肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫
本発明は、免疫原性タンパク質／ペプチドを発現するように設計されたバクテリオファージを含むワクチンに関する。本発明のバクテリオファージ表面は、特定の細胞タイプの表面レセプターに対しファージを標的とするように設計されるペプチド／タンパク質を含むようには修飾されていない
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性タンパク質／ペプチドを発現するように設計されたバクテリオファージを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子ワクチン接種は、核酸をワクチン成分として使用する新しく刺激的な手法である(総説として非特許文献１：Leitner et al., Vaccine 18: 765-777,2000参照)。これと対照的に、従来のワクチンでは、病原微生物またはその抗原部分を使用する必要がある。「従来の」ワクチンには３種類のタイプ：弱毒ワクチン、死菌／サブユニットワクチン、及び組換体ワクチンがある。弱毒ワクチンは病原性が低減された生菌を用いるもので、一般に最も有効なワクチンである。しかし、ワクチン成分である菌がチェックされずに成長したり病原性を有するタイプに復帰した場合に面倒な問題を生じるおそれがある。死菌ワクチンまたはサブユニットワクチンは複数回の注射が必要であり、その結果、コストが増す上、適切な投与をする上で問題があり、さらに、微生物が完全に死滅していないおそれもある。組換体ワクチンは、病原微生物由来の抗原を非病原性ベクターに組み込むものであり、効果的であるが、本来の立体構造のまま抗原を発現させるのが困難なため、効果が限られる場合が多い。
【０００３】
ワクチンを有効にするには、十分に長い期間にわたって十分な量の抗原を投与し、２次（記憶）応答を誘導する必要がある。しかし、これは従来のワクチンでは問題がある。一方、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチンは、長期にわたって病原性抗原のコピーを有効に生産し、生ワクチンで見られるのと同様に、ＭＨＣクラスＩ応答とクラスＩＩ応答の両方を誘導することができる。しかし、有望であるとされているにもかかわらず、ＤＮＡワクチンは、まだその力を十分に発揮していない。感染微生物の攻撃を受けた際、ＤＮＡワクチンの多くは、測定可能な体液性（抗体）免疫応答を引き起こすにもかかわらず低い効果しか示さない(非特許文献２：Beard, CW & Mason PW., 1998. Nature Biotech. 16: 1325)。
【０００４】
現時点では、核酸が宿主細胞に入り免疫応答を誘導するメカニズムはよくわかっていないが、最も簡単な手法は、可溶性注入液として通常筋肉内にＤＮＡを投与することである。一般にはこれとは異なる２つの方法が使用されており、それらは、「遺伝子銃」法（ＤＮＡを微小金粒子上に付着させ、ヘリウム高速流を用いてこれを細胞内に強制注入する）とリポソームを用いたトランスフェクション（宿主細胞膜と融合する正電荷脂質によってＤＮＡを被覆し複合体を形成する）である。免疫部位を取り巻く細胞がＤＮＡを取り込んでコードされた抗原を発現し、これが免疫系の抗原提示（ＡＰ）細胞により「異物」と認識され、これによりＴ細胞とＢ細胞が活性化されて抗原に対する免疫応答が誘導されると考えられている。
【０００５】
しかし、これには以下の問題がある。すなわち、（１）大多数のＤＮＡが非ＡＰ細胞において発現するため、発現が比較的不十分な上、非特異的である。（２）非ＡＰ細胞において外来抗原が発現すると、その細胞が宿主免疫系から「感染状態にある」と認識され、結局その細胞が死んでしまうため、免疫応答が可能な期間が短くなってしまう。さらに、（３）裸のＤＮＡ／ＲＮＡはヌクレアーゼの作用に非常に敏感である。このため、免疫に用いられた核酸は大多数が免疫直後に分解されてしまう。
【０００６】
国際公開第９８／０５３４４号（特許文献１）には、外来遺伝子を送達するために、標的細胞上のレセプターに結合するリガンドをその表面に含むように修飾されたバクテリオファージベクターを用いる方法が記載されている。この文献に記載されたベクターは、概ね遺伝子治療（この場合、ベクターは特定の細胞タイプを標的とする。）のために使用することが意図されている。抗原ペプチドを送達するために修飾バクテリオファージベクターを使用することにも言及している。
【０００７】
米国特許第5,736,388号公報（特許文献２）には、真核細胞に核酸分子を送達するために、変異体尾部繊維タンパク質を組み込むか、または真核細胞レセプターに対するリガンドを組み込んで修飾したラムダ型のバクテリオファージが記載されている。
【０００８】
米国特許第6,054,312号公報（特許文献３）は、表面にリガンドを提示する繊維状ファージ粒子に関するものであり、リガンドは、ファージ粒子に共有結合しているか修飾されたファージ粒子と複合したファージキャプシドタンパク質との融合タンパク質である。
【０００９】
国際公開第９９／５５７２０号（特許文献４）も、標的遺伝子送達で使用される異種起源の標的タンパク質を外部に提示するように修飾したファージについて記載している。
【００１０】
しかし、前述の特許/特許出願はすべて、一般に遺伝子治療の目的で核酸を特定の細胞を標的として送達し得るようにファージ表面を修飾することを記載している。
【００１１】
多数の文献(Ishiura, M. et al, Molec. And Cell. Biol., p607-616, 1982（非特許文献３）; Aujame, L. et al, Biotechiques, 28 pl202-1213, 2000（非特許文献４）; Horst, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 72, p3531-3535, 1975（非特許文献５）; Jkayama and Dery, Molec. and Cell. Biol. 5, pll36-1142, 1985（非特許文献６）;及びSrivatsan, E. et al, 38, p227-234, 1984（非特許文献７）)が、哺乳類培養細胞に感染させ、タンパク質を発現させるためのファージの使用に関連している。しかし、これがインビボに適用し得るという示唆、あるいはワクチンの開発に使用できるという示唆はない。
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９８／０５３４４号
【特許文献２】米国特許第５，７３６，３８８号公報
【特許文献３】米国特許第６，０５４，３１２号公報
【特許文献４】国際公開第９９／５５７２０号
【非特許文献１】Leitner et al., Vaccine 18: 765-777,2000
【非特許文献２】Beard, CW & Mason PW., 1998. Nature Biotech. 16: 1325
【非特許文献３】Ishiura, M. et al, Molec. And Cell. Biol., p607-616, 1982
【非特許文献４】Aujame, L. et al, Biotechiques, 28 pl202-1213, 2000
【非特許文献５】Horst, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 72, p3531-3535, 1975
【非特許文献６】Jkayama and Dery, Molec. and Cell. Biol. 5, pll36-1142, 1985
【非特許文献７】Srivatsan, E. et al, 38, p227-234, 1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は前述の問題点の少なくとも１つを解消及び／または軽減することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１に、本発明は、表面が修飾されていないバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含む肝炎ワクチン製剤を提供する。ここで、バクテリオファージ粒子は、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体中で前記ポリペプチドに対する免疫応答が引き起こされるものである。
【００１５】
前述の開示例（例えば、国際公開第９８／０５３４４号、米国特許第５，７３６，３８８号公報、米国特許第６，０５４，３１２号公報及び国際公開第９９／５５７２０号参照）と異なり、本発明のバクテリオファージの表面は、ファージ表面に外来ペプチド／タンパク質（つまり、通常は存在しないペプチド／タンパク質）を含むようには修飾されておらず、特定の細胞タイプの表面レセプターに対しファージを標的とするように設計されていない。それ故、特定の細胞タイプの表面レセプターに対しファージを標的とするように設計せずに、外来ペプチド／タンパク質を含むようにバクテリオファージの表面を修飾してもよいという点は、理解される。
【００１６】
肝炎ワクチンは肝炎ウイルス、例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型またはＥ型、好ましくはＢ型のいずれかに対する予防接種に用いることが出来る。ＡＰ細胞の表面に発現及び提示された抗原は免疫応答を誘導できる他の肝炎タンパク質が発現されているにもかかわらず、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）のような表面抗原になる。
【００１７】
さらに、バクテリオファージは１個以上の肝炎抗原を発現するように設計され、例えば１個以上の肝炎型から抗原を発現することができる。
【００１８】
本発明者は高用量のバクテリオファージ粒子がより良好な免疫応答をもたらすことを観察している。したがって、好ましくは１０9個以上のバクテリオファージ、１０10個あるいは１０11個以上のバクテリオファージ粒子のような投与量が動物に投与される。
【００１９】
したがって、第２に、１０9個以上のバクテリオファージ粒子、各粒子の修飾されていない表面及び薬学的に許容し得る担体を含むワクチン製剤が提供され、上記バクテリオファージ粒子は生物体の抗原提示細胞の表面に発現及び提示し得るポリペプチドをコードする外来核酸分子を含み、その結果上記ポリペプチドに対する免疫応答が生物体で惹起される。
【００２０】
本発明者は、粒子表面に標的とするペプチドまたはリガンドを含むようには修飾されていないバクテリオファージがＡＰ細胞によって取り込まれることを観察した。このように、本発明のバクテリオファージは「異物」として認識され、従って、宿主免疫系によって通常の方法で処理されると考えられる。さらに、外来ペプチド／タンパク質（それは選択された哺乳類宿主中には通常存在しないペプチド／タンパク質である）をコードし得る外来核酸を含むようにバクテリオファージのゲノムを修飾することによって、この外来タンパク質への免疫応答が誘発される。従って、外来ペプチド／タンパク質をコードする核酸は（抗原提示細胞その他において）発現され、ＡＰ細胞の表面上に提示される。免疫応答は体液性（即ち抗体）及び／または細胞性免疫応答のいずれでもよい。
【００２１】
外来核酸は、天然には存在しないポリヌクレオチドに関するもので、異種起源のペプチドまたはタンパク質として（即ち、天然に存在するバクテリオファージ中では通常発現されないか生物学的に有意なレベルで発現されないペプチドまたはタンパク質として）発現され得るものである。発現されたペプチドまたはタンパク質は、ワクチンが接種された宿主において免疫応答を引き起こすのに十分なレベルで発現される。
【００２２】
第２点に従って本発明は、病原体の１種または複数のタンパク質に対して適切な免疫保護反応が惹起され得る限りにおいて、必ずしも肝炎に限らず実際上任意の感染症のワクチンの調製に適用できる点が理解されるべきである。適当な疾病の例は、疾病を引き起こす病原体そのものに対しての予防接種、あるいは、疾病を運ぶベクターに対する予防接種を含む。こうした病原体またはベクターは、ウイルス、バクテリア、真菌類、酵母、原虫類、寄生虫、昆虫及び感染性海綿状脳症を含む。本発明は、ヒト及び動物の両方の感染症に適用可能である。適当な疾病のリストは当業者にはよく知られており、その例は、「Ｏ．Ｉ．Ｅ．標準品のマニュアル及び診断試験」第３版(O.I.E. Manual of Standards and Diagnostic Tests 3rd Ed., OIE, Paris 1996), トップリー＆ウィルソン「細菌学・ウイルス学・免疫の原理」第８版(Topley & Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunity 8th Ed., Eds.Parker M.T. and Collier L.H., Vol. IV (Index), Edward Arnold, London 1990), Bell J.C.他著「人畜共通伝染病：動物から人への感染移行」（The Zoonoses: Infections Transmitted from Animals to Man. Bell J.C. et al., Edward Arnold, London 1988）及びNoble E.R.他著「寄生虫学：動物寄生虫の生物学」第６版(Parasitology: The Biology of Animal Parasites 6th Ed. Noble E.R. et al., Lea Febiger, Philadelphia, 1989.)に見ることができる。さらに、ワクチンタンパク質として癌細胞特異的抗原の発現による癌細胞に対する免疫応答を引き起こすために本発明を使用することができる。
【００２３】
従って、本発明は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を、例えば細胞中に存在する例えばヌクレアーゼから保護するため、安定なマトリックス内に封じ込める方法を提供する。バクテリオファージ表面の「外来」タンパク質は、特に抗原提示（ＡＰ）細胞への核酸の直接取り込みを可能にする。理論的に限定されるものではないが、バクテリオファージ粒子は外来抗原として認識されると予想される。粒子全体がこのように宿主免疫系の抗原提示細胞によって直接取り込まれ、タンパク質被覆が除去され、ＤＮＡが放出される。次いで、これが核に移動して発現される。このプロセスは、ワクチンＤＮＡの発現及びその後のポリペプチドの生産が、免疫応答を引き起こすのには最適のルートであるＡＰ細胞内でのみ起こるため効率的であると考えられる。
【００２４】
一般に、「ポリペプチド」という用語は、抗原活性を示す一連のアミノ酸またはその配列を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。ポリペプチドは、必要であれば、インビボで及び/またはインビトロで、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化及び/または翻訳後の開裂によって修飾されてもよく、従って特に、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質及び融合タンパク質が含まれる。当業者には当然理解されるであろうが、修飾されたポリペプチドは生理的機能（すなわち、免疫応答を引き起こす能力）を保持すべきである。
