耐病性キュウリ
【課題】キュウリに影響を及ぼすクロステロウイルスファミリーのウイルス（特にＢＰＹＶ及びＣＹＳＤＶ）に対する耐性、Ｓ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ及び／又はＥ．ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍにより生じるキュウリウドンコ病に対する抵抗性を有するキュウリの提供。
【解決手段】キュウリウドンコ病耐性と同時にキュウリクロステロウイルス耐性を有するキュウリ。かかる植物の好ましい実施形態では、クロステロウイルス耐性（ＱＴＬ−１）に関与する１つ以上のゲノム領域、並びにウドンコ病耐性（ｐｍ−ｈ及び／又はｐｍ−ｌ）に関与する１つ以上のゲノム領域が単一の染色体上に存在する。かかる植物のより好ましい実施形態では、ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方が存在し、かつＱＴＬ−１がｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの間に位置する。
【解決手段】キュウリウドンコ病耐性と同時にキュウリクロステロウイルス耐性を有するキュウリ。かかる植物の好ましい実施形態では、クロステロウイルス耐性（ＱＴＬ−１）に関与する１つ以上のゲノム領域、並びにウドンコ病耐性（ｐｍ−ｈ及び／又はｐｍ−ｌ）に関与する１つ以上のゲノム領域が単一の染色体上に存在する。かかる植物のより好ましい実施形態では、ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方が存在し、かつＱＴＬ−１がｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの間に位置する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐病性植物及び植物育種の分野、より詳細にはウドンコ病及びクロステロウイルス−耐性キュウリ植物の育種に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）の農業生産においては、様々な植物病に見舞われることがしばしばある。黄化ウイルスによってそのような植物病が生じ、キュウリの生産において深刻な経済的ダメージが生じることもある。クロステロウイルス（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（キュウリに悪影響を与える黄化ウイルスの中で最も上位の分類学上のクラスタを形成）のファミリーには、３０種類以上の、曲状及び糸状の、昆虫により媒介される植物ウイルスが含まれる。上記ファミリーは３つの属からなり、特にモンシロチョウにより媒介されるＣｒｉｎｉｖｉｒｕｓ属には、キュウリに深刻な影響を与える種が含まれる。この属には特に、ウリ科黄色萎縮ウイルス（ＣＹＳＤＶ）、レタス伝染性黄斑ウイルス（ＬＩＹＶ）、及びビート偽黄化病ウイルス（ＢＰＹＶ）などの種が属する。ＣＹＳＤＶ及びＢＰＹＶはキュウリ栽培者にとり最も脅威である。
【０００３】
上記のウイルスは通常昆虫ベクター上に存在し、植物上の昆虫の摂食活動によって伝播する。したがって、キュウリクロステロウイルスは、殺虫剤の散布により抑制できる。しかしながら、好ましくは農業及び園芸におけるクロステロウイルスの制御は、寄主植物のウイルス耐性栽培品種を提供することにより行われる。現時点では、抵抗性のキュウリ種のゲノム上の少なくとも２つの量的形質遺伝子座又はＱＴＬｓが、キュウリのクロステロウイルス耐性と関連していることが知られている（特許文献１）。ゆえに子孫植物へのクロステロウイルス耐性関連の遺伝物質の適当な遺伝的浸透は、これらのＱＴＬｓに連結させた特異的なマーカーを検出することによってモニターできる。ゆえにＱＴＬｓについての見識を利用して、クロステロウイルス耐性栽培品種の育種を効率的に行うことが可能となる。
【０００４】
キュウリの農業生産に影響を及ぼす他の重要な植物病として、キュウリウドンコ病（ＰＭ）が挙げられる。ウリ科のＰＭは、菌類のＳ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ及びＥ．ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍによって生じうる。当該植物病は一年中発生し、その症状は、感染した葉の表面上における純粋な白い菌糸による小さなスポットの発生から始まり、そのスポットが次第に拡大し、最終的に茎及び葉が白い、粉末状の大量の胞子及び菌糸で覆われるに至る、というものである。重度の感染により葉の変色及び損失が生じ、その結果、果実の数及びサイズの減少に至る。ウドンコ病に対して効果的な多くの殺菌剤が存在するが、かかる化学物質に対する菌の耐性の問題が生じる。
【０００５】
ある程度のウドンコ病耐性であれば、様々なキュウリ株において見られる。かかる株としては、例えばインドの野生のキュウリ：番号ＰＩ１９７０８８及び番号ＰＩ２００８１５、ＰＩ２００８１８、並びに栽培品種Ｎａｔｓｕｆｕｓｈｉｎａｒｉ及びＡｓｏｍｉｄｏｒｉ（モリシタら、２００３）が挙げられる。また、ＰＭに対する耐性と関連する様々な遺伝子が公知であり（Ｆａｎｏｕｒａｋｉｓ、１９８４；Ｆｕｊｉｅｄａ及びＡｋｉｙａ（１９６２）；Ｋｏｏｉｓｔｒａ、１９６８、１９７１；Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒｕｍら、１９７１、１９７２）、Ｎａｔｓｕｆｕｓｈｉｎａｒｉのｐｍ−１及びｐｍ−２、ＰＩ２００８１５及びＰＩ２００８１８のｐｍ−３、及び栽培変種Ｗｉｓ．ＳＭＲ１８の「ｐｍ−ｈ」（遺伝子「ｐｍ−ｈ」は本願明細書においてｐｍ−ｈとして示されるｐｍ遺伝子座に相当する）などが挙げられる。栽培されている幾つかのキュウリの種類は、ＰＭに対する部分的な耐性を示すものの、大部分の農業生産者は未だに葉への殺菌剤投与に依存している。この理由の１つとして、他のタイプの耐性を示す株に対してＰＭ耐性を導入するのが困難であるという点が挙げられる。例えば、ＰＭ耐性対立遺伝子を得た株が、クロステロウイルスに対して感受性になる（それまではそうではなかった）、あるいはその逆という事態が育種の際に生じることが例として挙げられる。実際に、交配試験において、ＰＭ及びクロステロウイルス両方に対する耐性を示すキュウリの株はこれまで得られていない。すなわち有用な二重抵抗性の組換え体はこれまで得られていない。しかしながら驚くべきことに、比較的直接的な育種方法によっても、異なる特徴を単一のゲノムに取り込ませることが可能であることを見出した。
【特許文献１】国際公開第０２／２２８３６号パンフレット
【非特許文献１】Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ ＪＡ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ（ｅｄｓ．）（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献２】Ｂａｉ ＹＬ，Ｈｕａｎｇ ＣＣ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｕｌｓｔ Ｒ，Ｍｅｉｊｅｒ Ｄｅｋｅｎｓ Ｆ，Ｂｏｎｎｅｍａ Ｇ，Ｌｉｎｄｈｏｕｔ Ｐ（２００３）ＱＴＬｓ ｆｏｒ ｔｏｍａｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｏｉｄｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）ｉｎ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ Ｇｌ．１６０１ ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ．ＭｏＩ．ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １６： １６９−１７６．
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ，Ｍｕｒｐｈｙ ＪＥ，ａｎｄ Ｓｗａｉｎ ＷＦ（１９８７）Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃａｌｌｕｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８４：３９６２−３９６６．
【非特許文献４】Ｄｅｓｈａｙｅｓ Ａ，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ Ｌ，Ｃａｂｏｃｈｅ Ｍ（１９８５）Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：２７３１−２７３７．
【非特許文献５】Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ Ｋ，Ｂｏｎｎｅ Ｅ，Ｂｏｓｓｕｔ Ｍ，Ｄｅ Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ Ｍ，Ｌｅｅｍａｎｓ Ｊ（１９９２）Ｐｌａｎｔ．Ｃｅｌｌ ４： １４９５−１５０５．
【非特許文献６】Ｄｒａｐｅｒ Ｊ，Ｄａｖｅｙ ＭＲ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＪＰ，Ｃｏｃｋｉｎｇ ＥＣ ａｎｄ Ｃｏｘ ＢＪ（１９８２）Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｓｍｉｄ− ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｅｔｕｎｉａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３，４５１−４５８．
【非特許文献７】Ｆａｎｏｕｒａｋｉｓ ＮＥ（１９８４）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ｏｆ ｍｅｉｏｓｉｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ．
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｅｄａ Ｋ，ａｎｄ Ａｋｉｙａ Ｒ（１９６２）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｓｐｉｎｅ ｃｏｌｏｒ ｏｎ ｆｒｕｉｔ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．ＨｏＨ．Ｓｄ．３１：３０−３２．
【非特許文献９】Ｇａｎａｌ ＭＷ（１９９６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ− ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ，Ｉｎ： Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，６１−７３．
【非特許文献１０】Ｇｒｕｂｅｒ ＭＹ，Ｃｒｏｓｂｙ ＷＬ（１９９３）Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ ＢＲ Ｇｌｉｃｋ，ＪＥ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ，ｐｐ ８９−１１９．
【非特許文献１１】Ｈａｉｎ Ｒ，Ｓｔａｂｅｌ Ｐ，Ｃｚｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙ ＡＰ，Ｓｔｅｉｎｂｌｉｓｓ ＨＨ，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ Ｌ，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ（１９８５）Ｕｐｔａｋｅ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｔｏ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６１−１６８．
【非特許文献１２】Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＣＭ．（１９９７）Ａ ｂｉｎａｒｙ−ＢＡＣ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ− ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ．Ｇｅｎｅ ２００： １０７−１１６．
【非特許文献１３】Ｈｏｒｅｊｓｉ Ｔ，Ｓｔａｕｂ ＪＥ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｃ．（２０００）Ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１５（２）：１０５−１１３．
【非特許文献１４】Ｈｏｒｓｃｈ ＲＢ，Ｆｒａｌｅｙ ＲＴ，Ｒｏｇｅｒｓ ＳＧ，Ｓａｎｄｅｒｓ ＰＲ，Ｌｌｏｙｄ Ａ（１９８５）Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７： １２２９−１２３１．
【非特許文献１５】Ｊｉａｎｇ Ｊ，Ｇｉｌｌ ＢＳ，Ｗａｎｇ ＧＬ，Ｒｏｎａｌｄ ＰＣ ａｎｄ Ｗａｒｄ ＤＣ（１９９５）Ｍｅｔａｐｈａｓｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４８７−４４９１．
【非特許文献１６】Ｋａｄｏ ＣＩ（１９９１）： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１０，１−３２．
【非特許文献１７】Ｋｌｅｉｎ ＴＭ，Ｇｒａｄｚｉｅｌ Ｔ，Ｆｒｏｍｍ ＭＥ，Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ（１９８８）． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｚｅａ ｍａｙｓ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ５５９−５６３．
【非特許文献１８】Ｋｌｅｉｎ ＴＭ，Ａｒｅｎｔｚｅｎ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ ＰＡ，ａｎｄ Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ− ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ Ｓ（１９９２）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ．Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２８６−２９１．
【非特許文献１９】Ｋｌｅｉｎｅ Ｍ，Ｃａｉ Ｄ，Ｈｅｒｍａｎｎ ＲＧ，ａｎｄ Ｊｕｎｇ Ｃ（１９９５）Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｅｍａｔｏｄｅ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｂ．ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９０： ３９９−４０６．
【非特許文献２０】Ｋｏｏｉｓｔｒａ Ｅ（１９６８）Ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １７：２３６− ２４４．
【非特許文献２１】Ｋｏｏｉｓｔｒａ Ｅ（１９７１）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｆｌｅｓｈ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｃｏｌｏｒｓ ｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｃｕｍｂｅｒｓ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ２０：５２１−５２３．
【非特許文献２２】Ｌｕｉ ＢＨ（１９９７）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ： Ｌｉｎｋａｇｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ＱＴＬ Ａｎａｌｙｓｉｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｇ １８−１９．
【非特許文献２３】Ｍｉｋｉ ＢＬ，Ｆｏｂｅｒｔ ＰＦ，Ｃｈａｒｅｓｔ ＰＪ，Ｉｙｅｒ ＶＮ．１９９３．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ： Ｇｌｉｃｋ ＢＲ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＥ（Ｅｄｓ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６７−８８．
【非特許文献２４】Ｍｏｌｏｎｅｙ ＭＭ，Ｗａｌｋｅｒ ＪＭ，Ｓｈａｒｍａ ＫＫ（１９８９）Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉｎ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ８： ２３８− ２４２．
【非特許文献２５】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｍ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｋ，Ｓａｉｔｏ Ｔ，ａｎｄ Ｓａｋａｔａ Ｙ（２００３）Ｒｅｖｉｅｗ： Ｐｏｗｄｅｒｙ Ｍｉｌｄｅｗ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ．ＪＡＲＱ ３７（１），７−１４．
【非特許文献２６】Ｎｅｓｂｉｔｔ ＴＣ，Ｔａｎｋｓｌｅｙ ＳＤ（２００１）ｆｗ２．２ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ，ｗｉｔｈ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｆｒｕｉｔ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈａｔｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７： ５７５−５８３．
【非特許文献２７】Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＡＨ（１９９６）Ｍａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｐ．４１−５４．Ｉｎ Ａ．Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ（ｅｄ．）Ｇｅｎｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ．
【非特許文献２８】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＲＬ，Ｓｏｍｅｒｓ ＤＡ，Ｈｉｂｂｅｒｄ ＫＡ．１９８８．Ｃｅｌｌ／ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ： Ｇ．Ｆ．Ｓｐｒａｇｕｅ ＆ Ｊ．Ｗ．Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｄｓ．Ｃｏｒｎ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，３ｒｄ ｅｄ．，ｐ．３４５−３８７．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ．
【非特許文献２９】Ｐｉｅｒｉｋ，Ｒ．Ｌ．Ｍ．（１９９９）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．
【非特許文献３０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献３１】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ，Ｋｌｅｉｎ ＴＭ，ＷｏＩｆ ＥＤ，Ａｌｌｅｎ Ｎ（１９８７）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｊ．Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７−３７．
【非特許文献３２】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ（１９８８）Ｔｈｅ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：２９９−３０２．
【非特許文献３３】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ（１９９０）Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，７９，２０６−２０９．
【非特許文献３４】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ，Ｓｍｉｔｈ ＦＤ，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＪＡ（１９９３）Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：４８３−５０９．
【非特許文献３５】Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒｕｍ Ｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＨ，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＣＥ（１９７１）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６１：１２１８−１２２１．
【非特許文献３６】Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒｕｍ Ｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＨ，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＣＥ（１９７２）Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｗｉｔｈ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ．ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ ７：５５５−５５６．
【非特許文献３７】Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｐａｒｔ Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．
【非特許文献３８】Ｖａｎ Ｂｅｒｌｏｏ Ｒ，Ａａｌｂｅｒｓ Ｈ，Ｗｅｒｋｍａｎ Ａ，Ｎｉｋｓ ＲＥ（２００１）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ＱＴＬ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＱＴＬ−ＮＩＬｓ ｆｏｒ ｂａｒｌｅｙ ｌｅａｆ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＭｏＩ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ８： １８７−１９５．
【非特許文献３９】Ｖｏｓ Ｐ，Ｈｏｇｅｒｓ Ｒ，Ｂｌｅｅｋｅｒ Ｍ，Ｒｅｉｊａｎｓ Ｍ，ｖａｎ ｄｅ Ｌｅｅ Ｔ，Ｈｏｍｅｓ Ｍ，Ｆｒｉｊｔｅｒｓ Ａ，Ｐｏｔ Ｊ，Ｐｅｌｅｍａｎ Ｊ，Ｋｕｉｐｅｒ Ｍ（１９９５）ＡＦＬＰ： ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３： ４４０７−４４１４．
【非特許文献４０】Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｃｈｅｎｇ Ｌ，Ｘｕ Ｎ，Ｚｈａｏ Ｍ，Ｌｉ Ｃ，Ｙｕａｎ Ｊ，ａｎｄ Ｊｉａ Ｓ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：９９６−９９７．
【非特許文献４１】Ｚｈａｏ Ｓ，ａｎｄ Ｓｔｏｄｏｌｓｋｙ Ｍ（２００４）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＶｏＩ ２５５．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、キュウリに影響を及ぼすクロステロウイルスファミリーのウイルス（特にＢＰＹＶ及びＣＹＳＤＶ）に対する耐性、Ｓ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ及び／又はＥ．ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍにより生じるキュウリウドンコ病に対する抵抗性を有するキュウリの提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは鋭意研究の結果、ＣＹＳＤＶ及びＰＭに対する耐性を示す多くのキュウリを見出した。更に、これらの二重抵抗性のキュウリが、ウドンコ病耐性と関連する２つの定量形質遺伝子座（ＱＴＬｓ）（本願明細書におけるｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ）、並びにクロステロウイルス耐性に関連する主要なＱＴＬ（本願明細書におけるＱＴＬ−１）を含むことを発見した。更に重要なことに、全てのＱＴＬｓが単一の遺伝連鎖群に位置するということを発見した。すなわち本発明の発明者は基本的に、これらの植物ではクロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性遺伝子が単一の染色体に存在することを発見した。かかる植物は植物育種への使用に非常に適する。更に発明者らは、なぜこれまで二重抵抗性のキュウリが交配試験で得られなかったのかを示すメカニズムを発見した。特定の理論に束縛されるわけではないが、１つの植物病に対する耐性を与えるのに必要となる遺伝的要素の遺伝質浸透により、他の植物病に対する耐性を与えるのに必要となる遺伝的要素が損なわれるものと考えられる。この発見によって、発明者らはある特殊な育種方式を開発し、それにより上記の問題が解決され、所望の二重抵抗性を有する植物が得られるようになった。
【０００８】
本発明の第１の態様は、キュウリウドンコ病耐性と同時にキュウリクロステロウイルス耐性を有するキュウリの提供に関する。
【０００９】
本発明のかかる植物の好ましい実施形態では、クロステロウイルス耐性（ＱＴＬ−１）に関与する１つ以上のゲノム領域、並びにウドンコ病耐性（ｐｍ−ｈ及び／又はｐｍ−ｌ）に関与する１つ以上のゲノム領域は単一の染色体上に存在する。かかる植物のより好ましい実施形態では、ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方が存在し、かつＱＴＬ−１がｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの間に位置する。
【００１０】
本発明の植物の更なる実施形態では、国際公開第０２／２２８３６号（本発明に援用する）において更に詳細に記載されているように、ＱＴＬ−１の存在は、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜される少なくとも１つの隣接マーカーの存在の有無により示される。
【００１１】
本発明の植物の他の実施形態では、ｐｍ−ｈと称されるＱＴＬの存在は、前記植物のウドンコ病耐性を伴う単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）から生じる、少なくとも１つの突然変異を含んでなる核酸配列の存在に有無により示され、前記少なくとも１つの単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）は下記の表２に示すようにＳＮＰ１及びＳＮＰ２から選抜される。
【００１２】
別の実施形態では、本発明の植物中の、ｐｍ−ｌと称されるＱＴＬの存在は、前記植物のウドンコ病耐性と関連する、以下の表３中でＳＮＰ３として示される単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）から生じる少なくとも１つの突然変異を含んでなる核酸配列の存在の有無により示されるか、又は、前記植物のウドンコ病耐性と関連する、以下の表３における５ｂｐの挿入部分（５’−ＡＡＴＴＴ−３’）として示す少なくとも１つの突然変異を含んでなる核酸配列の存在の有無により示される。
【００１３】
本発明の好適な実施形態では、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する抵抗性を示す植物の提供に関する。詳細には、前記植物はキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）であり、前記植物は単一の染色体上に、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域と、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含んでなり、クロステロウイルス耐性を付与する前記少なくとも１つの領域が、Ｅ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーと連結し、ウドンコ病耐性を付与する前記少なくとも１つの領域が、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに−マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに連結している。
【００１４】
本発明の植物は、クロステロウイルス耐性に関連する第２のＱＴＬを任意に含んでもよい（国際公開第０２／２２８３６号に記載のＱＴＬ−２ように、このＱＴＬの局在化及び特徴に関する詳細がこの特許文献の明細書に明確に示されている）。このＱＴＬは、染色体上の別々の位置に配置していることが示されている。
【００１５】
本発明の別の態様は、上記の本発明に係るキュウリの一部分の提供に関する。好ましくは、前記植物の一部分は、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選択され、最も好ましくは種子である。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明に係る上記の二重抵抗性キュウリ（クロステロウイルス及びＰＭに耐性を示す［ＰＭ−葉（ｐｍ−ｌ）及びＰＭ−胚軸（ｐｍ−ｈ）抵抗性の表現型を含む］）と、農産物として望ましい特徴を有する第２のキュウリ又は他の種類の植物（好ましくはキュウリ株の植物）とを交配させることにより得られるＦ１種の提供に関する。好ましくは、前記第２のキュウリは最小限のｐｍ−ｈを含む（劣性遺伝子であるため）。その場合、前記第２のキュウリは最小限のヘテロ型であり、好ましくは、劣性のｐｍ−ｈ特性を有するため、ホモ型である。他の好適な実施形態では、前記第２のキュウリはクロステロウイルスに感受性で、好ましくは近交系の植物である。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明に係る上記Ｆ１種を栽培することによって得られる雑種植物の提供に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明にかかる上記ハイブリッド植物の一部分の提供に関する。好ましくは前記植物の一部分は、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選抜され、最も好ましくは果実である。
【００１９】
上記したように、ＰＭ又はクロステロウイルスへの耐性に必要となる各々の遺伝要素を１つだけ有する抵抗性植物の交配による、当該遺伝要素の遺伝的浸透により、他の植物病に対する耐性に必要となる遺伝因子が損失すると考えられている。この発見により、発明者らはこの課題を解決できる育種方法の開発に至り、それにより所望の二重耐性植物を得るに至った。本発明の発明者は、耐性がＱＴＬ−１によって付与されるクロステロウイルス−耐性親キュウリ株と、耐性がｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌによって付与されるＰＭ耐性キュウリ株との交配により効果的に二重抵抗性のキュウリを作製する場合に、育種において、組換え体の作製（すなわち１つの染色体における相同組換えを発生させる）するステップと、それに続く、単一の染色体上にＱＴＬ−１及びｐｍ−ｌ、又はＱＴＬ−１及びｐｍ−ｈを有する植物を選抜するステップを含める必要があることを見出した。好ましくは、前記選抜ステップは、単一の染色体上にＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈを有する植物の選抜を含んでなる。より好ましくは、ＱＴＬ−１はｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌが配置されているゲノム領域の間に挿入され、それにより、クロステロウイルス耐性に必要となるＱＴＬ１がＰＭ耐性に必要となる２つのＱＴＬｓの間に挟まれる位置関係をとる。
【００２０】
ＰＭ又はクロステロウイルス耐性と関係する、本明細書で定義されるいずれかのＱＴＬの存在の確認は、植物の染色体上の各々のＱＴＬと連結した１つ以上の遺伝マーカー、植物の染色体上の各々のＱＴＬに対して連鎖不平衡である遺伝マーカー、又はそれらの組み合わせを検出することによってなされる。
【００２１】
前記植物の前記ＱＴＬｓの存在及び／又は位置の適切な検出方法には、前記ＱＴＬｓを特徴づけるＡＦＬＰマーカーの使用が含まれる。好ましくは、単一の染色体上におけるＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及び／又はｐｍ−ｈを有する植物の上記選抜のためのステップは、ｐ／ｎ−４のための定量形質遺伝子座（ＱＴＬ）を有する染色体上、又はＰＭ−耐性と関連するｐｍ−ｈのための定量形質遺伝子座（ＱＴＬ）を有する染色体上、好ましくはｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌのための定量形質遺伝子座を有する染色体上の、クロステロウイルス耐性関連の定量形質遺伝子座ＱＴＬ−１を特徴づける少なくとも１つのＡＦＬＰマーカーの検出を含んでなり、その場合、前記ＱＴＬ−１マーカーはＱＴＬ ｐｍ−ｈとＱＴＬ ｐｍ−ｌの間の染色体領域に位置する。すなわち、当該選抜プロセスは、表２、３及び４に記載のマーカーからなるマーカー群から選抜される１つ以上のマーカーの検出を含んでなってもよい。
【００２２】
本発明の別の態様は、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリの選抜方法であって、前記植物において、単一の染色体上のＱＴＬ−１、並びに少なくともＱＴＬｓ ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈのうちの１つを検出することを含んでなる方法の提供に関する。
【００２３】
一実施形態では、当該方法は以下のステップを含んでなる：
ａ）キュウリからゲノムＤＮＡのサンプルを得るステップと（当該サンプルは充分な長さのゲノムＤＮＡ断片を含んでなる）、
ｂ）少なくとも１つの第１のＱＴＬ、又はそれに関連するＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈからなる群から選抜される分子マーカーを含んでなる断片を選抜するための精製反応を実施するステップと、
ｃ）前記選抜された核酸断片の増幅反応を実施するステップであって、少なくとも１つの第２のＱＴＬ、又はそれに関連するＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈからなる群から選抜される分子マーカーを含んでなる断片を検出するステップと、
ｄ）ステップｃ）の反応生成物中の、予測された長さ又は予測された核酸配列を有する増幅されたＤＮＡ断片を検出するステップ。
【００２４】
好ましい実施形態では、前記ステップｂ）は、前記第１のＱＴＬの分子マーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記マーカーを定義する核酸配列と実質的に相補的である少なくとも１つの核酸プローブの使用を含んでなり、前記核酸プローブは前記１つ以上のマーカーを定義する核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する。
【００２５】
他の好ましい例として、前記処理ｃ）は、前記第２のＱＴＬの分子マーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記第２のＱＴＬの分子マーカーの核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーセットの使用を含んでなる。
【００２６】
本発明の方法の他の実施形態では、前記植物中の単一の染色体上の前記ＱＴＬｓの存在を検出するステップは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術、又はｉｎ ｓｉｔｕ増幅技術を用いて実施する。また、前記ＱＴＬｓの分子マーカーを定義するか、又は前記ＱＴＬの分子マーカーの核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプローブ及びプライマーを、前記方法で使用するのが好適である。
【００２７】
本発明の幾つかの態様では、分子マーカーは好ましくは、ＳＮＰ、挿入突然変異マーカー又はＡＦＬＰマーカーであり、好ましくは表２から４に列挙されるマーカーからなる群から選抜されるマーカー、並びに本願明細書に引用される文献において記載されたそれらである。
【００２８】
本発明の別の態様は、キュウリクロステロウイルス、及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリ植物の作製方法の提供に関し、当該方法は以下のステップを含んでなる：
ａ）キュウリクロステロウイルス耐性を付与する染色体領域を含む第１のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１により表される、キュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーの存在を検出することにより行われるステップと、
