肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット
【課題】肺および眼サルコイドーシスを検出するための検出マーカー及び検出キットを提供する。
【解決手段】抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗ｒｅｔ ＳＤＲ２抗体、抗ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体を含む肺サルコイドーシスの検出マーカーとする。
【解決手段】抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗ｒｅｔ ＳＤＲ２抗体、抗ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体を含む肺サルコイドーシスの検出マーカーとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺サルコイドーシスは全身性の非乾酪性肉芽腫病変形成を主張とする原因不明の疾患であるが、疾患特異的な検出マーカーとしては血清中のangiotensin
converting enzyme:以下ＡＣＥやリゾチームが報告されているが、血清中のＡＣＥ陽性率は５０％前後とされ、血清中のリゾチームは疾患特異性が乏しいことがいわれている。
【０００３】
サルコイドーシスは全身性の疾患であり、眼病変（眼サルコイドーシス）から発見されることも多い。眼サルコイドーシスには特徴的な眼病変が揃い、眼サルコイドーシスが強く疑われるが、全身検査陽性所見が乏しく、診断基準を満たさずに疑診にとどまる症例も稀ではない。
【０００４】
肺サルコイドーシスの診断には気管支肺胞洗浄検査（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ:以下ＢＡＬ）が行われている。肺サルコイドーシスにおいては、ＢＡＬ液中に多くの炎症細胞、とりわけＣＤ４陽性リンパ球の増加が確認されたことの報告があり、肺胞腔や間質に浸潤したＣＤ４ 陽性リンパ球が病態に重要な役割を果たしているのではないかとの示唆がある（例えば下記非特許文献１参照）。
【０００５】
ところで、ＳＥＲＥＸ（Ｓｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）法は、約１万個のｃＤＮＡの中で数個程度しか存在しない自己抗原発現ｃＤＮＡに対しても検出が可能であり、微量の自己抗原の検出に適した方法である。このＳＥＲＥＸ法により肺癌をはじめとする様々な腫瘍関連抗原が同定されている。同定された抗原には、転写因子、細胞の分化抗原、細胞構成蛋白などに対する自己抗体に加え、新規遺伝子も含まれている。即ちＳＥＲＥＸ法は自己抗原検索においては強力で有用な手法であり、これを用いた報告として、サルコイドーシス関連自己抗体の検索に関して一文献のみ報告がある（下記非特許文献２参照）。
【０００６】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＢＡＬ液中のＴ細胞Ｖα／β鎖遺伝子再構成の検索では、抗原特異的なＴ細胞増生が肺サルコイドーシスに認められ、ＨＬＡ クラスＩＩ 抗原の抗原収容溝に収まった抗原ペプチドとＨＬＡ 抗原の複合体と適切に結合する構造を持ったＴ細胞抗原受容体を有するＴ細胞レパトリーが抗原特異的免疫反応によって増殖したことを意味し、疾患関連抗原の存在が示唆されている（例えば下記非特許文献３参照）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｒｎｏｔ Ｚ ら、”ＴＣＲ Ｖβ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｓａｒｃｏｉｄ ｌｕｎｇ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ， ＢＡＬ， ａｎｄ ｂｌｏｏｄ”、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １９９７年、１５６巻、１５９３−１６００頁
【非特許文献２】Ｅｂｅら、“Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ”、Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ ２０００年、１７巻、２５６−２６５頁
【非特許文献３】Ｄｏｈｉ Ｍら、” Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｌｕｎｇｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ”、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４年、１５２巻、１９８３−１９８８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
確かに、上記非特許文献１においてＣＤ４陽性Ｔ細胞が何らか病態に関与していることを示唆しているが、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が増加する機序や網膜炎が合併する機序は大部分が不明であり、しかも、末梢血ＡＣＥの増加のみによっては肺サルコイドーシスの診断を行うことが困難な症例が多数存在する。眼科医が発見する眼病変自体の大きさは数十ミクロンから数ミリ単位以下であるため、病巣が眼内に限局する場合には、眼内病巣からＡＣＥ などが流血中に流出しても、全身単位での活性はきわめて低くなり、通常の検査では検出限度以下となる。眼サルコイドーシスに特異的な疾患マーカーは現在存在しないため、ぶどう膜炎を初発症状としても、眼サルコイドーシスの診断がきわめて困難である。
【０００９】
また、ＳＥＲＥＸ法については、殆どが腫瘍関連抗原の同定のために用いられているものであって、腫瘍関連抗原以外のものに適用した例は極めて稀である。これを用いたサルコイドーシスの報告としては上記非特許文献２の一文献のみ、報告があるが、この報告は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ 菌ＤＮＡを組み込んだファージを用いたＳＥＲＥＸ解析であり、肺胞上皮を含め人の細胞が発現するｃＤＮＡを組み込んだファージを用いたＳＥＲＥＸ解析は行われていない。
【００１０】
更に、上記非特許文献３に記載の報告では、抗原特異的なＴ細胞増生が認められているが、ＰＣＲ法のみでは症例間でＨＬＡ抗原が異なること、認識している抗原は抗原提示細胞によって断片化されていること、からサルコイドーシス関連自己抗体が認識する抗原の決定は極めて困難である。
【００１１】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスを検出するための検出マーカー及び検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＢＡＬ液中や肺間質中に浸潤するＴ細胞は、その免疫グロブリン可変部領域にＶα／Ｖβ鎖を有しており、肺胞局所に疾患特異的な抗原が存在し、肺において疾患特異的な抗原／抗体反応が生じているのであれば、Ｂ細胞による抗体産生にはＣＤ４陽性Ｔ細胞の援助が必要不可欠である。まず、我々も肺サルコイドーシス症例のＢＡＬ液中のＣＤ４陽性Ｔ細胞のＶβ鎖を解析したところ、全例に特定のＣＤ４陽性Ｔ細胞のｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌな増生が認められた。この所見はいままでの肺サルコイドーシスのＢＡＬ液における報告を裏付け、肺胞局所において特異的な抗原に対してＣＤ４陽性Ｔ細胞が増生し、活発な抗原抗体反応の存在を示唆する結果であった。眼サルコイドーシスに伴って縦隔リンパ節腫脹や肺内陰影が合併することも稀ではなく、肺胞と眼において共通の自己抗原に対する免疫反応が生じている可能性も考えられる。もしそのような自己抗原が存在するのであれば、眼周囲のリンパ節腫脹はほとんど認められないことと肺サルコイドーシスが合併する場合には縦隔リンパ節腫脹を併発していることが多いことから、サルコイドーシスに伴う抗原刺激は肺内に強く存在していることが示唆される。
