肝硬変進展抑制用食品及び薬剤
【課題】 効果が高く、副作用の心配がなく、摂取が容易な肝硬変進展抑制用食品及び薬剤を提供する。
【解決手段】 天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００のペプチドを、肝硬変進
展抑制用食品および薬剤とする。この食品または薬剤を摂取することによって、肝硬変の進展を抑制する効果が発揮される。
【解決手段】 天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００のペプチドを、肝硬変進
展抑制用食品および薬剤とする。この食品または薬剤を摂取することによって、肝硬変の進展を抑制する効果が発揮される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−グルタミンに富むペプチドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品及び薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓疾患の中でも肝硬変は大きな問題である。現在日本には約４００万人（Ｂ型：約１５０万人、Ｃ型：約２５０万人）の慢性肝炎患者が存在する。慢性肝炎は肝硬変へと移行するが、その移行率は、Ｂ型肝炎で２０％、Ｃ型肝炎で６０％とされている。結果的に現在日本では、人口１０万人当たり、Ｂ型肝炎から６４７人、Ｃ型肝炎から１７２３人の合わせて２３７０人が毎年肝硬変に移行しているとされている。また、肝硬変による年間の死亡者数は年間１万７千人に及んでいる。そこで、肝炎から肝硬変への進展を抑制する方法が求められているが、適切な方法がないのが現状である。
【０００３】
肝硬変は、肝臓が線維化し硬化した状態である。ここで肝の線維化とは肝臓内の組織傷害に対する創傷治癒機転の結果、コラーゲンなどの細胞外マトリックス(extracellular matrix：ECM)が過剰に蓄積した病態である。
【０００４】
通常、生体におけるコラーゲンは産生と分解を繰り返しながら一定のバランスを維持しているが、病的条件下ではそのバランスが崩れ線維化が生じる。肝線維化は主に肝炎ウイルスやアルコールによる炎症に伴って起こり、特に炎症が慢性化した際に著明となる。肝細胞が肝炎やアルコールによる障害を繰り返し受けると、門脈域の限界板をこえて線維化が進展し、小葉構造が破壊される。肝細胞が再生して再生結節とよばれる構造がつくられ、やがて肝硬変とよばれる線維化の進展した状態になる。
【０００５】
肝における主要なＥＣＭ産生細胞は肝星細胞であり、肝障害により増加する液性因子が複雑に作用しあって、星細胞が活性化し肝線維化が生じる。星細胞は肝臓におけるビタミンＡ貯蔵細胞（伊東細胞）として知られ、筋線維芽細胞ファミリーに属する。肝線維化過程では、星細胞はクッパー細胞や浸潤細胞からのサイトカインにより活性化され活性化細胞へと形質転換しコラーゲンなどのＥＣＭを著明に産生する。さらに肝臓中のコラーゲン分解酵素であるマトリックス分解酵素（matrix metalloprotease：MMP）の抑制因子(tissue inhibitor of metalloprotease: TIMP)、ＴＧＦ−β(transforming growth factor-β)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)などのサイトカイン、ＨＧＦ(hepatocyte growth factor)などの成長因子を産生し、肝線維化の中心的な役割を果す。活性化星細胞は各種サイトカイン受容体の発現も増加し、サイトカインに対し高感受性になる。
【０００６】
コラーゲンの産生、分解は各種サイトカインやマトリックス分解酵素とその抑制因子により複雑に調節されている。コラーゲンの分解・代謝にはＭＭＰが関与するが、線維化が進むにつれ、ＭＭＰ−２（基底膜成分の分解を担当）の活性型（プロテアーゼとして作用するMMP）の割合が低下し、コラーゲンのターンオーバーが抑制されることが知られてい
る。
【０００７】
WO03/074071には、小麦グルテンを酵素的に部分加水分解して得られるグルタミンペプ
チドに、肝臓疾患の改善作用のあることが知られている。しかし、その詳しい作用については十分知られていない。
【特許文献１】ＷＯ０３／０７４０７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
慢性肝炎であっても良好な状態を維持することが出来れば、生命予後並びに生活の質を大いに改善することが期待できる。そこで本発明の課題は、慢性肝炎から肝硬変への進展を抑制する食品及び薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者は、肝臓に慢性的な炎症が起きている（慢性肝炎）状態におけるグルタミンペプチドの効果を鋭意研究した結果、グルタミンペプチドに慢性肝炎から肝硬変への進展を抑制する効果があることを発見した。さらに詳しくは、WO03/074071に記載された方法で製
造したグルタミンペプチドを、動物モデルに投与し、その生物学的な作用を詳細に検討した。その結果、グルタミンペプチドの投与は、重度の肝炎等の肝疾患の指標として用いることが多い血清中のＧＯＴ(Glutamic Oxaloacetic Transaminase)およびＧＰＴ(Glutamic
Pyruvic Transaminase)に変化が無い場合であっても、肝硬変の進展を抑制していることを発見し、本発明を完成したものである。
