肝臓保護剤、肝がん発症抑制剤、及びそれらの医薬組成物
【課題】 肝臓の保護剤、肝がんへの進展を抑制することによる肝がん発症抑制剤、及びそれらを用いた医薬品組成物を提供する。
【解決手段】
本発明の肝臓保護剤、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによる肝がんの発症抑制剤、および医薬組成物は、ブルーベリーの葉の加工処理物、例えば、ブルーベリー葉の破砕物、抽出物または搾汁を有効成分として用いる。ブルーベリー葉の加工処理物には、インターフェロン等の抗がん剤とは異なり、血小板や白血球の減少等の副作用はなく、日常薬として長期にわたり継続して服用できる。
【解決手段】
本発明の肝臓保護剤、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによる肝がんの発症抑制剤、および医薬組成物は、ブルーベリーの葉の加工処理物、例えば、ブルーベリー葉の破砕物、抽出物または搾汁を有効成分として用いる。ブルーベリー葉の加工処理物には、インターフェロン等の抗がん剤とは異なり、血小板や白血球の減少等の副作用はなく、日常薬として長期にわたり継続して服用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然の植物成分を有効成分とする肝臓保護剤、肝がん発症抑制剤、及びそれらの医薬組成物としての用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本人の肝がんの発生数は、各種がんの中でも上位にある。肝がんの罹患数は未だ増加傾向にあり、特に高齢者の割合が高まっている。肝がんの早期発見・早期治療が重要であることは言うまでもないが、より大切なのは、肝臓、特に慢性肝炎や肝硬変の患者について肝臓を保護すること、慢性肝炎や肝硬変から前癌病変を経て肝がん発症にいたる肝がんへの進展を抑制すること、その結果として肝がんの発症を抑制することである。
【０００３】
近年、慢性肝炎や肝硬変の進行を抑制し、肝がんの発症を遅延させる治療に、インターフェロンが広く使用されている。しかしながら、有効量のインターフェロン投与は、脱毛、食欲減退、鬱、血小板の減少など副作用が強く、長期にわたる継続的治療には問題がある（非特許文献１）。また、病態によりインターフェロン投与が困難な患者も少なくない。従って、副作用が少なく、安全かつ簡便に投与でき、長期にわたって服用することが可能な肝臓保護剤、または肝がんへの進展を抑制して肝がんの発症を阻止する薬物が切望されている。
【０００４】
ところで、本発明と同様にブルーベリーの葉に由来する植物成分に着目して、その薬理機能を開示する文献として非特許文献２および３を挙げることができる。
【０００５】
非特許文献２は、ブルーベリー培養細胞のアントシアニンとフラボノイド含量について、実と紅葉（red leaves）とを比較定量し、ラビットアイブルーベリーの葉、特に紅葉には、実と同等量のアントシアニンが、また実より多くのフラボノイドが含まれていることを開示している。また、ハイブッシュブルーベリー葉のエタノール抽出物に、抗酸化機能があることも指摘している。しかしながら、ブルーベリー葉に、肝臓保護作用、特に前癌病変から肝がんへの進展抑制作用や肝がんの発症抑制作用があることについての言及はない。
【０００６】
また当該非特許文献２には、ブルーベリーの葉にケルセチンが含まれていることが開示されている。これに関連して、非特許文献３には、ケルセチンを含むキョウチクトウ科の植物アポシナム・ベネタム（Apocynum Venetum）の葉に、四塩化炭素及びガラクトソアミン誘導ラットにおける肝障害保護作用があることが、ＡＬＴ等の肝機能血液検査の結果に基づいて示されている。しかしながら、非特許文献３の肝機能血液検査の結果は、アポシナム・ベネタム葉の水抽出物そのものの作用を示すものであり、同葉に含まれる多数のフラボノイド中のケルセチン固有の効果を直接的に示すものではない。このように、ある同一の物質を含む種々の天然植物成分が、同様の生理活性を有するとは言えない。
【非特許文献１】「Ｃ型慢性肝炎に対する最近の話題 ＩＦＮの副作用とその対策」Ｍｅｄ Ｄｉｇ Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，１９−２２（１９９７．１１）
【非特許文献２】Shioka Hamamatsu et al “Compositions of Anthocyanin and Other Flavonoids in Cultured Cells of Rabbiteye Blueberry (Vaccinium ashei Reade ev. Tifblue)” Food Sci. Technol. Res. 10 [3] 239-246 (2004)
【非特許文献３】Quangbo Xiong et al ”Hepatoprotective Effect of Apocynum venetum and its active constituents”Plant Medica [66] 127-133 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、かかる現況にかんがみ、ブルーベリー葉の種々の機能につきin vitro試験を行った結果、ブルーベリー葉に肝がん細胞の増殖抑制作用およびＣ型肝炎ウイルス感染細胞の増殖抑制作用があることを見出し、既に特許出願済みである（特願２００５−２０３５８４、特願２００５−３１３９９５）。確かに、肝がん発症後にそれを治療する必要性は高いものの、近年予防医学という観点から、事前に肝がんの発症を阻止する必要性が叫ばれている。
【０００８】
本発明は、かかる観点から、安全で長期の投与に耐える植物由来の肝臓保護剤を提供することを目的としている。
【０００９】
また本発明は、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによって肝がんの発症を抑止する薬剤を提供することを目的としている。
【００１０】
さらに本発明は、肝臓保護作用及び肝がん発症抑制作用を有し、肝疾患を惹起する確度の高い及び／または肝疾患を発症している患者に対して、肝機能の増悪を抑制するために、また、前癌病変を有する肝がん発症前の患者に対して、専ら肝がん発症を抑制するために用いられる（言い換えれば、肝がん予防剤として用いられる）、植物由来の医薬品組成物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解消すべく、さらにブルーベリー葉について、in vivo試験によって肝臓機能への影響を検討した結果、驚くべきことに、ブルーベリー葉に肝臓保護作用、及び前癌病変から肝がんへの進展を抑制し、肝がんの発症を抑制する作用があることを見出し、本発明にいたった。
【００１２】
前期目的を達成した本発明は、次の態様を特徴としている。
項１：ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤。
項２：ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とし、肝がんへの進展を抑制することを特徴とする肝がん発症抑制剤。
項３：血中のアラニントランスアミナーゼ値が異常値を示す患者に対し、肝機能の増悪を抑制するために用いられる項１の肝臓保護剤を含む医薬品組成物。
項４：前癌病変を有する患者に対し、肝がんへの進展を抑制するために用いられる、項２記載の肝がん発症抑制剤を有効成分とする医薬品組成物。
【００１３】
本発明において、ブルーベリー葉の肝臓保護作用とは、肝機能増悪の可能性が予測及び／または誘発された段階での作用を意味し、肝がんの発症抑制作用とは、肝がん発症前の段階での作用を意味する。また、肝機能の増悪とは、ＡＬＴないしは、後述実施例中に記載するその他の血液肝機能検査項目であるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン（ＴＢ）のうちいずれかの値が各正常値を超えて上昇するものを意味する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のブルーベリー葉の加工処理物、例えばブルーベリー葉の粉砕物、搾汁及び／又は抽出物等を有効成分とする肝臓保護剤は、肝疾患を発症する確率が高いか、または既に肝疾患を発症している患者に対して、肝機能の増悪を抑制するため有効に用いることができる。また、本発明の肝がん発症抑制剤は、特に前癌病変から肝がんへの進展を抑制する作用に優れているため、前癌病変を有する肝がん発症前の患者について肝がんの発症を抑制するために、言い換えれば肝がん予防剤として有効に用いることができる。
【００１５】
さらに本発明のブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤および肝がん発症抑制剤は、後述する反復投与毒性試験で示すように、ラットへの亜急性毒性における血液及び組織の異常が認められないことから、肝疾患を発症する確率が高いか若しくは発症している患者、慢性肝炎や肝硬変の患者、またはＣ型肝炎ウイルスキャリアー患者等に長期に亘り、安心して投与することができる。特にインターフェロン投与が困難な患者にとっては、今のところ適切な代替治療剤がないだけに大きな福音になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
一般にブルーベリーは、ツツジ科（Ericaceae）スノキ属（Vaccinium）サイアノココス節（Cyanococcus）に分類される、落葉性あるいは常緑性の、低木性（または半高木性）の果樹である（Vander Kloet, 1988:玉田、1996）。ブルーベリーはおよそ6種類からなるが、果樹園芸上重要な種は、(1)ハイブッシュブルーベリー（Highbush blueberry, Vaccininum corymbosum. L）、(2)ラビットアイブルーベリー（Rabbiteyeblueberry, V. ashei Reade）、(3)ローブッシュブルーベリー（Lowbushblueberry, V.angstifolium MichauxとV.myrtilloidesAition）の３つである。
【００１７】
本発明のブルーベリー葉として用いられるブルーベリーは、その種類や原産地を特に制限するものではなく、いずれも使用することができるが、本発明の薬理機能の点からラビットアイブルーベリーが望ましい。
