置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド
【課題】標識したポリヌクレオチドの提供。
【解決手段】以下の構造を有する置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドが開示されている：ここで、Ｘは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α−アミノ酸、及び４−アミノ−２−ブチン酸からなる群から選択される。Ｒ１及びＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；Ｒ３は、−Ｈ及び低級アルキルからなる群から選択される。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である。さらに、プライマー伸長方法が提供され、これは、上記Ｘ置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを使用し、そして、上記Ｘ置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを含有するポリヌクレオチドが提供される。
【解決手段】以下の構造を有する置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドが開示されている：ここで、Ｘは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α−アミノ酸、及び４−アミノ−２−ブチン酸からなる群から選択される。Ｒ１及びＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；Ｒ３は、−Ｈ及び低級アルキルからなる群から選択される。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である。さらに、プライマー伸長方法が提供され、これは、上記Ｘ置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを使用し、そして、上記Ｘ置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを含有するポリヌクレオチドが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素の基質として有用なヌクレオチド化合物、プライマー伸長反応でこのようなヌクレオチド化合物を使用する方法、およびこのようなヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】
【０００４】
【数２】
【背景技術】
【０００５】
（背景）
核酸配列決定は、現代の生物学および生物工学において必須の重要な技術となっており、基本的な生物研究から薬剤の発見や臨床医学までの範囲の分野に関連した情報を提供する。大容量のＤＮＡ配列データが収集されているので、核酸配列決定法のスループットを高めると共にコストを下げるために、自動化技術が開発されている（Ｓｍｉｔｈ；Ｃｏｎｎｅｌｌ；Ｔｒａｉｎｏｒ）。
【０００６】
好ましい自動化核酸配列決定法は、Ｓａｎｇｅｒにより開発された酵素複製技術に基づいている（Ｓａｎｇｅｒ）。Ｓａｎｇｅｒの方法では、一本鎖テンプレート核酸の配列は、一組のポリヌクレオチドフラグメントを合成するための核酸ポリメラーゼを用いて決定され、ここで、このフラグメントは、（ｉ）このテンプレート配列に対する配列相補性を有し、（ｉｉ）単一ヌクレオチドにより長さが変わり、そして（ｉｉｉ）公知のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）での５’−末端終止を有する。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定されるテンプレート核酸の３’−末端にアニールされ、このプライマーの３’−末端は、相補的ポリヌクレオチドフラグメントのポリメラーゼ媒介重合に対する開始部位として、役立つ。この酵素的重合工程は、このテンプレート−プライマーハイブリッドと４個の天然デオキシヌクレオチド（「ｄＮＴＰ」）、核酸ポリメラーゼ酵素および２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（「ｄｄＮＴＰ」）「ターミネーター」とを組み合わせることにより、行われる。このターミネーターの組み込みは、この３’−末端の水酸基を欠いたフラグメントを形成し、それゆえ、このポリメラーゼによって、さらに伸長され得ない（すなわち、このフラグメントは、「終止されている」）。組込みのためのｄｄＮＴＰおよびその対応ｄＮＴＰの間の競合の結果、異なるサイズのフラグメントが分配され、各フラグメントは、この反応で使用される特定のターミネーターで終止される。このテンプレート核酸の完全な配列を発見するために、４個の並発反応が行われ、各反応は、異なるｄｄＮＴＰターミネーターを使用する。これらのフラグメントのサイズ分配を決定するために、これらのフラグメントは、サイズが異なるフラグメントを単一ヌクレオチドによって分割するように、電気泳動により分離される。
【０００７】
古典的なＳａｎｇｅｒ法の現代版変形法では、このヌクレオチドターミネーターは、蛍光色素で標識され（Ｐｒｏｂｅｒ；Ｈｏｂｂｓ）、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ酵素が使用される（Ｍｕｒｒａｙ）。色素標識したターミネーターを使用することにより、以下のいくつかの利点が得られる：（ｉ）放射性同位体の貯蔵、使用および廃棄に付随した問題がなくなる；（ｉｉ）色素標識したプライマーを合成する必要性がなくなる；および（ｉｉｉ）各Ａ、Ｇ、ＣまたはＴヌクレオチド用に異なる色素標識を使用するとき、単一の管にて、４個の反応の全てを同時に行うことができる。熱安定性のポリメラーゼ酵素を使用することにより、（ｉ）この重合反応を高温で行うことが可能になり、それにより、このテンプレートのいずれかの二次構造が分断され、その結果、より少ない配列依存性アーチファクトが得られ、そして、（ｉｉ）この配列決定反応が熱サイクルでき、それにより、生成する伸長生成物の量を線形的に増幅させるのに役立ち、それゆえ、配列を得るのに必要なＤＮＡテンプレートの量が低減される。
【０００８】
Ｓａｎｇｅｒ配列決定法のこれらの現代版変形法は、効果的であることが証明されているものの、それらの性能および経済性を最適化することに関して、いくつかの問題点が残っている。Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定法で熱安定性のポリメラーゼ酵素と組み合わせて現在入手できる色素標識ターミネーターを使用するとき、特に、フルオレセイン型色素標識の場合に遭遇する１つの問題点には、５０：１の比まで、非標識ｄＮＴＰよりも大過剰の色素標識ターミネーターが必要なことがある。この大過剰の標識ターミネーターにより、この電気泳動分離工程を行う前に、この配列決定反応生成物を精製する必要が生じる。この清浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）工程は、組み込まれていない標識化ターミネーター種および真正の配列決定フラグメントの同時移入により起こる干渉を回避するために、必要である。典型的な清浄化方法には、エタノール沈殿またはクロマトグラフィー分離が含まれる（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。このような清浄化工程は、完全に自動化した配列決定系（ここで、その配列決定反応生成物は、電気泳動分離プロセスに直接移される）を開発する仕事を著しく複雑にする。
【０００９】
Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定法で熱安定性のポリメラーゼと組み合わせて現在入手できる色素標識ターミネーターを使用するとき遭遇する第二の問題点には、これらの反応生成物を電気泳動により分離し蛍光検出を用いて検出するとき、ピーク高さの不均一な分布が得られることがある。このような不均一なピーク高さは、自動化した配列測定およびヘテロ接合体の検出を実質的に信頼できないものとするために、不利である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本発明は、プライマー伸長反応（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応またはＰＣＲ反応）において、鎖終止ヌクレオチドおよび鎖伸長ヌクレオチドとして有用な、新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの本発明者らによる発見に関する。
【００１１】
本発明の目的は、標識した鎖終止ヌクレオチドを形成するのに使用できるヌクレオチドを提供することにある。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖終止ヌクレオチドを提供することにある。
【００１３】
本発明のなおさらなる目的は、蛍光標識を含む鎖終止ヌクレオチドであって、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において、非標識の鎖終止ヌクレオチドよりも低い過剰濃度のこのような標識した鎖終止ヌクレオチドを必要とするものを提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において、ピーク高さのより均一な分布が得られる標識した鎖終止ヌクレオチドを提供することにある。
【００１５】
本発明の目的は、標識した鎖伸長ヌクレオチドを形成するのに使用できるヌクレオチドを提供することにある。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖伸長ヌクレオチドを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、標識したポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを使用するプライマー伸長反応を包含する方法を提供することにある。
【００１９】
第一の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、以下の構造を有するヌクレオシド化合物により、達成される：
【００２０】
【化１】
ここで、Ｘは、
【００２１】
【化２】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００２２】
【化３】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００２３】
【化４】
および
【００２４】
【化５】
からなる群から選択される；そしてＲ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される。Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基であり、ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１位にて結合しており、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このプリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、この７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このピリミジンの５位に結合している。Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；Ｗ２は、−ＯＨ、またはこのヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そしてＷ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の第一の局面の第一の好ましい実施態様では、Ｒ１およびＲ２の１個は、標識であり、より好ましくは、この標識は、フルオレセイン型色素、ローダミン型色素またはＦＬＡＮ型色素である。
【００２６】
本発明の第一の局面の第二の好ましい実施態様では、Ｗ１は、−Ｈである；Ｗ２は、−ＯＨ、またはその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そしてＷ３は、−Ｐ３Ｏ１０である。より好ましくは、Ｗ２は、−ＯＨ、−Ｈ、アジド、アミノ、フルオロおよびメトキシからなる群から選択される。
【００２７】
本発明の第一の局面の第三の好ましい実施態様では、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニンおよび７−デアザグアノシンからなる群から選択される。
【００２８】
本発明の第一の局面の第四の好ましい実施態様では、Ｘは、
【００２９】
【化６】
であり、ｎ＝１であり、そしてΦ基は、パラ立体配置にある。
【００３０】
第二の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、プライマー伸長反応を行う方法により達成され、この方法は、テンプレート核酸を提供する工程；このテンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールする工程；およびこのプライマーを伸長するために、このプライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加する工程を包含し、このプライマー伸長試薬は、上記の本発明の第一局面のヌクレオシド化合物を含有する。
【００３１】
第三の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、上記の本発明の第一の局面のヌクレオシド化合物を含有するポリヌクレオチドにより、達成される。
【００３２】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 以下の構造を有するヌクレオシド化合物：
【００３３】
【化１８】
ここで、Ｘは、
【００３４】
【化１９】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００３５】
【化２０】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００３６】
【化２１】
および
【００３７】
【化２２】
からなる群から選択される；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのＮ１位にて結合している；そして
ここで、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの５位に結合している；
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；
Ｗ２は、−ＯＨ、または該ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そして
Ｗ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
（項目２） Ｒ１およびＲ２の１個が、標識である、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目３） 前記標識が、フルオレセイン型色素である、項目２に記載のヌクレオシド化合物。
（項目４） 前記標識が、ローダミン型色素およびＦＬＡＮ型色素からなる群から選択される、項目２に記載のヌクレオシド化合物。
（項目５） Ｗ１が、−Ｈであり；
Ｗ２が、−ＯＨ、または前記ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分であり；そして
Ｗ３が、−Ｐ３Ｏ１０である、
項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目６） Ｗ２が、−ＯＨ、−Ｈ、アジド、アミノ、ハロ、およびメトキシからなる群から選択される、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目７） Ｗ２が、−Ｈおよびフルオロからなる群から選択される、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目８） Ｂが、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンからなる群から選択される、項目１に記載のヌクレオシド。
（項目９） Ｘが、パラ立体配置を有するアルキルアミノ安息香酸であり、そしてｎ＝１である、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目１０） プライマー伸長反応を行う方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
テンプレート核酸を提供すること；
該テンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールすること；および
該プライマーを伸長するために、該プライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加することであって、該プライマー伸長試薬は、以下の構造を有するヌクレオシド化合物を含有する：
【００３８】
【化２３】
ここで、Ｘは、
【００３９】
【化２４】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４０】
【化２５】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４１】
【化２６】
および
【００４２】
【化２７】
からなる群から選択される；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのＮ１位にて結合している；そして
ここで、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの５位に結合している；
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；
Ｗ２は、−ＯＨ、または該ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そして
Ｗ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
（項目１１） Ｒ１およびＲ２が、標識であり、そして他が、−Ｈである、項目１０に記載の方法。
（項目１２） 以下の構造を有するヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチド：
【００４３】
【化２８】
ここで、Ｘは、
【００４４】
【化２９】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４５】
【化３０】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４６】
【化３１】
および
【００４７】
【化３２】
からなる群から選択される；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのＮ１位にて結合している；そして
ここで、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの５位に結合している；
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；
Ｗ２は、−ＯＨ、または該ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そして
Ｗ３は、−ＰＯ４、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴定アッセイから得た結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴定アッセイから得た結果を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴定アッセイから得た結果を示す。
【図２】図２は、２−フタルイミドエタノール（３）および３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン（５）の合成を示す。
【図３】図３は、５−｛３−（２−フタルアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（７）および５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（８）の合成を示す。
【図４】図４は、５−｛３−（２’−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン一リン酸（１０）の合成を示す。
【図５】図５は、５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１２）および５−｛３−（２−アミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１３）の合成を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）、およびトリフルオロアセトアミドブト−２−イノイックＮＨＳエステル（２１）の合成を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）、およびトリフルオロアセトアミドブト−２−イノイックＮＨＳエステル（２１）の合成を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）、およびトリフルオロアセトアミドブト−２−イノイックＮＨＳエステル（２１）の合成を示す。
