肺癌におけるＥＭＬ４とＡＬＫの融合のためのＦＩＳＨアッセイ
提供する方法および組成物は、ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体の逆位を検出するＦＩＳＨアッセイを行うことに関する。本明細書に記載するＦＩＳＨアッセイは、治療戦略の決定と同様に、診断および予後診断の目的で有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年２月１２日出願の米国仮出願番号61/065,422の「肺癌におけるＥＭＬ４とＡＬＫの融合のためのＦＩＳＨアッセイ」の35 U.S.C. § 119(e)に基づく利益を主張し、ここに参照によって全体に組み込まれる。
【０００２】
政府利害関係
本研究は、米国立衛生研究所により、助成金番号1RO1CA114465-01に基づいて一部支援がなされた。米国政府は本発明に権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＥＭＬ４遺伝子およびＡＬＫ遺伝子が関係する第２染色体上の逆位を試験するＦＩＳＨアッセイに属する。本アッセイは、肺癌の診断および予後診断の応用例を有する。
【背景技術】
【０００４】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、元来、ＡＬＫのＣ末端キナーゼドメインおよび多様な遺伝子産物のＮ末端部からなる融合タンパク質の生産をもたらす染色体転座から発見された(Morris et al., Science, 1994, 263:1281-1284)。ＡＬＫ遺伝子が関係する転座は、未分化リンパ腫の４０−６０％で同定されたが(Falini et al., Am J Pathol, 1998, 153: 875-886)、それらは、Ｂ細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、および筋線維芽細胞腫などのいくつかの珍しい悪性腫瘍でも発見された(Gascoyne et al., Blood, 2003, 102: 2568-2573; Griffin et al., Cancer Res, 1999, 59: 2776-2780; Lawrence et al., Am J Pathol, 2000, 157: 377-384)。ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）は、最も共通したＡＬＫの融合パートナーであるが（転座の８０％）、少なくとも６つの他の融合パートナーが同定された(Amin et al., Blood, 2007, 110: 2259-2267)。全長ＡＬＫの発現は、主神経組織の発生時に制限されるが、いくつかの珍しい悪性腫瘍もまたその遺伝子を発現する(Falini et al., Am J Pathol, 1998, 153:875-886; Iwahara et al., Oncogene, 1997, 14: 439-449; Lamant et al., Am J Pathol, 2000, 156:1711-1721)。ＡＬＫが関係する遺伝子融合は、ＡＬＫチロシンキナーゼの恒常的な活性化を頻繁にもたらす。ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＳＴＡＴ３、ホスホリパーゼγ、および細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）を含む、ＡＬＫキナーゼ活性の多様な下流ターゲットが同定された(Amin et al., Blood, 2007, 110: 2259-2267)。
【０００５】
ＡＬＫ遺伝子と棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）の融合が、日本人の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のサブセットで最近検出された(Soda et al., Nature, 2007, 448: 561-566)。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の頻度は、日本人の非小細胞肺癌では６．７％（５／７５）であることがわかった。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合が、男女ともに、非喫煙者または現喫煙者から、腺癌および有棘細胞癌で検出され、ＥＧＦＲまたはＫ−Ｒａｓ変異で相互排他的であった。さらに、ＥＭＬ４−ＡＬＫは、３Ｔ３細胞およびＢａ／Ｆ３モデルで癌化していた(Soda et al., Nature, 2007, 448:561-566)。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書には、ＥＭＬ４およびＡＬＫが関係する染色体逆位の検出のための、ＦＩＳＨアッセイを行う方法および組成物が記載される。ＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位を検出する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイに少なくとも部分的に基づく、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断および予後診断の方法、およびＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物を用いる、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患の処置方法もまた含まれる。本発明のさらなる側面は、ＮＳＣＬＣの対象を、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきかを決定する方法に関し、かかる対象がＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位を示すかという分析に少なくとも部分的に基づく。ＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位を検出するＦＩＳＨアッセイに用いるプローブ、およびかかるＦＩＳＨアッセイを行うためのキットも記載する。
【０００７】
本発明の側面は、染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定するＦＩＳＨアッセイを行うための方法に関し、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含むプローブセットとを接触させること、ここで、第一のプローブは第一の標識を有し、非逆位型の第一の染色体にハイブリダイズ可能であり、第二のプローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、非逆位型の第二の染色体にハイブリダイズ可能であって、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、；第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること；および第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、を含む。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点（breakpoint）の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。
【０００８】
いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定する方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第一の染色体にハイブリダイズ可能な第一の核酸プローブ、および、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識と異なる第二の標識を有し、かつ第二の染色体にハイブリダイズ可能な第二のプローブとを接触させること、ここで、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、；第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、；および第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、に関係する。いくつかの態様では、第一の核酸プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６であって標識を有し、かつ第二の核酸プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１であって第二の標識を有する。
【０００９】
本明細書は、対象から生物学的試料を単離すること、その試料から染色体調製物を産出すること、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、その染色体調製物でＦＩＳＨを行うこと、およびその染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象がＮＳＣＬＣを有すると決定することを含む、対象のＮＳＣＬＣを診断する方法をさらに記載する。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。ある態様では、第一の核酸プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第一の標識を有し、かつ第二の核酸プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第二の標識を有する。本発明の側面は、ＦＩＳＨ解析の結果に基づいて、不良、中間または良好の予後を示す対象の分類方法を含む。ＮＳＣＬＣの診断および／または予後診断のいくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは腺癌である。ＮＳＣＬＣの診断および／または予後診断の他の態様では、ＮＳＣＬＣは有棘細胞癌である。
【００１０】
本発明の側面は、ＮＳＣＬＣの対象をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきかを決定する方法にさらに関係し、その方法は、対象から生物学的試料を単離すること、その試料から染色体調製物を産出すること、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、その染色体調製物でＦＩＳＨを行うこと、およびその染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきと決定することに関係する。いくつかの態様では、その方法は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で対象を処置することにさらに関係する。いくつかの態様では、ＥＧＦＲインヒビターも対象に投与される。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。いくつかの態様では、第一の核酸プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第一の標識を有し、第二の核酸プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第二の標識を有する。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４またはＰＦ−０２３４１０６６などのキナーゼインヒビターである。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む。ある態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーまたはそれら組み合わせのいずれかである。
【００１１】
本発明の側面は、ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位を検出するための核酸プローブをさらに含む。いくつかの態様では、核酸プローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＥＭＬ４染色体にハイブリダイズし、ＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４染色体にハイブリダイズする。いくつかの態様では、核酸プローブは、標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＡＬＫ染色体にハイブリダイズし、ＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫ染色体にハイブリダイズする。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。いくつかの態様では、プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列の少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する。いくつかの態様では、プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する。
【００１２】
本明細書は、染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定するためのキットをさらに記載し、そのキットは、第一の核酸プローブであって、そのプローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＥＭＬ４染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４染色体にハイブリダイズする、前記第一の核酸プローブ；第二の核酸プローブであって、そのプローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＡＬＫ染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫ染色体にハイブリダイズする、前記第二の核酸プローブ；染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定するＦＩＳＨアッセイを行うための第一および第二のプローブの使用についての説明書（instruction）、を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。いくつかの態様では、キットはＤＡＰＩなどのＤＮＡ対比染色剤をさらに含む。いくつかの態様では、キットはハイブリダイゼーションバッファー、封入剤（mounting media）、およびコントロールスライドを含む。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象の、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患の、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物を対象に投与する処置方法に関係する。いくつかの態様では、疾患は非小細胞肺癌などの癌である。ある態様では、非小細胞肺癌は、腺癌または有棘細胞癌である。
【００１５】
いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４またはＰＦ−０２３４１０６６などのキナーゼインヒビターを含む。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはそれら組み合わせのいずれかなどのＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーまたはそれら組み合わせのいずれかを含む。本明細書に記載の、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象の、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患を処置する方法は、エルロチニブ（Erlotinib）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、またはＡＧ１４７８などのＥＧＦＲインヒビターの投与も含むことができる。本明細書に記載の方法は、化学療法剤の投与も含んでもよい。いくつかの態様では、複数のＡＬＫキナーゼインヒビターおよび／またはＥＧＦＲインヒビターおよび／または化学療法剤が投与される。いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象において、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患を処置する方法が、本明細書に記載の診断方法を用いてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象に適用される。いくつかの態様では、対象はＥＧＦＲ変異を有すると診断される。
【００１６】
対象は、いくつかの態様では、手術および／または放射線治療を受けてもよい。
本発明の側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を発現する細胞で、細胞をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物と接触させることにより、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害することに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１は、ＮＳＣＬＣの細胞株および腫瘍でのＥＭＬ４−ＡＬＫを示す。図１Ａは、エクソンアレイを用いる肺癌の細胞株でのＡＬＫ融合遺伝子の検出を示す。８３種の肺癌の細胞株のスクリーニングで（８０／８３ＮＳＣＬＣ）、エクソンアレイは、Ｈ３１２２およびＨ２２２８細胞株が、他の８１の細胞株と比較して、ＡＬＫのエクソン２０〜２９に対応する＃８０〜１４０のＡＬＫプローブについて、有意に高いシグナル（log2差）を有していたことを示した。プローブは、標識強度に基づいて、非反応プローブ（薄い陰影（light shade））、低強度プローブ（中間の陰影（intermediate shade））および高強度プローブ（濃い陰影（dark shade））の３つのカテゴリーに割り当てられた。高強度プローブのみが、切断点の検出に使用された。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＮＳＣＬＣの細胞株および腫瘍におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合のＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。プライマーセット２は、Ｈ３１２２、Ｈ２２２８、およびＤＦＣＩ０３２細胞株からＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を増幅するが、Ａ５４９株からは増幅しない。プライマーセット１および２は、８種の原発性ＮＳＣＬＣからもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を検出した。Ｈ３１２２細胞はポジティブコントロールとして、Ａ５４９はネガティブコントロールとして役立つ。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＮＳＣＬＣでの４つの異なるＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体の模式的な図を示す。
【００１８】
【図２】図２は、ＦＩＳＨを用いたＥＭＬ４−ＡＬＫの検出を示す。図２Ａは、ＡＬＫ（矢印）およびＥＭＬ（矢頭）のシグナルが別々に見える野生型ＰＣ−９細胞株を示す。図２Ｂは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合シグナル（矢印）が小さな染色体外断片（矢印）に見えるＨ２２２８細胞株を示す。図２Ｃは、染色体の一つがＥＭＬ４−ＡＬＫ融合シグナルを黄色で示す（矢印）ＤＦＣＩ０３２細胞株を示す。図２Ｄは、図２Ｃに示すＤＦＣＩ０３２細胞株を樹立するために使用した胸水を有する患者の腫瘍から得られたＦＦＰＥ標本から、ＥＭＬ４−ＡＬＫについての間期ＦＩＳＨを示す。腫瘍は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合シグナル（矢印）について、ヘテロ接合性である。
【００１９】
【図３Ａ】図３は、ＮＳＣＬＣの細胞株を含むＥＭＬ４−ＡＬＫの成育に対するＮＶＰ−ＴＡＥ６８４の効果を示す。図３Ａは、表示濃度のＴＡＥ−６８４で処理したＮＳＣＬＣ細胞を表すグラフを示す。生存可能な細胞が、処理７２時間後に測定された。生存可能な細胞の割合が、未処理のコントロールと相対的に示される。Ａ５４９（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）；ＰＣ９（ＥＧＦＲ 欠失Ｅ７４６＿Ａ７５０）；Ｈ２２２８（ＥＭＬ４−ＡＬＫ 変異体３）；Ｈ３１２２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ 変異体１）；ＤＦＣＩ０３２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ 変異体１）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、無処理（左バー）および０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４で７２時間処理した後（右バー）のサブＧ１フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。ＴＡＥ−６８４処理に続く顕著なアポトーシスは、Ｈ３１２２細胞株でのみ観察される。
【図３Ｃ】図３Ｃは、０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４の７２時間処理に続くＰＡＲＰのウェスタンブロット解析を示す。Ａでの細胞成育に対するＴＡＥ−６８４の効果と一致して、８９ｋＤａの切断ＰＡＲＰ産物が、Ｈ３１２２細胞株でのみ観察される。
【００２０】
【図４】図４は、野生型およびＥＭＬ４−ＡＬＫポジティブＮＳＣＬＣの細胞株でのＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処理に続くウェスタンブロット解析を示す。全ＡＬＫおよびリン酸化ＡＬＫは、ＥＭＬ４−ＡＬＫポジティブ細胞株（Ｈ３１２２、Ｈ２２２８、ＤＦＣＩ０３２）のみで検出されるが、野生型コントロール（ＰＣ−９）では検出されない。Ｈ３１２２およびＤＦＣＩ０３２細胞株では、ＡＬＫポジティブのバンドは変異体１（矢印１）の予測分子量（１１７ｋＤａ）に対応する〜１１５ｋＤａで移動し、Ｈ２２２８では、バンドは変異体３（矢印３）の予測分子量（９０／９１ｋＤａ）にも対応する〜９０ｋＤａで移動する。ＡＬＫリン酸化は、すべての細胞株において、０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処理後（６時間）完全に阻害される。Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３、およびＥＲＫ１／２のリン酸化は、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４でＨ３１２２およびＨ２２２８細胞株で減少するが、ＤＦＣＩ０３２およびＰＣ−９株においては、変化しないままである。すべての細胞株は、ＰＴＥＮの存在を示す。α−チューブリンが、ローディングコントロールとして使用される。
【００２１】
【図５】図５は、ＮＳＣＬＣの細胞株におけるＡＬＫ遺伝子の異なる部位の発現レベルを、エクソンアレイを用いて示す。非反応プローブは、薄い陰影で示され、低強度プローブは中間の陰影で示され、高強度プローブは濃い陰影で示される。図５Ａは、Ｈ２２２８細胞株において、エクソンアレイが３’末端に位置するＡＬＫプローブについて、残り８３種の細胞株と比較して有意に高いシグナルを検出したことを示す。図５Ｂは、Ｈ２２２８株と類似してＨ３１２２細胞株において、ＡＬＫの３’末端において有意に高いシグナルが見られたことを示す。図５Ｃは、ＨＣＣ２９３５細胞株では、異なるＡＬＫプローブについては、シグナルに違いが無いことを示す。
【００２２】
【図６】図６は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの検出に使用するＦＩＳＨアッセイの図解を示す。野生型の標本では、ＡＬＫおよびＥＭＬ４のシグナルは、第２染色体に別々に見られる。(ｉｎｖ（２）（ｐ２３．３ｐ２１）の逆位を通してＥＭＬ４とＡＬＫが融合した場合、個々の両シグナルは融合し、単一のシグナルを形成する。
【００２３】
【図７】図７は、核酸プローブを含み、およびＦＩＳＨアッセイでのそれらの使用についての説明書を含むキットを示す。
【００２４】
詳細な説明
本発明の側面は、ＥＭＬ４とＡＬＫをまとめる異常な染色体の逆位を検出する方法および組成物に関する。本発明は、少なくとも部分的に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイが、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位をもたらす染色体逆位を検出するために使用され得ることの発見に関する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるこの染色体逆位の罹患率は、本明細書に記載のＦＩＳＨアッセイの診断および予後診断への適用をもたらした。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出のためのＦＩＳＨアッセイの使用は、かかる遺伝子融合を示す対象の適切な処置戦略の決定することの適用性も有する。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するＦＩＳＨアッセイの使用のためのプローブ、かかるプローブを産出する方法、およびかかるプローブを含むキットが、本明細書にさらに記載される。
【００２５】
本発明は、その適用において続く記載に係る、または図に示される構成の詳細および成分の配置に限定されない。本発明は、他の態様および様々な方法での実践または実行が可能である。また、本明細書で使用する専門語および用語は、記載の目的であり、限定としてみなされるべきではない。本明細書の、「包含する（including）」、「含む（comprising）」または「有する（having）」、「含有する（containing）」、「関係する（involving）」およびそれらのバリエーションの使用は、その後に列挙する項目、および追加項目と同様に、それらに相当するものを包含することを意味する。
【００２６】
本発明の側面は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの使用に関する。本明細書で使用するように、「蛍光インサイチュハイブリダイゼーション」または「ＦＩＳＨ」は、染色体上の特定のＤＮＡ配列にハイブリダイズする標識核酸プローブの使用によって、染色体上の特定のＤＮＡ配列を検出、または局在化する方法を言及する。本明細書で使用するように、「核酸プローブ」は、染色体上の特定のＤＮＡ配列を認識してハイブリダイズする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど）配列を言及する。ＦＩＳＨは多様な研究応用例があるが、ある応用例では、染色体の逆位を検出する能力に属する。本明細書で使用されるように、「染色体の逆位」は、染色体のセグメントが端々逆転する再構成を言及する。逆位は、野生型または正常な細胞では通常起こらない２つの遺伝子間での融合が生じ、癌などの障害を引き起こす可能性がある。したがって、細胞中の染色体逆位の検出は、癌などの障害を示すものになり得る。
【００２７】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子に関係する染色体の逆位は、複数のタイプの癌で検出され、６つの異なる遺伝子との融合に関係し得る（Amin et al., Blood, 2007, 110:2259-2267）。これら逆位において、ＡＬＫのＣ末端キナーゼドメインは、様々な遺伝子のＮ末端領域と融合する（Morris et al., Science, 1994, 263:1281-1284）。近年、ＡＬＫ遺伝子が棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子と融合する染色体の逆位が、日本人のＮＳＣＬＣ患者で検出された（Soda et al., Nature, 2007, 448: 561-566）。染色体の逆位、またはＥＭＬ４とＡＬＫとの間の融合は、本明細書ではＥＭＬ４−ＡＬＫとして言及される。本明細書の例の部門で提示するデータは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合は、アメリカ人および韓国人のＮＳＣＬＣ患者においても広まっていることを明らかにする。
【００２８】
本発明の側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位の存在検出におけるＦＩＳＨの使用に関する。本明細書に記載の方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含むプローブセットを接触させること、ここで、第一のプローブは第一の標識を有し、非逆位型の第一の染色体にハイブリダイズ可能であり、第二のプローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、非逆位型の第二の染色体にハイブリダイズ可能であって、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、；第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること；および第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、を含む。
【００２９】
複数の異なるアプローチが、本発明と適合性のあるプローブセットを設計するために使用され得ることは、認められるべきである。いくつかの態様において、核酸プローブは、「融合プローブ」として記載されてもよい。これら態様では、第一のプローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブはＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズする。第二の核酸プローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＡＬＫ染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫ染色体にハイブリダイズする。ＥＭＬ４とＡＬＫが逆位によって融合しなかった野生型の染色体調製物において、第一および第二のプローブは、それぞれの非逆鋳型の染色体領域にハイブリダイズし、２つの別々のシグナルが検出される。ＥＭＬ４とＡＬＫが逆位によって融合した異常な染色体調製物において、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする。
【００３０】
他の態様では、「ブレークアパート（break-apart）」プローブは、本発明と適合性でもある。これら態様では、第一のプローブは標識を有し、逆位切断点付近の非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である。第二のプローブは、第一のプローブと異なる標識を有し、逆位切断点の反対側の同一染色体領域とハイブリダイズ可能である。染色体が異常な逆位を起こさなかった正常な野生型の染色体の調製物では、２つのプローブは、隣接のシグナルまたは単一のシグナルとして検出されるだろう。染色体が逆位および融合を起こした異常な染色体の調製物では、２つのシグナルが、染色体の逆位による分離のために、別々のシグナルとして離れて検出されるだろう。ＥＭＬ４またはＡＬＫのいずれのブレークアパートプローブも、本発明に適合性がある。
【００３１】
いくつかの態様では、ＦＩＳＨアッセイで使用される核酸プローブは、オークランド小児病院研究所のＢＡＣ ＰＡＣリソースセンター（ＢＰＲＣ）（Oakland、CA）から入手可能なＢＡＣ（バクテリア人工染色体）クローンから産生される。本明細書で使用するように、「ＢＡＣ」は、大腸菌細胞においてＤＮＡ断片をクローニングするために使用されるベクターを言及する。ＢＡＣは、典型的には５０〜３００ｋｂのＤＮＡインサートを含有する。他の態様では、ＦＩＳＨアッセイに使用する核酸プローブは、フォスミドから産生され得る。本明細書で使用されるように、「フォスミド」は、細菌のＦ−プラスミドに基づくクローニングベクターを言及する。ある態様では、プローブは、ともにプールした複数のフォスミドから産生される。ＦＩＳＨアッセイのための最適プローブの長さは、経験的に決定する必要があるかもしれないことは、認められるべきである。いくつかの態様では、プローブの長さは、８０〜１５０ｋｂｐの間である。大きなＤＮＡ断片の他の供給源もＦＩＳＨアッセイのためのプローブ産生に、したがって、本発明の方法と適合性があるであろうことは、さらに認められるべきである。より小さなＤＮＡ断片も本発明の方法と適合性があり、いくつかの態様では、（フォスミドについて上述するように）ともにプールされる。
【００３２】
本発明の側面によると、核酸プローブは、タグまたは標識によって標識される。いくつかの態様では、ＦＩＳＨアッセイに使用するタグまたは標識は、フルオロフォアとも言及される蛍光タグまた蛍光標識である。核酸を標識するいずれの適切な技法が本発明と適合性があり、当業者によって理解されるであろう。いくつかの態様では、核酸プローブは標準プロトコルに従って、ニックトランスレーションを介して標識される。他の態様では、核酸プローブは標準プロトコルに従って、ランダムプライミングを介して標識される。さらなる態様では、核酸プローブは標準プロトコルに従って、末端標識を介して標識される。核酸プローブを標識するために使用されるいずれのタグまたは標識は、本発明と適合性があることは、認められるべきである。いくつかの態様では、タグは限定されることなく、Abbott Molecular（Des Plaines、IL）からすべて入手可能なSpectrumRed-dUTP、SpectrumGreen-dUTP、SpectrumGreen-11-dUTP、およびSpectrumOrange-dUTPから選択される。いくつかの態様では、プローブは、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識されてもよい。
【００３３】
いくつかの態様では、核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂ、１Ｍｂまたは１Ｍｂ以下の内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である。ＡＬＫおよびＥＭＬ４は、１２メガベース離れて第２染色体のショートアームに両方位置しており、５’から３’の方向性は反対にある。２つの異なるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体が以前に特徴づけられ、両方ともＥＭＬ４遺伝子のエクソン１〜１３（変異体１）またはエクソン１〜２０（変異体２）と融合するＡＬＫのエクソン２０〜２９に関係する（Soda et al., Nature, 2007, 448: 561-566）。変異体３（ＥＭＬ４のエクソン６がＡＬＫのエクソン２０と融合する）は、選択的にスプライシングする３３ｂｐの断片（エクソン７ａ）を組み込ませるために、融合体のＥＭＬ４部分のスプライシングを変化させる。本明細書に記載される融合遺伝子の変異体４は、ＥＭＬ４コドン１〜５６９（エクソン１５）を、ＡＬＫのコドン１０７８〜１６２１に融合する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体１では、切断点は、ＥＭＬ４のエクソン１３の３．６ｋｂ下流であり、ＡＬＫのエクソン２１の２９７ｂｐ上流である。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体２では、切断点は、ＥＭＬ４のエクソン２０の５４５ｂｐ下流およびＡＬＫのエクソン２１の２３２ｂｐ上流に位置する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体３および４では、正確な切断点はまだ決定されていない。しかしながら、特異的な変異体の切断点は、当業者によって決定され得る。
【００３４】
複数のプローブが、本発明と適合性があることは、認められるべきである。プローブは、ＵＣＳＣゲノムデータベースウェブサイトを通じて利用可能であるように、公に利用可能なヒトゲノム配列データと同様に、逆位の切断点およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合変異体の配列データに関して、本明細書で提供される情報に基づいて設計可能である。さらなるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体が存在するかもしれないことも、認められるべきである。本明細書に記載のプローブおよびアッセイは、すべての可能なＥＭＬ４−ＡＬＫの変異体、およびこれら変異体を同定する方法を包含する。いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を認識するように設計したプローブは、すべてのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の変異体を認識するだろう。他の態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を認識するように設計したプローブは、１または複数のＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の変異体を認識するかもしれない。
【００３５】
いくつかの態様では、ＡＬＫの３’末端にハイブリダイズする核酸プローブおよびＥＭＬ４の５’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するためのＦＩＳＨに使用される。いくつかの態様では、ＡＬＫの３’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−１００Ｃ１から産生され、標識を有する。いくつかの態様では、ＡＬＫの３’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のＲＰ１１−１００Ｃ１との配列同一性を含む。いくつかの態様では、ＥＭＬ４の５’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−６６７Ｉ６から産生され、標識を有する。
いくつかの態様では、ＥＭＬ４の５’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のＲＰ１１−６６７Ｉ６との配列同一性を含む。ＲＰ１１−１００Ｃ１およびＲＰ１１−６６７Ｉ６は両方とも、オークランド小児病院研究所のＢＡＣ ＰＡＣリソースセンター（ＢＰＲＣ）（Oakland、CA）から入手可能である。
【００３６】
本発明の側面によると、ＦＩＳＨは染色体調製物上で、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む第一のプローブおよびＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む第二のプローブなどの、蛍光標識をしたプローブを用いて行われる。ＦＩＳＨは、当業者に知られた標準技法に従って行われる（Lee et al., Chromosoma, 2000, 109:381-389）。いくつかの態様では、ＦＩＳＨを行うための試料調整は、自家蛍光の減少およびスライド上に試料を乗せることに関係する。いくつかの態様では、試料は、固定および処理した組織、凍結試料、スライド上の試料、またはパラフィン包埋の試料からなる。試料調整の側面は、米国特許公報US2006/0199213およびUS2005/0100944でさらに考察され、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