【００１８】
本発明で用いるブルーベリー葉は、その薬理機能及び食感の観点から、萌芽して紅葉前までのブルーベリー青葉が望ましい。この時期のブルーベリー葉（青葉）は、肝臓保護作用、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによる肝がん発症抑制作用を示すばかりでなく、紅葉した葉が有する苦味がなく、熱水抽出時の風味においてすぐれている。
【００１９】
本発明においてブルーベリー葉は、葉を採取後加工処理した加工処理物として用いる。加工処理物としては、ブルーベリー葉の粉砕物（生、乾燥物）、搾汁、任意の溶媒による抽出物を用いることができるが、本発明の薬理機能及び加工容易性から葉の粉砕物、抽出物が望ましい。
【００２０】
乾燥粉砕物は、ブルーベリー葉を乾燥した後粉砕するか、または葉を細く切断した後に乾燥することによって調製する。乾燥には、本発明の薬理効果を損なわない範囲であれば特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。好ましくは、成分変化の少ない真空凍結乾燥である。真空凍結乾燥条件は、原料葉の状態によって異なるので特定できないが、例えば生葉をそのまま乾燥する際、凍結温度は−３０℃〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５時間〜２４時間の範囲が望ましい。
【００２１】
ブルーベリー葉の抽出物は、葉をそのまま、もしくは破砕物とした後、抽出操作に供するか、また乾燥後、必要に応じて粉砕し、しかる後抽出操作に供することによって調製することができる。また葉の搾汁も、上記抽出原料として使用することができる。なお、かかる葉の搾汁は、必要に応じて、濃縮または乾燥した後に抽出操作に供してもよい。
【００２２】
抽出溶媒には、水、エタノールが安全上望ましいが、抽出溶媒を完全留去して、ブルーベリー葉を抽出物の乾燥粉末として調製する場合には、メタノールやブタノールのごとき低級アルキルアルコール、あるいはアセトン、ＤＭＳＯのごとき溶媒も使用や種々の溶媒を組み合わせた多段階抽出も可能である。
【００２３】
得られた抽出物は、必要に応じて、ろ過または遠心分離などの操作により固形物を除去する。次の工程で行われる操作に応じては、抽出物をそのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。また得られた抽出物は、濃縮もしくは乾燥後、さらに適正な溶媒、例えば、非溶解性溶媒で洗浄精製して用いても、またこれを更に適当な溶媒に溶解若しくは懸濁して用いることもできる。さらに本発明においては、例えば、得られた溶媒抽出液を、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段に供して、ブルーベリー葉の乾燥抽出エキスとして使用することもできる。
【００２４】
このようにして得られるブルーベリー葉の加工処理物は、後述の実施例で示すように、肝臓保護作用（表４及び表８参照）、および前癌病変から肝がんへの進展を抑制して肝がんの発症を抑止する作用（図２−図４参照）を有している。
【００２５】
表４は、発がん起始物質であるＮ−ニトロソ化合物（イニシエーター）、及び発がん促進物質（プロモーター）であるバルビツール酸系化合物によって肝細胞前癌病変を誘導したモデルラットの血液中のアラニントランスアミナーゼ値（血液ＡＬＴ値）を示しており、本発明のブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与ラット群の血液ＡＬＴ値は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉非投与コントロール群に比して、有意な低下が認められる。さらに後述する反復投与毒性試験においても、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与ラット群の血液ＡＬＴ値と血液中のアルカリフォスファターゼ値（血液ＡＬＰ値）は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末未投与コントロール群に比して、低下する傾向が認められる。なお、血液ＡＬＴ値およびＡＬＰ値は、いずれも肝機能障害の指標として広く利用されているものである（例えば、「高久史麿、尾形悦郎、黒川 清、矢崎義雄 編、新臨床内科学 第8版p804-805 (2002年)（医学書院）」など参照）。これらのことからわかるように、本発明で用いるブルーベリー葉凍結乾燥粉末は、血中のアラニントランスアミナーゼ値が異常値を示す患者に対して、肝臓を保護する作用を有する。
【００２６】
よって本発明は、前述するブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤を提供するものである。肝臓保護剤中に含まれるブルーベリー葉の加工処理物の割合は、当該肝臓保護剤が上記肝臓保護作用を発揮する限り特に制限されず、ブルーベリー葉の加工処理物を100％含有するものであってもよい。
【００２７】
また本発明は、前述するブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝がん発症抑制剤をも提供する。
【００２８】
ここでブルーベリー葉による肝がん発症抑制作用の機序は必ずしも明確ではないが、図１及び図２からわかるように、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末を投与していない群に対して、当該粉末を投与した群は、肝がん前癌病変の発症個数に有意な変化は認めがたいものの、その進展度合いを示す病変部の面積は有意に減少している。このことから、ブルーベリー葉は、前癌病変のイニシエーション因子よりもプロモーション因子に関与しており、前癌病変の発生抑制作用よりも、むしろ発生した前癌病変が肝がんに進展することを抑制する作用を有するものと推定される。いずれにしても、本発明の肝がん発生抑制剤は、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによって、結果的に肝がんの発症を抑制する作用を発揮するものである。
【００２９】
当該肝がん発生抑制剤中に含まれるブルーベリー葉の加工処理物の割合は、当該肝がん発生抑制剤が少なくとも上記の肝がんへの進展抑制作用を発揮する限り特に制限されず、ブルーベリー葉の加工処理物を100％含有するものであってもよい。
【００３０】
本発明に用いるブルーベリー葉には、後述するように、ラットへの反復投与毒性試験において、血液及び組織異常は認められない。インターフェロンはその投与により平均して約２０％程度血小板数が減少するとの報告があるが、ブルーベリー葉には、こうした血小板数の有意な減少は認められない。具体的には、ラットにブルーベリーの葉３％を含む飼料を与えた場合、その血小板数はオスで111.1±4.1、メスで98.2±3.5である。ブルーベリー葉を与えなかったコントロール群では、オス111.5±4.5、メス102.7±3.7である（いずれも単位は「×10000/mm3」である）。
【００３１】
このことから、ブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤および肝がん発生抑制剤は、安全性が高く長期投与も可能で、医薬組成物の有効成分として有効に利用できるものであると判断される。
【００３２】
ゆえに、本発明の肝臓保護剤および肝がん発症抑制剤は、上記ブルーベリー葉の加工処理物（特に粉砕物、搾汁、もしくは抽出物）を単独で、固体または液体状で利用することもできるが、これに薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬組成物として製剤することもできる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、その形態に特に制限はないが、経口に適した形態であることが好ましい。例えば、経口投与用固体組成物（固形医薬製剤）としては、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の形態を、また経口投与用液状組成物（液状医薬製剤）としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態をとることができる。これらの製剤には、有効成分に加えて、剤形に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐH調整剤等を適宜配合、常法に従って調製することができる。
【００３４】
また本発明の医薬組成物には、有効成分であるブルーベリー葉、及び前記担体または添加剤に加えて、ビタミン等の他の機能性成分が含まれていてもよい。医薬組成物の有効成分の組成比は、使用目的等によって異なるので特定はできないが、後述の有効投与量を基準値として、適宜調整可能である。
【００３５】
本発明の医薬組成物の有効投与量は、投与法、投与期間、患者の病態、年齢、性別、投与目的、その他の条件に応じて広範囲から選択できる。例えば、本発明の医薬組成物を肝臓保護剤または肝がん発症抑制剤として用いる場合の体重60kgのヒトに対する１回投与あたりの量として、ブルーベリー葉の乾燥重量に換算して約１００〜６０００ｍｇ、好ましくは約５００〜２０００ｍｇの範囲を挙げることができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物の投与時期及び期間は、有効成分が植物起源の安全で副作用の少ないブルーベリー葉であることから特に制限はない。
【００３７】
具体的には、本発明の肝臓保護剤を有効成分とする医薬組成物は、血中のアラニントランスアミナーゼ値（血液ＡＬＴ値）が異常値を示す患者を対象として、当該患者について肝機能増悪の可能性が予測される段階及び／または肝機能増悪が誘発された段階に投与することができる。
【００３８】
血液ＡＬＴ値は、前述するように肝機能を評価する指標値として広く使用されている値であり（高久史麿、尾形悦郎、黒川清、矢崎義雄編、新臨床内科学第8版、p804-805 (2002年)（医学書院））、通常、男性の場合8〜42IU/L、女性の場合6〜27IU/Lの範囲にあれば正常であると判断される。従って、本発明が対象とする「血液ＡＬＴ値が異常値を示す患者」は、血液ＡＬＴ値が上記正常の範囲外にある患者、
