美白剤
【課題】 本発明は、優れたシミ・ソバカス及び皮膚の色黒の予防・改善効果を有するチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤。
【解決手段】 コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ阻害作用及びメラニン産生抑制作用を有する美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線やホルモンバランスの乱れによって表皮中のメラノサイトが活性化されると、シミ・ソバカス及び皮膚の色黒の原因となるメラニンが産生される。このメラニンの産生を抑え、シミ・ソバカス及び皮膚の色黒を予防・改善することを一般に美白と呼んでいる。従って、美白剤としてはメラニン産生抑制剤が用いられている。また、メラニン合成系はチロシナーゼを律速酵素とする一連の酸化反応であることから、メラニン合成系に直接働きかけるチロシナーゼ阻害剤も美白剤として用いられている。
【０００３】
従来、高い安全性を有し、さらにこれら症状への高い予防・改善効果を期待して、生薬や植物又はそれらの抽出物から有望な素材を見出すことが行われてきた。例えば、ミズヒキの抽出物（特許文献１参照）、マンシュウウコギ（特許文献２参照）、大高良姜の抽出物（特許文献３参照）がチロシナーゼ阻害作用を有することが報告されている。また、ジンチョウゲ科植物の有機溶媒可溶性成分がメラニン産生抑制作用を有することが報告されている（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８３１４４
【特許文献２】特開２００６−１８２７１３
【特許文献３】特開２００６−５６８６８
【特許文献４】特開平５−２１３７１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、優れたシミ・ソバカス及び皮膚の色黒の予防・改善効果を有するチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、種々検討した結果、コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物がチロシナーゼ阻害作用及びメラニン産生抑制作用を有し、優れた美白剤であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は
（１）コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するチロシナーゼ阻害剤。
（２）コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するメラニン産生抑制剤。
（３）コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有する美白剤。
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のコウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物は、チロシナーゼ阻害作用及びメラニン産生抑制作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明で用いるコウズクとはショウガ科（Zingiberaceae）の大高良姜Alpinia galanga（別名ナンキョウソウ）の果実である。前掲の特許文献３においては、同じ植物の根茎の乾燥物の抽出物がチロシナーゼ阻害活性及び美白作用を有することが報告されている。本発明に用いるコウズクとしては、大高良姜の果実をそのまま用いることができる。又は粉砕後、溶媒にて抽出したものを用いることもできる。抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール等のアルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール類、アセトン等のケトン類等の有機溶媒を、単独又は２種以上組み合わせて使用することができる。抽出物は、上記抽出物をそのまま使用することも、乾燥エキスとして使用することもできる。
【００１０】
一方、本発明で用いるソシマとはジンチョウゲ科（Thymelaeaceae）の黄瑞香Dalphne giraldiiの根皮あるいは茎皮である。前掲の特許文献４においては、ジンチョウゲ科植物の内、ジンチョウゲの有機溶媒可溶性成分がメラニン産生抑制作用及び色素細胞の白色化作用を有することが報告されている。本発明に用いるソシマとしては黄瑞香の根皮あるいは茎皮をそのまま用いることができる。又は粉砕後、溶媒にて抽出したものを用いることもできる。抽出溶媒としては上記と同様の溶媒を用いることができる。抽出物は、そのまま使用することもでき、また乾燥エキスとして使用することもできる。