ＦＩＳＨアッセイは、核酸プローブと染色体上の特異的なＤＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションの検出に頼っている。本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための、二本のＤＮＡまたはＲＮＡ相補鎖の結合過程、またはそれらのハイブリッドを言及する。ハイブリダイゼーションの工程は、１、２、または複数のプローブに関係してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、種々のプローブについて経験的に決定される必要があることは、認められるだろう。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に知られるように、高ストリンジェンシーから低ストリンジェンシーの条件の範囲を生じて変動し得る。温度、塩濃度、ホルムアミド濃度、およびデキストラン硫酸などの他の成分（米国特許公報US2005/0100944で考察）を限定することなく含む複数の因子が、ハイブリダイゼーションを至適化するために、経験的に操作され得る。これら因子および他の条件は、与えられたプローブおよび試料についてのハイブリダイゼーションシグナルを至適化するために、ハイブリダイゼーションの工程中および続く洗浄工程中に変動し得る。インサイチュハイブリダイゼーションの一般的な条件は、Leitch et al., In Situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v. 27 (1994)で、考察される。プローブ検出について、より高いストリンジェンシー条件は、一般的にはより低いバックグラウンドシグナルをもたらすが、感度もまた減少し得る。いくつかの態様では、高ストリンジェンシー条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃からなり、中ストリンジェンシー条件は、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃からなり、低ストリンジェンシー条件は、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃からなる（米国特許公報US2006/0199213で考察）。これら条件の多数の可能なバリエーション、および数々のバッファーおよび塩を含む多数の他の成分が、本発明と適合性があるだろう。
【００３８】
ＦＩＳＨアッセイでの正のハイブリダイゼーションシグナルは、蛍光顕微鏡を通じて、核酸プローブに付随するタグの可視化によって検出される。いくつかの態様では、第一の核酸プローブは、SpectrumRed-dUTPなどの蛍光タグで標識される一方で、第二の核酸プローブは、SpectrumGreen-dUTPなどの異なる蛍光タグで標識される。ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体の逆位がなかった染色体調製物中では、２つの蛍光シグナルが、赤色および緑色のシグナルとして、別々に検出されるだろう。ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体の逆位があった染色体調製物中では、２つの蛍光シグナルは併合し、単一の黄色のシグナルとして検出されるだろう。したがって、遺伝子融合は、逆位に伴う２つのシグナルの近接、および２つの蛍光シグナルの併合による異なる色彩の検出によって示される。
【００３９】
いくつかの態様では、ＦＩＳＨアッセイは、テスト試料およびコントロール試料に関係するだろう。いくつかの態様では、コントロール試料は、野生型または正常な染色体調製物であってもよい一方で、テスト試料は、ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位の存在が疑われる試料であってもよい。テスト試料およびコントロール試料は、同一のプローブで処理され、プローブの局在および蛍光シグナルが、コントロール試料とテスト試料との間で比較されるだろう。コントロール試料が野生型または正常な染色体調製物である態様では、テスト試料中のプローブおよびコントロール試料中のプローブでの類似の局在および蛍光シグナルは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含まないことを示す一方で、テスト試料中のプローブおよびコントロール試料中のプローブでの局在および蛍光シグナルの違いは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むことを示す。他の態様では、コントロール試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むことが知られている試料であってもよい。これらの態様では、テスト試料のプローブおよびコントロール試料のプローブでの類似の局在および蛍光シグナルは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むことを示す一方で、テスト試料中のプローブおよびコントロール試料中のプローブでの局在および蛍光シグナルの違いは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含まないことを示す。
【００４０】
本発明の側面は、例えば、対象から細胞試料または組織試料を得て、かかる試料をＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在についてアッセイすることによって、対象における癌の発症、進行または退行を診断またはモニタリングする方法を含む。本明細書で使用されるように、「癌」の用語は、身体臓器およびシステムの正常な機能を妨害するかもしれない、細胞の制御されない成育を言及し、原発性および転移性の腫瘍を含む。原発性腫瘍、または最初の部位から転移し、生命の維持に必要な臓器に接種する癌は、発症した臓器の機能的悪化を介して、最終的には対象の死をもたらす。転移腫瘍は、原発性腫瘍の部位とは異なり、原発性腫瘍から身体の他の部位への癌細胞の播種に起因する癌細胞または癌細胞の集団である。転移腫瘍は、最終的には対象の死をもたらすかもしれない。
【００４１】
いくつかの態様では、請求する発明の側面によって、診断または処置される対象は、肺癌を伴う対象である。肺癌は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を包含する。肺癌の症例約８０％の原因である非小細胞肺癌は、有棘細胞癌（類表皮癌とも呼ばれる）、大細胞癌、腺癌、多形性、カルチノイド腫瘍、唾液腺癌、および未分類の細胞種を限定することなく含む、複数のタイプの癌を包含する。本発明の側面は、ＮＳＣＬＣの全カテゴリーを包含する。いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは腺癌である。他の態様では、ＮＳＣＬＣは有棘細胞癌である。
【００４２】
対象は、癌を有する疑いがあってもなくてもよい。症状の発症は、対象の症状と関連する、生理学的な変化または特徴の開始である。かかる変化は、生理学的な症候によって証明されてもよく、または臨床的に無症候である。例えば、癌の発症は、その時点で臨床的な症候が明らかでないかもしれないが、癌に関する生理学的特徴が対象に存在するかもしれない期間を伴ってもよい。症状の進行は発症に続き、臨床的な症候の増加によって特徴づけられても、そうでなくてもよい、その症状の生理学的特徴の前進である。対照的に、症状の退行は、おそらく平行して症候の減少を伴う症状の生理学的特徴の減少であり、処置に起因してもよく、または病状の自然回復であってもよい。
【００４３】
非癌細胞または非癌組織には存在しないＥＭＬ４−ＡＬＫ融合などの癌に関連する遺伝子融合の存在は、対象における癌のマーカーとして特定される。癌の症状の発症は、かかる特定されたマーカーが以前に存在しなかった対象試料中で、かかるマーカーの出現によって示されてもよい。例えば、癌のマーカーが対象由来の第一の試料に存在しないと決定された場合、癌のマーカーがその対象由来の第二または続く試料中で存在するとの決定は、その対象での癌の発症の指標になる。癌に関連するマーカーのいくつかの例では、転移腫瘍に対して原発性腫瘍中で差次的に発現してもよく、そのため、対象試料中の選択した癌関連ポリペプチドの同定に基づいて、疾患のステージおよび／または診断レベルを確立することができる。
【００４４】
単一の組織タイプにおける異なるタイプの癌は、異なる癌関連マーカーを発現するかもしれない。かかるバリエーションは、癌特異的診断および続く患者の特異的な症状にあわせた処置を可能とするかもしれない。これら発現の差は、癌関連マーカーの差次的発現に基づいて、医師が癌を診断することを可能とし、差次的マーカーに基づいて特異的な処置を選択および投与することを可能とする。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位などの癌関連マーカーの単離および同定は、当業者がこの癌関連マーカーの発現によって特徴づけられる障害の診断をすることを可能とする。
【００４５】
本発明の側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出のためのＦＩＳＨアッセイの使用を通じて、ＮＳＣＬＣの診断に関する。いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣの診断方法は、対象から生物学的試料を単離すること、その試料から染色体調製物を産出すること、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、その染色体調製物でＦＩＳＨを行うこと、およびその染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象がＮＳＣＬＣを有すると決定することを含む。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出のためのＦＩＳＨアッセイの使用によって、ＮＳＣＬＣと診断された対象は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物の投与によって処置されてもよい。いくつかの態様では、ＥＧＦＲインヒビターまたは他の治療を含む組成物も投与されてもよい。
【００４６】
本明細書で使用するように、「生物学的試料」の用語は、生物体全体または組織、細胞または成分部分のサブセットを言及してもよい。「生物学的試料」はまた、生物体全体または組織、細胞、成分部分から調製したホモジネート、ライセート、または抽出物、またはそれら画分または部分を言及してもよい。いくつかの態様では、生物学的試料は、肺組織由来の試料だろう。いくつかの態様では、生物学的試料はインビボであってもよい。他の態様では、生物学的試料はインビトロであってもよい。いくつかの態様では、生物学的試料は細胞株、細胞培養物、または細胞懸濁液であってもよい。好ましくは、生物学的試料はＤＮＡの量およびタイプ、および／または試料が由来する親細胞に存在する発現産物に対応する。生物学的試料は、ヒトの対象またはヒト以外の対象由来になり得る。染色体調製物は、標準プロトコルに従って、生物学的試料から調製される。いくつかの態様では、ＦＩＳＨを行うために使用される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本である。
【００４７】
いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を検出するＦＩＳＨ解析の結果は、ＮＳＣＬＣの診断に使用されるだろう。他の態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するＦＩＳＨ解析の結果は、ＦＩＳＨ解析の結果に基づいて、不良、中間または良好のＮＳＣＬＣの予後を示す対象の分類に使用されるだろう。ＮＳＣＬＣの診断または予後診断のためのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するＦＩＳＨ解析の実行は、他のマーカー、または他の診断または予後診断アッセイの分析と併用してもよいと認められるべきである。いくつかの態様では、他のアッセイが、染色体逆位の分子的基盤のさらなる確認のために、またはさらなる分析のために、ＦＩＳＨアッセイと併用して、または続いて行われてもよい。例えば、どのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体が生物学的試料中に存在するかを検証または確認するために、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲが、生物学的試料で行われてもよい。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を測定するアッセイの実行も、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むと疑われる、または含むと知られている生物学的試料で行われてもよい。
【００４８】
いくつかの態様では、テスト試料はＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有する対象由来の試料であってもよい一方で、コントロール試料は癌を含まない、および／または前癌性の症状がない細胞または対象由来の試料であってもよい。これら態様では、コントロール試料ではなく、テスト試料でのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出は、テスト試料はＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有する対象に由来したことを示すかもしれない。いくつかの態様では、コントロール試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を示すＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有すると知られている細胞または対象に由来する試料であってもよい。これらの態様では、テスト試料およびコントロール試料でのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出は、テスト試料はＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有する対象に由来したことを示すかもしれない。いくつかの態様では、コントロール試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む、または含まないＮＳＣＬＣの細胞株であってもよい。
【００４９】
本発明のいくつかの側面によれば、対象（例えば、ＮＳＣＬＣ患者）は、すべてではない場合に、少なくともいくつかの癌細胞でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を発現する疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する場合、その対象はＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物での処置の候補として、同定されてもよい。したがって、いくつかの態様では、対象（例えば、ＮＳＣＬＣ患者）はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の存在について試験され、存在の場合には、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物での処置の候補として同定される。ＥＭＬ４−ＡＬＫ間融合のいずれの検出も、この遺伝子融合の可能性のあるいずれの変異体をも包含し、ＡＬＫキナーゼ活性のインヒビターで処置する指標とみなされてもよいことは、認められるべきである。いくつかの態様では、すべてではない場合に、少なくともいくつかの癌細胞でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を示す疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する対象（例、ＮＳＣＬＣ患者）は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物を含む処置を、推薦または処方されてもよい。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「対象」の用語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物または動物を言及する。ヒト以外の哺乳動物は、家畜動物、ペット、実験動物、およびヒト以外の霊長類を含む。ヒト以外の対象は、限定なしに特別に、ニワトリ、ウマ、雌牛、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク、およびウサギを含む。本発明のいくつかの態様では、対象は患者である。本明細書で使用するように、「患者」は、医師または他の医療従事者を受診した、それらからアドバイスを受けた、またはそれらから処方箋または他の推薦を受けた者を含む、医師または他の医療従事者の世話を受ける対象を言及する。患者は典型的には、ＮＳＣＬＣを有する、または有するリスクがある対象である。
【００５１】
「処置」または「処置する」の用語は、症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）の予防、寛解、防止または治癒を意図する。症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）開始後の処置は、症状および／または関連する症候を減少、寛解または一斉に除去する、または悪化することから防止することを目的とする。症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）開始前の対象の処置（すなわち、予防処置）は、症状にかかるリスクを減少すること、および／または症状にかかった場合に重症度を和らげることを目的とする。本明細書で使用するように、「防止」の用語は、対象が障害にかかるであろう確立の減少をもたらす、症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）にかかるリスクのある対象の予防処置、およびすでに確立した障害のさらなる発達の阻害を言及する。
【００５２】
本発明の側面は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物と細胞を接触させることによって、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を発現する細胞でのＡＬＫキナーゼ活性を阻害することに関係する。ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象で、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）の処置に使用することができる。ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＡＬＫおよび／またはＡＬＫキナーゼ活性の発現（例えば、転写、翻訳、および／または安定性）を阻害してもよいことは、認められるべきである。インヒビターは、ＡＬＫを阻害する特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターまたは非特異的なインヒビター（例えば、非特異的キナーゼインヒビター）またはマルチターゲットインヒビターであってもよい。ＡＬＫキナーゼのインヒビターが開発され、前臨床モデルで検討された。初期の研究は、ＷＨＩ−Ｐ１５４（ＩＣ５０ 〜５μＭ）、ピリドン（スタウロスポリンのＩＣ５０ ０．１５〜０．７８μＭ）などのＡＬＫインヒビターを用いて、またはＨＳＰ９０インヒビターとともに行われた(Li et al., Med Res Rev, 2007, Aug 10, Epub ahead of print)。その後に、ジアミノまたはアミノピリミジンなどのより強力で特異的なＡＬＫインヒビターが開発された。これらは、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６などのＡＬＫキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジンインヒビターを含む(Galkin et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104:270-275; Zou et al., Cancer Res, 2007, 67:4408-4417)。これら両インヒビターは、良好な生物学的利用能を有し、それらはＡＬＫキナーゼ活性およびＮＰＭ−ＡＬＫポジティブのリンパ腫細胞の成育を、低ナノモル範囲（Ｋａｒｐａｓ２９９細胞で、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６それぞれ２〜５ｎＭおよび２６ｎＭのＩＣ５０）で阻害する。ＰＦ−０２３４１０６６は、現在第Ｉ相臨床開発中の、ＭＥＴおよびＡＬＫの両方のインヒビターである。本明細書に記載の方法は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を示す対象におけるＮＳＣＬＣの処置のための、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害するいずれのキナーゼインヒビターの使用も包含する。いくつかの態様では、キナーゼインヒビターは、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４である(Galkin et al., Proc Natl Acad Sci., 2007, 104(1):270-5)。他の態様では、キナーゼインヒビターは、ＰＦ−０２３４１０６６である(Christensen et al., Mol Cancer Ther, 2007, 6(12 Pt 1):3314-22)。ＡＬＫキナーゼ活性の下流ターゲットは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＳＴＡＴ３、ホスホリパーゼγ、および細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）を含む(Amin et al., Blood, 2007, 110:2259-2267)。いくつかの態様では、すべてではない場合に、少なくともいくつかの癌細胞でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を示す疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する対象（例えば、ＮＳＣＬＣ患者）は、下流シグナル伝達経路の成分を阻害する１または２以上の組成物を含む処置を推薦または処方されてもよい。
【００５３】
いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼの活性を阻害する組成物は、小分子、ペプチド、アプタマー、または抗体であってもよい。他の態様では、ＡＬＫキナーゼの活性を阻害する組成物は、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤であってもよい。本明細書で使用されるように、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤は、ＡＬＫの発現を阻害可能ないずれの分子または組成物になり得る。例えば、それはＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または他の適した分子、またはそれら組み合わせのいずれかであろう。ＮＰＭ−ＡＬＫ含有モデルでの、ＡＬＫのｓｈＲＮＡノックダウンを使用する研究は、成育阻害およびアポトーシスを示し、ＡＬＫ阻害が潜在的に有効な治療戦略であるかもしれないことを示唆した(Piva et al., Blood, 2006, 107:689-697)。
【００５４】
当該技術分野で既知の多様な遺伝子ノックダウンの戦略は、遺伝子発現（例えば、ＡＬＫ発現）を阻害するために使用することができる。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、および他の当該技術分野で既知の小分子干渉核酸に基づく分子を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を使用する遺伝子ノックダウン戦略が使用されてもよい。ＡＬＫ発現をノックダウンする方法、およびＡＬＫ発現のノックダウンに適した分子の例が、米国特許公報20080279870、20080090776および20050005314から参照によって組み込まれる。さらに、当業者はＡＬＫ配列(GenBank identifier NM_004304)に基づいて、過度の実験なしにＡＬＫ発現ノックダウンのためのコンストラクトを設計することができるであろう。ある態様では、ベクターに基づくＲＮＡｉ様式（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒ発現コンストラクト）が、細胞で遺伝子（例えば、ＡＬＫ）の発現を減少させるために使用される。いくつかの態様では、本発明の治療上の組成物は、ｓｈＲＮＡなどの低分子干渉核酸を発現する単離プラスミドベクター（例えば、当該技術分野で既知または本明細書で開示された単離プラスミドベクターのいずれか）を含む。単離プラスミドは、小分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする遺伝子に、操作可能となるように結合した腫瘍特異的プロモーターを含んでもよい。ある場合には、単離プラスミドベクターは、個体に感染することが可能なウイルスに収められている。代表的なウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、および当該技術分野で既知および本明細書で開示される他のものを含む。
【００５５】
ｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドおよび／または改変したｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドなどの、広範囲のＲＮＡｉに基づく様式が、細胞で遺伝子の発現を阻害するために利用できるであろう。改変したｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドは、効力、ターゲットへの親和力、安全性のプロファイル、および／または、例えば細胞内分解に対して抵抗性または部分的に抵抗性にするために安定性を改変するように修飾したものである。例えば、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性、結合親和力、および／または取り込みを増加させるために、ホスホロチオエートなどの修飾を、オリゴヌクレオチドにすることができる。加えて、疎水化および生物共役化は、ｓｉＲＮＡの運搬およびターゲッティングを増強し(De Paula et al., RNA. 13(4):431-56, 2007)、リボ−ジフルオロトルイル（ribo-difluorotoluyl）ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、遺伝子発現抑制活性を維持する(Xia et al., ASC Chem. Biol. 1(3):176-83, (2006))。無修飾ｓｉＲＮＡよりＳ１ヌクレアーゼ分解に抵抗性のある、アミド結合オリゴリボヌクレオシドのｓｉＲＮＡが、産生された(Iwase R et al. 2006 Nucleic Acids Symp Ser 50: 175-176)。加えて、糖部２’位およびリン酸ジエステル結合でのｓｉＲＮＡの修飾は、有効性の失うことなく血清安定性を向上させる(Choung et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 342(3):919-26, 2006)。遺伝子（例えば、ＡＬＫ遺伝子）の発現阻害に使用することができる他の分子は、遺伝子、ＲＮＡ転写物、またはタンパク質を対象にするセンスおよびアンチセンス核酸（一本鎖または二本鎖）、リボザイム、ペプチド、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重らせん体形成オリゴヌクレオチド、抗体、およびアプタマーおよびそれらの修飾型を含む。アンチセンスおよびリボザイムの抑制戦略は、遺伝子産物の発現を減少させることにより、または、変異部位で変異転写物を切断することにより、腫瘍表現型の逆転をもたらした(Carter and Lemoine Br. J. Cancer. 67(5):869-76, 1993; Lange et al., Leukemia. 6(11):1786-94, 1993; Valera et al., J. Biol. Chem. 269(46):28543-6, 1994; Dosaka-Akita et al., Am. J. Clin. Pathol. 102(5):660-4, 1994; Feng et al., Cancer Res. 55(10):2024-8, 1995; Quattrone et al., Cancer Res. 55(1):90-5, 1995; Lewin et al., Nat Med. 4(8):967-71, 1998)。リボザイムはまた、変異遺伝子の遺伝子発現阻害およびターゲットトランススプライシングによる変異矯正の両方の手段として提案された(Sullenger and Cech Nature 371(6498):619-22, 1994; Jones et al., Nat. Med. 2(6):643-8, 1996)。リボザイム活性は、例えば、タンパク質または促進性オリゴヌクレオチドに結合する非特異的な核酸の使用によって増大する(Herschlag et al., Embo J. 13(12):2913-24, 1994; Jankowsky and Schwenzer Nucleic Acids Res. 24(3):423-9,1996)。マルチターゲットリボザイム（結合型またはショットガン型）は、リボザイムの遺伝子抑制効率を向上させる手段として示唆された(Ohkawa et al., Nucleic Acids Symp Ser. (29):121-2, 1993)。
【００５６】
三重らせん体アプローチは、配列特異的遺伝子抑制についても研究された。三重らせん体形成オリゴヌクレオチドは、ある場合には、配列特異的な方法で結合することがわかった(Postel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(18):8227-31, 1991; Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(2):504-8, 1992; Hardenbol and Van Dyke Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(7):2811-6, 1996; Porumb et al., Cancer Res. 56(3):515-22, 1996)。同様に、ペプチド核酸は、遺伝子発現を阻害することが示された(Hanvey et al., Antisense Res. Dev. 1(4):307-17, 1991; Knudsen and Nielson Nucleic Acids Res. 24(3):494-500, 1996; Taylor et al., Arch. Surg. 132(11):1177-83, 1997)。副溝結合ポリアミドは、配列特異的な方法でＤＮＡターゲットに結合することができ、したがって、ＤＮＡレベルでの抑制のための有用な小分子を代表しているかもしれない(Trauger et al., Chem. Biol. 3(5):369-77, 1996)。加えて、ドミナントネガティブ変異ペプチドおよび抗体を用いて、タンパク質レベルでの干渉により、抑制が得られた(Herskowitz Nature 329(6136):219-22, 1987; Rimsky et al., Nature 341(6241):453-6, 1989; Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(9):3199-203, 1989)。ある場合には、抑制戦略は、タンパク質の随伴する減少はなく、ＲＮＡレベルの減少をもたらした一方で、他ではＲＮＡの減少は、タンパク質の減少に反映した。利用可能である多様な一連の抑制戦略は、興味の対象となるタンパク質（例えば、ＡＬＫポリペプチド）をターゲットするために選択され得るＤＮＡアプタマーおよび／またはＲＮＡアプタマーの使用を含む。
【００５７】
本発明の側面は、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲまたはＲａｓなどの他の遺伝子の発現状態に関係なく、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合によって特徴づけられる癌の処置に関すると認められるべきである。いくつかの態様では、ＥＧＦＲインヒビター（例えば、ＥＧＦＲ活性、発現など、またはそれら組み合わせのいずれかのインヒビター）も、対象に推薦、処方、または投与される。いくつかのＥＧＦＲインヒビターの非限定例は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、およびＡＧ１４７８を含む。いくつかの態様では、化学療法剤も、対象に推薦、処方、および／または投与される。化学療法剤は、アルキル化剤、核酸（例えば、ＤＮＡ）損傷剤、または他の適した化学療法剤であってもよい。いくつかの態様では、化学療法剤は、白金に基づく化合物（例えば、シスプラチンまたは関連化合物）である。いくつかの態様では、１または２以上のＥＧＦＲインヒビター、１または２以上のＡＬＫキナーゼインヒビターおよび／または１または２以上の化学療法剤の組み合わせが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合に関連する症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有すると同定された対象に、推薦、処方、および／または投与されてもよい。
【００５８】
いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象は、ＥＧＦＲ変異を有するとも診断される。ある態様では、ＥＧＦＲ変異は活性化変異である。本明細書で使用されるように、ＥＧＦＲの活性化変異は、野生型ＥＧＦＲと比較して活性の増加をもたらすいずれのＥＧＦＲ変異である。例えば、ＥＧＦＲの活性化変異は、ＥＧＦＲの恒常的活性をもたらすかもしれない。いくつかの態様では、ＥＧＦＲシグナルの増加と関連する癌は、細胞外ドメイン内に欠失があるＥＧＦＲの変異型を発現していてもよい。ある態様では、変異型のＥＧＦＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩである。ある態様では、ＥＧＦＲシグナル活性の増加を生じる変異は、ＥＧＦＲシグナルの増加を起こすＥＧＦＲの細胞外ドメイン（例えば、細胞外ドメインをコードするＥＧＦＲ遺伝子の一部）での点変異、欠失、挿入、複製、逆位または他の変異のいずれか、またはそれら組合せのいずれかによって生じてもよい。ＥＧＦＲシグナルの増加をもたらす変異は、ＥＧＦＲの細胞内ドメイン内であってもまたよい（例えば、欠失、点変異、挿入、複製、逆位など、またはそれら組合せのいずれか）。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位およびＥＧＦＲ変異を両方有すると診断された対象は、ＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する、１または２以上の組成物の投与を介して処置されてもよい。いくつかの態様では、対象は手術および／または放射線治療も受ける。
【００５９】
いくかの態様では、処置される疾患は癌である。癌細胞は、正常な成育制御の喪失が原因で、異常に分裂および複製する細胞である。癌細胞は、ほとんど常に、少なくとも一つの遺伝子変異から生じる。「腫瘍（tumor）」の用語は、文字通りに「新たな成育」を意味する新生物（neoplasm）と通常等しく、「癌（cancer）」と互換的に使用される。「新生物の障害（neoplastic disorder）」は、細胞の増殖、特に新生物に関連するいずれかの障害である。「新生物」は、その出現を始めた発癌性因子を取り除いた後に、持続して増殖する組織の異常な集団である。良性および悪性の二つのタイプの新生物がある。ほとんどすべての良性腫瘍は、被包性および非侵襲性である。対照的に、悪性腫瘍はほとんど被包性ではないが、隣接する組織に、浸潤性の破壊的成育によって侵入する。この浸潤性の成育は、最初の腫瘍とは非連続的な部位に腫瘍細胞を移植することを伴う。本発明の方法は、本明細書に記載される他の各腫瘍と同様に、肉腫、細胞種、線維種、白血病、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、および神経膠腫を限定せずに含むヒトの新生物の障害の処置に使用できる。
【００６０】
本明細書で使用される「癌」は、身体臓器およびシステムの正常な機能を干渉する細胞の制御されない成育を言及する。最初の部位から転移し、臓器に接種する癌は、発症した臓器の機能的悪化を介して、最終的には対象の死をもたらす。白血病などの造血性の癌は、対象中の正常な造血性のカウンターパートを打ち負かすことができ、そのため（貧血、血小板減少症、および好中球減少症の形で）究極的には死の原因となる造血不全をもたらす。
【００６１】
転移腫瘍は、原発性腫瘍の部位とは異なり、原発性腫瘍から身体の他の部位への癌細胞の播種に起因する癌細胞の領域である。原発性腫瘍の集団の診断時に、対象は転移腫瘍の存在についてモニタリングされてもよい。転移腫瘍は、特異的な症候のモニタリングに加えて、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板数、肝臓機能調査、胸部Ｘ線、および骨スキャンの単独の使用または併用によって、もっともよく検出される。
【００６２】
癌は、限定せずに、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭および首の癌、胃癌、上皮内腫瘍、腎癌、喉頭癌、白血球、肝癌、肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽腫、口腔癌（例えば、唇、下、口、および咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系の癌を、他の細胞種および肉腫と同様に含む。いくつかの態様では、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）が、処置または診断される癌である。
【００６３】
ある側面では、癌を有する対象に本発明の組成物を投与することに関係し、癌を処置する方法が提供される。「癌を有する対象」は、癌と診断された対象である。いくつかの態様では、対象は固形腫瘤によって特徴づけられる癌のタイプを有する。存在する場合、固形腫瘤は、原発性腫瘤であってもよい。原発性腫瘤は、組織の正常な細胞から、変換に起因する癌細胞の組織での成育を言及する。ほとんどの場合、原発性腫瘤は、視覚的および触診の方法を通じて発見され得る嚢胞の存在によって、もしくは形状、手触りまたは組織の重量の不規則性によって、同定される。
【００６４】
しかしながら、いくつかの原発性腫瘍は触知できなく、Ｘ線（例えば、マンモグラフィー）などの医用画像の技法を通して、または針穿刺吸引によってのみ検出可能である。これら後者の技法の使用は、早期検出でより一般的である。組織内での癌細胞の分子および表現型の分析は、通常、癌が組織に対して内因性であるか、または病変はもう一つの部位からの転移が原因であるかを確認するだろう。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「癌医薬」は、癌の処置を目的として対象に投与される剤を言及する。本明細書で使用されるように、「癌の処置」は、癌の発生を防止すること、癌の症候を減少すること、および／または確立した癌の成育を阻害することを含む。他の側面では、癌医薬は、癌発生のリスクを減少させる目的で、癌発生のリスクにある対象に投与される。様々なタイプの癌の処置のための医薬が本明細書に記載される。癌医薬は、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、および生物学的応答修飾因子などのカテゴリーを包含する。癌医薬は、対象中の腫瘍または癌の負荷（すなわち、癌または腫瘍細胞の数）を減少するよりもむしろ、癌の症候を減少させるために、対象に投与する剤も含む。この後者のタイプの癌医薬の一つの例は、正常な範囲内で赤血球および／または血小板レベルを維持するために、癌を有する対象にする輸血である。例として、かかる輸血の非存在下では、正常なレベル以下の血小板の癌患者は、止血不能の出血のリスクにある。
【００６６】
癌医薬は、癌の処置を目的とした外科手術または放射線療法のいずれも言及しない。 本発明の多様な側面によると、いくつかの型のＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する組成物および癌医薬は、癌の処置を目的とした外科手術および／または放射線療法の後に投与されてもよい。手術および放射線照射は、まだ一般的に種々の癌を処置するために使用されている。ある場合には、手術は癌発生のリスクを減少させる予防方法にも使用される。この後者の手術の使用例として、乳癌発生のリスクのある対象、例えば、乳癌に対して家族性の傾向がある者は、その疾患の発生リスクを減少させるために、乳房の除去（すなわち、乳房切除）を時々受ける。そのうえ、例の部門に記載するように、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の試験を受けた複数の患者は、ＮＳＣＬ細胞種の外科的除去を受けた、または受ける予定である。