特に血液ＡＬＴ値が上記正常の範囲外となる可能性の高い、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアー、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変肝患者である。また肝機能の増悪（誘発、進展）の有無は、上記血液ＡＬＴ値のほか、血液肝機能検査で慣用されるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、および総ビリルビン（ＴＢ）の値から定法に従って評価することができる。
【００３９】
また本発明の肝がん発症抑制剤を有効成分とする医薬組成物は、前癌病変を有する患者、すなわち肝がん発症リスクの高い患者（具体的にはＣ型肝炎ウイルスキャリアー、慢性肝炎、または肝硬変の患者等）を対象として、肝がんを発症する前の段階に投与することが効果的である。
【００４０】
なお、患者について肝がんを発症しているか否かの判断は、当業界の技術常識に基づいて病理組織学的な側面から行うことができる。例えば、実験例で示すように、細胞の異型性の程度、細胞分裂像の増加、および増殖パターン、特に周囲組織に浸潤性に増殖するパターンが病変部の肝細胞に認められる場合、肝がん発症と判断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の肝臓保護剤、肝がんへの進展を抑制することによる肝がん発症抑制剤、並びに本発明のブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする医薬組成物は、血液ＡＬＴ値が異常値を示す患者、具体的には肝疾患を発症するリスクの高い患者や肝疾患を発症している患者、および前癌病変を有する患者（Ｃ型肝炎ウイルスキャリアー、慢性肝炎、または肝硬変の患者等）に対する肝機能改善薬として、また肝がん発症への予防的医薬品として、広く利用することができる。特に、血小板や白血球の減少等により、インターフェロン治療ができない患者に、長期に亘り安心して服用できる日常薬としての利用性が高い。
【実施例】
【００４２】
以下、実験例を用いて本発明をより詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって制限されるものではない。なお、実施例中、「％」は特に言及しないかぎり、「Ｗ／Ｗ％」を意味する。
【００４３】
実験例１
（１）ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の調製
ラビットアイブルーベリー種のホームベルの９月採取の生葉（青葉）を、−３０℃で凍結したのち、真空凍結乾燥機（日本ドライフーズ株式会社）により、最高棚温６５℃、最終品温４０℃、乾燥時間25時間の条件で真空凍結乾燥した。次いで、粉砕機を用いて粉砕し、１．０ｍｍスクリーンを通過させることにより、ブルーベリー葉の乾燥粉末物を得た。
【００４４】
（２）給餌飼料の調製
（１）で調製したブルーベリー葉凍結乾燥粉末を用いて、表１に示す組成の給餌飼料を調製した。被検給餌試料は、ラットの一般飼料成分に、上記で調製したブルーベリー葉凍結乾燥粉末を３．０％の配合割合となるように添加混合して調製した。コントロール給餌飼料は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末を添加しない一般飼料で調製した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
（３）試験方法
被検動物として、実験前の一定期間、ＣＥ−２粉末飼料（日本クレア株式会社より購入）で飼育したWistar系雄ラットを用いた。Wistar系雄ラット（７週齢、初体重１９２〜２３４ｇ）を４群に群分けした（表２参照）。群分け時の群間の平均体重には統計学的な有意差はなかった。
【００４７】
第２群と第４群の被検動物には、前述する被検給餌飼料（ブルーベリー葉添加）を、また第１群及び第３群の被験動物には、コントロール給餌飼料（ブルーベリー葉非添加）を１５週間に亘って投与した。このうち、第１群と第２群の被験動物には、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の前癌病変発症抑制作用を見るため、給餌飼料投与開始から１週間目に発がん起始物質（イニシエーター）であるＮ−ニトロソ化合物〔ＤＥＮ（N-nitrosodiethylamine diethylnitrosamine）〕を、ＤＥＮ２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で単回腹腔内投与した。なお、ＤＥＮは生理食塩水に溶解して用いた。一方、比較のため、第３群と第４群の被験動物には、給餌飼料投与開始から１週間目に生理食塩液のみを同様に腹腔内投与した。
【００４８】
次いで、発症した前癌病変に対するブルーベリー葉凍結乾燥粉末の進展抑制作用を見るため、第１群と第２群の被検動物に、ＤＥＮの腹腔内投与１週間後から１３週間に亘って、発がん促進物質（プロモーター）であるバルビツール酸系化合物〔ＰＢ （Phenobarbital）〕の０．０５％水溶液を飲水させた。一方、比較のため、第３群と第４群の被検動物には、生理食塩水の腹腔内投与１週間後から１３週間に亘って、通常水を飲水させた。
【００４９】
各群の発がん物質（ＤＥＮおよびＰＢ）投与の有無、被検給餌飼料およびコントロール給餌飼料の別、及び動物数を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
投与期間終了後、エーテル麻酔下に開腹し、下部大静脈より採血し、放血致死させた後、肝臓を摘出した。採血した血液を肝機能検査に供し、摘出した肝臓は免疫組織化学的検査に供した。
【００５２】
（3-1）血液肝機能検査
アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン（ＴＢ）の濃度測定を株式会社エスアールエルに依頼した。
【００５３】
（3-2）免疫組織化学的検査
肝臓の右葉（外側）、右葉（内側）及び左葉（内側）から各１片の計３片を切り出し、１０％緩衝ホルマリン液にて固定した。次いで、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、薄切して肝臓切片を作製した後、ペルオキシダーゼ標識ポリマー（DAKO株式会社製）を用いた間接法にて、当該肝臓切片における胎盤型Glutathione S−transferase（ＧＳＴ−Ｐ）を免疫組織化学的に染色した。胎盤型ＧＳＴ−Ｐは正常のラット肝臓には存在しないが、ラット肝臓前癌病変および肝癌細胞では発現することが良く知られているマーカー酵素である〔Osada et al.,”Altered gene expression of transcriptional regulatory factors in tumor marker-positive cells during chemically induced hepatocarcinogenesis”
Toxicol Lett. Dec [167]106-13 (2006).〕〔Satoh et al., ”Purification, Induction, and Distribution of Placental Glutathione Transferase: A New Marker Enzyme for Preneoplastic Cells in the Rat Chemical Hepatocarcinogenesis” Proc Natl Acad Sci U S A. Jun [82] 3964-8 (1985) 〕。
【００５４】
肝臓切片の直径０．２ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の短径及び長径を、病理標本画像解析装置（オリンパス株式会社製）を用いて計測し、ラット１匹あたりのＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の個数及び概算重量を算出した。ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の概算重量は、Battelle Columbus Laboratoriesによる方法（短径の二乗×長径／２）を用いて算出した。
【００５５】
（４）試験結果
実験前後のラット体重、摂食量、肝重量の結果を表３に、肝機能検査の結果を表４に、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の個数の結果とその抑制率を図１及び表５に、概算重量の結果とその抑制率を図２及び表６に示す。また、ＧＳＴ−Ｐ免疫染色結果の代表的な画像を図３（コントロール群）及び図４(ブルーベリー葉投与群)に、被検群１の肝臓組織に形成された癌病変の画像を図５に各々示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表３より終体重に及ぼすブルーベリー葉凍結乾燥粉末の明確な影響は観察されなかった。摂食量は、発がん物質投与によって低下したが、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末による影響は観察されなかった。肝重量は、発がん物質投与によって増加したが、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末により低下傾向を示した。
【００５８】
【表４】
【００５９】
表４の血液肝機能検査の結果、被検群２は、被検群１に比して、肝障害を示すＡＬＴ値及びＴＢ値が有意に減少し、ＡＬＰ値が減少傾向であることが確認された。また、被検群４は、被検群３に比して、ＴＢ値が減少傾向であることが確認された。この結果よりブルーベリー葉が肝臓保護作用を有することが示唆された。
【００６０】
