肝炎予防治療剤
【課題】新たな肝炎予防治療剤の提供。
【解決手段】Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶又はその抽出物を含有する肝炎予防治療剤。
【解決手段】Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶又はその抽出物を含有する肝炎予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
肝炎は、急性肝炎、劇症肝炎、遅発性肝不全(ＬＯＨＦ：ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｉｌｕｒｅ)、慢性肝炎に分類される肝臓の炎症性疾患であり、種々の原因によって発症する。肝炎を原因によって分類すれば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等のウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎等に分類される。
【背景技術】
【０００２】
肝炎の症状は発熱、黄疸、全身倦怠感などが主症状であり、Ｃ型肝炎等においては慢性肝炎を経て肝硬変や肝臓癌になるケースが多い。
【０００３】
肝炎の治療薬としては、食事療法、インターフェロン投与、肝保護薬、ステロイド剤等が挙げられる。また、最近、茶カテキンの活性酸素種消去活性、抗酸化作用に着目して、種々の報告がされている。例えば、茶カテキンの肝臓癌に対する作用として、鉄代謝の改善による慢性Ｃ型肝炎の改善効果（非特許文献１）、アテローム性動脈硬化症感受性マウス肝臓の抗脂質酸化作用の亢進（非特許文献２）、慢性肝炎・肝硬変における肝炎活動の抑制（非特許文献３）、アルコール性脂肪性肝炎による肝障害の抑制（非特許文献４）、ヒト肝ガン細胞に対する増殖抑制効果（非特許文献５）などが報告されている。また、カテキン類による肝臓への脂肪蓄積抑制（特許文献１）、過剰鉄起因肝臓障害の予防・治療（特許文献２）、顕著な肝機能の低下抑制・改善（特許文献３）などが知られている。
【非特許文献１】肝臓，Ｖｏｌ．４７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２），Ａ４１２（２００６）
【非特許文献２】Ｊ．Ｏｌｅｏ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．５４（１２），６４１−６４８（２００５）
【非特許文献３】臨床と研究，Ｖｏｌ．８１（９），１５４９−１５５２（２００４）
【非特許文献４】Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 消化器，Ｖｏｌ．２００４，３３２−３３６（２００４）
【非特許文献５】生活科学研究誌，Ｖｏｌ．１２，３９−４７（２００３）
【特許文献１】特開２００５−１７９２７７号公報
【特許文献２】特開２００３−２１２７８０号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の茶カテキンの肝炎に対する予防治療作用は十分でなく、より強い肝炎予防治療作用を有する植物由来の成分が望まれていた。
従って本発明は、安全性が高い植物成分由来であって、より薬理作用の優れた肝炎予防治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者らは、後発酵茶に着目して種々検討し、ある特定量の水分を茶に含浸させ、糸状菌を接種して生育させたところ、ＳＯＤ活性が著しく高い後発酵茶が得られた。そして、当該ＳＯＤ活性の高い後発酵茶を用いて肝炎モデルにおける肝炎予防治療効果を検討したところ、この後発酵茶を投与すれば強力な肝炎予防治療効果が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶又はその抽出物を含有する肝炎予防治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の後発酵茶又はその抽出物の肝炎予防治療効果は強力であり、特に非アルコール性脂肪性肝炎に有効である。また、本発明で用いる後発酵茶又はその抽出物は安全性が高く、長期間飲用又は服用が可能であることから、特に慢性肝炎への移行の防止又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いる後発酵茶の原料としての茶は、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種であれば、特に品種等には限定されない。また、収穫直後の生茶葉、殺青後の茶葉、粗揉後の茶葉、揉捻後の茶葉、中揉後の茶葉、精揉後の茶葉、荒茶等の緑茶であっても、茶茎、茶花及びこれらの粉末品等の加工品等であっても、さらに半発酵茶、完全発酵茶も使用可能であり、原料となる茶は後発酵茶の用途により、適宜選択可能である。このうち、不発酵茶を用いることが、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から好ましい。
【０００９】
これらの茶の発酵に用いられる微生物は、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から糸状菌であるのが好ましい。糸状菌としては、醸造食品や発酵食品等の食品に使用可能な糸状菌の中から選抜することが可能である。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等を使用することができ、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられ、さらには該糸状菌から誘導される変異株であっても使用することができる。これらを単独で若しくはそれらを組合せて使用してもよい。これらの菌株は、ＩＦＯ、ＩＡＭ、ＡＴＣＣ、ＮＲＲＣ等の菌株分譲機関、日本醸造協会や市販の種菌株販売会社等から入手可能である。
【００１０】
本発明に用いる後発酵茶の製法においては、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上、好ましくは１５０重量部以上、より好ましくは２００重量部以上、最適には３００〜４００重量部の水を加える。ここでの水分量の調整は原料となる茶に、水を加え、馴染ませ、糸状菌が生育できる条件にすることを意味する。例えば、荒茶を使用した場合、該荒茶はすでに約３〜５重量％の水分を既に含んでおり、加える水分量は、茶が含んでいる水分を考慮して調整する必要がある。また、生茶葉のように水分を７０〜８０重量％含んでいるものについては、加水しなくても良い。上記の水分含量は、培養・発酵に用いる糸状菌が繁殖又は発酵可能な量であり、かつ本発明の高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得るために重要である。該糸状菌を優先的に繁殖させることで、雑菌汚染をより防止することができる。該水分調整後に、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うことが挙げられる。該殺菌後は、冷却し、該茶を殺菌済み培養・発酵槽に移し、下記の植菌工程を行う。なお、該殺菌工程は、茶の水分量が変化しないように密閉系で行うのが好ましい。
【００１１】
水分含量を調整した茶に、糸状菌を接種し、一般に２０〜４０℃で３〜３０日間、好ましくは２５〜３７℃で３〜７日間培養・発酵する。ここで培養・発酵方法は、通常用いられる方法であれば、液体培養・発酵法、固体培養・発酵法等いずれの方法でも良い。次いで、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うこと、又は、８０〜１２０℃で加熱乾燥し該糸状菌を殺菌するとともに、水分含量を１０重量％以下、好ましくは５重量％以下にする。これにより、本発明のＳＯＤ活性の高い後発酵茶が製造される。
【００１２】
本発明の後発酵茶は、そのままの形態でも利用可能であるが、加熱、乾熱、マイクロ波等で殺菌を行い、さらに粉砕後、粉末、ペーストの形で、あるいは溶媒を用いて抽出し、後発酵茶抽出物として利用できる。さらに、当該後発酵茶抽出物を、スプレードライヤー、ドラムドライヤー、フリーズドライヤー、エアードライヤー等を用いて乾燥し、粉末化を行うことで、後発酵茶抽出物末とすることができる。また、必要に応じて造粒機等を用いて顆粒品とすることができる。