【図７】図７は、５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノアセチル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２３）の合成を示す。
【図８】図８は、５−［３−｛２−［Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２５）の合成を示す。
【図９】図９は、５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノ−ブト−２−イノイック）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２７）の合成を示す。
【図１０】図１０は、３個の異なる色素ターミネーター配列決定反応から得た結果を示し、ここで、各反応は、色素をターミネーターに結合する異なるリンカーを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施態様に対して、詳細な参照がなされ、その実施例は、添付の図面に例示されている。本発明は、その好ましい実施態様に関連して記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施態様に限定する意図はないことが分かる。反対に、本発明は、その代替、改変および等価物を含むことを意図しており、これらは、添付の請求の範囲で規定される本発明の範囲内に含まれ得る。
【００５０】
一般に、本発明は、ポリメラーゼ酵素に対して基質として有用な新規な種類の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド化合物、このようなヌクレオシド化合物を含むポリヌクレオチド、およびプライマー伸長反応においてこのようなヌクレオシド化合物を使用する方法を包含する。本発明の化合物は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法で使用する色素標識ヌクレオチド鎖終止試薬の調製、およびプライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲ）を含む方法で使用する色素標識ヌクレオチド鎖伸長試薬の調製において、特定の用途が見出されている。
【００５１】
本発明は、一部には、目的の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素用の特に良好な基質であること、すなわち、（ｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応にて、現在入手できる標識ターミネーターを使用したときに必要なものと比較して、著しく低いモル過剰しか必要としないこと、および（ｉｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにて、現在入手できる標識ターミネーターを使用したときに見られるものと比較して、ピーク高さのより均一な分布が見られることの発見に基づいている。
【００５２】
Ｉ．定義
他に述べられていなければ、本明細書中で使用する以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図している：
「低級アルキル」との用語は、１個〜８個の炭素原子を含有する直鎖および分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなど）を表わす。
【００５３】
「標識」との用語は、本発明のヌクレオシドに結合したとき、このようなヌクレオシドおよびこのようなヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを、公知の検出手段を用いて検出可能にする部分を意味する。例示の標識には、蛍光体、発色団、放射性同位元素、スピン標識、酵素標識、化学発光標識など（これらは、適切な検出器による標識化合物の直接的な検出を可能にする）、またはリガンド、例えば、抗原またはビオチン（これは、検出可能な抗リガンド（例えば、標識抗体またはアビジン）に、高い親和性で特異的に結合できる）が挙げられる。好ましくは、これらの標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン型色素またはローダミン型色素（Ｌｅｅ；Ｍｅｎｃｈｅｎ））である。
【００５４】
「ヌクレオシド」との用語は、２’−デオキシ形状および２’−ヒドロキシル形状を含めて、その１’位でペントースに結合したプリン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物を意味する（Ｓｔｒｙｅｒ）。本明細書中で使用する「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）を意味し、ここで、最も一般的なエステル化部位は、このペントースのＣ−５位に結合した水酸基である。多くの場合、本発明の開示では、ヌクレオシドとの用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を包含することを意図している。ヌクレオシドに関する「アナログ」には、例えば、他の文献で記述のように（Ｓｃｈｅｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ １９９１）、変性塩基部分、変性糖部分および／または変性リン酸エステル部分を有する合成アナログが挙げられる。
【００５５】
本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」との用語は、天然ヌクレオチドモノマーまたはそれらのアナログの線状ポリマーを意味し、これには、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形状などが含まれる。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結により連結されており、本明細書中で使用する「ホスホジエステル連結」との用語は、ホスホジエステル結合またはそれらのホスフェートアナログを含む結合を意味し、これらには、会合した対イオンが存在するなら、このような対イオン（例えば、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）を含む。このポリヌクレオチドの大きさは、典型的には、数個（例えば、８個〜４０個）のモノマー単位から、数千個のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような一連の文字で表わされるときは、このヌクレオチドは、他に指示がなければ、５’→３’の順序で左から右に配列されており、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表わし、「Ｃ」は、デオキシシチジンを表わし、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表わし、そして「Ｔ」は、チミジンを表わすことが分かる。
【００５６】
「ホスフェートアナログ」との用語は、ホスフェートのアナログであって、ここでそのリン原子が＋５酸化状態であり、そしてその酸素原子の１個またはそれ以上が非酸素部分で置き換えられているものを意味し、例示のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなど（会合した対イオン（例えば、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）があれば、このような対イオンを含めて）が挙げられる。
【００５７】
本明細書中で使用される「プロパルギルアミドリンカー」との用語は、以下の構造を有するリンカーを意味する：
【００５８】
【化７】
また、「プロパルギルエトキシアミドリンカー」との用語は、以下の構造を有するリンカーを意味する：
【００５９】
【化８】
ここで、上記構造のそれぞれについて、そのアセチレンの終止末端は、ヌクレオチド塩基に結合しており、そしてそのアミド窒素は、標識との好都合な連結を介して、結合される。
【００６０】
本発明の「Ｘ」部分に関連して、「アミノアルカン酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６１】
【化９】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である；「アルキルアミノ安息香酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６２】
【化１０】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である；「α−アミノ酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６３】
【化１１】
そして「４−アミノ−２−ブチン酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６４】
【化１２】
ここで、上記構造では、Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基または標識であり、そしてＲ４は、アミノ酸側鎖（天然（Ｓｔｒｙｅｒ）または合成のいずれか）である。
【００６５】
「プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのヌクレオ塩基に結合したプロパルギルエトキシアミドリンカーを含むヌクレオチドを意味する。
【００６６】
「フルオレセイン型色素」との用語は、以下の縮合三環系を含有する種類のキサンテン色素分子を意味する：
【００６７】
【化１３】
ここで、各デオキシ環位置では、広範囲の置換が可能である。フルオレセイン型色素の特に好ましいサブセットには、４，７−ジクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ）が挙げられる。ＤＮＡ配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオレセイン型色素の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−（および６）カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、および５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）が包含される。多くの場合、−１または−２との名称は、特定の色素（例えば、ＨＥＸ−１）の略語の後で、付けられる。この「−１」および「−２」との名称は、使用する特定の色素異性体を意味する。これらの１および２異性体は、Ｃ−８カラムおよび溶出勾配（１５％アセトニトリル／８５％ ０．１ Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム〜３５％アセトニトリル／６５％ ０．１ Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用する逆相クロマトグラフィー分離系にて、遊離色素の溶出順序（この１異性体が最初に溶出する）により、定義される。
【００６８】
「ローダミン型色素」との用語は、以下の縮合三環系を含有する種類のキサンテン色素分子を意味する：
【００６９】
【化１４】
ここで、好ましくは、Ｙ１〜Ｙ４は、別個に、水素または低級アルキルであり、または一緒になって、Ｙ１およびＲ２は、プロパノであり、そしてＹ２およびＲ１は、プロパノであるか、または一緒になって、Ｙ３およびＲ３は、プロパノであり、そしてＹ４およびＲ４は、プロパノである。Ｒ１〜Ｒ４位置を含めた各デオキシ環位置にて、広範囲の置換が可能である。ヌクレオシド標識として有用な例示のローダミン型色素には、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ジクロロテトラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）などが挙げられる（Ｂｅｒｇｏｔ；Ｌｅｅ）。
【００７０】
本明細書中で使用する「ＦＬＡＮ色素」との用語は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン色素化合物を意味する：
【００７１】
【化１５】
ここで、Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムまたはアミンである。Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基、またはそれらの組合せである。そして、Ｒ９は、アセチレン、アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せ、以下の構造を有する置換フェニルである：
【００７２】
【化１６】
ここで、Ｘ１は、カルボン酸またはスルホン酸である；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素または低級アルキルである；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸または連結基である（Ｂｅｎｓｏｎ）。
【００７３】
本明細書中で使用する「プライマー伸長試薬」との用語は、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介の伸長を起こすのに必要な成分を含有する試薬を意味する。プライマー伸長試薬には、以下が挙げられる：（ｉ）ポリメラーゼ酵素、例えば、熱安定性ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）；（ｉｉ）緩衝液；（ｉｉｉ）鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ジオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザデオキシグアノシン５’−三リン酸、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシチミジン５’−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸）；および必要に応じて、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応の場合に、（ｉｖ）１個またはそれ以上の鎖終止ヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザジデオキシグアノシン５’−三リン酸、ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、ジデオキチミジン５’−三リン酸、およびジデオキシシチジン５’−三リン酸）。
【００７４】
「テンプレート核酸」とは、単一鎖形状で提示できる任意の核酸であって、プライマーオリゴヌクレオチドでアニールできるものを意味する。例示のテンプレート核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、このＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに特定すると、テンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応に由来のＤＮＡ増幅生成物などであり得る。テンプレートＤＮＡの調製方法は、他の文献に見られ得る（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ）。
【００７５】
ＩＩ．置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物を包含する。（本開示全体で提供された全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造およびプロトン化状態を含むことを意図することに留意のこと）。
【００７６】
【化１７】
式Ｉの構造では、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基であり、好ましい実施態様では、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニンおよび７−デアザグアノシンからなる群から選択される。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、このヌクレオチドの糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合され、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１位にて結合される。Ｂがプリンのとき、隣接三重結合炭素は、このプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンのとき、隣接三重結合炭素は、７−デアザプリンの７位に結合され、Ｂがピリミジンのとき、隣接三重結合炭素は、このピリミジンの５位に結合される。
【００７７】
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨから選択される。Ｗ１が−ＯＨであるとき、このヌクレオシドは、リボヌクレオチドであり、そしてＷ１が−Ｈであるとき、このヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオチドである。
【００７８】
Ｗ２は、−ＯＨ、またはこのヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である。この機能に有用な好ましい部分には、−Ｈ、アジド、アミノ、ハロ、メトキシなどが挙げられる。特に好ましい実施態様では、Ｗ２は、−Ｈまたはフルオロである。
【００７９】
Ｗ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。ポリヌクレオチドの酵素的合成に有用な好ましい実施態様では、Ｗ３は−Ｐ３Ｏ１０である。
【００８０】
Ｘは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α−アミノ酸、および４−アミノ−２−ブチン酸からなる群から選択される。好ましくは、Ｘは、アルキルアミノ安息香酸である。Ｘがアミノアルカン酸またはアルキルアミノ安息香酸のとき、ｎは、１〜５の範囲であり、さらに好ましくは、ｎは、１〜３の範囲である。Ｘがアルキルアミノ安息香酸のとき、そのフェニル基は、その隣接するカルボニル基およびメチレン基に関して、メタ、パラまたはオルト配置であり得る。好ましい実施態様では、フェニル基は、パラ配置である。Ｘがα−アミノ酸のとき、アミノ酸側鎖は、任意の適切な天然または合成のアミノ酸側鎖であり得る。
【００８１】
上記Ｘ部分のうちの任意のものについて、Ｒ１およびＲ２は、−Ｈ、低級アルキル、保護基または標識から選択される。好ましくは、標識は、蛍光色素である。より好ましくは、標識は、フルオレセイン型蛍光色素、ローダミン型蛍光色素またはＦＬＡＮ型蛍光色素である。好ましくは、Ｒ１およびＲ２の一方が標識のとき、他方は、−Ｈまたは低級アルキルのいずれかである。好ましい保護基には、ハロアセチル、アシル、アルコキシカルボニルまたはスルホニルが挙げられる。より好ましくは、この保護基は、トリフルオロアセチルである。
【００８２】
この標識は、置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの第一級または第二級アミノ部分と、標識上に位置している「相補的官能性」との反応により、典型的に形成される「連結」を介して、このヌクレオシドに結合される。好ましくは、この相補的官能性は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホニルクロライド、アルデヒドまたはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミンまたは他の活性カルボキシレートである（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）。特に好ましい実施態様では、この相補的官能性は、活性化ＮＨＳエステルであり、これは、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンと反応し、この場合、活性化ＮＨＳエステルを形成するには、カルボキシレート相補的官能性を含む標識は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応されて、ＮＨＳエステルを形成する（Ｋｈａｎｎａ；Ｋａｓａｉ）。以下の表１は、代表的な相補的官能性およびこの相補的官能性とこの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンとの反応により形成されて得られた連結のサンプリングを示す。
【００８３】
【表１】
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される。
【００８４】
ＩＩＩ．置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの合成