【００１１】
本発明における「チロシナーゼ阻害剤」には、直接的にチロシナーゼと基質の反応を阻害するもの、及びメラノサイトに作用し、間接的にチロシナーゼの活性を阻害するものが含まれる。後者の例としては、チロシナーゼ自体の発現を抑制したり、チロシナーゼの成熟を抑制したりするものが挙げられる。
【００１２】
本発明における「美白剤」とは、シミ・ソバカス及び皮膚の色黒を予防・改善するものである。
【００１３】
本発明は、例えば医薬品、医薬部外品、化粧料等として使用することができる。その形態としては、各種内服剤、皮膚外用剤等が挙げられる。具体的に内服剤では、錠剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、及びゼリー剤等、皮膚外用剤では、液剤、ローション剤、軟膏剤、パック剤及びクリーム剤等として使用できる。
【００１４】
本発明を内服剤として用いる場合、発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で、必要に応じて他の公知の添加剤、例えば、ビタミン、アミノ酸、生薬、天然物、賦形剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、界面活性剤、可塑剤、香料などを混合して製造することができる。
【００１５】
本発明を皮膚外用剤として用いる場合、発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で、必要に応じて他の公知の添加剤、例えば、1，3-ブチレングリコール、エタノール、メタノール及び精製水等の溶媒、パラベン等の保存剤、ヒノキチオール等の殺菌剤、白色ワセリン、スクワラン及びパラフィン等の油分、イソオクタン酸セチル、カプリン酸セチル及びモノオレイン酸グリセリン等のエステル、シリコーン樹脂及びシリコーンオイル等のシリコーン誘導体、ポリオキシエチレン硬化ひまし油等の界面活性剤、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール等のゲル化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、着色剤等を混合して製造することができる。
【実施例】
【００１６】
以下に製造例及び試験例をあげ、本発明を詳細に説明する。
製造例 生薬抽出物の製造方法
試験例で用いるコウズク、ソシマ、及びジンコウの抽出物は、各生薬を細切後、10倍量の50v/v%エタノール水溶液を加え、沸騰状態で30分間加熱抽出し、濾過後減圧下でエタノールを留去し、さらに、濃縮を行うことにより得た。それぞれの抽出物の収率はコウズクが7.52%、ソシマが12.68%、ジンコウが16.17%であった。
【００１７】
試験例１ B16メラノーマ細胞由来チロシナーゼに対する直接阻害試験
10w/v%FBS添加Earl's MEM培地を用いてB16-F1細胞を96穴プレートに2.5×10４ cell/wellで播種し，37℃で24時間培養した。翌日、ウェル内をPBS（1/15mol/L、pH6.8）で洗浄し、PBSに溶解した1w/v% Triton X-100を50μL用いて細胞を融解した。最終濃度が表１の各濃度となるようPBSで希釈したコウズク抽出物を50μL添加し、さらに基質としてPBSに溶解した0.1w/v% L-DOPAを50μL添加して混和し、37℃で3時間反応させた。なお陽性対照として、コウズク抽出物の代わりにコウジ酸を最終濃度100μMとなるよう添加したものを用いた。反応前後でdopachromeの450nmにおける吸光度を測定し、以下の式よりチロシナーゼ活性を求めた。式中、Ａは被験物質添加ウェルにおける反応前後の450nmの吸光度増加を示し、Ｂは被験物質のかわりにPBSを添加したウェルにおける反応前後の450nmの吸光度増加を示す。結果を表１に示した。
チロシナーゼ活性（％ control）＝１００×Ａ／Ｂ
【００１８】
【表１】
【００１９】
10〜300μg/mLのコウズク抽出物は、B16メラノーマ細胞由来チロシナーゼの活性を、添加濃度に依存して抑制した。コウズク抽出物を300μg/mL用いると、美白化粧品等に用いられるコウジ酸を100μM用いた場合と同等のチロシナーゼ阻害作用を示した。
【００２０】
試験例２ 培養B16メラノーマ細胞のチロシナーゼに対する抑制試験
Earl's MEM培地に分散したB16-F1細胞を96穴プレート2×103 cell/wellで播種し、37℃で24時間インキュベートした。最終濃度が表２の各濃度となるよう培地で希釈した生薬抽出物を10μL添加し、37℃で2日間インキュベートした。陽性対照として最終濃度1mMのコウジ酸を用いた。