【００６７】
そのうえ、本発明の方法は、ＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する組成物とともに、１以上の癌医薬の使用を包含するように意図される。例として、適切な場合には、ＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する組成物は、化学療法剤および免疫療法剤の両方とともに投与されてもよい。代わりに癌医薬は、癌を有する、または癌発生のリスクのある対象を処置する目的で一つの対象にすべて投与される、免疫療法剤と癌ワクチン、または化学療法剤と癌ワクチン、または化学療法剤、免疫療法剤および癌ワクチンを包含してもよい。
【００６８】
本明細書で使用されるように、化学療法剤とは、癌細胞を直接ターゲットする化学的および生物学的な剤である。これら剤のいくつかは、持続生存に依存する癌細胞の細胞活性を阻害するように機能する。化学療法剤のカテゴリーは、アルキル化／アルカロイドの剤、代謝拮抗剤、ホルモンまたはホルモン類似体、および数々の抗悪性腫瘍剤を含む。
【００６９】
本発明による使用できる化学療法剤の例は、限定せずに、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、リュープロリド酢酸塩（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸塩、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸塩、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ、メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン、ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）およびビンデシン硫酸塩を含む。
【００７０】
ホルモン療法は、本明細書に開示する癌の処置方法と併用してもよい、もう一つの治療アプローチである。ホルモン療法は、癌を有する、または癌を有するリスクがある対象の処置における、ホルモンまたはホルモンの代替物および誘導体の使用を言及する。例は、エストロゲン療法、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール（例えば、乳癌および前立腺癌）、抗エストロゲン療法、例えば、タモキシフェン（例えば、乳癌）、プロゲスチン療法、例えば、メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール（例えば、乳癌および子宮内膜癌）、アンドロゲン遮断、例えば、フルタミドなどの抗アンドロゲン物質（例えば、前立腺癌）、副腎ステロイドを含む副腎皮質ステロイド（例えば、リンパ性白血病およびリンパ腫）、合成グルココルチコイド療法、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、およびデキサメタゾン（例えば、乳癌およびいくつかの中枢神経系腫瘍）、アンドロゲン、例えば、フルオキシメステロン（例えば、乳癌）、合成テストステロン類似体、アロマターゼインヒビター、例えば、アミノグルテチミド（例えば、乳癌）、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えば、リュープロリド（例えば、前立腺癌）、ソマトスタチン類似体、例えば、オクトレオチド（例えば、胃癌および膵癌）を含む。
【００７１】
生物学的応答修飾因子とは、癌細胞の直接の細胞毒性によることよりもむしろ、対象の癌に対する応答を変化させる剤である。例は、サイトカイン、例えば、Ｉ型インターフェロン（αおよびβ）、ＩＩ型インターフェロン（γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）、およびＴＮＦαおよびＴＮＦ−β、もしくは造血系増殖因子、例えば、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦを含む。
【００７２】
本発明の組成物は、有効量で投与されてもよい。有効量とは、医学的に望ましい結果の供給に十分な本発明組成物の投与量である。有効量は、処置される特定の症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）の発症を遅らせること、進行を阻害すること、発症または進行を一斉に停止することに必要な量を意味する。有効量は、症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）の１または２以上の兆候または症候を減少させる量であってもよい。対象に投与される場合、有効量は処置される特定の症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）、症状の重症度、対象それぞれのパラメーターであって、年齢、健康状態、大きさおよび体重を含むもの、併用する処置、処置の頻度、および投与方法に当然依存するだろう。これら因子は、当業者に周知であり、ただの日常的な実験に取り組まれることができる。
【００７３】
本発明組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象、組成物、および投与方法について、望ましい治療上の応答に達するのに効果的な本発明組成物の量を得るために変動し得る。選択される投与量レベルは、特定の組成物の活性、投与経路、処置される症状の重症度、症状、および処置される対象の前病歴に依存する。しかしながら、望まれる治療上の労力に達するのに必要な量より低い組成物の投与量から始めること、および望まれる効果を達成するまで徐々に投与量を増加することは、当該技術分野の範囲である。いくつかの態様では、低い投与量が、単一の組成物より、複数の組成物の組み合わせに要求されるであろう（例えば、異なるキナーゼを阻害する組成物と併用するＡＬＫキナーゼを阻害する組成物）。同様に低い投与量が、シングルターゲットインヒビターより、１以上のキナーゼを阻害するマルチターゲットインヒビターに要求される。
【００７４】
本発明の組成物は、いずれの適した経路によっても対象に投与され得る。例えば、組成物は経口的に投与でき、舌下に、直腸に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、（粉末、軟膏、または液滴によって）局所的および経皮的に、頬側に、または経鼻的に投与することも含む。本明細書で使用される「非経口的」投与の用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、乳房内、眼内、眼球後部、肺内、くも膜下腔内、皮下および関節内の注射および注入を含む、消化管経由以外の投与方法を言及する。例えば、脳内、腹腔内、脾膜下、または角膜内などの身体に本発明組成物を包埋することを含む、外科的移植も意図される。
【００７５】
本発明組成物の局所的投与の投薬形態は、本明細書に記載されるように、粉末、噴霧、軟膏、および吸入薬を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体およびいずれの必要とする保存剤、バッファー、または要求されるかもしれない噴霧剤（propellant）とともに、無菌条件下で混合される。
【００７６】
非経口的注射のための本発明の医薬組成物は、無菌の注射可能な溶液または分散液中へ、使用直前に再調整するための無菌粉末と同様に、薬学的に許容可能な無菌の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョンを含む。適した水性および非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同様のものなど）およびそれらの適した混合物、植物油（オリーブ油など）、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。例えば、レシチンなどのコーティング剤、分散液の場合には要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。
【００７７】
これら組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントも含むことができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール、および同様なものの多様な抗細菌および抗真菌剤を含むことにより、微生物作用の予防は保証される。糖、食塩、および同様のものなどの等張剤を含むことも望ましいかもしれない。注射可能な医薬剤形の持続的な吸収は、ステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅らせる剤を含むことにより、起こすことができる。
【００７８】
ある場合には、組成物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの組成物の吸収を遅らせることが望ましい。難水溶性の結晶性または非結晶性物質の液状懸濁液の使用によって、この結果は達成される。組成物の吸収率は、したがって溶解率に依存し、次には結晶の大きさおよび結晶形に依存するかもしれない。代わって、非経口的に投与する組成物形態の遅延した吸収は、油性ビヒクル中に組成物を溶解または懸濁させることによって達成される。
【００７９】
注射可能なデポの形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に組成物のマイクロエンカプセルマトリックスを形成することによって作られる。ポリマーに対する組成物の比率、およびに利用される特定のポリマーの性質に依存して、組成物の放出率が調節される。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドライド）を含む。デポ注射製剤は、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに、薬物を封入することによって調製される。
例えば、細菌保持またはウイルス保持フィルターを通して濾過することにより、または使用直前に滅菌水または無菌注射媒体中に溶解または分散可能な無菌固形組成物の剤形での滅菌剤を組み込むことによって、注射可能な製剤を滅菌することができる。
【００８０】
本発明は、本発明医薬組成物の経口投与の方法を提供する。経口固形投薬形態は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042)の８９章に一般的に記載される。経口投与のための固形投与形態は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、トローチまたはロゼンジ、カシェ、ペレット、および顆粒を含む。また、リポソーム被包またはプロテイノイド被包が（例えば、米国特許番号４，９２５，６７３で報告されるプロテイノイドマイクロスフィア）、本組成物の調製に使用することができる。当該技術分野で知られるように、リポソームは一般的に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体に分散する単層または多層状の液晶水和物によって形成される。リポソームを形成可能な、無毒性で、生理学的に許容可能な、および代謝可能な脂質のいずれかが使用される。リポソーム形態の本組成物は、本発明の組成物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤、および同様のものを含有する。好ましい脂質は、天然および合成両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p 33, et seqを参照。リポソーム被包は、多様なポリマーで誘導体化されたリポソームを含んでもよい（例えば、米国特許番号５，０１３，５５６）。一般的に、製剤は本発明の組成物、および胃の中での分解に対して保護および腸の中での生物学的に活性な物質の放出を可能とする不活性成分を含む。
【００８１】
かかる固形投薬形態では、組成物は少なくとも１の不活性で、薬学的に許容可能な賦形剤または担体と混合、または含むように化学修飾される。賦形剤または担体は、好ましくは（ａ）タンパク質分解の阻害、および（ｂ）胃または腸からの血流中への取り込みを可能とする。ある態様では、賦形剤または担体は、本発明組成物の取り込み、組成物の全体的な安定性、および／または身体での組成物の循環時間を増加する。賦形剤および担体は、例えば、クエン酸ナトリウム、または無水リン酸水素カルシウム、および／または（ａ）第三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどの無機塩、およびFAST-FLO（登録商標）、EMDEX（登録商標）、STA-RX 1500（登録商標）、EMCOMPRESS（登録商標）およびAVICEL（登録商標）などの市販の希釈剤と同様に、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、セルロース、修飾デキストラン、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、（ｂ）例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ガム類（例えば、アルギン酸、アカシア）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、およびスクロースなどの結合剤、（ｃ）グリセロールなどの保湿剤、（ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸、炭酸ナトリウム、デンプンに基づく市販の崩壊剤を含むデンプン、EXPLOTAB（登録商標）、グリコール酸ナトリウムデンプン、AMBERLITE（登録商標）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、ゼラチン、橙皮、カルボキシメチルセルロース、天然海綿、ベントナイト、不溶解性カチオン交換樹脂、および寒天、カラヤまたはトラガントなどの粉末ガム類などの崩壊剤、（ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤、（ｆ）第四級アンモニウム化合物もしくはオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの脂肪酸などの吸収促進剤、（ｇ）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、アニオン性界面活性剤であって、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムを含むもの、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムをなどのカチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤であって、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリンサングリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むもの、などの湿潤剤、（ｈ）カオリンおよびベントナイト粘度などの吸収剤、（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＴ）、流動パラフィン、植物油、ワックス、CARBOWAX（登録商標）4000、CARBOWAX（登録商標）6000、ラウリル硫酸マグネシウム、およびそれら混合物などの潤滑剤、（ｊ）デンプン、タルク、焼成シリカ、およびケイアルミン酸水和物を含む、調製時に薬剤の流動性を向上させ、圧縮時に再構成を援助する流動促進剤。カプセル、錠剤、およびピルの場合には、投薬形態はバッファーも含むことができる。
【００８２】
同様のタイプの固体組成物は、高分子ポリエチレングリコールなどと同様にラクトースまたは乳糖などの賦形剤を用いて、軟および硬ゼラチンカプセルの充填剤として利用できる。
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒の固形投与形態は、腸溶性コーティングおよび製剤技術分野で既知である他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができる。それらは任意に、乳白剤（opacifying agent）を含むことができ、任意に遅らせる方法で、活性成分を腸管の一部のみに、または優先的に解放する組成物にもなり得る。代表的な物質は、EUDRAGIT（登録商標）として入手可能な物質などのｐＨ感受性の溶解度を有するポリマーを含む。使用可能な包埋する組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。
【００８３】
適切な場合、本発明の組成物は、１または２以上の上述の賦形剤と、マイクロカプセルの形態にすることができる。経口投与用の液体投与形態は、薬学的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。本発明の組成物に加えて、液体投与形態は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３− ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、およびそれら混合物などの、可溶化剤および乳化剤を含有することができる。
【００８４】
不活性希釈剤のほかに、経口組成物は、そのような、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、着色料、香料、および芳香剤などのアジュバントも含むことができる。経口組成物は処方され、さらに飲料などの食用の製品を含むことができる。本発明の組成物に加えて、懸濁液は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガント、およびそれら混合物などの懸濁剤を含有することができる。
【００８５】
本発明組成物の肺送達もまた、本明細書で意図される。組成物は、吸引しながら哺乳動物の肺へ送られ、それにより肺の上皮層から血流へのトラバースを促進する。Adjei et al., Pharmaceutical Research 7:565-569 (1990)；Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (leuprolide acetate)；Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl.5): s.143-146 (1989)(endothelin-1)；Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3:206-212 (1989)(a1-antitrypsin)；Smith et al., J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (a1-proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins," Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (recombinant human growth hormone)；Debs et al., The Journal of Immunology 140:3482-3488 (1988) (interferon-g and tumor necrosis factor a)、およびPlatz et al., 米国特許番号５，２８４，６５６（顆粒球コロニー刺激因子）を参照。
【００８６】
限定せずに、当業者によく知られているネブライザー、定量噴霧式吸入器、および粉末吸入器を含む、治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械装置が、本発明の実践での使用について意図される。ある本発明の実践に適した市販装置のある特定の例は、Mallinckrodt, Inc.（St. Louis, MO）製のULTRAVENT（登録商標）ネブライザー、Marquest Medical Products（Englewood, CO）製のACORN II（登録商標）ネブライザー、Glaxo Inc.（Research Triangle Park, N.C）製のVENTOL（登録商標）定量噴霧式吸入器、およびFisons Corp.（Bedford, MA）製のSPINHALER（登録商標）粉末吸入器である。
【００８７】
かかるすべての装置は、本発明組成物の投薬に適した製剤の使用を要求する。典型的には、各製剤は、利用する装置のタイプに特異的であり、治療に有用な希釈剤、アジュバント、および/または担体に加えて、適切な噴霧剤物質の使用に関係する。末端の肺への最も効果的な送達のために、組成物は、好ましくは１０ｍｍ以下の平均粒径で、最も好ましくは０．５〜５ｍｍで、粒子の形態に調製してもよい。
【００８８】
担体は、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトールなどの炭水化物を含む。製剤に使用する他の成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどの脂質、天然または合成界面活性剤、ポリエチレングリコール（阻害剤自体を誘導体化するその使用から離れても）、サイクロデキストランなどのデキストラン、胆汁酸塩、および他の関連するエンハンサー、セルロースおよびセルロース誘導体、およびアミノ酸を含む。
加えて、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフィア、複合体、包接錯体（inclusion complex）、または他のタイプの担体の使用が意図される。
【００８９】
噴射や超音波のネブライザーいずれかの使用に適した製剤は、典型的には、ｍＬ当たりの溶液につき、約０．１〜２５ｍｇの生物学的活性のタンパク質濃度で水に溶解した本発明の組成物を含む。製剤は、バッファーおよび単糖も含むことができる（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のために）。ネブライザー製剤は、エアロゾルを形成する溶液の噴霧によって起こる、インヒビター組成物の表面誘導の凝集を減少または防止するための界面活性剤を含有することができる。
【００９０】
一般的に、定量噴霧式吸入器で使用する製剤は、界面活性剤の助けを借りて噴霧剤に懸濁した本発明の組成物を含有する微粉末を含む。
噴霧剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせを含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素などの、この目的のために利用するいずれの従来物質になり得る。適切な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン、大豆レシチンを含む。オレイン酸は、界面活性剤としても有用になり得る。
粉末吸入器から投薬するための製剤は、本発明の組成物を含有する乾燥微粉末を含み、装置から粉の拡散を容易にする量（例えば、製剤の重量の５０〜９０％）のラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールなどの増量剤を含むことができる。
【００９１】
本発明組成物の鼻腔内送達もまた、意図される。鼻腔内送達は、肺において製品を蒸着を必要とせずに、鼻に治療薬を投与後、血流への組成物の通過を直接可能にする。鼻腔内送達のための製剤は、デキストランまたはサイクロデキストランのものが含まれる。他の粘膜を通る輸送を介しての送達もまた、意図される。
【００９２】
直腸または膣投与のための組成物は、好ましくは本発明の組成物と、室温で固体であるが体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤または担体とを混合することにより、調製され得る坐剤である。
【００９３】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の検出のために、染色体調製物でＦＩＳＨアッセイを行うためのキットも、本発明の範囲内にある。かかるキットの例は、核酸プローブのセットを含んでもよく、第一のプローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、そのプローブはＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、そのプローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズし、第二の核酸プローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、そのプローブは非逆位型のＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、そのプローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズする。キットは、染色体調製物でＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行うための第一および第二のプローブの使用についての説明書を、さらに含んでもよい。キットは、癌患者由来の染色体調製物で、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の陽性同定がＮＳＣＬＣの陽性診断を示す、診断目的の説明書をさらに含んでもよい。キットは、癌患者由来の染色体調製物でのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の陽性同定が、患者をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきであることを示す説明書をさらに含んでもよい。
【００９４】
いくつかの態様では、キットはＤＡＰＩなどのＤＮＡ対比染色剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、キットはハイブリダイゼーションバッファーおよび／または洗浄バッファーを限定することなく含む、試薬およびバッファーをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、キットは封入剤および／またはコントロールスライドをさらに含んでもよい。
【００９５】
他の態様では、本発明のキットは、癌または前癌性症状の治療計画を決定するために有用であるかもしれない。例えば、生物学的試料は、ＮＳＣＬＣを有する対象から摂取してもよく、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物への応答をインビトロで試験してもよい。インビトロアッセイに対する陽性応答は、対象がＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物のインビボでの投与に応答するであろうという、正の指標としてとられてもよい。かかるキットの例では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物、および生物学的試料がＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物での処置に応答するかを決定するために、組成物を生物学的試料で試験するための説明書を含む。
【００９６】
本発明のキットは、癌の処置に有用であってもよい。かかるキットの例は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物、および癌の処置のための１または２以上の組成物の使用についての説明書を含んでもよい。本発明の側面は、本明細書に記載する１または２以上のインヒビターでの同時処置に関する。したがって、本発明の側面は、本明細書に記載される２またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）インヒビターの組み合わせを含む、キットまたは組成物に関する。
【００９７】
本発明のキットは、本明細書に開示するいずれの生物学的または化学的メカニズムへの関与のための組成物使用の記載を含む。キットは、症状の徴候に対抗するように、病理を処置する活動条件の記載を、さらに含むことができる。すなわち、キットは本明細書で考察する組成物の使用の記載を含む。キットは、２またはそれ以上の本発明組成物の組み合わせの使用についての説明書、または本発明組成物および癌の処置についての治療計画を決定するため、または癌の処置について示される１または２以上の他の化合物の組み合わせの使用についての説明書を含むことができる。説明書はまた、以前に記載された適した技法のいずれかによって組成物を投与するために提供されてもよい。
【００９８】
本明細書に記載されるキットはまた、１または２以上の容器を含んでもよく、組成物および以前に記載された他の成分を含んでもよい。キットはまた、ある場合には、本発明の組成物を混合、希釈、および／または投与または適用のための説明書を含んでもよい。キットはまた、試料中で、またはかかる処置の必要な対象に、成分を混合、希釈または投与するための容器と同様に、１または２以上の溶媒、界面活性剤、保存剤および／または希釈剤（例えば、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）または５％デキストロース）とともに他の容器を含むことができる。
【００９９】
キットの組成物は、例えば、液状の溶液または乾燥粉末として、いずれかの適した形態として提供されてもよい。提供される組成物が乾燥粉末である場合、組成物は適した溶媒の添加によって再構成されてもよく、提供もまたされてもよい。組成物の液状形態が使用される態様では、液状形態は濃縮またはすぐに使用可能な状態であってもよい。溶媒は、組成物および使用方法または投与方法に依存するだろう。薬物組成物のための適した溶媒は、例えば、以前に記載されたように周知であり、文献で利用可能である。溶媒は、組成物および使用方法または投与方法に依存するだろう。
【０１００】
本発明による有用なキットの例が、図７に示される。キット（１１）は、核酸プローブセット（１７および１９）およびそれら使用の説明書（２１）などの成分を収容する容器（１５）を示す。
【０１０１】
本発明は、続く例によってさらに説明され、さらに限定すると解釈されるべきではない。本出願を通じて引用されるすべての参照（参考文献、交付済み特許、公開済み特許出願、および係属中の特許出願を含む）の内容全体が、これに明確に参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
例
例１
肺癌におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位およびＡＬＫキナーゼ阻害に対する感受性
染色体２ｐの逆位に起因するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、〜７％の日本人の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において最近検出された。この遺伝的変化も、インビトロおよびインビボで癌化させていた。米国人（ｎ＝１３８）および韓国人（ｎ＝１６７）の患者由来のＮＳＣＬＣ（ｎ＝３０５）における、およびＮＳＣＬＣ細胞株（ｎ＝８３）におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの頻度が、現在の研究で検討された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの４種の異なる変異体が、８人（３％）のＮＳＣＬＣ（米国人のＮＳＣＬＣ患者から２／１３８（１．５％）、韓国人患者から６／１６７（３．６％））、および３／８３（３．６％）のＮＳＣＬＣ細胞株において、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検出された。すべてのＥＭＬ４−ＡＬＫ含有腫瘍および細胞株は腺癌であり、未または軽（１０パック年（pack years）以下）タバコ喫煙者であるＮＳＣＬＣ患者で、現在／元喫煙者と比較してより頻繁に発生した（６％対１％；ｐ＝０．０４９）。非常に特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターであるＮＶＰ−ＴＡＥ６８４の有効性は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位があるＮＳＣＬＣ細胞株で検討された。３種の細胞培養株のすべてにおいてＡＬＫのリン酸化が阻害されたにもかかわらず、３種の細胞株のうち１種の成育のみが、Ｈ３１２２がＮＶＰ−ＴＡＥ６８４によって阻害され、これは顕著なアポトーシスを伴った。他の２種のＥＭＬ４−ＡＬＫ含有細胞株においては、Ｈ３１２２とは異なり、ＡＬＫのリン酸化阻害は、ＡＬＫ、ＳＴＡＴ３またはＥＲＫ１／２リン酸化阻害をもたらさないか、部分的にのみもたらした。これらの研究は、ＡＬＫ阻害剤は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を抱える肺癌のサブセットのための潜在的に効果的な治療であり、さらに臨床開発を支援するかもしれないことを示唆する。
【０１０３】
材料と方法
細胞株および腫瘍
肺癌細胞株（８０種のＮＳＣＬＣ、２種の中皮腫、および１腫の神経内分泌腫瘍株）は、ＡＴＣＣ(Manassas, VA)から購入され、またはJohn D. Minna博士およびAdi F. Gazdar博士(UT Southwestern, Dallas, TX)より受け取った（表１）。ダナ・ファーバー癌研究所で、２種の追加のＮＳＣＬＣ細胞株（ＤＦＣＩ０２４、ＤＦＣＩ０３２）が、未処置の喫煙未経験の女性ＮＳＣＬＣ患者の胸水から樹立された。
【０１０４】
ＮＳＣＬＣ腫瘍標本（ｎ＝３０５）は、ＲＮＡ抽出に十分な材料が入手可能である外科的切除から回収した。癌のステージ分類は、ＩＡＳＬＣステージ分類ガイドラインに従って行われた。腫瘍は、２００４ＷＨＯ分類システムによって分類した。７０％以上の腫瘍細胞含量のある凍結腫瘍組織が、さらなる分析に使用された。加えて、手術前ネオアジュバント治療を受けた患者、手術から１月以内に死亡した患者、二重の原発性肺癌のある患者、胸水または胸膜播種のある患者、および不完全な切除を受けた、または縦隔リンパ節郭清を受けなかった患者の腫瘍組織は、研究から除外された。 標本の大部分（ｎ＝１６７）が、１９９５〜２００７年の間に韓国のサムスンメディカルセンターで回収された一方で（韓国人コホート）、残りの標本（ｎ＝１３８）は、マサチューセッツ州ボストンのブリッガム女性病院で回収され（米国人コホート）、以前に公表された（１４〜１６）。
【０１０５】
腫瘍および細胞株標本は、急速冷凍され、−８０℃で保存された。ＲＮＡは、Trizol(Invitrogen, Carlsbad、CA)で抽出され、Rneasy Mini Kit (Qiagen、Valencia、CA)で精製された。０．５〜１μｇの全ＲＮＡは、QuantiTect逆転写キット(Qiagen, Valencia, CA)でのｃＤＮＡ合成に使用された。
【表１】
【表２】
【表３】
【０１０６】
エクソンアレイ試験
肺癌細胞株におけるＡＬＫの転座をスクリーニングするために、これら細胞株由来のｍＲＮＡから以前に産出した現存のAffymetrix HuEx-1.0 Exon Array (Affymetrix, Santa Clara, CA)のデータを使用した。プローブが全転写物の３’末端に制限されている典型的なｍＲＮＡ発現アレイとは異なり、HuEx-1.0アレイはヒトゲノムのすべての既知および予測されたエクソンに位置するプローブを含有するように設計された。ＡＬＫ遺伝子の転座は、３’末端（キナーゼドメイン）におけるより高い発現で、異なるレベルの発現量が切断点の５’側と３’側のエクソンとの間で生じると考えられた。全プローブについてのアレイのノーマライズおよびバックグラウンド補正を行った後、分析はＡＬＫ遺伝子（参照配列ＮＭ＿００４３０４）にユニークに位置する１０４のプローブに制限した。その遺伝子全域のプローブの応答特性の違いを補正するために、全試料について、プローブ強度値は他の野生型標本全域の平均プローブ強度で割った。各細胞株について、切断点である可能性の最も高い位置は、５’と３’とのプローブサブセット間の平均発現量の最大偏差を与えるプローブとして算定された。各推測切断点についての有意水準が、単純両側ｔ検定を用いて計算された。
【０１０７】
ＲＴ−ＰＣＲおよび変異分析
ＥＭＬ４−ＡＬＫのＲＴ−ＰＣＲ解析については、ＥＭＬ４−ＡＬＫを最初に記載した論文で使用した同一のプライマー配列（プライマーセット１）が用いられた（９）。プライマーセット１では、フォワードプライマーはＥＭＬ４のエクソン１３に位置する一方で、リバースプライマーはＡＬＫのエクソン２０に位置する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合は、ＥＭＬ４のエクソン６とＡＬＫのエクソン１９との間でも起こり得る（変異体３）（Mano H. 未発表）。ここで、プライマーは、プライマーセット１では失敗するため、ＥＭＬ４のエクソン３におけるフォワードプライマー(5’-taccagtgctgtctcaattgcagg- 3’) （配列番号３）を有し、プライマーセット１と同一のリバースプライマーを使用する追加のプライマーセット（プライマーセット２）を使用した。ＰＣＲ増幅は、製造元のガイドラインに基づいて、JumpStart Taq酵素(Sigma, St. Louis, MO)を用いて行った。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１０８】
ＮＳＣＬＣ腫瘍については、ＫＲａｓまたはＥＧＦＲの遺伝子型同定は、ＲＴ−ＰＣＲに基づくSURVEYOR-WAVE変異分析（１７）を用いて行い、その後、陽性標本の配列決定、またはＲＴ−ＰＣＲ産物の直接の配列決定を行った。ＤＦＣＩ０３２細胞株の変異分析は、ＥＧＦＲ、ＫＲａｓ、Ｂ−Ｒａｆ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＨｅｒ２における既知の変異を抱える特異的なエクソンについてのプライマーとともに、ゲノムＤＮＡに基づくSURVEYOR-WAVE分析を用いて行った。
【０１０９】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１−６６７Ｉ６およびＲＰ１１−１００Ｃ１（オークランド小児病院研究所、Oakland、CA）を、それぞれＥＭＬ４遺伝子およびＡＬＫ遺伝子のプローブとして使用した。ＢＡＣクローンは、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート状にそれぞれストリークし、３７℃、オーバーナイトで生育させた。各ＢＡＣクローン由来の一つのコロニーが選択され、ＴＢ中で３７℃、オーバーナイトで生育させ、確立した手法を用いてＢＡＣ ＤＮＡを抽出した。
【０１１０】
中期ＦＩＳＨのためのスライドは、標準の細胞遺伝学的な手法を用いて調製した。パラフィン包埋スライドは、６０℃のホットプレート上にオーバーナイトでインキュベートし、その後室温でそれぞれ２分間、２回キシレン処理に曝した。組織は、その後１００ｍＭトリス塩基／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）中に１００℃で４５分間置き、室温で５〜１０分間１×ＰＢＳですすいだ後、１５０ｍＬのDigest-All(Zymed, San Francisco, CA)で３７℃、２０分間の処理を２度した。スライドは、室温で５〜１０分間１×ＰＢＳですすぎ、その後室温で１分間、１０％ホルマリン中で固定した。最後に、組織は７０％、９０％、および１００％の一連のエタノールでそれぞれ２分間脱水した。
【０１１１】
ＲＰ１１−１００Ｃ１ ＢＡＣ ＤＮＡ（１μｇ）は、製造元の推薦プロトコルを用いて、ニックトランスレーションによってspectrum red dUTP(Vysis, Des Plains, IL)で標識し、１μｇのＲＰ１１−６６７Ｉ６ＢＡＣ ＤＮＡは、ニックトランスレーションによってspectrum green-11-dUTP(Vysis, Des Plains, IL)で標識した。プローブは、５０μｇのCot-1 DNAと組み合わせ、エタノール沈殿し、および２０μｌの５０％ホルムアミド含有hybrizolに再懸濁した。プローブは、標準のＦＩＳＨ手順に従って（１８）、ハイブリダイズおよび洗浄した。
【０１１２】
ＡＬＫキナーゼインヒビター
ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４は、強力で特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターであり、ダナ・ファーバー癌研究所のN. Gray博士によって合成された（１２、１９、２０）。ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４は、特許で公開されている手順に従って合成し、得られた化合物の構造および純度は、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて確認した。