免疫組織化学的検査では、直径０．２ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣につき、画像解析装置を用いて解析した。その結果図１に示すように、被検群１（発がん物質投与／コントロール給餌飼料投与群、代表図；図３）の結果と、被検群２（発がん物質投与／被検給餌飼料投与群、代表図；図４）の結果との比較からわかるように、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の平均個数は、直径０．２ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の平均個数についてはブルーベリー葉凍結乾燥粉末の投与による影響は観察されないが、直径０．３ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の平均個数では、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の投与により減少した。また図２より、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の概算重量も、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の投与により減少した。被検群３と４の被検動物では、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣は観察されなかった。
【００６１】
ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の個数及び概算重量に基づくブルーベリー葉凍結乾燥粉末の抑制率を次式により算出した結果、表５に示すようにブルーベリー葉凍結乾燥粉末の前癌病変発生抑制率を示す個数では、直径０．３ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣については４３．５％、直径０．４ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣については４６．８％、直径０．５ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣については５５．３％であった。また、表６に示すように同前癌病変進展抑制率を示す概算重量では、０．００４ｍｇ以上が６４．１％、０．０２ｍｇ以上が８３．４％、０．０５ｍｇ以上が８６．２％、０．１ｍｇ以上が８７．７％であった。
【００６２】
【数１】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【００６５】
被検群１には直径1.5mm以上のＧＳＴ−Ｐ陽性結節が一ヶ所形成されており（図５-A）、この病変においては変異肝細胞の間質および周囲肝実質への浸潤性増殖(図5-B）とともに、非腫瘍部の肝細胞と比較して核の腫大と明瞭な核小体が明らかであり、多くの細胞分裂像（矢印）を伴っている（図5-C, D)。このように明らかな浸潤と細胞異型を示すことから、病理組織学的に肝細胞癌と診断された。しかしながら、ブルーベリー葉投与群（被検群２）にはこのような病変は認められなかった。
【００６６】
以上、実施例の結果から、ブルーベリー葉には次の薬理作用があることが判明した。
【００６７】
（ａ）血液肝機能検査の結果、ブルーベリー葉の投与により肝機能障害の指標であるＡＬＴ及びＴＢが有意に減少していたことから、ブルーベリー葉には肝臓保護作用がある。
【００６８】
（ｂ）免疫組織化学的検査の結果、被験動物の肝臓組織におけるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣（前癌病変）の個数は、ブルーベリー葉投与群とコントロール群との間に明らかな差を認めないにもかかわらず、その平均サイズがブルーベリー葉投与群においては強く抑制されたことから、ブルーベリー葉がＧＳＴ−Ｐ陽性変異肝細胞の過剰増殖を抑制していると考えられる。この結果はブルーベリー葉投与が発がんイニシエーター（この場合はニトロソアミン）による遺伝子変異の結果もたらされる変異細胞の出現よりも、発がんプロモーター（この場合はフェノバルビタール）による変異細胞の過剰増殖に強く干渉しこれを抑制していることを示している。よって、ブルーベリー葉には前癌病変の進展抑制作用（前癌病変から肝がんへの進展抑制作用、言い換えれば肝がん発症抑制作用）が顕著である。
【００６９】
実験例２ 反復投与毒性試験
被検動物として、実験前の一定期間、ＣＥ−２粉末飼料（九動株式会社より購入）で飼育したSprague-Dawley系雌雄ラットを用いた。雌雄ラット（５週齢、初体重オス１３１〜１３３ｇ、メス１１１〜１１２ｇ）をそれぞれ２群に群分けした。群分け時の群間の平均体重には統計学的な有意差はなかった。被検動物には、前述する被検給餌飼料（ブルーベリー葉添加）及びコントロール給餌飼料（ブルーベリー葉非添加）を１ヶ月に亘って投与した。
【００７０】
また、投与期間中、ラットを一日絶食させ、尿を採取した。
【００７１】
投与期間終了後、絶食下でラットを屠殺し、血液、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓を採取した。血液は生化学的指数及び血球の性状検査に供し、各種臓器は重量測定後、病理組織学的検査に供した。
【００７２】
尿は、尿タンパク質、尿ブドウ糖、尿ウロビリノーゲンを測定した。
【００７３】
血液は、総タンパク質、アルブミン／グロブリン比、アルブミン、トリグリセリド、総コレステロール、尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、クロール、カリウム、カルシウム、無機リン酸、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アルカリフォスファターゼ、血小板A、血液像、血色素量、赤血球数、白血球数、ヘマトクリット、MCV、MHC、MCHCの測定を株式会社エスアールエルに依頼した。
【００７４】
各種臓器は１０％緩衝ホルマリン液にて固定した。次いで、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、薄切して各種臓器切片を作製した後、ヘマトキシリン及びエオジン溶液で染色した。
【００７５】
実験前後のラット体重、摂食量、各種臓器重量の結果を表７に、血液検査結果を表８に、尿検査結果を表９にそれぞれ示す。各種臓器の病理組織学検査の画像を図６−１０に示す。
【００７６】
【表７】
【００７７】
【表８】
【００７８】
【表９】
【００７９】
表７に示すように、終体重は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群によりオスで減少したが、摂食量に及ぼす影響は観察されなかった。
【００８０】
表８に示すように、総タンパク質及びアルブミンはブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群によりメスで増加した。赤血球数はブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群によりオスで増加した。しかし、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与による各種血液パラメーターの異常はいずれの群においても認められなかった。
【００８１】
また、表８中肝機能障害の指標であるＡＬＴ値及びＡＬＰ値は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末未投与群と比較し、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群において低値を示した。この結果よりブルーベリー葉が肝臓保護作用を有することが示唆された。
【００８２】
表９に示すように、尿パラメーターに及ぼすブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与による影響は観察されなかった。
【００８３】
図６−１０に示すように、各種臓器の病理学的検査の結果、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与による組織および細胞の形態学的異常は認められなかった。
【００８４】
以上の反復投与毒性試験の結果からわかるように、ブルーベリー葉投与による毒性は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】直径0.2mm以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣のラット１匹あたりの平均個数を、細胞巣のサイズ別に示した図である。
【図２】直径0.2mm以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣のラット１匹あたりの概算総重量を示す図である。
【図３】被検群１の肝臓組織に形成されたＧＳＴ−Ｐ陽性前癌病変（ＧＳＴ−Ｐ免疫染色画像）を示す図である。
【図４】被検群２の肝臓組織に形成されたＧＳＴ−Ｐ陽性前癌病変（ＧＳＴ−Ｐ免疫染色画像）を示す図である。
【図５】被検群１の肝臓組織に形成された癌病変を示す図である（A: GST-P免疫染色結果の弱拡大画像。B: 病変部辺縁の中拡大像（ヘマトキシリン・エオジン染色。腫瘍細胞（T）、非腫瘍部（N））。C: 腫瘍部分の強拡大像（ヘマトキシリン・エオジン染色）。Ｄ:非腫瘍部の肝細胞の強拡大像（ヘマトキシリン・エオジン染色）。
【図６】反復投与毒性試験に用いたラット肝臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図７】反復投与毒性試験に用いたラット心臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図８】反復投与毒性試験に用いたラット肺の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図９】反復投与毒性試験に用いたラット腎臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図１０】反復投与毒性試験に用いたラット脾臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然の植物成分を有効成分とする肝臓保護剤、肝がん発症抑制剤、及びそれらの医薬組成物としての用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本人の肝がんの発生数は、各種がんの中でも上位にある。肝がんの罹患数は未だ増加傾向にあり、特に高齢者の割合が高まっている。肝がんの早期発見・早期治療が重要であることは言うまでもないが、より大切なのは、肝臓、特に慢性肝炎や肝硬変の患者について肝臓を保護すること、慢性肝炎や肝硬変から前癌病変を経て肝がん発症にいたる肝がんへの進展を抑制すること、その結果として肝がんの発症を抑制することである。
