美白効果向上剤、その製造方法、それを用いた美白剤組成物及びそれを含有する皮膚外用剤
【課題】 それ自体は美白作用を有しないか、又は有していてもわずかであって単独では美白剤として実用に供すことはできないが、これまで使用されている美白剤に配合すると、その美白剤の美白効果を著しく向上させることができる美白効果向上剤を提供する。
【解決手段】 オゴノリ属紅藻類からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とする美白効果向上剤であって、オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集することにより製造する。
【解決手段】 オゴノリ属紅藻類からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とする美白効果向上剤であって、オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集することにより製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それ自体は美白作用をほとんど示さないか、或いは示してもわずかであって実用には供し得ないものであるが、美白剤と併用したときに、美白剤の美白効果を著しく向上させる作用を有する美白効果向上剤、その製造方法、それを用いた美白剤組成物及びそれを含有する皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、黒い地肌を白くしたり、日焼けによる黒色化を回復させるための種々の美白剤が知られている。例えば、広く現在使用されている美白作用有効成分であるアスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、α−アルブチン、β−アルブチン、エラグ酸、グラブリジン、アスタキサンチン、ハイドロキノンがある。また、アロエと、アオサ科、オゴノリ科、テングサ科、ミリン科、コンブ科、アイヌワカメ科、ホンダワラ科、ヒバマタ科、フノリ科、ヒトエグサ科、ミル科、ウシケノリ科、スギノリ科、カギノリ科、イバラノリ科、ナガマツモ科、モヅク科、ダービリア科、レッソニア科又はダルス科に属する海藻の抽出物から選択される海藻のエキスとを含有する日焼けによる皮膚のダメージを回復するための皮膚外用剤組成物（特許文献１参照）、ヤナギノリ、ムカデノリ、トサカノリ、オオオゴノリ、クロノリ、マツノリ、イシノハナ、カイメンソウ及びイソノハナの中から選ばれる海藻の抽出物を有効成分とする美白化粧料（特許文献２参照）、褐藻類、紅藻類、緑藻類から選ばれる１種以上の海藻の抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤（特許文献３参照）、ムカデノリ、フダラク、オゴノリ、ヒラキントキ、ツノマタ、オオバツノマタ、ウチワツノマタ及びホソバノトサカモドキよりなる群より選ばれた少なくとも１種の海藻抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤（特許文献４参照）、紅藻類の海藻にアルカリ処理を施した海藻抽出物を含有するメラニン生成抑制剤（特許文献５参照）などがこれまでに提案されている。
【０００３】
しかしながら、これまでの美白剤は、一般に作用が弱いため、長期間にわたって使用しないと、その効果が発揮されないし、また、短期間で効果を発揮させようと強力なものを用いると、皮膚の損傷をもたらすという問題があった。
したがって、穏やかに作用し、かつ急速に効果が発揮される美白剤組成物の出現が要望されていた。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１１６４５８号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献２】特開２０００−２１２０２５号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献３】特開２００１−１３９４１９号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献４】特開２００１−３０２４９１号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献５】特開２００１−３０２４９２号公報（特許請求の範囲その他）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような事情のもとで、それ自体は美白作用を有しないか、又は有していてもわずかであって単独では美白剤として実用に供すことはできないが、これまで使用されている美白剤に配合すると、その美白剤の美白効果を著しく向上させることができる美白効果向上剤を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、美白剤の美白効果を向上させることについて、種々研究を重ねた結果、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）から、特定の条件下で抽出された赤血球凝集素が、凝集活性が高く認識糖鎖選択性が高い上に、イオン強度により凝集活性を制御し、熱処理によって糖結合性が消失せず、認識糖鎖選択性に優れ、かつ細胞性免疫能力賦活などの自己免疫増強活性を有すること、更にこの新規な自己免疫増強剤は、それ自体は美白作用を示さないが、これを美白剤に配合すると、美白剤の美白効果を著しく向上しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とする美白効果向上剤、その製造方法、それを用いた美白剤組成物及び美白剤組成物を含有した皮膚外用剤を提供するものである。
【０００８】
本発明の美白効果向上剤においては、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）を塩類水溶液により抽出した液状抽出物が用いられる。
この液状抽出物としては、オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得た（１）「粗活性画分（沈殿）」、又は粗活性画分を沈殿として分取し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た液状の（２）「粗活性画分（液状）」、又はさらに、所望に応じ、１００℃、１〜１０分間の熱処理によって夾雑タンパク質を除去した（３）「粗活性画分（熱処理済み）」、又はさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製した精製画分が用いられる。
【０００９】
上記の硫酸アンモニウムの飽和濃度は、「グリーン及びヒューズ（Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．＆ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｗ．Ｌ．）著（１９５５）「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、第６７〜９０ページ」に記載されている［結晶硫酸アンモニウムの添加量と濃度（％飽和）との関係に関する表］に基づいて、規定されるものである。
【００１０】
この際用いる塩類水溶液としては、例えば生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液などがあり、特に、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液が好ましい。
【００１１】
上記で得た液状体は、糖を主成分とする赤血球凝集素を含んでいる。このような糖としては、糖を構成している単糖の中のガラクトースの割合が７０〜１００質量％、特に９０〜１００質量％のものが好ましい。本発明の有効成分として上記液状体を用いる場合、糖のほかに糖の質量に対してタンパク質の質量が０.４以下であるタンパク質を含んでいてもよい。
なお、糖の定量は、標準試料としてガラクトースを用いて、フェノール硫酸法によって行い、タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって行う。
【００１２】
この際の原料としては、オゴノリ属紅藻類が用いられるが、特にオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）、それらの亜種が好ましい。本発明においてオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）には、（１）オゴノリ属海藻（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）に分類される海藻、あるいは、（２）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に分類される海藻、あるいは、（３）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に過去に分類された海藻を含む。
【００１３】
例えば、日本産海藻では、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）には、「新日本海藻誌日本産海藻類総覧、吉田忠生著、内田老鶴圃発行、１９９８年」においてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ：グラシラリアレス）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ：グラシラリアシー）に分類されている海藻が含まれている。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。
【００１４】
上記の方法を好適に行うには、上記の紅藻類原料に（イ）水溶性画分の抽出工程、（ロ）粗活性画分の分取工程、及び、必要に応じて、（ハ）凝集素の精製工程を順次施す。
【００１５】
前記各工程について、さらに詳細に説明すると、まず（イ）工程においては、原料の紅藻類に塩類含有水溶液、例えば、生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液、好ましくは、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液を加えてホモゲナイズしたのち、遠心分離処理し、上澄である粗抽出液を得る。
【００１６】
次に（ロ）工程においては、前記（イ）工程で得られた抽出液に、まず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により除去する。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去される。次いで、遠心分離処理で得た上澄に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて２段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により分別したのち、この沈殿画分を塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液で再溶解し、所望に応じ、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対する透析等により精製して粗活性画分を得る。この粗活性画分は、そのまま本発明の美白効果向上剤として用いることができる。
【００１７】
（ロ）工程においては最後に、粗活性画分を１００℃、１〜１０分間熱処理し沈殿した夾雑タンパク質を除去することにより、熱処理済みの粗活性画分を得る。この熱処理済みの粗活性画分は、そのまま本発明の美白効果向上剤として用いることができる。
【００１８】
この熱処理済みの粗活性画分については、所望に応じ、さらに（ハ）工程を行うことができる。（ハ）工程においては、前記（ロ）工程で得られた熱処理済みの粗活性画分を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１０万以上の画分を分画し、さらにクロマトグラフィーにより成分を分離し、精製赤血球凝集素を得る。この際、最終段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーあるいはそれらの組合せを用いるのが有利である。
【００１９】
ここでいう、分子量１０万以上の画分とは、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、球状タンパク質を標準分子量物質として用いて、溶出画分の分子量を算出した結果が１０万以上の分子量に相当する画分をいう。
【００２０】
上記の精製画分・精製標品の０．１ミリリットルをＴＳＫゲル Ｇ３０００ ＰＷＸＬカラムに添加し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムから０．１ミリリットルずつ溶出画分を集める。この際、標準分子量物質として、チログロブリン（分子量６６９，０００）、フェリチン（分子量４４０，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）を用いる。その結果、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素の溶出した画分（赤血球凝集活性の画分）を示す凝集活性を有するピークの頂点は分子量５．６４×１０5に相当することが分かった。
【００２１】
本発明の美白効果向上剤は、美白剤すなわち美白作用をもつ植物抽出物に対し、通常１０：１ないし１：１の割合で配合する。これにより美白剤の美白効果は著しく向上する。上記配合割合は必ずしもこの範囲に限定されることはなく、必要に応じこれよりも少なくしてもよいし、また増加してもよい。
【００２２】
本発明の美白効果向上剤として用いる有効成分はさらに次に示す事項によって特徴付けられる。
（１）プロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されること、
（２）ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化すること、
（３）細胞性免疫能力賦活活性を有すること、
（４）１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有すること、
（５）ヒトリンパ球を幼若化する活性を有すること、
（６）トリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進させること。
【００２３】
本発明の美白効果向上剤は、海藻特に紅藻類由来の新規なものであって、イオン強度により凝集活性が制御でき、認識糖鎖選択性に優れ、細胞性免疫能力賦活など自己免疫増強活性を有し、１００℃、１０分間の熱処理後も糖結合活性を有するという利点がある。更にこのものは美白剤に対し配合することにより、美白剤の美白効果を向上させる。
【００２４】
次に、本発明の美白効果向上剤を配合した美白剤組成物で用いる美白剤としては、これまで美白剤として知られている美白作用を有する成分の中から任意に選んで用いることができる。このような成分として、例えばアスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、α−アルブチン、β−アルブチン、エラグ酸、グラブリジン、アスタキサンチン、ハイドロキノンを挙げることができる。さらに美白作用を有する植物抽出物としては、チロシナーゼ活性阻害剤であるパシャンベ、カンゾウ、アロエ、ソウハクヒ、クジン、シモツケ、トウキ、ベニバナ、紅茶、ユキノシタ、クチナシ、ウコン、茶、ハマメリス、セイヨウネズ、シャクヤク、センキュウ、ユーカリ、メラニン生成阻害剤であるパシャンベ、フトモモ、サンザシ、茶、ユキノシタ、マロニエ、ローズマリー、セイヨウボダイジュ、オトギリソウ、サンショウ、ユーカリ、チョウジ、セージを挙げることができる。これらは単独で用いてもよいし、また２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
この美白剤組成物には、さらにエラスターゼ活性阻害剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロン酸産生促進及びコラーゲン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の皮膚機能改善剤、及び／又はＳＯＤ様活性剤及びＤＰＰＨラジカル消去剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗酸化剤を含有させることができる。
【００２６】
上記のエラスターゼ活性阻害剤としては、ショウキョウ、フトモモ、クジン、パシャンベ、ホホバ葉、イリス、サンヤク、ワレモコウ、アシタバ、ベニバナ、スギナ、オオバナサルスベリ、センキュウ、ヤグルマギク、エイジツ、ニンジン、トウキンセンカ、ローマカミツレ、シモツケソウ、サンキライ、チョウジ、チンピ、ソウハクヒ、サンシシ、ジオウ、アルニカ、センコツ、ショウブ根、モモ葉、キョウニン、メリロート、ユーカリ、ラベンダー、クマザサ、ホオウ、ゼニアオイ、ゲンノショウコ、ブドウ葉、トウヒ、サイシン、ハッカ、ホップ、ローズマリー、エイジツ、シソ、メリッサ、パセリ、キキョウ、紅茶、サンザシ、ハス葉、フキタンポポ、オトギリソウ、ツボクサ、センブリ、コンフリー及びカンゾウからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、上記のコラゲナーゼ活性阻害剤としては、例えばヨウバイヒ、シラカバ、セイヨウボダイジュ、ケイヒ、ワレモコウ、オトギリソウ、フトモモ、マロニエ、パシャンベ、ダイオウ、シモツケソウ、紅茶、ハマメリス、ユーカリ、ゴバイシ、アセンヤク、オオバナサルスベリ、ホホバ葉、ビワ葉、ゲンノショウコ、ボタン、オウレン、ハス葉、ユキノシタ、チョウトウコウ、ブドウ葉、サンザシ、ガイヨウ、ハイビスカス、トチュウ、茶、キナ、ヘンナ、イチョウ、シソ、サンキライ、タイム、セージ、オウバク、オクラ、アルニカ、ホップ及びオウゴンからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、上記のヒアルロン酸産生促進剤としては、例えばブクリョウ、エイジツ、サイシン、ゲンノショウコ、キナ、フキタンポポ、アガリスク、チョウトウコウ、ベニバナ、シコン、ツボクサ、トウキンセンカ、キョウニン、セージ、シラカバ、ジオウ、ハッカ、カラスムギ、ローマカミツレ、オトギリソウ及びヤグルマギクからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、上記のコラーゲン産生促進剤としては、例えばコンフリー、ローマカミツレ、紅茶、サンザシ、ハス葉、クロレラ、ガイヨウ、クマザサ、ゴボウ、クジン、サイシン、ビワ葉、シソ、クワ葉、タイム、オプリア・ストレプタカンサ、トウヒ、オドリコソウ、ワレモコウ、アイブライト、チンピ、ゼニアオイ、ショウキョウ、カミツレ、セイヨウネズ、センブリ、ジオウ、ローズマリー及びセージからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物をそれぞれ挙げることができる。
【００２７】
また、上記のＳＯＤ様活性剤としては、例えばフトモモ、パシャンベ、ヨウバイヒ、ゴバイシ、チョウジ、ホホバ葉、ワレモコウ、マロニエ、シモツケソウ、茶、シラカバ、アセンヤク、メリッサ、オオバナサルスベリ、ケイヒ、紅茶、ゲンノショコ、タイム、ユーカリ、セイヨウボダイジュ、ダイオウ、セージ、ガイヨウ、ハマメリス、ローズマリー、ユキノシタ、ラベンダー、オトギリソウソ、トチュウ、ビワ葉、チョウトウコウ、シソ、ボタンピ、カワラヨモギ、サンショウ、セイヨウノコギリソウ、キナ、アルニカ、ハス葉、オウゴン及びビデンスピローサからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、上記のＤＰＰＨラジカル消去剤としては、例えばゴバイシ、パシャンベ、シモツケソウ、ヨウバイヒ、ワレモコウ、茶、フトモモ、チョウジ、メリッサ、シラカバ、バナバ、ユーカリ、ローズマリー、ダイオウ、ケイヒ、ハマメリス、ゲンノショウコ、アセンヤク、紅茶、オトギリソウ、セージ、マロニエ、セイヨウボダイジュ、タイム、ボタンピ、シソ、ガイヨウ、ユキノシタ、チョウトウコウ、ヘンナ、サンショウ、ブドウ葉、センコツ、ハス葉、ラベンダー、キナ、トチュウ、セイヨウノコギリソウ、アイブライト、アルニカ、ハッカ及びビワ葉からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物をそれぞれ挙げることができる。