ｂ）キュウリウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含む第２のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１により表される、第１のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップか、又は、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１の挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００により表される、第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップによって行われるステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得られた前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）Ｆ１種子をＦ１植物に成長させ、交配又は自家交配することによって前記Ｆ１植物から更なる子孫を生じさせるステップと、
ｅ）前記更なる子孫植物から、ステップａ）において定義したキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーと、ステップｂ）において定義したキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーを含んでなる植物を選抜するステップ。
【００２９】
当業者であれば、前記更なる子孫の集団は、その集団から単一の染色体上に少なくとも２つの相同組換えを生じさせている植物の存在を検出できるのに充分なサイズでなければならないことを理解するであろう。通常、１，０００の植物からなる集団で充分である。本発明で提案するマーカー選抜技術による利点としては、かかる母集団のサイズであっても、目的の遺伝子型（表現型的として検知されなくてもよい）の存在を容易にスクリーニングできる点が挙げられる。
【００３０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップｂ）の第２のキュウリを選抜するステップが、前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓのうちの１つのみを有する第２のキュウリを選抜することを含んでなり、また前記方法は、以下のステップを更に含んでなる：
ｆ）前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓ（すなわち前記第２のキュウリに存在しないＱＴＬ）のうちのもう１つを有する第３のキュウリを選抜するステップと、
ｇ）ステップｅ）で得られたＦ１植物と、前記第３のキュウリとを交配させて、更なる子孫植物を得るステップと、
ｈ）当該子孫植物から、ステップａ）で定義されるキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬと、ステップｂ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する両方のＱＴＬｓを含む植物を選抜するステップ。
【００３１】
好ましい実施形態では、ウドンコ病耐性を付与する遺伝子座ｐｒｎ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方を含む植物が選抜され、詳細には、ＱＴＬ−１によって特徴づけられるクロステロウイルス耐性を付与する遺伝子座が、ウドンコ病耐性を付与する遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方の間に配置されている。
【００３２】
すなわち、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性を示すキュウリの作製方法の他の好ましい実施態様では、ステップｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する染色体領域を含むキュウリを選抜するステップは以下のステップを含んでなる：
−前記植物のゲノム中において、
配列番号１のＳＮＰマーカー ３９Ｔ→Ｇ、
配列番号２のＳＮＰマーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１で表される第１のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号３のＳＮＰマーカー １９３Ｃ→Ｔ、
配列番号４の位置２２１における挿入突然変異 ５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００で表される第２のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップ。
【００３３】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性を示すキュウリを作製する方法の他の好ましい実施形態では、ステップａ）、ｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）のうちの少なくとも１つは、前記植物から得たゲノムＤＮＡのサンプルを提供するステップと、前記ゲノムＤＮＡのサンプル中から前記少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなる。
【００３４】
他の好ましい実施形態では、ステップｅ）は、植物ゲノム中において、ＱＴＬ−１と関連する少なくとも１つのマーカー、並びにｐｍ−ｈ若しくはｐｍ−ｌに関連する少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなり、好ましくは、植物ゲノム中及び単一の染色体上において、ＱＴＬ−１に関連する少なくとも１つのマーカー、ｐｍ−ｌに関連する少なくとも１つのマーカー、及びｐｍ−ｈに関連する少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなり、好ましくは、表２、３及び４に列挙されるマーカー群から選択されるマーカーを含んでなる。
【００３５】
他の好ましい実施形態では、ステップｅ）は、上記の二重抵抗性のキュウリを選抜するための本発明の方法により実施される。
【００３６】
ステップｃ）からｅ）にて説明した方法であって、二重抵抗性のＦ１を生じさせる一度の交配において、単一の染色体上で少なくとも２つの相同組換えが生じる方法は、多くの世代を通じて実施可能であり、それにより、単一の染色体中における所望の（少なくとも２回の）相同組換え、及びそれによる二重抵抗性の植物の形成が、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５又はいかなる世代においても実施可能となる。かかるバリエーションは本発明の範囲内に含まれ、当業者によって容易に実施される。
【００３７】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリを作製する代替的な方法は、次のステップを含んでなる：
ａ）本発明の方法を実施して、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示す第１のキュウリを選抜するステップと、
ｂ）前記植物を同系育種して、前記ＱＴＬｓのホモ接合植物株を得るステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得た前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）前記Ｆ１種子をＦ１植物に成長させるステップ。
【００３８】
本発明の別の態様は、本発明の方法で作製される植物又はその部分の提供に関する。
【００３９】
本発明により子孫植物の非常に迅速なスクリーニングが可能となり、それにより二重耐性を示すと考えられる植物の選抜が可能となる。例えば、子孫植物の中から、少なくとも１つのｐｍ−ｈマーカー、少なくとも１つのｐｍ−ｌマーカー及び少なくとも１つのＱＴＬ−１マーカーを有する植物を検出することが可能となる。かかる植物は、望ましい遺伝的浸透が行われたと考えられる。更なるマーカーに関するスクリーニングを行うことにより、子孫植物が二重耐性を示すという予測上の信頼性を向上させることができる。３つのＱＴＬｓの各々の少なくとも１つのマーカーを示す植物の検出に基づき、植物を選抜することが可能となり、また育種プログラムあるいは更なる同定試験にも使用できる。
【００４０】
本発明の植物の利点としては、上記の特性が同一の染色体に存在するため、従来の育種を使用したときでも、上記の両方の耐性を制御する遺伝子を（ハイブリッド）植物中へ容易に移動させることが可能となることであり、逆に従来の育種技術を用いた場合では、それらの特性が隔離した染色体上に存在するため、両方の特性を有するハイブリッドを作製するのがはるかに困難となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
定義
本明細書で使用される「キュウリ」という用語には、一般にＣｕｃｕｍｂｅｒと呼ばれるプラント、アメリカガーキン、Ｃａｓｓａｂａｎａｎａ、Ｃｕｋｅ、Ｇｈｅｒｋｉｎ、Ｈｏｔｈｏｕｓｅキュウリ、Ｌｅｍｏｎキュウリ、Ｍａｎｄｅｒａキュウリ、Ｐｉｃｋｌｉｎｇキュウリ、Ｓｅｒｐｅｎｔキュウリ、Ｓｌｉｃｉｎｇキュウリ、Ｓｎａｋｅキュウリ及び西インド諸島のガーキンなどが包含されるがこれらに限定されないキュウリ植物又はその一部を意味する。
【００４２】
本発明の用語「植物部分」とは、単細胞及び細胞組織（例えば植物において、完全である植物細胞、細胞凝集塊及び植物が再生できる組織培養）などの植物の一部を意味する。植物部分の例としては、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽及び種子に由来する単一の細胞及び組織、ならびに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト、カルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「クロステロウイルス」とはＣｌｏｓｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅのファミリーのウイルスのことを指し、一般にＣｕｃｕｒｂｉｔ黄色萎縮障害ウイルス（ＣＹＳＤＶ）、Ｌｅｔｔｕｃｅ伝染性黄化病ウイルス（ＬＩＹＶ）、及びＢｅｅｔ偽黄化病ウイルス（ＢＰＹＶ、またその同義語Ｃｕｃｕｍｂｅｒクロロチックスポットウイルス（ＣＣＳＶ）、Ｃｕｃｕｍｂｅｒ黄化病ウイルス、Ｍｕｓｋｍｅｌｏｎ黄化病ウイルス又はＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｐａｌｌｉｄｏｓｉｓウイルスとして公知）と呼ばれるウイルス、好ましくはＢＰＹＶ及びＣＹＳＤＶ、最も好ましくはＣＹＳＤＶである。好ましくは、キュウリ植物に関する用語「ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ」とは、特にキュウリ（ｉ．ｅ．ｔｈｅ Ｃｒｉｎｉｖｉｉｄｅａｅ）に影響を与える属を指す。
【００４４】
本明細書で使用される「ウドンコ病」という用語は、真菌Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（またその同義語Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ黄色ｉｉ及びＳ．ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅとして公知）によって、及び／又は真菌Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ（またその同義語Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍとして公知）によって、及び／又は真菌Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｔａｕｒｉｃａ（またその同義語Ｏｉｄｉｏｐｓｉｓ ｔａｕｒｉｃａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｔａｕｒｉｃａ、Ｏｖｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｃｙｎａｒｅａ、Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍとして公知）によって、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）において、生じる疾患を意味する。
【００４５】
用語「ＱＴＬ」は、本願明細書では、連続的に分散した（定量的な）表現型特徴の発現と関連する、対立遺伝子（例えば遺伝子又は制御配列の形）を含んでいる、当業者に公知の染色体領域を意味する用語として用いられる。「耐病性ＱＴＬ」という用語は、特定の染色体に置かれる領域であって、すなわち、耐性遺伝子をコードする少なくとも１つの遺伝子に関連するか、又は、少なくとも１つの制御領域、（染色体領域）であって、耐性に関連する１つ以上の遺伝子の発現を制御するものを指す。耐性を伴うＱＴＬｓを指すものとして、より短い同義語：「耐性付与遺伝子座」を本願明細書では用いる。ＱＴＬｓは、１つ以上の分子ゲノムマーカーを使用して、特異的なキュウリ継承のゲノムのそれらの遺伝子位置を示すことにより定義されてもよい。１つ以上のマーカーは、次に、特異的な遺伝子座を示す。遺伝子座の間の距離は、通常同じ染色体上の遺伝子座との間に、乗換えの頻度で測定される。２つの遺伝子座が遠くに離れるほど、より頻繁に交叉がそれらの間において、発生する。逆にいえば、２つの遺伝子座が間近である場合、それらの間での交叉は発生しにくい。概して、１センチモルガン、コーサンビー・マップ関数、ｃＭは、遺伝子座（マーカー）との間に、１％の組換えにほぼ等しい（Ｌｕｉ、１９９７）。ＱＴＬが並列マーカーによって、示すことができる場合、エンドポイントマーカー間の遺伝的距離はＱＴＬのサイズを表す。
【００４６】
用語「染色体」は、本願明細書では、当業者に公知のように、細胞ＤＮＡを含有し、そのヌクレオチド配列に遺伝子の線形配列を有する、細胞核の自己再生する遺伝的構造のことを意味する用語として用いる。
【００４７】
本発明で使用する「連鎖群」という用語は、同じ染色体に置かれる遺伝子又は遺伝形質の全てを指す。連鎖群の範囲内で、十分に間近であるそれらの遺伝子座は、遺伝的交雑の結合を示す。交差の確率が染色体上の遺伝子との間の物理的距離によって、増加するため、場所が連鎖群の中で各々からはるかに隔離した遺伝子は、遺伝子検査において、いかなる検出可能な直接的な結合も示すことはありえない。用語「連鎖群」は、大部分は染色体譲渡がまだなされなかった遺伝子のシステムの連結された挙動を示す遺伝子の遺伝子座を指すために用いる。したがって、本発明では、用語「連鎖群」とは、染色体（物理的存在）と同義である。
【００４８】
本発明の用語「対立遺伝子」とは、遺伝子の１つ以上のいずれかの代替的な形を意味しその全ての対立遺伝子が少なくとも１つの特徴又は特徴に関する。二倍体細胞において、提供された遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。本発明はＱＴＬｓ（すなわち１つ以上の遺伝子又は制御配列を含みうるゲノム領域）に関するため、若干の例においては「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち染色体部分の対立遺伝子）を指すのがより正確であるが、そのような場合、用語「対立遺伝子」は用語「ハプロタイプ」を含むものとして理解されるべきである。
【００４９】
本願明細書における「遺伝子」とは、一連のＤＮＡからなる遺伝単位として定義され、それは、染色体上の特定の位置を占め、また生物体の特定の形質又は特徴を制御する遺伝的な暗号を含んでなる。
【００５０】
「遺伝子座」とは、提供された遺伝子又は制御配列が提供された種の染色体に占有する位置として、本願明細書に定義される。
【００５１】
「相同組換え」とは、２つのＤＮＡ分子の間でのＤＮＡ断片の組換え（「クロスオーバー」）、又は同一のヌクレオチド配列の一定の領域における対染色体の染色分体間での組換えのことを指す。「組換え現象」は、本願明細書において、減数分裂のクロスオーバーを意味すると理解される。
【００５２】
本発明で使用する「分子マーカー」という用語は、核酸配列の特徴の相違を視覚化する方法において、用いられる指標のことを指す。かかる指標の例としては、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅された断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲｓ）配列同定された増幅領域（ＳＣＡＲｓ）、切断された増幅された多形配列（ＣＡＰＳ）マーカー又はアイソザイムマーカー又は特異的な遺伝子の及び染色体位置を定義する本願明細書に記載されているマーカーの組合せが挙げられる。「ＱＴＬにリンクされる分子マーカー」は、本明細書で定義されるように、ＳＮＰ、挿入変異、並びにＡＦＬＰマーカー又はフィールドにおいて、使用する通常の他のタイプのあらゆるマーカーのことを指してもよい。本願明細書におけるＡＦＬＰマーカーの前後関係において、マーカーとは、２つのＡＦＬＰ−プライマーに隣接するキュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列を指し、そのプライマーは、「コアプライマー」Ｅ及びＭ（制限酵素部位ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅｌ部位に相当）（Ｖｏｓその他、１９９５、Ｂａｉその他。２００３）、更に示すような２つ又は３つの選択的な塩基が続き、各々に選択的なヌクレオチドを確認する２桁のコードが続き、それによって、「コアプライマー」が延長される（コードに関しては表１を参照）。Ｅ１６／Ｍ５０−２４４は、増幅プライマーＥｃｏＲＩ ＋ ＣＣ及びＭｓｅｌ ＋ ＣＡＴを用いて得られる、２４４ｂｐ．の全長を有する断片状のマーカーを意味する。断片の長さは断片の検出方法に依存すると考えられ、若干の塩基を増減させたものであっても、その正確な長さのものとさほど変わらない。本願明細書に記載のマーカーを定義する際、リケージマップの他のマーカーとの、そのマーカーの染色体上の相対的位置として参照する必要がある。すなわち、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４は、そのプライマーの配列によって、増幅生成物の長さによって、並びに、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００及び／又はＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００３との相対的位置によって、又は、本願明細書に記載のように、表４のマトリックスのｃＭの対応する距離を有する順序づけられたリストにて図示するように、他のマーカーとの相対的な位置により定義されてもよい。しかしながら、考慮が必要となることとして、植物間の交雑により、特定のマーカーが損なわれることもあることが挙げられるが、但し特定のマーカーの欠如が、耐病性を与え、マーカーがそこに連結する遺伝因子の存在を否定するわけではない。
【００５３】
表１：通常、ＡＦＬＰ分析において適用され、本発明においても用いるプライマー伸長コード（Ｓｏｕｒｃｅ：Ｋｅｙｇｅｎｅ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ）
【表１】
【００５４】
用語「キュウリ特異的なＤＮＡ配列」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは、９０％以上、好ましくは、９５％以上、好ましくは、９７％以上、最も好ましくは９９％以上、キュウリのゲノム配列とのヌクレオチド配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を意味する。それは大きな類似性を示し、好ましくはＱＴＬ−１マーカーの場合、ＱＴＬ−１マーカーに隣接するキュウリのアクセッションＮｏ．ＰＩ ２５０１４７のＤＮＡ塩基配列の一部を構成する。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド配列相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間の相同性を意味する。２つの配列のアラインメントを作成したときに最大の一致性でヌクレオチドの配列が同じである場合に、ポリヌクレオチドは「相同な」配列を有するという。２つ以上のポリヌクレオチドの間の配列比較は、通常、配列類似性を有する局部領域を同定し、比較ウインドウ上の２つの配列の部分を比較することにより実施される。比較ウインドウは通常、約２０〜２００の連続ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの「配列相同性のパーセンテージ」（例えば５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００パーセント配列相同性）は、比較ウインドウの上の２つの最適に整列配置された配列を比較することによって、決定でき、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分には、最適な２つの配列の参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較し添加又は欠失（すなわちギャップ）が存在する。パーセンテージの算出は、
（ａ）同一の核酸塩基が両方の配列において、存在する位置の数を勘定してマッチする位置の数を算出し、
（ｂ）比較のウインドウの位置の総数で、上記のマッチする位置の数を除算し、
（ｃ）結果に１００を乗算して配列相同性パーセンテージとして示すことにより行われる。比較配列の最適配列は、周知のアルゴリズムを用いたコンピュータ化された実施態様で行ってもよく、又は視覚による検査によって、実施してもよい。直ちに利用できる配列比較及び並列配列アルゴリズムとしては、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９７）、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（両方ともインターネットで利用可能）が挙げられる。他の適切なプログラムとしては、ＧＡＰ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＰｌｏｔＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ及びＦＡＳＴＡ（ウィスコンシンＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ） （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ，１９８４））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される「ｐｍ−ｈ」という用語は、下子葉部において、発現される推定のウドンコ病抵抗性遺伝子を意味し、好ましくは表２の特定のＳＮＰの存在下で定義される。
【００５７】
表２：ウドンコ病耐性表現型との完全な関連を示すＳＮＰを、ＱＴＬ ｐｍ−ｈとして本願明細書に示す。
【表２】
【００５８】
本明細書で使用される「ｐｍ−ｌ」という用語は、推定のウドンコ病抵抗性遺伝子ｐｍ−ｌｅａｆを意味し、好ましくは表３の特定の突然変異の存在下で定義される。
【００５９】
表３：ウドンコ病耐性表現型との完全な関連を示している突然変異を、ＱＴＬ ｐｍ−ｌとして本願明細書に示す。
【表３】
【００６０】
「ＱＴＬ−１」用語とは、クロステロウイルス耐性に連結するゲノム領域を指し、ＷＯ ０２／２２８３６において、詳細に記載されているマーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及び／又はＥ１１／Ｍ４８−２５１により定義される（上記開示内容を本発明に援用する）。
【００６１】
「子孫」植物という用語は、１つ以上の親株からの無性生殖的若しくは有性生殖的な再生によって、得られる植物、又はその子孫としてのあらゆる植物のことを指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローニング若しくは自家交配、又は２つの親植物を交配させることによって、得られ、Ｆ１若しくはＦ２、又はそれ以上の世代を含むものと解される。Ｆ１は、両親（その少なくとも１つが特徴ドナーとして初めて用いられ）から製作される第一世代の子であり、一方、第二世代（Ｆ２）又はそれ以降の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子孫がＦ１、Ｆ２などの自殖から作製される標本である。ゆえにＦ１は、２人の本物の繁殖両親（本当の繁殖は、特徴のためにホモ接合性である）のハイブリッドから生じているハイブリッドであると（通常）考えられ、Ｆ２が前記Ｆ１ハイブリッドの自家受粉から生じる子孫であると（通常）考えられる。
【００６２】
本発明では、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する場所に存在するとき、「ヘテロ接合体」という用語を、それを表す遺伝子的条件として用いる。
【００６３】
本発明では、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する場所に存在するとき、「ホモ接合性」という用語を、それを表す遺伝子的条件として用いる。
【００６４】
植物育種の前後関係の「ハイブリッド」という用語は、異なる系列又は種類又は種の植物交配により作製される、遺伝的に異なる両親の子としての植物を意味し、２つの自殖系統の交配を含むがこれに限定されない。
【００６５】
本発明で用いる「近交系」という用語は、実質的にホモ接合の個体又は株を意味する。
【００６６】
本発明における用語「遺伝子移入」とは、天然の、及び人工的なプロセスであって、種を交配させることによって、１つの種、変異体多様性又は園芸品種のゲノム領域が他の種、変異体又は園芸品種のゲノムに移入することを指す。当該方法は、任意に再発する親に戻し交配して実施してもよい。
【００６７】
本願明細書に用いられる「遺伝子工学」、「形質転換」及び「遺伝子組換え」の用語は、単離されクローニングされた遺伝子を、他の生物体のＤＮＡ（通常染色体ＤＮＡ又はゲノム）へ移入することと、同義である。
【００６８】
本発明の用語「集団」とは、共通の遺伝的な派生を有する、遺伝的に異質な植物のコレクションを意味する。
【００６９】
本発明の用語「変異体」又は「栽培品種」とは、構造的若しくは遺伝子的特徴及び／又はパフォーマンスによって、同じ種の範囲内で他の種類と区別できる、類似する植物群を意味する。
【００７０】
「抵抗性」及び「耐性」の用語は、感染に対する部分的及び完全な耐性のことを指す。感受性の植物は、感染に対して抵抗性を有さないか、又は耐性レベルが低いと考えられる。上記の用語には、「完全な耐性」、「免疫性」「中程度の耐性」、「部分的な耐性」、「過敏症」及び「許容性」などの、別に定義することが可能な形の抵抗性が包含される。
【００７１】
「完全な耐性」とは、感染の後に病気が全く進行しない状態のことを指し、病原体が細胞内に入ること（第一の感染）がなされない結果によるものであってもよく、あるいは、細胞内で感染源が増殖できず、他の細胞にも感染しない（潜在的な感染ではなく、拡散することもない）結果によるものであってもよい。
【００７２】
「感受性」という用語は、植物が疾患による影響を受け、病徴に至るような疾患に対する耐性を有しない植物を指すものとして、本願明細書で用いられる。ゆえに「感受性」という用語は、「非抵抗性」と同義語である。
【００７３】
核酸に関する「ハイブリッド」という用語は、相補的なヌクレオチド塩基間の水素結合により形成される二本鎖核酸分子（又はデュプレックス）を指す。「ハイブリダイズする」又は「アニールする」という用語は、核酸配列の一本鎖が補完的な塩基との間で水素結合による二重螺旋部分を形成させる方法のことを指す。
【００７４】
「プローブ」という用語は、目標核酸配列分析物又はその相補ＤＮＡ誘導体の相補配列と共に水素結合デュプレックスを形成する、一本鎖オリゴヌクレオチド配列をいう。
【００７５】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、増幅目標にアニーリングでき、ＤＮＡポリメラーゼの結合を可能にするオリゴヌクレオチドを意味し、それにより、プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件（すなわちヌクレオチド及び例えばＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の存在）、並びに適切な温度及びｐＨ条件下に設けられた場合に、ＤＮＡ合成の開始位置として機能する。（増幅）プライマーは好ましくは増幅の最大効率のために一本鎖である。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼの存在下での伸長生成物の十分な合成を可能にするため、十分な長さを有する必要がある。プライマーの正確な長さは多くの因子に依存し、例えば温度及びプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）などが挙げられる。例えばＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅において、用いる、一対の双方向性プライマーは、１つの順方向及び１つの逆方向プライマーからなる。本明細書で用いられる「プライマー」は、複数のプライマーを指すこともあると理解され、特に増幅される目標領域の末端配列に関して情報の曖昧性が存在する場合には複数のプライマーが用いられる。それ故、「プライマー」には、配列又は中に若干の変異を有する配列を含んでなる、プライマーオリゴヌクレオチドのみならず、典型的な塩基対形成を可能にするプライマーも包含される。オリゴヌクレオチドプライマーは、いかなる適切な方法で調製してもよい。特異的な配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は公知であり、例えばクローニングや、配列の制限酵素処理、及び直接の化学合成などが挙げられる。化学合成の例としては、ホスホジ−又はトリエステル法、ジエチルホスホロアミデート法及び固相支持法（米国特許第４４５８０６６号で開示）などが挙げられる。プライマーは、必要に応じて標識してもよく、例えば分光、蛍光、光化学、生化学、免疫化学若しくは化学的な測定手段で検出される態様で標識してもよい。温度依存性のオリゴヌクレオチドプライマー伸長は、ポリメラーゼにより触媒され、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸エステル（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（すなわちｄＮＴＰｓ）又はその類似体の十分な量の存在下、適当な塩、金属陽イオン及びｐＨ緩衝システムを含有する反応溶媒中で当該触媒反応がなされる。適切なポリメラーゼは、プライマー−及び鋳型に依存してＤＮＡ合成反応を触媒することが知られている酵素である。公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ又はそのクレノー断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらのＤＮＡポリメラーゼを有するＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼすための反応条件下は、従来技術において、周知である。合成の生成物は鋳型鎖及びプライマー拡張鎖からなる二重分子であり、標的配列を含む。これらの生成物は、次のラウンドで複製のための鋳型として役立つ。複製の２回において、第１のサイクルのプライマー伸長鎖は、その相補プライマーによって、アニールされる、合成により、「ショート」にプライマー配列又はそれらの補足によって、５’−及び３’末端に結合される生成物を与える。変性、プライマーアニーリング及び伸長の反復サイクルは、プライマーにより定義される目標領域の指数関数的な蓄積に結果としてなる。充分なサイクルは、核酸の目標領域を含んでいるポリヌクレオチドの所望の量を提供するために行われる。所望の量は異なる場合もあり、生成物ポリヌクレオチド実際に用いる目的により異なる。ＰＣＲ方法は通常ハンドブックに記載され、当業者に知られている。ＰＣＲによる増幅の後、標的ポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、検出できる。それはストリンジェント〜適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で標的配列と共に安定ハイブリッドを形成する。プローブが標的配列と基本的に完全に相補的である（すなわち約９９％以上）と考えられる場合、ストリンジェントな条件が用いられる。若干の不適当な組み合わせが予想される場合、例えばプローブが変異株と完全に相補的でないことが予想される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは減少すると考えられる。しかしながら、非特異／偶然の結合を排除する条件を選択する。ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす、そして、非特異的結合に対して選択する条件は、従来技術において、周知で、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びラッセル（２００１）に記載されている。通常、低い塩濃度及びより高い温度は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増加させる。
【００７６】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ポリヌクレオチドが、通常は核酸の複雑な混合物中でその標的とハイブリダイズするが、実質的に他の配列とはハイブリダイズしない条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、また反応状況によっても異なる。長い配列は、高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細にわたるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）を参照のこと。通常、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度ｐＨにおいて、特定の配列の場合の熱融点（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍ値とは、所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度条件において、標的と相補的なプローブの５０％が平衡状態において、標的配列とハイブリダイズする温度のことを指す（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍ値では、プローブの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ以下のナトリウムイオン濃度であり、通常はｐＨ７．０〜８．３において、０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（又は他の塩）濃度であり、温度が短いプローブ（例えば１０〜５０のヌクレオチド）では３０℃以上、長いプローブ（例えば５０超のヌクレオチド長）では約６０℃以上である。ストリンジェントな条件は、不安定化剤（例えばホルムアミド）の添加によって、設定してもよい。選択的若しくは特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドに対して少なくとも２倍（好ましくは１０倍）のハイブリダイゼーションである。条件がしばしばそうである典型的な厳しいハイブリダイゼーション：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベート、又は、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、６５℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳで洗浄、である。ＰＣＲでは、アニーリング温度はプライマー長に応じて３２℃〜４８℃で変化しうるが、約３６℃の温度が、低いストリンジェンシーによる増幅において、典型的である。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するための更なるガイドラインは、多数の参考文献（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９）において、開示されている。
【００７７】
好ましい実施態様の説明二重耐性植物の生産農業及び園芸の繁殖プログラムの目的は、それらの遺伝組成を改良することによって、植物の性能を強化することである。本質的には、この改良は、目的の性能特性に影響している遺伝子に対して最も好ましい対立遺伝子の頻度を増加させることによって、なされる。野生の植物株を用い、遺伝子及び表現型バリエーションの豊富な資源とする。伝統的に、農業若しくは園芸分野においては、このような変種を用いて、所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を有する野生植物系列又はその子孫を選択し、別の所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を有する系列と交配し、所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を示す（その頻度が増加した）植物を子孫植物から選択することを行う。メンデルの遺伝の法則の更なる理解及び利用（並びに分子遺伝学的ツールとの組み合わせ）によりこのような選抜プロセスが可能となった。例えば、所望の遺伝子型の又はポテンシャル表現型特性を有する植物を選択する方法は、前記植物を量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の存在（すなわち連続的に分散（定量的に）した表現型特徴の発現と関連する対立遺伝子を含有する染色体領域の存在）の検出に基づいて行われる。通常、ＱＴＬは、表現型特徴における定量的変化に統計学的に結びつく１つ以上のマーカーによって、特徴づけられて、遺伝子と基本的に同義である。ＱＴＬマッピングは、目的の特徴の発現に影響を及ぼしている候補遺伝子座の同定を可能にする。植物繁殖においては、 マーカーによる選抜（ＭＡＳ）が可能であり、すなわち植物中でＱＴＬ関連のマーカーを検出することによって、好ましい対立遺伝子を有する植物を選抜する。
【００７８】
栽培植物の繁殖プログラムの大きな問題の１つは、別々の特徴間の負の遺伝相関の存在である。これは、例えばさまざまな疾患耐性植物系列の複製能及び産生間の負の遺伝相関を有するケースである。もう一方への１つの植物系列のゲノムからのＤＮＡの遺伝子移入が基本的な繁殖形質の発現に妨げてもよいか又は影響を及ぼしうることが理解される。同様に、もう一方への１つの植物からの移入耐性を与えている遺伝子配列の試みにより、すでに宿主株に存在するに耐性特性が除去されうる。
