耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌より組成を制御可能なキシロオリゴ糖を製造する方法
【課題】耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌より組成を制御可能なキシロオリゴ糖を製造する方法の提供。
【解決手段】本発明は耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌（Bacillus halodurans)より制御可能な組成のキシロオリゴ糖を製造する方法を提供し、それによると、植物材料を利用して耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養して、耐アルカリ性、耐高温のキシラナーゼを取得し、さらに該キシリナーゼとキシラン原料を反応させてキシロオリゴ糖を得る。並びに該植物材料の違いを利用し、異なるキシロオリゴ糖組成の最終製品を得られる。該植物材料は、カバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマ、或いはこれらの任意の組合せとされる。
【解決手段】本発明は耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌（Bacillus halodurans)より制御可能な組成のキシロオリゴ糖を製造する方法を提供し、それによると、植物材料を利用して耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養して、耐アルカリ性、耐高温のキシラナーゼを取得し、さらに該キシリナーゼとキシラン原料を反応させてキシロオリゴ糖を得る。並びに該植物材料の違いを利用し、異なるキシロオリゴ糖組成の最終製品を得られる。該植物材料は、カバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマ、或いはこれらの任意の組合せとされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一種のキシロオリゴ糖の製造方法に係り、特に一種の、異なるキシロオリゴ糖の組成比を制御可能である製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にオリゴ糖の長所は、腸内微生物群を改善し、腸内腐敗物質の発生を減らし、血液内脂質過多を改善し、コレステロールを減らし、便秘現象を減らし、虫歯を防止し、免疫賦活性を増強し、カルシウムの吸収を促進する、等である。キシロオリゴ糖とフラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、異麦芽オリゴ糖等は低消化性オリゴ糖に属し、人体が代謝できないが、多種類の機能特性を有し、例えば、腸内ビフィルス菌を増殖させ、虫歯を引き起こしにくい。このためそれは腸のプロバイオティクス、特にビフィズス菌及び乳酸桿菌を増殖させることができ、これらのオリゴ糖はプレバイオティクス(prebiotics)に属し、プロバイオティクスの生長を促進する物質である。
【０００３】
キシロオリゴ糖(xylooligosaccharide) は、２〜７個のキシロース(xylose)がグリコシド結合してなるオリゴ糖の総称である。キシロオリゴ糖はオリゴ糖中で、ビフィルス菌を増殖させる機能が最も優れている一種であり、その他の同類のオリゴ糖の５−２０倍である。
【０００４】
現在市場には、すでにキシロオリゴ糖の製品が市販され、キシロオリゴ糖は植物材料、例えば、フスマ(wheat bran)、トウモロコシの穂軸(corn-cob)より製造される。植物材料の組成中には大量のキシラン(xylan) が含有され、キシラン主鎖上の側鎖は、キシラン以外の糖類、例えばグルクロン酸(glucuronic acid) で組成されている。オリゴ糖(oligosaccharide) の組成中にただキシランと多くの側鎖しかない時、相対的に低重合度のオリゴ糖のみ製造可能である。
【０００５】
キシロオリゴ糖の工業上の製造方法は、キシラン(xylan) をキシラナーゼ(xylanase)を利用して分解することで得られ、キシランは植物体内に大量に存在する半セルロースであり、キシラナーゼは前述のキシランを分解できる酵素である。ガーベラの茎と煙草中に長鎖形式のキシランが見られ、且つキシロースのみで組成されている。工業応用上、キシランの形式はアラビノキシラン(arabinoxylan)が主であり、この種のキシランはフスマ或いはトウモロコシの穂軸のような農業副産物中より得られ、グルクロノアラビノキシラン(glucuronoarabinoxylan) は針葉樹材(softwood)中に見られ、グルクロノキシランは広葉樹材(hardwood)中に見られる。工業上、これらのキシランを含有する糖類の応用は、キシロース以外に、アラビノース(arabinose) 、グルクロン酸、4-Ｏ- メチルグルクロン酸、ブドウ糖、半ラクトースが添加される。キシロースとその他の糖類は、その特性がソース植物のタイプにより違いがある。
【０００６】
市販されているキシロオリゴ糖製品の組成成分は、主に、キシロバイオース、キシロトリオース及び比較的高い重合度のオリゴ糖とされ、そのうち、キシロバイオース、キシロトリオースは人体のプロバイオティクスを活性化させる最も重要な成分である。工業上、製造コストを下げるために、便宜な原料であるフスマ或いはトウモロコシの穂軸である特定の微生物( 例えば Aspergillus niger、Bacillus halodurans 等) を誘導してこれらの酵素を分泌させ、さらに直接粗酵素液でキシロオリゴ糖に富む原料例えばトウモロコシの穂軸を触媒反応で加水分解してキシロオリゴ糖となす。
【０００７】
前述のキシロオリゴ糖はキシロース数の異なる低重合糖混合物であり、異なるキシロース数で構成されたキシロオリゴ糖はその機能性も異なる。一般に、キシロオリゴ糖の乳酸菌とビフィズス菌に対する培養効果はキシロースの数が少ないキシロオリゴ糖ほど良好であり、キシロース数が多いほどキシロオリゴ糖の利用率は漸減する。最近の研究によると、ラクトバチルス ブレビス菌(Lactobacillus brevis)はキシロビオース(xylobiose) を好み、ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌(Bifidobacterium adolescentis)はキシロトリオース(xylotriose)及びキシロテトラオース(xylotetraose)を偏好する（非特許文献１）。このほかの研究は、ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌のキシロオリゴ糖に対する利用性が、キシロトリオースが最良であり、その次に、キシロトリオースが良いことを示し（非特許文献２）、ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌を２４時間培養した後に、全体のキシロオリゴ糖に対する利用率は７７％であり、各組成の利用率は、キシロトリオースが９０％で、キシロバイオースが８４％、キシロテトラオースが８３％で、キシロペンタオース(xylopentaose)が７１％であった。ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌はキシロオリゴ糖のある環境下で、繁殖速度はその他のビフィズス菌B.Longum,B.infantis, and B.breveより遥かに高い。キシロオリゴ糖中のキシロースは、効果はキシロオリゴ糖のように良くはないが、ビフィルス菌により消化利用され得る。さらにキシロースはグリコニュートリエント（糖鎖栄養素）の８つの成分のうちの一つであり、抗細菌と抗黴菌の機能を有し、特に、グラム陰性菌及び白色連鎖球菌に対抗し、また、腸内プロバイオティクスの生長を助ける。
【０００８】
キシランはアルカリ性環境下での可溶性が最高であり、また、キシラナーゼは応用中に実行する前処理過程が、通常高温過程を経る必要があり、ゆえに、アルカリ性環境下で活性を喪失せず、及び、耐アルカリ性で、耐高温のキシラナーゼを取得できることは明かに最も重要である。
【０００９】
このため、もし、耐熱耐アルカリ性のキシラナーゼを利用し、さらにキシロオリゴ糖中のキシロース数組成比を制御できる製造方法があれば、異なる用途（例えば異なる種類の乳酸菌の増殖に用いる）の応用に対して、大きく貢献することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】文献名 Moura et al.,LWT-Food Science and Technology,40(2007)963-972
【非特許文献２】文献名 Gullon al.,J.Agric.Food Chem.56(2008) 7482-7487