【００１０】
したがって、本発明は、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチ
ドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品に関する。当該ペプチドは、Ｌ−グルタミン含有量が２０〜４０質量％で、平均分子量が５００〜２０,０００であるのが好まし
く、小麦粉グルテンを原料として製造されたペプチドが特に好ましい。
【００１１】
なお、以下の記載において、本発明のグルタミン含有量の高いペプチドを「グルタミンペプチド」と称する。また、本明細書において、用語「ペプチド」および「グルタミンペプチド」は、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成されるペプチドを意味する。故に、用語「Ｌ−アミノ酸」または「アミノ酸」は、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸を意味する。
【００１２】
本発明のグルタミンペプチドを飲食品に含有させることにより、日常生活においてグルタミンペプチドをより容易に摂取できる。さらに、当該ペプチドは肝硬変進展抑制用薬剤として投与することもできる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチドを含
むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品および肝硬変進展抑制用薬剤が提供される。本発明において用いるグルタミンペプチドは安全性に優れており、長期間投与するのに適している。このため、肝硬変進展抑制用食品及び薬剤として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のグルタミンペプチド、例えばWO03/074071に記載の方法で製造することができ
る。さらに小麦グルテン由来のグルタミンペプチドは、従来から既に市販されている（例えば日清ファルマ株式会社製の「グルタミンペプチドＧＰ−１」、ＤＭＶ社製の「グルタミンペプチドＧＰＡ」など）。これらのグルタミンペプチドはそのまま用いてもよいし、また場合により加水分解、分画などの処理を施してもよい。
【００１５】
このようなグルタミンペプチドを、例えばパン、うどんなどの麺類、クッキー、せんべいなどの炭水化物系食品、お茶類、スープ類、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類、流動食、ジュース類、ゼリー状飲料等に含ませた肝硬変進展抑制用食品を製造する。そのような食品としては健康食品、機能性食品として、一日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。成人１日当たりの摂取量は、グルタミンペプチドとして通常４〜８０ｇ、好ましくは６〜６０ｇである。
【００１６】
本発明のグルタミンペプチドを含む肝硬変進展抑制用薬剤は、グルタミンペプチドを定法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤などの経口製剤とすることができる。その際の、成人１日当たりの投与量は、食品の場合と同じである。
【００１７】
肝硬変の診断の指標とされる血液生化学分析値としては、例えば、ヒアルロン酸含量、アンモニア含量、チモール混濁度がある。
【００１８】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸が重合した高分子量の粘液性ムコ多糖類で、他のグリコサミノグリカンとともに生体内の結合組織中に広く分布(臍帯、関節液、硝子体などにはとくに豊富に存在)しており、関節潤滑作用や細菌侵入に対する生体防御作用および電解質と水の調節作用を担っている。産生遊離されたヒアルロン酸は血流にのってリンパ組織へ移行し、さらに肝臓へ移り代謝される。一方、肝臓の線維化が進むと肝臓内の伊東細胞、線維芽細胞などのヒアルロン酸産生が亢進する。また、血中のヒアルロン酸の約９０％以上を分解するとされている肝類洞内皮細胞は線維化に伴いその機能を失い、ヒアルロン酸の血中の濃度が増加する。臨床的には、肝硬変と非肝硬変の鑑別に有用性が高く、Ｃ型慢性活動性肝炎におけるＩＦＮ治療効果予測にも有用である。
【００１９】
アンモニア(NH3)は、タンパク質の代謝過程でアミノ酸から脱アミノされて生じ、肝で
尿素合成に利用されるが、血中ＮＨ3の大部分は消化管(小腸粘膜と大腸内細菌)由来とさ
れる。ＮＨ3の解毒は肝細胞での尿素回路に依存し、尿素は腎より尿中に排泄される。し
たがって、肝臓機能の低下による尿素サイクル活性の低下、腸内におけるＮＨ3産生の増
加および門脈副血行枝による門脈血の大循環系への流入などの場合には、血中ＮＨ3濃度
が高値となる。
【００２０】
チモール混濁試験(thymol turbiduty test：TTT)は、硫酸亜鉛混濁試験(zinc sulfate turbidity test：ZNN)とともに一般に行われている膠質反応で、肝疾患の診断および経過の追跡に古くから用いられている。しかしながら蛋白比の変動により変化するという欠点もあるが、今なお急性肝炎の慢性化や慢性肝疾患の程度を知る指標として用いられている。ＴＴＴ異常はＩｇＧ、ＩｇＭの増加(A型肝炎)、アルブミン減少、脂質、リポ蛋白の増加の場合にその頻度が高く、また胆汁うっ滞では特に糖蛋白の血中増加が本反応の修飾(抑制)を行う。
【００２１】
