肥満症治療における肥満細胞安定化薬
本発明は、肥満細胞を安定化させる化合物を投与することによって肥満症を治療またはその発症を予防する方法に関する。さらに、本発明は、肥満細胞安定化薬と、肥満症を治療または予防することにおけるこの安定化薬を使用することについての説明書との両方を含む、治療構成物を包含する。例えば、一実施形態において、本発明の方法で使用される薬物は、クロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、及びロドキサミドからなる群より選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願はアメリカ合衆国において２００７年９月２８日提出の、本明細書中で、その全体を参考として援用する仮出願６０／９６０，４０８に対する優先権及び利益を主張するものである。
【０００２】
政府財政援助に係る供述
アメリカ合衆国政府は、保健社会福祉省により授与されたＮＩＨ助成ＨＬ６０９４２号の条件に基づく規定により、本発明において全額支払済み実施権及び限定された状況において特許権者に妥当な条件で他に実施権を付与させる権利を有する。
【０００３】
発明の属する分野
本発明は、肥満症の治療及び予防に有用な組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明背景
肥満症は、極めて一般的かつ有害な代謝病であり、アメリカ合衆国や世界中で公衆衛生上に極めて深刻な脅威を与える。この疾患の有病率は１９８０年代半ば頃から著しく増加し始めた。アメリカ合衆国では成人の５０％が過体重であり、３０％が肥満である。さらに深刻なことに、肥満の有病率とそれにと関連する糖尿病は小児においても急速に増加している。個人や家族そして社会に与える肥満の影響は、特に、保健資源の費用および利用の点からも大変深刻である。これらのことより、体重管理は学問的な話題になるばかりではなく、社会的関心も高まっている。
【０００５】
肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ；ＭＣ）は、細胞質の顆粒を放出することによってアレルギー反応を誘導することを促進し、その内容物はＩｇＥおよび補体因子による感作の際にアレルギー性の炎症を促進する（非特許文献１；非特許文献２）。近年、生化学的ならびに組織学的研究により、肥満細胞の、血液媒介性（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ）の白血球の動員（非特許文献２）、平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ， ＳＭＣ）／内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ， ＥＣ）の増殖（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、アポトーシス（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、Ｔリンパ球の遊走および活性化（非特許文献２）、血管新生（非特許文献９）、マトリックスリモデリング（非特許文献１０）への関与が示唆された。肥満症における肥満細胞の明確な役割は明らかになっていないのが現状である。
【０００６】
最近、肥満細胞欠損マウスの発見（Ｄｕｔｔｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：３７５４−３７５８ （１９９５）； Ｗｏｌｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ３５：８２−８８ （２００５））や肥満モデル（遺伝的あるいは食事誘導性の肥満マウスの両方）が利用できることにより、肥満症およびその合併症における肥満細胞の役割評価が可能となってきた。さらに、重要な肥満細胞メディエーターや白色脂肪組織（ＷＡＴ）ケモカイン受容体の遺伝子欠損変異マウスが利用できることにより、肥満症に不可欠な脂肪細胞におけるメディエーターや脂肪細胞のホーミングに必要とされるＷＡＴにおけるケモカインを同定することが可能になった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｒｏｇ． Ａｌｌｅｒｇｙ （１９８４）３４：２７１−３２１
【非特許文献２】Ｍｅｋｏｒｉら、Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１０４：５１７−５２３
【非特許文献３】Ｔｏｄａら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．（１９８７）６１：２８０−２８６
【非特許文献４】Ｉｎｏｕｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（１９９６）１４９：２０３７−２０５４
【非特許文献５】Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．（１９９５）７７：５４−６３
【非特許文献６】Ｌａｔｔｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００３）１９５：１３０−１３８
【非特許文献７】Ｌｅｓｋｉｎｅｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．（２００３）２３：２３８−２３４３
【非特許文献８】Ｌｅｓｋｉｎｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００３）６６：１４９３−１４９８
【非特許文献９】Ｚｕｄａｉｒｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（２００６）１６８：２８０−２９１
【非特許文献１０】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｃｕｒｒ． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ． Ｒｅｐ．（２００２）４：２２２−２２７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概要
本発明は、肥満細胞が、炎症促進性サイトカインおよび他のメディエーターの産生および放出におそらく起因して、肥満症の発症において重要な役割をすることを示唆する実験に基づく。マウスに高脂肪食（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｅｔ）を与えたところ、正常対照群マウスよりも、肥満細胞欠損マウスでの体重の増加が実質的に低かった。しかし、正常なマウスに肥満細胞安定化薬も投与することにより、体重増加が実質的に回避される。
【０００９】
その第一の局面において、この発明は、肥満細胞を安定化させる薬物の有効な量を投与することによって動物またはヒトのいずれかにおいて肥満症を治療および予防するための方法に関する。用語“有効量“とは治療目的を達するために十分な量の薬物をいう。この場合では、このことは、肥満症のための治療として与えたときには、体重減少を促進するか、または肥満症の発症を予防するために与えたときには、および体重増加を防止するのに十分な量の肥満細胞安定化薬が与えられなければならないことを意味する。この薬物を経鼻的に投与するならば、通常の投薬量は５−１００ｍｇ／日である。経口的に投与するならば、投薬量はやや多く、通常５０−１５００ｍｇ／日である。本発明の目的のためには、ヒトまたは動物の理想的体重よりも２０％超重いか、ボディマス指数（ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ， ＢＭＩ）が３０以上であるか、および／または体脂肪３０％超のものを肥満とみなした。
【００１０】
上記の方法で投与される肥満細胞安定化薬は、好ましくは２４時間の期間にわたって与えられる、２つ以上の等量の用量に分割される。好ましい薬物は、クロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、ロドキサミドである。これらは、ナトリウム塩、二ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩のような薬学的に受容可能な塩を含む、任意の薬学的に受容可能な形態で与えられ得る。他に指定されない限り、これらの薬物のうちの一つに対する言及が、その薬学的に受容可能な形態の全てを含むことが理解される。いくつかの好ましい形態は、ネドクロミルナトリウム（特に、経鼻投与５〜５０ｍｇ／日、経口投与５０〜５００ｍｇ／日）、フマル酸ケトチフェン（特に、経口投与１〜２００ｍｇ／日）、ロドキサミドトロメタミン（特に、経口投与１〜２００ｍｇ／日）である。もっとも好ましい薬物はクロモリンナトリウムあるいはクロモリン二ナトリウムで投薬量は、経口的に２００〜１，０００ｍｇ／日である。本明細書中に記載されるすべての投薬量は、人への薬物の投与に関するものである。もし動物に投与する場合、ヒトへの投薬量は、案内を提供し、体重の差について調整がなされる。例えば、動物の体重が５０ポンドなら、ヒトの用量のおよそ三分の一量が投与される。
【００１１】
上記の方法は、肥満である個体において体重減少を促進するかあるいは個体（特に、遺伝的要因または環境因子による体重増加の傾向がある個体）において体重増加を予防するために実行され得る。肥満症を治療するために、ヒトまたは動物に与える場合、薬物の投与は、個体が、元の体重の少なくとも１０％、好ましくは１５あるいは２０％減少するまで毎日基準で続けるべきである。特に好ましい実施形態において、肥満の個体は、クロモリン、特にクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムをこの期間にわたり一日あたり２００〜１，０００ｍｇの用量で投与される。治療を受けている患者は肥満症とは別の他の病気を有しても、治療時にアレルギー、心血管疾患または糖尿病のような状態を有さなくてもよい。
【００１２】
別の局面において、本発明は、肥満細胞安定化薬と、肥満症を予防および治療するために患者にこの安定化薬を投与するための説明書との両方を含む治療構成物に関する。安定化薬は単位用量形態での治療構成物の一部であり、完成した薬学的容器（ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）の中に包装されるべきである。用語“単位用量形態”とは、錠剤、カプセル、あるいは液剤の量などの単回の薬物投与の実体をいう。“完成した薬学的容器”はボトル、バイアル、ブリスターパックのような医薬品に通常使用される任意の種々のタイプのパッケージをいう。本発明の目的として、完成した薬学的容器は、薬物の経鼻投与のために設計されたパッケージ（すなわち、それを含むボトルまたはバイアル）を含み、鼻スプレーとして液剤または粉末を送達するように使用され得る。同様に、“単位用量形態”は、薬物をある濃度で溶かした液剤を含み、これは、患者へ固定量で経鼻的あるいは経口的な投与した場合、治療効果を提供する。
【００１３】
治療構成物に含有される、最も好ましい肥満細胞安定化薬は、クロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、ロドキサミドである。これらの薬物を錠剤またはカプセルの形で経口投与する時、単位用量は一般的に５〜１，０００ｍｇで、より一般的には１０〜５００ｍｇである。等価な量が、経口液剤として投与される単位用量形態中にある。もし薬物が経鼻的に投与されるならば、一般的に１回のスプレーで０．１〜１０ｍｇを患者が受容するように、液剤は、代表的に十分な濃度の薬物を含むべきである。
【００１４】
治療組成物の一部を形成する説明書は、肥満細胞安定化薬を含むパッケージ上にか、完成した薬学的容器上にかまたは別個のパッケージ挿入物として存在する。この説明書は、例えば、肥満症を治療または予防するために、患者に投与されるべき肥満細胞安定化薬の投薬量を含む。本治療が必要となる患者は、一般的に、肥満であるか、以前に肥満であったか、肥満症の家族歴を有する患者、あるいは体重増加が重篤な健康リスクを生成する患者、例えば確立した心血管疾患のある患者である。
【００１５】
本発明は、特定の化合物を、肥満細胞を安定化するその活性についてアッセイすることによってその化合物が、肥満症の治療または予防に有用か否かを判定する方法も包含する。当該分野において周知の安定化アッセイ（特に、アレルギー治療における有用性について化合物をスクリーニングするために開発されたアッセイ）のいずれも、この目的のために使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、肥満細胞安定化薬が肥満症を制御するのに使用され得ることを示す実施例セクションに以下のようにまとめられた実験に基づいている。これらの薬物は、肥満のヒトが体重を減らすことを補助するか、ヒトを肥満になることから予防するためのいずれかに使用され得る。
【００１７】
Ａ．肥満細胞安定化薬
肥満細胞を安定化する薬物は、アレルギーの治療との関連で広く研究された。そしてこれらの薬物のいくつかは商品として使用されている。もっとも好まれる肥満細胞安定化薬はクロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、ロドキサミドであり、これらは、購入され得るか、または当該分野で周知の方法を使用して合成され得る。さらに、当該分野で記載される、任意のその他の薬学的に受容可能な肥満細胞抑制剤についても本発明で使用され得る。これらとしては、アメリカ合衆国特許（６，２０７，６８４；４，６３４，６９９；６，２０７，６８４；４，８７１，８６５；４，９２３，８９２；６，２２５，３２７；７，０６０，８２７）に開示される化合物が挙げられる。化合物を調製するための方法が、化合物を精製し得る方法と使用され得る形態についての情報と共に、これらの米国特許の各々に提示される。これらの化合物は、任意の薬学的に受容可能な塩を含む、任意の薬学的に受容可能な形態で患者に与えられ得、最も好ましい薬物はクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムのいずれかである。
【００１８】
Ｂ．薬学的組成物の製造
肥満細胞を安定化させる薬物は、当該分野で標準的な方法にしたがって薬学的組成物に組み入れられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（１９９０）を参照のこと）。処方物は、当該分野で一般的に使用される任意の経路によって送達されるように設計され得、経口または経鼻送達のために設計された調製物が好ましい。例えば錠剤、カプセルのような経口組成物について、肥満細胞安定化薬は一般的に１〜５００ｍｇで存在すべきである。経鼻送達用の組成物において、安定薬は一般的に０．５〜５０ｍｇ／ｍｌとし、１〜２０ｍｇ／ｍｌにするのがより好ましい。経口的に摂取される液剤に、同様の濃度範囲が使用され得る。好ましくはないが、投与の他の経路も使用され得る。
【００１９】