【００２８】
本発明の美白剤組成物を配合してなる皮膚外用剤には、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用される成分や添加剤を併用することができる。これらの添加成分の具体例を示すと次のとおりである。
【００２９】
界面活性剤としては、例えばセッケン用素地、脂肪酸セッケン、高級アルキル硫酸エステル、アルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、高級脂肪酸アミドスルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、硫酸化油、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸塩、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸塩、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等のアニオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノニウム塩、ジアルキルモルホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等のカチオン界面活性剤。イミダゾリン系界面活性剤、ベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体等の親油性非イオン界面活性剤。ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物、ＰＯＥ硬化ヒマシ油誘導体、ＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体、アルカノールアミド、ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル等の親水性非イオン界面活性剤などを挙げることができる。
【００３０】
また、油類としては、例えばアボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油及びその硬化油。流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油。トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンを挙げることができる。
【００３１】
高級脂肪酸としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などがある。高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール、ホホバアルコール、ラノリンアルコール、バチルアルコール、２−デシルテトラテセシノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール等がある。合成エステルとしては、例えば、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等がある。シリコーンとしては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチルシクロポリシロキサン等の環状ポリシロキサン、シリコーン樹脂等の三次元網目構造のものを挙げることができる。
【００３２】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、アテロコラーゲン、尿素、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、dlピロリドンカルボン酸塩、可溶性コラーゲン、等のほか、各種動植物抽出物、酵母抽出物などを挙げることができる。
【００３３】
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸誘導体等の安息香酸系紫外線吸収剤、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、アミルサシリレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、オクチルシンナメート等の桂皮酸系紫外線吸収剤、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤、４−メチルベンジリデンカンファー、３−ベンジリデンカンファー、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾールなどを挙げることができる。
【００３４】
ビタミン類としては、例えば、ビタミン油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ２類、ピリドキシン塩酸塩等のビタミンＢ６類、Ｌ−アスコルビン酸等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、エルゴカルシフェノール等のビタミンＤ類、ニコチン酸アミド等のニコチン酸類、酢酸トコフェノール等のビタミンＥ類、ビタミンＰ、ビオチンなどを挙げることができる。
【００３５】
天然水溶性高分子としては、例えば、アラビアガム、トラガントガム、ガラクタン、グアガム、キャロブガム、カラヤガム、カラギーナン、ペクチン、カンテン、クインスシード、アルゲコロイド、デンプン、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン、コラーゲン、カゼイン、ヒアルロン酸、アルブミン、ゼラチンなどがある。半合成水溶性高分子としては、例えば、メチルセルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系高分子、カルボキシメチルデンプン等のデンプン系高分子、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸系高分子等がある。合成水溶性高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子、ポリエチレングリコール２０００等のポリオキシエチレン系高分子、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体等の共重合高分子系、ポリアクリルアミド等のアクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオンポリマーなどを挙げることができる。
【００３６】
粉末成分としては、例えば、タルク、カオリン、雲母、セリサイト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、シリカ、硫酸バリウム、焼セッコウ、フッ素アパタイト、セラミックパウダー等の無機粉末、ナイロン粉末、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末などがある。色素剤としては、二酸化チタン、酸化鉄、カーボンブラック、コバルトバイオレツト等の無機顔料、赤色２０１号、赤色３号、黄色２０５号、黄色４号等の有機顔料、クロロフィル、リボフラビン、β−カロチン等の天然色素、ベニバナ、ウコン等の植物抽出物色素等がある。防腐剤としては、安息香酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸塩、パラオキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール等がある。酸化防止剤としては、トコフェノール、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸エステル等がある。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸などを挙げることができる。
【００３７】
そのほか、抗菌、細胞賦活、皮脂分泌調整、消炎、収斂、抗アレルギー等の生理活性作用を有する植物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物を併用することもできる。また、上記以外にも、香料、アルコール、水等を適宜配合することができる。
【００３８】
本発明の美白剤組成物を含有する皮膚外用剤の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系等何れでもよく、使用形態も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、セッケン、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等いずれでもよい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の美白効果向上剤を用いると、美白剤の美白効果を著しく向上させることができ、短期間で、しかも少ない量の美白剤により美白効果を発現させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
次に、参考例及び実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００４１】
参考例１
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００４２】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。得られた沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に再溶解し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２５６単位であり、比活性は３３７２．９単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は６２．４％であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
【００４３】
（ハ）凝集素の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性画分に１００℃、１０分間の熱処理を行い、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は０．８７６３μｇ／ｍｌであった。以上の結果から、本発明の美白効果向上剤を用いると、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分かる。
【００４４】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は２０４８単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００４５】
精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は２０４８単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の美白効果向上剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分かる。
【００４６】
精製標品についてマイトジェン活性を調べるために、ヒトリンパ球幼若化試験を行った。リンパ球幼若化試験は、患者や健常人の末梢血リンパ球のＤＮＡ合成能を測定、比較するのによく用いられる。この反応は一般的な細胞性免疫反応能力を示すと考えられている。測定方法としては、固定染色標本で染色体の出現した細胞数を数える方法、形態学的に観察する方法等もあるが、本例では、3Ｈ−チミジンの細胞核への取り込みを測定する方法を行った。健常人３名分の検体からのリンパ球を用いて実験した。
【００４７】
培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ3 ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量に合わせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。
【００４８】
比較用マイトジェンとしてインゲンマメレクチンを培養液に溶解して濃度１０〜５０μｇ／ｍｌに調製した。滅菌小試験管に分注、密栓して−２０℃で保存した。
【００４９】
リンパ球の分離は次のように行った。すなわち、ヘパリン添加血液よりフィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）法にてリンパ球を分離し、ＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。分離したリンパ球を培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０5個／ｍｌに調整したリンパ球浮遊液を得た。
【００５０】
リンパ球の培養は次のように行った。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注した。次いでマイトジェン溶液として、精製標品、陽性コントロールとしての比較用マイトジェン、陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。次いでＣＯ2濃度５％、３７℃の空気中、湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に3Ｈ−チミジンを培養液中の最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００５１】
活性の測定は次のように行った。すなわち、Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨを用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。十分に乾燥させた後、液体シンチレーターとしてトルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。結果を１検体あたり３回の測定の平均値として表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
この表から、本発明の美白効果向上剤は、従来知られている陸上植物由来の赤血球凝集素よりも高いマイトジェン活性を示すことが分かる。
【００５４】
参考例２
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿質量５００ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−３０℃で凍結した。３０ｍＭ塩化カリウムと３μＭ硫酸亜鉛、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含んだ０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻（ツルシラモ湿質量５００ｇ相当）に対し、抽出用緩衝液８００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００５５】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度３５質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度７０％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し添加終了後、４℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で再溶解し、次いで０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２５６単位であった。
【００５６】
（ハ）凝集素の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性画分を１００℃１分間で熱処理、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。このようにして得た精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２０４８単位であった。以上の結果から、本発明の美白効果向上剤が、その活性を保持したまま得られることが分かる。
【００５７】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を検討したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は２０４８単位であるのに対し、０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００５８】
また、精製標品を１００℃１０分間の熱処理を行った後での凝集活性を測定したところ２０４８単位であり、熱処理による凝集活性の低下は認められなかった。
【００５９】
粗活性画分及び精製標品についてマイトジェン活性を測定した。ヒトリンパ球幼若化試験を行った。
【００６０】
次に、3Ｈ−チミジンの取り込みによる、ヒトリンパ球幼若化試験を行って、粗活性画分と精製標品についてのマイトジェン活性を測定した。この場合、すべての細胞培養に要する材料、例えば、マイクロプレート、セルハーベスター、グラスファイバーフィルター、カウンティングバイアル、3Ｈ−チミジン、トルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）、液体シンチレーションカウンターの準備及びこれらを用いて行う操作はいずれも無菌的に行った。
【００６１】
次に、培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ3 ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量にあわせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。この状態で２か月は保存使用可能であった。使用時には使い切るようにし、凍結融解は繰り返さないようにした。
【００６２】
リンパ球は、ヘパリン添加血液からフィコール・コンレイ法により分離した。次いでＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄したのち、培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０5個／ｍｌに調整した。
【００６３】
リンパ球の培養は、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注して行った。
【００６４】
次いで、リンパ球の入ったマイクロプレートをクリーンブース内に置いた。３つの実験区により実験を行った。紫外線照射を行わず、３０分間クリーンブース内に放置した対照実験区を実験区Ａとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を３０分間行った実験区を実験区Ｂとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を１６時間行った実験区を実験区Ｃとした。紫外線照射は次のように行った。マイクロプレートをクロマトビューポータブル暗箱（フナコシ株式会社製）に入れ、暗箱上部取り付けた６ワット・ハンディ型ＵＶランプＵＶＬ−５６型ブラックレイランプ（フナコシ株式会社製）より、長波長（３６５ｎｍ）の紫外線を照射した。この際の３６５ｎｍの紫外線強度は、デジタル式ＵＶＸ ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ紫外線強度計（フナコシ株式会社製）にＭＯＤＥＬ ＵＶＸ−３６センサー（フナコシ株式会社製）を接続して測定した。マイクロプレートの位置での紫外線強度は、０．６３ｍＷ／ｃｍ2であった。