【００２５】
本発明のバクテリオファージは、好ましくは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び／またはその他同種のものなど、適切な転写／翻訳レギュレーターを含む。典型的には、プロモーターはＣＭＶ、ＳＶ（シミアンウイルス）４０、チミジンキナーゼ、ＲＳＶプロモーターその他の真核生物プロモーターでよい。プロモーターはコンスティテューティブプロモーターが便利である。しかし、当業者に既知の制御可能なプロモーターも使用してもよい。例えば、コンスティテューティブプロモーターと制御可能なプロモーターの制御下に外来核酸を含むコンストラクトを設計してもよい。このようにすれば、初めにコンスティテューティブプロモーターによって外来核酸の発現を誘導し、次の時点で制御可能なプロモーターを発現させ、それによって外来核酸の発現を引き起こすことができる。これによって、より強い免疫応答をもたらすこともできる。
【００２６】
多数の適当なバクテリオファージが当業者に知られている。適当なバクテリオファージの例はラムダ（λ）である。現在、バクテリオファージλは日常的なＤＮＡ操作手順でクローニングベクターとして使用されている。これらについては、ＤＮＡはファージ構造体とは別個に精製される。しかし、完全なλファージ粒子は、上に挙げた基準を満たす。すなわち、ＤＮＡは、宿主免疫系によって外来抗原として認識される保護タンパク質マトリックス内に包含される。ファージλは通常大腸菌に感染するため、そのＤＮＡは真核細胞では「不活性」、つまり、発現されないと考えられる。しかし、ＤＮＡが哺乳類細胞に取込まれた場合、対象とするワクチン（または外来）遺伝子の上流に真核生物プロモーターが組み込まれ、次いでその遺伝子が発現されるのであれば、抗原、つまり、タンパク質／ペプチドが生じるはずである。日常的なクローニングベクターとして広範囲に使用されているため、λには多数の変異体が存在し、その中には、哺乳類細胞での発現のために設計された強力な真核生物のプロモーターが含まれる。通常は、λベクターの関連部分は、さらに遺伝子操作を行なう前にプラスミドＤＮＡとして除去される。次いで、大腸菌宿主由来の高度に精製したプラスミドＤＮＡが、遺伝免疫のために使用される。しかし、真核生物のプロモーター及び対象とするワクチン（つまり、外来）遺伝子を含む完全なλファージ粒子を免疫のために使用する場合、それはＡＰ細胞によって取り込まれる。タンパク質被覆の除去に続いて、ＡＰ細胞内で直接に抗原が産生されると考えられ、抗原がＡＰ細胞の表面に提示されて免疫応答を引き起こす。この場合、免疫用ファージ粒子の調製に必要なのは最も基礎的な精製プロセスだけである。プラスミドクローニングベクターと比較して、λを使用するさらなる利点は、より大きなサイズの挿入断片を収容できるという点である。
【００２７】
他の適当なバクテリオファージも、当業者によく知られており、ｐ１ファージ、Ｔファージ（例えばＴ１〜Ｔ７）、Ｍｕ、ｆｄまたはＭ１３並びに繊維状ファージが含まれる。
【００２８】
本発明で好ましいバクテリオファージは、外来核酸及び関連するプロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び／または同様なものを、約0.5〜ｌ００キロ塩基の間に組み込む能力を有するものである。例えば、既知のラムダファージは、９〜５０キロ塩基の間に収容できる。このようにすれば、１個のペプチド／タンパク質または複数のペプチド／タンパク質の単一または多数のコピーを発現することが可能である。
【００２９】
典型的には、本発明のバクテリオファージは、選択された哺乳類の宿主の自然な細菌叢中で溶解成長(lytic growth)をしない。例えば、「研究室」ファージ株の多くは、非野生株である「研究室」細菌株にのみ感染できることが知られている。これに加え、またはこれに代えて、バクテリオファージは宿主の細菌株中でもインビトロでは溶解成長しないかインビトロでの生育にヘルパーファージを必要とする。従って、バクテリオファージは、例えば、アンバー変異、温度感受性変異などを含んでもよい。
【００３０】
ＡＰ細胞中で外来核酸の発現を増強するための手段が一般に提供されている。このような手段としては、核酸分解を最小限にすること及び／または核を標的とすることを支援する方法が挙げられる。このような手段の例としては、クロロキンまたは他のリソソーム／エンドソーム酵素異化阻害剤を使用して核酸分解を最小限にする方法、及び／または核移行シグナルを使用して核酸を核に移行させる方法が挙げられる。
【００３１】
ワクチン製剤は、バクテリオファージによって発現させるべきタンパク質源をさらに含んでもよい。このようにすれば、宿主は、タンパク質への１次的な免疫応答を誘発し、次いで、ＡＰ細胞の表面で発現され提示されたタンパク質によりさらに持続的な免疫応答を引き起こすことができる。
【００３２】
別の具体化では、ファージ粒子表面の抗原タンパク質を発現するためにファージを修飾してもよい。例えば、ベクター媒体として完全なバクテリオファージＭ１３粒子を使用することが可能である。Ｍ１３に対する挿入サイズはλに対するものよりも相当に小さいが、「ファージディスプレイ」法(Hawkins, RE et al. 1992, J. Mol. Biol. 226: 889)は、ファージ粒子が、その外殻タンパク質に融合させた外来抗原部分を媒介できることを意味している。従って、ワクチン遺伝子が原核生物プロモーター（例えばＬａｃ Ｚプロモーター）と真核生物プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の両方の制御を受けるようなコンストラクトを作成することができ、大腸菌宿主中で成長させた場合、原核生物プロモーターはワクチン抗原の発現を指示し、タンパク質複合体としてＭ１３外殻への組込みを可能にし、この結果、ワクチン後に強力な１次反応を誘導するはずである。次いで、ＡＰ細胞による取り込みに続いて、ＤＮＡが放出され、真核生物プロモーターがＡＰ細胞内部からのワクチン抗原の長期にわたる発現を指示し、強力な２次応答が維持されるであろう。
【００３３】
外来核酸は、免疫応答を増強することができるポリペプチドのような、少なくとも１つの別のポリペプチドをコードしてもよい。別のポリペプチドはサイトカインなどのアジュバントタンパク質やポリペプチドでもよく、例えばγインターフェロン（γＩＦＮ）のようなインターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ及び／または他のサイトカイン／ケモカインをコードするものでもよい。さらに、ＨｅｐＢコア抗原のような「ヘルパーエピトープ」が、Ｂ細胞を活性化し、かつ強いＴ細胞反応を誘導するために使用できる。あるいはまたはさらに、ＣｐＧオリゴジヌクレオチドなどの免疫刺激シグナルを使用してもよい。
【００３４】
バクテリオファージは、任意の適当な経路、例えば注入によって投与することができ、例えば、アンプルに入れて、または複数回分の投与量を容器に入れて単位用量形式(unit dosage form)で調製してもよい。バクテリオファージは、油性もしくは好ましくは水性媒体を用いた懸濁液、溶液または乳剤などの形でもよい。あるいは、バクテリオファージは凍結乾燥された形とし、投与の際に発熱性物質を含まない滅菌水などのような適当な媒体で再構成してもよい。この方法では、タンパク質、糖などの安定化剤をファージ粒子を凍結乾燥する際に加えてもよい。液状でも再構成される凍結乾燥形でも、注入溶液のｐＨを適切に調節するのに必要な量の薬剤、好ましくはバッファーを含む。非経口投与、特に、製剤を静脈内投与しようとする場合、溶質の総濃度は、製剤を等張性であるか低張性またはわずかに高張性であるように調整しなければならない。浸透圧の調節には糖のような非イオン性物質が好ましく、特にショ糖が好ましい。これらの形のうちのいずれでも、さらにデンプンまたは糖、グリセリンまたは食塩水などの適当な調整剤を含んでもよい。組成物は、液体でも固体でも、単位用量あたりバクテリオファージ材料を0.1％から９９％まで含む。
【００３５】
好ましい実施態様では、ワクチンはアジュバントを含んでもよい。一般にアジュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を強化する物質を含む。多種多様なアジュバントが当業者に知られている。アジュバントの例としては、フロイント(Freund)完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、リポソーム及び、国際公開第９０／１１０９２号に記載されているようなニオソーム(niosome)、鉱物油及び非鉱物油ベースの油中水型乳剤アジュバント、サイトカイン、短い免疫刺激ポリヌクレオチド配列（例えば、Sato Y. et al. (1996) Science Vol. 273pp. 352-354; Krieg A.M. (1996) Trends in Microbial. 4pp. 73-77Sato Y. et al. (1996) Science Vol. 273pp. 352-354; Krieg A.M. (1996) Trends in Microbial. 4pp. 73-77に記載されているようなＣｐＧジヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。
【００３６】
バクテリオファージはいわゆる「媒体」と結合させてもよい。媒体は共有結合することなくバクテリオファージが付着することができる化合物または基質である。典型的な「媒体」化合物は、金粒子、ガラスなどのシリカ粒子などを含む。従って、本発明のバクテリオファージはバイオリスティック(biolistic)な方法を使用して生物体に導入してもよい。例えば、被覆された金粒子を使用する高速衝撃法(high-velocity bombard method)が文献に記載されている(Williams R.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88pp. 2726-2730; Fynan E.F. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90pp. 11478-11482)。
【００３７】
さらに、ワクチンは１種類またはそれ以上の適当な界面活性化合物または乳化剤、例えばスパン(Span)またはトゥイーン(Tween)を含んでもよい。
【００３８】
本発明のワクチンの投与態様は、患者に本発明の免疫保護量のウイルスを送達するものであれば任意の適当なルートによるものでよい。しかし、ワクチンは、筋肉内または深い皮下ルート経由で好ましくは非経口的に投与される。必要であれば、経粘膜(例えば経直腸、経口、経鼻、経膣)投与で、または他の腸管外ルート経由、すなわち、皮内、鼻腔内または静脈内などの他の投与態様も使用できる。経鼻投与のための製剤を開発してもよいし、アジュバントとして例えばキトサンを含んでもよい(Nat. Medicine 5(4) 387-92, 1999)。
【００３９】
しかし、任意の特定のレシピエント生物体に対する具体的投与量は、年齢、一般的な健康状態及び性別、投与時間、投与ルート、投与されている他の薬との相乗効果及び求められている保護の程度を含む様々な要因に依存することが理解されるであろう。もちろん、必要ならば、投与は適当な間隔で繰り返すことができる。
【００４０】
従って、本発明は、別の面では、ヒトまたは動物にここに記述されるようなワクチン製剤の有効量を投与して予防的かつ／または治療的に免疫する方法を提供する。ここで、有効量はヒト及び／または動物において免疫応答を誘発可能な量である。
【００４１】
さらに、生物体の抗原提示細胞の表面に発現及び提示し得るポリペプチドをコードする外来核酸分子を含むバクテリオファージ粒子の使用が提供され、その結果上述のポリペプチドに対する免疫応答が、特定の疾患に対する予防接種のワクチン製造のための生物体において惹起される。
【００４２】
好ましくは、予防接種される疾患は肝炎、例えばＢ型肝炎である。
好ましくは、単位用量当たりの薬剤は１０10個あるいは１０11個以上のような１０10個以上のバクテリオファージ粒子を含む。
【００４３】
本発明を実施例の方法ならびに以下に示す図を参照して述べる。
図１は本発明に従って設計されたラムダファージを作成するために用いたｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）ベクターの概要図を示す；
図２はマウスに投与した様々な肝炎コンストラクトのＥＬＩＳＡ反応の時間経過の図表を示す；
図３は図２に示したデータのグループ平均を描いている図表を示す；
図４は国際標準品との比較によってマウス血清中の抗ＨＢｓ濃度測定の図表を示す；及び
図５はＥＬＩＳＡで測定した時の、λ−ＨＢｓＡｇ（Ａ〜Ｄ）及び組換えＨＢｓＡｇ（Ｅ＋Ｆ）で予防接種したウサギにおけるＨＢｓＡｇ（白丸、左側目盛り）及び全バクテリオファージ（黒四角、右側目盛り）に対する抗体反応を示す。ウサギＡ〜Ｄは０、９、１５及び２７週にλ−ＨＢｓＡｇで予防接種した（矢印で示した）。ウサギＥとＦは０及び２７週に組替えＨＢｓＡｇで予防接種した。ＨＢｓＡｇプレートに対しモノクローナル抗体（クローンＮＦ５、Aldevron）を１：50,000の希釈で用い、一方マウスのポリクローナル抗血清（１：５００）をファージ−被覆プレートに対して用いた。各血清サンプルからのシグナルは種々のプレート間で相対シグナルを比較できるようにこの標準のシグナルに対して標準化した。
【実施例】
【００４４】
実施例：Ｂ型肝炎に対するバクテリオファージを介した免疫
ＨｅｐＢｓバクテリオファージベクターの作成−λＨｅｐＢｓ
ラムダファージへのＨｅｐＢ発現カセットのクローニング。
プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（ｐＣＭＶ−Ｓ）（Aldeveron）（図１を参照）をλ−ｇｔ１１（Stratagene）のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。ｐＣＭＶ−ＳベクターにはＥｃｏＲＩサイトはないが、矛盾の無い（compatible）粘着末端を与えるＭｆｅＩサイトがある。ＭｆｅＩサイトはプラスミド上１６０番目の塩基に存在し、一方サイトメガロウイルス真核生物プロモーターは２０６番目の塩基にあるので、この酵素による１ヶ所の切断は発現カセットを妨げない。
【００４５】
プラスミド（１μｇ／μｌを１６ｍｌ）ＤＮＡをメーカー推奨バッファー中２０単位のＭｆｅＩ（New England Biolabs）を用い３７℃、２時間で消化した。消化の成功は１％アガロースゲルで１ｍｌの消化物を電気泳動することにより確認した。