肥満細胞安定化薬は、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンゾアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖などの炭水化物、アミラーゼまたはデンプン；ステアリン酸ナトリウム；タルク（滑石）；サリチル酸；パラフィン；脂肪酸エステル；ポリマーなどを含む、薬学的調製物に一般的に使われるビヒクルおよび賦形剤のいずれかと一緒に使用される。薬学的調製物を滅菌し得、必要に応じて分散剤、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用する塩、緩衝剤、着色剤、矯味矯臭剤、および／または芳香物質のような補助物質と混合し得る。
【００２０】
液剤、特に注射用の液剤は水または、エタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセライド、グリセリンの部分的エステルのような生理的に適合性のある有機溶剤を使用して調製することができる。調製物は従来の技術を使用して作製され得、これは、例えば、滅菌の等浸透圧性生理食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水とポリグリコールの混合物、リンゲル液などを含み得る。
【００２１】
Ｃ．剤形および投与経路
本発明は、経口、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）、内用（ｉｎｔｅｒｎａｌ）、直腸内、経鼻、舌下、経皮、経膣、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、そして皮下経路を含む任意の投与経路に適合性がある。使用され得る剤形は、錠剤、カプセル、粉末薬、エアロゾル、坐薬、皮膚用パッチ剤、非経口的な薬、除放性調製物、そして懸濁液、溶液および乳濁液を含む経口性の液体が挙げられる。もっとも好ましい投与経路は経口投与および経鼻投与である。望ましい場合、組成物（特に、注射用組成物）は、投与前に再構成される、フリーズドライおよび凍結乾燥したものであり得る。剤形は、唯一の活性成分として肥満細胞安定化薬を含み得るか、他の活性薬剤も含んでもよい。すべての剤形は、当該分野で標準的であり、かつＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ， Ａ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））のような参考研究に教示される方法に基づいて調製され得る。
【００２２】
Ｄ．治療方法
本明細書に書かれている治療目的は、患者の体重を減らすこと、またはさらなる体重の増加を防ぐことである。体重の増加を防ぐために使用される場合、最適な投薬量は、動物実験（本明細書に記載されるような実験）の結果に基づき、臨床研究は、当該分野で周知の方法を使用して実行される。肥満細胞安定化薬は、すでに他の疾患症状、特にアレルギーに利用されており、既存の投薬量は、肥満症の予防または治療に有効な投薬量を評価するための開始点として役立ち得る。既存の知識に基づき、経口送達方法を使用して、代表的に、患者が、肥満細胞安定化薬の５０〜１，５００ｍｇ／日の経口用量で、好ましくは少なくとも２個の等しい用量に分けて受容することが期待される。薬物が経鼻投与される場合、５〜１００ｍｇ／日の量の安定化薬を毎日投与され、再度、この量が、いくつかの等しい用量に分割されることが期待される。
【００２３】
Ｅ．糖尿病に関する意見
本発明に述べられている実験は主として肥満症に関することであるが、特定の局面は、同じ方法がＩ型糖尿病の治療または予防にも適用可能であることが示唆された。糖尿病治療における目的はインスリン依存性を減らす、もしくは無くすことである。好ましい薬物および投薬量は肥満に対するものと同じである。
【００２４】
Ｆ．治療構成物の包装
これまで述べられてきたように、肥満細胞安定化薬に含まれる薬学的組成物は、完成した薬学的容器内に配置され得、組成物の使用に関する医師への説明書とともに販売され得る。経鼻送達用の調製物において、薬学的組成物は、一般にスプレーとして組成物を送達するように設計されたデバイスに包装された液剤または粉末である。この方法で薬物を送達するための当該分野で公知のあらゆるデバイスは、この発明に適合性がある。送達の意図された経路に依存して、他の容器は、ボトル、バイアル、アンプル、ブリスターパックなどを含み得る。
【００２５】
薬学的組成物の使用に関する説明書は、薬学的組成物を含む容器上にか、またはパッケージ挿入物として含まれ得る。あるいは、説明書は、薬学的組成物を販売する箱または他のパッケージに含まれ得る。すべての場合において、説明書は、薬学的組成物が体重の減少の促進、または体重増加の予防目的で投与されることを示す。活性成分の記載には、投薬量およびどのようにして薬学的組成物を投与するのかに関する情報と共に含まれている。
【００２６】
Ｇ．アッセイ方法
本発明は、肥満細胞を安定化する能力をもとに肥満症の治療または予防において化合物の使用の可能性を評価するための方法も含んでいる。これらのアッセイは、当該分野で周知であり、またアレルギーの治療において有用な薬剤の同定と組み合わせて使用される。
【００２７】
使用され得る適切なアッセイの一例はＵＳ ６，２２５，３２７に記述されたものである。手短に説明すると、肥満細胞（約５，０００個／アッセイチューブ）を試験化合物と共に３７℃で約１５分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＥ（約１０μｇ／ｍｌ）に曝露させる。さらに１５分後、遠心分離によって反応を止める。その後、上清を回収し、放射免疫測定法などによりヒスタミン含有量について分析する。このサンプル（試験サンプル）に存在するヒスタミンの量と、試験化合物非存在下で肥満細胞と抗ヒトＩｇＥをインキュベートして得たコントロール調製物内の量との間で比較を行う。コントロールと比較しての、試験サンプル中のヒスタミン含量の減少は、試験化合物が肥満細胞を安定化するように作用することを示している。安定薬の有効性は、抑制の所定のレベル（例えばヒスタミン放出の５０％の減少）を達成するのに必要とされる濃度によって反映される。
【実施例】
【００２８】
この研究は、肥満細胞が食事に誘発された肥満および糖尿病の重大な一因となることを明らかにしている。肥満のヒトおよびマウス由来の白色脂肪組織（ＷＡＴ）は脂肪の少ない対照群のＷＡＴと比較してより多くの肥満細胞が含まれている。マウスの遺伝子的に決定された肥満細胞の欠損および薬理学的な肥満細胞の安定化は、グルコースホメオスタシスおよびエネルギー消費を改善することと協調して、体重増加を減らし、血清および／またはＷＡＴ中の炎症性サイトカイン、ケモカインおよびプロテアーゼの量を減らす。機械学的研究は、肥満細胞がＷＡＴを高め、筋肉の血管新生を高め、付随する脂質生成に関係するカテプシン活性を高めることを明らかにする。体重増加の減少および耐糖能の改善と一致して、肥満細胞の欠損および安定化は筋肉およびＷＡＴ内の、抗脂質生成性（ａｎｔｉ−ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）マトリックスフィブロネクチン、グルコース輸送体Ｇｌｕｔ４、およびインスリン受容体のレベルを上げる。サイトカイン欠損肥満細胞の利用により、これらの細胞がマウスの脂肪細胞脂質の沈着およびカテプシンの発現をインビトロで誘導し、ＩＬ６およびＩＦＮ−γの産生により食事誘導性の肥満およびグルコース代謝をインビボで促進することを確立した。臨床で使用される肥満細胞を安定化させる薬剤は、マウスの肥満と糖尿病を抑え、これらの一般的なヒトの代謝障害に対する新しい治療法を示唆している。
【００２９】
Ｉ．方法
マウス
野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）、Ｉｌ６−／−（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ１１）、およびＩｆｎｇ−／−（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ１０）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から購入した。類遺伝子性のＴｎｆ−／−（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ１０）マウスと肥満細胞欠損ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウス（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ＞１０）は、記載されるようにＣ５７ＢＬ／６マウスとのもどし交配によって発生させた（Ｓｕｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：７１９−７２４（２００７）；Ｗｏｌｔｅｒｓら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ３５：８２−８８（２００５））。すべての動物実験のプロトコールはＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの常任委員会に是認され、すべてのマウスは病原体のない設備に収容された。肥満を引き起こすために、６週齢のマウス（メス及びオス）に高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， ＮＪ）を１２〜２０週間与えた。マウスの体重は週に１回モニタリングした。高脂肪食消費の各々の経過の終わりまで、耐糖能とエネルギー消費量のアッセイを以前の報告（Ｙａｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：９７０−９７７（２００７））に従って実行した。マウスの血液サンプルは血清アディポカインの測定のために採取された。皮下脂肪と内臓脂肪と褐色脂肪と骨格筋は別個にタンパク抽出およびパラフィン切片の調製のために集められた。組織タンパクの抽出物はＥＬＩＳＡ、イムノブロット分析、およびシステイニルカテプシン活性部位の標識に用いられた。イムノブロット解析では３０μｇのタンパクを、２２０ｋＤａフィブロネクチン（マウスモノクローナル抗体， １：１００， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）と２００ｋＤａインスリン受容体（マウスモノクローナル抗体， １：１００， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を検出するために８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したか、またはＧｌｕｔ４（マウスモノクローナル抗体， １：２００， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ＵＣＰ１（ラビットポリクロ―ナル抗体， １：３０００， Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、アクチン（マウスモノクローナル抗体， １：５００， Ａｂｃａｍ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＧＡＰＤＨ， ラビットポリクロ―ナル抗体， １：１０００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）を検出するために１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。カテプシン活性部位の標識については、以前に記載されたように、３０μｇのタンパクを１μｌの６００ｍＭ のジチオスレイトールと１μｌの［１２５Ｉ］−ＪＰＭをｐＨ５．５の緩衝液中でインキュベートした。３７℃で１時間反応混合物をインキュベートした後、標識されたタンパクを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルはクマシーブルーで染色し、脱色、乾燥させＸ線フィルムに曝露した。肝臓および胃腸管は組織学的分析のために回収した。
【００３０】
患者の選択
この研究では８０人の肥満症の被験体が、２００３年〜２００７年の間にＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｃａｒｅ ｏｆ Ｏｂｅｓｉｔｙ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）において先を見越して集められ登録された（平均年齢３７．５歳、範囲２０−６６歳、平均ＢＭＩ ４８．５ｋｇ／ｍ２、範囲３２−８５ ｋｇ／ｍ２；女性／男性比６９／１１）。これらの被験体はＡｓｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｕｂｒｉｑｕｅ−Ｈｏｐｉｔａｕｘ ｄｅ Ｐａｒｉｓにより支持される臨床研究プログラムにおける、食事介入あるいは胃の手術のどちらかの候補者たちである。これらの被験体からは、炎症性疾患あるいは感染症、がん、アルコール乱用、腎疾患の者は除外された。胃の手術の際、本発明者らは、肥満患者の一部の臍周囲の領域から皮下脂肪組織を採取した（Ｎ＝６， ボディマス指数＝５１．７１±１．４０ｋｇ／ｍ２， グルコース： ５．３８±０．１３ ｍｍｏｌ／ｌ， インシュリン：１３．３２±１．０６μＵ／ｍｌ）。同じような地理的領域にいる、健康で、非肥満の年齢が対応する（Ｐ＝０．２）の個体がコントロールとして集められた（Ｎ＝３２、平均年齢；４１．４歳、範囲、２０−６２歳；平均ＢＭＩ、２２．８ｋｇ／ｍ２；範囲、１９．９−２８．４ｋｇ／ｍ２；女／男比、２２／１０）。１０人の肥満のないコントロール（ＢＭＩ＝２３．６７±０．４８ｋｇ／ｍ２；グルコース：４．８２±０．４５ｍｍｏｌ／ｌ、インシュリン：７．２０±１．５６μＵ／ｍｌ）において、臍周囲の領域において皮下脂肪組織を針生検により採取した。代謝の研究に参加したボランティアは、介入の前、３か月間、体重は安定していた。絶食後の朝に採取した血液サンプルおよび血清は使用時まで−８０℃で凍結した。組織サンプルはホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会によりこの臨床研究は承認され、すべての被験体に書面でのインフォームドコンセントを行なった。
【００３１】
免疫組織学
ヒトおよびマウスのＷＡＴと筋肉組織は１０％ホルマリンで一晩固定し、パラフィン包埋し５μｍの切片を作成した。抗ヒト肥満細胞トリプターゼ抗体（マウスモノクローナル抗体， １：１００， Ｄａｋｏ， ＴＲＡＰＰＥＳ ＣＥＤＥＸ， Ｆｒａｎｃｅ）、抗マウス肥満細胞ＣＤ１１７抗体（ラットモノクローナル抗体， １：１０， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、および抗マウスＣＤ３１抗体（ラットモノクローナル抗体， １：４００， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）でＷＡＴ、筋肉および肝臓の切片上の肥満細胞と微細血管を免疫染色した。研究者は、組織の起源がわからないようにして、ヒトトリプターゼ陽性肥満細胞とＣＤ１１７陽性肥満細胞をカウントし、データは細胞数／ｍｍ２で示した。ＷＡＴと筋肉におけるＣＤ３１陽性の面積は、記載されるようにＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて同様に測定し、そしてデータはＣＤ３１陽性面積のパーセンテージで示した（Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：６０２０−６０２９ （２００６）； Ｗｉｌｄ， Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ５９：３６８−３７６ （２０００））。ヘマトキシリン‐エオジン染色は消化管の組織学的評価を補助した。
