肺癌診断用ポリペプチド、肺癌の検出方法、および治療効果の評価方法
【課題】肺癌の血清および血漿にて測定できる腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡおよびＣＹＦＲＡのほかにも、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰが臨床にて使用されている。しかしながら、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰは、小細胞肺癌特異的なものであって、非小細胞癌を検出することはできない。また、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、ＳＣＣおよびＳＬＸにおいては、非小細胞肺癌を検出するための感度および特異度はいずれも低く、また、初期ステージの肺癌を検出することができず、早期の肺癌診断のための使用には適していない。そのため、非小細胞肺癌診断に適用できる新規バイオマーカー、とりわけ早期の肺癌診断にも使用できる肺癌診断用の新規バイオマーカーを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する肺癌診断用のポリペプチドを、質量分析法により検出または測定する
。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する肺癌診断用のポリペプチドを、質量分析法により検出または測定する
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌診断用ポリペプチドならびに肺癌診断用ポリペプチドを用いた肺癌の検出方法および治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、日本および欧米で最も死亡者数の多い癌であり、難治性である。肺癌は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌に分けることができ、肺癌患者全体の１５％が小細胞肺癌であり、残りの８５％が非小細胞肺癌である。さらに、非小細胞癌は、病理組織学的に、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌の３つのタイプに分けることができる。
【０００３】
喫煙は依然として癌の主要な危険因子である。しかしながら、近年、非喫煙者における肺癌（主に腺癌）が増加してきている。肺癌患者における５年後の生存率はわずか１５％程度である。これは、初期の段階で肺癌を検出できる方法がないことに大きく起因する。肺癌患者のうち初期ステージの疾患と診断されるケースはわずか１６％である。胸部Ｘ線、喀痰細胞診、およびヘリカルＣＴなどは肺癌検出のスクリーニングツールとして用いられてきているが、肺癌の死亡率の改善に関しては、ほとんど効果をもたらしていない。
【０００４】
一方、疾患の早期発見を達成し、臨床管理を向上させるために、肺癌用血清バイオマーカーが開発されてきている（非特許文献１参照）。それにもかかわらず、その臨床有用性は限られている（非特許文献２および３参照）。ＣＥＡ（carcinoembryonic antigen）およびＣＹＦＲＡ（cytokeratin 19 fragment）は、一部の非小細胞癌患者の血清において存在量が増加している。そのため、これらは、疾患の状態をモニターしたり、治療に対する反応を評価したりと、臨床上有効である。しかしながらこれらは、臨床診断での使用には適していない（非特許文献４参照）。なぜならば、これらは、喫煙や肺炎などの他の疾患および他の種類の癌にも関連していることが知られており、さらには、初期ステージの肺癌を検出することができないからである。
【０００５】
近年、プロテオミクス技術を用いて臨床検体におけるタンパク質の発現パターンをモニタリングすることによって、癌の診断に用いられる可能性のある新規バイオマーカーの発見を可能なものとしている。癌の病原の分子基板および癌関連タンパク質の特性の理解をより深めるために、２Ｄ−ＤＩＧＥ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、タンパク質アレイ、ＩＣＡＴ、ｉＴＲＡＱおよびＭｕｄＰＩＴなどの種々のプロテオミクスツールが、種々の生体試料の差分解析に用いられてきている（非特許文献５参照）。生体試料としては、細胞可溶化物、血清および血漿などが含まれている。
【０００６】
複雑な生体試料の中から微量成分を推定バイオマーカーとして同定するために、焦点を合わせたプロテオミクス技術および目標を定めたプロテオミクス技術が注目を集めてきている。例えば、ＩＭＡＣ（非特許文献６参照）などのリンタンパクプロテオミクス技術、細胞表面捕捉（ＣＳＣ）技術（非特許文献７および８参照）、およびグリカン構造特異的定量技術であるＩＧＥＬ（非特許文献９参照）などが挙げられる。これらの技術によれば、とりわけ、血液プロテオーム試料における高感度および高スループットなプロファイリングを妨げている技術的制限を回避できる。この技術的制限の原因としては、血液プロテオーム試料自体が非常に複雑であること、タンパク質のダイナミックレンジが非常に大きいことが挙げられる。同様に、自然発生したペプチドを取り扱うプロテオミクスの一分野は、ペプチドミクスと呼ばれている。タンパク質のプロセシングまたは分解によって生じたペプチドを直接解析することは、体液中のバイオマーカーペプチドの検出に有用であると考えられている（非特許文献１０参照）。また、ペプチドミクスの一環として、新規バイオマーカーを質量分析技術を利用して取得する方法もまた提案されている（非特許文献１１参照）。
【０００７】
これまで５００種以上のプロテアーゼ／ペプチダーゼが、ヒト細胞で発現していることが知られている（非特許文献１２および１３参照）。これらは、細胞間領域、細胞外マトリクスおよび血液を含めた生体のあらゆる場所で働いており、他のタンパク質の機能の活性化、細胞タンパク質の分解、さらには癌の進行または抑制に関わっている（非特許文献１４〜１６参照）。事実、多くのマトリクスメタロプロテアーゼが種々の癌細胞で過剰発現しており、これにより、癌細胞または転移促進に都合のよい微環境の構築を助長している（非特許文献１６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gail M. H., Muenz L., McIntire K. R., Radovich B., Braunstein G., Brown P. R., Deftos L., Dnistrian A., Dunsmore M., Elashoff R., and et al., J. Natl. Cancer Inst. 1988, 80, 97-101.
【非特許文献２】McCarthy N. J., and Swain S. M., Cancer J. 2001, 7, 175-177.
【非特許文献３】Brundage M. D., Davies D. and Mackillop W. J., Chest. 2002, 122, 1037-1057.
【非特許文献４】Sung H. J. and Cho J. Y., BMB Rep. 2008, 41, 615-625.
【非特許文献５】Maurya P., Meleady P., Dowling P. and Clynes M., Anticancer Res. 2007, 27, 1247-1255.
【非特許文献６】Gamez-Pozo A., Sanchez-Navarro I., Nistal M., Calvo E., Madero R., Diaz E., Camafeita E., de Castro J., Lopez J. A., Gonzalez-Baron M., Espinosa E. and Fresno Vara J. A., PloS One 2009, 4, e7731.
【非特許文献７】Wollscheid B., Bausch-Fluck D., Henderson C., O'Brien R., Bibel M., Schiese R., Aebersold R. and Watts J. D., Nat. Biotechnol. 2009, 27, 378-386.
【非特許文献８】Schiese R., Wollscheid B. and Aebersold R., Mol. Oncol. 2009, 3, 33-44.
【非特許文献９】Ueda K., Takami S., Saichi N., Daigo Y., Ishikawa N., Kohno N., Katsumata M., Yamane A., Ota M., Sato T. A., Nakamura Y. and Nakagawa H., Mol. Cell Proteomics 2010.
【非特許文献１０】Villanueva J., Nazarian A., Lawlor K. and Tempst P., Nat. Protoc. 2009, 4, 1167-1183.
【非特許文献１１】Ueda K., Sato T., Daigo Y., Ishikawa N., Kohno N., Nakamura Y., and Nakagawa H., AACR-JCA 8th Joint Conference: Cancer Genomics, Epigenomics, and the Development of Novel Therapeutics, 2010.
【非特許文献１２】Lopez-Otin C. and Bond J. S., J. Biol. Chem. 2008, 283, 30433-30437.
【非特許文献１３】Overall C. M. and Blobel C. P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 245-257.
【非特許文献１４】Palermo C. and Joyce J. A., Trends Pharmacol. Sci. 2008, 29, 22-28.
【非特許文献１５】Lopez-Otin C. and Matrisian L. M., Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 800-808.
【非特許文献１６】Egeblad M. and Werb Z., Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 161-174.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
肺癌の血清および血漿にて測定できる腫瘍マーカーとしては、上記したＣＥＡおよびＣＹＦＲＡのほかにも、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰが臨床にて使用されている。しかしながら、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰは、小細胞肺癌特異的なものであって、非小細胞癌を検出することはできない。また、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、ＳＣＣおよびＳＬＸにおいては、非小細胞肺癌を検出するための感度および特異度はいずれも低く、また、初期ステージの肺癌を検出することができず、早期の肺癌診断のための使用には適していない。
【００１０】
そのため、非小細胞肺癌診断に適用できる新規バイオマーカー、とりわけ早期の肺癌診断にも使用できるバイオマーカーの開発が強く望まれている。
【００１１】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、肺癌診断用の新規バイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述したプロテアーゼおよびペプチダーゼ活性によって、癌の進行または癌に関連した応答を非常によく反映している消化ペプチド断片が生成されるはずである。したがって、ヒト血清またはヒト血漿におけるペプチドミクスプロファイリングは、新規癌マーカー探索の有力なツールであると考えられる。
【００１３】
以上を鑑み、本発明者らが鋭意検討を行った結果、ゲル濾過クロマトグラフィおよび質量分析法を用いた大規模スクリーニングによって、肺癌患者の血清中に特異的に存在するペプチドを見出し、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドは、上記課題を解決するために、配列番号１〜１９の何れか１つに示されるアミノ酸配列からなる構成である。
【００１５】
本発明に係る肺癌の検出方法は、上記課題を解決するために、生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する工程を含む構成である。
【００１６】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、少なくとも配列番号５、１２または１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、質量分析法により上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記工程において、上記試料をゲル濾過クロマトグラフィに供して肺癌診断用ポリペプチド画分を取得して、得られた画分について上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される２以上の上記肺癌診断用ポリペプチドを一度に検出または測定することが可能である。
【００２０】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記試料が血液、血清または血漿であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記工程に先立って、上記試料に加熱処理を施すことが好ましい。
【００２２】
本発明に係る肺癌患者における治療効果の評価方法は、治療が施される前に生体から採取した試料、および治療が施された後に生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つを検出または測定する第１の工程と、それぞれの検出結果を比較する第２の工程とを含む構成である。
【発明の効果】
【００２３】
特定の配列からなる本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドを用いることにより、採取した生体試料を用いて肺癌を検出することが可能となる。したがって、本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドは、肺癌バイオマーカーとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】バイオマーカーペプチドのスクリーニング方法の概要を示す図である。
【図２】一実施例における血清試料のＨＰＬＣによる分離結果のスペクトルの重ね合わせを示す図である。
【図３】一実施例における血清試料のＨＰＬＣによる分離結果のスペクトルの一部を拡大して示す図である。
【図４】一実施例における血清試料の質量分析を行った結果のＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】一実施例における血清試料の質量分析を行った結果について作成したクロマトグラム面を示す図である。
【図６】全クロマトグラム面をアラインメントした結果の一部を示す図である。
【図７】一実施例における健常人グループおよび肺癌患者グループの間のｔ検定におけるｐ値に従ったクラスターの階層図である。
【図８】一実施例における候補バイオマーカーペプチドについて主成分分析を行った結果を示す図である。
【図９】一実施例における最適なＭＲＭトランジションを設定するために、７６個のＭＲＭトランジションを同時にモニタリングした結果を示す図である。
【図１０】一実施例における相対定量化解析の結果を示すボックスプロットの図である。
【図１１】一実施例における相対定量化解析の結果を示すＲＯＣカーブの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
＜１．肺癌診断用ポリペプチド＞
本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドは、配列番号１〜１９の何れか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２６】
これらのポリペプチドは、肺癌患者由来の血清において、健常人由来の血清に比してより多く検出される。そのため、血清中の本肺癌診断用ポリペプチドの存在量を測定して健常人における存在量と比較することにより、肺癌を検出することが可能となる。すなわち、本肺癌診断用ポリペプチドは、肺癌検出用のバイオマーカーとして用いることができる。
【００２７】
ここで、「肺癌」とは、ヒトの腺癌（肺腺癌）、扁平上皮癌および大細胞癌を含む非小細胞癌を指す。本発明に係る肺癌診断用ペプチドは、とりわけ、腺癌の検出に特に有効である。
【００２８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヒトアミロリド感受性カチオンチャネル４（ＡＣＣＮ４）タンパク質のＮ末端から６１３番目から６２４番目までのアミノ酸残基の配列である。このアミノ酸配列からなるポリペプチドを、本明細書では、「ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４」と称する。
