胎児肝臓細胞を含む組成物およびＨＣＶ感染で有用な方法
本発明は、ＨＣＶ感染後にＨＣＶを効果的に生産できる細胞を含む組成物、該細胞を培養するための組成物、該組成物の製造方法、および該組成物中の細胞をＨＣＶで感染させる方法を提供する。また、本発明はＨＣＶ生産をアッセイするための方法、およびＨＣＶの生産に影響する化合物を評価する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２００３年１２月１日に出願された米国仮出願第６０／５２６，４１１号の優先権の利益を主張する。前記出願の全明細書をここに引用して援用する。
【０００２】
本発明は、一般には、効果的にＨＣＶを再生することができる細胞を含む組成物、およびそれを製造する、および使用するための方法および組成物に向けられる。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は感染したヒトにおいて頑強に複製されるが、培養された細胞中で該ウイルスを増殖させる頑強な方法は未だ完成されていない。感染した血清を用いてイン・ビボで培養されたヒト肝臓細胞を感染させる場合、少量のＨＣＶが複製されるに過ぎず、これは、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出可能に過ぎない。
【０００４】
ＨＣＶで培養された細胞を感染する試みは末梢血液単核細胞、ヒトＢおよびＴ細胞系、ヒト肝臓細胞系、および初代ヒト胎児および成人細胞で報告されている。しかしながら、今日報告されている結果は失望するものであった。しばしば、ウイルス複製は余りにも低くて、細胞の感染した集団から生じたＨＣＶは、全くではないにせよ、ＲＴ−ＰＣＲで検出できるに過ぎず、従って、少数のＨＣＶ ＲＮＡのコピーが観察できるに過ぎない。さらに、ウイルス生産は散在性であって、同一ウイルスおよび細胞では、同一または異なる日にウエル間で再現性がない。なおさらに、感染のピークを観察するのには、ウイルスを投与した後数日、一ヶ月さえ要する。例えば、Iacovacci et al., Hepatology 26(5):1328-1337 (1997)。これらの問題は、ＨＣＶに罹った患者を治療するのに、および／またはＨＣＶ感染に関連する研究で有用であり得る化合物の同定および迅速なスクリーニングを妨げる。
【０００５】
ＷＯ ０２／０７７２０６は培養した細胞においてＨＣＶを増殖させる方法を記載する。しかしながら、該方法は不利を有する。ＷＯ ０２／０７７２０６に開示された方法においては、細胞は単離後間もなく用いなければならない。従って、単一ドナーからの細胞では単一実験のみができるにすぎない。一人のドナーからは、細胞の一組を得ることができ、従って、１つの実験を行うことができる。さらに、該方法で用いる培地は比較的複雑である。
【０００６】
従って、細胞培養においてＨＣＶを感染させ、複製する方法に対する継続した要望が存在する。また、培養においてＨＣＶ生産を阻害する化合物を測定するための迅速かつ効果的な方法に対する要望も存在する。この適用は、ＨＣＶを効果的に再生することができる細胞を含む組成物、細胞の組成物、細胞を培養するための培地の作成方法、細胞をＨＣＶで感染させる方法、ＨＣＶ感染をアッセイする方法、および本発明の組成物および方法を用いてＨＣＶの生産に影響する化合物の能力を評価する方法を提供することによってこれらの問題を解決する。
【０００７】
本発明は、高ＨＣＶ生産培養細胞を含む組成物の製法を提供する。１つの具体例において、本発明は、低温保存され、効果的であり得て、かつＨＣＶで効果的に感染させることができる、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓からの細胞を含む細胞混合物を含む組成物を提供する。本発明は、試料中の、効果的であり得て、かつＨＣＶで効果的に感染させることができる、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓からの細胞を含む細胞混合物を含む組成物を提供する。また、本発明は、本発明の方法によって調製された細胞を含む組成物も提供する。本発明のもう１つの具体例において、細胞混合物中の細胞はサイズが約４０ミクロンないし約７０ミクロンのフィルターを通過することができる。本発明のもう１つの具体例において、該組成物は、フィーダー細胞と組み合わせて、または組み合わせることなく用いられる。本発明のなおもう１つの具体例において、フィーダー細胞はＳＴＯ（Ｒｅｉｄ−９９）細胞である。ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ−９９）細胞は単に例示的なフィーダー細胞であって、他のそのようなフィーダー細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから容易に入手することができる。
【０００８】
本発明は細胞を培養するための組成物を提供する。本発明の１つの具体例において、細胞を培養するための組成物は、ＢＳＡ、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む培地を含む。
【０００９】
本発明は、ＨＣＶを本発明の組成物に投与することによって細胞混合物を感染させる方法を提供する。本発明の１つの具体例によると、ＨＣＶはＲＮＡ８９８である。本発明のもう１つの具体例において、ＨＣＶウイルスを、組成物中で細胞を洗浄し、または接種物を細胞培養基で置き換えるに先立って、ｃｍ２当たり約０．５２ｍｌの容量にて、約３７℃にて約４ないし約２４時間まず組成物（接種物）と共にインキュベートする。
【００１０】
本発明は、本発明の組成物をフィーダー細胞と共にインキュベートし、組成物中の該細胞をＨＣＶと接触させ；次いで、該細胞および／または該細胞が培養された培地に関連するＨＣＶを測定することによって、ＨＣＶ感染をアッセイする方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の組成物をフィーダー細胞と共にインキュベートし、組成物中の細胞をＨＣＶウイルスと接触させ、次いで、ＨＣＶとの接触の前または後に化合物を投与する工程を含む、ＨＣＶの生産に影響する、すなわち、より多くのＨＣＶを生産する細胞の組成物の能力に影響する化合物の能力を評価する方法を提供する。
【００１１】
１つの具体例において、該方法を用いてＨＣＶ生産を阻害する細胞についてスクリーニングする。さらなる具体例において、該方法を用いて、ＨＣＶ生産を阻害するそれらの能力について複数の化合物を同時にスクリーニングする。
【００１２】
もう１つの具体例において、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＨＣＶ ＲＮＡの量を測定することによって、ＨＣＶの存在を判断する。１つの具体例において、試料中のＨＣＶ ＲＮＡを内部対照として用いられる第２のウイルスからのＲＮＡの量と比較する。さらなる具体例において、第２のウイルスがウシウイルス下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）である。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な記載および特定の具体例は本発明の好ましい具体例を示すが、説明のためだけに掲げるものであり、なぜなら、本発明の精神および範囲内の種々の変形および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかになるだろうからである。
【００１４】
好ましい具体例の記載
ＨＣＶのイン・ビトロ増殖に適する細胞に対する要望が存在する。もしＨＣＶによって感染され得るが、イン・ビトロ細胞において長期に生産することができ、単離に際して直ちに使用する必要が無い肝臓細胞集団を生産することができれば、それは最も便利であろう。本発明は、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から単離された肝臓細胞および造血細胞を含む細胞混合物を提供することによって、これらの要望に取り組む。混合された細胞集団調製物は、増殖培地中でフィーダー細胞系の存在と増殖されたそのような細胞混合物の４×１０４細胞が、ＲＮＡ８９８のようなＨＣＶウイルスの細胞への投与、または該ウイルスへの感染から７２時間後に培地中で約５０００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを生産するようなものである。
【００１５】
本発明の組成物は、低温保存された妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された細胞を含む細胞混合物を含む。
【００１６】
また、試料のホルモン的に規定された培地中でＨＣＶで効率的かつ効果的に感染させることができる妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された細胞を含む細胞混合物を含む組成物も本発明によって提供される。
【００１７】
低温保存されたものであって、試料のホルモン的に規定された培地中でＨＣＶで効率的かつ効果的に感染させることができる、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された細胞を含む細胞混合物を含む組成物も本発明によって提供される。
【００１８】
１つの具体例によると、ヒトは妊娠後３月ないし誕生後１年までの間でそれを含む年齢である。本発明の１つの具体例において、ヒトは妊娠後３月ないし６月齢である。もう１つの具体例において、ヒトは妊娠後１８週ないし２２週齢の間である。本発明の１つの具体例において、細胞は胎児肝臓および造血細胞を含む。本発明の１つの具体例において、肝臓および造血細胞はアルファフェトプロテイン、アルブミンおよび／またはグリコホリンを発現することができる。１つの好ましい具体例によると、もしヒトが成人であれば、ヒトの肝臓は健康なものである。
【００１９】
本発明は、ＨＣＶウイルス、ＲＮＡ８９８（以下、「ＲＮＡ８９８」）の感染および複製のためのかなり良好な宿主細胞である細胞を含む組成物を含む。ＲＮＡ８９８は、ブダペスト条約の条件の下に２００１年３月２７日にAmerican Type Culture Collection (「ATCC」)、University Boulevard, Manassas, VA 201102209) (ATCC受託番号:PTA-3237)に寄託された。１つの具体例によると、本発明の組成物は、もし組成物中に４×１０４の細胞があれば、ウイルスの投与から７２時間後に培地中に、約５０００コピーを超える；約１００００コピーを超える；または約５００００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを生産することができる。例えば、本発明の方法に従って調製され、かつ、本明細書中における方法に従ってアッセイされた組成物は、ウイルスの投与から７２時間後に培地中に約５０００を超える、約１００００コピーを超える、または約５００００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを生産することができるであろう。
【００２０】
当業者であれば、もし組成物中の細胞の数が４×１０４細胞よりも大きければ、生産されるウイルスＲＮＡのコピーの合計数は組成物中の細胞の増大した数に相応する量だけ増加することを容易に理解するであろう。
【００２１】
同様に、当業者であれば、もし組成物中の細胞の数が４×１０４細胞よりも小さければ、生産されるウイルスＲＮＡのコピーの合計数は組成物中の細胞の減少した数に相応する量だけ減少することを容易に理解するであろう。従って、同一数のコピーのＨＣＶ ＲＮＡを比例して生産する４×１０４未満のまたはそれを超える細胞を含む組成物が考えられる。本発明による組成物は、ウイルスの組成物への投与から７２時間後に５０００ないし５５０００コピーのＨＣＶ ＲＮＡ；１００００ないし５５０００コピーのＨＣＶ ＲＮＡおよび２５０００ないし５５０００コピーのＨＣＶ ＲＮＡを生産することができる。
【００２２】
ある例示的な具体例において、本発明は、本発明による組成物の細胞混合物が、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を入手し、細胞を肝臓から分離される組成物中の切り裂かれた肝臓をインキュベートすることを含む工程に従って調製することができることを記載する。分離された細胞は、約４０ミクロン以上の物体が分離された細胞から除去されるように処理される。加えて、赤血球細胞も分離された細胞から除去される。次いで、分離された細胞を、０．１ｍＭないし０．６ｍＭカルシウム、ウシ血清アルブミン、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む無血清培地に再懸濁させ、無血清培地中で培養する。この最終再懸濁および培養工程は、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物にそれを再懸濁させることによって、分離された細胞を低温に保存することを含む工程に先行しても、先行しなくてもよい。このように本発明の細胞の好ましい集団は組成物に調製され、そこでは、該組成物は妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から単離された肝臓細胞および造血細胞を含み、ここに、培養基中のフィーダー細胞系の存在下で該細胞混合物の４×１０４細胞を含む調製物は、ＨＣＶウイルスＲＮＡ８９８の該調製物への投与から７２時間後に、培地中で、約５０００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを生産する。該調製物は低温保存してもしなくてもよい。そのような組成物を製造し、使用する方法および組成物は後にさらに詳細に記載する。