【００６５】
次いで、それぞれの実験区に対して、マイトジェン溶液として、粗活性画分、精製標品、リン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。粗活性画分は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、実験に供した。粗活性画分での3Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。精製標品は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、希釈液を実験に供した。精製標品での3Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。
次いで５％ＣＯ2含有空気中３７℃の湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に3Ｈ−チミジンを培養液当りの最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００６６】
活性の測定は次のように行った。Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨ等を用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。次いで充分乾燥させた後、液体シンチレーター ５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。実施例１で用いた３人とは別の３人の検体（以下、検体ａ、ｂ及びｃという）からのリンパ球を用いて実験した。ある実験条件での実験数を３回（表には１、２、３と記載）とし、平均は３回の測定の平均値を示す。その検体ａについての結果を表２、検体ｂについての結果を表３、検体ｃについての結果を表４にそれぞれ示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
【００７０】
表２ないし４の実験区Ａから明らかなように、参考例２で得られた粗活性画分及び精製標品からなる本発明の美白効果向上剤は、陰性コントロールと比べて、3Ｈ−チミジンの取り込み量がそれぞれ６００倍以上及び３４００倍以上と著しく多いので、優れたマイトジェン活性を示すことが分かる。
また、表２ないし４の陰性コントロールの平均値から明らかなように、紫外線を照射すると、3Ｈ−チミジンの取り込み量、すなわち免疫力が低下することが分かるが、実験区Ｂ及びＣの結果から明らかなように、本発明の美白効果向上剤を添加することにより、紫外線を照射しても3Ｈ−チミジンの取り込みが促進されることが分かる。
以上の結果から、自己免疫増強成分の粗活性画分・精製標品を紫外線照射処理によりＤＮＡ合成能力（3Ｈ−チミジンの取り込みなど）など免疫力が低下したヒトリンパ球に対して添加することにより、当該リンパ球のＤＮＡ合成能力など免疫力を増強させることができる。また、紫外線照射時間が３０分以内であれば、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合と同等のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができる。紫外線を１６時間照射しても、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合の５０％以上のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができるし、紫外線を照射しなかった陰性コントロールと比較すると、3Ｈ−チミジンの取り込み量がはるかに多いことが分かる。
【００７１】
参考例３
参考例１−（ロ）の粗活性画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エタノールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２７巻、第２０６３〜２０６７ページ（１９８８年）参照］を行った以外は、参考例１と同様にして粗活性画分を得た。この粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４単位、比活性は５３．４単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は５．０％であった。これらの結果を表５に示す。比較のために参考例１の結果も併記した。
【００７２】
参考例４
常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って、紅藻類由来の赤血球凝集素を得た。得られた粗活性画分の赤血球凝集活性は１６単位、比活性は１４９．５単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は１９．５％であった。これらの結果を表５に示す。また、精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は３２．６μｇ／ｍｌであり、参考例１の約１／４０の比活性に相当した。これらの結果を表５に示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】
参考例５
紅藻類から常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って精製した分子量５０，０００の凝集素について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに１０２４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は認められなかった。これらの結果を表６に示す。
【００７５】
参考例６
Ｃｏｎ Ａ［和光純薬（株）製］２５ｍｇをリン酸緩衝液１００ｍｌに溶解し、ウサギ赤血球凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに６４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は認められなかった。これらの結果を表６に示す。比較のために参考例１の結果も併記した。
【００７６】
【表６】
【００７７】
Ｃｏｎ Ａを１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は検出されず、熱処理により凝集活性の消失が認められた。
【００７８】
表５から明らかなように、本発明の美白効果向上剤は、凝集活性、比活性、活性回収率がいずれも高く、活性回収率は参考例３の約１２倍、参考例４の約３倍、比活性は参考例３の約６３倍、参考例４の約２３倍である。また、表６から参考例１の精製凝集素は参考例５及び６のものと異なり、ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により制御されることが分かる。
【００７９】
参考例７
美白剤の有効成分として用いられる植物エキスのチロシナーゼ活性阻害作用について試験した。
（チロシナーゼ活性阻害の評価）
試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、マウス由来Ｂ１６メラノーマ培養細胞を９６穴プレートに５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2にて２４時間培養した後、試験試料の各濃度を添加し、３７℃、５％ＣＯ2にてさらに３日間培養した。チロシナーゼ活性の測定前にウエル中の培地は除去し、ＰＢＳ（−）１００μＬで２回洗浄した。各ウエル中に４５μｌ １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳを加え、１分間プレートを振動させ、細胞膜を破壊し、基質として０．１％のＬ−ＤＯＰＡ溶液を加えて、３７℃にて３時間反応させ、マイクロプレートリーダーにて波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したメラニン量を定量した。また同時にＬｏｗｒｙ法にて細胞の蛋白量を測定し、単位蛋白量あたりのメラニン量を算出した。対照として試料溶液を添加しない（コントロール）細胞を用い、チロシナーゼ活性阻害率とした。試験の結果チロシナーゼ活性阻害作用の評価の高かったものを表７に記す。
本発明では、ＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。一般に、ＩＣ５０が低い値ほど、その活性阻害作用・機能が強いことを意味する。
【００８０】
【表７】
【００８１】
参考例８
美白剤の有効成分として用いられる植物エキスのメラニン産生抑制作用について試験した。
（メラニン生成抑制の評価）
マウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて、３５ｍｍのシャーレに５×１０4ｃｅｌｌずつ播種し、５％ＣＯ2にて３７℃２４時間培養した。２４時間後、シャーレの培地を除去し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２ｍｌと各濃度に溶解した試験試料（各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものをＤＭＳＯに１０％溶解し、さらにＰＢＳ（−）にて希釈して濃度調整）２０μｌ加え、さらに３７℃にて３日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、１．５ｍｌチューブに入れ、２５℃、１２０００回転、１０分間遠心操作し、細胞ペレットを作成した。コントロールには、２０μＬのＰＢＳ（−）を用いた。評価は、下記の評価基準にて行なった。
【００８２】
＜評価基準＞
細胞ペレットの色調
０−コントロールと同様な黒色
１−コントロールに比べわずかに薄い黒色
２−コントロールに比べて明瞭に薄い黒色
３−灰色に近い黒色
４−灰色
５−白色
細胞ペレットの量
１−コントロールに比べ明瞭に少ない
２−コントロールに比べわずかに少ない
３−コントロールと同量
試験結果を表８に示す。
【００８３】
【表８】
【００８４】
参考例９
皮膚機能改善剤として用いられる植物エキスのエステラーゼ活性阻害について試験した。
（エラスターゼ活性阻害の評価）
ヒト線維芽細胞由来エラスターゼ及び合成基質としてＳｕｃ−（Ａｌａ）3−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて評価した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。また、反応緩衝液として、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いた。
【００８５】
（試験方法）
合成基質をＤＭＳＯにて溶解し、１００μｌずつマイクロチューブに分注し凍結保存した。使用時に反応緩衝液を用いて希釈し６ｍＭとした。エラスターゼは、ヒト正常線維芽細胞を１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭにて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で一回洗浄し、０．５％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００／ＰＢＳ（−）を２５μｌ添加、溶解した細胞液を用いた。
９６穴プレートに、それぞれ試験試料２５μＬ、６ｍＭの合成基質５０μｌを加え、直ちに３７℃にて２時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーで４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
【００８６】
測定結果より次式によりエラスターゼ阻害率を算出し、各固形物濃度より、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度を算出した。本発明ではＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。
エラスターゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれ精製水、緩衝液を代わりに用いた。試験結果活性の高かったものを表９に示す。
【００８７】
【表９】
【００８８】
参考例１０
皮膚機能改善剤として用いられる各種植物エキスについてのコラゲナーゼ阻害活性を試験した。
（コラゲナーゼ阻害活性の評価）
Ｗｕｎｓｃｈ−Ｈｅｉｄｒｉｃｈ法を一部変更した方法（薬学雑誌１１８，４２３−４２９，１９９８）により測定した。コラゲナーゼは、Ｓｉｇｍａ社製ＴｙｐｅＩＶを５ｍｇ／ｍｌとし１００μｌずつ分注し凍結保存する。使用時に５０倍希釈し０．１ｍｇ／ｍｌとして使用した。コラゲナーゼ合成基質は、ＰＺ−ペプチド（Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ，Ｂａｃｈｅｍ社製）０．５ｍｇに調製した。希釈液は、ともに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．１，２０ｍＭＣａＣｌ2を含有）を使用した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。
【００８９】
（試験方法）
合成基質４００μｌ、コラゲナーゼ５０μｌ、試験試料５０μｌを加え、３７℃にて３０分間反応させた後、２５ｍＭクエン酸溶液１ｍｌを加えて反応を停止させた。酢酸エチル５ｍｌを加えて激しく振とうさせた後、２５００ｒｐｍにて遠心分離した。酢酸エチル層をとり、３２０ｎｍで吸光度を測定した。
測定結果より次式によりコラゲナーゼ阻害率を算出し、各固形物濃度より、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度を算出した。本発明ではＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。
コラゲナーゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、コラゲナーゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、コラゲナーゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、コラゲナーゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、コラゲナーゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれの水を代わりに用いた。試験結果活性の高かったものを表１０に示す。
【００９０】
【表１０】
【００９１】
参考例１１
皮膚機能改善剤として用いられる各種植物エキスのヒアルロン酸産生促進作用について試験した。
（ヒアルロン酸産生促進作用の評価）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭを用いて、９６穴プレートに２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養後、試験試料含有ＭＥＭに交換し、５日間培養した。培養上清のヒアルロン酸量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。同時にＭＴＴ還元法にて線維芽細胞数を測定し、細胞当たりのヒアルロン酸産生量を算出した。試料を含有しない対照の細胞当たりヒアルロン酸産生量を１００とし、相対値で示した。試験試料は、各植物１０ｇに精製水１００ｇを加え、７０℃にて３時間抽出した後、ろ過し、固形分濃度１％に調製したものを０．５％添加した。試験の結果を表１１に示す。
【００９２】
【表１１】
【００９３】
参考例１２
皮膚機能改善剤として用いられる各種植物エキスのコラーゲン産生促進作用について試験した。
（コラーゲン産生促進作用の評価）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭを用いて、９６穴プレートに２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養後、ＰＢＳ（−）にて洗浄後、試料を添加した無血清培地に交換し、４８時間培養する。培養後、培養上清中に含まれる1型コラーゲンをＥＬＩＳＡ法にて定量した。１００μｌの培養上清をＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、１８時間室温に保管した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、１％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで２時間ブロッキングした。抗ヒトＩ型コラーゲン抗体、ペルオキシダーゼ標準抗ラットＩｇＧ抗体で処理し、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色させた。４５０ｎｍの吸光度から培養上清中に含まれるＩ型コラーゲン量を求め、単位蛋白当たりとして算出した。蛋白定量は、Ｌｏｗｒｙ法を用いた。コントロールのＩ型コラーゲン量を１００とした相対値として評価した。試験試料は、各植物１０ｇに精製水１００ｇを加え、７０℃にて３時間抽出した後、ろ過し、固形分濃度１％に調製したものを０．５％添加した。試験の結果を表１２に示す。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
参考例１３
抗酸化剤として用いられる各種植物エキスの活性酸素消去作用ＳＯＤ様活性作用について試験した。
（活性酸素消去作用ＳＯＤ様活性作用の測定）
ＳＯＤ様活性は、ＮＢＴ法（ＸＯＤ系と組み合わせたＢｅａｕｃｈａｍｐｓらの方法Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ．，４４、２７９〜２８７、１９７１）に従った。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。その結果を表１３に記す。
【００９６】
【表１３】
【００９７】
参考例１４
抗酸化剤として用いられる各種植物エキスについて活性酸素消去作用ＤＰＰＨラジカル消去能の測定を行った。
ＤＰＰＨ（ジフェニルピクリルヒドラジルラジカル）ラジカル（Ｓｉｇｍａ社）をエタノールに溶解し０．１ｍＭ溶液とした。０．１ｍＭＤＰＰＨラジカル溶液３ｍｌを試験管にとり、試験溶液０．５ｍｌを加え、室温で１０分間放置後、波長５１７ｎｍで吸光度を測定した。コントロールには、試験試料の代わりに精製水を用いた。消去能は、ＢＨＡ４２．３μｇ／ｍｌでの反応に対応する試験試料の抽出物固形量で比較した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。その結果を表１４に記す。
【００９８】
【表１４】
【実施例１】
【００９９】
美白剤効果試験
夏期の太陽光に４時間（１日２時間２日間）晒された２０〜２５歳の健常な男女各２５名を被験者とし、左右上腕内側部皮膚を対象として太陽光に晒された日の５日後より、各皮膚外用剤を朝夕１回ずつ４週間塗布した。皮膚外用剤の処方は下記に示す。試験物質の組成は表１５に示す。使用した植物エキスは、市販のもの（香栄興業製）を用いた。また、試験の結果を表１６に示す。
【０１００】