消化したプラスミドＤＮＡは次にフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。消化物は蒸留水で２００μｌの最終容積にした。等容積のフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（３５：３４：１）（Fisher Biosciences UN2821）を加え、混合しフェーズロックチューブ（Eppendorf 0032 007.953）中マイクロフュージを用い13000ｒｐｍで回転させた。それから上部の水層を除き、同チューブ中当容積のクロロフォルムで抽出した。
【００４６】
抽出後、水層を新しいチューブに移し、最終濃度が0.3Ｍになるように２２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた。２倍量の氷冷エタノールを加え、チューブを混合し−２０℃で終夜貯蔵した。それからチューブを13000ｒｐｍで回転し、上澄み液を別の容器に移し７５０μｌの氷冷７０％エタノールを加えた。チューブを13000ｒｐｍで２分間遠心した。上澄み液を除き痕跡のアルコールを完全に除くためチューブを逆さにして１０〜１５分間放置した。それからペレットを１５μｌの滅菌蒸留水に再度懸濁させた。
【００４７】
抽出したＤＮＡは１％アガロースゲルで１μｌを電気泳動し、ＯＤ２６０／２８０比をチェックすることにより純度を調べた。
この精製ＤＮＡとStratagene由来のＥｃｏＲＩで消化した子牛腸管アルカリホスファターゼ処理λ−ｇｔ１１（カタログ番号234211）を用いてライゲーションを行った。２μｌのラムダＤＮＡ（0.5μｇ／μｌ）を既に９０ｎｇ／μｌに希釈された1.5μｌの消化プラスミドに加えた。ｇｔ１１はおよそ４３ｋｂで挿入断片はおよそ5.6ｋｂなので、１μｌのｇｔ１１及び１３５ｎｇの挿入断片の使用は１：１のモル比となる。３ＵのＤＮＡリガーゼ（Promega M1801）と適切なバッファーを加え容積を蒸留水で１０μｌとした。対照ライゲーションも用い、それは挿入ＤＮＡの替わりに1.5μｌの水を加えた他には上述したようにセットアップした。ライゲーションは４℃で終夜インキュベートして行った。
【００４８】
ライゲーション後、１μｌのライゲーション混合物を挿入断片がしかるべき所にあることを確認するためにライゲーションさせていないラムダＤＮＡと一緒にアガロースゲルで電気泳動を行った。ライゲーション後いずれのサイトも存在しないので、挿入断片はＥｃｏＲＩあるいはＭｆｅＩ消化によって除去されず、全体のサイズ差が確認に用いられた。
ライゲーションしたＤＮＡをPromega lambda packagene system（cat. K3154）を用いてインビトロでパッケージした。上述したようにライゲーション反応物と対照反応物の５μｌを２５μｌのpackagene抽出物に加えた。packagene kitより供給されたポジティブコントロールＤＮＡを用いて３番目の反応をセットアップした。いずれの反応も室温で３時間インキュベートするために放置した。インキュベーション後反応を停止させるために２２５μｌのファージバッファー（packageneの使用説明書を参照）を加え12.5μｌのクロロフォルムを加えた。チューブを良く混ぜ白色沈殿物を沈殿させた。澄んだ上澄み液はパッケージされたファージを含む。
【００４９】
packageneマニュアルに述べられたプロトコールを用いてパッケージされたファージを滴定した。簡単に述べると、ファージバッファー中でファージを連続希釈し（１：1000、１：10000）それぞれの希釈液１００μｌを指数関数的な発育期のE. coli LE392の１００μｌに加えた（３７℃で前もって暖めた新鮮な培地１：１００で新たに終夜生育させ、ＬＥ３９２を指数期とし３７℃で2.5時間振ることにより生育させる）。細胞とファージをよく混合し３７℃で３０分間インキュベートした。それから３ｍｌのＴＢ ｔｏｐ ａｇａｒ（１ｇのバクト−トリプトース、0.5ｇのＮａｃｌ、１００ｍｌの水中0.8ｇの寒天−オートクレーブ、６０℃に冷却し１ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4を加える）を４８℃で細胞／ファージに加え、良く混合しその後３７℃に前もって暖められたＬＢ−寒天プレート上に注いだ。
【００５０】
終夜インキュベーション後プラーク数を数えた。挿入断片とのライゲーション由来のパッケージされたファージのプレートは挿入断片の無いコントロールよりも１５０〜２００倍のカウントであった。計算したパッケージング効率は4.2×１０6組み換え体／μｇ ＤＮＡであった。
【００５１】
６個のポジティブクローンと２個のネガティブクローンを選び、標準法（Sambrookら、1989年、分子クローニング：実験マニュアル。Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y.）により小スケールのファージ増幅を行った。その後これら８個の精選ファージのサンプルを上述したようにＸ−ｇａｌとＩＰＴＧの存在下Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ１−ｂｌｕｅ ｃｅｌｌ上で培養した。ｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトへの挿入断片はｌａｃＺ遺伝子を妨害するので、クローン中の挿入断片の存在を確認するために青／白のカラー選択を用いた。挿入断片を有するファージは白いプラークを与え、一方挿入断片の無いファージは青いプラークを与えた。挿入断片を有するプレートから選択した６個のファージ中５個が青のプラークを与え、これらの１つをその後の研究に選んだ。
【００５２】
最終的に挿入断片の存在を確認するために、Promega Wizard lambda DNA抽出キット（カタログ番号A7290）を用いて選択したファージクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。ｐＣＭＶ−ｓプラスミドに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。λ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩクローニングサイトのいずれかの側に位置する他のプライマーをクローニングサイト全域で配列を決定するために用い、さらに挿入断片の存在を確認するために用いた。
【００５３】
それから多様性の低い標準的な大量スケールの液体培養（Sambrookら、1989年、分子クローニング：実験マニュアル。Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y.）をその後のＤＮＡ予防接種試験のためのファージ（λＨｅｐＢｓ）の大量製造に用いた。
【００５４】
予防接種のプロトコール
それぞれ１０匹のマウスを含む８群について検討した。
マウス群は以下の通り：
（１）ネガティブコントロール。非発現バクテリオファージ（λｃＩ857）を筋肉内投与により免疫した。
（２）ポジティブコントロール。組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）で免疫した。
（３）‘裸‘のＤＮＡによる予防接種のポジティブコントロール。サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＲＣ／ＣＭＶ−ＨＢｓ［Ｓ］）のコントロール下ＨｅｐＢ表面抗原を発現するプラスミドで免疫した。
（４）サイトメガロウイルスプロモーター（λＨｅｐＢｓ）のコントロール下ＨｅｐＢ表面抗原を発現するバクテリオファージλ。経口／鼻腔内投与、バクテリオファージは粘膜アジュバントキトサンとの複合体として与えた。
（５）λＨｅｐＢｓ、リポソームと組み合わせて筋肉注射した。
（６）λＨｅｐＢｓ、オイルを主体としたアジュバント（モンタニド２０６）で筋肉注射した。
（７）λＨｅｐＢｓ、アジュバント無しＳＭバッファーのみで筋肉注射した。
（８）λＨｅｐＢｓ、真空乾燥したバクテリオファージ粒子を皮膚に投与するためBio-Rad Helios圧縮窒素ガス‘遺伝子銃‘を用いて皮内／皮下免疫を行った。
ワクチンの製造と免疫のプロトコール：２週毎にマウスから採血した。０及び３週にマウスに予防接種した。予防接種に先立ち、ハロタンを吸入させマウスを麻酔した（グループ８を除いて）。
【００５５】
予防接種法：
グループ１〜３及びグループ５〜７（筋肉内投与免疫）。前けい骨筋への到達を容易にするため後肢を剃った。皮膚にサンプルを注射するため２７Ｇ×３／４インチの針を用いた。針の先は前けい骨粗面の約３ｍｍ外側。針先は３ｍｍ挿入し、サンプル（プラスミドＤＮＡ、ファージあるいは組替えＨｅｐＢ表面抗原［ＨＢｓＡｇ］）を約１０秒かけてゆっくりと注射した。針は約５〜１０秒そのままにし、その後ゆっくりと引き抜いた。
【００５６】
ワクチン製造：
グループ３：プラスミドＤＮＡは0.5ｍｇ／ｍｌの濃度でエンドトキシンを含まないホスフェートバッファー食塩水（ＰＢＳ）に含まれ、１匹当たり５０μｌ（２５μｇＤＮＡ／マウス）を用いた。
【００５７】
グループ２：エンドトキシンを含まない５０μｌのＰＢＳ中１μｇの組換えＨＢｓＡｇをマウスに注射した。
【００５８】
グループ１及び７：バクテリオファージはＳＭバッファー（１リットル当たり；塩化ナトリウム5.8ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２ｇ、１ｍトリス−塩酸（ｐＨ7.5）５０ｍｌ、２％ゲラチン溶液５ｍｌ）中１×１０13個プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌの濃度で投与した。５×１０11個ファージ／マウスの用量に等価のファージ５０μｌを注射した。
【００５９】
グループ５：マウス当たり；２×１０11個のファージ（５μｇのＤＮＡに等価）を陽イオン性脂質のトランスフェクタム（Promega）で被覆して投与した。製造：２０μｌのファージ（ＳＭバッファー中）を２０μｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウムに加えた。１０ｍｌ中１０μｌのトランスフェクタムを加え、溶液を混合し上述したように筋肉内投与する３時間前に１０分間放置した。注射量は５０μｌ／マウス。
【００６０】
グループ６：ＳＭバッファー中２×１０13個／ｍｌの濃度で２５μｌのファージを等容量のモンタニド２０６オイルアジュバント（Seppic、Paris、France）と混合し、各マウスに５０μｌのワクチン（５×１０11個ファージ／マウス）を筋肉内投与し免疫した。
【００６１】
グループ４（経口／鼻腔内投与免疫）：１０μｌの１％キトサン（［Ｆｌｕｋａ、媒体分子量］、１％酢酸中１０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌのＳＭバッファー中１×１０13個のファージに滴下して貯蔵用に調整した。投与に先立ち、懸濁液を暫時かき混ぜた。マウスが麻酔から意識を回復し始めた時に、ギルソン型ピペットを用いて５μｌの滴量を各鼻孔に投与した。
【００６２】
グループ８（遺伝子銃）：ファージ粒子を送達させるためにＢｉｏ−Ｒａｄ Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃を用いた。１０μｌのＳＭバッファー中１０11個のファージ粒子を遺伝子銃プラスチックチューブカートリッジに移し、−７０℃で凍らせ、それから終夜凍結乾燥した。各マススの腹部を剃り１回の免疫当たり１匹のマウス当たり５００ｐｓｉの圧力で１回の発射で投与した。
【００６３】
採血スケジュール：
１群１０匹のマウス、
マウス１〜２は０、２、４及び６週に採血、
マウス３〜４は０、２、４、６及び７週に採血、
マウス５〜６は０、２、４、６及び８週に採血、
マウス７〜８は０、２、４、６、８及び９週に採血、
マウス８〜９は０、２、４、６、８及び１０週に採血。
各時点ですべてのマウスから採血していないので、このことから図２におけるマウス採血のギャップが説明される。
【００６４】
結果
ＥＬＩＳＡにより測定したＨＢｓＡｇに対する抗体反応。
各群で個々のマウスについて抗体反応の時間経過を測定した。種々のプレート間の標準化を行うために個々のＥＬＩＳＡプレートには抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体の１：50,000の希釈液を含む（結果は各図表の関連部分に‘コントロール’値として示す）。図３は図２で示したデータの群平均を示す。
【００６５】
有意な抗体反応がグループ２（組換えＨｅｐＢｓ）とグループ５〜７（それぞれリポソーム、モンタニド及びアジュバント無しによるλＨｅｐＢｓ）で観察された。他のグループでは反応は見られないかごく僅か観察された。（グループ４の見かけの増加はすべての採血に影響したＥＬＩＳＡプレートの非特異的なエッジ効果であり、これが繰り返された。）。
【００６６】
マウスにおける抗ＨｅｐＢ表面抗原反応を定量化するために、最後の採血は国際標準品と比較した（Bio-Rad Monolisa抗ＨＢｓ標準品カタログ番号72399）。間接ＥＬＩＳＡによってマウス血清の１：１０希釈を調べた。プレートを0.2Ｍの炭酸ナトリウムコーティングバッファー中ｐＨ9.6で１００μｌ／ウェルのＨＢｓ（１μｇ／ｍｌ）で被覆した。プレートは被覆するために室温で終夜放置した。
【００６７】
一夜インキュベーション後、プレートを一度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎですすぎ、ＰＢＳ−ｗｅｅｎ中５％のMarvelスキムミルクの粉末をウェル当たり２００μｌ加え、非結合サイトをブロックするために室温で３０分間放置した。
【００６８】
それからブロック溶液を除きブロッキングバッファー中マウス１次抗血清の１：１０希釈の１００μｌを加え、ブロック溶液単独をネガティブコントロールとして用いた。標準品はウェル当たり１００μｌを加えるとの条件で用いた。例外として１ｍＩＵ／ｍｌ（ミリ国際単位／ｍｌ）の標準品は１０ｍＩＵ／ｍｌの標準品をＰＢＳ中１：１０に希釈することにより作成した。それから室温で2.5時間プレートをインキュベートした。
【００６９】
インキュベーション後、１次血清サンプルを除きプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。その後２次抗血清を加えた。セイヨウワサビペロキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ社カタログ番号A-8667）の１：５００希釈液をウェル当たり１００μｌ加えた。提供された国際標準品はヒトＩｇＧであったので、２次抗体として抗ヒト血清を用いた。試験したサンプルはマウス血清であったが、マウス血清で得られた数値は実際の値よりも低いにもかかわらず、両者を検出するためのＨＲＰ標識２次抗体にとってマウス及びヒトの免疫グロブリン間に十分な交差反応性のあることが期待された。２次抗体でプレートを室温で1.5時間インキュベートした。
【００７０】