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述の周知技術の問題を解決するため、本発明の目的は、一種の、キシロオリゴ糖の組成を制御可能なバチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) を提供することにあり、それはすでに２０１１年９月２６日に中華人民共和国典型培養物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION (CCTCC))に寄託され、その寄託コードはＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１１３３０である。この耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌は二種類の耐熱耐アルカリ性キシラナーゼを分泌し得て、該耐熱耐アルカリ性キシラナーゼはキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) 或いはキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は前述の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌より組成制御可能なキシロオリゴ糖を製造する方法は、そのステップが、植物材料を使用し高ｐＨ値下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養し、該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌中より酵素組合せを取得し、該酵素組合せはキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) 及びキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) を包含する。該酵素組合せとキシラン(xylan) 原料を酵素反応させ、キシロオリゴ糖を取得し、該キシロオリゴ糖は、キシロール、キシロバイオース、キシロトリオース、重合度４以上のキシラン及びその任意の組合せで組成された群より選択される。該植物材料はカバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマで組成された群より選択される。該高ｐＨ値の範囲は、８〜１１とされる。該酵素組合せは、本実施例中では酵素液とされ、それは該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を遠心処理して上澄み液を得て、該上澄み液を硫酸アンモニウムで沈殿させた後に、再懸濁させ並びに透析して得られた液体である。該キシラン原料は、トウモロコシの穂軸とされる。該酵素反応の条件は、摂氏３０〜８０度、ｐＨ４〜１１とされる。該植物材料がアルカリ処理されたフスマとされる時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は３２％以上とされる。該植物材料がトウモロコシの穂軸とされる時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は２７％以上とされる。また、酵素反応時間が４時間以内で終わる時、該キシロオリゴ糖中のキシロトリオースの比率は８．６％以上となる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により製造されたキシロオリゴ糖は抗細菌、抗黴菌及び腸内プロバイオティクスの生長を助けるという長所のほかに、異なるキシロース数の組成比率を制御できる特色を有し、キシロオリゴ糖のキシロース数比率により異なる種類の乳酸菌保健食品、飲食品中に組み合わせることで、各種のキシロオリゴ糖成分に最大の利用を達成させられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異なる培地の下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の分泌のタンパク質ゲル電気泳動及び酵素活性電気泳動分析結果を示し、ＥとＢはそれぞれカバ材キシラン含有のエマーソン培地とバーグミネラル塩培地での培養を、Ｍは既知の分子量のマーカーを代表する。
【図２】異なる誘導基質の下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の分泌のタンパク質ゲル電気泳動及び酵素活性電気泳動分析結果を示し、Ｃ、Ｗ及びＷ１はそれぞれトウモロコシの穂軸、フスマ、及びアルカリ処理したフスマのエマーソン培地、Ｍは既知の分子量のマーカーを代表する。
【図３】実施例一Ａ中のキシランとキシラナーゼの反応前の基質中の水可溶性成分及び反応後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルを示し、Ａはキシランとキシラナーゼ反応前、Ｂはキシラナーゼ反応４時間後、Ｃはキシラナーゼ反応２４時間後、Ｄはキシリナーゼ反応４７時間後を代表する。
【図４】実施例二中のキシランとキシラナーゼの反応前の基質中の水可溶性成分及び反応１５時間後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルであり、Ａはキシランとキシラナーゼ反応前、Ｂはキシラナーゼ反応１５時間後を代表する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の技術内容、構造特徴、達成する目的を詳細に説明するため、以下に実施例を挙げて説明する。以下に述べることは、本発明の実施例にすぎず、本発明の実施の範囲を限定するものではなく、本発明の特許請求の範囲に基づきなし得る同等の変化と修飾は、いずれも本発明の権利のカバーする範囲内に属するものとする。
【００１６】
本発明は耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) （寄託コードＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１１３３０)のエンドキシラナーゼ(endo-xylanases)により異なる組成のキシロオリゴ糖を製造する。
【００１７】
本発明で使用する耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌は、パルプ工場の廃水処理場でスクリーニングして得られ、大量の耐熱耐アルカリ性キシラナーゼを分泌でき、これらキシラナーゼは、それは二種類の活性タンパク質を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ゲル片における所在位置は、４５ｋＤａと２３ｋＤａであり、このためそれぞれxyn45(SEQ ID NO.:1) とxyn23(SEQ ID NO.:2) と称され、それぞれエンドキシラナーゼ(endo-xylanases)に属する。xyn45 とxyn23yはそれぞれ第１０と第１１ファミリーのグリコシルヒドロラーゼ(glycosyl hydrolases) に属し、第１０ファミリーのグリコシルヒドロラーゼの特性は、分子量が比較的大きく(>30kD) 、酸性ｐＩ値（低ｐＩ値）に属し、構造が比較的大きく且つ弛緩している。第１１ファミリーのグリコシルヒドロラーゼの特性は、分子量が比較的小さく(<30kD) 、アルカリ性ｐＩ値（高ｐＩ値）に属し、構造が比較的小さく且つ緊密である。xyn45 とxyn23 は広範なｐＨ値と耐高温の応用範囲を有し、摂氏70度でｐＨ４〜１１の間でいずれも活性を有する。xyn23 はｐＨ７の時に活性が最高の温度は摂氏６０度であるが、摂氏７０度の時の活性は最大活性の９０％を有する。xyn45 はｐＨ７の時、高活性を示す温度が非常に広く、範囲は摂氏４２−７５度であり、活性最高の温度は摂氏７０度である。総合すると、これら二種類の酵素は摂氏３０−８０度でいずれも５０％以上の活性を有し、最良の温度は摂氏７２度である。これら二種類の酵素はｐＨ４〜１１でいずれも６０％以上の活性を有する。これら二種類のグリコシルヒドロラーゼを単独或いは混合使用すると、いずれもキシランを加水分解して重合度（ＤＰ）が比較的小さいオリゴ糖となすことができ、これにより、キシロオリゴ糖を製造するのに用いることのできる理想的なキシラナーゼである。
【００１８】
本発明の実施例では、異なる植物材料で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌を誘導し、比率の異なる二種類のキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) とキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) を含む酵素組合せを獲る。その後、同じキシラン原料に作用させて、組成の異なるキシロオリゴ糖を獲る。組成の異なるキシロオリゴ糖はその機能性も異なり、既存の技術において、単一酵素を生物触媒とするのとは異なり、すなわち、本発明は異なる誘導材料により酵素組成を調整することで、異なる組成のキシロオリゴ糖を獲得する製造方法である。
【００１９】
耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌を誘導する植物材料は、キシランを含有する任意の材料、例えば、カバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマとされ、好ましくは、カバ材、アルカリ処理されたフスマ、トウモロコシの穂軸、最も好ましくはアルカリ処理されたフスマ及びトウモロコシの穂軸とされる。
【００２０】
耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の培養基は通常、基礎培養基例えばエマーソン培地(Emerson medium)或いはバーグミネラル塩培地(Berg's mineral salts medium) に、キシランを加えて組成される。キシランは誘導基質とされ、バチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) のキシラナーゼ分泌を誘導し、これら二種類の培地（キシランを含有しない）の組成は以下のとおりである。
【００２１】
エマーソン培地は、０．５５％酵母抽出物(Yeast extract) 、０．５％ペプトン、０．０２％の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ）、０．１％のリン酸水素二カリウム（Ｋ2 ＨＰＯ4 ）で組成され、さらに１Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨ値が１０となるように調整される。
【００２２】
バーグミネラル塩培地は、０．２％の硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3 ）、０．１％の酵母抽出物、０．０５％のリン酸水素二カリウム、０．０２％の硫酸マグネシウム水和物（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）、０．００２％の塩化マンガン（ＭｎＣｌ）、０．００２％の塩化カルシウム（ＣａＣｌ2 ）で組成される。さらに２５％の炭酸ナトリウム（Ｎａ2 ＣＯ3 ）でｐＨ値が１０．５となるように調整される。
【００２３】