ＧＯＴとＧＰＴはともにピリドキサールリン酸(PALP)を補酵素とする代表的なアミノ基転移酵素である。肝胆道疾患、心疾患、筋疾患、溶血性疾患などの障害の程度、臨床経過などを知るためにもっとも一般的に用いられ、肝硬変の病状の進展を判断する目安として採用されることが多い。今回、本発明者等は、グルタミン含有量の高いペプチドを肝硬変となっている動物個体に摂取させた場合、グルタミン含有量の高いペプチドを摂取によってＧＯＴ、ＧＰＴには見るべき変化が無い場合でも、その他の指標となるデータの改善ができることを見出し、グルタミン含有量の高いペプチドを肝硬変進展抑制用食品および薬剤として用いるものである。
【００２２】
以下に、実施例によりグルタミンペプチドの肝硬変進展抑制作用について、詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
生物試験による結果の概要
肝炎から肝硬変への進展に対する効果を検討するために、ラット四塩化炭素による慢性肝炎モデルを用いた。このモデルでは、毎週２回、皮下的に四塩化炭素を投与することにより、肝臓に慢性的な炎症をおこさせるものであるが、２０週以上継続することにより肝炎から肝硬変へ移行することが知られている。
【００２４】
ラットへの四塩化炭素投与開始から３週間後に、試験群の飼料をグルタミンペプチド含有（４％及び８％）のものに切り替え２５週間まで四塩化炭素投与を継続し、グルタミンペプチドを与えなかった対照群と比較した。その結果、血清中のＧＯＴおよびＧＰＴには殆ど差が無かったが、アンモニア、チモール混濁試験、ヒアルロン酸はグルタミンペプチド投与群で対照群よりも有意な低値を示した。また摘出した肝臓の状態は、対照群では硬化が進み、表面が滑らかでなく無数の結節で覆われた状態になっていたのに対して、グルタミンペプチド投与群ではより軽度であった。また、肝臓の萎縮は、グルタミンペプチド投与群ではより軽度であり、肝臓重量は対照群よりも大きかった。また対照群では半数以上の個体で腹水を観察したのに対して、グルタミンペプチド投与群では６例中０もしくは１例に腹水を認めただけであった。
【００２５】
ＭＭＰの活性をゼラチン・ザイモグラフィーにより調べたところ、グルタミンペプチド投与群では対照群に比して活性型ＭＭＰ−２が多く観察され、コラーゲンの代謝が活性化していることが示唆された。また肝臓中のコラーゲンを、可溶性画分、不溶性画分中のハイドロキシ・プロリン（Hyp）として測定した結果、グルタミンペプチド投与群では対照
群に比して、可溶性画分のＨｙｐが増えており、コラーゲンの代謝が活性化していることが示唆された。以下これらの生物試験について詳述する。
【００２６】
肝硬変モデルラットを用いたグルタミンペプチドの投与試験
（１）試験方法
１７匹の７週齢のＳＤ系雄ラットを実験に用いた。各ラットに四塩化炭素とオリーブ油を等量混合した液（1ml/kg/回）を２５週間にわたって、毎週２回（火曜日と金曜日）皮
下に投与した。
ラットには、最初の３週間は２０％カゼイン食を与え、その後、各群の体重に差が無いように、対照群（n=5）、４％グルタミンペプチド群（n=6）、８％グルタミンペプチド群（n=6）に分けた。対照群には引き続き２０％カゼイン食を与え、４％グルタミンペプチ
ド群にはカゼインの４％をグルタミンペプチドＧＰ−１（日清ファルマ株式会社）に置き換えた試験食（4%GP食）を与え、８％グルタミンペプチド群にはカゼインの８％をＧＰ−１に置き換えた試験食（8%GP食）与えた。試験に使用した飼料の詳細を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
用いたグルタミンペプチドは、WO03/074071に記載の方法にしたがって製造したもので
ある。WO03/074071に記載された方法によって測定したグルタミンペプチドの平均分子量
およびグルタミン含有量は、それぞれ、１０,０００および３２質量％である。
試験期間中、ラットには飼料及び水を自由に摂取させた。試験最終日前日より絶食とし、採取日にエーテル麻酔下にて犠死せしめ、血液、組織などを分析に供した。
【００２９】
（２）体重及び解剖所見
試験終了時の体重等を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
体重は、グルタミンペプチド投与群の方やや大きかったが統計的に有意ではなかった。解剖時に腹水の有無をチェックしたところ、対照群では５例中３例に腹水を認めたのに対して、４％グルタミンペプチド群で腹水を確認できたのは６例中０例、８％グルタミンペプチド群では６例中１例のみであった。
【００３２】
また肝臓については、対照群の肝臓は表面が粗く、多数の結節が認められ、全体的に線維化していたのに対して、グルタミンペプチド投与群では、全体的に対照群よりも大きく、硬化の程度も対照群よりは軽度であった。表２に示されたように、グルタミンペプチド投与群の肝臓重量が対照群よりも大きいことが統計学的にも確認された（スチューデントのｔ検定、ｐ<0.05）。
【００３３】
（３）血液生化学分析
ＧＯＴ、ＧＰＴはＪＳＣＣ標準化対応法（三浦裕、日本臨床、５３−増−２６６、１９９５）、アンモニアはＯｋａｄａ−Ｆｕｊｉｔａ変法（井廻道夫、日本臨床、５３−増−４７８、１９９５）、チモール混濁試験 （TTT）は消化器学会肝機能研究班推奨法（門奈丈之ら、日本臨床、５３−増−１６３、１９９５）、ヒアルロン酸はラテックス凝集免疫比濁法（島村朗ら、医学と薬学、４４（６）：１１４１−１１４６、２０００）によりそれぞれ測定した。
分析した結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