【００２３】
本発明の細胞集団および組成物の調製における最初の工程は適当な肝臓細胞集団を得ることを含む。好ましくは、肝臓細胞集団は霊長類である細胞、最も好ましくはヒト細胞を含む。ヒト細胞は、好ましくは、妊娠後３月齢以降のヒトから単離される。１つの具体例によると、ヒトは妊娠後３月ないし誕生後１年までの間でそれを含む年齢である。本発明のもう１つの具体例において、ヒトは妊娠後３ないし６月齢である。もう１つの具体例において、ヒトは妊娠後１８ないし２２週齢の間である。本発明の１つの具体例において、細胞は胎児肝臓および造血細胞を含む。本発明の１つの具体例によると、肝臓および造血細胞はアルファフェトプロテイン、アルブミンおよび８またはグリコホリンを発現することができる。１つの好ましい具体例によると、もしヒトが成人であれば、ヒト肝臓は健康なものである。
【００２４】
本発明のための種々の源からの肝臓の切り裂きは、典型的には、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）緩衝液中で行う。１つの具体例において、ＥＧＴＡ緩衝液は０．１ｍＭないし１．０ｍＭのＥＧＴＡを含む。本発明のもう１つの具体例において、ＥＧＴＡの濃度は０．５ｍＭである。器官物質はこの緩衝液の冷（４℃）アリコット中で切り裂く。該緩衝液は、好ましくは、器官組織の解離を容易とする剤を含有する。解離は、プロテアーゼの存在によって促進され得る。プロテアーゼ溶液は温かくてもまたは冷たくてもよい。典型的には、用いるプロテアーゼはトリプシンである。トリプシン処理の不利の一つは、もし組織を上昇した温度（例えば、室温またはそれより高温）で長時間トリプシンに暴露すれば、それが損傷を引き起こしかねないことである。従って、細胞は、典型的には、温かいトリプシン中で３０分以内のインキュベーションにより収穫される。しかしながら、組織に十分な解離は、典型的には、３ないし４時間を必要とし、よって、より低い（例えば４℃）の温度でトリプシン処理を行うのがしばしば望ましい。これは、組織をプロテアーゼに適切に浸漬しつつ、組織に対する損傷を最小化する。このように、組織は、０．２５％トリプシンを含有するＥＧＴＡ緩衝液に４℃にて１０分間ないし１８時間までの間浸漬することができる。次いで、組織をプロテアーゼ−含有緩衝液から取り出し、３７℃の浴に２ないし３０分間入れる。次いで、例えば、１ｍｌの好ましくは温かい媒体を存在する元の組織１００ｍｇ毎に加えることによって、細胞を組織から分離する。混合物をピペットで上下に穏和に処理すると、組織の解離が促進されて、細胞は媒体に分散するようになる。
【００２５】
トリプシンの代わりに、あるいはトリプシンに加えて、他のプロテアーゼを用いて、組織の解離を容易とすることもできる。好ましい具体例において、解離はコラゲナーゼを用いて達成される。粗製コラゲナーゼ（例えば、２０００ユニット／ｍｌ）を用いる。コラゲナーゼはトリプシンに対して好ましい。なぜならば、多くの組織はトリプシンに対するよりもコラーゲンに対して感受性が低く、従って、組織細胞の一体性に対する損傷はコラゲナーゼではより少ないからである。好ましい態様において、解離の方法は、ＥＧＴＡ中での第一のインキュベーション、続いての、コラゲナーゼを含有するカルシウム−含有緩衝液中での第二のインキュベーションを用いる２工程肝臓灌流を含む（Seglen, P.O. Methods Cell Biol 13:29, 1976）。組織はＥＧＴＡ緩衝液中で切り刻まれる。次いで、ＥＧＴＡ緩衝液を除去し、コラゲナーゼおよびカルシウムを含有するが、キレート化剤（例えば、ＥＧＴＡまたはその同等体）を含有せず、例えば、２００ユニットのコラゲナーゼ／ｍｌを含有する別の緩衝液または培地と置き換える。次いで、組織を、撹拌しつつ、例えば、３７℃にて、例えば、１０分ないし４８時間までこの溶液中でインキュベートする。もし組織はそれがインキュベートされる容器の底に塗り付けられるならば、効果的な解離が認識できる。組織が解離された後、混合物を５０ないし１００ｇにおいて３分間遠心する。上澄みを捨て、細胞を適当な培地に再懸濁し、培養して、細胞を拡大培養する。特定の好ましい具体例において、解離は、０．１ないし５．０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むコラゲナーゼ緩衝液を用いて行う。本発明のもう１つの具体例において、コラゲナーゼの濃度は２ｍｇ／ｍｌである。（供給業者：ＧＩＢＣＯ ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、例えば、ＧＩＢＣＯカタログ番号１７７０１より肝臓灌流培地が得られる）。好ましい解離方法において、組織をＥＧＴＡ中で１０分間インキュベートする。組織を沈降させ、ＥＧＴＡを含有する上澄みを取り出す。次いで、沈積した組織をコラゲナーゼを含有する緩衝液（例えば、ＧＩＢＣＯ肝臓灌流培地カタログ番号１７７０１）中で３０分間インキュベートする。
【００２６】
用いることができるさらなるプロテアーゼは、例えば、プロナーゼ（Schaffer et al., Am. J. Physiol., 273(3,1)G686-G695, 1997; Glavin et al., J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 276:1174-1179, 1996）およびジスパーゼ（Compton et al., J. Cell. Physiol., 177:274-281, 1998; Inamatsu et al., J. Invest. Dermatol., 111:767-775, 1998）のような細菌プロテアーゼを含む。加えて、ヒアルロニダーゼおよびノイラミニダーゼのような他の酵素を用いることもできる。
【００２７】
一旦解離工程が完了すれば、細胞懸濁液をさらに処理して、目的物および物質を除去する。特定の好ましい具体例において、本発明の細胞集団はサイズが約４０ミクロンのフィルターを通過することができる。従って、本発明の細胞集団の調製の工程は、４０ミクロンよりも大きな解離した組織から目的物を取り出すことを含む。本発明によるこのサイズ排除工程は、サイズが約４０ミクロンのフィルターを通過することができない細胞の組織、デブリスおよび凝集物のような物体を除去することを意味する。かくして、例えば、サイズがほぼ４０ミクロンからサイズは１００ミクロンまで（例えば、５０、６０、７０、８０または９０ミクロン）のフィルターの使用、およびサイズが４０ミクロンよりも大きなデブリスを除去するための他の方法が考えられる。１つの具体例において、濾過工程は、サイズが約４０ミクロンよりも大きなフィルターを通過することができない物体を除去する。複数の濾過工程を使用することができ、例えば、より大きなポアのフィルターを用いる最初の濾過工程に続いて、より小さなポアサイズを用いる引き続いての濾過を行うことができる。本発明によるフィルターの例はナイロンフィルターを含む（例えば、Ｆａｌｃｏｎからの「細胞ストレイナー」（カタログ番号２０３４、２３５０または２３６０））。
【００２８】
細胞集団から４０ミクロンよりも大きな物体を除去することに加えて、本発明の分離工程は、細胞混合物から赤血球細胞を除去する工程も含む。赤血球細胞は、該細胞が肝臓から分離された後に、調製プロセスの間にいずれかの段階で除去することができると理解すべきである。赤血球細胞を除去する方法は当該分野で知られている。本発明の１つの具体例によると、赤血球細胞は遠心管中での順次の低速回転によって除去される。例えば、フィルターを通過した分離細胞を５０×ｇ（４５０ｒｐｍ）において４分間回転させることができる、細胞ペレットを再懸濁し、同一プロセスを数回反復することができる。
【００２９】
このようにして、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液である細胞集団が得られ、ここに、肝臓細胞の懸濁液は４０ミクロンよりも小さな細胞よりなる。好ましくは、懸濁液は、赤血球細胞を実質的に含まないものである。
【００３０】
本発明の細胞集団は、アルファフェトプロテイン、アルブミンおよび／またはグリコホリンを発現する細胞が豊富化されたものである。好ましくは、該細胞はＣＤ３４を発現しないものである（それをＣＤ３４−という）。当業者であれば、該集団の細胞は１以上のこれらのマーカーを含むか否かを評価する技術を認識しているであろう。そのような技術は免疫染色を含むことができる。例えば、ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡからの抗−アルファフェトプロテイン抗体、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの抗−グリコホリン抗体（３２５９１）、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの抗−ヒトＣＤ３４抗体（３４３７１Ａ）、およびＡｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹからの抗−アルブミン抗体（ＹＭ５０２４）を用いることができる。
【００３１】
前記した抗体を用いて単離された細胞集団の表面でのこれらのマーカーの存在を測定するに加えて、当業者であれば単離技術におけるそのような抗体を用いて所望の細胞集団を単離することができるのを理解するであろう。従って、例示的な具体例において、単独、あるいはフィーダー細胞系の存在下で、妊娠後のヒト３月齢以降の肝臓を切り裂くことによって単離された一次細胞が培養において拡大培養され、拡大培養された培養は、本発明で言うような細胞の存在につき、豊富化される。そのような豊富化技術は、有利には免疫学的手法に基づく技術を使用することができる。これらは、限定されるものではないが、免疫接着、蛍光−活性化フローサイトメトリー免疫学的に基づくカラムクロマトグラフィー、抗体−コンジュゲーテッドセファロースビーズ（または他の不活性のビーズ）、または他の免疫学的ベースの適用、例えば、免疫−磁気分類）よりなる。しかし、これらの手法は肝臓細胞の集団を否定するものではなく、むしろ、その単離に導く。
【００３２】
他の物理的分離手法は抗原精製に先立ち、またはその後に適用することができる。それらは、限定されるものではないが、平衡密度遠心、速度沈積、または対向流遠心溶出法よりなる。同様に、他の抗原マーカーを陽性または陰性態様で用いることができ、さらに、これらの細胞を否定する。これらは、限定されるものではないが、動物主要組織適合性遺伝子が、（特に、ＨＬＡ ＤＲＡ）の抗原、造血性抗原（例えば、ＣＤ３３，ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ９、ＣＤ２０）、または他の肝臓蛋白質よりなる。
【００３３】
本発明の肝臓細胞は、細胞の平衡−密度遠心によって豊富化することができる。細胞の平衡−密度遠心は、適当な細胞が幾分豊富化された低密度細胞を供する。ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配を用いることができる。１つの具体例において、平衡−密度遠心は、免疫アフイニティー工程の前に行うことができる。この具体例おいて、抗体精製技術の工程は、所望の密度を持つ肝臓細胞で行う。さらなる具体例において、平衡−密度遠心が、細胞の抗体精製後に行うことができる。あるいは、平衡−密度遠心精製工程は、抗体精製前に１回、抗体精製工程の後に１回の２回行うことができる。
【００３４】
もう１つの態様において、肝臓細胞の集団は、プラスチックへの接着を用いることによって豊富化することができる。本発明の好ましい集団はプラスチック−接着性肝臓細胞である。肝臓細胞の集団は、細胞の単離された集団に存在する非接着性細胞を除去することによって豊富化することができる。これらの非接着性細胞の除去は、肝臓細胞集団を接着性、表面、典型的には、組織培養プラスチックまたはガラスに暴露することによって達成することができる。接着性肝臓細胞は、組織培養プラスチックまたはガラスに接着し、他方、非接着性細胞は懸濁液中に留まる。懸濁液中の細胞は、上澄みを除去し、接着性細胞を洗浄することによって容易に除去することができる。非接着性細胞は免疫精製工程の前または後に除去することができる。好ましくは間質細胞は、免疫精製工程に組織培養プラスチックまたはガラスのような固体表面の使用は当該分野でよく知られている。組織培養プラスチックおよびガラスを処理して（例えば、シリコーン、ニトロセルロース、ニッケル、リシンなど）、細胞の接着を促進し、または阻害することができる。処理されたおよび処理されていない表面は商業的に入手可能である。
【００３５】
もう１つの態様において、細胞の豊富化された集団は細部に従ってさらに分画される。好ましい具体例において、細部分画は、例えば、ＦＡＣＳcanフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって達成することができる。本発明の細胞は直径が４０ミクロン未満、より好ましくは約１０ないし約３０ミクロンの平均直径を有する。
【００３６】
ＦＡＣＳは、それらがレーザービームを通過する場合の光散乱特性に基づいて細胞のサブ−集団の分離を可能とする。前方光散乱（ＦＡＬＳ）は細胞のサイズに関連し、側方散乱特徴（ＳＳＣ）としても知られた右側角光散乱は細胞密度、細胞含有量および核−細胞質の比率、すなわち、細胞の複雑性に関連する。細胞は蛍光コンジュゲートと抗体で標識することができるので、それは抗体（蛍光）強度によってさらに特徴付けることができる。例示的な具体例において、ＦＡＣＳ医薬ＣＳマシーンはＣＳ３４−（低蛍光）およびＣＳ３４＋（高蛍光）を分離するように設定することができる。