【００１３】
上記抽出の際に用いる溶媒としては、水又は炭素数１〜６のアルコール類を単独で若しくはこれら溶媒の２つ以上の組合せが使用でき、例えば水、エタノール、含水エタノール等が挙げられる。好ましくは水単独、若しくは含水エタノールより好ましくは水とエタノールの０〜９５：１００〜５の混合物（ｖ／ｖ）が使用できる。
抽出条件としては、約２０〜７０℃で０．１〜５時間抽出し、ろ過を行い、さらに得られたろ液を８０〜９５℃で３０分間の条件で加熱処理を行い、冷却することが好ましい。
上記抽出物は、適宜、不活性な不純物を除去するため、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の分離・精製方法によって、さらに精製してもよい。具体的には、抽出物末を上記抽出溶媒を用いて再度抽出することが挙げられる。
【００１４】
上記の製造方法により得られた後発酵茶又はその抽出物は、抗酸化活性の一つの指標であるＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り２，０００ｕｎｉｔｓ以上、好ましくは８，０００ｕｎｉｔｓ以上、より好ましくは９，０００ｕｎｉｔｓ以上、さらに好ましくは９，０００〜５００，０００ｕｎｉｔｓ有する。例えば、原料としての茶に緑茶を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを用いて本発明の製造方法にて製造した後発酵茶は、ＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り９，０００ｕｎｉｔｓ以上を有している。
【００１５】
優れたＳＯＤ活性を有する上記の後発酵茶又はその抽出物は、後記実施例に示すように、肝炎モデルの一つである非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）モデルに対して優れた予防治療効果を有する。具体的には、肝炎の指標であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ：Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）値、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ：Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）値及びヒアルロン酸値を顕著に回復させた。また、肝臓ミトコンドリア由来の活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）産生量を低下させた。さらに肝臓の病理学的組織も改善する効果を有する。従って、前記後発酵茶又はその抽出物は、種々の前記肝炎、例えば急性肝炎、慢性肝炎、各種ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎等の予防治療剤として有用である。
【００１６】
本発明の肝炎予防治療剤は、医薬として、また特定保健用食品、機能性食品等として使用することができる。これらの医薬の投与形態としては、経口、注射、外用等が挙げられるが、経口投与形態が好ましい。経口用医薬及び食品の形態としては、アンプル、カプセル、丸剤、錠剤、粉末、顆粒、固形、液剤、ゲル、気泡等の他、各種食品中に配合することもできる。これらの組成物の調製にあたっては、賦形剤、結合剤、滑沢剤等を適宜配合することができる。これらの医薬及び食品への前記後発酵茶又はその抽出物の配合量は、固形分（乾燥重量）換算で０．０００１〜２０重量％、０．０１〜１０重量％が好ましく、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【００１７】
本発明の肝炎予防治療剤の投与量は、特に制限されないが、成人１日あたり後発酵茶又はその抽出物の固形分（乾燥重量）として、１０〜５，０００ｍｇ、さらに５０〜１，０００ｍｇ、特に１００〜５００ｍｇが好ましく、これらの量は１回又は数回に分けて投与してもよい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１９】
［参考例１］
緑茶（荒茶）５００ｇを１００重量部としてそれぞれ０重量部、５０重量部、７０重量部、８０重量部、１００重量部、２００重量部、３００重量部、３５０重量部、４００重量部、５００重量部、７００重量部の水を加え、混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶葉を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み５ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養した後、乾燥させ、後発酵茶を得た。該後発酵茶に５，０００ｍＬの５０％（体積／体積）エタノールを添加し、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い得られた、ろ液を固形分３０％（重量／体積）まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶抽出物を得た。該後発酵茶抽出物に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学社製）を用いてＳＯＤ活性を測定し、後発酵茶固形分当たりに換算した。結果を表１に示す。
【００２０】
ＳＯＤ活性の測定は以下の通り行った。まず、試料となる後発酵茶抽出物を蒸留水で希釈し、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、０．０３７５ｍｇ／ｍＬ、０．００７５ｍｇ／ｍＬ、及び０．００３７５ｍｇ／ｍＬになるようにサンプル溶液を調製した。このサンプル溶液を９６ｗｅｌｌ プレートの各ｗｅｌｌに２０μＬずつ分注した。次に、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに同封されているＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調製したＷＳＴ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬずつ加えよく混合した。さらに、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに付属のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調整したＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬずつマルチチャンネルピペットにて加え、プレートリーダー中で３７℃、２０分間インキュベートし、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。尚、各々にはＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの代わりに付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いたブランクを設けた。さらに、サンプル溶液の代わりに蒸留水を用いたコントロール及びそのブランクを設けた。測定した吸光度から、「スーパーオキシド」と「ＷＳＴ−１」から「ＷＳＴ−１ ｆｏｒｍａｚａｎ」が生成される反応の阻害率を求め、さらにサンプルのＩＣ50値（単位：ｇ／ｍＬ）を算出した。
また、サンプル溶液の代わりにＳＯＤ標準品を用い、ＳＯＤ濃度と阻害率の関数にて検量線を作成した。作成した検量線から、ＳＯＤのＩＣ50値（単位：ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を算出した。
上記の「サンプルのＩＣ50値」及び「ＳＯＤのＩＣ50値」からサンプルのＳＯＤ活性を算出した。計算式は以下の通りである。
（サンプルのＳＯＤ活性 単位：ｕｎｉｔｓ／ｇ）＝（ＳＯＤのＩＣ50値）÷（サンプルのＩＣ50値）
【００２１】
【表１】
【００２２】
表１より、水添加量２００〜５００重量部の範囲で高いＳＯＤ活性を、３００〜４００重量部でより高いＳＯＤ活性を示すことがわかる。
