育毛剤、ＮＦＡＴシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤
【課題】新規な育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤、NFATシグナル阻害方法及びカルシニューリン活性阻害方法を提供する。
【解決手段】育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。
【解決手段】育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物又は植物抽出物を有効成分とする、育毛剤、NFAT（nuclear factor of activated T cells）シグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Nuclear factor of activated T cells （以下、NFATと略称する）は、T細胞活性化に重要なInterleukin-2（IL-2）の転写を活性化する因子として発見され、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA（以下、CsAと略称する）やタクロリムス（以下、FK506と略称する）の標的であるセリン／スレオニン脱リン酸化酵素カルシニューリンによりその転写活性調節が行われていることが報告されている（図２参照）。すなわちCsAやFK506はNFATシグナルを阻害することによりT細胞活性化を抑制する。CsAやFK506は移植免疫抑制剤としてのみならず、免疫系の関与することが知られている関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎の治療薬としても認可されている。このようなNFATがNFAT結合配列（図２においては“NFAT site”）に結合することによって、当該NFAT結合配列より下流の遺伝子の転写が促進される系を『NFATシグナル』と称する。
【０００３】
一方、NFATシグナルを阻害することによって育毛（発毛を含む）効果を期待できると報告されている（非特許文献１）。また、NFATシグナルを阻害するCsAの誘導体が育毛剤として使用可能であることも報告されている（特許文献１及び２）。
【０００４】
また、NFATは、育毛作用や免疫系への作用に留まらず、心筋・骨格筋の分化調節による筋組織形成、脳における神経ネットワークの形成、骨芽細胞分化調節による骨代謝など、多くの臓器で発現し、重要な役割を果たす"多機能転写因子"として捉えられるようになってきた。
【０００５】
NFATシグナルが生体において及ぼす役割としては上述したとおりであるが、NFATシグナルを阻害することで、免疫抑制作用（非特許文献２）、乾癬治療（非特許文献３）、アトピー性皮膚炎治療（非特許文献４）、（心）筋肥大抑制（非特許文献５）、抗リウマチ薬としての可能性（非特許文献６）及び破骨細胞分化抑制作用（非特許文献７）などが期待できると報告されている。また、前述のようにNFATは免疫性サイトカインIL-2を産生する経路を介していることから、NFATシグナル阻害剤は自己免疫疾患を含む免疫性サイトカインが関与していると考えられる疾患の治療または予防に有用である。かかる対象疾患としては、例えば各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症などが挙げられる。したがって、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬、骨代謝疾患治療剤、育毛剤、発毛促進剤及び、上記に列記したような新規な用途が期待される。
【０００６】
【特許文献１】WO 01/035914（特表2003-514000号公報）
【特許文献２】WO 2004/041221（特表2006-508103号公報）
【特許文献３】特許3527584号
【特許文献４】特開2005-89392号公報
【特許文献５】特開平1-38013号公報
【特許文献６】特開昭63-145216号公報
【非特許文献１】Gafter-Gvili A, Sredni B, Gal R, Gafter U, and Kalechman Y、"Cyclosporin A-induced hair growth in mice is associated with inhibition of calcineurin-dependent activation of NFAT in follicular keratinocytes" Am J Physiol Cell Physiol, 284: C1593-C603, 2003
【非特許文献２】Lee M and Park J、"Regulation of NFAT activation: a potential therapeutic target for immunosuppression" Mol Cells, 22: 1-7, 2006
【非特許文献３】Feldman S、"Advances in psoriasis treatment" Dermatol Online J, 6: 4, 2000
【非特許文献４】Hultsch T、"Immunomodulation and safety of topical calcineurin inhibitors for the treatment of atopic dermatitis" Dermatology, 211: 2, 2005
【非特許文献５】Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, Markham B, Richardson J, Robbins J, Grant SR, and Olson EN、"A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy" Cell, 93: 215-228, 1998
【非特許文献６】Urushibara M, Takayanagi H, Koga T, Kim S, Isobe M, Morishita Y, Nakagawa T, Loeffler M, Kodama T, Kurosawa H, and Taniguchi T、" Antirheumatic drug, leflunomide, inhibits osteoclastgenesis by interfering with RANKL-stimulated induction of NFATc1" Arthritis and Rheumatism, 50: 794-804, 2004
【非特許文献７】Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A, Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, and Taniguchi T、" Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in termial differentiation of osteoclasts" Developmental Cell, 3: 889-901, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、新規な育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤、NFATシグナル阻害方法及びカルシニューリン活性阻害方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、NFATシグナル伝達に対する作用を評価する系を新規に構築し、当該系を用いて種々の植物についてNFATシグナル阻害作用を網羅的に解析した結果、NFATシグナル阻害作用を有するとともに、育毛剤としての奏功、及びカルシニューリン阻害作用を有する植物を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。
【００１０】
特に、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤としては、レモングラスの地上部を上記植物とすることが好ましい。ここで、上記抽出物としては水性アルコール抽出物を挙げることができる。
【００１１】