【００３２】
ＥＬＩＳＡ
凍結したマウスのＷＡＴは粉々に砕き、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で溶解した。ＷＡＴおよび血清サンプルは、製造者の説明書に従ってＩＬ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）、ＩＦＮ−γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＭＣＰ−１ （ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、アディポネクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＭＰ−９ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃａｔ Ｓ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣａｔ Ｌ （Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）についてのＥＬＩＳＡに供した。
【００３３】
ヒトの血清トリプターゼレベルの測定のため、９６−ｗｅｌｌプレートをウサギ抗ヒトトリプターゼポリクローナル抗体（１：１０００， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でプレコートした。１：２に希釈したヒト血清サンプルはスタンダードとして組換え型ヒトトリプターゼと一緒に抗体でコーティングしたプレートに加えた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、抗ヒトトリプターゼモノクローナル抗体（１：２０００， ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ， Ｒａｌｅｉｇｈ， ＮＣ）で１時間インキュベートした。検出抗体として、ＨＲＰ結合体化抗マウスＩｇ Ｇ（１：１０００， Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を用いた。
【００３４】
３Ｔ３−Ｌｌ細胞培養および分化
マウスの前駆脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）３Ｔ３−Ｌｌ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）は、前述のように６−ｗｅｌｌあるいは２４−ｗｅｌｌプレートで培養し、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン中で脂肪細胞に分化した（Ｙａｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：９７０−９７７ （２００７））。 ３Ｔ３−Ｌｌの分化における肥満細胞の役割を評価するために、生きている肥満細胞（６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに ２ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌまたは２４−ｗｅｌｌ プレートに５ｘ１０５細胞／ｗｅｌｌ）あるいはそれらの脱顆粒タンパク抽出物（生きている細胞数と同等の）を１００％コンフルエントの３Ｔ３−Ｌｌ細胞に添加した。共培養は７〜９日間維持され、生きている肥満細胞または肥満細胞のタンパク抽出物を含む培養培地は、２日毎に交換した。オイルレッドＯ染色により脂肪沈着を定量化し、データはＯＤ５１０ｎｍ読み取り値により示した。分化した３Ｔ３−Ｌｌ細胞は前述のとおり、ｐＨ５．５緩衝液に細胞を溶解することによって、カテプシン活性部位の標識にも用いた（Ｓｈｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：７２５８−７２６２（１９９２））。
【００３５】
ＢＭＭＣ培養と再形成
ＢＭＭＣは、本発明者らが以前報告したようにＷＴ、Ｉｌ６−／−、Ｔｎｆ−／−、Ｉｆｎｇ−／−マウスの骨髄から調製した（Ｓｕｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：７１９−７２４ （２００７）； Ｓｕｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１７：３３５９−３３６８ （２００７））。組換えマウスＩＬ３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）での５週間分化させた（Ｓｕｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：７１９−７２４ （２００７））後、細胞の純度および形態はそれぞれＣＤ１１７媒介ＦＡＣＳ分析およびトルイジンブルー染色によって確認した。マウスにおける肥満症での肥満細胞の役割を調べるために、６週齢のオスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの尾静脈に、それぞれのタイプのマウス由来のＢＭＭＣ（１ｘ１０７／マウス）を注射した。ＢＭＭＣ再形成の２週間後、それらのマウスに高脂肪食を消費させて肥満症と糖尿病を誘導させた。マウスの体重は毎週記録され、タンパク抽出物調製のためのＷＡＴを採集前に耐糖能アッセイを行なった。
【００３６】
統計
マウスから得られたすべてのデータは平均値±ＳＥとして示し、本発明者らのデータのサイズが小さいことと異常なデータ分布に起因する、統計的有意差はノンパラメトリック検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）を用いて判定した。ヒト血清のキマーゼおよびトリプターゼのデータは平均値±標準誤差で示した。Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定により、すべての臨床的および生物学的パラメーターは正規分布を示した。非対称の変数（キマーゼおよびトリプターゼ）は統計処理の前に、その分布を正規化するために対数変換し、検証した。グループ間の比較について、Ｓｒｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、非連続の値についてのカイ２乗検定を使用した。統計解析はＪＭＰの統計ソフトウェア （ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， ＮＣ）により行なった。Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【００３７】
ＩＩ．結果
肥満の被験体のＷＡＴには、脂肪細胞に加えてマクロファージとリンパ球が含まれていた（Ｗｅｉｓｂｅｒｇら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１２：１７９６−１８０８ （２００３）； Ｗｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５：１０２９−１０３８ （２００７））。これらの炎症性細胞はＷＡＴでサイトカインや成長因子、ケモカインおよびプロテアーゼを産生する （Ｗｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５：１０２９−１０３８ （２００７）； Ｆａｎｔｕｚｚｉ， Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１５：９１１−９１９ （２００５））。ただし、肥満症および関連する代謝性合併症である糖尿病の病因におけるこれらの細胞の役割に関しては依然として不明である。他の認識されていない細胞が決定的な一因となっているのかもしれない。ヒトの脂肪組織切片において、脂肪細胞特異的なトリプターゼモノクローナル抗体による免疫染色から、脂肪の少ない（ｌｅａｎ）ドナー由来のＷＡＴより肥満の被験体のＷＡＴでの肥満細胞の数が多いことが明らかになった。肥満のドナーの血清中の肥満細胞プロテアーゼのレベルがより高いことは、この脂肪細胞含量がより多いことに付随した。ＥＬＩＳＡを使用して、肥満のドナー（ボディマス指数≧３０ｋｇ／ｍｍ２）は、性別についての補正前（Ｐ＜０．０１）と後（Ｐ＜０．０１，多変量解析）で脂肪の少ない被験体（ボディマス指数＜３０ｋｇ／ｍｍ２）よりも有意に高い血清トリプターゼ濃度を有した。これらの結果は肥満症における肥満細胞の役割を示唆する。
【００３８】
肥満症における肥満細胞の直接的な関与を評価するために、肥満細胞欠損ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスにおける食事誘導性肥満症を研究した。ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスはｃ−Ｋｉｔプロモーター領域の反転型突然変異に起因して成熟肥満細胞を欠損している（Ｄｕｔｔｌｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３７５４−３７５８（１９９５））が、血液中の他の白血球の数と活性は正常で、生体内における肥満細胞機能の探索が可能である。１２週間高脂肪食を与えた６週齢のオスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスは野生型（ＷＴ）類遺伝子性コントロールと比較して、著しく体重の増加が少なかった。同様に、肥満細胞安定化薬であるクロモリン二ナトリウム（ＤＳＣＧ） （Ｅｉｇｅｎら、Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８０：６１２−６２１ （１９８７））の毎日の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受容するＷＴマウスもまた、体重増加の減弱を有した。ＤＳＣＧ治療は、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの体重にさらに影響を与えず、これは、肥満細胞を介して作用することが示唆された。体重の減少と一致して、オスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスまたはＤＳＣＧを受容したマウスは、未治療のＷＴコントロールと比較して、顕著に少ない総皮下および内臓脂肪を有した。メスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスあるいはＤＳＣＧ投与をしたＷＴマウスでも、体重増加ならびに皮下および内臓脂肪において類似の減少を示した。ヒトの脂肪組織のように、食事誘導性肥満マウス由来のＷＴにも多くのｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）陽性肥満細胞が存在したのに対して、固形飼料を給餌した脂肪の少ないマウス由来のＷＡＴは、はるかに少ない肥満細胞を有した。興味深いことに、これらのマウスは、体重増加に関してＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスと同様に応答したが、ＤＳＣＧ治療したマウス由来のＷＡＴは、同じ食事条件下の未治療のマウス由来のＷＡＴと同様な肥満細胞の数を有し、このことは、ＤＳＣＧ治療されたＷＴマウスが、未治療のＷＴマウスよりも少ない活性な肥満細胞を有することが示唆された。オスおよびメスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスまたはＤＳＣＧを受容したマウスの体重の減少と一致して、これらのマウスは、ＷＴコントロールよりも顕著に低いレベルの血清レプチンレベルも有した。ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスおよびＤＳＣＧ治療マウスがより脂肪が少ないだけでなく、これらのマウスが、グルコース負荷に対して、より感受性であることも示した。グルコース負荷アッセイにより、肥満細胞を有さない（ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈ）マウスあるいは安定化された肥満細胞を有するマウス（ＤＳＣＧで治療されたＷＴ）において有意に改善された耐糖能が明らかになった。肥満細胞の欠損や不活性化の有益な効果のメカニズムを理解するために、本発明者らは、エネルギー消費アッセイを実行し、褐色脂肪における結合解離した（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ）蛋白−１（ＵＣＰ１）を測定した。食物／水の摂取量、糞便／尿の生成量そして酸素消費量とＣＯ２産生量を測定することによって、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスとＤＳＣＧ治療したＷＴマウスは、未治療のＷＴマウスよりも有意に多い酸素消費とＣＯ２産生によって示される、安静時の代謝率が増加していることを見出した。ＷＴコントロールマウスと比較して、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスおよびＤＳＣＧを受容したマウスにおけるエネルギー消費の指標である褐色脂肪ＵＣＰ１発現が明らかに高かった。重要なことに、ＤＳＣＧ治療ＷＴマウスにおける体重の減少および耐糖能の改善は食物／水の摂取の減少によるものでもＤＳＣＧの何らかの毒性効果によるものでもないことではなかった。組織学的な分析では、ＤＳＣＧ治療し、高脂肪食を給餌したマウスと固形飼料を給餌したＷＴマウスの肝臓および消化管では病理学的に相違が認めなかった。高脂肪食を給餌したＷＴマウス由来の脂肪肝内にはたくさんの肥満細胞と脂肪細胞が存在したのに対して、固形飼料を給餌した野生型マウスまたはＤＳＣＧで治療し、高脂肪食を給餌したＷＴマウス由来の肝臓内には、肥満細胞も脂質を負荷した脂肪細胞も検出されなかった。同様に、組織学的解析では膵臓、胃、結腸、小腸において、固形飼料を給餌したＷＴマウスと高脂肪食を給餌し、ＤＳＣＧ治療したＷＴマウスとの間に顕著な相違は認められなかった。本発明者らの観察を広げるために、肥満や糖尿病を誘発するためＷＴマウスに高脂肪食を１２週間給餌し、これらの肥満症や糖尿病マウスを次の４つの治療グループに分けた。Ｉ、高脂肪食を給餌し続ける；ＩＩ、固形飼料に切り替える；ＩＩＩ、毎日のＤＳＣＧ腹腔内注射とともに高脂肪食を給餌し続ける；ＩＶ、固形飼料に切り替え、ＤＳＣＧで治療する。期待された通り、食事の切り替え（グループＩＩ）により体重は減少（８％）し、耐糖能も改善したが、食事の切り替えとＤＳＣＧ投与の併用（グループＩＶ）は体重と耐糖能のもっともよい改善がもたらされた。ＤＳＣＧ治療の８週間後、グループＩＩＩのマウスの体重は１２％減少したが、グループＩＶのマウスの体重は１９％減少し、４０〜４１ｇで安定した。重要なことは、グループＩＶのマウスは４つのグループの中で最も耐糖能が高いことも明らかにされ、肥満細胞の安定化により、ヒトの肥満および糖尿病の管理の可能性が示された。