【００１３】
そこで、更に本発明者らが上記について検討を行ったところ、肺胞内腔にはその構成細胞として、 ＩＩ型肺胞上皮と肺胞マクロファージがあげられる。肺胞腔内でサルコイドーシス特異的な抗原抗体反応が生じているのであれば、構成細胞として大部分を占める肺胞上皮やマクロファージが有する蛋白が抗原として働いているのではないかと推察した。肺胞上皮が発現する蛋白を非常に鋭敏な方法（ＳＥＲＥＸ法）で解析を行うことで、肺サルコイドーシスの患者血清中に存在する自己抗体の検出が可能であることを見いだした。以下具体的に示すが、我々の発見した９種類の自己抗体は比較的高頻度で肺サルコイドーシス症例の血清中に存在し、これらのうちのひとつであるｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） とｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）は肺胞上皮と網膜に共通に存在する蛋白であることから、肺胞腔内で肺胞上皮やマクロファージから流出した自己抗原蛋白が抗原となって抗体産生が生じ、この蛋白は網膜にも発現している蛋白のため、これらの異常な自己抗体が眼サルコイドーシスの眼病変の病因の一因であり、これらの自己抗体の測定は眼サルコイドーシスの診断に有用であることを発見した。これらを組み合わせることによって、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの正確な血清学的診断が可能となる。
【００１４】
即ち、本発明に係る肺サルコイドーシスの検出マーカーは、抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）抗体、抗ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体の少なくとも一つを含有してなることを特徴とする。また、眼サルコイドーシスの検出マーカーは、抗ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）抗体、抗ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｒｅｔ ＳＤＲ２）抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６，ＣＤ６７７０２５，ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体の少なくとも一つを含有してなることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る肺サルコイドーシスの検出キットは、ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなることを特徴とする。また、眼サルコイドーシスの検出キットは、ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなることを特徴とする。なおここで基材としては上記抗原タンパクを吸着させて抗体反応を確認できる限りにおいて限定はされないが、メンブレンやＥＬＩＳＡ法にも散られるプレートなどが該当する。またこの場合において、抗原タンパクは標識が付されていること、標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていること、も望ましい。
【００１６】
また、本発明に係る方法としては、ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、
１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの標識された抗原タンパクを吸着したプレートに血液又はＢＡＬ液を塗布することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
以上、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスを検出するための検出マーカー及び検出キットを提供することができるようになる。特に、今回我々の発見した１５種類の自己抗体は既存には報告されておらず、サルコイドーシス以外の症例ではほとんどの自己抗体は検出されず、診断検査としての利用価値が高い。
【００１８】
本発明を用いることによって、治療前後のＢＡＬ液または経時的に採取した血清による連続的な疾患特異的自己抗体の解析が可能となる。とりわけ、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白を用いた自己抗体の測定は、病勢フォローやステロイドなどの治療効果判定に最適な検査法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。
【００２０】
本発明の実施の形態としては、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー、検出キットの態様を採用できる。肺サルコイドーシス検出マーカーの態様として、抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体の少なくとも一つを含んでなることとする。眼サルコイドーシスの検出マーカーの態様として抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体の少なくとも一つを含んでなることとする。即ち、肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いのある患者から血液又はＢＡＬ液を抽出し、この抗体が存在しているか否かを調べ、存在している場合は肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いがあると判定することができる。これにより精度よく調べることができるようになる。
【００２１】
また本発明の一実施形態として、ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出キットとすることもできる。これにより、肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いのある患者から血液又はＢＡＬ液を抽出し、この抗原タンパクが抗体と反応しているか否かを調べることにより、肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いがあるか否かを判定することができる。具体的にはこれら抗原タンパクを基材に吸着させ、ＢＡＬ液又は血清などを塗布することにより抗原タンパクと反応させ、更に発光又は発色部位を有する二次抗体と反応させることで、発光等が行われるか、又はその量にもとづいて抗体が存在しているか否かを判定し、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスであるか否かを判定することが可能となる。この場合において、抗原タンパクには抗原タンパクを作成する観点から標識が付されていることが望ましい。特に本実施形態によると、あらかじめ作成した自己抗原蛋白が吸着したメンブレンやプレートを利用することによって、迅速な検査が可能であり、１時間程度で結果を得ることができる。そのため、病状が刻々と変化する重症例のサルコイドーシス症例においても迅速な対応が可能である。肺サルコイドーシスが悪化した場合には、できるだけ早い治療が必要であるが、他の合併症（感染症、悪性腫瘍）の除外に時間がかかり、診断に苦慮する場合が多い。本発明は肺サルコイドーシス自体が悪化したのか他の合併症が重なったのかを鑑別するうえで非常に重要な情報を提供可能であり、迅速な対応に結びつくことができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本実施形態に係る発明の効果を実証すべく検討を行った。以下説明する。