図２〜９は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのいくつかの代表的な合成を示す。この合成では、ブロモエタノール１は、フタルイミドカリウム２と反応して、フタルイミド誘導体３が得られる。このフタルイミド誘導体は、次いで、ＮａＨの存在下にて、プロパルギルブロマイド４でＯ−アルキル化されて、保護した３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン連結アーム５が得られる。図２を参照せよ。次いで、ヨードヌクレオシド６は、ジメチルホルムアミド中、ヨウ化第一銅、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、およびトリエチルアミンの存在下にて、室温でおよそ１２時間またはこの反応がＴＬＣで決定されるように完結するまで、保護連結アームと反応されて、それにより、化合物７が形成される。この溶液は、次いで、真空下で濃縮され、生成物は、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製され、そして同定および純度測定のために、プロトンＮＭＲおよび分析用逆相ＨＰＬＣにより分析される。エチレンジアミンでの処理に続いて、トリフルオロ酢酸エチルでのアセチル化により、ヌクレオシド連結アーム化合物８が得られる。図３を参照せよ。リン酸トリメチル中にて、−３０℃で、このヌクレオシド連結アーム化合物８に、新たに蒸留したオキシ塩化リンを添加して、対応するジクロロモノホスフェート９を形成する。反応混合物を２Ｍ重炭酸テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ ８．０）でクエンチして、モノホスフェート１０を得、これは、次いで、分取逆相ＨＰＬＣにより精製される。図４を参照せよ。モノホスフェート１０は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で活性化され、過剰のＣＤＩは、ＭｅＯＨでクエンチされて、活性化モノホスフェート１１が得られる。この活性化モノホスフェートは、室温で、ピロリン酸トリブチルアンモニウムと反応される。この反応は、完結したとき、０．２Ｍ ＴＥＡＢでクエンチされ、そして逆相ＨＰＬＣにより精製されて、保護トリホスフェート１２が得られる。精製した保護トリホスフェートは、乾燥するまでエバポレートされ、そして濃ＮＨ４ＯＨ水溶液中に再懸濁されて、ＴＦＡ基が除去され、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド１３が得られる。図５を参照せよ。
【００８５】
一般に、Ｘ部分のプロパルギルエトキシアミドヌクレオチド（例えば、１３）への結合は、以下のようにして行われる。Ｘ部分のアミン官能性を保護するために、Ｘ部分とアミン保護試薬（例えば、トリフルオロアセテート、例えば、図６Ａ〜Ｃの化合物１４、１７または２０）とを反応させることにより、アミン保護Ｘ部分が形成される。アミン保護Ｘ部分の酸官能性を活性化するために、アミン保護Ｘ部分は、酸活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えば、図６Ａ〜Ｃの化合物１５、１８または２１）と反応される。次に、酸活性化されたアミン保護Ｘ部分は、塩基条件下（例えば、２５０ ｍＭの重炭酸塩緩衝液、ｐＨ ９）で、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドと反応されて、アミン保護された置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド（例えば、図７の化合物２２、図８の化合物２４、または図９の化合物２６を参照のこと）を生じる。最後に、アミン保護基は、強塩基（例えば、ＮＨ４ＯＨ）との反応により、アミン保護された置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドから除去されて、置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド（例えば、図７の化合物２３、図８の化合物２５、または図９の化合物２７を参照のこと）が得られる。
【００８６】
一般に、好ましい方法では、本発明の標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドは、以下のようにして調製される。置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド（例えば、２３、２５または２７）は、中性緩衝溶液（例えば、１００ ｍＭ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０））に溶解され、溶液を乾燥状態までエバポレートされ、そして、ヌクレオシドを塩基性緩衝溶液（例えば、２５０ ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝９）に再懸濁する。この溶液に、標識−ＮＨＳエステル（ＤＭＳＯ中）が添加され、そして撹拌しながら、一晩反応される。完結すると、この反応混合物は、イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより精製されて、標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドが得られる。
【００８７】
ＩＶ．プロパルギルエトキシアミド化合物を使用する方法
本発明のプロパルギルエトキシアミド化合物は、以下の工程を包含するタイプのテンプレート媒介プライマー伸長反応を含めた方法での使用によく適合する：（ｉ）テンプレート核酸を提供する工程；（ｉｉ）このテンプレート核酸の一部に、オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、それにより、プライマー−テンプレートハイブリッドを形成する工程；および（ｉｉｉ）このプライマーを伸長するために、このプライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加する工程。特に、本発明の化合物は、プライマー伸長生成物に標識を直接含入させる手段を提供する。
【００８８】
プライマー伸長反応を使用する第一の好ましい種類の方法では、この伸長生成物は、本発明の標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを、プライマー伸長反応物に含有させ、それにより、この伸長生成物全体にわたって、標識をランダムに含入させることにより、標識される（［Ｆ］ｄＮＴＰ試薬プロトコル）。このような方法は、ＰＣＲ単位複製配列、および単一のプライマー誘導伸長生成物を標識するのに使用できる。このようにして伸長生成物を標識するために、プライマー伸長反応は、確立したプロトコルを用いて行われるが、この反応系には、標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドが添加される。一般に、ＰＣＲの状況で、プライマー伸長反応を行うためには、テンプレート核酸は、各プライマー２０ ｐｍｏｌと、プライマー伸長試薬（これは、２０ ｍＭの緩衝液（ｐＨ ８）、１．５ ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および２単位のＴａｑポリメラーゼまたは他の適切な熱安定性ポリメラーゼを含有する）と混合される。次いで、反応混合物を熱サイクルにかけるが、典型的な熱サイクルプロフィールは、変性工程（例えば、９６℃で１５秒間）、プライマーアニーリング工程（例えば、５５℃で３０秒間）、およびプライマー伸長工程（例えば、７２℃で９０秒間）を包含する。典型的には、この熱サイクルは、約１０〜４０サイクル繰り返される。ＰＣＲ増幅のためには、標識デオキシヌクレオチド三リン酸と非標識デオキシヌクレオチド三リン酸との典型的な比は、所望のシグナル量に依存して、１００：１〜１０００：１の間である。増幅効率に悪影響を起こすことなくＰＣＲ反応混合物中にて使用できる標識デオキシヌクレオチド三リン酸と非標識デオキシヌクレオチド三リン酸との最大比は、およそ１：４である。
【００８９】
プライマー伸長反応を使用する第二の好ましい種類の方法では、この伸長生成物は、プライマー伸長反応物に本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを含有させて、それにより、伸長生成物の３’−末端ヌクレオチドにて、検出可能な標識をランダムに含入させることにより標識される（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定）。一般に、本発明の標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いたＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定の状況でプライマー伸長反応を行うためには、１μｌのテンプレート溶液（水５μｌで希釈したＰＣＲ反応物１μｌ）および２μｌのプライマー（０．４ ｐｍｏｌ／μｌ）は、プライマー伸長試薬（これは、２μｌの緩衝液（４００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９．０）、２μｌのデオキシヌクレオチド／標識ジデオキシヌクレオチド混合物（Ｔ−終止反応、１２５０μＭ ｄｄＴＴＰ、２５０μＭ ｄＡＴＰ、２５０μＭ ｄＣＴＰ、１８０μＭ ７−デアザ−ｄＧＴＰ、および２５０μＭ ｄＴＴＰ）、および２μｌのポリメラーゼ酵素（５単位／μｌであって、この場合、１単位は、Ｌａｗｙｅｒのように定義される）を含有する）と混合される。次いで、反応物は、以下の代表的なプログラムを用いて、熱サイクルにかけられる：９８℃で５秒間の変性に続いて、９６℃で５秒間；５５℃で４０秒間；６０℃で１分間のサイクルの繰り返し、このサイクルは、およそ１５回繰り返される。
【００９０】
本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド化合物はまた、プライマー伸長生成物の塩基特異的な開裂に依存したＳａｎｇｅｒ型配列決定の変形法（例えば、標識ヌクレオチド使用する方法）の状況にて、よく適合する（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ １９８８；Ｓｈａｗ）。
【実施例】
【００９１】
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明らかにされるが、これらの実施例は、本発明の純粋な例示とすることを意図しており、いずれの様式でも、その範囲を限定することを意図していない。
【００９２】
（実施例１）
配列決定反応に必要なターミネーター過剰を決定するためのターミネーター滴定アッセイ
完全な配列決定ラダー（ｌａｄｄｅｒ）（すなわち、約２０ヌクレオチドと約６００ヌクレオチドの間の長さを有する特定の塩基で終止する全てのフラグメントを含有する配列決定ラダー）を作るのに必要な最小量の色素標識ターミネーターを決定するために、ターミネーター滴定アッセイを使用した。このターミネーター滴定アッセイの不可欠な成分は、（ｉ）第一色素で標識したプライマー、および（ｉｉ）この第一色素とスペクトル分解可能な第二色素で標識したターミネーターであった。このアッセイでは、この配列決定反応物に、不充分な濃度の色素ターミネーターを添加したとき、ジデオキシ終止フラグメントは形成されず、配列決定ゲル上では、第一色素のみで標識した「偽スポット」により形成された生成物だけが見られた。本明細書中で使用する「偽スポット」との用語は、ジデオキシターミネーターで終止していないプライマー伸長生成物を意味し、このような生成物は、おそらく、ポリメラーゼ酵素がテンプレート核酸鎖から自発的に分離するときに形成される。多すぎるターミネーターを使用したときには、短い終止生成物（すなわち、長さが約５０個未満のヌクレオチド）しか形成されず、このような生成物は、第一色素および第二色素の両方を含有していた。適切な量のターミネーターを使用したとき、完全な配列決定ラダーが生成し、ラダーの各フラグメントは、第一色素および第二色素の両方で標識されていた。
【００９３】
色素−ターミネーター反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１６）で提供されたプロトコルに従ったＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳを用いて、行った。（このＦＳ酵素は、２点変異−−Ｇ４６ＤおよびＦ６６７Ｙを有する組み換えＴｈｅｒｍｕｓ水生ＤＮＡポリメラーゼである）。ｄＮＴＰミックス、色素標識プライマーおよび色素標識ターミネーター以外の全ての試薬は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１７）から得た。ｄＮＴＰミックスは、各２ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなっていた。反応成分のプレミックスを、以下の表に示すように調製し、ここで、全ての量は、反応ベースあたりで示されている：
【００９４】
【表２】
反応物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８０１−１００）に適合した０．５ ｍｌ微量遠心分離管に組み込んだ。反応物の容量は２０μＬであり、これには、上記反応プレミックス１５μＬ、可変量の色素標識ターミネーター、および全反応容量を２０μＬにするのに充分な量の水を含む。各反応物に、１〜５００ ｐｍｏｌの色素標識ターミネーターを添加した。蒸発を防止するために、各反応物の頂部に、鉱油３０μＬを添加した。これらの反応物を、以下のようにして熱サイクルにかけた：９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、および６０℃で４分間を２５サイクルに続いて、４℃で保持するサイクル。
【００９５】
全ての反応物を、製造業者の指示（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｐ／ｎ ＣＳ−９０１）に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム上のスピン−カラム精製により精製した。このカラム内のゲル物質は、室温で少なくとも３０分間にわたり、脱イオン水０．８ ｍＬで水和させた。カラムが水和され、ゲル物質に気泡が取り込まれていないことを確認した後、カラムの上部および下部の末端キャップを取り除き、カラムを、重力により排水した。次いで、カラムを、キットに備え付けた洗浄管に挿入し、そして可変速度微量遠心分離機で、１３００ｘｇで２分間にわたり遠心分離し、洗浄管を取り除き、そして試料収集管に挿入した。この反応混合物を、オイルの下部から注意深く取り出し、そしてゲル物質上に充填した。カラムを、可変速度微量遠心分離で、１３００ｘｇで２分間遠心分離した。次いで、溶出した試料を、真空遠心分離で乾燥した。
【００９６】
配列決定ゲル上に充填する前に、乾燥した試料を、２５μＬのＴｅｍｐｌａｔｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１６７４）中に再懸濁させ、ボルテックスし、２分間にわたって９５℃まで加熱し、氷上で冷却し、再びボルテックスし、そして遠心分離した（１３，０００ｘｇ）。再懸濁した試料１０μＬを、ＰＥ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ３１０−００−１００／１２０）に適合させた試料バイアル（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１９５７）に等分した。３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの電気泳動は、ＤＮＡ配列決定分析に特別に適合させたふるい分けポリマーおよび毛細管（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７（ポリマー）およびｐ／ｎ ４０２８４０（毛細管））を用いて行った。各場合では、ふるい分けポリマーは、核酸変性物を含んでいた。試料は、２．５ ｋＶで３０秒間、毛細管に動電的に注入し、そしてこの毛細管の外壁を５０℃に維持しつつ、１２．２ ｋＶで２時間走査した。
【００９７】
図１Ａ〜Ｃは、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙから得た典型的な結果を示し、この場合、プライマーはＴＡＭＲＡ色素で標識され、ｄｄＡＴＰターミネーターは、６−ＦＡＭ色素で標識され、ＴＡＭＲＡ色素をこのジデオキシヌクレオチドターミネーターに連結するために、伝統的なプロパルギルアミドリンカーを使用した。これらのトレースは、ヌクレオチド７１〜１７５に対する電気泳動走査時間の関数として、一定波長での蛍光強度を示す。プライマー伸長反応物に添加した色素−ターミネーターの量は、可変であった：図１Ａでは、１ ｐｍｏｌのターミネーターを使用し、図１Ｂでは、４ ｐｍｏｌのターミネーターを使用し、そして図１Ｃでは、１５０ ｐｍｏｌのターミネーターを使用した。各パネルの上のトレースは、色素標識ターミネーターで発光し、５３５〜５４５ ｎｍで集めた蛍光であり、各パネルの下のトレースは、色素標識プライマーで発光し、５７５〜５８５ ｎｍで集めた蛍光である。色素プライマートレース（下）は、適切に終止したフラグメントでけでなく、偽ストップ（ｆａｌｓｅ ｓｔｏｐ）（すなわち、色素標識ターミネーターで終止していないフラグメント）も示している。色素ターミネータートレース（上）は、色素標識ターミネーターの特異的な取り込みを示している。
【００９８】
図１Ａは、１ ｐｍｏｌの６−ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰターミネーターを用いる反応についてのデータを示す。この色素ターミネータートレースでは、小さなピークにより明らかなように、極く僅かな特異的混入が検出された。この色素−プライマートレースで示された偽ストップは、任意の特異的に終止したピークとも実質的に同じ大きさであった。このパターンから、この色素−ターミネーター濃度が非常に低いことが明らかとなった。図１Ｂは、４ ｐｍｏｌの６−ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰターミネーターを用いた反応についてのデータを示す。このターミネータートレースでは、この配列決定ラダー全体を通じて、比較的に一定のピーク高さで、良好な特異的ターミネーター混入が認められた。この色素プライマートレースでは、偽ストップノイズの上部に容易に識別できるピークが存在しており、これらのピークは、色素ターミネータートレースのピークと共に移動していた。このパターンは、この色素ターミネーター濃度は、使用可能な範囲内であったことを示す。図１Ｃは、１５０ ｐｍｏｌの６−ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰターミネーターを用いた反応についてのデータを示す。「トップヘビー（ｔｏｐ ｈｅａｖｙ）」パターンが見られ、色素ターミネータートレースの初期のピークが、非常に高レベルの色素ターミネーター混入を示し、その後のピークは、ずっと低いレベルの混入を示していた。このパターンは、この色素−ターミネーター濃度が高すぎたことを示している。
【００９９】
（実施例２）
リンカー型の関数として、完全配列決定ラダーを形成するのに必要なＨＥＸ−１−標識したＣ−ターミネーターの量
以下の表は、実施例１にて上で記述のターミネーター滴定アッセイに従って、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な色素標識したＣ−ターミネーターの相対モル過剰（ｍｏｌａｒ ｅｘｃｅｓｓ）を示す。この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な非標識ジデオキシターミネーターの量が１の値となるように、定義される。各場合では、Ｃ−ターミネーターは、ＨＥＸ−１色素に連結した。
【０１００】
【表３】
ａ この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な非標識ジデオキシターミネーターの量が１．０の値となるように定義される。
【０１０１】
（実施例３）
５−｛３−（２−アミノエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１３）の合成
Ａ．物質および方法
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、２５０μｍ層のシリカゲル６０−Ｆ２５４で予め塗装したガラス板上で行った。蛍光のクエンチおよび／または５％硫酸での炭化により展開した後、化合物をＴＬＣ板上に配置した。ＳＩＰブランドシリカゲル６０Å、２３０〜４００ Ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐ／ｎ Ｃ４５８２−８７）上で、フラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。以下のようにして、ＮＭＲスペクトルを得た：１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、室温で、ＣＤＣｌ３（内部Ｍｅ４Ｓｉ、δ０）またはＤ２Ｏ（外部Ｍｅ４Ｓｉ、δ０）に溶解した溶液で３００ ＭＨｚにて記録した；１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ３（内部Ｍｅ４Ｓｉ、δ０）に溶解した溶液で、７５．５ ＭＨｚにて記録した；１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ３またはＤ２Ｏ（外部ＣＦＣｌ３、δ０）に溶解した溶液で、２８２．２３ ＭＨｚにて記録した；そして３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、Ｄ２Ｏ中の溶液で、１２１．４４ ＭＨｚにて記録した。全ての場合において、ＮＭＲデータは、提案した構造に一致していた。他に指示がなければ、全ての反応は室温で行い、後処理において、有機溶媒の溶液を、等容量の水溶液で洗浄した。有機溶液を、４０〜５０℃の浴温を用いた真空下でのロータリーエバポレーターでの濃縮の前に、無水Ｎａ２ＳＯ４で一般的に乾燥した。分析および分取目的で使用したＨＰＬＣ系は以下の通りであった：