【００２９】
配列番号２〜５に示されるアミノ酸配列はそれぞれ、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）のＮ末端から２７１番目から２８３番目までのアミノ酸残基の配列、２６８番目から２８４番目までのアミノ酸残基の配列、２６０番目から２８４番目までのアミノ酸残基の配列、および２７３番目から２８３番目までのアミノ酸残基の配列である。これらのアミノ酸配列からなる各ポリペプチドを、本明細書ではそれぞれ、「ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３」、「ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４」、「ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４」、および「ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３」と称する。
【００３０】
配列番号６に示されるアミノ酸配列は、ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）のＮ末端から１９４番目から２１４番目までのアミノ酸残基の配列である。このアミノ酸配列からなるポリペプチドを、本明細書では、「ＡＰＯＥ １９４−２１４」と称する。
【００３１】
配列番号７〜１８に示されるアミノ酸配列はそれぞれ、ヒトフィブリノゲンアルファ鎖（ＦＩＢＡ）のＮ末端から１番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、７番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、７番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、２番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、５番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、５番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、６番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、６番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、４番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、４番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、３番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、および３番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列である。これらのアミノ酸配列からなる各ポリペプチドを、本明細書ではそれぞれ、「ＦＩＢＡ １−１６」、「ＦＩＢＡ ７−１５」、「ＦＩＢＡ ７−１６」、「ＦＩＢＡ ２−１６」、「ＦＩＢＡ ５−１５」、「ＦＩＢＡ ５−１６」、「ＦＩＢＡ ６−１５」、「ＦＩＢＡ ６−１６」、「ＦＩＢＡ ４−１５」、「ＦＩＢＡ ４−１６」、「ＦＩＢＡ ３−１５」、および「ＦＩＢＡ ３−１６」と称する。
【００３２】
配列番号１９に示されるアミノ酸配列は、ヒトｌｉｍｂｉｎタンパク質のＮ末端から３０６番目から３１３番目までのアミノ酸残基の配列である。このアミノ酸配列からなるポリペプチドを、本明細書では、「ＬＢＮ ３０６−３１３」と称する。
【００３３】
上記した各肺癌診断用ポリペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
上記した肺癌診断用ポリペプチドのうち、ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４、ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ １−１６、ＦＩＢＡ ２−１６、ＦＩＢＡ ５−１６、ＦＩＢＡ ６−１５、ＦＩＢＡ ６−１６、ＦＩＢＡ ４−１６、ＦＩＢＡ ３−１５、ＦＩＢＡ ３−１６、およびＬＢＮ ３０６−３１３は、健常人と肺癌患者との間で血清における存在量に、より大きな有意差があるため、肺癌を検出するためのバイオマーカーとして、より好ましい。
【００３６】
さらに、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ ５−１６、およびＬＢＮ ３０６−３１３については、肺癌の手術可能ステージ（ステージＩ，ＩＩ，ＩＩＩａ）での、感度および特異度により優れているため、とりわけ、肺癌の手術可能ステージを検出するためのバイオマーカーとして、特に好ましい。
【００３７】
肺癌患者由来の血清において、健常人由来の血清に比してより多く検出されるという観点から、表２にＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８として示した各化合物も肺癌を検出するバイオマーカーとして用いることが可能である。表２に示した各化合物は、ヒトの血清に由来する化合物であって、対応させて示す分子量を有しているペプチドである。なお、表２に示す分子量、ｍ／ｚ、ＲＴ（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）およびＣｈａｒｇｅは、後述する実施例３に記載した測定法により同定した値である。また各化合物がペプチドまたは修飾ペプチドである場合にそのアミノ酸配列は、後述する実施例４に記載した測定法により同定することが可能である。なお、ＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８として示した各化合物は、そのイオン化における電荷および分子量から、ペプチドまたは修飾ペプチドであると推定される。
【００３８】
【表２】
【００３９】
すなわち、採取した被験者の血清において、表２に示される分子量を有している化合物を検出または測定することによっても、肺癌を検出することが可能である。
【００４０】
なお、ＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８の化合物のうち、少なくともＩＤ＿００２（ＦＩＢＡ ５−１６）、ＩＤ＿００４（ＦＩＢＡ ５−１５）、ＩＤ＿００５（ＦＩＢＡ ７−１６）、ＩＤ＿００７（ＬＢＮ ３０６−３１３）、ＩＤ＿００８（ＦＩＢＡ ３−１５）、ＩＤ＿００９（ＦＩＢＡ １−１６）、ＩＤ＿０１０（ＦＩＢＡ ３−１６）、ＩＤ＿０１１（ＦＩＢＡ ７−１５）、ＩＤ＿０１２（ＦＩＢＡ ４−１５）、ＩＤ＿０１３（ＦＩＢＡ ２−１６）、ＩＤ＿０１５（ＦＩＢＡ ４−１６）、ＩＤ＿０２３（ＦＩＢＡ ２−１６）、ＩＤ＿０２７（ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４）、ＩＤ＿０３１（ＦＩＢＡ ２−１６）、ＩＤ＿０３２（ＦＩＢＡ ６−１６）、ＩＤ＿０３３（ＦＩＢＡ ６−１６）、ＩＤ＿０３９（ＦＩＢＡ ６−１５）、ＩＤ＿０５１（ＦＩＢＡ ５−１５）、ＩＤ＿０６４（ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４）、ＩＤ＿０６９（ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３）、ＩＤ＿０７５（ＦＩＢＡ ５−１６）、ＩＤ＿０８５（ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４）、ＩＤ＿０９３（ＦＩＢＡ ５−１６）、ＩＤ＿０９９（ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３）、ＩＤ＿１０８（ＡＰＯＥ １９４−２１４）、ＩＤ＿１１３（ＦＩＢＡ ３−１６）、およびＩＤ＿１１４（ＦＩＢＡ ２−１６）についてはペプチドであって、データベース検索によってそのアミノ酸配列が同定されており、表１に示すペプチドの何れかに分類されている。
【００４１】
＜２．肺癌疾患の検出方法＞
本発明に係る肺癌疾患の検出方法は、生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する工程を含めばよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００４２】
本明細書において、「肺癌診断用ポリペプチドを測定する」とは、生体試料およびこれを精製して得られる試料における肺癌診断用ポリペプチドの存在量または濃度を測定することを意図している。
【００４３】
本発明の検出方法の一例として、被験者由来の生体試料中における少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドの量を測定し、対照被験者（健常者）由来の生体試料中におけるこの肺癌診断用ポリペプチドの量を測定し、両者を比較することによって、肺癌を検出することができる。具体的には、被験者由来の試料における肺癌診断用ポリペプチドの量と、健常者由来の試料における当該肺癌診断用ポリペプチドの量とを比較して、両者の間で有意な相違が見られた場合には、この被験者が肺癌に罹患しているか、または肺癌に罹患している可能性が高いと判定することができる。健常者由来の試料における当該肺癌診断用ポリペプチドの量は予め測定したものを用いることが可能である。あるいは、予め健常者由来の生体試料における肺癌診断用ポリペプチドの量を測定して、これに基づいて正常濃度範囲を定めておき、被験者由来の生体試料において肺癌診断用ポリペプチドの量がその正常濃度範囲から外れた場合に、肺癌に罹患していると判定することも可能である。
【００４４】
ここで「試料」とは、生体（ヒト）から採取した試料であって、上記肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定できる試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、血清、および血漿などを用いることができる。中でも、血清および血漿が好ましい。
【００４５】
肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する方法としては、肺癌診断用ポリペプチドの存在量を定量的もしくは半定量的に決定できるか、または肺癌診断用ポリペプチドの有無を決定できる限り、特に制限されるものではなく、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび免疫沈降法などの免疫学的手法、ならびに質量分析法などを用いることができる。中でも、以下の観点から質量分析法が好ましい。質量分析装置を用いた質量分析法によれば、特異的な抗体を作製する必要がないため、簡便に肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することができる。また、質量分析装置を用いた質量分析法は、感度および精度に優れているため、より正確な判定を行うことができる。さらに、多成分同時分析が可能なマルチチャネル型の質量分析装置を用いることにより、２以上の肺癌診断用ポリペプチドを一度に検出または測定することが可能となる。２以上の肺癌診断用ポリペプチドを用いて判定を行うことによって、肺癌に罹患しているか否かについてより正確な判定を行うことが可能となる。あるいは、２以上の肺癌診断用ポリペプチドを組み合わせて判定することによって、肺癌がどのステージの状態であるか否かについてより正確な判定を行うことが可能となる。さらには、肺癌以外の他の疾患に関するバイオマーカーも同時に測定することが可能となり、一度に様々な疾患についての検出を試みることが可能となる。また、より精度よく検出をおこなうためには、タンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いることが好ましい。本発明の検出方法において用いられる質量分析装置としては定量可能であれば特に制限はなく、四重極型および飛行時間型など従来公知の型の質量分析装置を用いることが可能である。
【００４６】
肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定に用いられる試料は、生体から採取した後、肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定を行う前に、加熱処理が施されることが好ましい。試料に加熱処理を施すことによって、試料中に含まれるタンパク質分解酵素を失活させることができる。これにより、肺癌診断用ポリペプチドが検出および測定前に分解されることを防ぐことができる。加熱処理としては、例えば１００℃で１０分の処理が可能である。あるいは、加熱処理の代わりに、試料を酸変性または有機溶媒沈殿法に供することによって、タンパク質分解酵素によるペプチドの分解を防止してもよい。酸変性では、例えば、１％トリフルオロ酢酸存在下で６０℃に加熱してタンパク質のみを沈殿させて、その上清を、検出および測定用試料として用いればよい。また、有機溶媒沈殿法としては、例えば、アセトンおよびアセトニトリルなどの有機溶媒を血清の５〜１０倍量添加することによってタンパク質のみを沈殿させて、同様にその上清を、検出および測定用試料として用いればよい。なお、効率の観点から、単純に加熱処理を行うことが好ましい。
【００４７】
肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定に用いられる試料は、質量分析に供する前に、ゲル濾過クロマトグラフィ（サイズ排除クロマトグラフィ）によって、肺癌診断用ポリペプチドを含む画分として濃縮して、この画分について肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定を行うことが好ましい。これにより、血液試料から１ステップで質量分析に供することが可能になる。すなわち、例えばタンパク質のＭＳ分析では必須であるトリプシン消化などのステップを全て省略することができる。したがって、肺癌診断用ポリペプチドの検出および測定を、簡便かつ迅速に行うことができる。また、ゲル濾過クロマトグラフィによる処理であれば、有機溶媒および強酸などの毒劇物を必要としないため、作業従事者における健康被害のリスクが低く、臨床検査技師などの医療従事者であっても前処理を実施することができる。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィによる処理は、タンパク質等の高分子に対する排除効果がきわめて高い。そのため、引き続き行われる質量分析による検出工程の再現性を高めることができる。
【００４８】
肺癌診断用ポリペプチドを含む画分として回収する画分は、肺癌診断用ポリペプチドを含む限りその分子量の範囲に制限はなく、例えば、分子量が１，０００（Ｄａ）以上、５，０００（Ｄａ）以下のペプチドを含むような画分を回収すればよい。
【００４９】
これまで様々なアプローチにて、血清および血漿に適用できる疾患バイオマーカー候補タンパク質およびペプチドが同定されてきているが、それらを臨床に応用していくためには、広いダイナミックレンジを有し、正確で多検体を処理できる方法が必要である。その多くは特異的抗体を用いてのＥＬＩＳＡの系が担っていたが、ＥＬＩＳＡの系に使える特異的な抗体を確立することは困難であり、血清および血漿における疾患バイオマーカーの確証、追証実験を遂行することが困難な場合が多い。
【００５０】
これに対して本発明の肺癌診断用バイオマーカーおよび肺癌の検出方法によれば、特異的抗体を製造することなく、多検体を正確に処理でき、高感度で肺癌を検出することができる。
【００５１】
＜３．肺癌患者における治療効果の評価方法＞
本発明に係る肺癌患者における治療効果の評価方法は、治療が施される前に生体から採取した試料、および治療が施された後に生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つを検出または測定する第１の工程と、それぞれの検出結果を比較する第２の工程とを含めばよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００５２】
本発明の評価方法の一例として、肺癌患者の生体試料中における少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドの量を肺癌の治療開始前に予め測定し、肺癌の治療開始後に、同一患者の当該肺癌診断用ポリペプチドの量を測定し、両者を比較することによって、肺癌の治療効果を評価することができる。具体的には、治療開始前の肺癌診断用ポリペプチドの量と、治療開始後の当該肺癌診断用ポリペプチドの量とを比較して、治療開始後の当該肺癌診断用ポリペプチドの量が、健常者の生体試料中における当該肺癌診断用ポリペプチドの量に近づいており、両者（治療開始前および治療開始後）の間で有意な相違が見られた場合には、この患者に対して行った治療に効果があったと評価することができる。
【００５３】
なお、肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定に用いられる生体試料の調製および精製、ならびに肺癌診断用ポリペプチドの検出方法または測定方法は、上記＜２．肺癌疾患の検出方法＞の説明を援用することができる。