【００２３】
また、得られた後発酵茶抽出物を皮膚に塗布したところほとんど刺激性がなかった。また、味も渋味が低く良好であった。
【００２４】
また、同様の方法で、従来から飲用されている後発酵茶のＳＯＤ活性を測定した結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
表２より、本発明の後発酵茶が、従来の後発酵茶に比べて高いＳＯＤ活性を有することがわかる。
【００２７】
［参考例２］
緑茶（荒茶）５００ｇに、１，７５０ｍＬの水を加え混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み４ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵させた。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶４８６ｇを得た。次いで、該後発酵茶に、５，０００ｍＬの水を添加し、５０℃で１時間、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い得られた、ろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶水抽出物を得た。得られた後発酵茶水抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶水抽出物末を得た（１０８ｇ）。得られた後発酵茶水抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、２０，０６２ｕｎｉｔｓ（後発酵茶水抽出物末１ｇ当たり８０，２３８ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００２８】
［実施例１］
実験的に調整された脂肪肝担持ラットに対し、酸化ストレス（ＯＳ：Ｏｘｇｅｎ Ｓｔｒｅｓｓ）を負荷し、生体内低酸素状態を形成させることにより、ＮＡＳＨの生化学的・病理組織学的特徴を有するＮＡＳＨ病態モデルラットを作出できるが、脂肪肝担持ラットに対し酸化ストレスを負荷すると同時に、後発酵茶水抽出物を投与した後、該ラットの血液の生化学検査、肝臓ミトコンドリアのＲＯＳ量のＥＳＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法による定量及び肝臓組織の病理組織学観察を行うことにより、脂肪肝からＮＡＳＨへの病態の進行に対する、後発酵茶水抽出物の予防効果を評価した。
【００２９】
（１）実施方法
実験動物として、６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１８０−２００ｇ／匹）を用いた。動物はポリプロピレン不透明ケージ（Ｗ２２０×Ｌ３２０×Ｈ１３５、夏目製作所社製）内で２〜３匹ずつ飼育した。飼育室は、湿度４０〜５０％、室温２０〜２５℃に維持し、１２時間の明暗サイクル（点灯；ＡＭ８：００、消灯；ＰＭ８：００）に設定した。
【００３０】
脂肪肝作成のため、４週間、自由摂取にてコリン欠乏食（ＣＤＨＦ：Ｃｈｏｌｉｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｉｇｈ−Ｆａｔ Ｆｏｏｄ、オリエンタル酵母社製）を与えた。その後も、病態維持のため実験終了までＣＤＨＦを与えた。
ＯＳを負荷し生体内低酸素状態を形成させ、ＮＡＳＨ病態を作出するため、上記脂肪肝担持ラットに対し、生理食塩水に溶解させた亜硝酸ナトリウムを３０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、６週間にわたり腹腔内投与した。投与期間中は２週間ごとに尾静脈から採血し、病態の確認を行い、病態の進行状況に問題がないことを確認した。
【００３１】
ＮＡＳＨに対する後発酵茶水抽出物の有効性評価のため、上記亜硝酸ナトリウム投与群に対し、同時に後発酵茶水抽出物（参考例２で得たもの）を１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、又は、２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、６週間にわたりゾンデにて強制経口投与した。投与期間終了後、犠牲死させ、該ラットの血液の生化学検査及び肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳの定量を行い、肝臓組織の病理組織学的変化を観察した。
【００３２】
なお、本実験は、（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）、（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）、（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）に群分けし、各群６匹（ｎ＝６）とした。
【００３３】
血漿中ＡＳＴ、ＡＬＴ値はトランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）にて測定した。血漿中ヒアルロン酸値はヒアルロン酸測定キット（生化学工業株式会社）にて測定した。
【００３４】
肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ量測定は以下の手順で行った。すなわち、肝臓試料は、下大静脈より１．１５％塩化カリウム溶液（５ｍＭベンズアミジン含む）にて灌流後、採取した。肝臓組織１ｇに対し３ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュークロース、０．１Ｍ塩化カリウム含む）を加え、ホモジナイズした後、３,０００×ｇ（１０分間、４℃）で遠心分離し、上清を得た。次いで、この上清を９,０００×ｇ（２０分間、４℃）で遠心分離し、沈殿物を１ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュークロース、０．１Ｍ塩化カリウム含む）にて２回遠心洗浄し、ミトコンドリア画分を得た。該画分１４．２８ｍｇに対し、１ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュークロース、０．１Ｍ塩化カリウム含む）を加え、溶解し、試料溶液とした。この時の濃度はミトコンドリアのタンパク量に換算すると、５００μｇ／ｍＬに相当する。
【００３５】
上記試料溶液３５μｌ、０．１％ｄｏｄｅｃｙｌ ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、５ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｔｅ、５ｍＭ ｍａｌａｔｅ及び２００ｍＭ ｓｕｃｃｉｎａｔｅを含む溶液２５μｌ、４．６Ｍ ５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ）溶液２０μｌ及び２ｍＭ ＮＡＤＨ溶液２０μｌの合計１００μｌを、３７℃で５分間インキュベーションした後、直ちにＥＳＲ測定装置（ＪＥＳ−ＲＥＩＸ／ＨＲ、日本電子株式会社製）にて、本溶液のＲＯＳ量を常温で測定した。測定に当たり、あらかじめｃａｖｉｔｙ内に挿入されたＭｎＯのＭｎ2+をラジカルの計算基準とした。ラジカル発生量はＭｎ2+のｍａｘｉｍｕｍ ｍｅｔｅｒ ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｒ）に対するミトコンドリア試料（ｈｓ）のそれとの比、即ち、ＥＳＲ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ｈｓ／ｈｒ）で算定した。
【００３６】
統計学的処理として、全ての結果は平均値±標準誤差で示した。得られたデータは一元配置分散分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ、ＡＮＯＶＡ）後、Ｔｕｒｋｅｙの多重比較検定法を用いて統計学的処理を行った。２群間の比較にはＳｔｕｄｅｎｔｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、危険率５％以下を優位差有りと判定した。
