肝臓線維化抑制剤
【課題】新規の肝臓線維化抑制剤の提供。
【解決手段】リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）を有効成分とする肝臓線維化抑制剤。
【解決手段】リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）を有効成分とする肝臓線維化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の肝臓線維化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、正常状態から、慢性肝炎及び肝硬変を経て肝がんへと移行することが知られており、これら移行過程のいずれかを遅らせることで、病態の進行を抑制することが重要となる。例えば、投薬によって肝硬変の進行を遅らせるために従来は、インターフェロンやグリチルリチン製剤が使用されている（非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
一方、慢性肝炎は、肝臓の線維化を経て肝硬変、肝がんへと進行することが知られている。これに対して、近年の研究によって、肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ）が肝臓の線維化に関与することが明らかとなっている。肝星細胞は、肝臓の類洞壁をなす内皮細胞と肝細胞（肝実質細胞）との隙間（ディッセ （Ｄｉｓｓｅ）腔）に存在し、脂肪とビタミンＡを血中から取り込んで貯蔵する機能を有する。そして、休止状態から活性化状態に移行することで、脂肪が消失し、筋線維芽細胞様に形態が変化して増殖すると共に、コラーゲンを盛んに産生する。肝星細胞では、抗炎症サイトカインであるＴＧＦ−β等によるコラーゲンの産生と、ＭＭＰ１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ（Ｍａｔｒｉｘ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）１３）等によるコラーゲンの分解とで、コラーゲン量のバランスが保たれているが、慢性肝炎では、このバランスが崩れることでコラーゲンが過剰に蓄積され、肝星細胞が線維化すると考えられる。したがって、肝星細胞の線維化を抑制する手法は、肝臓の線維化、すなわち肝硬変の進行抑制に極めて有効であると考えられる
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】A long-term glycyrrhizin injection therapy reduces hepatocellular carcinogenesis rate in patients with interferon-resistant active chronic hepatitis C: a cohort study of 1249 patients., Ikeda K, Arase Y, Kobayashi M, Saitoh S, Someya T, Hosaka T, Sezaki H, Akuta N, Suzuki Y, Suzuki F, Kumada H., Dig Dis Sci. 2006 Mar;51(3):603-9.
【非特許文献２】Long-term outcome after interferon therapy in elderly patients with chronic hepatitis C., Arase Y, Ikeda K, Suzuki F, Suzuki Y, Saitoh S, Kobayashi M, Akuta N, Someya T, Koyama R, Hosaka T, Sezaki H, Kobayashi M, Kumada H., Intervirology. 2007;50(1):16-23.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、肝硬変の進行抑制、肝がんの予防には、肝臓の線維化抑制が重要であり、新規の線維化抑制剤の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規の肝臓線維化抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）由来の成分として知られるリコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）が、肝臓線維化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、上記課題を解決するため、
本発明は、リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）を有効成分とする肝臓線維化抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規の肝臓線維化抑制剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１における電気泳動後の撮像データである。
【図２】試験例１における電気泳動後の撮像データである。
【図３】実施例２におけるＭＭＰ１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ１３）プロモーターの活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるＣＯＬ１Ａ２（Ｉ型コラーゲンのα２鎖）プロモーターの活性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例４における培養後の肝星細胞の撮像データであり、（ａ）はＬｉｃｏＡ（リコカルコンＡ）を使用した場合、（ｂ）はＧＡ（グリチルレチン酸）を使用した場合、（ｃ）はＧＬ（グリチルリチン）を使用した場合、（ｄ）はＤＭＳＯ（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド）を使用した場合の、それぞれの撮像データである。
【図６】実施例５における薬剤投与後のマウスの肝臓の撮像データであり、（ａ）は四塩化炭素（ＣＣl４）及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合の、それぞれの撮像データである。
【図７】図６の撮像データから算出した、組織全面に占める線維化組織面の割合を示すグラフであり、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合を、それぞれ示す。
【図８】実施例５における薬剤投与後のマウスの血清中のトランスアミナーゼ値の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間ＣＭＣを前半の４週間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間それぞれ投与した場合、（ｃ）はＣＣl４及びＣＭＣを８週間投与した場合を、それぞれ示す。
【図９】試験例２における、ＬｉｃｏＡの投与方法と血清中濃度との関係を投与後の時間ごとに示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の肝臓線維化抑制剤（以下、「線維化抑制剤」と略記する）は、リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ、以下、「ＬｉｃｏＡ」と略記する）を有効成分とする。かかる線維化抑制剤は、肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ）を主因とする肝臓の線維化を抑制する。
【００１１】
ＬｉｃｏＡは、マメ科カンゾウ属の多年生植物の一種である甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）からの油性抽出物中に含まれ、下記式（１）で表される。
ＬｉｃｏＡは、抗菌性を有することが知られており、近年は、抗マラリア活性を有する化合物として知られているが、肝臓線維化抑制作用を有することは、これまでに全く知られていない。
【００１２】
【化１】
【００１３】
本発明の線維化抑制剤の製剤形態は特に限定されず、目的に応じて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤（水薬等）等の経口剤；吸入剤、座剤、注射剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏等の非経口剤等から適宜選択すればよい。これら製剤形態の線維化抑制剤は、いずれも公知の方法で製造できる。
【００１４】
線維化抑制剤を経口剤等の製剤形態とする場合には、これら製剤の製造で通常使用される各種添加剤を配合してもよい。前記添加剤としては、賦形剤、滑沢剤、可塑剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、矯味剤、着色剤、香料等が例示できる。
前記添加剤は、一種を単独で使用してもよいし、二種以上を併用してもよい。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて適宜選択すればよい。
【００１５】