その後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでプレートを洗浄し、ウェル当たりSigma Fast OPD展開溶液（カタログ番号P9187）の２００μｌ/ウェルを加え展開した。プレートを１５分間展開し、その後３Ｍの硫酸５０μｌ／ウェルを加え反応を止めた。自動プレート読み取り装置（４９２ｎｍ）でプレートを測定した。
【００７１】
選択した結果を図４に示す。
リポソーム中λＨｅｐＢｓで免疫したマウス（グループ５、マウス４）の血清の１：１０希釈液は17.5ｍＩＵ／ｍｌに等価の反応を示し、一方コントロールのｐＲＣ／ＣＭＶ−ＨＢｓ［Ｓ］で免疫したマウスは2.5ｍＩＵ／ｍｌに等価の反応を示した。保護のための認められた国際濃度は血清の１０ｍＩＵ／ｍｌで、λＨｅｐＢｓによる免疫は保護に対して認められた国際濃度よりも大きな抗体価（１：１０希釈で）をもたらしたことを示している。さらなる例は；グループ６（λＨｅｐＢｓプラスモンタニド）マウス５、１６ｍＩＵ／ｍｌ＠１：１０希釈、及びグループ７（λＨｅｐＢｓのみ）マウス８、１４ｍＩＵ／ｍｌ＠１：１０希釈。抗体濃度は無希釈マウス血清を用いて試験した時よりも高いと予想される。試験サンプルにおいて１次マウス血清に対して抗ヒト２次抗体が用いられているので（むしろ特異的抗マウスＨＲＰ複合体よりも）、これらの結果はおそらく実際の抗体価よりも表示不足していることが認められる。
【００７２】
実施例２：Ｂ型肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫に関するさらなる実験
ウサギの免疫
食塩水バッファー中２×１０11個ファージ／ｍｌ（４×１０10個ファージ、２μｇＤＮＡ／ウサギ）の濃度で筋肉内投与した２００μｌのλ−ＨＢｓＡｇでウサギに予防摂取した。ファージワクチンを０、９、１５及び２７週に投与した。組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ−Aldevron）を投与したウサギには０及び２７週に２５μｇ／ｍｌ（５μｇタンパク質／ウサギ）の濃度で２００μｌの食塩水バッファー中タンパク質を筋肉内投与した。ウサギから定期的に採血し、抗体反応をＥＬＩＳＡにより定量した。
【００７３】
抗体反応のＥＬＩＳＡ測定
組換えＨＢｓＡｇまたはバクテリオファージλコートタンパク質に対する抗体反応を間接ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇの精製ＨＢｓＡｇ（Aldevron）あるいは１０9個のバクテリオファージ（５０ｎｇ）／ウェルのいずれかで0.05Ｍの炭酸ナトリウムバッファー中ｐＨ9.2で終夜被覆した。その後コーティングバッファーを除き、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中５％のＭａｒｖｅｌ乾燥スキムミルク）を３７℃で３０分間加えた。その後ブロッキングバッファーを除き、ブロッキングバッファー中１：５０の希釈で１００μｌ／ウェルの１次抗体を加え、プレートを４℃で終夜インキュベートした。それからプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５回洗浄し、抗ウサギセイヨウワサビペロキシダーゼ標識２次抗体（ＤＡＫＯ）をメーカーの推奨希釈で３７℃で１時間で加えた。その後プレートをＰＢＳ−Ｔｅｅｎ中で５回洗浄し、２００μｌ／ウェルの基質（SIGMA Fast-OPD錠）を加え、プレートを暗所で５分間（ファージプレート）及び３０分間（ＨＢｓＡｇプレート）展開した。５０μｌ／ウェルの３Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４９２ｎｍで光学濃度を測定した。ＥＬＩＳＡプレートの最初のウェルにブロッキングバッファー中１００μｌの希釈１次抗体（推定力価に依存して１：１０〜１：５０）を加え、プレートの１２カラムすべてを１：１に連続希釈することにより反応を停止させた。各血清サンプルに対するエンドポイントの力価を計算するためにＯＤ492NM＝0.2のカットオフ値を用いた。
【００７４】
結果
マウス以外の動物での免疫反応を調べ、追加の予防接種がより一貫した反応を与えるかどうかを明らかにするために、４羽のウサギをλ−ＨＢｓＡｇレポーターコンストラクトで免疫し、２羽を組換えＨＢｓＡｇタンパク質で免疫した。注射間の間隔を大きく取り、初期の実験での２羽に比べて全部で４羽（λ−ＨＢｓＡｇ）または２羽（組換えＨＢｓＡｇ）に投与し、１〜３週毎に採血した。組換えＨＢｓＡｇに対しＥＬＩＳＡによって抗体価を測定した(図５)。λ−ＨＢｓＡｇの２回の予防接種後、ファージをコードしたＨＢｓＡｇワクチン抗原に対し矛盾する反応が再度見られた。λ−ＨＢｓＡｇを接種した４羽のウサギの内１羽がＨＢｓＡｇに対して有意な反応を示し（図５Ｄ）、一方残る３羽は低レベルのゆるやかな増加を示した。これらの割合はλ−ＥＧＦＰによる２回の予防接種後観察された割合と類似していた（即ち、レポーターファージワクチンによる２回の予防接種後動物の２５％がＥＧＦＰに対し反応を示す）。しかし３回の予防接種後、いずれのウサギも組替えＨＢｓＡｇタンパク質による１回の予防接種により誘導される反応に匹敵するかあるいは有意に増加した過剰な抗ＨＢｓＡｇ反応を示した(図５)。λ−ＨＢｓＡｇによる４回の予防接種は１羽で抗ＨＢｓＡｇ力価の顕著な増加（図５Ｃ）を、他の３羽に低強度のよりゆるやかな増加をもたらした。組換えＨＢｓＡｇを投与したグループでは、２回目の予防接種は２羽でＨＢｓＡｇ抗体価の上昇をもたらしたが、この強度は特にこのグループの他のウサギ（ウサギＦ）で観察された力価に比較して、またはλ−ＨＢｓＡｇを予防接種したグループに比べた時非常に弱いＨＢｓＡｇ抗体価を示すウサギ５Ｅで低かった。この反応の矛盾は以前にＨＢｓＡｇについて報告されている（Alper, C. A., Kruskall, M. S., Marcus-Bagley, D., Craven, D. E., Katz, A. J., Brink, S. J., Dienstag, J. L., Awdeh, Z., and Yunis, E. J. Ｂ型肝炎ワクチンに対する無反応の遺伝的予測N. Engl. J. Med. 1989; 321: 708-712）。
【００７５】
ＨＢｓＡｇ抗体反応のエンドポイントでの滴定はλ−ＨＢｓＡｇで予防接種したウサギ（力価は０週で１：１０であった）に対して２２週後１：１２０〜１：６４０の間であった、一方これらのウサギ（組換えλ−ＨＢｓＡｇを投与された）に対して同じ時点で１：１６０（ウサギＥ）と１：６００（ウサギＦ）の力価が観察された。λファージコートタンパク質に対する最初の予防接種後λ−ＨＢｓＡｇで予防接種されたすべてのウサギで高い抗体反応が観察され、このことはこの高い抗ファージ反応がその後のファージ予防接種の有効性を阻害しなかった（図５Ａ〜Ｄ）ことを示している。２２週での抗ファージ反応は４羽いずれにとってもエンドポイントの滴定は１：50,000のオーダーであった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に従って設計されたラムダファージを作成するために用いたｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）ベクターの概要図を示す。
【図２ａ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ１（ネガティブコントロールファージ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｂ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ２（ＨｅｐＢタンパク質）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｃ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ３（ＨｅｐＢプラスミドコントロール）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｄ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ４（経口／キトサンＨｅｐＢファージ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｅ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ５（ＨｅｐＢファージ＋リポソーム）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｆ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ６（モンタニド／ラムダＨｅｐＢ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｇ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ７（ＰＢＳ中ＨｅｐＢファージ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｈ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ８（ＤＮＡ銃／ＨｅｐＢ予防接種）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図３】Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）に対する反応のＥＬＩＳＡによるグループ平均を示す。
【図４】国際標準との比較によるマウス血清中抗ＨＢｓ濃度の測定結果を示す。
【図５】ウサギＡ〜Ｆについて、ＥＬＩＳＡで測定した時の、λ−ＨＢｓＡｇ（Ａ−Ｄ）及び組換えＨＢｓＡｇ（Ｅ＋Ｆ）で予防接種したＨＢｓＡｇ（白丸、左側目盛り）及び全バクテリオファージ（黒四角、右側目盛り）に対する抗体反応を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性タンパク質／ペプチドを発現するように設計されたバクテリオファージを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子ワクチン接種は、核酸をワクチン成分として使用する新しく刺激的な手法である(総説として非特許文献１：Leitner et al., Vaccine 18: 765-777,2000参照)。これと対照的に、従来のワクチンでは、病原微生物またはその抗原部分を使用する必要がある。「従来の」ワクチンには３種類のタイプ：弱毒ワクチン、死菌／サブユニットワクチン、及び組換体ワクチンがある。弱毒ワクチンは病原性が低減された生菌を用いるもので、一般に最も有効なワクチンである。しかし、ワクチン成分である菌がチェックされずに成長したり病原性を有するタイプに復帰した場合に面倒な問題を生じるおそれがある。死菌ワクチンまたはサブユニットワクチンは複数回の注射が必要であり、その結果、コストが増す上、適切な投与をする上で問題があり、さらに、微生物が完全に死滅していないおそれもある。組換体ワクチンは、病原微生物由来の抗原を非病原性ベクターに組み込むものであり、効果的であるが、本来の立体構造のまま抗原を発現させるのが困難なため、効果が限られる場合が多い。
【０００３】
ワクチンを有効にするには、十分に長い期間にわたって十分な量の抗原を投与し、２次（記憶）応答を誘導する必要がある。しかし、これは従来のワクチンでは問題がある。一方、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチンは、長期にわたって病原性抗原のコピーを有効に生産し、生ワクチンで見られるのと同様に、ＭＨＣクラスＩ応答とクラスＩＩ応答の両方を誘導することができる。しかし、有望であるとされているにもかかわらず、ＤＮＡワクチンは、まだその力を十分に発揮していない。感染微生物の攻撃を受けた際、ＤＮＡワクチンの多くは、測定可能な体液性（抗体）免疫応答を引き起こすにもかかわらず低い効果しか示さない(非特許文献２：Beard, CW & Mason PW., 1998. Nature Biotech. 16: 1325)。
【０００４】
現時点では、核酸が宿主細胞に入り免疫応答を誘導するメカニズムはよくわかっていないが、最も簡単な手法は、可溶性注入液として通常筋肉内にＤＮＡを投与することである。一般にはこれとは異なる２つの方法が使用されており、それらは、「遺伝子銃」法（ＤＮＡを微小金粒子上に付着させ、ヘリウム高速流を用いてこれを細胞内に強制注入する）とリポソームを用いたトランスフェクション（宿主細胞膜と融合する正電荷脂質によってＤＮＡを被覆し複合体を形成する）である。免疫部位を取り巻く細胞がＤＮＡを取り込んでコードされた抗原を発現し、これが免疫系の抗原提示（ＡＰ）細胞により「異物」と認識され、これによりＴ細胞とＢ細胞が活性化されて抗原に対する免疫応答が誘導されると考えられている。
【０００５】
しかし、これには以下の問題がある。すなわち、（１）大多数のＤＮＡが非ＡＰ細胞において発現するため、発現が比較的不十分な上、非特異的である。（２）非ＡＰ細胞において外来抗原が発現すると、その細胞が宿主免疫系から「感染状態にある」と認識され、結局その細胞が死んでしまうため、免疫応答が可能な期間が短くなってしまう。さらに、（３）裸のＤＮＡ／ＲＮＡはヌクレアーゼの作用に非常に敏感である。このため、免疫に用いられた核酸は大多数が免疫直後に分解されてしまう。
【０００６】
国際公開第９８／０５３４４号（特許文献１）には、外来遺伝子を送達するために、標的細胞上のレセプターに結合するリガンドをその表面に含むように修飾されたバクテリオファージベクターを用いる方法が記載されている。この文献に記載されたベクターは、概ね遺伝子治療（この場合、ベクターは特定の細胞タイプを標的とする。）のために使用することが意図されている。抗原ペプチドを送達するために修飾バクテリオファージベクターを使用することにも言及している。
【０００７】
米国特許第5,736,388号公報（特許文献２）には、真核細胞に核酸分子を送達するために、変異体尾部繊維タンパク質を組み込むか、または真核細胞レセプターに対するリガンドを組み込んで修飾したラムダ型のバクテリオファージが記載されている。
【０００８】
米国特許第6,054,312号公報（特許文献３）は、表面にリガンドを提示する繊維状ファージ粒子に関するものであり、リガンドは、ファージ粒子に共有結合しているか修飾されたファージ粒子と複合したファージキャプシドタンパク質との融合タンパク質である。
【０００９】
国際公開第９９／５５７２０号（特許文献４）も、標的遺伝子送達で使用される異種起源の標的タンパク質を外部に提示するように修飾したファージについて記載している。
【００１０】
しかし、前述の特許/特許出願はすべて、一般に遺伝子治療の目的で核酸を特定の細胞を標的として送達し得るようにファージ表面を修飾することを記載している。
【００１１】