上述したNFATシグナル阻害剤を対象の細胞又は組織に接触させることによって、当該細胞又は組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。また、上述したカルシニューリン阻害剤を対象の細胞又は組織に接触させることによって、当該細胞又は組織におけるカルシニューリン活性を阻害することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、有効性が実証された新規な育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤を提供することができる。また、本発明にかかるNFATシグナル阻害剤によれば、NFATによって正に制御される転写を抑制することができる。さらに、本発明にかかるカルシニューリン阻害剤によれば、NAFTを活性化するカルシニューリン活性を抑制することができる。また、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、有効成分として天然物質に由来するものを含有することから安全に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。ここで、レモングラスとは、学名をCymbopogon citratusと称し、イネ科に分類される植物である。なおレモングラスは、NFATシグナル阻害作用、カルシニューリン阻害作用及び育毛作用を有することが後述の実施例で新規に明らかとなった植物である。NFATシグナル阻害作用は、NFATシグナル阻害率を指標として評価することができる。レモングラス抽出物においては、NFATシグナル阻害率が94.5％である。ここで、NFATシグナル阻害率とは、要するに、抽出物を作用させないときのNFATによる転写活性に対して、抽出物を作用させたときの当該転写活性の低下率を意味している。
【００１４】
NFATシグナル阻害とは、NFATに対して直接的又は間接的に作用してNFATによる転写促進活性を低減させることを意味する。NFATシグナル阻害作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のNFAT結合配列と当該NFAT結合配列の下流にレポーター遺伝子と有するプラスミドを導入した宿主を用いるレポーターアッセイを挙げることができる（図１参照）。なお、NFATの活性はカルシウムイオンに依存するため、レポーターアッセイはカルシウムイオンを宿主に流入させる条件下で行う。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、従来、生化学実験の分野で使用されている如何なるレポーター遺伝子も使用することができる。例えばレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子（GUS遺伝子）及びグリーンフルオレセントプロテイン遺伝子（GFP遺伝子）等を挙げることができる。
【００１５】
NFAT結合配列とは、NFATが結合する配列からなるオリゴヌクレオチド、例えば、GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT（pNFAT-Luc、Stratagene、配列番号１）といった塩基配列を例示することができる。なお、上述したプラスミドにおいては、このようなNFAT結合配列を１セットとして複数セットを連結して導入してもよい。複数のNFAT結合配列を連結して使用することによって、NFATによる転写促進活性をより高感度に測定することができる。なお、上述したNFATシグナル阻害率は、上述したレポーターアッセイから算出した値である。
【００１６】
また、カルシニューリン阻害作用は、カルシニューリンによる脱リン酸化活性の阻害率を指標として評価することができる。レモングラス抽出物においては、カルシニューリン活性阻害率が40.4％である。ここで、カルシニューリン活性阻害率とは、要するに、抽出物を作用させないときのカルシニューリンによるリン酸化ペプチド（基質）の脱リン酸化活性に対して、抽出物を作用させたときの当該脱リン酸化活性の低下率を意味している。
【００１７】
カルシニューリン（Ca2+/calmodulin-regulated Ser/Thr phosphatase）は、Ca2+が介在するシグナル伝達系に関わっており、NFATを含む特定のリン酸化蛋白質の特定のリン酸基を遊離させる。カルシニューリン阻害作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のカルシニューリンの基質となるリン酸化蛋白質又はペプチドを基質として用い、基質からのリン酸基の遊離を検出する方法を挙げることができる。カルシニューリンの基質となるリン酸化ペプチドとしては、例えば、RIIリン酸化ペプチド（DLDVPIPGRFDRV[pS]VAAE）を挙げることができる。したがって、カルシニューリン阻害活性は、カルシニューリン及び基質の存在下に抽出物を作用させ、このとき遊離したリン酸を測定することにより測定できる。遊離したリン酸は、特に限定されないが、例えばマラカイトグリーン試薬を用いて定量することができる。
【００１８】
また、育毛作用は、毛伸長速度を指標として評価することができる。レモングラス抽出物においては、毛伸長促進率が114.1％である。ここで、毛伸長促進率とは、要するに、抽出物を作用させないときの毛伸長率に対して、抽出物を作用させたときの当該毛伸長率の促進率を意味している。
【００１９】
育毛作用とは、毛包に作用し、毛の伸長の促進、太さの増大、毛周期の休止期から成長期への移行促進、成長期から退行期への移行阻害を行なうことにより毛の量を増加させることを意味する。従って、育毛には、発毛、養毛及び脱毛予防の概念が包含されるものとする。育毛作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば単離毛包を器官培養し、培養期間中の毛の伸長量を測定する方法が挙げられる。
【００２０】
特に、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物における全草、葉、茎、花、果実、種子、根茎又は根等をそのまま含むものとすることができる。あるいは本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、当該植物の全草、葉、茎、花、果実、種子、根茎又は根等を粉砕して用いたものを含むことが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラスの地上部を使用することが好ましい。ここで、地上部とは、植物の全体から根茎及び根を除いた部分を意味する。すなわち、地上部には、葉、茎、花、果実及び種子が含まれる。本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、植物抽出物は、植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。本発明において、植物の抽出物とは、上記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味する。
【００２２】
植物の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤又は非極性溶剤のいずれをも使用することができる。抽出溶剤としては、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び二酸化炭素等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の2種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。
【００２３】
本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、抽出溶剤としては、水性アルコールが好ましく、特に水性エタノール、中でも８０〜９９．５％エタノールを使用することが特に好ましい。本発明に係るNFATシグナル阻害剤としては、上記植物の抽出物を、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、上記植物等の抽出物をクロマトグラフィー液々分配等の分離技術に供し、当該抽出物から不活性な夾雑物を除去したものを用いることもできる。
【００２４】
上述した有効成分は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。具体的には、上述した有効成分を、対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、NFATシグナルによって生ずる種々の遺伝子発現を転写レベルで抑制することができる。