前記賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、果糖、デキストリン、デンプン、食塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、無水ケイ酸、カオリン等が例示できる。
【００１６】
前記滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、タルク、トウモロコシデンプン、マクロゴール等が例示できる。
【００１７】
前記可塑剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン類、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、クエン酸トリエチル等が例示できる。
【００１８】
前記結合剤としては、ゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン、水飴、甘草エキス、トラガント、単シロップ等が例示できる。
前記崩壊剤としては、デンプン、カンテン、カルメロースカルシウム、カルメロース、結晶セルロース等が例示できる。
前記湿潤剤としては、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００１９】
前記矯味剤としては、白糖、ハチミツ、サッカリンナトリウム、ハッカ、ユーカリ油、ケイヒ油等が例示できる。
前記着色剤としては、酸化鉄、β−カロチン、クロロフィル、水溶性食用タール色素等が例示できる。
前記香料としては、レモン油、オレンジ油、ｄｌ−又はl−メントール等が例示できる。
【００２０】
線維化抑制剤を吸入剤、注射剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏等、非経口剤の製剤形態とする場合には、使用できる溶媒として、注射用蒸留水、無菌の非水性溶媒、懸濁剤等が例示できる。非水性溶媒又は懸濁剤の基剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が好ましいものとして例示できる。
【００２１】
さらに、線維化抑制剤を貼付剤等、非経口剤の製剤形態とする場合には、有効成分等の各成分と基剤との混合物を、布、紙、プラスチックフィルム等に薄く塗布すれば良い。
【００２２】
本発明の線維化抑制剤には、本発明の効果を妨げない範囲内で、上記成分以外の薬学上許容される任意成分を、必要に応じて適宜配合しても良い。
前記任意成分としては、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等が例示できる。
【００２３】
本発明の線維化抑制剤は、経口投与及び非経口投与のいずれでも投与できるが、非経口投与とすることが好ましく、注射剤として投与することが特に好ましい。
【００２４】
線維化抑制剤の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜調節することが好ましい。経口投与の場合には、通常、成人一人一日あたり、ＬｉｃｏＡの量として、０．５ｍｇ〜２．０ｇであることが好ましい。非経口投与の場合にも、通常、成人一人一日あたり、ＬｉｃｏＡの量として、０．５ｍｇ〜２．０ｇであることが好ましい。
本発明の線維化抑制剤は、所定量を一日に一回又は複数回に分けて投与される。
【００２５】
ＬｉｃｏＡは、公知の方法に従って合成することができ、また、甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）から抽出することもできる。
ＬｉｃｏＡを合成した場合には、反応終了後、常法により必要に応じて後処理を行い、生成物を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は二つ以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、生成物を取り出せばよい。また、取り出した生成物は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は二つ以上組み合わせて一回以上行うことで、精製してもよい。
さらに、ＬｉｃｏＡは、甘草を破砕等の加工後に、水及び有機溶媒の二層系から公知の方法に従って抽出することでも得られる。この時、適宜必要に応じて、得られた抽出成分を上記と同様の後処理、取り出し、精製に供してもよい。
ＬｉｃｏＡとしては、市販品を使用してもよい。
【００２６】
肝星細胞は、休止状態から活性化状態へと移行することで、線維化され得るものとなる。
そして、ＬｉｃｏＡは、実施例で後述するように、活性化状態にある肝星細胞の線維化を抑制する。この時、ＬｉｃｏＡは、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（Ｍａｔｒｉｘ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １３、以下、「ＭＭＰ１３」と略記する）の発現を促進してコラーゲンの分解を促進すると共に、Ｉ型コラーゲンのα２鎖（以下、「ＣＯＬ１Ａ２」と略記する）の発現を抑制してコラーゲンの産生を抑制することで、コラーゲンの過剰な蓄積を抑制すると考えられる。
また、ＬｉｃｏＡは、肝星細胞に対する休止状態から活性化状態への移行を抑制する。
これら作用により、本発明の線維化抑制剤は、肝臓の線維化を抑制する。
【実施例】
【００２７】
以下、具体的に実施例を挙げ、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下において単位「Ｍ」は「モル／Ｌ」を意味する。また、各薬剤の皮下投与及び腹腔内投与は、注射器を使用して行った。
【００２８】
＜活性化状態の肝星細胞におけるＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［実施例１］
（肝星細胞の分離、及び活性化状態の肝星細胞の培養）
マウスの肝臓からプロナーゼ及びコラゲナーゼ灌流法によって肝星細胞を分離した。
次いで、分離した肝星細胞をプラスティックディッシュに播種し、液体培地である１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）溶液中で、３７℃で７日間培養することで、肝星細胞を休止状態から活性化状態へと移行させた。さらに、血清成分の影響を極力除くため、血清濃度を１０％から０．１％へと変更して２４時間培養した。
次いで、
（１−ａ）ＬｉｃｏＡを濃度が２．５μＭとなるように
（１−ｂ）グリチルレチン酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「ＧＡ」と略記する）を濃度が５μＭとなるように
（１−ｃ）グリチルリチン（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ、以下、「ＧＬ」と略記する）を濃度が５μＭとなるように
（１−ｄ）Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と略記する）を濃度が０．４％となるように
それぞれ別々に培養物に添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。なお、これら培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに３個ずつ作製した（ｎ＝３）。
【００２９】
（ＭＭＰ１３に対応する配列の検出）
次いで、培養した活性化状態の肝星細胞からＲＮＡを精製し、以降、常法にしたがって、ｃＤＮＡを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法でｃＤＮＡを増幅させた後、これを２％アガロースゲル電気泳動に供して、ＭＭＰ１３に対応する配列を検出した。この時の泳動結果の撮像データを図１に示す。
【００３０】
＜休止状態の肝星細胞におけるＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［試験例１］
（肝星細胞の分離、休止状態の肝星細胞の培養、及びＭＭＰ１３に対応する配列の検出）
肝星細胞播種後の７日間の培養に代えて、同じ温度での２４時間の培養を行うことで、肝星細胞を休止状態のままとし、活性化状態へ移行させなかったこと以外は、実施例１と同様に培養し、ＭＭＰ１３に対応する配列を検出した。この時の泳動結果の撮像データを図２に示す。なお、培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに２個ずつ作製した（ｎ＝２）。
【００３１】
図１から明らかなように、活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）よりも、ＭＭＰ１３に対応するバンドが濃くなっており、ＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現が促進されたことを確認できた。一方、ＧＡ及びＧＬを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。このように、ＬｉｃｏＡは、ＭＭＰ１３の発現を促進し、活性化状態の肝星細胞の線維化抑制作用を有することが確認できた。