多数の文献(Ishiura, M. et al, Molec. And Cell. Biol., p607-616, 1982（非特許文献３）; Aujame, L. et al, Biotechiques, 28 pl202-1213, 2000（非特許文献４）; Horst, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 72, p3531-3535, 1975（非特許文献５）; Jkayama and Dery, Molec. and Cell. Biol. 5, pll36-1142, 1985（非特許文献６）;及びSrivatsan, E. et al, 38, p227-234, 1984（非特許文献７）)が、哺乳類培養細胞に感染させ、タンパク質を発現させるためのファージの使用に関連している。しかし、これがインビボに適用し得るという示唆、あるいはワクチンの開発に使用できるという示唆はない。
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９８／０５３４４号
【特許文献２】米国特許第５，７３６，３８８号公報
【特許文献３】米国特許第６，０５４，３１２号公報
【特許文献４】国際公開第９９／５５７２０号
【非特許文献１】Leitner et al., Vaccine 18: 765-777,2000
【非特許文献２】Beard, CW & Mason PW., 1998. Nature Biotech. 16: 1325
【非特許文献３】Ishiura, M. et al, Molec. And Cell. Biol., p607-616, 1982
【非特許文献４】Aujame, L. et al, Biotechiques, 28 pl202-1213, 2000
【非特許文献５】Horst, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 72, p3531-3535, 1975
【非特許文献６】Jkayama and Dery, Molec. and Cell. Biol. 5, pll36-1142, 1985
【非特許文献７】Srivatsan, E. et al, 38, p227-234, 1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は前述の問題点の少なくとも１つを解消及び／または軽減することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１に、本発明は、表面が修飾されていないバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含む肝炎ワクチン製剤を提供する。ここで、バクテリオファージ粒子は、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体中で前記ポリペプチドに対する免疫応答が引き起こされるものである。
【００１５】
前述の開示例（例えば、国際公開第９８／０５３４４号、米国特許第５，７３６，３８８号公報、米国特許第６，０５４，３１２号公報及び国際公開第９９／５５７２０号参照）と異なり、本発明のバクテリオファージの表面は、ファージ表面に外来ペプチド／タンパク質（つまり、通常は存在しないペプチド／タンパク質）を含むようには修飾されておらず、特定の細胞タイプの表面レセプターに対しファージを標的とするように設計されていない。それ故、特定の細胞タイプの表面レセプターに対しファージを標的とするように設計せずに、外来ペプチド／タンパク質を含むようにバクテリオファージの表面を修飾してもよいという点は、理解される。
【００１６】
肝炎ワクチンは肝炎ウイルス、例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型またはＥ型、好ましくはＢ型のいずれかに対する予防接種に用いることが出来る。ＡＰ細胞の表面に発現及び提示された抗原は免疫応答を誘導できる他の肝炎タンパク質が発現されているにもかかわらず、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）のような表面抗原になる。
【００１７】
さらに、バクテリオファージは１個以上の肝炎抗原を発現するように設計され、例えば１個以上の肝炎型から抗原を発現することができる。
【００１８】
本発明者は高用量のバクテリオファージ粒子がより良好な免疫応答をもたらすことを観察している。したがって、好ましくは１０9個以上のバクテリオファージ、１０10個あるいは１０11個以上のバクテリオファージ粒子のような投与量が動物に投与される。
【００１９】
したがって、第２に、１０9個以上のバクテリオファージ粒子、各粒子の修飾されていない表面及び薬学的に許容し得る担体を含むワクチン製剤が提供され、上記バクテリオファージ粒子は生物体の抗原提示細胞の表面に発現及び提示し得るポリペプチドをコードする外来核酸分子を含み、その結果上記ポリペプチドに対する免疫応答が生物体で惹起される。
【００２０】
本発明者は、粒子表面に標的とするペプチドまたはリガンドを含むようには修飾されていないバクテリオファージがＡＰ細胞によって取り込まれることを観察した。このように、本発明のバクテリオファージは「異物」として認識され、従って、宿主免疫系によって通常の方法で処理されると考えられる。さらに、外来ペプチド／タンパク質（それは選択された哺乳類宿主中には通常存在しないペプチド／タンパク質である）をコードし得る外来核酸を含むようにバクテリオファージのゲノムを修飾することによって、この外来タンパク質への免疫応答が誘発される。従って、外来ペプチド／タンパク質をコードする核酸は（抗原提示細胞その他において）発現され、ＡＰ細胞の表面上に提示される。免疫応答は体液性（即ち抗体）及び／または細胞性免疫応答のいずれでもよい。
【００２１】
外来核酸は、天然には存在しないポリヌクレオチドに関するもので、異種起源のペプチドまたはタンパク質として（即ち、天然に存在するバクテリオファージ中では通常発現されないか生物学的に有意なレベルで発現されないペプチドまたはタンパク質として）発現され得るものである。発現されたペプチドまたはタンパク質は、ワクチンが接種された宿主において免疫応答を引き起こすのに十分なレベルで発現される。
【００２２】
第２点に従って本発明は、病原体の１種または複数のタンパク質に対して適切な免疫保護反応が惹起され得る限りにおいて、必ずしも肝炎に限らず実際上任意の感染症のワクチンの調製に適用できる点が理解されるべきである。適当な疾病の例は、疾病を引き起こす病原体そのものに対しての予防接種、あるいは、疾病を運ぶベクターに対する予防接種を含む。こうした病原体またはベクターは、ウイルス、バクテリア、真菌類、酵母、原虫類、寄生虫、昆虫及び感染性海綿状脳症を含む。本発明は、ヒト及び動物の両方の感染症に適用可能である。適当な疾病のリストは当業者にはよく知られており、その例は、「Ｏ．Ｉ．Ｅ．標準品のマニュアル及び診断試験」第３版(O.I.E. Manual of Standards and Diagnostic Tests 3rd Ed., OIE, Paris 1996), トップリー＆ウィルソン「細菌学・ウイルス学・免疫の原理」第８版(Topley & Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunity 8th Ed., Eds.Parker M.T. and Collier L.H., Vol. IV (Index), Edward Arnold, London 1990), Bell J.C.他著「人畜共通伝染病：動物から人への感染移行」（The Zoonoses: Infections Transmitted from Animals to Man. Bell J.C. et al., Edward Arnold, London 1988）及びNoble E.R.他著「寄生虫学：動物寄生虫の生物学」第６版(Parasitology: The Biology of Animal Parasites 6th Ed. Noble E.R. et al., Lea Febiger, Philadelphia, 1989.)に見ることができる。さらに、ワクチンタンパク質として癌細胞特異的抗原の発現による癌細胞に対する免疫応答を引き起こすために本発明を使用することができる。
【００２３】
従って、本発明は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を、例えば細胞中に存在する例えばヌクレアーゼから保護するため、安定なマトリックス内に封じ込める方法を提供する。バクテリオファージ表面の「外来」タンパク質は、特に抗原提示（ＡＰ）細胞への核酸の直接取り込みを可能にする。理論的に限定されるものではないが、バクテリオファージ粒子は外来抗原として認識されると予想される。粒子全体がこのように宿主免疫系の抗原提示細胞によって直接取り込まれ、タンパク質被覆が除去され、ＤＮＡが放出される。次いで、これが核に移動して発現される。このプロセスは、ワクチンＤＮＡの発現及びその後のポリペプチドの生産が、免疫応答を引き起こすのには最適のルートであるＡＰ細胞内でのみ起こるため効率的であると考えられる。
【００２４】
一般に、「ポリペプチド」という用語は、抗原活性を示す一連のアミノ酸またはその配列を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。ポリペプチドは、必要であれば、インビボで及び/またはインビトロで、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化及び/または翻訳後の開裂によって修飾されてもよく、従って特に、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質及び融合タンパク質が含まれる。当業者には当然理解されるであろうが、修飾されたポリペプチドは生理的機能（すなわち、免疫応答を引き起こす能力）を保持すべきである。
【００２５】
本発明のバクテリオファージは、好ましくは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び／またはその他同種のものなど、適切な転写／翻訳レギュレーターを含む。典型的には、プロモーターはＣＭＶ、ＳＶ（シミアンウイルス）４０、チミジンキナーゼ、ＲＳＶプロモーターその他の真核生物プロモーターでよい。プロモーターはコンスティテューティブプロモーターが便利である。しかし、当業者に既知の制御可能なプロモーターも使用してもよい。例えば、コンスティテューティブプロモーターと制御可能なプロモーターの制御下に外来核酸を含むコンストラクトを設計してもよい。このようにすれば、初めにコンスティテューティブプロモーターによって外来核酸の発現を誘導し、次の時点で制御可能なプロモーターを発現させ、それによって外来核酸の発現を引き起こすことができる。これによって、より強い免疫応答をもたらすこともできる。
【００２６】
多数の適当なバクテリオファージが当業者に知られている。適当なバクテリオファージの例はラムダ（λ）である。現在、バクテリオファージλは日常的なＤＮＡ操作手順でクローニングベクターとして使用されている。これらについては、ＤＮＡはファージ構造体とは別個に精製される。しかし、完全なλファージ粒子は、上に挙げた基準を満たす。すなわち、ＤＮＡは、宿主免疫系によって外来抗原として認識される保護タンパク質マトリックス内に包含される。ファージλは通常大腸菌に感染するため、そのＤＮＡは真核細胞では「不活性」、つまり、発現されないと考えられる。しかし、ＤＮＡが哺乳類細胞に取込まれた場合、対象とするワクチン（または外来）遺伝子の上流に真核生物プロモーターが組み込まれ、次いでその遺伝子が発現されるのであれば、抗原、つまり、タンパク質／ペプチドが生じるはずである。日常的なクローニングベクターとして広範囲に使用されているため、λには多数の変異体が存在し、その中には、哺乳類細胞での発現のために設計された強力な真核生物のプロモーターが含まれる。通常は、λベクターの関連部分は、さらに遺伝子操作を行なう前にプラスミドＤＮＡとして除去される。次いで、大腸菌宿主由来の高度に精製したプラスミドＤＮＡが、遺伝免疫のために使用される。しかし、真核生物のプロモーター及び対象とするワクチン（つまり、外来）遺伝子を含む完全なλファージ粒子を免疫のために使用する場合、それはＡＰ細胞によって取り込まれる。タンパク質被覆の除去に続いて、ＡＰ細胞内で直接に抗原が産生されると考えられ、抗原がＡＰ細胞の表面に提示されて免疫応答を引き起こす。この場合、免疫用ファージ粒子の調製に必要なのは最も基礎的な精製プロセスだけである。プラスミドクローニングベクターと比較して、λを使用するさらなる利点は、より大きなサイズの挿入断片を収容できるという点である。
【００２７】
他の適当なバクテリオファージも、当業者によく知られており、ｐ１ファージ、Ｔファージ（例えばＴ１〜Ｔ７）、Ｍｕ、ｆｄまたはＭ１３並びに繊維状ファージが含まれる。
【００２８】
本発明で好ましいバクテリオファージは、外来核酸及び関連するプロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び／または同様なものを、約0.5〜ｌ００キロ塩基の間に組み込む能力を有するものである。例えば、既知のラムダファージは、９〜５０キロ塩基の間に収容できる。このようにすれば、１個のペプチド／タンパク質または複数のペプチド／タンパク質の単一または多数のコピーを発現することが可能である。
【００２９】
典型的には、本発明のバクテリオファージは、選択された哺乳類の宿主の自然な細菌叢中で溶解成長(lytic growth)をしない。例えば、「研究室」ファージ株の多くは、非野生株である「研究室」細菌株にのみ感染できることが知られている。これに加え、またはこれに代えて、バクテリオファージは宿主の細菌株中でもインビトロでは溶解成長しないかインビトロでの生育にヘルパーファージを必要とする。従って、バクテリオファージは、例えば、アンバー変異、温度感受性変異などを含んでもよい。
【００３０】
ＡＰ細胞中で外来核酸の発現を増強するための手段が一般に提供されている。このような手段としては、核酸分解を最小限にすること及び／または核を標的とすることを支援する方法が挙げられる。このような手段の例としては、クロロキンまたは他のリソソーム／エンドソーム酵素異化阻害剤を使用して核酸分解を最小限にする方法、及び／または核移行シグナルを使用して核酸を核に移行させる方法が挙げられる。
【００３１】
ワクチン製剤は、バクテリオファージによって発現させるべきタンパク質源をさらに含んでもよい。このようにすれば、宿主は、タンパク質への１次的な免疫応答を誘発し、次いで、ＡＰ細胞の表面で発現され提示されたタンパク質によりさらに持続的な免疫応答を引き起こすことができる。
【００３２】