【００７９】
さまざまな特徴の遺伝についての知識により、例えば病害抵抗性と関連するＱＴＬのためにホモ接合性株の選抜が可能となる。遺伝子の起源及び繁殖プログラムの所望の特徴の位置についての知識の中で使用法予測された繁殖している結果の精度を増加させ、従来の繁殖プログラムと比較し選抜速度が増加する。例えば、実際、所望の特徴が遺伝子的ベース（他の特徴に遺伝的にリンクされる）を有するとき、子孫中におけるそれらの２つの特徴の均一性の増加に役立つ。なぜなら、所望の対立遺伝子に関するホモ接合の親が、大部分の子孫に対して、分離の少ない状態でそれらを子孫に渡すからである。
【００８０】
上記したように、本発明の発明者は、クロステロウイルス及びウドンコ病に耐性のある植物を見出した。かかる植物はこれまで公知ではなかった。すでにウドンコ病耐性植物系列へのクロステロウイルス耐性系列からのＤＮＡ移入（又はその逆）の試みはこれまで成功しなかった。
【００８１】
本発明の発明者は、更に、二重耐性植物で、単一ユニットにつれて実質的に共遺伝するほど密接に、クロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性のための遺伝子が結合されるということを発見した。遺伝子（非常に密接に、連結される）間のかかる遺伝子の構成は、しばしば、カップリング期（シス）にある対立遺伝子（遺伝子）とも呼ばれる。そのような場合、遺伝子が単一染色体にあることが通常認められる。事実、単一染色体上に遺伝子又はＱＴＬｓが存在するとき、それらがカップリング期にあることが意味される。
【００８２】
本発明の発明者は、二重耐性植物では、クロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性遺伝子が連鎖群４に存在することを発見した。Ｈｏｒｅｊｓｉらによれば（２０００）キュウリＬの連鎖群４はまた、べと病（ｄｍ．）耐性遺伝子を有する。ＬＧ ４は更に、以下のＲＦＬＰマーカーのうちの１つ又は組合せ、（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ ＩＮＴＭＡＰ，Ｋｅｙｇｅｎｅ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって、決定、マップ位置はｃＭ、ブラケット）：ＣｓＣ０３２ａ／Ｅｌ（２５．９）ＣｓＰ３５７／Ｈ３（３１．７）ＣｓＣ５８８／Ｈ３（３４．２）ＣｓＣ４７７Ｈ３（３５．３）ＣｓＣ６９４／Ｅ５（３８．５）ＣｓＰ３４７／Ｈ３（３８．５）ＣｓＣ３６５／Ｅｌ（４１）ＣｓＣ３８６／Ｅｌ（４１）ＣｓＣ２３０／Ｅｌ（４１．７）ＣｓＰ０６４／Ｅｌ（４５．５）により特徴付けられる。
【００８３】
明確な染色体番号は、キュウリクロステロウイルス耐性ＱＴＬ１、並びにウドンコ病耐性に関与するｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈが位置する染色体には割り当てられていない。しかしながら、当該染色体はこれら及び他のゲノム領域が位置する連鎖群（ＬＧ４）を参照することにより示されてもよい。用語連鎖群とは、耐性を与えている対立遺伝子が位置し、染色体と同じ階層的なレベルを有する物理的ゲノム単位を指すものとして本願明細書で用いる。
【００８４】
クロステロウイルス＋ｐｍ耐性のための遺伝子が単一染色体に存在することを発見した利点として、２つ挙げられる。
【００８５】
第１に、単一染色体上（好ましくは、小さい隣接する染色体部分）に遺伝子が存在するため、繁殖目的において、非常に有利であり、それらが共同で子孫植物に移入されるということである。ウドンコ病耐性及びクロステロウイルス耐性に関連する遺伝子との物理的な結合の結果として、交配による子孫植物（本発明の二重耐性植物を親株として用いた）では子孫植物における分離の頻度が低くなる。
【００８６】
第２に、この知識は、２つの特徴を単一の植物系列内において、組み合わせるのが非常に困難である理由を説明するため、植物育種の助けとなる。いかなる理論にも束縛されないが、クロステロウイルス耐性に関与するＱＴＬの特定の位置、及びそのＱＴＬの選抜により、望ましい遺伝子移入の形成が妨げられたか、望ましい遺伝子移入の可能性が極めて低い確率に抑えられていた。ウドンコ病耐性及びクロステロウイルス耐性のためのＱＴＬを伴うＱＴＬｓは近い位置に存在し、すでに第１の耐性（例えばウドンコ病）を有している植物系列への、第２の耐性特徴（例えばクロステロウイルス耐性）ＱＴＬの遺伝子移入により、第１の耐性特徴の（一部分の）損失が生じることが考えられる。植物系列がウドンコ病耐性（ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ）のための両方のＱＴＬｓを有する場合、ウドンコ病耐性の基礎をなしている遺伝情報に「損傷を与え」ず、クロステロウイルス耐性のためのＱＴＬの遺伝子移入が、ゲノムの非常に小さい部分において、のみ行われる。
【００８７】
ゆえに、さまざまな抵抗性遺伝子が単一染色体に位置することを発見したこととは別に、両方のウドンコ病耐性対立遺伝子が二重耐性植物に存在するときに、クロステロウイルス耐性に関連するＱＴＬ（ＱＴＬ−１）は、ＰＭ耐性（ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌ）を伴う２つのＱＴＬｓの間に存在することを見出した。この発見は、所望の遺伝子型を有する植物への組換え頻度が低いことを更に部分的に説明するものとも考えられる。また、かかる植物を作製するための、少なくとも３つの可能なシナリオが考えられ、それらを作製するいくつかの再現性のある方法が考案させる。
【００８８】
第１の方法は、目的の第１の系列の植物に由来するクロステロウイルス耐性遺伝子座（本明細書でＱＴＬ−１として定義）を、２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌを有する、目的の第２の系列のウドンコ病耐性植物に移入することを含んでなる。これが目的の第２の系列の遺伝的バックグラウンドに結果としてなることである場合、当該方法は、ＱＴＬ−１を、２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの間のゲノム領域に遺伝子移入することを含んでなり、それにより、目的の第２の系列の遺伝的バックグラウンドを有する子孫植物中で、ｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈの構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとなる（図１を参照）。これに基づくと、単一染色体の特定の領域における二重の相同組換（すなわち各交差における１度の現象）のみにより、目的の第２の系列の遺伝的バックグラウンドにおいて、クロステロウイルス及びＰＭ耐性の二重耐性の表現型が得られる子孫植物の適当な遺伝子移入を、ＱＴＬ−１、ｐｍ−１及びｐｍ−ｈ特異的なマーカーを用いてモニターしてもよい。
【００８９】
第２の方法では、異なる遺伝的バックグラウンド（すなわち第１の目的の株）において、耐性特徴を組み合わせることを望むかもしれないかかる方法は、目的の第２の系列の植物に由来するＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌを、ＱＴＬ−１場所を有するための第１の系列に係るクロステロウイルス耐性植物に移入することを含むと考えられる。この場合、当該方法は、ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌ遺伝子座を独立にＱＴＬ−１場所の両側に遺伝子移入することを含んでなり、それにより、目的の第１の系列の遺伝的バックグラウンドを有する子孫植物において、ｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈの構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとなる。（図２を参照）。この構成に基づくと、単一染色体の特定の領域において、少なくとも２つの二重相同組換（すなわち４回の交差）が、クロステロウイルス及びＰＭ耐性の二重耐性表現型の獲得に必要であることが考えられる。また、子孫植物の適当な遺伝子移入を、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ特異的なマーカーを用いてモニターしてもよい。
【００９０】
上記より、例えば野生型のＣＹＳＤＶ耐性の、例えば ＰＭ耐性の市販のキュウリへの遺伝子移入が非常に稀な現象であることが説明されると考えられる。同様に、例えばクロステロウイルス耐性の市販のキュウリへの、例えば野生型の両方のＰＭ耐性遺伝子座の遺伝子移入が更に稀な現象である理由も説明ができる。
【００９１】
組換えは、減数分裂の間の２つの相同染色体の間での情報の交換である。組換え植物において、最初は染色体の範囲内で特異的な位置に存在するＤＮＡは、他の植物に由来するＤＮＡと組み換えられる（父性から母性、あるいはその逆）。二重組換えでは、この組み換え反応は二度、例えば遺伝子／遺伝子座の両側において、行われる。必要な材料だけを組み換え、可能な限り染色体上の有益な第一の情報を維持するために、通常４度の交差現象（上記参照）が必要となる。かかる二重組換えを見つける通常の方法は、Ｆ２−植物の集団をスクリーニングすることである。この集団は、まれな（低頻度）二重組換えを検出するために充分なサイズでなければならない。二重組換えの頻度は、一重組換えの頻度に左右される。例えば、１０ｃＭ領域の組換えは１０％の頻度であった場合、二重組換えは、１０％×１０％＝１％（１センチモルガンは、検定交雑の１％の組換え子孫として定義される）の頻度となる。
【００９２】
低頻度のこの問題を迂回するための１つの方法は、「平行（パラレル）組換え」の実施である。これは基本的に、２つの組換えが別個に２つの異なる植物において、生じさせ、その後で、組換えを、得られるＦ２において、単純な交雑及び選抜を行うことによって、１つの植物で組み合わせることを意味する。これにより、スクリーニングする植物数が減少する。
【００９３】
ゆえに、二重耐性植物を作製する第３の方法は、目的の第１の系列に由来する２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ又はｐｍ−ｌのうちの１つを、ＱＴＬ−１遺伝子座を有するための第２の系列のクロステロウイルス耐性植物に移入して、ｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１又はＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈの構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとすることと、目的の第３の系列に由来する２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ又はｐｍ−ｌのうちの他方を、ＱＴＬ−１遺伝子座を有するための第２の系列の他のクロステロウイルス耐性のある植物に移入して、ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈ又はｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１の構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとすることを含んでなる（図３を参照）。その後、個々の組換えから遺伝子移入を含んでいる子孫植物は、構成ｐｍ−ｌを有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリに結果としてなるために交差する−ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈ（図３を参照）。また、さまざまな子孫植物への適当な遺伝子移入は、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈに特異的なマーカーを用いて、更に交雑された植物をモニターしてもよい。当業者であれば、図４−６を基にして他の方法を考案してもよい。
【００９４】
スクリーニングに用いる植物数を制限する方法は、例えば以下の通りに実施してもよい：最初に、両方のＰＭ−耐性対立遺伝子（ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ）を有する個体と、ＱＴＬ耐性対立遺伝子ＱＴＬ−１を有する個体の２個体を交配する。次に、ｐｍ対立遺伝子の１つとＱＴＬ−１との間の１つの交差を有する、以下のような植物を選抜する：２ｐｍ対立遺伝子の２つのエンドポイント間の遺伝的距離が１０ｃＭであり、ＱＴＬｌが中央（ＱＴＬｌと、ｐｍ−ｌ又はｐｍ−ｈのいずれが１つの間が５ｃＭ）に位置する場合に、ＱＴＬｌといずれかのｐｍ−遺伝子座との間のかかる組換えが５％の頻度で生じる。それにより、最初に交配により得た２００の子孫植物をスクリーニングする（１０が組換えＡ型及び１０の組換えＢ型である）。次に、このようにして同定された組換え体を自家交配し、１０の植物をスクリーニングし、ＱＴＬ−１及びｐｍ−に隣接するマーカーを用いてホモ接合体の子孫を解析する。ホモ接合体Ａ×Ｂ（１０Ａと１０Ｂを交配）との間で１０の交配を行い、得られるＦ２に関して１０の植物をスクリーニングして１つの二重組換えを選抜する。最終的に、１０の二重組換え体を得る。スクリーニングした植物数は全部で５００であったが、従来の方法では合計４０００の植物のスクリーニングが、１０の独立した二重組換え体を得るのに必要であった（ＱＴＬ−１及びいずれのｐｍ−遺伝子座間も５ｃＭの距離、０．０５×０．０５＝０．２５％の二重組換え頻度を有する結果となることが必要であった）。
【００９５】
本発明は、マーカーにより補助される選抜方法（ＭＡＳ）のより良好なモデルの提供に関する。ゆえに本発明は、植物の育種方法、植物（特にキュウリ）の選抜方法の提供に関する。特に繁殖プログラムに用いられる育種植物としての栽培用キュウリ、又は所望の遺伝子型又は潜在的表現型を有する栽培用キュウリの選抜方法の提供に関する。特に、商業的に有用な植物として本願明細書に記載した、有益なウリ科の果物の作製に際に応用できる。本願明細書における栽培用植物とは、故意に選抜されたか、又は所望の遺伝子型又は潜在的な表現型有するとして、農業若しくは園芸生産において故意に選抜された植物に由来する植物（特に同系交配によって得られた植物）として定義される。
【００９６】
本発明の二重耐性植物は例えば、遺伝子型ＡＡＢＢｃｃ、ＡＡＢｂｃｃ、ＡａＢＢｃｃ又はＡａＢｂｃｃを有してもよい。「Ａ」とは優性のｐｍ−ｌ遺伝子座に基づく耐性遺伝子型であり、「ａ」はそれに対応する非抵抗性の対立遺伝子であり、「Ｂ」は優性のＱＴＬ−１遺伝子座に基づく耐性遺伝子型であり、「ｂ」はその対応する感受性の対立遺伝子であり、「ｃ」は劣性のｐｍ−ｈ遺伝子座に基づく耐性遺伝子型である。したがって、本発明の二重耐性植物には、ハイブリッド植物並びにホモ接合植物の両方が包含される。これらの遺伝子型は、以下の交配（親生殖体の遺伝子型）を行うことによって得られる：ＡＢｃ×ＡＢｃ、ＡＢｃ×Ａｂｃ、ＡＢｃ×ａＢｃ、ＡＢｃ×ａｂｃ及びＡｂｃ×ａＢｃ。したがって、生殖体ａｂｃを作出する植物（ｐｍ−ｈを除き、耐性を有さない植物）であっても、本発明の二重耐性（ハイブリッド）植物の作製に使用できることが分かる。特に好ましい実施態様では、本発明の二重耐性植物は、近交系植物（耐性対立遺伝子がホモ接合）である。
【００９７】
ｐｍ−ｈ遺伝子は劣性遺伝子であるため、バイオアッセイを用いてＦ１又はＢＣ１においてはモニターできない（すなわち感受性の親を用いてＦ１／ＢＣ１を作製した場合（繁殖の際に一般的））。したがって、本願明細書記載のように、子孫植物への適当な遺伝子移入が、ＱＴＬ特異的なマーカーを用いてモニターできるというのが、本発明の顕著な効果である。ＭＡＳ又はＭＡＢ方法を用いることにより、当業者は植物の選抜方法の提供をうけることになる。
【００９８】
ゆえに本発明はまた、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性を示すキュウリの選抜方法の提供に関し、当該方法は、前記植物において、本明細書で定義されるＱＴＬ−１の単一染色体上の存在、及び、本明細書で定義されるＱＴＬｓであるｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈの少なくとも１つを検出することを含んでなる。かかる植物を選択するための本発明の好ましい方法は、ａ）キュウリからゲノムＤＮＡのサンプルを調製するステップと、ｂ）前記ゲノムＤＮＡのサンプルにおいて、ＱＴＬに連結する、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈからなる群から選択される少なくとも１つの分子マーカーを検出する（好ましくは前記群から少なくとも２つの分子マーカーを検出するステップであって、１つのマーカーがクロステロウイルス耐性を検出し、他のマーカーがウドンコ病耐性を検出するステップを含んでなる。
【００９９】
キュウリからゲノムＤＮＡのサンプルを調製する処理は、公知の標準的なＤＮＡ単離方法により実施してもよい。
【０１００】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、好ましい実施形態では、ＡＦＬＰ方法で用いられる双方向性プライマーセットを使用して、以下で適切なＱＴＬのマーカーであると判明した増幅生成物を産生させることを含んでなる。かかるプライマーセットは、ＡＦＬＰマーカーを定めるプライマー、又はマーカー特異的なプライマーとして本願明細書に記載する。双方向性とは、核酸の増幅反応において、１つが順方向プライマーとして機能し、もう１つが逆方向プライマーとして機能することを意味する。
【０１０１】
あるいは、分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、他の好ましい実施形態では、前記分子マーカーを定義する核酸配列と実質的に相補的な塩基配列を有する核酸プローブの使用を含んでなり、当該核酸プローブは、前記分子マーカーを定義する塩基配列と、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。適切な核酸プローブは例えばマーカーに対応する増幅生成物の一本鎖でもよい。
【０１０２】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、前記ゲノムＤＮＡ上の核酸増幅反応を行わせて１つ以上のＱＴＬｓを検出するステップを含んでもよい。それは一組のマーカー特異的なプライマーを使用してＰＣＲ反応を実施することにより可能となる好ましい実施形態では、前記ステップｂ）は、前記ＱＴＬのＡＦＬＰマーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記ＱＴＬのＡＦＬＰマーカーの核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーセットの使用を含んでなる。
【０１０３】
処理ｄ）の、予測された長さ又は予測された核酸配列を有するＤＮＡフラグメントを検出する処理は好ましくは、増幅されたＤＮＡフラグメントが、最初にマーカーが検出された植物由来のＤＮＡと同じプライマーを用いた同様の反応に基づいて増幅した場合の結果を基にした、予想される長さ（数塩基（例えば１、２又は３の塩基）長の増減があってもよい）に対応する長さを有する態様で実施するか、又は、前記増幅されたＤＮＡフラグメントが、最初に前記マーカーが検出された植物中のＱＴＬに関連したマーカーの配列に基づいて予想される配列に一致する核酸配列（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％超、更に好ましくは９９％を超の相同性を有しても良い）を有する態様で実施する。当業者に自明のように、感受性の親には存在するが耐性植物には存在しないマーカー（いわゆるトランスマーカー）はまた、子孫植物中の耐性を検出するアッセイにおいて有用であると考えられるが、但しマーカーの欠如を試験して特異的な特徴の存在を検出する場合には最適でない。
【０１０４】
予測された長さを又は予測された核酸配列を有する増幅されたＤＮＡフラグメントを検出するステップは、標準的なゲル電気泳動、又は自動ＤＮＡ解析装置を用いて実施してもよい。当該方法は無論、当業者にとり周知である。
【０１０５】
植物において単一染色体上に２つのＱＴＬｓの存在を検出する際、染色体ペインティング法を用いてもよい。かかる方法では、少なくとも第１のＱＴＬ及び少なくとも第２のＱＴＬを、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法又はｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲ法で、同じ染色体上で検出してもよい。かかる技術を用いて、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈの位置とのＱＴＬ−１の前記染色体上の相対的位置を確認してもよく、またその方法は公知技術である（例えばｖｉｄｅ Ｊｉａｎｇら、１９９５を参照）。より簡便には、２つのＱＴＬｓが単一染色体に存在するという事実を、それらがカップリング期にあることに基づいて確認してもよい（すなわち、別々の染色体に個々の遺伝子が存在する場合と比較して分離が減少している）。
【０１０６】
分子マーカー及びＱＴＬｓ：
分子マーカーを用いて、核酸配列の相違を視覚化してもよい。この視覚化は、制限酵素（ＲＦＬＰ）による切断後のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応を使用する方法（例えばＳＴＳ、マイクロサテライト、ＡＦＬＰ）において可能である。２つの親の遺伝子型の全ての違いは、これらの親の遺伝子型の交配に基づくマッピング集団（例えばＢＣ１、Ｆ２、図２を参照）において分離している。異なるマーカーの分離を比較し、組換え頻度を算出してもよい。通常、異なる染色体上の分子マーカーの組換え頻度は５０％である。同じ染色体に存在する分子マーカー間の組換え頻度は、マーカー間の距離に依存する。低い組換え頻度は、染色体上におけるマーカー間の低い遺伝的距離に対応する。全ての組換え頻度を比較することにより、染色体上の分子マーカーで最も論理的なオーダーが得られる。この最も論理的なオーダーは、連鎖地図（パターソン、１９９６）で表すことができる。耐病性の強化（例えば病原体による感染後の疾患を得ることの低下する発生率、及び／又は病原体との接触後の病変成長率の低下）と関連する連鎖地図上の隣接するマーカー群は、その疾患耐性に関連するＱＴＬの位置をピンポイントで示すものである。
【０１０７】
本願明細書で同定されるマーカーを用いてもよく、様々な本発明の態様として本願明細書に示される。本発明の態様は、本願明細書で同定されるマーカーの使用に限定されるものではない。上記の態様は、本願明細書に開示されているマーカーの使用のみに限定されず、むしろ未同定のものも同様に含まれる。遺伝学的単位には、「遺伝子」（形質発現が予測できない多数の因子に依存する）以外にも遺伝学的単位「ＱＴＬ」が存在し、それは定量可能な表現型に直接関与するゲノム領域のことを指す。したがって、遺伝子は植物育種にはほとんど関係しないが、ＱＴＬは植物育種に直接適用できるものである。本発明の発明者は、本明細書で定義されるキュウリのクロステロウイルス耐性及びウドンコ病耐性に関与するＱＴＬｓが、子孫植物のゲノムにおいて、各々特異的な構成を有しなければならないということを発見した。本発明者は、キュウリのゲノムの単一染色体上の、異なるＱＴＬｓに帰属する隣接するゲノムマーカーの一連の存在が、両方の耐性の存在と相関し、それにより、このゲノム構成が通常のメンデル式の遺伝形式で遺伝しうるという観察結果を基礎として、かかる新たな知見を得た。
【０１０８】
本発明で同定されたＱＴＬｓは、単一の染色体又は連鎖群上に位置し、それらの位置はそれ以外の多くの任意のマーカーによって十分に特徴づけられる。本明細書における試験では、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）及び挿入変異マーカーを用いたが、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）マーカー、マイクロサテライトマーカー（例えばＳＳＲｓ）、配列依存的増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカー、切断増幅多形配列（ＧＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー、又はこれらのマーカーの組合せを用いてもよい。一般に、ＱＴＬは数百万塩基の領域にわたることもある。したがって、ＱＴＬの完全な配列情報を得ることは実際には不可能であり、また不必要でもある。むしろ、（一連の隣接するゲノムマーカーの存在と、特異的な表現型の存在との間の観察された相関によって）ＱＴＬを最初に検出する方法により、子孫植物の集団の中から、特異的な表現型特徴を示すポテンシャル遺伝子を有する植物を発見することが可能となる。したがって本発明において、非限定的なマーカーのリストを提供することにより、繁殖プログラムにおけるＱＴＬｓの有用性が提供される。
【０１０９】
マーカーは、ある特定の系列に対して特異的である。したがって、特異的な特徴は特異的なマーカーと関係している。本出願に示すマーカーはＱＴＬの位置を示すだけでなく、それらはまた植物の特異的な表現型の存在との相関関係も示す。ゲノム上のＱＴＬの位置を示す隣接ゲノムマーカーは専ら恣意的なものであり、非限定的であることに留意すべきである。一般に、ＱＴＬの位置は、一連の隣接するマーカーとして示され、それは表現型に対する統計学的な相関関係を示すものである。その一連の外でマーカーが見出されたとき（すなわち特異的な閾値以下のＬＯＤ−スコアを示し、当該マーカーが隔離され、その領域における当該マーカーとＱＴＬ間の組換えが頻繁に発生し、マーカーの存在が統計学的に有意に表現型の存在と相関しないとき）、ＱＴＬの境界がそこで設定される。したがって、その特定された領域に位置する他のマーカーを用いてＱＴＬの位置を示すことも可能である。
【０１１０】
隣接するゲノムマーカーを用いて、個々の植物におけるＱＴＬ（すなわち表現型）の存在を示すことができる点は更に重要であり、すなわちマーカーアシスト選抜（ＭＡＳ）方法に使用できる。原則として、多くの潜在的に有用なマーカーは限定されるが、多くのマーカーを用いてもよく、当業者であれば、本願明細書に記載のマーカー以外の他のマーカーを容易に同定することができる。ＱＴＬに連結したあらゆるマーカー（例えば、当該ゲノム領域の物理的に境界内に、ある一定の閾値を上回るＬＯＤスコアを示すマーカーが分布し、それにより交配の際、マーカーとＱＴＬとの間で全く組換えが起こらないか、若しくはごくわずかな組換えしか起こらない）、並びにＱＴＬに対して連鎖不平衡にあるいかなるマーカー、並びにＱＴＬ中で実際に突然変異を表すマーカーを、ＭＡＳ方法に用いてもよい。このことは、本発明においてＱＴＬｓに関連するマーカーとして同定されたもの（例えばＱＴＬ−１に対するＡＦＬＰマーカーのＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１）が、ＭＡＳ方法の使用に適しているマーカーの単なる一例に過ぎないことを示すものである。更に、ＱＴＬ（又は特異的な特徴を付与するその一部）が他の遺伝的バックグラウンド（すなわち他の植物のゲノム）に移入されると、若干のマーカーは、その特徴が表れるにもかかわらず、子孫内では存在しなくなることがある。すなわち、かかるマーカーは、ゲノム領域の外側に存在し、それはオリジナルの親系列においてのみＱＴＬの特異的な特性を付与する部分であること、並びに、新規な遺伝的バックグラウンドは異なるゲノム構成を有することを示すものである。そのマーカーの不在が子孫への遺伝因子の良好な導入を示すかかるマーカーは「トランスマーカー」と称され、本発明におけるＭＡＳ法における使用も同様に好適である。
【０１１１】
ＱＴＬの同定後、ＱＴＬの効果（耐性）を、例えば試験対象のＱＴＬｓを分離させているＢＣ２Ｓ１世代の耐性を評価することによって確認してもよい。耐性の評価は、周知のようにキュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性をバイオアッセイするのが最適である。例えば、単離ＣＹＳＤＶ（ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ及びＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）のコレクションｎｏ．ＰＶ−０５９２／ＥＷＳＮ＿６として保管）を使用してもよく、実験的な感染は、例えばＢｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ（Ｂバイオタイプ）による伝達により行ってもよい。また、自然感染条件下でのフィールド試験を行い、ＣＹＳＤＶ又は他のクロステロウイルス耐性を評価してもよい。植物材料の人工接種によりウドンコ病耐性を評価してもよい。本発明に係るマーカーを最適に用いて、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリにおける、本発明の１つ以上のＱＴＬｓの存在を検出してもよく、またそれを用いて、マーカーアシスト選抜、並びにウドンコ病及びクロステロウイルス耐性キュウリの育種を実施してもよい。好ましくは、本発明のＱＴＬの存在の検出は、本明細書で定義される少なくとも１つのＱＴＬのマーカーを用いて実施される。ゆえに本発明の別の態様は、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬの存在の検出方法の提供に関する。当該方法は、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性であると考えられるキュウリにおいて、前記ＱＴＬの核酸配列の存在を検出することを含んでなり、上述のマーカーを用いてその存在を検出することを特徴とする。
【０１１２】
本発明のＱＴＬの核酸配列は、例えば前記ＱＴＬと関連する１つ以上のマーカーの核酸配列を決定し、前記マーカー配列の内部プライマーを設計し、更にそれを用いて前記マーカー配列の外のＱＴＬの配列を決定して解析してもよい。例えば、表２、３及び４のＡＦＬＰマーカーの核酸配列は、対象となる植物のゲノム中の前記マーカーの存在の決定において使用する泳動ゲルから前記マーカーを単離し、例えば公知の方法であるジデオキシ末端停止法により、前記マーカーの核酸配列を決定してもよい。
【０１１３】
ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリのＱＴＬの存在を検出するかかる方法の実施形態では、当該方法は、前記ＱＴＬ（好ましくは表２、３及び４のマーカーから選択）に連結したマーカーの核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを提供するステップと、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリのゲノム核酸の断片と、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとを接触させるステップと、前記ゲノム核酸断片に対する、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションの存在を測定するステップを含んでなる。
【０１１４】
好ましくは前記方法は前記ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリから得られる核酸サンプルに対して実施するが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いてもよい。あるいは、より好ましい実施形態ではあるが、当業者であれば、ＱＴＬの核酸配列が決定された後、前記ＱＴＬの核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできる特異的なハイブリッド形成用のプローブ若しくはオリゴヌクレオチドを設計し、かかるハイブリダイゼーションプローブを用いて、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリにおいて、本発明のＱＴＬの存在を検出することができる。
【０１１５】
主要なクロステロウイルス抵抗性遺伝子の位置を示すマーカーは、親株から生じた耐性個体及び高感受性個体からのキュウリＤＮＡ断片の選択的増幅によって得てもよい。当該方法は、−前記断片を制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ及びＭｓｅｌ）で処理し、更にライゲーションさせ、当該断片の端にプライマーに対応する補助アダプター（それらの端に１つ以上の特異的なヌクレオチドを有する）を連結させるステップであって、プライマー対のうちの１つのプライマーが検出目的で標識されているステップと、−変性条件下でゲル電気泳動を行い、増幅生成物を分離させるステップと、−抵抗性の子孫に由来する断片の混合物、及び感受性の子孫に由来する断片の混合物と、親株に由来する断片とを、それらの電気泳動プロファイルを比較することによって、抵抗性の遺伝子座と遺伝的に連結している多形バンドを同定するステップを含んでなる。前記同定の後、全ての個体に関して確証試験を行い、更にマーカーと耐性遺伝子座との間の遺伝子組換え率を算出する。
【０１１６】
原則として、本明細書で用いられる個々のＡＰＬＰマーカーは指定されたマーカーコードを有する。このコードは２つのプライマーを定義し、任意に、定義済みのアクセッションＮｏ．（上記表１の説明を参照）のプライマーの増幅生成物の長さを示す図との組み合わせにより説明する。すなわちＡＦＬＰマーカーを用いることにより、キュウリゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を実施し、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡフラグメントを得、示されたアクセッションＮｏ．の場合、示された長さの断片が得られる。更に当該マーカーは、５’−３’方向において、第１のプライマー配列、キュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列、及び第２のプライマー配列からなる配列、更にはその補足配列を含んでなる。したがって、キュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列には２つのプライマーが隣接している。用語「キュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列」は、それぞれのプライマーが隣接する領域の核酸配列を意味し、国際公開第０２／２２８３６号にて説明したように、特定のプライマーを使用してキュウリ目録Ｋｈｉｒａ ＰＩ２５０１４７から増幅される配列、又はそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列相同性を有する配列を表す。
【０１１７】
トランスジェニック技術によるウドンコ病及びクロステロウイルス耐性キュウリの育種：
本発明の別の態様では、少なくともＱＴＬ−１を含んでなる核酸（好ましくはＤＮＡ）配列、並びにｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ又はその耐性付与部分のうちの１つ（好ましくは両方）を、本発明の二重耐性キュウリの育種に用いてもよい。本発明のこの態様では、本明細書で定義されるＱＴＬｓ又はその耐性付与部分の使用により、二重耐性キュウリを作製し、当該使用においては、適切な宿主植物への前記ＱＴＬを含む核酸配列の導入を含んでなる。前述のように、前記核酸配列は、適切なクロステロウイルス及び／又はウドンコ病耐性ドナー植物に由来してもよい。ＱＴＬ−１として本願明細書に同定されるクロステロウイルス耐性遺伝子座の適切な供給源として、キュウリランドレース Ｋｈｉｒａ（ＰＩ２５０１４７）（パキスタン産）が挙げられる。それらの商業的な供給源、並びにその他の多くのＰＭ耐性キュウリ園芸品種は、例えばｈｔｔｐ：／／ｃｕｋｅ．ｈｏｒｔ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ｃｕｃｕｒｂｉｔ／ｃｕｋｅ／ｃｕｋｅｍａｉｎ．ｈｔｍｌ．に列挙されている。ＰＭ耐性植物は、例えばＴ．Ｃ．Ｗｅｈｎｅｒ，ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｅｎｅ ｃｕｒａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｃｕｒｂｉｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ（ＣＧＣ），Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅａｌｅｉｇｈ，ＮＣ２７６９５−７６０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．から得られてもよい。本願明細書に記載する両方のｐｍ遺伝子座の供給源としては、ＮＰＩ（ＰＩ ２００８１５を有する交雑Ｎａｔｓｕｆｕｓｈｉｎａｒｉ（ＰＩ ２７９４６５）から調製）が挙げられる。それらは例えば、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（ＣＧＮ），Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得てもよい。ＥＣＰ／ＧＲ Ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｈｏｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｇｒｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＣＯＭＡＶ） ｉｎ Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ、又はＧｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＧＲＩＮ） ｈｏｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＵＳＤＡ’ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄなどの幾つかの植物データベースを用いて、登録株の検索を行ってもよい。本発明によるこれらの材料の同定方法において記載したように、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性を示す他のキュウリを耐性ドナー植物として利用してもよい。
【０１１８】
適切なドナー植物を同定した後、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性を付与するＱＴＬを含む核酸配列、又はその耐性付与部分を、利用可能ないかなる方法によって適切な宿主植物へ導入してもよい。例えば、上述の核酸配列は、感受性の宿主植物と、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性ドナー植物を交配すること（すなわち遺伝子移入）、形質転換、プロトプラスト融合、二重ハプロイド技術、又は胚レスキュー若しくは他のいかなる核酸伝達システムによって行ってもよく、任意に、ＱＴＬを含む耐性型の子孫植物の選抜をその後行ってもよい。クロステロウイルス又はウドンコ病耐性（又はその耐性付与部分）のためのＱＴＬを含んでなる核酸配列を導入するトランスジェニック技術では、当該核酸を公知の方法を用いて前記ドナー植物から単離し、その単離された核酸をトランスジェニック技術を用いて宿主植物に導入する。当該導入方法としては、例えばベクター、生殖体、又は他の適切な媒体（例えば前記核酸配列でコーティングした粒子）の導入が挙げられる。