一方、図２から明らかなように、休止状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）よりも、ＭＭＰ１３に対応するバンドが薄くなっており、ＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現が抑制されたことを確認できた。一方、ＧＡ及びＧＬを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。肝星細胞のここでの休止状態は、活性化直前、すなわち肝障害初期の状態と言うこともできる。そして、肝障害初期にＭＭＰ１３が増加すると、肝障害の憎悪が認められることが知られているので、休止状態でＬｉｃｏＡがＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現を抑制したことは、ＬｉｃｏＡが肝障害初期に肝障害憎悪に対する抑制作用を有することが示唆される。
【００３２】
＜活性化状態の肝星細胞におけるＭＭＰ１３プロモーターの活性の確認＞
［実施例２］
（活性化状態の肝星細胞の分離、及び活性化状態の肝星細胞へのＭＭＰ１３プロモーターの導入）
四塩化炭素（以下、「ＣＣl４」と略記する）の投与によって肝硬変を生じさせたラットより分離及び確立された活性化状態の肝星細胞株（ＣＦＳＣ−８Ｂ ｃｅｌｌｓ）を用いた。
前記株化活性化肝星細胞をプラスティックディッシュに播種し、液体培地である１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ溶液中で、３７℃で４８時間培養した。さらに、液体培地中に、ＭＭＰ１３プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子とを結合させたプラスミドのリン酸カルシウム共沈物を添加し、５時間培養後、グリセロールショックにより、これら肝星細胞に前記プラスミドを導入した。
次いで、０．１％のＦＣＳを含むＤＭＥMと交換し、
（２−ａ）ＬｉｃｏＡを濃度が２．５μＭとなるように
（２−ｂ）ＧＡを濃度が５μＭとなるように
（２−ｃ）ＧＬを濃度が５μＭとなるように
（２−ｄ）グリチルレチン酸モノグルクロナイド（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｎｏ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、以下、「ＭＧＡ」と略記する）を濃度が５μＭとなるように
（２−ｅ）ＤＭＳＯを濃度が０．４％となるように
それぞれ別々に培養物に添加し、さらに３７℃で４８時間培養した。なお、これら培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに３個ずつ作製した（ｎ＝３）。
【００３３】
（ＭＭＰ１３プロモーターの活性測定）
次いで、培養終了後の肝星細胞について、常法に従い、ルシフェラーゼのアッセイを行い、ＭＭＰ１３プロモーターの活性を測定した。この時の測定結果を図３に示す。図３のグラフ中、縦軸はＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）の活性を１００％とした時の、各薬剤を使用した場合の活性（％）を示す。
【００３４】
図３から明らかなように、活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）に対して、ＭＭＰ１３プロモーターの活性が２倍以上となっており、ＭＭＰ１３の発現が促進されたことを確認できた。一方、ＧＡ、ＧＬ及びＭＧＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。
【００３５】
＜活性化状態の肝星細胞におけるＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性の確認＞
［実施例３］
（活性化状態の肝星細胞の分離、活性化状態の肝星細胞へのＣＯＬ１Ａ２プロモーターの導入、及びＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性測定）
常法に従い、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子とを結合させたプラスミドを作製した。そしてこのプラスミドを、ＭＭＰ１３プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子とを結合させたプラスミドに代えて使用し、さらに、薬剤としてＧＬ及びＭＧＡを使用しなかったこと以外は、実施例２と同様に培養し、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性を測定した。この時の測定結果を図４に示す。図４のグラフ中、縦軸はＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）の活性を１００％とした時の、各薬剤を使用した場合の活性（％）を示す。なお、培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに２〜３個ずつ作製した（ｎ＝２〜３）。
【００３６】
図４から明らかなように、活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）に対して、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性は半分以下となっており、ＣＯＬ１Ａ２の発現が抑制されたことを確認できた。一方、ＧＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。
【００３７】
活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡは、実施例２から明らかなように、ＭＭＰ１３プロモーターの活性を向上させて、ＭＭＰ１３の発現を促進し、コラーゲンの分解を促進する。さらに、実施例３から明らかなように、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性を抑制して、ＣＯＬ１Ａ２の発現を抑制し、コラーゲンの産生を抑制する。このようにＬｉｃｏＡは、活性化状態の肝星細胞において、コラーゲンの過剰な蓄積を抑制する作用を有しており、これにより、肝星細胞の線維化を抑制する。
【００３８】
＜休止状態の肝星細胞に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［実施例４］
（肝星細胞の分離及び培養）
実施例１と同様の方法で、マウスの肝臓から肝星細胞を分離した。
また、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ溶液に、
（４−ａ）濃度が２．５μＭとなるようにＬｉｃｏＡを溶解させた液体培地
（４−ｂ）濃度が２０μＭとなるようにＧＡを溶解させた液体培地
（４−ｃ）濃度が２０μＭとなるようにＧＬを溶解させた液体培地
（４−ｄ）濃度が０．４％となるようにＤＭＳＯを溶解させた液体培地
をそれぞれ調製した。
次いで、分離した休止状態の肝星細胞をプラスティックディッシュに播種し、前記液体培地中で、それぞれ３７℃で７日間培養した。
【００３９】
（培養後の肝星細胞の観察）
次いで、培養した肝星細胞において、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ，ａｌｐｈａ−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅを用いた免疫蛍光染色によりα平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、以下、「αＳＭＡ」と略記する）を染色し、共焦点レーザー顕微鏡（「５１０ｍｅｔａ」、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で画像を観察して、蛍光シグナルを検出することで、αＳＭＡの発現の有無、発現の程度を確認した。αＳＭＡは、筋線維芽細胞の指標として知られており、ここでは、肝星細胞の休止状態から活性化状態への移行の指標とした。この時の撮像データを図５に示す。図５中、（ａ）はＬｉｃｏＡを使用した場合（（４−ａ））、（ｂ）はＧＡを使用した場合（（４−ｂ））、（ｃ）はＧＬを使用した場合（（４−ｃ））、（ｄ）はＤＭＳＯを使用した場合（（４−ｄ））の、それぞれの撮像データである。
【００４０】
図５から明らかなように、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール、（ｄ））には、αＳＭＡが多量に検出され、αＳＭＡによる細胞骨格の構築を確認できたのに対し、脂肪はほとんど確認できなかった。
一方、ＬｉｃｏＡを使用した場合（（ａ））には、αＳＭＡがほとんど検出されず、αＳＭＡによる細胞骨格の構築を確認できなかったのに対し、脂肪の残存を確認できた。ＧＡを使用した場合（（ｂ））、ＧＬを使用した場合（（ｃ））も同様であった。これらの蛍光シグナルは、一次抗体の除去で消失することから、免疫反応が特異的であることが判った。
以上のように、ＬｉｃｏＡは、肝星細胞の休止状態から活性化状態への移行時に特徴的な、脂肪の消失、及び筋線維芽細胞様への形態変化を抑制しており、肝星細胞に対する休止状態から活性化状態への移行抑制作用を有しており、肝星細胞の線維化抑制作用を有することが確認できた。
【００４１】
＜肝臓に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［実施例５］
（マウスの肝障害誘導と薬剤投与）