【００２３】
Ｔ細胞Ｖβ鎖は２５種類のサブファミリーから構成されているため、まずそれぞれのサブファミリーに特異的なプライマーを作成した。作成したプライマーを図１に示す。なお図中、Ｖβ１、Ｖβ２…、Ｖβ２５はｆｏｗａｒｄとして用い、Ｃβはｒｅｖｅｒｓｅとして共通に用いた。
【００２４】
そして肺サルコイドーシス２０症例に対しＢＡＬを行い、そのＢＡＬを抽出した。そしてこのＢＡＬ液からＤｙｎａ ｂｅａｄｓを用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞の分離、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＴ細胞のＶβ鎖可変部領域の増幅を行い、更にこのＰＣＲ産物を２％アガロースで泳動しエチジウムブロマイドによる染色では、ごく一部のＶβ鎖サブグループのみが発現していた（図２参照）。
【００２５】
次に、ＳＥＲＥＸ法の概要を図３に示す。ＩＩ型肺胞上皮癌培養株からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを作成後、得られたｃＤＮＡ ライブラリーを蛋白発現ベクター（ＺＡＰ発現ベクター）に組み込み作成したファージを大腸菌に感染させ、ｃ−ＤＮＡのコードする蛋白を大腸菌に発現させた。そしてｃｏｌｏｎｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって、肺サルコイドーシスの血清およびＢＡＬ液中の免疫グロブリンと結合するプラークを選別し、陽性ファージをファジェミドベクターに変換後、シークエンスによって特異的蛋白の塩基配列を決定した。ホモロジー検索によって蛋白の構造を決定し、肺サルコイドーシス／眼サルコイドーシスの血清中およびＢＡＬ液中に存在する自己抗体の認識自己抗原の同定を行った。以上の結果、症例とその症例に対して検出された自己抗体が認識している抗原を図４、５に示す。
【００２６】
図４、図５によると、１５種類の抗体のうち、抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体は、ＳＥＲＥＸ法によって解析した肺サルコイドーシス１０例中５例（５０％）の血清および ＢＡＬ液中に存在した。抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体と抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体は肺サルコイドーシス１０例中４例（４０％）の血清およびＢＡＬ液中に存在していた。抗 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体は肺サルコイドーシス１０例中３例（３０％）の血清およびＢＡＬ液中に存在していた。抗 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体は１０例中１例（１０％）に存在していた。これにより、自己抗体を検出することによって、肺サルコイドーシス、眼サルコイドースの有無を判定することができることを確かめた。
【００２７】
また今回ＳＥＲＥＸ法で解析した１０例中４例 (図６)はＡＣＥの上昇認めるが、今回発見した抗体のうち陽性率の高い４つの自己抗体（抗poly
a binding protein 1抗体、抗1-phosphatidylinositol-4-phosphate
5 kinase isoform c抗体、抗 retinal short-chain
dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体、抗ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体）を組あわせることによって、１０例中９例（９０％）は、新規自己抗体が陽性であり、ＡＣＥが陰性であった６例はすべて自己抗体が陽性であった。肺胞と網膜の両方に発現がみられる共通抗原のうち、今回検出頻度が高かった抗 retinal short-chain dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体は、眼サルコイドーシス症例７例中３例（４３％）に陽性であった。また抗 retinal short-chain dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体が陽性で現在眼サルコイドーシスの症状を有していない残りの１例においても、ガリウムシンチ検査では眼に集積が認められ、眼にもサルコイドーシス病変が潜在している可能性が示唆された。肺胞と眼の共通抗原に対する自己抗体とくに抗 retinal short-chain dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体は眼サルコイドーシスの診断マーカーとして有用である。
【００２８】
また、今回検出した１５種類の自己抗原蛋白のうち発現頻度が高い３種類の蛋白（ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２））について、自己抗体認識抗原遺伝子全体に対するプライマーを作成し、ＲＴ−ＰＣＲ法で解析し、それぞれの遺伝子の発現を確認した。図７にここで設計したプライマーを示す。３種類のうち２種類（ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ １、ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２））の自己抗原蛋白は、ＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）および単球系培養株（ＴＨＰ−１）の双方に対して発現を確認することができた。残りの１種類の自己抗原蛋白（１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ）は、ＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）のみに発現が認められた。肺サルコイドーシスは肺胞腔内に病変の主座が存在すると考えられており、肺胞腔側の構成細胞の大部分を占めるＩＩ型肺胞上皮および肺胞マクロファージの両者から自己抗体認識抗原蛋白が産生されている可能性を確認した。この結果を図８に示す。そして更に、発見した自己抗体認識抗原蛋白をＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白として人工的に大腸菌に作成させた。以下に行った蛋白作成方法の概要を示す。
【００２９】
上記のＲＴ−ＰＣＲ法によってで得られたＰＣＲ産物をＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白発現ベクター（Ｐｑｅ−３０ＵＡ）にライゲーションし、コンペテントＭ１５細胞にトランスフォーメーションを行った。得られたＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白発現コロニー蛋白をニトロセルロースフィルターに転写後、ＩＰＴＧを含むプレートにフィルターを移し６×ｈｉｓタグ標識蛋白質を発現させた。得られたフィルターをＰｅｎｔａ−ＨｉｓＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを用いて免疫染色を行い自己抗体認識抗原蛋白発現コロニーを選別した。得られたコロニーをピックアップし培養液中で増殖させ、６×ｈｉｓタグ標識蛋白質の抽出を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によって蛋白発現を確認した後、大腸菌大量培養液から、自己抗体認識抗原蛋白（Ｈｉｓ−ｔａｇ標識蛋白）の精製を行った。