【０１１３】
細胞増殖および成育アッセイ
成育および成育阻害は、メトキシテトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイによって評価した。生存細胞の数を決定するための比色法であるこのアッセイは、細胞による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）の、細胞培養培地中に可溶なホルマザン産物への生体内還元に基づき、分光測定で検出可能である。ＮＳＣＬＣ細胞は７２時間の処理に曝し、実験あたりに使用した細胞の数を経験的に決定した。全実験ポイントは、６から１２のウェルで設定し、全実験は少なくとも３回繰り返した。データは、Windows（登録商標）用GraphPad Prism version 3.00を用いて図示された（GraphPadインターネットサイトで利用可能なGraphPad Software）。曲線は、Ｓ字用量反応とともに非線形回帰モデルを用いてフィットさせた。
【０１１４】
抗生物質およびウェスタンブロッティング
以前に特定した条件下で成育した細胞は、製造元のガイドラインに基づいて、Cell Lysis Buffer(Cell Signaling Technologies, Danvers, MA)を用いて溶解した。細胞溶解後、ライセートは４℃、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清が続く手順に使用された。ウェスタンブロット解析は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動およびニトロセルロース膜への転写によって分離した後に行った。免疫ブロッティングは、抗体製造元の推薦に従って行った。 抗体の結合は、増強化学発光システムを用いて検出した(Perkin Elmer, Boston, MA)。 抗ＡＬＫ、抗リン酸化ＡＬＫ（Ｔｙｒ−１６０４）、抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ−４７３）、抗Ａｋｔ、抗ＳＴＡＴ３、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）、抗ＰＴＥＮ、および抗ＰＡＲＰ抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から得られた。全ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＴ１８５／ｐＹ１８７）抗体は、Biosource International (Camarillo, CA)から購入した。抗α−チューブリン抗体は、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。
【０１１５】
蛍光標識細胞分取分析
細胞は回収し、少なくとも１時間（または実験の準備が整うまで）４０％エタノールで固定した。固定した細胞は、０．５ｍＬの５００ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡで、３７℃、４５分間処理し、６９ｍｍｏｌ／Ｌヨウ化プロピジウム（３８ｍＭクエン酸ナトリウム中）で、少なくとも３０分間、暗所で室温にて染色した。染色細胞は、ModFit(Verity Software House, Topsham, ME)およびCellQuest(Becton Dickinson, San Jose, CA)プログラムの両方を用いて、Becton Dickinson蛍光標識細胞分取器中でＤＮＡ含量について分析した。
【０１１６】
結果
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の同定
８３種の肺癌細胞株のパネル（表１）を潜在的なＡＬＫの転座について迅速にスクリーニングするために、以前にこれら細胞株由来のｍＲＮＡから産生した現存のAffymetrix HuEx-1.0 Exon Arrayデータを使用した。ＡＬＫ遺伝子の転座は、３’末端（キナーゼドメイン）におけるより高い発現で、異なるレベルの発現量が切断点の５’側と３’側のエクソンとの間で生じると考えられた。各細胞株について、切断点である可能性の最も高い位置は、５’と３’とのプローブサブセット間の平均発現量の最大偏差を与えるプローブとして算定された。
【０１１７】
この方法を用いて、ＡＬＫ遺伝子において統計学的に有意な切断点を有する２種の細胞株、Ｈ３１２２およびＨ２２２８が同定された（ｐ<０．００１）（図１Ａおよび図５）。使用したアルゴリズムは、切断点の位置または方向を考慮しなかったが、両試料の推測ＡＬＫ切断点は、ＡＬＫ遺伝子における保存されたエクソン２０の切断点と非常に近く、両試料中で、発現は５’末端より３’末端でより高かった。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、融合遺伝子産物の存在は、Ｈ３１２２およびＨ２２２８の両方で確認されたが、他の８１種の細胞株においては確認されなかった。Ｈ３１２２においては、ＲＴ−ＰＣＲプライマーセット１（ＥＭＬ４のエクソン１３におけるフォワードプライマー、ＡＬＫのエクソン２１におけるリバースプライマー）は、〜２５０ｂｐの産物を産生した一方で、Ｈ２２２８細胞株では、プライマーセット２（ＥＭＬ４のエクソン３でのフォワードプライマー、ＡＬＫのエクソン２１におけるリバースプライマー）は、〜４５０ｂｐの産物を産生した（図１Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、サンガー塩基配列決定法によって確認し、Ｈ３１２２におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの変異体１およびＨ２２２８における変異体３の存在を示した。他の融合変異体には存在しない選択的にスプライシングした３３ｂｐ断片（エクソン７ａ）が、この細胞株において検出された（図１Ｃ、表２）。Ｈ３１２２およびＨ２２２８の両細胞株は、腺癌の組織診断のある女性ＮＳＣＬＣ患者から樹立し、およびＨ２２２８細胞株は喫煙の未経験者由来であるため、スクリーニングは、これらのダナ・ファーバー癌研究で確立した臨床的特徴とともに、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの存在について行った。ＤＦＣＩ０２４およびＤＦＣＩ０３２の２種の細胞株が同定され、両方とも腺癌のある化学療法未処置の喫煙未経験者由来であった。両細胞株は、ＥＧＦＲおよびＫｒａｓについて野生型であった。プライマーセット２を用いるＲＴ−ＰＣＲで、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、ＤＦＣＩ０３２細胞株で検出された（図１Ｂ）。したがって、すべてあわせて、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位が、３／８３（３．６％）のＮＳＣＬＣ細胞株で検出された。
【０１１８】
表２ 融合変異体３で検出された選択的にスプライシングしたＥＭＬ４のエクソン７ａについての配列
【数１】
【０１１９】
ＮＳＣＬＣ腫瘍によけるＥＭＬ４−ＡＬＫ
米国人（ｎ＝１３８）および韓国人（ｎ＝１６７）起源の患者由来のＮＳＣＬＣ（ｎ＝３０５）腫瘍は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲを用いてスクリーニングされた。融合遺伝子の発現は、プライマーセット１で、４種の腫瘍において検出された（図１Ｂ）。２種の腫瘍は、〜２５０ｂｐの大きさのＲＴ−ＰＣＲ産物を有していた一方で、他の２種は、〜４５０ｂｐの大きさの産物を有していた。〜２５０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を有する腫瘍は、変異体１の融合遺伝子を有することをサンガー塩基配列決定法で確認した一方で、より大きな産物の腫瘍は、以前に公表されていない変異体の融合遺伝子（以後、変異体４と命名）を有していた。変異体４の融合遺伝子は、ＥＭＬ４コドン１−５６９がＡＬＫのコドン１０７８−１６２１に融合する（図１Ｃ、表３）。腫瘍はプライマーセット２でもスクリーニングされ、追加４種の腫瘍が、遺伝学的変化に陽性と検出された（図１Ｂ）。これらすべては、変異体３のＥＭＬ４−ＡＬＫを含有することがサンガー塩基配列決定法によって確認された。選択的にスプライシングしたＥＭＬ４のエクソン７ａは、すべての腫瘍においても存在したので、この発見はＨ２２２８細胞株だけに限定していなかったことを示唆する。腫瘍は、結腸腺癌由来の９種の肺転移腫瘍も含み、興味深いことに、これらの一つは、変異体１のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を含んでいた。
【０１２０】
表３ ＲＴ−ＰＣＲプライマーセット１でのＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体４の配列
【数２】
【０１２１】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、３０５人中８人（３％）のＮＳＣＬＣ腫瘍で検出された（図４）。６つの陽性（６／１６７； ３．６％）が、韓国人患者由来の腫瘍で検出された一方で、２つ（２／１３８（１．５％））が、米国人患者由来のＮＳＣＬＣで検出された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの頻度は、男性（２％）に対して女性（４％）でより高かった。ＥＭＬ４−ＡＬＫを含有するＮＳＣＬＣのＮＳＣＬＣ患者は、野生型腫瘍の患者（６１．９歳）より若い年齢中位数（５５．９歳）を有していた。ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性腫瘍の全８種は、腺癌であった。さらに、融合遺伝子は、喫煙者由来の腫瘍（１％；２／１８４）と比較して、制限された喫煙歴（＜１０パック年）の患者でより頻繁に（６％；４／６９）有意に（ｐ＝０．０４９；表４）検出された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の患者２人からは、喫煙情報が入手不可能であった。患者１人由来の腫瘍は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子とともに、同時発生的ＥＧＦＲキナーゼドメイン変異（エクソン１９欠失）を有していた。この患者は、手術を単独で処置され、ＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるゲフィチニブまたはエルロチニブのどちらでも処置されなかった。８種の腫瘍は、いずれも同時発生的Ｋ−Ｒａｓ変異を含んでいなかった。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
ＦＩＳＨを用いるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出
ＲＴ−ＰＣＲおよび長距離ゲノムＰＣＲは、細胞株および／または新鮮腫瘍標本からＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出に適用可能な方法である。しかしながら、大多数の臨床的ＮＳＣＬＣ腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本であり、いずれの方法もＦＦＰＥからＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するのには実現可能ではない。加えて、現在利用可能なＡＬＫのための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブは、小さな染色体の逆位を検出するのに十分な解像度を有しないかもしれないブレークアパートプローブである(Vysis LSI ALK dual color, break apart rearrangement probe, Vysis Inc.)。したがって、既知の５’側のＥＭＬ４切断点（緑色）および既知の３’側のＡＬＫ切断点（赤色）にハイブリダイズするＦＩＳＨプローブが設計された。野生型ゲノムの場合には、プローブは２つの別々のドットに可視化する一方で、逆位および融合の場合には（いずれの変異体でも）、ドットは単一のシグナル（黄色）に併合するはずである（図５）。
【０１２４】
ＦＩＳＨプローブは、最初にＥＭＬ−ＡＬＫ融合遺伝子のある、またはないＮＳＣＬＣ細胞株を用いて検討した。野生型細胞株ＰＣ−９（図３Ａ）およびＡ５４９においては、プローブのシグナルは、２つの別々のドットで見られた。ＤＦＣＩ０３２（図３Ｃ）およびＨ３１２２においては、プローブは、染色体対の１つでＥＭＬ４のＡＬＫへの融合を検出した一方で、他の対は野生型シグナルを示した。興味深いことに、Ｈ２２２８細胞株においては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、小さな染色体外断片において検出された（図３Ｂ）。ＦＩＳＨ法は細胞株においてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を検出可能であったので、次にその方法がＦＦＰＥ標本に使用できるかを調査した。胸水がＤＦＣＩ０３２細胞株を樹立するのに使用された患者からの診断の時点に得られたＦＦＰＥ腫瘍標本が検討された。このＦＦＰＥ腫瘍標本においては、間期の核におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合が、明確に検出された（図３Ｄ）。
【０１２５】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子含有ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＬＫキナーゼ活性の阻害
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を記載する最初の研究においては、ＡＬＫキナーゼインヒビター（ＷＨＩ−１５４）は、融合癌化したＢａ／Ｆ３モデルで成育阻害を誘導することが示された（９）。したがって、融合遺伝子を保有するＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＬＫキナーゼインヒビターの効果を試験した。非常に特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターであるＮＶＰ−ＴＡＥ６８４が調べられた（１２）。
【０１２６】
ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４は、Ｈ３１２２細胞株のみ成育を有意に阻害する一方で（ＩＣ５０ 〜１０ｎＭ）、他の２種のＥＭＬ４−ＡＬＫ含有細胞株であるＨ２２２８およびＤＣＩ０３２は、ＥＧＦＲ変異（ＰＣ−９；欠失Ｅ７４６＿Ａ７５０）またはＫ−Ｒａｓ変異（Ａ５４９；Ｇ１２Ｓ）を含むものと同様にその阻害剤に抵抗性（ＩＣ５０ １〜１０μＭ）であることがわかった（図３Ａ）。ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処置はまた、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって（図３Ｂ）、または切断ＰＡＲＰのウェスタン解析によって検出されたように（図３Ｃ）、Ｈ３１２２細胞株のみで顕著なアポトーシスをもたらした。成長停止またはアポトーシスは、ＴＡＥ６８４処理後に他の細胞株においては観察されなかった。
【０１２７】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ含有細胞株の３種中１種のみの成育がＴＡＥ−６８４によって阻害された理由を特定するために、ＡＬＫのリン酸化および下流シグナル伝達タンパク質に及ぼす影響を検討した。全ＡＬＫおよびリン酸化ＡＬＫの両方が、すべてのＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性細胞株（Ｈ３１２２、Ｈ２２２８、およびＤＦＣＩ０３２）において存在していたが、ＥＧＦＲ変異のＰＣ−９細胞株においては非存在であった（図４）。０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処置後、リン酸化ＡＬＫの完全な下方制御が、ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性細胞の全３種で観察された。しかしながら、これはＨ３１２２細胞株においてのみ、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２リン酸化の実質的な阻害を伴った。Ｈ２２２８細胞株においては、いくつかだが完全ではないＡｋｔおよびＥＲＫ１／２リン酸化の阻害があった一方で、これらはＤＦＣＩ０３２細胞株では変化していなかった。これら発見を説明するＥＧＦＲ、Ｋｒａｓ、Ｂ−Ｒａｆ、ＨＥＲ２またはＰＩＫ３ＣＡの同時発生的変異は、この細胞株においては検出されなかった（データ非表示）。さらに、ＤＦＣＩ０３２細胞株は、ＰＴＥＮを発現した（図４）。融合遺伝子におけるＡＬＫキナーゼドメイン配列の変化は、Ｈ２２２８またはＤＦＣＩ０３２からは検出されなかった（データ非表示）。
【０１２８】
考察
本研究では、ＮＳＣＬＣ細胞株および異なる民族的背景のＮＳＣＬＣ患者由来の原発性腫瘍におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の頻度を特徴づけた。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、米国人のＮＳＣＬＣ患者より韓国人において、腺癌および制限されたタバコ煙暴露の患者においてより頻繁に、３％のＮＳＣＬＣ標本において検出された。興味深いことに、これら同時の臨床病理学的な特徴は（女性、アジアの民族性、制限されたタバコ喫煙）、ＮＳＣＬＣにおけるＥＧＦＲキナーゼドメイン変異を予測することが示された（２１）。したがって、本研究は、アジア人患者と比較してコーカサス人種由来の、およびタバコ未喫煙者または軽喫煙者由来のＮＳＣＬＣにおける遺伝学的差異についてさらなる証拠を提供する。さらに、以前に処置していない肺腺癌のある女性未喫煙者から樹立した細胞株（ＤＦＣＩ０３２）を含む３種のＮＳＣＬＣ細胞株において、ＥＭＬ４−ＡＬＫが検出された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの転座のあるこれら細胞株の１種は（Ｈ３１２２）、非常に感受性であり、ＡＬＫキナーゼインヒビター（ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４）処置後に、顕著なアポトーシスを起こすこともわかった。Ｈ３１２２細胞株における発見は、この細胞株において、ＡＬＫキナーゼが決定的な生存シグナル経路を単独で調節する癌遺伝子依存性の現象であることを示唆する。ＡＬＫ阻害は、これらシグナル経路のすべての阻害および続くアポトーシスを起こす。これは、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣに類似する（２２、２３）。
【０１２９】
遺伝学的に定義された肺癌患者のサブセットにおける分子標的治療の使用は、効果的な治療戦略として出現している。例として、１０〜３０％のＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲキナーゼドメインに活性化変異を含有し、６０〜８０％のＥＧＦＲ変異の患者は、ＥＧＦＲキナーゼインヒビターであるゲフィチニブまたはエルロチニブで処置後、劇的なＸ線検査の応答を得る（２１、２４）。同様に、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株は、ＥＧＦＲ野生型細胞株と比較して、インビトロでゲフィチニブに非常に感受性であり、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株のみが、ゲフィチニブ処理後のアポトーシスを起こす（２２、２５、２６）。本研究からの発見は、少なくとも腫瘍がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を含むＮＳＣＬＣ患者のサブセットに、ＡＬＫ阻害が有効な治療戦略であるかもしれないことを実証する。さらに、大多数の成人組織においては、ＡＬＫは通常発現していないので、特異的なＡＬＫ阻害剤は忍容性が良好かもしれない。ＡＬＫ阻害剤が臨床開発を経るように、それらはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のあるＮＳＣＬＣ患者においても検討されるべきである。我々は、ＦＦＰＥ標本からＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するのに使用され得るＦＩＳＨアッセイも開発した。これは、ＡＬＫキナーゼインヒビターの臨床研究のために、適切なＮＳＣＬＣ患者の同定を容易にする。
【０１３０】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位がある３種のＮＳＣＬＣ細胞株が同定されたが、３種の細胞株すべてにおいてＡＬＫリン酸化の阻害があったにもかかわらず、３種中１種のみがＴＡＥ６８４によって成育が阻害された（図３および４）。これは、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣとは全く異なっており、大部分のＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株はゲフィチニブまたはエルロチニブにインビトロで感受性である（２２、２７〜２９）。これら差異は臨床的に有意であるかもしれず、ＡＬＫインヒビターは単独でＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位があるＮＳＣＬＣ患者のサブセットに効果的かもしれないことを示唆する。ＤＦＣＩ０３２においては、ＡＬＫ阻害は、下流シグナル伝達タンパク質の阻害を起こさなかった一方で（図４）、Ｈ２２２８においては、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２リン酸化の部分的阻害のみが、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４で観察された（図４）。ＤＦＣＩ０３２またはＨ２２２８は両方とも、ＦＩＳＨで調べられるように、すべての細胞においてＥＭＬ４−ＡＬＫの転座を含有する（データ非表示）。ＤＦＣＩ０３２およびＨ２２２８細胞において、このＡＬＫの阻害と下流シグナル伝達タンパク質の阻害との間のずれの背後にあるメカニズムは依然不明である。ＤＦＣＩ０３２およびＨ２２２８細胞株は、ＮＳＣＬＣにおいて一般に変異する既知の癌遺伝子のいずれにおいても同時発生的変異を含んでいなく、これら知見の可能な説明としてＰＴＥＮ発現を失ってもいなかった（３０）。代わりに、これら細胞株は他のチロシンキナーゼの同時活性化を含んでおり、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４では阻害されないかもしれない平行する生存シグナル伝達をもたらしている（３１、３２）。近年、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣにおけるゲフィチニブ抵抗性のメカニズムとして、ＭＥＴ増幅が記載された。ＥＧＦＲ変異およびＭＥＴ増幅を含有するＨＣＣ８２７ ＧＲ細胞株において、 ＭＥＴおよびＥＧＦＲ両方の阻害は、成育阻害およびＡｋｔリン酸化阻害に重要であった（３１）。ＥＧＦＲの阻害単独またはＭＥＴの阻害単独は、ＨＣＣ８２７ ＧＲ細胞の成育阻害も、Ａｋｔのリン酸化も試験した試料中ではもたらさなかった。ＤＦＣＩ０３２およびＨ２２２８のさらなる研究は、それらが他の同時発生的に活性化したキナーゼも含有するか特定するのに役立つかもしれない。かかる研究はうまくいけば、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４とともに、さらなる有効な併用戦略の同定をもたらすだろう。興味深いことに、同時発生的なＥＧＦＲ活性化変異は、ＮＳＣＬＣ腫瘍標本の８種中１種において、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位とともに検出された。ＥＧＦＲキナーゼインヒビター単独またはＡＬＫキナーゼインヒビター単独の有効性におけるこれら２つの同時発生的変異の臨床的重要性は不明である。しかしながら、変異ＥＧＦＲおよびＥＭＬ４−ＡＬＫは両方とも発癌性であり、Ａｋｔシグナル伝達を活性化するので、ＥＧＦＲインヒビターおよびＡＬＫインヒビターの併用戦略は、この腫瘍の成育を阻害するのにおそらく効果的であるだろう。
【０１３１】
【表５】
【表６】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年２月１２日出願の米国仮出願番号61/065,422の「肺癌におけるＥＭＬ４とＡＬＫの融合のためのＦＩＳＨアッセイ」の35 U.S.C. § 119(e)に基づく利益を主張し、ここに参照によって全体に組み込まれる。
【０００２】
政府利害関係
本研究は、米国立衛生研究所により、助成金番号1RO1CA114465-01に基づいて一部支援がなされた。米国政府は本発明に権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＥＭＬ４遺伝子およびＡＬＫ遺伝子が関係する第２染色体上の逆位を試験するＦＩＳＨアッセイに属する。本アッセイは、肺癌の診断および予後診断の応用例を有する。
【背景技術】
【０００４】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、元来、ＡＬＫのＣ末端キナーゼドメインおよび多様な遺伝子産物のＮ末端部からなる融合タンパク質の生産をもたらす染色体転座から発見された(Morris et al., Science, 1994, 263:1281-1284)。ＡＬＫ遺伝子が関係する転座は、未分化リンパ腫の４０−６０％で同定されたが(Falini et al., Am J Pathol, 1998, 153: 875-886)、それらは、Ｂ細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、および筋線維芽細胞腫などのいくつかの珍しい悪性腫瘍でも発見された(Gascoyne et al., Blood, 2003, 102: 2568-2573; Griffin et al., Cancer Res, 1999, 59: 2776-2780; Lawrence et al., Am J Pathol, 2000, 157: 377-384)。ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）は、最も共通したＡＬＫの融合パートナーであるが（転座の８０％）、少なくとも６つの他の融合パートナーが同定された(Amin et al., Blood, 2007, 110: 2259-2267)。全長ＡＬＫの発現は、主神経組織の発生時に制限されるが、いくつかの珍しい悪性腫瘍もまたその遺伝子を発現する(Falini et al., Am J Pathol, 1998, 153:875-886; Iwahara et al., Oncogene, 1997, 14: 439-449; Lamant et al., Am J Pathol, 2000, 156:1711-1721)。ＡＬＫが関係する遺伝子融合は、ＡＬＫチロシンキナーゼの恒常的な活性化を頻繁にもたらす。ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＳＴＡＴ３、ホスホリパーゼγ、および細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）を含む、ＡＬＫキナーゼ活性の多様な下流ターゲットが同定された(Amin et al., Blood, 2007, 110: 2259-2267)。
【０００５】
ＡＬＫ遺伝子と棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）の融合が、日本人の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のサブセットで最近検出された(Soda et al., Nature, 2007, 448: 561-566)。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の頻度は、日本人の非小細胞肺癌では６．７％（５／７５）であることがわかった。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合が、男女ともに、非喫煙者または現喫煙者から、腺癌および有棘細胞癌で検出され、ＥＧＦＲまたはＫ−Ｒａｓ変異で相互排他的であった。さらに、ＥＭＬ４−ＡＬＫは、３Ｔ３細胞およびＢａ／Ｆ３モデルで癌化していた(Soda et al., Nature, 2007, 448:561-566)。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書には、ＥＭＬ４およびＡＬＫが関係する染色体逆位の検出のための、ＦＩＳＨアッセイを行う方法および組成物が記載される。ＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位を検出する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイに少なくとも部分的に基づく、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断および予後診断の方法、およびＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物を用いる、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患の処置方法もまた含まれる。本発明のさらなる側面は、ＮＳＣＬＣの対象を、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきかを決定する方法に関し、かかる対象がＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位を示すかという分析に少なくとも部分的に基づく。ＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位を検出するＦＩＳＨアッセイに用いるプローブ、およびかかるＦＩＳＨアッセイを行うためのキットも記載する。
【０００７】
本発明の側面は、染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定するＦＩＳＨアッセイを行うための方法に関し、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含むプローブセットとを接触させること、ここで、第一のプローブは第一の標識を有し、非逆位型の第一の染色体にハイブリダイズ可能であり、第二のプローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、非逆位型の第二の染色体にハイブリダイズ可能であって、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、；第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること；および第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、を含む。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点（breakpoint）の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。
【０００８】
いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定する方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第一の染色体にハイブリダイズ可能な第一の核酸プローブ、および、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識と異なる第二の標識を有し、かつ第二の染色体にハイブリダイズ可能な第二のプローブとを接触させること、ここで、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、；第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、；および第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、に関係する。いくつかの態様では、第一の核酸プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６であって標識を有し、かつ第二の核酸プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１であって第二の標識を有する。
【０００９】
本明細書は、対象から生物学的試料を単離すること、その試料から染色体調製物を産出すること、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、その染色体調製物でＦＩＳＨを行うこと、およびその染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象がＮＳＣＬＣを有すると決定することを含む、対象のＮＳＣＬＣを診断する方法をさらに記載する。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。ある態様では、第一の核酸プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第一の標識を有し、かつ第二の核酸プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第二の標識を有する。本発明の側面は、ＦＩＳＨ解析の結果に基づいて、不良、中間または良好の予後を示す対象の分類方法を含む。ＮＳＣＬＣの診断および／または予後診断のいくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは腺癌である。ＮＳＣＬＣの診断および／または予後診断の他の態様では、ＮＳＣＬＣは有棘細胞癌である。
【００１０】
本発明の側面は、ＮＳＣＬＣの対象をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきかを決定する方法にさらに関係し、その方法は、対象から生物学的試料を単離すること、その試料から染色体調製物を産出すること、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、その染色体調製物でＦＩＳＨを行うこと、およびその染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきと決定することに関係する。いくつかの態様では、その方法は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で対象を処置することにさらに関係する。いくつかの態様では、ＥＧＦＲインヒビターも対象に投与される。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。いくつかの態様では、第一の核酸プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第一の標識を有し、第二の核酸プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性および第二の標識を有する。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４またはＰＦ−０２３４１０６６などのキナーゼインヒビターである。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む。ある態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーまたはそれら組み合わせのいずれかである。
【００１１】
本発明の側面は、ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位を検出するための核酸プローブをさらに含む。いくつかの態様では、核酸プローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＥＭＬ４染色体にハイブリダイズし、ＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４染色体にハイブリダイズする。いくつかの態様では、核酸プローブは、標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＡＬＫ染色体にハイブリダイズし、ＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫ染色体にハイブリダイズする。いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。いくつかの態様では、プローブは、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列の少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する。いくつかの態様では、プローブは、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する。
【００１２】
本明細書は、染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定するためのキットをさらに記載し、そのキットは、第一の核酸プローブであって、そのプローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＥＭＬ４染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４染色体にハイブリダイズする、前記第一の核酸プローブ；第二の核酸プローブであって、そのプローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＡＬＫ染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫ染色体にハイブリダイズする、前記第二の核酸プローブ；染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定するＦＩＳＨアッセイを行うための第一および第二のプローブの使用についての説明書（instruction）、を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、各核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂまたは１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である。いくつかの態様では、キットはＤＡＰＩなどのＤＮＡ対比染色剤をさらに含む。いくつかの態様では、キットはハイブリダイゼーションバッファー、封入剤（mounting media）、およびコントロールスライドを含む。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象の、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患の、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物を対象に投与する処置方法に関係する。いくつかの態様では、疾患は非小細胞肺癌などの癌である。ある態様では、非小細胞肺癌は、腺癌または有棘細胞癌である。
【００１５】
いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４またはＰＦ−０２３４１０６６などのキナーゼインヒビターを含む。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはそれら組み合わせのいずれかなどのＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーまたはそれら組み合わせのいずれかを含む。本明細書に記載の、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象の、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患を処置する方法は、エルロチニブ（Erlotinib）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、またはＡＧ１４７８などのＥＧＦＲインヒビターの投与も含むことができる。本明細書に記載の方法は、化学療法剤の投与も含んでもよい。いくつかの態様では、複数のＡＬＫキナーゼインヒビターおよび／またはＥＧＦＲインヒビターおよび／または化学療法剤が投与される。いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象において、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患を処置する方法が、本明細書に記載の診断方法を用いてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象に適用される。いくつかの態様では、対象はＥＧＦＲ変異を有すると診断される。