下記手順に従って、ＣＣl４が投与されたマウスの肝星細胞に対するＬｉｃｏＡの作用を確認した。
すなわち、マウスに対して、
（５−ａ）８週間に渡って、１回の投与量を１ｍＬ／ｋｇとして週に２回（合計１６回）ＣＣl４を皮下投与すると共に、この間並行して、１回の投与量を３０ｍｇ／ｋｇとして週に３回（合計２４回）、ＬｉｃｏＡ０．５％カルボキシメチルセルロース（以下「ＣＭＣ」と略記する）懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のマウスに対して、
（５−ｂ）８週間に渡って、１回の投与量を１ｍＬ／ｋｇとして週に２回（合計１６回）ＣＣl４を皮下投与すると共に、この間並行して、前半の４週間は週に３回（合計１２回）、後述するＬｉｃｏＡ投与時に相当する用量の０．５％ＣＭＣを腹腔内投与し（すなわち、ＬｉｃｏＡは投与しない。以下、同様。）、続く後半の４週間は１回の投与量を３０ｍｇ／ｋｇとして週に３回（合計１２回）、ＬｉｃｏＡ０．５％ＣＭＣ懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のマウスに対して、
（５−ｃ）８週間に渡って、１回の投与量を１ｍＬ／ｋｇとして週に２回（合計１６回）ＣＣl４を皮下投与すると共に、この間並行して、週に３回（合計２４回）、ＬｉｃｏＡ投与時に相当する用量の０．５％ＣＭＣを腹腔内投与した。
なお、使用したマウスは、それぞれの投与パターンごとに５〜６匹とした（ｎ＝５〜６）。
【００４２】
（肝臓の観察）
上記のように８週間に渡って飼育したマウスから肝臓を切り出して切片を作製し、これをアザン（Ａｚａｎ）染色して、光学顕微鏡（「ＡＸ７０」、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を使用して画像を観察し、肝臓の線維化の程度を調べた。この時の撮像データを図６に示す。図６中、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合（（５−ａ））、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合（（５−ｂ））、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合（（５−ｃ））の、それぞれの撮像データである。
さらに、前記撮像データから、組織全面に占める線維化組織面の割合（面積％）を算出した。結果を図７に示す。図７中、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合（（５−ａ））、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合（（５−ｂ））、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合（（５−ｃ））を、それぞれ示す。すなわち、（ａ）〜（ｃ）の符号は、図６及び７で共通している。
【００４３】
（血清中のトランスアミナーゼ値の測定）
上記のように８週間に渡って飼育したマウスから血液を採取し、血清中のトランスアミナーゼ値を測定した。ここでは、トランスアミナーゼとして、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＳＴ」と略記する）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＬＴ」と略記する）の値を測定した。結果を図８に示す。図８中、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合（（５−ａ））、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合（（５−ｂ））、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合（（５−ｃ））を、それぞれ示す。すなわち、（ａ）〜（ｃ）の符号は、図６〜８で共通している。
【００４４】
図６及び７から明らかなように、（ａ）の場合には、（ｃ）の場合に対して肝臓の線維化が有意に抑制され、（ｂ）の場合よりもその効果が高かった。すなわち、肝障害発生の初期からＬｉｃｏＡを投与することで、肝臓の高い線維化抑制効果が得られた。
また、図８において、（ａ）の場合には、（ｂ）及び（ｃ）の場合よりもトランスアミナーゼ値が低い傾向にあった。これらトランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）は、肝実質細胞が破壊されることで血中に漏出するが、（ａ）の場合には、これが抑制されることを示唆しており、図６及び７の結果と整合していた。
【００４５】
＜ＬｉｃｏＡの投与方法と血清中濃度との関係の確認＞
［試験例２］
（ラットへのＬｉｃｏＡの投与）
下記手順に従って、ラットにおけるＬｉｃｏＡの投与方法と血清中濃度との関係を確認した。
すなわち、ラットに対して、
（Ｔ２−ａ）濃度が６０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＬｉｃｏＡのオリーブオイル懸濁液を調製し、ＬｉｃｏＡの投与量が２００ｍｇ／ｋｇとなるように、この懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のラットに対して、
（Ｔ２−ｂ）濃度が６０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＬｉｃｏＡ０．５％ＣＭＣ懸濁液を調製し、ＬｉｃｏＡの投与量が２００ｍｇ／ｋｇとなるように、この懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のラットに対して、
（Ｔ２−ｃ）ＬｉｃｏＡを２００ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。
【００４６】
（ＬｉｃｏＡの血清中濃度の測定）
次いで、ラットから所定の時間ごとに血液を採取し、ＬｉｃｏＡの血清中濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手法を用いて測定した。結果を図９に示す。なお、図９のグラフ中、横軸の経過時間「０（分）」は、ＬｉｃｏＡの投与時を意味する。
【００４７】
図９から明らかなように、腹腔内投与によって、ＬｉｃｏＡの血清中濃度が速やかに上昇することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、医療分野で慢性肝炎、肝硬変及び肝がんの治療に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の肝臓線維化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、正常状態から、慢性肝炎及び肝硬変を経て肝がんへと移行することが知られており、これら移行過程のいずれかを遅らせることで、病態の進行を抑制することが重要となる。例えば、投薬によって肝硬変の進行を遅らせるために従来は、インターフェロンやグリチルリチン製剤が使用されている（非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
一方、慢性肝炎は、肝臓の線維化を経て肝硬変、肝がんへと進行することが知られている。これに対して、近年の研究によって、肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ）が肝臓の線維化に関与することが明らかとなっている。肝星細胞は、肝臓の類洞壁をなす内皮細胞と肝細胞（肝実質細胞）との隙間（ディッセ （Ｄｉｓｓｅ）腔）に存在し、脂肪とビタミンＡを血中から取り込んで貯蔵する機能を有する。そして、休止状態から活性化状態に移行することで、脂肪が消失し、筋線維芽細胞様に形態が変化して増殖すると共に、コラーゲンを盛んに産生する。肝星細胞では、抗炎症サイトカインであるＴＧＦ−β等によるコラーゲンの産生と、ＭＭＰ１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ（Ｍａｔｒｉｘ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）１３）等によるコラーゲンの分解とで、コラーゲン量のバランスが保たれているが、慢性肝炎では、このバランスが崩れることでコラーゲンが過剰に蓄積され、肝星細胞が線維化すると考えられる。したがって、肝星細胞の線維化を抑制する手法は、肝臓の線維化、すなわち肝硬変の進行抑制に極めて有効であると考えられる
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】A long-term glycyrrhizin injection therapy reduces hepatocellular carcinogenesis rate in patients with interferon-resistant active chronic hepatitis C: a cohort study of 1249 patients., Ikeda K, Arase Y, Kobayashi M, Saitoh S, Someya T, Hosaka T, Sezaki H, Akuta N, Suzuki Y, Suzuki F, Kumada H., Dig Dis Sci. 2006 Mar;51(3):603-9.