【００３９】
ＩＩＩ．考察
肥満症の発症には脂質生成、血管新生、マトリックスリモデリングを含まれる。血管新生は肥満症において特定の重要性を有する。栄養成分を白色脂肪に提供する以外に、微細血管は、アディポカインの放出が続く白血球浸潤の経路を提供する。マウスでは血管新生の抑制により脂肪組織発達が抑制される（Ｒｕｐｎｉｃｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１０７３０−１０７３５ （２００２））。肥満のＷＴマウス由来白色脂肪と筋組織は、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１についての実質的な免疫染色を示した。対照的に、高脂肪食を給餌したＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウス、あるいはＤＳＣＧを受容したマウスは、固形飼料を給餌した脂肪の少ないマウスと同様なＣＤ３１陽性領域を有した。血管新生の低減により白血球の侵潤が減少し、したがって炎症メディエーターのＷＡＴ産生も低下した可能性がある（Ｓｋｏｕｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：２５０６−２５１６（２００７））。この概念と一致して、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスとＤＳＣＧを受容したマウスの血清および／または白色脂肪は、ＩＬ６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９）およびカテプシンＳ（Ｃａｔ Ｓ）のより低いレベルを有したが、いくつかのアディポカイン（アディポネクチンやＣａｔ Ｌなど）が有意な変化をしなかった。マトリックスのタンパク分解は血管新生促進ペプチド（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）の放出によって血管新生に寄与する可能性がある（Ｘｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５４：１０６９−１０７９（２００１））。本発明者らは以前、抗血管新生ペプチドの分解と血管新生促進性ラミン−５ 断片γ２の生成によって血管新生においてＣａｔ Ｓが重要な役割を果たすことを明らかにした（Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：６０２０−６０２９ （２００６））。ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスおよびＤＳＣＧ治療したマウスにおける血管新生の減少は、白色脂肪および血清中の低いＣａｔ Ｓレベルを伴っていた。活性なカテプシンを選択的に標識する［１２５Ｉ］−ＪＰＭと白色脂肪タンパク抽出物を一緒にインキュベートした結果、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの白色脂肪においてＣａｔ Ｓ、Ｃａｔ Ｋ、Ｃａｔ Ｂを含む活性なカテプシンの減弱が見出された。興味深いことに、ＤＳＣＧ治療したマウスの白色脂肪は、ＷＴコントロールに類似した、活性なＣａｔ ＳおよびＣａｔ Ｋのレベルを依然として有し、このことは、これらの組織内の肥満細胞の数の多さと一致していた。Ｃａｔ ＳのＥＬＡＩＳＡにより、本発明者らは、異なるマウス間の局所および全身レベルを測定することが可能であった。ＪＰＭ標識実験からの観察と同様に、オスおよびメスの両方のＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスは、ＷＴコントロールよりも低い血清中および白色脂肪中のＣａｔ Ｓレベルを示した。対照的に、ＤＳＣＧ治療は、血清中のＣａｔ Ｓレベルは有意に減少させたが、白色脂肪では減少しなかった。このことはこの抗アレルギー物質は効果的に肥満細胞を不活性化することが示唆した。
【００４０】
本発明者らは以前の研究で、システイニル・カテプシンは血管新生を促進するだけでなく、抗脂質生成マトリックス構成成分であるフィブロネクチン、グルコース輸送体であるＧｌｕｔ４、そしてインスリン受容体（ＩＲ）の分解による脂質生成に関与することを示唆した（Ｗａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１：６０２０−６０２９ （２００６）； Ｙａｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：９７０−９７７ （２００７）； Ｔａｌｅｂら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７：４９５０−４９５９ （２００６））。肥満細胞の欠損および不活性化は、低減したカテプシン活性に起因して、これらのタンパクに間接的に影響し得る。この仮説に一致して、３つのすべての分子はＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの白色脂肪および筋肉内で増加した。面白いことに、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスよりも、ＤＳＣＧ治療したマウス由来の白色脂肪および筋肉内において、多くのフィブロネクチン、Ｇｌｕｔ４およびＩＲ分子が検出され、このことからＤＳＣＧは肥満細胞よりも影響を与えることが示唆された。しかしながら、そのようなＤＳＣＧの追加の効果は、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスにおける体重の増加および耐糖能に、あるいはＷＴマウスにおける肝臓や消化管の組織学にさらには変化を与えなかった。
【００４１】
肥満細胞がマウスの肥満症および糖尿病を制御する分子機構をさらに理解するために、本発明者らは、３つの一般的な肥満細胞サイトカイン（ＩＬ６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）のうちの１つを欠くマウスから骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣ）を調製し、これらのサイトカインのうちのいずれかが存在しないことによって、インビトロでの前脂肪細胞の分化ならびにインビボでの食事誘導性の肥満症および糖尿病を誘導することにおいて肥満細胞の活性が減弱されるか否かを調べた。根底にある機構は未知のままだが、分化カクテル（インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン）がなくとも、ＷＴマウス、Ｔｎｆ−／−マウスおよびＩｆｎｇ−／−マウス由来ＢＭＭＣは、３Ｔ３ −Ｌ１の脂質生成と関連するカテプシン発現を誘導した。対照的に、ＩＬ６−／−ＢＭＭＣは、両方の変数に対する効力ははるかに低かった。インビボで肥満症におけるこれらの肥満細胞サイトカインが一定の役割を果たすことを証明するために、これらの細胞をオスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスへ養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ）した。高脂肪食での１３週間の後、ＷＴおよびＴｎｆ−／−ＢＭＭＣで再形成させたマウスは、再形成させていないマウスに比べて、有意に体重増加が大きかったが、Ｉｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／−ＢＭＭＣで再形成させたマウスではそうではなかった。しかし、これらのマウスは全て、ＷＴコントロールよりも脂肪が少なかった。体重の差に一致して、ＷＴおよびＴｎｆ−／− ＢＭＭＣを受容したマウスは、再形成させていないマウスあるいはＩｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／− ＢＭＭＣを受容したマウスよりも、有意に高い血清インシュリンおよびグルコースレベルを有した。ＷＴまたはＴｎｆ−／− ＢＭＭＣを受容したＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスではなくＩｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／− ＢＭＭＣを受容したＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスもまた、ＷＴコントロールと比較して耐糖能の改善を示し、このことから、肥満細胞由来のＩＬ６およびＩＦＮ−γはこれらの代謝性障害に寄与することが示唆された。この結論を支持することにおいて、本発明者らは、Ｉｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／−ＢＭＭＣ再形成ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスからの白色脂肪抽出物におけるマトリックス・フィブロネクチン、Ｇｌｕｔ４およびＩＲの量が、ＷＴマウスあるいはＷＴまたはＴｎｆ−／−ＢＭＭＣを受容したマウスよりも高いことを検出した。白色脂肪におけるこれらの分子の違いは、変化したタンパク質分解または脂肪細胞の大きさの差に起因し得る。本発明者らは、ＷＴコントロールよりもＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウス由来の白色脂肪の脂肪細胞の方が小さいことを見出したが、異なるＢＭＭＣ再形成マウス間では、白色脂肪の脂肪細胞の大きさは有意には変動しなかった。対照的に、種々の再形成されたレシピエントにおけるシステイニル・カテプシンの発現には明らかな違いが認められた。なぜＩｆｎｇ−／−ＢＭＭＣがＷＴ ＢＭＭＣと同程度３Ｔ３−Ｌ１の脂質生成およびカテプシン活性を誘導したが、体重やグルコース感受性を回復できなかったのかは不明である。肥満細胞由来のＩＦＮ−γは、パラクリン作用を介して脂肪細胞分化以外にも、血管新生あるいは近隣細胞のプロテアーゼ発現のような他のプロセスに影響を与え得る。Ｉｆｎｇ−／−ＢＭＭＣ再形成ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスのＷＡＴにおける低いカテプシン活性の観察はこの概念を支持する。したがって、インビボにおいて肥満細胞調節因子がどのように白色脂肪成長を調節し、どのさらなる肥満細胞因子が参加するかはさらなる研究に値する。
【００４２】
本研究によりマウスの肥満症および糖尿病における肥満細胞の新しい役割を確立し、一般に臨床で使用されている抗アレルギー薬を使用する、これらの一般的なヒト代謝病の可能性のある新規な療法を示唆する。
【００４３】
本明細書に引用されたすべての参考文献は完全に援用される。本発明は、いまや十分に説明されたので、広範かつ等価な範囲の条件およびパラメータなどの範囲で、本発明またはそのあらゆる実施形態の精神または範囲に影響を与えることなく、本発明を実施し得ることが当業者によって理解される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願はアメリカ合衆国において２００７年９月２８日提出の、本明細書中で、その全体を参考として援用する仮出願６０／９６０，４０８に対する優先権及び利益を主張するものである。
【０００２】
政府財政援助に係る供述
アメリカ合衆国政府は、保健社会福祉省により授与されたＮＩＨ助成ＨＬ６０９４２号の条件に基づく規定により、本発明において全額支払済み実施権及び限定された状況において特許権者に妥当な条件で他に実施権を付与させる権利を有する。
【０００３】
発明の属する分野
本発明は、肥満症の治療及び予防に有用な組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明背景
肥満症は、極めて一般的かつ有害な代謝病であり、アメリカ合衆国や世界中で公衆衛生上に極めて深刻な脅威を与える。この疾患の有病率は１９８０年代半ば頃から著しく増加し始めた。アメリカ合衆国では成人の５０％が過体重であり、３０％が肥満である。さらに深刻なことに、肥満の有病率とそれにと関連する糖尿病は小児においても急速に増加している。個人や家族そして社会に与える肥満の影響は、特に、保健資源の費用および利用の点からも大変深刻である。これらのことより、体重管理は学問的な話題になるばかりではなく、社会的関心も高まっている。
【０００５】
肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ；ＭＣ）は、細胞質の顆粒を放出することによってアレルギー反応を誘導することを促進し、その内容物はＩｇＥおよび補体因子による感作の際にアレルギー性の炎症を促進する（非特許文献１；非特許文献２）。近年、生化学的ならびに組織学的研究により、肥満細胞の、血液媒介性（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ）の白血球の動員（非特許文献２）、平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ， ＳＭＣ）／内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ， ＥＣ）の増殖（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、アポトーシス（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、Ｔリンパ球の遊走および活性化（非特許文献２）、血管新生（非特許文献９）、マトリックスリモデリング（非特許文献１０）への関与が示唆された。肥満症における肥満細胞の明確な役割は明らかになっていないのが現状である。
【０００６】
最近、肥満細胞欠損マウスの発見（Ｄｕｔｔｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：３７５４−３７５８ （１９９５）； Ｗｏｌｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ３５：８２−８８ （２００５））や肥満モデル（遺伝的あるいは食事誘導性の肥満マウスの両方）が利用できることにより、肥満症およびその合併症における肥満細胞の役割評価が可能となってきた。さらに、重要な肥満細胞メディエーターや白色脂肪組織（ＷＡＴ）ケモカイン受容体の遺伝子欠損変異マウスが利用できることにより、肥満症に不可欠な脂肪細胞におけるメディエーターや脂肪細胞のホーミングに必要とされるＷＡＴにおけるケモカインを同定することが可能になった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｒｏｇ． Ａｌｌｅｒｇｙ （１９８４）３４：２７１−３２１