【００２５】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、育毛剤又は発毛促進剤として使用できる。また、NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、又は予防剤として使用することができる。NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患としては、免疫系疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、心筋を含む筋肥大症、リウマチ、骨代謝疾患、各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症等を挙げることができる。したがって、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬及び骨代謝疾患治療剤等として使用することができる。
【００２６】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬用途として使用する場合、剤形として、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬用組成物として使用する場合、上記NFATシグナル阻害剤の他、剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。
【００２７】
一方、上述した有効成分は、カルシニューリンの活性を低減させることから、細胞や組織におけるカルシニューリンが関与するシグナル伝達を阻害することができる。具体的には、上述した有効成分を、対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるカルシニューリンが関与するシグナル伝達を阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、カルシニューリンが関与するシグナル伝達によって生ずる種々のイベントを抑制することができる。
【００２８】
本発明に係るカルシニューリン活性阻害剤は、カルシニューリンが関与するシグナル伝達を抑制することから、カルシニューリンが関与するシグナル伝達の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、又は予防剤として使用することができる。カルシニューリンが関与するシグナル伝達の亢進に起因する症状や疾患としては、上記で例示したNFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患の他に、各種のアレルギー性疾患、統合失調症などの精神疾患等を挙げることができる。
【００２９】
本発明に係るカルシニューリン活性阻害剤を医薬用途として使用する場合、剤形として、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。本発明に係るカルシニューリン活性阻害剤を医薬用組成物として使用する場合、剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明に係る育毛剤は、例えば皮膚用の医薬部外品として使用するものであり、使用形態に適した剤形として提供される。具体的に剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤、トニック剤、スプレー剤及び乳剤等が挙げられる。当該医薬部外品には、植物の抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。また、育毛剤においては、上述した有効成分の他に、通常用いられる養毛薬効剤、例えば、毛包賦活剤、血行促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、保湿剤、抗脂漏剤、局所刺激剤、抗男性ホルモン剤、カリウムチャンネルオープナー、抗酸化剤等を必要に応じて適宜配合し、育毛効果の向上を図ることができる。毛包賦活剤としては、フラバノノール類、N -アセチル- L -メチオニン、パントテン酸及びその誘導体、アデノシン及びその誘導体、アスパラギン酸カリウム、ペンタデカン酸グリセリド、6 -ベンジアルアミノプリン、モノニトログアヤコールナトリウム等が挙げられる。血行促進剤としては、二酸化炭素、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、センブリエキス、ニンジンエキス、塩化カルプロニウム、ビタミンE及びその誘導体等が挙げられる。抗菌剤としては、イソプロピルメチルフェノール、塩化ベンザルコニウム、オクトピロックス、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等が挙げられる。抗炎症剤としては、甘草エキス、グリチルリチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸及びその誘導体、アズレン、グアイアズレン、オウゴンエキス、カミツレエキス、クマザサエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、桃葉エキス、セイヨウノコギリソウエキス等が挙げられる。保湿剤としては、オトギリソウエキス、オーツ麦エキス、グリセリン、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、延命草エキス、オオムギエキス、ブドウエキス、プロピレングリコール、桔梗エキス、ヨクイニンエキス等が挙げられる。抗脂漏剤としては、イオウ、レシチン、カシュウエキス、チオキソロン等が挙げられる局所刺激剤としては、カンファー、トウガラシチンキ等が挙げられる。抗男性ホルモン剤としては、サイプロテロンアセテート、1 1α -ハイドロキシプロゲステロン、フルタマイド、3 -デオキシアデノシン、酢酸クロルマジノン、エチニルエストラジオール、スピロノラクトン、エピテステロン、フィナステライド、アロエ、サンショウ、チョウジエキス、クアチャララーテエキス、オタネニンジン等が挙げられる。カリウムチャンネルオープナーとしては、ミノキシジル、クロマカリム、ジアゾキシド及びその誘導体、ピナシジル等が挙げられる。抗酸化剤としては、紅茶エキス、茶エキス、エイジツエキス、黄杞エキス、ビタミンＣ及びその誘導体、エリソルビン酸、没食子酸プロピル、ジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。
【００３１】
上述した有効成分を組成物として使用する場合、植物の抽出物の配合量は、乾燥物として計算して、通常、組成物全組成の0.00001〜5重量％、特に0.0001〜0.1重量％とすることが好ましい。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を用いる場合、植物の抽出物の投与量は、通常の成人で固形分残量にして0.01mg〜1g/1日とすることが望ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕 植物抽出物の製造
本実施例では、レモングラスの抽出物を製造した。レモングラスの地上部(ベトナム産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過し、ろ液を濃縮して抽出物０.７ｇを得た。蒸発残分１．０ｗ/ｖ％であった。
【００３４】
〔実施例２〕 NFATシグナル阻害効果
本例では、NFATシグナル阻害効果を検証するための評価システムを構築し、当該評価システムを用いて実施例１で製造した植物抽出物についてのNFATシグナル阻害効果を検証した。
【００３５】
（１）評価システムのための材料及び方法
細胞培養
上記評価システムには、ヒト腎（HEK293）細胞をATCC（American Type Culture Collection）より購入し、使用した。HEK293細胞は、DMEM（High glucose、10% heat-inactivated FBS）中37℃、5% CO2条件下で培養した。
【００３６】
プラスミド、トランスフェクション
上記評価システムには、NFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼが導入されたプラスミドpNFAT-Luc（Stratagene）をHEK293細胞にトランスフェクションしたものを使用した。詳細には、NFAT転写活性の評価用に4連のNFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入されたpNFAT-luc（STRATAGENE）をHEK293細胞にトランスフェクションした。また、トランスフェクション効率によるばらつきをなくすことを目的として、ホタルルシフェラーゼに由来するシグナルを補正するためにCMV promoterの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたpRL-CMV（Promega）を同時にトランスフェクションした。
【００３７】
トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000 reagent（Invitrogen）を用いて使用説明書に従って行った。トランスフェクションの8時間後に培地を交換し、一晩インキュベートした。その後、実施例１で製造した植物抽出物を添加（0.5 vol%）し、その1時間後に1μM Ionomycinを添加した。8時間後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ionomycinは、カルシウムイオンに特異的なイオノフォアであり、細胞内にカルシウムイオンを流入させる薬剤として知られている。Ionomycin添加により、カルシウムイオン依存性脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化し、それに伴ってNFATの転写活性が上昇することから、本システムはNFATシグナル活性化阻害剤を探索するのに適していると考えられる。
【００３８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega）を用い、使用説明書に従って行った。すなわち、培地を除去後、PBSにより2倍希釈したDual-Glo luciferase reagentを加え、攪拌した後、20分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のDual-Glo Stop&Glo reagentを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性測定はMiniLumat LB 9506（EG&G BERTHOLD）を用いて行い、ルシフェラーゼによる発光量を定量的に検出した。双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は2秒とした。
【００３９】
NFATシグナル阻害率の算出
全てのNFAT転写活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、NFATシグナル阻害率を以下の式にて算出した。
NFATシグナル阻害率（%）＝100−（試験サンプル及びIonomycin添加群−無刺激群）／（Ionomycinのみ添加群−無刺激群）×100
上記計算により、Ionomycin刺激によるNFATシグナル活性化をテストサンプルが何%阻害したかについて算出することができる。
【００４０】
結果
実施例１で製造したレモングラス抽出物によるNFATシグナル阻害率は94.5％であった。この結果からレモングラス抽出物がNFATシグナルを阻害することが明らかとなった。すなわち、レモングラス抽出物は、NFATにより正に制御される転写を抑制することができる。したがって、実施例１で製造したレモングラス抽出物は優れたNFATシグナル阻害剤であり、例えば免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、育毛剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等の候補物質として同定されたこととなる。
【００４１】
〔実施例３〕
本例では、対象物質の育毛効果を検証できるin vitroの実験系を用いて実施例１で製造したレモングラス抽出物の育毛効果を検証した。
【００４２】
ブタ毛包器官培養による毛伸長評価
食肉用豚種の臀部皮膚を適当な大きさに切り分け、余分な脂肪組織を除いた。豚皮は無菌下でヒビテン液（5%ヒビテン液（住友製薬）を水で5〜20倍に希釈）に5分〜10分浸することにより消毒を行った後にD-PBSで数回洗浄した。その後、実体顕微鏡下にて洗浄した豚皮から毛包を単離してWilliam's Medium E培地（Invitrogen）培地中に集めた。
【００４３】
単離した毛包は、1ウェルあたり400μlのWilliam's Medium E培地（1% Penicillin-Streptomycin 溶液（Invitrogen）添加）が入った24ウェル培養プレートに1本ずつ入れた。毛包は37℃、5% CO2条件下にて8日間培養し、その間、1日または2日おきに培地の交換を行った。
【００４４】
上記の培地に実施例１で製造したレモングラス抽出物を添加（固形分濃度0.0001重量%）し、溶媒コントロールであるエタノール添加群とともに8日間培養した。培養を開始日（0日目）および8日目の実体顕微鏡画像をCCDカメラ（pixera model.No.PVC 100C）で撮影し、その画像から毛球部基底部から毛幹先端までの長さを測定した。その後、溶媒コントロール群の培養前後における毛伸長量を100%として実施例１で製造したレモングラス抽出物添加群の毛伸長率を算出した。
【００４５】
その結果、レモングラス抽出物添加群においては、溶媒コントロール群と比較して114.1％の毛伸長率が認められた。この結果から、レモングラス抽出物は育毛効果を有することが明らかとなった。すなわち、レモングラス抽出物は、優れた育毛剤として使用できることが明らかとなった。
【００４６】
〔実施例５〕
本例では、対象物質のカルシニューリン阻害効果を検証できる市販のキットを実施例１で製造したレモングラス抽出物のカルシニューリン阻害効果を検証した。
【００４７】
カルシニューリン活性測定
カルシニューリン酵素活性は、リコンビナントヒトカルシニューリンを酵素とし、カルシニューリンの基質ペプチドとしてRIIリン酸化ペプチド（DLDVPIPGRFDRV[pS]VAAE）を基質として用いたCalcineurin assay kit（BIOMOL）を用い、キットに添付されたプロトコール通りに測定した。なお、実施例１で製造したレモングラス抽出物は1 vol%にて使用した。実施例１で製造したレモングラス抽出物のカルシニューリン活性阻害効果は、溶媒コントロールのカルシニューリン活性を100%とした時の阻害率として算出した。
【００４８】
その結果、レモングラス抽出物添加群においては、溶媒コントロール群と比較して40.4％であった。この結果から、レモングラス抽出物はカルシニューリンの活性を阻害することが明らかとなった。すなわち、レモングラス抽出物は、カルシニューリンが関与するシグナル伝達系を抑制することができる。したがって、実施例１で製造したレモングラス抽出物は、優れたカルシニューリン活性阻害剤として使用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】NFATシグナル阻害作用を測定する方法の一例として挙げたレポーターアッセイの概略構成図である。
【図２】NFATとNFAT結合部位との結合及びその下流の遺伝子転写促進を示す、NFATシグナルの概略構成図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物又は植物抽出物を有効成分とする、育毛剤、NFAT（nuclear factor of activated T cells）シグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Nuclear factor of activated T cells （以下、NFATと略称する）は、T細胞活性化に重要なInterleukin-2（IL-2）の転写を活性化する因子として発見され、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA（以下、CsAと略称する）やタクロリムス（以下、FK506と略称する）の標的であるセリン／スレオニン脱リン酸化酵素カルシニューリンによりその転写活性調節が行われていることが報告されている（図２参照）。すなわちCsAやFK506はNFATシグナルを阻害することによりT細胞活性化を抑制する。CsAやFK506は移植免疫抑制剤としてのみならず、免疫系の関与することが知られている関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎の治療薬としても認可されている。このようなNFATがNFAT結合配列（図２においては“NFAT site”）に結合することによって、当該NFAT結合配列より下流の遺伝子の転写が促進される系を『NFATシグナル』と称する。
【０００３】
一方、NFATシグナルを阻害することによって育毛（発毛を含む）効果を期待できると報告されている（非特許文献１）。また、NFATシグナルを阻害するCsAの誘導体が育毛剤として使用可能であることも報告されている（特許文献１及び２）。
【０００４】
また、NFATは、育毛作用や免疫系への作用に留まらず、心筋・骨格筋の分化調節による筋組織形成、脳における神経ネットワークの形成、骨芽細胞分化調節による骨代謝など、多くの臓器で発現し、重要な役割を果たす"多機能転写因子"として捉えられるようになってきた。
【０００５】