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１６）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら冷却し、クリームを調製した。
成 分 質 量％
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル １２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（10）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（11）キサンタンガム ０．１％
（12）グリセリン １．０％
（13）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（14）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（15）表１５に示す試験物質
（16）精製水 残余
【０１０１】
使用後の淡色化効果を下記の判定基準に基づいて判定した。
【０１０２】
（判定基準）
有効 ：コントロールに比較して明らかな淡色化効果が認められた
やや有効：コントロールに比較して淡色化効果が認められた
効果なし：コントロールとほぼ同程度であった
なお、コントロールは試験物質に代えて精製水を使用した。結果を表１６に示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
【表１６】
【０１０５】
表１６から明らかなように、ツルシラモ粗活性画分を配合したクリームを用いた場合には、配合されていないクリームを用いた場合と比較して顕著な美白効果向上が確認された。また、皮膚機能改善剤、抗酸化剤を添加したものは、美白効果の有効性を増した。これらの試験により、本発明の美白組成物を配合した皮膚外用剤は、日焼け後の皮膚の美白に有効な化粧料であることが確認された。
【０１０６】
以下にさらに、本発明の化粧品処方例を示す。
【実施例２】
【０１０７】
下記成分（７）〜（１１）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（６）及び（１２）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調製した。
成 分 質 量％
（１）クインスシードエキス ８．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（４）オゴノリ粗活性画分 ２．０％
（５）パシャンベ抽出液 １．０％
（６）ブクリョウ抽出液 １．０％
（７）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（８）エチルアルコール ５．０％
（９）β−アルブチン ５．０％
（10）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（11）香料 ０．１％
（12）精製水 残余
【実施例３】
【０１０８】
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１５）及び（１７）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、乳液を調製した。
成 分 質 量％
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合シリノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミレスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（10）アスコルビン酸ステアリル ２．０％
（11）クインスシードエキス ５．０％
（12）オゴノリ粗活性画分 ２．０％
（13）フトモモ抽出物 ２．０％
（14）シモツケソウ抽出液 １．０％
（15）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（16）香料 ０．１％
（17）精製水 残余
【実施例４】
【０１０９】
セッケン製造の定法により下記成分を混合しセッケンを調製した。
成 分 質 量％
（１）セッケン素地 ５３．２％
（２）スクロール １９．４％
（３）ホホバ油 ０．２５％
（４）ツルシラモ粗活性画分 ２．５％
（５）ショウキョウ抽出液 ２．０％
（６）ワレモコウ抽出液 １．０％
（７）濃グリセリン ６．５％
（８）グラブリジン ０．１％
（９）ヒドロキシエタンジホスホン酸 ０．１５％
（10）常水 残余
【実施例５】
【０１１０】
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（８）及び（１０）を７０℃に加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（９）を加えてクレンジングジェルを調製した。
成 分 質 量％
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５８．８％
（３）パラオキシ安息香酸エステル ０．３％
（４）ツルシラモ粗活性画分 １．０％
（５）エラグ酸 ０．５％
（６）パシャンベ抽出液 ０．５％
（７）濃グリセリン ５．９％
（８）ソルビトール ５．０％
（９）香料 ０．１％
（10）精製水 残余
【実施例６】
【０１１１】
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化し、次いでＣ相を加えて均一に溶解し、パック剤を調製した。
成 分 質 量％
（Ａ相）ジプロピレングリコール ５．０％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ５．０％
（Ｂ相）オリーブ油 ５．０％
酢酸トコフェノール ０．２％
パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（Ｃ相）亜硫酸水素ナトリウム ０．０３％
ポリビニルアルコール １３．０％
オゴノリ粗活性画分 １．０％
ブクリョウ抽出液 ０．５％
フトモモ抽出液 ０．５％
エタノール ７．０％
精製水 残余
【実施例７】
【０１１２】
下記成分（１）〜（６）を充分に混合粉砕した粉末部をＡとし、（７）（８）をＢ液、（９）〜（１４）及び（１６）をＣ液とする。Ｃ液を加熱攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに加熱混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、（１５）を加え、さらに室温まで冷却して乳液ファンデーションを調製した。
成 分 質 量％
（１）二酸化チタン １０．３％
（２）セリサイト ５．４％
（３）カオリン ３．０％
（４）黄色酸化鉄 ０．７％
（５）ベンガラ ０．４％
（６）黒色酸化鉄 ０．２％
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン １１．５％
（８）流動パラフィン ８．５％
（９）セスキオレイン酸ソルビタン ３．０％
（10）ツルシラモ粗活性画分 １．５％
（11）フトモモ抽出液 １．５％
（12）チョウジ抽出液 １．５％
（13）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（14）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（15）香料 ０．２％
（16）精製水 残余
【実施例８】
【０１１３】
下記成分（１）〜（７）をブレンダーで均一に混合し、これに（８）〜（１６）を加え、よく混練して固形ファンデーションを調製した。
成 分 質 量％
（１）タルク ４２．４％
（２）カオリン １５．５％
（３）セリサイト １０．０％
（４）亜鉛華 ７．０％
（５）二酸化チタン ３．８％
（６）黄色酸化鉄 ２．９％
（７）黒色酸化鉄 ０．２％
（８）スクワラン ７．５％
（９）イソステアリン酸 ４．０％
（１０）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン ３．０％
（１１）オクタン酸イソセチル ２．０％
（１２）オゴノリ粗活性画分 ０．５％
（１３）パシャンベ抽出液 ０．５％
（１４）サイシン抽出液 ０．５％
（１５）パラオキシ安息香酸エステル ０．１％
（１６）香料 ０．１％
【０１１４】
上記実施例１〜８の皮膚外用剤は、いずれも優れた美白効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の美白効果向上剤は、美白剤組成物の成分として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それ自体は美白作用をほとんど示さないか、或いは示してもわずかであって実用には供し得ないものであるが、美白剤と併用したときに、美白剤の美白効果を著しく向上させる作用を有する美白効果向上剤、その製造方法、それを用いた美白剤組成物及びそれを含有する皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、黒い地肌を白くしたり、日焼けによる黒色化を回復させるための種々の美白剤が知られている。例えば、広く現在使用されている美白作用有効成分であるアスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、α−アルブチン、β−アルブチン、エラグ酸、グラブリジン、アスタキサンチン、ハイドロキノンがある。また、アロエと、アオサ科、オゴノリ科、テングサ科、ミリン科、コンブ科、アイヌワカメ科、ホンダワラ科、ヒバマタ科、フノリ科、ヒトエグサ科、ミル科、ウシケノリ科、スギノリ科、カギノリ科、イバラノリ科、ナガマツモ科、モヅク科、ダービリア科、レッソニア科又はダルス科に属する海藻の抽出物から選択される海藻のエキスとを含有する日焼けによる皮膚のダメージを回復するための皮膚外用剤組成物（特許文献１参照）、ヤナギノリ、ムカデノリ、トサカノリ、オオオゴノリ、クロノリ、マツノリ、イシノハナ、カイメンソウ及びイソノハナの中から選ばれる海藻の抽出物を有効成分とする美白化粧料（特許文献２参照）、褐藻類、紅藻類、緑藻類から選ばれる１種以上の海藻の抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤（特許文献３参照）、ムカデノリ、フダラク、オゴノリ、ヒラキントキ、ツノマタ、オオバツノマタ、ウチワツノマタ及びホソバノトサカモドキよりなる群より選ばれた少なくとも１種の海藻抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤（特許文献４参照）、紅藻類の海藻にアルカリ処理を施した海藻抽出物を含有するメラニン生成抑制剤（特許文献５参照）などがこれまでに提案されている。
【０００３】
しかしながら、これまでの美白剤は、一般に作用が弱いため、長期間にわたって使用しないと、その効果が発揮されないし、また、短期間で効果を発揮させようと強力なものを用いると、皮膚の損傷をもたらすという問題があった。
したがって、穏やかに作用し、かつ急速に効果が発揮される美白剤組成物の出現が要望されていた。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１１６４５８号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献２】特開２０００−２１２０２５号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献３】特開２００１−１３９４１９号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献４】特開２００１−３０２４９１号公報（特許請求の範囲その他）
【特許文献５】特開２００１−３０２４９２号公報（特許請求の範囲その他）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような事情のもとで、それ自体は美白作用を有しないか、又は有していてもわずかであって単独では美白剤として実用に供すことはできないが、これまで使用されている美白剤に配合すると、その美白剤の美白効果を著しく向上させることができる美白効果向上剤を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、美白剤の美白効果を向上させることについて、種々研究を重ねた結果、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）から、特定の条件下で抽出された赤血球凝集素が、凝集活性が高く認識糖鎖選択性が高い上に、イオン強度により凝集活性を制御し、熱処理によって糖結合性が消失せず、認識糖鎖選択性に優れ、かつ細胞性免疫能力賦活などの自己免疫増強活性を有すること、更にこの新規な自己免疫増強剤は、それ自体は美白作用を示さないが、これを美白剤に配合すると、美白剤の美白効果を著しく向上しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とする美白効果向上剤、その製造方法、それを用いた美白剤組成物及び美白剤組成物を含有した皮膚外用剤を提供するものである。
【０００８】
本発明の美白効果向上剤においては、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）を塩類水溶液により抽出した液状抽出物が用いられる。
この液状抽出物としては、オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得た（１）「粗活性画分（沈殿）」、又は粗活性画分を沈殿として分取し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た液状の（２）「粗活性画分（液状）」、又はさらに、所望に応じ、１００℃、１〜１０分間の熱処理によって夾雑タンパク質を除去した（３）「粗活性画分（熱処理済み）」、又はさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製した精製画分が用いられる。
【０００９】
上記の硫酸アンモニウムの飽和濃度は、「グリーン及びヒューズ（Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．＆ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｗ．Ｌ．）著（１９５５）「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、第６７〜９０ページ」に記載されている［結晶硫酸アンモニウムの添加量と濃度（％飽和）との関係に関する表］に基づいて、規定されるものである。
【００１０】
この際用いる塩類水溶液としては、例えば生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液などがあり、特に、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液が好ましい。
【００１１】
上記で得た液状体は、糖を主成分とする赤血球凝集素を含んでいる。このような糖としては、糖を構成している単糖の中のガラクトースの割合が７０〜１００質量％、特に９０〜１００質量％のものが好ましい。本発明の有効成分として上記液状体を用いる場合、糖のほかに糖の質量に対してタンパク質の質量が０.４以下であるタンパク質を含んでいてもよい。
なお、糖の定量は、標準試料としてガラクトースを用いて、フェノール硫酸法によって行い、タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって行う。
【００１２】
この際の原料としては、オゴノリ属紅藻類が用いられるが、特にオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）、それらの亜種が好ましい。本発明においてオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）には、（１）オゴノリ属海藻（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）に分類される海藻、あるいは、（２）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に分類される海藻、あるいは、（３）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に過去に分類された海藻を含む。
【００１３】
例えば、日本産海藻では、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）には、「新日本海藻誌日本産海藻類総覧、吉田忠生著、内田老鶴圃発行、１９９８年」においてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ：グラシラリアレス）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ：グラシラリアシー）に分類されている海藻が含まれている。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。
【００１４】
上記の方法を好適に行うには、上記の紅藻類原料に（イ）水溶性画分の抽出工程、（ロ）粗活性画分の分取工程、及び、必要に応じて、（ハ）凝集素の精製工程を順次施す。
【００１５】
前記各工程について、さらに詳細に説明すると、まず（イ）工程においては、原料の紅藻類に塩類含有水溶液、例えば、生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液、好ましくは、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液を加えてホモゲナイズしたのち、遠心分離処理し、上澄である粗抽出液を得る。
【００１６】
次に（ロ）工程においては、前記（イ）工程で得られた抽出液に、まず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により除去する。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去される。次いで、遠心分離処理で得た上澄に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて２段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により分別したのち、この沈殿画分を塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液で再溶解し、所望に応じ、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対する透析等により精製して粗活性画分を得る。この粗活性画分は、そのまま本発明の美白効果向上剤として用いることができる。
【００１７】
（ロ）工程においては最後に、粗活性画分を１００℃、１〜１０分間熱処理し沈殿した夾雑タンパク質を除去することにより、熱処理済みの粗活性画分を得る。この熱処理済みの粗活性画分は、そのまま本発明の美白効果向上剤として用いることができる。
【００１８】
この熱処理済みの粗活性画分については、所望に応じ、さらに（ハ）工程を行うことができる。（ハ）工程においては、前記（ロ）工程で得られた熱処理済みの粗活性画分を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１０万以上の画分を分画し、さらにクロマトグラフィーにより成分を分離し、精製赤血球凝集素を得る。この際、最終段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーあるいはそれらの組合せを用いるのが有利である。
【００１９】