【００３０】
これにより得られた１５種類の肺サルコイドシス特異的Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白をＴｈｅ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いて、６ｍｍ Ｄｏｔとしてナイロンメンブレン上に吸着させた。これにより、得られた蛋白吸着メンブレンを症例の血清およびＢＡＬ液でｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させ化学発光にて自己抗体発現の有無を１１種類同時に検出した。Ｄｏｔ ｂｌｏｔ法およびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による検索では、肺サルコイドーシスの血清および気管支肺胞洗浄液を用いた場合にのみＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白に対して陽性バンドを検出することができ、またバンドの発現強度は、病勢が悪化した場合に強く検出される傾向が認められた。
【００３１】
また、上記により得られた１５種類の肺サルコイドーシス特異的Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白をＮｉ−ＮＴ（図４）ＳＥＲＥＸ法によって検出した肺サルコイドーシス特異的自己抗体の認識する自己抗原蛋白とその発現頻度を調べた。Ａ標識ＥＬＩＳＡプレートに添加し４度で一晩インキュベートし固定した。これによりＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白をＮｉ−ＮＴＡに結合させることができ、これにより得られたＥＬＩＳＡプレートを用いて症例血清およびＢＡＬ液を用いて自己抗原蛋白と結合する自己抗体濃度を検出した。Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白を吸着させたプレートによる血清およびＢＡＬ液によるＥＬＩＳＡ解析では、病勢が悪化した場合に抗体価が高く検出される傾向が認められた。本発明のＥＬＩＳＡ解析は、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの病勢フォローに有用な指標であった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ｔ細胞Ｖβ鎖サブファミリーに対するＰＣＲ法に用いたプライマーを示す図。
【図２】肺サルコイドーシスにおけるＴ細胞Ｖβ鎖サブファミリーの解析の例。
【図３】ＳＥＲＥＸ法の概略図を示す図である。
【図４】ＳＥＲＥＸ法によって検出した肺サルコイドーシス特異的自己抗体の認識する自己抗原蛋白とその発現頻度を示す図。
【図５】ＳＥＲＥＸ法によって検出した肺サルコイドーシス特異的自己抗体の認識する肺胞と眼共通自己抗原蛋白とその発現頻度を示す図。
【図６】発現頻度の高い３種類の自己抗体の発現状況を示す図。
【図７】肺サルコイドーシス自己抗体認識抗原遺伝子を増幅するために用いたＰＣＲプライマーを示す図。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲ法によって３種類の自己抗原蛋白のＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）および単球系培養株（ＴＨＰ−１）における発現を解析した図。 １：ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、 ２：１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ３：ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、Ａ：Ａ５４９ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｔ：ＴＨＰ−１ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
【技術分野】
【０００１】
本発明は肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺サルコイドーシスは全身性の非乾酪性肉芽腫病変形成を主張とする原因不明の疾患であるが、疾患特異的な検出マーカーとしては血清中のangiotensin
converting enzyme:以下ＡＣＥやリゾチームが報告されているが、血清中のＡＣＥ陽性率は５０％前後とされ、血清中のリゾチームは疾患特異性が乏しいことがいわれている。
【０００３】
サルコイドーシスは全身性の疾患であり、眼病変（眼サルコイドーシス）から発見されることも多い。眼サルコイドーシスには特徴的な眼病変が揃い、眼サルコイドーシスが強く疑われるが、全身検査陽性所見が乏しく、診断基準を満たさずに疑診にとどまる症例も稀ではない。
【０００４】
肺サルコイドーシスの診断には気管支肺胞洗浄検査（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ:以下ＢＡＬ）が行われている。肺サルコイドーシスにおいては、ＢＡＬ液中に多くの炎症細胞、とりわけＣＤ４陽性リンパ球の増加が確認されたことの報告があり、肺胞腔や間質に浸潤したＣＤ４ 陽性リンパ球が病態に重要な役割を果たしているのではないかとの示唆がある（例えば下記非特許文献１参照）。
【０００５】
ところで、ＳＥＲＥＸ（Ｓｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）法は、約１万個のｃＤＮＡの中で数個程度しか存在しない自己抗原発現ｃＤＮＡに対しても検出が可能であり、微量の自己抗原の検出に適した方法である。このＳＥＲＥＸ法により肺癌をはじめとする様々な腫瘍関連抗原が同定されている。同定された抗原には、転写因子、細胞の分化抗原、細胞構成蛋白などに対する自己抗体に加え、新規遺伝子も含まれている。即ちＳＥＲＥＸ法は自己抗原検索においては強力で有用な手法であり、これを用いた報告として、サルコイドーシス関連自己抗体の検索に関して一文献のみ報告がある（下記非特許文献２参照）。
【０００６】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＢＡＬ液中のＴ細胞Ｖα／β鎖遺伝子再構成の検索では、抗原特異的なＴ細胞増生が肺サルコイドーシスに認められ、ＨＬＡ クラスＩＩ 抗原の抗原収容溝に収まった抗原ペプチドとＨＬＡ 抗原の複合体と適切に結合する構造を持ったＴ細胞抗原受容体を有するＴ細胞レパトリーが抗原特異的免疫反応によって増殖したことを意味し、疾患関連抗原の存在が示唆されている（例えば下記非特許文献３参照）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｒｎｏｔ Ｚ ら、”ＴＣＲ Ｖβ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｓａｒｃｏｉｄ ｌｕｎｇ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ， ＢＡＬ， ａｎｄ ｂｌｏｏｄ”、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １９９７年、１５６巻、１５９３−１６００頁