【０１１９】
植物の形質転換は一般に、植物細胞において機能する発現ベクターの構築を必要とする。本発明において、かかるベクターはクロステロウイルス又はウドンコ病耐性のためのＱＴＬ（又はその耐性付与部分）を含む核酸配列を含んでなり、当該ベクターにおいて、クロステロウイルス又はウドンコ病−耐性を与えている遺伝子は、調節エレメント（例えばプロモータ）と連結しているか、又は制御下にある。当該組合せに含まれる遺伝子の少なくとも１つがクロステロウイルス又はウドンコ病−耐性をコードする場合、当該発現ベクターは１つ以上のかかる制御可能に連結された遺伝子／制御エレメントの組合せを含んでもよい。当該ベクターはプラスミドの形でもよく、単独で使用してもよく、又は他のプラスミドとの組合せで使用してもよく、それらを用いて、公知技術の形質転換法（例えばアグロバクテリウム形質転換系）を用いて、クロステロウイルス耐性及びウドンコ病遺伝子を導入した植物を得る。
【０１２０】
発現ベクターは、使用可能な状態で調節エレメント（例えばプロモータ）と連結された少なくとも１つのマーカー遺伝子を含んでもよく、それにより、マーカーを含む形質転換細胞を、ネガティブ選抜（選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞生長を阻害）によって、又は、ポジティブ選抜（マーカー遺伝子によってコードされる生成物のスクリーニング）により回収することができる。植物の形質転換に一般的に用いられる選択可能な多くのマーカー遺伝子が従来技術において周知であり、例えば、選抜用の化学物質の毒性を代謝的に除去する酵素をコードする遺伝子（抗生物質又は除草剤）、又は阻害剤に対する感受性を喪失する形に変換された標的をコードする遺伝子などが挙げられる。マンノース選抜のようないくつかのポジティブ選抜方法が公知である。あるいは、マーカーを使用しない形質転換を行い、前記マーカー遺伝子のない植物を得てもよく、その技術は従来技術において周知である。
【０１２１】
発現ベクターを植物に導入する１つの方法は、アグロバクテリウム（例えばＨｏｒｓｃｈら、１９８５）の自然形質転換システムに基づく。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは遺伝的に植物細胞を形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＴｉ及びＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の形質転換に関与する遺伝子を担持する（例えばＫａｄｏ（１９９１）を参照）。発現ベクターを植物組織に導入する方法としては、アグロバクテリウムチュメファシエンス、（Ｈｏｒｓｃｈその他、１９８５）を用いた植物細胞の直接感染又は共存培養が挙げられる。グルーバー及びクロスビー（１９９３）及びマローニー（１９８９）は、アグロバクテリウムを媒介された遺伝子移入その他のアグロバクテリウムベクターシステムを開示している。また米国特許第５５９１６１６号を参照のこと。植物発現ベクター及びレポーター遺伝子及び変換プロトコルの一般的説明、並びにアグロバクテリウムの媒介による遺伝子移入ためのアグロバクテリウムベクターシステム及びそれを用いた方法の説明は、グルーバー及びクロスビー（１９９３）に記載されている。植物組織を培養する一般の方法は、三木ら（１９９３）による例、及びフィリップスら（１９８８）により開示されている。分子クローニング技術及び適切な発現ベクターのための適当な参照ハンドブックとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）が挙げられる。
【０１２２】
発現ベクターを植物に導入する他の方法として、マイクロインジェクションにより媒介される形質転換に基づく方法が挙げられる。当該方法では、ＤＮＡをマイクロ発射体の表面上に担持させることを特徴とする。発現ベクターは、植物細胞壁及び膜を透過するのに十分な３００〜６００ｍ／ｓの速度にマイクロ発射体を加速する装置を用いて植物組織に導入される（サンフォードその他、１９８７、１９９３；サンフォード、１９８８、１９９０；クラインら、１９８８、１９９２を参照）。植物にＤＮＡを導入する他の方法としては、標的細胞（チャンその他は、知る、１９９１）の超音波処理を介する方法が挙げられる。あるいは、リポソーム又はスフェロプラスト融合を用いて、発現ベクターを植物に導入してもよい（例えばＤｅｓｈａｙｅｓら、１９８５、及びＣｈｒｉｓｔｏｕら（１９８７を参照）。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−Ｌ−オルニチンを用いたプロトプラストへのＤＮＡの直接の取り込みも報告されている（例えばＨａｉｎら、１９８５、及びＤｒａｐｅｒら、１９８２を参照）。プロトプラスト及び全細胞及び組織へのエレクトロポーレーションに関しても開示されている（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、１９９２、及びラウルセン、１９９４を参照）。
【０１２３】
他の周知の技術（例えばＢＡＣの使用、キュウリゲノムの一部を細菌人工染色体（ＢＡＣ）に導入（すなわちベクターを用いて大腸菌細胞のＤＮＡフラグメント（１００〜３００ｋｂのサイズを挿入、平均１５０ｋｂ）をクローニング）し、バクテリア大腸菌で見つかる天然のＰ因子プラスミドに基づく（Ｚｈａｏ及びＳｔｏｄｏｌｓｋｙ、２００４）方法）、を例えばＢＩＢＡＣシステム（ハミルトン、１９９７）との組合せで使用し、遺伝子導入植物を作製してもよい。
【０１２４】
キュウリ標的組織の形質転換に続いて、上記した選択可能なマーカー遺伝子を発現させ、現在公知技術の再生及び選抜方法を用いて形質転換細胞、組織及び／又は植物の選抜を行う。
【０１２５】
非トランスジェニック方法によるクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリの育種：
クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを作製するための別の実施形態では、プロトプラスト融合を用いて、ドナー植物から宿主植物への核酸導入を行ってもよい。プロトプラスト融合とは、２つ以上のプロトプラスト（細胞壁を酵素処理によって除去した細胞）間の誘発若しくは自然的な結合（例えば体細胞ハイブリダイゼーション）により、単一の二核若しくは多核細胞を作製する技術のことを指す。融合細胞（性質により交配できない植物種から得てもよい）を組織培養して、望ましい特徴の組合せを示すハイブリッド植物を形成できる。より詳しくは、第１のプロトプラストを、クロステロウイルス又はウドンコ病感染に対する耐性を示すにキュウリ又は他の植物系列から得てもよい。第２のプロトプラストは、例えば、病害抵抗性、虫害抵抗性、有益な果物特徴など（これらに限定されない）を有する第２のキュウリ又は他の植物変異体（好ましくは商業的に有益な特徴を有するキュウリ系列）から調製してもよい。次にプロトプラストを、従来公知のプロトプラスト融合法を用いて融合させる。
【０１２６】
あるいは、ドナー植物から宿主植物への胚レスキュー（ｅｍｂｒｙｏ ｒｅｓｃｕｅ）を採用し、本願明細書に記載の１つ以上のＱＴＬｓを含有する核酸を導入してもよい。胚レスキューは、植物が生存できる種子の作製に失敗した時、交配株から胚を単離するのに用いることができる。この方法では、植物の受精卵又は未熟種子を組織培養し、新規な植物を作製する（Ｐｉｅｒｉｋ、１９９９）。
【０１２７】
本発明はまた、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性キュウリの作製方法にも関する。当該方法は、上記したドナーキュウリ中において、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関連する定量耐性遺伝子座（ＱＴＬ）の存在を検出する方法を実施するステップと、少なくとも検出した当該１つ以上のＱＴＬ、又はクロステロウイルス若しくはウドンコ病耐性付与部分を含んでなる核酸配列を、前記ドナー植物からクロステロウイルス又はウドンコ病感受性の宿主キュウリに導入するステップを含んでなる。前記核酸配列の導入は本願明細書に上記したいかなる方法で実施してもよい。
【０１２８】
かかる方法の好ましい実施態様として、交雑によって、前記核酸配列を、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性ドナーキュウリから、クロステロウイルス又はウドンコ病感受性の宿主キュウリへの遺伝子導入する態様が包含される。したがって、この遺伝子導入は従来の繁殖方法を用いて適宜実施してもよい。ＱＴＬｓは好ましくはマーカーアシスト選抜（ＭＡＳ）又はマーカーアシスト育種（ＭＡＢ）を用いて商業的なキュウリ種へ移入される。ＭＡＳ及びＭＡＢは、所望の特徴をコードする遺伝子を１つ以上含むそれらの子孫植物の同定及び選抜における、当該分子マーカーの１つ以上の使用を含んでなる。かかる例においては、その同定及び選抜は本発明に係るＱＴＬｓ又はそれに連結するマーカーの選抜に基づく。ＭＡＳを用いて、目的のＱＴＬを有する近同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を育種してもよく、各ＱＴＬの効果の詳細な検討も可能となり、また戻し交配自殖系統（ＢＩＬ）集団の育種にも応用することができる（例えばＮｅｓｂｉｔｔら、２００１、ｖａｎ Ｂｅｒｌｏｏら、２００１）。この実施形態により育種されるキュウリは、宿主植物から大多数のそれらの特徴を好適に引き継ぎ、またドナー植物からのクロステロウイルス及びウドンコ病耐性の特徴も有する。
【０１２９】
上記したように、従来の繁殖方法を用いて、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関与する核酸配列を、クロステロウイルス及びウドンコ病感受性の宿主キュウリに導入することができる。系統育種と呼ばれる１つの方法では、クロステロウイルス又はウドンコ病に対する耐性を示し、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関与する核酸コード配列を有するドナーキュウリを、クロステロウイルス若しくはウドンコ病感受性の宿主キュウリ（好ましくは商業的に望ましい特徴（限定されないが病害抵抗性、虫害抵抗性、有益な果物特徴など）を示す）と交配させる。得られる植物群（Ｆ１ハイブリッド）を更に自家授粉し、種子（Ｆ２種子）を得る。Ｆ２種子から成長させたＦ２植物を、更にクロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関してスクリーニングする。当該集団を、様々な方法でスクリーニングしてもよい。
【０１３０】
第１に、従来の疾患スクリーンを使用して集団をスクリーニングしてもよい。かかる病態スクリーニングは公知である。好ましくは、定量的バイオアッセイを用いる。第２に、マーカーアシスト選抜を実施し、上記した分子マーカーの１つ以上を使用してクロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関与する核酸コード配列を含むそれらの子孫を同定してもよい。上記した他の方法を用いて、ＱＴＬの存在を検出してもよい。また、マーカーアシスト選抜を用いて定量的バイオアッセイから得られる結果を確認してもよく、またその他の幾つかの方法を組み合わせて用いてもよい。
【０１３１】
近交系クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリ系列の親系列は、循環選択及び戻し交配の技術を使用して育種してもよく、自殖及び／又はジハプロイド又は他のあらゆる技術を用いて作製してもよい。循環選択及び戻し交配において、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性は、循環親と、第１のドナー植物を交配させることにより標的宿主植物に移入することもできる。それは反復親とは異なり、本明細書において「一回親」と称される。循環親はクロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性を有さないか、又は低い耐性を有する植物であって、例えば商業的に望ましい特徴（病害抵抗性、虫害抵抗性、有益な果物特徴など）を有するものである。一回親は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性を示し、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する核酸配列を含んでなる。一回親は、循環親との交配により得られる植物変異体又は近交系であってもよい。循環親及び一回親との間で交配して得た株を、循環親に戻し交配する。得られる植物群を更に所望の特徴に関してスクリーニングする。当該スクリーニング方法は特に限定されない。例えば、周知の表現型病理スクリーニング又は定量的バイオアッセイを用いて、集団をスクリーニングしてもよい。あるいは、バイオアッセイを使用する代わりに、マーカーアシスト選抜（ＭＡＳ）を、上記の分子マーカー、ハイブリッド形成プローブ又はポリヌクレオチドの１つ以上を使用して、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する核酸配列を含む子孫を同定してもよい。また、ＭＡＳを用いて定量的バイオアッセイから得られる結果を確認してもよい。また、ｐｍ−ｈの劣性形質は、この遺伝子が表現型スクリーン（例えば耐性バイオアッセイ）を用いてＦ１又はＢＣ１集団から選抜できないことを意味する。ゆえに本願明細書に係るマーカーは、遺伝子型のスクリーニングによって適当な子孫植物を選択するのに適切である。
【０１３２】
スクリーニングの後、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性表現型を示すＦ１ハイブリッド植物、又は好ましくは遺伝子型は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する核酸配列を含んでなり、それを更に選抜して循環親に戻し交配し、キュウリを次第に近交系にする。このプロセスは、２〜５以上の世代にわたり実施することが好ましい。原則として、循環親と一回親との交配により得られる、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性株の子孫は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する１つ以上の遺伝子に関してヘテロ接合体である。
【０１３３】
例えば、植物系列にｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ遺伝子座を移入したとき、ｐｍ−ｈ遺伝子座は劣性であり、その耐性表現型は、ホモ接合のｐｍ−ｈ植物を形成できる条件下においてのみ子孫植物において生じることに留意すべきである。
【０１３４】
一般に、所望の特徴をハイブリッドキュウリ変異体に導入する方法は、以下のステップを含んでなる：
（ａ）１つ以上の所望の特徴を含む他のキュウリと、近交系キュウリ親を交配して、Ｆ１子孫植物を作製するステップであって、当該所望の特徴が、クロステロウイルス耐性及びウドンコ病耐性からなる群から選択されるステップと、
（ｂ）好ましくは本明細書で定義される分子マーカーを使用して、所望の特徴を有する前記Ｆ１子孫植物を選抜するステップと、
（ｃ）前記近交系キュウリ親株と、前記選択された子孫との戻し交配して戻し交配植物を得るステップと、
（ｄ）戻し交配子孫植物を、所望の特徴及び前記近交系キュウリ親株の形態的、生理的な特徴に関して選択するステップであって、前記選抜が、ゲノムＤＮＡを単離し、上記ＤＮＡを、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及び／又はｐｍ−ｈの少なくとも１つの分子マーカー（好ましくは本願明細書に記載のもの）の存在に関して試験するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）を２回以上反復し、第３世代若しくはそれ以上の戻し交配子孫植物を作製するステップと、
（ｆ）選抜した戻し交配子孫を任意に近交し、ホモ接合の植物を同定するステップと、
（ｇ）最低１つの前記戻し交配子孫又は近交系植物と、他の近交系のキュウリ親株（好ましくはｐｍ−ｈｙｐｏ耐性、すなわちホモ接合のｐｍ−ｈ）とを交配し、ハイブリッドキュウリ変異体（同じ環境で成長させたとき、ハイブリッドキュウリ変異体の所望の特徴、並びに形態的及び生理的特徴の全てを有する）を得るステップを含んでなる。
【０１３５】
上記のように、最後の戻し交配生成は近交により行い、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関してホモ接合の純粋株（近交系）子孫を得てもよい。したがって、循環選択、戻し交配及び近交により、商業的に有用な特徴と関連する他の遺伝子と共に、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関連する遺伝子と相同な遺伝子を有する系列が得られる。
【０１３６】
クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリ及び種子：
植物育種の目的は、単一の変異体又はハイブリッド中で様々な望ましい特徴を組み合わせることである。商品作物の場合、これらの特徴としては、病気及び昆虫に対する耐性、熱及びかんばつに対する体制、成熟期間の短縮、収率の上昇及び農産物としての優れた品質などが挙げられる。植物特徴（例えば発芽及び成長、成長率、成熟及び草高の均一性など）が重要となることもある。
【０１３７】
商品作物は、花粉媒介による植物的な方法を利用して育種される。植物は、同一の花に由来する花粉が、その同一の花若しくは同じ植物の他の花へ移される場合に自家授粉される。同じファミリー又は系列の個体を花粉媒介に用いたとき、植物は兄弟授粉される。花粉が、異なるファミリー又は異なる系列の植物に存在する花に由来する場合、植物は他花受粉される。
【０１３８】
多世代にわたり自動授粉され、形態を基に選抜された植物は、全ての遺伝子座においてホモ接合性になっており、真の繁殖子孫としての同一集団を形成する。２つの異なるホモ接合性系列間での交配により、多くの遺伝子座に関してヘテロ接合体であるハイブリッド植物の同一集団を形成する。多くの遺伝子座でヘテロ接合体となっている２本の植物の交配により、遺伝的に多様な、同一でないヘテロな植物集団を形成する。
【０１３９】
キュウリ育種プログラムにおけるハイブリッドキュウリ多様性の成長は、以下の３つのステップを含んでなる：
（１）第一の育種交配のために、様々な生殖質プールから植物を選抜するステップと、
（２）繁殖交配から選抜された植物を数世代にわたり近交し、個々に繁殖した、非常に均一な一連の近交系を作製するステップと、
（３）ハイブリッド子孫（Ｆ１）の作製に無関係な近交系と、選抜された近交系とを交配させるステップ。同系交配を充分行った後、連続したハイブリッド世代は単に、育種された近交系の種子を増加させる目的でのみ用いる。好ましくは、近交系は、その遺伝子座の約９５％以上でホモ接合性対立遺伝子を含まなければならない。
【０１４０】
近交系のホモ接合性及び均質性による顕著な効果として、確立された近交系のペアを交配して作製したハイブリッドは、常に同質であるということである。優れたハイブリッドを作製する近交系を同定した後、これらの近交系両親を使用してハイブリッド種を継続的に供給することができ、更にこのハイブリッド種子からハイブリッドキュウリを栽培することができる。
【０１４１】
本発明の方法で作製できるクロステロウイルス及びウドンコ病抵抗キュウリ、又はその部分は、本発明に包含される。
【０１４２】
本発明の別の態様は、上記にて説明したＱＴＬｓを何らかの構成で含んでなるクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリ又はその部分の提供に関し、詳細には、少なくとも１つの前記ＱＴＬｓはその天然の遺伝的バックグラウンドに存在しない。本発明のクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリは、例えば近交系のいかなる遺伝子タイプ、ハイブリッド、ハプロイド、ジハプロイド、又はトランスジェニックであってもよい。更に、本発明の植物は、耐性特徴に関してヘテロ接合体であってもよく、またホモ接合性であってもよい（好ましくはホモ接合性である）。本発明のＱＴＬｓ（並びにその耐性付与部分）をいかなる植物に導入してクロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物を作製してもよいが、本発明に係る方法及び植物は、キュウリに関連する植物である。
【０１４３】
本願明細書に記載されているクロステロウイルス及びウドンコ病耐性近交系キュウリ系列を用いて、更に交配を行い、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性ハイブリッド植物を作製してもよい。例えば、本発明の第１のクロステロウイルス及びウドンコ病耐性近交系キュウリは、商業的に望ましい特徴（例えば病害抵抗性、虫害抵抗性、望ましい果物特徴など）を有する第２の近交系キュウリと交配してもよい。この第２の近交系キュウリ系列は、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性を有さなくてもよい。好ましくは、この系列は、この劣性形質がハイブリッドの子孫植物において発現されるために、ｐｍ−ｈに関してホモ接合性である。
【０１４４】
本発明の別の態様は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを栽培する際の種子の作製方法に関する。一実施形態では、当該方法は、
クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを準備するステップと、
前記クロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物を他のキュウリと交配するステップと、
前記交配から得られる種子を収集するステップを含んでなる。更にそれを栽培し、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを作製する。
【０１４５】
別の実施形態では、当該方法は以下のステップを含んでなる：
本発明のクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを準備するステップと、
前記クロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物とキュウリとを交配するステップと、
前記交配から生じる種子を回収し、前記種を植物体に成長させるステップと、
本願明細書に記載のいずれかの方法で、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物を選抜するステップと、
充分な世代数にわたり、選択された植物を自家授粉して繁殖させ、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性を付与する対立遺伝子が安定した植物を得るステップと、
そのように得られた植物を、望ましい表現型を有するキュウリと十分な世代数にわたり戻し交配して、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性、並びに望ましい表現型を有するキュウリを得るステップと、
最後の戻し交配から生じる植物から作製される種子を回収するステップ。上記の種子を栽培し、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性を有するキュウリを作製する。
【０１４６】
表４のマトリックスにおいて、ｐｍ耐性若しくはクロステロウイルス耐性の親に由来する（耐性親の存在として示される）二重耐性植物における、マーカーの有無を示す。マトリックスは更に、二重（ＰＭ及びクロステロウイルス）耐性植物系列と関連するＡＦＬＰマーカーの起源及び相対的位置を示す。用語ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈにより示される「マーカー」は、２つのそれぞれのウドンコ病耐性遺伝子座の中心位置を示す。ＱＴＬ−１遺伝子座の位置は決定しなかったが、クロステロウイルス関連マーカーを使用することにより、その遺伝子座は２つのｐｍ遺伝子座の間に存在することが示される。表より、プールｎｒｓ．１〜６では、プールｎｒｓ．１０〜１５より短い、クロステロウイルス耐性親からの遺伝子移入が可能であることが示唆される。マトリックスの解釈は、以下の通りである：例えば、マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３（５６．９ｃＭ）は、ｐｍ耐性親及び二重耐性子孫に存在したが、一方マーカーＥ１１／Ｍ８０−Ｍ００３（７９．１ｃＭ）は、クロステロウイルス耐性親には存在したものの、二重耐性子孫には存在しなかった。すなわち、マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３はＰＭ関連のマーカーであり（その存在は、テストした植物系列のｐｍ−ｌ関連遺伝子の領域の存在を示す）、一方、マーカーＥ１１／Ｍ８０−Ｍ００３は、クロステロウイルス耐性に関連するＱＴＬ−１遺伝子座の近傍の遺伝的領域であるが、ｐｍ−ｈｙｐｏ（ｐｍ−ｈ）耐性の発現にとっては必須ではないことを示す。
【０１４７】
【表４】
＋＝ホモ接合性が存在（高密度のバンド）、
−＝存在しない（バンドなし）、
＋／−＝ヘテロ接合体が（低密度バンド）、
Ｄ＝中程度に存在（中程度のバンド）、
・＝ＰＭ抵抗親におけるマーカースコア（両方存在：［＋］、不在：［−］）、
・＝マーカースコア（クロステロウイルス耐性親）、
・＝親系列における未同定マーカーの存在。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】考えられる組換えシナリオを示す図。２つの別々の植物から得たそうであるウドンコ病（ｐｍ）及びクロステロウイルス（ＱＴＬ−１）耐性を、単一の子孫植物内で連結させた。多くの耐性遺伝子座を有するものとして示される様々な親植物は、それ自体交配若しくは自家交配の結果でありえることを理解すべきである。すなわち、ＱＴＬであるｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈを有する植物は、単一のＱＴＬを有する植物間での交配によって得られる。
【図２】同上。
【図３】同上。
【図４】同上。
【図５】同上。
【図６】同上。
【図７】単一の連鎖群における、キュウリＮＰＩ由来のウドンコ病耐性（ｐｍ）遺伝子、及びＣ．ｓａｔｉｖｕｓ Ｋｈｉｒａ由来のクロステロウイルス耐性（ＱＴＬ−１）遺伝子の様々な位置関係を示す。Ｐｍ−ｌｅａｆ１は、本明細書で用いられるｐｍ−ｌに相当し、Ｐｍ ｈｙｐｏは本明細書で用いられるｐｍ−ｈに相当する。
【図８】本願明細書の表２及び３中の各配列番号により示されるＳＮＰ及び挿入マーカー近傍のＤＮＡ配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐病性植物及び植物育種の分野、より詳細にはウドンコ病及びクロステロウイルス−耐性キュウリ植物の育種に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）の農業生産においては、様々な植物病に見舞われることがしばしばある。黄化ウイルスによってそのような植物病が生じ、キュウリの生産において深刻な経済的ダメージが生じることもある。クロステロウイルス（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（キュウリに悪影響を与える黄化ウイルスの中で最も上位の分類学上のクラスタを形成）のファミリーには、３０種類以上の、曲状及び糸状の、昆虫により媒介される植物ウイルスが含まれる。上記ファミリーは３つの属からなり、特にモンシロチョウにより媒介されるＣｒｉｎｉｖｉｒｕｓ属には、キュウリに深刻な影響を与える種が含まれる。この属には特に、ウリ科黄色萎縮ウイルス（ＣＹＳＤＶ）、レタス伝染性黄斑ウイルス（ＬＩＹＶ）、及びビート偽黄化病ウイルス（ＢＰＹＶ）などの種が属する。ＣＹＳＤＶ及びＢＰＹＶはキュウリ栽培者にとり最も脅威である。
【０００３】
上記のウイルスは通常昆虫ベクター上に存在し、植物上の昆虫の摂食活動によって伝播する。したがって、キュウリクロステロウイルスは、殺虫剤の散布により抑制できる。しかしながら、好ましくは農業及び園芸におけるクロステロウイルスの制御は、寄主植物のウイルス耐性栽培品種を提供することにより行われる。現時点では、抵抗性のキュウリ種のゲノム上の少なくとも２つの量的形質遺伝子座又はＱＴＬｓが、キュウリのクロステロウイルス耐性と関連していることが知られている（特許文献１）。ゆえに子孫植物へのクロステロウイルス耐性関連の遺伝物質の適当な遺伝的浸透は、これらのＱＴＬｓに連結させた特異的なマーカーを検出することによってモニターできる。ゆえにＱＴＬｓについての見識を利用して、クロステロウイルス耐性栽培品種の育種を効率的に行うことが可能となる。
【０００４】
キュウリの農業生産に影響を及ぼす他の重要な植物病として、キュウリウドンコ病（ＰＭ）が挙げられる。ウリ科のＰＭは、菌類のＳ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ及びＥ．ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍによって生じうる。当該植物病は一年中発生し、その症状は、感染した葉の表面上における純粋な白い菌糸による小さなスポットの発生から始まり、そのスポットが次第に拡大し、最終的に茎及び葉が白い、粉末状の大量の胞子及び菌糸で覆われるに至る、というものである。重度の感染により葉の変色及び損失が生じ、その結果、果実の数及びサイズの減少に至る。ウドンコ病に対して効果的な多くの殺菌剤が存在するが、かかる化学物質に対する菌の耐性の問題が生じる。
【０００５】
ある程度のウドンコ病耐性であれば、様々なキュウリ株において見られる。かかる株としては、例えばインドの野生のキュウリ：番号ＰＩ１９７０８８及び番号ＰＩ２００８１５、ＰＩ２００８１８、並びに栽培品種Ｎａｔｓｕｆｕｓｈｉｎａｒｉ及びＡｓｏｍｉｄｏｒｉ（モリシタら、２００３）が挙げられる。また、ＰＭに対する耐性と関連する様々な遺伝子が公知であり（Ｆａｎｏｕｒａｋｉｓ、１９８４；Ｆｕｊｉｅｄａ及びＡｋｉｙａ（１９６２）；Ｋｏｏｉｓｔｒａ、１９６８、１９７１；Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒｕｍら、１９７１、１９７２）、Ｎａｔｓｕｆｕｓｈｉｎａｒｉのｐｍ−１及びｐｍ−２、ＰＩ２００８１５及びＰＩ２００８１８のｐｍ−３、及び栽培変種Ｗｉｓ．ＳＭＲ１８の「ｐｍ−ｈ」（遺伝子「ｐｍ−ｈ」は本願明細書においてｐｍ−ｈとして示されるｐｍ遺伝子座に相当する）などが挙げられる。栽培されている幾つかのキュウリの種類は、ＰＭに対する部分的な耐性を示すものの、大部分の農業生産者は未だに葉への殺菌剤投与に依存している。この理由の１つとして、他のタイプの耐性を示す株に対してＰＭ耐性を導入するのが困難であるという点が挙げられる。例えば、ＰＭ耐性対立遺伝子を得た株が、クロステロウイルスに対して感受性になる（それまではそうではなかった）、あるいはその逆という事態が育種の際に生じることが例として挙げられる。実際に、交配試験において、ＰＭ及びクロステロウイルス両方に対する耐性を示すキュウリの株はこれまで得られていない。すなわち有用な二重抵抗性の組換え体はこれまで得られていない。しかしながら驚くべきことに、比較的直接的な育種方法によっても、異なる特徴を単一のゲノムに取り込ませることが可能であることを見出した。
【特許文献１】国際公開第０２／２２８３６号パンフレット
【非特許文献１】Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ ＪＡ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ（ｅｄｓ．）（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献２】Ｂａｉ ＹＬ，Ｈｕａｎｇ ＣＣ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｕｌｓｔ Ｒ，Ｍｅｉｊｅｒ Ｄｅｋｅｎｓ Ｆ，Ｂｏｎｎｅｍａ Ｇ，Ｌｉｎｄｈｏｕｔ Ｐ（２００３）ＱＴＬｓ ｆｏｒ ｔｏｍａｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｏｉｄｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）ｉｎ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ Ｇｌ．１６０１ ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ．ＭｏＩ．ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １６： １６９−１７６．
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ，Ｍｕｒｐｈｙ ＪＥ，ａｎｄ Ｓｗａｉｎ ＷＦ（１９８７）Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃａｌｌｕｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８４：３９６２−３９６６．
【非特許文献４】Ｄｅｓｈａｙｅｓ Ａ，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ Ｌ，Ｃａｂｏｃｈｅ Ｍ（１９８５）Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：２７３１−２７３７．
【非特許文献５】Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ Ｋ，Ｂｏｎｎｅ Ｅ，Ｂｏｓｓｕｔ Ｍ，Ｄｅ Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ Ｍ，Ｌｅｅｍａｎｓ Ｊ（１９９２）Ｐｌａｎｔ．Ｃｅｌｌ ４： １４９５−１５０５．
【非特許文献６】Ｄｒａｐｅｒ Ｊ，Ｄａｖｅｙ ＭＲ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＪＰ，Ｃｏｃｋｉｎｇ ＥＣ ａｎｄ Ｃｏｘ ＢＪ（１９８２）Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｓｍｉｄ− ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｅｔｕｎｉａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３，４５１−４５８．
【非特許文献７】Ｆａｎｏｕｒａｋｉｓ ＮＥ（１９８４）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ｏｆ ｍｅｉｏｓｉｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ．
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｅｄａ Ｋ，ａｎｄ Ａｋｉｙａ Ｒ（１９６２）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｓｐｉｎｅ ｃｏｌｏｒ ｏｎ ｆｒｕｉｔ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．ＨｏＨ．Ｓｄ．３１：３０−３２．
【非特許文献９】Ｇａｎａｌ ＭＷ（１９９６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ− ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ，Ｉｎ： Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，６１−７３．
【非特許文献１０】Ｇｒｕｂｅｒ ＭＹ，Ｃｒｏｓｂｙ ＷＬ（１９９３）Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ ＢＲ Ｇｌｉｃｋ，ＪＥ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ，ｐｐ ８９−１１９．
【非特許文献１１】Ｈａｉｎ Ｒ，Ｓｔａｂｅｌ Ｐ，Ｃｚｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙ ＡＰ，Ｓｔｅｉｎｂｌｉｓｓ ＨＨ，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ Ｌ，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ（１９８５）Ｕｐｔａｋｅ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｔｏ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６１−１６８．
【非特許文献１２】Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＣＭ．（１９９７）Ａ ｂｉｎａｒｙ−ＢＡＣ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ− ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ．Ｇｅｎｅ ２００： １０７−１１６．
【非特許文献１３】Ｈｏｒｅｊｓｉ Ｔ，Ｓｔａｕｂ ＪＥ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｃ．（２０００）Ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１５（２）：１０５−１１３．
【非特許文献１４】Ｈｏｒｓｃｈ ＲＢ，Ｆｒａｌｅｙ ＲＴ，Ｒｏｇｅｒｓ ＳＧ，Ｓａｎｄｅｒｓ ＰＲ，Ｌｌｏｙｄ Ａ（１９８５）Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７： １２２９−１２３１．
【非特許文献１５】Ｊｉａｎｇ Ｊ，Ｇｉｌｌ ＢＳ，Ｗａｎｇ ＧＬ，Ｒｏｎａｌｄ ＰＣ ａｎｄ Ｗａｒｄ ＤＣ（１９９５）Ｍｅｔａｐｈａｓｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４８７−４４９１．
【非特許文献１６】Ｋａｄｏ ＣＩ（１９９１）： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１０，１−３２．