【非特許文献２】Long-term outcome after interferon therapy in elderly patients with chronic hepatitis C., Arase Y, Ikeda K, Suzuki F, Suzuki Y, Saitoh S, Kobayashi M, Akuta N, Someya T, Koyama R, Hosaka T, Sezaki H, Kobayashi M, Kumada H., Intervirology. 2007;50(1):16-23.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、肝硬変の進行抑制、肝がんの予防には、肝臓の線維化抑制が重要であり、新規の線維化抑制剤の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規の肝臓線維化抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）由来の成分として知られるリコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）が、肝臓線維化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、上記課題を解決するため、
本発明は、リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）を有効成分とする肝臓線維化抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規の肝臓線維化抑制剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１における電気泳動後の撮像データである。
【図２】試験例１における電気泳動後の撮像データである。
【図３】実施例２におけるＭＭＰ１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ１３）プロモーターの活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるＣＯＬ１Ａ２（Ｉ型コラーゲンのα２鎖）プロモーターの活性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例４における培養後の肝星細胞の撮像データであり、（ａ）はＬｉｃｏＡ（リコカルコンＡ）を使用した場合、（ｂ）はＧＡ（グリチルレチン酸）を使用した場合、（ｃ）はＧＬ（グリチルリチン）を使用した場合、（ｄ）はＤＭＳＯ（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド）を使用した場合の、それぞれの撮像データである。
【図６】実施例５における薬剤投与後のマウスの肝臓の撮像データであり、（ａ）は四塩化炭素（ＣＣl４）及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合の、それぞれの撮像データである。
【図７】図６の撮像データから算出した、組織全面に占める線維化組織面の割合を示すグラフであり、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合を、それぞれ示す。
【図８】実施例５における薬剤投与後のマウスの血清中のトランスアミナーゼ値の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間ＣＭＣを前半の４週間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間それぞれ投与した場合、（ｃ）はＣＣl４及びＣＭＣを８週間投与した場合を、それぞれ示す。
【図９】試験例２における、ＬｉｃｏＡの投与方法と血清中濃度との関係を投与後の時間ごとに示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の肝臓線維化抑制剤（以下、「線維化抑制剤」と略記する）は、リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ、以下、「ＬｉｃｏＡ」と略記する）を有効成分とする。かかる線維化抑制剤は、肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ）を主因とする肝臓の線維化を抑制する。
【００１１】
ＬｉｃｏＡは、マメ科カンゾウ属の多年生植物の一種である甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）からの油性抽出物中に含まれ、下記式（１）で表される。
ＬｉｃｏＡは、抗菌性を有することが知られており、近年は、抗マラリア活性を有する化合物として知られているが、肝臓線維化抑制作用を有することは、これまでに全く知られていない。
【００１２】
【化１】
【００１３】
本発明の線維化抑制剤の製剤形態は特に限定されず、目的に応じて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤（水薬等）等の経口剤；吸入剤、座剤、注射剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏等の非経口剤等から適宜選択すればよい。これら製剤形態の線維化抑制剤は、いずれも公知の方法で製造できる。
【００１４】
線維化抑制剤を経口剤等の製剤形態とする場合には、これら製剤の製造で通常使用される各種添加剤を配合してもよい。前記添加剤としては、賦形剤、滑沢剤、可塑剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、矯味剤、着色剤、香料等が例示できる。
前記添加剤は、一種を単独で使用してもよいし、二種以上を併用してもよい。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて適宜選択すればよい。
【００１５】
前記賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、果糖、デキストリン、デンプン、食塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、無水ケイ酸、カオリン等が例示できる。
【００１６】
前記滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、タルク、トウモロコシデンプン、マクロゴール等が例示できる。
【００１７】
前記可塑剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン類、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、クエン酸トリエチル等が例示できる。
【００１８】
前記結合剤としては、ゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン、水飴、甘草エキス、トラガント、単シロップ等が例示できる。
前記崩壊剤としては、デンプン、カンテン、カルメロースカルシウム、カルメロース、結晶セルロース等が例示できる。
前記湿潤剤としては、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００１９】
前記矯味剤としては、白糖、ハチミツ、サッカリンナトリウム、ハッカ、ユーカリ油、ケイヒ油等が例示できる。
前記着色剤としては、酸化鉄、β−カロチン、クロロフィル、水溶性食用タール色素等が例示できる。
前記香料としては、レモン油、オレンジ油、ｄｌ−又はl−メントール等が例示できる。
【００２０】
線維化抑制剤を吸入剤、注射剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏等、非経口剤の製剤形態とする場合には、使用できる溶媒として、注射用蒸留水、無菌の非水性溶媒、懸濁剤等が例示できる。非水性溶媒又は懸濁剤の基剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が好ましいものとして例示できる。