【非特許文献２】Ｅｂｅら、“Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ”、Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ ２０００年、１７巻、２５６−２６５頁
【非特許文献３】Ｄｏｈｉ Ｍら、” Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｌｕｎｇｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ”、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４年、１５２巻、１９８３−１９８８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
確かに、上記非特許文献１においてＣＤ４陽性Ｔ細胞が何らか病態に関与していることを示唆しているが、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が増加する機序や網膜炎が合併する機序は大部分が不明であり、しかも、末梢血ＡＣＥの増加のみによっては肺サルコイドーシスの診断を行うことが困難な症例が多数存在する。眼科医が発見する眼病変自体の大きさは数十ミクロンから数ミリ単位以下であるため、病巣が眼内に限局する場合には、眼内病巣からＡＣＥ などが流血中に流出しても、全身単位での活性はきわめて低くなり、通常の検査では検出限度以下となる。眼サルコイドーシスに特異的な疾患マーカーは現在存在しないため、ぶどう膜炎を初発症状としても、眼サルコイドーシスの診断がきわめて困難である。
【０００９】
また、ＳＥＲＥＸ法については、殆どが腫瘍関連抗原の同定のために用いられているものであって、腫瘍関連抗原以外のものに適用した例は極めて稀である。これを用いたサルコイドーシスの報告としては上記非特許文献２の一文献のみ、報告があるが、この報告は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ 菌ＤＮＡを組み込んだファージを用いたＳＥＲＥＸ解析であり、肺胞上皮を含め人の細胞が発現するｃＤＮＡを組み込んだファージを用いたＳＥＲＥＸ解析は行われていない。
【００１０】
更に、上記非特許文献３に記載の報告では、抗原特異的なＴ細胞増生が認められているが、ＰＣＲ法のみでは症例間でＨＬＡ抗原が異なること、認識している抗原は抗原提示細胞によって断片化されていること、からサルコイドーシス関連自己抗体が認識する抗原の決定は極めて困難である。
【００１１】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスを検出するための検出マーカー及び検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＢＡＬ液中や肺間質中に浸潤するＴ細胞は、その免疫グロブリン可変部領域にＶα／Ｖβ鎖を有しており、肺胞局所に疾患特異的な抗原が存在し、肺において疾患特異的な抗原／抗体反応が生じているのであれば、Ｂ細胞による抗体産生にはＣＤ４陽性Ｔ細胞の援助が必要不可欠である。まず、我々も肺サルコイドーシス症例のＢＡＬ液中のＣＤ４陽性Ｔ細胞のＶβ鎖を解析したところ、全例に特定のＣＤ４陽性Ｔ細胞のｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌな増生が認められた。この所見はいままでの肺サルコイドーシスのＢＡＬ液における報告を裏付け、肺胞局所において特異的な抗原に対してＣＤ４陽性Ｔ細胞が増生し、活発な抗原抗体反応の存在を示唆する結果であった。眼サルコイドーシスに伴って縦隔リンパ節腫脹や肺内陰影が合併することも稀ではなく、肺胞と眼において共通の自己抗原に対する免疫反応が生じている可能性も考えられる。もしそのような自己抗原が存在するのであれば、眼周囲のリンパ節腫脹はほとんど認められないことと肺サルコイドーシスが合併する場合には縦隔リンパ節腫脹を併発していることが多いことから、サルコイドーシスに伴う抗原刺激は肺内に強く存在していることが示唆される。
【００１３】
そこで、更に本発明者らが上記について検討を行ったところ、肺胞内腔にはその構成細胞として、 ＩＩ型肺胞上皮と肺胞マクロファージがあげられる。肺胞腔内でサルコイドーシス特異的な抗原抗体反応が生じているのであれば、構成細胞として大部分を占める肺胞上皮やマクロファージが有する蛋白が抗原として働いているのではないかと推察した。肺胞上皮が発現する蛋白を非常に鋭敏な方法（ＳＥＲＥＸ法）で解析を行うことで、肺サルコイドーシスの患者血清中に存在する自己抗体の検出が可能であることを見いだした。以下具体的に示すが、我々の発見した９種類の自己抗体は比較的高頻度で肺サルコイドーシス症例の血清中に存在し、これらのうちのひとつであるｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） とｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）は肺胞上皮と網膜に共通に存在する蛋白であることから、肺胞腔内で肺胞上皮やマクロファージから流出した自己抗原蛋白が抗原となって抗体産生が生じ、この蛋白は網膜にも発現している蛋白のため、これらの異常な自己抗体が眼サルコイドーシスの眼病変の病因の一因であり、これらの自己抗体の測定は眼サルコイドーシスの診断に有用であることを発見した。これらを組み合わせることによって、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの正確な血清学的診断が可能となる。
【００１４】
即ち、本発明に係る肺サルコイドーシスの検出マーカーは、抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）抗体、抗ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ抗体、抗ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体の少なくとも一つを含有してなることを特徴とする。また、眼サルコイドーシスの検出マーカーは、抗ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）抗体、抗ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｒｅｔ ＳＤＲ２）抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６，ＣＤ６７７０２５，ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体の少なくとも一つを含有してなることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る肺サルコイドーシスの検出キットは、ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなることを特徴とする。また、眼サルコイドーシスの検出キットは、ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなることを特徴とする。なおここで基材としては上記抗原タンパクを吸着させて抗体反応を確認できる限りにおいて限定はされないが、メンブレンやＥＬＩＳＡ法にも散られるプレートなどが該当する。またこの場合において、抗原タンパクは標識が付されていること、標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていること、も望ましい。