これら二種類の培地に２％カバ材キシラン(Birchwood xylan) を加え、滅菌後に耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養し、500 ミリリットル三角フラスコで摂氏３７度の培養箱中で２００ｒｐｍで揺らして１２０時間培養し、遠心分離により得られた上澄み液を硫酸アンモニウムで９０％の飽和度の下で沈殿させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離の後の沈殿物を、０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁させ、得られた酵素液を薄膜(Cellu Sep membranes) で透析した後、タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び酵素活性電気泳動(zymogram)を実行し、結果を図１に示した。そのうち、Ｅはエマーソン培地を代表し、Ｂはバーグミネラル塩培地を代表し、Ｍはマーカー(marker)を代表する。
【００２４】
図１から分かるように、これら二種類のカバ材キシランを含有する培地はいずれも耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を誘導して、酵素活性を有するキシラナーゼxyn45 とxyn23 を分泌させた。ただし、異なる培地を使用すると得られるタンパク質含有量と酵素活性は異なり、カバ材キシラン含有のバーグミネラル塩培地を使用すると、タンパク質濃度0.5 g/L 、酵素活性（摂氏５５度で測定）が53 U/mL であった。カバ材キシラン含有のエマーソン培地を使用すると、タンパク質濃度2.4 g/L 、酵素活性（摂氏５５度で測定）が211 U/mLであった。明かに、エマーソン培地を使用することで、比較的多くの酵素タンパク質及びキシラナーゼ活性を得られる。
【００２５】
さらにエマーソン培地を基礎とし、それぞれ異なるキシラン原料を使用し、すなわち、2 ％トウモロコシの穂軸、フスマ及びアルカリ処理フスマを誘導基質とし、耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養してキシラナーゼを分泌させ、得られた酵素液をタンパク質ゲル電気泳動及び酵素活性電気泳動分析した結果を、図２に示した。そのうち、Ｃ、Ｗ、及びＷ１はそれぞれトウモロコシの穂軸、フスマ及びアルカリ処理フスマを含むエマーソン培地を代表し、Ｍは既知の分子量のマーカーとされる。結果は、トウモロコシの穂軸或いはフスマを使用した培地の誘導により得られるキシラナーゼはxyn45 がメインであり、xyn23 のタンパク質点及び活性はいずれも非常に不明確であり、ただし、アルカリ処理したフスマで誘導して得られたキシラナーゼxyn45 とxyn23 はいずれもあり、前述のカバ材キシランの培地と比較すると、得られるxyn23 はさらに明確である。これらの結果から、異なる植物原料の誘導下で、耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の分泌するキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は顕著に異なることが示された。
【００２６】
以下に異なる植物材料の誘導下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌が分泌するキシラナーゼxyn45 とxyn23 の発生比率を示す。トウモロコシの穂軸で誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は９０：１０であった。カバ材キシランで誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は７０：３０であった。フスマで誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は７０：３０であった。アルカリ処理フスマで誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は５０：５０であった。
【００２７】
前述の二種類のキシラナーゼxyn45 とxyn23 の組成比率の違いにより、同じキシラン原料に作用させて得られるキシロオリゴ糖製品組成比率も同じでなく、キシラン原料は任意のキシラン含有の材料、例えばカバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマとされ、好ましくはフスマ及びトウモロコシの穂軸、最も好ましくはトウモロコシの穂軸とされる。
【００２８】
以下に実施例一から三を挙げて本発明についてさらに詳しく説明するが、これらの実施例は明細書の内容を支持するためのもので、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【００２９】
［実施例一Ａ］
アルカリ処理したフスマを耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌を誘導する材料とする。
キシラナーゼの製造：まず耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼの分泌を誘導する基質を製造する。すなわち、固体−液体比が１対１０の方式でフスマと１％の水酸化ナゴリウムを混合し、摂氏１２１度の高圧釜で１０分間滅菌し、その後、純水で洗浄してｐＨ７とし、余剰物を乾燥することでアルカリ処理したフスマを獲る。続いて、２５０ミリリットルの三角フラスコ(Erlenmeyer flask)に１００ミリリットルのエマーソン培地を入れた。該エマーソン培地は、０．５５％酵母抽出物、０．５％ペプトン、０．０２％硫酸マグネシウム、及び０．１％リン酸水素二カリウムを包含し、さらにｐＨが１０となるように調整されている。２％の上述のアルカリ処理したフスマを加え、全体の混合物を、摂氏１２１度の高圧釜で３０分間滅菌する。三角フラスコを室温まで冷却した後、１０％（ｖ／ｖ）の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を接種し、摂氏３７度の培養箱で１７０ｒｐｍで振動して４〜５日培養する。その後、菌液を１３０００ｒｐｍで摂氏４度で３０分間遠心分離し、上澄み液を硫酸アンモニウムで９０％の飽和度の下で沈殿させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離した後の沈殿物を０．１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁させ、透析後に粗酵素液となす。この粗酵素液の単位体積の活性は１７９Ｕ／ｍＬ（摂氏３７度で測定）であった。
キシランの製造：トウモロコシの穂軸を研磨して１５％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で固体−液体比が１対２０の下で、摂氏９０度で９０分間処理し、得られた上澄み液を酢酸(acetic acid) で中和してｐＨ５．０となし、その後、３倍体積の９５％のエタノールを加えて６０分間浸漬させ、得られた沈殿物はキシランである。このキシランを基質とし、前述のようにして得られたキシラナーゼの作用の下で、キシランを分解してキシロオリゴ糖を発生させる。
キシラナーゼの反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量は２％（ｗ／ｖ）、酵素用量８．９５ Ｕ／ｍＬ、反応温度は摂氏５０度、ｐＨ ８．０。得られた製品をＨＰＬＣ(High-performance liquid chromatography)分析した。そのうち、ＨＰＬＣの機器構造は以下のとおりである。カラム(Column)はBioRad column Aminex HPX-87H(300mm × 7.8mm) 、カラム温度は摂氏65度、検出器(Detector)は屈折率検出器(RI detector) とされる。移動相(Mobile phase)は5mM 硫酸（Ｈ2 ＳＯ4 ）、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎとされる。
図３はキシランとキシラナーゼ反応前の基質中の水可溶性成分及び反応後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルであり、図中、Ａ〜Ｄのスペクトルはそれぞれキシランとキシラナーゼの反応前、反応４時間、反応２４時間、反応４７時間のスペクトルを代表する。
製品組成の時間に伴う変化は下表のとおりである。
【表１】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
反応前の基質の水可溶成分は７．４５ ｇ／Ｌとされ、いずれも重合度が４より大きいキシロオリゴ糖成分であり、重合度が３より小さいキシロオリゴ糖の存在は無い。反応後に増加する水可溶性キシロオリゴ糖はキシラナーゼが形成する加水分解物とされ、これにより計算して得られた２４時間の転化率（キシラナーゼ反応が形成するキシロオリゴ糖生産率）は５６．４％であり、４７時間では６１．５％である。もし、反応前アルカリ処理アルカリ処理で得られる水可溶性キシロオリゴ糖を包含すると、総キシロオリゴ糖生産率は第２４時間は９３．７％とされ、反応４７時間後には９８．７％となる。
前述の総キシロオリゴ糖生産率計算方式：基質用量２％（ｗ／ｖ）は２０ｇ／Ｌに相当し、２４時間と４７時間反応の後のキシロオリゴ糖総量はそれぞれ１８．７３ｇ／Ｌと１９．７４ｇ／Ｌである。これにより、総キシロオリゴ糖生産率は反応２４時間後には１８．７３／２０×１００％＝９３．７％、反応４８時間後には１９．７４／２０×１００％＝９８．７％である。
キシラナーゼ反応の時間に伴う変化はキシロトリオースがまず生産され、その後、キシロバイオース濃度が急速に増加し、キシロトリオースは分解されてキシロバイオースとキシロースになり後期に濃度は下降する。反応２４時間の後、各オリゴ糖の比率変化は大きくなくなり、反応は緩慢となる。この結果から分かるように、比較的高い比率のキシロトリオースを得ようとすれば、反応は比較的早く（２時間から４時間）終了する必要があり、この時、転化率（キシロオリゴ糖生産率）は少し低いが、平均すると約４２．５％ある。