【００３７】
抗体、例えば、ＣＤ３４＋モノクローナル抗体で肝臓細胞を標識するためには、細胞を肝臓から引き裂き、それらを実施例１に記載したようにプロテアーゼで処理することによって調製することができる。細胞調製物は遠心管においてｍｌ当たり、たとえば、約１×１０５ないし１×１０６細胞を含むアリコットに分割される。次いで、この懸濁液をベンチトップまたは他の遠心管にて遠心する。次いで、そのように生成された細胞ペレットを、選択されたモノクローナル抗体を含有する適当な緩衝液に再懸濁させ、適当な時間の間インキュベートする。標識された細胞を洗浄し、標識された細胞のアリコットをフルオレセイン−標識抗−マウス免疫グロブリンと共にインキュベートする。この懸濁液を洗浄し、細胞ソーティングのための適当な緩衝液に再懸濁させる。
【００３８】
ＦＡＣＳによって細胞をソーティングするにおいて、低ＳＳＣおよび中間細胞（ＦＡＬＳ）についてのウインドウ（すなわち、電子的に規定された領域）を設定する。このウインドウにおける細胞を、抗体−蛍光活性によってさらに分けることができる。ＦＡＣＳの設定をキャリブレートして、特定の抗原に対して陽性および陰性の細胞を収集する。
【００３９】
本発明の特別な具体例において、肝臓細胞はＦＡＣＳによって特徴付けることができる。ＣＤ３４−細胞を同定し、単離するための前記技術を、先に例示したもののような特異的抗体を用いて他の抗原決定基につき反復する。このようにして当業者であれば、本発明の細胞の高度に豊富化された集団を生じさせることができる。
【００４０】
ＦＡＣＳに対する代替法として、免疫単離を用いて細胞を単離することができる。注目する特定の抗原に対する抗体の利用性は、注目する肝臓細胞の特異的分離を可能とする。そのような具体例において、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４−細胞から分離し、次いで、（例えば、抗−アルファフェトプロテイン抗体；抗−グリコホリン抗体；抗−アルブミン抗体等を用いて）細胞上の他の抗原決定基の存在に従ってさらに分離する。精製技術は当業者によく知られている。これらの技術は、限定されるものではないが、イムノマグネティックス、免疫吸着などのような標準的な免疫学的手法を用い、混合物の他の成分から所望の細胞を含有する肝臓細胞画分を分離するための、肝臓から細胞環境の切り裂きおよび分画を用いる傾向がある。前記したようにして所望の肝臓細胞画分を分離すれば、種々の分離手段を用いてさらに精製して、さらなる精製を達成することができる。分析方法は、特に、純粋な細胞表面抗原の調製に特に適した分析方法はクロマトグラフィーを用いる。
【００４１】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離するべき物質、およびそれが特異的に結合することができる分子の間の特異的親和性に依拠するクロマトグラフィー手法である。これは受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム物質は、結合パートナー（この場合は抗体）の１つを不溶性マトリックスに共有結合カップリングさせることによって合成される。従って、カラム物質は溶液から当該物質を特異的に吸着することができる。結合が起こらないものに条件を変化（ｐＨ、イオン強度、温度等を変化させる）させることによって、溶出が起こる。
【００４２】
アフィニティークロマトグラフィーの最も通常の形態の１つは、免疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明に従って用いるのに適した抗体の創成は後に議論する。抗体または抗原を不溶性の不活性なマトリックスに付着させる。分離すべき細胞集団を、特異的な抗体−抗原相互作用があるようにマトリックスに適用する。結合した抗原／抗体を、低いｐＨ緩衝液、高塩濃度等のような、中程度の変性溶媒への暴露によって吸着剤から溶出させる。
【００４３】
特定の具体例において、本発明の細胞は、イムノマグネティックスクロマトグラフィーを用いて単離される。例えば、抗−ＣＤ３４または他の抗体を磁性ビーズに付着させる。これらの抗体−標識磁性ビーズは、アフィニティー精製についての基礎として用いられる。細胞の抗体−標識全肝臓細胞調製物は、ここに、例えば、抗−ＣＤ３４抗体含有磁性アフィニティーカラムに適用される。非−接着性細胞を収集し、磁場の除去によって、磁性カラムから接着性細胞を捨てる。もう１つの具体例において、細胞をまず抗体（例えば、抗−ＣＤ３４抗体）で標識し、次いで、二次抗体を運ぶ磁性ビーズまたはスフィアで標識する。
【００４４】
炭水化物含有化合物の精製で有用なもう１つのタイプのアフィニティークロマトグラフィーはレクチンアフィニティークロマトグラフィーである、このタイプのクロマトグラフィーはＣＤ３４＋細胞を除去するのに有用である。レクチンは、種々の多糖および糖蛋白質に結合するクラスの物質である。レクチンは、通常、臭化シアンによってアガロースにカップリングされる。SepharoseにカップリングしたコンカナバリンＡは、用いられるこの種の最初の物質であり、多糖の単離で広く用いられており、レクチン以外の糖蛋白質はヒラマメレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製で用いられてきた小麦胚芽アグルチニン、およびＨｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａレクチンを含む。レクチンそれ自体は、炭水化物リガンドでのアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。ラクトースは、ヒマおよび落花生からレクチンを精製するのに用いられており；マルトースはヒラマメおよびタチナタマメからレクチンを抽出するのに有用であり；Ｎ−アセチル−Ｄガラクトサミンは大豆からレクチンを精製するのに用いられており；Ｎ−アセチルグルコサミニルは小麦胚芽からのレクチンに結合し；Ｄ−ガラクトサミンは二枚貝からレクチンを得るのに用いられており；Ｌ−７コースはハスからのレクチンに結合する。
【００４５】
磁性ビーズを用いる免疫選択は、所望のモノクローナル抗体で予め被覆されたビーズを使用する。細胞をモノクローナル抗体で予め被覆し、ビーズに付着した二次抗−マウス免疫グロブリンを通じて磁性ビーズに付着させることができる。次いで、ビーズに結合した細胞を磁石で除去する。これは、所望の細胞の高い回収率を可能とする迅速な方法である。
【００４６】
免疫接着において、プラスチック被覆表面を用いて、細胞を混合物から単離する。ペトリ皿のような表面を、所望の表現型を保有する細胞を選択する抗体で被覆する。細胞を被覆された皿の上に置き、細胞および皿のコーティングの間の相互作用を行う適当な時間の間インキュベートする。インキュベーション時間の後、非接着性細胞を適当な緩衝液で穏和に洗浄することのよって除去する。次いで、皿に付着したままの抗体−接着性細胞を培養し、および／またはトリプシン処理、または当業者によく知られた他の細胞収穫技術を用いて回収する。
【００４７】
本発明の望ましい肝臓細胞集団は、アルファフェトプロテイン、アルブミン、およびグリコホリンに向けられた抗体と免疫反応性（すなわち、該集団の細胞は、これらのマーカーの各々に対して陽性であり、それを含む）であるが、抗ＣＤ３４抗体と免疫反応性ではない（ＣＤ３４を含まないものである）。かくして、抗体を用いて、肝臓細胞の集団を豊富化する。肝臓細胞はさらに特徴付けられるので、肝臓細胞と免疫反応する他の抗体は他の当業者によって作成できるであろう。肝臓細胞抗原決定基と免疫反応性であるこれらの他の抗体の使用も同様に考えられる。
【００４８】
もう１つの具体例において、肝臓細胞上の決定基と免疫反応性である抗体と免疫反応性である第２の抗体を用いて、肝臓細胞の集団を豊富化することができる。二次抗体の使用は一般に当該分野で知られている。典型的には、二次抗体は、第一の抗体の定常基と免疫反応性である抗体である。好ましい二次抗体は抗−ウサギ、抗−マウス、抗−ラット、抗−ヤギおよび抗−ウマ免疫グロブリンであって、商業的に入手可能である。好ましい具体例において、二次抗体は、組織培養皿、アガロース、ポリアクリルアミド、および磁性粒子を含めた固体基材にコンジュゲートさせる。この具体例において、肝臓細胞の細胞表面の決定基に対して特異的な抗体を、まず、単離すべき肝臓細胞の集団に免疫反応させる。次いで、抗体が付着した細胞を含有する肝臓細胞集団を、固体基材にコンジュゲートする二次抗体に暴露する。細胞の豊富化が達成される。なぜならば、抗体で標識された細胞のみが二次抗体と免疫反応するからである。磁性粒子にコンジュゲートした二次抗体を供する市販のキットが利用できる。このシステムにおいては、抗体を表す適切に標識された肝臓細胞は、磁場への暴露によって精製される。
【００４９】
特別な具体例において、本発明の細胞は低温保存される。肝臓細胞の低温保存の方法は、当業者に知られている。肝臓細胞の低温保存のためのある種の低温保護媒体を記載する米国特許５,７２３,２８２号；米国特許第６,５２１,４０２号、特に、米国特許第６,１３６,５２５号(ここに引用してその全体を援用する)を参照されたし。
【００５０】
本出願においては、低温保存すべき細胞は、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清の最終濃度を含む培地に再懸濁させる。次いで、細胞をフリーザーの安全容器に分注し、特定の条件、窒素、液体または蒸気、該容器のソーティング、および用いる場合の該細胞の解凍下で、容器を特定の時間凍結させる。一般的に言って、低温保護剤は、細胞内氷の凍結の間おける形成のような低温保存の有害な効果を最小化するのに用いる化合物である。説明のために、限定されるものではないが、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、アミノ酸、プロパンジオールを挙げることができる。
【００５１】
好ましい肝臓細胞培養基は、細胞を、最小細胞劣化にて、液体窒素貯蔵で遭遇する極端な温度変化に耐えるものとするものである。ある具体例においては、培地は、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾン（ＨＤＭ２）を含有し、さらに、チミジン、アルブミン、インスリン、デキサメタゾン、グルタミンおよび哺乳動物血清のような１以上の補足物を含有することができるＤＭＥＭ培地と定義される。以下の表は用いることができ、その変形であり得る培地の例示的濃度を提供する。
【００５２】
【表１】
【００５３】
哺乳動物血清が胎児ウシ血清、胎児子ウシ血清、および１０％ないし９０％の濃度範囲のブタ血清を含むことができる。特に好ましい具体例において、培地は、加えて、約１０ないし約１５％の範囲のＤＭＳＯ、約３．５ないし約１５％の範囲のアルブミン、および約１０ないし約２０％の範囲のグリセロールを補足する。特別な具体例において、低温保存用の培地は胎児ウシ血清（以下、ＦＢＳ）と、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）とを含む。より具体的には、低温保護培地は約５ないし約２０％のＦＢＳおよび約５ないし約１５％のＤＭＳＯを含む。最も好ましいのは、１０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを含む低温保護培地である。
【００５４】
前記定義の単離された肝臓細胞集団は、特定の密度にてフリーザー抵抗性容器に分注することによって低温保存用に調製される。そのような容器は、限定されるものではないが、バイアル、バッグ、カン等を含む。好ましいのはプラスチックバックであって、最も好ましいのは、約２５０ｍｌないし約５００ｍｌの範囲の容量を有するＢａｘｔｅｒプラスチックバックのＣｒｙｏｃｙｔｅ商標である。
【００５５】
細胞を容器に分注し、例えば、機械的アルミニウムシール、熱的インパルスヒートシーラー、ルーエルロックプラグ等を用いて容器をシールする。熱シーリングが最も好ましい。そのようにシールされた容器は好ましくは、低温保存すべき全ての容器が満たされ、シールされ、従って、それらが同時に低温保存できるまで０ないし４℃に保たれる。
【００５６】
低温保存すべき細胞の細胞密度は変化し得る。例えば、細胞は約５×１０６細胞／ｍｌないし約１０×１０６細胞／ｍｌの密度で低温保存することができる。約１０ないし約５０ｍｌの範囲の容量を２５０ｍｌのフリージング容器中で維持することができ、他方、約５０ないし約１５０ｍｌを５００ｍｌのフリージング容器中で低温保存することができる。加えて、細胞を接種して、制御された結晶化、またはフリージング前に既に冷却されている溶液中での氷の形成を生じさせることができる。接種の方法は当業者に知られており、冷金属ロッドをフリージング溶液に挿入し、液体窒素のブラストをフリージング容器に導入することを含む。
【００５７】
細胞の均一なフリージングが好ましく、凍結すべき容器がフリージングプレートの間に置かれるフリージングプレートを用いて達成することができる。
【００５８】
肝臓細胞が一旦フリージング容器に分注されたならば、それはフリーザーに入れる準備ができている。約４℃ないし約−９０℃で凍結することができるいずれのフリーザーも考えられるが、制御速度フリーザーが好ましい。非−制御速度フリーザーを用いる場合、低温保存すべきであって、細胞を含有する容器を、好ましくは発泡スチロールの箱に貯蔵し、フリーザー中に約２ないし約２４時間入れられるフリーザー安全容器に入れる。その後、容器をフリーザーから取り出し、直ちに液体窒素中で長時間保存用に冷却する。用いる準備ができたならば、細胞を３７ないし４２℃の水浴中で解凍し、残存する低温保存剤を順次の洗浄によって除去する。