【非特許文献１７】Ｋｌｅｉｎ ＴＭ，Ｇｒａｄｚｉｅｌ Ｔ，Ｆｒｏｍｍ ＭＥ，Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ（１９８８）． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｚｅａ ｍａｙｓ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ５５９−５６３．
【非特許文献１８】Ｋｌｅｉｎ ＴＭ，Ａｒｅｎｔｚｅｎ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ ＰＡ，ａｎｄ Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ− ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ Ｓ（１９９２）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ．Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２８６−２９１．
【非特許文献１９】Ｋｌｅｉｎｅ Ｍ，Ｃａｉ Ｄ，Ｈｅｒｍａｎｎ ＲＧ，ａｎｄ Ｊｕｎｇ Ｃ（１９９５）Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｅｍａｔｏｄｅ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｂ．ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９０： ３９９−４０６．
【非特許文献２０】Ｋｏｏｉｓｔｒａ Ｅ（１９６８）Ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １７：２３６− ２４４．
【非特許文献２１】Ｋｏｏｉｓｔｒａ Ｅ（１９７１）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｆｌｅｓｈ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｃｏｌｏｒｓ ｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｃｕｍｂｅｒｓ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ２０：５２１−５２３．
【非特許文献２２】Ｌｕｉ ＢＨ（１９９７）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ： Ｌｉｎｋａｇｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ＱＴＬ Ａｎａｌｙｓｉｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｇ １８−１９．
【非特許文献２３】Ｍｉｋｉ ＢＬ，Ｆｏｂｅｒｔ ＰＦ，Ｃｈａｒｅｓｔ ＰＪ，Ｉｙｅｒ ＶＮ．１９９３．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ： Ｇｌｉｃｋ ＢＲ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＥ（Ｅｄｓ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６７−８８．
【非特許文献２４】Ｍｏｌｏｎｅｙ ＭＭ，Ｗａｌｋｅｒ ＪＭ，Ｓｈａｒｍａ ＫＫ（１９８９）Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉｎ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ８： ２３８− ２４２．
【非特許文献２５】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｍ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｋ，Ｓａｉｔｏ Ｔ，ａｎｄ Ｓａｋａｔａ Ｙ（２００３）Ｒｅｖｉｅｗ： Ｐｏｗｄｅｒｙ Ｍｉｌｄｅｗ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ．ＪＡＲＱ ３７（１），７−１４．
【非特許文献２６】Ｎｅｓｂｉｔｔ ＴＣ，Ｔａｎｋｓｌｅｙ ＳＤ（２００１）ｆｗ２．２ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ，ｗｉｔｈ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｆｒｕｉｔ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈａｔｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７： ５７５−５８３．
【非特許文献２７】Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＡＨ（１９９６）Ｍａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｐ．４１−５４．Ｉｎ Ａ．Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ（ｅｄ．）Ｇｅｎｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ．
【非特許文献２８】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＲＬ，Ｓｏｍｅｒｓ ＤＡ，Ｈｉｂｂｅｒｄ ＫＡ．１９８８．Ｃｅｌｌ／ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ： Ｇ．Ｆ．Ｓｐｒａｇｕｅ ＆ Ｊ．Ｗ．Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｄｓ．Ｃｏｒｎ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，３ｒｄ ｅｄ．，ｐ．３４５−３８７．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ．
【非特許文献２９】Ｐｉｅｒｉｋ，Ｒ．Ｌ．Ｍ．（１９９９）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．
【非特許文献３０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献３１】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ，Ｋｌｅｉｎ ＴＭ，ＷｏＩｆ ＥＤ，Ａｌｌｅｎ Ｎ（１９８７）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｊ．Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７−３７．
【非特許文献３２】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ（１９８８）Ｔｈｅ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：２９９−３０２．
【非特許文献３３】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ（１９９０）Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，７９，２０６−２０９．
【非特許文献３４】Ｓａｎｆｏｒｄ ＪＣ，Ｓｍｉｔｈ ＦＤ，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＪＡ（１９９３）Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：４８３−５０９．
【非特許文献３５】Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒｕｍ Ｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＨ，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＣＥ（１９７１）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６１：１２１８−１２２１．
【非特許文献３６】Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒｕｍ Ｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＨ，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＣＥ（１９７２）Ａ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｗｉｔｈ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ．ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ ７：５５５−５５６．
【非特許文献３７】Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｐａｒｔ Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．
【非特許文献３８】Ｖａｎ Ｂｅｒｌｏｏ Ｒ，Ａａｌｂｅｒｓ Ｈ，Ｗｅｒｋｍａｎ Ａ，Ｎｉｋｓ ＲＥ（２００１）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ＱＴＬ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＱＴＬ−ＮＩＬｓ ｆｏｒ ｂａｒｌｅｙ ｌｅａｆ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＭｏＩ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ８： １８７−１９５．
【非特許文献３９】Ｖｏｓ Ｐ，Ｈｏｇｅｒｓ Ｒ，Ｂｌｅｅｋｅｒ Ｍ，Ｒｅｉｊａｎｓ Ｍ，ｖａｎ ｄｅ Ｌｅｅ Ｔ，Ｈｏｍｅｓ Ｍ，Ｆｒｉｊｔｅｒｓ Ａ，Ｐｏｔ Ｊ，Ｐｅｌｅｍａｎ Ｊ，Ｋｕｉｐｅｒ Ｍ（１９９５）ＡＦＬＰ： ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３： ４４０７−４４１４．
【非特許文献４０】Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｃｈｅｎｇ Ｌ，Ｘｕ Ｎ，Ｚｈａｏ Ｍ，Ｌｉ Ｃ，Ｙｕａｎ Ｊ，ａｎｄ Ｊｉａ Ｓ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：９９６−９９７．
【非特許文献４１】Ｚｈａｏ Ｓ，ａｎｄ Ｓｔｏｄｏｌｓｋｙ Ｍ（２００４）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＶｏＩ ２５５．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、キュウリに影響を及ぼすクロステロウイルスファミリーのウイルス（特にＢＰＹＶ及びＣＹＳＤＶ）に対する耐性、Ｓ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ及び／又はＥ．ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍにより生じるキュウリウドンコ病に対する抵抗性を有するキュウリの提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは鋭意研究の結果、ＣＹＳＤＶ及びＰＭに対する耐性を示す多くのキュウリを見出した。更に、これらの二重抵抗性のキュウリが、ウドンコ病耐性と関連する２つの定量形質遺伝子座（ＱＴＬｓ）（本願明細書におけるｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ）、並びにクロステロウイルス耐性に関連する主要なＱＴＬ（本願明細書におけるＱＴＬ−１）を含むことを発見した。更に重要なことに、全てのＱＴＬｓが単一の遺伝連鎖群に位置するということを発見した。すなわち本発明の発明者は基本的に、これらの植物ではクロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性遺伝子が単一の染色体に存在することを発見した。かかる植物は植物育種への使用に非常に適する。更に発明者らは、なぜこれまで二重抵抗性のキュウリが交配試験で得られなかったのかを示すメカニズムを発見した。特定の理論に束縛されるわけではないが、１つの植物病に対する耐性を与えるのに必要となる遺伝的要素の遺伝質浸透により、他の植物病に対する耐性を与えるのに必要となる遺伝的要素が損なわれるものと考えられる。この発見によって、発明者らはある特殊な育種方式を開発し、それにより上記の問題が解決され、所望の二重抵抗性を有する植物が得られるようになった。
【０００８】
本発明の第１の態様は、キュウリウドンコ病耐性と同時にキュウリクロステロウイルス耐性を有するキュウリの提供に関する。
【０００９】
本発明のかかる植物の好ましい実施形態では、クロステロウイルス耐性（ＱＴＬ−１）に関与する１つ以上のゲノム領域、並びにウドンコ病耐性（ｐｍ−ｈ及び／又はｐｍ−ｌ）に関与する１つ以上のゲノム領域は単一の染色体上に存在する。かかる植物のより好ましい実施形態では、ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方が存在し、かつＱＴＬ−１がｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの間に位置する。
【００１０】
本発明の植物の更なる実施形態では、国際公開第０２／２２８３６号（本発明に援用する）において更に詳細に記載されているように、ＱＴＬ−１の存在は、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜される少なくとも１つの隣接マーカーの存在の有無により示される。
【００１１】
本発明の植物の他の実施形態では、ｐｍ−ｈと称されるＱＴＬの存在は、前記植物のウドンコ病耐性を伴う単一のヌクレオチド多形（ＳＮＰ）から生じる、少なくとも１つの突然変異を含んでなる核酸配列の存在に有無により示され、前記少なくとも１つの単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）は下記の表２に示すようにＳＮＰ１及びＳＮＰ２から選抜される。
【００１２】
別の実施形態では、本発明の植物中の、ｐｍ−ｌと称されるＱＴＬの存在は、前記植物のウドンコ病耐性と関連する、以下の表３中でＳＮＰ３として示される単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）から生じる少なくとも１つの突然変異を含んでなる核酸配列の存在の有無により示されるか、又は、前記植物のウドンコ病耐性と関連する、以下の表３における５ｂｐの挿入部分（５’−ＡＡＴＴＴ−３’）として示す少なくとも１つの突然変異を含んでなる核酸配列の存在の有無により示される。
【００１３】
本発明の好適な実施形態では、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する抵抗性を示す植物の提供に関する。詳細には、前記植物はキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）であり、前記植物は単一の染色体上に、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域と、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含んでなり、クロステロウイルス耐性を付与する前記少なくとも１つの領域が、Ｅ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーと連結し、ウドンコ病耐性を付与する前記少なくとも１つの領域が、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに−マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに連結している。
【００１４】
本発明の植物は、クロステロウイルス耐性に関連する第２のＱＴＬを任意に含んでもよい（国際公開第０２／２２８３６号に記載のＱＴＬ−２ように、このＱＴＬの局在化及び特徴に関する詳細がこの特許文献の明細書に明確に示されている）。このＱＴＬは、染色体上の別々の位置に配置していることが示されている。
【００１５】
本発明の別の態様は、上記の本発明に係るキュウリの一部分の提供に関する。好ましくは、前記植物の一部分は、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選択され、最も好ましくは種子である。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明に係る上記の二重抵抗性キュウリ（クロステロウイルス及びＰＭに耐性を示す［ＰＭ−葉（ｐｍ−ｌ）及びＰＭ−胚軸（ｐｍ−ｈ）抵抗性の表現型を含む］）と、農産物として望ましい特徴を有する第２のキュウリ又は他の種類の植物（好ましくはキュウリ株の植物）とを交配させることにより得られるＦ１種の提供に関する。好ましくは、前記第２のキュウリは最小限のｐｍ−ｈを含む（劣性遺伝子であるため）。その場合、前記第２のキュウリは最小限のヘテロ型であり、好ましくは、劣性のｐｍ−ｈ特性を有するため、ホモ型である。他の好適な実施形態では、前記第２のキュウリはクロステロウイルスに感受性で、好ましくは近交系の植物である。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明に係る上記Ｆ１種を栽培することによって得られる雑種植物の提供に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明にかかる上記ハイブリッド植物の一部分の提供に関する。好ましくは前記植物の一部分は、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選抜され、最も好ましくは果実である。
【００１９】
上記したように、ＰＭ又はクロステロウイルスへの耐性に必要となる各々の遺伝要素を１つだけ有する抵抗性植物の交配による、当該遺伝要素の遺伝的浸透により、他の植物病に対する耐性に必要となる遺伝因子が損失すると考えられている。この発見により、発明者らはこの課題を解決できる育種方法の開発に至り、それにより所望の二重耐性植物を得るに至った。本発明の発明者は、耐性がＱＴＬ−１によって付与されるクロステロウイルス−耐性親キュウリ株と、耐性がｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌによって付与されるＰＭ耐性キュウリ株との交配により効果的に二重抵抗性のキュウリを作製する場合に、育種において、組換え体の作製（すなわち１つの染色体における相同組換えを発生させる）するステップと、それに続く、単一の染色体上にＱＴＬ−１及びｐｍ−ｌ、又はＱＴＬ−１及びｐｍ−ｈを有する植物を選抜するステップを含める必要があることを見出した。好ましくは、前記選抜ステップは、単一の染色体上にＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈを有する植物の選抜を含んでなる。より好ましくは、ＱＴＬ−１はｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌが配置されているゲノム領域の間に挿入され、それにより、クロステロウイルス耐性に必要となるＱＴＬ１がＰＭ耐性に必要となる２つのＱＴＬｓの間に挟まれる位置関係をとる。
【００２０】
ＰＭ又はクロステロウイルス耐性と関係する、本明細書で定義されるいずれかのＱＴＬの存在の確認は、植物の染色体上の各々のＱＴＬと連結した１つ以上の遺伝マーカー、植物の染色体上の各々のＱＴＬに対して連鎖不平衡である遺伝マーカー、又はそれらの組み合わせを検出することによってなされる。
【００２１】
前記植物の前記ＱＴＬｓの存在及び／又は位置の適切な検出方法には、前記ＱＴＬｓを特徴づけるＡＦＬＰマーカーの使用が含まれる。好ましくは、単一の染色体上におけるＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及び／又はｐｍ−ｈを有する植物の上記選抜のためのステップは、ｐ／ｎ−４のための定量形質遺伝子座（ＱＴＬ）を有する染色体上、又はＰＭ−耐性と関連するｐｍ−ｈのための定量形質遺伝子座（ＱＴＬ）を有する染色体上、好ましくはｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌのための定量形質遺伝子座を有する染色体上の、クロステロウイルス耐性関連の定量形質遺伝子座ＱＴＬ−１を特徴づける少なくとも１つのＡＦＬＰマーカーの検出を含んでなり、その場合、前記ＱＴＬ−１マーカーはＱＴＬ ｐｍ−ｈとＱＴＬ ｐｍ−ｌの間の染色体領域に位置する。すなわち、当該選抜プロセスは、表２、３及び４に記載のマーカーからなるマーカー群から選抜される１つ以上のマーカーの検出を含んでなってもよい。
【００２２】
本発明の別の態様は、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリの選抜方法であって、前記植物において、単一の染色体上のＱＴＬ−１、並びに少なくともＱＴＬｓ ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈのうちの１つを検出することを含んでなる方法の提供に関する。
【００２３】
一実施形態では、当該方法は以下のステップを含んでなる：
ａ）キュウリからゲノムＤＮＡのサンプルを得るステップと（当該サンプルは充分な長さのゲノムＤＮＡ断片を含んでなる）、
ｂ）少なくとも１つの第１のＱＴＬ、又はそれに関連するＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈからなる群から選抜される分子マーカーを含んでなる断片を選抜するための精製反応を実施するステップと、
ｃ）前記選抜された核酸断片の増幅反応を実施するステップであって、少なくとも１つの第２のＱＴＬ、又はそれに関連するＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈからなる群から選抜される分子マーカーを含んでなる断片を検出するステップと、
ｄ）ステップｃ）の反応生成物中の、予測された長さ又は予測された核酸配列を有する増幅されたＤＮＡ断片を検出するステップ。
【００２４】
好ましい実施形態では、前記ステップｂ）は、前記第１のＱＴＬの分子マーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記マーカーを定義する核酸配列と実質的に相補的である少なくとも１つの核酸プローブの使用を含んでなり、前記核酸プローブは前記１つ以上のマーカーを定義する核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する。
【００２５】
他の好ましい例として、前記処理ｃ）は、前記第２のＱＴＬの分子マーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記第２のＱＴＬの分子マーカーの核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーセットの使用を含んでなる。
【００２６】
本発明の方法の他の実施形態では、前記植物中の単一の染色体上の前記ＱＴＬｓの存在を検出するステップは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術、又はｉｎ ｓｉｔｕ増幅技術を用いて実施する。また、前記ＱＴＬｓの分子マーカーを定義するか、又は前記ＱＴＬの分子マーカーの核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプローブ及びプライマーを、前記方法で使用するのが好適である。
【００２７】
本発明の幾つかの態様では、分子マーカーは好ましくは、ＳＮＰ、挿入突然変異マーカー又はＡＦＬＰマーカーであり、好ましくは表２から４に列挙されるマーカーからなる群から選抜されるマーカー、並びに本願明細書に引用される文献において記載されたそれらである。
【００２８】
本発明の別の態様は、キュウリクロステロウイルス、及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリ植物の作製方法の提供に関し、当該方法は以下のステップを含んでなる：
ａ）キュウリクロステロウイルス耐性を付与する染色体領域を含む第１のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１により表される、キュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーの存在を検出することにより行われるステップと、
ｂ）キュウリウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含む第２のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１により表される、第１のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップか、又は、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１の挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００により表される、第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップによって行われるステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得られた前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）Ｆ１種子をＦ１植物に成長させ、交配又は自家交配することによって前記Ｆ１植物から更なる子孫を生じさせるステップと、
ｅ）前記更なる子孫植物から、ステップａ）において定義したキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーと、ステップｂ）において定義したキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーを含んでなる植物を選抜するステップ。
【００２９】
当業者であれば、前記更なる子孫の集団は、その集団から単一の染色体上に少なくとも２つの相同組換えを生じさせている植物の存在を検出できるのに充分なサイズでなければならないことを理解するであろう。通常、１，０００の植物からなる集団で充分である。本発明で提案するマーカー選抜技術による利点としては、かかる母集団のサイズであっても、目的の遺伝子型（表現型的として検知されなくてもよい）の存在を容易にスクリーニングできる点が挙げられる。
【００３０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップｂ）の第２のキュウリを選抜するステップが、前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓのうちの１つのみを有する第２のキュウリを選抜することを含んでなり、また前記方法は、以下のステップを更に含んでなる：
ｆ）前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓ（すなわち前記第２のキュウリに存在しないＱＴＬ）のうちのもう１つを有する第３のキュウリを選抜するステップと、
ｇ）ステップｅ）で得られたＦ１植物と、前記第３のキュウリとを交配させて、更なる子孫植物を得るステップと、
ｈ）当該子孫植物から、ステップａ）で定義されるキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬと、ステップｂ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する両方のＱＴＬｓを含む植物を選抜するステップ。
【００３１】
好ましい実施形態では、ウドンコ病耐性を付与する遺伝子座ｐｒｎ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方を含む植物が選抜され、詳細には、ＱＴＬ−１によって特徴づけられるクロステロウイルス耐性を付与する遺伝子座が、ウドンコ病耐性を付与する遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの両方の間に配置されている。
【００３２】
すなわち、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性を示すキュウリの作製方法の他の好ましい実施態様では、ステップｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する染色体領域を含むキュウリを選抜するステップは以下のステップを含んでなる：
−前記植物のゲノム中において、
配列番号１のＳＮＰマーカー ３９Ｔ→Ｇ、
配列番号２のＳＮＰマーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１で表される第１のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号３のＳＮＰマーカー １９３Ｃ→Ｔ、
配列番号４の位置２２１における挿入突然変異 ５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００で表される第２のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップ。
【００３３】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性を示すキュウリを作製する方法の他の好ましい実施形態では、ステップａ）、ｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）のうちの少なくとも１つは、前記植物から得たゲノムＤＮＡのサンプルを提供するステップと、前記ゲノムＤＮＡのサンプル中から前記少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなる。
【００３４】
他の好ましい実施形態では、ステップｅ）は、植物ゲノム中において、ＱＴＬ−１と関連する少なくとも１つのマーカー、並びにｐｍ−ｈ若しくはｐｍ−ｌに関連する少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなり、好ましくは、植物ゲノム中及び単一の染色体上において、ＱＴＬ−１に関連する少なくとも１つのマーカー、ｐｍ−ｌに関連する少なくとも１つのマーカー、及びｐｍ−ｈに関連する少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなり、好ましくは、表２、３及び４に列挙されるマーカー群から選択されるマーカーを含んでなる。
【００３５】
他の好ましい実施形態では、ステップｅ）は、上記の二重抵抗性のキュウリを選抜するための本発明の方法により実施される。
【００３６】
ステップｃ）からｅ）にて説明した方法であって、二重抵抗性のＦ１を生じさせる一度の交配において、単一の染色体上で少なくとも２つの相同組換えが生じる方法は、多くの世代を通じて実施可能であり、それにより、単一の染色体中における所望の（少なくとも２回の）相同組換え、及びそれによる二重抵抗性の植物の形成が、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５又はいかなる世代においても実施可能となる。かかるバリエーションは本発明の範囲内に含まれ、当業者によって容易に実施される。
【００３７】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリを作製する代替的な方法は、次のステップを含んでなる：
ａ）本発明の方法を実施して、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示す第１のキュウリを選抜するステップと、
ｂ）前記植物を同系育種して、前記ＱＴＬｓのホモ接合植物株を得るステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得た前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）前記Ｆ１種子をＦ１植物に成長させるステップ。
【００３８】
本発明の別の態様は、本発明の方法で作製される植物又はその部分の提供に関する。
【００３９】
本発明により子孫植物の非常に迅速なスクリーニングが可能となり、それにより二重耐性を示すと考えられる植物の選抜が可能となる。例えば、子孫植物の中から、少なくとも１つのｐｍ−ｈマーカー、少なくとも１つのｐｍ−ｌマーカー及び少なくとも１つのＱＴＬ−１マーカーを有する植物を検出することが可能となる。かかる植物は、望ましい遺伝的浸透が行われたと考えられる。更なるマーカーに関するスクリーニングを行うことにより、子孫植物が二重耐性を示すという予測上の信頼性を向上させることができる。３つのＱＴＬｓの各々の少なくとも１つのマーカーを示す植物の検出に基づき、植物を選抜することが可能となり、また育種プログラムあるいは更なる同定試験にも使用できる。
【００４０】
本発明の植物の利点としては、上記の特性が同一の染色体に存在するため、従来の育種を使用したときでも、上記の両方の耐性を制御する遺伝子を（ハイブリッド）植物中へ容易に移動させることが可能となることであり、逆に従来の育種技術を用いた場合では、それらの特性が隔離した染色体上に存在するため、両方の特性を有するハイブリッドを作製するのがはるかに困難となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
定義
本明細書で使用される「キュウリ」という用語には、一般にＣｕｃｕｍｂｅｒと呼ばれるプラント、アメリカガーキン、Ｃａｓｓａｂａｎａｎａ、Ｃｕｋｅ、Ｇｈｅｒｋｉｎ、Ｈｏｔｈｏｕｓｅキュウリ、Ｌｅｍｏｎキュウリ、Ｍａｎｄｅｒａキュウリ、Ｐｉｃｋｌｉｎｇキュウリ、Ｓｅｒｐｅｎｔキュウリ、Ｓｌｉｃｉｎｇキュウリ、Ｓｎａｋｅキュウリ及び西インド諸島のガーキンなどが包含されるがこれらに限定されないキュウリ植物又はその一部を意味する。
【００４２】
本発明の用語「植物部分」とは、単細胞及び細胞組織（例えば植物において、完全である植物細胞、細胞凝集塊及び植物が再生できる組織培養）などの植物の一部を意味する。植物部分の例としては、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽及び種子に由来する単一の細胞及び組織、ならびに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト、カルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「クロステロウイルス」とはＣｌｏｓｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅのファミリーのウイルスのことを指し、一般にＣｕｃｕｒｂｉｔ黄色萎縮障害ウイルス（ＣＹＳＤＶ）、Ｌｅｔｔｕｃｅ伝染性黄化病ウイルス（ＬＩＹＶ）、及びＢｅｅｔ偽黄化病ウイルス（ＢＰＹＶ、またその同義語Ｃｕｃｕｍｂｅｒクロロチックスポットウイルス（ＣＣＳＶ）、Ｃｕｃｕｍｂｅｒ黄化病ウイルス、Ｍｕｓｋｍｅｌｏｎ黄化病ウイルス又はＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｐａｌｌｉｄｏｓｉｓウイルスとして公知）と呼ばれるウイルス、好ましくはＢＰＹＶ及びＣＹＳＤＶ、最も好ましくはＣＹＳＤＶである。好ましくは、キュウリ植物に関する用語「ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ」とは、特にキュウリ（ｉ．ｅ．ｔｈｅ Ｃｒｉｎｉｖｉｉｄｅａｅ）に影響を与える属を指す。
【００４４】
本明細書で使用される「ウドンコ病」という用語は、真菌Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（またその同義語Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ黄色ｉｉ及びＳ．ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅとして公知）によって、及び／又は真菌Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ（またその同義語Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍとして公知）によって、及び／又は真菌Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｔａｕｒｉｃａ（またその同義語Ｏｉｄｉｏｐｓｉｓ ｔａｕｒｉｃａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｔａｕｒｉｃａ、Ｏｖｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｃｙｎａｒｅａ、Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍとして公知）によって、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）において、生じる疾患を意味する。
【００４５】
用語「ＱＴＬ」は、本願明細書では、連続的に分散した（定量的な）表現型特徴の発現と関連する、対立遺伝子（例えば遺伝子又は制御配列の形）を含んでいる、当業者に公知の染色体領域を意味する用語として用いられる。「耐病性ＱＴＬ」という用語は、特定の染色体に置かれる領域であって、すなわち、耐性遺伝子をコードする少なくとも１つの遺伝子に関連するか、又は、少なくとも１つの制御領域、（染色体領域）であって、耐性に関連する１つ以上の遺伝子の発現を制御するものを指す。耐性を伴うＱＴＬｓを指すものとして、より短い同義語：「耐性付与遺伝子座」を本願明細書では用いる。ＱＴＬｓは、１つ以上の分子ゲノムマーカーを使用して、特異的なキュウリ継承のゲノムのそれらの遺伝子位置を示すことにより定義されてもよい。１つ以上のマーカーは、次に、特異的な遺伝子座を示す。遺伝子座の間の距離は、通常同じ染色体上の遺伝子座との間に、乗換えの頻度で測定される。２つの遺伝子座が遠くに離れるほど、より頻繁に交叉がそれらの間において、発生する。逆にいえば、２つの遺伝子座が間近である場合、それらの間での交叉は発生しにくい。概して、１センチモルガン、コーサンビー・マップ関数、ｃＭは、遺伝子座（マーカー）との間に、１％の組換えにほぼ等しい（Ｌｕｉ、１９９７）。ＱＴＬが並列マーカーによって、示すことができる場合、エンドポイントマーカー間の遺伝的距離はＱＴＬのサイズを表す。
【００４６】