分析用逆相ＨＰＬＣ：カラム：Ｓｐｈｅｒｉ−５ ＲＰ−Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、２２０×４．６ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−００１７）；勾配：０〜５０％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて２０分間に続いて、５０％アセトニトリル〜１００％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて１０分間。
【０１０２】
分析用イオン対ＨＰＬＣ：カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ ＯＤ−３００、７μｍの粒子サイズ、２２０×４．６ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−０３３１）；勾配：０〜４０％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて３０分間に続いて、４０％アセトニトリル〜６０％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて５分間。
【０１０３】
分取アニオン交換ＨＰＬＣ：カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ Ａｎｉｏｎ、２０μｍの粒子サイズ、２５０×１０ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−０１７２）；勾配：４０％アセトニトリル：６０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ ７．０〜４０％アセトニトリル：６０％ １．５ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ８で４．５ ｍｌ／分にて２０分間に続いて、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出。
【０１０４】
分取逆相ＨＰＬＣ：カラム：Ｐｒｅｐ Ｎｏｖａ Ｐａｋ ＨＲ−Ｃ１８、６μｍの粒子サイズ、６０Åの細孔サイズ、３００×４０ ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐ／ｎ ＷＡＴ０３７７０４）；勾配（モノホスフェートおよびトリホスフェートについて）：１００％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ ７〜２０％アセトニトリル：８０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７で５０ ｍｌ／分にて３０分間に続いて、２０％アセトニトリル：８０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７〜５０％アセトニトリル：５０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７で１０分間；勾配（色素標識三リン酸について）：１００％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７〜１０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７：９０％アセトニトリル。
【０１０５】
Ｂ．２−フタルイミドエタノール（３）の合成
フタルイミドカリウム２（２．７ｇ、１４．６ ｍｍｏｌ）を、ブロモエタノール１のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１２ ｍＬ、１４．１ ｍｍｏｌ）に添加した。７０℃で１２時間撹拌した後、この混合物を濃縮し、次いで、ジクロロメタン（１００ ｍＬ）で希釈した。濾過により固形分を除去した後、その有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３：２〜２：３ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、０．２２のＲＦ（３：２のヘキサン−酢酸エチル）を有する白色固形分（１．１９ｇ、４４．１２％）として、化合物３を得た。図２を参照せよ。
【０１０６】
Ｃ．３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン（５）の合成
化合物３（１．１４ｇ、５．９６ ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ ｍＬ）撹拌溶液に、ＮａＨ（０．３６ｇ、８０％）を滴下した。ＮａＨを完全に添加した後、撹拌を室温で０．５時間継続し、その反応系を０℃まで冷却した。プロパルギルブロマイド４（１．５ ｍＬ、１３．４７ ｍｍｏｌ）を添加し、この撹拌を、０℃でさらに０．５時間、次いで、室温で２時間継続した。メタノールを注意深く添加して過剰のＮａＨを分解した後、溶媒を蒸発させ、その粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３：２〜１：１〜２：３ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、０．２２のＲＦ（３：２のヘキサン−酢酸エチル）を有する固形物（４９５ ｍｇ、３６．２％）として、化合物５を得た。図２を参照せよ。
【０１０７】
Ｄ．５−｛３−（２−フタルアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（７）の合成
５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン６（１００ ｍｇ、０．３ ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ ｍＬ）中、ヨウ化第一銅（１１．４ ｍｇ、０．０６ ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（６９ ｍｇ、０．０６ ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（８４μＬ、０．６ ｍｍｏｌ）の存在下にて、アルゴン雰囲気下にて、室温で１２時間にわたり、化合物５（１５８ ｍｇ、０．６９ ｍｍｏｌ）と反応させた。次いで、この反応物を、メタノール中の重炭酸塩形態のＤｏｗｅｘ−１アニオン交換樹脂２ｇで希釈した。室温で１時間撹拌した後、この反応混合物を濾過し、そして濃縮した。この生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（１３：１のジクロロメタン−メタノール）により精製して、０．２３のＲＦ（溶媒は９：１のジクロロメタン−メタノール）を有する化合物７（７５ ｍｇ、５７．６６％）を得た。図３を参照せよ。
【０１０８】
Ｅ．５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（８）の合成
化合物７（７３ ｍｇ、０．１７ ｍｍｏｌ）およびエチレンジアミン（４００μＬ）の混合物を、エタノール（４ ｍＬ）中にて、８０℃で１時間加熱した。次いで、この反応系を乾燥状態までエバポレートし、その残留物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸メチル（６．５ ｍＬ）を添加した。８０℃で１時間撹拌した後、この溶媒をエバポレートし、その残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶媒は９：１のジクロロメタン−メタノール）により精製して、０．２４のＲＦ（９：１のジクロロメタン−メタノール）を有する化合物８（３６ ｍｇ、５０．７％）を得た。図３を参照せよ。
【０１０９】
Ｆ．５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン一リン酸（１０）の合成
新たに蒸留したオキシ塩化リン（１６．２μＬ、０．１７ ｍｍｏｌ）を、−３０℃で、リン酸トリメチル（１５０μＬ）中のヌクレオシド８（１８．８ ｍｇ、０．０４６ ｍｍｏｌ）に添加して、対応するジクロロモノホスフェート９を形成した。この反応混合物を、８０分間にわたって−５℃まで暖めて、撹拌を、室温でさらに１時間継続した。この反応物を、２ Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（ｐＨ ８．０）でクエンチし、そして上記のような分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、モノホスフェート１０（１２．３ ｍｇ、５４．５６％）を得た。図４を参照せよ。
【０１１０】
Ｇ．５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１２）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００μｌ）に溶解したモノホスフェート１０（７．４ ｍｇ、１５．３ ｍｍｏｌ）を、室温で１時間にわたって、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（４．２ ｍｇ、２５．９ ｍｍｏｌ）と共に撹拌した。過剰のＣＤＩを、乾燥メタノール（４０μＬ）の添加によりクエンチした。活性化モノホスフェート１１を、室温で２４時間にわたって、ｎ−トリブチルアミン（１６μＬ）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６０μＬ）中のピロリン酸トリブチルアンモニウムの溶液と共に撹拌した。この反応物を、２ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ８．０）でクエンチし、そして上記のような分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、トリホスフェート１２を得た。図５を参照せよ。
【０１１１】
Ｈ．５−｛３−（２−アミノエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１３）の合成
精製し保護したトリホスフェート１２を、濃ＮＨ４ＯＨ水（４ ｍＬ）に取り出し、そして室温で２．５時間撹拌した。この反応混合物を濃縮して、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド１３を得た。次いで、この濃縮した化合物を、２．６ ｍＭの濃度まで、０．１ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０）で、バルクとして調合した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および上記の分析用イオン対ＨＰＬＣにより、確認した。図５を参照せよ。
【０１１２】
（実施例４）
５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノアセチル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２３）［グリシン置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド］の合成
Ａ．トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）の合成−−図６Ａ
トリフルオロアセトアミドグリシン１４（０．９６ｇ、５．６ ｍｍｏｌｅｓ）を、室温で１時間にわたって、乾燥ＤＭＦ（１０ ｍＬ）中にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６５ｇ、５．７ ｍｍｏｌｅｓ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）（１．６８ｇ、５．７ ｍｍｏｌｅｓ）と反応させた。この反応溶液を酢酸エチル（２００ ｍＬ）で希釈し、そして０．１ Ｎ ＨＣｌ（２×１００ ｍＬ）で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、このトリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル１５（１．４３ｇ、１００％）を得た。
【０１１３】
Ｂ．５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノアセチル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２３）の合成−−図７
１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオチド１３（２００μｌ、１５．２ ｍＭ）を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、２５０ ｍＭの重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．０）１００μｌに再懸濁させた。このトリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル１５の溶液（５０μｌ、ＤＭＳＯ中で２３％ ｗ／ｗ）を添加し、そして室温で一晩撹拌した。次いで、この反応混合物を、以下のようにして、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製した：カラム：Ａｑｕａｐｏｒｅ ＯＤＳ、２０μｍの粒子サイズ、２５０×１０ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−０１６３）；勾配：０〜５０％アセトニトリルで４．５ ｍｌ／分にて２０分間に続いて、４０％アセトニトリル〜１００％アセトニトリルで、４．５ ｍｌ／分にて１０分間。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護したトリホスフェート２２を得た。
【０１１４】
精製し保護したトリホスフェート２２を、濃ＮＨ４ＯＨ水（２ ｍＬ）に取り出し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を濃縮して、グリシン置換プロパルギルアミノヌクレオチド２３を得た。このグリシン置換プロパルギルアミノヌクレオチド２３のバルクを、４．８４ ｍＭの濃度まで、０．１ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０）中へのこの反応混合物の溶解により調合した。調合したバルク溶液の濃度および純度は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および上記実施例３の分析用逆相ＨＰＬＣにより、確認した。
【０１１５】
（実施例５）
５−［３−｛２−［Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２５）［メチルアミノ安息香酸（パラ）置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド］の合成
Ａ．４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）の合成−−図６Ｂ
４−アミノメチル安息香酸１６（４ｇ、２６．５ ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（６０ ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸メチル（３ ｍＬ）に溶解し、この溶液に、トリエチルアミン（３ ｍＬ）を添加した。６０℃で５時間撹拌した後、この反応溶液を酢酸エチル（５００ ｍＬ）で希釈し、そして水（６×２００ ｍＬ）で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、白色の固形物として、トリフルオロアセトアミドメチル安息香酸１７（４．６ｇ、７０．３％）を得た。
【０１１６】
このトリフルオロアセトアミドメチル安息香酸１７（４．４９ｇ、１８．２ ｍｍｏｌ）を、室温で２時間にわたり、酢酸エチル１００ ｍｌ中にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０９ｇ、１８．２ ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．７４ｇ、１８．２ ｍｍｏｌ）と反応させた。この反応溶液を濾過して、白色沈殿物を除去し、その有機層を１Ｎ ＨＣｌ（１００ ｍＬ）で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。この濃縮物を、以下のステップ勾配を用いるシリカゲル固定相を用いた順相カラムクロマトグラフィーにより、クロマトグラフにかけて、白色の固形物（３．５ｇ、５６％）として、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル１８を得た：４０：１のジクロロメタン：酢酸エチルに続いて、１０：１のジクロロメタン：酢酸エチル。
【０１１７】
Ｂ．５−［３−｛２−［Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２５）の合成−−図８
１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオシド１３（２００μｌ、１５．２ ｍＭ）を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、２５０ ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．０）１５０μｌに再懸濁させた。４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル１８の溶液（１００μｌ、１００μｌのＤＭＳＯ中で２５ ｍｇ）を添加し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、実施例４にて上で記述した分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護したトリホスフェート２２を得た。
【０１１８】
この精製し保護したトリホスフェート２２を、濃ＮＨ４ＯＨ水（２ ｍＬ）に取り出し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を濃縮して、メチルアミノ安息香酸（パラ）置換プロパルギルアミノヌクレオチド２５を得た。次いで、この置換プロパルギルアミノヌクレオチド２５のバルク溶液を、０．１ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０）へのこの反応混合物の溶解により調合した。調合したバルク溶液の濃度および純度は、それぞれ、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および上記実施例３の分析用逆相ＨＰＬＣにより確認した。
【０１１９】
（実施例６）
置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドへの色素の結合
１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）中の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、それを、２５０ ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．０）に再懸濁させた。所望の色素−ＮＨＳ溶液（ＤＭＳＯ中）を添加し、そして暗所中にて、室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、上記の分取アニオン交換ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮し、そして上記の分取逆相ＨＰＬＣにより再精製した。最終生成物を真空中で乾燥し、そして１ ｍＭの濃度まで、５０ ｍＭ ＣＡＰＳＯ（ｐＨ ９．６）で希釈した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、ＵＶ／ＶＩＳ分光分析および上記の分析用イオン対ＨＰＬＣにより確認した。
【０１２０】
（実施例７）
本発明の置換プロパルギルエトキシアミドジデオキシヌクレオチドを用いて改良したピーク高さ均等性
図１０は、ＨＥＸ−１−標識ｄｄＣＴＰを用いた単色配列決定反応の電気泳動図であり、この場合、このＨＥＸ−１色素は、３個の異なるタイプのリンカーのそれぞれを用いて、ターミネーターに結合している。上記ターミネーター滴定アッセイに基づき、各リンカータイプについて、その最適なターミネーター濃度を使用した。上のパネルは、５０ ｐｍでのプロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、中央のパネルは、２５ ｐｍでのメチルアミノ安息香酸（パラ）置換プロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、下のパネルは、２５０ ｐｍでのグリシン置換プロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示す。図１０の上の電気泳動図における番号により示されるように、図１０で示した配列決定ラダー部分は、−２１ Ｍ１３配列決定プライマー（前方）を用いたｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の配列の塩基６３から塩基１０４までに及んでいる。各実験の相対誤差は、以下のようであり、この場合、本明細書中で使用する用語「相対誤差」は、この図で示した電気泳動図部分にわたるピーク高さの比または標準偏差および中間ピーク高さ（ｍｅａｎ ｐｅａｋ ｈｅｉｇｈｔ）を意味する。