【００５９】
制御速度フリーザーを用いる場合、フリージングプロフィールを該フリーザーにプログラムして、均一なフリージングを確保する。全てのそのようなフリージングプロフィールは、一旦試料の温度が−４℃に到達したならば開始すべきである。そのような制御速度温度についての冷却速度は当業者に知られており、米国特許第６，１３６，５２５号はそのような冷却速度の例を提供している。好ましくは、制御速度フリーザープロフィールは、潜熱の放出に対して補償するようにプログラムされた窒素のブラストを含む。潜熱の放出の補償は、細胞の低温保存の間における細胞損傷の尤度を減少させる。このプログラムされた冷ブラストは、フリージングサイクルにおける全てのフリージング容器上の外部の氷のシーディングを同調させるのを助ける。これは特に有利である。というのは、低温保存細胞の臨界点は氷形成の段階の間に起こるからである。氷形成が、液体相における分子のランダムに起こるクラスターであり得る核形成部位で開始する。核形成氷結晶は、氷の全面に形成されて、これは固化が完了するまで液体全体にわたって拡大する。
【００６０】
細胞を低温保存するための好ましい方法は、１０％ＤＭＳＯおよび１０％ＦＣＳを含有する培地中に細胞を２×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁させ、次いで、バイアル当たり該懸濁液の１ｍｌを２ｍｌのクリオバイアルに分注することである。次いで、それをＮａｌｇｅｎｅ低温１℃フリージング容器（カタログ番号１００−０００１）に挿入することによって制御された速度にてバイアルを凍結させ、次いで、これを−７０℃のフリーザーに一晩入れる。次いで、バイアルを、長期貯蔵用の液体窒素貯蔵タンクの蒸気相に移す。
【００６１】
一旦細胞を前記したフリーザー技術を介して凍結したならば、それを、窒素貯蔵フリーザー中にて、長期間貯蔵用の低温発生貯蔵ボックス中に置くことができる。長期間貯蔵では、細胞を再懸濁に先立って数週間、数ヶ月または数年さえの間貯蔵することができると考えられる。フリージング容器を蒸気または液体窒素中で貯蔵することができる。
【００６２】
使用に先立って、細胞は解凍しなければならず、ＤＭＳＯは除去しなければならない。解凍は３７ないし４２℃の浴を介して達成される。スラッシュが出現すると、細胞を容器から取り出す。次いで、細胞を、冷培養基を含有する遠心管に注ぐ。初期細胞容量を新鮮な冷培養基に５ないし１０回加えることによって、初期の細胞容量を遠心管中で希釈する。次いで、懸濁液を５ないし１５ｇにおいて２ないし５分間回転して沈める。上澄みを吸引して、残存するＤＭＳＯを含有する培地を除去する。その後、約２ないし４回、新鮮な培地を細胞ペレットに加える。
【００６３】
本発明の細胞は、低温保存の前、後、または前および後に、増殖させ、細胞培養において拡大培養する。しかしながら、本発明の細胞集団を調製する方法は低温保存および解凍工程を省略することができるのに注意すべきである。
【００６４】
好ましい具体例において、細胞が本明細書中においてはホルモン的に規定される培地中で増殖させる。本発明の１つの具体例において、本発明の組成物を共培養し、フィーダー細胞と共に用いるか、さらにフィーダー細胞を含む。フィーダー細胞は細胞内マトリックス、および肝臓細胞の増殖および拡大培養のための成長因子のような拡散可能な因子を提供する。１つの具体例において、フィーダー細胞はＨＣＶに感染する能力をほとんどまたは全く有しない。もう１つの具体例において、フィーダー細胞は線維芽細胞である。もう１つの具体例において、フィーダー細胞は胚性腸間膜線維芽細胞である。
【００６５】
本発明によるフィーダー細胞の例はＳＰＯのような胚線維芽細胞（ＭＥＦ）およびラット胚線維芽細胞である。例えば、Hogan et al., Manipulating The Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 第２版 Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Robertson, E.J.編(1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, ed. Robertson, E.J. (IRS, Oxford), pp. 71-112。ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞は有用なフィーダー細胞の１つのタイプである。ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ−９９）細胞は、ブダペスト条約の条件の下で、２００１年３月２７日に、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 2209に寄託した（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−３２３６）。フィーダー細胞を培養し、維持する方法は、当該分野で知られている。例えば、Methods for culturing and maintaining feeder cells are known in the art. See, for example, in Methods for Tissue Engineering, Ed. Robert Lanza, Academic Press, NY (2002), pp. 151-202参照。
【００６６】
フィーダー細胞は、当該分野で知られた方法に従って、増殖阻止することができる。例えば、ＳＰＯ細胞を細胞培養プレートに２ないし４８時間で接着させることができる。次に、ＳＴＯ細胞をインキュベートする培地を除去し、２ｕｇ／ｍｌマイトマイシンＣを含有する培地で置き換える。次いで、ＳＴＯ細胞を約３７℃にて約２時間インキュベートする。インキュベーション後に、マイトマイシンＣを含有する培地を除去する。細胞を２回洗浄し、次いで、ＳＴＯ細胞培養を、本発明の細胞混合物を加える前に０ないし４８時間維持する。
【００６７】
１つの具体例において、本発明の細胞の再懸濁液で用いられる培地は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＧＬ）および微量元素を含む培地である。
【００６８】
動物またはヒトの一次細胞、細胞系および組織を本発明の培地で培養することができる。１つの具体例において、培養基は無血清培地、カルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、ニコチンアミド、微量元素、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む。もう１つの具体例によると、培養基は、更に以下の成分：グルカゴン、肝臓増殖因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子のいずれか１つ、組合せ、または全てを含むことができる。さらなる具体例において、培養基は、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まない。
【００６９】
前記プロセスに従って、細胞混合物を調製した後、該細胞および、必要であれば、フィーダー細胞を維持するのに適当な培地中で培養すべきである。本発明の１つの具体例において、培地は、ＨＣＶ感染で用いる細胞混合物について最適化される。この目的で言うような１つの培地は、カルシウム、ウシ血清アルブミン（ＢｓＡ）、遊離脂肪酸（ＦＡＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、ニコチンアミド、微量元素、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンを含み、所望により以下の成分：グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子のいずれか１つ、組合せ、または全てを含む無血清培地（例えば、（ダルベッコウの修飾句培地ＤＭＥＭ））を含む。本発明の１つの具体例によると、培養基は低密度リポ蛋白質（ＬＤＤ）を含まない。
【００７０】
この目的で有用なもう１つの培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む無血清培地を含む。
【００７１】
１つの具体例において、培地は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まない。もう１つの具体例において、培地は遊離脂肪酸（ＦＡＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、または微量元素を含まない。
【００７２】
もう１つの具体例において、培地は、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含有しない。
【００７３】
もう１つの具体例において、培地は、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、遊離脂肪酸（ＦＡＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、または微量元素、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子を含まない。もう１つの具体例において、培地は無血清である。
【００７４】
１つの具体例において、培養基におけるカルシウムの濃度は０．１ｍＭないし０．６ｍＭの間である。もう１つの具体例において、カルシウムの濃度はほぼ０．５ｍＭである。１つの具体例において、ＢＳＡ濃度は５００ｕｇ／ｍｌである。もう１つの具体例において、ニコチンアミドの濃度は５ｍＭである。１つの具体例において、インスリンの濃度は１０ｕｇ／ｍｌである。１つの具体例において、遊離脂肪酸の濃度は７．６ｅＥｑ／Ｌである。１つの具体例において、ＥＧＦの濃度は１００ｍｇ／ｍｌである。１つの具体例において、肝臓成長因子の濃度は２０ｕｇ／ｍｌである。１つの具体例において、エタノールアミンの濃度は１０−６Ｍである。１つの具体例において、チロトロピン放出因の濃度は、１０７−６Ｍである。１つの具体例において、ＨＤＬの濃度は５ｕｇ／ｍｌである。１つの具体例において、ヒドロコルチゾンの濃度は１０−６Ｍである。１つの具体例において、培地はＩＭ−ＨＤＭ培地である。
【００７５】
ＤＭＥＭ（高グルコース）、500ug/ml BSA, 7.6uEq/L遊離脂肪酸(FAA), 5ug/ml HDL, 5mM ニコチンアミド、1x 微量元素 [1x10-7M銅, 5x10-11M亜鉛, 3x10 10Mセレン], 100ng/ml EGF, 10 ng/mlインスリン, 5ug/mlトランスフェリン, 10-6Mヒドロコルチゾン, 2ug/ml グルカゴン、20ug/ml肝臓増殖因子、10-6Mエタノールアミン10-6Mチロトロピン放出因子を含む。１つの具体例において、7.6uEq/Lの全ＦＦＡら、2.36μＭパルミチン酸(16:0), 0.21uM パルミトレイン酸(cis-16:1 n-7), 0.88μMステアリン酸(18:0), 1.02μMオレイン酸(cis-18:1 n-9), 2.71μMリノール酸(cis-18:2 n-6),および0.43μMリノレン酸(cis 18:3 n-3)の混合物を含む。培地は、細菌の増殖を妨げるための抗生物質、例えば、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むこともできる。
【００７６】
もう１つの具体例において、培地はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＩＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、およびヒドロコルチゾンを含む無血清培地を含む。
【００７７】
本発明の組成物の細胞混合物は、細胞外マトリックスで被覆したプラスチック基材上で平板培養することができる。細胞外マトリックス成分の例は、限定されるものではないが、例えば、コラーゲンＩ型、コラーゲン型ＩＶ型または接着蛋白質、フィブロネクチンおよびラミンまたはマトリゲル（Matrigel）(ICN Biochemicals Inc.)を含む。
【００７８】
コラーゲンは、用いる場合、単独で、あるいはラミンまたはフィブロネクチンと組み合わせて、あるいはプロテオグリカンと組み合わせて、あるいは細胞外マトリックス材料が豊富化された組織抽出物と一緒に用いることができる。細胞外マトリックスは前記したフィーダー細胞によって供することもできる。そのような細胞混合物および細胞外マトリックスの組合せは、本発明によってＨＣＶアッセイ方法で用いることができる。
【００７９】
本発明の細胞組成物は、ＨＣＶ感染させることができるイン・ビトロ細胞を供するのに有用であり、従って、ＨＣＶに罹った患者を治療するのに有用であり得る化合物の同定および迅速なスクリーニングのためのおよび／またはＨＣＶ感染に関連する研究のために有用なイン・ビトロ培養系を提供する。従って、好ましい具体例において、本発明の細胞組成物は、ＲＮＡ８９８、またはＲＮＡ８９８のＨＣＶ感染同等体と接触させることができる。ＲＮＡ８９８感染同等体は、本発明の方法に従って調製された組成物の４×１０４細胞をＨＣＶウイルスと接触させてから７２時間後に約５０００コピーを超える、約１００００コピーを超える、または約５００００コピーを超えるＨＣＶ ＲＮＡを生じさせることができるＲＮＡ８９８以外のＨＣＶ株である。１つの具体例によると、細胞は、ｃｍ２当たり約０．５２ｍｌの容量において、約３７℃で、本発明の組成物をＲＮＡ８９８または感染同等体と約２４時間接触させることによって感染させる。本発明の１つの具体例によると、ＨＣＶで感染させるべき細胞を細胞外マトリックスと共に培養する。本発明のもう１つの具体例において、細胞外マトリックスはフィーダー細胞（例えば、ＳＴＯ−（Ｒｅｉｄ９９）細胞）によって供される。