用語「染色体」は、本願明細書では、当業者に公知のように、細胞ＤＮＡを含有し、そのヌクレオチド配列に遺伝子の線形配列を有する、細胞核の自己再生する遺伝的構造のことを意味する用語として用いる。
【００４７】
本発明で使用する「連鎖群」という用語は、同じ染色体に置かれる遺伝子又は遺伝形質の全てを指す。連鎖群の範囲内で、十分に間近であるそれらの遺伝子座は、遺伝的交雑の結合を示す。交差の確率が染色体上の遺伝子との間の物理的距離によって、増加するため、場所が連鎖群の中で各々からはるかに隔離した遺伝子は、遺伝子検査において、いかなる検出可能な直接的な結合も示すことはありえない。用語「連鎖群」は、大部分は染色体譲渡がまだなされなかった遺伝子のシステムの連結された挙動を示す遺伝子の遺伝子座を指すために用いる。したがって、本発明では、用語「連鎖群」とは、染色体（物理的存在）と同義である。
【００４８】
本発明の用語「対立遺伝子」とは、遺伝子の１つ以上のいずれかの代替的な形を意味しその全ての対立遺伝子が少なくとも１つの特徴又は特徴に関する。二倍体細胞において、提供された遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。本発明はＱＴＬｓ（すなわち１つ以上の遺伝子又は制御配列を含みうるゲノム領域）に関するため、若干の例においては「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち染色体部分の対立遺伝子）を指すのがより正確であるが、そのような場合、用語「対立遺伝子」は用語「ハプロタイプ」を含むものとして理解されるべきである。
【００４９】
本願明細書における「遺伝子」とは、一連のＤＮＡからなる遺伝単位として定義され、それは、染色体上の特定の位置を占め、また生物体の特定の形質又は特徴を制御する遺伝的な暗号を含んでなる。
【００５０】
「遺伝子座」とは、提供された遺伝子又は制御配列が提供された種の染色体に占有する位置として、本願明細書に定義される。
【００５１】
「相同組換え」とは、２つのＤＮＡ分子の間でのＤＮＡ断片の組換え（「クロスオーバー」）、又は同一のヌクレオチド配列の一定の領域における対染色体の染色分体間での組換えのことを指す。「組換え現象」は、本願明細書において、減数分裂のクロスオーバーを意味すると理解される。
【００５２】
本発明で使用する「分子マーカー」という用語は、核酸配列の特徴の相違を視覚化する方法において、用いられる指標のことを指す。かかる指標の例としては、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅された断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲｓ）配列同定された増幅領域（ＳＣＡＲｓ）、切断された増幅された多形配列（ＣＡＰＳ）マーカー又はアイソザイムマーカー又は特異的な遺伝子の及び染色体位置を定義する本願明細書に記載されているマーカーの組合せが挙げられる。「ＱＴＬにリンクされる分子マーカー」は、本明細書で定義されるように、ＳＮＰ、挿入変異、並びにＡＦＬＰマーカー又はフィールドにおいて、使用する通常の他のタイプのあらゆるマーカーのことを指してもよい。本願明細書におけるＡＦＬＰマーカーの前後関係において、マーカーとは、２つのＡＦＬＰ−プライマーに隣接するキュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列を指し、そのプライマーは、「コアプライマー」Ｅ及びＭ（制限酵素部位ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅｌ部位に相当）（Ｖｏｓその他、１９９５、Ｂａｉその他。２００３）、更に示すような２つ又は３つの選択的な塩基が続き、各々に選択的なヌクレオチドを確認する２桁のコードが続き、それによって、「コアプライマー」が延長される（コードに関しては表１を参照）。Ｅ１６／Ｍ５０−２４４は、増幅プライマーＥｃｏＲＩ ＋ ＣＣ及びＭｓｅｌ ＋ ＣＡＴを用いて得られる、２４４ｂｐ．の全長を有する断片状のマーカーを意味する。断片の長さは断片の検出方法に依存すると考えられ、若干の塩基を増減させたものであっても、その正確な長さのものとさほど変わらない。本願明細書に記載のマーカーを定義する際、リケージマップの他のマーカーとの、そのマーカーの染色体上の相対的位置として参照する必要がある。すなわち、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４は、そのプライマーの配列によって、増幅生成物の長さによって、並びに、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００及び／又はＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００３との相対的位置によって、又は、本願明細書に記載のように、表４のマトリックスのｃＭの対応する距離を有する順序づけられたリストにて図示するように、他のマーカーとの相対的な位置により定義されてもよい。しかしながら、考慮が必要となることとして、植物間の交雑により、特定のマーカーが損なわれることもあることが挙げられるが、但し特定のマーカーの欠如が、耐病性を与え、マーカーがそこに連結する遺伝因子の存在を否定するわけではない。
【００５３】
表１：通常、ＡＦＬＰ分析において適用され、本発明においても用いるプライマー伸長コード（Ｓｏｕｒｃｅ：Ｋｅｙｇｅｎｅ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ）
【表１】
【００５４】
用語「キュウリ特異的なＤＮＡ配列」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは、９０％以上、好ましくは、９５％以上、好ましくは、９７％以上、最も好ましくは９９％以上、キュウリのゲノム配列とのヌクレオチド配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を意味する。それは大きな類似性を示し、好ましくはＱＴＬ−１マーカーの場合、ＱＴＬ−１マーカーに隣接するキュウリのアクセッションＮｏ．ＰＩ ２５０１４７のＤＮＡ塩基配列の一部を構成する。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド配列相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間の相同性を意味する。２つの配列のアラインメントを作成したときに最大の一致性でヌクレオチドの配列が同じである場合に、ポリヌクレオチドは「相同な」配列を有するという。２つ以上のポリヌクレオチドの間の配列比較は、通常、配列類似性を有する局部領域を同定し、比較ウインドウ上の２つの配列の部分を比較することにより実施される。比較ウインドウは通常、約２０〜２００の連続ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの「配列相同性のパーセンテージ」（例えば５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００パーセント配列相同性）は、比較ウインドウの上の２つの最適に整列配置された配列を比較することによって、決定でき、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分には、最適な２つの配列の参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較し添加又は欠失（すなわちギャップ）が存在する。パーセンテージの算出は、
（ａ）同一の核酸塩基が両方の配列において、存在する位置の数を勘定してマッチする位置の数を算出し、
（ｂ）比較のウインドウの位置の総数で、上記のマッチする位置の数を除算し、
（ｃ）結果に１００を乗算して配列相同性パーセンテージとして示すことにより行われる。比較配列の最適配列は、周知のアルゴリズムを用いたコンピュータ化された実施態様で行ってもよく、又は視覚による検査によって、実施してもよい。直ちに利用できる配列比較及び並列配列アルゴリズムとしては、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９７）、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（両方ともインターネットで利用可能）が挙げられる。他の適切なプログラムとしては、ＧＡＰ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＰｌｏｔＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ及びＦＡＳＴＡ（ウィスコンシンＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ） （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ，１９８４））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される「ｐｍ−ｈ」という用語は、下子葉部において、発現される推定のウドンコ病抵抗性遺伝子を意味し、好ましくは表２の特定のＳＮＰの存在下で定義される。
【００５７】
表２：ウドンコ病耐性表現型との完全な関連を示すＳＮＰを、ＱＴＬ ｐｍ−ｈとして本願明細書に示す。
【表２】
【００５８】
本明細書で使用される「ｐｍ−ｌ」という用語は、推定のウドンコ病抵抗性遺伝子ｐｍ−ｌｅａｆを意味し、好ましくは表３の特定の突然変異の存在下で定義される。
【００５９】
表３：ウドンコ病耐性表現型との完全な関連を示している突然変異を、ＱＴＬ ｐｍ−ｌとして本願明細書に示す。
【表３】
【００６０】
「ＱＴＬ−１」用語とは、クロステロウイルス耐性に連結するゲノム領域を指し、ＷＯ ０２／２２８３６において、詳細に記載されているマーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及び／又はＥ１１／Ｍ４８−２５１により定義される（上記開示内容を本発明に援用する）。
【００６１】
「子孫」植物という用語は、１つ以上の親株からの無性生殖的若しくは有性生殖的な再生によって、得られる植物、又はその子孫としてのあらゆる植物のことを指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローニング若しくは自家交配、又は２つの親植物を交配させることによって、得られ、Ｆ１若しくはＦ２、又はそれ以上の世代を含むものと解される。Ｆ１は、両親（その少なくとも１つが特徴ドナーとして初めて用いられ）から製作される第一世代の子であり、一方、第二世代（Ｆ２）又はそれ以降の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子孫がＦ１、Ｆ２などの自殖から作製される標本である。ゆえにＦ１は、２人の本物の繁殖両親（本当の繁殖は、特徴のためにホモ接合性である）のハイブリッドから生じているハイブリッドであると（通常）考えられ、Ｆ２が前記Ｆ１ハイブリッドの自家受粉から生じる子孫であると（通常）考えられる。
【００６２】
本発明では、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する場所に存在するとき、「ヘテロ接合体」という用語を、それを表す遺伝子的条件として用いる。
【００６３】
本発明では、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する場所に存在するとき、「ホモ接合性」という用語を、それを表す遺伝子的条件として用いる。
【００６４】
植物育種の前後関係の「ハイブリッド」という用語は、異なる系列又は種類又は種の植物交配により作製される、遺伝的に異なる両親の子としての植物を意味し、２つの自殖系統の交配を含むがこれに限定されない。
【００６５】
本発明で用いる「近交系」という用語は、実質的にホモ接合の個体又は株を意味する。
【００６６】
本発明における用語「遺伝子移入」とは、天然の、及び人工的なプロセスであって、種を交配させることによって、１つの種、変異体多様性又は園芸品種のゲノム領域が他の種、変異体又は園芸品種のゲノムに移入することを指す。当該方法は、任意に再発する親に戻し交配して実施してもよい。
【００６７】
本願明細書に用いられる「遺伝子工学」、「形質転換」及び「遺伝子組換え」の用語は、単離されクローニングされた遺伝子を、他の生物体のＤＮＡ（通常染色体ＤＮＡ又はゲノム）へ移入することと、同義である。
【００６８】
本発明の用語「集団」とは、共通の遺伝的な派生を有する、遺伝的に異質な植物のコレクションを意味する。
【００６９】
本発明の用語「変異体」又は「栽培品種」とは、構造的若しくは遺伝子的特徴及び／又はパフォーマンスによって、同じ種の範囲内で他の種類と区別できる、類似する植物群を意味する。
【００７０】
「抵抗性」及び「耐性」の用語は、感染に対する部分的及び完全な耐性のことを指す。感受性の植物は、感染に対して抵抗性を有さないか、又は耐性レベルが低いと考えられる。上記の用語には、「完全な耐性」、「免疫性」「中程度の耐性」、「部分的な耐性」、「過敏症」及び「許容性」などの、別に定義することが可能な形の抵抗性が包含される。
【００７１】
「完全な耐性」とは、感染の後に病気が全く進行しない状態のことを指し、病原体が細胞内に入ること（第一の感染）がなされない結果によるものであってもよく、あるいは、細胞内で感染源が増殖できず、他の細胞にも感染しない（潜在的な感染ではなく、拡散することもない）結果によるものであってもよい。
【００７２】
「感受性」という用語は、植物が疾患による影響を受け、病徴に至るような疾患に対する耐性を有しない植物を指すものとして、本願明細書で用いられる。ゆえに「感受性」という用語は、「非抵抗性」と同義語である。
【００７３】
核酸に関する「ハイブリッド」という用語は、相補的なヌクレオチド塩基間の水素結合により形成される二本鎖核酸分子（又はデュプレックス）を指す。「ハイブリダイズする」又は「アニールする」という用語は、核酸配列の一本鎖が補完的な塩基との間で水素結合による二重螺旋部分を形成させる方法のことを指す。
【００７４】
「プローブ」という用語は、目標核酸配列分析物又はその相補ＤＮＡ誘導体の相補配列と共に水素結合デュプレックスを形成する、一本鎖オリゴヌクレオチド配列をいう。
【００７５】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、増幅目標にアニーリングでき、ＤＮＡポリメラーゼの結合を可能にするオリゴヌクレオチドを意味し、それにより、プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件（すなわちヌクレオチド及び例えばＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の存在）、並びに適切な温度及びｐＨ条件下に設けられた場合に、ＤＮＡ合成の開始位置として機能する。（増幅）プライマーは好ましくは増幅の最大効率のために一本鎖である。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼの存在下での伸長生成物の十分な合成を可能にするため、十分な長さを有する必要がある。プライマーの正確な長さは多くの因子に依存し、例えば温度及びプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）などが挙げられる。例えばＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅において、用いる、一対の双方向性プライマーは、１つの順方向及び１つの逆方向プライマーからなる。本明細書で用いられる「プライマー」は、複数のプライマーを指すこともあると理解され、特に増幅される目標領域の末端配列に関して情報の曖昧性が存在する場合には複数のプライマーが用いられる。それ故、「プライマー」には、配列又は中に若干の変異を有する配列を含んでなる、プライマーオリゴヌクレオチドのみならず、典型的な塩基対形成を可能にするプライマーも包含される。オリゴヌクレオチドプライマーは、いかなる適切な方法で調製してもよい。特異的な配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は公知であり、例えばクローニングや、配列の制限酵素処理、及び直接の化学合成などが挙げられる。化学合成の例としては、ホスホジ−又はトリエステル法、ジエチルホスホロアミデート法及び固相支持法（米国特許第４４５８０６６号で開示）などが挙げられる。プライマーは、必要に応じて標識してもよく、例えば分光、蛍光、光化学、生化学、免疫化学若しくは化学的な測定手段で検出される態様で標識してもよい。温度依存性のオリゴヌクレオチドプライマー伸長は、ポリメラーゼにより触媒され、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸エステル（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（すなわちｄＮＴＰｓ）又はその類似体の十分な量の存在下、適当な塩、金属陽イオン及びｐＨ緩衝システムを含有する反応溶媒中で当該触媒反応がなされる。適切なポリメラーゼは、プライマー−及び鋳型に依存してＤＮＡ合成反応を触媒することが知られている酵素である。公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ又はそのクレノー断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらのＤＮＡポリメラーゼを有するＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼすための反応条件下は、従来技術において、周知である。合成の生成物は鋳型鎖及びプライマー拡張鎖からなる二重分子であり、標的配列を含む。これらの生成物は、次のラウンドで複製のための鋳型として役立つ。複製の２回において、第１のサイクルのプライマー伸長鎖は、その相補プライマーによって、アニールされる、合成により、「ショート」にプライマー配列又はそれらの補足によって、５’−及び３’末端に結合される生成物を与える。変性、プライマーアニーリング及び伸長の反復サイクルは、プライマーにより定義される目標領域の指数関数的な蓄積に結果としてなる。充分なサイクルは、核酸の目標領域を含んでいるポリヌクレオチドの所望の量を提供するために行われる。所望の量は異なる場合もあり、生成物ポリヌクレオチド実際に用いる目的により異なる。ＰＣＲ方法は通常ハンドブックに記載され、当業者に知られている。ＰＣＲによる増幅の後、標的ポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、検出できる。それはストリンジェント〜適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で標的配列と共に安定ハイブリッドを形成する。プローブが標的配列と基本的に完全に相補的である（すなわち約９９％以上）と考えられる場合、ストリンジェントな条件が用いられる。若干の不適当な組み合わせが予想される場合、例えばプローブが変異株と完全に相補的でないことが予想される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは減少すると考えられる。しかしながら、非特異／偶然の結合を排除する条件を選択する。ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす、そして、非特異的結合に対して選択する条件は、従来技術において、周知で、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びラッセル（２００１）に記載されている。通常、低い塩濃度及びより高い温度は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増加させる。
【００７６】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ポリヌクレオチドが、通常は核酸の複雑な混合物中でその標的とハイブリダイズするが、実質的に他の配列とはハイブリダイズしない条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、また反応状況によっても異なる。長い配列は、高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細にわたるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）を参照のこと。通常、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度ｐＨにおいて、特定の配列の場合の熱融点（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍ値とは、所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度条件において、標的と相補的なプローブの５０％が平衡状態において、標的配列とハイブリダイズする温度のことを指す（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍ値では、プローブの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ以下のナトリウムイオン濃度であり、通常はｐＨ７．０〜８．３において、０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（又は他の塩）濃度であり、温度が短いプローブ（例えば１０〜５０のヌクレオチド）では３０℃以上、長いプローブ（例えば５０超のヌクレオチド長）では約６０℃以上である。ストリンジェントな条件は、不安定化剤（例えばホルムアミド）の添加によって、設定してもよい。選択的若しくは特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドに対して少なくとも２倍（好ましくは１０倍）のハイブリダイゼーションである。条件がしばしばそうである典型的な厳しいハイブリダイゼーション：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベート、又は、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、６５℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳで洗浄、である。ＰＣＲでは、アニーリング温度はプライマー長に応じて３２℃〜４８℃で変化しうるが、約３６℃の温度が、低いストリンジェンシーによる増幅において、典型的である。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するための更なるガイドラインは、多数の参考文献（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９）において、開示されている。
【００７７】
好ましい実施態様の説明二重耐性植物の生産農業及び園芸の繁殖プログラムの目的は、それらの遺伝組成を改良することによって、植物の性能を強化することである。本質的には、この改良は、目的の性能特性に影響している遺伝子に対して最も好ましい対立遺伝子の頻度を増加させることによって、なされる。野生の植物株を用い、遺伝子及び表現型バリエーションの豊富な資源とする。伝統的に、農業若しくは園芸分野においては、このような変種を用いて、所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を有する野生植物系列又はその子孫を選択し、別の所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を有する系列と交配し、所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を示す（その頻度が増加した）植物を子孫植物から選択することを行う。メンデルの遺伝の法則の更なる理解及び利用（並びに分子遺伝学的ツールとの組み合わせ）によりこのような選抜プロセスが可能となった。例えば、所望の遺伝子型の又はポテンシャル表現型特性を有する植物を選択する方法は、前記植物を量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の存在（すなわち連続的に分散（定量的に）した表現型特徴の発現と関連する対立遺伝子を含有する染色体領域の存在）の検出に基づいて行われる。通常、ＱＴＬは、表現型特徴における定量的変化に統計学的に結びつく１つ以上のマーカーによって、特徴づけられて、遺伝子と基本的に同義である。ＱＴＬマッピングは、目的の特徴の発現に影響を及ぼしている候補遺伝子座の同定を可能にする。植物繁殖においては、 マーカーによる選抜（ＭＡＳ）が可能であり、すなわち植物中でＱＴＬ関連のマーカーを検出することによって、好ましい対立遺伝子を有する植物を選抜する。
【００７８】
栽培植物の繁殖プログラムの大きな問題の１つは、別々の特徴間の負の遺伝相関の存在である。これは、例えばさまざまな疾患耐性植物系列の複製能及び産生間の負の遺伝相関を有するケースである。もう一方への１つの植物系列のゲノムからのＤＮＡの遺伝子移入が基本的な繁殖形質の発現に妨げてもよいか又は影響を及ぼしうることが理解される。同様に、もう一方への１つの植物からの移入耐性を与えている遺伝子配列の試みにより、すでに宿主株に存在するに耐性特性が除去されうる。
【００７９】
さまざまな特徴の遺伝についての知識により、例えば病害抵抗性と関連するＱＴＬのためにホモ接合性株の選抜が可能となる。遺伝子の起源及び繁殖プログラムの所望の特徴の位置についての知識の中で使用法予測された繁殖している結果の精度を増加させ、従来の繁殖プログラムと比較し選抜速度が増加する。例えば、実際、所望の特徴が遺伝子的ベース（他の特徴に遺伝的にリンクされる）を有するとき、子孫中におけるそれらの２つの特徴の均一性の増加に役立つ。なぜなら、所望の対立遺伝子に関するホモ接合の親が、大部分の子孫に対して、分離の少ない状態でそれらを子孫に渡すからである。
【００８０】
上記したように、本発明の発明者は、クロステロウイルス及びウドンコ病に耐性のある植物を見出した。かかる植物はこれまで公知ではなかった。すでにウドンコ病耐性植物系列へのクロステロウイルス耐性系列からのＤＮＡ移入（又はその逆）の試みはこれまで成功しなかった。
【００８１】
本発明の発明者は、更に、二重耐性植物で、単一ユニットにつれて実質的に共遺伝するほど密接に、クロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性のための遺伝子が結合されるということを発見した。遺伝子（非常に密接に、連結される）間のかかる遺伝子の構成は、しばしば、カップリング期（シス）にある対立遺伝子（遺伝子）とも呼ばれる。そのような場合、遺伝子が単一染色体にあることが通常認められる。事実、単一染色体上に遺伝子又はＱＴＬｓが存在するとき、それらがカップリング期にあることが意味される。
【００８２】
本発明の発明者は、二重耐性植物では、クロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性遺伝子が連鎖群４に存在することを発見した。Ｈｏｒｅｊｓｉらによれば（２０００）キュウリＬの連鎖群４はまた、べと病（ｄｍ．）耐性遺伝子を有する。ＬＧ ４は更に、以下のＲＦＬＰマーカーのうちの１つ又は組合せ、（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ ＩＮＴＭＡＰ，Ｋｅｙｇｅｎｅ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって、決定、マップ位置はｃＭ、ブラケット）：ＣｓＣ０３２ａ／Ｅｌ（２５．９）ＣｓＰ３５７／Ｈ３（３１．７）ＣｓＣ５８８／Ｈ３（３４．２）ＣｓＣ４７７Ｈ３（３５．３）ＣｓＣ６９４／Ｅ５（３８．５）ＣｓＰ３４７／Ｈ３（３８．５）ＣｓＣ３６５／Ｅｌ（４１）ＣｓＣ３８６／Ｅｌ（４１）ＣｓＣ２３０／Ｅｌ（４１．７）ＣｓＰ０６４／Ｅｌ（４５．５）により特徴付けられる。
【００８３】
明確な染色体番号は、キュウリクロステロウイルス耐性ＱＴＬ１、並びにウドンコ病耐性に関与するｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈが位置する染色体には割り当てられていない。しかしながら、当該染色体はこれら及び他のゲノム領域が位置する連鎖群（ＬＧ４）を参照することにより示されてもよい。用語連鎖群とは、耐性を与えている対立遺伝子が位置し、染色体と同じ階層的なレベルを有する物理的ゲノム単位を指すものとして本願明細書で用いる。
【００８４】
クロステロウイルス＋ｐｍ耐性のための遺伝子が単一染色体に存在することを発見した利点として、２つ挙げられる。
【００８５】
第１に、単一染色体上（好ましくは、小さい隣接する染色体部分）に遺伝子が存在するため、繁殖目的において、非常に有利であり、それらが共同で子孫植物に移入されるということである。ウドンコ病耐性及びクロステロウイルス耐性に関連する遺伝子との物理的な結合の結果として、交配による子孫植物（本発明の二重耐性植物を親株として用いた）では子孫植物における分離の頻度が低くなる。
【００８６】
第２に、この知識は、２つの特徴を単一の植物系列内において、組み合わせるのが非常に困難である理由を説明するため、植物育種の助けとなる。いかなる理論にも束縛されないが、クロステロウイルス耐性に関与するＱＴＬの特定の位置、及びそのＱＴＬの選抜により、望ましい遺伝子移入の形成が妨げられたか、望ましい遺伝子移入の可能性が極めて低い確率に抑えられていた。ウドンコ病耐性及びクロステロウイルス耐性のためのＱＴＬを伴うＱＴＬｓは近い位置に存在し、すでに第１の耐性（例えばウドンコ病）を有している植物系列への、第２の耐性特徴（例えばクロステロウイルス耐性）ＱＴＬの遺伝子移入により、第１の耐性特徴の（一部分の）損失が生じることが考えられる。植物系列がウドンコ病耐性（ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ）のための両方のＱＴＬｓを有する場合、ウドンコ病耐性の基礎をなしている遺伝情報に「損傷を与え」ず、クロステロウイルス耐性のためのＱＴＬの遺伝子移入が、ゲノムの非常に小さい部分において、のみ行われる。
【００８７】
ゆえに、さまざまな抵抗性遺伝子が単一染色体に位置することを発見したこととは別に、両方のウドンコ病耐性対立遺伝子が二重耐性植物に存在するときに、クロステロウイルス耐性に関連するＱＴＬ（ＱＴＬ−１）は、ＰＭ耐性（ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌ）を伴う２つのＱＴＬｓの間に存在することを見出した。この発見は、所望の遺伝子型を有する植物への組換え頻度が低いことを更に部分的に説明するものとも考えられる。また、かかる植物を作製するための、少なくとも３つの可能なシナリオが考えられ、それらを作製するいくつかの再現性のある方法が考案させる。
【００８８】
第１の方法は、目的の第１の系列の植物に由来するクロステロウイルス耐性遺伝子座（本明細書でＱＴＬ−１として定義）を、２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌを有する、目的の第２の系列のウドンコ病耐性植物に移入することを含んでなる。これが目的の第２の系列の遺伝的バックグラウンドに結果としてなることである場合、当該方法は、ＱＴＬ−１を、２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌの間のゲノム領域に遺伝子移入することを含んでなり、それにより、目的の第２の系列の遺伝的バックグラウンドを有する子孫植物中で、ｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈの構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとなる（図１を参照）。これに基づくと、単一染色体の特定の領域における二重の相同組換（すなわち各交差における１度の現象）のみにより、目的の第２の系列の遺伝的バックグラウンドにおいて、クロステロウイルス及びＰＭ耐性の二重耐性の表現型が得られる子孫植物の適当な遺伝子移入を、ＱＴＬ−１、ｐｍ−１及びｐｍ−ｈ特異的なマーカーを用いてモニターしてもよい。
【００８９】
第２の方法では、異なる遺伝的バックグラウンド（すなわち第１の目的の株）において、耐性特徴を組み合わせることを望むかもしれないかかる方法は、目的の第２の系列の植物に由来するＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌを、ＱＴＬ−１場所を有するための第１の系列に係るクロステロウイルス耐性植物に移入することを含むと考えられる。この場合、当該方法は、ｐｍ−ｈ及びｐｍ−ｌ遺伝子座を独立にＱＴＬ−１場所の両側に遺伝子移入することを含んでなり、それにより、目的の第１の系列の遺伝的バックグラウンドを有する子孫植物において、ｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈの構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとなる。（図２を参照）。この構成に基づくと、単一染色体の特定の領域において、少なくとも２つの二重相同組換（すなわち４回の交差）が、クロステロウイルス及びＰＭ耐性の二重耐性表現型の獲得に必要であることが考えられる。また、子孫植物の適当な遺伝子移入を、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ特異的なマーカーを用いてモニターしてもよい。
【００９０】
上記より、例えば野生型のＣＹＳＤＶ耐性の、例えば ＰＭ耐性の市販のキュウリへの遺伝子移入が非常に稀な現象であることが説明されると考えられる。同様に、例えばクロステロウイルス耐性の市販のキュウリへの、例えば野生型の両方のＰＭ耐性遺伝子座の遺伝子移入が更に稀な現象である理由も説明ができる。
【００９１】
組換えは、減数分裂の間の２つの相同染色体の間での情報の交換である。組換え植物において、最初は染色体の範囲内で特異的な位置に存在するＤＮＡは、他の植物に由来するＤＮＡと組み換えられる（父性から母性、あるいはその逆）。二重組換えでは、この組み換え反応は二度、例えば遺伝子／遺伝子座の両側において、行われる。必要な材料だけを組み換え、可能な限り染色体上の有益な第一の情報を維持するために、通常４度の交差現象（上記参照）が必要となる。かかる二重組換えを見つける通常の方法は、Ｆ２−植物の集団をスクリーニングすることである。この集団は、まれな（低頻度）二重組換えを検出するために充分なサイズでなければならない。二重組換えの頻度は、一重組換えの頻度に左右される。例えば、１０ｃＭ領域の組換えは１０％の頻度であった場合、二重組換えは、１０％×１０％＝１％（１センチモルガンは、検定交雑の１％の組換え子孫として定義される）の頻度となる。
【００９２】
低頻度のこの問題を迂回するための１つの方法は、「平行（パラレル）組換え」の実施である。これは基本的に、２つの組換えが別個に２つの異なる植物において、生じさせ、その後で、組換えを、得られるＦ２において、単純な交雑及び選抜を行うことによって、１つの植物で組み合わせることを意味する。これにより、スクリーニングする植物数が減少する。
【００９３】
ゆえに、二重耐性植物を作製する第３の方法は、目的の第１の系列に由来する２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ又はｐｍ−ｌのうちの１つを、ＱＴＬ−１遺伝子座を有するための第２の系列のクロステロウイルス耐性植物に移入して、ｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１又はＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈの構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとすることと、目的の第３の系列に由来する２つのＰＭ−耐性付与遺伝子座ｐｍ−ｈ又はｐｍ−ｌのうちの他方を、ＱＴＬ−１遺伝子座を有するための第２の系列の他のクロステロウイルス耐性のある植物に移入して、ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈ又はｐｍ−ｌ−ＱＴＬ−１の構成を有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリとすることを含んでなる（図３を参照）。その後、個々の組換えから遺伝子移入を含んでいる子孫植物は、構成ｐｍ−ｌを有するゲノムＤＮＡ配列アセンブリに結果としてなるために交差する−ＱＴＬ−１−ｐｍ−ｈ（図３を参照）。また、さまざまな子孫植物への適当な遺伝子移入は、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈに特異的なマーカーを用いて、更に交雑された植物をモニターしてもよい。当業者であれば、図４−６を基にして他の方法を考案してもよい。
【００９４】
スクリーニングに用いる植物数を制限する方法は、例えば以下の通りに実施してもよい：最初に、両方のＰＭ−耐性対立遺伝子（ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ）を有する個体と、ＱＴＬ耐性対立遺伝子ＱＴＬ−１を有する個体の２個体を交配する。次に、ｐｍ対立遺伝子の１つとＱＴＬ−１との間の１つの交差を有する、以下のような植物を選抜する：２ｐｍ対立遺伝子の２つのエンドポイント間の遺伝的距離が１０ｃＭであり、ＱＴＬｌが中央（ＱＴＬｌと、ｐｍ−ｌ又はｐｍ−ｈのいずれが１つの間が５ｃＭ）に位置する場合に、ＱＴＬｌといずれかのｐｍ−遺伝子座との間のかかる組換えが５％の頻度で生じる。それにより、最初に交配により得た２００の子孫植物をスクリーニングする（１０が組換えＡ型及び１０の組換えＢ型である）。次に、このようにして同定された組換え体を自家交配し、１０の植物をスクリーニングし、ＱＴＬ−１及びｐｍ−に隣接するマーカーを用いてホモ接合体の子孫を解析する。ホモ接合体Ａ×Ｂ（１０Ａと１０Ｂを交配）との間で１０の交配を行い、得られるＦ２に関して１０の植物をスクリーニングして１つの二重組換えを選抜する。最終的に、１０の二重組換え体を得る。スクリーニングした植物数は全部で５００であったが、従来の方法では合計４０００の植物のスクリーニングが、１０の独立した二重組換え体を得るのに必要であった（ＱＴＬ−１及びいずれのｐｍ−遺伝子座間も５ｃＭの距離、０．０５×０．０５＝０．２５％の二重組換え頻度を有する結果となることが必要であった）。
【００９５】
本発明は、マーカーにより補助される選抜方法（ＭＡＳ）のより良好なモデルの提供に関する。ゆえに本発明は、植物の育種方法、植物（特にキュウリ）の選抜方法の提供に関する。特に繁殖プログラムに用いられる育種植物としての栽培用キュウリ、又は所望の遺伝子型又は潜在的表現型を有する栽培用キュウリの選抜方法の提供に関する。特に、商業的に有用な植物として本願明細書に記載した、有益なウリ科の果物の作製に際に応用できる。本願明細書における栽培用植物とは、故意に選抜されたか、又は所望の遺伝子型又は潜在的な表現型有するとして、農業若しくは園芸生産において故意に選抜された植物に由来する植物（特に同系交配によって得られた植物）として定義される。
【００９６】