ＧＯＴおよびＧＰＴには、差が認められなかったものの、肝硬変の指標とされるアンモニア、チモール混濁法、ヒアルロン酸については、グルタミンペプチド投与群の方が、値が低かった。
【００３６】
（４）肝臓中のマトリックス・メタロプロテアーゼ
各ラットの肝臓１００mgを取り５００mlのＰＢＳ（137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 8.1 mM
Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 5mM EDTA, pH 7.2）中でホモジナイズする。得られたホモジネートを遠心分離（10,000 g × 5 min）し、上清（可溶性画分）と沈殿（残渣）とに分
けた。可溶性画分の一定量をゼラチン・ザイモグラフィーにより分析することで、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を測定した。ゼラチン・ザイモグラフィーとは、試料をゼラチン含有ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後、ゲルを非イオン性界面活性剤を含む中性緩衝液に浸し、ＳＤＳを除去することによりＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９をリナチュレーションせしめ、ゲル中のゼラチンを分解させることにより、ＣＢＢ(Coomassie Brilliant Blue)で染色した後にゼラチンが分解された部分を染色されない活性バンドとして検出する方法である。この方法によれば、不活性型のＭＭＰsもリナチュレーション過程で活性型に変換するので、検出が可能である。
【００３７】
ゼラチン・ザイモグラフィーにより分析した結果を図１に示す。この結果から、グルタミンペプチド投与群では、肝臓中のＭＭＰ−２の活性型が多くなっており、コラーゲン分解が亢進していることが確認された。これは、活性型のＭＭＰによって肝線維化の進展が抑制されていることを示すものである。
【００３８】
（５）肝臓中のコラーゲン
各ラットの肝臓１００mgを取り５００mlのＰＢＳ中でホモジナイズする。得られたホモジネートを遠心分離（10,000 g × 5 min）し、上清（可溶性画分）と沈殿（残渣）とに
分けた。それぞれの画分の一定量ずつを群ごとに混合した後、Ｐｉｃｏ−Ｔａｇアミノ酸分析システム（日本ウォーターズ）により分析し、ハイドロキシプロリン（Hyp）の含量
を分析した。その結果、グルタミンペプチド投与群では、可溶性画分のＨｙｐが対照群よりも多いことが確認された（図２）。
【００３９】
Ｈｙｐはコラーゲンの３０％を占めるアミノ酸であり、かつコラーゲンに特異的に存在するので、コラーゲンの量を反映している。このことから、グルタミンペプチド投与群では可溶性のコラーゲンが多く、コラーゲンの代謝が活性化していることが確認された。
以上より、グルタミンペプチドは、肝臓のコラーゲン代謝を活性化し、肝線維化を抑制することで、肝炎から肝硬変への進展を抑制することが明らかとなった。
【００４０】
（６）投与量の検討
肝炎から肝硬変への進展を抑制させるためのグルタミンペプチドの投与量を決定すべく、異なった量のグルタミンペプチドを含む試験食を与えて上記の試験を繰り返した。その結果、ラットを用いた場合には、飼料（20％蛋白質）中に含ませるべきグルタミンペプチドの量は２〜２０％、好ましくは３〜１５％であることが判った。
【００４１】
この投与量の検討の結果を元に成人１日当たりの摂取量を換算すると、通常、成人の蛋白質の１日所要量は８０ｇとされているので、グルタミンペプチドとして４〜８０ｇ、好ましくは６〜６０ｇとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】肝臓中のマトリックス・メタロプロテアーゼ試験の結果得られた、ゼラチン・ザイモグラフィーの結果を示す図である。なお、図において画像は反転してある。
【図２】肝臓中のコラーゲン試験の結果得られたハイドロキシ・プロリン含量を示す図である。図中Ｃｏｎは、カゼイン食を投与されたコントロール群、ＧＰ４は４％グルタミンペプチド食を投与された群、ＧＰ８は８％グルタミンペプチド食を投与された群である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−グルタミンに富むペプチドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品及び薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓疾患の中でも肝硬変は大きな問題である。現在日本には約４００万人（Ｂ型：約１５０万人、Ｃ型：約２５０万人）の慢性肝炎患者が存在する。慢性肝炎は肝硬変へと移行するが、その移行率は、Ｂ型肝炎で２０％、Ｃ型肝炎で６０％とされている。結果的に現在日本では、人口１０万人当たり、Ｂ型肝炎から６４７人、Ｃ型肝炎から１７２３人の合わせて２３７０人が毎年肝硬変に移行しているとされている。また、肝硬変による年間の死亡者数は年間１万７千人に及んでいる。そこで、肝炎から肝硬変への進展を抑制する方法が求められているが、適切な方法がないのが現状である。
【０００３】
肝硬変は、肝臓が線維化し硬化した状態である。ここで肝の線維化とは肝臓内の組織傷害に対する創傷治癒機転の結果、コラーゲンなどの細胞外マトリックス(extracellular matrix：ECM)が過剰に蓄積した病態である。