プレートをPBSで洗浄した後、PBSに溶解した1w/v% Triton X-100を50μL添加し、プレートシェーカー上で5分間振とうすることにより細胞を融解した。PBSに溶解した0.1w/v%L-DOPAを50μL添加し、37℃で振とうしながら3時間反応させた。L-DOPA添加1分後、及び3時間後にdopachromeの450nmの吸光度を測定し、以下の式からチロシナーゼ活性を求めた。式中、Ｃは被験物質添加ウェルにおける450nmの吸光度増加を示し、Ｄは被験物質のかわりにPBSを添加したウェルにおける450nmの吸光度増加を示す。結果を表２に示した。
チロシナーゼ活性（％ control）＝１００×Ｃ／Ｄ
【００２１】
【表２】
【００２２】
0.3〜10μg/mLのソシマエキスは、B16メラノーマ細胞のチロシナーゼの活性を、添加濃度に依存して抑制した。また、ソシマと同じジンチョウゲ科のジンコウにチロシナーゼ阻害作用は認められなかった。
【００２３】
試験例３ 皮膚モデルを用いた毒性試験
皮膚モデルMel-300-A（クラボウ）を、長期維持培地LLMMを用いて6穴プレートで維持した。表３の各濃度となるよう10v/v%エタノール水溶液で希釈した生薬抽出物を、培養開始日より１日おきに、上皮側より100μLを添加した。37℃で12日間培養後、内容物を除去し，PBSでウェルを洗浄した。コントロールでは、植物エキスの代わりに10v/v%エタノール水溶液100μLを添加した。
MTTアッセイキット（クラボウ社製）のMTT溶液（付属希釈液で1mg/mLに調製）を24wellプレートに300μLずつ添加し、皮膚モデルを浸隻し、37℃で3時間インキュベートした。PBSで洗浄した皮膚モデルを別の24wellプレートに移し、キット付属のMTT抽出液2mLを添加することにより皮膚モデルを完全に浸隻した。プレートを密封してアルミホイルで遮光し、室温で一晩抽出した後、抽出液200μLを96wellプレートに移し、550nmの吸光度を測定した。550nmの吸光度が、コントロールの80%以下となった場合を毒性ありと判断した。チロシナーゼ阻害作用を示したコウズク及びソシマの、皮膚モデルMTTに及ぼす結果を表３に示した。表３ではコントロールの吸光度を１００とし、それぞれの被験物質及び濃度における吸光度を相対値で示した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
コウズクについては1w/v%以上で、ソシマについては0.1w/v%以上で、皮膚モデル毒性が認められた。
【００２６】
試験例４ 皮膚モデルを用いたメラニン産生抑制試験
皮膚モデル毒性を示さない適用濃度を用いて、皮膚モデルのメラニン産生に対する、生薬抽出物の作用を評価した。試験例３と同様に刺激した皮膚モデルをPBSで洗浄し、細胞層を1.5mLのチューブに移し、1w/v％SDS/0.05mM EDTA/10mM Tris-HCl buffer(pH6.8) 50μLとホモジナイザーを用いて細胞を分散・破壊した。さらに同溶液400μLを添加した後、同溶液で5mg/mLに調整したProteinase K溶液20μLを添加し、45℃で一晩インキュベートした。同Proteinase K溶液20μLを添加し、500mM Na2CO3水溶液50μL で塩基性とした後、30w/v％過酸化水素水10μLを添加し、80℃で30分反応させて冷却した。CH3Cl：MeOH（2:1）100μLを添加後，遠心して上清を回収した。200μLを96穴プレートに移し、405nmのメラニン吸収を測定し、以下の式よりメラニン量を求めた。式中、Ｅは被験物質を適用した皮膚モデルから得られた405nmの吸光度を示し、Ｆは被験物質のかわりに10v/v%エタノール水溶液を適用した皮膚モデルから得られた405nmの吸光度を示す。結果を表4に示した。
メラニン量（％ control）＝１００×Ｅ／Ｆ
【００２７】
【表４】
【００２８】
コウズク及びソシマはいずれもコウジ酸と同等のメラニン産生抑制作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤は、医薬品、医薬部外品もしくは化粧料として使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ阻害作用及びメラニン産生抑制作用を有する美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線やホルモンバランスの乱れによって表皮中のメラノサイトが活性化されると、シミ・ソバカス及び皮膚の色黒の原因となるメラニンが産生される。このメラニンの産生を抑え、シミ・ソバカス及び皮膚の色黒を予防・改善することを一般に美白と呼んでいる。従って、美白剤としてはメラニン産生抑制剤が用いられている。また、メラニン合成系はチロシナーゼを律速酵素とする一連の酸化反応であることから、メラニン合成系に直接働きかけるチロシナーゼ阻害剤も美白剤として用いられている。