【００３７】
（２）実験結果
投与期間終了後、犠牲死させ、該ラットの血液の生化学的検査、肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ量、肝臓組織の病理組織学的変化を観察した結果を以下に示す。
【００３８】
（２）−１ 生化学検査
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２５±２ ＩＵ／Ｌから２２０±３８ ＩＵ／Ｌに上昇。
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２１±２ ＩＵ／Ｌから４７±２ ＩＵ／Ｌに上昇。
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍＬ）は９５±１２ｍｇ／ｍＬから２０５±２７ｍｇ／ｍＬに上昇。
本結果から、酸化ストレスによって脂肪肝からＮＡＳＨへ進行している事が明らかに認められた。
【００３９】
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２１±２ ＩＵ／Ｌから１５７±２ ＩＵ／Ｌに上昇。
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２２±２ ＩＵ／Ｌから３５±２ ＩＵ／Ｌに上昇。
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍＬ）は１１９±１４ｍｇ／ｍＬから１８４±１５ｍｇ／ｍＬに上昇。
本結果から、酸化ストレスによって誘導される脂肪肝からのＮＡＳＨへの進行が、後発酵茶水抽出物粉末１０ｍｇ／ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。
【００４０】
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２１±３ ＩＵ／Ｌから８８±９ ＩＵ／Ｌに上昇。
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２２±２ ＩＵ／Ｌから２８±２ ＩＵ／Ｌに上昇（正常値に回復）。
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍＬ）は１１９±１５ｍｇ／ｍＬから１０２±１１ｍｇ／ｍＬに低下（正常値に回復）。
本結果から、酸化ストレスによって誘導される脂肪肝からのＮＡＳＨへの進行が、後発酵茶水抽出物粉末２００ｍｇ／ｋｇ（体重）投与により大幅に改善される傾向が認められた。
【００４１】
（２）−２ 肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生値（シグナル相対強度）
ＯＳ負荷前のシグナル相対強度０．７±０．１に対し、
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）：１．０±０．１
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）：０．８±０．１
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）：０．５±０．１
であった。
本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生量が、後発酵茶水抽出物粉末投与により濃度依存的に低下する傾向が認められた。
【００４２】
（２）−３ ヘマトキシリン・エオジン染色による肝臓組織の観察
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行い、大滴脂肪の沈着状態を観察し、下記結果を得た。
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
多くの大滴性の脂肪滴及び大きな肝細胞配列の乱れ有り。
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
中程度の大滴性の脂肪滴及び中程度の肝細胞配列の乱れ有り。
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
小程度大滴性の脂肪滴及び小程度の肝細胞配列の乱れ有り。
本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における大滴性の脂肪滴増大及び肝細胞配列の乱れ増大が、後発酵茶水抽出物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【００４３】
（２）−４ マッソン・トリクローム染色による肝臓組織の観察
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきマッソン・トリクローム染色を行い、膠原線維の線維化状態を観察し、下記結果を得た。
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
門脈域から中心静脈域の架橋形成が生じ偽小葉形成が認められた。
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
軽度の門脈域から中心静脈域の架橋形成が認められた。
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
門脈域と中心静脈周囲に繊維化が認められるが、架橋形成は認められない。
本結果から、脂肪肝よりＮＡＳＨへの進行に伴って増大する肝臓組織における架橋形成及び繊維化増大が後発酵茶水抽出物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【００４４】
（２）−５ ベルリン・ブルー染色による肝臓組織の観察
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきベルリン・ブルー染色を行い、鉄イオン沈着状態を観察し、下記結果を得た。
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
門脈域から中心静脈域に大きな鉄の沈着が認められた。
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
門脈域から中心静脈域に軽度の鉄の沈着が認められた。
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
鉄の沈着は殆んど認められなかった。
本結果から、脂肪肝よりＮＡＳＨへの進行に伴って増大する肝臓組織における鉄の沈着増大が、後発酵茶水抽出物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【００４５】
［製剤例１］
次の処方により、顆粒を製造した。
後発酵茶エキス末（参考例２） ３５０（質量部）
乳糖 ４７０
結晶セルロース １５０
ヒドロキシプロピルセルロース ３０
【００４６】
［製剤例２］
次の処方により、湿式造粒し、打錠して錠剤を得た。
後発酵茶エキス末（参考例２） ３５０（質量部）
乳糖 ４７０
結晶セルロース １４０
ヒドロキシプロピルセルロース ３０
ステアリン酸マグネシウム １
タルク ９
【技術分野】
【０００１】
肝炎は、急性肝炎、劇症肝炎、遅発性肝不全(ＬＯＨＦ：ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｉｌｕｒｅ)、慢性肝炎に分類される肝臓の炎症性疾患であり、種々の原因によって発症する。肝炎を原因によって分類すれば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等のウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎等に分類される。
【背景技術】
【０００２】
肝炎の症状は発熱、黄疸、全身倦怠感などが主症状であり、Ｃ型肝炎等においては慢性肝炎を経て肝硬変や肝臓癌になるケースが多い。
【０００３】