【０１２１】
【表４】
全ての文献および特許出願の内容は、個々の文献または特許出願のそれぞれの内容が具体的かつ個別的に本明細書中で参考として援用されているかのように、本明細書中で参考として援用されている。
【０１２２】
少数の実施態様だけを上で詳細に記述しているものの、化学分野の当業者は、その好ましい実施態様において、それらの教示から逸脱することなく、多くの改良が可能であることを、充分に理解している。このような改良の全ては、以下の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図している。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素の基質として有用なヌクレオチド化合物、プライマー伸長反応でこのようなヌクレオチド化合物を使用する方法、およびこのようなヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】
【０００４】
【数２】
【背景技術】
【０００５】
（背景）
核酸配列決定は、現代の生物学および生物工学において必須の重要な技術となっており、基本的な生物研究から薬剤の発見や臨床医学までの範囲の分野に関連した情報を提供する。大容量のＤＮＡ配列データが収集されているので、核酸配列決定法のスループットを高めると共にコストを下げるために、自動化技術が開発されている（Ｓｍｉｔｈ；Ｃｏｎｎｅｌｌ；Ｔｒａｉｎｏｒ）。
【０００６】
好ましい自動化核酸配列決定法は、Ｓａｎｇｅｒにより開発された酵素複製技術に基づいている（Ｓａｎｇｅｒ）。Ｓａｎｇｅｒの方法では、一本鎖テンプレート核酸の配列は、一組のポリヌクレオチドフラグメントを合成するための核酸ポリメラーゼを用いて決定され、ここで、このフラグメントは、（ｉ）このテンプレート配列に対する配列相補性を有し、（ｉｉ）単一ヌクレオチドにより長さが変わり、そして（ｉｉｉ）公知のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）での５’−末端終止を有する。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定されるテンプレート核酸の３’−末端にアニールされ、このプライマーの３’−末端は、相補的ポリヌクレオチドフラグメントのポリメラーゼ媒介重合に対する開始部位として、役立つ。この酵素的重合工程は、このテンプレート−プライマーハイブリッドと４個の天然デオキシヌクレオチド（「ｄＮＴＰ」）、核酸ポリメラーゼ酵素および２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（「ｄｄＮＴＰ」）「ターミネーター」とを組み合わせることにより、行われる。このターミネーターの組み込みは、この３’−末端の水酸基を欠いたフラグメントを形成し、それゆえ、このポリメラーゼによって、さらに伸長され得ない（すなわち、このフラグメントは、「終止されている」）。組込みのためのｄｄＮＴＰおよびその対応ｄＮＴＰの間の競合の結果、異なるサイズのフラグメントが分配され、各フラグメントは、この反応で使用される特定のターミネーターで終止される。このテンプレート核酸の完全な配列を発見するために、４個の並発反応が行われ、各反応は、異なるｄｄＮＴＰターミネーターを使用する。これらのフラグメントのサイズ分配を決定するために、これらのフラグメントは、サイズが異なるフラグメントを単一ヌクレオチドによって分割するように、電気泳動により分離される。
【０００７】
古典的なＳａｎｇｅｒ法の現代版変形法では、このヌクレオチドターミネーターは、蛍光色素で標識され（Ｐｒｏｂｅｒ；Ｈｏｂｂｓ）、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ酵素が使用される（Ｍｕｒｒａｙ）。色素標識したターミネーターを使用することにより、以下のいくつかの利点が得られる：（ｉ）放射性同位体の貯蔵、使用および廃棄に付随した問題がなくなる；（ｉｉ）色素標識したプライマーを合成する必要性がなくなる；および（ｉｉｉ）各Ａ、Ｇ、ＣまたはＴヌクレオチド用に異なる色素標識を使用するとき、単一の管にて、４個の反応の全てを同時に行うことができる。熱安定性のポリメラーゼ酵素を使用することにより、（ｉ）この重合反応を高温で行うことが可能になり、それにより、このテンプレートのいずれかの二次構造が分断され、その結果、より少ない配列依存性アーチファクトが得られ、そして、（ｉｉ）この配列決定反応が熱サイクルでき、それにより、生成する伸長生成物の量を線形的に増幅させるのに役立ち、それゆえ、配列を得るのに必要なＤＮＡテンプレートの量が低減される。
【０００８】
Ｓａｎｇｅｒ配列決定法のこれらの現代版変形法は、効果的であることが証明されているものの、それらの性能および経済性を最適化することに関して、いくつかの問題点が残っている。Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定法で熱安定性のポリメラーゼ酵素と組み合わせて現在入手できる色素標識ターミネーターを使用するとき、特に、フルオレセイン型色素標識の場合に遭遇する１つの問題点には、５０：１の比まで、非標識ｄＮＴＰよりも大過剰の色素標識ターミネーターが必要なことがある。この大過剰の標識ターミネーターにより、この電気泳動分離工程を行う前に、この配列決定反応生成物を精製する必要が生じる。この清浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）工程は、組み込まれていない標識化ターミネーター種および真正の配列決定フラグメントの同時移入により起こる干渉を回避するために、必要である。典型的な清浄化方法には、エタノール沈殿またはクロマトグラフィー分離が含まれる（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。このような清浄化工程は、完全に自動化した配列決定系（ここで、その配列決定反応生成物は、電気泳動分離プロセスに直接移される）を開発する仕事を著しく複雑にする。
【０００９】
Ｓａｎｇｅｒ型核酸配列決定法で熱安定性のポリメラーゼと組み合わせて現在入手できる色素標識ターミネーターを使用するとき遭遇する第二の問題点には、これらの反応生成物を電気泳動により分離し蛍光検出を用いて検出するとき、ピーク高さの不均一な分布が得られることがある。このような不均一なピーク高さは、自動化した配列測定およびヘテロ接合体の検出を実質的に信頼できないものとするために、不利である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本発明は、プライマー伸長反応（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応またはＰＣＲ反応）において、鎖終止ヌクレオチドおよび鎖伸長ヌクレオチドとして有用な、新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの本発明者らによる発見に関する。
【００１１】
本発明の目的は、標識した鎖終止ヌクレオチドを形成するのに使用できるヌクレオチドを提供することにある。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖終止ヌクレオチドを提供することにある。
【００１３】
本発明のなおさらなる目的は、蛍光標識を含む鎖終止ヌクレオチドであって、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において、非標識の鎖終止ヌクレオチドよりも低い過剰濃度のこのような標識した鎖終止ヌクレオチドを必要とするものを提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法において、ピーク高さのより均一な分布が得られる標識した鎖終止ヌクレオチドを提供することにある。
【００１５】
本発明の目的は、標識した鎖伸長ヌクレオチドを形成するのに使用できるヌクレオチドを提供することにある。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、標識を含む鎖伸長ヌクレオチドを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、標識したポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを使用するプライマー伸長反応を包含する方法を提供することにある。
【００１９】
第一の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、以下の構造を有するヌクレオシド化合物により、達成される：
【００２０】
【化１】
ここで、Ｘは、
【００２１】
【化２】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００２２】
【化３】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００２３】
【化４】
および
【００２４】
【化５】
からなる群から選択される；そしてＲ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される。Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基であり、ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１位にて結合しており、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このプリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、この７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、このピリミジンの５位に結合している。Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；Ｗ２は、−ＯＨ、またはこのヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そしてＷ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の第一の局面の第一の好ましい実施態様では、Ｒ１およびＲ２の１個は、標識であり、より好ましくは、この標識は、フルオレセイン型色素、ローダミン型色素またはＦＬＡＮ型色素である。
【００２６】
本発明の第一の局面の第二の好ましい実施態様では、Ｗ１は、−Ｈである；Ｗ２は、−ＯＨ、またはその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そしてＷ３は、−Ｐ３Ｏ１０である。より好ましくは、Ｗ２は、−ＯＨ、−Ｈ、アジド、アミノ、フルオロおよびメトキシからなる群から選択される。
【００２７】
本発明の第一の局面の第三の好ましい実施態様では、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニンおよび７−デアザグアノシンからなる群から選択される。
【００２８】
本発明の第一の局面の第四の好ましい実施態様では、Ｘは、
【００２９】
【化６】
であり、ｎ＝１であり、そしてΦ基は、パラ立体配置にある。
【００３０】
第二の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、プライマー伸長反応を行う方法により達成され、この方法は、テンプレート核酸を提供する工程；このテンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールする工程；およびこのプライマーを伸長するために、このプライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加する工程を包含し、このプライマー伸長試薬は、上記の本発明の第一局面のヌクレオシド化合物を含有する。
【００３１】
第三の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、上記の本発明の第一の局面のヌクレオシド化合物を含有するポリヌクレオチドにより、達成される。
【００３２】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 以下の構造を有するヌクレオシド化合物：
【００３３】
【化１８】
ここで、Ｘは、
【００３４】
【化１９】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００３５】
【化２０】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００３６】
【化２１】
および
【００３７】
【化２２】
からなる群から選択される；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのＮ１位にて結合している；そして
ここで、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの５位に結合している；
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；
Ｗ２は、−ＯＨ、または該ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そして
Ｗ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
（項目２） Ｒ１およびＲ２の１個が、標識である、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目３） 前記標識が、フルオレセイン型色素である、項目２に記載のヌクレオシド化合物。
（項目４） 前記標識が、ローダミン型色素およびＦＬＡＮ型色素からなる群から選択される、項目２に記載のヌクレオシド化合物。
（項目５） Ｗ１が、−Ｈであり；
Ｗ２が、−ＯＨ、または前記ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分であり；そして
Ｗ３が、−Ｐ３Ｏ１０である、
項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目６） Ｗ２が、−ＯＨ、−Ｈ、アジド、アミノ、ハロ、およびメトキシからなる群から選択される、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目７） Ｗ２が、−Ｈおよびフルオロからなる群から選択される、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目８） Ｂが、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンからなる群から選択される、項目１に記載のヌクレオシド。
（項目９） Ｘが、パラ立体配置を有するアルキルアミノ安息香酸であり、そしてｎ＝１である、項目１に記載のヌクレオシド化合物。
（項目１０） プライマー伸長反応を行う方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
テンプレート核酸を提供すること；
該テンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールすること；および
該プライマーを伸長するために、該プライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加することであって、該プライマー伸長試薬は、以下の構造を有するヌクレオシド化合物を含有する：
【００３８】
【化２３】
ここで、Ｘは、
【００３９】
【化２４】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４０】
【化２５】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４１】
【化２６】
および
【００４２】
【化２７】
からなる群から選択される；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのＮ１位にて結合している；そして
ここで、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの５位に結合している；
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；
Ｗ２は、−ＯＨ、または該ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そして
Ｗ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
（項目１１） Ｒ１およびＲ２が、標識であり、そして他が、−Ｈである、項目１０に記載の方法。
（項目１２） 以下の構造を有するヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチド：
【００４３】
【化２８】
ここで、Ｘは、
【００４４】
【化２９】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４５】
【化３０】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である、
【００４６】
【化３１】
および
【００４７】
【化３２】
からなる群から選択される；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される；
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのＮ１位にて結合している；そして
ここで、Ｂがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの８位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該７−デアザプリンの７位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの５位に結合している；
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される；
Ｗ２は、−ＯＨ、または該ヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である；そして
Ｗ３は、−ＰＯ４、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴定アッセイから得た結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴定アッセイから得た結果を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、種々の濃度の色素標識ターミネーターを用いたターミネーター滴定アッセイから得た結果を示す。
【図２】図２は、２−フタルイミドエタノール（３）および３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン（５）の合成を示す。
【図３】図３は、５−｛３−（２−フタルアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（７）および５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（８）の合成を示す。
【図４】図４は、５−｛３−（２’−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン一リン酸（１０）の合成を示す。
【図５】図５は、５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１２）および５−｛３−（２−アミドエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１３）の合成を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）、およびトリフルオロアセトアミドブト−２−イノイックＮＨＳエステル（２１）の合成を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）、およびトリフルオロアセトアミドブト−２−イノイックＮＨＳエステル（２１）の合成を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）、およびトリフルオロアセトアミドブト−２−イノイックＮＨＳエステル（２１）の合成を示す。
【図７】図７は、５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノアセチル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２３）の合成を示す。
【図８】図８は、５−［３−｛２−［Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２５）の合成を示す。
【図９】図９は、５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノ−ブト−２−イノイック）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２７）の合成を示す。