【００２１】
さらに、線維化抑制剤を貼付剤等、非経口剤の製剤形態とする場合には、有効成分等の各成分と基剤との混合物を、布、紙、プラスチックフィルム等に薄く塗布すれば良い。
【００２２】
本発明の線維化抑制剤には、本発明の効果を妨げない範囲内で、上記成分以外の薬学上許容される任意成分を、必要に応じて適宜配合しても良い。
前記任意成分としては、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等が例示できる。
【００２３】
本発明の線維化抑制剤は、経口投与及び非経口投与のいずれでも投与できるが、非経口投与とすることが好ましく、注射剤として投与することが特に好ましい。
【００２４】
線維化抑制剤の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜調節することが好ましい。経口投与の場合には、通常、成人一人一日あたり、ＬｉｃｏＡの量として、０．５ｍｇ〜２．０ｇであることが好ましい。非経口投与の場合にも、通常、成人一人一日あたり、ＬｉｃｏＡの量として、０．５ｍｇ〜２．０ｇであることが好ましい。
本発明の線維化抑制剤は、所定量を一日に一回又は複数回に分けて投与される。
【００２５】
ＬｉｃｏＡは、公知の方法に従って合成することができ、また、甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）から抽出することもできる。
ＬｉｃｏＡを合成した場合には、反応終了後、常法により必要に応じて後処理を行い、生成物を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は二つ以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、生成物を取り出せばよい。また、取り出した生成物は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は二つ以上組み合わせて一回以上行うことで、精製してもよい。
さらに、ＬｉｃｏＡは、甘草を破砕等の加工後に、水及び有機溶媒の二層系から公知の方法に従って抽出することでも得られる。この時、適宜必要に応じて、得られた抽出成分を上記と同様の後処理、取り出し、精製に供してもよい。
ＬｉｃｏＡとしては、市販品を使用してもよい。
【００２６】
肝星細胞は、休止状態から活性化状態へと移行することで、線維化され得るものとなる。
そして、ＬｉｃｏＡは、実施例で後述するように、活性化状態にある肝星細胞の線維化を抑制する。この時、ＬｉｃｏＡは、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（Ｍａｔｒｉｘ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １３、以下、「ＭＭＰ１３」と略記する）の発現を促進してコラーゲンの分解を促進すると共に、Ｉ型コラーゲンのα２鎖（以下、「ＣＯＬ１Ａ２」と略記する）の発現を抑制してコラーゲンの産生を抑制することで、コラーゲンの過剰な蓄積を抑制すると考えられる。
また、ＬｉｃｏＡは、肝星細胞に対する休止状態から活性化状態への移行を抑制する。
これら作用により、本発明の線維化抑制剤は、肝臓の線維化を抑制する。
【実施例】
【００２７】
以下、具体的に実施例を挙げ、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下において単位「Ｍ」は「モル／Ｌ」を意味する。また、各薬剤の皮下投与及び腹腔内投与は、注射器を使用して行った。
【００２８】
＜活性化状態の肝星細胞におけるＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［実施例１］
（肝星細胞の分離、及び活性化状態の肝星細胞の培養）
マウスの肝臓からプロナーゼ及びコラゲナーゼ灌流法によって肝星細胞を分離した。
次いで、分離した肝星細胞をプラスティックディッシュに播種し、液体培地である１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）溶液中で、３７℃で７日間培養することで、肝星細胞を休止状態から活性化状態へと移行させた。さらに、血清成分の影響を極力除くため、血清濃度を１０％から０．１％へと変更して２４時間培養した。
次いで、
（１−ａ）ＬｉｃｏＡを濃度が２．５μＭとなるように
（１−ｂ）グリチルレチン酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「ＧＡ」と略記する）を濃度が５μＭとなるように
（１−ｃ）グリチルリチン（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ、以下、「ＧＬ」と略記する）を濃度が５μＭとなるように
（１−ｄ）Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と略記する）を濃度が０．４％となるように
それぞれ別々に培養物に添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。なお、これら培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに３個ずつ作製した（ｎ＝３）。
【００２９】
（ＭＭＰ１３に対応する配列の検出）
次いで、培養した活性化状態の肝星細胞からＲＮＡを精製し、以降、常法にしたがって、ｃＤＮＡを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法でｃＤＮＡを増幅させた後、これを２％アガロースゲル電気泳動に供して、ＭＭＰ１３に対応する配列を検出した。この時の泳動結果の撮像データを図１に示す。
【００３０】
＜休止状態の肝星細胞におけるＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［試験例１］
（肝星細胞の分離、休止状態の肝星細胞の培養、及びＭＭＰ１３に対応する配列の検出）
肝星細胞播種後の７日間の培養に代えて、同じ温度での２４時間の培養を行うことで、肝星細胞を休止状態のままとし、活性化状態へ移行させなかったこと以外は、実施例１と同様に培養し、ＭＭＰ１３に対応する配列を検出した。この時の泳動結果の撮像データを図２に示す。なお、培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに２個ずつ作製した（ｎ＝２）。
【００３１】
図１から明らかなように、活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）よりも、ＭＭＰ１３に対応するバンドが濃くなっており、ＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現が促進されたことを確認できた。一方、ＧＡ及びＧＬを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。このように、ＬｉｃｏＡは、ＭＭＰ１３の発現を促進し、活性化状態の肝星細胞の線維化抑制作用を有することが確認できた。
一方、図２から明らかなように、休止状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）よりも、ＭＭＰ１３に対応するバンドが薄くなっており、ＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現が抑制されたことを確認できた。一方、ＧＡ及びＧＬを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。肝星細胞のここでの休止状態は、活性化直前、すなわち肝障害初期の状態と言うこともできる。そして、肝障害初期にＭＭＰ１３が増加すると、肝障害の憎悪が認められることが知られているので、休止状態でＬｉｃｏＡがＭＭＰ１３のｍＲＮＡ発現を抑制したことは、ＬｉｃｏＡが肝障害初期に肝障害憎悪に対する抑制作用を有することが示唆される。