【０００４】
通常、生体におけるコラーゲンは産生と分解を繰り返しながら一定のバランスを維持しているが、病的条件下ではそのバランスが崩れ線維化が生じる。肝線維化は主に肝炎ウイルスやアルコールによる炎症に伴って起こり、特に炎症が慢性化した際に著明となる。肝細胞が肝炎やアルコールによる障害を繰り返し受けると、門脈域の限界板をこえて線維化が進展し、小葉構造が破壊される。肝細胞が再生して再生結節とよばれる構造がつくられ、やがて肝硬変とよばれる線維化の進展した状態になる。
【０００５】
肝における主要なＥＣＭ産生細胞は肝星細胞であり、肝障害により増加する液性因子が複雑に作用しあって、星細胞が活性化し肝線維化が生じる。星細胞は肝臓におけるビタミンＡ貯蔵細胞（伊東細胞）として知られ、筋線維芽細胞ファミリーに属する。肝線維化過程では、星細胞はクッパー細胞や浸潤細胞からのサイトカインにより活性化され活性化細胞へと形質転換しコラーゲンなどのＥＣＭを著明に産生する。さらに肝臓中のコラーゲン分解酵素であるマトリックス分解酵素（matrix metalloprotease：MMP）の抑制因子(tissue inhibitor of metalloprotease: TIMP)、ＴＧＦ−β(transforming growth factor-β)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)などのサイトカイン、ＨＧＦ(hepatocyte growth factor)などの成長因子を産生し、肝線維化の中心的な役割を果す。活性化星細胞は各種サイトカイン受容体の発現も増加し、サイトカインに対し高感受性になる。
【０００６】
コラーゲンの産生、分解は各種サイトカインやマトリックス分解酵素とその抑制因子により複雑に調節されている。コラーゲンの分解・代謝にはＭＭＰが関与するが、線維化が進むにつれ、ＭＭＰ−２（基底膜成分の分解を担当）の活性型（プロテアーゼとして作用するMMP）の割合が低下し、コラーゲンのターンオーバーが抑制されることが知られてい
る。
【０００７】
WO03/074071には、小麦グルテンを酵素的に部分加水分解して得られるグルタミンペプ
チドに、肝臓疾患の改善作用のあることが知られている。しかし、その詳しい作用については十分知られていない。
【特許文献１】ＷＯ０３／０７４０７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
慢性肝炎であっても良好な状態を維持することが出来れば、生命予後並びに生活の質を大いに改善することが期待できる。そこで本発明の課題は、慢性肝炎から肝硬変への進展を抑制する食品及び薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者は、肝臓に慢性的な炎症が起きている（慢性肝炎）状態におけるグルタミンペプチドの効果を鋭意研究した結果、グルタミンペプチドに慢性肝炎から肝硬変への進展を抑制する効果があることを発見した。さらに詳しくは、WO03/074071に記載された方法で製
造したグルタミンペプチドを、動物モデルに投与し、その生物学的な作用を詳細に検討した。その結果、グルタミンペプチドの投与は、重度の肝炎等の肝疾患の指標として用いることが多い血清中のＧＯＴ(Glutamic Oxaloacetic Transaminase)およびＧＰＴ(Glutamic
Pyruvic Transaminase)に変化が無い場合であっても、肝硬変の進展を抑制していることを発見し、本発明を完成したものである。
【００１０】
したがって、本発明は、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチ
ドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品に関する。当該ペプチドは、Ｌ−グルタミン含有量が２０〜４０質量％で、平均分子量が５００〜２０,０００であるのが好まし
く、小麦粉グルテンを原料として製造されたペプチドが特に好ましい。
【００１１】
なお、以下の記載において、本発明のグルタミン含有量の高いペプチドを「グルタミンペプチド」と称する。また、本明細書において、用語「ペプチド」および「グルタミンペプチド」は、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成されるペプチドを意味する。故に、用語「Ｌ−アミノ酸」または「アミノ酸」は、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸を意味する。
【００１２】
本発明のグルタミンペプチドを飲食品に含有させることにより、日常生活においてグルタミンペプチドをより容易に摂取できる。さらに、当該ペプチドは肝硬変進展抑制用薬剤として投与することもできる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチドを含
むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品および肝硬変進展抑制用薬剤が提供される。本発明において用いるグルタミンペプチドは安全性に優れており、長期間投与するのに適している。このため、肝硬変進展抑制用食品及び薬剤として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のグルタミンペプチド、例えばWO03/074071に記載の方法で製造することができ