【００１６】
対象は、いくつかの態様では、手術および／または放射線治療を受けてもよい。
本発明の側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を発現する細胞で、細胞をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物と接触させることにより、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害することに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１は、ＮＳＣＬＣの細胞株および腫瘍でのＥＭＬ４−ＡＬＫを示す。図１Ａは、エクソンアレイを用いる肺癌の細胞株でのＡＬＫ融合遺伝子の検出を示す。８３種の肺癌の細胞株のスクリーニングで（８０／８３ＮＳＣＬＣ）、エクソンアレイは、Ｈ３１２２およびＨ２２２８細胞株が、他の８１の細胞株と比較して、ＡＬＫのエクソン２０〜２９に対応する＃８０〜１４０のＡＬＫプローブについて、有意に高いシグナル（log2差）を有していたことを示した。プローブは、標識強度に基づいて、非反応プローブ（薄い陰影（light shade））、低強度プローブ（中間の陰影（intermediate shade））および高強度プローブ（濃い陰影（dark shade））の３つのカテゴリーに割り当てられた。高強度プローブのみが、切断点の検出に使用された。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＮＳＣＬＣの細胞株および腫瘍におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合のＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。プライマーセット２は、Ｈ３１２２、Ｈ２２２８、およびＤＦＣＩ０３２細胞株からＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を増幅するが、Ａ５４９株からは増幅しない。プライマーセット１および２は、８種の原発性ＮＳＣＬＣからもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を検出した。Ｈ３１２２細胞はポジティブコントロールとして、Ａ５４９はネガティブコントロールとして役立つ。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＮＳＣＬＣでの４つの異なるＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体の模式的な図を示す。
【００１８】
【図２】図２は、ＦＩＳＨを用いたＥＭＬ４−ＡＬＫの検出を示す。図２Ａは、ＡＬＫ（矢印）およびＥＭＬ（矢頭）のシグナルが別々に見える野生型ＰＣ−９細胞株を示す。図２Ｂは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合シグナル（矢印）が小さな染色体外断片（矢印）に見えるＨ２２２８細胞株を示す。図２Ｃは、染色体の一つがＥＭＬ４−ＡＬＫ融合シグナルを黄色で示す（矢印）ＤＦＣＩ０３２細胞株を示す。図２Ｄは、図２Ｃに示すＤＦＣＩ０３２細胞株を樹立するために使用した胸水を有する患者の腫瘍から得られたＦＦＰＥ標本から、ＥＭＬ４−ＡＬＫについての間期ＦＩＳＨを示す。腫瘍は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合シグナル（矢印）について、ヘテロ接合性である。
【００１９】
【図３Ａ】図３は、ＮＳＣＬＣの細胞株を含むＥＭＬ４−ＡＬＫの成育に対するＮＶＰ−ＴＡＥ６８４の効果を示す。図３Ａは、表示濃度のＴＡＥ−６８４で処理したＮＳＣＬＣ細胞を表すグラフを示す。生存可能な細胞が、処理７２時間後に測定された。生存可能な細胞の割合が、未処理のコントロールと相対的に示される。Ａ５４９（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）；ＰＣ９（ＥＧＦＲ 欠失Ｅ７４６＿Ａ７５０）；Ｈ２２２８（ＥＭＬ４−ＡＬＫ 変異体３）；Ｈ３１２２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ 変異体１）；ＤＦＣＩ０３２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ 変異体１）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、無処理（左バー）および０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４で７２時間処理した後（右バー）のサブＧ１フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。ＴＡＥ−６８４処理に続く顕著なアポトーシスは、Ｈ３１２２細胞株でのみ観察される。
【図３Ｃ】図３Ｃは、０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４の７２時間処理に続くＰＡＲＰのウェスタンブロット解析を示す。Ａでの細胞成育に対するＴＡＥ−６８４の効果と一致して、８９ｋＤａの切断ＰＡＲＰ産物が、Ｈ３１２２細胞株でのみ観察される。
【００２０】
【図４】図４は、野生型およびＥＭＬ４−ＡＬＫポジティブＮＳＣＬＣの細胞株でのＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処理に続くウェスタンブロット解析を示す。全ＡＬＫおよびリン酸化ＡＬＫは、ＥＭＬ４−ＡＬＫポジティブ細胞株（Ｈ３１２２、Ｈ２２２８、ＤＦＣＩ０３２）のみで検出されるが、野生型コントロール（ＰＣ−９）では検出されない。Ｈ３１２２およびＤＦＣＩ０３２細胞株では、ＡＬＫポジティブのバンドは変異体１（矢印１）の予測分子量（１１７ｋＤａ）に対応する〜１１５ｋＤａで移動し、Ｈ２２２８では、バンドは変異体３（矢印３）の予測分子量（９０／９１ｋＤａ）にも対応する〜９０ｋＤａで移動する。ＡＬＫリン酸化は、すべての細胞株において、０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処理後（６時間）完全に阻害される。Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３、およびＥＲＫ１／２のリン酸化は、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４でＨ３１２２およびＨ２２２８細胞株で減少するが、ＤＦＣＩ０３２およびＰＣ−９株においては、変化しないままである。すべての細胞株は、ＰＴＥＮの存在を示す。α−チューブリンが、ローディングコントロールとして使用される。
【００２１】
【図５】図５は、ＮＳＣＬＣの細胞株におけるＡＬＫ遺伝子の異なる部位の発現レベルを、エクソンアレイを用いて示す。非反応プローブは、薄い陰影で示され、低強度プローブは中間の陰影で示され、高強度プローブは濃い陰影で示される。図５Ａは、Ｈ２２２８細胞株において、エクソンアレイが３’末端に位置するＡＬＫプローブについて、残り８３種の細胞株と比較して有意に高いシグナルを検出したことを示す。図５Ｂは、Ｈ２２２８株と類似してＨ３１２２細胞株において、ＡＬＫの３’末端において有意に高いシグナルが見られたことを示す。図５Ｃは、ＨＣＣ２９３５細胞株では、異なるＡＬＫプローブについては、シグナルに違いが無いことを示す。
【００２２】
【図６】図６は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの検出に使用するＦＩＳＨアッセイの図解を示す。野生型の標本では、ＡＬＫおよびＥＭＬ４のシグナルは、第２染色体に別々に見られる。(ｉｎｖ（２）（ｐ２３．３ｐ２１）の逆位を通してＥＭＬ４とＡＬＫが融合した場合、個々の両シグナルは融合し、単一のシグナルを形成する。
【００２３】
【図７】図７は、核酸プローブを含み、およびＦＩＳＨアッセイでのそれらの使用についての説明書を含むキットを示す。
【００２４】
詳細な説明
本発明の側面は、ＥＭＬ４とＡＬＫをまとめる異常な染色体の逆位を検出する方法および組成物に関する。本発明は、少なくとも部分的に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイが、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位をもたらす染色体逆位を検出するために使用され得ることの発見に関する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるこの染色体逆位の罹患率は、本明細書に記載のＦＩＳＨアッセイの診断および予後診断への適用をもたらした。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出のためのＦＩＳＨアッセイの使用は、かかる遺伝子融合を示す対象の適切な処置戦略の決定することの適用性も有する。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するＦＩＳＨアッセイの使用のためのプローブ、かかるプローブを産出する方法、およびかかるプローブを含むキットが、本明細書にさらに記載される。
【００２５】
本発明は、その適用において続く記載に係る、または図に示される構成の詳細および成分の配置に限定されない。本発明は、他の態様および様々な方法での実践または実行が可能である。また、本明細書で使用する専門語および用語は、記載の目的であり、限定としてみなされるべきではない。本明細書の、「包含する（including）」、「含む（comprising）」または「有する（having）」、「含有する（containing）」、「関係する（involving）」およびそれらのバリエーションの使用は、その後に列挙する項目、および追加項目と同様に、それらに相当するものを包含することを意味する。
【００２６】
本発明の側面は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの使用に関する。本明細書で使用するように、「蛍光インサイチュハイブリダイゼーション」または「ＦＩＳＨ」は、染色体上の特定のＤＮＡ配列にハイブリダイズする標識核酸プローブの使用によって、染色体上の特定のＤＮＡ配列を検出、または局在化する方法を言及する。本明細書で使用するように、「核酸プローブ」は、染色体上の特定のＤＮＡ配列を認識してハイブリダイズする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど）配列を言及する。ＦＩＳＨは多様な研究応用例があるが、ある応用例では、染色体の逆位を検出する能力に属する。本明細書で使用されるように、「染色体の逆位」は、染色体のセグメントが端々逆転する再構成を言及する。逆位は、野生型または正常な細胞では通常起こらない２つの遺伝子間での融合が生じ、癌などの障害を引き起こす可能性がある。したがって、細胞中の染色体逆位の検出は、癌などの障害を示すものになり得る。
【００２７】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子に関係する染色体の逆位は、複数のタイプの癌で検出され、６つの異なる遺伝子との融合に関係し得る（Amin et al., Blood, 2007, 110:2259-2267）。これら逆位において、ＡＬＫのＣ末端キナーゼドメインは、様々な遺伝子のＮ末端領域と融合する（Morris et al., Science, 1994, 263:1281-1284）。近年、ＡＬＫ遺伝子が棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子と融合する染色体の逆位が、日本人のＮＳＣＬＣ患者で検出された（Soda et al., Nature, 2007, 448: 561-566）。染色体の逆位、またはＥＭＬ４とＡＬＫとの間の融合は、本明細書ではＥＭＬ４−ＡＬＫとして言及される。本明細書の例の部門で提示するデータは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合は、アメリカ人および韓国人のＮＳＣＬＣ患者においても広まっていることを明らかにする。
【００２８】
本発明の側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの染色体逆位の存在検出におけるＦＩＳＨの使用に関する。本明細書に記載の方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含むプローブセットを接触させること、ここで、第一のプローブは第一の標識を有し、非逆位型の第一の染色体にハイブリダイズ可能であり、第二のプローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、非逆位型の第二の染色体にハイブリダイズ可能であって、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、；第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること；および第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、を含む。
【００２９】
複数の異なるアプローチが、本発明と適合性のあるプローブセットを設計するために使用され得ることは、認められるべきである。いくつかの態様において、核酸プローブは、「融合プローブ」として記載されてもよい。これら態様では、第一のプローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブはＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズする。第二の核酸プローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブは非逆位型のＡＬＫ染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫ染色体にハイブリダイズする。ＥＭＬ４とＡＬＫが逆位によって融合しなかった野生型の染色体調製物において、第一および第二のプローブは、それぞれの非逆鋳型の染色体領域にハイブリダイズし、２つの別々のシグナルが検出される。ＥＭＬ４とＡＬＫが逆位によって融合した異常な染色体調製物において、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする。
【００３０】
他の態様では、「ブレークアパート（break-apart）」プローブは、本発明と適合性でもある。これら態様では、第一のプローブは標識を有し、逆位切断点付近の非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である。第二のプローブは、第一のプローブと異なる標識を有し、逆位切断点の反対側の同一染色体領域とハイブリダイズ可能である。染色体が異常な逆位を起こさなかった正常な野生型の染色体の調製物では、２つのプローブは、隣接のシグナルまたは単一のシグナルとして検出されるだろう。染色体が逆位および融合を起こした異常な染色体の調製物では、２つのシグナルが、染色体の逆位による分離のために、別々のシグナルとして離れて検出されるだろう。ＥＭＬ４またはＡＬＫのいずれのブレークアパートプローブも、本発明に適合性がある。
【００３１】
いくつかの態様では、ＦＩＳＨアッセイで使用される核酸プローブは、オークランド小児病院研究所のＢＡＣ ＰＡＣリソースセンター（ＢＰＲＣ）（Oakland、CA）から入手可能なＢＡＣ（バクテリア人工染色体）クローンから産生される。本明細書で使用するように、「ＢＡＣ」は、大腸菌細胞においてＤＮＡ断片をクローニングするために使用されるベクターを言及する。ＢＡＣは、典型的には５０〜３００ｋｂのＤＮＡインサートを含有する。他の態様では、ＦＩＳＨアッセイに使用する核酸プローブは、フォスミドから産生され得る。本明細書で使用されるように、「フォスミド」は、細菌のＦ−プラスミドに基づくクローニングベクターを言及する。ある態様では、プローブは、ともにプールした複数のフォスミドから産生される。ＦＩＳＨアッセイのための最適プローブの長さは、経験的に決定する必要があるかもしれないことは、認められるべきである。いくつかの態様では、プローブの長さは、８０〜１５０ｋｂｐの間である。大きなＤＮＡ断片の他の供給源もＦＩＳＨアッセイのためのプローブ産生に、したがって、本発明の方法と適合性があるであろうことは、さらに認められるべきである。より小さなＤＮＡ断片も本発明の方法と適合性があり、いくつかの態様では、（フォスミドについて上述するように）ともにプールされる。
【００３２】
本発明の側面によると、核酸プローブは、タグまたは標識によって標識される。いくつかの態様では、ＦＩＳＨアッセイに使用するタグまたは標識は、フルオロフォアとも言及される蛍光タグまた蛍光標識である。核酸を標識するいずれの適切な技法が本発明と適合性があり、当業者によって理解されるであろう。いくつかの態様では、核酸プローブは標準プロトコルに従って、ニックトランスレーションを介して標識される。他の態様では、核酸プローブは標準プロトコルに従って、ランダムプライミングを介して標識される。さらなる態様では、核酸プローブは標準プロトコルに従って、末端標識を介して標識される。核酸プローブを標識するために使用されるいずれのタグまたは標識は、本発明と適合性があることは、認められるべきである。いくつかの態様では、タグは限定されることなく、Abbott Molecular（Des Plaines、IL）からすべて入手可能なSpectrumRed-dUTP、SpectrumGreen-dUTP、SpectrumGreen-11-dUTP、およびSpectrumOrange-dUTPから選択される。いくつかの態様では、プローブは、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識されてもよい。
【００３３】
いくつかの態様では、核酸プローブは、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ、２Ｍｂ、１Ｍｂまたは１Ｍｂ以下の内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である。ＡＬＫおよびＥＭＬ４は、１２メガベース離れて第２染色体のショートアームに両方位置しており、５’から３’の方向性は反対にある。２つの異なるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体が以前に特徴づけられ、両方ともＥＭＬ４遺伝子のエクソン１〜１３（変異体１）またはエクソン１〜２０（変異体２）と融合するＡＬＫのエクソン２０〜２９に関係する（Soda et al., Nature, 2007, 448: 561-566）。変異体３（ＥＭＬ４のエクソン６がＡＬＫのエクソン２０と融合する）は、選択的にスプライシングする３３ｂｐの断片（エクソン７ａ）を組み込ませるために、融合体のＥＭＬ４部分のスプライシングを変化させる。本明細書に記載される融合遺伝子の変異体４は、ＥＭＬ４コドン１〜５６９（エクソン１５）を、ＡＬＫのコドン１０７８〜１６２１に融合する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体１では、切断点は、ＥＭＬ４のエクソン１３の３．６ｋｂ下流であり、ＡＬＫのエクソン２１の２９７ｂｐ上流である。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体２では、切断点は、ＥＭＬ４のエクソン２０の５４５ｂｐ下流およびＡＬＫのエクソン２１の２３２ｂｐ上流に位置する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体３および４では、正確な切断点はまだ決定されていない。しかしながら、特異的な変異体の切断点は、当業者によって決定され得る。
【００３４】
複数のプローブが、本発明と適合性があることは、認められるべきである。プローブは、ＵＣＳＣゲノムデータベースウェブサイトを通じて利用可能であるように、公に利用可能なヒトゲノム配列データと同様に、逆位の切断点およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合変異体の配列データに関して、本明細書で提供される情報に基づいて設計可能である。さらなるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体が存在するかもしれないことも、認められるべきである。本明細書に記載のプローブおよびアッセイは、すべての可能なＥＭＬ４−ＡＬＫの変異体、およびこれら変異体を同定する方法を包含する。いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を認識するように設計したプローブは、すべてのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の変異体を認識するだろう。他の態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を認識するように設計したプローブは、１または複数のＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の変異体を認識するかもしれない。
【００３５】
いくつかの態様では、ＡＬＫの３’末端にハイブリダイズする核酸プローブおよびＥＭＬ４の５’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するためのＦＩＳＨに使用される。いくつかの態様では、ＡＬＫの３’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−１００Ｃ１から産生され、標識を有する。いくつかの態様では、ＡＬＫの３’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のＲＰ１１−１００Ｃ１との配列同一性を含む。いくつかの態様では、ＥＭＬ４の５’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−６６７Ｉ６から産生され、標識を有する。
いくつかの態様では、ＥＭＬ４の５’末端にハイブリダイズする核酸プローブは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のＲＰ１１−６６７Ｉ６との配列同一性を含む。ＲＰ１１−１００Ｃ１およびＲＰ１１−６６７Ｉ６は両方とも、オークランド小児病院研究所のＢＡＣ ＰＡＣリソースセンター（ＢＰＲＣ）（Oakland、CA）から入手可能である。
【００３６】
本発明の側面によると、ＦＩＳＨは染色体調製物上で、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む第一のプローブおよびＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む第二のプローブなどの、蛍光標識をしたプローブを用いて行われる。ＦＩＳＨは、当業者に知られた標準技法に従って行われる（Lee et al., Chromosoma, 2000, 109:381-389）。いくつかの態様では、ＦＩＳＨを行うための試料調整は、自家蛍光の減少およびスライド上に試料を乗せることに関係する。いくつかの態様では、試料は、固定および処理した組織、凍結試料、スライド上の試料、またはパラフィン包埋の試料からなる。試料調整の側面は、米国特許公報US2006/0199213およびUS2005/0100944でさらに考察され、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
ＦＩＳＨアッセイは、核酸プローブと染色体上の特異的なＤＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションの検出に頼っている。本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための、二本のＤＮＡまたはＲＮＡ相補鎖の結合過程、またはそれらのハイブリッドを言及する。ハイブリダイゼーションの工程は、１、２、または複数のプローブに関係してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、種々のプローブについて経験的に決定される必要があることは、認められるだろう。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に知られるように、高ストリンジェンシーから低ストリンジェンシーの条件の範囲を生じて変動し得る。温度、塩濃度、ホルムアミド濃度、およびデキストラン硫酸などの他の成分（米国特許公報US2005/0100944で考察）を限定することなく含む複数の因子が、ハイブリダイゼーションを至適化するために、経験的に操作され得る。これら因子および他の条件は、与えられたプローブおよび試料についてのハイブリダイゼーションシグナルを至適化するために、ハイブリダイゼーションの工程中および続く洗浄工程中に変動し得る。インサイチュハイブリダイゼーションの一般的な条件は、Leitch et al., In Situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v. 27 (1994)で、考察される。プローブ検出について、より高いストリンジェンシー条件は、一般的にはより低いバックグラウンドシグナルをもたらすが、感度もまた減少し得る。いくつかの態様では、高ストリンジェンシー条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃からなり、中ストリンジェンシー条件は、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃からなり、低ストリンジェンシー条件は、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃からなる（米国特許公報US2006/0199213で考察）。これら条件の多数の可能なバリエーション、および数々のバッファーおよび塩を含む多数の他の成分が、本発明と適合性があるだろう。
【００３８】
ＦＩＳＨアッセイでの正のハイブリダイゼーションシグナルは、蛍光顕微鏡を通じて、核酸プローブに付随するタグの可視化によって検出される。いくつかの態様では、第一の核酸プローブは、SpectrumRed-dUTPなどの蛍光タグで標識される一方で、第二の核酸プローブは、SpectrumGreen-dUTPなどの異なる蛍光タグで標識される。ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体の逆位がなかった染色体調製物中では、２つの蛍光シグナルが、赤色および緑色のシグナルとして、別々に検出されるだろう。ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体の逆位があった染色体調製物中では、２つの蛍光シグナルは併合し、単一の黄色のシグナルとして検出されるだろう。したがって、遺伝子融合は、逆位に伴う２つのシグナルの近接、および２つの蛍光シグナルの併合による異なる色彩の検出によって示される。
【００３９】
いくつかの態様では、ＦＩＳＨアッセイは、テスト試料およびコントロール試料に関係するだろう。いくつかの態様では、コントロール試料は、野生型または正常な染色体調製物であってもよい一方で、テスト試料は、ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位の存在が疑われる試料であってもよい。テスト試料およびコントロール試料は、同一のプローブで処理され、プローブの局在および蛍光シグナルが、コントロール試料とテスト試料との間で比較されるだろう。コントロール試料が野生型または正常な染色体調製物である態様では、テスト試料中のプローブおよびコントロール試料中のプローブでの類似の局在および蛍光シグナルは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含まないことを示す一方で、テスト試料中のプローブおよびコントロール試料中のプローブでの局在および蛍光シグナルの違いは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むことを示す。他の態様では、コントロール試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むことが知られている試料であってもよい。これらの態様では、テスト試料のプローブおよびコントロール試料のプローブでの類似の局在および蛍光シグナルは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むことを示す一方で、テスト試料中のプローブおよびコントロール試料中のプローブでの局在および蛍光シグナルの違いは、テスト試料はＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含まないことを示す。
【００４０】
本発明の側面は、例えば、対象から細胞試料または組織試料を得て、かかる試料をＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在についてアッセイすることによって、対象における癌の発症、進行または退行を診断またはモニタリングする方法を含む。本明細書で使用されるように、「癌」の用語は、身体臓器およびシステムの正常な機能を妨害するかもしれない、細胞の制御されない成育を言及し、原発性および転移性の腫瘍を含む。原発性腫瘍、または最初の部位から転移し、生命の維持に必要な臓器に接種する癌は、発症した臓器の機能的悪化を介して、最終的には対象の死をもたらす。転移腫瘍は、原発性腫瘍の部位とは異なり、原発性腫瘍から身体の他の部位への癌細胞の播種に起因する癌細胞または癌細胞の集団である。転移腫瘍は、最終的には対象の死をもたらすかもしれない。
【００４１】
いくつかの態様では、請求する発明の側面によって、診断または処置される対象は、肺癌を伴う対象である。肺癌は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を包含する。肺癌の症例約８０％の原因である非小細胞肺癌は、有棘細胞癌（類表皮癌とも呼ばれる）、大細胞癌、腺癌、多形性、カルチノイド腫瘍、唾液腺癌、および未分類の細胞種を限定することなく含む、複数のタイプの癌を包含する。本発明の側面は、ＮＳＣＬＣの全カテゴリーを包含する。いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣは腺癌である。他の態様では、ＮＳＣＬＣは有棘細胞癌である。
【００４２】
対象は、癌を有する疑いがあってもなくてもよい。症状の発症は、対象の症状と関連する、生理学的な変化または特徴の開始である。かかる変化は、生理学的な症候によって証明されてもよく、または臨床的に無症候である。例えば、癌の発症は、その時点で臨床的な症候が明らかでないかもしれないが、癌に関する生理学的特徴が対象に存在するかもしれない期間を伴ってもよい。症状の進行は発症に続き、臨床的な症候の増加によって特徴づけられても、そうでなくてもよい、その症状の生理学的特徴の前進である。対照的に、症状の退行は、おそらく平行して症候の減少を伴う症状の生理学的特徴の減少であり、処置に起因してもよく、または病状の自然回復であってもよい。
【００４３】
非癌細胞または非癌組織には存在しないＥＭＬ４−ＡＬＫ融合などの癌に関連する遺伝子融合の存在は、対象における癌のマーカーとして特定される。癌の症状の発症は、かかる特定されたマーカーが以前に存在しなかった対象試料中で、かかるマーカーの出現によって示されてもよい。例えば、癌のマーカーが対象由来の第一の試料に存在しないと決定された場合、癌のマーカーがその対象由来の第二または続く試料中で存在するとの決定は、その対象での癌の発症の指標になる。癌に関連するマーカーのいくつかの例では、転移腫瘍に対して原発性腫瘍中で差次的に発現してもよく、そのため、対象試料中の選択した癌関連ポリペプチドの同定に基づいて、疾患のステージおよび／または診断レベルを確立することができる。
【００４４】
単一の組織タイプにおける異なるタイプの癌は、異なる癌関連マーカーを発現するかもしれない。かかるバリエーションは、癌特異的診断および続く患者の特異的な症状にあわせた処置を可能とするかもしれない。これら発現の差は、癌関連マーカーの差次的発現に基づいて、医師が癌を診断することを可能とし、差次的マーカーに基づいて特異的な処置を選択および投与することを可能とする。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位などの癌関連マーカーの単離および同定は、当業者がこの癌関連マーカーの発現によって特徴づけられる障害の診断をすることを可能とする。
【００４５】
本発明の側面は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出のためのＦＩＳＨアッセイの使用を通じて、ＮＳＣＬＣの診断に関する。いくつかの態様では、ＮＳＣＬＣの診断方法は、対象から生物学的試料を単離すること、その試料から染色体調製物を産出すること、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、その染色体調製物でＦＩＳＨを行うこと、およびその染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象がＮＳＣＬＣを有すると決定することを含む。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出のためのＦＩＳＨアッセイの使用によって、ＮＳＣＬＣと診断された対象は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物の投与によって処置されてもよい。いくつかの態様では、ＥＧＦＲインヒビターまたは他の治療を含む組成物も投与されてもよい。
【００４６】
本明細書で使用するように、「生物学的試料」の用語は、生物体全体または組織、細胞または成分部分のサブセットを言及してもよい。「生物学的試料」はまた、生物体全体または組織、細胞、成分部分から調製したホモジネート、ライセート、または抽出物、またはそれら画分または部分を言及してもよい。いくつかの態様では、生物学的試料は、肺組織由来の試料だろう。いくつかの態様では、生物学的試料はインビボであってもよい。他の態様では、生物学的試料はインビトロであってもよい。いくつかの態様では、生物学的試料は細胞株、細胞培養物、または細胞懸濁液であってもよい。好ましくは、生物学的試料はＤＮＡの量およびタイプ、および／または試料が由来する親細胞に存在する発現産物に対応する。生物学的試料は、ヒトの対象またはヒト以外の対象由来になり得る。染色体調製物は、標準プロトコルに従って、生物学的試料から調製される。いくつかの態様では、ＦＩＳＨを行うために使用される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本である。
【００４７】
いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を検出するＦＩＳＨ解析の結果は、ＮＳＣＬＣの診断に使用されるだろう。他の態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するＦＩＳＨ解析の結果は、ＦＩＳＨ解析の結果に基づいて、不良、中間または良好のＮＳＣＬＣの予後を示す対象の分類に使用されるだろう。ＮＳＣＬＣの診断または予後診断のためのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するＦＩＳＨ解析の実行は、他のマーカー、または他の診断または予後診断アッセイの分析と併用してもよいと認められるべきである。いくつかの態様では、他のアッセイが、染色体逆位の分子的基盤のさらなる確認のために、またはさらなる分析のために、ＦＩＳＨアッセイと併用して、または続いて行われてもよい。例えば、どのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の変異体が生物学的試料中に存在するかを検証または確認するために、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲが、生物学的試料で行われてもよい。いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼ活性を測定するアッセイの実行も、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含むと疑われる、または含むと知られている生物学的試料で行われてもよい。
【００４８】
いくつかの態様では、テスト試料はＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有する対象由来の試料であってもよい一方で、コントロール試料は癌を含まない、および／または前癌性の症状がない細胞または対象由来の試料であってもよい。これら態様では、コントロール試料ではなく、テスト試料でのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出は、テスト試料はＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有する対象に由来したことを示すかもしれない。いくつかの態様では、コントロール試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を示すＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有すると知られている細胞または対象に由来する試料であってもよい。これらの態様では、テスト試料およびコントロール試料でのＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の検出は、テスト試料はＮＳＣＬＣまたは前癌性の症状を有する対象に由来したことを示すかもしれない。いくつかの態様では、コントロール試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む、または含まないＮＳＣＬＣの細胞株であってもよい。
【００４９】
本発明のいくつかの側面によれば、対象（例えば、ＮＳＣＬＣ患者）は、すべてではない場合に、少なくともいくつかの癌細胞でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を発現する疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する場合、その対象はＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物での処置の候補として、同定されてもよい。したがって、いくつかの態様では、対象（例えば、ＮＳＣＬＣ患者）はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の存在について試験され、存在の場合には、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物での処置の候補として同定される。ＥＭＬ４−ＡＬＫ間融合のいずれの検出も、この遺伝子融合の可能性のあるいずれの変異体をも包含し、ＡＬＫキナーゼ活性のインヒビターで処置する指標とみなされてもよいことは、認められるべきである。いくつかの態様では、すべてではない場合に、少なくともいくつかの癌細胞でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を示す疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する対象（例、ＮＳＣＬＣ患者）は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物を含む処置を、推薦または処方されてもよい。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「対象」の用語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物または動物を言及する。ヒト以外の哺乳動物は、家畜動物、ペット、実験動物、およびヒト以外の霊長類を含む。ヒト以外の対象は、限定なしに特別に、ニワトリ、ウマ、雌牛、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク、およびウサギを含む。本発明のいくつかの態様では、対象は患者である。本明細書で使用するように、「患者」は、医師または他の医療従事者を受診した、それらからアドバイスを受けた、またはそれらから処方箋または他の推薦を受けた者を含む、医師または他の医療従事者の世話を受ける対象を言及する。患者は典型的には、ＮＳＣＬＣを有する、または有するリスクがある対象である。