【０００３】
従来、高い安全性を有し、さらにこれら症状への高い予防・改善効果を期待して、生薬や植物又はそれらの抽出物から有望な素材を見出すことが行われてきた。例えば、ミズヒキの抽出物（特許文献１参照）、マンシュウウコギ（特許文献２参照）、大高良姜の抽出物（特許文献３参照）がチロシナーゼ阻害作用を有することが報告されている。また、ジンチョウゲ科植物の有機溶媒可溶性成分がメラニン産生抑制作用を有することが報告されている（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８３１４４
【特許文献２】特開２００６−１８２７１３
【特許文献３】特開２００６−５６８６８
【特許文献４】特開平５−２１３７１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、優れたシミ・ソバカス及び皮膚の色黒の予防・改善効果を有するチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、種々検討した結果、コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物がチロシナーゼ阻害作用及びメラニン産生抑制作用を有し、優れた美白剤であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は
（１）コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するチロシナーゼ阻害剤。
（２）コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するメラニン産生抑制剤。
（３）コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有する美白剤。
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のコウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物は、チロシナーゼ阻害作用及びメラニン産生抑制作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明で用いるコウズクとはショウガ科（Zingiberaceae）の大高良姜Alpinia galanga（別名ナンキョウソウ）の果実である。前掲の特許文献３においては、同じ植物の根茎の乾燥物の抽出物がチロシナーゼ阻害活性及び美白作用を有することが報告されている。本発明に用いるコウズクとしては、大高良姜の果実をそのまま用いることができる。又は粉砕後、溶媒にて抽出したものを用いることもできる。抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール等のアルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール類、アセトン等のケトン類等の有機溶媒を、単独又は２種以上組み合わせて使用することができる。抽出物は、上記抽出物をそのまま使用することも、乾燥エキスとして使用することもできる。
【００１０】
一方、本発明で用いるソシマとはジンチョウゲ科（Thymelaeaceae）の黄瑞香Dalphne giraldiiの根皮あるいは茎皮である。前掲の特許文献４においては、ジンチョウゲ科植物の内、ジンチョウゲの有機溶媒可溶性成分がメラニン産生抑制作用及び色素細胞の白色化作用を有することが報告されている。本発明に用いるソシマとしては黄瑞香の根皮あるいは茎皮をそのまま用いることができる。又は粉砕後、溶媒にて抽出したものを用いることもできる。抽出溶媒としては上記と同様の溶媒を用いることができる。抽出物は、そのまま使用することもでき、また乾燥エキスとして使用することもできる。
【００１１】
本発明における「チロシナーゼ阻害剤」には、直接的にチロシナーゼと基質の反応を阻害するもの、及びメラノサイトに作用し、間接的にチロシナーゼの活性を阻害するものが含まれる。後者の例としては、チロシナーゼ自体の発現を抑制したり、チロシナーゼの成熟を抑制したりするものが挙げられる。
【００１２】
本発明における「美白剤」とは、シミ・ソバカス及び皮膚の色黒を予防・改善するものである。
【００１３】
本発明は、例えば医薬品、医薬部外品、化粧料等として使用することができる。その形態としては、各種内服剤、皮膚外用剤等が挙げられる。具体的に内服剤では、錠剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、及びゼリー剤等、皮膚外用剤では、液剤、ローション剤、軟膏剤、パック剤及びクリーム剤等として使用できる。