【非特許文献２】Ｍｅｋｏｒｉら、Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１０４：５１７−５２３
【非特許文献３】Ｔｏｄａら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．（１９８７）６１：２８０−２８６
【非特許文献４】Ｉｎｏｕｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（１９９６）１４９：２０３７−２０５４
【非特許文献５】Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．（１９９５）７７：５４−６３
【非特許文献６】Ｌａｔｔｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００３）１９５：１３０−１３８
【非特許文献７】Ｌｅｓｋｉｎｅｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．（２００３）２３：２３８−２３４３
【非特許文献８】Ｌｅｓｋｉｎｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００３）６６：１４９３−１４９８
【非特許文献９】Ｚｕｄａｉｒｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（２００６）１６８：２８０−２９１
【非特許文献１０】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｃｕｒｒ． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ． Ｒｅｐ．（２００２）４：２２２−２２７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概要
本発明は、肥満細胞が、炎症促進性サイトカインおよび他のメディエーターの産生および放出におそらく起因して、肥満症の発症において重要な役割をすることを示唆する実験に基づく。マウスに高脂肪食（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｅｔ）を与えたところ、正常対照群マウスよりも、肥満細胞欠損マウスでの体重の増加が実質的に低かった。しかし、正常なマウスに肥満細胞安定化薬も投与することにより、体重増加が実質的に回避される。
【０００９】
その第一の局面において、この発明は、肥満細胞を安定化させる薬物の有効な量を投与することによって動物またはヒトのいずれかにおいて肥満症を治療および予防するための方法に関する。用語“有効量“とは治療目的を達するために十分な量の薬物をいう。この場合では、このことは、肥満症のための治療として与えたときには、体重減少を促進するか、または肥満症の発症を予防するために与えたときには、および体重増加を防止するのに十分な量の肥満細胞安定化薬が与えられなければならないことを意味する。この薬物を経鼻的に投与するならば、通常の投薬量は５−１００ｍｇ／日である。経口的に投与するならば、投薬量はやや多く、通常５０−１５００ｍｇ／日である。本発明の目的のためには、ヒトまたは動物の理想的体重よりも２０％超重いか、ボディマス指数（ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ， ＢＭＩ）が３０以上であるか、および／または体脂肪３０％超のものを肥満とみなした。
【００１０】
上記の方法で投与される肥満細胞安定化薬は、好ましくは２４時間の期間にわたって与えられる、２つ以上の等量の用量に分割される。好ましい薬物は、クロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、ロドキサミドである。これらは、ナトリウム塩、二ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩のような薬学的に受容可能な塩を含む、任意の薬学的に受容可能な形態で与えられ得る。他に指定されない限り、これらの薬物のうちの一つに対する言及が、その薬学的に受容可能な形態の全てを含むことが理解される。いくつかの好ましい形態は、ネドクロミルナトリウム（特に、経鼻投与５〜５０ｍｇ／日、経口投与５０〜５００ｍｇ／日）、フマル酸ケトチフェン（特に、経口投与１〜２００ｍｇ／日）、ロドキサミドトロメタミン（特に、経口投与１〜２００ｍｇ／日）である。もっとも好ましい薬物はクロモリンナトリウムあるいはクロモリン二ナトリウムで投薬量は、経口的に２００〜１，０００ｍｇ／日である。本明細書中に記載されるすべての投薬量は、人への薬物の投与に関するものである。もし動物に投与する場合、ヒトへの投薬量は、案内を提供し、体重の差について調整がなされる。例えば、動物の体重が５０ポンドなら、ヒトの用量のおよそ三分の一量が投与される。
【００１１】
上記の方法は、肥満である個体において体重減少を促進するかあるいは個体（特に、遺伝的要因または環境因子による体重増加の傾向がある個体）において体重増加を予防するために実行され得る。肥満症を治療するために、ヒトまたは動物に与える場合、薬物の投与は、個体が、元の体重の少なくとも１０％、好ましくは１５あるいは２０％減少するまで毎日基準で続けるべきである。特に好ましい実施形態において、肥満の個体は、クロモリン、特にクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムをこの期間にわたり一日あたり２００〜１，０００ｍｇの用量で投与される。治療を受けている患者は肥満症とは別の他の病気を有しても、治療時にアレルギー、心血管疾患または糖尿病のような状態を有さなくてもよい。
【００１２】
別の局面において、本発明は、肥満細胞安定化薬と、肥満症を予防および治療するために患者にこの安定化薬を投与するための説明書との両方を含む治療構成物に関する。安定化薬は単位用量形態での治療構成物の一部であり、完成した薬学的容器（ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）の中に包装されるべきである。用語“単位用量形態”とは、錠剤、カプセル、あるいは液剤の量などの単回の薬物投与の実体をいう。“完成した薬学的容器”はボトル、バイアル、ブリスターパックのような医薬品に通常使用される任意の種々のタイプのパッケージをいう。本発明の目的として、完成した薬学的容器は、薬物の経鼻投与のために設計されたパッケージ（すなわち、それを含むボトルまたはバイアル）を含み、鼻スプレーとして液剤または粉末を送達するように使用され得る。同様に、“単位用量形態”は、薬物をある濃度で溶かした液剤を含み、これは、患者へ固定量で経鼻的あるいは経口的な投与した場合、治療効果を提供する。
【００１３】
治療構成物に含有される、最も好ましい肥満細胞安定化薬は、クロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、ロドキサミドである。これらの薬物を錠剤またはカプセルの形で経口投与する時、単位用量は一般的に５〜１，０００ｍｇで、より一般的には１０〜５００ｍｇである。等価な量が、経口液剤として投与される単位用量形態中にある。もし薬物が経鼻的に投与されるならば、一般的に１回のスプレーで０．１〜１０ｍｇを患者が受容するように、液剤は、代表的に十分な濃度の薬物を含むべきである。
【００１４】
治療組成物の一部を形成する説明書は、肥満細胞安定化薬を含むパッケージ上にか、完成した薬学的容器上にかまたは別個のパッケージ挿入物として存在する。この説明書は、例えば、肥満症を治療または予防するために、患者に投与されるべき肥満細胞安定化薬の投薬量を含む。本治療が必要となる患者は、一般的に、肥満であるか、以前に肥満であったか、肥満症の家族歴を有する患者、あるいは体重増加が重篤な健康リスクを生成する患者、例えば確立した心血管疾患のある患者である。
【００１５】
本発明は、特定の化合物を、肥満細胞を安定化するその活性についてアッセイすることによってその化合物が、肥満症の治療または予防に有用か否かを判定する方法も包含する。当該分野において周知の安定化アッセイ（特に、アレルギー治療における有用性について化合物をスクリーニングするために開発されたアッセイ）のいずれも、この目的のために使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、肥満細胞安定化薬が肥満症を制御するのに使用され得ることを示す実施例セクションに以下のようにまとめられた実験に基づいている。これらの薬物は、肥満のヒトが体重を減らすことを補助するか、ヒトを肥満になることから予防するためのいずれかに使用され得る。
【００１７】
Ａ．肥満細胞安定化薬
肥満細胞を安定化する薬物は、アレルギーの治療との関連で広く研究された。そしてこれらの薬物のいくつかは商品として使用されている。もっとも好まれる肥満細胞安定化薬はクロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、ロドキサミドであり、これらは、購入され得るか、または当該分野で周知の方法を使用して合成され得る。さらに、当該分野で記載される、任意のその他の薬学的に受容可能な肥満細胞抑制剤についても本発明で使用され得る。これらとしては、アメリカ合衆国特許（６，２０７，６８４；４，６３４，６９９；６，２０７，６８４；４，８７１，８６５；４，９２３，８９２；６，２２５，３２７；７，０６０，８２７）に開示される化合物が挙げられる。化合物を調製するための方法が、化合物を精製し得る方法と使用され得る形態についての情報と共に、これらの米国特許の各々に提示される。これらの化合物は、任意の薬学的に受容可能な塩を含む、任意の薬学的に受容可能な形態で患者に与えられ得、最も好ましい薬物はクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムのいずれかである。
【００１８】
Ｂ．薬学的組成物の製造
肥満細胞を安定化させる薬物は、当該分野で標準的な方法にしたがって薬学的組成物に組み入れられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（１９９０）を参照のこと）。処方物は、当該分野で一般的に使用される任意の経路によって送達されるように設計され得、経口または経鼻送達のために設計された調製物が好ましい。例えば錠剤、カプセルのような経口組成物について、肥満細胞安定化薬は一般的に１〜５００ｍｇで存在すべきである。経鼻送達用の組成物において、安定薬は一般的に０．５〜５０ｍｇ／ｍｌとし、１〜２０ｍｇ／ｍｌにするのがより好ましい。経口的に摂取される液剤に、同様の濃度範囲が使用され得る。好ましくはないが、投与の他の経路も使用され得る。
【００１９】
肥満細胞安定化薬は、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンゾアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖などの炭水化物、アミラーゼまたはデンプン；ステアリン酸ナトリウム；タルク（滑石）；サリチル酸；パラフィン；脂肪酸エステル；ポリマーなどを含む、薬学的調製物に一般的に使われるビヒクルおよび賦形剤のいずれかと一緒に使用される。薬学的調製物を滅菌し得、必要に応じて分散剤、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用する塩、緩衝剤、着色剤、矯味矯臭剤、および／または芳香物質のような補助物質と混合し得る。
【００２０】
液剤、特に注射用の液剤は水または、エタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセライド、グリセリンの部分的エステルのような生理的に適合性のある有機溶剤を使用して調製することができる。調製物は従来の技術を使用して作製され得、これは、例えば、滅菌の等浸透圧性生理食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水とポリグリコールの混合物、リンゲル液などを含み得る。
【００２１】
Ｃ．剤形および投与経路
本発明は、経口、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）、内用（ｉｎｔｅｒｎａｌ）、直腸内、経鼻、舌下、経皮、経膣、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、そして皮下経路を含む任意の投与経路に適合性がある。使用され得る剤形は、錠剤、カプセル、粉末薬、エアロゾル、坐薬、皮膚用パッチ剤、非経口的な薬、除放性調製物、そして懸濁液、溶液および乳濁液を含む経口性の液体が挙げられる。もっとも好ましい投与経路は経口投与および経鼻投与である。望ましい場合、組成物（特に、注射用組成物）は、投与前に再構成される、フリーズドライおよび凍結乾燥したものであり得る。剤形は、唯一の活性成分として肥満細胞安定化薬を含み得るか、他の活性薬剤も含んでもよい。すべての剤形は、当該分野で標準的であり、かつＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ， Ａ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））のような参考研究に教示される方法に基づいて調製され得る。
【００２２】
Ｄ．治療方法
本明細書に書かれている治療目的は、患者の体重を減らすこと、またはさらなる体重の増加を防ぐことである。体重の増加を防ぐために使用される場合、最適な投薬量は、動物実験（本明細書に記載されるような実験）の結果に基づき、臨床研究は、当該分野で周知の方法を使用して実行される。肥満細胞安定化薬は、すでに他の疾患症状、特にアレルギーに利用されており、既存の投薬量は、肥満症の予防または治療に有効な投薬量を評価するための開始点として役立ち得る。既存の知識に基づき、経口送達方法を使用して、代表的に、患者が、肥満細胞安定化薬の５０〜１，５００ｍｇ／日の経口用量で、好ましくは少なくとも２個の等しい用量に分けて受容することが期待される。薬物が経鼻投与される場合、５〜１００ｍｇ／日の量の安定化薬を毎日投与され、再度、この量が、いくつかの等しい用量に分割されることが期待される。
【００２３】
Ｅ．糖尿病に関する意見
本発明に述べられている実験は主として肥満症に関することであるが、特定の局面は、同じ方法がＩ型糖尿病の治療または予防にも適用可能であることが示唆された。糖尿病治療における目的はインスリン依存性を減らす、もしくは無くすことである。好ましい薬物および投薬量は肥満に対するものと同じである。
【００２４】
Ｆ．治療構成物の包装
これまで述べられてきたように、肥満細胞安定化薬に含まれる薬学的組成物は、完成した薬学的容器内に配置され得、組成物の使用に関する医師への説明書とともに販売され得る。経鼻送達用の調製物において、薬学的組成物は、一般にスプレーとして組成物を送達するように設計されたデバイスに包装された液剤または粉末である。この方法で薬物を送達するための当該分野で公知のあらゆるデバイスは、この発明に適合性がある。送達の意図された経路に依存して、他の容器は、ボトル、バイアル、アンプル、ブリスターパックなどを含み得る。
【００２５】