肝炎の治療薬としては、食事療法、インターフェロン投与、肝保護薬、ステロイド剤等が挙げられる。また、最近、茶カテキンの活性酸素種消去活性、抗酸化作用に着目して、種々の報告がされている。例えば、茶カテキンの肝臓癌に対する作用として、鉄代謝の改善による慢性Ｃ型肝炎の改善効果（非特許文献１）、アテローム性動脈硬化症感受性マウス肝臓の抗脂質酸化作用の亢進（非特許文献２）、慢性肝炎・肝硬変における肝炎活動の抑制（非特許文献３）、アルコール性脂肪性肝炎による肝障害の抑制（非特許文献４）、ヒト肝ガン細胞に対する増殖抑制効果（非特許文献５）などが報告されている。また、カテキン類による肝臓への脂肪蓄積抑制（特許文献１）、過剰鉄起因肝臓障害の予防・治療（特許文献２）、顕著な肝機能の低下抑制・改善（特許文献３）などが知られている。
【非特許文献１】肝臓，Ｖｏｌ．４７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２），Ａ４１２（２００６）
【非特許文献２】Ｊ．Ｏｌｅｏ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．５４（１２），６４１−６４８（２００５）
【非特許文献３】臨床と研究，Ｖｏｌ．８１（９），１５４９−１５５２（２００４）
【非特許文献４】Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 消化器，Ｖｏｌ．２００４，３３２−３３６（２００４）
【非特許文献５】生活科学研究誌，Ｖｏｌ．１２，３９−４７（２００３）
【特許文献１】特開２００５−１７９２７７号公報
【特許文献２】特開２００３−２１２７８０号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の茶カテキンの肝炎に対する予防治療作用は十分でなく、より強い肝炎予防治療作用を有する植物由来の成分が望まれていた。
従って本発明は、安全性が高い植物成分由来であって、より薬理作用の優れた肝炎予防治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者らは、後発酵茶に着目して種々検討し、ある特定量の水分を茶に含浸させ、糸状菌を接種して生育させたところ、ＳＯＤ活性が著しく高い後発酵茶が得られた。そして、当該ＳＯＤ活性の高い後発酵茶を用いて肝炎モデルにおける肝炎予防治療効果を検討したところ、この後発酵茶を投与すれば強力な肝炎予防治療効果が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶又はその抽出物を含有する肝炎予防治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の後発酵茶又はその抽出物の肝炎予防治療効果は強力であり、特に非アルコール性脂肪性肝炎に有効である。また、本発明で用いる後発酵茶又はその抽出物は安全性が高く、長期間飲用又は服用が可能であることから、特に慢性肝炎への移行の防止又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いる後発酵茶の原料としての茶は、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種であれば、特に品種等には限定されない。また、収穫直後の生茶葉、殺青後の茶葉、粗揉後の茶葉、揉捻後の茶葉、中揉後の茶葉、精揉後の茶葉、荒茶等の緑茶であっても、茶茎、茶花及びこれらの粉末品等の加工品等であっても、さらに半発酵茶、完全発酵茶も使用可能であり、原料となる茶は後発酵茶の用途により、適宜選択可能である。このうち、不発酵茶を用いることが、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から好ましい。
【０００９】
これらの茶の発酵に用いられる微生物は、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から糸状菌であるのが好ましい。糸状菌としては、醸造食品や発酵食品等の食品に使用可能な糸状菌の中から選抜することが可能である。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等を使用することができ、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられ、さらには該糸状菌から誘導される変異株であっても使用することができる。これらを単独で若しくはそれらを組合せて使用してもよい。これらの菌株は、ＩＦＯ、ＩＡＭ、ＡＴＣＣ、ＮＲＲＣ等の菌株分譲機関、日本醸造協会や市販の種菌株販売会社等から入手可能である。
【００１０】
本発明に用いる後発酵茶の製法においては、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上、好ましくは１５０重量部以上、より好ましくは２００重量部以上、最適には３００〜４００重量部の水を加える。ここでの水分量の調整は原料となる茶に、水を加え、馴染ませ、糸状菌が生育できる条件にすることを意味する。例えば、荒茶を使用した場合、該荒茶はすでに約３〜５重量％の水分を既に含んでおり、加える水分量は、茶が含んでいる水分を考慮して調整する必要がある。また、生茶葉のように水分を７０〜８０重量％含んでいるものについては、加水しなくても良い。上記の水分含量は、培養・発酵に用いる糸状菌が繁殖又は発酵可能な量であり、かつ本発明の高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得るために重要である。該糸状菌を優先的に繁殖させることで、雑菌汚染をより防止することができる。該水分調整後に、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うことが挙げられる。該殺菌後は、冷却し、該茶を殺菌済み培養・発酵槽に移し、下記の植菌工程を行う。なお、該殺菌工程は、茶の水分量が変化しないように密閉系で行うのが好ましい。
【００１１】
水分含量を調整した茶に、糸状菌を接種し、一般に２０〜４０℃で３〜３０日間、好ましくは２５〜３７℃で３〜７日間培養・発酵する。ここで培養・発酵方法は、通常用いられる方法であれば、液体培養・発酵法、固体培養・発酵法等いずれの方法でも良い。次いで、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うこと、又は、８０〜１２０℃で加熱乾燥し該糸状菌を殺菌するとともに、水分含量を１０重量％以下、好ましくは５重量％以下にする。これにより、本発明のＳＯＤ活性の高い後発酵茶が製造される。
【００１２】
本発明の後発酵茶は、そのままの形態でも利用可能であるが、加熱、乾熱、マイクロ波等で殺菌を行い、さらに粉砕後、粉末、ペーストの形で、あるいは溶媒を用いて抽出し、後発酵茶抽出物として利用できる。さらに、当該後発酵茶抽出物を、スプレードライヤー、ドラムドライヤー、フリーズドライヤー、エアードライヤー等を用いて乾燥し、粉末化を行うことで、後発酵茶抽出物末とすることができる。また、必要に応じて造粒機等を用いて顆粒品とすることができる。
【００１３】
上記抽出の際に用いる溶媒としては、水又は炭素数１〜６のアルコール類を単独で若しくはこれら溶媒の２つ以上の組合せが使用でき、例えば水、エタノール、含水エタノール等が挙げられる。好ましくは水単独、若しくは含水エタノールより好ましくは水とエタノールの０〜９５：１００〜５の混合物（ｖ／ｖ）が使用できる。
抽出条件としては、約２０〜７０℃で０．１〜５時間抽出し、ろ過を行い、さらに得られたろ液を８０〜９５℃で３０分間の条件で加熱処理を行い、冷却することが好ましい。
上記抽出物は、適宜、不活性な不純物を除去するため、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の分離・精製方法によって、さらに精製してもよい。具体的には、抽出物末を上記抽出溶媒を用いて再度抽出することが挙げられる。
【００１４】
上記の製造方法により得られた後発酵茶又はその抽出物は、抗酸化活性の一つの指標であるＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り２，０００ｕｎｉｔｓ以上、好ましくは８，０００ｕｎｉｔｓ以上、より好ましくは９，０００ｕｎｉｔｓ以上、さらに好ましくは９，０００〜５００，０００ｕｎｉｔｓ有する。例えば、原料としての茶に緑茶を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを用いて本発明の製造方法にて製造した後発酵茶は、ＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り９，０００ｕｎｉｔｓ以上を有している。