【図１０】図１０は、３個の異なる色素ターミネーター配列決定反応から得た結果を示し、ここで、各反応は、色素をターミネーターに結合する異なるリンカーを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施態様に対して、詳細な参照がなされ、その実施例は、添付の図面に例示されている。本発明は、その好ましい実施態様に関連して記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施態様に限定する意図はないことが分かる。反対に、本発明は、その代替、改変および等価物を含むことを意図しており、これらは、添付の請求の範囲で規定される本発明の範囲内に含まれ得る。
【００５０】
一般に、本発明は、ポリメラーゼ酵素に対して基質として有用な新規な種類の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド化合物、このようなヌクレオシド化合物を含むポリヌクレオチド、およびプライマー伸長反応においてこのようなヌクレオシド化合物を使用する方法を包含する。本発明の化合物は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法で使用する色素標識ヌクレオチド鎖終止試薬の調製、およびプライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲ）を含む方法で使用する色素標識ヌクレオチド鎖伸長試薬の調製において、特定の用途が見出されている。
【００５１】
本発明は、一部には、目的の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素用の特に良好な基質であること、すなわち、（ｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応にて、現在入手できる標識ターミネーターを使用したときに必要なものと比較して、著しく低いモル過剰しか必要としないこと、および（ｉｉ）Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定プロセスにて、現在入手できる標識ターミネーターを使用したときに見られるものと比較して、ピーク高さのより均一な分布が見られることの発見に基づいている。
【００５２】
Ｉ．定義
他に述べられていなければ、本明細書中で使用する以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図している：
「低級アルキル」との用語は、１個〜８個の炭素原子を含有する直鎖および分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなど）を表わす。
【００５３】
「標識」との用語は、本発明のヌクレオシドに結合したとき、このようなヌクレオシドおよびこのようなヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを、公知の検出手段を用いて検出可能にする部分を意味する。例示の標識には、蛍光体、発色団、放射性同位元素、スピン標識、酵素標識、化学発光標識など（これらは、適切な検出器による標識化合物の直接的な検出を可能にする）、またはリガンド、例えば、抗原またはビオチン（これは、検出可能な抗リガンド（例えば、標識抗体またはアビジン）に、高い親和性で特異的に結合できる）が挙げられる。好ましくは、これらの標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン型色素またはローダミン型色素（Ｌｅｅ；Ｍｅｎｃｈｅｎ））である。
【００５４】
「ヌクレオシド」との用語は、２’−デオキシ形状および２’−ヒドロキシル形状を含めて、その１’位でペントースに結合したプリン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物を意味する（Ｓｔｒｙｅｒ）。本明細書中で使用する「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）を意味し、ここで、最も一般的なエステル化部位は、このペントースのＣ−５位に結合した水酸基である。多くの場合、本発明の開示では、ヌクレオシドとの用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を包含することを意図している。ヌクレオシドに関する「アナログ」には、例えば、他の文献で記述のように（Ｓｃｈｅｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ １９９１）、変性塩基部分、変性糖部分および／または変性リン酸エステル部分を有する合成アナログが挙げられる。
【００５５】
本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」との用語は、天然ヌクレオチドモノマーまたはそれらのアナログの線状ポリマーを意味し、これには、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形状などが含まれる。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結により連結されており、本明細書中で使用する「ホスホジエステル連結」との用語は、ホスホジエステル結合またはそれらのホスフェートアナログを含む結合を意味し、これらには、会合した対イオンが存在するなら、このような対イオン（例えば、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）を含む。このポリヌクレオチドの大きさは、典型的には、数個（例えば、８個〜４０個）のモノマー単位から、数千個のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような一連の文字で表わされるときは、このヌクレオチドは、他に指示がなければ、５’→３’の順序で左から右に配列されており、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表わし、「Ｃ」は、デオキシシチジンを表わし、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表わし、そして「Ｔ」は、チミジンを表わすことが分かる。
【００５６】
「ホスフェートアナログ」との用語は、ホスフェートのアナログであって、ここでそのリン原子が＋５酸化状態であり、そしてその酸素原子の１個またはそれ以上が非酸素部分で置き換えられているものを意味し、例示のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなど（会合した対イオン（例えば、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）があれば、このような対イオンを含めて）が挙げられる。
【００５７】
本明細書中で使用される「プロパルギルアミドリンカー」との用語は、以下の構造を有するリンカーを意味する：
【００５８】
【化７】
また、「プロパルギルエトキシアミドリンカー」との用語は、以下の構造を有するリンカーを意味する：
【００５９】
【化８】
ここで、上記構造のそれぞれについて、そのアセチレンの終止末端は、ヌクレオチド塩基に結合しており、そしてそのアミド窒素は、標識との好都合な連結を介して、結合される。
【００６０】
本発明の「Ｘ」部分に関連して、「アミノアルカン酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６１】
【化９】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である；「アルキルアミノ安息香酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６２】
【化１０】
ここで、ｎは、１〜５の範囲である；「α−アミノ酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６３】
【化１１】
そして「４−アミノ−２−ブチン酸」との用語は、以下の構造を意味する：
【００６４】
【化１２】
ここで、上記構造では、Ｒ１およびＲ２は、別個に、−Ｈ、低級アルキル、保護基または標識であり、そしてＲ４は、アミノ酸側鎖（天然（Ｓｔｒｙｅｒ）または合成のいずれか）である。
【００６５】
「プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのヌクレオ塩基に結合したプロパルギルエトキシアミドリンカーを含むヌクレオチドを意味する。
【００６６】
「フルオレセイン型色素」との用語は、以下の縮合三環系を含有する種類のキサンテン色素分子を意味する：
【００６７】
【化１３】
ここで、各デオキシ環位置では、広範囲の置換が可能である。フルオレセイン型色素の特に好ましいサブセットには、４，７−ジクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ）が挙げられる。ＤＮＡ配列決定法で蛍光標識として使用されるフルオレセイン型色素の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−（および６）カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、および５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）が包含される。多くの場合、−１または−２との名称は、特定の色素（例えば、ＨＥＸ−１）の略語の後で、付けられる。この「−１」および「−２」との名称は、使用する特定の色素異性体を意味する。これらの１および２異性体は、Ｃ−８カラムおよび溶出勾配（１５％アセトニトリル／８５％ ０．１ Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム〜３５％アセトニトリル／６５％ ０．１ Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用する逆相クロマトグラフィー分離系にて、遊離色素の溶出順序（この１異性体が最初に溶出する）により、定義される。
【００６８】
「ローダミン型色素」との用語は、以下の縮合三環系を含有する種類のキサンテン色素分子を意味する：
【００６９】
【化１４】
ここで、好ましくは、Ｙ１〜Ｙ４は、別個に、水素または低級アルキルであり、または一緒になって、Ｙ１およびＲ２は、プロパノであり、そしてＹ２およびＲ１は、プロパノであるか、または一緒になって、Ｙ３およびＲ３は、プロパノであり、そしてＹ４およびＲ４は、プロパノである。Ｒ１〜Ｒ４位置を含めた各デオキシ環位置にて、広範囲の置換が可能である。ヌクレオシド標識として有用な例示のローダミン型色素には、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ジクロロテトラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）などが挙げられる（Ｂｅｒｇｏｔ；Ｌｅｅ）。
【００７０】
本明細書中で使用する「ＦＬＡＮ色素」との用語は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン色素化合物を意味する：
【００７１】
【化１５】
ここで、Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムまたはアミンである。Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基、またはそれらの組合せである。そして、Ｒ９は、アセチレン、アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せ、以下の構造を有する置換フェニルである：
【００７２】
【化１６】
ここで、Ｘ１は、カルボン酸またはスルホン酸である；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素または低級アルキルである；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸または連結基である（Ｂｅｎｓｏｎ）。
【００７３】
本明細書中で使用する「プライマー伸長試薬」との用語は、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介の伸長を起こすのに必要な成分を含有する試薬を意味する。プライマー伸長試薬には、以下が挙げられる：（ｉ）ポリメラーゼ酵素、例えば、熱安定性ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）；（ｉｉ）緩衝液；（ｉｉｉ）鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ジオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザデオキシグアノシン５’−三リン酸、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシチミジン５’−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸）；および必要に応じて、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応の場合に、（ｉｖ）１個またはそれ以上の鎖終止ヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザジデオキシグアノシン５’−三リン酸、ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、ジデオキチミジン５’−三リン酸、およびジデオキシシチジン５’−三リン酸）。
【００７４】
「テンプレート核酸」とは、単一鎖形状で提示できる任意の核酸であって、プライマーオリゴヌクレオチドでアニールできるものを意味する。例示のテンプレート核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、このＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに特定すると、テンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応に由来のＤＮＡ増幅生成物などであり得る。テンプレートＤＮＡの調製方法は、他の文献に見られ得る（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ）。
【００７５】
ＩＩ．置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物を包含する。（本開示全体で提供された全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造およびプロトン化状態を含むことを意図することに留意のこと）。
【００７６】
【化１７】
式Ｉの構造では、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基であり、好ましい実施態様では、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニンおよび７−デアザグアノシンからなる群から選択される。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、このヌクレオチドの糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９位にて結合され、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１位にて結合される。Ｂがプリンのとき、隣接三重結合炭素は、このプリンの８位に結合され、Ｂが７−デアザプリンのとき、隣接三重結合炭素は、７−デアザプリンの７位に結合され、Ｂがピリミジンのとき、隣接三重結合炭素は、このピリミジンの５位に結合される。
【００７７】
Ｗ１は、−Ｈおよび−ＯＨから選択される。Ｗ１が−ＯＨであるとき、このヌクレオシドは、リボヌクレオチドであり、そしてＷ１が−Ｈであるとき、このヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオチドである。
【００７８】
Ｗ２は、−ＯＨ、またはこのヌクレオシドがその３’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である。この機能に有用な好ましい部分には、−Ｈ、アジド、アミノ、ハロ、メトキシなどが挙げられる。特に好ましい実施態様では、Ｗ２は、−Ｈまたはフルオロである。
【００７９】
Ｗ３は、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスフェートアナログ、および−ＯＨからなる群から選択される。ポリヌクレオチドの酵素的合成に有用な好ましい実施態様では、Ｗ３は−Ｐ３Ｏ１０である。
【００８０】
Ｘは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α−アミノ酸、および４−アミノ−２−ブチン酸からなる群から選択される。好ましくは、Ｘは、アルキルアミノ安息香酸である。Ｘがアミノアルカン酸またはアルキルアミノ安息香酸のとき、ｎは、１〜５の範囲であり、さらに好ましくは、ｎは、１〜３の範囲である。Ｘがアルキルアミノ安息香酸のとき、そのフェニル基は、その隣接するカルボニル基およびメチレン基に関して、メタ、パラまたはオルト配置であり得る。好ましい実施態様では、フェニル基は、パラ配置である。Ｘがα−アミノ酸のとき、アミノ酸側鎖は、任意の適切な天然または合成のアミノ酸側鎖であり得る。
【００８１】
上記Ｘ部分のうちの任意のものについて、Ｒ１およびＲ２は、−Ｈ、低級アルキル、保護基または標識から選択される。好ましくは、標識は、蛍光色素である。より好ましくは、標識は、フルオレセイン型蛍光色素、ローダミン型蛍光色素またはＦＬＡＮ型蛍光色素である。好ましくは、Ｒ１およびＲ２の一方が標識のとき、他方は、−Ｈまたは低級アルキルのいずれかである。好ましい保護基には、ハロアセチル、アシル、アルコキシカルボニルまたはスルホニルが挙げられる。より好ましくは、この保護基は、トリフルオロアセチルである。
【００８２】
この標識は、置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの第一級または第二級アミノ部分と、標識上に位置している「相補的官能性」との反応により、典型的に形成される「連結」を介して、このヌクレオシドに結合される。好ましくは、この相補的官能性は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホニルクロライド、アルデヒドまたはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミンまたは他の活性カルボキシレートである（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）。特に好ましい実施態様では、この相補的官能性は、活性化ＮＨＳエステルであり、これは、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンと反応し、この場合、活性化ＮＨＳエステルを形成するには、カルボキシレート相補的官能性を含む標識は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応されて、ＮＨＳエステルを形成する（Ｋｈａｎｎａ；Ｋａｓａｉ）。以下の表１は、代表的な相補的官能性およびこの相補的官能性とこの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンとの反応により形成されて得られた連結のサンプリングを示す。
【００８３】
【表１】
Ｒ３は、−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される。
【００８４】
ＩＩＩ．置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの合成
図２〜９は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのいくつかの代表的な合成を示す。この合成では、ブロモエタノール１は、フタルイミドカリウム２と反応して、フタルイミド誘導体３が得られる。このフタルイミド誘導体は、次いで、ＮａＨの存在下にて、プロパルギルブロマイド４でＯ−アルキル化されて、保護した３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン連結アーム５が得られる。図２を参照せよ。次いで、ヨードヌクレオシド６は、ジメチルホルムアミド中、ヨウ化第一銅、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、およびトリエチルアミンの存在下にて、室温でおよそ１２時間またはこの反応がＴＬＣで決定されるように完結するまで、保護連結アームと反応されて、それにより、化合物７が形成される。この溶液は、次いで、真空下で濃縮され、生成物は、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製され、そして同定および純度測定のために、プロトンＮＭＲおよび分析用逆相ＨＰＬＣにより分析される。エチレンジアミンでの処理に続いて、トリフルオロ酢酸エチルでのアセチル化により、ヌクレオシド連結アーム化合物８が得られる。図３を参照せよ。リン酸トリメチル中にて、−３０℃で、このヌクレオシド連結アーム化合物８に、新たに蒸留したオキシ塩化リンを添加して、対応するジクロロモノホスフェート９を形成する。反応混合物を２Ｍ重炭酸テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ ８．０）でクエンチして、モノホスフェート１０を得、これは、次いで、分取逆相ＨＰＬＣにより精製される。図４を参照せよ。モノホスフェート１０は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で活性化され、過剰のＣＤＩは、ＭｅＯＨでクエンチされて、活性化モノホスフェート１１が得られる。この活性化モノホスフェートは、室温で、ピロリン酸トリブチルアンモニウムと反応される。この反応は、完結したとき、０．２Ｍ ＴＥＡＢでクエンチされ、そして逆相ＨＰＬＣにより精製されて、保護トリホスフェート１２が得られる。精製した保護トリホスフェートは、乾燥するまでエバポレートされ、そして濃ＮＨ４ＯＨ水溶液中に再懸濁されて、ＴＦＡ基が除去され、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド１３が得られる。図５を参照せよ。