【００３０】
［実施例一Ｂ］
実施例一Ａの酵素液で、濃度試験を行う。
キシラナーゼの製造及びキシランの製造は実施例Ａと同じである。
キシラナーゼ反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量は２％（ｗ／ｖ）、酵素用量１７．５ Ｕ／ｍＬ、反応温度は摂氏５０度、ｐＨ ８．０。得られた製品をＨＰＬＣ(High-performance liquid chromatography)分析した。
反応１５時間の後、製品組成（濃度及び百分率）は以下のとおりである。
【表２】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
実施例一Ａと比較すると、キシラナーゼ用量は８．９５Ｕ／ｍＬから１７．５Ｕ／ｍＬにアップする。これにより反応速度は比較的速くなり、反応１５時間後に実施例一Ａの反応２４時間後の結果に相当する結果が得られた。最終製品は重合度が４より小さいキシロオリゴ糖中、キシロバイオースが絶大な部分（３２％以上）を占め、キシロース及びその他の単糖を合わせてもただ５％しかなく、キシロトリオースは５〜６％の間である。
【００３１】
［実施例二］
トウモロコシの穂軸を耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌誘導材料となす。
キシラナーゼの製造：２５０ミリリットルの三角フラスコに１００ミリリットルのエマーソン培地を入れる。該エマーソン培地は、０．５５％酵母抽出物、０．５％ペプトン、０．０２％硫酸マグネシウム、及び０．１％リン酸水素二カリウムを包含し、さらにｐＨが１０となるように調整される。２％の上述のトウモロコシの穂軸粉末を加え、全体の混合物を、摂氏１２１度の高圧釜で３０分間滅菌する。三角フラスコが室温まで冷却された後、１０％（ｖ／ｖ）の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を接種し、摂氏３７度の培養箱で１７０ｒｐｍで振動して４〜５日培養する。その後、菌液を１３０００ｒｐｍで摂氏４度で３０分間遠心分離し、その上澄み液を硫酸アンモニウムで９０％の飽和度の下で沈殿させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離した後の沈殿物を０．１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁させ、透析後に粗酵素液となす。この粗酵素液の単位体積の活性は１２８Ｕ／ｍＬ（摂氏３７度で測定）であった。
キシランの製造は実施例一Ａと同じである。
キシラナーゼの反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量は２％（ｗ／ｖ）、キシラナーゼ用量は１７．５Ｕ／ｍＬ、反応温度は摂氏５０度、ｐＨ ８．０。得られた製品をＨＰＬＣ(High-performance liquid chromatography)分析した。
図４はキシランとキシラナーゼ反応前の基質中の水可溶性成分及び１５時間反応後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルであり、図中、Ａはキシランとキシラナーゼの反応前、Ｂはキシラナーゼ反応１５時間後のスペクトルである。
反応１５時間の後、製品組成（濃度及び百分率）は以下のとおりである。
第１次実験
【表３】
第２次実験
【表４】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
本実施例から分かるように、トウモロコシの穂軸で培養した耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌より得られる酵素液でキシランを分解して得られるキシロオリゴ糖成分は、キシロバイオース比率が比較的低く（約２７％）、キシロース及びその他の単糖を合わせると比較的高い約９％であり、キシロトリオースは約７％を維持する。
【００３２】
［実施例三］
実施例一の酵素液で、キシラナーゼの耐アルカリ性を試験する。
酵素の製造及びキシランの製造は実施例一と同じである。
酵素反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量２％ ｗ／ｖ、酵素用量１７．９Ｕ／ｍＬ、反応温度摂氏５０度、ｐＨ値はそれぞれ９、１０及び１１である。得られる製品をＨＰＬＣで分析する。
反応１５時間の後、製品組成（濃度及び百分率）は以下のとおり。
【表５】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
実施例一Ｂと比較すると、ｐＨ値は高くなり反応速度は遅くなり、これにより転化率は下降する。アルカリ処理したフスマで耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養して得られる酵素液は、単糖（主にはキシロース）比率が比較的低いが、キシロバイオースのキシロトリオースに対する比率は高ｐＨ値での反応時に僅かに下降する。本実施例は酵素はアルカリ条件下でもなおキシロオリゴ糖製造の能力を有することを示す。
実施例一Ａから分かるように、アルカリ処理したフスマをキシラナーゼ発生を誘導する植物材料となす時、時間の増加（０〜４７時間）に伴い、キシロースとキシロバイオースの比率は増加し、それぞれ１．５９〜４．３９％及び２１．７９〜３５．６５％であり、キシロトリオースの比率は、２時間後の９．５８から４７時間後の５．３１％に漸減する。実施例二でトウモロコシの穂軸をキシラナーゼ発生を誘導する植物材料となし、実施例一Ｂ中のその他の条件を同じにした結果と比較すると、トウモロコシの穂軸を使用して発生するキシロースの比率は７．１０％と比較的高く、アルカリ処理したフスマではただ３．６２％である。トウモロコシの穂軸を使用して発生するキシロバイオースの比率は比較的低く２７．４７％で、アルカリ処理したフスマは３２．２４％である。ゆえに、必要により適当な材料を選択することで、必要なキシロース数のキシロオリゴ糖組成比率を達成でき、並びに実施例三の結果により、酵素はアルカリ性環境下で反応できることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一種のキシロオリゴ糖の製造方法に係り、特に一種の、異なるキシロオリゴ糖の組成比を制御可能である製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にオリゴ糖の長所は、腸内微生物群を改善し、腸内腐敗物質の発生を減らし、血液内脂質過多を改善し、コレステロールを減らし、便秘現象を減らし、虫歯を防止し、免疫賦活性を増強し、カルシウムの吸収を促進する、等である。キシロオリゴ糖とフラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、異麦芽オリゴ糖等は低消化性オリゴ糖に属し、人体が代謝できないが、多種類の機能特性を有し、例えば、腸内ビフィルス菌を増殖させ、虫歯を引き起こしにくい。このためそれは腸のプロバイオティクス、特にビフィズス菌及び乳酸桿菌を増殖させることができ、これらのオリゴ糖はプレバイオティクス(prebiotics)に属し、プロバイオティクスの生長を促進する物質である。
【０００３】
キシロオリゴ糖(xylooligosaccharide) は、２〜７個のキシロース(xylose)がグリコシド結合してなるオリゴ糖の総称である。キシロオリゴ糖はオリゴ糖中で、ビフィルス菌を増殖させる機能が最も優れている一種であり、その他の同類のオリゴ糖の５−２０倍である。
【０００４】
現在市場には、すでにキシロオリゴ糖の製品が市販され、キシロオリゴ糖は植物材料、例えば、フスマ(wheat bran)、トウモロコシの穂軸(corn-cob)より製造される。植物材料の組成中には大量のキシラン(xylan) が含有され、キシラン主鎖上の側鎖は、キシラン以外の糖類、例えばグルクロン酸(glucuronic acid) で組成されている。オリゴ糖(oligosaccharide) の組成中にただキシランと多くの側鎖しかない時、相対的に低重合度のオリゴ糖のみ製造可能である。
【０００５】
キシロオリゴ糖の工業上の製造方法は、キシラン(xylan) をキシラナーゼ(xylanase)を利用して分解することで得られ、キシランは植物体内に大量に存在する半セルロースであり、キシラナーゼは前述のキシランを分解できる酵素である。ガーベラの茎と煙草中に長鎖形式のキシランが見られ、且つキシロースのみで組成されている。工業応用上、キシランの形式はアラビノキシラン(arabinoxylan)が主であり、この種のキシランはフスマ或いはトウモロコシの穂軸のような農業副産物中より得られ、グルクロノアラビノキシラン(glucuronoarabinoxylan) は針葉樹材(softwood)中に見られ、グルクロノキシランは広葉樹材(hardwood)中に見られる。工業上、これらのキシランを含有する糖類の応用は、キシロース以外に、アラビノース(arabinose) 、グルクロン酸、4-Ｏ- メチルグルクロン酸、ブドウ糖、半ラクトースが添加される。キシロースとその他の糖類は、その特性がソース植物のタイプにより違いがある。
【０００６】
市販されているキシロオリゴ糖製品の組成成分は、主に、キシロバイオース、キシロトリオース及び比較的高い重合度のオリゴ糖とされ、そのうち、キシロバイオース、キシロトリオースは人体のプロバイオティクスを活性化させる最も重要な成分である。工業上、製造コストを下げるために、便宜な原料であるフスマ或いはトウモロコシの穂軸である特定の微生物( 例えば Aspergillus niger、Bacillus halodurans 等) を誘導してこれらの酵素を分泌させ、さらに直接粗酵素液でキシロオリゴ糖に富む原料例えばトウモロコシの穂軸を触媒反応で加水分解してキシロオリゴ糖となす。
【０００７】