ここでいう、分子量１０万以上の画分とは、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、球状タンパク質を標準分子量物質として用いて、溶出画分の分子量を算出した結果が１０万以上の分子量に相当する画分をいう。
【００２０】
上記の精製画分・精製標品の０．１ミリリットルをＴＳＫゲル Ｇ３０００ ＰＷＸＬカラムに添加し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムから０．１ミリリットルずつ溶出画分を集める。この際、標準分子量物質として、チログロブリン（分子量６６９，０００）、フェリチン（分子量４４０，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）を用いる。その結果、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素の溶出した画分（赤血球凝集活性の画分）を示す凝集活性を有するピークの頂点は分子量５．６４×１０5に相当することが分かった。
【００２１】
本発明の美白効果向上剤は、美白剤すなわち美白作用をもつ植物抽出物に対し、通常１０：１ないし１：１の割合で配合する。これにより美白剤の美白効果は著しく向上する。上記配合割合は必ずしもこの範囲に限定されることはなく、必要に応じこれよりも少なくしてもよいし、また増加してもよい。
【００２２】
本発明の美白効果向上剤として用いる有効成分はさらに次に示す事項によって特徴付けられる。
（１）プロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されること、
（２）ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化すること、
（３）細胞性免疫能力賦活活性を有すること、
（４）１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有すること、
（５）ヒトリンパ球を幼若化する活性を有すること、
（６）トリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進させること。
【００２３】
本発明の美白効果向上剤は、海藻特に紅藻類由来の新規なものであって、イオン強度により凝集活性が制御でき、認識糖鎖選択性に優れ、細胞性免疫能力賦活など自己免疫増強活性を有し、１００℃、１０分間の熱処理後も糖結合活性を有するという利点がある。更にこのものは美白剤に対し配合することにより、美白剤の美白効果を向上させる。
【００２４】
次に、本発明の美白効果向上剤を配合した美白剤組成物で用いる美白剤としては、これまで美白剤として知られている美白作用を有する成分の中から任意に選んで用いることができる。このような成分として、例えばアスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、α−アルブチン、β−アルブチン、エラグ酸、グラブリジン、アスタキサンチン、ハイドロキノンを挙げることができる。さらに美白作用を有する植物抽出物としては、チロシナーゼ活性阻害剤であるパシャンベ、カンゾウ、アロエ、ソウハクヒ、クジン、シモツケ、トウキ、ベニバナ、紅茶、ユキノシタ、クチナシ、ウコン、茶、ハマメリス、セイヨウネズ、シャクヤク、センキュウ、ユーカリ、メラニン生成阻害剤であるパシャンベ、フトモモ、サンザシ、茶、ユキノシタ、マロニエ、ローズマリー、セイヨウボダイジュ、オトギリソウ、サンショウ、ユーカリ、チョウジ、セージを挙げることができる。これらは単独で用いてもよいし、また２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
この美白剤組成物には、さらにエラスターゼ活性阻害剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロン酸産生促進及びコラーゲン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の皮膚機能改善剤、及び／又はＳＯＤ様活性剤及びＤＰＰＨラジカル消去剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗酸化剤を含有させることができる。
【００２６】
上記のエラスターゼ活性阻害剤としては、ショウキョウ、フトモモ、クジン、パシャンベ、ホホバ葉、イリス、サンヤク、ワレモコウ、アシタバ、ベニバナ、スギナ、オオバナサルスベリ、センキュウ、ヤグルマギク、エイジツ、ニンジン、トウキンセンカ、ローマカミツレ、シモツケソウ、サンキライ、チョウジ、チンピ、ソウハクヒ、サンシシ、ジオウ、アルニカ、センコツ、ショウブ根、モモ葉、キョウニン、メリロート、ユーカリ、ラベンダー、クマザサ、ホオウ、ゼニアオイ、ゲンノショウコ、ブドウ葉、トウヒ、サイシン、ハッカ、ホップ、ローズマリー、エイジツ、シソ、メリッサ、パセリ、キキョウ、紅茶、サンザシ、ハス葉、フキタンポポ、オトギリソウ、ツボクサ、センブリ、コンフリー及びカンゾウからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、上記のコラゲナーゼ活性阻害剤としては、例えばヨウバイヒ、シラカバ、セイヨウボダイジュ、ケイヒ、ワレモコウ、オトギリソウ、フトモモ、マロニエ、パシャンベ、ダイオウ、シモツケソウ、紅茶、ハマメリス、ユーカリ、ゴバイシ、アセンヤク、オオバナサルスベリ、ホホバ葉、ビワ葉、ゲンノショウコ、ボタン、オウレン、ハス葉、ユキノシタ、チョウトウコウ、ブドウ葉、サンザシ、ガイヨウ、ハイビスカス、トチュウ、茶、キナ、ヘンナ、イチョウ、シソ、サンキライ、タイム、セージ、オウバク、オクラ、アルニカ、ホップ及びオウゴンからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、上記のヒアルロン酸産生促進剤としては、例えばブクリョウ、エイジツ、サイシン、ゲンノショウコ、キナ、フキタンポポ、アガリスク、チョウトウコウ、ベニバナ、シコン、ツボクサ、トウキンセンカ、キョウニン、セージ、シラカバ、ジオウ、ハッカ、カラスムギ、ローマカミツレ、オトギリソウ及びヤグルマギクからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、上記のコラーゲン産生促進剤としては、例えばコンフリー、ローマカミツレ、紅茶、サンザシ、ハス葉、クロレラ、ガイヨウ、クマザサ、ゴボウ、クジン、サイシン、ビワ葉、シソ、クワ葉、タイム、オプリア・ストレプタカンサ、トウヒ、オドリコソウ、ワレモコウ、アイブライト、チンピ、ゼニアオイ、ショウキョウ、カミツレ、セイヨウネズ、センブリ、ジオウ、ローズマリー及びセージからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物をそれぞれ挙げることができる。
【００２７】
また、上記のＳＯＤ様活性剤としては、例えばフトモモ、パシャンベ、ヨウバイヒ、ゴバイシ、チョウジ、ホホバ葉、ワレモコウ、マロニエ、シモツケソウ、茶、シラカバ、アセンヤク、メリッサ、オオバナサルスベリ、ケイヒ、紅茶、ゲンノショコ、タイム、ユーカリ、セイヨウボダイジュ、ダイオウ、セージ、ガイヨウ、ハマメリス、ローズマリー、ユキノシタ、ラベンダー、オトギリソウソ、トチュウ、ビワ葉、チョウトウコウ、シソ、ボタンピ、カワラヨモギ、サンショウ、セイヨウノコギリソウ、キナ、アルニカ、ハス葉、オウゴン及びビデンスピローサからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、上記のＤＰＰＨラジカル消去剤としては、例えばゴバイシ、パシャンベ、シモツケソウ、ヨウバイヒ、ワレモコウ、茶、フトモモ、チョウジ、メリッサ、シラカバ、バナバ、ユーカリ、ローズマリー、ダイオウ、ケイヒ、ハマメリス、ゲンノショウコ、アセンヤク、紅茶、オトギリソウ、セージ、マロニエ、セイヨウボダイジュ、タイム、ボタンピ、シソ、ガイヨウ、ユキノシタ、チョウトウコウ、ヘンナ、サンショウ、ブドウ葉、センコツ、ハス葉、ラベンダー、キナ、トチュウ、セイヨウノコギリソウ、アイブライト、アルニカ、ハッカ及びビワ葉からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物をそれぞれ挙げることができる。
【００２８】
本発明の美白剤組成物を配合してなる皮膚外用剤には、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用される成分や添加剤を併用することができる。これらの添加成分の具体例を示すと次のとおりである。
【００２９】
界面活性剤としては、例えばセッケン用素地、脂肪酸セッケン、高級アルキル硫酸エステル、アルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、高級脂肪酸アミドスルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、硫酸化油、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸塩、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸塩、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等のアニオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノニウム塩、ジアルキルモルホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等のカチオン界面活性剤。イミダゾリン系界面活性剤、ベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体等の親油性非イオン界面活性剤。ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物、ＰＯＥ硬化ヒマシ油誘導体、ＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体、アルカノールアミド、ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル等の親水性非イオン界面活性剤などを挙げることができる。
【００３０】
また、油類としては、例えばアボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油及びその硬化油。流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油。トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンを挙げることができる。
【００３１】
高級脂肪酸としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などがある。高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール、ホホバアルコール、ラノリンアルコール、バチルアルコール、２−デシルテトラテセシノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール等がある。合成エステルとしては、例えば、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等がある。シリコーンとしては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチルシクロポリシロキサン等の環状ポリシロキサン、シリコーン樹脂等の三次元網目構造のものを挙げることができる。
【００３２】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、アテロコラーゲン、尿素、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、dlピロリドンカルボン酸塩、可溶性コラーゲン、等のほか、各種動植物抽出物、酵母抽出物などを挙げることができる。
【００３３】
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸誘導体等の安息香酸系紫外線吸収剤、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、アミルサシリレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、オクチルシンナメート等の桂皮酸系紫外線吸収剤、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤、４−メチルベンジリデンカンファー、３−ベンジリデンカンファー、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾールなどを挙げることができる。
【００３４】
ビタミン類としては、例えば、ビタミン油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ２類、ピリドキシン塩酸塩等のビタミンＢ６類、Ｌ−アスコルビン酸等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、エルゴカルシフェノール等のビタミンＤ類、ニコチン酸アミド等のニコチン酸類、酢酸トコフェノール等のビタミンＥ類、ビタミンＰ、ビオチンなどを挙げることができる。
【００３５】
天然水溶性高分子としては、例えば、アラビアガム、トラガントガム、ガラクタン、グアガム、キャロブガム、カラヤガム、カラギーナン、ペクチン、カンテン、クインスシード、アルゲコロイド、デンプン、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン、コラーゲン、カゼイン、ヒアルロン酸、アルブミン、ゼラチンなどがある。半合成水溶性高分子としては、例えば、メチルセルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系高分子、カルボキシメチルデンプン等のデンプン系高分子、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸系高分子等がある。合成水溶性高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子、ポリエチレングリコール２０００等のポリオキシエチレン系高分子、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体等の共重合高分子系、ポリアクリルアミド等のアクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオンポリマーなどを挙げることができる。
【００３６】
粉末成分としては、例えば、タルク、カオリン、雲母、セリサイト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、シリカ、硫酸バリウム、焼セッコウ、フッ素アパタイト、セラミックパウダー等の無機粉末、ナイロン粉末、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末などがある。色素剤としては、二酸化チタン、酸化鉄、カーボンブラック、コバルトバイオレツト等の無機顔料、赤色２０１号、赤色３号、黄色２０５号、黄色４号等の有機顔料、クロロフィル、リボフラビン、β−カロチン等の天然色素、ベニバナ、ウコン等の植物抽出物色素等がある。防腐剤としては、安息香酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸塩、パラオキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール等がある。酸化防止剤としては、トコフェノール、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸エステル等がある。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸などを挙げることができる。
【００３７】
そのほか、抗菌、細胞賦活、皮脂分泌調整、消炎、収斂、抗アレルギー等の生理活性作用を有する植物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物を併用することもできる。また、上記以外にも、香料、アルコール、水等を適宜配合することができる。
【００３８】
本発明の美白剤組成物を含有する皮膚外用剤の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系等何れでもよく、使用形態も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、セッケン、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等いずれでもよい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の美白効果向上剤を用いると、美白剤の美白効果を著しく向上させることができ、短期間で、しかも少ない量の美白剤により美白効果を発現させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
次に、参考例及び実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００４１】
参考例１
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００４２】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。得られた沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に再溶解し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２５６単位であり、比活性は３３７２．９単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は６２．４％であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
【００４３】
（ハ）凝集素の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性画分に１００℃、１０分間の熱処理を行い、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は０．８７６３μｇ／ｍｌであった。以上の結果から、本発明の美白効果向上剤を用いると、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分かる。
【００４４】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は２０４８単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００４５】
精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は２０４８単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の美白効果向上剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分かる。
【００４６】
精製標品についてマイトジェン活性を調べるために、ヒトリンパ球幼若化試験を行った。リンパ球幼若化試験は、患者や健常人の末梢血リンパ球のＤＮＡ合成能を測定、比較するのによく用いられる。この反応は一般的な細胞性免疫反応能力を示すと考えられている。測定方法としては、固定染色標本で染色体の出現した細胞数を数える方法、形態学的に観察する方法等もあるが、本例では、3Ｈ−チミジンの細胞核への取り込みを測定する方法を行った。健常人３名分の検体からのリンパ球を用いて実験した。
【００４７】