【００３２】
＜活性化状態の肝星細胞におけるＭＭＰ１３プロモーターの活性の確認＞
［実施例２］
（活性化状態の肝星細胞の分離、及び活性化状態の肝星細胞へのＭＭＰ１３プロモーターの導入）
四塩化炭素（以下、「ＣＣl４」と略記する）の投与によって肝硬変を生じさせたラットより分離及び確立された活性化状態の肝星細胞株（ＣＦＳＣ−８Ｂ ｃｅｌｌｓ）を用いた。
前記株化活性化肝星細胞をプラスティックディッシュに播種し、液体培地である１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ溶液中で、３７℃で４８時間培養した。さらに、液体培地中に、ＭＭＰ１３プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子とを結合させたプラスミドのリン酸カルシウム共沈物を添加し、５時間培養後、グリセロールショックにより、これら肝星細胞に前記プラスミドを導入した。
次いで、０．１％のＦＣＳを含むＤＭＥMと交換し、
（２−ａ）ＬｉｃｏＡを濃度が２．５μＭとなるように
（２−ｂ）ＧＡを濃度が５μＭとなるように
（２−ｃ）ＧＬを濃度が５μＭとなるように
（２−ｄ）グリチルレチン酸モノグルクロナイド（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｎｏ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、以下、「ＭＧＡ」と略記する）を濃度が５μＭとなるように
（２−ｅ）ＤＭＳＯを濃度が０．４％となるように
それぞれ別々に培養物に添加し、さらに３７℃で４８時間培養した。なお、これら培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに３個ずつ作製した（ｎ＝３）。
【００３３】
（ＭＭＰ１３プロモーターの活性測定）
次いで、培養終了後の肝星細胞について、常法に従い、ルシフェラーゼのアッセイを行い、ＭＭＰ１３プロモーターの活性を測定した。この時の測定結果を図３に示す。図３のグラフ中、縦軸はＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）の活性を１００％とした時の、各薬剤を使用した場合の活性（％）を示す。
【００３４】
図３から明らかなように、活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）に対して、ＭＭＰ１３プロモーターの活性が２倍以上となっており、ＭＭＰ１３の発現が促進されたことを確認できた。一方、ＧＡ、ＧＬ及びＭＧＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。
【００３５】
＜活性化状態の肝星細胞におけるＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性の確認＞
［実施例３］
（活性化状態の肝星細胞の分離、活性化状態の肝星細胞へのＣＯＬ１Ａ２プロモーターの導入、及びＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性測定）
常法に従い、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子とを結合させたプラスミドを作製した。そしてこのプラスミドを、ＭＭＰ１３プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子とを結合させたプラスミドに代えて使用し、さらに、薬剤としてＧＬ及びＭＧＡを使用しなかったこと以外は、実施例２と同様に培養し、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性を測定した。この時の測定結果を図４に示す。図４のグラフ中、縦軸はＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）の活性を１００％とした時の、各薬剤を使用した場合の活性（％）を示す。なお、培養サンプルは、添加した薬剤（ＬｉｃｏＡ等）ごとに２〜３個ずつ作製した（ｎ＝２〜３）。
【００３６】
図４から明らかなように、活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール）に対して、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性は半分以下となっており、ＣＯＬ１Ａ２の発現が抑制されたことを確認できた。一方、ＧＡを使用した場合には、ＤＭＳＯを使用した場合と大きな違いは認められなかった。
【００３７】
活性化状態の肝星細胞において、ＬｉｃｏＡは、実施例２から明らかなように、ＭＭＰ１３プロモーターの活性を向上させて、ＭＭＰ１３の発現を促進し、コラーゲンの分解を促進する。さらに、実施例３から明らかなように、ＣＯＬ１Ａ２プロモーターの活性を抑制して、ＣＯＬ１Ａ２の発現を抑制し、コラーゲンの産生を抑制する。このようにＬｉｃｏＡは、活性化状態の肝星細胞において、コラーゲンの過剰な蓄積を抑制する作用を有しており、これにより、肝星細胞の線維化を抑制する。
【００３８】
＜休止状態の肝星細胞に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［実施例４］
（肝星細胞の分離及び培養）
実施例１と同様の方法で、マウスの肝臓から肝星細胞を分離した。
また、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ溶液に、
（４−ａ）濃度が２．５μＭとなるようにＬｉｃｏＡを溶解させた液体培地
（４−ｂ）濃度が２０μＭとなるようにＧＡを溶解させた液体培地
（４−ｃ）濃度が２０μＭとなるようにＧＬを溶解させた液体培地
（４−ｄ）濃度が０．４％となるようにＤＭＳＯを溶解させた液体培地
をそれぞれ調製した。
次いで、分離した休止状態の肝星細胞をプラスティックディッシュに播種し、前記液体培地中で、それぞれ３７℃で７日間培養した。
【００３９】
（培養後の肝星細胞の観察）
次いで、培養した肝星細胞において、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ，ａｌｐｈａ−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅを用いた免疫蛍光染色によりα平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、以下、「αＳＭＡ」と略記する）を染色し、共焦点レーザー顕微鏡（「５１０ｍｅｔａ」、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で画像を観察して、蛍光シグナルを検出することで、αＳＭＡの発現の有無、発現の程度を確認した。αＳＭＡは、筋線維芽細胞の指標として知られており、ここでは、肝星細胞の休止状態から活性化状態への移行の指標とした。この時の撮像データを図５に示す。図５中、（ａ）はＬｉｃｏＡを使用した場合（（４−ａ））、（ｂ）はＧＡを使用した場合（（４−ｂ））、（ｃ）はＧＬを使用した場合（（４−ｃ））、（ｄ）はＤＭＳＯを使用した場合（（４−ｄ））の、それぞれの撮像データである。
【００４０】
図５から明らかなように、ＤＭＳＯを使用した場合（コントロール、（ｄ））には、αＳＭＡが多量に検出され、αＳＭＡによる細胞骨格の構築を確認できたのに対し、脂肪はほとんど確認できなかった。
一方、ＬｉｃｏＡを使用した場合（（ａ））には、αＳＭＡがほとんど検出されず、αＳＭＡによる細胞骨格の構築を確認できなかったのに対し、脂肪の残存を確認できた。ＧＡを使用した場合（（ｂ））、ＧＬを使用した場合（（ｃ））も同様であった。これらの蛍光シグナルは、一次抗体の除去で消失することから、免疫反応が特異的であることが判った。