前述のキシロオリゴ糖はキシロース数の異なる低重合糖混合物であり、異なるキシロース数で構成されたキシロオリゴ糖はその機能性も異なる。一般に、キシロオリゴ糖の乳酸菌とビフィズス菌に対する培養効果はキシロースの数が少ないキシロオリゴ糖ほど良好であり、キシロース数が多いほどキシロオリゴ糖の利用率は漸減する。最近の研究によると、ラクトバチルス ブレビス菌(Lactobacillus brevis)はキシロビオース(xylobiose) を好み、ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌(Bifidobacterium adolescentis)はキシロトリオース(xylotriose)及びキシロテトラオース(xylotetraose)を偏好する（非特許文献１）。このほかの研究は、ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌のキシロオリゴ糖に対する利用性が、キシロトリオースが最良であり、その次に、キシロトリオースが良いことを示し（非特許文献２）、ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌を２４時間培養した後に、全体のキシロオリゴ糖に対する利用率は７７％であり、各組成の利用率は、キシロトリオースが９０％で、キシロバイオースが８４％、キシロテトラオースが８３％で、キシロペンタオース(xylopentaose)が７１％であった。ビフィドバクテリウム‐アドレッセンティス菌はキシロオリゴ糖のある環境下で、繁殖速度はその他のビフィズス菌B.Longum,B.infantis, and B.breveより遥かに高い。キシロオリゴ糖中のキシロースは、効果はキシロオリゴ糖のように良くはないが、ビフィルス菌により消化利用され得る。さらにキシロースはグリコニュートリエント（糖鎖栄養素）の８つの成分のうちの一つであり、抗細菌と抗黴菌の機能を有し、特に、グラム陰性菌及び白色連鎖球菌に対抗し、また、腸内プロバイオティクスの生長を助ける。
【０００８】
キシランはアルカリ性環境下での可溶性が最高であり、また、キシラナーゼは応用中に実行する前処理過程が、通常高温過程を経る必要があり、ゆえに、アルカリ性環境下で活性を喪失せず、及び、耐アルカリ性で、耐高温のキシラナーゼを取得できることは明かに最も重要である。
【０００９】
このため、もし、耐熱耐アルカリ性のキシラナーゼを利用し、さらにキシロオリゴ糖中のキシロース数組成比を制御できる製造方法があれば、異なる用途（例えば異なる種類の乳酸菌の増殖に用いる）の応用に対して、大きく貢献することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】文献名 Moura et al.,LWT-Food Science and Technology,40(2007)963-972
【非特許文献２】文献名 Gullon al.,J.Agric.Food Chem.56(2008) 7482-7487
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述の周知技術の問題を解決するため、本発明の目的は、一種の、キシロオリゴ糖の組成を制御可能なバチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) を提供することにあり、それはすでに２０１１年９月２６日に中華人民共和国典型培養物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION (CCTCC))に寄託され、その寄託コードはＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１１３３０である。この耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌は二種類の耐熱耐アルカリ性キシラナーゼを分泌し得て、該耐熱耐アルカリ性キシラナーゼはキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) 或いはキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は前述の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌より組成制御可能なキシロオリゴ糖を製造する方法は、そのステップが、植物材料を使用し高ｐＨ値下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養し、該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌中より酵素組合せを取得し、該酵素組合せはキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) 及びキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) を包含する。該酵素組合せとキシラン(xylan) 原料を酵素反応させ、キシロオリゴ糖を取得し、該キシロオリゴ糖は、キシロール、キシロバイオース、キシロトリオース、重合度４以上のキシラン及びその任意の組合せで組成された群より選択される。該植物材料はカバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマで組成された群より選択される。該高ｐＨ値の範囲は、８〜１１とされる。該酵素組合せは、本実施例中では酵素液とされ、それは該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を遠心処理して上澄み液を得て、該上澄み液を硫酸アンモニウムで沈殿させた後に、再懸濁させ並びに透析して得られた液体である。該キシラン原料は、トウモロコシの穂軸とされる。該酵素反応の条件は、摂氏３０〜８０度、ｐＨ４〜１１とされる。該植物材料がアルカリ処理されたフスマとされる時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は３２％以上とされる。該植物材料がトウモロコシの穂軸とされる時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は２７％以上とされる。また、酵素反応時間が４時間以内で終わる時、該キシロオリゴ糖中のキシロトリオースの比率は８．６％以上となる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により製造されたキシロオリゴ糖は抗細菌、抗黴菌及び腸内プロバイオティクスの生長を助けるという長所のほかに、異なるキシロース数の組成比率を制御できる特色を有し、キシロオリゴ糖のキシロース数比率により異なる種類の乳酸菌保健食品、飲食品中に組み合わせることで、各種のキシロオリゴ糖成分に最大の利用を達成させられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異なる培地の下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の分泌のタンパク質ゲル電気泳動及び酵素活性電気泳動分析結果を示し、ＥとＢはそれぞれカバ材キシラン含有のエマーソン培地とバーグミネラル塩培地での培養を、Ｍは既知の分子量のマーカーを代表する。
【図２】異なる誘導基質の下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の分泌のタンパク質ゲル電気泳動及び酵素活性電気泳動分析結果を示し、Ｃ、Ｗ及びＷ１はそれぞれトウモロコシの穂軸、フスマ、及びアルカリ処理したフスマのエマーソン培地、Ｍは既知の分子量のマーカーを代表する。
【図３】実施例一Ａ中のキシランとキシラナーゼの反応前の基質中の水可溶性成分及び反応後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルを示し、Ａはキシランとキシラナーゼ反応前、Ｂはキシラナーゼ反応４時間後、Ｃはキシラナーゼ反応２４時間後、Ｄはキシリナーゼ反応４７時間後を代表する。
【図４】実施例二中のキシランとキシラナーゼの反応前の基質中の水可溶性成分及び反応１５時間後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルであり、Ａはキシランとキシラナーゼ反応前、Ｂはキシラナーゼ反応１５時間後を代表する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の技術内容、構造特徴、達成する目的を詳細に説明するため、以下に実施例を挙げて説明する。以下に述べることは、本発明の実施例にすぎず、本発明の実施の範囲を限定するものではなく、本発明の特許請求の範囲に基づきなし得る同等の変化と修飾は、いずれも本発明の権利のカバーする範囲内に属するものとする。
【００１６】
本発明は耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) （寄託コードＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１１３３０)のエンドキシラナーゼ(endo-xylanases)により異なる組成のキシロオリゴ糖を製造する。
【００１７】
本発明で使用する耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌は、パルプ工場の廃水処理場でスクリーニングして得られ、大量の耐熱耐アルカリ性キシラナーゼを分泌でき、これらキシラナーゼは、それは二種類の活性タンパク質を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ゲル片における所在位置は、４５ｋＤａと２３ｋＤａであり、このためそれぞれxyn45(SEQ ID NO.:1) とxyn23(SEQ ID NO.:2) と称され、それぞれエンドキシラナーゼ(endo-xylanases)に属する。xyn45 とxyn23yはそれぞれ第１０と第１１ファミリーのグリコシルヒドロラーゼ(glycosyl hydrolases) に属し、第１０ファミリーのグリコシルヒドロラーゼの特性は、分子量が比較的大きく(>30kD) 、酸性ｐＩ値（低ｐＩ値）に属し、構造が比較的大きく且つ弛緩している。第１１ファミリーのグリコシルヒドロラーゼの特性は、分子量が比較的小さく(<30kD) 、アルカリ性ｐＩ値（高ｐＩ値）に属し、構造が比較的小さく且つ緊密である。xyn45 とxyn23 は広範なｐＨ値と耐高温の応用範囲を有し、摂氏70度でｐＨ４〜１１の間でいずれも活性を有する。xyn23 はｐＨ７の時に活性が最高の温度は摂氏６０度であるが、摂氏７０度の時の活性は最大活性の９０％を有する。xyn45 はｐＨ７の時、高活性を示す温度が非常に広く、範囲は摂氏４２−７５度であり、活性最高の温度は摂氏７０度である。総合すると、これら二種類の酵素は摂氏３０−８０度でいずれも５０％以上の活性を有し、最良の温度は摂氏７２度である。これら二種類の酵素はｐＨ４〜１１でいずれも６０％以上の活性を有する。これら二種類のグリコシルヒドロラーゼを単独或いは混合使用すると、いずれもキシランを加水分解して重合度（ＤＰ）が比較的小さいオリゴ糖となすことができ、これにより、キシロオリゴ糖を製造するのに用いることのできる理想的なキシラナーゼである。