【００５４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００５５】
以下に示す各実施例において、「肺癌」は、特に断りのない限り、肺腺癌を指すものとする。
【００５６】
各実施例について詳細に説明する前に、本肺癌診断用ポリペプチドのスクリーニングの流れの概要を図１を参照して説明する。
【００５７】
本肺癌診断用ポリペプチドのスクリーニングでは、まず、複数の肺癌患者および健常人から血清を採取して加熱処理することによって血清を調製した（実施例１、２）。次いで、それぞれの血清についてサイズ排除クロマトグラフィを行うことによって、特定の分子量画分を収集した（実施例２）。収集した画分についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行い、本画分に含まれるペプチド成分を抽出した（実施例３、４）。抽出したペプチド成分について、非ラベル化定量解析を行った（実施例３）。肺癌患者からのデータと健常人からのデータとを比較し、統計解析を行うことによって、肺癌患者特異的なペプチドを選抜する（実施例３）。ここまでが、スクリーニング段階である。検証段階では、選抜した各ペプチドについて、別の肺癌患者および健常人の血清を対象として、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）による相対定量解析を行った（実施例５）。得られた結果について統計解析を行うことによって、各ペプチドの評価を行った（実施例６）。以上によって、肺癌の検出に用いられるバイオマーカーを同定した。以下、各実施例について詳細に説明する。
【００５８】
〔実施例１：血清の調製〕
インフォームド・コンセントを得た上で、広島大学病院における１２２人の肺腺癌患者（ステージＩ〜ＩＶ）から、ヒト血清試料を得た。また、正常コントロール用の血清試料を、インフォームド・コンセントを得た上で、広島ＮＴＴ病院において健康診断を受けている３０人の健康なボランティア、および高知大学病院において健康診断を受けている３６人の健康なボランティアから得た。
【００５９】
血清は、一般的な手法を用いて、遠心分離（１５００×ｇ、１０分間）によって全血から収集し、−８０℃で保存した。
【００６０】
〔実施例２：ペプチドーム画分の収集〕
全ての血清を１回だけ凍結融解させ、プロテアーゼおよびペプチダーゼによる血清中の成分の分解を防ぐため、また加熱処理中のタンパク質の凝集を避けるため、すぐに、プロテオミクスグレードの水を用いて４倍に希釈した上で１００℃にて１０分間インキュベートした。Ｓｐｉｎ−Ｘ ０．４５μｍスピンフィルタを用いて濾過した後、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所社製）に連結している１０／３００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に、１０μｌのサンプルを投入した。１００ｍＭの酢酸アンモニウムの一定流量（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）のもと、試料をＨＰＬＣに導入した。カラムを通過した試料について２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。結果を図２に示す。
【００６１】
図２は、１６人分の血清試料に対応するゲル濾過ＨＰＬＣのスペクトルを重ね合わせて示している図である。図２に示されるように、ゲル濾過ＨＰＬＣでは、血清タンパク質および血清ペプチドの分離が非常に再現性よく行われていた。
【００６２】
次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて、サイズ排除クロマトグラフィの精度を評価した。図３は、上記ゲル濾過ＨＰＬＣの１つのスペクトルの一部を拡大して示している。図３中「１」〜「１０」の網掛けによって示す１０個の画分（保持時間が１４分から３４分までの２分毎の画分）について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて解析することによって、サイズ排除クロマトグラフィの精度を評価した。その結果を図４に示す。図４は、１０個の画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．１０）のそれぞれについてのＭＳスペクトルを示す図である。図４の連続的なＭＳスペクトルに示されるように、ゲル濾過クロマトグラフィを行うことによって、血清タンパク質および血清ペプチドを分子量に応じて正確に分離することができている。
【００６３】
図４に示す結果に基づき、図３中「５」〜「１０」の網掛けによって示す６個の画分（保持時間が２２分から３４分まで）をペプチドーム画分と規定して収集した。これらの画分は１，０００〜５，０００の分子量に対応している。
【００６４】
収集した画分（ペプチド試料）を、Ｖａｃｕｕｍ Ｓｐｉｎ Ｄｒｉｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて乾燥させた。
【００６５】
〔実施例３：ペプチドバイオマーカーのスクリーニング〕
肺癌の初期の段階の検出に用いられ得る血清ペプチドを探索するために、健常人および肺癌患者を含む９２人の血清試料の定量的ペプチドームプロファイルを取得した。９２人の内訳を表３に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
９２人のうち、６２人が肺癌患者である。６２人の肺癌患者のうち、３２人が手術可能なステージにある肺癌患者（ステージＩ：ｎ＝１０、ステージＩＩ：ｎ＝１０、ステージＩＩＩａ：ｎ＝１２）であり、３０人が進行ステージにある肺癌患者（ステージＩＩＩｂ：ｎ＝１５、ステージＩＶ：ｎ＝１５）である。これにより、肺癌の進行度を反映したバイオマーカーを取得することが可能となる。
【００６８】
まず、実施例１と同様にして血清を採取した。また、実施例２と同様にしてゲル濾過クロマトグラフィによって血清試料を精製した。得られた９２個のペプチド試料をそれぞれ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した。具体的には、得られたペプチド試料（乾燥させたペプチドーム画分）を、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む２％のアセトニトリルに溶解した。このペプチド試料について、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（ＤＩＯＮＥＸ社製）に連結したＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて解析した。
【００６９】
まず、Ｌ−Ｃｏｌｕｍｎビーズを手作業で装填した１００μｍ×２００ｍｍ ｔｉｐ−ｃｏｌｕｍｎ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、ペプチド試料を分離した。ペプチド試料の分離には、流速２００ｎｌ／ｍｉｎの溶媒Ａ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸、７０％アセトニトリル）を用いた。ここで、溶媒Ｂは多段階の線形勾配を形成させており、９５分間で溶媒Ｂを５％から５５％まで変化させ、その後１０分間で５５％から９５％まで変化させている。
【００７０】
溶出物について、直接、１秒のＭＳサーベイ（ｍ／ｚ ４００〜１８００）を行ない、その中で最も強度の強かったプリカーサイオン（３０カウント以上、＋２〜＋４の荷電状態、ｍ／ｚ範囲は５０／２０００）に対して３度のＭＳ／ＭＳ測定を行った。なお、サーベイの条件は、ＳＩＤＡ＝３．０、最大蓄積時間＝２．０秒である。すでに標的にされていたプリカーサイオンは、４０秒間の反復ＭＳ／ＭＳ取得（１００ｍＤａの質量許容度）からは除外した。
【００７１】
ＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅにおいて得られた９２個のｒａｗデータファイル（．ｗｉｆｆフォーマットおよび．ｗｉｆｆ．ｓｃａｎフォーマット）を、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ ＲｅｆｉｎｅｒＭＳモジュール（Ｇｅｎｅｄａｔａ社製）に直接導入した。このモジュールを用いて、まず、図５に示すようなＭＳクロマトグラム面を作成した。また、全てのクロマトグラムについて、装置特異的ノイズおよび化学ノイズを実質的に差し引いて除去した。具体的には、クロマトグラム化学ノイズサブトラクションアクティビティにおいて、ＲＴ Ｗｉｎｄｏｗ＝３ｓｃａｎとして平坦化を実施した。バックグラウンドのノイズを除去するために、ピーク強度を下記のように規定した：
Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ＝ｍａｘ（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｒｉｇｉｎａｌ−Ｑｕａｎｔｉｌｅ−Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，０）
ｍａｘは引数のうち大きいものをとる関数である。ここでは、Ｑｕａｎｔｉｌｅ値＝５０％、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１５ｃｐｓとした。また、少なくとも以下の何れか１つの基準を満たすシグナルをノイズピークとみなして、差し引き除去した：
・ＲＴ Ｗｉｎｄｏｗ＞５０ｓｃａｎ
・Ｍｉｎｉｍｕｍ ＲＴ Ｌｅｎｇｔｈ＝４ｓｃａｎ
・Ｍｉｎｉｍｕｍ ｍ／ｚ ｌｅｎｇｔｈ＝８ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ。
【００７２】
次いで、各ＭＳクロマトグラム面における保持時間（ＲＴ）グリッドを、９２個のクロマトグラム面の間で正しくアラインメントした。アラインメントの結果の一部を図６に示す。アラインメントを行うことにより、複数の試料を用いた確実な定量解析を行うことができるようになる。アラインメントの際のクロマトグラムＲＴアラインメントアクティビティにおけるパラメータは以下の通りである：
・ｍ／ｚ Ｗｉｎｄｏｗ＝０．１Ｄａ
・ＲＴ Ｗｉｎｄｏｗ＝０．２ｍｉｎ
・Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
・ＲＴ ｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｅｒｖａｌ＝５ｍｉｎ。
【００７３】
次いで、特定のクロマトグラム面では検出されないピークの位置情報も確実に取得するために、クロマトグラム積算ピーク検出アクティビティによって、一時的に平均化したクロマトグラムにおけるピークを検出した。その際のパラメータは以下の通りである：
・Ｓｕｍｍａｔｉｏｎ Ｗｉｎｄｏｗ＝５ｓｃａｎ
・Ｏｖｅｒｌａｐ＝５０
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｐｅａｋ Ｓｉｚｅ＝４ｓｃａｎ
・Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍｅｒｇｅ Ｄｉｓｔａｎｃｅ＝１０ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ
・Ｇａｐ／Ｐｅａｋ Ｒａｔｉｏ＝１
・Ｍｅｔｈｏｄ＝ｃｕｒｖａｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｐｅａｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
・Ｐｅａｋ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝５
・Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８
・Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１。
【００７４】
その後、２段階の積算アイソトープクラスタリングアクティビティによって、２Ｄピークの中からアイソトープパターンを同定した。同一のペプチドシグナルに属する各アイソトープピークをピーククラスターとして分類した。クラスターのいくつかの例を図５中の一点破線枠で示している。第１のクラスタリングは以下の基準に沿って実施した：
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｈａｒｇｅ＝１
・Ｍａｘｉｍｕｍ Ｃｈａｒｇｅ＝１０
・Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｐｅａｋｓ＝０
・Ｆｉｒｓｔ Ａｌｌｏｗｅｄ Ｇａｐ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ＝３
・Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ＝ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ
・ＲＴ Ｔｏｌｅｆａｎｃｅ＝０．１ｍｉｎ
・ｍ／ｚ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝０．０５Ｄａ
・Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｓｈａｐｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝１０．０
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｉｚｅ Ｒａｔｉｏ＝１．２。
【００７５】
第２のクラスタリングは、
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｉｚｅ Ｒａｔｉｏ＝０．６
・Ｒｅｕｓｅ Ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ＝ｔｕｒｅ
とした以外は第１のクラスタリングと同一のセッティングによって実施した。
【００７６】
この結果、９２個の血清試料から、電荷状態が＋１〜＋１０の何れかである、重複しない１２，３９６個のピーククラスターが検出された。
【００７７】
検出された全てのクラスターピークの情報（ｍ／ｚ、保持時間、および強度を含む）を、ＡＢＳファイルとして出力した。
【００７８】
出力されたＡＢＳファイルをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ Ａｎａｌｙｓｔモジュールにおいてロードした。さらなる統計的な検討のために、この中から、電荷状態が＋２〜＋６の何れかである３，５３７個のピーククラスターを利用した。
【００７９】
血清レベルにおいて肺癌特異的な変化を示しているペプチドのピークを抽出するために、健常人グループ（ｎ＝３０）と肺癌患者グループ（ｎ＝６２）との間で、スチューデントのｔ検定を実施した。スチューデントのｔ検定に際して、９２個の血清試料の中でみられたピーク強度のバリエーションは、それぞれの血清試料における強度の中央値を１０，０００に固定することによって標準化した。標準化した強度データを用いて、健常人グループと肺癌患者グループとの間で、スチューデントのｔ検定を実施した。この結果を図７に示す。
【００８０】
図７は、スチューデントのｔ検定におけるｐ値に従ったクラスター（ペプチド）の階層図である。この検定におけるｐ値がｐ＜０．０１であり、２つのグループ間での強度差が５倍以上であるものを、バイオマーカーとして使用し得るペプチドのピークとして抽出した。その結果、１１８個のペプチドが同定された（上記表２に示すＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８）。
【００８１】
これら１１８個のペプチドに関して、９２人の被験者を健常人グループおよび肺癌患者グループにグループ分けするための統計的な有効性を評価するために、これら１１８個の候補バイオマーカーペプチドを用いて主成分分析を行った。結果を図８に示す。図８に示されるように、９２人の被験者を健常人グループおよび肺癌患者グループに正しくグループ分けすることができた。すなわち、１１８個のペプチドの定量値は、被験者を健常人グループおよび肺癌患者グループに正確にグループ分けするのに統計的に充分であることが示された。したがって、これら１１８個のペプチドは、肺癌を検出するためのバイオマーカーとして使用できる。
【００８２】
以上、ゲル濾過クロマトグラフィおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたバイオマーカーのスクリーニングによって、肺癌バイオマーカーとして使用できる１１８個のペプチドを得た。
【００８３】
〔実施例４：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチド配列の同定〕
ＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＭＡＳＣＯＴデータベース検索を用いて、包括的ペプチド配列決定を実施した。ＭＡＳＣＯＴデータベース検索は、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ ２．０ ソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて実施した。ＭＳ／ＭＳデータについての検索は、以下のパラメータを用いて、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５７．４（２０，４００配列）からのヒトタンパク質データベースに対して実施した：
・Ｔａｘｏｎｏｍｙ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓｅ
・Ｅｎｚｙｍｅ＝Ｎｏｎｅ
・Ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ＝Ｎｏｎｅ
・Ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ＝Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍｅｔ）
・ＭＳ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝５０ｐｐｍ
・ＭＳ／ＭＳ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝０．１Ｄａ
予測値（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）＜０．０５である場合に、ＭＳ／ＭＳデータのペプチドが、その予測値に対応する配列からなるものと認定した。
【００８４】
９２人の被験者の血清試料に由来する２３０，６５７個のＭＳ／ＭＳクエリのうち、５，３８２個のペプチドは、ＭＡＳＣＯＴの期待値が＜０．０５でもって配列決定された。重複したものを除くと、４２４種類のペプチドが同定された。これらは、１０６種のタンパク質に対応するものであった。
【００８５】
上述の１１８個のペプチドに関していえば、１９個について配列を決定することができた。配列決定がなされた１９個のペプチドのうち、１２個のペプチドはフィブリノゲンアルファ鎖（ＦＩＢＡ）由来であり、４個のペプチドは、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）由来であり、残りは、それぞれ、アミロリド感受性カチオンチャネル４（ＡＣＣＮ４）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）およびｌｉｍｂｉｎ（ＬＢＭ）由来であった。１９個のペプチドの各アミノ酸配列は、上述の表１に示している。
【００８６】
〔実施例５：ＭＲＭによる定量化〕
本ペプチドの量的再現性を評価するため、また、配列決定された１９個のバイオマーカーペプチドの臨床有用性を評価するために、新たに調製した９６人の被験者の血清試料について、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）法を用いて、ラベル化を伴わない相対定量化解析を実施した。９６人の被験者の内訳を表４に示す。本実施例における各被験者は、表３に示した被験者とは別の被験者である。
【００８７】
【表４】
【００８８】
１９個のペプチドそれぞれに特異的で最適なＭＲＭトランジションを設定するために、スクリーニングの段階で検出されたプリカーサイオンのｍ／ｚ値をＱ１チャンネルとしてセットし、ＭＳ／ＭＳスペクトルの中から最も強度が高かった４つのフラグメントイオンを選択して各ｍ／ｚ値をＱ３チャンネルとしてセットした。血清ペプチドーム試料について、４０００ ＱＴＲＡＰ マススペクトロメトリを用いて、全７６（１９×４）個のＭＲＭトランジションを同時にモニタリングした。
【００８９】
質量分析に先立って、実施例２と同様に、採取した血清試料をＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラムクロマトグラフィ処理に供した。抽出した試料（ペプチド）を乾燥させた後、２％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸とを含み、さらに１ｆｍｏｌ／μｌのＢＳＡを含むトリプシン消化溶液中に溶解した。次いで、Ｐａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４ ＰＡＬ ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＭＲ社製）に連結している４０００ ＱＴＲＡＰ質量分析装置（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて解析した。
【００９０】
ペプチド試料の分離は、Ｌ−Ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳビーズ（化学物質評価研究機構製）を手作業で装填した１００μｍ×１００ｍｍ ｔｉｐ−ｃｏｌｕｍｎ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。ペプチド試料の分離には、流速２００ｎｌ／ｍｉｎの溶媒Ａ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸、９０％アセトニトリル）を用いた。ここで、溶媒Ｂは線形勾配を形成させており、１０分間で溶媒Ｂを２％から１００％まで変化させている。７６個のモニタリングの結果を図９に示す。図９中の各クロマトグラムは、ＱＳＴＳＲ−Ｅｌｉｔｅ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析において最も高い強度を示した４つのフラグメントイオンについて４０００ ＱＴＲＡＰ システムを用いてモニタリングした、４つのクロマトグラムを重ね合わせて示している。
【００９１】
各ペプチドについて、特異的な溶出保持時間を決定した。そして、各ペプチドについて、４つのＭＲＭトランジションの中から最も強いＭＲＭクロマトグラムのピークを示す最適なＭＲＭトランジションを選択した。それぞれのＭＲＭトランジションの情報を表５に示す。
【００９２】
【表５】
【００９３】
ＦＩＢＡ ３−１６およびＦＩＢＡ ５−１６の２つのペプチドは、ＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅおよび４０００ ＱＴＲＡＰ システムの間でのフラグメントイオンの強度が同一のオーダーを示していた。
【００９４】
次に、３６人の健常人（正常コントロール）由来の血清試料および６０人の肺癌患者由来の血清試料を用いて、ＭＲＭによる相対定量解析を実施した。解析は、繰り返して行った。
【００９５】
まず、１９個のバイオマーカーペプチドのイオンおよびＢＳＡ由来の５個のペプチドのイオンを、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）のＭＲＭモードによって同時にモニタリングした。ＭＲＭクロマトグラムを得た後、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて、このクロマトグラムを平滑化し、定量化した。各試料におけるＭＲＭのピーク領域は、下記式：
標準化後のピーク領域＝１０００×（ｒａｗデータのピーク領域）／（５個のＢＳＡ断片におけるピーク領域の積算）
のようにして標準化した。１９個のバイオマーカーペプチドの血清におけるレベルを、標準化および平均化した後のＭＲＭクロマトグラムピーク領域から算出した。算出結果をボックスプロットとして図１０に示す。図１０の横軸において「Ｎ」は、健常人由来の血清試料であることを表しており、「Ｉ」〜「ＩＶ」はそれぞれ、肺癌のステージがステージＩ〜ＩＶにある肺癌患者由来の血清試料であることを表している。ボックスプロットはＲアルゴリズムによって作成した。それぞれにおいてボックスは、標本の２５％分位点から７５％分位点までを表している。ボックスを横切る線は中央点を表している。ボックスの上部および下部から出ている線の長さはそれぞれ、ボックスの長さの１．５倍の範囲内にあるデータの最大値および最小値によって規定されている。
【００９６】
〔実施例６：ＭＲＭによる定量に基づく統計評価〕
肺癌の早期検出におけるバイオマーカーペプチドの有効性を評価するために、スチューデントのｔ検定によって、肺癌の手術可能ステージ（ステージＩ，ＩＩ，ＩＩＩａ）のグループおよび健常人グループの間で定量結果を統計的に比較評価した。結果を図１０中に示している。
【００９７】
図１０に示されるように、１９個のペプチドのうち、１５個のペプチド（ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４、ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３、ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４、ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＡＰＯＥ １９４−２１４、ＦＩＢＡ １−１６、ＦＩＢＡ ２−１６、ＦＩＢＡ ５−１６、ＦＩＢＡ ６−１５、ＦＩＢＡ ６−１６、ＦＩＢＡ ４−１６、ＦＩＢＡ ３−１５、ＦＩＢＡ ３−１６、ＬＢＮ ３０６−３１３）については、２つのグループ間で、血清レベルにおいて有意な差（ｐ＜０．０５）を示した。一方、残りの４個のペプチド（ＦＩＢＡ ４−１５、ＦＩＢＡ ５−１５、ＦＩＢＡ ７−１５およびＦＩＢＡ ７−１６）は、有意な差（ｐ＜０．０５）を示さなかった。
【００９８】
同様に、１９個のペプチドについて、スチューデントのｔ検定によって、肺癌の進行ステージ（ステージＩＩＩｂ，ＩＶ）のグループと、健常人グループとを比較した。結果を図１０中に示している。
【００９９】
図１０に示されるように、１５個のペプチド（ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４、ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ １−１６、ＦＩＢＡ ７−１５、ＦＩＢＡ ７−１６、ＦＩＢＡ ２−１６、ＦＩＢＡ ５−１６、ＦＩＢＡ ６−１５、ＦＩＢＡ ６−１６、ＦＩＢＡ ４−１５、ＦＩＢＡ ４−１６、ＦＩＢＡ ３−１５、ＦＩＢＡ ３−１６、ＬＢＮ ３０６−３１３）については、２つのグループ間で、血清レベルにおいて有意な差（ｐ＜０．０５）を示した。一方、４個のペプチド（ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３、ＦＩＢＡ ５−１５およびＡＰＯＥ １９４−２１４）は、２つのグループ間で、有意な差（ｐ＜０．０５）を示さなかった。
【０１００】
さらに、バイオマーカーの感度（sensitivity）および特異度（specificity）を評価するために、ＲＯＣカーブ解析を実施した。ＲＯＣカーブは、Ｒアルゴリズムによって作成した。カットオフ値は、（sensitivity，specificity）＝（１，１）からの距離が最小となる点にセットした。解析結果の一部を図１１示す。図１１中、「Ｓｅｎｓ」は感度、「Ｓｐｅｃ」は特異度、「ＰＶ＋」は正の予測値（positive predictive value）、そして「ＰＶ−」は負の予測値（negative predictive value）を表している。
【０１０１】
手術可能ステージにある肺癌患者の検出を行うための感度の値を前提とすると、ＦＩＢＡ ６−１５、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ ５−１６およびＬＢＮ ３０６−３１３は、感度の値がそれぞれ、８７．１％、６１．３％、５８．１％および５８．１％であったため、優れたバイオマーカーであることが示された。なかでも、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ ５−１６およびＬＢＮ ３０６−３１３は、特異度がそれぞれ、８８．９％、９４．４％および１００％と著しく高かった。したがって、これら３つのペプチドは、肺癌を初期のステージで検出できる、より効果的なバイオマーカーであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上のように、本発明は、肺癌を早期に検出することができる。したがって、本発明は、診断医療分野および保健医学分野に広く利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌診断用ポリペプチドならびに肺癌診断用ポリペプチドを用いた肺癌の検出方法および治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、日本および欧米で最も死亡者数の多い癌であり、難治性である。肺癌は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌に分けることができ、肺癌患者全体の１５％が小細胞肺癌であり、残りの８５％が非小細胞肺癌である。さらに、非小細胞癌は、病理組織学的に、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌の３つのタイプに分けることができる。
【０００３】
喫煙は依然として癌の主要な危険因子である。しかしながら、近年、非喫煙者における肺癌（主に腺癌）が増加してきている。肺癌患者における５年後の生存率はわずか１５％程度である。これは、初期の段階で肺癌を検出できる方法がないことに大きく起因する。肺癌患者のうち初期ステージの疾患と診断されるケースはわずか１６％である。胸部Ｘ線、喀痰細胞診、およびヘリカルＣＴなどは肺癌検出のスクリーニングツールとして用いられてきているが、肺癌の死亡率の改善に関しては、ほとんど効果をもたらしていない。
【０００４】
一方、疾患の早期発見を達成し、臨床管理を向上させるために、肺癌用血清バイオマーカーが開発されてきている（非特許文献１参照）。それにもかかわらず、その臨床有用性は限られている（非特許文献２および３参照）。ＣＥＡ（carcinoembryonic antigen）およびＣＹＦＲＡ（cytokeratin 19 fragment）は、一部の非小細胞癌患者の血清において存在量が増加している。そのため、これらは、疾患の状態をモニターしたり、治療に対する反応を評価したりと、臨床上有効である。しかしながらこれらは、臨床診断での使用には適していない（非特許文献４参照）。なぜならば、これらは、喫煙や肺炎などの他の疾患および他の種類の癌にも関連していることが知られており、さらには、初期ステージの肺癌を検出することができないからである。
【０００５】
近年、プロテオミクス技術を用いて臨床検体におけるタンパク質の発現パターンをモニタリングすることによって、癌の診断に用いられる可能性のある新規バイオマーカーの発見を可能なものとしている。癌の病原の分子基板および癌関連タンパク質の特性の理解をより深めるために、２Ｄ−ＤＩＧＥ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、タンパク質アレイ、ＩＣＡＴ、ｉＴＲＡＱおよびＭｕｄＰＩＴなどの種々のプロテオミクスツールが、種々の生体試料の差分解析に用いられてきている（非特許文献５参照）。生体試料としては、細胞可溶化物、血清および血漿などが含まれている。
【０００６】
複雑な生体試料の中から微量成分を推定バイオマーカーとして同定するために、焦点を合わせたプロテオミクス技術および目標を定めたプロテオミクス技術が注目を集めてきている。例えば、ＩＭＡＣ（非特許文献６参照）などのリンタンパクプロテオミクス技術、細胞表面捕捉（ＣＳＣ）技術（非特許文献７および８参照）、およびグリカン構造特異的定量技術であるＩＧＥＬ（非特許文献９参照）などが挙げられる。これらの技術によれば、とりわけ、血液プロテオーム試料における高感度および高スループットなプロファイリングを妨げている技術的制限を回避できる。この技術的制限の原因としては、血液プロテオーム試料自体が非常に複雑であること、タンパク質のダイナミックレンジが非常に大きいことが挙げられる。同様に、自然発生したペプチドを取り扱うプロテオミクスの一分野は、ペプチドミクスと呼ばれている。タンパク質のプロセシングまたは分解によって生じたペプチドを直接解析することは、体液中のバイオマーカーペプチドの検出に有用であると考えられている（非特許文献１０参照）。また、ペプチドミクスの一環として、新規バイオマーカーを質量分析技術を利用して取得する方法もまた提案されている（非特許文献１１参照）。
【０００７】
これまで５００種以上のプロテアーゼ／ペプチダーゼが、ヒト細胞で発現していることが知られている（非特許文献１２および１３参照）。これらは、細胞間領域、細胞外マトリクスおよび血液を含めた生体のあらゆる場所で働いており、他のタンパク質の機能の活性化、細胞タンパク質の分解、さらには癌の進行または抑制に関わっている（非特許文献１４〜１６参照）。事実、多くのマトリクスメタロプロテアーゼが種々の癌細胞で過剰発現しており、これにより、癌細胞または転移促進に都合のよい微環境の構築を助長している（非特許文献１６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gail M. H., Muenz L., McIntire K. R., Radovich B., Braunstein G., Brown P. R., Deftos L., Dnistrian A., Dunsmore M., Elashoff R., and et al., J. Natl. Cancer Inst. 1988, 80, 97-101.