NFATシグナルが生体において及ぼす役割としては上述したとおりであるが、NFATシグナルを阻害することで、免疫抑制作用（非特許文献２）、乾癬治療（非特許文献３）、アトピー性皮膚炎治療（非特許文献４）、（心）筋肥大抑制（非特許文献５）、抗リウマチ薬としての可能性（非特許文献６）及び破骨細胞分化抑制作用（非特許文献７）などが期待できると報告されている。また、前述のようにNFATは免疫性サイトカインIL-2を産生する経路を介していることから、NFATシグナル阻害剤は自己免疫疾患を含む免疫性サイトカインが関与していると考えられる疾患の治療または予防に有用である。かかる対象疾患としては、例えば各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症などが挙げられる。したがって、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬、骨代謝疾患治療剤、育毛剤、発毛促進剤及び、上記に列記したような新規な用途が期待される。
【０００６】
【特許文献１】WO 01/035914（特表2003-514000号公報）
【特許文献２】WO 2004/041221（特表2006-508103号公報）
【特許文献３】特許3527584号
【特許文献４】特開2005-89392号公報
【特許文献５】特開平1-38013号公報
【特許文献６】特開昭63-145216号公報
【非特許文献１】Gafter-Gvili A, Sredni B, Gal R, Gafter U, and Kalechman Y、"Cyclosporin A-induced hair growth in mice is associated with inhibition of calcineurin-dependent activation of NFAT in follicular keratinocytes" Am J Physiol Cell Physiol, 284: C1593-C603, 2003
【非特許文献２】Lee M and Park J、"Regulation of NFAT activation: a potential therapeutic target for immunosuppression" Mol Cells, 22: 1-7, 2006
【非特許文献３】Feldman S、"Advances in psoriasis treatment" Dermatol Online J, 6: 4, 2000
【非特許文献４】Hultsch T、"Immunomodulation and safety of topical calcineurin inhibitors for the treatment of atopic dermatitis" Dermatology, 211: 2, 2005
【非特許文献５】Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, Markham B, Richardson J, Robbins J, Grant SR, and Olson EN、"A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy" Cell, 93: 215-228, 1998
【非特許文献６】Urushibara M, Takayanagi H, Koga T, Kim S, Isobe M, Morishita Y, Nakagawa T, Loeffler M, Kodama T, Kurosawa H, and Taniguchi T、" Antirheumatic drug, leflunomide, inhibits osteoclastgenesis by interfering with RANKL-stimulated induction of NFATc1" Arthritis and Rheumatism, 50: 794-804, 2004
【非特許文献７】Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A, Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, and Taniguchi T、" Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in termial differentiation of osteoclasts" Developmental Cell, 3: 889-901, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、新規な育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤、NFATシグナル阻害方法及びカルシニューリン活性阻害方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、NFATシグナル伝達に対する作用を評価する系を新規に構築し、当該系を用いて種々の植物についてNFATシグナル阻害作用を網羅的に解析した結果、NFATシグナル阻害作用を有するとともに、育毛剤としての奏功、及びカルシニューリン阻害作用を有する植物を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。
【００１０】
特に、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤としては、レモングラスの地上部を上記植物とすることが好ましい。ここで、上記抽出物としては水性アルコール抽出物を挙げることができる。
【００１１】
上述したNFATシグナル阻害剤を対象の細胞又は組織に接触させることによって、当該細胞又は組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。また、上述したカルシニューリン阻害剤を対象の細胞又は組織に接触させることによって、当該細胞又は組織におけるカルシニューリン活性を阻害することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、有効性が実証された新規な育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤を提供することができる。また、本発明にかかるNFATシグナル阻害剤によれば、NFATによって正に制御される転写を抑制することができる。さらに、本発明にかかるカルシニューリン阻害剤によれば、NAFTを活性化するカルシニューリン活性を抑制することができる。また、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、有効成分として天然物質に由来するものを含有することから安全に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。ここで、レモングラスとは、学名をCymbopogon citratusと称し、イネ科に分類される植物である。なおレモングラスは、NFATシグナル阻害作用、カルシニューリン阻害作用及び育毛作用を有することが後述の実施例で新規に明らかとなった植物である。NFATシグナル阻害作用は、NFATシグナル阻害率を指標として評価することができる。レモングラス抽出物においては、NFATシグナル阻害率が94.5％である。ここで、NFATシグナル阻害率とは、要するに、抽出物を作用させないときのNFATによる転写活性に対して、抽出物を作用させたときの当該転写活性の低下率を意味している。
【００１４】
NFATシグナル阻害とは、NFATに対して直接的又は間接的に作用してNFATによる転写促進活性を低減させることを意味する。NFATシグナル阻害作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のNFAT結合配列と当該NFAT結合配列の下流にレポーター遺伝子と有するプラスミドを導入した宿主を用いるレポーターアッセイを挙げることができる（図１参照）。なお、NFATの活性はカルシウムイオンに依存するため、レポーターアッセイはカルシウムイオンを宿主に流入させる条件下で行う。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、従来、生化学実験の分野で使用されている如何なるレポーター遺伝子も使用することができる。例えばレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子（GUS遺伝子）及びグリーンフルオレセントプロテイン遺伝子（GFP遺伝子）等を挙げることができる。
【００１５】