【００８５】
一般に、Ｘ部分のプロパルギルエトキシアミドヌクレオチド（例えば、１３）への結合は、以下のようにして行われる。Ｘ部分のアミン官能性を保護するために、Ｘ部分とアミン保護試薬（例えば、トリフルオロアセテート、例えば、図６Ａ〜Ｃの化合物１４、１７または２０）とを反応させることにより、アミン保護Ｘ部分が形成される。アミン保護Ｘ部分の酸官能性を活性化するために、アミン保護Ｘ部分は、酸活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えば、図６Ａ〜Ｃの化合物１５、１８または２１）と反応される。次に、酸活性化されたアミン保護Ｘ部分は、塩基条件下（例えば、２５０ ｍＭの重炭酸塩緩衝液、ｐＨ ９）で、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドと反応されて、アミン保護された置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド（例えば、図７の化合物２２、図８の化合物２４、または図９の化合物２６を参照のこと）を生じる。最後に、アミン保護基は、強塩基（例えば、ＮＨ４ＯＨ）との反応により、アミン保護された置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドから除去されて、置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド（例えば、図７の化合物２３、図８の化合物２５、または図９の化合物２７を参照のこと）が得られる。
【００８６】
一般に、好ましい方法では、本発明の標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドは、以下のようにして調製される。置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド（例えば、２３、２５または２７）は、中性緩衝溶液（例えば、１００ ｍＭ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０））に溶解され、溶液を乾燥状態までエバポレートされ、そして、ヌクレオシドを塩基性緩衝溶液（例えば、２５０ ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝９）に再懸濁する。この溶液に、標識−ＮＨＳエステル（ＤＭＳＯ中）が添加され、そして撹拌しながら、一晩反応される。完結すると、この反応混合物は、イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより精製されて、標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドが得られる。
【００８７】
ＩＶ．プロパルギルエトキシアミド化合物を使用する方法
本発明のプロパルギルエトキシアミド化合物は、以下の工程を包含するタイプのテンプレート媒介プライマー伸長反応を含めた方法での使用によく適合する：（ｉ）テンプレート核酸を提供する工程；（ｉｉ）このテンプレート核酸の一部に、オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、それにより、プライマー−テンプレートハイブリッドを形成する工程；および（ｉｉｉ）このプライマーを伸長するために、このプライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加する工程。特に、本発明の化合物は、プライマー伸長生成物に標識を直接含入させる手段を提供する。
【００８８】
プライマー伸長反応を使用する第一の好ましい種類の方法では、この伸長生成物は、本発明の標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを、プライマー伸長反応物に含有させ、それにより、この伸長生成物全体にわたって、標識をランダムに含入させることにより、標識される（［Ｆ］ｄＮＴＰ試薬プロトコル）。このような方法は、ＰＣＲ単位複製配列、および単一のプライマー誘導伸長生成物を標識するのに使用できる。このようにして伸長生成物を標識するために、プライマー伸長反応は、確立したプロトコルを用いて行われるが、この反応系には、標識した置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドが添加される。一般に、ＰＣＲの状況で、プライマー伸長反応を行うためには、テンプレート核酸は、各プライマー２０ ｐｍｏｌと、プライマー伸長試薬（これは、２０ ｍＭの緩衝液（ｐＨ ８）、１．５ ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および２単位のＴａｑポリメラーゼまたは他の適切な熱安定性ポリメラーゼを含有する）と混合される。次いで、反応混合物を熱サイクルにかけるが、典型的な熱サイクルプロフィールは、変性工程（例えば、９６℃で１５秒間）、プライマーアニーリング工程（例えば、５５℃で３０秒間）、およびプライマー伸長工程（例えば、７２℃で９０秒間）を包含する。典型的には、この熱サイクルは、約１０〜４０サイクル繰り返される。ＰＣＲ増幅のためには、標識デオキシヌクレオチド三リン酸と非標識デオキシヌクレオチド三リン酸との典型的な比は、所望のシグナル量に依存して、１００：１〜１０００：１の間である。増幅効率に悪影響を起こすことなくＰＣＲ反応混合物中にて使用できる標識デオキシヌクレオチド三リン酸と非標識デオキシヌクレオチド三リン酸との最大比は、およそ１：４である。
【００８９】
プライマー伸長反応を使用する第二の好ましい種類の方法では、この伸長生成物は、プライマー伸長反応物に本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを含有させて、それにより、伸長生成物の３’−末端ヌクレオチドにて、検出可能な標識をランダムに含入させることにより標識される（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定）。一般に、本発明の標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いたＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定の状況でプライマー伸長反応を行うためには、１μｌのテンプレート溶液（水５μｌで希釈したＰＣＲ反応物１μｌ）および２μｌのプライマー（０．４ ｐｍｏｌ／μｌ）は、プライマー伸長試薬（これは、２μｌの緩衝液（４００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９．０）、２μｌのデオキシヌクレオチド／標識ジデオキシヌクレオチド混合物（Ｔ−終止反応、１２５０μＭ ｄｄＴＴＰ、２５０μＭ ｄＡＴＰ、２５０μＭ ｄＣＴＰ、１８０μＭ ７−デアザ−ｄＧＴＰ、および２５０μＭ ｄＴＴＰ）、および２μｌのポリメラーゼ酵素（５単位／μｌであって、この場合、１単位は、Ｌａｗｙｅｒのように定義される）を含有する）と混合される。次いで、反応物は、以下の代表的なプログラムを用いて、熱サイクルにかけられる：９８℃で５秒間の変性に続いて、９６℃で５秒間；５５℃で４０秒間；６０℃で１分間のサイクルの繰り返し、このサイクルは、およそ１５回繰り返される。
【００９０】
本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド化合物はまた、プライマー伸長生成物の塩基特異的な開裂に依存したＳａｎｇｅｒ型配列決定の変形法（例えば、標識ヌクレオチド使用する方法）の状況にて、よく適合する（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ １９８８；Ｓｈａｗ）。
【実施例】
【００９１】
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明らかにされるが、これらの実施例は、本発明の純粋な例示とすることを意図しており、いずれの様式でも、その範囲を限定することを意図していない。
【００９２】
（実施例１）
配列決定反応に必要なターミネーター過剰を決定するためのターミネーター滴定アッセイ
完全な配列決定ラダー（ｌａｄｄｅｒ）（すなわち、約２０ヌクレオチドと約６００ヌクレオチドの間の長さを有する特定の塩基で終止する全てのフラグメントを含有する配列決定ラダー）を作るのに必要な最小量の色素標識ターミネーターを決定するために、ターミネーター滴定アッセイを使用した。このターミネーター滴定アッセイの不可欠な成分は、（ｉ）第一色素で標識したプライマー、および（ｉｉ）この第一色素とスペクトル分解可能な第二色素で標識したターミネーターであった。このアッセイでは、この配列決定反応物に、不充分な濃度の色素ターミネーターを添加したとき、ジデオキシ終止フラグメントは形成されず、配列決定ゲル上では、第一色素のみで標識した「偽スポット」により形成された生成物だけが見られた。本明細書中で使用する「偽スポット」との用語は、ジデオキシターミネーターで終止していないプライマー伸長生成物を意味し、このような生成物は、おそらく、ポリメラーゼ酵素がテンプレート核酸鎖から自発的に分離するときに形成される。多すぎるターミネーターを使用したときには、短い終止生成物（すなわち、長さが約５０個未満のヌクレオチド）しか形成されず、このような生成物は、第一色素および第二色素の両方を含有していた。適切な量のターミネーターを使用したとき、完全な配列決定ラダーが生成し、ラダーの各フラグメントは、第一色素および第二色素の両方で標識されていた。
【００９３】
色素−ターミネーター反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１６）で提供されたプロトコルに従ったＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳを用いて、行った。（このＦＳ酵素は、２点変異−−Ｇ４６ＤおよびＦ６６７Ｙを有する組み換えＴｈｅｒｍｕｓ水生ＤＮＡポリメラーゼである）。ｄＮＴＰミックス、色素標識プライマーおよび色素標識ターミネーター以外の全ての試薬は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１７）から得た。ｄＮＴＰミックスは、各２ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなっていた。反応成分のプレミックスを、以下の表に示すように調製し、ここで、全ての量は、反応ベースあたりで示されている：
【００９４】
【表２】
反応物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８０１−１００）に適合した０．５ ｍｌ微量遠心分離管に組み込んだ。反応物の容量は２０μＬであり、これには、上記反応プレミックス１５μＬ、可変量の色素標識ターミネーター、および全反応容量を２０μＬにするのに充分な量の水を含む。各反応物に、１〜５００ ｐｍｏｌの色素標識ターミネーターを添加した。蒸発を防止するために、各反応物の頂部に、鉱油３０μＬを添加した。これらの反応物を、以下のようにして熱サイクルにかけた：９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、および６０℃で４分間を２５サイクルに続いて、４℃で保持するサイクル。
【００９５】
全ての反応物を、製造業者の指示（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｐ／ｎ ＣＳ−９０１）に従って、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム上のスピン−カラム精製により精製した。このカラム内のゲル物質は、室温で少なくとも３０分間にわたり、脱イオン水０．８ ｍＬで水和させた。カラムが水和され、ゲル物質に気泡が取り込まれていないことを確認した後、カラムの上部および下部の末端キャップを取り除き、カラムを、重力により排水した。次いで、カラムを、キットに備え付けた洗浄管に挿入し、そして可変速度微量遠心分離機で、１３００ｘｇで２分間にわたり遠心分離し、洗浄管を取り除き、そして試料収集管に挿入した。この反応混合物を、オイルの下部から注意深く取り出し、そしてゲル物質上に充填した。カラムを、可変速度微量遠心分離で、１３００ｘｇで２分間遠心分離した。次いで、溶出した試料を、真空遠心分離で乾燥した。
【００９６】
配列決定ゲル上に充填する前に、乾燥した試料を、２５μＬのＴｅｍｐｌａｔｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１６７４）中に再懸濁させ、ボルテックスし、２分間にわたって９５℃まで加熱し、氷上で冷却し、再びボルテックスし、そして遠心分離した（１３，０００ｘｇ）。再懸濁した試料１０μＬを、ＰＥ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ３１０−００−１００／１２０）に適合させた試料バイアル（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１９５７）に等分した。３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの電気泳動は、ＤＮＡ配列決定分析に特別に適合させたふるい分けポリマーおよび毛細管（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７（ポリマー）およびｐ／ｎ ４０２８４０（毛細管））を用いて行った。各場合では、ふるい分けポリマーは、核酸変性物を含んでいた。試料は、２．５ ｋＶで３０秒間、毛細管に動電的に注入し、そしてこの毛細管の外壁を５０℃に維持しつつ、１２．２ ｋＶで２時間走査した。
【００９７】
図１Ａ〜Ｃは、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙから得た典型的な結果を示し、この場合、プライマーはＴＡＭＲＡ色素で標識され、ｄｄＡＴＰターミネーターは、６−ＦＡＭ色素で標識され、ＴＡＭＲＡ色素をこのジデオキシヌクレオチドターミネーターに連結するために、伝統的なプロパルギルアミドリンカーを使用した。これらのトレースは、ヌクレオチド７１〜１７５に対する電気泳動走査時間の関数として、一定波長での蛍光強度を示す。プライマー伸長反応物に添加した色素−ターミネーターの量は、可変であった：図１Ａでは、１ ｐｍｏｌのターミネーターを使用し、図１Ｂでは、４ ｐｍｏｌのターミネーターを使用し、そして図１Ｃでは、１５０ ｐｍｏｌのターミネーターを使用した。各パネルの上のトレースは、色素標識ターミネーターで発光し、５３５〜５４５ ｎｍで集めた蛍光であり、各パネルの下のトレースは、色素標識プライマーで発光し、５７５〜５８５ ｎｍで集めた蛍光である。色素プライマートレース（下）は、適切に終止したフラグメントでけでなく、偽ストップ（ｆａｌｓｅ ｓｔｏｐ）（すなわち、色素標識ターミネーターで終止していないフラグメント）も示している。色素ターミネータートレース（上）は、色素標識ターミネーターの特異的な取り込みを示している。
【００９８】
図１Ａは、１ ｐｍｏｌの６−ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰターミネーターを用いる反応についてのデータを示す。この色素ターミネータートレースでは、小さなピークにより明らかなように、極く僅かな特異的混入が検出された。この色素−プライマートレースで示された偽ストップは、任意の特異的に終止したピークとも実質的に同じ大きさであった。このパターンから、この色素−ターミネーター濃度が非常に低いことが明らかとなった。図１Ｂは、４ ｐｍｏｌの６−ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰターミネーターを用いた反応についてのデータを示す。このターミネータートレースでは、この配列決定ラダー全体を通じて、比較的に一定のピーク高さで、良好な特異的ターミネーター混入が認められた。この色素プライマートレースでは、偽ストップノイズの上部に容易に識別できるピークが存在しており、これらのピークは、色素ターミネータートレースのピークと共に移動していた。このパターンは、この色素ターミネーター濃度は、使用可能な範囲内であったことを示す。図１Ｃは、１５０ ｐｍｏｌの６−ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰターミネーターを用いた反応についてのデータを示す。「トップヘビー（ｔｏｐ ｈｅａｖｙ）」パターンが見られ、色素ターミネータートレースの初期のピークが、非常に高レベルの色素ターミネーター混入を示し、その後のピークは、ずっと低いレベルの混入を示していた。このパターンは、この色素−ターミネーター濃度が高すぎたことを示している。
【００９９】
（実施例２）
リンカー型の関数として、完全配列決定ラダーを形成するのに必要なＨＥＸ−１−標識したＣ−ターミネーターの量
以下の表は、実施例１にて上で記述のターミネーター滴定アッセイに従って、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な色素標識したＣ−ターミネーターの相対モル過剰（ｍｏｌａｒ ｅｘｃｅｓｓ）を示す。この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な非標識ジデオキシターミネーターの量が１の値となるように、定義される。各場合では、Ｃ−ターミネーターは、ＨＥＸ−１色素に連結した。
【０１００】
【表３】
ａ この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な非標識ジデオキシターミネーターの量が１．０の値となるように定義される。
【０１０１】
（実施例３）
５−｛３−（２−アミノエトキシ）プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１３）の合成
Ａ．物質および方法
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、２５０μｍ層のシリカゲル６０−Ｆ２５４で予め塗装したガラス板上で行った。蛍光のクエンチおよび／または５％硫酸での炭化により展開した後、化合物をＴＬＣ板上に配置した。ＳＩＰブランドシリカゲル６０Å、２３０〜４００ Ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐ／ｎ Ｃ４５８２−８７）上で、フラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。以下のようにして、ＮＭＲスペクトルを得た：１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、室温で、ＣＤＣｌ３（内部Ｍｅ４Ｓｉ、δ０）またはＤ２Ｏ（外部Ｍｅ４Ｓｉ、δ０）に溶解した溶液で３００ ＭＨｚにて記録した；１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ３（内部Ｍｅ４Ｓｉ、δ０）に溶解した溶液で、７５．５ ＭＨｚにて記録した；１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ３またはＤ２Ｏ（外部ＣＦＣｌ３、δ０）に溶解した溶液で、２８２．２３ ＭＨｚにて記録した；そして３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、Ｄ２Ｏ中の溶液で、１２１．４４ ＭＨｚにて記録した。全ての場合において、ＮＭＲデータは、提案した構造に一致していた。他に指示がなければ、全ての反応は室温で行い、後処理において、有機溶媒の溶液を、等容量の水溶液で洗浄した。有機溶液を、４０〜５０℃の浴温を用いた真空下でのロータリーエバポレーターでの濃縮の前に、無水Ｎａ２ＳＯ４で一般的に乾燥した。分析および分取目的で使用したＨＰＬＣ系は以下の通りであった：
分析用逆相ＨＰＬＣ：カラム：Ｓｐｈｅｒｉ−５ ＲＰ−Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、２２０×４．６ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−００１７）；勾配：０〜５０％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて２０分間に続いて、５０％アセトニトリル〜１００％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて１０分間。
【０１０２】
分析用イオン対ＨＰＬＣ：カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ ＯＤ−３００、７μｍの粒子サイズ、２２０×４．６ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−０３３１）；勾配：０〜４０％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて３０分間に続いて、４０％アセトニトリル〜６０％アセトニトリルで１．５ ｍｌ／分にて５分間。