【００１４】
本発明を内服剤として用いる場合、発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で、必要に応じて他の公知の添加剤、例えば、ビタミン、アミノ酸、生薬、天然物、賦形剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、界面活性剤、可塑剤、香料などを混合して製造することができる。
【００１５】
本発明を皮膚外用剤として用いる場合、発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で、必要に応じて他の公知の添加剤、例えば、1，3-ブチレングリコール、エタノール、メタノール及び精製水等の溶媒、パラベン等の保存剤、ヒノキチオール等の殺菌剤、白色ワセリン、スクワラン及びパラフィン等の油分、イソオクタン酸セチル、カプリン酸セチル及びモノオレイン酸グリセリン等のエステル、シリコーン樹脂及びシリコーンオイル等のシリコーン誘導体、ポリオキシエチレン硬化ひまし油等の界面活性剤、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール等のゲル化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、着色剤等を混合して製造することができる。
【実施例】
【００１６】
以下に製造例及び試験例をあげ、本発明を詳細に説明する。
製造例 生薬抽出物の製造方法
試験例で用いるコウズク、ソシマ、及びジンコウの抽出物は、各生薬を細切後、10倍量の50v/v%エタノール水溶液を加え、沸騰状態で30分間加熱抽出し、濾過後減圧下でエタノールを留去し、さらに、濃縮を行うことにより得た。それぞれの抽出物の収率はコウズクが7.52%、ソシマが12.68%、ジンコウが16.17%であった。
【００１７】
試験例１ B16メラノーマ細胞由来チロシナーゼに対する直接阻害試験
10w/v%FBS添加Earl's MEM培地を用いてB16-F1細胞を96穴プレートに2.5×10４ cell/wellで播種し，37℃で24時間培養した。翌日、ウェル内をPBS（1/15mol/L、pH6.8）で洗浄し、PBSに溶解した1w/v% Triton X-100を50μL用いて細胞を融解した。最終濃度が表１の各濃度となるようPBSで希釈したコウズク抽出物を50μL添加し、さらに基質としてPBSに溶解した0.1w/v% L-DOPAを50μL添加して混和し、37℃で3時間反応させた。なお陽性対照として、コウズク抽出物の代わりにコウジ酸を最終濃度100μMとなるよう添加したものを用いた。反応前後でdopachromeの450nmにおける吸光度を測定し、以下の式よりチロシナーゼ活性を求めた。式中、Ａは被験物質添加ウェルにおける反応前後の450nmの吸光度増加を示し、Ｂは被験物質のかわりにPBSを添加したウェルにおける反応前後の450nmの吸光度増加を示す。結果を表１に示した。
チロシナーゼ活性（％ control）＝１００×Ａ／Ｂ
【００１８】
【表１】
【００１９】
10〜300μg/mLのコウズク抽出物は、B16メラノーマ細胞由来チロシナーゼの活性を、添加濃度に依存して抑制した。コウズク抽出物を300μg/mL用いると、美白化粧品等に用いられるコウジ酸を100μM用いた場合と同等のチロシナーゼ阻害作用を示した。
【００２０】
試験例２ 培養B16メラノーマ細胞のチロシナーゼに対する抑制試験
Earl's MEM培地に分散したB16-F1細胞を96穴プレート2×103 cell/wellで播種し、37℃で24時間インキュベートした。最終濃度が表２の各濃度となるよう培地で希釈した生薬抽出物を10μL添加し、37℃で2日間インキュベートした。陽性対照として最終濃度1mMのコウジ酸を用いた。
プレートをPBSで洗浄した後、PBSに溶解した1w/v% Triton X-100を50μL添加し、プレートシェーカー上で5分間振とうすることにより細胞を融解した。PBSに溶解した0.1w/v%L-DOPAを50μL添加し、37℃で振とうしながら3時間反応させた。L-DOPA添加1分後、及び3時間後にdopachromeの450nmの吸光度を測定し、以下の式からチロシナーゼ活性を求めた。式中、Ｃは被験物質添加ウェルにおける450nmの吸光度増加を示し、Ｄは被験物質のかわりにPBSを添加したウェルにおける450nmの吸光度増加を示す。結果を表２に示した。
チロシナーゼ活性（％ control）＝１００×Ｃ／Ｄ
【００２１】
【表２】
【００２２】