薬学的組成物の使用に関する説明書は、薬学的組成物を含む容器上にか、またはパッケージ挿入物として含まれ得る。あるいは、説明書は、薬学的組成物を販売する箱または他のパッケージに含まれ得る。すべての場合において、説明書は、薬学的組成物が体重の減少の促進、または体重増加の予防目的で投与されることを示す。活性成分の記載には、投薬量およびどのようにして薬学的組成物を投与するのかに関する情報と共に含まれている。
【００２６】
Ｇ．アッセイ方法
本発明は、肥満細胞を安定化する能力をもとに肥満症の治療または予防において化合物の使用の可能性を評価するための方法も含んでいる。これらのアッセイは、当該分野で周知であり、またアレルギーの治療において有用な薬剤の同定と組み合わせて使用される。
【００２７】
使用され得る適切なアッセイの一例はＵＳ ６，２２５，３２７に記述されたものである。手短に説明すると、肥満細胞（約５，０００個／アッセイチューブ）を試験化合物と共に３７℃で約１５分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＥ（約１０μｇ／ｍｌ）に曝露させる。さらに１５分後、遠心分離によって反応を止める。その後、上清を回収し、放射免疫測定法などによりヒスタミン含有量について分析する。このサンプル（試験サンプル）に存在するヒスタミンの量と、試験化合物非存在下で肥満細胞と抗ヒトＩｇＥをインキュベートして得たコントロール調製物内の量との間で比較を行う。コントロールと比較しての、試験サンプル中のヒスタミン含量の減少は、試験化合物が肥満細胞を安定化するように作用することを示している。安定薬の有効性は、抑制の所定のレベル（例えばヒスタミン放出の５０％の減少）を達成するのに必要とされる濃度によって反映される。
【実施例】
【００２８】
この研究は、肥満細胞が食事に誘発された肥満および糖尿病の重大な一因となることを明らかにしている。肥満のヒトおよびマウス由来の白色脂肪組織（ＷＡＴ）は脂肪の少ない対照群のＷＡＴと比較してより多くの肥満細胞が含まれている。マウスの遺伝子的に決定された肥満細胞の欠損および薬理学的な肥満細胞の安定化は、グルコースホメオスタシスおよびエネルギー消費を改善することと協調して、体重増加を減らし、血清および／またはＷＡＴ中の炎症性サイトカイン、ケモカインおよびプロテアーゼの量を減らす。機械学的研究は、肥満細胞がＷＡＴを高め、筋肉の血管新生を高め、付随する脂質生成に関係するカテプシン活性を高めることを明らかにする。体重増加の減少および耐糖能の改善と一致して、肥満細胞の欠損および安定化は筋肉およびＷＡＴ内の、抗脂質生成性（ａｎｔｉ−ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）マトリックスフィブロネクチン、グルコース輸送体Ｇｌｕｔ４、およびインスリン受容体のレベルを上げる。サイトカイン欠損肥満細胞の利用により、これらの細胞がマウスの脂肪細胞脂質の沈着およびカテプシンの発現をインビトロで誘導し、ＩＬ６およびＩＦＮ−γの産生により食事誘導性の肥満およびグルコース代謝をインビボで促進することを確立した。臨床で使用される肥満細胞を安定化させる薬剤は、マウスの肥満と糖尿病を抑え、これらの一般的なヒトの代謝障害に対する新しい治療法を示唆している。
【００２９】
Ｉ．方法
マウス
野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）、Ｉｌ６−／−（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ１１）、およびＩｆｎｇ−／−（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ１０）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から購入した。類遺伝子性のＴｎｆ−／−（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ１０）マウスと肥満細胞欠損ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウス（Ｃ５７ＢＬ／６，Ｎ＞１０）は、記載されるようにＣ５７ＢＬ／６マウスとのもどし交配によって発生させた（Ｓｕｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：７１９−７２４（２００７）；Ｗｏｌｔｅｒｓら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ３５：８２−８８（２００５））。すべての動物実験のプロトコールはＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの常任委員会に是認され、すべてのマウスは病原体のない設備に収容された。肥満を引き起こすために、６週齢のマウス（メス及びオス）に高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， ＮＪ）を１２〜２０週間与えた。マウスの体重は週に１回モニタリングした。高脂肪食消費の各々の経過の終わりまで、耐糖能とエネルギー消費量のアッセイを以前の報告（Ｙａｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：９７０−９７７（２００７））に従って実行した。マウスの血液サンプルは血清アディポカインの測定のために採取された。皮下脂肪と内臓脂肪と褐色脂肪と骨格筋は別個にタンパク抽出およびパラフィン切片の調製のために集められた。組織タンパクの抽出物はＥＬＩＳＡ、イムノブロット分析、およびシステイニルカテプシン活性部位の標識に用いられた。イムノブロット解析では３０μｇのタンパクを、２２０ｋＤａフィブロネクチン（マウスモノクローナル抗体， １：１００， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）と２００ｋＤａインスリン受容体（マウスモノクローナル抗体， １：１００， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を検出するために８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したか、またはＧｌｕｔ４（マウスモノクローナル抗体， １：２００， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ＵＣＰ１（ラビットポリクロ―ナル抗体， １：３０００， Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、アクチン（マウスモノクローナル抗体， １：５００， Ａｂｃａｍ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＧＡＰＤＨ， ラビットポリクロ―ナル抗体， １：１０００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）を検出するために１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。カテプシン活性部位の標識については、以前に記載されたように、３０μｇのタンパクを１μｌの６００ｍＭ のジチオスレイトールと１μｌの［１２５Ｉ］−ＪＰＭをｐＨ５．５の緩衝液中でインキュベートした。３７℃で１時間反応混合物をインキュベートした後、標識されたタンパクを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルはクマシーブルーで染色し、脱色、乾燥させＸ線フィルムに曝露した。肝臓および胃腸管は組織学的分析のために回収した。
【００３０】
患者の選択
この研究では８０人の肥満症の被験体が、２００３年〜２００７年の間にＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｃａｒｅ ｏｆ Ｏｂｅｓｉｔｙ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）において先を見越して集められ登録された（平均年齢３７．５歳、範囲２０−６６歳、平均ＢＭＩ ４８．５ｋｇ／ｍ２、範囲３２−８５ ｋｇ／ｍ２；女性／男性比６９／１１）。これらの被験体はＡｓｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｕｂｒｉｑｕｅ−Ｈｏｐｉｔａｕｘ ｄｅ Ｐａｒｉｓにより支持される臨床研究プログラムにおける、食事介入あるいは胃の手術のどちらかの候補者たちである。これらの被験体からは、炎症性疾患あるいは感染症、がん、アルコール乱用、腎疾患の者は除外された。胃の手術の際、本発明者らは、肥満患者の一部の臍周囲の領域から皮下脂肪組織を採取した（Ｎ＝６， ボディマス指数＝５１．７１±１．４０ｋｇ／ｍ２， グルコース： ５．３８±０．１３ ｍｍｏｌ／ｌ， インシュリン：１３．３２±１．０６μＵ／ｍｌ）。同じような地理的領域にいる、健康で、非肥満の年齢が対応する（Ｐ＝０．２）の個体がコントロールとして集められた（Ｎ＝３２、平均年齢；４１．４歳、範囲、２０−６２歳；平均ＢＭＩ、２２．８ｋｇ／ｍ２；範囲、１９．９−２８．４ｋｇ／ｍ２；女／男比、２２／１０）。１０人の肥満のないコントロール（ＢＭＩ＝２３．６７±０．４８ｋｇ／ｍ２；グルコース：４．８２±０．４５ｍｍｏｌ／ｌ、インシュリン：７．２０±１．５６μＵ／ｍｌ）において、臍周囲の領域において皮下脂肪組織を針生検により採取した。代謝の研究に参加したボランティアは、介入の前、３か月間、体重は安定していた。絶食後の朝に採取した血液サンプルおよび血清は使用時まで−８０℃で凍結した。組織サンプルはホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会によりこの臨床研究は承認され、すべての被験体に書面でのインフォームドコンセントを行なった。
【００３１】
免疫組織学
ヒトおよびマウスのＷＡＴと筋肉組織は１０％ホルマリンで一晩固定し、パラフィン包埋し５μｍの切片を作成した。抗ヒト肥満細胞トリプターゼ抗体（マウスモノクローナル抗体， １：１００， Ｄａｋｏ， ＴＲＡＰＰＥＳ ＣＥＤＥＸ， Ｆｒａｎｃｅ）、抗マウス肥満細胞ＣＤ１１７抗体（ラットモノクローナル抗体， １：１０， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、および抗マウスＣＤ３１抗体（ラットモノクローナル抗体， １：４００， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）でＷＡＴ、筋肉および肝臓の切片上の肥満細胞と微細血管を免疫染色した。研究者は、組織の起源がわからないようにして、ヒトトリプターゼ陽性肥満細胞とＣＤ１１７陽性肥満細胞をカウントし、データは細胞数／ｍｍ２で示した。ＷＡＴと筋肉におけるＣＤ３１陽性の面積は、記載されるようにＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて同様に測定し、そしてデータはＣＤ３１陽性面積のパーセンテージで示した（Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：６０２０−６０２９ （２００６）； Ｗｉｌｄ， Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ５９：３６８−３７６ （２０００））。ヘマトキシリン‐エオジン染色は消化管の組織学的評価を補助した。
【００３２】
ＥＬＩＳＡ
凍結したマウスのＷＡＴは粉々に砕き、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で溶解した。ＷＡＴおよび血清サンプルは、製造者の説明書に従ってＩＬ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）、ＩＦＮ−γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＭＣＰ−１ （ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、アディポネクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＭＰ−９ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃａｔ Ｓ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣａｔ Ｌ （Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）についてのＥＬＩＳＡに供した。
【００３３】
ヒトの血清トリプターゼレベルの測定のため、９６−ｗｅｌｌプレートをウサギ抗ヒトトリプターゼポリクローナル抗体（１：１０００， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でプレコートした。１：２に希釈したヒト血清サンプルはスタンダードとして組換え型ヒトトリプターゼと一緒に抗体でコーティングしたプレートに加えた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、抗ヒトトリプターゼモノクローナル抗体（１：２０００， ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ， Ｒａｌｅｉｇｈ， ＮＣ）で１時間インキュベートした。検出抗体として、ＨＲＰ結合体化抗マウスＩｇ Ｇ（１：１０００， Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を用いた。
【００３４】
３Ｔ３−Ｌｌ細胞培養および分化
マウスの前駆脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）３Ｔ３−Ｌｌ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）は、前述のように６−ｗｅｌｌあるいは２４−ｗｅｌｌプレートで培養し、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン中で脂肪細胞に分化した（Ｙａｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：９７０−９７７ （２００７））。 ３Ｔ３−Ｌｌの分化における肥満細胞の役割を評価するために、生きている肥満細胞（６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに ２ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌまたは２４−ｗｅｌｌ プレートに５ｘ１０５細胞／ｗｅｌｌ）あるいはそれらの脱顆粒タンパク抽出物（生きている細胞数と同等の）を１００％コンフルエントの３Ｔ３−Ｌｌ細胞に添加した。共培養は７〜９日間維持され、生きている肥満細胞または肥満細胞のタンパク抽出物を含む培養培地は、２日毎に交換した。オイルレッドＯ染色により脂肪沈着を定量化し、データはＯＤ５１０ｎｍ読み取り値により示した。分化した３Ｔ３−Ｌｌ細胞は前述のとおり、ｐＨ５．５緩衝液に細胞を溶解することによって、カテプシン活性部位の標識にも用いた（Ｓｈｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：７２５８−７２６２（１９９２））。