【００１５】
優れたＳＯＤ活性を有する上記の後発酵茶又はその抽出物は、後記実施例に示すように、肝炎モデルの一つである非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）モデルに対して優れた予防治療効果を有する。具体的には、肝炎の指標であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ：Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）値、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ：Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）値及びヒアルロン酸値を顕著に回復させた。また、肝臓ミトコンドリア由来の活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）産生量を低下させた。さらに肝臓の病理学的組織も改善する効果を有する。従って、前記後発酵茶又はその抽出物は、種々の前記肝炎、例えば急性肝炎、慢性肝炎、各種ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎等の予防治療剤として有用である。
【００１６】
本発明の肝炎予防治療剤は、医薬として、また特定保健用食品、機能性食品等として使用することができる。これらの医薬の投与形態としては、経口、注射、外用等が挙げられるが、経口投与形態が好ましい。経口用医薬及び食品の形態としては、アンプル、カプセル、丸剤、錠剤、粉末、顆粒、固形、液剤、ゲル、気泡等の他、各種食品中に配合することもできる。これらの組成物の調製にあたっては、賦形剤、結合剤、滑沢剤等を適宜配合することができる。これらの医薬及び食品への前記後発酵茶又はその抽出物の配合量は、固形分（乾燥重量）換算で０．０００１〜２０重量％、０．０１〜１０重量％が好ましく、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【００１７】
本発明の肝炎予防治療剤の投与量は、特に制限されないが、成人１日あたり後発酵茶又はその抽出物の固形分（乾燥重量）として、１０〜５，０００ｍｇ、さらに５０〜１，０００ｍｇ、特に１００〜５００ｍｇが好ましく、これらの量は１回又は数回に分けて投与してもよい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１９】
［参考例１］
緑茶（荒茶）５００ｇを１００重量部としてそれぞれ０重量部、５０重量部、７０重量部、８０重量部、１００重量部、２００重量部、３００重量部、３５０重量部、４００重量部、５００重量部、７００重量部の水を加え、混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶葉を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み５ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養した後、乾燥させ、後発酵茶を得た。該後発酵茶に５，０００ｍＬの５０％（体積／体積）エタノールを添加し、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い得られた、ろ液を固形分３０％（重量／体積）まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶抽出物を得た。該後発酵茶抽出物に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学社製）を用いてＳＯＤ活性を測定し、後発酵茶固形分当たりに換算した。結果を表１に示す。
【００２０】
ＳＯＤ活性の測定は以下の通り行った。まず、試料となる後発酵茶抽出物を蒸留水で希釈し、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、０．０３７５ｍｇ／ｍＬ、０．００７５ｍｇ／ｍＬ、及び０．００３７５ｍｇ／ｍＬになるようにサンプル溶液を調製した。このサンプル溶液を９６ｗｅｌｌ プレートの各ｗｅｌｌに２０μＬずつ分注した。次に、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに同封されているＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調製したＷＳＴ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬずつ加えよく混合した。さらに、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに付属のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調整したＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬずつマルチチャンネルピペットにて加え、プレートリーダー中で３７℃、２０分間インキュベートし、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。尚、各々にはＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの代わりに付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いたブランクを設けた。さらに、サンプル溶液の代わりに蒸留水を用いたコントロール及びそのブランクを設けた。測定した吸光度から、「スーパーオキシド」と「ＷＳＴ−１」から「ＷＳＴ−１ ｆｏｒｍａｚａｎ」が生成される反応の阻害率を求め、さらにサンプルのＩＣ50値（単位：ｇ／ｍＬ）を算出した。
また、サンプル溶液の代わりにＳＯＤ標準品を用い、ＳＯＤ濃度と阻害率の関数にて検量線を作成した。作成した検量線から、ＳＯＤのＩＣ50値（単位：ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を算出した。
上記の「サンプルのＩＣ50値」及び「ＳＯＤのＩＣ50値」からサンプルのＳＯＤ活性を算出した。計算式は以下の通りである。
（サンプルのＳＯＤ活性 単位：ｕｎｉｔｓ／ｇ）＝（ＳＯＤのＩＣ50値）÷（サンプルのＩＣ50値）
【００２１】
【表１】
【００２２】
表１より、水添加量２００〜５００重量部の範囲で高いＳＯＤ活性を、３００〜４００重量部でより高いＳＯＤ活性を示すことがわかる。
【００２３】
また、得られた後発酵茶抽出物を皮膚に塗布したところほとんど刺激性がなかった。また、味も渋味が低く良好であった。
【００２４】
また、同様の方法で、従来から飲用されている後発酵茶のＳＯＤ活性を測定した結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
表２より、本発明の後発酵茶が、従来の後発酵茶に比べて高いＳＯＤ活性を有することがわかる。
【００２７】
［参考例２］
緑茶（荒茶）５００ｇに、１，７５０ｍＬの水を加え混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み４ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵させた。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶４８６ｇを得た。次いで、該後発酵茶に、５，０００ｍＬの水を添加し、５０℃で１時間、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い得られた、ろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶水抽出物を得た。得られた後発酵茶水抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶水抽出物末を得た（１０８ｇ）。得られた後発酵茶水抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、２０，０６２ｕｎｉｔｓ（後発酵茶水抽出物末１ｇ当たり８０，２３８ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００２８】