【０００３】
近年、慢性肝炎や肝硬変の進行を抑制し、肝がんの発症を遅延させる治療に、インターフェロンが広く使用されている。しかしながら、有効量のインターフェロン投与は、脱毛、食欲減退、鬱、血小板の減少など副作用が強く、長期にわたる継続的治療には問題がある（非特許文献１）。また、病態によりインターフェロン投与が困難な患者も少なくない。従って、副作用が少なく、安全かつ簡便に投与でき、長期にわたって服用することが可能な肝臓保護剤、または肝がんへの進展を抑制して肝がんの発症を阻止する薬物が切望されている。
【０００４】
ところで、本発明と同様にブルーベリーの葉に由来する植物成分に着目して、その薬理機能を開示する文献として非特許文献２および３を挙げることができる。
【０００５】
非特許文献２は、ブルーベリー培養細胞のアントシアニンとフラボノイド含量について、実と紅葉（red leaves）とを比較定量し、ラビットアイブルーベリーの葉、特に紅葉には、実と同等量のアントシアニンが、また実より多くのフラボノイドが含まれていることを開示している。また、ハイブッシュブルーベリー葉のエタノール抽出物に、抗酸化機能があることも指摘している。しかしながら、ブルーベリー葉に、肝臓保護作用、特に前癌病変から肝がんへの進展抑制作用や肝がんの発症抑制作用があることについての言及はない。
【０００６】
また当該非特許文献２には、ブルーベリーの葉にケルセチンが含まれていることが開示されている。これに関連して、非特許文献３には、ケルセチンを含むキョウチクトウ科の植物アポシナム・ベネタム（Apocynum Venetum）の葉に、四塩化炭素及びガラクトソアミン誘導ラットにおける肝障害保護作用があることが、ＡＬＴ等の肝機能血液検査の結果に基づいて示されている。しかしながら、非特許文献３の肝機能血液検査の結果は、アポシナム・ベネタム葉の水抽出物そのものの作用を示すものであり、同葉に含まれる多数のフラボノイド中のケルセチン固有の効果を直接的に示すものではない。このように、ある同一の物質を含む種々の天然植物成分が、同様の生理活性を有するとは言えない。
【非特許文献１】「Ｃ型慢性肝炎に対する最近の話題 ＩＦＮの副作用とその対策」Ｍｅｄ Ｄｉｇ Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，１９−２２（１９９７．１１）
【非特許文献２】Shioka Hamamatsu et al “Compositions of Anthocyanin and Other Flavonoids in Cultured Cells of Rabbiteye Blueberry (Vaccinium ashei Reade ev. Tifblue)” Food Sci. Technol. Res. 10 [3] 239-246 (2004)
【非特許文献３】Quangbo Xiong et al ”Hepatoprotective Effect of Apocynum venetum and its active constituents”Plant Medica [66] 127-133 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、かかる現況にかんがみ、ブルーベリー葉の種々の機能につきin vitro試験を行った結果、ブルーベリー葉に肝がん細胞の増殖抑制作用およびＣ型肝炎ウイルス感染細胞の増殖抑制作用があることを見出し、既に特許出願済みである（特願２００５−２０３５８４、特願２００５−３１３９９５）。確かに、肝がん発症後にそれを治療する必要性は高いものの、近年予防医学という観点から、事前に肝がんの発症を阻止する必要性が叫ばれている。
【０００８】
本発明は、かかる観点から、安全で長期の投与に耐える植物由来の肝臓保護剤を提供することを目的としている。
【０００９】
また本発明は、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによって肝がんの発症を抑止する薬剤を提供することを目的としている。
【００１０】
さらに本発明は、肝臓保護作用及び肝がん発症抑制作用を有し、肝疾患を惹起する確度の高い及び／または肝疾患を発症している患者に対して、肝機能の増悪を抑制するために、また、前癌病変を有する肝がん発症前の患者に対して、専ら肝がん発症を抑制するために用いられる（言い換えれば、肝がん予防剤として用いられる）、植物由来の医薬品組成物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解消すべく、さらにブルーベリー葉について、in vivo試験によって肝臓機能への影響を検討した結果、驚くべきことに、ブルーベリー葉に肝臓保護作用、及び前癌病変から肝がんへの進展を抑制し、肝がんの発症を抑制する作用があることを見出し、本発明にいたった。
【００１２】
前期目的を達成した本発明は、次の態様を特徴としている。
項１：ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤。
項２：ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とし、肝がんへの進展を抑制することを特徴とする肝がん発症抑制剤。
項３：血中のアラニントランスアミナーゼ値が異常値を示す患者に対し、肝機能の増悪を抑制するために用いられる項１の肝臓保護剤を含む医薬品組成物。
項４：前癌病変を有する患者に対し、肝がんへの進展を抑制するために用いられる、項２記載の肝がん発症抑制剤を有効成分とする医薬品組成物。
【００１３】
本発明において、ブルーベリー葉の肝臓保護作用とは、肝機能増悪の可能性が予測及び／または誘発された段階での作用を意味し、肝がんの発症抑制作用とは、肝がん発症前の段階での作用を意味する。また、肝機能の増悪とは、ＡＬＴないしは、後述実施例中に記載するその他の血液肝機能検査項目であるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン（ＴＢ）のうちいずれかの値が各正常値を超えて上昇するものを意味する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のブルーベリー葉の加工処理物、例えばブルーベリー葉の粉砕物、搾汁及び／又は抽出物等を有効成分とする肝臓保護剤は、肝疾患を発症する確率が高いか、または既に肝疾患を発症している患者に対して、肝機能の増悪を抑制するため有効に用いることができる。また、本発明の肝がん発症抑制剤は、特に前癌病変から肝がんへの進展を抑制する作用に優れているため、前癌病変を有する肝がん発症前の患者について肝がんの発症を抑制するために、言い換えれば肝がん予防剤として有効に用いることができる。
【００１５】
さらに本発明のブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤および肝がん発症抑制剤は、後述する反復投与毒性試験で示すように、ラットへの亜急性毒性における血液及び組織の異常が認められないことから、肝疾患を発症する確率が高いか若しくは発症している患者、慢性肝炎や肝硬変の患者、またはＣ型肝炎ウイルスキャリアー患者等に長期に亘り、安心して投与することができる。特にインターフェロン投与が困難な患者にとっては、今のところ適切な代替治療剤がないだけに大きな福音になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
一般にブルーベリーは、ツツジ科（Ericaceae）スノキ属（Vaccinium）サイアノココス節（Cyanococcus）に分類される、落葉性あるいは常緑性の、低木性（または半高木性）の果樹である（Vander Kloet, 1988:玉田、1996）。ブルーベリーはおよそ6種類からなるが、果樹園芸上重要な種は、(1)ハイブッシュブルーベリー（Highbush blueberry, Vaccininum corymbosum. L）、(2)ラビットアイブルーベリー（Rabbiteyeblueberry, V. ashei Reade）、(3)ローブッシュブルーベリー（Lowbushblueberry, V.angstifolium MichauxとV.myrtilloidesAition）の３つである。
【００１７】
本発明のブルーベリー葉として用いられるブルーベリーは、その種類や原産地を特に制限するものではなく、いずれも使用することができるが、本発明の薬理機能の点からラビットアイブルーベリーが望ましい。
【００１８】
本発明で用いるブルーベリー葉は、その薬理機能及び食感の観点から、萌芽して紅葉前までのブルーベリー青葉が望ましい。この時期のブルーベリー葉（青葉）は、肝臓保護作用、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによる肝がん発症抑制作用を示すばかりでなく、紅葉した葉が有する苦味がなく、熱水抽出時の風味においてすぐれている。
【００１９】
本発明においてブルーベリー葉は、葉を採取後加工処理した加工処理物として用いる。加工処理物としては、ブルーベリー葉の粉砕物（生、乾燥物）、搾汁、任意の溶媒による抽出物を用いることができるが、本発明の薬理機能及び加工容易性から葉の粉砕物、抽出物が望ましい。
【００２０】
乾燥粉砕物は、ブルーベリー葉を乾燥した後粉砕するか、または葉を細く切断した後に乾燥することによって調製する。乾燥には、本発明の薬理効果を損なわない範囲であれば特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。好ましくは、成分変化の少ない真空凍結乾燥である。真空凍結乾燥条件は、原料葉の状態によって異なるので特定できないが、例えば生葉をそのまま乾燥する際、凍結温度は−３０℃〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５時間〜２４時間の範囲が望ましい。
【００２１】
ブルーベリー葉の抽出物は、葉をそのまま、もしくは破砕物とした後、抽出操作に供するか、また乾燥後、必要に応じて粉砕し、しかる後抽出操作に供することによって調製することができる。また葉の搾汁も、上記抽出原料として使用することができる。なお、かかる葉の搾汁は、必要に応じて、濃縮または乾燥した後に抽出操作に供してもよい。
【００２２】