【００１６】
また、本発明に係る方法としては、ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、
１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの標識された抗原タンパクを吸着したプレートに血液又はＢＡＬ液を塗布することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
以上、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスを検出するための検出マーカー及び検出キットを提供することができるようになる。特に、今回我々の発見した１５種類の自己抗体は既存には報告されておらず、サルコイドーシス以外の症例ではほとんどの自己抗体は検出されず、診断検査としての利用価値が高い。
【００１８】
本発明を用いることによって、治療前後のＢＡＬ液または経時的に採取した血清による連続的な疾患特異的自己抗体の解析が可能となる。とりわけ、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白を用いた自己抗体の測定は、病勢フォローやステロイドなどの治療効果判定に最適な検査法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。
【００２０】
本発明の実施の形態としては、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー、検出キットの態様を採用できる。肺サルコイドーシス検出マーカーの態様として、抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体の少なくとも一つを含んでなることとする。眼サルコイドーシスの検出マーカーの態様として抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体の少なくとも一つを含んでなることとする。即ち、肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いのある患者から血液又はＢＡＬ液を抽出し、この抗体が存在しているか否かを調べ、存在している場合は肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いがあると判定することができる。これにより精度よく調べることができるようになる。
【００２１】
また本発明の一実施形態として、ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出キットとすることもできる。これにより、肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いのある患者から血液又はＢＡＬ液を抽出し、この抗原タンパクが抗体と反応しているか否かを調べることにより、肺サルコイドーシスまたは眼サルコイドーシスの疑いがあるか否かを判定することができる。具体的にはこれら抗原タンパクを基材に吸着させ、ＢＡＬ液又は血清などを塗布することにより抗原タンパクと反応させ、更に発光又は発色部位を有する二次抗体と反応させることで、発光等が行われるか、又はその量にもとづいて抗体が存在しているか否かを判定し、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスであるか否かを判定することが可能となる。この場合において、抗原タンパクには抗原タンパクを作成する観点から標識が付されていることが望ましい。特に本実施形態によると、あらかじめ作成した自己抗原蛋白が吸着したメンブレンやプレートを利用することによって、迅速な検査が可能であり、１時間程度で結果を得ることができる。そのため、病状が刻々と変化する重症例のサルコイドーシス症例においても迅速な対応が可能である。肺サルコイドーシスが悪化した場合には、できるだけ早い治療が必要であるが、他の合併症（感染症、悪性腫瘍）の除外に時間がかかり、診断に苦慮する場合が多い。本発明は肺サルコイドーシス自体が悪化したのか他の合併症が重なったのかを鑑別するうえで非常に重要な情報を提供可能であり、迅速な対応に結びつくことができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本実施形態に係る発明の効果を実証すべく検討を行った。以下説明する。
【００２３】
Ｔ細胞Ｖβ鎖は２５種類のサブファミリーから構成されているため、まずそれぞれのサブファミリーに特異的なプライマーを作成した。作成したプライマーを図１に示す。なお図中、Ｖβ１、Ｖβ２…、Ｖβ２５はｆｏｗａｒｄとして用い、Ｃβはｒｅｖｅｒｓｅとして共通に用いた。
【００２４】
そして肺サルコイドーシス２０症例に対しＢＡＬを行い、そのＢＡＬを抽出した。そしてこのＢＡＬ液からＤｙｎａ ｂｅａｄｓを用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞の分離、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＴ細胞のＶβ鎖可変部領域の増幅を行い、更にこのＰＣＲ産物を２％アガロースで泳動しエチジウムブロマイドによる染色では、ごく一部のＶβ鎖サブグループのみが発現していた（図２参照）。
【００２５】
次に、ＳＥＲＥＸ法の概要を図３に示す。ＩＩ型肺胞上皮癌培養株からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを作成後、得られたｃＤＮＡ ライブラリーを蛋白発現ベクター（ＺＡＰ発現ベクター）に組み込み作成したファージを大腸菌に感染させ、ｃ−ＤＮＡのコードする蛋白を大腸菌に発現させた。そしてｃｏｌｏｎｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって、肺サルコイドーシスの血清およびＢＡＬ液中の免疫グロブリンと結合するプラークを選別し、陽性ファージをファジェミドベクターに変換後、シークエンスによって特異的蛋白の塩基配列を決定した。ホモロジー検索によって蛋白の構造を決定し、肺サルコイドーシス／眼サルコイドーシスの血清中およびＢＡＬ液中に存在する自己抗体の認識自己抗原の同定を行った。以上の結果、症例とその症例に対して検出された自己抗体が認識している抗原を図４、５に示す。
【００２６】
図４、図５によると、１５種類の抗体のうち、抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体は、ＳＥＲＥＸ法によって解析した肺サルコイドーシス１０例中５例（５０％）の血清および ＢＡＬ液中に存在した。抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体と抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体は肺サルコイドーシス１０例中４例（４０％）の血清およびＢＡＬ液中に存在していた。抗 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体は肺サルコイドーシス１０例中３例（３０％）の血清およびＢＡＬ液中に存在していた。抗 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体は１０例中１例（１０％）に存在していた。これにより、自己抗体を検出することによって、肺サルコイドーシス、眼サルコイドースの有無を判定することができることを確かめた。
【００２７】
また今回ＳＥＲＥＸ法で解析した１０例中４例 (図６)はＡＣＥの上昇認めるが、今回発見した抗体のうち陽性率の高い４つの自己抗体（抗poly