0.3〜10μg/mLのソシマエキスは、B16メラノーマ細胞のチロシナーゼの活性を、添加濃度に依存して抑制した。また、ソシマと同じジンチョウゲ科のジンコウにチロシナーゼ阻害作用は認められなかった。
【００２３】
試験例３ 皮膚モデルを用いた毒性試験
皮膚モデルMel-300-A（クラボウ）を、長期維持培地LLMMを用いて6穴プレートで維持した。表３の各濃度となるよう10v/v%エタノール水溶液で希釈した生薬抽出物を、培養開始日より１日おきに、上皮側より100μLを添加した。37℃で12日間培養後、内容物を除去し，PBSでウェルを洗浄した。コントロールでは、植物エキスの代わりに10v/v%エタノール水溶液100μLを添加した。
MTTアッセイキット（クラボウ社製）のMTT溶液（付属希釈液で1mg/mLに調製）を24wellプレートに300μLずつ添加し、皮膚モデルを浸隻し、37℃で3時間インキュベートした。PBSで洗浄した皮膚モデルを別の24wellプレートに移し、キット付属のMTT抽出液2mLを添加することにより皮膚モデルを完全に浸隻した。プレートを密封してアルミホイルで遮光し、室温で一晩抽出した後、抽出液200μLを96wellプレートに移し、550nmの吸光度を測定した。550nmの吸光度が、コントロールの80%以下となった場合を毒性ありと判断した。チロシナーゼ阻害作用を示したコウズク及びソシマの、皮膚モデルMTTに及ぼす結果を表３に示した。表３ではコントロールの吸光度を１００とし、それぞれの被験物質及び濃度における吸光度を相対値で示した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
コウズクについては1w/v%以上で、ソシマについては0.1w/v%以上で、皮膚モデル毒性が認められた。
【００２６】
試験例４ 皮膚モデルを用いたメラニン産生抑制試験
皮膚モデル毒性を示さない適用濃度を用いて、皮膚モデルのメラニン産生に対する、生薬抽出物の作用を評価した。試験例３と同様に刺激した皮膚モデルをPBSで洗浄し、細胞層を1.5mLのチューブに移し、1w/v％SDS/0.05mM EDTA/10mM Tris-HCl buffer(pH6.8) 50μLとホモジナイザーを用いて細胞を分散・破壊した。さらに同溶液400μLを添加した後、同溶液で5mg/mLに調整したProteinase K溶液20μLを添加し、45℃で一晩インキュベートした。同Proteinase K溶液20μLを添加し、500mM Na2CO3水溶液50μL で塩基性とした後、30w/v％過酸化水素水10μLを添加し、80℃で30分反応させて冷却した。CH3Cl：MeOH（2:1）100μLを添加後，遠心して上清を回収した。200μLを96穴プレートに移し、405nmのメラニン吸収を測定し、以下の式よりメラニン量を求めた。式中、Ｅは被験物質を適用した皮膚モデルから得られた405nmの吸光度を示し、Ｆは被験物質のかわりに10v/v%エタノール水溶液を適用した皮膚モデルから得られた405nmの吸光度を示す。結果を表4に示した。
メラニン量（％ control）＝１００×Ｅ／Ｆ
【００２７】
【表４】
【００２８】
コウズク及びソシマはいずれもコウジ酸と同等のメラニン産生抑制作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のチロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、又は美白剤は、医薬品、医薬部外品もしくは化粧料として使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
ソシマ又はその抽出物を含有する美白剤。
【請求項１】
コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
コウズク又はソシマ、あるいはそれらの抽出物を含有するメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
ソシマ又はその抽出物を含有する美白剤。
【公開番号】特開２０１０−１８９３１２（Ｐ２０１０−１８９３１２Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３５１７９（Ｐ２００９−３５１７９）
【出願日】平成２１年２月１８日（２００９．２．１８）
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１８日（２００９．２．１８）
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【Ｆターム（参考）】
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