【００８０】
本発明の組成物における細胞から生じたＨＣＶの量は、例えば、ＨＣＶ蛋白質または核酸の生産を測定することによって決定することができる。
【００８１】
例えば、（その中またはそれに付着された）細胞および／または細胞が培養される培地に関連して見出されるＨＣＶ ＲＮＡのコピーの数を定量することができる。ＨＣＶ蛋白質または核酸分子が生産されたか否かを観察するために用いることができる当該分野で知られた技術がある。例えば、ＨＣＶ蛋白質に対して向けられた抗体でプローブされた蛋白質のウエスタンブロットまたはＨＣＶ核酸配列に対して相補的である標識核酸分子でプローブされたゲルのブロット０細胞および細胞培養基から蛋白質および核酸分子を抽出するための方法は、当該分野でよく知られており、この目的のためのキットは商業的に入手可能である。
【００８２】
本発明に従って生産されたＨＣＶ粒子のコピーの数をかなり正確に定量するためには、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が有用である。本発明の１つの具体例によると、ＲＴ−ＰＣＲ方法は、第２のウイルスまたは第２の核酸分子のいずれかの形態でアッセイされるべき細胞、細胞抽出物および／または培地の試料に加えられる既知の量の第２の核酸分子に対してその値と比較することによって、ＨＣＶ ＲＮＡのコピー数が決定されるように修飾される。第２のウイルスはＨＣＶに密接に関連するか、あるいは第２の核酸分子はＨＣＶ ＲＮＡに密接に関連する（すなわち、長さ、核酸の組成およびウイルスキャプシド構造が類似）のが望ましい。１つの具体例において、第２の核酸分子はフラビウイルスキャプシドにおけるものである。１つの具体例において、第２のＲＮＡ分子はウシウイルス下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）、例えば、ＢＶＤＶ ＮＡＤＬ株（ＡＴＣＣ受託番号：ＶＲ−５３４）からのＲＮＡである。
【００８３】
第２のウイルスまたは核酸分子の存在は、それが、第１の核酸分子の定量用の内部対照として働く点で有利である。この内部対照はランダム変動およびアッセイ変動のモニタリングおよび修正を可能とする。
【００８４】
例えば、本発明は：
１．該ＨＣＶを、既知の量のウシウイルス下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）と合わせ、ここに、該ＢＶＤＶは本発明の組成物と共に第２の核酸分子を含有し；
２．組成物の細胞、または細胞が培養される培地から、ＨＣＶに由来する第１の核酸分子およびＢＶＤＶに由来する第２の核酸分子を抽出して、組み合せた核酸抽出物を形成し；
３．該第１の核酸分子に対して特異的な第１の検出可能なプローブ、および該第２の核酸分子に対して特異的な第２の検出可能なプローブを、該組み合わせられた核酸抽出物に加え；
４．該組み合わせられた核酸抽出物をＰＣＲ手段によって増幅し；
５．該第１の検出可能なプローブおよび該第２の検出可能なプローブから独立して放出された検出可能なシグナルを、該増幅の間において種々のサイクルで定量し；
６．工程（ｅ）の結果を外挿し、該ＨＣＶにおける該第１の核酸分子の量、およびＢＶＤＶにおける該第２の核酸分子の量を計算し；次いで
７．工程（ｆ）における該第２の核酸の該計算された量を、工程（ａ）で用いた該第２の核酸の該既知の量と比較することによって、工程（ｆ）において決定された該第１の核酸分子の該計算された量の精度を評価する；
工程を含む方法を提供する。
【００８５】
もう１つの具体例によると、前記方法は、工程（ｆ）における該第２の核酸の該計算された量を工程（ａ）で用いた該第２の核酸の該既知の量と比較することによって決定されたファクターによって、工程（ｆ）において決定された該第１の核酸の該計算された量を調整するさらなる工程を含む。
【００８６】
もう１つの具体例によると、本発明は、ＨＣＶを投与する前または後に化合物を本発明の組成物に加え、引き続いて、組成物中の細胞および／または感染した細胞が培養される培地に関連するＨＣＶの存在を決定する工程を含む、ＨＣＶの生産に対する化合物の効果を決定する方法を提供する。もし該化合物がＨＣＶが組成物と接触された後に投与されるのを望むならば、ＨＣＶから１０日後以内に投与すべき化合物を組成物と接触させるのが好ましい。本発明に従ってテストすべき化合物はＨＣＶの生産を阻害し、または活性化することができる。従って、化合物はＨＣＶのライフサイクルのいずれかの段階を阻害して、その効果を達成することができる。そのような化合物の例は、限定されるものではないが、合成または精製された化学化合物、蛋白質および核酸分子を含む。化合物が加えられた試料は、同一条件下で処理されたものであるが、該化合物に暴露されていないか、またはＨＣＶ生産に対してほとんどまたは全く効果を有しないことが知られているもう１つの化合物に暴露された他の試料と比較することができる。
【００８７】
本発明の細胞集団をイン・ビトロスクリーニングアッセイで使用することが考えられ、そこでは、肝臓細胞のＨＣＶ感染に影響する剤がモニターされる。そのような方法はマルチウエル（例えば、９６−ウエル）プレートで行うことができる。該アッセイは、所望により、適当な培養基および適当な容器中にてフィーダー層と一緒に、本発明の細胞集団をインキュベートすることを含む。次いで、前記したように、細胞を適当なＨＣＶと接触させる。テスト化合物の存在下および不存在下におけるＨＣＶによる細胞の感染を評価する。種々の濃度の、テストすべきテスト化合物をウイルスの存在下および不存在下で細胞の共培養に加えることができると考えられる。さらに、細胞をウイルスの増殖細胞におけるいずれかの与えられた相においてテスト化合物に暴露することができる。例えば、いくつかの具体例において、細胞のウイルス感染が開始されたのと同時に（すなわち、ウイルスが加えられたのと同時に）ウイルス粒子を化合物に接触させるのが望ましいであろう。別法として、ウイルスライフサイクルにおける後の段階において（すなわち、細胞がウイルスで感染した状態となった後に）化合物を加えるのが好ましいであろう。さらに他の具体例において、ウイルスの添加に先立って細胞をテスト化合物と接触させて、テスト化合物がウイルスによる感染に対して予防効果を有するか否かを判断することができる。ウイルスのライフサイクルの特定の段階を決定するのは、当業者によく知られた方法を介して達成される。
【００８８】
種々の濃度の与えられたテスト化合物を、毒性効果が観察されないいくつかの濃度、および毒性効果が観察される少なくとも２以上のより高い濃度を含むことを目標として選択される。例えば、０マイクロモラーないし約３００マイクロモラーの範囲内のテスト化合物のいくつかの濃度をアッセイするのは、これらの目標を達成するのに通常は有用である。例えば、３５０マイクロモラー、４００マイクロモラー、４５０マイクロモラー、５００マイクロモラー、６００マイクロモラー、７００マイクロモラー、８００マイクロモラー、９００マイクロモラーのような３００マイクロモラーよりも高い濃度にて、あるいはマルチモラー濃度においてさえこれらのアッセイのあるものを行うのが可能であるか、あるいは望ましくさえある。化合物の見積もられた治療的に有効な濃度は、テストする濃度の上方範囲に関して最初のガイダンスを提供する。
【００８９】
アッセイの例示的な組においては、アッセイが行われるテスト化合物の濃度範囲は、アッセイ培地中の化合物の０．０５マイクロモラー、０．１マイクロモラー、１．０マイクロモラー、５．０マイクロモラー、１０．０マイクロモラー、２０．０マイクロモラー、５０．０マイクロモラー、１００マイクロモラー、および３００マイクロモラーの最終テスト化合物アッセイ濃度を生じる溶液の投与を含む。前記したように、これらは例示的な範囲であって、少なくとも４つの異なる濃度でいずれかの与えられたアッセイを行うことが考えられ、より好ましくは、濃度用量は、例えば、テストすべき化合物の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上の濃度を含むであろう。そのような濃度が、例えば、テスト組成物中の０．０５マイクロモラー、０．１マイクロモラー、０．５マイクロモラー、１．０マイクロモラー、２．０マイクロモラー、３．０マイクロモラー、４．０マイクロモラー、５．０マイクロモラー、１０．０マイクロモラー、１５．０マイクロモラー、２０．０マイクロモラー、２５．０マイクロモラー、３０．０マイクロモラー、３５．０マイクロモラー、４０．０マイクロモラー、４５．０マイクロモラー、５０．０マイクロモラー、５５．０マイクロモラー、６０．０マイクロモラー、６５．０マイクロモラー、７０．０マイクロモラー、７５．０マイクロモラー、８０．０マイクロモラー、８５．０マイクロモラー、９０．０マイクロモラー、９５．０マイクロモラー、１００マイクロモラー、１１０．０マイクロモラー、１２０．０マイクロモラー、１３０．０マイクロモラー、１４０．０マイクロモラー、１５０．０マイクロモラー、１６０．０マイクロモラー、１７０．０マイクロモラー、１８０．０マイクロモラー、１９０．０マイクロモラー、２００．０マイクロモラー、２１０．０マイクロモラー、２２０．０マイクロモラー、２３０．０マイクロモラー、２４０．０マイクロモラー、２５０．０マイクロモラー、２６０．０マイクロモラー、２７０．０マイクロモラー、２８０．０マイクロモラー、２９０．０マイクロモラー、および３００マイクロモラーの培地濃度を生じさせることができる。
【００９０】
テストすべき化合物は、天然に生じる化合物の断片または部分を含むことができるが、合理的な薬物設計スキームにより既に知られた化合物から誘導することができる。動物、細菌、真菌、葉および幹を含めた植物源および海洋試料のような天然の源から単離された化合物を、潜在的に言うような医薬組成物の存在についての候補としてアッセイすることができる。別法として、毒性につきスクリーニングすべき医薬抽出物合成することもできる（すなわち、人造化合物）。
【００９１】
モニターすべき化合物のタイプはとりわけ、抗ウイルス化合物、抗生物質、抗炎症化合物、抗うつ剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、利尿剤、抗高血圧化合物、抗不整脈薬物、抗癌、癌の治療用の化学療法化合物、抗微生物化合物であってよい。
【００９２】
細胞傷害性についてテストすべき化合物の源またはタイプにかかわらず、化合物の生物学的活性をモニターして、特定の化合物、または化合物の群の治療効果の適応症を供するのが必要であろう。もちろん、そのようなアッセイはテストすべき特定の治療適応症に依存するであろう。例示的な適応症は、ＨＣＶまたは他のウイルス感染を含む。
【００９３】
好ましい具体例において、本発明のアッセイは、薬物発見プログラムの一部として用いて、ＨＣＶ感染に対する増大した効果を持つ推定治療化合物を同定することができる。薬物の発見は、標的化治療領域において、有望性を示すある範囲の候補物質の同定で始まる。例示的な具体例において、ＶＸ−９５０のような例示的なコアまたは鋳型構造をさらなる薬物開発の努力のために用いることができる。他の構造は、同様に、合理的薬物設計を介して、抗−ＨＣＶ剤として設計された有用な特別な構造を提供する。一旦、鋳型が選択されれば、さらなる化学および構造活性分析を行って、化合物の効力を増加させる。このプロセスはリードプロセスを生じさせる。該プロセスのこの段階において本発明の方法を用いるスクリーニングを行って、これらの潜在的リード化合物に対する効力データを提供することができる。最高のリード化合物は、前臨床動物試験にエンターするように選択される。発見プロセスの初期に本発明の選択方法を取り込むと、この後期段階の間に失敗する化合物を大いに低下させる。
【００９４】
本発明の細胞集団に用いるイン・ビトロスクリーニングは薬物発見プログラムにおいていずれかの段階に使用することができるが、発見プロセスの初期に価値あることが判明するであろう。そのような分析から得られた情報は、化学者に、新しい鋳型における効力および効果を最大限とする適切な情報を与える。これらの方法を用い、推定治療化合物を、その相対的結合効果に基づいてランク付けし、または優先順位をつけることができ、同一治療またはクラスにおける既知の薬物と比較することができる。
【００９５】
ＶＳ−９５０は新しい抗−ＨＣＶ剤のための参照化合物として用いることができよう。
ＶＳ−９５０の構造
【化１】
【００９６】
本発明の細胞集団を用いて、効率につき多数の化合物をスクリーニングするための高スループットアッセイは特に考えられる。
【００９７】
ある具体例においては、高スループットスクリーニングを自動化することができる。高スループットスクリーニングアッセイにおいては、化合物の群を、ＨＣＶに感染させた本発明の細胞を含む細胞培養、およびＨＣＶに暴露されていない同様な培養に暴露させる。化合物のこれらの群は、以前個々に調製された化合物のコレクションから組み立てることができ、化合物バンクに貯蔵されているので、該組み立てはランダムなものであって、あるいは、同様な構造が形成された同様性プログラムを用いることによってガイドされる。
【００９８】