る。さらに小麦グルテン由来のグルタミンペプチドは、従来から既に市販されている（例えば日清ファルマ株式会社製の「グルタミンペプチドＧＰ−１」、ＤＭＶ社製の「グルタミンペプチドＧＰＡ」など）。これらのグルタミンペプチドはそのまま用いてもよいし、また場合により加水分解、分画などの処理を施してもよい。
【００１５】
このようなグルタミンペプチドを、例えばパン、うどんなどの麺類、クッキー、せんべいなどの炭水化物系食品、お茶類、スープ類、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類、流動食、ジュース類、ゼリー状飲料等に含ませた肝硬変進展抑制用食品を製造する。そのような食品としては健康食品、機能性食品として、一日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。成人１日当たりの摂取量は、グルタミンペプチドとして通常４〜８０ｇ、好ましくは６〜６０ｇである。
【００１６】
本発明のグルタミンペプチドを含む肝硬変進展抑制用薬剤は、グルタミンペプチドを定法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤などの経口製剤とすることができる。その際の、成人１日当たりの投与量は、食品の場合と同じである。
【００１７】
肝硬変の診断の指標とされる血液生化学分析値としては、例えば、ヒアルロン酸含量、アンモニア含量、チモール混濁度がある。
【００１８】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸が重合した高分子量の粘液性ムコ多糖類で、他のグリコサミノグリカンとともに生体内の結合組織中に広く分布(臍帯、関節液、硝子体などにはとくに豊富に存在)しており、関節潤滑作用や細菌侵入に対する生体防御作用および電解質と水の調節作用を担っている。産生遊離されたヒアルロン酸は血流にのってリンパ組織へ移行し、さらに肝臓へ移り代謝される。一方、肝臓の線維化が進むと肝臓内の伊東細胞、線維芽細胞などのヒアルロン酸産生が亢進する。また、血中のヒアルロン酸の約９０％以上を分解するとされている肝類洞内皮細胞は線維化に伴いその機能を失い、ヒアルロン酸の血中の濃度が増加する。臨床的には、肝硬変と非肝硬変の鑑別に有用性が高く、Ｃ型慢性活動性肝炎におけるＩＦＮ治療効果予測にも有用である。
【００１９】
アンモニア(NH3)は、タンパク質の代謝過程でアミノ酸から脱アミノされて生じ、肝で
尿素合成に利用されるが、血中ＮＨ3の大部分は消化管(小腸粘膜と大腸内細菌)由来とさ
れる。ＮＨ3の解毒は肝細胞での尿素回路に依存し、尿素は腎より尿中に排泄される。し
たがって、肝臓機能の低下による尿素サイクル活性の低下、腸内におけるＮＨ3産生の増
加および門脈副血行枝による門脈血の大循環系への流入などの場合には、血中ＮＨ3濃度
が高値となる。
【００２０】
チモール混濁試験(thymol turbiduty test：TTT)は、硫酸亜鉛混濁試験(zinc sulfate turbidity test：ZNN)とともに一般に行われている膠質反応で、肝疾患の診断および経過の追跡に古くから用いられている。しかしながら蛋白比の変動により変化するという欠点もあるが、今なお急性肝炎の慢性化や慢性肝疾患の程度を知る指標として用いられている。ＴＴＴ異常はＩｇＧ、ＩｇＭの増加(A型肝炎)、アルブミン減少、脂質、リポ蛋白の増加の場合にその頻度が高く、また胆汁うっ滞では特に糖蛋白の血中増加が本反応の修飾(抑制)を行う。
【００２１】
ＧＯＴとＧＰＴはともにピリドキサールリン酸(PALP)を補酵素とする代表的なアミノ基転移酵素である。肝胆道疾患、心疾患、筋疾患、溶血性疾患などの障害の程度、臨床経過などを知るためにもっとも一般的に用いられ、肝硬変の病状の進展を判断する目安として採用されることが多い。今回、本発明者等は、グルタミン含有量の高いペプチドを肝硬変となっている動物個体に摂取させた場合、グルタミン含有量の高いペプチドを摂取によってＧＯＴ、ＧＰＴには見るべき変化が無い場合でも、その他の指標となるデータの改善ができることを見出し、グルタミン含有量の高いペプチドを肝硬変進展抑制用食品および薬剤として用いるものである。
【００２２】
以下に、実施例によりグルタミンペプチドの肝硬変進展抑制作用について、詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
生物試験による結果の概要
肝炎から肝硬変への進展に対する効果を検討するために、ラット四塩化炭素による慢性肝炎モデルを用いた。このモデルでは、毎週２回、皮下的に四塩化炭素を投与することにより、肝臓に慢性的な炎症をおこさせるものであるが、２０週以上継続することにより肝炎から肝硬変へ移行することが知られている。
【００２４】
ラットへの四塩化炭素投与開始から３週間後に、試験群の飼料をグルタミンペプチド含有（４％及び８％）のものに切り替え２５週間まで四塩化炭素投与を継続し、グルタミンペプチドを与えなかった対照群と比較した。その結果、血清中のＧＯＴおよびＧＰＴには殆ど差が無かったが、アンモニア、チモール混濁試験、ヒアルロン酸はグルタミンペプチド投与群で対照群よりも有意な低値を示した。また摘出した肝臓の状態は、対照群では硬化が進み、表面が滑らかでなく無数の結節で覆われた状態になっていたのに対して、グルタミンペプチド投与群ではより軽度であった。また、肝臓の萎縮は、グルタミンペプチド投与群ではより軽度であり、肝臓重量は対照群よりも大きかった。また対照群では半数以上の個体で腹水を観察したのに対して、グルタミンペプチド投与群では６例中０もしくは１例に腹水を認めただけであった。