【００１８】
本発明の実施例では、異なる植物材料で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌を誘導し、比率の異なる二種類のキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) とキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) を含む酵素組合せを獲る。その後、同じキシラン原料に作用させて、組成の異なるキシロオリゴ糖を獲る。組成の異なるキシロオリゴ糖はその機能性も異なり、既存の技術において、単一酵素を生物触媒とするのとは異なり、すなわち、本発明は異なる誘導材料により酵素組成を調整することで、異なる組成のキシロオリゴ糖を獲得する製造方法である。
【００１９】
耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌を誘導する植物材料は、キシランを含有する任意の材料、例えば、カバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマとされ、好ましくは、カバ材、アルカリ処理されたフスマ、トウモロコシの穂軸、最も好ましくはアルカリ処理されたフスマ及びトウモロコシの穂軸とされる。
【００２０】
耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の培養基は通常、基礎培養基例えばエマーソン培地(Emerson medium)或いはバーグミネラル塩培地(Berg's mineral salts medium) に、キシランを加えて組成される。キシランは誘導基質とされ、バチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) のキシラナーゼ分泌を誘導し、これら二種類の培地（キシランを含有しない）の組成は以下のとおりである。
【００２１】
エマーソン培地は、０．５５％酵母抽出物(Yeast extract) 、０．５％ペプトン、０．０２％の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ）、０．１％のリン酸水素二カリウム（Ｋ2 ＨＰＯ4 ）で組成され、さらに１Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨ値が１０となるように調整される。
【００２２】
バーグミネラル塩培地は、０．２％の硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3 ）、０．１％の酵母抽出物、０．０５％のリン酸水素二カリウム、０．０２％の硫酸マグネシウム水和物（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）、０．００２％の塩化マンガン（ＭｎＣｌ）、０．００２％の塩化カルシウム（ＣａＣｌ2 ）で組成される。さらに２５％の炭酸ナトリウム（Ｎａ2 ＣＯ3 ）でｐＨ値が１０．５となるように調整される。
【００２３】
これら二種類の培地に２％カバ材キシラン(Birchwood xylan) を加え、滅菌後に耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養し、500 ミリリットル三角フラスコで摂氏３７度の培養箱中で２００ｒｐｍで揺らして１２０時間培養し、遠心分離により得られた上澄み液を硫酸アンモニウムで９０％の飽和度の下で沈殿させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離の後の沈殿物を、０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁させ、得られた酵素液を薄膜(Cellu Sep membranes) で透析した後、タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び酵素活性電気泳動(zymogram)を実行し、結果を図１に示した。そのうち、Ｅはエマーソン培地を代表し、Ｂはバーグミネラル塩培地を代表し、Ｍはマーカー(marker)を代表する。
【００２４】
図１から分かるように、これら二種類のカバ材キシランを含有する培地はいずれも耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を誘導して、酵素活性を有するキシラナーゼxyn45 とxyn23 を分泌させた。ただし、異なる培地を使用すると得られるタンパク質含有量と酵素活性は異なり、カバ材キシラン含有のバーグミネラル塩培地を使用すると、タンパク質濃度0.5 g/L 、酵素活性（摂氏５５度で測定）が53 U/mL であった。カバ材キシラン含有のエマーソン培地を使用すると、タンパク質濃度2.4 g/L 、酵素活性（摂氏５５度で測定）が211 U/mLであった。明かに、エマーソン培地を使用することで、比較的多くの酵素タンパク質及びキシラナーゼ活性を得られる。
【００２５】
さらにエマーソン培地を基礎とし、それぞれ異なるキシラン原料を使用し、すなわち、2 ％トウモロコシの穂軸、フスマ及びアルカリ処理フスマを誘導基質とし、耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養してキシラナーゼを分泌させ、得られた酵素液をタンパク質ゲル電気泳動及び酵素活性電気泳動分析した結果を、図２に示した。そのうち、Ｃ、Ｗ、及びＷ１はそれぞれトウモロコシの穂軸、フスマ及びアルカリ処理フスマを含むエマーソン培地を代表し、Ｍは既知の分子量のマーカーとされる。結果は、トウモロコシの穂軸或いはフスマを使用した培地の誘導により得られるキシラナーゼはxyn45 がメインであり、xyn23 のタンパク質点及び活性はいずれも非常に不明確であり、ただし、アルカリ処理したフスマで誘導して得られたキシラナーゼxyn45 とxyn23 はいずれもあり、前述のカバ材キシランの培地と比較すると、得られるxyn23 はさらに明確である。これらの結果から、異なる植物原料の誘導下で、耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌の分泌するキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は顕著に異なることが示された。
【００２６】
以下に異なる植物材料の誘導下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌が分泌するキシラナーゼxyn45 とxyn23 の発生比率を示す。トウモロコシの穂軸で誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は９０：１０であった。カバ材キシランで誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は７０：３０であった。フスマで誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は７０：３０であった。アルカリ処理フスマで誘導して発生したキシラナーゼxyn45 とxyn23 の比率は５０：５０であった。
【００２７】
前述の二種類のキシラナーゼxyn45 とxyn23 の組成比率の違いにより、同じキシラン原料に作用させて得られるキシロオリゴ糖製品組成比率も同じでなく、キシラン原料は任意のキシラン含有の材料、例えばカバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマとされ、好ましくはフスマ及びトウモロコシの穂軸、最も好ましくはトウモロコシの穂軸とされる。
【００２８】
以下に実施例一から三を挙げて本発明についてさらに詳しく説明するが、これらの実施例は明細書の内容を支持するためのもので、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【００２９】
［実施例一Ａ］
アルカリ処理したフスマを耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌を誘導する材料とする。
キシラナーゼの製造：まず耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼの分泌を誘導する基質を製造する。すなわち、固体−液体比が１対１０の方式でフスマと１％の水酸化ナゴリウムを混合し、摂氏１２１度の高圧釜で１０分間滅菌し、その後、純水で洗浄してｐＨ７とし、余剰物を乾燥することでアルカリ処理したフスマを獲る。続いて、２５０ミリリットルの三角フラスコ(Erlenmeyer flask)に１００ミリリットルのエマーソン培地を入れた。該エマーソン培地は、０．５５％酵母抽出物、０．５％ペプトン、０．０２％硫酸マグネシウム、及び０．１％リン酸水素二カリウムを包含し、さらにｐＨが１０となるように調整されている。２％の上述のアルカリ処理したフスマを加え、全体の混合物を、摂氏１２１度の高圧釜で３０分間滅菌する。三角フラスコを室温まで冷却した後、１０％（ｖ／ｖ）の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を接種し、摂氏３７度の培養箱で１７０ｒｐｍで振動して４〜５日培養する。その後、菌液を１３０００ｒｐｍで摂氏４度で３０分間遠心分離し、上澄み液を硫酸アンモニウムで９０％の飽和度の下で沈殿させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離した後の沈殿物を０．１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁させ、透析後に粗酵素液となす。この粗酵素液の単位体積の活性は１７９Ｕ／ｍＬ（摂氏３７度で測定）であった。