【非特許文献２】McCarthy N. J., and Swain S. M., Cancer J. 2001, 7, 175-177.
【非特許文献３】Brundage M. D., Davies D. and Mackillop W. J., Chest. 2002, 122, 1037-1057.
【非特許文献４】Sung H. J. and Cho J. Y., BMB Rep. 2008, 41, 615-625.
【非特許文献５】Maurya P., Meleady P., Dowling P. and Clynes M., Anticancer Res. 2007, 27, 1247-1255.
【非特許文献６】Gamez-Pozo A., Sanchez-Navarro I., Nistal M., Calvo E., Madero R., Diaz E., Camafeita E., de Castro J., Lopez J. A., Gonzalez-Baron M., Espinosa E. and Fresno Vara J. A., PloS One 2009, 4, e7731.
【非特許文献７】Wollscheid B., Bausch-Fluck D., Henderson C., O'Brien R., Bibel M., Schiese R., Aebersold R. and Watts J. D., Nat. Biotechnol. 2009, 27, 378-386.
【非特許文献８】Schiese R., Wollscheid B. and Aebersold R., Mol. Oncol. 2009, 3, 33-44.
【非特許文献９】Ueda K., Takami S., Saichi N., Daigo Y., Ishikawa N., Kohno N., Katsumata M., Yamane A., Ota M., Sato T. A., Nakamura Y. and Nakagawa H., Mol. Cell Proteomics 2010.
【非特許文献１０】Villanueva J., Nazarian A., Lawlor K. and Tempst P., Nat. Protoc. 2009, 4, 1167-1183.
【非特許文献１１】Ueda K., Sato T., Daigo Y., Ishikawa N., Kohno N., Nakamura Y., and Nakagawa H., AACR-JCA 8th Joint Conference: Cancer Genomics, Epigenomics, and the Development of Novel Therapeutics, 2010.
【非特許文献１２】Lopez-Otin C. and Bond J. S., J. Biol. Chem. 2008, 283, 30433-30437.
【非特許文献１３】Overall C. M. and Blobel C. P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 245-257.
【非特許文献１４】Palermo C. and Joyce J. A., Trends Pharmacol. Sci. 2008, 29, 22-28.
【非特許文献１５】Lopez-Otin C. and Matrisian L. M., Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 800-808.
【非特許文献１６】Egeblad M. and Werb Z., Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 161-174.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
肺癌の血清および血漿にて測定できる腫瘍マーカーとしては、上記したＣＥＡおよびＣＹＦＲＡのほかにも、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰが臨床にて使用されている。しかしながら、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰは、小細胞肺癌特異的なものであって、非小細胞癌を検出することはできない。また、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、ＳＣＣおよびＳＬＸにおいては、非小細胞肺癌を検出するための感度および特異度はいずれも低く、また、初期ステージの肺癌を検出することができず、早期の肺癌診断のための使用には適していない。
【００１０】
そのため、非小細胞肺癌診断に適用できる新規バイオマーカー、とりわけ早期の肺癌診断にも使用できるバイオマーカーの開発が強く望まれている。
【００１１】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、肺癌診断用の新規バイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述したプロテアーゼおよびペプチダーゼ活性によって、癌の進行または癌に関連した応答を非常によく反映している消化ペプチド断片が生成されるはずである。したがって、ヒト血清またはヒト血漿におけるペプチドミクスプロファイリングは、新規癌マーカー探索の有力なツールであると考えられる。
【００１３】
以上を鑑み、本発明者らが鋭意検討を行った結果、ゲル濾過クロマトグラフィおよび質量分析法を用いた大規模スクリーニングによって、肺癌患者の血清中に特異的に存在するペプチドを見出し、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドは、上記課題を解決するために、配列番号１〜１９の何れか１つに示されるアミノ酸配列からなる構成である。
【００１５】
本発明に係る肺癌の検出方法は、上記課題を解決するために、生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する工程を含む構成である。
【００１６】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、少なくとも配列番号５、１２または１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、質量分析法により上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記工程において、上記試料をゲル濾過クロマトグラフィに供して肺癌診断用ポリペプチド画分を取得して、得られた画分について上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される２以上の上記肺癌診断用ポリペプチドを一度に検出または測定することが可能である。
【００２０】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記試料が血液、血清または血漿であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る肺癌の検出方法は、上記工程に先立って、上記試料に加熱処理を施すことが好ましい。
【００２２】
本発明に係る肺癌患者における治療効果の評価方法は、治療が施される前に生体から採取した試料、および治療が施された後に生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つを検出または測定する第１の工程と、それぞれの検出結果を比較する第２の工程とを含む構成である。
【発明の効果】
【００２３】
特定の配列からなる本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドを用いることにより、採取した生体試料を用いて肺癌を検出することが可能となる。したがって、本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドは、肺癌バイオマーカーとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】バイオマーカーペプチドのスクリーニング方法の概要を示す図である。
【図２】一実施例における血清試料のＨＰＬＣによる分離結果のスペクトルの重ね合わせを示す図である。
【図３】一実施例における血清試料のＨＰＬＣによる分離結果のスペクトルの一部を拡大して示す図である。
【図４】一実施例における血清試料の質量分析を行った結果のＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】一実施例における血清試料の質量分析を行った結果について作成したクロマトグラム面を示す図である。
【図６】全クロマトグラム面をアラインメントした結果の一部を示す図である。
【図７】一実施例における健常人グループおよび肺癌患者グループの間のｔ検定におけるｐ値に従ったクラスターの階層図である。
【図８】一実施例における候補バイオマーカーペプチドについて主成分分析を行った結果を示す図である。
【図９】一実施例における最適なＭＲＭトランジションを設定するために、７６個のＭＲＭトランジションを同時にモニタリングした結果を示す図である。
【図１０】一実施例における相対定量化解析の結果を示すボックスプロットの図である。
【図１１】一実施例における相対定量化解析の結果を示すＲＯＣカーブの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
＜１．肺癌診断用ポリペプチド＞
本発明に係る肺癌診断用ポリペプチドは、配列番号１〜１９の何れか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２６】
これらのポリペプチドは、肺癌患者由来の血清において、健常人由来の血清に比してより多く検出される。そのため、血清中の本肺癌診断用ポリペプチドの存在量を測定して健常人における存在量と比較することにより、肺癌を検出することが可能となる。すなわち、本肺癌診断用ポリペプチドは、肺癌検出用のバイオマーカーとして用いることができる。
【００２７】
ここで、「肺癌」とは、ヒトの腺癌（肺腺癌）、扁平上皮癌および大細胞癌を含む非小細胞癌を指す。本発明に係る肺癌診断用ペプチドは、とりわけ、腺癌の検出に特に有効である。
【００２８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヒトアミロリド感受性カチオンチャネル４（ＡＣＣＮ４）タンパク質のＮ末端から６１３番目から６２４番目までのアミノ酸残基の配列である。このアミノ酸配列からなるポリペプチドを、本明細書では、「ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４」と称する。
【００２９】
配列番号２〜５に示されるアミノ酸配列はそれぞれ、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）のＮ末端から２７１番目から２８３番目までのアミノ酸残基の配列、２６８番目から２８４番目までのアミノ酸残基の配列、２６０番目から２８４番目までのアミノ酸残基の配列、および２７３番目から２８３番目までのアミノ酸残基の配列である。これらのアミノ酸配列からなる各ポリペプチドを、本明細書ではそれぞれ、「ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３」、「ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４」、「ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４」、および「ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３」と称する。
【００３０】
配列番号６に示されるアミノ酸配列は、ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）のＮ末端から１９４番目から２１４番目までのアミノ酸残基の配列である。このアミノ酸配列からなるポリペプチドを、本明細書では、「ＡＰＯＥ １９４−２１４」と称する。
【００３１】
配列番号７〜１８に示されるアミノ酸配列はそれぞれ、ヒトフィブリノゲンアルファ鎖（ＦＩＢＡ）のＮ末端から１番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、７番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、７番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、２番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、５番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、５番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、６番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、６番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、４番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、４番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列、３番目から１５番目までのアミノ酸残基の配列、および３番目から１６番目までのアミノ酸残基の配列である。これらのアミノ酸配列からなる各ポリペプチドを、本明細書ではそれぞれ、「ＦＩＢＡ １−１６」、「ＦＩＢＡ ７−１５」、「ＦＩＢＡ ７−１６」、「ＦＩＢＡ ２−１６」、「ＦＩＢＡ ５−１５」、「ＦＩＢＡ ５−１６」、「ＦＩＢＡ ６−１５」、「ＦＩＢＡ ６−１６」、「ＦＩＢＡ ４−１５」、「ＦＩＢＡ ４−１６」、「ＦＩＢＡ ３−１５」、および「ＦＩＢＡ ３−１６」と称する。
【００３２】
配列番号１９に示されるアミノ酸配列は、ヒトｌｉｍｂｉｎタンパク質のＮ末端から３０６番目から３１３番目までのアミノ酸残基の配列である。このアミノ酸配列からなるポリペプチドを、本明細書では、「ＬＢＮ ３０６−３１３」と称する。
【００３３】
上記した各肺癌診断用ポリペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
上記した肺癌診断用ポリペプチドのうち、ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４、ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ １−１６、ＦＩＢＡ ２−１６、ＦＩＢＡ ５−１６、ＦＩＢＡ ６−１５、ＦＩＢＡ ６−１６、ＦＩＢＡ ４−１６、ＦＩＢＡ ３−１５、ＦＩＢＡ ３−１６、およびＬＢＮ ３０６−３１３は、健常人と肺癌患者との間で血清における存在量に、より大きな有意差があるため、肺癌を検出するためのバイオマーカーとして、より好ましい。
【００３６】
さらに、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ ５−１６、およびＬＢＮ ３０６−３１３については、肺癌の手術可能ステージ（ステージＩ，ＩＩ，ＩＩＩａ）での、感度および特異度により優れているため、とりわけ、肺癌の手術可能ステージを検出するためのバイオマーカーとして、特に好ましい。
【００３７】