培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ3 ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量に合わせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。
【００４８】
比較用マイトジェンとしてインゲンマメレクチンを培養液に溶解して濃度１０〜５０μｇ／ｍｌに調製した。滅菌小試験管に分注、密栓して−２０℃で保存した。
【００４９】
リンパ球の分離は次のように行った。すなわち、ヘパリン添加血液よりフィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）法にてリンパ球を分離し、ＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。分離したリンパ球を培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０5個／ｍｌに調整したリンパ球浮遊液を得た。
【００５０】
リンパ球の培養は次のように行った。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注した。次いでマイトジェン溶液として、精製標品、陽性コントロールとしての比較用マイトジェン、陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。次いでＣＯ2濃度５％、３７℃の空気中、湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に3Ｈ−チミジンを培養液中の最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００５１】
活性の測定は次のように行った。すなわち、Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨを用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。十分に乾燥させた後、液体シンチレーターとしてトルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。結果を１検体あたり３回の測定の平均値として表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
この表から、本発明の美白効果向上剤は、従来知られている陸上植物由来の赤血球凝集素よりも高いマイトジェン活性を示すことが分かる。
【００５４】
参考例２
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿質量５００ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−３０℃で凍結した。３０ｍＭ塩化カリウムと３μＭ硫酸亜鉛、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含んだ０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻（ツルシラモ湿質量５００ｇ相当）に対し、抽出用緩衝液８００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
【００５５】
（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度３５質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度７０％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し添加終了後、４℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で再溶解し、次いで０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２５６単位であった。
【００５６】
（ハ）凝集素の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性画分を１００℃１分間で熱処理、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。このようにして得た精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２０４８単位であった。以上の結果から、本発明の美白効果向上剤が、その活性を保持したまま得られることが分かる。
【００５７】
精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を検討したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は２０４８単位であるのに対し、０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。
【００５８】
また、精製標品を１００℃１０分間の熱処理を行った後での凝集活性を測定したところ２０４８単位であり、熱処理による凝集活性の低下は認められなかった。
【００５９】
粗活性画分及び精製標品についてマイトジェン活性を測定した。ヒトリンパ球幼若化試験を行った。
【００６０】
次に、3Ｈ−チミジンの取り込みによる、ヒトリンパ球幼若化試験を行って、粗活性画分と精製標品についてのマイトジェン活性を測定した。この場合、すべての細胞培養に要する材料、例えば、マイクロプレート、セルハーベスター、グラスファイバーフィルター、カウンティングバイアル、3Ｈ−チミジン、トルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）、液体シンチレーションカウンターの準備及びこれらを用いて行う操作はいずれも無菌的に行った。
【００６１】
次に、培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ3 ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量にあわせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。この状態で２か月は保存使用可能であった。使用時には使い切るようにし、凍結融解は繰り返さないようにした。
【００６２】
リンパ球は、ヘパリン添加血液からフィコール・コンレイ法により分離した。次いでＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄したのち、培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０5個／ｍｌに調整した。
【００６３】
リンパ球の培養は、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注して行った。
【００６４】
次いで、リンパ球の入ったマイクロプレートをクリーンブース内に置いた。３つの実験区により実験を行った。紫外線照射を行わず、３０分間クリーンブース内に放置した対照実験区を実験区Ａとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を３０分間行った実験区を実験区Ｂとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を１６時間行った実験区を実験区Ｃとした。紫外線照射は次のように行った。マイクロプレートをクロマトビューポータブル暗箱（フナコシ株式会社製）に入れ、暗箱上部取り付けた６ワット・ハンディ型ＵＶランプＵＶＬ−５６型ブラックレイランプ（フナコシ株式会社製）より、長波長（３６５ｎｍ）の紫外線を照射した。この際の３６５ｎｍの紫外線強度は、デジタル式ＵＶＸ ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ紫外線強度計（フナコシ株式会社製）にＭＯＤＥＬ ＵＶＸ−３６センサー（フナコシ株式会社製）を接続して測定した。マイクロプレートの位置での紫外線強度は、０．６３ｍＷ／ｃｍ2であった。
【００６５】
次いで、それぞれの実験区に対して、マイトジェン溶液として、粗活性画分、精製標品、リン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。粗活性画分は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、実験に供した。粗活性画分での3Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。精製標品は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、希釈液を実験に供した。精製標品での3Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。
次いで５％ＣＯ2含有空気中３７℃の湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に3Ｈ−チミジンを培養液当りの最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。
【００６６】
活性の測定は次のように行った。Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨ等を用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。次いで充分乾燥させた後、液体シンチレーター ５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。実施例１で用いた３人とは別の３人の検体（以下、検体ａ、ｂ及びｃという）からのリンパ球を用いて実験した。ある実験条件での実験数を３回（表には１、２、３と記載）とし、平均は３回の測定の平均値を示す。その検体ａについての結果を表２、検体ｂについての結果を表３、検体ｃについての結果を表４にそれぞれ示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
【００７０】
表２ないし４の実験区Ａから明らかなように、参考例２で得られた粗活性画分及び精製標品からなる本発明の美白効果向上剤は、陰性コントロールと比べて、3Ｈ−チミジンの取り込み量がそれぞれ６００倍以上及び３４００倍以上と著しく多いので、優れたマイトジェン活性を示すことが分かる。
また、表２ないし４の陰性コントロールの平均値から明らかなように、紫外線を照射すると、3Ｈ−チミジンの取り込み量、すなわち免疫力が低下することが分かるが、実験区Ｂ及びＣの結果から明らかなように、本発明の美白効果向上剤を添加することにより、紫外線を照射しても3Ｈ−チミジンの取り込みが促進されることが分かる。
以上の結果から、自己免疫増強成分の粗活性画分・精製標品を紫外線照射処理によりＤＮＡ合成能力（3Ｈ−チミジンの取り込みなど）など免疫力が低下したヒトリンパ球に対して添加することにより、当該リンパ球のＤＮＡ合成能力など免疫力を増強させることができる。また、紫外線照射時間が３０分以内であれば、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合と同等のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができる。紫外線を１６時間照射しても、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合の５０％以上のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができるし、紫外線を照射しなかった陰性コントロールと比較すると、3Ｈ−チミジンの取り込み量がはるかに多いことが分かる。
【００７１】
参考例３
参考例１−（ロ）の粗活性画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エタノールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２７巻、第２０６３〜２０６７ページ（１９８８年）参照］を行った以外は、参考例１と同様にして粗活性画分を得た。この粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４単位、比活性は５３．４単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は５．０％であった。これらの結果を表５に示す。比較のために参考例１の結果も併記した。
【００７２】
参考例４
常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って、紅藻類由来の赤血球凝集素を得た。得られた粗活性画分の赤血球凝集活性は１６単位、比活性は１４９．５単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は１９．５％であった。これらの結果を表５に示す。また、精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は３２．６μｇ／ｍｌであり、参考例１の約１／４０の比活性に相当した。これらの結果を表５に示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】
参考例５
紅藻類から常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って精製した分子量５０，０００の凝集素について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに１０２４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は認められなかった。これらの結果を表６に示す。
【００７５】
参考例６
Ｃｏｎ Ａ［和光純薬（株）製］２５ｍｇをリン酸緩衝液１００ｍｌに溶解し、ウサギ赤血球凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに６４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は認められなかった。これらの結果を表６に示す。比較のために参考例１の結果も併記した。
【００７６】
【表６】
【００７７】
Ｃｏｎ Ａを１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は検出されず、熱処理により凝集活性の消失が認められた。
【００７８】
表５から明らかなように、本発明の美白効果向上剤は、凝集活性、比活性、活性回収率がいずれも高く、活性回収率は参考例３の約１２倍、参考例４の約３倍、比活性は参考例３の約６３倍、参考例４の約２３倍である。また、表６から参考例１の精製凝集素は参考例５及び６のものと異なり、ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により制御されることが分かる。
【００７９】
参考例７
美白剤の有効成分として用いられる植物エキスのチロシナーゼ活性阻害作用について試験した。
（チロシナーゼ活性阻害の評価）
試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、マウス由来Ｂ１６メラノーマ培養細胞を９６穴プレートに５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2にて２４時間培養した後、試験試料の各濃度を添加し、３７℃、５％ＣＯ2にてさらに３日間培養した。チロシナーゼ活性の測定前にウエル中の培地は除去し、ＰＢＳ（−）１００μＬで２回洗浄した。各ウエル中に４５μｌ １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳを加え、１分間プレートを振動させ、細胞膜を破壊し、基質として０．１％のＬ−ＤＯＰＡ溶液を加えて、３７℃にて３時間反応させ、マイクロプレートリーダーにて波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したメラニン量を定量した。また同時にＬｏｗｒｙ法にて細胞の蛋白量を測定し、単位蛋白量あたりのメラニン量を算出した。対照として試料溶液を添加しない（コントロール）細胞を用い、チロシナーゼ活性阻害率とした。試験の結果チロシナーゼ活性阻害作用の評価の高かったものを表７に記す。
本発明では、ＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。一般に、ＩＣ５０が低い値ほど、その活性阻害作用・機能が強いことを意味する。
【００８０】
【表７】
【００８１】
参考例８
美白剤の有効成分として用いられる植物エキスのメラニン産生抑制作用について試験した。
（メラニン生成抑制の評価）
マウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて、３５ｍｍのシャーレに５×１０4ｃｅｌｌずつ播種し、５％ＣＯ2にて３７℃２４時間培養した。２４時間後、シャーレの培地を除去し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２ｍｌと各濃度に溶解した試験試料（各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものをＤＭＳＯに１０％溶解し、さらにＰＢＳ（−）にて希釈して濃度調整）２０μｌ加え、さらに３７℃にて３日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、１．５ｍｌチューブに入れ、２５℃、１２０００回転、１０分間遠心操作し、細胞ペレットを作成した。コントロールには、２０μＬのＰＢＳ（−）を用いた。評価は、下記の評価基準にて行なった。
【００８２】
＜評価基準＞
細胞ペレットの色調
０−コントロールと同様な黒色
１−コントロールに比べわずかに薄い黒色
２−コントロールに比べて明瞭に薄い黒色
３−灰色に近い黒色
４−灰色
５−白色
細胞ペレットの量
１−コントロールに比べ明瞭に少ない
２−コントロールに比べわずかに少ない
３−コントロールと同量
試験結果を表８に示す。
【００８３】
【表８】
【００８４】
参考例９
皮膚機能改善剤として用いられる植物エキスのエステラーゼ活性阻害について試験した。
（エラスターゼ活性阻害の評価）
ヒト線維芽細胞由来エラスターゼ及び合成基質としてＳｕｃ−（Ａｌａ）3−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて評価した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。また、反応緩衝液として、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いた。
【００８５】
（試験方法）
合成基質をＤＭＳＯにて溶解し、１００μｌずつマイクロチューブに分注し凍結保存した。使用時に反応緩衝液を用いて希釈し６ｍＭとした。エラスターゼは、ヒト正常線維芽細胞を１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭにて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で一回洗浄し、０．５％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００／ＰＢＳ（−）を２５μｌ添加、溶解した細胞液を用いた。
９６穴プレートに、それぞれ試験試料２５μＬ、６ｍＭの合成基質５０μｌを加え、直ちに３７℃にて２時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーで４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
【００８６】