キシランの製造：トウモロコシの穂軸を研磨して１５％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で固体−液体比が１対２０の下で、摂氏９０度で９０分間処理し、得られた上澄み液を酢酸(acetic acid) で中和してｐＨ５．０となし、その後、３倍体積の９５％のエタノールを加えて６０分間浸漬させ、得られた沈殿物はキシランである。このキシランを基質とし、前述のようにして得られたキシラナーゼの作用の下で、キシランを分解してキシロオリゴ糖を発生させる。
キシラナーゼの反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量は２％（ｗ／ｖ）、酵素用量８．９５ Ｕ／ｍＬ、反応温度は摂氏５０度、ｐＨ ８．０。得られた製品をＨＰＬＣ(High-performance liquid chromatography)分析した。そのうち、ＨＰＬＣの機器構造は以下のとおりである。カラム(Column)はBioRad column Aminex HPX-87H(300mm × 7.8mm) 、カラム温度は摂氏65度、検出器(Detector)は屈折率検出器(RI detector) とされる。移動相(Mobile phase)は5mM 硫酸（Ｈ2 ＳＯ4 ）、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎとされる。
図３はキシランとキシラナーゼ反応前の基質中の水可溶性成分及び反応後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルであり、図中、Ａ〜Ｄのスペクトルはそれぞれキシランとキシラナーゼの反応前、反応４時間、反応２４時間、反応４７時間のスペクトルを代表する。
製品組成の時間に伴う変化は下表のとおりである。
【表１】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
反応前の基質の水可溶成分は７．４５ ｇ／Ｌとされ、いずれも重合度が４より大きいキシロオリゴ糖成分であり、重合度が３より小さいキシロオリゴ糖の存在は無い。反応後に増加する水可溶性キシロオリゴ糖はキシラナーゼが形成する加水分解物とされ、これにより計算して得られた２４時間の転化率（キシラナーゼ反応が形成するキシロオリゴ糖生産率）は５６．４％であり、４７時間では６１．５％である。もし、反応前アルカリ処理アルカリ処理で得られる水可溶性キシロオリゴ糖を包含すると、総キシロオリゴ糖生産率は第２４時間は９３．７％とされ、反応４７時間後には９８．７％となる。
前述の総キシロオリゴ糖生産率計算方式：基質用量２％（ｗ／ｖ）は２０ｇ／Ｌに相当し、２４時間と４７時間反応の後のキシロオリゴ糖総量はそれぞれ１８．７３ｇ／Ｌと１９．７４ｇ／Ｌである。これにより、総キシロオリゴ糖生産率は反応２４時間後には１８．７３／２０×１００％＝９３．７％、反応４８時間後には１９．７４／２０×１００％＝９８．７％である。
キシラナーゼ反応の時間に伴う変化はキシロトリオースがまず生産され、その後、キシロバイオース濃度が急速に増加し、キシロトリオースは分解されてキシロバイオースとキシロースになり後期に濃度は下降する。反応２４時間の後、各オリゴ糖の比率変化は大きくなくなり、反応は緩慢となる。この結果から分かるように、比較的高い比率のキシロトリオースを得ようとすれば、反応は比較的早く（２時間から４時間）終了する必要があり、この時、転化率（キシロオリゴ糖生産率）は少し低いが、平均すると約４２．５％ある。
【００３０】
［実施例一Ｂ］
実施例一Ａの酵素液で、濃度試験を行う。
キシラナーゼの製造及びキシランの製造は実施例Ａと同じである。
キシラナーゼ反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量は２％（ｗ／ｖ）、酵素用量１７．５ Ｕ／ｍＬ、反応温度は摂氏５０度、ｐＨ ８．０。得られた製品をＨＰＬＣ(High-performance liquid chromatography)分析した。
反応１５時間の後、製品組成（濃度及び百分率）は以下のとおりである。
【表２】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
実施例一Ａと比較すると、キシラナーゼ用量は８．９５Ｕ／ｍＬから１７．５Ｕ／ｍＬにアップする。これにより反応速度は比較的速くなり、反応１５時間後に実施例一Ａの反応２４時間後の結果に相当する結果が得られた。最終製品は重合度が４より小さいキシロオリゴ糖中、キシロバイオースが絶大な部分（３２％以上）を占め、キシロース及びその他の単糖を合わせてもただ５％しかなく、キシロトリオースは５〜６％の間である。
【００３１】
［実施例二］
トウモロコシの穂軸を耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌のキシラナーゼ分泌誘導材料となす。
キシラナーゼの製造：２５０ミリリットルの三角フラスコに１００ミリリットルのエマーソン培地を入れる。該エマーソン培地は、０．５５％酵母抽出物、０．５％ペプトン、０．０２％硫酸マグネシウム、及び０．１％リン酸水素二カリウムを包含し、さらにｐＨが１０となるように調整される。２％の上述のトウモロコシの穂軸粉末を加え、全体の混合物を、摂氏１２１度の高圧釜で３０分間滅菌する。三角フラスコが室温まで冷却された後、１０％（ｖ／ｖ）の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を接種し、摂氏３７度の培養箱で１７０ｒｐｍで振動して４〜５日培養する。その後、菌液を１３０００ｒｐｍで摂氏４度で３０分間遠心分離し、その上澄み液を硫酸アンモニウムで９０％の飽和度の下で沈殿させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離した後の沈殿物を０．１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁させ、透析後に粗酵素液となす。この粗酵素液の単位体積の活性は１２８Ｕ／ｍＬ（摂氏３７度で測定）であった。
キシランの製造は実施例一Ａと同じである。
キシラナーゼの反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量は２％（ｗ／ｖ）、キシラナーゼ用量は１７．５Ｕ／ｍＬ、反応温度は摂氏５０度、ｐＨ ８．０。得られた製品をＨＰＬＣ(High-performance liquid chromatography)分析した。
図４はキシランとキシラナーゼ反応前の基質中の水可溶性成分及び１５時間反応後の溶液中の製品のＨＰＬＣ分析スペクトルであり、図中、Ａはキシランとキシラナーゼの反応前、Ｂはキシラナーゼ反応１５時間後のスペクトルである。
反応１５時間の後、製品組成（濃度及び百分率）は以下のとおりである。
第１次実験
【表３】
第２次実験
【表４】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
本実施例から分かるように、トウモロコシの穂軸で培養した耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌より得られる酵素液でキシランを分解して得られるキシロオリゴ糖成分は、キシロバイオース比率が比較的低く（約２７％）、キシロース及びその他の単糖を合わせると比較的高い約９％であり、キシロトリオースは約７％を維持する。
【００３２】
［実施例三］
実施例一の酵素液で、キシラナーゼの耐アルカリ性を試験する。
酵素の製造及びキシランの製造は実施例一と同じである。
酵素反応でキシロオリゴ糖を製造する条件：基質用量２％ ｗ／ｖ、酵素用量１７．９Ｕ／ｍＬ、反応温度摂氏５０度、ｐＨ値はそれぞれ９、１０及び１１である。得られる製品をＨＰＬＣで分析する。
反応１５時間の後、製品組成（濃度及び百分率）は以下のとおり。
【表５】
＊ＤＰ１は非キシロースの単糖（アラビノース、ブドウ糖等）を代表する。
＊＊ＤＰ＞４は重合度が４より大きいキシロオリゴ糖を代表する。
実施例一Ｂと比較すると、ｐＨ値は高くなり反応速度は遅くなり、これにより転化率は下降する。アルカリ処理したフスマで耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養して得られる酵素液は、単糖（主にはキシロース）比率が比較的低いが、キシロバイオースのキシロトリオースに対する比率は高ｐＨ値での反応時に僅かに下降する。本実施例は酵素はアルカリ条件下でもなおキシロオリゴ糖製造の能力を有することを示す。
実施例一Ａから分かるように、アルカリ処理したフスマをキシラナーゼ発生を誘導する植物材料となす時、時間の増加（０〜４７時間）に伴い、キシロースとキシロバイオースの比率は増加し、それぞれ１．５９〜４．３９％及び２１．７９〜３５．６５％であり、キシロトリオースの比率は、２時間後の９．５８から４７時間後の５．３１％に漸減する。実施例二でトウモロコシの穂軸をキシラナーゼ発生を誘導する植物材料となし、実施例一Ｂ中のその他の条件を同じにした結果と比較すると、トウモロコシの穂軸を使用して発生するキシロースの比率は７．１０％と比較的高く、アルカリ処理したフスマではただ３．６２％である。トウモロコシの穂軸を使用して発生するキシロバイオースの比率は比較的低く２７．４７％で、アルカリ処理したフスマは３２．２４％である。ゆえに、必要により適当な材料を選択することで、必要なキシロース数のキシロオリゴ糖組成比率を達成でき、並びに実施例三の結果により、酵素はアルカリ性環境下で反応できることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託コードＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１１３３０であるキシロオリゴ糖の組成を制御可能な耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) 。