【００３５】
ＢＭＭＣ培養と再形成
ＢＭＭＣは、本発明者らが以前報告したようにＷＴ、Ｉｌ６−／−、Ｔｎｆ−／−、Ｉｆｎｇ−／−マウスの骨髄から調製した（Ｓｕｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：７１９−７２４ （２００７）； Ｓｕｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１７：３３５９−３３６８ （２００７））。組換えマウスＩＬ３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）での５週間分化させた（Ｓｕｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：７１９−７２４ （２００７））後、細胞の純度および形態はそれぞれＣＤ１１７媒介ＦＡＣＳ分析およびトルイジンブルー染色によって確認した。マウスにおける肥満症での肥満細胞の役割を調べるために、６週齢のオスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの尾静脈に、それぞれのタイプのマウス由来のＢＭＭＣ（１ｘ１０７／マウス）を注射した。ＢＭＭＣ再形成の２週間後、それらのマウスに高脂肪食を消費させて肥満症と糖尿病を誘導させた。マウスの体重は毎週記録され、タンパク抽出物調製のためのＷＡＴを採集前に耐糖能アッセイを行なった。
【００３６】
統計
マウスから得られたすべてのデータは平均値±ＳＥとして示し、本発明者らのデータのサイズが小さいことと異常なデータ分布に起因する、統計的有意差はノンパラメトリック検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）を用いて判定した。ヒト血清のキマーゼおよびトリプターゼのデータは平均値±標準誤差で示した。Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定により、すべての臨床的および生物学的パラメーターは正規分布を示した。非対称の変数（キマーゼおよびトリプターゼ）は統計処理の前に、その分布を正規化するために対数変換し、検証した。グループ間の比較について、Ｓｒｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、非連続の値についてのカイ２乗検定を使用した。統計解析はＪＭＰの統計ソフトウェア （ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， ＮＣ）により行なった。Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【００３７】
ＩＩ．結果
肥満の被験体のＷＡＴには、脂肪細胞に加えてマクロファージとリンパ球が含まれていた（Ｗｅｉｓｂｅｒｇら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１２：１７９６−１８０８ （２００３）； Ｗｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５：１０２９−１０３８ （２００７））。これらの炎症性細胞はＷＡＴでサイトカインや成長因子、ケモカインおよびプロテアーゼを産生する （Ｗｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５：１０２９−１０３８ （２００７）； Ｆａｎｔｕｚｚｉ， Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１５：９１１−９１９ （２００５））。ただし、肥満症および関連する代謝性合併症である糖尿病の病因におけるこれらの細胞の役割に関しては依然として不明である。他の認識されていない細胞が決定的な一因となっているのかもしれない。ヒトの脂肪組織切片において、脂肪細胞特異的なトリプターゼモノクローナル抗体による免疫染色から、脂肪の少ない（ｌｅａｎ）ドナー由来のＷＡＴより肥満の被験体のＷＡＴでの肥満細胞の数が多いことが明らかになった。肥満のドナーの血清中の肥満細胞プロテアーゼのレベルがより高いことは、この脂肪細胞含量がより多いことに付随した。ＥＬＩＳＡを使用して、肥満のドナー（ボディマス指数≧３０ｋｇ／ｍｍ２）は、性別についての補正前（Ｐ＜０．０１）と後（Ｐ＜０．０１，多変量解析）で脂肪の少ない被験体（ボディマス指数＜３０ｋｇ／ｍｍ２）よりも有意に高い血清トリプターゼ濃度を有した。これらの結果は肥満症における肥満細胞の役割を示唆する。
【００３８】
肥満症における肥満細胞の直接的な関与を評価するために、肥満細胞欠損ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスにおける食事誘導性肥満症を研究した。ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスはｃ−Ｋｉｔプロモーター領域の反転型突然変異に起因して成熟肥満細胞を欠損している（Ｄｕｔｔｌｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３７５４−３７５８（１９９５））が、血液中の他の白血球の数と活性は正常で、生体内における肥満細胞機能の探索が可能である。１２週間高脂肪食を与えた６週齢のオスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスは野生型（ＷＴ）類遺伝子性コントロールと比較して、著しく体重の増加が少なかった。同様に、肥満細胞安定化薬であるクロモリン二ナトリウム（ＤＳＣＧ） （Ｅｉｇｅｎら、Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８０：６１２−６２１ （１９８７））の毎日の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受容するＷＴマウスもまた、体重増加の減弱を有した。ＤＳＣＧ治療は、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの体重にさらに影響を与えず、これは、肥満細胞を介して作用することが示唆された。体重の減少と一致して、オスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスまたはＤＳＣＧを受容したマウスは、未治療のＷＴコントロールと比較して、顕著に少ない総皮下および内臓脂肪を有した。メスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスあるいはＤＳＣＧ投与をしたＷＴマウスでも、体重増加ならびに皮下および内臓脂肪において類似の減少を示した。ヒトの脂肪組織のように、食事誘導性肥満マウス由来のＷＴにも多くのｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）陽性肥満細胞が存在したのに対して、固形飼料を給餌した脂肪の少ないマウス由来のＷＡＴは、はるかに少ない肥満細胞を有した。興味深いことに、これらのマウスは、体重増加に関してＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスと同様に応答したが、ＤＳＣＧ治療したマウス由来のＷＡＴは、同じ食事条件下の未治療のマウス由来のＷＡＴと同様な肥満細胞の数を有し、このことは、ＤＳＣＧ治療されたＷＴマウスが、未治療のＷＴマウスよりも少ない活性な肥満細胞を有することが示唆された。オスおよびメスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスまたはＤＳＣＧを受容したマウスの体重の減少と一致して、これらのマウスは、ＷＴコントロールよりも顕著に低いレベルの血清レプチンレベルも有した。ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスおよびＤＳＣＧ治療マウスがより脂肪が少ないだけでなく、これらのマウスが、グルコース負荷に対して、より感受性であることも示した。グルコース負荷アッセイにより、肥満細胞を有さない（ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈ）マウスあるいは安定化された肥満細胞を有するマウス（ＤＳＣＧで治療されたＷＴ）において有意に改善された耐糖能が明らかになった。肥満細胞の欠損や不活性化の有益な効果のメカニズムを理解するために、本発明者らは、エネルギー消費アッセイを実行し、褐色脂肪における結合解離した（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ）蛋白−１（ＵＣＰ１）を測定した。食物／水の摂取量、糞便／尿の生成量そして酸素消費量とＣＯ２産生量を測定することによって、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスとＤＳＣＧ治療したＷＴマウスは、未治療のＷＴマウスよりも有意に多い酸素消費とＣＯ２産生によって示される、安静時の代謝率が増加していることを見出した。ＷＴコントロールマウスと比較して、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスおよびＤＳＣＧを受容したマウスにおけるエネルギー消費の指標である褐色脂肪ＵＣＰ１発現が明らかに高かった。重要なことに、ＤＳＣＧ治療ＷＴマウスにおける体重の減少および耐糖能の改善は食物／水の摂取の減少によるものでもＤＳＣＧの何らかの毒性効果によるものでもないことではなかった。組織学的な分析では、ＤＳＣＧ治療し、高脂肪食を給餌したマウスと固形飼料を給餌したＷＴマウスの肝臓および消化管では病理学的に相違が認めなかった。高脂肪食を給餌したＷＴマウス由来の脂肪肝内にはたくさんの肥満細胞と脂肪細胞が存在したのに対して、固形飼料を給餌した野生型マウスまたはＤＳＣＧで治療し、高脂肪食を給餌したＷＴマウス由来の肝臓内には、肥満細胞も脂質を負荷した脂肪細胞も検出されなかった。同様に、組織学的解析では膵臓、胃、結腸、小腸において、固形飼料を給餌したＷＴマウスと高脂肪食を給餌し、ＤＳＣＧ治療したＷＴマウスとの間に顕著な相違は認められなかった。本発明者らの観察を広げるために、肥満や糖尿病を誘発するためＷＴマウスに高脂肪食を１２週間給餌し、これらの肥満症や糖尿病マウスを次の４つの治療グループに分けた。Ｉ、高脂肪食を給餌し続ける；ＩＩ、固形飼料に切り替える；ＩＩＩ、毎日のＤＳＣＧ腹腔内注射とともに高脂肪食を給餌し続ける；ＩＶ、固形飼料に切り替え、ＤＳＣＧで治療する。期待された通り、食事の切り替え（グループＩＩ）により体重は減少（８％）し、耐糖能も改善したが、食事の切り替えとＤＳＣＧ投与の併用（グループＩＶ）は体重と耐糖能のもっともよい改善がもたらされた。ＤＳＣＧ治療の８週間後、グループＩＩＩのマウスの体重は１２％減少したが、グループＩＶのマウスの体重は１９％減少し、４０〜４１ｇで安定した。重要なことは、グループＩＶのマウスは４つのグループの中で最も耐糖能が高いことも明らかにされ、肥満細胞の安定化により、ヒトの肥満および糖尿病の管理の可能性が示された。
【００３９】
ＩＩＩ．考察
肥満症の発症には脂質生成、血管新生、マトリックスリモデリングを含まれる。血管新生は肥満症において特定の重要性を有する。栄養成分を白色脂肪に提供する以外に、微細血管は、アディポカインの放出が続く白血球浸潤の経路を提供する。マウスでは血管新生の抑制により脂肪組織発達が抑制される（Ｒｕｐｎｉｃｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１０７３０−１０７３５ （２００２））。肥満のＷＴマウス由来白色脂肪と筋組織は、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１についての実質的な免疫染色を示した。対照的に、高脂肪食を給餌したＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウス、あるいはＤＳＣＧを受容したマウスは、固形飼料を給餌した脂肪の少ないマウスと同様なＣＤ３１陽性領域を有した。血管新生の低減により白血球の侵潤が減少し、したがって炎症メディエーターのＷＡＴ産生も低下した可能性がある（Ｓｋｏｕｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：２５０６−２５１６（２００７））。この概念と一致して、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスとＤＳＣＧを受容したマウスの血清および／または白色脂肪は、ＩＬ６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９）およびカテプシンＳ（Ｃａｔ Ｓ）のより低いレベルを有したが、いくつかのアディポカイン（アディポネクチンやＣａｔ Ｌなど）が有意な変化をしなかった。マトリックスのタンパク分解は血管新生促進ペプチド（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）の放出によって血管新生に寄与する可能性がある（Ｘｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５４：１０６９−１０７９（２００１））。本発明者らは以前、抗血管新生ペプチドの分解と血管新生促進性ラミン−５ 断片γ２の生成によって血管新生においてＣａｔ Ｓが重要な役割を果たすことを明らかにした（Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：６０２０−６０２９ （２００６））。ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスおよびＤＳＣＧ治療したマウスにおける血管新生の減少は、白色脂肪および血清中の低いＣａｔ Ｓレベルを伴っていた。活性なカテプシンを選択的に標識する［１２５Ｉ］−ＪＰＭと白色脂肪タンパク抽出物を一緒にインキュベートした結果、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの白色脂肪においてＣａｔ Ｓ、Ｃａｔ Ｋ、Ｃａｔ Ｂを含む活性なカテプシンの減弱が見出された。興味深いことに、ＤＳＣＧ治療したマウスの白色脂肪は、ＷＴコントロールに類似した、活性なＣａｔ ＳおよびＣａｔ Ｋのレベルを依然として有し、このことは、これらの組織内の肥満細胞の数の多さと一致していた。Ｃａｔ ＳのＥＬＡＩＳＡにより、本発明者らは、異なるマウス間の局所および全身レベルを測定することが可能であった。ＪＰＭ標識実験からの観察と同様に、オスおよびメスの両方のＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスは、ＷＴコントロールよりも低い血清中および白色脂肪中のＣａｔ Ｓレベルを示した。対照的に、ＤＳＣＧ治療は、血清中のＣａｔ Ｓレベルは有意に減少させたが、白色脂肪では減少しなかった。このことはこの抗アレルギー物質は効果的に肥満細胞を不活性化することが示唆した。
【００４０】