NFAT結合配列とは、NFATが結合する配列からなるオリゴヌクレオチド、例えば、GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT（pNFAT-Luc、Stratagene、配列番号１）といった塩基配列を例示することができる。なお、上述したプラスミドにおいては、このようなNFAT結合配列を１セットとして複数セットを連結して導入してもよい。複数のNFAT結合配列を連結して使用することによって、NFATによる転写促進活性をより高感度に測定することができる。なお、上述したNFATシグナル阻害率は、上述したレポーターアッセイから算出した値である。
【００１６】
また、カルシニューリン阻害作用は、カルシニューリンによる脱リン酸化活性の阻害率を指標として評価することができる。レモングラス抽出物においては、カルシニューリン活性阻害率が40.4％である。ここで、カルシニューリン活性阻害率とは、要するに、抽出物を作用させないときのカルシニューリンによるリン酸化ペプチド（基質）の脱リン酸化活性に対して、抽出物を作用させたときの当該脱リン酸化活性の低下率を意味している。
【００１７】
カルシニューリン（Ca2+/calmodulin-regulated Ser/Thr phosphatase）は、Ca2+が介在するシグナル伝達系に関わっており、NFATを含む特定のリン酸化蛋白質の特定のリン酸基を遊離させる。カルシニューリン阻害作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のカルシニューリンの基質となるリン酸化蛋白質又はペプチドを基質として用い、基質からのリン酸基の遊離を検出する方法を挙げることができる。カルシニューリンの基質となるリン酸化ペプチドとしては、例えば、RIIリン酸化ペプチド（DLDVPIPGRFDRV[pS]VAAE）を挙げることができる。したがって、カルシニューリン阻害活性は、カルシニューリン及び基質の存在下に抽出物を作用させ、このとき遊離したリン酸を測定することにより測定できる。遊離したリン酸は、特に限定されないが、例えばマラカイトグリーン試薬を用いて定量することができる。
【００１８】
また、育毛作用は、毛伸長速度を指標として評価することができる。レモングラス抽出物においては、毛伸長促進率が114.1％である。ここで、毛伸長促進率とは、要するに、抽出物を作用させないときの毛伸長率に対して、抽出物を作用させたときの当該毛伸長率の促進率を意味している。
【００１９】
育毛作用とは、毛包に作用し、毛の伸長の促進、太さの増大、毛周期の休止期から成長期への移行促進、成長期から退行期への移行阻害を行なうことにより毛の量を増加させることを意味する。従って、育毛には、発毛、養毛及び脱毛予防の概念が包含されるものとする。育毛作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば単離毛包を器官培養し、培養期間中の毛の伸長量を測定する方法が挙げられる。
【００２０】
特に、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラス植物における全草、葉、茎、花、果実、種子、根茎又は根等をそのまま含むものとすることができる。あるいは本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、当該植物の全草、葉、茎、花、果実、種子、根茎又は根等を粉砕して用いたものを含むことが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤は、レモングラスの地上部を使用することが好ましい。ここで、地上部とは、植物の全体から根茎及び根を除いた部分を意味する。すなわち、地上部には、葉、茎、花、果実及び種子が含まれる。本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、植物抽出物は、植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。本発明において、植物の抽出物とは、上記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味する。
【００２２】
植物の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤又は非極性溶剤のいずれをも使用することができる。抽出溶剤としては、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び二酸化炭素等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の2種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。
【００２３】
本発明に係る育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びカルシニューリン阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、抽出溶剤としては、水性アルコールが好ましく、特に水性エタノール、中でも８０〜９９．５％エタノールを使用することが特に好ましい。本発明に係るNFATシグナル阻害剤としては、上記植物の抽出物を、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、上記植物等の抽出物をクロマトグラフィー液々分配等の分離技術に供し、当該抽出物から不活性な夾雑物を除去したものを用いることもできる。
【００２４】
上述した有効成分は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。具体的には、上述した有効成分を、対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、NFATシグナルによって生ずる種々の遺伝子発現を転写レベルで抑制することができる。
【００２５】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、育毛剤又は発毛促進剤として使用できる。また、NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、又は予防剤として使用することができる。NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患としては、免疫系疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、心筋を含む筋肥大症、リウマチ、骨代謝疾患、各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症等を挙げることができる。したがって、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬及び骨代謝疾患治療剤等として使用することができる。
【００２６】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬用途として使用する場合、剤形として、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬用組成物として使用する場合、上記NFATシグナル阻害剤の他、剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。
【００２７】
一方、上述した有効成分は、カルシニューリンの活性を低減させることから、細胞や組織におけるカルシニューリンが関与するシグナル伝達を阻害することができる。具体的には、上述した有効成分を、対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるカルシニューリンが関与するシグナル伝達を阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、カルシニューリンが関与するシグナル伝達によって生ずる種々のイベントを抑制することができる。
【００２８】
本発明に係るカルシニューリン活性阻害剤は、カルシニューリンが関与するシグナル伝達を抑制することから、カルシニューリンが関与するシグナル伝達の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、又は予防剤として使用することができる。カルシニューリンが関与するシグナル伝達の亢進に起因する症状や疾患としては、上記で例示したNFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患の他に、各種のアレルギー性疾患、統合失調症などの精神疾患等を挙げることができる。
【００２９】