抽出溶媒には、水、エタノールが安全上望ましいが、抽出溶媒を完全留去して、ブルーベリー葉を抽出物の乾燥粉末として調製する場合には、メタノールやブタノールのごとき低級アルキルアルコール、あるいはアセトン、ＤＭＳＯのごとき溶媒も使用や種々の溶媒を組み合わせた多段階抽出も可能である。
【００２３】
得られた抽出物は、必要に応じて、ろ過または遠心分離などの操作により固形物を除去する。次の工程で行われる操作に応じては、抽出物をそのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。また得られた抽出物は、濃縮もしくは乾燥後、さらに適正な溶媒、例えば、非溶解性溶媒で洗浄精製して用いても、またこれを更に適当な溶媒に溶解若しくは懸濁して用いることもできる。さらに本発明においては、例えば、得られた溶媒抽出液を、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段に供して、ブルーベリー葉の乾燥抽出エキスとして使用することもできる。
【００２４】
このようにして得られるブルーベリー葉の加工処理物は、後述の実施例で示すように、肝臓保護作用（表４及び表８参照）、および前癌病変から肝がんへの進展を抑制して肝がんの発症を抑止する作用（図２−図４参照）を有している。
【００２５】
表４は、発がん起始物質であるＮ−ニトロソ化合物（イニシエーター）、及び発がん促進物質（プロモーター）であるバルビツール酸系化合物によって肝細胞前癌病変を誘導したモデルラットの血液中のアラニントランスアミナーゼ値（血液ＡＬＴ値）を示しており、本発明のブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与ラット群の血液ＡＬＴ値は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉非投与コントロール群に比して、有意な低下が認められる。さらに後述する反復投与毒性試験においても、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与ラット群の血液ＡＬＴ値と血液中のアルカリフォスファターゼ値（血液ＡＬＰ値）は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末未投与コントロール群に比して、低下する傾向が認められる。なお、血液ＡＬＴ値およびＡＬＰ値は、いずれも肝機能障害の指標として広く利用されているものである（例えば、「高久史麿、尾形悦郎、黒川 清、矢崎義雄 編、新臨床内科学 第8版p804-805 (2002年)（医学書院）」など参照）。これらのことからわかるように、本発明で用いるブルーベリー葉凍結乾燥粉末は、血中のアラニントランスアミナーゼ値が異常値を示す患者に対して、肝臓を保護する作用を有する。
【００２６】
よって本発明は、前述するブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤を提供するものである。肝臓保護剤中に含まれるブルーベリー葉の加工処理物の割合は、当該肝臓保護剤が上記肝臓保護作用を発揮する限り特に制限されず、ブルーベリー葉の加工処理物を100％含有するものであってもよい。
【００２７】
また本発明は、前述するブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝がん発症抑制剤をも提供する。
【００２８】
ここでブルーベリー葉による肝がん発症抑制作用の機序は必ずしも明確ではないが、図１及び図２からわかるように、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末を投与していない群に対して、当該粉末を投与した群は、肝がん前癌病変の発症個数に有意な変化は認めがたいものの、その進展度合いを示す病変部の面積は有意に減少している。このことから、ブルーベリー葉は、前癌病変のイニシエーション因子よりもプロモーション因子に関与しており、前癌病変の発生抑制作用よりも、むしろ発生した前癌病変が肝がんに進展することを抑制する作用を有するものと推定される。いずれにしても、本発明の肝がん発生抑制剤は、前癌病変から肝がんへの進展を抑制することによって、結果的に肝がんの発症を抑制する作用を発揮するものである。
【００２９】
当該肝がん発生抑制剤中に含まれるブルーベリー葉の加工処理物の割合は、当該肝がん発生抑制剤が少なくとも上記の肝がんへの進展抑制作用を発揮する限り特に制限されず、ブルーベリー葉の加工処理物を100％含有するものであってもよい。
【００３０】
本発明に用いるブルーベリー葉には、後述するように、ラットへの反復投与毒性試験において、血液及び組織異常は認められない。インターフェロンはその投与により平均して約２０％程度血小板数が減少するとの報告があるが、ブルーベリー葉には、こうした血小板数の有意な減少は認められない。具体的には、ラットにブルーベリーの葉３％を含む飼料を与えた場合、その血小板数はオスで111.1±4.1、メスで98.2±3.5である。ブルーベリー葉を与えなかったコントロール群では、オス111.5±4.5、メス102.7±3.7である（いずれも単位は「×10000/mm3」である）。
【００３１】
このことから、ブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤および肝がん発生抑制剤は、安全性が高く長期投与も可能で、医薬組成物の有効成分として有効に利用できるものであると判断される。
【００３２】
ゆえに、本発明の肝臓保護剤および肝がん発症抑制剤は、上記ブルーベリー葉の加工処理物（特に粉砕物、搾汁、もしくは抽出物）を単独で、固体または液体状で利用することもできるが、これに薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬組成物として製剤することもできる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、その形態に特に制限はないが、経口に適した形態であることが好ましい。例えば、経口投与用固体組成物（固形医薬製剤）としては、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の形態を、また経口投与用液状組成物（液状医薬製剤）としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態をとることができる。これらの製剤には、有効成分に加えて、剤形に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐH調整剤等を適宜配合、常法に従って調製することができる。
【００３４】
また本発明の医薬組成物には、有効成分であるブルーベリー葉、及び前記担体または添加剤に加えて、ビタミン等の他の機能性成分が含まれていてもよい。医薬組成物の有効成分の組成比は、使用目的等によって異なるので特定はできないが、後述の有効投与量を基準値として、適宜調整可能である。
【００３５】
本発明の医薬組成物の有効投与量は、投与法、投与期間、患者の病態、年齢、性別、投与目的、その他の条件に応じて広範囲から選択できる。例えば、本発明の医薬組成物を肝臓保護剤または肝がん発症抑制剤として用いる場合の体重60kgのヒトに対する１回投与あたりの量として、ブルーベリー葉の乾燥重量に換算して約１００〜６０００ｍｇ、好ましくは約５００〜２０００ｍｇの範囲を挙げることができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物の投与時期及び期間は、有効成分が植物起源の安全で副作用の少ないブルーベリー葉であることから特に制限はない。
【００３７】
具体的には、本発明の肝臓保護剤を有効成分とする医薬組成物は、血中のアラニントランスアミナーゼ値（血液ＡＬＴ値）が異常値を示す患者を対象として、当該患者について肝機能増悪の可能性が予測される段階及び／または肝機能増悪が誘発された段階に投与することができる。
【００３８】
血液ＡＬＴ値は、前述するように肝機能を評価する指標値として広く使用されている値であり（高久史麿、尾形悦郎、黒川清、矢崎義雄編、新臨床内科学第8版、p804-805 (2002年)（医学書院））、通常、男性の場合8〜42IU/L、女性の場合6〜27IU/Lの範囲にあれば正常であると判断される。従って、本発明が対象とする「血液ＡＬＴ値が異常値を示す患者」は、血液ＡＬＴ値が上記正常の範囲外にある患者、
特に血液ＡＬＴ値が上記正常の範囲外となる可能性の高い、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアー、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変肝患者である。また肝機能の増悪（誘発、進展）の有無は、上記血液ＡＬＴ値のほか、血液肝機能検査で慣用されるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、および総ビリルビン（ＴＢ）の値から定法に従って評価することができる。
【００３９】
また本発明の肝がん発症抑制剤を有効成分とする医薬組成物は、前癌病変を有する患者、すなわち肝がん発症リスクの高い患者（具体的にはＣ型肝炎ウイルスキャリアー、慢性肝炎、または肝硬変の患者等）を対象として、肝がんを発症する前の段階に投与することが効果的である。
【００４０】
なお、患者について肝がんを発症しているか否かの判断は、当業界の技術常識に基づいて病理組織学的な側面から行うことができる。例えば、実験例で示すように、細胞の異型性の程度、細胞分裂像の増加、および増殖パターン、特に周囲組織に浸潤性に増殖するパターンが病変部の肝細胞に認められる場合、肝がん発症と判断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の肝臓保護剤、肝がんへの進展を抑制することによる肝がん発症抑制剤、並びに本発明のブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とする医薬組成物は、血液ＡＬＴ値が異常値を示す患者、具体的には肝疾患を発症するリスクの高い患者や肝疾患を発症している患者、および前癌病変を有する患者（Ｃ型肝炎ウイルスキャリアー、慢性肝炎、または肝硬変の患者等）に対する肝機能改善薬として、また肝がん発症への予防的医薬品として、広く利用することができる。特に、血小板や白血球の減少等により、インターフェロン治療ができない患者に、長期に亘り安心して服用できる日常薬としての利用性が高い。