肺癌患者由来の血清において、健常人由来の血清に比してより多く検出されるという観点から、表２にＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８として示した各化合物も肺癌を検出するバイオマーカーとして用いることが可能である。表２に示した各化合物は、ヒトの血清に由来する化合物であって、対応させて示す分子量を有しているペプチドである。なお、表２に示す分子量、ｍ／ｚ、ＲＴ（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）およびＣｈａｒｇｅは、後述する実施例３に記載した測定法により同定した値である。また各化合物がペプチドまたは修飾ペプチドである場合にそのアミノ酸配列は、後述する実施例４に記載した測定法により同定することが可能である。なお、ＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８として示した各化合物は、そのイオン化における電荷および分子量から、ペプチドまたは修飾ペプチドであると推定される。
【００３８】
【表２】
【００３９】
すなわち、採取した被験者の血清において、表２に示される分子量を有している化合物を検出または測定することによっても、肺癌を検出することが可能である。
【００４０】
なお、ＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８の化合物のうち、少なくともＩＤ＿００２（ＦＩＢＡ ５−１６）、ＩＤ＿００４（ＦＩＢＡ ５−１５）、ＩＤ＿００５（ＦＩＢＡ ７−１６）、ＩＤ＿００７（ＬＢＮ ３０６−３１３）、ＩＤ＿００８（ＦＩＢＡ ３−１５）、ＩＤ＿００９（ＦＩＢＡ １−１６）、ＩＤ＿０１０（ＦＩＢＡ ３−１６）、ＩＤ＿０１１（ＦＩＢＡ ７−１５）、ＩＤ＿０１２（ＦＩＢＡ ４−１５）、ＩＤ＿０１３（ＦＩＢＡ ２−１６）、ＩＤ＿０１５（ＦＩＢＡ ４−１６）、ＩＤ＿０２３（ＦＩＢＡ ２−１６）、ＩＤ＿０２７（ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４）、ＩＤ＿０３１（ＦＩＢＡ ２−１６）、ＩＤ＿０３２（ＦＩＢＡ ６−１６）、ＩＤ＿０３３（ＦＩＢＡ ６−１６）、ＩＤ＿０３９（ＦＩＢＡ ６−１５）、ＩＤ＿０５１（ＦＩＢＡ ５−１５）、ＩＤ＿０６４（ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４）、ＩＤ＿０６９（ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３）、ＩＤ＿０７５（ＦＩＢＡ ５−１６）、ＩＤ＿０８５（ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４）、ＩＤ＿０９３（ＦＩＢＡ ５−１６）、ＩＤ＿０９９（ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３）、ＩＤ＿１０８（ＡＰＯＥ １９４−２１４）、ＩＤ＿１１３（ＦＩＢＡ ３−１６）、およびＩＤ＿１１４（ＦＩＢＡ ２−１６）についてはペプチドであって、データベース検索によってそのアミノ酸配列が同定されており、表１に示すペプチドの何れかに分類されている。
【００４１】
＜２．肺癌疾患の検出方法＞
本発明に係る肺癌疾患の検出方法は、生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する工程を含めばよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００４２】
本明細書において、「肺癌診断用ポリペプチドを測定する」とは、生体試料およびこれを精製して得られる試料における肺癌診断用ポリペプチドの存在量または濃度を測定することを意図している。
【００４３】
本発明の検出方法の一例として、被験者由来の生体試料中における少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドの量を測定し、対照被験者（健常者）由来の生体試料中におけるこの肺癌診断用ポリペプチドの量を測定し、両者を比較することによって、肺癌を検出することができる。具体的には、被験者由来の試料における肺癌診断用ポリペプチドの量と、健常者由来の試料における当該肺癌診断用ポリペプチドの量とを比較して、両者の間で有意な相違が見られた場合には、この被験者が肺癌に罹患しているか、または肺癌に罹患している可能性が高いと判定することができる。健常者由来の試料における当該肺癌診断用ポリペプチドの量は予め測定したものを用いることが可能である。あるいは、予め健常者由来の生体試料における肺癌診断用ポリペプチドの量を測定して、これに基づいて正常濃度範囲を定めておき、被験者由来の生体試料において肺癌診断用ポリペプチドの量がその正常濃度範囲から外れた場合に、肺癌に罹患していると判定することも可能である。
【００４４】
ここで「試料」とは、生体（ヒト）から採取した試料であって、上記肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定できる試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、血清、および血漿などを用いることができる。中でも、血清および血漿が好ましい。
【００４５】
肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する方法としては、肺癌診断用ポリペプチドの存在量を定量的もしくは半定量的に決定できるか、または肺癌診断用ポリペプチドの有無を決定できる限り、特に制限されるものではなく、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび免疫沈降法などの免疫学的手法、ならびに質量分析法などを用いることができる。中でも、以下の観点から質量分析法が好ましい。質量分析装置を用いた質量分析法によれば、特異的な抗体を作製する必要がないため、簡便に肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することができる。また、質量分析装置を用いた質量分析法は、感度および精度に優れているため、より正確な判定を行うことができる。さらに、多成分同時分析が可能なマルチチャネル型の質量分析装置を用いることにより、２以上の肺癌診断用ポリペプチドを一度に検出または測定することが可能となる。２以上の肺癌診断用ポリペプチドを用いて判定を行うことによって、肺癌に罹患しているか否かについてより正確な判定を行うことが可能となる。あるいは、２以上の肺癌診断用ポリペプチドを組み合わせて判定することによって、肺癌がどのステージの状態であるか否かについてより正確な判定を行うことが可能となる。さらには、肺癌以外の他の疾患に関するバイオマーカーも同時に測定することが可能となり、一度に様々な疾患についての検出を試みることが可能となる。また、より精度よく検出をおこなうためには、タンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いることが好ましい。本発明の検出方法において用いられる質量分析装置としては定量可能であれば特に制限はなく、四重極型および飛行時間型など従来公知の型の質量分析装置を用いることが可能である。
【００４６】
肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定に用いられる試料は、生体から採取した後、肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定を行う前に、加熱処理が施されることが好ましい。試料に加熱処理を施すことによって、試料中に含まれるタンパク質分解酵素を失活させることができる。これにより、肺癌診断用ポリペプチドが検出および測定前に分解されることを防ぐことができる。加熱処理としては、例えば１００℃で１０分の処理が可能である。あるいは、加熱処理の代わりに、試料を酸変性または有機溶媒沈殿法に供することによって、タンパク質分解酵素によるペプチドの分解を防止してもよい。酸変性では、例えば、１％トリフルオロ酢酸存在下で６０℃に加熱してタンパク質のみを沈殿させて、その上清を、検出および測定用試料として用いればよい。また、有機溶媒沈殿法としては、例えば、アセトンおよびアセトニトリルなどの有機溶媒を血清の５〜１０倍量添加することによってタンパク質のみを沈殿させて、同様にその上清を、検出および測定用試料として用いればよい。なお、効率の観点から、単純に加熱処理を行うことが好ましい。
【００４７】
肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定に用いられる試料は、質量分析に供する前に、ゲル濾過クロマトグラフィ（サイズ排除クロマトグラフィ）によって、肺癌診断用ポリペプチドを含む画分として濃縮して、この画分について肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定を行うことが好ましい。これにより、血液試料から１ステップで質量分析に供することが可能になる。すなわち、例えばタンパク質のＭＳ分析では必須であるトリプシン消化などのステップを全て省略することができる。したがって、肺癌診断用ポリペプチドの検出および測定を、簡便かつ迅速に行うことができる。また、ゲル濾過クロマトグラフィによる処理であれば、有機溶媒および強酸などの毒劇物を必要としないため、作業従事者における健康被害のリスクが低く、臨床検査技師などの医療従事者であっても前処理を実施することができる。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィによる処理は、タンパク質等の高分子に対する排除効果がきわめて高い。そのため、引き続き行われる質量分析による検出工程の再現性を高めることができる。
【００４８】
肺癌診断用ポリペプチドを含む画分として回収する画分は、肺癌診断用ポリペプチドを含む限りその分子量の範囲に制限はなく、例えば、分子量が１，０００（Ｄａ）以上、５，０００（Ｄａ）以下のペプチドを含むような画分を回収すればよい。
【００４９】
これまで様々なアプローチにて、血清および血漿に適用できる疾患バイオマーカー候補タンパク質およびペプチドが同定されてきているが、それらを臨床に応用していくためには、広いダイナミックレンジを有し、正確で多検体を処理できる方法が必要である。その多くは特異的抗体を用いてのＥＬＩＳＡの系が担っていたが、ＥＬＩＳＡの系に使える特異的な抗体を確立することは困難であり、血清および血漿における疾患バイオマーカーの確証、追証実験を遂行することが困難な場合が多い。
【００５０】
これに対して本発明の肺癌診断用バイオマーカーおよび肺癌の検出方法によれば、特異的抗体を製造することなく、多検体を正確に処理でき、高感度で肺癌を検出することができる。
【００５１】
＜３．肺癌患者における治療効果の評価方法＞
本発明に係る肺癌患者における治療効果の評価方法は、治療が施される前に生体から採取した試料、および治療が施された後に生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つを検出または測定する第１の工程と、それぞれの検出結果を比較する第２の工程とを含めばよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００５２】
本発明の評価方法の一例として、肺癌患者の生体試料中における少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドの量を肺癌の治療開始前に予め測定し、肺癌の治療開始後に、同一患者の当該肺癌診断用ポリペプチドの量を測定し、両者を比較することによって、肺癌の治療効果を評価することができる。具体的には、治療開始前の肺癌診断用ポリペプチドの量と、治療開始後の当該肺癌診断用ポリペプチドの量とを比較して、治療開始後の当該肺癌診断用ポリペプチドの量が、健常者の生体試料中における当該肺癌診断用ポリペプチドの量に近づいており、両者（治療開始前および治療開始後）の間で有意な相違が見られた場合には、この患者に対して行った治療に効果があったと評価することができる。
【００５３】
なお、肺癌診断用ポリペプチドの検出または測定に用いられる生体試料の調製および精製、ならびに肺癌診断用ポリペプチドの検出方法または測定方法は、上記＜２．肺癌疾患の検出方法＞の説明を援用することができる。
【００５４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００５５】
以下に示す各実施例において、「肺癌」は、特に断りのない限り、肺腺癌を指すものとする。
【００５６】
各実施例について詳細に説明する前に、本肺癌診断用ポリペプチドのスクリーニングの流れの概要を図１を参照して説明する。
【００５７】
本肺癌診断用ポリペプチドのスクリーニングでは、まず、複数の肺癌患者および健常人から血清を採取して加熱処理することによって血清を調製した（実施例１、２）。次いで、それぞれの血清についてサイズ排除クロマトグラフィを行うことによって、特定の分子量画分を収集した（実施例２）。収集した画分についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行い、本画分に含まれるペプチド成分を抽出した（実施例３、４）。抽出したペプチド成分について、非ラベル化定量解析を行った（実施例３）。肺癌患者からのデータと健常人からのデータとを比較し、統計解析を行うことによって、肺癌患者特異的なペプチドを選抜する（実施例３）。ここまでが、スクリーニング段階である。検証段階では、選抜した各ペプチドについて、別の肺癌患者および健常人の血清を対象として、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）による相対定量解析を行った（実施例５）。得られた結果について統計解析を行うことによって、各ペプチドの評価を行った（実施例６）。以上によって、肺癌の検出に用いられるバイオマーカーを同定した。以下、各実施例について詳細に説明する。
【００５８】
〔実施例１：血清の調製〕
インフォームド・コンセントを得た上で、広島大学病院における１２２人の肺腺癌患者（ステージＩ〜ＩＶ）から、ヒト血清試料を得た。また、正常コントロール用の血清試料を、インフォームド・コンセントを得た上で、広島ＮＴＴ病院において健康診断を受けている３０人の健康なボランティア、および高知大学病院において健康診断を受けている３６人の健康なボランティアから得た。
【００５９】
血清は、一般的な手法を用いて、遠心分離（１５００×ｇ、１０分間）によって全血から収集し、−８０℃で保存した。
【００６０】
〔実施例２：ペプチドーム画分の収集〕
全ての血清を１回だけ凍結融解させ、プロテアーゼおよびペプチダーゼによる血清中の成分の分解を防ぐため、また加熱処理中のタンパク質の凝集を避けるため、すぐに、プロテオミクスグレードの水を用いて４倍に希釈した上で１００℃にて１０分間インキュベートした。Ｓｐｉｎ−Ｘ ０．４５μｍスピンフィルタを用いて濾過した後、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所社製）に連結している１０／３００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に、１０μｌのサンプルを投入した。１００ｍＭの酢酸アンモニウムの一定流量（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）のもと、試料をＨＰＬＣに導入した。カラムを通過した試料について２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。結果を図２に示す。
【００６１】