加えて、化合物のライブラリーおよび／またはアレイの慎重な調製および使用において迅速な成長もあった。各ライブラリーは、酵素または受容体のような生物学的標的に対してスクリーニングされる多数の化合物を含有する。生物学的ヒットが見出されると、該ヒットの原因となる化合物を同定する。そのような化合物またはリードは、一般に、スクリーニングにおいて比較的弱い活性を呈するが、より伝統的な医薬化学プログラムの実行のための基礎を形成して、活性を増強させる。ライブラリーはコンビナトーリアル化学の迅速に発展する技術を用いて、または平行した合成によって調製することができる（DeWitt et al, Proc Natl Acad Sci, 90, 6909, 1993; Jung et al, Angew Chem Int Ed Engl, 31:367-83, 1992; Pavia et al., Bioorg Med Chem Lett, 3:387-96, 1993）。
【００９９】
別法として、スクリーニングすべき化合物は、例えば、前記したＶＸ−９５０構造のような通常の鋳型またはコア構造にもとづいてライブラリーを形成することができる。そのような技術は、例えば、ＷＯ ９５／３２１８４（オキサゾロンおよびアミニジン鋳型）、ＷＯ ９５／３０６４２（ジヒドロベンゾピラン鋳型）およびＷＯ ９５／３５２７８（ピロリジン鋳型）に記載されている。該鋳型は、その各々を、段階的な様式で、多数の異なる試薬、例えば５つの試薬と反応させて、置換基の５×５×５の異なる組合せを導入し、１２５の成分を含有するライブラリーを与えることができる多数の機能的部位、例えば３つの機能的部位を有するであろう。該ライブラリーは、通常、置換基の全ての、または実質的に全ての可能な組合せを含むであろう。該鋳型は、例えば、ベンゾジアゼピン環のような既知のファルマコフォアを取り込む「偏った」鋳型、あるいは「偏っていない」鋳型であってよく、その選択は生物学的考慮よりも化学によってより影響される。
【０１００】
かくして、本発明の細胞集団および方法を用いて、薬物発見のためのリード化合物を同定することができる。前記したライブラリースクリーニングに加えて、そのようなリード化合物は、実験室において個々に作成された単一合成化合物のランダム交差スクリーニングによって、または微生物代謝産物、海洋海綿および植物のような天然産物源から得られた抽出物をスクリーニングすることによって作り出すことができる。
【０１０１】
もう１つの代替法において、化合物は、既知の生物学的に活性な化合物の構造および／または生物学的作用のその部位に基づいて合理的薬物設計を通じて作り出すことができる。これは、今回、コンピュータ−援助薬物設計の強力な技術によって実行された。合理的薬物設計の目標は、注目する生物学的に活性な分子の構造的アナログを作り出すことである。そのような技術は、本発明を用いて抗−ＨＣＶ活性につきスクリーニングすることができる特定の適用症につき潜在的に数千の化合物を生じるであろう。
【０１０２】
１つの具体例によると、前記方法を用いて、ＨＣＶ集団に対する複数の化合物の影響を同時にスクリーニングする。例えば、９６−ウエルプレートの各ウエルは、本発明の方法に従ってスクリーニングされるべき異なる化合物を含有し得る。さらなる具体例において、本発明の方法を用いて、ＨＣＶの生産を阻害する化合物を同定する。
【０１０３】
１つの具体例において、本発明の方法で用いるプライマーおよびプローブは、ＨＣＶ株の最も保存された領域に基づいて設計される。また、以下のさらなる基準に基づいてプローブを構築することもできる；ａ）プローブの融解温度はプライマーのそれよりも８℃ないし１０℃高い；ｂ）５’末端にＧは存在しない；ｃ）４を超えるＧのストレッチはない；および／またはｄ）プローブは高い融解温度をもつ内部構造を形成しないか、あるいはそれ自体とで、あるいはプライマーのいずれかとでデュプレックスを形成する。１つの具体例において、全ＰＣＲ領域は長さが約１５０塩基対であった。
【０１０４】
ＢＶＤＶの５’ＵＴＲについての有用なプライマーおよびプローブは同一の基準の組に基づいて設計することができる。加えて、ＨＣＶのプライマーまたはプローブはＢＶＤＶのそれに対して最小量の相同性を有することを確認するよう注意した。プライマーおよびプローブは、修飾された核酸分子を合成し、調製する商業的源から得ることができる（例えば、ＯｌｉｇｏおよびＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＢＶＤＶはＭＤＢＫ細胞の感染によって維持することができる。
【０１０５】
本発明の１つの具体例において、２つの異なるデュアル標識発蛍光性プローブを用い、各々は、ＨＣＶ核酸分子および第２の核酸分子の他方を除いて一方に対して特異的である。さらなる具体例において、各発蛍光性プローブは、典型的には、５’末端におけるレポーター色素および３’末端におけるクエンチャー色素を有する。２つの異なる発蛍光性プローブは、２つのピークの間で交差干渉なくして検出することができる区別される蛍光ピークをそれらが与えるように選択される。例えば、先に議論したように、第１の検出可能なプローブの５’末端は６カルボキシフルオレセイン（「６ＦＡＮ」）のようなレポーター色素で標識することができ、第２の検出可能なプローブの５’末端はＶＩＣのようなレポーター色素で標識することができる。双方の検出可能なプローブの３’末端は６カルボキシメチルローダミン（「６ＰＡＭＲＡ」）のようなクエンチャー色素で標識することができる。従って、第１の核酸および第２の核酸に結合すると、プローブの３’末端におけるクエンチャー色素に対する５’末端におけるレポーター色素の近接性の結果、蛍光の抑制がもたらされる。増幅の間、Ｔ番目のポリメラーゼが核酸配列にそって移動すると、クエンチャーは５’３’エキソの作用によってプローブから除去され、それにより、発蛍光性プローブを分解する。その結果、蛍光が発せられ、これは増幅サイクルの関数として記録される。従って、蛍光発光をモニターすると、リアルタイム増幅キネティックスを測定するための基礎が提供される。
【０１０６】
ＨＣＶ遺伝子型１についての有用なプライマーおよびプローブの例は（配列番号：１）５’ＣＣＡＴＧＡＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧ ３’（順方向プライマー）、（配列番号：２）５’ＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣ ３’（逆方向プライマー），およびＨＣＶプローブ、（配列番号：５）５’６ ＦＡＭ−ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ ３’である。ＢＶＤＶについてのプライマーおよびプローブは順方向プライマー、（配列番号：３）５’−ＣＡＧＧＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＧ−３’、逆方向プライマー、（配列番号：４）５’−ＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣ−３’、およびプローブ、５’ ＶＩＣ （配列番号：６）−ＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣＡＴＣＴＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ ３’よりなるものである。
【０１０７】
ＲＴおよびＰＣＲ反応は、キャップ付きの９６ウエルプレート光学トロイの同一ウエルで行うことができる（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）。本発明の１つの具体例において、多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いる（すなわち、同一チューブ中で２つの異なるＲＮＡ種、例えば、ＨＣＶ ＲＮＡおよびＢＶＤＶ ＲＮＡを同時に増幅し測定するＲＴ−ＰＣＲ反応）。該多重反応は、もしＨＣＶ陰性の結果が、培養が真に陰性であるか、あるいは抽出またはＲＴ−ＰＣＲ工程において何らかの技術的失敗があったという事実によるものか実行者が決定することができる利点を有する。１０または２０μｌのウイルスＲＮＡまたはＲＮＡ標準を、１ＸＴａｑｍａｎ緩衝液（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、各々３００ ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ，およびｄＵＴＰ、５ユニットのＴ番目ポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、４．０％増強剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）、ある濃度のプローブおよびプライマーを含む５０ｕｌのＲＴ−ＰＣＴ反応で増幅することができる。Ｔａｑｍａｎ ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、６０℃にて２５分間（ＲＴ）、９５℃にて５分間、続いて、４５サイクルの２−工程ＰＣＲ反応（１分間の６０℃、および１５秒間の９５℃）を行うことができる。ＨＣＶおよびもう１つの核酸を用いるアッセイ（多重）Ｔａｑｍａｎアッセイでは、種々の濃度のプライマーの双方の組のマトリックス混合物を用い、ＨＣＶおよびＢＶＤＶプライマーの量を最適化することができる。最終アッセイ溶液は、２０ｍＭの６−ＦＡＮ−標識ＨＣＶプローブおよびＶＩＣ−標識ＢＶＤＶプローブ双方、４００ｎＭの双方のＨＣＶプライマー、および４５ｎＭの双方のＢＶＤＶプライマーを含む。
【０１０８】
明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」、または「を含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、いずれかのため整数または整数の群を排除するものではないと理解されるであろう。
【０１０９】
２００１年３月２７２に出願された米国仮出願第６０／２７９，１７４号および米国特許出願第２００２０１４２４４９およびそこで引用された論文をここに引用して援用する。
【０１１０】
本発明の多数の具体例を示してきたが、基本的な工程を変化させて、本発明の組成物および方法を利用する他の具体例を提供できることが明らかであろう。従って、本発明の範囲は、ここに例示された特別な具体例よりはむしろ特許請求の範囲または明細書によって定義されるべきだと認識されるであろう。
【０１１１】
本発明の実施に関連する一般的方法は、ＷＯ０２／０７７２０６に見出すことができる。肝臓細胞の単離および低温保存についての一般的方法に関しては、Mitry, R. R., Hughes, R. D., and Dhawan, A. (2002)。Progress in human hepatocytes: isolation, culture & cryopreservation. Cell & Developmental Biology 13, 463-467。（ラットからの）胎児肝臓細胞単離についての詳細な方法に関してはArahyetes, R. M., Sierra, E., Codesal, J., Barrutia, M. S. G., Arza, E., Cubero, J., Ortiz, A., and Magnanto, P. (2001)。Optimization of the technique to isolate fetal hepatocytes, and assessment of their functionality by transplantation. Life Sciences 68, 763-772参照。
【０１１２】
一旦スクリーニングアッセイが適切な抗ＨＣＶ剤を同定したならば、該剤を医薬組成物として処方することができ、さらに、ＨＣＶ感染について、イン・ビトロモデルでテストすることができる。
【０１１３】
本発明のある態様においては、選択およびスクリーニングアッセイを行うための全ての必要成分は、キットにパッケージングすることができる。具体的には、本発明は、アッセイを含むための試薬のパッケージされた組、ならびにテストまたは参照化合物、該試薬を用いて本発明のアッセイの１以上の変形を行うための試薬がパッケージされた指示書を含むそのようなアッセイで用いられるキットを提供する。
【０１１４】
指示は、印刷された紙、またはコンピューターリーダブル磁性または光学媒体のようないずれかの有形媒体、またはインターネットを介してアクセスできるワールドワイドウエブページのような遠隔コンピュータデータ源を参照する指示書に固定することができる。
本発明で引用した書類の全ては、ここに引用して援用する。
【実施例】
【０１１５】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すために含める。本発明の実施でよく機能することが発明者らによって発見された技術を以下に表す実施例に開示された技術は、従って、その実施のための好ましい形態を構成すると考えることができるのは当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示され、なお同様な結果を得る特別な具体例において多くの変形をなすことができるのを認識するであろう。
【０１１６】
実施例１
低温保存
ヒト胎児肝臓細胞はコラゲナーゼ消化、７０ｕｍフィルターを通す濾過、および３回の低速遠心によって単離した。細胞を１０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭに２×１０６／ｍｌまで懸濁させ、制御速度フリージングによって凍結した。３７℃の水浴中へ、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の懸濁液を浸漬することによって細胞のバイアルを解凍し、低速遠心によってペレット化し、１０ｍｌのＤＭＥＭ １０％ＦＣＳに再度懸濁させ、コラーゲン被覆プラスチックに一晩付着させた。非−接着性細胞を単層を穏和にすすぐことによって除去し、次いで、ホルモン的に規定された培地によって培地を置き換えた。１０×対物レンズおよびＨｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔオプティックスを用いて顕微鏡写真を撮った。図１参照。