測定結果より次式によりエラスターゼ阻害率を算出し、各固形物濃度より、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度を算出した。本発明ではＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。
エラスターゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれ精製水、緩衝液を代わりに用いた。試験結果活性の高かったものを表９に示す。
【００８７】
【表９】
【００８８】
参考例１０
皮膚機能改善剤として用いられる各種植物エキスについてのコラゲナーゼ阻害活性を試験した。
（コラゲナーゼ阻害活性の評価）
Ｗｕｎｓｃｈ−Ｈｅｉｄｒｉｃｈ法を一部変更した方法（薬学雑誌１１８，４２３−４２９，１９９８）により測定した。コラゲナーゼは、Ｓｉｇｍａ社製ＴｙｐｅＩＶを５ｍｇ／ｍｌとし１００μｌずつ分注し凍結保存する。使用時に５０倍希釈し０．１ｍｇ／ｍｌとして使用した。コラゲナーゼ合成基質は、ＰＺ−ペプチド（Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ，Ｂａｃｈｅｍ社製）０．５ｍｇに調製した。希釈液は、ともに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．１，２０ｍＭＣａＣｌ2を含有）を使用した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。
【００８９】
（試験方法）
合成基質４００μｌ、コラゲナーゼ５０μｌ、試験試料５０μｌを加え、３７℃にて３０分間反応させた後、２５ｍＭクエン酸溶液１ｍｌを加えて反応を停止させた。酢酸エチル５ｍｌを加えて激しく振とうさせた後、２５００ｒｐｍにて遠心分離した。酢酸エチル層をとり、３２０ｎｍで吸光度を測定した。
測定結果より次式によりコラゲナーゼ阻害率を算出し、各固形物濃度より、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度を算出した。本発明ではＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。
コラゲナーゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、コラゲナーゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、コラゲナーゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、コラゲナーゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、コラゲナーゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれの水を代わりに用いた。試験結果活性の高かったものを表１０に示す。
【００９０】
【表１０】
【００９１】
参考例１１
皮膚機能改善剤として用いられる各種植物エキスのヒアルロン酸産生促進作用について試験した。
（ヒアルロン酸産生促進作用の評価）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭを用いて、９６穴プレートに２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養後、試験試料含有ＭＥＭに交換し、５日間培養した。培養上清のヒアルロン酸量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。同時にＭＴＴ還元法にて線維芽細胞数を測定し、細胞当たりのヒアルロン酸産生量を算出した。試料を含有しない対照の細胞当たりヒアルロン酸産生量を１００とし、相対値で示した。試験試料は、各植物１０ｇに精製水１００ｇを加え、７０℃にて３時間抽出した後、ろ過し、固形分濃度１％に調製したものを０．５％添加した。試験の結果を表１１に示す。
【００９２】
【表１１】
【００９３】
参考例１２
皮膚機能改善剤として用いられる各種植物エキスのコラーゲン産生促進作用について試験した。
（コラーゲン産生促進作用の評価）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭを用いて、９６穴プレートに２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養後、ＰＢＳ（−）にて洗浄後、試料を添加した無血清培地に交換し、４８時間培養する。培養後、培養上清中に含まれる1型コラーゲンをＥＬＩＳＡ法にて定量した。１００μｌの培養上清をＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、１８時間室温に保管した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、１％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで２時間ブロッキングした。抗ヒトＩ型コラーゲン抗体、ペルオキシダーゼ標準抗ラットＩｇＧ抗体で処理し、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色させた。４５０ｎｍの吸光度から培養上清中に含まれるＩ型コラーゲン量を求め、単位蛋白当たりとして算出した。蛋白定量は、Ｌｏｗｒｙ法を用いた。コントロールのＩ型コラーゲン量を１００とした相対値として評価した。試験試料は、各植物１０ｇに精製水１００ｇを加え、７０℃にて３時間抽出した後、ろ過し、固形分濃度１％に調製したものを０．５％添加した。試験の結果を表１２に示す。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
参考例１３
抗酸化剤として用いられる各種植物エキスの活性酸素消去作用ＳＯＤ様活性作用について試験した。
（活性酸素消去作用ＳＯＤ様活性作用の測定）
ＳＯＤ様活性は、ＮＢＴ法（ＸＯＤ系と組み合わせたＢｅａｕｃｈａｍｐｓらの方法Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ．，４４、２７９〜２８７、１９７１）に従った。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。その結果を表１３に記す。
【００９６】
【表１３】
【００９７】
参考例１４
抗酸化剤として用いられる各種植物エキスについて活性酸素消去作用ＤＰＰＨラジカル消去能の測定を行った。
ＤＰＰＨ（ジフェニルピクリルヒドラジルラジカル）ラジカル（Ｓｉｇｍａ社）をエタノールに溶解し０．１ｍＭ溶液とした。０．１ｍＭＤＰＰＨラジカル溶液３ｍｌを試験管にとり、試験溶液０．５ｍｌを加え、室温で１０分間放置後、波長５１７ｎｍで吸光度を測定した。コントロールには、試験試料の代わりに精製水を用いた。消去能は、ＢＨＡ４２．３μｇ／ｍｌでの反応に対応する試験試料の抽出物固形量で比較した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。その結果を表１４に記す。
【００９８】
【表１４】
【実施例１】
【００９９】
美白剤効果試験
夏期の太陽光に４時間（１日２時間２日間）晒された２０〜２５歳の健常な男女各２５名を被験者とし、左右上腕内側部皮膚を対象として太陽光に晒された日の５日後より、各皮膚外用剤を朝夕１回ずつ４週間塗布した。皮膚外用剤の処方は下記に示す。試験物質の組成は表１５に示す。使用した植物エキスは、市販のもの（香栄興業製）を用いた。また、試験の結果を表１６に示す。
【０１００】
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１６）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら冷却し、クリームを調製した。
成 分 質 量％
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル １２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（10）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（11）キサンタンガム ０．１％
（12）グリセリン １．０％
（13）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（14）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（15）表１５に示す試験物質
（16）精製水 残余
【０１０１】
使用後の淡色化効果を下記の判定基準に基づいて判定した。
【０１０２】
（判定基準）
有効 ：コントロールに比較して明らかな淡色化効果が認められた
やや有効：コントロールに比較して淡色化効果が認められた
効果なし：コントロールとほぼ同程度であった
なお、コントロールは試験物質に代えて精製水を使用した。結果を表１６に示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
【表１６】
【０１０５】
表１６から明らかなように、ツルシラモ粗活性画分を配合したクリームを用いた場合には、配合されていないクリームを用いた場合と比較して顕著な美白効果向上が確認された。また、皮膚機能改善剤、抗酸化剤を添加したものは、美白効果の有効性を増した。これらの試験により、本発明の美白組成物を配合した皮膚外用剤は、日焼け後の皮膚の美白に有効な化粧料であることが確認された。
【０１０６】
以下にさらに、本発明の化粧品処方例を示す。
【実施例２】
【０１０７】
下記成分（７）〜（１１）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（６）及び（１２）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調製した。
成 分 質 量％
（１）クインスシードエキス ８．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（４）オゴノリ粗活性画分 ２．０％
（５）パシャンベ抽出液 １．０％
（６）ブクリョウ抽出液 １．０％
（７）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（８）エチルアルコール ５．０％
（９）β−アルブチン ５．０％
（10）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（11）香料 ０．１％
（12）精製水 残余
【実施例３】
【０１０８】
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１５）及び（１７）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、乳液を調製した。
成 分 質 量％
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合シリノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミレスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（10）アスコルビン酸ステアリル ２．０％
（11）クインスシードエキス ５．０％
（12）オゴノリ粗活性画分 ２．０％
（13）フトモモ抽出物 ２．０％
（14）シモツケソウ抽出液 １．０％
（15）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（16）香料 ０．１％
（17）精製水 残余
【実施例４】
【０１０９】
セッケン製造の定法により下記成分を混合しセッケンを調製した。
成 分 質 量％
（１）セッケン素地 ５３．２％
（２）スクロール １９．４％
（３）ホホバ油 ０．２５％
（４）ツルシラモ粗活性画分 ２．５％
（５）ショウキョウ抽出液 ２．０％
（６）ワレモコウ抽出液 １．０％
（７）濃グリセリン ６．５％
（８）グラブリジン ０．１％
（９）ヒドロキシエタンジホスホン酸 ０．１５％
（10）常水 残余
【実施例５】
【０１１０】
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（８）及び（１０）を７０℃に加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（９）を加えてクレンジングジェルを調製した。
成 分 質 量％
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５８．８％
（３）パラオキシ安息香酸エステル ０．３％
（４）ツルシラモ粗活性画分 １．０％
（５）エラグ酸 ０．５％
（６）パシャンベ抽出液 ０．５％
（７）濃グリセリン ５．９％
（８）ソルビトール ５．０％
（９）香料 ０．１％
（10）精製水 残余
【実施例６】
【０１１１】
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化し、次いでＣ相を加えて均一に溶解し、パック剤を調製した。
成 分 質 量％
（Ａ相）ジプロピレングリコール ５．０％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ５．０％
（Ｂ相）オリーブ油 ５．０％
酢酸トコフェノール ０．２％
パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（Ｃ相）亜硫酸水素ナトリウム ０．０３％
ポリビニルアルコール １３．０％
オゴノリ粗活性画分 １．０％
ブクリョウ抽出液 ０．５％
フトモモ抽出液 ０．５％
エタノール ７．０％
精製水 残余
【実施例７】
【０１１２】
下記成分（１）〜（６）を充分に混合粉砕した粉末部をＡとし、（７）（８）をＢ液、（９）〜（１４）及び（１６）をＣ液とする。Ｃ液を加熱攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに加熱混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、（１５）を加え、さらに室温まで冷却して乳液ファンデーションを調製した。
成 分 質 量％
（１）二酸化チタン １０．３％
（２）セリサイト ５．４％
（３）カオリン ３．０％
（４）黄色酸化鉄 ０．７％
（５）ベンガラ ０．４％
（６）黒色酸化鉄 ０．２％
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン １１．５％
（８）流動パラフィン ８．５％
（９）セスキオレイン酸ソルビタン ３．０％
（10）ツルシラモ粗活性画分 １．５％
（11）フトモモ抽出液 １．５％
（12）チョウジ抽出液 １．５％
（13）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（14）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（15）香料 ０．２％
（16）精製水 残余
【実施例８】
【０１１３】
下記成分（１）〜（７）をブレンダーで均一に混合し、これに（８）〜（１６）を加え、よく混練して固形ファンデーションを調製した。
成 分 質 量％
（１）タルク ４２．４％
（２）カオリン １５．５％
（３）セリサイト １０．０％
（４）亜鉛華 ７．０％
（５）二酸化チタン ３．８％
（６）黄色酸化鉄 ２．９％
（７）黒色酸化鉄 ０．２％
（８）スクワラン ７．５％
（９）イソステアリン酸 ４．０％
（１０）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン ３．０％
（１１）オクタン酸イソセチル ２．０％
（１２）オゴノリ粗活性画分 ０．５％
（１３）パシャンベ抽出液 ０．５％
（１４）サイシン抽出液 ０．５％
（１５）パラオキシ安息香酸エステル ０．１％
（１６）香料 ０．１％
【０１１４】
上記実施例１〜８の皮膚外用剤は、いずれも優れた美白効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の美白効果向上剤は、美白剤組成物の成分として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とする美白効果向上剤。
【請求項２】
海藻がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１記載の美白効果向上剤。
【請求項３】
液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１又は２記載の美白効果向上剤。
【請求項４】
液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし３のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項５】
液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項６】
液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項７】
液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし６のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項８】
液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし７のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項９】
液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１０】
液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下である請求項１ないし８のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１１】
液状抽出物が１〜６０質量％の硫酸を含む請求項１ないし１０のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１２】
液状抽出物が海藻を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて不溶解分を除去し、その抽出液にさらに最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え、沈殿として回収した自己免疫増強剤の粗活性画分、あるいはその沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た粗活性画分の液状抽出物である請求項１ないし１１のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１３】
液状抽出物が海藻を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて不溶解分を除去し、その抽出液にさらに最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え、自己免疫増強剤の粗活性画分を沈殿として回収し、その沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た粗活性化画分の液状抽出物に対して１００℃において１〜１０分間熱処理し夾雑タンパク質を除去した、自己免疫増強剤の粗活性画分の熱処理物である請求項１ないし１１のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１４】