本発明者らは以前の研究で、システイニル・カテプシンは血管新生を促進するだけでなく、抗脂質生成マトリックス構成成分であるフィブロネクチン、グルコース輸送体であるＧｌｕｔ４、そしてインスリン受容体（ＩＲ）の分解による脂質生成に関与することを示唆した（Ｗａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１：６０２０−６０２９ （２００６）； Ｙａｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：９７０−９７７ （２００７）； Ｔａｌｅｂら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７：４９５０−４９５９ （２００６））。肥満細胞の欠損および不活性化は、低減したカテプシン活性に起因して、これらのタンパクに間接的に影響し得る。この仮説に一致して、３つのすべての分子はＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスの白色脂肪および筋肉内で増加した。面白いことに、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスよりも、ＤＳＣＧ治療したマウス由来の白色脂肪および筋肉内において、多くのフィブロネクチン、Ｇｌｕｔ４およびＩＲ分子が検出され、このことからＤＳＣＧは肥満細胞よりも影響を与えることが示唆された。しかしながら、そのようなＤＳＣＧの追加の効果は、ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスにおける体重の増加および耐糖能に、あるいはＷＴマウスにおける肝臓や消化管の組織学にさらには変化を与えなかった。
【００４１】
肥満細胞がマウスの肥満症および糖尿病を制御する分子機構をさらに理解するために、本発明者らは、３つの一般的な肥満細胞サイトカイン（ＩＬ６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）のうちの１つを欠くマウスから骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣ）を調製し、これらのサイトカインのうちのいずれかが存在しないことによって、インビトロでの前脂肪細胞の分化ならびにインビボでの食事誘導性の肥満症および糖尿病を誘導することにおいて肥満細胞の活性が減弱されるか否かを調べた。根底にある機構は未知のままだが、分化カクテル（インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン）がなくとも、ＷＴマウス、Ｔｎｆ−／−マウスおよびＩｆｎｇ−／−マウス由来ＢＭＭＣは、３Ｔ３ −Ｌ１の脂質生成と関連するカテプシン発現を誘導した。対照的に、ＩＬ６−／−ＢＭＭＣは、両方の変数に対する効力ははるかに低かった。インビボで肥満症におけるこれらの肥満細胞サイトカインが一定の役割を果たすことを証明するために、これらの細胞をオスのＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスへ養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ）した。高脂肪食での１３週間の後、ＷＴおよびＴｎｆ−／−ＢＭＭＣで再形成させたマウスは、再形成させていないマウスに比べて、有意に体重増加が大きかったが、Ｉｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／−ＢＭＭＣで再形成させたマウスではそうではなかった。しかし、これらのマウスは全て、ＷＴコントロールよりも脂肪が少なかった。体重の差に一致して、ＷＴおよびＴｎｆ−／− ＢＭＭＣを受容したマウスは、再形成させていないマウスあるいはＩｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／− ＢＭＭＣを受容したマウスよりも、有意に高い血清インシュリンおよびグルコースレベルを有した。ＷＴまたはＴｎｆ−／− ＢＭＭＣを受容したＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスではなくＩｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／− ＢＭＭＣを受容したＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスもまた、ＷＴコントロールと比較して耐糖能の改善を示し、このことから、肥満細胞由来のＩＬ６およびＩＦＮ−γはこれらの代謝性障害に寄与することが示唆された。この結論を支持することにおいて、本発明者らは、Ｉｌ６−／−およびＩｆｎｇ−／−ＢＭＭＣ再形成ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスからの白色脂肪抽出物におけるマトリックス・フィブロネクチン、Ｇｌｕｔ４およびＩＲの量が、ＷＴマウスあるいはＷＴまたはＴｎｆ−／−ＢＭＭＣを受容したマウスよりも高いことを検出した。白色脂肪におけるこれらの分子の違いは、変化したタンパク質分解または脂肪細胞の大きさの差に起因し得る。本発明者らは、ＷＴコントロールよりもＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウス由来の白色脂肪の脂肪細胞の方が小さいことを見出したが、異なるＢＭＭＣ再形成マウス間では、白色脂肪の脂肪細胞の大きさは有意には変動しなかった。対照的に、種々の再形成されたレシピエントにおけるシステイニル・カテプシンの発現には明らかな違いが認められた。なぜＩｆｎｇ−／−ＢＭＭＣがＷＴ ＢＭＭＣと同程度３Ｔ３−Ｌ１の脂質生成およびカテプシン活性を誘導したが、体重やグルコース感受性を回復できなかったのかは不明である。肥満細胞由来のＩＦＮ−γは、パラクリン作用を介して脂肪細胞分化以外にも、血管新生あるいは近隣細胞のプロテアーゼ発現のような他のプロセスに影響を与え得る。Ｉｆｎｇ−／−ＢＭＭＣ再形成ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスのＷＡＴにおける低いカテプシン活性の観察はこの概念を支持する。したがって、インビボにおいて肥満細胞調節因子がどのように白色脂肪成長を調節し、どのさらなる肥満細胞因子が参加するかはさらなる研究に値する。
【００４２】
本研究によりマウスの肥満症および糖尿病における肥満細胞の新しい役割を確立し、一般に臨床で使用されている抗アレルギー薬を使用する、これらの一般的なヒト代謝病の可能性のある新規な療法を示唆する。
【００４３】
本明細書に引用されたすべての参考文献は完全に援用される。本発明は、いまや十分に説明されたので、広範かつ等価な範囲の条件およびパラメータなどの範囲で、本発明またはそのあらゆる実施形態の精神または範囲に影響を与えることなく、本発明を実施し得ることが当業者によって理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物被験体における肥満症の治療または予防する方法であって、該方法は、該被験体に肥満細胞を安定化させる薬物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記肥満細胞を安定化させる薬物が、肥満のヒト被験体に、治療開始時の総体重の少なくとも１５％を減少させるのに少なくとも該被験体に十分な期間投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト及び動物被験体が、治療開始時においてアレルギー、心臓疾患及び糖尿病を有していない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物がクロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、及びロドキサミドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬物が、１日あたり用量５０〜１５００ｍｇにて経口投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬物が、１日あたり用量５〜１００ｍｇにて経鼻投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物が、１日あたり用量２００〜１０００ｍｇにて経口投与されるクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物が１日あたり用量５〜５０ｍｇにて経鼻投与されるネドクロミルナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物が１日あたり用量５０〜５００ｍｇにて経口投与されるネドクロミルナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬物が１日あたり用量１〜２００ｍｇにて経口投与されるフマル酸ケトチフェンである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬物が１日あたり用量１〜２００ｍｇにて経口投与されるロドキサミドトロメタミンである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
治療構成物であって、該治療構成物は：
ａ）完成した薬学的容器内の肥満細胞安定化薬、及び
ｂ）該肥満細胞安定化薬をヒトまたは動物患者に投与して肥満症を治療するための説明書
を含む、治療構成物。
【請求項１３】
前記薬物がクロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、及びロドキサミドからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬物がクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬物がネドクロミルナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物がフマル酸ケトチフェンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物がロドキサミドトロメタミンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記肥満細胞安定化薬が、単位用量形態で治療構成物の一部であり、単位用量当たり１〜５００ｍｇで存在する、請求項１３に記載の治療構成物。
【請求項１】
ヒトまたは動物被験体における肥満症の治療または予防する方法であって、該方法は、該被験体に肥満細胞を安定化させる薬物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記肥満細胞を安定化させる薬物が、肥満のヒト被験体に、治療開始時の総体重の少なくとも１５％を減少させるのに少なくとも該被験体に十分な期間投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト及び動物被験体が、治療開始時においてアレルギー、心臓疾患及び糖尿病を有していない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物がクロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、及びロドキサミドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬物が、１日あたり用量５０〜１５００ｍｇにて経口投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬物が、１日あたり用量５〜１００ｍｇにて経鼻投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物が、１日あたり用量２００〜１０００ｍｇにて経口投与されるクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物が１日あたり用量５〜５０ｍｇにて経鼻投与されるネドクロミルナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物が１日あたり用量５０〜５００ｍｇにて経口投与されるネドクロミルナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬物が１日あたり用量１〜２００ｍｇにて経口投与されるフマル酸ケトチフェンである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬物が１日あたり用量１〜２００ｍｇにて経口投与されるロドキサミドトロメタミンである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
治療構成物であって、該治療構成物は：
ａ）完成した薬学的容器内の肥満細胞安定化薬、及び
ｂ）該肥満細胞安定化薬をヒトまたは動物患者に投与して肥満症を治療するための説明書
を含む、治療構成物。
【請求項１３】
前記薬物がクロモリン、ネドクロミル、ケトチフェン、及びロドキサミドからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬物がクロモリンナトリウムまたはクロモリン二ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬物がネドクロミルナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物がフマル酸ケトチフェンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物がロドキサミドトロメタミンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記肥満細胞安定化薬が、単位用量形態で治療構成物の一部であり、単位用量当たり１〜５００ｍｇで存在する、請求項１３に記載の治療構成物。
【公表番号】特表２０１０−５４０５１９（Ｐ２０１０−５４０５１９Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２６９２４（Ｐ２０１０−５２６９２４）
【出願日】平成２０年９月２４日（２００８．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１０２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５２９１
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２４日（２００８．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１０２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５２９１
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【Ｆターム（参考）】
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