【実施例】
【００４２】
以下、実験例を用いて本発明をより詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって制限されるものではない。なお、実施例中、「％」は特に言及しないかぎり、「Ｗ／Ｗ％」を意味する。
【００４３】
実験例１
（１）ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の調製
ラビットアイブルーベリー種のホームベルの９月採取の生葉（青葉）を、−３０℃で凍結したのち、真空凍結乾燥機（日本ドライフーズ株式会社）により、最高棚温６５℃、最終品温４０℃、乾燥時間25時間の条件で真空凍結乾燥した。次いで、粉砕機を用いて粉砕し、１．０ｍｍスクリーンを通過させることにより、ブルーベリー葉の乾燥粉末物を得た。
【００４４】
（２）給餌飼料の調製
（１）で調製したブルーベリー葉凍結乾燥粉末を用いて、表１に示す組成の給餌飼料を調製した。被検給餌試料は、ラットの一般飼料成分に、上記で調製したブルーベリー葉凍結乾燥粉末を３．０％の配合割合となるように添加混合して調製した。コントロール給餌飼料は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末を添加しない一般飼料で調製した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
（３）試験方法
被検動物として、実験前の一定期間、ＣＥ−２粉末飼料（日本クレア株式会社より購入）で飼育したWistar系雄ラットを用いた。Wistar系雄ラット（７週齢、初体重１９２〜２３４ｇ）を４群に群分けした（表２参照）。群分け時の群間の平均体重には統計学的な有意差はなかった。
【００４７】
第２群と第４群の被検動物には、前述する被検給餌飼料（ブルーベリー葉添加）を、また第１群及び第３群の被験動物には、コントロール給餌飼料（ブルーベリー葉非添加）を１５週間に亘って投与した。このうち、第１群と第２群の被験動物には、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の前癌病変発症抑制作用を見るため、給餌飼料投与開始から１週間目に発がん起始物質（イニシエーター）であるＮ−ニトロソ化合物〔ＤＥＮ（N-nitrosodiethylamine diethylnitrosamine）〕を、ＤＥＮ２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で単回腹腔内投与した。なお、ＤＥＮは生理食塩水に溶解して用いた。一方、比較のため、第３群と第４群の被験動物には、給餌飼料投与開始から１週間目に生理食塩液のみを同様に腹腔内投与した。
【００４８】
次いで、発症した前癌病変に対するブルーベリー葉凍結乾燥粉末の進展抑制作用を見るため、第１群と第２群の被検動物に、ＤＥＮの腹腔内投与１週間後から１３週間に亘って、発がん促進物質（プロモーター）であるバルビツール酸系化合物〔ＰＢ （Phenobarbital）〕の０．０５％水溶液を飲水させた。一方、比較のため、第３群と第４群の被検動物には、生理食塩水の腹腔内投与１週間後から１３週間に亘って、通常水を飲水させた。
【００４９】
各群の発がん物質（ＤＥＮおよびＰＢ）投与の有無、被検給餌飼料およびコントロール給餌飼料の別、及び動物数を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
投与期間終了後、エーテル麻酔下に開腹し、下部大静脈より採血し、放血致死させた後、肝臓を摘出した。採血した血液を肝機能検査に供し、摘出した肝臓は免疫組織化学的検査に供した。
【００５２】
（3-1）血液肝機能検査
アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン（ＴＢ）の濃度測定を株式会社エスアールエルに依頼した。
【００５３】
（3-2）免疫組織化学的検査
肝臓の右葉（外側）、右葉（内側）及び左葉（内側）から各１片の計３片を切り出し、１０％緩衝ホルマリン液にて固定した。次いで、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、薄切して肝臓切片を作製した後、ペルオキシダーゼ標識ポリマー（DAKO株式会社製）を用いた間接法にて、当該肝臓切片における胎盤型Glutathione S−transferase（ＧＳＴ−Ｐ）を免疫組織化学的に染色した。胎盤型ＧＳＴ−Ｐは正常のラット肝臓には存在しないが、ラット肝臓前癌病変および肝癌細胞では発現することが良く知られているマーカー酵素である〔Osada et al.,”Altered gene expression of transcriptional regulatory factors in tumor marker-positive cells during chemically induced hepatocarcinogenesis”
Toxicol Lett. Dec [167]106-13 (2006).〕〔Satoh et al., ”Purification, Induction, and Distribution of Placental Glutathione Transferase: A New Marker Enzyme for Preneoplastic Cells in the Rat Chemical Hepatocarcinogenesis” Proc Natl Acad Sci U S A. Jun [82] 3964-8 (1985) 〕。
【００５４】
肝臓切片の直径０．２ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の短径及び長径を、病理標本画像解析装置（オリンパス株式会社製）を用いて計測し、ラット１匹あたりのＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の個数及び概算重量を算出した。ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の概算重量は、Battelle Columbus Laboratoriesによる方法（短径の二乗×長径／２）を用いて算出した。
【００５５】
（４）試験結果
実験前後のラット体重、摂食量、肝重量の結果を表３に、肝機能検査の結果を表４に、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の個数の結果とその抑制率を図１及び表５に、概算重量の結果とその抑制率を図２及び表６に示す。また、ＧＳＴ−Ｐ免疫染色結果の代表的な画像を図３（コントロール群）及び図４(ブルーベリー葉投与群)に、被検群１の肝臓組織に形成された癌病変の画像を図５に各々示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表３より終体重に及ぼすブルーベリー葉凍結乾燥粉末の明確な影響は観察されなかった。摂食量は、発がん物質投与によって低下したが、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末による影響は観察されなかった。肝重量は、発がん物質投与によって増加したが、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末により低下傾向を示した。
【００５８】
【表４】
【００５９】
表４の血液肝機能検査の結果、被検群２は、被検群１に比して、肝障害を示すＡＬＴ値及びＴＢ値が有意に減少し、ＡＬＰ値が減少傾向であることが確認された。また、被検群４は、被検群３に比して、ＴＢ値が減少傾向であることが確認された。この結果よりブルーベリー葉が肝臓保護作用を有することが示唆された。
【００６０】
免疫組織化学的検査では、直径０．２ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣につき、画像解析装置を用いて解析した。その結果図１に示すように、被検群１（発がん物質投与／コントロール給餌飼料投与群、代表図；図３）の結果と、被検群２（発がん物質投与／被検給餌飼料投与群、代表図；図４）の結果との比較からわかるように、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の平均個数は、直径０．２ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の平均個数についてはブルーベリー葉凍結乾燥粉末の投与による影響は観察されないが、直径０．３ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の平均個数では、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の投与により減少した。また図２より、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の概算重量も、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末の投与により減少した。被検群３と４の被検動物では、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣は観察されなかった。
【００６１】
ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の個数及び概算重量に基づくブルーベリー葉凍結乾燥粉末の抑制率を次式により算出した結果、表５に示すようにブルーベリー葉凍結乾燥粉末の前癌病変発生抑制率を示す個数では、直径０．３ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣については４３．５％、直径０．４ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣については４６．８％、直径０．５ｍｍ以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣については５５．３％であった。また、表６に示すように同前癌病変進展抑制率を示す概算重量では、０．００４ｍｇ以上が６４．１％、０．０２ｍｇ以上が８３．４％、０．０５ｍｇ以上が８６．２％、０．１ｍｇ以上が８７．７％であった。