［実施例１］
実験的に調整された脂肪肝担持ラットに対し、酸化ストレス（ＯＳ：Ｏｘｇｅｎ Ｓｔｒｅｓｓ）を負荷し、生体内低酸素状態を形成させることにより、ＮＡＳＨの生化学的・病理組織学的特徴を有するＮＡＳＨ病態モデルラットを作出できるが、脂肪肝担持ラットに対し酸化ストレスを負荷すると同時に、後発酵茶水抽出物を投与した後、該ラットの血液の生化学検査、肝臓ミトコンドリアのＲＯＳ量のＥＳＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法による定量及び肝臓組織の病理組織学観察を行うことにより、脂肪肝からＮＡＳＨへの病態の進行に対する、後発酵茶水抽出物の予防効果を評価した。
【００２９】
（１）実施方法
実験動物として、６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１８０−２００ｇ／匹）を用いた。動物はポリプロピレン不透明ケージ（Ｗ２２０×Ｌ３２０×Ｈ１３５、夏目製作所社製）内で２〜３匹ずつ飼育した。飼育室は、湿度４０〜５０％、室温２０〜２５℃に維持し、１２時間の明暗サイクル（点灯；ＡＭ８：００、消灯；ＰＭ８：００）に設定した。
【００３０】
脂肪肝作成のため、４週間、自由摂取にてコリン欠乏食（ＣＤＨＦ：Ｃｈｏｌｉｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｉｇｈ−Ｆａｔ Ｆｏｏｄ、オリエンタル酵母社製）を与えた。その後も、病態維持のため実験終了までＣＤＨＦを与えた。
ＯＳを負荷し生体内低酸素状態を形成させ、ＮＡＳＨ病態を作出するため、上記脂肪肝担持ラットに対し、生理食塩水に溶解させた亜硝酸ナトリウムを３０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、６週間にわたり腹腔内投与した。投与期間中は２週間ごとに尾静脈から採血し、病態の確認を行い、病態の進行状況に問題がないことを確認した。
【００３１】
ＮＡＳＨに対する後発酵茶水抽出物の有効性評価のため、上記亜硝酸ナトリウム投与群に対し、同時に後発酵茶水抽出物（参考例２で得たもの）を１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、又は、２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、６週間にわたりゾンデにて強制経口投与した。投与期間終了後、犠牲死させ、該ラットの血液の生化学検査及び肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳの定量を行い、肝臓組織の病理組織学的変化を観察した。
【００３２】
なお、本実験は、（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）、（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）、（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）に群分けし、各群６匹（ｎ＝６）とした。
【００３３】
血漿中ＡＳＴ、ＡＬＴ値はトランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）にて測定した。血漿中ヒアルロン酸値はヒアルロン酸測定キット（生化学工業株式会社）にて測定した。
【００３４】
肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ量測定は以下の手順で行った。すなわち、肝臓試料は、下大静脈より１．１５％塩化カリウム溶液（５ｍＭベンズアミジン含む）にて灌流後、採取した。肝臓組織１ｇに対し３ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュークロース、０．１Ｍ塩化カリウム含む）を加え、ホモジナイズした後、３,０００×ｇ（１０分間、４℃）で遠心分離し、上清を得た。次いで、この上清を９,０００×ｇ（２０分間、４℃）で遠心分離し、沈殿物を１ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュークロース、０．１Ｍ塩化カリウム含む）にて２回遠心洗浄し、ミトコンドリア画分を得た。該画分１４．２８ｍｇに対し、１ｍＬのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．２５Ｍシュークロース、０．１Ｍ塩化カリウム含む）を加え、溶解し、試料溶液とした。この時の濃度はミトコンドリアのタンパク量に換算すると、５００μｇ／ｍＬに相当する。
【００３５】
上記試料溶液３５μｌ、０．１％ｄｏｄｅｃｙｌ ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、５ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｔｅ、５ｍＭ ｍａｌａｔｅ及び２００ｍＭ ｓｕｃｃｉｎａｔｅを含む溶液２５μｌ、４．６Ｍ ５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ）溶液２０μｌ及び２ｍＭ ＮＡＤＨ溶液２０μｌの合計１００μｌを、３７℃で５分間インキュベーションした後、直ちにＥＳＲ測定装置（ＪＥＳ−ＲＥＩＸ／ＨＲ、日本電子株式会社製）にて、本溶液のＲＯＳ量を常温で測定した。測定に当たり、あらかじめｃａｖｉｔｙ内に挿入されたＭｎＯのＭｎ2+をラジカルの計算基準とした。ラジカル発生量はＭｎ2+のｍａｘｉｍｕｍ ｍｅｔｅｒ ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｒ）に対するミトコンドリア試料（ｈｓ）のそれとの比、即ち、ＥＳＲ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ｈｓ／ｈｒ）で算定した。
【００３６】
統計学的処理として、全ての結果は平均値±標準誤差で示した。得られたデータは一元配置分散分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ、ＡＮＯＶＡ）後、Ｔｕｒｋｅｙの多重比較検定法を用いて統計学的処理を行った。２群間の比較にはＳｔｕｄｅｎｔｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、危険率５％以下を優位差有りと判定した。
【００３７】
（２）実験結果
投与期間終了後、犠牲死させ、該ラットの血液の生化学的検査、肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ量、肝臓組織の病理組織学的変化を観察した結果を以下に示す。
【００３８】
（２）−１ 生化学検査
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２５±２ ＩＵ／Ｌから２２０±３８ ＩＵ／Ｌに上昇。
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２１±２ ＩＵ／Ｌから４７±２ ＩＵ／Ｌに上昇。
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍＬ）は９５±１２ｍｇ／ｍＬから２０５±２７ｍｇ／ｍＬに上昇。
本結果から、酸化ストレスによって脂肪肝からＮＡＳＨへ進行している事が明らかに認められた。
【００３９】
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２１±２ ＩＵ／Ｌから１５７±２ ＩＵ／Ｌに上昇。
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２２±２ ＩＵ／Ｌから３５±２ ＩＵ／Ｌに上昇。
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍＬ）は１１９±１４ｍｇ／ｍＬから１８４±１５ｍｇ／ｍＬに上昇。