図２は、１６人分の血清試料に対応するゲル濾過ＨＰＬＣのスペクトルを重ね合わせて示している図である。図２に示されるように、ゲル濾過ＨＰＬＣでは、血清タンパク質および血清ペプチドの分離が非常に再現性よく行われていた。
【００６２】
次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて、サイズ排除クロマトグラフィの精度を評価した。図３は、上記ゲル濾過ＨＰＬＣの１つのスペクトルの一部を拡大して示している。図３中「１」〜「１０」の網掛けによって示す１０個の画分（保持時間が１４分から３４分までの２分毎の画分）について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて解析することによって、サイズ排除クロマトグラフィの精度を評価した。その結果を図４に示す。図４は、１０個の画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．１０）のそれぞれについてのＭＳスペクトルを示す図である。図４の連続的なＭＳスペクトルに示されるように、ゲル濾過クロマトグラフィを行うことによって、血清タンパク質および血清ペプチドを分子量に応じて正確に分離することができている。
【００６３】
図４に示す結果に基づき、図３中「５」〜「１０」の網掛けによって示す６個の画分（保持時間が２２分から３４分まで）をペプチドーム画分と規定して収集した。これらの画分は１，０００〜５，０００の分子量に対応している。
【００６４】
収集した画分（ペプチド試料）を、Ｖａｃｕｕｍ Ｓｐｉｎ Ｄｒｉｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて乾燥させた。
【００６５】
〔実施例３：ペプチドバイオマーカーのスクリーニング〕
肺癌の初期の段階の検出に用いられ得る血清ペプチドを探索するために、健常人および肺癌患者を含む９２人の血清試料の定量的ペプチドームプロファイルを取得した。９２人の内訳を表３に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
９２人のうち、６２人が肺癌患者である。６２人の肺癌患者のうち、３２人が手術可能なステージにある肺癌患者（ステージＩ：ｎ＝１０、ステージＩＩ：ｎ＝１０、ステージＩＩＩａ：ｎ＝１２）であり、３０人が進行ステージにある肺癌患者（ステージＩＩＩｂ：ｎ＝１５、ステージＩＶ：ｎ＝１５）である。これにより、肺癌の進行度を反映したバイオマーカーを取得することが可能となる。
【００６８】
まず、実施例１と同様にして血清を採取した。また、実施例２と同様にしてゲル濾過クロマトグラフィによって血清試料を精製した。得られた９２個のペプチド試料をそれぞれ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した。具体的には、得られたペプチド試料（乾燥させたペプチドーム画分）を、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む２％のアセトニトリルに溶解した。このペプチド試料について、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（ＤＩＯＮＥＸ社製）に連結したＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて解析した。
【００６９】
まず、Ｌ−Ｃｏｌｕｍｎビーズを手作業で装填した１００μｍ×２００ｍｍ ｔｉｐ−ｃｏｌｕｍｎ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、ペプチド試料を分離した。ペプチド試料の分離には、流速２００ｎｌ／ｍｉｎの溶媒Ａ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸、７０％アセトニトリル）を用いた。ここで、溶媒Ｂは多段階の線形勾配を形成させており、９５分間で溶媒Ｂを５％から５５％まで変化させ、その後１０分間で５５％から９５％まで変化させている。
【００７０】
溶出物について、直接、１秒のＭＳサーベイ（ｍ／ｚ ４００〜１８００）を行ない、その中で最も強度の強かったプリカーサイオン（３０カウント以上、＋２〜＋４の荷電状態、ｍ／ｚ範囲は５０／２０００）に対して３度のＭＳ／ＭＳ測定を行った。なお、サーベイの条件は、ＳＩＤＡ＝３．０、最大蓄積時間＝２．０秒である。すでに標的にされていたプリカーサイオンは、４０秒間の反復ＭＳ／ＭＳ取得（１００ｍＤａの質量許容度）からは除外した。
【００７１】
ＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅにおいて得られた９２個のｒａｗデータファイル（．ｗｉｆｆフォーマットおよび．ｗｉｆｆ．ｓｃａｎフォーマット）を、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ ＲｅｆｉｎｅｒＭＳモジュール（Ｇｅｎｅｄａｔａ社製）に直接導入した。このモジュールを用いて、まず、図５に示すようなＭＳクロマトグラム面を作成した。また、全てのクロマトグラムについて、装置特異的ノイズおよび化学ノイズを実質的に差し引いて除去した。具体的には、クロマトグラム化学ノイズサブトラクションアクティビティにおいて、ＲＴ Ｗｉｎｄｏｗ＝３ｓｃａｎとして平坦化を実施した。バックグラウンドのノイズを除去するために、ピーク強度を下記のように規定した：
Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ＝ｍａｘ（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｒｉｇｉｎａｌ−Ｑｕａｎｔｉｌｅ−Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，０）
ｍａｘは引数のうち大きいものをとる関数である。ここでは、Ｑｕａｎｔｉｌｅ値＝５０％、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１５ｃｐｓとした。また、少なくとも以下の何れか１つの基準を満たすシグナルをノイズピークとみなして、差し引き除去した：
・ＲＴ Ｗｉｎｄｏｗ＞５０ｓｃａｎ
・Ｍｉｎｉｍｕｍ ＲＴ Ｌｅｎｇｔｈ＝４ｓｃａｎ
・Ｍｉｎｉｍｕｍ ｍ／ｚ ｌｅｎｇｔｈ＝８ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ。
【００７２】
次いで、各ＭＳクロマトグラム面における保持時間（ＲＴ）グリッドを、９２個のクロマトグラム面の間で正しくアラインメントした。アラインメントの結果の一部を図６に示す。アラインメントを行うことにより、複数の試料を用いた確実な定量解析を行うことができるようになる。アラインメントの際のクロマトグラムＲＴアラインメントアクティビティにおけるパラメータは以下の通りである：
・ｍ／ｚ Ｗｉｎｄｏｗ＝０．１Ｄａ
・ＲＴ Ｗｉｎｄｏｗ＝０．２ｍｉｎ
・Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
・ＲＴ ｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｅｒｖａｌ＝５ｍｉｎ。
【００７３】
次いで、特定のクロマトグラム面では検出されないピークの位置情報も確実に取得するために、クロマトグラム積算ピーク検出アクティビティによって、一時的に平均化したクロマトグラムにおけるピークを検出した。その際のパラメータは以下の通りである：
・Ｓｕｍｍａｔｉｏｎ Ｗｉｎｄｏｗ＝５ｓｃａｎ
・Ｏｖｅｒｌａｐ＝５０
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｐｅａｋ Ｓｉｚｅ＝４ｓｃａｎ
・Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍｅｒｇｅ Ｄｉｓｔａｎｃｅ＝１０ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ
・Ｇａｐ／Ｐｅａｋ Ｒａｔｉｏ＝１
・Ｍｅｔｈｏｄ＝ｃｕｒｖａｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｐｅａｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
・Ｐｅａｋ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝５
・Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８
・Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１。
【００７４】
その後、２段階の積算アイソトープクラスタリングアクティビティによって、２Ｄピークの中からアイソトープパターンを同定した。同一のペプチドシグナルに属する各アイソトープピークをピーククラスターとして分類した。クラスターのいくつかの例を図５中の一点破線枠で示している。第１のクラスタリングは以下の基準に沿って実施した：
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｈａｒｇｅ＝１
・Ｍａｘｉｍｕｍ Ｃｈａｒｇｅ＝１０
・Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｐｅａｋｓ＝０
・Ｆｉｒｓｔ Ａｌｌｏｗｅｄ Ｇａｐ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ＝３
・Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ＝ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ
・ＲＴ Ｔｏｌｅｆａｎｃｅ＝０．１ｍｉｎ
・ｍ／ｚ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝０．０５Ｄａ
・Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｓｈａｐｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝１０．０
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｉｚｅ Ｒａｔｉｏ＝１．２。
【００７５】
第２のクラスタリングは、
・Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｉｚｅ Ｒａｔｉｏ＝０．６
・Ｒｅｕｓｅ Ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ＝ｔｕｒｅ
とした以外は第１のクラスタリングと同一のセッティングによって実施した。
【００７６】
この結果、９２個の血清試料から、電荷状態が＋１〜＋１０の何れかである、重複しない１２，３９６個のピーククラスターが検出された。
【００７７】
検出された全てのクラスターピークの情報（ｍ／ｚ、保持時間、および強度を含む）を、ＡＢＳファイルとして出力した。
【００７８】
出力されたＡＢＳファイルをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ Ａｎａｌｙｓｔモジュールにおいてロードした。さらなる統計的な検討のために、この中から、電荷状態が＋２〜＋６の何れかである３，５３７個のピーククラスターを利用した。
【００７９】
血清レベルにおいて肺癌特異的な変化を示しているペプチドのピークを抽出するために、健常人グループ（ｎ＝３０）と肺癌患者グループ（ｎ＝６２）との間で、スチューデントのｔ検定を実施した。スチューデントのｔ検定に際して、９２個の血清試料の中でみられたピーク強度のバリエーションは、それぞれの血清試料における強度の中央値を１０，０００に固定することによって標準化した。標準化した強度データを用いて、健常人グループと肺癌患者グループとの間で、スチューデントのｔ検定を実施した。この結果を図７に示す。
【００８０】
図７は、スチューデントのｔ検定におけるｐ値に従ったクラスター（ペプチド）の階層図である。この検定におけるｐ値がｐ＜０．０１であり、２つのグループ間での強度差が５倍以上であるものを、バイオマーカーとして使用し得るペプチドのピークとして抽出した。その結果、１１８個のペプチドが同定された（上記表２に示すＩＤ＿００１〜ＩＤ＿１１８）。
【００８１】
これら１１８個のペプチドに関して、９２人の被験者を健常人グループおよび肺癌患者グループにグループ分けするための統計的な有効性を評価するために、これら１１８個の候補バイオマーカーペプチドを用いて主成分分析を行った。結果を図８に示す。図８に示されるように、９２人の被験者を健常人グループおよび肺癌患者グループに正しくグループ分けすることができた。すなわち、１１８個のペプチドの定量値は、被験者を健常人グループおよび肺癌患者グループに正確にグループ分けするのに統計的に充分であることが示された。したがって、これら１１８個のペプチドは、肺癌を検出するためのバイオマーカーとして使用できる。
【００８２】
以上、ゲル濾過クロマトグラフィおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたバイオマーカーのスクリーニングによって、肺癌バイオマーカーとして使用できる１１８個のペプチドを得た。
【００８３】
〔実施例４：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチド配列の同定〕
ＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＭＡＳＣＯＴデータベース検索を用いて、包括的ペプチド配列決定を実施した。ＭＡＳＣＯＴデータベース検索は、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ ２．０ ソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて実施した。ＭＳ／ＭＳデータについての検索は、以下のパラメータを用いて、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５７．４（２０，４００配列）からのヒトタンパク質データベースに対して実施した：
・Ｔａｘｏｎｏｍｙ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓｅ
・Ｅｎｚｙｍｅ＝Ｎｏｎｅ
・Ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ＝Ｎｏｎｅ
・Ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ＝Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍｅｔ）
・ＭＳ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝５０ｐｐｍ
・ＭＳ／ＭＳ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ＝０．１Ｄａ
予測値（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）＜０．０５である場合に、ＭＳ／ＭＳデータのペプチドが、その予測値に対応する配列からなるものと認定した。
【００８４】
９２人の被験者の血清試料に由来する２３０，６５７個のＭＳ／ＭＳクエリのうち、５，３８２個のペプチドは、ＭＡＳＣＯＴの期待値が＜０．０５でもって配列決定された。重複したものを除くと、４２４種類のペプチドが同定された。これらは、１０６種のタンパク質に対応するものであった。