本発明の二重耐性植物は例えば、遺伝子型ＡＡＢＢｃｃ、ＡＡＢｂｃｃ、ＡａＢＢｃｃ又はＡａＢｂｃｃを有してもよい。「Ａ」とは優性のｐｍ−ｌ遺伝子座に基づく耐性遺伝子型であり、「ａ」はそれに対応する非抵抗性の対立遺伝子であり、「Ｂ」は優性のＱＴＬ−１遺伝子座に基づく耐性遺伝子型であり、「ｂ」はその対応する感受性の対立遺伝子であり、「ｃ」は劣性のｐｍ−ｈ遺伝子座に基づく耐性遺伝子型である。したがって、本発明の二重耐性植物には、ハイブリッド植物並びにホモ接合植物の両方が包含される。これらの遺伝子型は、以下の交配（親生殖体の遺伝子型）を行うことによって得られる：ＡＢｃ×ＡＢｃ、ＡＢｃ×Ａｂｃ、ＡＢｃ×ａＢｃ、ＡＢｃ×ａｂｃ及びＡｂｃ×ａＢｃ。したがって、生殖体ａｂｃを作出する植物（ｐｍ−ｈを除き、耐性を有さない植物）であっても、本発明の二重耐性（ハイブリッド）植物の作製に使用できることが分かる。特に好ましい実施態様では、本発明の二重耐性植物は、近交系植物（耐性対立遺伝子がホモ接合）である。
【００９７】
ｐｍ−ｈ遺伝子は劣性遺伝子であるため、バイオアッセイを用いてＦ１又はＢＣ１においてはモニターできない（すなわち感受性の親を用いてＦ１／ＢＣ１を作製した場合（繁殖の際に一般的））。したがって、本願明細書記載のように、子孫植物への適当な遺伝子移入が、ＱＴＬ特異的なマーカーを用いてモニターできるというのが、本発明の顕著な効果である。ＭＡＳ又はＭＡＢ方法を用いることにより、当業者は植物の選抜方法の提供をうけることになる。
【００９８】
ゆえに本発明はまた、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性を示すキュウリの選抜方法の提供に関し、当該方法は、前記植物において、本明細書で定義されるＱＴＬ−１の単一染色体上の存在、及び、本明細書で定義されるＱＴＬｓであるｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈの少なくとも１つを検出することを含んでなる。かかる植物を選択するための本発明の好ましい方法は、ａ）キュウリからゲノムＤＮＡのサンプルを調製するステップと、ｂ）前記ゲノムＤＮＡのサンプルにおいて、ＱＴＬに連結する、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈからなる群から選択される少なくとも１つの分子マーカーを検出する（好ましくは前記群から少なくとも２つの分子マーカーを検出するステップであって、１つのマーカーがクロステロウイルス耐性を検出し、他のマーカーがウドンコ病耐性を検出するステップを含んでなる。
【００９９】
キュウリからゲノムＤＮＡのサンプルを調製する処理は、公知の標準的なＤＮＡ単離方法により実施してもよい。
【０１００】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、好ましい実施形態では、ＡＦＬＰ方法で用いられる双方向性プライマーセットを使用して、以下で適切なＱＴＬのマーカーであると判明した増幅生成物を産生させることを含んでなる。かかるプライマーセットは、ＡＦＬＰマーカーを定めるプライマー、又はマーカー特異的なプライマーとして本願明細書に記載する。双方向性とは、核酸の増幅反応において、１つが順方向プライマーとして機能し、もう１つが逆方向プライマーとして機能することを意味する。
【０１０１】
あるいは、分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、他の好ましい実施形態では、前記分子マーカーを定義する核酸配列と実質的に相補的な塩基配列を有する核酸プローブの使用を含んでなり、当該核酸プローブは、前記分子マーカーを定義する塩基配列と、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。適切な核酸プローブは例えばマーカーに対応する増幅生成物の一本鎖でもよい。
【０１０２】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、前記ゲノムＤＮＡ上の核酸増幅反応を行わせて１つ以上のＱＴＬｓを検出するステップを含んでもよい。それは一組のマーカー特異的なプライマーを使用してＰＣＲ反応を実施することにより可能となる好ましい実施形態では、前記ステップｂ）は、前記ＱＴＬのＡＦＬＰマーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記ＱＴＬのＡＦＬＰマーカーの核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーセットの使用を含んでなる。
【０１０３】
処理ｄ）の、予測された長さ又は予測された核酸配列を有するＤＮＡフラグメントを検出する処理は好ましくは、増幅されたＤＮＡフラグメントが、最初にマーカーが検出された植物由来のＤＮＡと同じプライマーを用いた同様の反応に基づいて増幅した場合の結果を基にした、予想される長さ（数塩基（例えば１、２又は３の塩基）長の増減があってもよい）に対応する長さを有する態様で実施するか、又は、前記増幅されたＤＮＡフラグメントが、最初に前記マーカーが検出された植物中のＱＴＬに関連したマーカーの配列に基づいて予想される配列に一致する核酸配列（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％超、更に好ましくは９９％を超の相同性を有しても良い）を有する態様で実施する。当業者に自明のように、感受性の親には存在するが耐性植物には存在しないマーカー（いわゆるトランスマーカー）はまた、子孫植物中の耐性を検出するアッセイにおいて有用であると考えられるが、但しマーカーの欠如を試験して特異的な特徴の存在を検出する場合には最適でない。
【０１０４】
予測された長さを又は予測された核酸配列を有する増幅されたＤＮＡフラグメントを検出するステップは、標準的なゲル電気泳動、又は自動ＤＮＡ解析装置を用いて実施してもよい。当該方法は無論、当業者にとり周知である。
【０１０５】
植物において単一染色体上に２つのＱＴＬｓの存在を検出する際、染色体ペインティング法を用いてもよい。かかる方法では、少なくとも第１のＱＴＬ及び少なくとも第２のＱＴＬを、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法又はｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲ法で、同じ染色体上で検出してもよい。かかる技術を用いて、ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈの位置とのＱＴＬ−１の前記染色体上の相対的位置を確認してもよく、またその方法は公知技術である（例えばｖｉｄｅ Ｊｉａｎｇら、１９９５を参照）。より簡便には、２つのＱＴＬｓが単一染色体に存在するという事実を、それらがカップリング期にあることに基づいて確認してもよい（すなわち、別々の染色体に個々の遺伝子が存在する場合と比較して分離が減少している）。
【０１０６】
分子マーカー及びＱＴＬｓ：
分子マーカーを用いて、核酸配列の相違を視覚化してもよい。この視覚化は、制限酵素（ＲＦＬＰ）による切断後のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応を使用する方法（例えばＳＴＳ、マイクロサテライト、ＡＦＬＰ）において可能である。２つの親の遺伝子型の全ての違いは、これらの親の遺伝子型の交配に基づくマッピング集団（例えばＢＣ１、Ｆ２、図２を参照）において分離している。異なるマーカーの分離を比較し、組換え頻度を算出してもよい。通常、異なる染色体上の分子マーカーの組換え頻度は５０％である。同じ染色体に存在する分子マーカー間の組換え頻度は、マーカー間の距離に依存する。低い組換え頻度は、染色体上におけるマーカー間の低い遺伝的距離に対応する。全ての組換え頻度を比較することにより、染色体上の分子マーカーで最も論理的なオーダーが得られる。この最も論理的なオーダーは、連鎖地図（パターソン、１９９６）で表すことができる。耐病性の強化（例えば病原体による感染後の疾患を得ることの低下する発生率、及び／又は病原体との接触後の病変成長率の低下）と関連する連鎖地図上の隣接するマーカー群は、その疾患耐性に関連するＱＴＬの位置をピンポイントで示すものである。
【０１０７】
本願明細書で同定されるマーカーを用いてもよく、様々な本発明の態様として本願明細書に示される。本発明の態様は、本願明細書で同定されるマーカーの使用に限定されるものではない。上記の態様は、本願明細書に開示されているマーカーの使用のみに限定されず、むしろ未同定のものも同様に含まれる。遺伝学的単位には、「遺伝子」（形質発現が予測できない多数の因子に依存する）以外にも遺伝学的単位「ＱＴＬ」が存在し、それは定量可能な表現型に直接関与するゲノム領域のことを指す。したがって、遺伝子は植物育種にはほとんど関係しないが、ＱＴＬは植物育種に直接適用できるものである。本発明の発明者は、本明細書で定義されるキュウリのクロステロウイルス耐性及びウドンコ病耐性に関与するＱＴＬｓが、子孫植物のゲノムにおいて、各々特異的な構成を有しなければならないということを発見した。本発明者は、キュウリのゲノムの単一染色体上の、異なるＱＴＬｓに帰属する隣接するゲノムマーカーの一連の存在が、両方の耐性の存在と相関し、それにより、このゲノム構成が通常のメンデル式の遺伝形式で遺伝しうるという観察結果を基礎として、かかる新たな知見を得た。
【０１０８】
本発明で同定されたＱＴＬｓは、単一の染色体又は連鎖群上に位置し、それらの位置はそれ以外の多くの任意のマーカーによって十分に特徴づけられる。本明細書における試験では、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）及び挿入変異マーカーを用いたが、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）マーカー、マイクロサテライトマーカー（例えばＳＳＲｓ）、配列依存的増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカー、切断増幅多形配列（ＧＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー、又はこれらのマーカーの組合せを用いてもよい。一般に、ＱＴＬは数百万塩基の領域にわたることもある。したがって、ＱＴＬの完全な配列情報を得ることは実際には不可能であり、また不必要でもある。むしろ、（一連の隣接するゲノムマーカーの存在と、特異的な表現型の存在との間の観察された相関によって）ＱＴＬを最初に検出する方法により、子孫植物の集団の中から、特異的な表現型特徴を示すポテンシャル遺伝子を有する植物を発見することが可能となる。したがって本発明において、非限定的なマーカーのリストを提供することにより、繁殖プログラムにおけるＱＴＬｓの有用性が提供される。
【０１０９】
マーカーは、ある特定の系列に対して特異的である。したがって、特異的な特徴は特異的なマーカーと関係している。本出願に示すマーカーはＱＴＬの位置を示すだけでなく、それらはまた植物の特異的な表現型の存在との相関関係も示す。ゲノム上のＱＴＬの位置を示す隣接ゲノムマーカーは専ら恣意的なものであり、非限定的であることに留意すべきである。一般に、ＱＴＬの位置は、一連の隣接するマーカーとして示され、それは表現型に対する統計学的な相関関係を示すものである。その一連の外でマーカーが見出されたとき（すなわち特異的な閾値以下のＬＯＤ−スコアを示し、当該マーカーが隔離され、その領域における当該マーカーとＱＴＬ間の組換えが頻繁に発生し、マーカーの存在が統計学的に有意に表現型の存在と相関しないとき）、ＱＴＬの境界がそこで設定される。したがって、その特定された領域に位置する他のマーカーを用いてＱＴＬの位置を示すことも可能である。
【０１１０】
隣接するゲノムマーカーを用いて、個々の植物におけるＱＴＬ（すなわち表現型）の存在を示すことができる点は更に重要であり、すなわちマーカーアシスト選抜（ＭＡＳ）方法に使用できる。原則として、多くの潜在的に有用なマーカーは限定されるが、多くのマーカーを用いてもよく、当業者であれば、本願明細書に記載のマーカー以外の他のマーカーを容易に同定することができる。ＱＴＬに連結したあらゆるマーカー（例えば、当該ゲノム領域の物理的に境界内に、ある一定の閾値を上回るＬＯＤスコアを示すマーカーが分布し、それにより交配の際、マーカーとＱＴＬとの間で全く組換えが起こらないか、若しくはごくわずかな組換えしか起こらない）、並びにＱＴＬに対して連鎖不平衡にあるいかなるマーカー、並びにＱＴＬ中で実際に突然変異を表すマーカーを、ＭＡＳ方法に用いてもよい。このことは、本発明においてＱＴＬｓに関連するマーカーとして同定されたもの（例えばＱＴＬ−１に対するＡＦＬＰマーカーのＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１）が、ＭＡＳ方法の使用に適しているマーカーの単なる一例に過ぎないことを示すものである。更に、ＱＴＬ（又は特異的な特徴を付与するその一部）が他の遺伝的バックグラウンド（すなわち他の植物のゲノム）に移入されると、若干のマーカーは、その特徴が表れるにもかかわらず、子孫内では存在しなくなることがある。すなわち、かかるマーカーは、ゲノム領域の外側に存在し、それはオリジナルの親系列においてのみＱＴＬの特異的な特性を付与する部分であること、並びに、新規な遺伝的バックグラウンドは異なるゲノム構成を有することを示すものである。そのマーカーの不在が子孫への遺伝因子の良好な導入を示すかかるマーカーは「トランスマーカー」と称され、本発明におけるＭＡＳ法における使用も同様に好適である。
【０１１１】
ＱＴＬの同定後、ＱＴＬの効果（耐性）を、例えば試験対象のＱＴＬｓを分離させているＢＣ２Ｓ１世代の耐性を評価することによって確認してもよい。耐性の評価は、周知のようにキュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病耐性をバイオアッセイするのが最適である。例えば、単離ＣＹＳＤＶ（ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ及びＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）のコレクションｎｏ．ＰＶ−０５９２／ＥＷＳＮ＿６として保管）を使用してもよく、実験的な感染は、例えばＢｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ（Ｂバイオタイプ）による伝達により行ってもよい。また、自然感染条件下でのフィールド試験を行い、ＣＹＳＤＶ又は他のクロステロウイルス耐性を評価してもよい。植物材料の人工接種によりウドンコ病耐性を評価してもよい。本発明に係るマーカーを最適に用いて、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリにおける、本発明の１つ以上のＱＴＬｓの存在を検出してもよく、またそれを用いて、マーカーアシスト選抜、並びにウドンコ病及びクロステロウイルス耐性キュウリの育種を実施してもよい。好ましくは、本発明のＱＴＬの存在の検出は、本明細書で定義される少なくとも１つのＱＴＬのマーカーを用いて実施される。ゆえに本発明の別の態様は、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬの存在の検出方法の提供に関する。当該方法は、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性であると考えられるキュウリにおいて、前記ＱＴＬの核酸配列の存在を検出することを含んでなり、上述のマーカーを用いてその存在を検出することを特徴とする。
【０１１２】
本発明のＱＴＬの核酸配列は、例えば前記ＱＴＬと関連する１つ以上のマーカーの核酸配列を決定し、前記マーカー配列の内部プライマーを設計し、更にそれを用いて前記マーカー配列の外のＱＴＬの配列を決定して解析してもよい。例えば、表２、３及び４のＡＦＬＰマーカーの核酸配列は、対象となる植物のゲノム中の前記マーカーの存在の決定において使用する泳動ゲルから前記マーカーを単離し、例えば公知の方法であるジデオキシ末端停止法により、前記マーカーの核酸配列を決定してもよい。
【０１１３】
ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリのＱＴＬの存在を検出するかかる方法の実施形態では、当該方法は、前記ＱＴＬ（好ましくは表２、３及び４のマーカーから選択）に連結したマーカーの核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを提供するステップと、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリのゲノム核酸の断片と、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとを接触させるステップと、前記ゲノム核酸断片に対する、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションの存在を測定するステップを含んでなる。
【０１１４】
好ましくは前記方法は前記ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリから得られる核酸サンプルに対して実施するが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いてもよい。あるいは、より好ましい実施形態ではあるが、当業者であれば、ＱＴＬの核酸配列が決定された後、前記ＱＴＬの核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできる特異的なハイブリッド形成用のプローブ若しくはオリゴヌクレオチドを設計し、かかるハイブリダイゼーションプローブを用いて、ウドンコ病及び／又はクロステロウイルス耐性を有すると思われるキュウリにおいて、本発明のＱＴＬの存在を検出することができる。
【０１１５】
主要なクロステロウイルス抵抗性遺伝子の位置を示すマーカーは、親株から生じた耐性個体及び高感受性個体からのキュウリＤＮＡ断片の選択的増幅によって得てもよい。当該方法は、−前記断片を制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ及びＭｓｅｌ）で処理し、更にライゲーションさせ、当該断片の端にプライマーに対応する補助アダプター（それらの端に１つ以上の特異的なヌクレオチドを有する）を連結させるステップであって、プライマー対のうちの１つのプライマーが検出目的で標識されているステップと、−変性条件下でゲル電気泳動を行い、増幅生成物を分離させるステップと、−抵抗性の子孫に由来する断片の混合物、及び感受性の子孫に由来する断片の混合物と、親株に由来する断片とを、それらの電気泳動プロファイルを比較することによって、抵抗性の遺伝子座と遺伝的に連結している多形バンドを同定するステップを含んでなる。前記同定の後、全ての個体に関して確証試験を行い、更にマーカーと耐性遺伝子座との間の遺伝子組換え率を算出する。
【０１１６】
原則として、本明細書で用いられる個々のＡＰＬＰマーカーは指定されたマーカーコードを有する。このコードは２つのプライマーを定義し、任意に、定義済みのアクセッションＮｏ．（上記表１の説明を参照）のプライマーの増幅生成物の長さを示す図との組み合わせにより説明する。すなわちＡＦＬＰマーカーを用いることにより、キュウリゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を実施し、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡフラグメントを得、示されたアクセッションＮｏ．の場合、示された長さの断片が得られる。更に当該マーカーは、５’−３’方向において、第１のプライマー配列、キュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列、及び第２のプライマー配列からなる配列、更にはその補足配列を含んでなる。したがって、キュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列には２つのプライマーが隣接している。用語「キュウリ特異的なＤＮＡ塩基配列」は、それぞれのプライマーが隣接する領域の核酸配列を意味し、国際公開第０２／２２８３６号にて説明したように、特定のプライマーを使用してキュウリ目録Ｋｈｉｒａ ＰＩ２５０１４７から増幅される配列、又はそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列相同性を有する配列を表す。
【０１１７】
トランスジェニック技術によるウドンコ病及びクロステロウイルス耐性キュウリの育種：
本発明の別の態様では、少なくともＱＴＬ−１を含んでなる核酸（好ましくはＤＮＡ）配列、並びにｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ又はその耐性付与部分のうちの１つ（好ましくは両方）を、本発明の二重耐性キュウリの育種に用いてもよい。本発明のこの態様では、本明細書で定義されるＱＴＬｓ又はその耐性付与部分の使用により、二重耐性キュウリを作製し、当該使用においては、適切な宿主植物への前記ＱＴＬを含む核酸配列の導入を含んでなる。前述のように、前記核酸配列は、適切なクロステロウイルス及び／又はウドンコ病耐性ドナー植物に由来してもよい。ＱＴＬ−１として本願明細書に同定されるクロステロウイルス耐性遺伝子座の適切な供給源として、キュウリランドレース Ｋｈｉｒａ（ＰＩ２５０１４７）（パキスタン産）が挙げられる。それらの商業的な供給源、並びにその他の多くのＰＭ耐性キュウリ園芸品種は、例えばｈｔｔｐ：／／ｃｕｋｅ．ｈｏｒｔ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ｃｕｃｕｒｂｉｔ／ｃｕｋｅ／ｃｕｋｅｍａｉｎ．ｈｔｍｌ．に列挙されている。ＰＭ耐性植物は、例えばＴ．Ｃ．Ｗｅｈｎｅｒ，ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｅｎｅ ｃｕｒａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｃｕｒｂｉｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ（ＣＧＣ），Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅａｌｅｉｇｈ，ＮＣ２７６９５−７６０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．から得られてもよい。本願明細書に記載する両方のｐｍ遺伝子座の供給源としては、ＮＰＩ（ＰＩ ２００８１５を有する交雑Ｎａｔｓｕｆｕｓｈｉｎａｒｉ（ＰＩ ２７９４６５）から調製）が挙げられる。それらは例えば、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（ＣＧＮ），Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得てもよい。ＥＣＰ／ＧＲ Ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｈｏｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｇｒｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＣＯＭＡＶ） ｉｎ Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ、又はＧｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＧＲＩＮ） ｈｏｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＵＳＤＡ’ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄなどの幾つかの植物データベースを用いて、登録株の検索を行ってもよい。本発明によるこれらの材料の同定方法において記載したように、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性を示す他のキュウリを耐性ドナー植物として利用してもよい。
【０１１８】
適切なドナー植物を同定した後、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性を付与するＱＴＬを含む核酸配列、又はその耐性付与部分を、利用可能ないかなる方法によって適切な宿主植物へ導入してもよい。例えば、上述の核酸配列は、感受性の宿主植物と、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性ドナー植物を交配すること（すなわち遺伝子移入）、形質転換、プロトプラスト融合、二重ハプロイド技術、又は胚レスキュー若しくは他のいかなる核酸伝達システムによって行ってもよく、任意に、ＱＴＬを含む耐性型の子孫植物の選抜をその後行ってもよい。クロステロウイルス又はウドンコ病耐性（又はその耐性付与部分）のためのＱＴＬを含んでなる核酸配列を導入するトランスジェニック技術では、当該核酸を公知の方法を用いて前記ドナー植物から単離し、その単離された核酸をトランスジェニック技術を用いて宿主植物に導入する。当該導入方法としては、例えばベクター、生殖体、又は他の適切な媒体（例えば前記核酸配列でコーティングした粒子）の導入が挙げられる。
【０１１９】
植物の形質転換は一般に、植物細胞において機能する発現ベクターの構築を必要とする。本発明において、かかるベクターはクロステロウイルス又はウドンコ病耐性のためのＱＴＬ（又はその耐性付与部分）を含む核酸配列を含んでなり、当該ベクターにおいて、クロステロウイルス又はウドンコ病−耐性を与えている遺伝子は、調節エレメント（例えばプロモータ）と連結しているか、又は制御下にある。当該組合せに含まれる遺伝子の少なくとも１つがクロステロウイルス又はウドンコ病−耐性をコードする場合、当該発現ベクターは１つ以上のかかる制御可能に連結された遺伝子／制御エレメントの組合せを含んでもよい。当該ベクターはプラスミドの形でもよく、単独で使用してもよく、又は他のプラスミドとの組合せで使用してもよく、それらを用いて、公知技術の形質転換法（例えばアグロバクテリウム形質転換系）を用いて、クロステロウイルス耐性及びウドンコ病遺伝子を導入した植物を得る。
【０１２０】
発現ベクターは、使用可能な状態で調節エレメント（例えばプロモータ）と連結された少なくとも１つのマーカー遺伝子を含んでもよく、それにより、マーカーを含む形質転換細胞を、ネガティブ選抜（選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞生長を阻害）によって、又は、ポジティブ選抜（マーカー遺伝子によってコードされる生成物のスクリーニング）により回収することができる。植物の形質転換に一般的に用いられる選択可能な多くのマーカー遺伝子が従来技術において周知であり、例えば、選抜用の化学物質の毒性を代謝的に除去する酵素をコードする遺伝子（抗生物質又は除草剤）、又は阻害剤に対する感受性を喪失する形に変換された標的をコードする遺伝子などが挙げられる。マンノース選抜のようないくつかのポジティブ選抜方法が公知である。あるいは、マーカーを使用しない形質転換を行い、前記マーカー遺伝子のない植物を得てもよく、その技術は従来技術において周知である。
【０１２１】
発現ベクターを植物に導入する１つの方法は、アグロバクテリウム（例えばＨｏｒｓｃｈら、１９８５）の自然形質転換システムに基づく。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは遺伝的に植物細胞を形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＴｉ及びＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の形質転換に関与する遺伝子を担持する（例えばＫａｄｏ（１９９１）を参照）。発現ベクターを植物組織に導入する方法としては、アグロバクテリウムチュメファシエンス、（Ｈｏｒｓｃｈその他、１９８５）を用いた植物細胞の直接感染又は共存培養が挙げられる。グルーバー及びクロスビー（１９９３）及びマローニー（１９８９）は、アグロバクテリウムを媒介された遺伝子移入その他のアグロバクテリウムベクターシステムを開示している。また米国特許第５５９１６１６号を参照のこと。植物発現ベクター及びレポーター遺伝子及び変換プロトコルの一般的説明、並びにアグロバクテリウムの媒介による遺伝子移入ためのアグロバクテリウムベクターシステム及びそれを用いた方法の説明は、グルーバー及びクロスビー（１９９３）に記載されている。植物組織を培養する一般の方法は、三木ら（１９９３）による例、及びフィリップスら（１９８８）により開示されている。分子クローニング技術及び適切な発現ベクターのための適当な参照ハンドブックとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）が挙げられる。
【０１２２】
発現ベクターを植物に導入する他の方法として、マイクロインジェクションにより媒介される形質転換に基づく方法が挙げられる。当該方法では、ＤＮＡをマイクロ発射体の表面上に担持させることを特徴とする。発現ベクターは、植物細胞壁及び膜を透過するのに十分な３００〜６００ｍ／ｓの速度にマイクロ発射体を加速する装置を用いて植物組織に導入される（サンフォードその他、１９８７、１９９３；サンフォード、１９８８、１９９０；クラインら、１９８８、１９９２を参照）。植物にＤＮＡを導入する他の方法としては、標的細胞（チャンその他は、知る、１９９１）の超音波処理を介する方法が挙げられる。あるいは、リポソーム又はスフェロプラスト融合を用いて、発現ベクターを植物に導入してもよい（例えばＤｅｓｈａｙｅｓら、１９８５、及びＣｈｒｉｓｔｏｕら（１９８７を参照）。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−Ｌ−オルニチンを用いたプロトプラストへのＤＮＡの直接の取り込みも報告されている（例えばＨａｉｎら、１９８５、及びＤｒａｐｅｒら、１９８２を参照）。プロトプラスト及び全細胞及び組織へのエレクトロポーレーションに関しても開示されている（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、１９９２、及びラウルセン、１９９４を参照）。
【０１２３】
他の周知の技術（例えばＢＡＣの使用、キュウリゲノムの一部を細菌人工染色体（ＢＡＣ）に導入（すなわちベクターを用いて大腸菌細胞のＤＮＡフラグメント（１００〜３００ｋｂのサイズを挿入、平均１５０ｋｂ）をクローニング）し、バクテリア大腸菌で見つかる天然のＰ因子プラスミドに基づく（Ｚｈａｏ及びＳｔｏｄｏｌｓｋｙ、２００４）方法）、を例えばＢＩＢＡＣシステム（ハミルトン、１９９７）との組合せで使用し、遺伝子導入植物を作製してもよい。
【０１２４】
キュウリ標的組織の形質転換に続いて、上記した選択可能なマーカー遺伝子を発現させ、現在公知技術の再生及び選抜方法を用いて形質転換細胞、組織及び／又は植物の選抜を行う。
【０１２５】
非トランスジェニック方法によるクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリの育種：
クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを作製するための別の実施形態では、プロトプラスト融合を用いて、ドナー植物から宿主植物への核酸導入を行ってもよい。プロトプラスト融合とは、２つ以上のプロトプラスト（細胞壁を酵素処理によって除去した細胞）間の誘発若しくは自然的な結合（例えば体細胞ハイブリダイゼーション）により、単一の二核若しくは多核細胞を作製する技術のことを指す。融合細胞（性質により交配できない植物種から得てもよい）を組織培養して、望ましい特徴の組合せを示すハイブリッド植物を形成できる。より詳しくは、第１のプロトプラストを、クロステロウイルス又はウドンコ病感染に対する耐性を示すにキュウリ又は他の植物系列から得てもよい。第２のプロトプラストは、例えば、病害抵抗性、虫害抵抗性、有益な果物特徴など（これらに限定されない）を有する第２のキュウリ又は他の植物変異体（好ましくは商業的に有益な特徴を有するキュウリ系列）から調製してもよい。次にプロトプラストを、従来公知のプロトプラスト融合法を用いて融合させる。
【０１２６】
あるいは、ドナー植物から宿主植物への胚レスキュー（ｅｍｂｒｙｏ ｒｅｓｃｕｅ）を採用し、本願明細書に記載の１つ以上のＱＴＬｓを含有する核酸を導入してもよい。胚レスキューは、植物が生存できる種子の作製に失敗した時、交配株から胚を単離するのに用いることができる。この方法では、植物の受精卵又は未熟種子を組織培養し、新規な植物を作製する（Ｐｉｅｒｉｋ、１９９９）。
【０１２７】
本発明はまた、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性キュウリの作製方法にも関する。当該方法は、上記したドナーキュウリ中において、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関連する定量耐性遺伝子座（ＱＴＬ）の存在を検出する方法を実施するステップと、少なくとも検出した当該１つ以上のＱＴＬ、又はクロステロウイルス若しくはウドンコ病耐性付与部分を含んでなる核酸配列を、前記ドナー植物からクロステロウイルス又はウドンコ病感受性の宿主キュウリに導入するステップを含んでなる。前記核酸配列の導入は本願明細書に上記したいかなる方法で実施してもよい。
【０１２８】
かかる方法の好ましい実施態様として、交雑によって、前記核酸配列を、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性ドナーキュウリから、クロステロウイルス又はウドンコ病感受性の宿主キュウリへの遺伝子導入する態様が包含される。したがって、この遺伝子導入は従来の繁殖方法を用いて適宜実施してもよい。ＱＴＬｓは好ましくはマーカーアシスト選抜（ＭＡＳ）又はマーカーアシスト育種（ＭＡＢ）を用いて商業的なキュウリ種へ移入される。ＭＡＳ及びＭＡＢは、所望の特徴をコードする遺伝子を１つ以上含むそれらの子孫植物の同定及び選抜における、当該分子マーカーの１つ以上の使用を含んでなる。かかる例においては、その同定及び選抜は本発明に係るＱＴＬｓ又はそれに連結するマーカーの選抜に基づく。ＭＡＳを用いて、目的のＱＴＬを有する近同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を育種してもよく、各ＱＴＬの効果の詳細な検討も可能となり、また戻し交配自殖系統（ＢＩＬ）集団の育種にも応用することができる（例えばＮｅｓｂｉｔｔら、２００１、ｖａｎ Ｂｅｒｌｏｏら、２００１）。この実施形態により育種されるキュウリは、宿主植物から大多数のそれらの特徴を好適に引き継ぎ、またドナー植物からのクロステロウイルス及びウドンコ病耐性の特徴も有する。
【０１２９】
上記したように、従来の繁殖方法を用いて、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関与する核酸配列を、クロステロウイルス及びウドンコ病感受性の宿主キュウリに導入することができる。系統育種と呼ばれる１つの方法では、クロステロウイルス又はウドンコ病に対する耐性を示し、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関与する核酸コード配列を有するドナーキュウリを、クロステロウイルス若しくはウドンコ病感受性の宿主キュウリ（好ましくは商業的に望ましい特徴（限定されないが病害抵抗性、虫害抵抗性、有益な果物特徴など）を示す）と交配させる。得られる植物群（Ｆ１ハイブリッド）を更に自家授粉し、種子（Ｆ２種子）を得る。Ｆ２種子から成長させたＦ２植物を、更にクロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関してスクリーニングする。当該集団を、様々な方法でスクリーニングしてもよい。
【０１３０】
第１に、従来の疾患スクリーンを使用して集団をスクリーニングしてもよい。かかる病態スクリーニングは公知である。好ましくは、定量的バイオアッセイを用いる。第２に、マーカーアシスト選抜を実施し、上記した分子マーカーの１つ以上を使用してクロステロウイルス又はウドンコ病耐性に関与する核酸コード配列を含むそれらの子孫を同定してもよい。上記した他の方法を用いて、ＱＴＬの存在を検出してもよい。また、マーカーアシスト選抜を用いて定量的バイオアッセイから得られる結果を確認してもよく、またその他の幾つかの方法を組み合わせて用いてもよい。
【０１３１】
近交系クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリ系列の親系列は、循環選択及び戻し交配の技術を使用して育種してもよく、自殖及び／又はジハプロイド又は他のあらゆる技術を用いて作製してもよい。循環選択及び戻し交配において、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性は、循環親と、第１のドナー植物を交配させることにより標的宿主植物に移入することもできる。それは反復親とは異なり、本明細書において「一回親」と称される。循環親はクロステロウイルス及びウドンコ病に対する耐性を有さないか、又は低い耐性を有する植物であって、例えば商業的に望ましい特徴（病害抵抗性、虫害抵抗性、有益な果物特徴など）を有するものである。一回親は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性を示し、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する核酸配列を含んでなる。一回親は、循環親との交配により得られる植物変異体又は近交系であってもよい。循環親及び一回親との間で交配して得た株を、循環親に戻し交配する。得られる植物群を更に所望の特徴に関してスクリーニングする。当該スクリーニング方法は特に限定されない。例えば、周知の表現型病理スクリーニング又は定量的バイオアッセイを用いて、集団をスクリーニングしてもよい。あるいは、バイオアッセイを使用する代わりに、マーカーアシスト選抜（ＭＡＳ）を、上記の分子マーカー、ハイブリッド形成プローブ又はポリヌクレオチドの１つ以上を使用して、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する核酸配列を含む子孫を同定してもよい。また、ＭＡＳを用いて定量的バイオアッセイから得られる結果を確認してもよい。また、ｐｍ−ｈの劣性形質は、この遺伝子が表現型スクリーン（例えば耐性バイオアッセイ）を用いてＦ１又はＢＣ１集団から選抜できないことを意味する。ゆえに本願明細書に係るマーカーは、遺伝子型のスクリーニングによって適当な子孫植物を選択するのに適切である。
【０１３２】
スクリーニングの後、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性表現型を示すＦ１ハイブリッド植物、又は好ましくは遺伝子型は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する核酸配列を含んでなり、それを更に選抜して循環親に戻し交配し、キュウリを次第に近交系にする。このプロセスは、２〜５以上の世代にわたり実施することが好ましい。原則として、循環親と一回親との交配により得られる、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性株の子孫は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関与する１つ以上の遺伝子に関してヘテロ接合体である。