a binding protein 1抗体、抗1-phosphatidylinositol-4-phosphate
5 kinase isoform c抗体、抗 retinal short-chain
dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体、抗ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体）を組あわせることによって、１０例中９例（９０％）は、新規自己抗体が陽性であり、ＡＣＥが陰性であった６例はすべて自己抗体が陽性であった。肺胞と網膜の両方に発現がみられる共通抗原のうち、今回検出頻度が高かった抗 retinal short-chain dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体は、眼サルコイドーシス症例７例中３例（４３％）に陽性であった。また抗 retinal short-chain dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体が陽性で現在眼サルコイドーシスの症状を有していない残りの１例においても、ガリウムシンチ検査では眼に集積が認められ、眼にもサルコイドーシス病変が潜在している可能性が示唆された。肺胞と眼の共通抗原に対する自己抗体とくに抗 retinal short-chain dehydrogenase/reductase (ret SDR2) 抗体は眼サルコイドーシスの診断マーカーとして有用である。
【００２８】
また、今回検出した１５種類の自己抗原蛋白のうち発現頻度が高い３種類の蛋白（ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２））について、自己抗体認識抗原遺伝子全体に対するプライマーを作成し、ＲＴ−ＰＣＲ法で解析し、それぞれの遺伝子の発現を確認した。図７にここで設計したプライマーを示す。３種類のうち２種類（ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ １、ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２））の自己抗原蛋白は、ＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）および単球系培養株（ＴＨＰ−１）の双方に対して発現を確認することができた。残りの１種類の自己抗原蛋白（１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ）は、ＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）のみに発現が認められた。肺サルコイドーシスは肺胞腔内に病変の主座が存在すると考えられており、肺胞腔側の構成細胞の大部分を占めるＩＩ型肺胞上皮および肺胞マクロファージの両者から自己抗体認識抗原蛋白が産生されている可能性を確認した。この結果を図８に示す。そして更に、発見した自己抗体認識抗原蛋白をＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白として人工的に大腸菌に作成させた。以下に行った蛋白作成方法の概要を示す。
【００２９】
上記のＲＴ−ＰＣＲ法によってで得られたＰＣＲ産物をＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白発現ベクター（Ｐｑｅ−３０ＵＡ）にライゲーションし、コンペテントＭ１５細胞にトランスフォーメーションを行った。得られたＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白発現コロニー蛋白をニトロセルロースフィルターに転写後、ＩＰＴＧを含むプレートにフィルターを移し６×ｈｉｓタグ標識蛋白質を発現させた。得られたフィルターをＰｅｎｔａ−ＨｉｓＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを用いて免疫染色を行い自己抗体認識抗原蛋白発現コロニーを選別した。得られたコロニーをピックアップし培養液中で増殖させ、６×ｈｉｓタグ標識蛋白質の抽出を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によって蛋白発現を確認した後、大腸菌大量培養液から、自己抗体認識抗原蛋白（Ｈｉｓ−ｔａｇ標識蛋白）の精製を行った。
【００３０】
これにより得られた１５種類の肺サルコイドシス特異的Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白をＴｈｅ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いて、６ｍｍ Ｄｏｔとしてナイロンメンブレン上に吸着させた。これにより、得られた蛋白吸着メンブレンを症例の血清およびＢＡＬ液でｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させ化学発光にて自己抗体発現の有無を１１種類同時に検出した。Ｄｏｔ ｂｌｏｔ法およびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による検索では、肺サルコイドーシスの血清および気管支肺胞洗浄液を用いた場合にのみＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白に対して陽性バンドを検出することができ、またバンドの発現強度は、病勢が悪化した場合に強く検出される傾向が認められた。
【００３１】
また、上記により得られた１５種類の肺サルコイドーシス特異的Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白をＮｉ−ＮＴ（図４）ＳＥＲＥＸ法によって検出した肺サルコイドーシス特異的自己抗体の認識する自己抗原蛋白とその発現頻度を調べた。Ａ標識ＥＬＩＳＡプレートに添加し４度で一晩インキュベートし固定した。これによりＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白をＮｉ−ＮＴＡに結合させることができ、これにより得られたＥＬＩＳＡプレートを用いて症例血清およびＢＡＬ液を用いて自己抗原蛋白と結合する自己抗体濃度を検出した。Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白を吸着させたプレートによる血清およびＢＡＬ液によるＥＬＩＳＡ解析では、病勢が悪化した場合に抗体価が高く検出される傾向が認められた。本発明のＥＬＩＳＡ解析は、肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの病勢フォローに有用な指標であった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ｔ細胞Ｖβ鎖サブファミリーに対するＰＣＲ法に用いたプライマーを示す図。
【図２】肺サルコイドーシスにおけるＴ細胞Ｖβ鎖サブファミリーの解析の例。
【図３】ＳＥＲＥＸ法の概略図を示す図である。
【図４】ＳＥＲＥＸ法によって検出した肺サルコイドーシス特異的自己抗体の認識する自己抗原蛋白とその発現頻度を示す図。
【図５】ＳＥＲＥＸ法によって検出した肺サルコイドーシス特異的自己抗体の認識する肺胞と眼共通自己抗原蛋白とその発現頻度を示す図。
【図６】発現頻度の高い３種類の自己抗体の発現状況を示す図。