【００６２】
【数１】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【００６５】
被検群１には直径1.5mm以上のＧＳＴ−Ｐ陽性結節が一ヶ所形成されており（図５-A）、この病変においては変異肝細胞の間質および周囲肝実質への浸潤性増殖(図5-B）とともに、非腫瘍部の肝細胞と比較して核の腫大と明瞭な核小体が明らかであり、多くの細胞分裂像（矢印）を伴っている（図5-C, D)。このように明らかな浸潤と細胞異型を示すことから、病理組織学的に肝細胞癌と診断された。しかしながら、ブルーベリー葉投与群（被検群２）にはこのような病変は認められなかった。
【００６６】
以上、実施例の結果から、ブルーベリー葉には次の薬理作用があることが判明した。
【００６７】
（ａ）血液肝機能検査の結果、ブルーベリー葉の投与により肝機能障害の指標であるＡＬＴ及びＴＢが有意に減少していたことから、ブルーベリー葉には肝臓保護作用がある。
【００６８】
（ｂ）免疫組織化学的検査の結果、被験動物の肝臓組織におけるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣（前癌病変）の個数は、ブルーベリー葉投与群とコントロール群との間に明らかな差を認めないにもかかわらず、その平均サイズがブルーベリー葉投与群においては強く抑制されたことから、ブルーベリー葉がＧＳＴ−Ｐ陽性変異肝細胞の過剰増殖を抑制していると考えられる。この結果はブルーベリー葉投与が発がんイニシエーター（この場合はニトロソアミン）による遺伝子変異の結果もたらされる変異細胞の出現よりも、発がんプロモーター（この場合はフェノバルビタール）による変異細胞の過剰増殖に強く干渉しこれを抑制していることを示している。よって、ブルーベリー葉には前癌病変の進展抑制作用（前癌病変から肝がんへの進展抑制作用、言い換えれば肝がん発症抑制作用）が顕著である。
【００６９】
実験例２ 反復投与毒性試験
被検動物として、実験前の一定期間、ＣＥ−２粉末飼料（九動株式会社より購入）で飼育したSprague-Dawley系雌雄ラットを用いた。雌雄ラット（５週齢、初体重オス１３１〜１３３ｇ、メス１１１〜１１２ｇ）をそれぞれ２群に群分けした。群分け時の群間の平均体重には統計学的な有意差はなかった。被検動物には、前述する被検給餌飼料（ブルーベリー葉添加）及びコントロール給餌飼料（ブルーベリー葉非添加）を１ヶ月に亘って投与した。
【００７０】
また、投与期間中、ラットを一日絶食させ、尿を採取した。
【００７１】
投与期間終了後、絶食下でラットを屠殺し、血液、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓を採取した。血液は生化学的指数及び血球の性状検査に供し、各種臓器は重量測定後、病理組織学的検査に供した。
【００７２】
尿は、尿タンパク質、尿ブドウ糖、尿ウロビリノーゲンを測定した。
【００７３】
血液は、総タンパク質、アルブミン／グロブリン比、アルブミン、トリグリセリド、総コレステロール、尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、クロール、カリウム、カルシウム、無機リン酸、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アルカリフォスファターゼ、血小板A、血液像、血色素量、赤血球数、白血球数、ヘマトクリット、MCV、MHC、MCHCの測定を株式会社エスアールエルに依頼した。
【００７４】
各種臓器は１０％緩衝ホルマリン液にて固定した。次いで、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、薄切して各種臓器切片を作製した後、ヘマトキシリン及びエオジン溶液で染色した。
【００７５】
実験前後のラット体重、摂食量、各種臓器重量の結果を表７に、血液検査結果を表８に、尿検査結果を表９にそれぞれ示す。各種臓器の病理組織学検査の画像を図６−１０に示す。
【００７６】
【表７】
【００７７】
【表８】
【００７８】
【表９】
【００７９】
表７に示すように、終体重は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群によりオスで減少したが、摂食量に及ぼす影響は観察されなかった。
【００８０】
表８に示すように、総タンパク質及びアルブミンはブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群によりメスで増加した。赤血球数はブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群によりオスで増加した。しかし、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与による各種血液パラメーターの異常はいずれの群においても認められなかった。
【００８１】
また、表８中肝機能障害の指標であるＡＬＴ値及びＡＬＰ値は、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末未投与群と比較し、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与群において低値を示した。この結果よりブルーベリー葉が肝臓保護作用を有することが示唆された。
【００８２】
表９に示すように、尿パラメーターに及ぼすブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与による影響は観察されなかった。
【００８３】
図６−１０に示すように、各種臓器の病理学的検査の結果、ブルーベリー葉凍結乾燥粉末投与による組織および細胞の形態学的異常は認められなかった。
【００８４】
以上の反復投与毒性試験の結果からわかるように、ブルーベリー葉投与による毒性は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】直径0.2mm以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣のラット１匹あたりの平均個数を、細胞巣のサイズ別に示した図である。
【図２】直径0.2mm以上のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣のラット１匹あたりの概算総重量を示す図である。
【図３】被検群１の肝臓組織に形成されたＧＳＴ−Ｐ陽性前癌病変（ＧＳＴ−Ｐ免疫染色画像）を示す図である。
【図４】被検群２の肝臓組織に形成されたＧＳＴ−Ｐ陽性前癌病変（ＧＳＴ−Ｐ免疫染色画像）を示す図である。
【図５】被検群１の肝臓組織に形成された癌病変を示す図である（A: GST-P免疫染色結果の弱拡大画像。B: 病変部辺縁の中拡大像（ヘマトキシリン・エオジン染色。腫瘍細胞（T）、非腫瘍部（N））。C: 腫瘍部分の強拡大像（ヘマトキシリン・エオジン染色）。Ｄ:非腫瘍部の肝細胞の強拡大像（ヘマトキシリン・エオジン染色）。
【図６】反復投与毒性試験に用いたラット肝臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図７】反復投与毒性試験に用いたラット心臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図８】反復投与毒性試験に用いたラット肺の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図９】反復投与毒性試験に用いたラット腎臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【図１０】反復投与毒性試験に用いたラット脾臓の病理組織学検査の画像を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤。
【請求項２】
ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とし、肝がんへの進展を抑制することを特徴とする肝がん発症抑制剤。
【請求項３】
血中のアラニントランスアミナーゼ値が異常値を示す患者に対して、肝機能の増悪を抑制するために用いられる請求項１の肝臓保護剤を含む医薬品組成物。
【請求項４】
前癌病変を有する患者に対して、肝がんへの進展を抑制するために用いられる、請求項２記載の肝がん発症抑制剤を有効成分とする医薬品組成物。
【請求項１】
ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とする肝臓保護剤。
【請求項２】
ブルーベリー葉加工処理物を有効成分とし、肝がんへの進展を抑制することを特徴とする肝がん発症抑制剤。
【請求項３】
血中のアラニントランスアミナーゼ値が異常値を示す患者に対して、肝機能の増悪を抑制するために用いられる請求項１の肝臓保護剤を含む医薬品組成物。
【請求項４】
前癌病変を有する患者に対して、肝がんへの進展を抑制するために用いられる、請求項２記載の肝がん発症抑制剤を有効成分とする医薬品組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−１７４４７９（Ｐ２００８−１７４４７９Ａ）
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８５６２（Ｐ２００７−８５６２）
【出願日】平成１９年１月１７日（２００７．１．１７）
【出願人】（３９２００１９３３）雲海酒造株式会社 (11)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（３９１０１１７００）宮崎県 (63)
【出願人】（３０６０２４６０９）財団法人宮崎県産業支援財団 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１７日（２００７．１．１７）
【出願人】（３９２００１９３３）雲海酒造株式会社 (11)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（３９１０１１７００）宮崎県 (63)
【出願人】（３０６０２４６０９）財団法人宮崎県産業支援財団 (23)
【Ｆターム（参考）】
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