【００５１】
「処置」または「処置する」の用語は、症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）の予防、寛解、防止または治癒を意図する。症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）開始後の処置は、症状および／または関連する症候を減少、寛解または一斉に除去する、または悪化することから防止することを目的とする。症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）開始前の対象の処置（すなわち、予防処置）は、症状にかかるリスクを減少すること、および／または症状にかかった場合に重症度を和らげることを目的とする。本明細書で使用するように、「防止」の用語は、対象が障害にかかるであろう確立の減少をもたらす、症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）にかかるリスクのある対象の予防処置、およびすでに確立した障害のさらなる発達の阻害を言及する。
【００５２】
本発明の側面は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物と細胞を接触させることによって、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を発現する細胞でのＡＬＫキナーゼ活性を阻害することに関係する。ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象で、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）の処置に使用することができる。ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物は、ＡＬＫおよび／またはＡＬＫキナーゼ活性の発現（例えば、転写、翻訳、および／または安定性）を阻害してもよいことは、認められるべきである。インヒビターは、ＡＬＫを阻害する特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターまたは非特異的なインヒビター（例えば、非特異的キナーゼインヒビター）またはマルチターゲットインヒビターであってもよい。ＡＬＫキナーゼのインヒビターが開発され、前臨床モデルで検討された。初期の研究は、ＷＨＩ−Ｐ１５４（ＩＣ５０ 〜５μＭ）、ピリドン（スタウロスポリンのＩＣ５０ ０．１５〜０．７８μＭ）などのＡＬＫインヒビターを用いて、またはＨＳＰ９０インヒビターとともに行われた(Li et al., Med Res Rev, 2007, Aug 10, Epub ahead of print)。その後に、ジアミノまたはアミノピリミジンなどのより強力で特異的なＡＬＫインヒビターが開発された。これらは、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６などのＡＬＫキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジンインヒビターを含む(Galkin et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104:270-275; Zou et al., Cancer Res, 2007, 67:4408-4417)。これら両インヒビターは、良好な生物学的利用能を有し、それらはＡＬＫキナーゼ活性およびＮＰＭ−ＡＬＫポジティブのリンパ腫細胞の成育を、低ナノモル範囲（Ｋａｒｐａｓ２９９細胞で、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６それぞれ２〜５ｎＭおよび２６ｎＭのＩＣ５０）で阻害する。ＰＦ−０２３４１０６６は、現在第Ｉ相臨床開発中の、ＭＥＴおよびＡＬＫの両方のインヒビターである。本明細書に記載の方法は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を示す対象におけるＮＳＣＬＣの処置のための、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害するいずれのキナーゼインヒビターの使用も包含する。いくつかの態様では、キナーゼインヒビターは、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４である(Galkin et al., Proc Natl Acad Sci., 2007, 104(1):270-5)。他の態様では、キナーゼインヒビターは、ＰＦ−０２３４１０６６である(Christensen et al., Mol Cancer Ther, 2007, 6(12 Pt 1):3314-22)。ＡＬＫキナーゼ活性の下流ターゲットは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＳＴＡＴ３、ホスホリパーゼγ、および細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）を含む(Amin et al., Blood, 2007, 110:2259-2267)。いくつかの態様では、すべてではない場合に、少なくともいくつかの癌細胞でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を示す疾患（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する対象（例えば、ＮＳＣＬＣ患者）は、下流シグナル伝達経路の成分を阻害する１または２以上の組成物を含む処置を推薦または処方されてもよい。
【００５３】
いくつかの態様では、ＡＬＫキナーゼの活性を阻害する組成物は、小分子、ペプチド、アプタマー、または抗体であってもよい。他の態様では、ＡＬＫキナーゼの活性を阻害する組成物は、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤であってもよい。本明細書で使用されるように、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤は、ＡＬＫの発現を阻害可能ないずれの分子または組成物になり得る。例えば、それはＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または他の適した分子、またはそれら組み合わせのいずれかであろう。ＮＰＭ−ＡＬＫ含有モデルでの、ＡＬＫのｓｈＲＮＡノックダウンを使用する研究は、成育阻害およびアポトーシスを示し、ＡＬＫ阻害が潜在的に有効な治療戦略であるかもしれないことを示唆した(Piva et al., Blood, 2006, 107:689-697)。
【００５４】
当該技術分野で既知の多様な遺伝子ノックダウンの戦略は、遺伝子発現（例えば、ＡＬＫ発現）を阻害するために使用することができる。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、および他の当該技術分野で既知の小分子干渉核酸に基づく分子を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を使用する遺伝子ノックダウン戦略が使用されてもよい。ＡＬＫ発現をノックダウンする方法、およびＡＬＫ発現のノックダウンに適した分子の例が、米国特許公報20080279870、20080090776および20050005314から参照によって組み込まれる。さらに、当業者はＡＬＫ配列(GenBank identifier NM_004304)に基づいて、過度の実験なしにＡＬＫ発現ノックダウンのためのコンストラクトを設計することができるであろう。ある態様では、ベクターに基づくＲＮＡｉ様式（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒ発現コンストラクト）が、細胞で遺伝子（例えば、ＡＬＫ）の発現を減少させるために使用される。いくつかの態様では、本発明の治療上の組成物は、ｓｈＲＮＡなどの低分子干渉核酸を発現する単離プラスミドベクター（例えば、当該技術分野で既知または本明細書で開示された単離プラスミドベクターのいずれか）を含む。単離プラスミドは、小分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする遺伝子に、操作可能となるように結合した腫瘍特異的プロモーターを含んでもよい。ある場合には、単離プラスミドベクターは、個体に感染することが可能なウイルスに収められている。代表的なウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、および当該技術分野で既知および本明細書で開示される他のものを含む。
【００５５】
ｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドおよび／または改変したｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドなどの、広範囲のＲＮＡｉに基づく様式が、細胞で遺伝子の発現を阻害するために利用できるであろう。改変したｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドは、効力、ターゲットへの親和力、安全性のプロファイル、および／または、例えば細胞内分解に対して抵抗性または部分的に抵抗性にするために安定性を改変するように修飾したものである。例えば、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性、結合親和力、および／または取り込みを増加させるために、ホスホロチオエートなどの修飾を、オリゴヌクレオチドにすることができる。加えて、疎水化および生物共役化は、ｓｉＲＮＡの運搬およびターゲッティングを増強し(De Paula et al., RNA. 13(4):431-56, 2007)、リボ−ジフルオロトルイル（ribo-difluorotoluyl）ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、遺伝子発現抑制活性を維持する(Xia et al., ASC Chem. Biol. 1(3):176-83, (2006))。無修飾ｓｉＲＮＡよりＳ１ヌクレアーゼ分解に抵抗性のある、アミド結合オリゴリボヌクレオシドのｓｉＲＮＡが、産生された(Iwase R et al. 2006 Nucleic Acids Symp Ser 50: 175-176)。加えて、糖部２’位およびリン酸ジエステル結合でのｓｉＲＮＡの修飾は、有効性の失うことなく血清安定性を向上させる(Choung et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 342(3):919-26, 2006)。遺伝子（例えば、ＡＬＫ遺伝子）の発現阻害に使用することができる他の分子は、遺伝子、ＲＮＡ転写物、またはタンパク質を対象にするセンスおよびアンチセンス核酸（一本鎖または二本鎖）、リボザイム、ペプチド、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重らせん体形成オリゴヌクレオチド、抗体、およびアプタマーおよびそれらの修飾型を含む。アンチセンスおよびリボザイムの抑制戦略は、遺伝子産物の発現を減少させることにより、または、変異部位で変異転写物を切断することにより、腫瘍表現型の逆転をもたらした(Carter and Lemoine Br. J. Cancer. 67(5):869-76, 1993; Lange et al., Leukemia. 6(11):1786-94, 1993; Valera et al., J. Biol. Chem. 269(46):28543-6, 1994; Dosaka-Akita et al., Am. J. Clin. Pathol. 102(5):660-4, 1994; Feng et al., Cancer Res. 55(10):2024-8, 1995; Quattrone et al., Cancer Res. 55(1):90-5, 1995; Lewin et al., Nat Med. 4(8):967-71, 1998)。リボザイムはまた、変異遺伝子の遺伝子発現阻害およびターゲットトランススプライシングによる変異矯正の両方の手段として提案された(Sullenger and Cech Nature 371(6498):619-22, 1994; Jones et al., Nat. Med. 2(6):643-8, 1996)。リボザイム活性は、例えば、タンパク質または促進性オリゴヌクレオチドに結合する非特異的な核酸の使用によって増大する(Herschlag et al., Embo J. 13(12):2913-24, 1994; Jankowsky and Schwenzer Nucleic Acids Res. 24(3):423-9,1996)。マルチターゲットリボザイム（結合型またはショットガン型）は、リボザイムの遺伝子抑制効率を向上させる手段として示唆された(Ohkawa et al., Nucleic Acids Symp Ser. (29):121-2, 1993)。
【００５６】
三重らせん体アプローチは、配列特異的遺伝子抑制についても研究された。三重らせん体形成オリゴヌクレオチドは、ある場合には、配列特異的な方法で結合することがわかった(Postel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(18):8227-31, 1991; Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(2):504-8, 1992; Hardenbol and Van Dyke Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(7):2811-6, 1996; Porumb et al., Cancer Res. 56(3):515-22, 1996)。同様に、ペプチド核酸は、遺伝子発現を阻害することが示された(Hanvey et al., Antisense Res. Dev. 1(4):307-17, 1991; Knudsen and Nielson Nucleic Acids Res. 24(3):494-500, 1996; Taylor et al., Arch. Surg. 132(11):1177-83, 1997)。副溝結合ポリアミドは、配列特異的な方法でＤＮＡターゲットに結合することができ、したがって、ＤＮＡレベルでの抑制のための有用な小分子を代表しているかもしれない(Trauger et al., Chem. Biol. 3(5):369-77, 1996)。加えて、ドミナントネガティブ変異ペプチドおよび抗体を用いて、タンパク質レベルでの干渉により、抑制が得られた(Herskowitz Nature 329(6136):219-22, 1987; Rimsky et al., Nature 341(6241):453-6, 1989; Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(9):3199-203, 1989)。ある場合には、抑制戦略は、タンパク質の随伴する減少はなく、ＲＮＡレベルの減少をもたらした一方で、他ではＲＮＡの減少は、タンパク質の減少に反映した。利用可能である多様な一連の抑制戦略は、興味の対象となるタンパク質（例えば、ＡＬＫポリペプチド）をターゲットするために選択され得るＤＮＡアプタマーおよび／またはＲＮＡアプタマーの使用を含む。
【００５７】
本発明の側面は、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲまたはＲａｓなどの他の遺伝子の発現状態に関係なく、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合によって特徴づけられる癌の処置に関すると認められるべきである。いくつかの態様では、ＥＧＦＲインヒビター（例えば、ＥＧＦＲ活性、発現など、またはそれら組み合わせのいずれかのインヒビター）も、対象に推薦、処方、または投与される。いくつかのＥＧＦＲインヒビターの非限定例は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、およびＡＧ１４７８を含む。いくつかの態様では、化学療法剤も、対象に推薦、処方、および／または投与される。化学療法剤は、アルキル化剤、核酸（例えば、ＤＮＡ）損傷剤、または他の適した化学療法剤であってもよい。いくつかの態様では、化学療法剤は、白金に基づく化合物（例えば、シスプラチンまたは関連化合物）である。いくつかの態様では、１または２以上のＥＧＦＲインヒビター、１または２以上のＡＬＫキナーゼインヒビターおよび／または１または２以上の化学療法剤の組み合わせが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合に関連する症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有すると同定された対象に、推薦、処方、および／または投与されてもよい。
【００５８】
いくつかの態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象は、ＥＧＦＲ変異を有するとも診断される。ある態様では、ＥＧＦＲ変異は活性化変異である。本明細書で使用されるように、ＥＧＦＲの活性化変異は、野生型ＥＧＦＲと比較して活性の増加をもたらすいずれのＥＧＦＲ変異である。例えば、ＥＧＦＲの活性化変異は、ＥＧＦＲの恒常的活性をもたらすかもしれない。いくつかの態様では、ＥＧＦＲシグナルの増加と関連する癌は、細胞外ドメイン内に欠失があるＥＧＦＲの変異型を発現していてもよい。ある態様では、変異型のＥＧＦＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩである。ある態様では、ＥＧＦＲシグナル活性の増加を生じる変異は、ＥＧＦＲシグナルの増加を起こすＥＧＦＲの細胞外ドメイン（例えば、細胞外ドメインをコードするＥＧＦＲ遺伝子の一部）での点変異、欠失、挿入、複製、逆位または他の変異のいずれか、またはそれら組合せのいずれかによって生じてもよい。ＥＧＦＲシグナルの増加をもたらす変異は、ＥＧＦＲの細胞内ドメイン内であってもまたよい（例えば、欠失、点変異、挿入、複製、逆位など、またはそれら組合せのいずれか）。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位およびＥＧＦＲ変異を両方有すると診断された対象は、ＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する、１または２以上の組成物の投与を介して処置されてもよい。いくつかの態様では、対象は手術および／または放射線治療も受ける。
【００５９】
いくかの態様では、処置される疾患は癌である。癌細胞は、正常な成育制御の喪失が原因で、異常に分裂および複製する細胞である。癌細胞は、ほとんど常に、少なくとも一つの遺伝子変異から生じる。「腫瘍（tumor）」の用語は、文字通りに「新たな成育」を意味する新生物（neoplasm）と通常等しく、「癌（cancer）」と互換的に使用される。「新生物の障害（neoplastic disorder）」は、細胞の増殖、特に新生物に関連するいずれかの障害である。「新生物」は、その出現を始めた発癌性因子を取り除いた後に、持続して増殖する組織の異常な集団である。良性および悪性の二つのタイプの新生物がある。ほとんどすべての良性腫瘍は、被包性および非侵襲性である。対照的に、悪性腫瘍はほとんど被包性ではないが、隣接する組織に、浸潤性の破壊的成育によって侵入する。この浸潤性の成育は、最初の腫瘍とは非連続的な部位に腫瘍細胞を移植することを伴う。本発明の方法は、本明細書に記載される他の各腫瘍と同様に、肉腫、細胞種、線維種、白血病、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、および神経膠腫を限定せずに含むヒトの新生物の障害の処置に使用できる。
【００６０】
本明細書で使用される「癌」は、身体臓器およびシステムの正常な機能を干渉する細胞の制御されない成育を言及する。最初の部位から転移し、臓器に接種する癌は、発症した臓器の機能的悪化を介して、最終的には対象の死をもたらす。白血病などの造血性の癌は、対象中の正常な造血性のカウンターパートを打ち負かすことができ、そのため（貧血、血小板減少症、および好中球減少症の形で）究極的には死の原因となる造血不全をもたらす。
【００６１】
転移腫瘍は、原発性腫瘍の部位とは異なり、原発性腫瘍から身体の他の部位への癌細胞の播種に起因する癌細胞の領域である。原発性腫瘍の集団の診断時に、対象は転移腫瘍の存在についてモニタリングされてもよい。転移腫瘍は、特異的な症候のモニタリングに加えて、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板数、肝臓機能調査、胸部Ｘ線、および骨スキャンの単独の使用または併用によって、もっともよく検出される。
【００６２】
癌は、限定せずに、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭および首の癌、胃癌、上皮内腫瘍、腎癌、喉頭癌、白血球、肝癌、肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽腫、口腔癌（例えば、唇、下、口、および咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系の癌を、他の細胞種および肉腫と同様に含む。いくつかの態様では、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）が、処置または診断される癌である。
【００６３】
ある側面では、癌を有する対象に本発明の組成物を投与することに関係し、癌を処置する方法が提供される。「癌を有する対象」は、癌と診断された対象である。いくつかの態様では、対象は固形腫瘤によって特徴づけられる癌のタイプを有する。存在する場合、固形腫瘤は、原発性腫瘤であってもよい。原発性腫瘤は、組織の正常な細胞から、変換に起因する癌細胞の組織での成育を言及する。ほとんどの場合、原発性腫瘤は、視覚的および触診の方法を通じて発見され得る嚢胞の存在によって、もしくは形状、手触りまたは組織の重量の不規則性によって、同定される。
【００６４】
しかしながら、いくつかの原発性腫瘍は触知できなく、Ｘ線（例えば、マンモグラフィー）などの医用画像の技法を通して、または針穿刺吸引によってのみ検出可能である。これら後者の技法の使用は、早期検出でより一般的である。組織内での癌細胞の分子および表現型の分析は、通常、癌が組織に対して内因性であるか、または病変はもう一つの部位からの転移が原因であるかを確認するだろう。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「癌医薬」は、癌の処置を目的として対象に投与される剤を言及する。本明細書で使用されるように、「癌の処置」は、癌の発生を防止すること、癌の症候を減少すること、および／または確立した癌の成育を阻害することを含む。他の側面では、癌医薬は、癌発生のリスクを減少させる目的で、癌発生のリスクにある対象に投与される。様々なタイプの癌の処置のための医薬が本明細書に記載される。癌医薬は、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、および生物学的応答修飾因子などのカテゴリーを包含する。癌医薬は、対象中の腫瘍または癌の負荷（すなわち、癌または腫瘍細胞の数）を減少するよりもむしろ、癌の症候を減少させるために、対象に投与する剤も含む。この後者のタイプの癌医薬の一つの例は、正常な範囲内で赤血球および／または血小板レベルを維持するために、癌を有する対象にする輸血である。例として、かかる輸血の非存在下では、正常なレベル以下の血小板の癌患者は、止血不能の出血のリスクにある。
【００６６】
癌医薬は、癌の処置を目的とした外科手術または放射線療法のいずれも言及しない。 本発明の多様な側面によると、いくつかの型のＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する組成物および癌医薬は、癌の処置を目的とした外科手術および／または放射線療法の後に投与されてもよい。手術および放射線照射は、まだ一般的に種々の癌を処置するために使用されている。ある場合には、手術は癌発生のリスクを減少させる予防方法にも使用される。この後者の手術の使用例として、乳癌発生のリスクのある対象、例えば、乳癌に対して家族性の傾向がある者は、その疾患の発生リスクを減少させるために、乳房の除去（すなわち、乳房切除）を時々受ける。そのうえ、例の部門に記載するように、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の試験を受けた複数の患者は、ＮＳＣＬ細胞種の外科的除去を受けた、または受ける予定である。
【００６７】
そのうえ、本発明の方法は、ＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する組成物とともに、１以上の癌医薬の使用を包含するように意図される。例として、適切な場合には、ＡＬＫキナーゼ活性および／またはＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する組成物は、化学療法剤および免疫療法剤の両方とともに投与されてもよい。代わりに癌医薬は、癌を有する、または癌発生のリスクのある対象を処置する目的で一つの対象にすべて投与される、免疫療法剤と癌ワクチン、または化学療法剤と癌ワクチン、または化学療法剤、免疫療法剤および癌ワクチンを包含してもよい。
【００６８】
本明細書で使用されるように、化学療法剤とは、癌細胞を直接ターゲットする化学的および生物学的な剤である。これら剤のいくつかは、持続生存に依存する癌細胞の細胞活性を阻害するように機能する。化学療法剤のカテゴリーは、アルキル化／アルカロイドの剤、代謝拮抗剤、ホルモンまたはホルモン類似体、および数々の抗悪性腫瘍剤を含む。
【００６９】
本発明による使用できる化学療法剤の例は、限定せずに、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、リュープロリド酢酸塩（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸塩、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸塩、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ、メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン、ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）およびビンデシン硫酸塩を含む。
【００７０】
ホルモン療法は、本明細書に開示する癌の処置方法と併用してもよい、もう一つの治療アプローチである。ホルモン療法は、癌を有する、または癌を有するリスクがある対象の処置における、ホルモンまたはホルモンの代替物および誘導体の使用を言及する。例は、エストロゲン療法、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール（例えば、乳癌および前立腺癌）、抗エストロゲン療法、例えば、タモキシフェン（例えば、乳癌）、プロゲスチン療法、例えば、メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール（例えば、乳癌および子宮内膜癌）、アンドロゲン遮断、例えば、フルタミドなどの抗アンドロゲン物質（例えば、前立腺癌）、副腎ステロイドを含む副腎皮質ステロイド（例えば、リンパ性白血病およびリンパ腫）、合成グルココルチコイド療法、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、およびデキサメタゾン（例えば、乳癌およびいくつかの中枢神経系腫瘍）、アンドロゲン、例えば、フルオキシメステロン（例えば、乳癌）、合成テストステロン類似体、アロマターゼインヒビター、例えば、アミノグルテチミド（例えば、乳癌）、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えば、リュープロリド（例えば、前立腺癌）、ソマトスタチン類似体、例えば、オクトレオチド（例えば、胃癌および膵癌）を含む。
【００７１】
生物学的応答修飾因子とは、癌細胞の直接の細胞毒性によることよりもむしろ、対象の癌に対する応答を変化させる剤である。例は、サイトカイン、例えば、Ｉ型インターフェロン（αおよびβ）、ＩＩ型インターフェロン（γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）、およびＴＮＦαおよびＴＮＦ−β、もしくは造血系増殖因子、例えば、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦを含む。
【００７２】
本発明の組成物は、有効量で投与されてもよい。有効量とは、医学的に望ましい結果の供給に十分な本発明組成物の投与量である。有効量は、処置される特定の症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）の発症を遅らせること、進行を阻害すること、発症または進行を一斉に停止することに必要な量を意味する。有効量は、症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）の１または２以上の兆候または症候を減少させる量であってもよい。対象に投与される場合、有効量は処置される特定の症状（例えば、ＮＳＣＬＣ）、症状の重症度、対象それぞれのパラメーターであって、年齢、健康状態、大きさおよび体重を含むもの、併用する処置、処置の頻度、および投与方法に当然依存するだろう。これら因子は、当業者に周知であり、ただの日常的な実験に取り組まれることができる。
【００７３】
本発明組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象、組成物、および投与方法について、望ましい治療上の応答に達するのに効果的な本発明組成物の量を得るために変動し得る。選択される投与量レベルは、特定の組成物の活性、投与経路、処置される症状の重症度、症状、および処置される対象の前病歴に依存する。しかしながら、望まれる治療上の労力に達するのに必要な量より低い組成物の投与量から始めること、および望まれる効果を達成するまで徐々に投与量を増加することは、当該技術分野の範囲である。いくつかの態様では、低い投与量が、単一の組成物より、複数の組成物の組み合わせに要求されるであろう（例えば、異なるキナーゼを阻害する組成物と併用するＡＬＫキナーゼを阻害する組成物）。同様に低い投与量が、シングルターゲットインヒビターより、１以上のキナーゼを阻害するマルチターゲットインヒビターに要求される。
【００７４】
本発明の組成物は、いずれの適した経路によっても対象に投与され得る。例えば、組成物は経口的に投与でき、舌下に、直腸に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、（粉末、軟膏、または液滴によって）局所的および経皮的に、頬側に、または経鼻的に投与することも含む。本明細書で使用される「非経口的」投与の用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、乳房内、眼内、眼球後部、肺内、くも膜下腔内、皮下および関節内の注射および注入を含む、消化管経由以外の投与方法を言及する。例えば、脳内、腹腔内、脾膜下、または角膜内などの身体に本発明組成物を包埋することを含む、外科的移植も意図される。
【００７５】
本発明組成物の局所的投与の投薬形態は、本明細書に記載されるように、粉末、噴霧、軟膏、および吸入薬を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体およびいずれの必要とする保存剤、バッファー、または要求されるかもしれない噴霧剤（propellant）とともに、無菌条件下で混合される。
【００７６】
非経口的注射のための本発明の医薬組成物は、無菌の注射可能な溶液または分散液中へ、使用直前に再調整するための無菌粉末と同様に、薬学的に許容可能な無菌の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョンを含む。適した水性および非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同様のものなど）およびそれらの適した混合物、植物油（オリーブ油など）、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。例えば、レシチンなどのコーティング剤、分散液の場合には要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。
【００７７】
これら組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントも含むことができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール、および同様なものの多様な抗細菌および抗真菌剤を含むことにより、微生物作用の予防は保証される。糖、食塩、および同様のものなどの等張剤を含むことも望ましいかもしれない。注射可能な医薬剤形の持続的な吸収は、ステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅らせる剤を含むことにより、起こすことができる。
【００７８】
ある場合には、組成物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの組成物の吸収を遅らせることが望ましい。難水溶性の結晶性または非結晶性物質の液状懸濁液の使用によって、この結果は達成される。組成物の吸収率は、したがって溶解率に依存し、次には結晶の大きさおよび結晶形に依存するかもしれない。代わって、非経口的に投与する組成物形態の遅延した吸収は、油性ビヒクル中に組成物を溶解または懸濁させることによって達成される。
【００７９】
注射可能なデポの形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に組成物のマイクロエンカプセルマトリックスを形成することによって作られる。ポリマーに対する組成物の比率、およびに利用される特定のポリマーの性質に依存して、組成物の放出率が調節される。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドライド）を含む。デポ注射製剤は、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに、薬物を封入することによって調製される。
例えば、細菌保持またはウイルス保持フィルターを通して濾過することにより、または使用直前に滅菌水または無菌注射媒体中に溶解または分散可能な無菌固形組成物の剤形での滅菌剤を組み込むことによって、注射可能な製剤を滅菌することができる。
【００８０】
本発明は、本発明医薬組成物の経口投与の方法を提供する。経口固形投薬形態は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042)の８９章に一般的に記載される。経口投与のための固形投与形態は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、トローチまたはロゼンジ、カシェ、ペレット、および顆粒を含む。また、リポソーム被包またはプロテイノイド被包が（例えば、米国特許番号４，９２５，６７３で報告されるプロテイノイドマイクロスフィア）、本組成物の調製に使用することができる。当該技術分野で知られるように、リポソームは一般的に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体に分散する単層または多層状の液晶水和物によって形成される。リポソームを形成可能な、無毒性で、生理学的に許容可能な、および代謝可能な脂質のいずれかが使用される。リポソーム形態の本組成物は、本発明の組成物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤、および同様のものを含有する。好ましい脂質は、天然および合成両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p 33, et seqを参照。リポソーム被包は、多様なポリマーで誘導体化されたリポソームを含んでもよい（例えば、米国特許番号５，０１３，５５６）。一般的に、製剤は本発明の組成物、および胃の中での分解に対して保護および腸の中での生物学的に活性な物質の放出を可能とする不活性成分を含む。
【００８１】
かかる固形投薬形態では、組成物は少なくとも１の不活性で、薬学的に許容可能な賦形剤または担体と混合、または含むように化学修飾される。賦形剤または担体は、好ましくは（ａ）タンパク質分解の阻害、および（ｂ）胃または腸からの血流中への取り込みを可能とする。ある態様では、賦形剤または担体は、本発明組成物の取り込み、組成物の全体的な安定性、および／または身体での組成物の循環時間を増加する。賦形剤および担体は、例えば、クエン酸ナトリウム、または無水リン酸水素カルシウム、および／または（ａ）第三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどの無機塩、およびFAST-FLO（登録商標）、EMDEX（登録商標）、STA-RX 1500（登録商標）、EMCOMPRESS（登録商標）およびAVICEL（登録商標）などの市販の希釈剤と同様に、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、セルロース、修飾デキストラン、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、（ｂ）例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ガム類（例えば、アルギン酸、アカシア）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、およびスクロースなどの結合剤、（ｃ）グリセロールなどの保湿剤、（ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸、炭酸ナトリウム、デンプンに基づく市販の崩壊剤を含むデンプン、EXPLOTAB（登録商標）、グリコール酸ナトリウムデンプン、AMBERLITE（登録商標）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、ゼラチン、橙皮、カルボキシメチルセルロース、天然海綿、ベントナイト、不溶解性カチオン交換樹脂、および寒天、カラヤまたはトラガントなどの粉末ガム類などの崩壊剤、（ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤、（ｆ）第四級アンモニウム化合物もしくはオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの脂肪酸などの吸収促進剤、（ｇ）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、アニオン性界面活性剤であって、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムを含むもの、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムをなどのカチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤であって、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリンサングリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むもの、などの湿潤剤、（ｈ）カオリンおよびベントナイト粘度などの吸収剤、（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＴ）、流動パラフィン、植物油、ワックス、CARBOWAX（登録商標）4000、CARBOWAX（登録商標）6000、ラウリル硫酸マグネシウム、およびそれら混合物などの潤滑剤、（ｊ）デンプン、タルク、焼成シリカ、およびケイアルミン酸水和物を含む、調製時に薬剤の流動性を向上させ、圧縮時に再構成を援助する流動促進剤。カプセル、錠剤、およびピルの場合には、投薬形態はバッファーも含むことができる。
【００８２】
同様のタイプの固体組成物は、高分子ポリエチレングリコールなどと同様にラクトースまたは乳糖などの賦形剤を用いて、軟および硬ゼラチンカプセルの充填剤として利用できる。
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒の固形投与形態は、腸溶性コーティングおよび製剤技術分野で既知である他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができる。それらは任意に、乳白剤（opacifying agent）を含むことができ、任意に遅らせる方法で、活性成分を腸管の一部のみに、または優先的に解放する組成物にもなり得る。代表的な物質は、EUDRAGIT（登録商標）として入手可能な物質などのｐＨ感受性の溶解度を有するポリマーを含む。使用可能な包埋する組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。