【請求項２】
請求項１記載の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌において、該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌は２種類の耐熱耐アルカリ性キシラナーゼを分泌でき、該耐熱耐アルカリ性キシラナーゼはキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) 及びキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) とされることを特徴とする、耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌。
【請求項３】
請求項１記載の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌で組成制御可能なキシロオリゴ糖を製造する方法において、そのステップは、
（１）植物材料で高ｐＨ値の下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養するステップ、
（２）該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌中よりキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) とキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) を包含する酵素組合せを取得するステップ、
（３）該酵素組合せとキシラン原料を酵素反応させるステップ、
（４）キシロース、キシロバイオース、キシロトリオース、重合度４以上のキシラン及びそれらの任意の組合せで組成される群より選択したキシロオリゴ糖を取得するステップ、
を包含することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、（１）のステップの該植物材料は、カバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマで組成される群より選択することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３記載の方法において、（１）のステップの該高ｐＨ値の範囲は８〜１１とすることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３記載の方法において、（２）のステップの該酵素組合せは該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を遠心処理して上澄み液を取り、該上澄み液を硫酸アンモニウムで沈殿させた後に再懸濁させ並びに透析して得た液体であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３記載の方法において、（３）のステップの該キシラン原料はカバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマで組成した群より選択することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項３又は７記載の方法において、（３）のステップの該キシラン原料はトウモロコシの穂軸とすることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項３記載の方法において、（３）のステップの該酵素反応の条件は摂氏３０〜８０度、ｐＨ４〜１１とすることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項３記載の方法において、該植物材料をアルカリ処理したフスマとする時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は３２％以上であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項３記載の方法において、該植物材料をトウモロコシの穂軸とする時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は２７％以上であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法において、該酵素反応の時間を４時間内で終了する時、該キシロオリゴ糖中のキシロトリオースの比率は８．６％以上であることを特徴とする方法。
【請求項１】
寄託コードＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１１３３０であるキシロオリゴ糖の組成を制御可能な耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌(Bacillus halodurans) 。
【請求項２】
請求項１記載の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌において、該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌は２種類の耐熱耐アルカリ性キシラナーゼを分泌でき、該耐熱耐アルカリ性キシラナーゼはキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) 及びキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) とされることを特徴とする、耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌。
【請求項３】
請求項１記載の耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌で組成制御可能なキシロオリゴ糖を製造する方法において、そのステップは、
（１）植物材料で高ｐＨ値の下で耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を培養するステップ、
（２）該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌中よりキシラナーゼxyn45(SEQ ID NO.:1) とキシラナーゼxyn23(SEQ ID NO.:2) を包含する酵素組合せを取得するステップ、
（３）該酵素組合せとキシラン原料を酵素反応させるステップ、
（４）キシロース、キシロバイオース、キシロトリオース、重合度４以上のキシラン及びそれらの任意の組合せで組成される群より選択したキシロオリゴ糖を取得するステップ、
を包含することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、（１）のステップの該植物材料は、カバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマで組成される群より選択することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３記載の方法において、（１）のステップの該高ｐＨ値の範囲は８〜１１とすることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３記載の方法において、（２）のステップの該酵素組合せは該耐アルカリ性バチルスハロデュランス菌を遠心処理して上澄み液を取り、該上澄み液を硫酸アンモニウムで沈殿させた後に再懸濁させ並びに透析して得た液体であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３記載の方法において、（３）のステップの該キシラン原料はカバ材、トウモロコシの穂軸、フスマ、サトウキビバガス、藁、アルカリ処理フスマで組成した群より選択することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項３又は７記載の方法において、（３）のステップの該キシラン原料はトウモロコシの穂軸とすることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項３記載の方法において、（３）のステップの該酵素反応の条件は摂氏３０〜８０度、ｐＨ４〜１１とすることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項３記載の方法において、該植物材料をアルカリ処理したフスマとする時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は３２％以上であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項３記載の方法において、該植物材料をトウモロコシの穂軸とする時、該キシロオリゴ糖中のキシロバイオースの比率は２７％以上であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法において、該酵素反応の時間を４時間内で終了する時、該キシロオリゴ糖中のキシロトリオースの比率は８．６％以上であることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１５７３５０（Ｐ２０１２−１５７３５０Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５０３２４（Ｐ２０１１−２５０３２４）
【出願日】平成２３年１１月１６日（２０１１．１１．１６）
【出願人】（５０３００４６９９）國立中正大學 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１６日（２０１１．１１．１６）
【出願人】（５０３００４６９９）國立中正大學 (2)
【Ｆターム（参考）】
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