【００２５】
ＭＭＰの活性をゼラチン・ザイモグラフィーにより調べたところ、グルタミンペプチド投与群では対照群に比して活性型ＭＭＰ−２が多く観察され、コラーゲンの代謝が活性化していることが示唆された。また肝臓中のコラーゲンを、可溶性画分、不溶性画分中のハイドロキシ・プロリン（Hyp）として測定した結果、グルタミンペプチド投与群では対照
群に比して、可溶性画分のＨｙｐが増えており、コラーゲンの代謝が活性化していることが示唆された。以下これらの生物試験について詳述する。
【００２６】
肝硬変モデルラットを用いたグルタミンペプチドの投与試験
（１）試験方法
１７匹の７週齢のＳＤ系雄ラットを実験に用いた。各ラットに四塩化炭素とオリーブ油を等量混合した液（1ml/kg/回）を２５週間にわたって、毎週２回（火曜日と金曜日）皮
下に投与した。
ラットには、最初の３週間は２０％カゼイン食を与え、その後、各群の体重に差が無いように、対照群（n=5）、４％グルタミンペプチド群（n=6）、８％グルタミンペプチド群（n=6）に分けた。対照群には引き続き２０％カゼイン食を与え、４％グルタミンペプチ
ド群にはカゼインの４％をグルタミンペプチドＧＰ−１（日清ファルマ株式会社）に置き換えた試験食（4%GP食）を与え、８％グルタミンペプチド群にはカゼインの８％をＧＰ−１に置き換えた試験食（8%GP食）与えた。試験に使用した飼料の詳細を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
用いたグルタミンペプチドは、WO03/074071に記載の方法にしたがって製造したもので
ある。WO03/074071に記載された方法によって測定したグルタミンペプチドの平均分子量
およびグルタミン含有量は、それぞれ、１０,０００および３２質量％である。
試験期間中、ラットには飼料及び水を自由に摂取させた。試験最終日前日より絶食とし、採取日にエーテル麻酔下にて犠死せしめ、血液、組織などを分析に供した。
【００２９】
（２）体重及び解剖所見
試験終了時の体重等を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
体重は、グルタミンペプチド投与群の方やや大きかったが統計的に有意ではなかった。解剖時に腹水の有無をチェックしたところ、対照群では５例中３例に腹水を認めたのに対して、４％グルタミンペプチド群で腹水を確認できたのは６例中０例、８％グルタミンペプチド群では６例中１例のみであった。
【００３２】
また肝臓については、対照群の肝臓は表面が粗く、多数の結節が認められ、全体的に線維化していたのに対して、グルタミンペプチド投与群では、全体的に対照群よりも大きく、硬化の程度も対照群よりは軽度であった。表２に示されたように、グルタミンペプチド投与群の肝臓重量が対照群よりも大きいことが統計学的にも確認された（スチューデントのｔ検定、ｐ<0.05）。
【００３３】
（３）血液生化学分析
ＧＯＴ、ＧＰＴはＪＳＣＣ標準化対応法（三浦裕、日本臨床、５３−増−２６６、１９９５）、アンモニアはＯｋａｄａ−Ｆｕｊｉｔａ変法（井廻道夫、日本臨床、５３−増−４７８、１９９５）、チモール混濁試験 （TTT）は消化器学会肝機能研究班推奨法（門奈丈之ら、日本臨床、５３−増−１６３、１９９５）、ヒアルロン酸はラテックス凝集免疫比濁法（島村朗ら、医学と薬学、４４（６）：１１４１−１１４６、２０００）によりそれぞれ測定した。
分析した結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
ＧＯＴおよびＧＰＴには、差が認められなかったものの、肝硬変の指標とされるアンモニア、チモール混濁法、ヒアルロン酸については、グルタミンペプチド投与群の方が、値が低かった。
【００３６】
（４）肝臓中のマトリックス・メタロプロテアーゼ
各ラットの肝臓１００mgを取り５００mlのＰＢＳ（137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 8.1 mM
Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 5mM EDTA, pH 7.2）中でホモジナイズする。得られたホモジネートを遠心分離（10,000 g × 5 min）し、上清（可溶性画分）と沈殿（残渣）とに分
けた。可溶性画分の一定量をゼラチン・ザイモグラフィーにより分析することで、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を測定した。ゼラチン・ザイモグラフィーとは、試料をゼラチン含有ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後、ゲルを非イオン性界面活性剤を含む中性緩衝液に浸し、ＳＤＳを除去することによりＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９をリナチュレーションせしめ、ゲル中のゼラチンを分解させることにより、ＣＢＢ(Coomassie Brilliant Blue)で染色した後にゼラチンが分解された部分を染色されない活性バンドとして検出する方法である。この方法によれば、不活性型のＭＭＰsもリナチュレーション過程で活性型に変換するので、検出が可能である。
【００３７】
ゼラチン・ザイモグラフィーにより分析した結果を図１に示す。この結果から、グルタミンペプチド投与群では、肝臓中のＭＭＰ−２の活性型が多くなっており、コラーゲン分解が亢進していることが確認された。これは、活性型のＭＭＰによって肝線維化の進展が抑制されていることを示すものである。