別の具体化では、ファージ粒子表面の抗原タンパク質を発現するためにファージを修飾してもよい。例えば、ベクター媒体として完全なバクテリオファージＭ１３粒子を使用することが可能である。Ｍ１３に対する挿入サイズはλに対するものよりも相当に小さいが、「ファージディスプレイ」法(Hawkins, RE et al. 1992, J. Mol. Biol. 226: 889)は、ファージ粒子が、その外殻タンパク質に融合させた外来抗原部分を媒介できることを意味している。従って、ワクチン遺伝子が原核生物プロモーター（例えばＬａｃ Ｚプロモーター）と真核生物プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の両方の制御を受けるようなコンストラクトを作成することができ、大腸菌宿主中で成長させた場合、原核生物プロモーターはワクチン抗原の発現を指示し、タンパク質複合体としてＭ１３外殻への組込みを可能にし、この結果、ワクチン後に強力な１次反応を誘導するはずである。次いで、ＡＰ細胞による取り込みに続いて、ＤＮＡが放出され、真核生物プロモーターがＡＰ細胞内部からのワクチン抗原の長期にわたる発現を指示し、強力な２次応答が維持されるであろう。
【００３３】
外来核酸は、免疫応答を増強することができるポリペプチドのような、少なくとも１つの別のポリペプチドをコードしてもよい。別のポリペプチドはサイトカインなどのアジュバントタンパク質やポリペプチドでもよく、例えばγインターフェロン（γＩＦＮ）のようなインターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ及び／または他のサイトカイン／ケモカインをコードするものでもよい。さらに、ＨｅｐＢコア抗原のような「ヘルパーエピトープ」が、Ｂ細胞を活性化し、かつ強いＴ細胞反応を誘導するために使用できる。あるいはまたはさらに、ＣｐＧオリゴジヌクレオチドなどの免疫刺激シグナルを使用してもよい。
【００３４】
バクテリオファージは、任意の適当な経路、例えば注入によって投与することができ、例えば、アンプルに入れて、または複数回分の投与量を容器に入れて単位用量形式(unit dosage form)で調製してもよい。バクテリオファージは、油性もしくは好ましくは水性媒体を用いた懸濁液、溶液または乳剤などの形でもよい。あるいは、バクテリオファージは凍結乾燥された形とし、投与の際に発熱性物質を含まない滅菌水などのような適当な媒体で再構成してもよい。この方法では、タンパク質、糖などの安定化剤をファージ粒子を凍結乾燥する際に加えてもよい。液状でも再構成される凍結乾燥形でも、注入溶液のｐＨを適切に調節するのに必要な量の薬剤、好ましくはバッファーを含む。非経口投与、特に、製剤を静脈内投与しようとする場合、溶質の総濃度は、製剤を等張性であるか低張性またはわずかに高張性であるように調整しなければならない。浸透圧の調節には糖のような非イオン性物質が好ましく、特にショ糖が好ましい。これらの形のうちのいずれでも、さらにデンプンまたは糖、グリセリンまたは食塩水などの適当な調整剤を含んでもよい。組成物は、液体でも固体でも、単位用量あたりバクテリオファージ材料を0.1％から９９％まで含む。
【００３５】
好ましい実施態様では、ワクチンはアジュバントを含んでもよい。一般にアジュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を強化する物質を含む。多種多様なアジュバントが当業者に知られている。アジュバントの例としては、フロイント(Freund)完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、リポソーム及び、国際公開第９０／１１０９２号に記載されているようなニオソーム(niosome)、鉱物油及び非鉱物油ベースの油中水型乳剤アジュバント、サイトカイン、短い免疫刺激ポリヌクレオチド配列（例えば、Sato Y. et al. (1996) Science Vol. 273pp. 352-354; Krieg A.M. (1996) Trends in Microbial. 4pp. 73-77Sato Y. et al. (1996) Science Vol. 273pp. 352-354; Krieg A.M. (1996) Trends in Microbial. 4pp. 73-77に記載されているようなＣｐＧジヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。
【００３６】
バクテリオファージはいわゆる「媒体」と結合させてもよい。媒体は共有結合することなくバクテリオファージが付着することができる化合物または基質である。典型的な「媒体」化合物は、金粒子、ガラスなどのシリカ粒子などを含む。従って、本発明のバクテリオファージはバイオリスティック(biolistic)な方法を使用して生物体に導入してもよい。例えば、被覆された金粒子を使用する高速衝撃法(high-velocity bombard method)が文献に記載されている(Williams R.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88pp. 2726-2730; Fynan E.F. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90pp. 11478-11482)。
【００３７】
さらに、ワクチンは１種類またはそれ以上の適当な界面活性化合物または乳化剤、例えばスパン(Span)またはトゥイーン(Tween)を含んでもよい。
【００３８】
本発明のワクチンの投与態様は、患者に本発明の免疫保護量のウイルスを送達するものであれば任意の適当なルートによるものでよい。しかし、ワクチンは、筋肉内または深い皮下ルート経由で好ましくは非経口的に投与される。必要であれば、経粘膜(例えば経直腸、経口、経鼻、経膣)投与で、または他の腸管外ルート経由、すなわち、皮内、鼻腔内または静脈内などの他の投与態様も使用できる。経鼻投与のための製剤を開発してもよいし、アジュバントとして例えばキトサンを含んでもよい(Nat. Medicine 5(4) 387-92, 1999)。
【００３９】
しかし、任意の特定のレシピエント生物体に対する具体的投与量は、年齢、一般的な健康状態及び性別、投与時間、投与ルート、投与されている他の薬との相乗効果及び求められている保護の程度を含む様々な要因に依存することが理解されるであろう。もちろん、必要ならば、投与は適当な間隔で繰り返すことができる。
【００４０】
従って、本発明は、別の面では、ヒトまたは動物にここに記述されるようなワクチン製剤の有効量を投与して予防的かつ／または治療的に免疫する方法を提供する。ここで、有効量はヒト及び／または動物において免疫応答を誘発可能な量である。
【００４１】
さらに、生物体の抗原提示細胞の表面に発現及び提示し得るポリペプチドをコードする外来核酸分子を含むバクテリオファージ粒子の使用が提供され、その結果上述のポリペプチドに対する免疫応答が、特定の疾患に対する予防接種のワクチン製造のための生物体において惹起される。
【００４２】
好ましくは、予防接種される疾患は肝炎、例えばＢ型肝炎である。
好ましくは、単位用量当たりの薬剤は１０10個あるいは１０11個以上のような１０10個以上のバクテリオファージ粒子を含む。
【００４３】
本発明を実施例の方法ならびに以下に示す図を参照して述べる。
図１は本発明に従って設計されたラムダファージを作成するために用いたｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）ベクターの概要図を示す；
図２はマウスに投与した様々な肝炎コンストラクトのＥＬＩＳＡ反応の時間経過の図表を示す；
図３は図２に示したデータのグループ平均を描いている図表を示す；
図４は国際標準品との比較によってマウス血清中の抗ＨＢｓ濃度測定の図表を示す；及び
図５はＥＬＩＳＡで測定した時の、λ−ＨＢｓＡｇ（Ａ〜Ｄ）及び組換えＨＢｓＡｇ（Ｅ＋Ｆ）で予防接種したウサギにおけるＨＢｓＡｇ（白丸、左側目盛り）及び全バクテリオファージ（黒四角、右側目盛り）に対する抗体反応を示す。ウサギＡ〜Ｄは０、９、１５及び２７週にλ−ＨＢｓＡｇで予防接種した（矢印で示した）。ウサギＥとＦは０及び２７週に組替えＨＢｓＡｇで予防接種した。ＨＢｓＡｇプレートに対しモノクローナル抗体（クローンＮＦ５、Aldevron）を１：50,000の希釈で用い、一方マウスのポリクローナル抗血清（１：５００）をファージ−被覆プレートに対して用いた。各血清サンプルからのシグナルは種々のプレート間で相対シグナルを比較できるようにこの標準のシグナルに対して標準化した。
【実施例】
【００４４】
実施例：Ｂ型肝炎に対するバクテリオファージを介した免疫
ＨｅｐＢｓバクテリオファージベクターの作成−λＨｅｐＢｓ
ラムダファージへのＨｅｐＢ発現カセットのクローニング。
プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（ｐＣＭＶ−Ｓ）（Aldeveron）（図１を参照）をλ−ｇｔ１１（Stratagene）のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。ｐＣＭＶ−ＳベクターにはＥｃｏＲＩサイトはないが、矛盾の無い（compatible）粘着末端を与えるＭｆｅＩサイトがある。ＭｆｅＩサイトはプラスミド上１６０番目の塩基に存在し、一方サイトメガロウイルス真核生物プロモーターは２０６番目の塩基にあるので、この酵素による１ヶ所の切断は発現カセットを妨げない。
【００４５】
プラスミド（１μｇ／μｌを１６ｍｌ）ＤＮＡをメーカー推奨バッファー中２０単位のＭｆｅＩ（New England Biolabs）を用い３７℃、２時間で消化した。消化の成功は１％アガロースゲルで１ｍｌの消化物を電気泳動することにより確認した。
消化したプラスミドＤＮＡは次にフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。消化物は蒸留水で２００μｌの最終容積にした。等容積のフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（３５：３４：１）（Fisher Biosciences UN2821）を加え、混合しフェーズロックチューブ（Eppendorf 0032 007.953）中マイクロフュージを用い13000ｒｐｍで回転させた。それから上部の水層を除き、同チューブ中当容積のクロロフォルムで抽出した。
【００４６】
抽出後、水層を新しいチューブに移し、最終濃度が0.3Ｍになるように２２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた。２倍量の氷冷エタノールを加え、チューブを混合し−２０℃で終夜貯蔵した。それからチューブを13000ｒｐｍで回転し、上澄み液を別の容器に移し７５０μｌの氷冷７０％エタノールを加えた。チューブを13000ｒｐｍで２分間遠心した。上澄み液を除き痕跡のアルコールを完全に除くためチューブを逆さにして１０〜１５分間放置した。それからペレットを１５μｌの滅菌蒸留水に再度懸濁させた。
【００４７】
抽出したＤＮＡは１％アガロースゲルで１μｌを電気泳動し、ＯＤ２６０／２８０比をチェックすることにより純度を調べた。
この精製ＤＮＡとStratagene由来のＥｃｏＲＩで消化した子牛腸管アルカリホスファターゼ処理λ−ｇｔ１１（カタログ番号234211）を用いてライゲーションを行った。２μｌのラムダＤＮＡ（0.5μｇ／μｌ）を既に９０ｎｇ／μｌに希釈された1.5μｌの消化プラスミドに加えた。ｇｔ１１はおよそ４３ｋｂで挿入断片はおよそ5.6ｋｂなので、１μｌのｇｔ１１及び１３５ｎｇの挿入断片の使用は１：１のモル比となる。３ＵのＤＮＡリガーゼ（Promega M1801）と適切なバッファーを加え容積を蒸留水で１０μｌとした。対照ライゲーションも用い、それは挿入ＤＮＡの替わりに1.5μｌの水を加えた他には上述したようにセットアップした。ライゲーションは４℃で終夜インキュベートして行った。
【００４８】
ライゲーション後、１μｌのライゲーション混合物を挿入断片がしかるべき所にあることを確認するためにライゲーションさせていないラムダＤＮＡと一緒にアガロースゲルで電気泳動を行った。ライゲーション後いずれのサイトも存在しないので、挿入断片はＥｃｏＲＩあるいはＭｆｅＩ消化によって除去されず、全体のサイズ差が確認に用いられた。
ライゲーションしたＤＮＡをPromega lambda packagene system（cat. K3154）を用いてインビトロでパッケージした。上述したようにライゲーション反応物と対照反応物の５μｌを２５μｌのpackagene抽出物に加えた。packagene kitより供給されたポジティブコントロールＤＮＡを用いて３番目の反応をセットアップした。いずれの反応も室温で３時間インキュベートするために放置した。インキュベーション後反応を停止させるために２２５μｌのファージバッファー（packageneの使用説明書を参照）を加え12.5μｌのクロロフォルムを加えた。チューブを良く混ぜ白色沈殿物を沈殿させた。澄んだ上澄み液はパッケージされたファージを含む。
【００４９】
packageneマニュアルに述べられたプロトコールを用いてパッケージされたファージを滴定した。簡単に述べると、ファージバッファー中でファージを連続希釈し（１：1000、１：10000）それぞれの希釈液１００μｌを指数関数的な発育期のE. coli LE392の１００μｌに加えた（３７℃で前もって暖めた新鮮な培地１：１００で新たに終夜生育させ、ＬＥ３９２を指数期とし３７℃で2.5時間振ることにより生育させる）。細胞とファージをよく混合し３７℃で３０分間インキュベートした。それから３ｍｌのＴＢ ｔｏｐ ａｇａｒ（１ｇのバクト−トリプトース、0.5ｇのＮａｃｌ、１００ｍｌの水中0.8ｇの寒天−オートクレーブ、６０℃に冷却し１ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4を加える）を４８℃で細胞／ファージに加え、良く混合しその後３７℃に前もって暖められたＬＢ−寒天プレート上に注いだ。
【００５０】
終夜インキュベーション後プラーク数を数えた。挿入断片とのライゲーション由来のパッケージされたファージのプレートは挿入断片の無いコントロールよりも１５０〜２００倍のカウントであった。計算したパッケージング効率は4.2×１０6組み換え体／μｇ ＤＮＡであった。
【００５１】
６個のポジティブクローンと２個のネガティブクローンを選び、標準法（Sambrookら、1989年、分子クローニング：実験マニュアル。Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y.）により小スケールのファージ増幅を行った。その後これら８個の精選ファージのサンプルを上述したようにＸ−ｇａｌとＩＰＴＧの存在下Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ１−ｂｌｕｅ ｃｅｌｌ上で培養した。ｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトへの挿入断片はｌａｃＺ遺伝子を妨害するので、クローン中の挿入断片の存在を確認するために青／白のカラー選択を用いた。挿入断片を有するファージは白いプラークを与え、一方挿入断片の無いファージは青いプラークを与えた。挿入断片を有するプレートから選択した６個のファージ中５個が青のプラークを与え、これらの１つをその後の研究に選んだ。
【００５２】