【００８５】
上述の１１８個のペプチドに関していえば、１９個について配列を決定することができた。配列決定がなされた１９個のペプチドのうち、１２個のペプチドはフィブリノゲンアルファ鎖（ＦＩＢＡ）由来であり、４個のペプチドは、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）由来であり、残りは、それぞれ、アミロリド感受性カチオンチャネル４（ＡＣＣＮ４）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）およびｌｉｍｂｉｎ（ＬＢＭ）由来であった。１９個のペプチドの各アミノ酸配列は、上述の表１に示している。
【００８６】
〔実施例５：ＭＲＭによる定量化〕
本ペプチドの量的再現性を評価するため、また、配列決定された１９個のバイオマーカーペプチドの臨床有用性を評価するために、新たに調製した９６人の被験者の血清試料について、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）法を用いて、ラベル化を伴わない相対定量化解析を実施した。９６人の被験者の内訳を表４に示す。本実施例における各被験者は、表３に示した被験者とは別の被験者である。
【００８７】
【表４】
【００８８】
１９個のペプチドそれぞれに特異的で最適なＭＲＭトランジションを設定するために、スクリーニングの段階で検出されたプリカーサイオンのｍ／ｚ値をＱ１チャンネルとしてセットし、ＭＳ／ＭＳスペクトルの中から最も強度が高かった４つのフラグメントイオンを選択して各ｍ／ｚ値をＱ３チャンネルとしてセットした。血清ペプチドーム試料について、４０００ ＱＴＲＡＰ マススペクトロメトリを用いて、全７６（１９×４）個のＭＲＭトランジションを同時にモニタリングした。
【００８９】
質量分析に先立って、実施例２と同様に、採取した血清試料をＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラムクロマトグラフィ処理に供した。抽出した試料（ペプチド）を乾燥させた後、２％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸とを含み、さらに１ｆｍｏｌ／μｌのＢＳＡを含むトリプシン消化溶液中に溶解した。次いで、Ｐａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４ ＰＡＬ ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＭＲ社製）に連結している４０００ ＱＴＲＡＰ質量分析装置（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて解析した。
【００９０】
ペプチド試料の分離は、Ｌ−Ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳビーズ（化学物質評価研究機構製）を手作業で装填した１００μｍ×１００ｍｍ ｔｉｐ−ｃｏｌｕｍｎ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。ペプチド試料の分離には、流速２００ｎｌ／ｍｉｎの溶媒Ａ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸、９０％アセトニトリル）を用いた。ここで、溶媒Ｂは線形勾配を形成させており、１０分間で溶媒Ｂを２％から１００％まで変化させている。７６個のモニタリングの結果を図９に示す。図９中の各クロマトグラムは、ＱＳＴＳＲ−Ｅｌｉｔｅ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析において最も高い強度を示した４つのフラグメントイオンについて４０００ ＱＴＲＡＰ システムを用いてモニタリングした、４つのクロマトグラムを重ね合わせて示している。
【００９１】
各ペプチドについて、特異的な溶出保持時間を決定した。そして、各ペプチドについて、４つのＭＲＭトランジションの中から最も強いＭＲＭクロマトグラムのピークを示す最適なＭＲＭトランジションを選択した。それぞれのＭＲＭトランジションの情報を表５に示す。
【００９２】
【表５】
【００９３】
ＦＩＢＡ ３−１６およびＦＩＢＡ ５−１６の２つのペプチドは、ＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅおよび４０００ ＱＴＲＡＰ システムの間でのフラグメントイオンの強度が同一のオーダーを示していた。
【００９４】
次に、３６人の健常人（正常コントロール）由来の血清試料および６０人の肺癌患者由来の血清試料を用いて、ＭＲＭによる相対定量解析を実施した。解析は、繰り返して行った。
【００９５】
まず、１９個のバイオマーカーペプチドのイオンおよびＢＳＡ由来の５個のペプチドのイオンを、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）のＭＲＭモードによって同時にモニタリングした。ＭＲＭクロマトグラムを得た後、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェア（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて、このクロマトグラムを平滑化し、定量化した。各試料におけるＭＲＭのピーク領域は、下記式：
標準化後のピーク領域＝１０００×（ｒａｗデータのピーク領域）／（５個のＢＳＡ断片におけるピーク領域の積算）
のようにして標準化した。１９個のバイオマーカーペプチドの血清におけるレベルを、標準化および平均化した後のＭＲＭクロマトグラムピーク領域から算出した。算出結果をボックスプロットとして図１０に示す。図１０の横軸において「Ｎ」は、健常人由来の血清試料であることを表しており、「Ｉ」〜「ＩＶ」はそれぞれ、肺癌のステージがステージＩ〜ＩＶにある肺癌患者由来の血清試料であることを表している。ボックスプロットはＲアルゴリズムによって作成した。それぞれにおいてボックスは、標本の２５％分位点から７５％分位点までを表している。ボックスを横切る線は中央点を表している。ボックスの上部および下部から出ている線の長さはそれぞれ、ボックスの長さの１．５倍の範囲内にあるデータの最大値および最小値によって規定されている。
【００９６】
〔実施例６：ＭＲＭによる定量に基づく統計評価〕
肺癌の早期検出におけるバイオマーカーペプチドの有効性を評価するために、スチューデントのｔ検定によって、肺癌の手術可能ステージ（ステージＩ，ＩＩ，ＩＩＩａ）のグループおよび健常人グループの間で定量結果を統計的に比較評価した。結果を図１０中に示している。
【００９７】
図１０に示されるように、１９個のペプチドのうち、１５個のペプチド（ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４、ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３、ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４、ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＡＰＯＥ １９４−２１４、ＦＩＢＡ １−１６、ＦＩＢＡ ２−１６、ＦＩＢＡ ５−１６、ＦＩＢＡ ６−１５、ＦＩＢＡ ６−１６、ＦＩＢＡ ４−１６、ＦＩＢＡ ３−１５、ＦＩＢＡ ３−１６、ＬＢＮ ３０６−３１３）については、２つのグループ間で、血清レベルにおいて有意な差（ｐ＜０．０５）を示した。一方、残りの４個のペプチド（ＦＩＢＡ ４−１５、ＦＩＢＡ ５−１５、ＦＩＢＡ ７−１５およびＦＩＢＡ ７−１６）は、有意な差（ｐ＜０．０５）を示さなかった。
【００９８】
同様に、１９個のペプチドについて、スチューデントのｔ検定によって、肺癌の進行ステージ（ステージＩＩＩｂ，ＩＶ）のグループと、健常人グループとを比較した。結果を図１０中に示している。
【００９９】
図１０に示されるように、１５個のペプチド（ＡＣＣＮ４ ６１３−６２４、ＡＰＯＡ４ ２６０−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ １−１６、ＦＩＢＡ ７−１５、ＦＩＢＡ ７−１６、ＦＩＢＡ ２−１６、ＦＩＢＡ ５−１６、ＦＩＢＡ ６−１５、ＦＩＢＡ ６−１６、ＦＩＢＡ ４−１５、ＦＩＢＡ ４−１６、ＦＩＢＡ ３−１５、ＦＩＢＡ ３−１６、ＬＢＮ ３０６−３１３）については、２つのグループ間で、血清レベルにおいて有意な差（ｐ＜０．０５）を示した。一方、４個のペプチド（ＡＰＯＡ４ ２６８−２８４、ＡＰＯＡ４ ２７１−２８３、ＦＩＢＡ ５−１５およびＡＰＯＥ １９４−２１４）は、２つのグループ間で、有意な差（ｐ＜０．０５）を示さなかった。
【０１００】
さらに、バイオマーカーの感度（sensitivity）および特異度（specificity）を評価するために、ＲＯＣカーブ解析を実施した。ＲＯＣカーブは、Ｒアルゴリズムによって作成した。カットオフ値は、（sensitivity，specificity）＝（１，１）からの距離が最小となる点にセットした。解析結果の一部を図１１示す。図１１中、「Ｓｅｎｓ」は感度、「Ｓｐｅｃ」は特異度、「ＰＶ＋」は正の予測値（positive predictive value）、そして「ＰＶ−」は負の予測値（negative predictive value）を表している。
【０１０１】
手術可能ステージにある肺癌患者の検出を行うための感度の値を前提とすると、ＦＩＢＡ ６−１５、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ ５−１６およびＬＢＮ ３０６−３１３は、感度の値がそれぞれ、８７．１％、６１．３％、５８．１％および５８．１％であったため、優れたバイオマーカーであることが示された。なかでも、ＡＰＯＡ４ ２７３−２８３、ＦＩＢＡ ５−１６およびＬＢＮ ３０６−３１３は、特異度がそれぞれ、８８．９％、９４．４％および１００％と著しく高かった。したがって、これら３つのペプチドは、肺癌を初期のステージで検出できる、より効果的なバイオマーカーであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上のように、本発明は、肺癌を早期に検出することができる。したがって、本発明は、診断医療分野および保健医学分野に広く利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１９の何れか１つに示されるアミノ酸配列からなる、肺癌診断用ポリペプチド。
【請求項２】
生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する工程を含む、肺癌の検出方法。
【請求項３】
少なくとも配列番号５、１２または１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
質量分析法により上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することを特徴とする請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
上記工程において、上記試料をゲル濾過クロマトグラフィに供して肺癌診断用ポリペプチド画分を取得して、得られた画分について上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することを特徴とする請求項２〜４の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
上記肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される２以上の上記肺癌診断用ポリペプチドを一度に検出または測定することを特徴とする請求項２〜５の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
上記試料が血液、血清または血漿であることを特徴とする請求項２〜６の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
上記工程に先立って、上記試料に加熱処理を施すことを特徴とする請求項２〜７の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項９】
肺癌患者における治療効果の評価方法であって、
治療が施される前に生体から採取した試料、および治療が施された後に生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つを検出または測定する第１の工程と、
それぞれの検出結果を比較する第２の工程とを含む、治療効果の評価方法。
【請求項１】
配列番号１〜１９の何れか１つに示されるアミノ酸配列からなる、肺癌診断用ポリペプチド。
【請求項２】
生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定する工程を含む、肺癌の検出方法。
【請求項３】
少なくとも配列番号５、１２または１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
質量分析法により上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することを特徴とする請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
上記工程において、上記試料をゲル濾過クロマトグラフィに供して肺癌診断用ポリペプチド画分を取得して、得られた画分について上記少なくとも１つの肺癌診断用ポリペプチドを検出または測定することを特徴とする請求項２〜４の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
上記肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される２以上の上記肺癌診断用ポリペプチドを一度に検出または測定することを特徴とする請求項２〜５の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
上記試料が血液、血清または血漿であることを特徴とする請求項２〜６の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
上記工程に先立って、上記試料に加熱処理を施すことを特徴とする請求項２〜７の何れか１項に記載の検出方法。
【請求項９】
肺癌患者における治療効果の評価方法であって、
治療が施される前に生体から採取した試料、および治療が施された後に生体から採取した試料において、配列番号１〜１９に示されるアミノ酸配列からなる肺癌診断用ポリペプチドの群より選択される少なくとも１つを検出または測定する第１の工程と、
それぞれの検出結果を比較する第２の工程とを含む、治療効果の評価方法。
【図１】
【図５】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図５】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−５１８２２（Ｐ２０１２−５１８２２Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９４２６８（Ｐ２０１０−１９４２６８）
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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