本結果から、酸化ストレスによって誘導される脂肪肝からのＮＡＳＨへの進行が、後発酵茶水抽出物粉末１０ｍｇ／ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。
【００４０】
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２１±３ ＩＵ／Ｌから８８±９ ＩＵ／Ｌに上昇。
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）は２２±２ ＩＵ／Ｌから２８±２ ＩＵ／Ｌに上昇（正常値に回復）。
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍＬ）は１１９±１５ｍｇ／ｍＬから１０２±１１ｍｇ／ｍＬに低下（正常値に回復）。
本結果から、酸化ストレスによって誘導される脂肪肝からのＮＡＳＨへの進行が、後発酵茶水抽出物粉末２００ｍｇ／ｋｇ（体重）投与により大幅に改善される傾向が認められた。
【００４１】
（２）−２ 肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生値（シグナル相対強度）
ＯＳ負荷前のシグナル相対強度０．７±０．１に対し、
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）：１．０±０．１
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）：０．８±０．１
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）：０．５±０．１
であった。
本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生量が、後発酵茶水抽出物粉末投与により濃度依存的に低下する傾向が認められた。
【００４２】
（２）−３ ヘマトキシリン・エオジン染色による肝臓組織の観察
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行い、大滴脂肪の沈着状態を観察し、下記結果を得た。
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
多くの大滴性の脂肪滴及び大きな肝細胞配列の乱れ有り。
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
中程度の大滴性の脂肪滴及び中程度の肝細胞配列の乱れ有り。
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
小程度大滴性の脂肪滴及び小程度の肝細胞配列の乱れ有り。
本結果から、ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における大滴性の脂肪滴増大及び肝細胞配列の乱れ増大が、後発酵茶水抽出物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【００４３】
（２）−４ マッソン・トリクローム染色による肝臓組織の観察
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきマッソン・トリクローム染色を行い、膠原線維の線維化状態を観察し、下記結果を得た。
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
門脈域から中心静脈域の架橋形成が生じ偽小葉形成が認められた。
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
軽度の門脈域から中心静脈域の架橋形成が認められた。
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
門脈域と中心静脈周囲に繊維化が認められるが、架橋形成は認められない。
本結果から、脂肪肝よりＮＡＳＨへの進行に伴って増大する肝臓組織における架橋形成及び繊維化増大が後発酵茶水抽出物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【００４４】
（２）−５ ベルリン・ブルー染色による肝臓組織の観察
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため、公知の手法に基づきベルリン・ブルー染色を行い、鉄イオン沈着状態を観察し、下記結果を得た。
（ｉ）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）
門脈域から中心静脈域に大きな鉄の沈着が認められた。
（ii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶１０ｍｇ／ｋｇ）
門脈域から中心静脈域に軽度の鉄の沈着が認められた。
（iii）群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋茶２００ｍｇ／ｋｇ）
鉄の沈着は殆んど認められなかった。
本結果から、脂肪肝よりＮＡＳＨへの進行に伴って増大する肝臓組織における鉄の沈着増大が、後発酵茶水抽出物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【００４５】
［製剤例１］
次の処方により、顆粒を製造した。
後発酵茶エキス末（参考例２） ３５０（質量部）
乳糖 ４７０
結晶セルロース １５０
ヒドロキシプロピルセルロース ３０
【００４６】
［製剤例２］
次の処方により、湿式造粒し、打錠して錠剤を得た。
後発酵茶エキス末（参考例２） ３５０（質量部）
乳糖 ４７０
結晶セルロース １４０
ヒドロキシプロピルセルロース ３０
ステアリン酸マグネシウム １
タルク ９
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶又はその抽出物を含有する肝炎予防治療剤。
【請求項２】
肝炎が、急性肝炎又は慢性肝炎である請求項１記載の肝炎予防治療剤。
【請求項３】
肝炎が、慢性肝炎である請求項１記載の肝炎予防治療剤。
【請求項４】
肝炎が、非アルコール性脂肪性肝炎である請求項１記載の肝炎予防治療剤。
【請求項１】
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶又はその抽出物を含有する肝炎予防治療剤。
【請求項２】
肝炎が、急性肝炎又は慢性肝炎である請求項１記載の肝炎予防治療剤。
【請求項３】
肝炎が、慢性肝炎である請求項１記載の肝炎予防治療剤。
【請求項４】
肝炎が、非アルコール性脂肪性肝炎である請求項１記載の肝炎予防治療剤。
【公開番号】特開２００９−２９７３５（Ｐ２００９−２９７３５Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９４１１５（Ｐ２００７−１９４１１５）
【出願日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月２８日 Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ発行の「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ，２００７．」において発表、及び平成１９年３月１５日 名古屋国際会議場にて社団法人 日本薬理学会主催の「第８０回日本薬理学会年会」において発表
【出願人】（０００２１００６７）池田食研株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月２８日 Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ発行の「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ，２００７．」において発表、及び平成１９年３月１５日 名古屋国際会議場にて社団法人 日本薬理学会主催の「第８０回日本薬理学会年会」において発表
【出願人】（０００２１００６７）池田食研株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
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