【００８３】
適切な場合、本発明の組成物は、１または２以上の上述の賦形剤と、マイクロカプセルの形態にすることができる。経口投与用の液体投与形態は、薬学的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。本発明の組成物に加えて、液体投与形態は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３− ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、およびそれら混合物などの、可溶化剤および乳化剤を含有することができる。
【００８４】
不活性希釈剤のほかに、経口組成物は、そのような、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、着色料、香料、および芳香剤などのアジュバントも含むことができる。経口組成物は処方され、さらに飲料などの食用の製品を含むことができる。本発明の組成物に加えて、懸濁液は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガント、およびそれら混合物などの懸濁剤を含有することができる。
【００８５】
本発明組成物の肺送達もまた、本明細書で意図される。組成物は、吸引しながら哺乳動物の肺へ送られ、それにより肺の上皮層から血流へのトラバースを促進する。Adjei et al., Pharmaceutical Research 7:565-569 (1990)；Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (leuprolide acetate)；Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl.5): s.143-146 (1989)(endothelin-1)；Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3:206-212 (1989)(a1-antitrypsin)；Smith et al., J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (a1-proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins," Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (recombinant human growth hormone)；Debs et al., The Journal of Immunology 140:3482-3488 (1988) (interferon-g and tumor necrosis factor a)、およびPlatz et al., 米国特許番号５，２８４，６５６（顆粒球コロニー刺激因子）を参照。
【００８６】
限定せずに、当業者によく知られているネブライザー、定量噴霧式吸入器、および粉末吸入器を含む、治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械装置が、本発明の実践での使用について意図される。ある本発明の実践に適した市販装置のある特定の例は、Mallinckrodt, Inc.（St. Louis, MO）製のULTRAVENT（登録商標）ネブライザー、Marquest Medical Products（Englewood, CO）製のACORN II（登録商標）ネブライザー、Glaxo Inc.（Research Triangle Park, N.C）製のVENTOL（登録商標）定量噴霧式吸入器、およびFisons Corp.（Bedford, MA）製のSPINHALER（登録商標）粉末吸入器である。
【００８７】
かかるすべての装置は、本発明組成物の投薬に適した製剤の使用を要求する。典型的には、各製剤は、利用する装置のタイプに特異的であり、治療に有用な希釈剤、アジュバント、および/または担体に加えて、適切な噴霧剤物質の使用に関係する。末端の肺への最も効果的な送達のために、組成物は、好ましくは１０ｍｍ以下の平均粒径で、最も好ましくは０．５〜５ｍｍで、粒子の形態に調製してもよい。
【００８８】
担体は、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトールなどの炭水化物を含む。製剤に使用する他の成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどの脂質、天然または合成界面活性剤、ポリエチレングリコール（阻害剤自体を誘導体化するその使用から離れても）、サイクロデキストランなどのデキストラン、胆汁酸塩、および他の関連するエンハンサー、セルロースおよびセルロース誘導体、およびアミノ酸を含む。
加えて、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフィア、複合体、包接錯体（inclusion complex）、または他のタイプの担体の使用が意図される。
【００８９】
噴射や超音波のネブライザーいずれかの使用に適した製剤は、典型的には、ｍＬ当たりの溶液につき、約０．１〜２５ｍｇの生物学的活性のタンパク質濃度で水に溶解した本発明の組成物を含む。製剤は、バッファーおよび単糖も含むことができる（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のために）。ネブライザー製剤は、エアロゾルを形成する溶液の噴霧によって起こる、インヒビター組成物の表面誘導の凝集を減少または防止するための界面活性剤を含有することができる。
【００９０】
一般的に、定量噴霧式吸入器で使用する製剤は、界面活性剤の助けを借りて噴霧剤に懸濁した本発明の組成物を含有する微粉末を含む。
噴霧剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせを含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素などの、この目的のために利用するいずれの従来物質になり得る。適切な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン、大豆レシチンを含む。オレイン酸は、界面活性剤としても有用になり得る。
粉末吸入器から投薬するための製剤は、本発明の組成物を含有する乾燥微粉末を含み、装置から粉の拡散を容易にする量（例えば、製剤の重量の５０〜９０％）のラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールなどの増量剤を含むことができる。
【００９１】
本発明組成物の鼻腔内送達もまた、意図される。鼻腔内送達は、肺において製品を蒸着を必要とせずに、鼻に治療薬を投与後、血流への組成物の通過を直接可能にする。鼻腔内送達のための製剤は、デキストランまたはサイクロデキストランのものが含まれる。他の粘膜を通る輸送を介しての送達もまた、意図される。
【００９２】
直腸または膣投与のための組成物は、好ましくは本発明の組成物と、室温で固体であるが体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤または担体とを混合することにより、調製され得る坐剤である。
【００９３】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の検出のために、染色体調製物でＦＩＳＨアッセイを行うためのキットも、本発明の範囲内にある。かかるキットの例は、核酸プローブのセットを含んでもよく、第一のプローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、そのプローブはＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、そのプローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズし、第二の核酸プローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、そのプローブは非逆位型のＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、そのプローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズする。キットは、染色体調製物でＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行うための第一および第二のプローブの使用についての説明書を、さらに含んでもよい。キットは、癌患者由来の染色体調製物で、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の陽性同定がＮＳＣＬＣの陽性診断を示す、診断目的の説明書をさらに含んでもよい。キットは、癌患者由来の染色体調製物でのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の陽性同定が、患者をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきであることを示す説明書をさらに含んでもよい。
【００９４】
いくつかの態様では、キットはＤＡＰＩなどのＤＮＡ対比染色剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、キットはハイブリダイゼーションバッファーおよび／または洗浄バッファーを限定することなく含む、試薬およびバッファーをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、キットは封入剤および／またはコントロールスライドをさらに含んでもよい。
【００９５】
他の態様では、本発明のキットは、癌または前癌性症状の治療計画を決定するために有用であるかもしれない。例えば、生物学的試料は、ＮＳＣＬＣを有する対象から摂取してもよく、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物への応答をインビトロで試験してもよい。インビトロアッセイに対する陽性応答は、対象がＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物のインビボでの投与に応答するであろうという、正の指標としてとられてもよい。かかるキットの例では、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物、および生物学的試料がＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物での処置に応答するかを決定するために、組成物を生物学的試料で試験するための説明書を含む。
【００９６】
本発明のキットは、癌の処置に有用であってもよい。かかるキットの例は、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する１または２以上の組成物、および癌の処置のための１または２以上の組成物の使用についての説明書を含んでもよい。本発明の側面は、本明細書に記載する１または２以上のインヒビターでの同時処置に関する。したがって、本発明の側面は、本明細書に記載される２またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）インヒビターの組み合わせを含む、キットまたは組成物に関する。
【００９７】
本発明のキットは、本明細書に開示するいずれの生物学的または化学的メカニズムへの関与のための組成物使用の記載を含む。キットは、症状の徴候に対抗するように、病理を処置する活動条件の記載を、さらに含むことができる。すなわち、キットは本明細書で考察する組成物の使用の記載を含む。キットは、２またはそれ以上の本発明組成物の組み合わせの使用についての説明書、または本発明組成物および癌の処置についての治療計画を決定するため、または癌の処置について示される１または２以上の他の化合物の組み合わせの使用についての説明書を含むことができる。説明書はまた、以前に記載された適した技法のいずれかによって組成物を投与するために提供されてもよい。
【００９８】
本明細書に記載されるキットはまた、１または２以上の容器を含んでもよく、組成物および以前に記載された他の成分を含んでもよい。キットはまた、ある場合には、本発明の組成物を混合、希釈、および／または投与または適用のための説明書を含んでもよい。キットはまた、試料中で、またはかかる処置の必要な対象に、成分を混合、希釈または投与するための容器と同様に、１または２以上の溶媒、界面活性剤、保存剤および／または希釈剤（例えば、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）または５％デキストロース）とともに他の容器を含むことができる。
【００９９】
キットの組成物は、例えば、液状の溶液または乾燥粉末として、いずれかの適した形態として提供されてもよい。提供される組成物が乾燥粉末である場合、組成物は適した溶媒の添加によって再構成されてもよく、提供もまたされてもよい。組成物の液状形態が使用される態様では、液状形態は濃縮またはすぐに使用可能な状態であってもよい。溶媒は、組成物および使用方法または投与方法に依存するだろう。薬物組成物のための適した溶媒は、例えば、以前に記載されたように周知であり、文献で利用可能である。溶媒は、組成物および使用方法または投与方法に依存するだろう。
【０１００】
本発明による有用なキットの例が、図７に示される。キット（１１）は、核酸プローブセット（１７および１９）およびそれら使用の説明書（２１）などの成分を収容する容器（１５）を示す。
【０１０１】
本発明は、続く例によってさらに説明され、さらに限定すると解釈されるべきではない。本出願を通じて引用されるすべての参照（参考文献、交付済み特許、公開済み特許出願、および係属中の特許出願を含む）の内容全体が、これに明確に参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
例
例１
肺癌におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位およびＡＬＫキナーゼ阻害に対する感受性
染色体２ｐの逆位に起因するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、〜７％の日本人の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において最近検出された。この遺伝的変化も、インビトロおよびインビボで癌化させていた。米国人（ｎ＝１３８）および韓国人（ｎ＝１６７）の患者由来のＮＳＣＬＣ（ｎ＝３０５）における、およびＮＳＣＬＣ細胞株（ｎ＝８３）におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの頻度が、現在の研究で検討された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの４種の異なる変異体が、８人（３％）のＮＳＣＬＣ（米国人のＮＳＣＬＣ患者から２／１３８（１．５％）、韓国人患者から６／１６７（３．６％））、および３／８３（３．６％）のＮＳＣＬＣ細胞株において、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検出された。すべてのＥＭＬ４−ＡＬＫ含有腫瘍および細胞株は腺癌であり、未または軽（１０パック年（pack years）以下）タバコ喫煙者であるＮＳＣＬＣ患者で、現在／元喫煙者と比較してより頻繁に発生した（６％対１％；ｐ＝０．０４９）。非常に特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターであるＮＶＰ−ＴＡＥ６８４の有効性は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位があるＮＳＣＬＣ細胞株で検討された。３種の細胞培養株のすべてにおいてＡＬＫのリン酸化が阻害されたにもかかわらず、３種の細胞株のうち１種の成育のみが、Ｈ３１２２がＮＶＰ−ＴＡＥ６８４によって阻害され、これは顕著なアポトーシスを伴った。他の２種のＥＭＬ４−ＡＬＫ含有細胞株においては、Ｈ３１２２とは異なり、ＡＬＫのリン酸化阻害は、ＡＬＫ、ＳＴＡＴ３またはＥＲＫ１／２リン酸化阻害をもたらさないか、部分的にのみもたらした。これらの研究は、ＡＬＫ阻害剤は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を抱える肺癌のサブセットのための潜在的に効果的な治療であり、さらに臨床開発を支援するかもしれないことを示唆する。
【０１０３】
材料と方法
細胞株および腫瘍
肺癌細胞株（８０種のＮＳＣＬＣ、２種の中皮腫、および１腫の神経内分泌腫瘍株）は、ＡＴＣＣ(Manassas, VA)から購入され、またはJohn D. Minna博士およびAdi F. Gazdar博士(UT Southwestern, Dallas, TX)より受け取った（表１）。ダナ・ファーバー癌研究所で、２種の追加のＮＳＣＬＣ細胞株（ＤＦＣＩ０２４、ＤＦＣＩ０３２）が、未処置の喫煙未経験の女性ＮＳＣＬＣ患者の胸水から樹立された。
【０１０４】
ＮＳＣＬＣ腫瘍標本（ｎ＝３０５）は、ＲＮＡ抽出に十分な材料が入手可能である外科的切除から回収した。癌のステージ分類は、ＩＡＳＬＣステージ分類ガイドラインに従って行われた。腫瘍は、２００４ＷＨＯ分類システムによって分類した。７０％以上の腫瘍細胞含量のある凍結腫瘍組織が、さらなる分析に使用された。加えて、手術前ネオアジュバント治療を受けた患者、手術から１月以内に死亡した患者、二重の原発性肺癌のある患者、胸水または胸膜播種のある患者、および不完全な切除を受けた、または縦隔リンパ節郭清を受けなかった患者の腫瘍組織は、研究から除外された。 標本の大部分（ｎ＝１６７）が、１９９５〜２００７年の間に韓国のサムスンメディカルセンターで回収された一方で（韓国人コホート）、残りの標本（ｎ＝１３８）は、マサチューセッツ州ボストンのブリッガム女性病院で回収され（米国人コホート）、以前に公表された（１４〜１６）。
【０１０５】
腫瘍および細胞株標本は、急速冷凍され、−８０℃で保存された。ＲＮＡは、Trizol(Invitrogen, Carlsbad、CA)で抽出され、Rneasy Mini Kit (Qiagen、Valencia、CA)で精製された。０．５〜１μｇの全ＲＮＡは、QuantiTect逆転写キット(Qiagen, Valencia, CA)でのｃＤＮＡ合成に使用された。
【表１】
【表２】
【表３】
【０１０６】
エクソンアレイ試験
肺癌細胞株におけるＡＬＫの転座をスクリーニングするために、これら細胞株由来のｍＲＮＡから以前に産出した現存のAffymetrix HuEx-1.0 Exon Array (Affymetrix, Santa Clara, CA)のデータを使用した。プローブが全転写物の３’末端に制限されている典型的なｍＲＮＡ発現アレイとは異なり、HuEx-1.0アレイはヒトゲノムのすべての既知および予測されたエクソンに位置するプローブを含有するように設計された。ＡＬＫ遺伝子の転座は、３’末端（キナーゼドメイン）におけるより高い発現で、異なるレベルの発現量が切断点の５’側と３’側のエクソンとの間で生じると考えられた。全プローブについてのアレイのノーマライズおよびバックグラウンド補正を行った後、分析はＡＬＫ遺伝子（参照配列ＮＭ＿００４３０４）にユニークに位置する１０４のプローブに制限した。その遺伝子全域のプローブの応答特性の違いを補正するために、全試料について、プローブ強度値は他の野生型標本全域の平均プローブ強度で割った。各細胞株について、切断点である可能性の最も高い位置は、５’と３’とのプローブサブセット間の平均発現量の最大偏差を与えるプローブとして算定された。各推測切断点についての有意水準が、単純両側ｔ検定を用いて計算された。
【０１０７】
ＲＴ−ＰＣＲおよび変異分析
ＥＭＬ４−ＡＬＫのＲＴ−ＰＣＲ解析については、ＥＭＬ４−ＡＬＫを最初に記載した論文で使用した同一のプライマー配列（プライマーセット１）が用いられた（９）。プライマーセット１では、フォワードプライマーはＥＭＬ４のエクソン１３に位置する一方で、リバースプライマーはＡＬＫのエクソン２０に位置する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合は、ＥＭＬ４のエクソン６とＡＬＫのエクソン１９との間でも起こり得る（変異体３）（Mano H. 未発表）。ここで、プライマーは、プライマーセット１では失敗するため、ＥＭＬ４のエクソン３におけるフォワードプライマー(5’-taccagtgctgtctcaattgcagg- 3’) （配列番号３）を有し、プライマーセット１と同一のリバースプライマーを使用する追加のプライマーセット（プライマーセット２）を使用した。ＰＣＲ増幅は、製造元のガイドラインに基づいて、JumpStart Taq酵素(Sigma, St. Louis, MO)を用いて行った。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１０８】
ＮＳＣＬＣ腫瘍については、ＫＲａｓまたはＥＧＦＲの遺伝子型同定は、ＲＴ−ＰＣＲに基づくSURVEYOR-WAVE変異分析（１７）を用いて行い、その後、陽性標本の配列決定、またはＲＴ−ＰＣＲ産物の直接の配列決定を行った。ＤＦＣＩ０３２細胞株の変異分析は、ＥＧＦＲ、ＫＲａｓ、Ｂ−Ｒａｆ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＨｅｒ２における既知の変異を抱える特異的なエクソンについてのプライマーとともに、ゲノムＤＮＡに基づくSURVEYOR-WAVE分析を用いて行った。
【０１０９】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１−６６７Ｉ６およびＲＰ１１−１００Ｃ１（オークランド小児病院研究所、Oakland、CA）を、それぞれＥＭＬ４遺伝子およびＡＬＫ遺伝子のプローブとして使用した。ＢＡＣクローンは、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート状にそれぞれストリークし、３７℃、オーバーナイトで生育させた。各ＢＡＣクローン由来の一つのコロニーが選択され、ＴＢ中で３７℃、オーバーナイトで生育させ、確立した手法を用いてＢＡＣ ＤＮＡを抽出した。
【０１１０】
中期ＦＩＳＨのためのスライドは、標準の細胞遺伝学的な手法を用いて調製した。パラフィン包埋スライドは、６０℃のホットプレート上にオーバーナイトでインキュベートし、その後室温でそれぞれ２分間、２回キシレン処理に曝した。組織は、その後１００ｍＭトリス塩基／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）中に１００℃で４５分間置き、室温で５〜１０分間１×ＰＢＳですすいだ後、１５０ｍＬのDigest-All(Zymed, San Francisco, CA)で３７℃、２０分間の処理を２度した。スライドは、室温で５〜１０分間１×ＰＢＳですすぎ、その後室温で１分間、１０％ホルマリン中で固定した。最後に、組織は７０％、９０％、および１００％の一連のエタノールでそれぞれ２分間脱水した。
【０１１１】
ＲＰ１１−１００Ｃ１ ＢＡＣ ＤＮＡ（１μｇ）は、製造元の推薦プロトコルを用いて、ニックトランスレーションによってspectrum red dUTP(Vysis, Des Plains, IL)で標識し、１μｇのＲＰ１１−６６７Ｉ６ＢＡＣ ＤＮＡは、ニックトランスレーションによってspectrum green-11-dUTP(Vysis, Des Plains, IL)で標識した。プローブは、５０μｇのCot-1 DNAと組み合わせ、エタノール沈殿し、および２０μｌの５０％ホルムアミド含有hybrizolに再懸濁した。プローブは、標準のＦＩＳＨ手順に従って（１８）、ハイブリダイズおよび洗浄した。
【０１１２】
ＡＬＫキナーゼインヒビター
ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４は、強力で特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターであり、ダナ・ファーバー癌研究所のN. Gray博士によって合成された（１２、１９、２０）。ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４は、特許で公開されている手順に従って合成し、得られた化合物の構造および純度は、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて確認した。
【０１１３】
細胞増殖および成育アッセイ
成育および成育阻害は、メトキシテトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイによって評価した。生存細胞の数を決定するための比色法であるこのアッセイは、細胞による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）の、細胞培養培地中に可溶なホルマザン産物への生体内還元に基づき、分光測定で検出可能である。ＮＳＣＬＣ細胞は７２時間の処理に曝し、実験あたりに使用した細胞の数を経験的に決定した。全実験ポイントは、６から１２のウェルで設定し、全実験は少なくとも３回繰り返した。データは、Windows（登録商標）用GraphPad Prism version 3.00を用いて図示された（GraphPadインターネットサイトで利用可能なGraphPad Software）。曲線は、Ｓ字用量反応とともに非線形回帰モデルを用いてフィットさせた。
【０１１４】
抗生物質およびウェスタンブロッティング
以前に特定した条件下で成育した細胞は、製造元のガイドラインに基づいて、Cell Lysis Buffer(Cell Signaling Technologies, Danvers, MA)を用いて溶解した。細胞溶解後、ライセートは４℃、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清が続く手順に使用された。ウェスタンブロット解析は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動およびニトロセルロース膜への転写によって分離した後に行った。免疫ブロッティングは、抗体製造元の推薦に従って行った。 抗体の結合は、増強化学発光システムを用いて検出した(Perkin Elmer, Boston, MA)。 抗ＡＬＫ、抗リン酸化ＡＬＫ（Ｔｙｒ−１６０４）、抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ−４７３）、抗Ａｋｔ、抗ＳＴＡＴ３、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）、抗ＰＴＥＮ、および抗ＰＡＲＰ抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から得られた。全ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＴ１８５／ｐＹ１８７）抗体は、Biosource International (Camarillo, CA)から購入した。抗α−チューブリン抗体は、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。
【０１１５】
蛍光標識細胞分取分析
細胞は回収し、少なくとも１時間（または実験の準備が整うまで）４０％エタノールで固定した。固定した細胞は、０．５ｍＬの５００ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡで、３７℃、４５分間処理し、６９ｍｍｏｌ／Ｌヨウ化プロピジウム（３８ｍＭクエン酸ナトリウム中）で、少なくとも３０分間、暗所で室温にて染色した。染色細胞は、ModFit(Verity Software House, Topsham, ME)およびCellQuest(Becton Dickinson, San Jose, CA)プログラムの両方を用いて、Becton Dickinson蛍光標識細胞分取器中でＤＮＡ含量について分析した。
【０１１６】
結果
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の同定
８３種の肺癌細胞株のパネル（表１）を潜在的なＡＬＫの転座について迅速にスクリーニングするために、以前にこれら細胞株由来のｍＲＮＡから産生した現存のAffymetrix HuEx-1.0 Exon Arrayデータを使用した。ＡＬＫ遺伝子の転座は、３’末端（キナーゼドメイン）におけるより高い発現で、異なるレベルの発現量が切断点の５’側と３’側のエクソンとの間で生じると考えられた。各細胞株について、切断点である可能性の最も高い位置は、５’と３’とのプローブサブセット間の平均発現量の最大偏差を与えるプローブとして算定された。
【０１１７】
この方法を用いて、ＡＬＫ遺伝子において統計学的に有意な切断点を有する２種の細胞株、Ｈ３１２２およびＨ２２２８が同定された（ｐ<０．００１）（図１Ａおよび図５）。使用したアルゴリズムは、切断点の位置または方向を考慮しなかったが、両試料の推測ＡＬＫ切断点は、ＡＬＫ遺伝子における保存されたエクソン２０の切断点と非常に近く、両試料中で、発現は５’末端より３’末端でより高かった。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、融合遺伝子産物の存在は、Ｈ３１２２およびＨ２２２８の両方で確認されたが、他の８１種の細胞株においては確認されなかった。Ｈ３１２２においては、ＲＴ−ＰＣＲプライマーセット１（ＥＭＬ４のエクソン１３におけるフォワードプライマー、ＡＬＫのエクソン２１におけるリバースプライマー）は、〜２５０ｂｐの産物を産生した一方で、Ｈ２２２８細胞株では、プライマーセット２（ＥＭＬ４のエクソン３でのフォワードプライマー、ＡＬＫのエクソン２１におけるリバースプライマー）は、〜４５０ｂｐの産物を産生した（図１Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、サンガー塩基配列決定法によって確認し、Ｈ３１２２におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの変異体１およびＨ２２２８における変異体３の存在を示した。他の融合変異体には存在しない選択的にスプライシングした３３ｂｐ断片（エクソン７ａ）が、この細胞株において検出された（図１Ｃ、表２）。Ｈ３１２２およびＨ２２２８の両細胞株は、腺癌の組織診断のある女性ＮＳＣＬＣ患者から樹立し、およびＨ２２２８細胞株は喫煙の未経験者由来であるため、スクリーニングは、これらのダナ・ファーバー癌研究で確立した臨床的特徴とともに、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの存在について行った。ＤＦＣＩ０２４およびＤＦＣＩ０３２の２種の細胞株が同定され、両方とも腺癌のある化学療法未処置の喫煙未経験者由来であった。両細胞株は、ＥＧＦＲおよびＫｒａｓについて野生型であった。プライマーセット２を用いるＲＴ−ＰＣＲで、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、ＤＦＣＩ０３２細胞株で検出された（図１Ｂ）。したがって、すべてあわせて、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位が、３／８３（３．６％）のＮＳＣＬＣ細胞株で検出された。
【０１１８】
表２ 融合変異体３で検出された選択的にスプライシングしたＥＭＬ４のエクソン７ａについての配列
【数１】
【０１１９】
ＮＳＣＬＣ腫瘍によけるＥＭＬ４−ＡＬＫ
米国人（ｎ＝１３８）および韓国人（ｎ＝１６７）起源の患者由来のＮＳＣＬＣ（ｎ＝３０５）腫瘍は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲを用いてスクリーニングされた。融合遺伝子の発現は、プライマーセット１で、４種の腫瘍において検出された（図１Ｂ）。２種の腫瘍は、〜２５０ｂｐの大きさのＲＴ−ＰＣＲ産物を有していた一方で、他の２種は、〜４５０ｂｐの大きさの産物を有していた。〜２５０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を有する腫瘍は、変異体１の融合遺伝子を有することをサンガー塩基配列決定法で確認した一方で、より大きな産物の腫瘍は、以前に公表されていない変異体の融合遺伝子（以後、変異体４と命名）を有していた。変異体４の融合遺伝子は、ＥＭＬ４コドン１−５６９がＡＬＫのコドン１０７８−１６２１に融合する（図１Ｃ、表３）。腫瘍はプライマーセット２でもスクリーニングされ、追加４種の腫瘍が、遺伝学的変化に陽性と検出された（図１Ｂ）。これらすべては、変異体３のＥＭＬ４−ＡＬＫを含有することがサンガー塩基配列決定法によって確認された。選択的にスプライシングしたＥＭＬ４のエクソン７ａは、すべての腫瘍においても存在したので、この発見はＨ２２２８細胞株だけに限定していなかったことを示唆する。腫瘍は、結腸腺癌由来の９種の肺転移腫瘍も含み、興味深いことに、これらの一つは、変異体１のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を含んでいた。
【０１２０】
表３ ＲＴ−ＰＣＲプライマーセット１でのＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体４の配列
【数２】
【０１２１】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、３０５人中８人（３％）のＮＳＣＬＣ腫瘍で検出された（図４）。６つの陽性（６／１６７； ３．６％）が、韓国人患者由来の腫瘍で検出された一方で、２つ（２／１３８（１．５％））が、米国人患者由来のＮＳＣＬＣで検出された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの頻度は、男性（２％）に対して女性（４％）でより高かった。ＥＭＬ４−ＡＬＫを含有するＮＳＣＬＣのＮＳＣＬＣ患者は、野生型腫瘍の患者（６１．９歳）より若い年齢中位数（５５．９歳）を有していた。ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性腫瘍の全８種は、腺癌であった。さらに、融合遺伝子は、喫煙者由来の腫瘍（１％；２／１８４）と比較して、制限された喫煙歴（＜１０パック年）の患者でより頻繁に（６％；４／６９）有意に（ｐ＝０．０４９；表４）検出された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の患者２人からは、喫煙情報が入手不可能であった。患者１人由来の腫瘍は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子とともに、同時発生的ＥＧＦＲキナーゼドメイン変異（エクソン１９欠失）を有していた。この患者は、手術を単独で処置され、ＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるゲフィチニブまたはエルロチニブのどちらでも処置されなかった。８種の腫瘍は、いずれも同時発生的Ｋ−Ｒａｓ変異を含んでいなかった。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
ＦＩＳＨを用いるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出
ＲＴ−ＰＣＲおよび長距離ゲノムＰＣＲは、細胞株および／または新鮮腫瘍標本からＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出に適用可能な方法である。しかしながら、大多数の臨床的ＮＳＣＬＣ腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本であり、いずれの方法もＦＦＰＥからＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するのには実現可能ではない。加えて、現在利用可能なＡＬＫのための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブは、小さな染色体の逆位を検出するのに十分な解像度を有しないかもしれないブレークアパートプローブである(Vysis LSI ALK dual color, break apart rearrangement probe, Vysis Inc.)。したがって、既知の５’側のＥＭＬ４切断点（緑色）および既知の３’側のＡＬＫ切断点（赤色）にハイブリダイズするＦＩＳＨプローブが設計された。野生型ゲノムの場合には、プローブは２つの別々のドットに可視化する一方で、逆位および融合の場合には（いずれの変異体でも）、ドットは単一のシグナル（黄色）に併合するはずである（図５）。
【０１２４】
ＦＩＳＨプローブは、最初にＥＭＬ−ＡＬＫ融合遺伝子のある、またはないＮＳＣＬＣ細胞株を用いて検討した。野生型細胞株ＰＣ−９（図３Ａ）およびＡ５４９においては、プローブのシグナルは、２つの別々のドットで見られた。ＤＦＣＩ０３２（図３Ｃ）およびＨ３１２２においては、プローブは、染色体対の１つでＥＭＬ４のＡＬＫへの融合を検出した一方で、他の対は野生型シグナルを示した。興味深いことに、Ｈ２２２８細胞株においては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、小さな染色体外断片において検出された（図３Ｂ）。ＦＩＳＨ法は細胞株においてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を検出可能であったので、次にその方法がＦＦＰＥ標本に使用できるかを調査した。胸水がＤＦＣＩ０３２細胞株を樹立するのに使用された患者からの診断の時点に得られたＦＦＰＥ腫瘍標本が検討された。このＦＦＰＥ腫瘍標本においては、間期の核におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合が、明確に検出された（図３Ｄ）。
【０１２５】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子含有ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＬＫキナーゼ活性の阻害
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を記載する最初の研究においては、ＡＬＫキナーゼインヒビター（ＷＨＩ−１５４）は、融合癌化したＢａ／Ｆ３モデルで成育阻害を誘導することが示された（９）。したがって、融合遺伝子を保有するＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＬＫキナーゼインヒビターの効果を試験した。非常に特異的なＡＬＫキナーゼインヒビターであるＮＶＰ−ＴＡＥ６８４が調べられた（１２）。
【０１２６】
ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４は、Ｈ３１２２細胞株のみ成育を有意に阻害する一方で（ＩＣ５０ 〜１０ｎＭ）、他の２種のＥＭＬ４−ＡＬＫ含有細胞株であるＨ２２２８およびＤＣＩ０３２は、ＥＧＦＲ変異（ＰＣ−９；欠失Ｅ７４６＿Ａ７５０）またはＫ−Ｒａｓ変異（Ａ５４９；Ｇ１２Ｓ）を含むものと同様にその阻害剤に抵抗性（ＩＣ５０ １〜１０μＭ）であることがわかった（図３Ａ）。ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処置はまた、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって（図３Ｂ）、または切断ＰＡＲＰのウェスタン解析によって検出されたように（図３Ｃ）、Ｈ３１２２細胞株のみで顕著なアポトーシスをもたらした。成長停止またはアポトーシスは、ＴＡＥ６８４処理後に他の細胞株においては観察されなかった。
【０１２７】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ含有細胞株の３種中１種のみの成育がＴＡＥ−６８４によって阻害された理由を特定するために、ＡＬＫのリン酸化および下流シグナル伝達タンパク質に及ぼす影響を検討した。全ＡＬＫおよびリン酸化ＡＬＫの両方が、すべてのＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性細胞株（Ｈ３１２２、Ｈ２２２８、およびＤＦＣＩ０３２）において存在していたが、ＥＧＦＲ変異のＰＣ−９細胞株においては非存在であった（図４）。０．１μＭ ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４処置後、リン酸化ＡＬＫの完全な下方制御が、ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性細胞の全３種で観察された。しかしながら、これはＨ３１２２細胞株においてのみ、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２リン酸化の実質的な阻害を伴った。Ｈ２２２８細胞株においては、いくつかだが完全ではないＡｋｔおよびＥＲＫ１／２リン酸化の阻害があった一方で、これらはＤＦＣＩ０３２細胞株では変化していなかった。これら発見を説明するＥＧＦＲ、Ｋｒａｓ、Ｂ−Ｒａｆ、ＨＥＲ２またはＰＩＫ３ＣＡの同時発生的変異は、この細胞株においては検出されなかった（データ非表示）。さらに、ＤＦＣＩ０３２細胞株は、ＰＴＥＮを発現した（図４）。融合遺伝子におけるＡＬＫキナーゼドメイン配列の変化は、Ｈ２２２８またはＤＦＣＩ０３２からは検出されなかった（データ非表示）。