【図７】肺サルコイドーシス自己抗体認識抗原遺伝子を増幅するために用いたＰＣＲプライマーを示す図。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲ法によって３種類の自己抗原蛋白のＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）および単球系培養株（ＴＨＰ−１）における発現を解析した図。 １：ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、 ２：１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ３：ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、Ａ：Ａ５４９ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｔ：ＴＨＰ−１ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体の少なくとも一つを含有してなる肺サルコイドーシスの検出マーカー。
【請求項２】
抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＣＤ６７６９０６，ＣＤ６７７０２５，ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体の少なくとも一つを含有してなる眼サルコイドーシスの検出マーカー。
【請求項３】
ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる肺サルコイドーシスの検出キット。
【請求項４】
ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる眼サルコイドーシスの検出キット。
【請求項５】
前記抗原タンパクは標識が付されていることを特徴とする請求項３記載の肺サルコイドーシスの検出キット。
【請求項６】
前記抗原タンパクは標識が付されていることを特徴とする請求項４記載の眼サルコイドーシスの検出キット。
【請求項７】
前記標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていることを特徴とする請求項３記載の肺サルコイドーシスの検出キット。
【請求項８】
前記標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていることを特徴とする請求項４記載の眼サルコイドーシスの検出キット。
【請求項９】
ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの標識された抗原タンパクを吸着したプレートに血液又はＢＡＬ液を塗布することを特徴とする方法。
【請求項１】
抗ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １抗体、抗１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ抗体、抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗 ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ抗体、抗 s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ抗体、抗 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体、抗 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２抗体の少なくとも一つを含有してなる肺サルコイドーシスの検出マーカー。
【請求項２】
抗 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２） 抗体、抗ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＣＤ６７６９０６，ＣＤ６７７０２５，ＣＤ６７７０６８）抗体、抗ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）抗体、抗網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）抗体、抗レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）抗体の少なくとも一つを含有してなる眼サルコイドーシスの検出マーカー。
【請求項３】
ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる肺サルコイドーシスの検出キット。
【請求項４】
ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる眼サルコイドーシスの検出キット。
【請求項５】
前記抗原タンパクは標識が付されていることを特徴とする請求項３記載の肺サルコイドーシスの検出キット。
【請求項６】
前記抗原タンパクは標識が付されていることを特徴とする請求項４記載の眼サルコイドーシスの検出キット。
【請求項７】
前記標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていることを特徴とする請求項３記載の肺サルコイドーシスの検出キット。
【請求項８】
前記標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていることを特徴とする請求項４記載の眼サルコイドーシスの検出キット。
【請求項９】
ｐｏｌｙ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、１−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ、 ｒｅｔｉｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ｒｅｔ ＳＤＲ２）、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ−ＩＩ、s−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ 、 ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ構成蛋白（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＣＤ６７６９０６， ＣＤ６７７０２５， ＣＤ６７７０６８）、ｏｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ 構成蛋白（ＣＤ０６６２９３）、網膜構成蛋白（ＢＱ６３７７８１）、レンズ構成蛋白（ＣＤ６７４，３９）の少なくともいずれかの標識された抗原タンパクを吸着したプレートに血液又はＢＡＬ液を塗布することを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１９８２３１（Ｐ２０１２−１９８２３１Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２４１８９（Ｐ２０１２−１２４１８９）
【出願日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【分割の表示】特願２０１０−２９６９８（Ｐ２０１０−２９６９８）の分割
【原出願日】平成１７年４月１２日（２００５．４．１２）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【分割の表示】特願２０１０−２９６９８（Ｐ２０１０−２９６９８）の分割
【原出願日】平成１７年４月１２日（２００５．４．１２）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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