本発明に係るカルシニューリン活性阻害剤を医薬用途として使用する場合、剤形として、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。本発明に係るカルシニューリン活性阻害剤を医薬用組成物として使用する場合、剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明に係る育毛剤は、例えば皮膚用の医薬部外品として使用するものであり、使用形態に適した剤形として提供される。具体的に剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤、トニック剤、スプレー剤及び乳剤等が挙げられる。当該医薬部外品には、植物の抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。また、育毛剤においては、上述した有効成分の他に、通常用いられる養毛薬効剤、例えば、毛包賦活剤、血行促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、保湿剤、抗脂漏剤、局所刺激剤、抗男性ホルモン剤、カリウムチャンネルオープナー、抗酸化剤等を必要に応じて適宜配合し、育毛効果の向上を図ることができる。毛包賦活剤としては、フラバノノール類、N -アセチル- L -メチオニン、パントテン酸及びその誘導体、アデノシン及びその誘導体、アスパラギン酸カリウム、ペンタデカン酸グリセリド、6 -ベンジアルアミノプリン、モノニトログアヤコールナトリウム等が挙げられる。血行促進剤としては、二酸化炭素、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、センブリエキス、ニンジンエキス、塩化カルプロニウム、ビタミンE及びその誘導体等が挙げられる。抗菌剤としては、イソプロピルメチルフェノール、塩化ベンザルコニウム、オクトピロックス、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等が挙げられる。抗炎症剤としては、甘草エキス、グリチルリチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸及びその誘導体、アズレン、グアイアズレン、オウゴンエキス、カミツレエキス、クマザサエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、桃葉エキス、セイヨウノコギリソウエキス等が挙げられる。保湿剤としては、オトギリソウエキス、オーツ麦エキス、グリセリン、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、延命草エキス、オオムギエキス、ブドウエキス、プロピレングリコール、桔梗エキス、ヨクイニンエキス等が挙げられる。抗脂漏剤としては、イオウ、レシチン、カシュウエキス、チオキソロン等が挙げられる局所刺激剤としては、カンファー、トウガラシチンキ等が挙げられる。抗男性ホルモン剤としては、サイプロテロンアセテート、1 1α -ハイドロキシプロゲステロン、フルタマイド、3 -デオキシアデノシン、酢酸クロルマジノン、エチニルエストラジオール、スピロノラクトン、エピテステロン、フィナステライド、アロエ、サンショウ、チョウジエキス、クアチャララーテエキス、オタネニンジン等が挙げられる。カリウムチャンネルオープナーとしては、ミノキシジル、クロマカリム、ジアゾキシド及びその誘導体、ピナシジル等が挙げられる。抗酸化剤としては、紅茶エキス、茶エキス、エイジツエキス、黄杞エキス、ビタミンＣ及びその誘導体、エリソルビン酸、没食子酸プロピル、ジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。
【００３１】
上述した有効成分を組成物として使用する場合、植物の抽出物の配合量は、乾燥物として計算して、通常、組成物全組成の0.00001〜5重量％、特に0.0001〜0.1重量％とすることが好ましい。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を用いる場合、植物の抽出物の投与量は、通常の成人で固形分残量にして0.01mg〜1g/1日とすることが望ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕 植物抽出物の製造
本実施例では、レモングラスの抽出物を製造した。レモングラスの地上部(ベトナム産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過し、ろ液を濃縮して抽出物０.７ｇを得た。蒸発残分１．０ｗ/ｖ％であった。
【００３４】
〔実施例２〕 NFATシグナル阻害効果
本例では、NFATシグナル阻害効果を検証するための評価システムを構築し、当該評価システムを用いて実施例１で製造した植物抽出物についてのNFATシグナル阻害効果を検証した。
【００３５】
（１）評価システムのための材料及び方法
細胞培養
上記評価システムには、ヒト腎（HEK293）細胞をATCC（American Type Culture Collection）より購入し、使用した。HEK293細胞は、DMEM（High glucose、10% heat-inactivated FBS）中37℃、5% CO2条件下で培養した。
【００３６】
プラスミド、トランスフェクション
上記評価システムには、NFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼが導入されたプラスミドpNFAT-Luc（Stratagene）をHEK293細胞にトランスフェクションしたものを使用した。詳細には、NFAT転写活性の評価用に4連のNFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入されたpNFAT-luc（STRATAGENE）をHEK293細胞にトランスフェクションした。また、トランスフェクション効率によるばらつきをなくすことを目的として、ホタルルシフェラーゼに由来するシグナルを補正するためにCMV promoterの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたpRL-CMV（Promega）を同時にトランスフェクションした。
【００３７】
トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000 reagent（Invitrogen）を用いて使用説明書に従って行った。トランスフェクションの8時間後に培地を交換し、一晩インキュベートした。その後、実施例１で製造した植物抽出物を添加（0.5 vol%）し、その1時間後に1μM Ionomycinを添加した。8時間後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ionomycinは、カルシウムイオンに特異的なイオノフォアであり、細胞内にカルシウムイオンを流入させる薬剤として知られている。Ionomycin添加により、カルシウムイオン依存性脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化し、それに伴ってNFATの転写活性が上昇することから、本システムはNFATシグナル活性化阻害剤を探索するのに適していると考えられる。
【００３８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega）を用い、使用説明書に従って行った。すなわち、培地を除去後、PBSにより2倍希釈したDual-Glo luciferase reagentを加え、攪拌した後、20分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のDual-Glo Stop&Glo reagentを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性測定はMiniLumat LB 9506（EG&G BERTHOLD）を用いて行い、ルシフェラーゼによる発光量を定量的に検出した。双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は2秒とした。
【００３９】
NFATシグナル阻害率の算出
全てのNFAT転写活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、NFATシグナル阻害率を以下の式にて算出した。
NFATシグナル阻害率（%）＝100−（試験サンプル及びIonomycin添加群−無刺激群）／（Ionomycinのみ添加群−無刺激群）×100
上記計算により、Ionomycin刺激によるNFATシグナル活性化をテストサンプルが何%阻害したかについて算出することができる。
【００４０】
結果