最終的に挿入断片の存在を確認するために、Promega Wizard lambda DNA抽出キット（カタログ番号A7290）を用いて選択したファージクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。ｐＣＭＶ−ｓプラスミドに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。λ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩクローニングサイトのいずれかの側に位置する他のプライマーをクローニングサイト全域で配列を決定するために用い、さらに挿入断片の存在を確認するために用いた。
【００５３】
それから多様性の低い標準的な大量スケールの液体培養（Sambrookら、1989年、分子クローニング：実験マニュアル。Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y.）をその後のＤＮＡ予防接種試験のためのファージ（λＨｅｐＢｓ）の大量製造に用いた。
【００５４】
予防接種のプロトコール
それぞれ１０匹のマウスを含む８群について検討した。
マウス群は以下の通り：
（１）ネガティブコントロール。非発現バクテリオファージ（λｃＩ857）を筋肉内投与により免疫した。
（２）ポジティブコントロール。組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）で免疫した。
（３）‘裸‘のＤＮＡによる予防接種のポジティブコントロール。サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＲＣ／ＣＭＶ−ＨＢｓ［Ｓ］）のコントロール下ＨｅｐＢ表面抗原を発現するプラスミドで免疫した。
（４）サイトメガロウイルスプロモーター（λＨｅｐＢｓ）のコントロール下ＨｅｐＢ表面抗原を発現するバクテリオファージλ。経口／鼻腔内投与、バクテリオファージは粘膜アジュバントキトサンとの複合体として与えた。
（５）λＨｅｐＢｓ、リポソームと組み合わせて筋肉注射した。
（６）λＨｅｐＢｓ、オイルを主体としたアジュバント（モンタニド２０６）で筋肉注射した。
（７）λＨｅｐＢｓ、アジュバント無しＳＭバッファーのみで筋肉注射した。
（８）λＨｅｐＢｓ、真空乾燥したバクテリオファージ粒子を皮膚に投与するためBio-Rad Helios圧縮窒素ガス‘遺伝子銃‘を用いて皮内／皮下免疫を行った。
ワクチンの製造と免疫のプロトコール：２週毎にマウスから採血した。０及び３週にマウスに予防接種した。予防接種に先立ち、ハロタンを吸入させマウスを麻酔した（グループ８を除いて）。
【００５５】
予防接種法：
グループ１〜３及びグループ５〜７（筋肉内投与免疫）。前けい骨筋への到達を容易にするため後肢を剃った。皮膚にサンプルを注射するため２７Ｇ×３／４インチの針を用いた。針の先は前けい骨粗面の約３ｍｍ外側。針先は３ｍｍ挿入し、サンプル（プラスミドＤＮＡ、ファージあるいは組替えＨｅｐＢ表面抗原［ＨＢｓＡｇ］）を約１０秒かけてゆっくりと注射した。針は約５〜１０秒そのままにし、その後ゆっくりと引き抜いた。
【００５６】
ワクチン製造：
グループ３：プラスミドＤＮＡは0.5ｍｇ／ｍｌの濃度でエンドトキシンを含まないホスフェートバッファー食塩水（ＰＢＳ）に含まれ、１匹当たり５０μｌ（２５μｇＤＮＡ／マウス）を用いた。
【００５７】
グループ２：エンドトキシンを含まない５０μｌのＰＢＳ中１μｇの組換えＨＢｓＡｇをマウスに注射した。
【００５８】
グループ１及び７：バクテリオファージはＳＭバッファー（１リットル当たり；塩化ナトリウム5.8ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２ｇ、１ｍトリス−塩酸（ｐＨ7.5）５０ｍｌ、２％ゲラチン溶液５ｍｌ）中１×１０13個プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌの濃度で投与した。５×１０11個ファージ／マウスの用量に等価のファージ５０μｌを注射した。
【００５９】
グループ５：マウス当たり；２×１０11個のファージ（５μｇのＤＮＡに等価）を陽イオン性脂質のトランスフェクタム（Promega）で被覆して投与した。製造：２０μｌのファージ（ＳＭバッファー中）を２０μｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウムに加えた。１０ｍｌ中１０μｌのトランスフェクタムを加え、溶液を混合し上述したように筋肉内投与する３時間前に１０分間放置した。注射量は５０μｌ／マウス。
【００６０】
グループ６：ＳＭバッファー中２×１０13個／ｍｌの濃度で２５μｌのファージを等容量のモンタニド２０６オイルアジュバント（Seppic、Paris、France）と混合し、各マウスに５０μｌのワクチン（５×１０11個ファージ／マウス）を筋肉内投与し免疫した。
【００６１】
グループ４（経口／鼻腔内投与免疫）：１０μｌの１％キトサン（［Ｆｌｕｋａ、媒体分子量］、１％酢酸中１０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌのＳＭバッファー中１×１０13個のファージに滴下して貯蔵用に調整した。投与に先立ち、懸濁液を暫時かき混ぜた。マウスが麻酔から意識を回復し始めた時に、ギルソン型ピペットを用いて５μｌの滴量を各鼻孔に投与した。
【００６２】
グループ８（遺伝子銃）：ファージ粒子を送達させるためにＢｉｏ−Ｒａｄ Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃を用いた。１０μｌのＳＭバッファー中１０11個のファージ粒子を遺伝子銃プラスチックチューブカートリッジに移し、−７０℃で凍らせ、それから終夜凍結乾燥した。各マススの腹部を剃り１回の免疫当たり１匹のマウス当たり５００ｐｓｉの圧力で１回の発射で投与した。
【００６３】
採血スケジュール：
１群１０匹のマウス、
マウス１〜２は０、２、４及び６週に採血、
マウス３〜４は０、２、４、６及び７週に採血、
マウス５〜６は０、２、４、６及び８週に採血、
マウス７〜８は０、２、４、６、８及び９週に採血、
マウス８〜９は０、２、４、６、８及び１０週に採血。
各時点ですべてのマウスから採血していないので、このことから図２におけるマウス採血のギャップが説明される。
【００６４】
結果
ＥＬＩＳＡにより測定したＨＢｓＡｇに対する抗体反応。
各群で個々のマウスについて抗体反応の時間経過を測定した。種々のプレート間の標準化を行うために個々のＥＬＩＳＡプレートには抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体の１：50,000の希釈液を含む（結果は各図表の関連部分に‘コントロール’値として示す）。図３は図２で示したデータの群平均を示す。
【００６５】
有意な抗体反応がグループ２（組換えＨｅｐＢｓ）とグループ５〜７（それぞれリポソーム、モンタニド及びアジュバント無しによるλＨｅｐＢｓ）で観察された。他のグループでは反応は見られないかごく僅か観察された。（グループ４の見かけの増加はすべての採血に影響したＥＬＩＳＡプレートの非特異的なエッジ効果であり、これが繰り返された。）。
【００６６】
マウスにおける抗ＨｅｐＢ表面抗原反応を定量化するために、最後の採血は国際標準品と比較した（Bio-Rad Monolisa抗ＨＢｓ標準品カタログ番号72399）。間接ＥＬＩＳＡによってマウス血清の１：１０希釈を調べた。プレートを0.2Ｍの炭酸ナトリウムコーティングバッファー中ｐＨ9.6で１００μｌ／ウェルのＨＢｓ（１μｇ／ｍｌ）で被覆した。プレートは被覆するために室温で終夜放置した。
【００６７】
一夜インキュベーション後、プレートを一度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎですすぎ、ＰＢＳ−ｗｅｅｎ中５％のMarvelスキムミルクの粉末をウェル当たり２００μｌ加え、非結合サイトをブロックするために室温で３０分間放置した。
【００６８】
それからブロック溶液を除きブロッキングバッファー中マウス１次抗血清の１：１０希釈の１００μｌを加え、ブロック溶液単独をネガティブコントロールとして用いた。標準品はウェル当たり１００μｌを加えるとの条件で用いた。例外として１ｍＩＵ／ｍｌ（ミリ国際単位／ｍｌ）の標準品は１０ｍＩＵ／ｍｌの標準品をＰＢＳ中１：１０に希釈することにより作成した。それから室温で2.5時間プレートをインキュベートした。
【００６９】
インキュベーション後、１次血清サンプルを除きプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。その後２次抗血清を加えた。セイヨウワサビペロキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ社カタログ番号A-8667）の１：５００希釈液をウェル当たり１００μｌ加えた。提供された国際標準品はヒトＩｇＧであったので、２次抗体として抗ヒト血清を用いた。試験したサンプルはマウス血清であったが、マウス血清で得られた数値は実際の値よりも低いにもかかわらず、両者を検出するためのＨＲＰ標識２次抗体にとってマウス及びヒトの免疫グロブリン間に十分な交差反応性のあることが期待された。２次抗体でプレートを室温で1.5時間インキュベートした。
【００７０】
その後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでプレートを洗浄し、ウェル当たりSigma Fast OPD展開溶液（カタログ番号P9187）の２００μｌ/ウェルを加え展開した。プレートを１５分間展開し、その後３Ｍの硫酸５０μｌ／ウェルを加え反応を止めた。自動プレート読み取り装置（４９２ｎｍ）でプレートを測定した。
【００７１】
選択した結果を図４に示す。
リポソーム中λＨｅｐＢｓで免疫したマウス（グループ５、マウス４）の血清の１：１０希釈液は17.5ｍＩＵ／ｍｌに等価の反応を示し、一方コントロールのｐＲＣ／ＣＭＶ−ＨＢｓ［Ｓ］で免疫したマウスは2.5ｍＩＵ／ｍｌに等価の反応を示した。保護のための認められた国際濃度は血清の１０ｍＩＵ／ｍｌで、λＨｅｐＢｓによる免疫は保護に対して認められた国際濃度よりも大きな抗体価（１：１０希釈で）をもたらしたことを示している。さらなる例は；グループ６（λＨｅｐＢｓプラスモンタニド）マウス５、１６ｍＩＵ／ｍｌ＠１：１０希釈、及びグループ７（λＨｅｐＢｓのみ）マウス８、１４ｍＩＵ／ｍｌ＠１：１０希釈。抗体濃度は無希釈マウス血清を用いて試験した時よりも高いと予想される。試験サンプルにおいて１次マウス血清に対して抗ヒト２次抗体が用いられているので（むしろ特異的抗マウスＨＲＰ複合体よりも）、これらの結果はおそらく実際の抗体価よりも表示不足していることが認められる。
【００７２】
実施例２：Ｂ型肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫に関するさらなる実験
ウサギの免疫
食塩水バッファー中２×１０11個ファージ／ｍｌ（４×１０10個ファージ、２μｇＤＮＡ／ウサギ）の濃度で筋肉内投与した２００μｌのλ−ＨＢｓＡｇでウサギに予防摂取した。ファージワクチンを０、９、１５及び２７週に投与した。組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ−Aldevron）を投与したウサギには０及び２７週に２５μｇ／ｍｌ（５μｇタンパク質／ウサギ）の濃度で２００μｌの食塩水バッファー中タンパク質を筋肉内投与した。ウサギから定期的に採血し、抗体反応をＥＬＩＳＡにより定量した。
【００７３】
抗体反応のＥＬＩＳＡ測定
組換えＨＢｓＡｇまたはバクテリオファージλコートタンパク質に対する抗体反応を間接ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇの精製ＨＢｓＡｇ（Aldevron）あるいは１０9個のバクテリオファージ（５０ｎｇ）／ウェルのいずれかで0.05Ｍの炭酸ナトリウムバッファー中ｐＨ9.2で終夜被覆した。その後コーティングバッファーを除き、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中５％のＭａｒｖｅｌ乾燥スキムミルク）を３７℃で３０分間加えた。その後ブロッキングバッファーを除き、ブロッキングバッファー中１：５０の希釈で１００μｌ／ウェルの１次抗体を加え、プレートを４℃で終夜インキュベートした。それからプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５回洗浄し、抗ウサギセイヨウワサビペロキシダーゼ標識２次抗体（ＤＡＫＯ）をメーカーの推奨希釈で３７℃で１時間で加えた。その後プレートをＰＢＳ−Ｔｅｅｎ中で５回洗浄し、２００μｌ／ウェルの基質（SIGMA Fast-OPD錠）を加え、プレートを暗所で５分間（ファージプレート）及び３０分間（ＨＢｓＡｇプレート）展開した。５０μｌ／ウェルの３Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４９２ｎｍで光学濃度を測定した。ＥＬＩＳＡプレートの最初のウェルにブロッキングバッファー中１００μｌの希釈１次抗体（推定力価に依存して１：１０〜１：５０）を加え、プレートの１２カラムすべてを１：１に連続希釈することにより反応を停止させた。各血清サンプルに対するエンドポイントの力価を計算するためにＯＤ492NM＝0.2のカットオフ値を用いた。
【００７４】
結果
マウス以外の動物での免疫反応を調べ、追加の予防接種がより一貫した反応を与えるかどうかを明らかにするために、４羽のウサギをλ−ＨＢｓＡｇレポーターコンストラクトで免疫し、２羽を組換えＨＢｓＡｇタンパク質で免疫した。注射間の間隔を大きく取り、初期の実験での２羽に比べて全部で４羽（λ−ＨＢｓＡｇ）または２羽（組換えＨＢｓＡｇ）に投与し、１〜３週毎に採血した。組換えＨＢｓＡｇに対しＥＬＩＳＡによって抗体価を測定した(図５)。λ−ＨＢｓＡｇの２回の予防接種後、ファージをコードしたＨＢｓＡｇワクチン抗原に対し矛盾する反応が再度見られた。λ−ＨＢｓＡｇを接種した４羽のウサギの内１羽がＨＢｓＡｇに対して有意な反応を示し（図５Ｄ）、一方残る３羽は低レベルのゆるやかな増加を示した。これらの割合はλ−ＥＧＦＰによる２回の予防接種後観察された割合と類似していた（即ち、レポーターファージワクチンによる２回の予防接種後動物の２５％がＥＧＦＰに対し反応を示す）。しかし３回の予防接種後、いずれのウサギも組替えＨＢｓＡｇタンパク質による１回の予防接種により誘導される反応に匹敵するかあるいは有意に増加した過剰な抗ＨＢｓＡｇ反応を示した(図５)。λ−ＨＢｓＡｇによる４回の予防接種は１羽で抗ＨＢｓＡｇ力価の顕著な増加（図５Ｃ）を、他の３羽に低強度のよりゆるやかな増加をもたらした。組換えＨＢｓＡｇを投与したグループでは、２回目の予防接種は２羽でＨＢｓＡｇ抗体価の上昇をもたらしたが、この強度は特にこのグループの他のウサギ（ウサギＦ）で観察された力価に比較して、またはλ−ＨＢｓＡｇを予防接種したグループに比べた時非常に弱いＨＢｓＡｇ抗体価を示すウサギ５Ｅで低かった。この反応の矛盾は以前にＨＢｓＡｇについて報告されている（Alper, C. A., Kruskall, M. S., Marcus-Bagley, D., Craven, D. E., Katz, A. J., Brink, S. J., Dienstag, J. L., Awdeh, Z., and Yunis, E. J. Ｂ型肝炎ワクチンに対する無反応の遺伝的予測N. Engl. J. Med. 1989; 321: 708-712）。