以上のように、ＬｉｃｏＡは、肝星細胞の休止状態から活性化状態への移行時に特徴的な、脂肪の消失、及び筋線維芽細胞様への形態変化を抑制しており、肝星細胞に対する休止状態から活性化状態への移行抑制作用を有しており、肝星細胞の線維化抑制作用を有することが確認できた。
【００４１】
＜肝臓に対するＬｉｃｏＡの作用の確認＞
［実施例５］
（マウスの肝障害誘導と薬剤投与）
下記手順に従って、ＣＣl４が投与されたマウスの肝星細胞に対するＬｉｃｏＡの作用を確認した。
すなわち、マウスに対して、
（５−ａ）８週間に渡って、１回の投与量を１ｍＬ／ｋｇとして週に２回（合計１６回）ＣＣl４を皮下投与すると共に、この間並行して、１回の投与量を３０ｍｇ／ｋｇとして週に３回（合計２４回）、ＬｉｃｏＡ０．５％カルボキシメチルセルロース（以下「ＣＭＣ」と略記する）懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のマウスに対して、
（５−ｂ）８週間に渡って、１回の投与量を１ｍＬ／ｋｇとして週に２回（合計１６回）ＣＣl４を皮下投与すると共に、この間並行して、前半の４週間は週に３回（合計１２回）、後述するＬｉｃｏＡ投与時に相当する用量の０．５％ＣＭＣを腹腔内投与し（すなわち、ＬｉｃｏＡは投与しない。以下、同様。）、続く後半の４週間は１回の投与量を３０ｍｇ／ｋｇとして週に３回（合計１２回）、ＬｉｃｏＡ０．５％ＣＭＣ懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のマウスに対して、
（５−ｃ）８週間に渡って、１回の投与量を１ｍＬ／ｋｇとして週に２回（合計１６回）ＣＣl４を皮下投与すると共に、この間並行して、週に３回（合計２４回）、ＬｉｃｏＡ投与時に相当する用量の０．５％ＣＭＣを腹腔内投与した。
なお、使用したマウスは、それぞれの投与パターンごとに５〜６匹とした（ｎ＝５〜６）。
【００４２】
（肝臓の観察）
上記のように８週間に渡って飼育したマウスから肝臓を切り出して切片を作製し、これをアザン（Ａｚａｎ）染色して、光学顕微鏡（「ＡＸ７０」、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を使用して画像を観察し、肝臓の線維化の程度を調べた。この時の撮像データを図６に示す。図６中、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合（（５−ａ））、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合（（５−ｂ））、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合（（５−ｃ））の、それぞれの撮像データである。
さらに、前記撮像データから、組織全面に占める線維化組織面の割合（面積％）を算出した。結果を図７に示す。図７中、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合（（５−ａ））、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合（（５−ｂ））、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合（（５−ｃ））を、それぞれ示す。すなわち、（ａ）〜（ｃ）の符号は、図６及び７で共通している。
【００４３】
（血清中のトランスアミナーゼ値の測定）
上記のように８週間に渡って飼育したマウスから血液を採取し、血清中のトランスアミナーゼ値を測定した。ここでは、トランスアミナーゼとして、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＳＴ」と略記する）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＬＴ」と略記する）の値を測定した。結果を図８に示す。図８中、（ａ）はＣＣl４及びＬｉｃｏＡを８週間投与した場合（（５−ａ））、（ｂ）はＣＣl４を８週間投与し、この間、ＬｉｃｏＡを後半の４週間投与した場合（（５−ｂ））、（ｃ）はＣＣl４を８週間投与した場合（（５−ｃ））を、それぞれ示す。すなわち、（ａ）〜（ｃ）の符号は、図６〜８で共通している。
【００４４】
図６及び７から明らかなように、（ａ）の場合には、（ｃ）の場合に対して肝臓の線維化が有意に抑制され、（ｂ）の場合よりもその効果が高かった。すなわち、肝障害発生の初期からＬｉｃｏＡを投与することで、肝臓の高い線維化抑制効果が得られた。
また、図８において、（ａ）の場合には、（ｂ）及び（ｃ）の場合よりもトランスアミナーゼ値が低い傾向にあった。これらトランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）は、肝実質細胞が破壊されることで血中に漏出するが、（ａ）の場合には、これが抑制されることを示唆しており、図６及び７の結果と整合していた。
【００４５】
＜ＬｉｃｏＡの投与方法と血清中濃度との関係の確認＞
［試験例２］
（ラットへのＬｉｃｏＡの投与）
下記手順に従って、ラットにおけるＬｉｃｏＡの投与方法と血清中濃度との関係を確認した。
すなわち、ラットに対して、
（Ｔ２−ａ）濃度が６０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＬｉｃｏＡのオリーブオイル懸濁液を調製し、ＬｉｃｏＡの投与量が２００ｍｇ／ｋｇとなるように、この懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のラットに対して、
（Ｔ２−ｂ）濃度が６０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＬｉｃｏＡ０．５％ＣＭＣ懸濁液を調製し、ＬｉｃｏＡの投与量が２００ｍｇ／ｋｇとなるように、この懸濁液を腹腔内投与した。
また、別のラットに対して、
（Ｔ２−ｃ）ＬｉｃｏＡを２００ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。
【００４６】
（ＬｉｃｏＡの血清中濃度の測定）
次いで、ラットから所定の時間ごとに血液を採取し、ＬｉｃｏＡの血清中濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手法を用いて測定した。結果を図９に示す。なお、図９のグラフ中、横軸の経過時間「０（分）」は、ＬｉｃｏＡの投与時を意味する。
【００４７】
図９から明らかなように、腹腔内投与によって、ＬｉｃｏＡの血清中濃度が速やかに上昇することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、医療分野で慢性肝炎、肝硬変及び肝がんの治療に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）を有効成分とする肝臓線維化抑制剤。
【請求項１】
リコカルコンＡ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ａ）を有効成分とする肝臓線維化抑制剤。
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−１０３９２５（Ｐ２０１３−１０３９２５Ａ）
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５０７４６（Ｐ２０１１−２５０７４６）
【出願日】平成２３年１１月１６日（２０１１．１１．１６）
【出願人】（０００１７０３５８）株式会社ミノファーゲン製薬 (16)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１６日（２０１１．１１．１６）
【出願人】（０００１７０３５８）株式会社ミノファーゲン製薬 (16)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
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