【０１１７】
実施例２
タイムコース分析
低温保存したヒト胎児肝臓細胞を解凍し、コラーゲン被覆９６−ウエルプレートのウエルに一晩接着させた。非−接着性細胞を除去し、ＤＭＥＭ、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、およびヒドロコルチゾンを含有するホルモン的に規定された培地（ＨＤＭ２）で培地を置き換えた。細胞をＨＣＶウイルスで接種し、３７℃にて８時間インキュベートした。非−吸着ウイルスを除去し、培養をＨＤＭ２で２回洗浄し、次いで、新鮮なＨＤＭ２を加えた。示された接種の後（接種開始後）、４ウエルをＰＢＳで２回すすぎ、次いで、細胞をカオトロピック緩衝液で溶解させ、Ｑｉａｇｅｎ９６−ウエルＲＮｅａｓｙ手法を用いてＲＮＡを単離した。多重ＲＴ−ＰＣＲを用いてＨＣＶ ＲＮＡを定量し、四連試料（ウエル当たりのＨＣＶコピー数）の平均および標準偏差を求める。ダネット検定での結果の分析は、接種後４６および５６時間に収穫された試料は、２２時間の時点より早い時点より有意に多いＨＣＶ ＲＮＡを含有することを示した。図２参照。
【０１１８】
実施例３
ＨＣＶ感染の阻害
低温保存したヒト胎児肝臓細胞を解凍し、コラーゲン被覆９６−ウエルプレートのウエルに３７℃にて６時間接着させた。非−接着性細胞を除去し、ＤＭＥＭ、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、およびコルチゾンを含有するホルモン的に規定された培地（ＨＤＭ２）で培地を置き換えた。異なる濃度のＶＸ−９５０の存在下でウエルをＨＣＶで接種し、３７℃にて１５時間インキュベートした。非−吸着ウイルスを除去し、培養をＤＭＥＭで２回洗浄し、次いで、同一濃度のＶＸ−９５０を含有する新鮮なＨＤＭ２を加えた。さらに４７時間のインキュベーションの後、ウエルをＰＢＳで２回すすぎ、次いで、カオトロピック緩衝液で細胞を溶解させ、Ｑｉａｇｅｎ９６−ウエルＲＮｅａｓｙ手法を用いてＲＮＡを単離した。多重ＲＴ−ＰＣＲ方法を用いて、ＨＣＶ ＲＮＡを定量し、各濃度の阻害剤における三連試料の平均および標準偏差を表す（ウエル当たりのＨＣＶコピー数）。０．２ｕＭ以上のＶＸ−９５０の濃度は、ほとんど完全なＨＣＶ複製の阻害を示した。図３参照。
【０１１９】
本明細書中に開示し、特許請求する組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして過度な実験を行うことなく為し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい具体例にて記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、種々の変形を、組成物および／または方法、および工程、または方法の工程の系列に適用できるのは当業者に明であろう。より具体的には、化学的におよび生理学的に関連するある種の剤は本明細書中に記載した剤に代えて置き換えることができ、他方、同一または類似の結果を達成するであろうことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような同様な代替法および修飾は、添付の請求の範囲によって定義される発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０１２０】
本明細書を通じて引用された文献は、本明細書中に記載されたものを補足する例示的手法または他の詳細を供する程度に、全て、ここに引用して援用される。
【０１２１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の態様をさらに説明することを意図する。本発明は、ここに示した特別な具体例の詳細な記載と組み合わされて、図面を参照することによって良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、解凍、およびコラーゲン−被覆組織培養ウエルへの付着後における低温保存したヒト胎児肝臓細胞を示す。低温保存した胎児肝臓細胞を解凍し、付着から５時間（図１Ａ）または２４時間（図１Ｂ）後に、ホルモン的に規定された培地中で、コラーゲンＩ被覆組織培養皿で培養した。代表的な顕微鏡視野を示す。４０×対物レンズ、Hoffman Differentialオプティックス。
【図２】図２は、低温保存したヒト胎児肝臓細胞の感染後における細胞関連ＨＣＶ ＲＮＡの増加のタイムコースを示す。
【図３】図３は、ＨＣＶ ＮＳ３・４ａプロテアーゼ阻害剤ＶＸ−９５０による低温保存ヒト胎児肝臓細胞のＨＣＶ感染の阻害を示す（ＷＯ０２／１８３６９参照）。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２００３年１２月１日に出願された米国仮出願第６０／５２６，４１１号の優先権の利益を主張する。前記出願の全明細書をここに引用して援用する。
【０００２】
本発明は、一般には、効果的にＨＣＶを再生することができる細胞を含む組成物、およびそれを製造する、および使用するための方法および組成物に向けられる。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は感染したヒトにおいて頑強に複製されるが、培養された細胞中で該ウイルスを増殖させる頑強な方法は未だ完成されていない。感染した血清を用いてイン・ビボで培養されたヒト肝臓細胞を感染させる場合、少量のＨＣＶが複製されるに過ぎず、これは、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出可能に過ぎない。
【０００４】
ＨＣＶで培養された細胞を感染する試みは末梢血液単核細胞、ヒトＢおよびＴ細胞系、ヒト肝臓細胞系、および初代ヒト胎児および成人細胞で報告されている。しかしながら、今日報告されている結果は失望するものであった。しばしば、ウイルス複製は余りにも低くて、細胞の感染した集団から生じたＨＣＶは、全くではないにせよ、ＲＴ−ＰＣＲで検出できるに過ぎず、従って、少数のＨＣＶ ＲＮＡのコピーが観察できるに過ぎない。さらに、ウイルス生産は散在性であって、同一ウイルスおよび細胞では、同一または異なる日にウエル間で再現性がない。なおさらに、感染のピークを観察するのには、ウイルスを投与した後数日、一ヶ月さえ要する。例えば、Iacovacci et al., Hepatology 26(5):1328-1337 (1997)。これらの問題は、ＨＣＶに罹った患者を治療するのに、および／またはＨＣＶ感染に関連する研究で有用であり得る化合物の同定および迅速なスクリーニングを妨げる。
【０００５】
ＷＯ ０２／０７７２０６は培養した細胞においてＨＣＶを増殖させる方法を記載する。しかしながら、該方法は不利を有する。ＷＯ ０２／０７７２０６に開示された方法においては、細胞は単離後間もなく用いなければならない。従って、単一ドナーからの細胞では単一実験のみができるにすぎない。一人のドナーからは、細胞の一組を得ることができ、従って、１つの実験を行うことができる。さらに、該方法で用いる培地は比較的複雑である。
【０００６】
従って、細胞培養においてＨＣＶを感染させ、複製する方法に対する継続した要望が存在する。また、培養においてＨＣＶ生産を阻害する化合物を測定するための迅速かつ効果的な方法に対する要望も存在する。この適用は、ＨＣＶを効果的に再生することができる細胞を含む組成物、細胞の組成物、細胞を培養するための培地の作成方法、細胞をＨＣＶで感染させる方法、ＨＣＶ感染をアッセイする方法、および本発明の組成物および方法を用いてＨＣＶの生産に影響する化合物の能力を評価する方法を提供することによってこれらの問題を解決する。
【０００７】
本発明は、高ＨＣＶ生産培養細胞を含む組成物の製法を提供する。１つの具体例において、本発明は、低温保存され、効果的であり得て、かつＨＣＶで効果的に感染させることができる、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓からの細胞を含む細胞混合物を含む組成物を提供する。本発明は、試料中の、効果的であり得て、かつＨＣＶで効果的に感染させることができる、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓からの細胞を含む細胞混合物を含む組成物を提供する。また、本発明は、本発明の方法によって調製された細胞を含む組成物も提供する。本発明のもう１つの具体例において、細胞混合物中の細胞はサイズが約４０ミクロンないし約７０ミクロンのフィルターを通過することができる。本発明のもう１つの具体例において、該組成物は、フィーダー細胞と組み合わせて、または組み合わせることなく用いられる。本発明のなおもう１つの具体例において、フィーダー細胞はＳＴＯ（Ｒｅｉｄ−９９）細胞である。ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ−９９）細胞は単に例示的なフィーダー細胞であって、他のそのようなフィーダー細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから容易に入手することができる。
【０００８】
本発明は細胞を培養するための組成物を提供する。本発明の１つの具体例において、細胞を培養するための組成物は、ＢＳＡ、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む培地を含む。
【０００９】
本発明は、ＨＣＶを本発明の組成物に投与することによって細胞混合物を感染させる方法を提供する。本発明の１つの具体例によると、ＨＣＶはＲＮＡ８９８である。本発明のもう１つの具体例において、ＨＣＶウイルスを、組成物中で細胞を洗浄し、または接種物を細胞培養基で置き換えるに先立って、ｃｍ２当たり約０．５２ｍｌの容量にて、約３７℃にて約４ないし約２４時間まず組成物（接種物）と共にインキュベートする。
【００１０】
本発明は、本発明の組成物をフィーダー細胞と共にインキュベートし、組成物中の該細胞をＨＣＶと接触させ；次いで、該細胞および／または該細胞が培養された培地に関連するＨＣＶを測定することによって、ＨＣＶ感染をアッセイする方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の組成物をフィーダー細胞と共にインキュベートし、組成物中の細胞をＨＣＶウイルスと接触させ、次いで、ＨＣＶとの接触の前または後に化合物を投与する工程を含む、ＨＣＶの生産に影響する、すなわち、より多くのＨＣＶを生産する細胞の組成物の能力に影響する化合物の能力を評価する方法を提供する。
【００１１】
１つの具体例において、該方法を用いてＨＣＶ生産を阻害する細胞についてスクリーニングする。さらなる具体例において、該方法を用いて、ＨＣＶ生産を阻害するそれらの能力について複数の化合物を同時にスクリーニングする。
【００１２】
もう１つの具体例において、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＨＣＶ ＲＮＡの量を測定することによって、ＨＣＶの存在を判断する。１つの具体例において、試料中のＨＣＶ ＲＮＡを内部対照として用いられる第２のウイルスからのＲＮＡの量と比較する。さらなる具体例において、第２のウイルスがウシウイルス下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）である。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な記載および特定の具体例は本発明の好ましい具体例を示すが、説明のためだけに掲げるものであり、なぜなら、本発明の精神および範囲内の種々の変形および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかになるだろうからである。
【００１４】
好ましい具体例の記載
ＨＣＶのイン・ビトロ増殖に適する細胞に対する要望が存在する。もしＨＣＶによって感染され得るが、イン・ビトロ細胞において長期に生産することができ、単離に際して直ちに使用する必要が無い肝臓細胞集団を生産することができれば、それは最も便利であろう。本発明は、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から単離された肝臓細胞および造血細胞を含む細胞混合物を提供することによって、これらの要望に取り組む。混合された細胞集団調製物は、増殖培地中でフィーダー細胞系の存在と増殖されたそのような細胞混合物の４×１０４細胞が、ＲＮＡ８９８のようなＨＣＶウイルスの細胞への投与、または該ウイルスへの感染から７２時間後に培地中で約５０００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを生産するようなものである。
【００１５】
本発明の組成物は、低温保存された妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された細胞を含む細胞混合物を含む。
【００１６】
また、試料のホルモン的に規定された培地中でＨＣＶで効率的かつ効果的に感染させることができる妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された細胞を含む細胞混合物を含む組成物も本発明によって提供される。
【００１７】
低温保存されたものであって、試料のホルモン的に規定された培地中でＨＣＶで効率的かつ効果的に感染させることができる、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された細胞を含む細胞混合物を含む組成物も本発明によって提供される。
