの標識ポリヌクレオチド溶液を調製し、これに実施例１に記載したハイブリダイゼーション試薬３０μＬと、ポリヌクレオチド７および８をそれぞれ０．０１ｐｍｏｌ混合した、ハイブリダイゼーション溶液を作製した。
【００６９】
上記ＤＮＡ固定化基板に、上記ハイブリダイゼーション溶液を添加し、実施例１に記載した手法で固定化を行った。
【００７０】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度を、ポリヌクレオチド７および８で検出される、Ｃｙ３およびＣｙ５の信号強度が同程度になるように調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表５に示す。
【表５】
【００７１】
ＳＮＰタイプは、相補的な標識塩基との相補的に結合する。表５の結果より、ＳＮＰ１および、ＳＮＰ２のＳＮＰタイプはＡ／Ｔのヘテロ、ＳＮＰ３および、ＳＮＰ４のＳＮＰタイプはＡのホモであると判断される。この結果は、公知の手法であるシークエンス法の結果と整合性を得た。さらに、ＶＮＴＲ反復数の判断においても、前述の結果と同様に蛍光強度比が2となり、その反復数は３回もしくは２回と４回のヘテロと判別できた。このことから、タグ配列を固定化した固定化担体を用いることで、ＳＮＰｓとＶＮＴＲ配列の同時検出が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本発明の原理を説明するための模式図である。
【図２】図２は、標識核酸の繰り返し配列以外の部位に内部標準の導入方法を説明するための模式図である。
【図３】図３は、ＰＣＲ産物を用いた標的核酸の調製法を説明するための概念図である。
【図４】図４は、標的核酸中の繰り返し配列単位に、相補的塩基鎖が結合する機構を説明する概念図である。
【図５】図５は、固定化担体を用いて標識核酸を検出・定量する機構を説明する概念図である
【符号の説明】
【００７３】
１ 繰り返し配列単位
２ 相補的塩基鎖
３ 繰り返し塩基配列
４ 標的核酸
５ プライマー
６ アニール部位
７、８ 相補的塩基鎖
９ 繰り返し塩基配列
１０ 標識塩基
１１ タグ配列
１２ 基板
１３ 固定化担体
１４ 標識
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第１の工程と、
前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とからそれぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識
の標識量の量比を求める第２の工程と
を含む、繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項２】
前記第１の工程の前に、
繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含む、請求項１に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項３】
前記第１の工程の前に、
プライマーを用いて繰り返し配列を有する標的核酸を増幅する工程と
前記繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含む、請求項１に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項４】
前記プライマーには、標識が導入されている、請求項３に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項５】
前記第1の工程が、前記ハイブリダイズした相補的塩基鎖の末端に標識塩基を伸長するものである、請求項２ないし４のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項６】
標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせる、請求項２ないし４のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項７】
さらに、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列以外の部分にハイブリダイズさせる、請求項６に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項８】
前記標識塩基が付加された相補的塩基鎖を、前記複合体から解離させた後に、
前記相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定する、請求項５または６に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項９】
前記繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成された標的核酸の相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定する、請求項４ないし７のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１０】
前記相補的塩基鎖または前記標的核酸は、タグ配列を有する、請求項２ないし９のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１１】
前記タグ配列は、非天然型核酸を含む、請求項１０に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１２】
繰り返し塩基配列の反復数の測定と、一塩基多型の検出とを同時に行う、請求項１ないし１１のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１３】
繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、
前記標的核酸または相補的塩基鎖を固定する固定化担体と
を含む、繰り返し塩基配列の反復数測定キット。
【請求項１４】
前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有する、請求項１３に記載の繰り返し塩基配列の反復数測定キット。
【請求項１５】
さらに、前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含む、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖である、請求項１３または１４に記載の繰り返し塩基配列の反復数測定キット。
【請求項１】
繰り返し塩基配列内の塩基配列と繰り返し塩基配列外の塩基配列とのそれぞれに、標識を導入する第１の工程と、
前記標識された繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列とからそれぞれに導入された標識の標識量を測定し、測定した標識量から繰り返し塩基配列内の塩基配列に導入された標識と繰り返し塩基配列外の塩基配列に導入された標識
の標識量の量比を求める第２の工程と
を含む、繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項２】
前記第１の工程の前に、
繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含む、請求項１に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項３】
前記第１の工程の前に、
プライマーを用いて繰り返し配列を有する標的核酸を増幅する工程と
前記繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的な塩基鎖をハイブリダイズさせ、繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成する工程を含む、請求項１に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項４】
前記プライマーには、標識が導入されている、請求項３に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項５】
前記第1の工程が、前記ハイブリダイズした相補的塩基鎖の末端に標識塩基を伸長するものである、請求項２ないし４のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項６】
標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列単位にハイブリダイズさせる、請求項２ないし４のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項７】
さらに、標識塩基が付加されている相補的な塩基鎖を用いて、標的核酸の繰り返し配列以外の部分にハイブリダイズさせる、請求項６に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項８】
前記標識塩基が付加された相補的塩基鎖を、前記複合体から解離させた後に、
前記相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定する、請求項５または６に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項９】
前記繰り返し配列単位−相補的塩基鎖複合体を形成された標的核酸の相補的塩基鎖に付加された標識塩基の量を測定することにより、繰り返し塩基配列内の塩基配列と標識された繰り返し塩基配列外の塩基配列のそれぞれに導入された標識の標識量を測定する、請求項４ないし７のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１０】
前記相補的塩基鎖または前記標的核酸は、タグ配列を有する、請求項２ないし９のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１１】
前記タグ配列は、非天然型核酸を含む、請求項１０に記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１２】
繰り返し塩基配列の反復数の測定と、一塩基多型の検出とを同時に行う、請求項１ないし１１のいずれかに記載の繰り返し塩基配列の反復数の測定方法。
【請求項１３】
繰り返し塩基配列を有する標的核酸の繰り返し配列単位に相補的に結合する相補的塩基鎖と、
前記標的核酸または相補的塩基鎖を固定する固定化担体と
を含む、繰り返し塩基配列の反復数測定キット。
【請求項１４】
前記相補的塩基鎖は、タグ配列を有する、請求項１３に記載の繰り返し塩基配列の反復数測定キット。
【請求項１５】
さらに、前記相補的塩基鎖に標識核酸を延伸するための標識核酸を含む、あるいは前記相補的塩基鎖は、標識核酸が付加されている相補的塩基鎖である、請求項１３または１４に記載の繰り返し塩基配列の反復数測定キット。
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１９３９８４（Ｐ２００８−１９３９８４Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４３３９（Ｐ２００７−３４３３９）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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