【０１３３】
例えば、植物系列にｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈ遺伝子座を移入したとき、ｐｍ−ｈ遺伝子座は劣性であり、その耐性表現型は、ホモ接合のｐｍ−ｈ植物を形成できる条件下においてのみ子孫植物において生じることに留意すべきである。
【０１３４】
一般に、所望の特徴をハイブリッドキュウリ変異体に導入する方法は、以下のステップを含んでなる：
（ａ）１つ以上の所望の特徴を含む他のキュウリと、近交系キュウリ親を交配して、Ｆ１子孫植物を作製するステップであって、当該所望の特徴が、クロステロウイルス耐性及びウドンコ病耐性からなる群から選択されるステップと、
（ｂ）好ましくは本明細書で定義される分子マーカーを使用して、所望の特徴を有する前記Ｆ１子孫植物を選抜するステップと、
（ｃ）前記近交系キュウリ親株と、前記選択された子孫との戻し交配して戻し交配植物を得るステップと、
（ｄ）戻し交配子孫植物を、所望の特徴及び前記近交系キュウリ親株の形態的、生理的な特徴に関して選択するステップであって、前記選抜が、ゲノムＤＮＡを単離し、上記ＤＮＡを、ＱＴＬ−１、ｐｍ−ｌ及び／又はｐｍ−ｈの少なくとも１つの分子マーカー（好ましくは本願明細書に記載のもの）の存在に関して試験するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）を２回以上反復し、第３世代若しくはそれ以上の戻し交配子孫植物を作製するステップと、
（ｆ）選抜した戻し交配子孫を任意に近交し、ホモ接合の植物を同定するステップと、
（ｇ）最低１つの前記戻し交配子孫又は近交系植物と、他の近交系のキュウリ親株（好ましくはｐｍ−ｈｙｐｏ耐性、すなわちホモ接合のｐｍ−ｈ）とを交配し、ハイブリッドキュウリ変異体（同じ環境で成長させたとき、ハイブリッドキュウリ変異体の所望の特徴、並びに形態的及び生理的特徴の全てを有する）を得るステップを含んでなる。
【０１３５】
上記のように、最後の戻し交配生成は近交により行い、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関してホモ接合の純粋株（近交系）子孫を得てもよい。したがって、循環選択、戻し交配及び近交により、商業的に有用な特徴と関連する他の遺伝子と共に、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性に関連する遺伝子と相同な遺伝子を有する系列が得られる。
【０１３６】
クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリ及び種子：
植物育種の目的は、単一の変異体又はハイブリッド中で様々な望ましい特徴を組み合わせることである。商品作物の場合、これらの特徴としては、病気及び昆虫に対する耐性、熱及びかんばつに対する体制、成熟期間の短縮、収率の上昇及び農産物としての優れた品質などが挙げられる。植物特徴（例えば発芽及び成長、成長率、成熟及び草高の均一性など）が重要となることもある。
【０１３７】
商品作物は、花粉媒介による植物的な方法を利用して育種される。植物は、同一の花に由来する花粉が、その同一の花若しくは同じ植物の他の花へ移される場合に自家授粉される。同じファミリー又は系列の個体を花粉媒介に用いたとき、植物は兄弟授粉される。花粉が、異なるファミリー又は異なる系列の植物に存在する花に由来する場合、植物は他花受粉される。
【０１３８】
多世代にわたり自動授粉され、形態を基に選抜された植物は、全ての遺伝子座においてホモ接合性になっており、真の繁殖子孫としての同一集団を形成する。２つの異なるホモ接合性系列間での交配により、多くの遺伝子座に関してヘテロ接合体であるハイブリッド植物の同一集団を形成する。多くの遺伝子座でヘテロ接合体となっている２本の植物の交配により、遺伝的に多様な、同一でないヘテロな植物集団を形成する。
【０１３９】
キュウリ育種プログラムにおけるハイブリッドキュウリ多様性の成長は、以下の３つのステップを含んでなる：
（１）第一の育種交配のために、様々な生殖質プールから植物を選抜するステップと、
（２）繁殖交配から選抜された植物を数世代にわたり近交し、個々に繁殖した、非常に均一な一連の近交系を作製するステップと、
（３）ハイブリッド子孫（Ｆ１）の作製に無関係な近交系と、選抜された近交系とを交配させるステップ。同系交配を充分行った後、連続したハイブリッド世代は単に、育種された近交系の種子を増加させる目的でのみ用いる。好ましくは、近交系は、その遺伝子座の約９５％以上でホモ接合性対立遺伝子を含まなければならない。
【０１４０】
近交系のホモ接合性及び均質性による顕著な効果として、確立された近交系のペアを交配して作製したハイブリッドは、常に同質であるということである。優れたハイブリッドを作製する近交系を同定した後、これらの近交系両親を使用してハイブリッド種を継続的に供給することができ、更にこのハイブリッド種子からハイブリッドキュウリを栽培することができる。
【０１４１】
本発明の方法で作製できるクロステロウイルス及びウドンコ病抵抗キュウリ、又はその部分は、本発明に包含される。
【０１４２】
本発明の別の態様は、上記にて説明したＱＴＬｓを何らかの構成で含んでなるクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリ又はその部分の提供に関し、詳細には、少なくとも１つの前記ＱＴＬｓはその天然の遺伝的バックグラウンドに存在しない。本発明のクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリは、例えば近交系のいかなる遺伝子タイプ、ハイブリッド、ハプロイド、ジハプロイド、又はトランスジェニックであってもよい。更に、本発明の植物は、耐性特徴に関してヘテロ接合体であってもよく、またホモ接合性であってもよい（好ましくはホモ接合性である）。本発明のＱＴＬｓ（並びにその耐性付与部分）をいかなる植物に導入してクロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物を作製してもよいが、本発明に係る方法及び植物は、キュウリに関連する植物である。
【０１４３】
本願明細書に記載されているクロステロウイルス及びウドンコ病耐性近交系キュウリ系列を用いて、更に交配を行い、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性ハイブリッド植物を作製してもよい。例えば、本発明の第１のクロステロウイルス及びウドンコ病耐性近交系キュウリは、商業的に望ましい特徴（例えば病害抵抗性、虫害抵抗性、望ましい果物特徴など）を有する第２の近交系キュウリと交配してもよい。この第２の近交系キュウリ系列は、クロステロウイルス又はウドンコ病耐性を有さなくてもよい。好ましくは、この系列は、この劣性形質がハイブリッドの子孫植物において発現されるために、ｐｍ−ｈに関してホモ接合性である。
【０１４４】
本発明の別の態様は、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを栽培する際の種子の作製方法に関する。一実施形態では、当該方法は、
クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを準備するステップと、
前記クロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物を他のキュウリと交配するステップと、
前記交配から得られる種子を収集するステップを含んでなる。更にそれを栽培し、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを作製する。
【０１４５】
別の実施形態では、当該方法は以下のステップを含んでなる：
本発明のクロステロウイルス及びウドンコ病耐性キュウリを準備するステップと、
前記クロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物とキュウリとを交配するステップと、
前記交配から生じる種子を回収し、前記種を植物体に成長させるステップと、
本願明細書に記載のいずれかの方法で、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性植物を選抜するステップと、
充分な世代数にわたり、選択された植物を自家授粉して繁殖させ、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性を付与する対立遺伝子が安定した植物を得るステップと、
そのように得られた植物を、望ましい表現型を有するキュウリと十分な世代数にわたり戻し交配して、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性、並びに望ましい表現型を有するキュウリを得るステップと、
最後の戻し交配から生じる植物から作製される種子を回収するステップ。上記の種子を栽培し、クロステロウイルス及びウドンコ病耐性を有するキュウリを作製する。
【０１４６】
表４のマトリックスにおいて、ｐｍ耐性若しくはクロステロウイルス耐性の親に由来する（耐性親の存在として示される）二重耐性植物における、マーカーの有無を示す。マトリックスは更に、二重（ＰＭ及びクロステロウイルス）耐性植物系列と関連するＡＦＬＰマーカーの起源及び相対的位置を示す。用語ｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈにより示される「マーカー」は、２つのそれぞれのウドンコ病耐性遺伝子座の中心位置を示す。ＱＴＬ−１遺伝子座の位置は決定しなかったが、クロステロウイルス関連マーカーを使用することにより、その遺伝子座は２つのｐｍ遺伝子座の間に存在することが示される。表より、プールｎｒｓ．１〜６では、プールｎｒｓ．１０〜１５より短い、クロステロウイルス耐性親からの遺伝子移入が可能であることが示唆される。マトリックスの解釈は、以下の通りである：例えば、マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３（５６．９ｃＭ）は、ｐｍ耐性親及び二重耐性子孫に存在したが、一方マーカーＥ１１／Ｍ８０−Ｍ００３（７９．１ｃＭ）は、クロステロウイルス耐性親には存在したものの、二重耐性子孫には存在しなかった。すなわち、マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３はＰＭ関連のマーカーであり（その存在は、テストした植物系列のｐｍ−ｌ関連遺伝子の領域の存在を示す）、一方、マーカーＥ１１／Ｍ８０−Ｍ００３は、クロステロウイルス耐性に関連するＱＴＬ−１遺伝子座の近傍の遺伝的領域であるが、ｐｍ−ｈｙｐｏ（ｐｍ−ｈ）耐性の発現にとっては必須ではないことを示す。
【０１４７】
【表４】
＋＝ホモ接合性が存在（高密度のバンド）、
−＝存在しない（バンドなし）、
＋／−＝ヘテロ接合体が（低密度バンド）、
Ｄ＝中程度に存在（中程度のバンド）、
・＝ＰＭ抵抗親におけるマーカースコア（両方存在：［＋］、不在：［−］）、
・＝マーカースコア（クロステロウイルス耐性親）、
・＝親系列における未同定マーカーの存在。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】考えられる組換えシナリオを示す図。２つの別々の植物から得たそうであるウドンコ病（ｐｍ）及びクロステロウイルス（ＱＴＬ−１）耐性を、単一の子孫植物内で連結させた。多くの耐性遺伝子座を有するものとして示される様々な親植物は、それ自体交配若しくは自家交配の結果でありえることを理解すべきである。すなわち、ＱＴＬであるｐｍ−ｌ及びｐｍ−ｈを有する植物は、単一のＱＴＬを有する植物間での交配によって得られる。
【図２】同上。
【図３】同上。
【図４】同上。
【図５】同上。
【図６】同上。
【図７】単一の連鎖群における、キュウリＮＰＩ由来のウドンコ病耐性（ｐｍ）遺伝子、及びＣ．ｓａｔｉｖｕｓ Ｋｈｉｒａ由来のクロステロウイルス耐性（ＱＴＬ−１）遺伝子の様々な位置関係を示す。Ｐｍ−ｌｅａｆ１は、本明細書で用いられるｐｍ−ｌに相当し、Ｐｍ ｈｙｐｏは本明細書で用いられるｐｍ−ｈに相当する。
【図８】本願明細書の表２及び３中の各配列番号により示されるＳＮＰ及び挿入マーカー近傍のＤＮＡ配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示す植物であって、前記植物がキュウリであり、前記植物が単一の染色体上に、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域と、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含んでなり、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの前記領域が、Ｅ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜される少なくとも１つのマーカーと連結し、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの前記領域が、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに−マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに連結している植物。
【請求項２】
請求項１記載の植物であって、前記植物が、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも２つの染色体領域を含んでなり、
前記少なくとも２つの領域のうちの第１が、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーと連結し、
前記少なくとも２つの領域のうちの第２が、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１の挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに連結している植物。
【請求項３】
請求項２記載の植物であって、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの前記領域が、請求項２記載のウドンコ病耐性を付与する少なくとも２つの前記領域の間に位置する植物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項記載のキュウリの部分。
【請求項５】
請求項４記載の部分であって、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選択される、前記部分。
【請求項６】
農産物として望ましい特徴を有する第２のキュウリ又は他の種類の植物（好ましくはキュウリ株）と、請求項１から３のいずれか１項記載のキュウリを交配させることにより得られるＦ１種子であって、前記種子が、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜されるクロステロウイルス耐性に関連する少なくとも１つのマーカーと、ウドンコ病耐性に関する、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーとを含んでなる種子。
【請求項７】
請求項６記載の種子であって、前記第２のキュウリがクロステロウイルスに感受性であり、少なくとも１つの前記ウドンコ病耐性マーカーがホモ接合的に存在する種子。
【請求項８】
前記第２のキュウリが近交系の植物である、請求項６又は７記載の種子。
【請求項９】
請求項４から８のいずれか１項記載の種子を成長させることにより得られるハイブリッド植物。
【請求項１０】
請求項９記載のハイブリッド植物の部分。
【請求項１１】
請求項１０記載の部分であって、前記部分が花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選抜される部分。
【請求項１２】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対して抵抗性の植物の選抜方法であって、前記植物がキュウリであり、前記方法がマーカー検出アッセイを実施することを含んでなり、前記アッセイが、
ａ）前記植物のゲノムにおいて、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜されるクロステロウイルス耐性に関連する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
ｂ）前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される、ウドンコ病耐性に関連する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号１のＳＮＰマーカー ３９Ｔ→Ｇ、
配列番号２のＳＮＰマーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１で表される第１のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号３のＳＮＰマーカー １９３Ｃ→Ｔ、
配列番号４の位置２２１における挿入突然変異 ５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００で表される第２のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の方法であって、前記方法が、
ａ）前記植物からゲノムＤＮＡのサンプルを得るステップと、
ｂ）前記植物のゲノムＤＮＡのサンプルにおいて、クロステロウイルス耐性に関連する少なくとも１つの前記マーカーと、ウドンコ病耐性に連結する少なくとも１つの前記マーカーを検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法であって、前記ステップｂ）が、前記マーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記マーカーを定義する核酸配列と実質的に相補的である少なくとも１つの核酸プローブの使用を含んでなり、前記核酸プローブが１つ以上の前記マーカーを定義する核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する方法。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項記載の方法であって、前記マーカーが、例えば交配試験において、カップリングしないマーカーの場合と比較しマーカー同士の分離が減少することにより、同一の染色体上において存在し、カップリング段階であることが示される方法。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか１項記載の方法により選抜される植物。
【請求項１８】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリの作製方法であって、
ａ）キュウリクロステロウイルス耐性を付与する染色体領域を含む第１のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１により表される、キュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーの存在を検出することにより行われるステップと、
ｂ）キュウリウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含む第２のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１により表される、第１のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップか、
又は、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１の挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００により表される、第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップによって行われるステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得られた前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）Ｆ１種子をＦ１植物に成長させ、交配又は自家交配することによって前記Ｆ１植物から更なる子孫を生じさせるステップと、
ｅ）前記更なる子孫植物から、ステップａ）において定義したキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーと、ステップｂ）において定義したキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーを含んでなる植物を選抜するステップを含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法であって、ステップｂ）の第２のキュウリを選抜するステップが、前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓのうちの１つのみを有する第２のキュウリを選抜することを含んでなり、
更に、
ｆ）前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓ（すなわち前記第２のキュウリに存在しないＱＴＬ）のうちのもう１つを有する第３のキュウリを選抜するステップと、
ｇ）ステップｅ）で得られたＦ１植物と、前記第３のキュウリとを交配させて、更なる子孫植物を得るステップと、
ｈ）当該子孫植物から、ステップａ）で定義されるキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬと、ステップｂ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する両方のＱＴＬｓを含む植物を選抜するステップを含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか１項記載の方法であって、ステップｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する染色体領域を含むキュウリを選抜するステップが、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号１のＳＮＰマーカー ３９Ｔ→Ｇ、
配列番号２のＳＮＰマーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１で表される第１のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号３のＳＮＰマーカー １９３Ｃ→Ｔ、
配列番号４の位置２２１における挿入突然変異 ５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００で表される第２のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含んでなる方法。
【請求項２１】
請求項１７から２０のいずれか１項記載の方法であって、ステップａ）、ｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）のうちの少なくとも１つは、前記植物から得たゲノムＤＮＡのサンプルを提供するステップと、前記ゲノムＤＮＡのサンプル中から前記少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなる方法。
【請求項２２】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリを作製する方法であって、
ａ）請求項１２から１６のいずれか１項記載の方法を実施して、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示す第１のキュウリを選抜するステップと、
ｂ）前記植物を同系育種して、前記ＱＴＬｓのホモ接合植物株を得るステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得た前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）前記Ｆ１種子をＦ１植物に成長させるステップを含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項１８から２２のいずれか１項記載の方法で得られる植物又はその部分。
【請求項１】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示す植物であって、前記植物がキュウリであり、前記植物が単一の染色体上に、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域と、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含んでなり、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの前記領域が、Ｅ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜される少なくとも１つのマーカーと連結し、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの前記領域が、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに−マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに連結している植物。
【請求項２】
請求項１記載の植物であって、前記植物が、ウドンコ病耐性を付与する少なくとも２つの染色体領域を含んでなり、
前記少なくとも２つの領域のうちの第１が、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーと連結し、
前記少なくとも２つの領域のうちの第２が、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１の挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに連結している植物。
【請求項３】
請求項２記載の植物であって、クロステロウイルス耐性を付与する少なくとも１つの前記領域が、請求項２記載のウドンコ病耐性を付与する少なくとも２つの前記領域の間に位置する植物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項記載のキュウリの部分。
【請求項５】
請求項４記載の部分であって、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選択される、前記部分。
【請求項６】
農産物として望ましい特徴を有する第２のキュウリ又は他の種類の植物（好ましくはキュウリ株）と、請求項１から３のいずれか１項記載のキュウリを交配させることにより得られるＦ１種子であって、前記種子が、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜されるクロステロウイルス耐性に関連する少なくとも１つのマーカーと、ウドンコ病耐性に関する、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーとを含んでなる種子。
【請求項７】
請求項６記載の種子であって、前記第２のキュウリがクロステロウイルスに感受性であり、少なくとも１つの前記ウドンコ病耐性マーカーがホモ接合的に存在する種子。
【請求項８】
前記第２のキュウリが近交系の植物である、請求項６又は７記載の種子。
【請求項９】
請求項４から８のいずれか１項記載の種子を成長させることにより得られるハイブリッド植物。
【請求項１０】
請求項９記載のハイブリッド植物の部分。
【請求項１１】
請求項１０記載の部分であって、前記部分が花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、枝、根茎、種子、プロトプラスト及びカルスから選抜される部分。
【請求項１２】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対して抵抗性の植物の選抜方法であって、前記植物がキュウリであり、前記方法がマーカー検出アッセイを実施することを含んでなり、前記アッセイが、
ａ）前記植物のゲノムにおいて、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１からなる群から選抜されるクロステロウイルス耐性に関連する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
ｂ）前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１における挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１、Ｅ２３／Ｍ３８−Ｍ００１、Ｅ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００からなる群から選択される、ウドンコ病耐性に関連する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号１のＳＮＰマーカー ３９Ｔ→Ｇ、
配列番号２のＳＮＰマーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１で表される第１のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号３のＳＮＰマーカー １９３Ｃ→Ｔ、
配列番号４の位置２２１における挿入突然変異 ５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００で表される第２のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の方法であって、前記方法が、
ａ）前記植物からゲノムＤＮＡのサンプルを得るステップと、
ｂ）前記植物のゲノムＤＮＡのサンプルにおいて、クロステロウイルス耐性に関連する少なくとも１つの前記マーカーと、ウドンコ病耐性に連結する少なくとも１つの前記マーカーを検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法であって、前記ステップｂ）が、前記マーカーを定義する少なくとも１つのプライマーセット、又は前記マーカーを定義する核酸配列と実質的に相補的である少なくとも１つの核酸プローブの使用を含んでなり、前記核酸プローブが１つ以上の前記マーカーを定義する核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する方法。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項記載の方法であって、前記マーカーが、例えば交配試験において、カップリングしないマーカーの場合と比較しマーカー同士の分離が減少することにより、同一の染色体上において存在し、カップリング段階であることが示される方法。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか１項記載の方法により選抜される植物。
【請求項１８】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリの作製方法であって、
ａ）キュウリクロステロウイルス耐性を付与する染色体領域を含む第１のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、マーカーＥ１６／Ｍ５０−２４４、Ｅ１６／Ｍ５０−１８８及びＥ１１／Ｍ４８−２５１により表される、キュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーの存在を検出することにより行われるステップと、
ｂ）キュウリウドンコ病耐性を付与する少なくとも１つの染色体領域を含む第２のキュウリを選抜するステップであって、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号１の単一ヌクレオチド多形マーカー ３９Ｔ→Ｇ、
− 配列番号２の単一ヌクレオチド多形マーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
− マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１により表される、第１のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップか、
又は、前記選抜が、前記植物のゲノムにおいて、
− 配列番号３の単一ヌクレオチド多形マーカー １９３Ｃ→Ｔ、
− 配列番号４の位置２２１の挿入突然変異５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
− マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００により表される、第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬと連結している、少なくとも１つのマーカーの存在を検出することによって行われるステップによって行われるステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得られた前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）Ｆ１種子をＦ１植物に成長させ、交配又は自家交配することによって前記Ｆ１植物から更なる子孫を生じさせるステップと、
ｅ）前記更なる子孫植物から、ステップａ）において定義したキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーと、ステップｂ）において定義したキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬに連結している少なくとも１つのマーカーを含んでなる植物を選抜するステップを含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法であって、ステップｂ）の第２のキュウリを選抜するステップが、前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓのうちの１つのみを有する第２のキュウリを選抜することを含んでなり、
更に、
ｆ）前記第１若しくは第２のキュウリウドンコ病耐性を付与するＱＴＬｓ（すなわち前記第２のキュウリに存在しないＱＴＬ）のうちのもう１つを有する第３のキュウリを選抜するステップと、
ｇ）ステップｅ）で得られたＦ１植物と、前記第３のキュウリとを交配させて、更なる子孫植物を得るステップと、
ｈ）当該子孫植物から、ステップａ）で定義されるキュウリクロステロウイルス耐性を付与するＱＴＬと、ステップｂ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する両方のＱＴＬｓを含む植物を選抜するステップを含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか１項記載の方法であって、ステップｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）で定義されるキュウリウドンコ病耐性を付与する染色体領域を含むキュウリを選抜するステップが、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号１のＳＮＰマーカー ３９Ｔ→Ｇ、
配列番号２のＳＮＰマーカー ２９Ｇ→Ａ、並びに
マーカーＥ１６／Ｍ５０−Ｆ−１９４、Ｅ１１／Ｍ４８−Ｆ−２５１及びＥ２３／Ｍ３８−Ｍ００１で表される第１のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップと、
−前記植物のゲノム中において、
配列番号３のＳＮＰマーカー １９３Ｃ→Ｔ、
配列番号４の位置２２１における挿入突然変異 ５’−ＡＡＴＴＴ−３’、並びに
マーカーＥ２３／Ｍ４０−Ｍ００３、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００２、Ｅ２４／Ｍ４６−Ｍ００３、Ｅ１２／Ｍ９１−Ｍ００３、Ｅ２６／Ｍ４３−Ｍ００３、Ｅ１４／Ｍ５９−Ｆ−１３４及びＥ１４／Ｍ５９−Ｆ−２００で表される第２のキュウリウドンコ病耐性付与ＱＴＬに連結する少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含んでなる方法。
【請求項２１】
請求項１７から２０のいずれか１項記載の方法であって、ステップａ）、ｂ）、ｅ）、ｆ）又はｈ）のうちの少なくとも１つは、前記植物から得たゲノムＤＮＡのサンプルを提供するステップと、前記ゲノムＤＮＡのサンプル中から前記少なくとも１つのマーカーを検出するステップを含んでなる方法。
【請求項２２】
キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示すキュウリを作製する方法であって、
ａ）請求項１２から１６のいずれか１項記載の方法を実施して、キュウリクロステロウイルス及びキュウリウドンコ病に対する耐性を示す第１のキュウリを選抜するステップと、
ｂ）前記植物を同系育種して、前記ＱＴＬｓのホモ接合植物株を得るステップと、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）から得た前記植物を交配してＦ１種子を得るステップと、
ｄ）前記Ｆ１種子をＦ１植物に成長させるステップを含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項１８から２２のいずれか１項記載の方法で得られる植物又はその部分。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１４５２３（Ｐ２００９−５１４５２３Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８８３５（Ｐ２００８−５３８８３５）
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０００５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３０１５
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０８１３５０７９）デ ルイター シーズ アール アンド ディー ビー．ヴイ． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０００５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３０１５
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０８１３５０７９）デ ルイター シーズ アール アンド ディー ビー．ヴイ． (1)
【Ｆターム（参考）】
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