【０１２８】
考察
本研究では、ＮＳＣＬＣ細胞株および異なる民族的背景のＮＳＣＬＣ患者由来の原発性腫瘍におけるＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の頻度を特徴づけた。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、米国人のＮＳＣＬＣ患者より韓国人において、腺癌および制限されたタバコ煙暴露の患者においてより頻繁に、３％のＮＳＣＬＣ標本において検出された。興味深いことに、これら同時の臨床病理学的な特徴は（女性、アジアの民族性、制限されたタバコ喫煙）、ＮＳＣＬＣにおけるＥＧＦＲキナーゼドメイン変異を予測することが示された（２１）。したがって、本研究は、アジア人患者と比較してコーカサス人種由来の、およびタバコ未喫煙者または軽喫煙者由来のＮＳＣＬＣにおける遺伝学的差異についてさらなる証拠を提供する。さらに、以前に処置していない肺腺癌のある女性未喫煙者から樹立した細胞株（ＤＦＣＩ０３２）を含む３種のＮＳＣＬＣ細胞株において、ＥＭＬ４−ＡＬＫが検出された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの転座のあるこれら細胞株の１種は（Ｈ３１２２）、非常に感受性であり、ＡＬＫキナーゼインヒビター（ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４）処置後に、顕著なアポトーシスを起こすこともわかった。Ｈ３１２２細胞株における発見は、この細胞株において、ＡＬＫキナーゼが決定的な生存シグナル経路を単独で調節する癌遺伝子依存性の現象であることを示唆する。ＡＬＫ阻害は、これらシグナル経路のすべての阻害および続くアポトーシスを起こす。これは、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣに類似する（２２、２３）。
【０１２９】
遺伝学的に定義された肺癌患者のサブセットにおける分子標的治療の使用は、効果的な治療戦略として出現している。例として、１０〜３０％のＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲキナーゼドメインに活性化変異を含有し、６０〜８０％のＥＧＦＲ変異の患者は、ＥＧＦＲキナーゼインヒビターであるゲフィチニブまたはエルロチニブで処置後、劇的なＸ線検査の応答を得る（２１、２４）。同様に、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株は、ＥＧＦＲ野生型細胞株と比較して、インビトロでゲフィチニブに非常に感受性であり、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株のみが、ゲフィチニブ処理後のアポトーシスを起こす（２２、２５、２６）。本研究からの発見は、少なくとも腫瘍がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を含むＮＳＣＬＣ患者のサブセットに、ＡＬＫ阻害が有効な治療戦略であるかもしれないことを実証する。さらに、大多数の成人組織においては、ＡＬＫは通常発現していないので、特異的なＡＬＫ阻害剤は忍容性が良好かもしれない。ＡＬＫ阻害剤が臨床開発を経るように、それらはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のあるＮＳＣＬＣ患者においても検討されるべきである。我々は、ＦＦＰＥ標本からＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を検出するのに使用され得るＦＩＳＨアッセイも開発した。これは、ＡＬＫキナーゼインヒビターの臨床研究のために、適切なＮＳＣＬＣ患者の同定を容易にする。
【０１３０】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位がある３種のＮＳＣＬＣ細胞株が同定されたが、３種の細胞株すべてにおいてＡＬＫリン酸化の阻害があったにもかかわらず、３種中１種のみがＴＡＥ６８４によって成育が阻害された（図３および４）。これは、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣとは全く異なっており、大部分のＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株はゲフィチニブまたはエルロチニブにインビトロで感受性である（２２、２７〜２９）。これら差異は臨床的に有意であるかもしれず、ＡＬＫインヒビターは単独でＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位があるＮＳＣＬＣ患者のサブセットに効果的かもしれないことを示唆する。ＤＦＣＩ０３２においては、ＡＬＫ阻害は、下流シグナル伝達タンパク質の阻害を起こさなかった一方で（図４）、Ｈ２２２８においては、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２リン酸化の部分的阻害のみが、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４で観察された（図４）。ＤＦＣＩ０３２またはＨ２２２８は両方とも、ＦＩＳＨで調べられるように、すべての細胞においてＥＭＬ４−ＡＬＫの転座を含有する（データ非表示）。ＤＦＣＩ０３２およびＨ２２２８細胞において、このＡＬＫの阻害と下流シグナル伝達タンパク質の阻害との間のずれの背後にあるメカニズムは依然不明である。ＤＦＣＩ０３２およびＨ２２２８細胞株は、ＮＳＣＬＣにおいて一般に変異する既知の癌遺伝子のいずれにおいても同時発生的変異を含んでいなく、これら知見の可能な説明としてＰＴＥＮ発現を失ってもいなかった（３０）。代わりに、これら細胞株は他のチロシンキナーゼの同時活性化を含んでおり、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４では阻害されないかもしれない平行する生存シグナル伝達をもたらしている（３１、３２）。近年、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣにおけるゲフィチニブ抵抗性のメカニズムとして、ＭＥＴ増幅が記載された。ＥＧＦＲ変異およびＭＥＴ増幅を含有するＨＣＣ８２７ ＧＲ細胞株において、 ＭＥＴおよびＥＧＦＲ両方の阻害は、成育阻害およびＡｋｔリン酸化阻害に重要であった（３１）。ＥＧＦＲの阻害単独またはＭＥＴの阻害単独は、ＨＣＣ８２７ ＧＲ細胞の成育阻害も、Ａｋｔのリン酸化も試験した試料中ではもたらさなかった。ＤＦＣＩ０３２およびＨ２２２８のさらなる研究は、それらが他の同時発生的に活性化したキナーゼも含有するか特定するのに役立つかもしれない。かかる研究はうまくいけば、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４とともに、さらなる有効な併用戦略の同定をもたらすだろう。興味深いことに、同時発生的なＥＧＦＲ活性化変異は、ＮＳＣＬＣ腫瘍標本の８種中１種において、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位とともに検出された。ＥＧＦＲキナーゼインヒビター単独またはＡＬＫキナーゼインヒビター単独の有効性におけるこれら２つの同時発生的変異の臨床的重要性は不明である。しかしながら、変異ＥＧＦＲおよびＥＭＬ４−ＡＬＫは両方とも発癌性であり、Ａｋｔシグナル伝達を活性化するので、ＥＧＦＲインヒビターおよびＡＬＫインヒビターの併用戦略は、この腫瘍の成育を阻害するのにおそらく効果的であるだろう。
【０１３１】
【表５】
【表６】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行うことを含む方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含むプローブセットとを接触させること、
ここで、第一のプローブは第一の標識を有し、非逆位型の第一の染色体にハイブリダイズ可能であり、第二のプローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、非逆位型の第二の染色体にハイブリダイズ可能であって、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、
（ｂ）第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、および
（ｃ）第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第一の染色体にハイブリダイズ可能な第一の核酸プローブ、および、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識と異なる第二の標識を有し、かつ第二の染色体にハイブリダイズ可能な第二のプローブを含むプローブセットとを接触させること、
ここで、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、
（ｂ）第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、および
（ｃ）第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
第一の核酸プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６であって標識を有し、かつ第二の核酸プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１であって第二の標識を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象の非小細胞肺癌を診断する方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること、
（ｂ）該試料から染色体調製物を産出すること、
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、該染色体調製物での蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行うこと、および
（ｆ）該染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、該対象が非小細胞肺癌を有すると決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第一の核酸プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第二の核酸プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第二の標識を有する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＩＳＨ解析の結果に基づいて、不良、中間または良好の予後を示す対象を分類することをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
非小細胞肺癌が腺癌である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
非小細胞肺癌が有棘細胞癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非小細胞肺癌の対象を、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきかを決定する方法であって、該方法は、
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること、
（ｂ）該試料から染色体調製物を産出すること、
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、該染色体調製物で蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行うこと、および
（ｆ）該染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきと決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で、対象を処置することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第一の核酸プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第二の核酸プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第二の標識を有する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、キナーゼインヒビターを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キナーゼインヒビターが、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
キナーゼインヒビターが、ＰＦ−０２３４１０６６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはそれら組み合せを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、抗体、小分子、ペプチド、アプタマー、またはそれら組み合せを含む、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象にＥＧＦＲインヒビターを投与することをさらに含む、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位を検出するための核酸プローブであって、該核酸プローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブはＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズする、前記プローブ。
【請求項２９】
請求項２８の核酸プローブを含み、さらに、標識を有する第二のプローブを含む組成物であって、ここで第二のプローブは、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、第二のプローブはＡＬＫを含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、第二のプローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズする、前記プローブを含む組成物。
【請求項３０】
逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３１】
逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３１に記載のプローブ。
【請求項３３】
第二のプローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
第二のプローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
第二のプローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３７】
プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する、請求項２９に記載の組成物
【請求項３８】
ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位を検出するための核酸プローブであって、該核酸プローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブはＡＬＫを含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズし、ここで該プローブはＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む、前記プローブ。
【請求項３９】
染色体調製物内においてＥＭＬ４／ＡＬＫの逆位を同定するためのキットであって、
（ａ）第一の核酸プローブであって、該プローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、該プローブは非逆位型のＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、該プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズする、前記第一の核酸プローブ；
（ｂ）第二の核酸プローブであって、該プローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、該プローブは非逆位型のＡＬＫを含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、該プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズする、前記第二の核酸プローブ；
（ｃ）染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行うための該第一および第二のプローブの使用についての説明書、
を含む、前記キット。
【請求項４０】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
ＤＮＡ対比染色剤をさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
ＤＮＡ対比染色剤がＤＡＰＩである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
ハイブリダイゼーションバッファーをさらに含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
封入剤をさらに含む、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
コントロールスライドをさらに含む、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象における、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患を処置する方法であって、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４９】
疾患が癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
癌が、非小細胞肺癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
非小細胞肺癌が、腺癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
非小細胞肺癌が、有棘細胞癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、キナーゼインヒビターを含む、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
キナーゼインヒビターが、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
キナーゼインヒビターが、ＰＦ−０２３４１０６６である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＡＬＫキナーゼを阻害する組成物が、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはそれら組み合せを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーまたはそれら組み合わせのいずれかを含む、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ＥＧＦＲインヒビターを投与することをさらに含む、請求項４８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ＥＧＦＲインヒビターが、エルロチニブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＥＧＦＲインヒビターが、ゲフィチニブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ＥＧＦＲインヒビターが、ＡＧ１４７８である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
複数のＡＬＫキナーゼインヒビターおよび／またはＥＧＦＲインヒビターおよび／または化学療法剤が投与される、請求項４８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
対象が、請求項１に記載の方法を用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断される、請求項４８〜６３のいずれか一項の方法。
【請求項６６】
対象が、ＥＧＦＲ変異を有すると診断される、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
対象が、手術を受ける、請求項４８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
対象が、放射線治療を受ける、請求項４８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を発現する細胞においてＡＬＫ活性を阻害する方法であって、該細胞とＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項１】
染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行うことを含む方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含むプローブセットとを接触させること、
ここで、第一のプローブは第一の標識を有し、非逆位型の第一の染色体にハイブリダイズ可能であり、第二のプローブは第一の標識と異なる第二の標識を有し、非逆位型の第二の染色体にハイブリダイズ可能であって、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、
（ｂ）第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、および
（ｃ）第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、染色体調製物と、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第一の染色体にハイブリダイズ可能な第一の核酸プローブ、および、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識と異なる第二の標識を有し、かつ第二の染色体にハイブリダイズ可能な第二のプローブを含むプローブセットとを接触させること、
ここで、（ｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こした場合、第一および第二のプローブは、第一および第二の両標識が単一のシグナルとして現れるように、逆位および融合を介して形成した派生染色体にハイブリダイズする一方で、（ｉｉ）第一および第二の染色体が逆位および融合を起こさなかった場合、第一および第二のプローブは、２つのシグナルが検出されるように、それぞれの染色体にハイブリダイズする、
（ｂ）第一および第二のプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、および
（ｃ）第一および第二のプローブが派生染色体上に現れるか、またはそれぞれ第一および第二の染色体上に別々に現れるかをパターンから決定し、それによってＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
第一の核酸プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６であって標識を有し、かつ第二の核酸プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１であって第二の標識を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象の非小細胞肺癌を診断する方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること、
（ｂ）該試料から染色体調製物を産出すること、
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、該染色体調製物での蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行うこと、および
（ｆ）該染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、該対象が非小細胞肺癌を有すると決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第一の核酸プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第二の核酸プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第二の標識を有する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＩＳＨ解析の結果に基づいて、不良、中間または良好の予後を示す対象を分類することをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
非小細胞肺癌が腺癌である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
非小細胞肺癌が有棘細胞癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非小細胞肺癌の対象を、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきかを決定する方法であって、該方法は、
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること、
（ｂ）該試料から染色体調製物を産出すること、
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の存在または非存在を同定するために、該染色体調製物で蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行うこと、および
（ｆ）該染色体調製物がＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を含む場合に、対象をＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で処置すべきと決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物で、対象を処置することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第一の核酸プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第一の標識を有し、かつ第二の核酸プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、第二の標識を有する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、キナーゼインヒビターを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キナーゼインヒビターが、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
キナーゼインヒビターが、ＰＦ−０２３４１０６６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはそれら組み合せを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、抗体、小分子、ペプチド、アプタマー、またはそれら組み合せを含む、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象にＥＧＦＲインヒビターを投与することをさらに含む、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位を検出するための核酸プローブであって、該核酸プローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、プローブはＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズする、前記プローブ。
【請求項２９】
請求項２８の核酸プローブを含み、さらに、標識を有する第二のプローブを含む組成物であって、ここで第二のプローブは、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、第二のプローブはＡＬＫを含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、第二のプローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズする、前記プローブを含む組成物。
【請求項３０】
逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３１】
逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３１に記載のプローブ。
【請求項３３】
第二のプローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
第二のプローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
第二のプローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
プローブが、ＲＰ１１−６６７Ｉ６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３７】
プローブが、ＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含み、標識を有する、請求項２９に記載の組成物
【請求項３８】
ＥＭＬ４とＡＬＫとの間の染色体逆位を検出するための核酸プローブであって、該核酸プローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、プローブはＡＬＫを含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズし、ここで該プローブはＲＰ１１−１００Ｃ１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む、前記プローブ。
【請求項３９】
染色体調製物内においてＥＭＬ４／ＡＬＫの逆位を同定するためのキットであって、
（ａ）第一の核酸プローブであって、該プローブは標識を有し、ＥＭＬ４が逆位を起こさなかった場合、該プローブは非逆位型のＥＭＬ４を含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＥＭＬ４が逆位を起こした場合、該プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＥＭＬ４を含む染色体にハイブリダイズする、前記第一の核酸プローブ；
（ｂ）第二の核酸プローブであって、該プローブは標識を有し、ＡＬＫが逆位を起こさなかった場合、該プローブは非逆位型のＡＬＫを含む非逆位型の染色体にハイブリダイズし、かつＡＬＫが逆位を起こした場合、該プローブは逆位を介して形成した派生染色体にハイブリダイズするように、ＡＬＫを含む染色体にハイブリダイズする、前記第二の核酸プローブ；
（ｃ）染色体調製物内においてＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を同定する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを行うための該第一および第二のプローブの使用についての説明書、
を含む、前記キット。
【請求項４０】
各プローブが、逆位と関連する切断点の５Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
各プローブが、逆位と関連する切断点の２Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
各プローブが、逆位と関連する切断点の１Ｍｂ内に位置する領域で、非逆位型の各染色体にハイブリダイズ可能である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
ＤＮＡ対比染色剤をさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
ＤＮＡ対比染色剤がＤＡＰＩである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
ハイブリダイゼーションバッファーをさらに含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
封入剤をさらに含む、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
コントロールスライドをさらに含む、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断された対象における、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位の発現によって特徴づけられる疾患を処置する方法であって、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４９】
疾患が癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
癌が、非小細胞肺癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
非小細胞肺癌が、腺癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
非小細胞肺癌が、有棘細胞癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、キナーゼインヒビターを含む、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
キナーゼインヒビターが、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
キナーゼインヒビターが、ＰＦ−０２３４１０６６である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、ＡＬＫの発現をノックダウンする剤を含む、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＡＬＫキナーゼを阻害する組成物が、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはそれら組み合せを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物が、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーまたはそれら組み合わせのいずれかを含む、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ＥＧＦＲインヒビターを投与することをさらに含む、請求項４８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ＥＧＦＲインヒビターが、エルロチニブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＥＧＦＲインヒビターが、ゲフィチニブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ＥＧＦＲインヒビターが、ＡＧ１４７８である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
複数のＡＬＫキナーゼインヒビターおよび／またはＥＧＦＲインヒビターおよび／または化学療法剤が投与される、請求項４８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
対象が、請求項１に記載の方法を用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を有すると診断される、請求項４８〜６３のいずれか一項の方法。
【請求項６６】
対象が、ＥＧＦＲ変異を有すると診断される、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
対象が、手術を受ける、請求項４８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
対象が、放射線治療を受ける、請求項４８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ＥＭＬ４−ＡＬＫの逆位を発現する細胞においてＡＬＫ活性を阻害する方法であって、該細胞とＡＬＫキナーゼ活性を阻害する組成物とを接触させることを含む、前記方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５１１９４９（Ｐ２０１１−５１１９４９Ａ）
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６７７９（Ｐ２０１０−５４６７７９）
【出願日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００８７９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０２４４６
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５０１３６８６４３）ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド (10)
【出願人】（５１０２１９６５９）ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート (1)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】４４ Ｂｉｎｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂｐ ３７２ Ａ Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ ０２１１５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００８７９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０２４４６
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５０１３６８６４３）ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド (10)
【出願人】（５１０２１９６５９）ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート (1)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】４４ Ｂｉｎｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂｐ ３７２ Ａ Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ ０２１１５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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