【００７５】
ＨＢｓＡｇ抗体反応のエンドポイントでの滴定はλ−ＨＢｓＡｇで予防接種したウサギ（力価は０週で１：１０であった）に対して２２週後１：１２０〜１：６４０の間であった、一方これらのウサギ（組換えλ−ＨＢｓＡｇを投与された）に対して同じ時点で１：１６０（ウサギＥ）と１：６００（ウサギＦ）の力価が観察された。λファージコートタンパク質に対する最初の予防接種後λ−ＨＢｓＡｇで予防接種されたすべてのウサギで高い抗体反応が観察され、このことはこの高い抗ファージ反応がその後のファージ予防接種の有効性を阻害しなかった（図５Ａ〜Ｄ）ことを示している。２２週での抗ファージ反応は４羽いずれにとってもエンドポイントの滴定は１：50,000のオーダーであった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に従って設計されたラムダファージを作成するために用いたｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）ベクターの概要図を示す。
【図２ａ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ１（ネガティブコントロールファージ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｂ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ２（ＨｅｐＢタンパク質）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｃ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ３（ＨｅｐＢプラスミドコントロール）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｄ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ４（経口／キトサンＨｅｐＢファージ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｅ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ５（ＨｅｐＢファージ＋リポソーム）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｆ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ６（モンタニド／ラムダＨｅｐＢ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｇ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ７（ＰＢＳ中ＨｅｐＢファージ）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図２ｈ】ＨｅｐＢ抗原に対するグループ８（ＤＮＡ銃／ＨｅｐＢ予防接種）のＥＬＩＳＡ反応を示す。
【図３】Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）に対する反応のＥＬＩＳＡによるグループ平均を示す。
【図４】国際標準との比較によるマウス血清中抗ＨＢｓ濃度の測定結果を示す。
【図５】ウサギＡ〜Ｆについて、ＥＬＩＳＡで測定した時の、λ−ＨＢｓＡｇ（Ａ−Ｄ）及び組換えＨＢｓＡｇ（Ｅ＋Ｆ）で予防接種したＨＢｓＡｇ（白丸、左側目盛り）及び全バクテリオファージ（黒四角、右側目盛り）に対する抗体反応を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が修飾されていないバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、バクテリオファージ粒子が、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体において前記ポリペプチドに対する免疫応答を引き起こす肝炎ワクチン製剤。
【請求項２】
Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、及び／またはＥ型肝炎に対する予防接種において使用する請求項１に記載の肝炎ワクチン。
【請求項３】
抗原提示細胞の表面に発現及び提示された抗原が肝炎表面抗原である請求項１または２に記載の肝炎ワクチン。
【請求項４】
バクテリオファージが１個以上の肝炎抗原を発現するように設計された先行するいずれかの請求項に記載の肝炎ワクチン。
【請求項５】
各粒子の表面が修飾されていない１０9個以上のバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、バクテリオファージ粒子が、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体において前記ポリペプチドに対する免疫応答を引き起こすワクチン製剤。
【請求項６】
体液性及び／または細胞性免疫応答を誘導することができる先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
ウイルス、バクテリア、真菌類、酵母、原生動物、寄生虫、昆虫または伝染性海綿状脳症に対する予防接種において使用する請求項５に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
癌細胞特異的抗原の発現によって癌細胞に対する免疫応答を誘導すべく使用する請求項５に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
バクテリオファージが、ポリペプチドの発現を促進するための転写レギュレーター及び／または翻訳レギュレーターを含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
ＣＭＶ、ＳＶ４０、チミジンキナーゼ、またはＲＳＶプロモーターのような真核生物プロモーターを含む請求項９に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
コンスティテューティブプロモーター及び制御可能なプロモーターの制御下外来核酸を含む請求項９に記載のワクチン製剤。
【請求項１２】
バクテリオファージが、ラムダ（λ）、ｐ１ファージ、Ｔファージ、Ｍｕ、ｆｄ、Ｍ１３、または繊維状ファージである先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
バクテリオファージが、１個のポリペプチドの単一コピーもしくは多重コピーまたは複数のポリペプチドを発現し得るものである先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
バクテリオファージが、選択された哺乳類宿主の自然な細菌叢において溶解成長しない先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
リソソーム／エンドソームの酵素的異化阻害剤及び／または核移行シグナルをさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
バクテリオファージによって発現されるポリペプチドをさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１７】
ファージ粒子表面のポリペプチドを発現するようにバクテリオファージが修飾されている先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１８】
外来核酸が免疫応答を増強させ得るポリペプチドをもコードする先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１９】
さらにアジュバントを含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項２０】
バクテリオファージが媒体と結合している先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項２１】
ヒトまたは動物における疾病の予防及び／または治療において使用される先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１】
表面が修飾されていないバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、バクテリオファージ粒子が、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体において前記ポリペプチドに対する免疫応答を引き起こす肝炎ワクチン製剤。
【請求項２】
Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、及び／またはＥ型肝炎に対する予防接種において使用する請求項１に記載の肝炎ワクチン。
【請求項３】
抗原提示細胞の表面に発現及び提示された抗原が肝炎表面抗原である請求項１または２に記載の肝炎ワクチン。
【請求項４】
バクテリオファージが１個以上の肝炎抗原を発現するように設計された先行するいずれかの請求項に記載の肝炎ワクチン。
【請求項５】
各粒子の表面が修飾されていない１０9個以上のバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、バクテリオファージ粒子が、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体において前記ポリペプチドに対する免疫応答を引き起こすワクチン製剤。
【請求項６】
体液性及び／または細胞性免疫応答を誘導することができる先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
ウイルス、バクテリア、真菌類、酵母、原生動物、寄生虫、昆虫または伝染性海綿状脳症に対する予防接種において使用する請求項５に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
癌細胞特異的抗原の発現によって癌細胞に対する免疫応答を誘導すべく使用する請求項５に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
バクテリオファージが、ポリペプチドの発現を促進するための転写レギュレーター及び／または翻訳レギュレーターを含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
ＣＭＶ、ＳＶ４０、チミジンキナーゼ、またはＲＳＶプロモーターのような真核生物プロモーターを含む請求項９に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
コンスティテューティブプロモーター及び制御可能なプロモーターの制御下外来核酸を含む請求項９に記載のワクチン製剤。
【請求項１２】
バクテリオファージが、ラムダ（λ）、ｐ１ファージ、Ｔファージ、Ｍｕ、ｆｄ、Ｍ１３、または繊維状ファージである先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
バクテリオファージが、１個のポリペプチドの単一コピーもしくは多重コピーまたは複数のポリペプチドを発現し得るものである先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
バクテリオファージが、選択された哺乳類宿主の自然な細菌叢において溶解成長しない先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
リソソーム／エンドソームの酵素的異化阻害剤及び／または核移行シグナルをさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
バクテリオファージによって発現されるポリペプチドをさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１７】
ファージ粒子表面のポリペプチドを発現するようにバクテリオファージが修飾されている先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１８】
外来核酸が免疫応答を増強させ得るポリペプチドをもコードする先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項１９】
さらにアジュバントを含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項２０】
バクテリオファージが媒体と結合している先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【請求項２１】
ヒトまたは動物における疾病の予防及び／または治療において使用される先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図２ｈ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図２ｈ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５０３８６０（Ｐ２００６−５０３８６０Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４０９６７（Ｐ２００４−５４０９６７）
【出願日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４２６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３０６９４
【国際公開日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【出願人】（５０３３４５３０７）モアダン・リサーチ・インスティテュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４２６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３０６９４
【国際公開日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【出願人】（５０３３４５３０７）モアダン・リサーチ・インスティテュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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