実施例１で製造したレモングラス抽出物によるNFATシグナル阻害率は94.5％であった。この結果からレモングラス抽出物がNFATシグナルを阻害することが明らかとなった。すなわち、レモングラス抽出物は、NFATにより正に制御される転写を抑制することができる。したがって、実施例１で製造したレモングラス抽出物は優れたNFATシグナル阻害剤であり、例えば免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、育毛剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等の候補物質として同定されたこととなる。
【００４１】
〔実施例３〕
本例では、対象物質の育毛効果を検証できるin vitroの実験系を用いて実施例１で製造したレモングラス抽出物の育毛効果を検証した。
【００４２】
ブタ毛包器官培養による毛伸長評価
食肉用豚種の臀部皮膚を適当な大きさに切り分け、余分な脂肪組織を除いた。豚皮は無菌下でヒビテン液（5%ヒビテン液（住友製薬）を水で5〜20倍に希釈）に5分〜10分浸することにより消毒を行った後にD-PBSで数回洗浄した。その後、実体顕微鏡下にて洗浄した豚皮から毛包を単離してWilliam's Medium E培地（Invitrogen）培地中に集めた。
【００４３】
単離した毛包は、1ウェルあたり400μlのWilliam's Medium E培地（1% Penicillin-Streptomycin 溶液（Invitrogen）添加）が入った24ウェル培養プレートに1本ずつ入れた。毛包は37℃、5% CO2条件下にて8日間培養し、その間、1日または2日おきに培地の交換を行った。
【００４４】
上記の培地に実施例１で製造したレモングラス抽出物を添加（固形分濃度0.0001重量%）し、溶媒コントロールであるエタノール添加群とともに8日間培養した。培養を開始日（0日目）および8日目の実体顕微鏡画像をCCDカメラ（pixera model.No.PVC 100C）で撮影し、その画像から毛球部基底部から毛幹先端までの長さを測定した。その後、溶媒コントロール群の培養前後における毛伸長量を100%として実施例１で製造したレモングラス抽出物添加群の毛伸長率を算出した。
【００４５】
その結果、レモングラス抽出物添加群においては、溶媒コントロール群と比較して114.1％の毛伸長率が認められた。この結果から、レモングラス抽出物は育毛効果を有することが明らかとなった。すなわち、レモングラス抽出物は、優れた育毛剤として使用できることが明らかとなった。
【００４６】
〔実施例５〕
本例では、対象物質のカルシニューリン阻害効果を検証できる市販のキットを実施例１で製造したレモングラス抽出物のカルシニューリン阻害効果を検証した。
【００４７】
カルシニューリン活性測定
カルシニューリン酵素活性は、リコンビナントヒトカルシニューリンを酵素とし、カルシニューリンの基質ペプチドとしてRIIリン酸化ペプチド（DLDVPIPGRFDRV[pS]VAAE）を基質として用いたCalcineurin assay kit（BIOMOL）を用い、キットに添付されたプロトコール通りに測定した。なお、実施例１で製造したレモングラス抽出物は1 vol%にて使用した。実施例１で製造したレモングラス抽出物のカルシニューリン活性阻害効果は、溶媒コントロールのカルシニューリン活性を100%とした時の阻害率として算出した。
【００４８】
その結果、レモングラス抽出物添加群においては、溶媒コントロール群と比較して40.4％であった。この結果から、レモングラス抽出物はカルシニューリンの活性を阻害することが明らかとなった。すなわち、レモングラス抽出物は、カルシニューリンが関与するシグナル伝達系を抑制することができる。したがって、実施例１で製造したレモングラス抽出物は、優れたカルシニューリン活性阻害剤として使用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】NFATシグナル阻害作用を測定する方法の一例として挙げたレポーターアッセイの概略構成図である。
【図２】NFATとNFAT結合部位との結合及びその下流の遺伝子転写促進を示す、NFATシグナルの概略構成図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする育毛剤。
【請求項２】
上記植物は、レモングラスの地上部であることを特徴とする請求項１記載の育毛剤。
【請求項３】
上記抽出物は水性アルコール抽出物であることを特徴とする請求項１又は２記載の育毛剤。
【請求項４】
レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするNFATシグナル阻害剤。
【請求項５】
上記植物は、レモングラスの地上部であることを特徴とする請求項４記載のNFATシグナル阻害剤。
【請求項６】
上記抽出物は水性アルコール抽出物であることを特徴とする請求項４又は５記載のNFATシグナル阻害剤。
【請求項７】
レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするカルシニューリン阻害剤。
【請求項８】
上記植物は、レモングラスの地上部であることを特徴とする請求項７記載のカルシニューリン阻害剤。
【請求項９】
上記抽出物は水性アルコール抽出物であることを特徴とする請求項７又は８記載のカルシニューリン阻害剤。
【請求項１０】
対象の細胞又は組織に対して、請求項４乃至６いずれか一項記載のNFATシグナル阻害剤を接触させる、NFAT活性阻害方法。
【請求項１１】
対象の細胞又は組織に対して、請求項７乃至９いずれか一項記載のカルシニューリン阻害剤を接触させる、カルシニューリン活性阻害方法。
【請求項１】
レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする育毛剤。
【請求項２】
上記植物は、レモングラスの地上部であることを特徴とする請求項１記載の育毛剤。
【請求項３】
上記抽出物は水性アルコール抽出物であることを特徴とする請求項１又は２記載の育毛剤。
【請求項４】
レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするNFATシグナル阻害剤。
【請求項５】
上記植物は、レモングラスの地上部であることを特徴とする請求項４記載のNFATシグナル阻害剤。
【請求項６】
上記抽出物は水性アルコール抽出物であることを特徴とする請求項４又は５記載のNFATシグナル阻害剤。
【請求項７】
レモングラス植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするカルシニューリン阻害剤。
【請求項８】
上記植物は、レモングラスの地上部であることを特徴とする請求項７記載のカルシニューリン阻害剤。
【請求項９】
上記抽出物は水性アルコール抽出物であることを特徴とする請求項７又は８記載のカルシニューリン阻害剤。
【請求項１０】
対象の細胞又は組織に対して、請求項４乃至６いずれか一項記載のNFATシグナル阻害剤を接触させる、NFAT活性阻害方法。
【請求項１１】
対象の細胞又は組織に対して、請求項７乃至９いずれか一項記載のカルシニューリン阻害剤を接触させる、カルシニューリン活性阻害方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１２２７（Ｐ２０１０−１２２７Ａ）
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５９２４２（Ｐ２００８−１５９２４２）
【出願日】平成２０年６月１８日（２００８．６．１８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０７２８４６４０）ナショナル・インスティテュート・オブ・メディシナル・マテリアルズ (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
【住所又は居所原語表記】３Ｂ Ｑｕａｎｇ Ｔｒｕｎｇ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｈａｎｏｉ， Ｖｉｅｔｎａｍ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１８日（２００８．６．１８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０７２８４６４０）ナショナル・インスティテュート・オブ・メディシナル・マテリアルズ (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
【住所又は居所原語表記】３Ｂ Ｑｕａｎｇ Ｔｒｕｎｇ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｈａｎｏｉ， Ｖｉｅｔｎａｍ
【Ｆターム（参考）】
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