【０１０３】
分取アニオン交換ＨＰＬＣ：カラム：ＡｑｕａｐｏｒｅＴＭ Ａｎｉｏｎ、２０μｍの粒子サイズ、２５０×１０ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−０１７２）；勾配：４０％アセトニトリル：６０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ ７．０〜４０％アセトニトリル：６０％ １．５ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ８で４．５ ｍｌ／分にて２０分間に続いて、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出。
【０１０４】
分取逆相ＨＰＬＣ：カラム：Ｐｒｅｐ Ｎｏｖａ Ｐａｋ ＨＲ−Ｃ１８、６μｍの粒子サイズ、６０Åの細孔サイズ、３００×４０ ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐ／ｎ ＷＡＴ０３７７０４）；勾配（モノホスフェートおよびトリホスフェートについて）：１００％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ ７〜２０％アセトニトリル：８０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７で５０ ｍｌ／分にて３０分間に続いて、２０％アセトニトリル：８０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７〜５０％アセトニトリル：５０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７で１０分間；勾配（色素標識三リン酸について）：１００％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７〜１０％ １００ ｍＭ ＴＥＡＢ ｐＨ ７：９０％アセトニトリル。
【０１０５】
Ｂ．２−フタルイミドエタノール（３）の合成
フタルイミドカリウム２（２．７ｇ、１４．６ ｍｍｏｌ）を、ブロモエタノール１のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１２ ｍＬ、１４．１ ｍｍｏｌ）に添加した。７０℃で１２時間撹拌した後、この混合物を濃縮し、次いで、ジクロロメタン（１００ ｍＬ）で希釈した。濾過により固形分を除去した後、その有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３：２〜２：３ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、０．２２のＲＦ（３：２のヘキサン−酢酸エチル）を有する白色固形分（１．１９ｇ、４４．１２％）として、化合物３を得た。図２を参照せよ。
【０１０６】
Ｃ．３−（２−フタルイミドエトキシ）プロピン（５）の合成
化合物３（１．１４ｇ、５．９６ ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ ｍＬ）撹拌溶液に、ＮａＨ（０．３６ｇ、８０％）を滴下した。ＮａＨを完全に添加した後、撹拌を室温で０．５時間継続し、その反応系を０℃まで冷却した。プロパルギルブロマイド４（１．５ ｍＬ、１３．４７ ｍｍｏｌ）を添加し、この撹拌を、０℃でさらに０．５時間、次いで、室温で２時間継続した。メタノールを注意深く添加して過剰のＮａＨを分解した後、溶媒を蒸発させ、その粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３：２〜１：１〜２：３ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、０．２２のＲＦ（３：２のヘキサン−酢酸エチル）を有する固形物（４９５ ｍｇ、３６．２％）として、化合物５を得た。図２を参照せよ。
【０１０７】
Ｄ．５−｛３−（２−フタルアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（７）の合成
５−ヨード−２’，３’−ジデオキシシチジン６（１００ ｍｇ、０．３ ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ ｍＬ）中、ヨウ化第一銅（１１．４ ｍｇ、０．０６ ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（６９ ｍｇ、０．０６ ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（８４μＬ、０．６ ｍｍｏｌ）の存在下にて、アルゴン雰囲気下にて、室温で１２時間にわたり、化合物５（１５８ ｍｇ、０．６９ ｍｍｏｌ）と反応させた。次いで、この反応物を、メタノール中の重炭酸塩形態のＤｏｗｅｘ−１アニオン交換樹脂２ｇで希釈した。室温で１時間撹拌した後、この反応混合物を濾過し、そして濃縮した。この生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（１３：１のジクロロメタン−メタノール）により精製して、０．２３のＲＦ（溶媒は９：１のジクロロメタン−メタノール）を有する化合物７（７５ ｍｇ、５７．６６％）を得た。図３を参照せよ。
【０１０８】
Ｅ．５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン（８）の合成
化合物７（７３ ｍｇ、０．１７ ｍｍｏｌ）およびエチレンジアミン（４００μＬ）の混合物を、エタノール（４ ｍＬ）中にて、８０℃で１時間加熱した。次いで、この反応系を乾燥状態までエバポレートし、その残留物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸メチル（６．５ ｍＬ）を添加した。８０℃で１時間撹拌した後、この溶媒をエバポレートし、その残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶媒は９：１のジクロロメタン−メタノール）により精製して、０．２４のＲＦ（９：１のジクロロメタン−メタノール）を有する化合物８（３６ ｍｇ、５０．７％）を得た。図３を参照せよ。
【０１０９】
Ｆ．５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン一リン酸（１０）の合成
新たに蒸留したオキシ塩化リン（１６．２μＬ、０．１７ ｍｍｏｌ）を、−３０℃で、リン酸トリメチル（１５０μＬ）中のヌクレオシド８（１８．８ ｍｇ、０．０４６ ｍｍｏｌ）に添加して、対応するジクロロモノホスフェート９を形成した。この反応混合物を、８０分間にわたって−５℃まで暖めて、撹拌を、室温でさらに１時間継続した。この反応物を、２ Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（ｐＨ ８．０）でクエンチし、そして上記のような分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、モノホスフェート１０（１２．３ ｍｇ、５４．５６％）を得た。図４を参照せよ。
【０１１０】
Ｇ．５−｛３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１２）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００μｌ）に溶解したモノホスフェート１０（７．４ ｍｇ、１５．３ ｍｍｏｌ）を、室温で１時間にわたって、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（４．２ ｍｇ、２５．９ ｍｍｏｌ）と共に撹拌した。過剰のＣＤＩを、乾燥メタノール（４０μＬ）の添加によりクエンチした。活性化モノホスフェート１１を、室温で２４時間にわたって、ｎ−トリブチルアミン（１６μＬ）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６０μＬ）中のピロリン酸トリブチルアンモニウムの溶液と共に撹拌した。この反応物を、２ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ８．０）でクエンチし、そして上記のような分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、トリホスフェート１２を得た。図５を参照せよ。
【０１１１】
Ｈ．５−｛３−（２−アミノエトキシ）−プロピン−１−イル｝−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（１３）の合成
精製し保護したトリホスフェート１２を、濃ＮＨ４ＯＨ水（４ ｍＬ）に取り出し、そして室温で２．５時間撹拌した。この反応混合物を濃縮して、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド１３を得た。次いで、この濃縮した化合物を、２．６ ｍＭの濃度まで、０．１ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０）で、バルクとして調合した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および上記の分析用イオン対ＨＰＬＣにより、確認した。図５を参照せよ。
【０１１２】
（実施例４）
５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノアセチル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２３）［グリシン置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド］の合成
Ａ．トリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル（１５）の合成−−図６Ａ
トリフルオロアセトアミドグリシン１４（０．９６ｇ、５．６ ｍｍｏｌｅｓ）を、室温で１時間にわたって、乾燥ＤＭＦ（１０ ｍＬ）中にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６５ｇ、５．７ ｍｍｏｌｅｓ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）（１．６８ｇ、５．７ ｍｍｏｌｅｓ）と反応させた。この反応溶液を酢酸エチル（２００ ｍＬ）で希釈し、そして０．１ Ｎ ＨＣｌ（２×１００ ｍＬ）で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、このトリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル１５（１．４３ｇ、１００％）を得た。
【０１１３】
Ｂ．５−［３−｛２−［Ｎ−（２−アミノアセチル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２３）の合成−−図７
１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオチド１３（２００μｌ、１５．２ ｍＭ）を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、２５０ ｍＭの重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．０）１００μｌに再懸濁させた。このトリフルオロアセトアミドグリシンＮＨＳエステル１５の溶液（５０μｌ、ＤＭＳＯ中で２３％ ｗ／ｗ）を添加し、そして室温で一晩撹拌した。次いで、この反応混合物を、以下のようにして、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製した：カラム：Ａｑｕａｐｏｒｅ ＯＤＳ、２０μｍの粒子サイズ、２５０×１０ ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ０７１１−０１６３）；勾配：０〜５０％アセトニトリルで４．５ ｍｌ／分にて２０分間に続いて、４０％アセトニトリル〜１００％アセトニトリルで、４．５ ｍｌ／分にて１０分間。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護したトリホスフェート２２を得た。
【０１１４】
精製し保護したトリホスフェート２２を、濃ＮＨ４ＯＨ水（２ ｍＬ）に取り出し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を濃縮して、グリシン置換プロパルギルアミノヌクレオチド２３を得た。このグリシン置換プロパルギルアミノヌクレオチド２３のバルクを、４．８４ ｍＭの濃度まで、０．１ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０）中へのこの反応混合物の溶解により調合した。調合したバルク溶液の濃度および純度は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および上記実施例３の分析用逆相ＨＰＬＣにより、確認した。
【０１１５】
（実施例５）
５−［３−｛２−［Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２５）［メチルアミノ安息香酸（パラ）置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド］の合成
Ａ．４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル（１８）の合成−−図６Ｂ
４−アミノメチル安息香酸１６（４ｇ、２６．５ ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（６０ ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸メチル（３ ｍＬ）に溶解し、この溶液に、トリエチルアミン（３ ｍＬ）を添加した。６０℃で５時間撹拌した後、この反応溶液を酢酸エチル（５００ ｍＬ）で希釈し、そして水（６×２００ ｍＬ）で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、白色の固形物として、トリフルオロアセトアミドメチル安息香酸１７（４．６ｇ、７０．３％）を得た。
【０１１６】
このトリフルオロアセトアミドメチル安息香酸１７（４．４９ｇ、１８．２ ｍｍｏｌ）を、室温で２時間にわたり、酢酸エチル１００ ｍｌ中にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０９ｇ、１８．２ ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．７４ｇ、１８．２ ｍｍｏｌ）と反応させた。この反応溶液を濾過して、白色沈殿物を除去し、その有機層を１Ｎ ＨＣｌ（１００ ｍＬ）で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。この濃縮物を、以下のステップ勾配を用いるシリカゲル固定相を用いた順相カラムクロマトグラフィーにより、クロマトグラフにかけて、白色の固形物（３．５ｇ、５６％）として、４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル１８を得た：４０：１のジクロロメタン：酢酸エチルに続いて、１０：１のジクロロメタン：酢酸エチル。
【０１１７】
Ｂ．５−［３−｛２−［Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）］アミノエトキシ｝プロピン−１−イル］−２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（２５）の合成−−図８
１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオシド１３（２００μｌ、１５．２ ｍＭ）を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、２５０ ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．０）１５０μｌに再懸濁させた。４−（トリフルオロアセトアミドメチル）安息香酸ＮＨＳエステル１８の溶液（１００μｌ、１００μｌのＤＭＳＯ中で２５ ｍｇ）を添加し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、実施例４にて上で記述した分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護したトリホスフェート２２を得た。
【０１１８】
この精製し保護したトリホスフェート２２を、濃ＮＨ４ＯＨ水（２ ｍＬ）に取り出し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を濃縮して、メチルアミノ安息香酸（パラ）置換プロパルギルアミノヌクレオチド２５を得た。次いで、この置換プロパルギルアミノヌクレオチド２５のバルク溶液を、０．１ Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ ７．０）へのこの反応混合物の溶解により調合した。調合したバルク溶液の濃度および純度は、それぞれ、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および上記実施例３の分析用逆相ＨＰＬＣにより確認した。
【０１１９】
（実施例６）
置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドへの色素の結合
１００ ｍＭ ＴＥＡ−重炭酸塩（ｐＨ ７．０）中の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、それを、２５０ ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．０）に再懸濁させた。所望の色素−ＮＨＳ溶液（ＤＭＳＯ中）を添加し、そして暗所中にて、室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、上記の分取アニオン交換ＨＰＬＣにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮し、そして上記の分取逆相ＨＰＬＣにより再精製した。最終生成物を真空中で乾燥し、そして１ ｍＭの濃度まで、５０ ｍＭ ＣＡＰＳＯ（ｐＨ ９．６）で希釈した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、ＵＶ／ＶＩＳ分光分析および上記の分析用イオン対ＨＰＬＣにより確認した。
【０１２０】
（実施例７）
本発明の置換プロパルギルエトキシアミドジデオキシヌクレオチドを用いて改良したピーク高さ均等性
図１０は、ＨＥＸ−１−標識ｄｄＣＴＰを用いた単色配列決定反応の電気泳動図であり、この場合、このＨＥＸ−１色素は、３個の異なるタイプのリンカーのそれぞれを用いて、ターミネーターに結合している。上記ターミネーター滴定アッセイに基づき、各リンカータイプについて、その最適なターミネーター濃度を使用した。上のパネルは、５０ ｐｍでのプロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、中央のパネルは、２５ ｐｍでのメチルアミノ安息香酸（パラ）置換プロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、下のパネルは、２５０ ｐｍでのグリシン置換プロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示す。図１０の上の電気泳動図における番号により示されるように、図１０で示した配列決定ラダー部分は、−２１ Ｍ１３配列決定プライマー（前方）を用いたｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の配列の塩基６３から塩基１０４までに及んでいる。各実験の相対誤差は、以下のようであり、この場合、本明細書中で使用する用語「相対誤差」は、この図で示した電気泳動図部分にわたるピーク高さの比または標準偏差および中間ピーク高さ（ｍｅａｎ ｐｅａｋ ｈｅｉｇｈｔ）を意味する。
【０１２１】
【表４】
全ての文献および特許出願の内容は、個々の文献または特許出願のそれぞれの内容が具体的かつ個別的に本明細書中で参考として援用されているかのように、本明細書中で参考として援用されている。
【０１２２】
少数の実施態様だけを上で詳細に記述しているものの、化学分野の当業者は、その好ましい実施態様において、それらの教示から逸脱することなく、多くの改良が可能であることを、充分に理解している。このような改良の全ては、以下の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１４３９４６（Ｐ２００９−１４３９４６Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６７７２（Ｐ２００９−２６７７２）
【出願日】平成２１年２月６日（２００９．２．６）
【分割の表示】特願平１０−５４２８０３の分割
【原出願日】平成１０年３月２３日（１９９８．３．２３）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月６日（２００９．２．６）
【分割の表示】特願平１０−５４２８０３の分割
【原出願日】平成１０年３月２３日（１９９８．３．２３）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
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