【００３８】
（５）肝臓中のコラーゲン
各ラットの肝臓１００mgを取り５００mlのＰＢＳ中でホモジナイズする。得られたホモジネートを遠心分離（10,000 g × 5 min）し、上清（可溶性画分）と沈殿（残渣）とに
分けた。それぞれの画分の一定量ずつを群ごとに混合した後、Ｐｉｃｏ−Ｔａｇアミノ酸分析システム（日本ウォーターズ）により分析し、ハイドロキシプロリン（Hyp）の含量
を分析した。その結果、グルタミンペプチド投与群では、可溶性画分のＨｙｐが対照群よりも多いことが確認された（図２）。
【００３９】
Ｈｙｐはコラーゲンの３０％を占めるアミノ酸であり、かつコラーゲンに特異的に存在するので、コラーゲンの量を反映している。このことから、グルタミンペプチド投与群では可溶性のコラーゲンが多く、コラーゲンの代謝が活性化していることが確認された。
以上より、グルタミンペプチドは、肝臓のコラーゲン代謝を活性化し、肝線維化を抑制することで、肝炎から肝硬変への進展を抑制することが明らかとなった。
【００４０】
（６）投与量の検討
肝炎から肝硬変への進展を抑制させるためのグルタミンペプチドの投与量を決定すべく、異なった量のグルタミンペプチドを含む試験食を与えて上記の試験を繰り返した。その結果、ラットを用いた場合には、飼料（20％蛋白質）中に含ませるべきグルタミンペプチドの量は２〜２０％、好ましくは３〜１５％であることが判った。
【００４１】
この投与量の検討の結果を元に成人１日当たりの摂取量を換算すると、通常、成人の蛋白質の１日所要量は８０ｇとされているので、グルタミンペプチドとして４〜８０ｇ、好ましくは６〜６０ｇとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】肝臓中のマトリックス・メタロプロテアーゼ試験の結果得られた、ゼラチン・ザイモグラフィーの結果を示す図である。なお、図において画像は反転してある。
【図２】肝臓中のコラーゲン試験の結果得られたハイドロキシ・プロリン含量を示す図である。図中Ｃｏｎは、カゼイン食を投与されたコントロール群、ＧＰ４は４％グルタミンペプチド食を投与された群、ＧＰ８は８％グルタミンペプチド食を投与された群である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン含有量が２０〜４０質量％で、平均分子量が５００〜２０,０００のペ
プチドである請求項１記載の肝硬変進展抑制用食品。
【請求項３】
小麦粉グルテンを原料として製造されたペプチドである請求項１または２記載の肝硬変進展抑制用食品。
【請求項４】
天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用薬剤。
【請求項５】
Ｌ−グルタミン含有量が２０〜４０質量％で、平均分子量が５００〜２０,０００のペ
プチドである請求項４記載の肝硬変進展抑制用薬剤。
【請求項６】
小麦粉グルテンを原料として製造されたペプチドである請求項４または５記載の肝硬変進展抑制用薬剤。
【請求項１】
天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用食品。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン含有量が２０〜４０質量％で、平均分子量が５００〜２０,０００のペ
プチドである請求項１記載の肝硬変進展抑制用食品。
【請求項３】
小麦粉グルテンを原料として製造されたペプチドである請求項１または２記載の肝硬変進展抑制用食品。
【請求項４】
天然の蛋白質を構成するＬ−アミノ酸から構成され、Ｌ−グルタミン含有量が１５〜６０質量％で、平均分子量が２００〜１００,０００であるペプチドを含むことを特徴とする肝硬変進展抑制用薬剤。
【請求項５】
Ｌ−グルタミン含有量が２０〜４０質量％で、平均分子量が５００〜２０,０００のペ
プチドである請求項４記載の肝硬変進展抑制用薬剤。
【請求項６】
小麦粉グルテンを原料として製造されたペプチドである請求項４または５記載の肝硬変進展抑制用薬剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−５５０２２（Ｐ２００６−５５０２２Ａ）
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３８２１７（Ｐ２００４−２３８２１７）
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年４月１日 日本栄養・食糧学会発行の「第５８回 日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（３０１０４９７４４）日清ファルマ株式会社 (61)
【出願人】（０００２２６９９８）株式会社日清製粉グループ本社 (125)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年４月１日 日本栄養・食糧学会発行の「第５８回 日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（３０１０４９７４４）日清ファルマ株式会社 (61)
【出願人】（０００２２６９９８）株式会社日清製粉グループ本社 (125)
【Ｆターム（参考）】
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