液状抽出物が海藻を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて不溶解分を除去し、その抽出液にさらに最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え、自己免疫増強剤の粗活性画分を沈殿として回収し、その沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た粗活性化画分の液状抽出物に対して１００℃において１〜１０分間熱処理し夾雑タンパク質を除去したのち、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製した自己免疫増強剤の精製画分である請求項１ないし１３のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１５】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集することを特徴とする美白効果向上剤の製造方法。
【請求項１６】
液状抽出物をさらに１００℃において１〜１０分間熱処理して夾雑タンパク質を除去し、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製する請求項１５記載の美白効果向上剤の製造方法。
【請求項１７】
塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１５又は１６記載の美白効果向上剤の製造方法。
【請求項１８】
塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１５又は１６記載の皮膚老化防止効果向上剤の製造方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１４のいずれか記載の美白効果向上剤を含有する（Ａ）美白剤及び／又は（Ｂ）チロシナーゼ活性作用又はメラニン産生抑制作用を有する植物抽出物からなる美白剤組成物。
【請求項２０】
（Ａ）の美白剤が、アスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、α―アルブチン、β−アルブチン、エラグ酸、グラブリジン、アスタキサンチン、ハイドロキノンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１９記載の美白剤組成物。
【請求項２１】
（Ｂ）のチロシナーゼ活性阻害作用を有する植物抽出物が、パシャンベ、カンゾウ、アロエ、ソウハクヒ、クジン、シモツケ、トウキ、ベニバナ、紅茶、ユキノシタ、クチナシ、ウコン、茶、ハマメリス、セイヨウネズ、シャクヤク、センキュウ、ユーカリの群より選ばれる少なくとも１種、メラニン産生抑制作用を有する植物抽出物が、パシャンベ、フトモモ、サンザシ、茶、ユキノシタ、マロニエ、ローズマリー、セイヨウボダイジュ、オトギリソウ、サンショウ、ユウカリ、チョウジ、セージの群より選ばれる少なくとも１種である請求項１９ないし２０記載の美白剤組成物。
【請求項２２】
エラスターゼ活性阻害剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及びコラーゲン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の皮膚機能改善剤、及び／又はＳＯＤ様活性剤及びＤＰＰＨラジカル消去剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗酸化剤を含有する請求項１９、２０又は２１記載の美白剤組成物。
【請求項２３】
エラスターゼ活性阻害剤が、ショウキョウ、フトモモ、クジン、パシャンベ、ホホバ葉、イリス、サンヤク、ワレモコウ、アシタバ、ベニバナ、スギナ、オオバナサルスベリ、センキュウ、ヤグルマギク、エイジツ、ニンジン、トウキンセンカ、ローマカミツレ、シモツケソウ、サンキライ、チョウジ、チンピ、ソウハクヒ、サンシシ、ジオウ、アルニカ、センコツ、ショウブ根、モモ葉、キョウニン、メリロート、ユーカリ、ラベンダー、クマザサ、ホオウ、ゼニアオイ、ゲンノショウコ、ブドウ葉、トウヒ、サイシン、ハッカ、ホップ、ローズマリー、エイジツ、シソ、メリッサ、パセリ、キキョウ、紅茶、サンザシ、ハス葉、フキタンポポ、オトギリソウ、ツボクサ、センブリ、コンフリー及びカンゾウからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、コラゲナーゼ活性阻害剤が、ヨウバイヒ、シラカバ、セイヨウボダイジュ、ケイヒ、ワレモコウ、オトギリソウ、フトモモ、マロニエ、パシャンベ、ダイオウ、シモツケソウ、紅茶、ハマメリス、ユーカリ、ゴバイシ、アセンヤク、オオバナサルスベリ、ホホバ葉、ビワ葉、ゲンノショウコ、ボタン、オウレン、ハス葉、ユキノシタ、チョウトウコウ、ブドウ葉、サンザシ、ガイヨウ、ハイビスカス、トチュウ、茶、キナ、ヘンナ、イチョウ、シソ、サンキライ、タイム、セージ、オウバク、オクラ、アルニカ、ホップ及びオウゴンからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、ヒアルロン酸産生促進剤が、ブクリョウ、エイジツ、サイシン、ゲンノショウコ、キナ、フキタンポポ、アガリスク、チョウトウコウ、ベニバナ、シコン、ツボクサ、トウキンセンカ、キョウニン、セージ、シラカバ、ジオウ、ハッカ、カラスムギ、ローマカミツレ、オトギリソウ及びヤグルマギクからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、コラーゲン産生促進剤が、コンフリー、ローマカミツレ、紅茶、サンザシ、ハス葉、クロレラ、ガイヨウ、クマザサ、ゴボウ、クジン、サイシン、ビワ葉、シソ、クワ葉、タイム、オプリア・ストレプタカンサ、トウヒ、オドリコソウ、ワレモコウ、アイブライト、チンピ、ゼニアオイ、ショウキョウ、カミツレ、セイヨウネズ、センブリ、ジオウ、ローズマリー及びセージからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物である請求項２２記載の美白剤組成物。
【請求項２４】
ＳＯＤ様活性剤が、フトモモ、パシャンベ、ヨウバイヒ、ゴバイシ、チョウジ、ホホバ葉、ワレモコウ、マロニエ、シモツケソウ、茶、シラカバ、アセンヤク、メリッサ、オオバナサルスベリ、ケイヒ、紅茶、ゲンノショコ、タイム、ユーカリ、セイヨウボダイジュ、ダイオウ、セージ、ガイヨウ、ハマメリス、ローズマリー、ユキノシタ、ラベンダー、オトギリソウソ、トチュウ、ビワ葉、チョウトウコウ、シソ、ボタンピ、カワラヨモギ、サンショウ、セイヨウノコギリソウ、キナ、アルニカ、ハス葉、オウゴン及びビデンスピローサからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、ＤＰＰＨラジカル消去剤が、ゴバイシ、パシャンベ、シモツケソウ、ヨウバイヒ、ワレモコウ、茶、フトモモ、チョウジ、メリッサ、シラカバ、バナバ、ユーカリ、ローズマリー、ダイオウ、ケイヒ、ハマメリス、ゲンノショウコ、アセンヤク、紅茶、オトギリソウ、セージ、マロニエ、セイヨウボダイジュ、タイム、ボタンピ、シソ、ガイヨウ、ユキノシタ、チョウトウコウ、ヘンナ、サンショウ、ブドウ葉、センコツ、ハス葉、ラベンダー、キナ、トチュウ、セイヨウノコギリソウ、アイブライト、アルニカ、ハッカ及びビワ葉からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物である請求項２２記載の美白剤組成物。
【請求項２５】
請求項１９ないし２４のいずれかに記載の美白剤組成物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項１】
オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とする美白効果向上剤。
【請求項２】
海藻がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１記載の美白効果向上剤。
【請求項３】
液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１又は２記載の美白効果向上剤。
【請求項４】
液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし３のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項５】
液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項６】
液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項７】
液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし６のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項８】
液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし７のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項９】
液状抽出物がトリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１０】
液状抽出物が糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し０．４以下である請求項１ないし８のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１１】
液状抽出物が１〜６０質量％の硫酸を含む請求項１ないし１０のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１２】
液状抽出物が海藻を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて不溶解分を除去し、その抽出液にさらに最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え、沈殿として回収した自己免疫増強剤の粗活性画分、あるいはその沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た粗活性画分の液状抽出物である請求項１ないし１１のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１３】
液状抽出物が海藻を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて不溶解分を除去し、その抽出液にさらに最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え、自己免疫増強剤の粗活性画分を沈殿として回収し、その沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た粗活性化画分の液状抽出物に対して１００℃において１〜１０分間熱処理し夾雑タンパク質を除去した、自己免疫増強剤の粗活性画分の熱処理物である請求項１ないし１１のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１４】
液状抽出物が海藻を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて不溶解分を除去し、その抽出液にさらに最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加え、自己免疫増強剤の粗活性画分を沈殿として回収し、その沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た粗活性化画分の液状抽出物に対して１００℃において１〜１０分間熱処理し夾雑タンパク質を除去したのち、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製した自己免疫増強剤の精製画分である請求項１ないし１３のいずれかに記載の美白効果向上剤。
【請求項１５】
オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集することを特徴とする美白効果向上剤の製造方法。
【請求項１６】
液状抽出物をさらに１００℃において１〜１０分間熱処理して夾雑タンパク質を除去し、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製する請求項１５記載の美白効果向上剤の製造方法。
【請求項１７】
塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１５又は１６記載の美白効果向上剤の製造方法。
【請求項１８】
塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１５又は１６記載の皮膚老化防止効果向上剤の製造方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１４のいずれか記載の美白効果向上剤を含有する（Ａ）美白剤及び／又は（Ｂ）チロシナーゼ活性作用又はメラニン産生抑制作用を有する植物抽出物からなる美白剤組成物。
【請求項２０】
（Ａ）の美白剤が、アスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、α―アルブチン、β−アルブチン、エラグ酸、グラブリジン、アスタキサンチン、ハイドロキノンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１９記載の美白剤組成物。
【請求項２１】
（Ｂ）のチロシナーゼ活性阻害作用を有する植物抽出物が、パシャンベ、カンゾウ、アロエ、ソウハクヒ、クジン、シモツケ、トウキ、ベニバナ、紅茶、ユキノシタ、クチナシ、ウコン、茶、ハマメリス、セイヨウネズ、シャクヤク、センキュウ、ユーカリの群より選ばれる少なくとも１種、メラニン産生抑制作用を有する植物抽出物が、パシャンベ、フトモモ、サンザシ、茶、ユキノシタ、マロニエ、ローズマリー、セイヨウボダイジュ、オトギリソウ、サンショウ、ユウカリ、チョウジ、セージの群より選ばれる少なくとも１種である請求項１９ないし２０記載の美白剤組成物。
【請求項２２】
エラスターゼ活性阻害剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及びコラーゲン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の皮膚機能改善剤、及び／又はＳＯＤ様活性剤及びＤＰＰＨラジカル消去剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の抗酸化剤を含有する請求項１９、２０又は２１記載の美白剤組成物。
【請求項２３】
エラスターゼ活性阻害剤が、ショウキョウ、フトモモ、クジン、パシャンベ、ホホバ葉、イリス、サンヤク、ワレモコウ、アシタバ、ベニバナ、スギナ、オオバナサルスベリ、センキュウ、ヤグルマギク、エイジツ、ニンジン、トウキンセンカ、ローマカミツレ、シモツケソウ、サンキライ、チョウジ、チンピ、ソウハクヒ、サンシシ、ジオウ、アルニカ、センコツ、ショウブ根、モモ葉、キョウニン、メリロート、ユーカリ、ラベンダー、クマザサ、ホオウ、ゼニアオイ、ゲンノショウコ、ブドウ葉、トウヒ、サイシン、ハッカ、ホップ、ローズマリー、エイジツ、シソ、メリッサ、パセリ、キキョウ、紅茶、サンザシ、ハス葉、フキタンポポ、オトギリソウ、ツボクサ、センブリ、コンフリー及びカンゾウからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、コラゲナーゼ活性阻害剤が、ヨウバイヒ、シラカバ、セイヨウボダイジュ、ケイヒ、ワレモコウ、オトギリソウ、フトモモ、マロニエ、パシャンベ、ダイオウ、シモツケソウ、紅茶、ハマメリス、ユーカリ、ゴバイシ、アセンヤク、オオバナサルスベリ、ホホバ葉、ビワ葉、ゲンノショウコ、ボタン、オウレン、ハス葉、ユキノシタ、チョウトウコウ、ブドウ葉、サンザシ、ガイヨウ、ハイビスカス、トチュウ、茶、キナ、ヘンナ、イチョウ、シソ、サンキライ、タイム、セージ、オウバク、オクラ、アルニカ、ホップ及びオウゴンからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、ヒアルロン酸産生促進剤が、ブクリョウ、エイジツ、サイシン、ゲンノショウコ、キナ、フキタンポポ、アガリスク、チョウトウコウ、ベニバナ、シコン、ツボクサ、トウキンセンカ、キョウニン、セージ、シラカバ、ジオウ、ハッカ、カラスムギ、ローマカミツレ、オトギリソウ及びヤグルマギクからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、コラーゲン産生促進剤が、コンフリー、ローマカミツレ、紅茶、サンザシ、ハス葉、クロレラ、ガイヨウ、クマザサ、ゴボウ、クジン、サイシン、ビワ葉、シソ、クワ葉、タイム、オプリア・ストレプタカンサ、トウヒ、オドリコソウ、ワレモコウ、アイブライト、チンピ、ゼニアオイ、ショウキョウ、カミツレ、セイヨウネズ、センブリ、ジオウ、ローズマリー及びセージからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物である請求項２２記載の美白剤組成物。
【請求項２４】
ＳＯＤ様活性剤が、フトモモ、パシャンベ、ヨウバイヒ、ゴバイシ、チョウジ、ホホバ葉、ワレモコウ、マロニエ、シモツケソウ、茶、シラカバ、アセンヤク、メリッサ、オオバナサルスベリ、ケイヒ、紅茶、ゲンノショコ、タイム、ユーカリ、セイヨウボダイジュ、ダイオウ、セージ、ガイヨウ、ハマメリス、ローズマリー、ユキノシタ、ラベンダー、オトギリソウソ、トチュウ、ビワ葉、チョウトウコウ、シソ、ボタンピ、カワラヨモギ、サンショウ、セイヨウノコギリソウ、キナ、アルニカ、ハス葉、オウゴン及びビデンスピローサからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物、ＤＰＰＨラジカル消去剤が、ゴバイシ、パシャンベ、シモツケソウ、ヨウバイヒ、ワレモコウ、茶、フトモモ、チョウジ、メリッサ、シラカバ、バナバ、ユーカリ、ローズマリー、ダイオウ、ケイヒ、ハマメリス、ゲンノショウコ、アセンヤク、紅茶、オトギリソウ、セージ、マロニエ、セイヨウボダイジュ、タイム、ボタンピ、シソ、ガイヨウ、ユキノシタ、チョウトウコウ、ヘンナ、サンショウ、ブドウ葉、センコツ、ハス葉、ラベンダー、キナ、トチュウ、セイヨウノコギリソウ、アイブライト、アルニカ、ハッカ及びビワ葉からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物である請求項２２記載の美白剤組成物。
【請求項２５】
請求項１９ないし２４のいずれかに記載の美白剤組成物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【公開番号】特開２００６−１０４１１８（Ｐ２００６−１０４１１８Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９２０２６（Ｐ２００４−２９２０２６）
【出願日】平成１６年１０月４日（２００４．１０．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度経済産業省受託研究 地域中小企業支援型研究開発「海藻由来の自己免疫増強剤の化粧品原料への実用化研究」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（５９９０００２１２）香栄興業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月４日（２００４．１０．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度経済産業省受託研究 地域中小企業支援型研究開発「海藻由来の自己免疫増強剤の化粧品原料への実用化研究」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（５９９０００２１２）香栄興業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
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