【００１８】
１つの具体例によると、ヒトは妊娠後３月ないし誕生後１年までの間でそれを含む年齢である。本発明の１つの具体例において、ヒトは妊娠後３月ないし６月齢である。もう１つの具体例において、ヒトは妊娠後１８週ないし２２週齢の間である。本発明の１つの具体例において、細胞は胎児肝臓および造血細胞を含む。本発明の１つの具体例において、肝臓および造血細胞はアルファフェトプロテイン、アルブミンおよび／またはグリコホリンを発現することができる。１つの好ましい具体例によると、もしヒトが成人であれば、ヒトの肝臓は健康なものである。
【００１９】
本発明は、ＨＣＶウイルス、ＲＮＡ８９８（以下、「ＲＮＡ８９８」）の感染および複製のためのかなり良好な宿主細胞である細胞を含む組成物を含む。ＲＮＡ８９８は、ブダペスト条約の条件の下に２００１年３月２７日にAmerican Type Culture Collection (「ATCC」)、University Boulevard, Manassas, VA 201102209) (ATCC受託番号:PTA-3237)に寄託された。１つの具体例によると、本発明の組成物は、もし組成物中に４×１０４の細胞があれば、ウイルスの投与から７２時間後に培地中に、約５０００コピーを超える；約１００００コピーを超える；または約５００００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを生産することができる。例えば、本発明の方法に従って調製され、かつ、本明細書中における方法に従ってアッセイされた組成物は、ウイルスの投与から７２時間後に培地中に約５０００を超える、約１００００コピーを超える、または約５００００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを生産することができるであろう。
【００２０】
当業者であれば、もし組成物中の細胞の数が４×１０４細胞よりも大きければ、生産されるウイルスＲＮＡのコピーの合計数は組成物中の細胞の増大した数に相応する量だけ増加することを容易に理解するであろう。
【００２１】
同様に、当業者であれば、もし組成物中の細胞の数が４×１０４細胞よりも小さければ、生産されるウイルスＲＮＡのコピーの合計数は組成物中の細胞の減少した数に相応する量だけ減少することを容易に理解するであろう。従って、同一数のコピーのＨＣＶ ＲＮＡを比例して生産する４×１０４未満のまたはそれを超える細胞を含む組成物が考えられる。本発明による組成物は、ウイルスの組成物への投与から７２時間後に５０００ないし５５０００コピーのＨＣＶ ＲＮＡ；１００００ないし５５０００コピーのＨＣＶ ＲＮＡおよび２５０００ないし５５０００コピーのＨＣＶ ＲＮＡを生産することができる。
【００２２】
ある例示的な具体例において、本発明は、本発明による組成物の細胞混合物が、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を入手し、細胞を肝臓から分離される組成物中の切り裂かれた肝臓をインキュベートすることを含む工程に従って調製することができることを記載する。分離された細胞は、約４０ミクロン以上の物体が分離された細胞から除去されるように処理される。加えて、赤血球細胞も分離された細胞から除去される。次いで、分離された細胞を、０．１ｍＭないし０．６ｍＭカルシウム、ウシ血清アルブミン、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む無血清培地に再懸濁させ、無血清培地中で培養する。この最終再懸濁および培養工程は、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物にそれを再懸濁させることによって、分離された細胞を低温に保存することを含む工程に先行しても、先行しなくてもよい。このように本発明の細胞の好ましい集団は組成物に調製され、そこでは、該組成物は妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から単離された肝臓細胞および造血細胞を含み、ここに、培養基中のフィーダー細胞系の存在下で該細胞混合物の４×１０４細胞を含む調製物は、ＨＣＶウイルスＲＮＡ８９８の該調製物への投与から７２時間後に、培地中で、約５０００コピーを超えるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを生産する。該調製物は低温保存してもしなくてもよい。そのような組成物を製造し、使用する方法および組成物は後にさらに詳細に記載する。
【００２３】
本発明の細胞集団および組成物の調製における最初の工程は適当な肝臓細胞集団を得ることを含む。好ましくは、肝臓細胞集団は霊長類である細胞、最も好ましくはヒト細胞を含む。ヒト細胞は、好ましくは、妊娠後３月齢以降のヒトから単離される。１つの具体例によると、ヒトは妊娠後３月ないし誕生後１年までの間でそれを含む年齢である。本発明のもう１つの具体例において、ヒトは妊娠後３ないし６月齢である。もう１つの具体例において、ヒトは妊娠後１８ないし２２週齢の間である。本発明の１つの具体例において、細胞は胎児肝臓および造血細胞を含む。本発明の１つの具体例によると、肝臓および造血細胞はアルファフェトプロテイン、アルブミンおよび８またはグリコホリンを発現することができる。１つの好ましい具体例によると、もしヒトが成人であれば、ヒト肝臓は健康なものである。
【００２４】
本発明のための種々の源からの肝臓の切り裂きは、典型的には、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）緩衝液中で行う。１つの具体例において、ＥＧＴＡ緩衝液は０．１ｍＭないし１．０ｍＭのＥＧＴＡを含む。本発明のもう１つの具体例において、ＥＧＴＡの濃度は０．５ｍＭである。器官物質はこの緩衝液の冷（４℃）アリコット中で切り裂く。該緩衝液は、好ましくは、器官組織の解離を容易とする剤を含有する。解離は、プロテアーゼの存在によって促進され得る。プロテアーゼ溶液は温かくてもまたは冷たくてもよい。典型的には、用いるプロテアーゼはトリプシンである。トリプシン処理の不利の一つは、もし組織を上昇した温度（例えば、室温またはそれより高温）で長時間トリプシンに暴露すれば、それが損傷を引き起こしかねないことである。従って、細胞は、典型的には、温かいトリプシン中で３０分以内のインキュベーションにより収穫される。しかしながら、組織に十分な解離は、典型的には、３ないし４時間を必要とし、よって、より低い（例えば４℃）の温度でトリプシン処理を行うのがしばしば望ましい。これは、組織をプロテアーゼに適切に浸漬しつつ、組織に対する損傷を最小化する。このように、組織は、０．２５％トリプシンを含有するＥＧＴＡ緩衝液に４℃にて１０分間ないし１８時間までの間浸漬することができる。次いで、組織をプロテアーゼ−含有緩衝液から取り出し、３７℃の浴に２ないし３０分間入れる。次いで、例えば、１ｍｌの好ましくは温かい媒体を存在する元の組織１００ｍｇ毎に加えることによって、細胞を組織から分離する。混合物をピペットで上下に穏和に処理すると、組織の解離が促進されて、細胞は媒体に分散するようになる。
【００２５】
トリプシンの代わりに、あるいはトリプシンに加えて、他のプロテアーゼを用いて、組織の解離を容易とすることもできる。好ましい具体例において、解離はコラゲナーゼを用いて達成される。粗製コラゲナーゼ（例えば、２０００ユニット／ｍｌ）を用いる。コラゲナーゼはトリプシンに対して好ましい。なぜならば、多くの組織はトリプシンに対するよりもコラーゲンに対して感受性が低く、従って、組織細胞の一体性に対する損傷はコラゲナーゼではより少ないからである。好ましい態様において、解離の方法は、ＥＧＴＡ中での第一のインキュベーション、続いての、コラゲナーゼを含有するカルシウム−含有緩衝液中での第二のインキュベーションを用いる２工程肝臓灌流を含む（Seglen, P.O. Methods Cell Biol 13:29, 1976）。組織はＥＧＴＡ緩衝液中で切り刻まれる。次いで、ＥＧＴＡ緩衝液を除去し、コラゲナーゼおよびカルシウムを含有するが、キレート化剤（例えば、ＥＧＴＡまたはその同等体）を含有せず、例えば、２００ユニットのコラゲナーゼ／ｍｌを含有する別の緩衝液または培地と置き換える。次いで、組織を、撹拌しつつ、例えば、３７℃にて、例えば、１０分ないし４８時間までこの溶液中でインキュベートする。もし組織はそれがインキュベートされる容器の底に塗り付けられるならば、効果的な解離が認識できる。組織が解離された後、混合物を５０ないし１００ｇにおいて３分間遠心する。上澄みを捨て、細胞を適当な培地に再懸濁し、培養して、細胞を拡大培養する。特定の好ましい具体例において、解離は、０．１ないし５．０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むコラゲナーゼ緩衝液を用いて行う。本発明のもう１つの具体例において、コラゲナーゼの濃度は２ｍｇ／ｍｌである。（供給業者：ＧＩＢＣＯ ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、例えば、ＧＩＢＣＯカタログ番号１７７０１より肝臓灌流培地が得られる）。好ましい解離方法において、組織をＥＧＴＡ中で１０分間インキュベートする。組織を沈降させ、ＥＧＴＡを含有する上澄みを取り出す。次いで、沈積した組織をコラゲナーゼを含有する緩衝液（例えば、ＧＩＢＣＯ肝臓灌流培地カタログ番号１７７０１）中で３０分間インキュベートする。
【００２６】
用いることができるさらなるプロテアーゼは、例えば、プロナーゼ（Schaffer et al., Am. J. Physiol., 273(3,1)G686-G695, 1997; Glavin et al., J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 276:1174-1179, 1996）およびジスパーゼ（Compton et al., J. Cell. Physiol., 177:274-281, 1998; Inamatsu et al., J. Invest. Dermatol., 111:767-775, 1998）のような細菌プロテアーゼを含む。加えて、ヒアルロニダーゼおよびノイラミニダーゼのような他の酵素を用いることもできる。
【００２７】
一旦解離工程が完了すれば、細胞懸濁液をさらに処理して、目的物および物質を除去する。特定の好ましい具体例において、本発明の細胞集団はサイズが約４０ミクロンのフィルターを通過することができる。従って、本発明の細胞集団の調製の工程は、４０ミクロンよりも大きな解離した組織から目的物を取り出すことを含む。本発明によるこのサイズ排除工程は、サイズが約４０ミクロンのフィルターを通過することができない細胞の組織、デブリスおよび凝集物のような物体を除去することを意味する。かくして、例えば、サイズがほぼ４０ミクロンからサイズは１００ミクロンまで（例えば、５０、６０、７０、８０または９０ミクロン）のフィルターの使用、およびサイズが４０ミクロンよりも大きなデブリスを除去するための他の方法が考えられる。１つの具体例において、濾過工程は、サイズが約４０ミクロンよりも大きなフィルターを通過することができない物体を除去する。複数の濾過工程を使用することができ、例えば、より大きなポアのフィルターを用いる最初の濾過工程に続いて、より小さなポアサイズを用いる引き続いての濾過を行うことができる。本発明によるフィルターの例はナイロンフィルターを含む（例えば、Ｆａｌｃｏｎからの「細胞ストレイナー」（カタログ番号２０３４、２３５０または２３６０））。
【００２８】
細胞集団から４０ミクロンよりも大きな物体を除去することに加えて、本発明の分離工程は、細胞混合物から赤血球細胞を除去する工程も含む。赤血球細胞は、該細胞が肝臓から分離された後に、調製プロセスの間にいずれかの段階で除去することができると理解すべきである。赤血球細胞を除去する方法は当該分野で知られている。本発明の１つの具体例によると、赤血球細胞は遠心管中での順次の低速回転によって除去される。例えば、フィルターを通過した分離細胞を５０×ｇ（４５０ｒｐｍ）において４分間回転させることができる、細胞ペレットを再懸濁し、同一プロセスを数回反復することができる。
【００２９】
このようにして、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液である細胞集団が得られ、ここに、肝臓細胞の懸濁液は４０ミクロンよりも小さな細胞よりなる。好ましくは、懸濁液は、赤血球細胞を実質的に含まないものである。
【００３０】
本発明の細胞集団は、アルファフェトプロテイン、アルブミンおよび／またはグリコホリンを発現する細胞が豊富化されたものである。好ましくは、該細胞はＣＤ３４を発現しないものである（それをＣＤ３４−という）。当業者であれば、該集団の細胞は１以上のこれらのマーカーを含むか否かを評価する技術を認識しているであろう。そのような技術は免疫染色を含むことができる。例えば、ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡからの抗−アルファフェトプロテイン抗体、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの抗−グリコホリン抗体（３２５９１）、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの抗−ヒトＣＤ３４抗体（３４３７１Ａ）、およびＡｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹからの抗−アルブミン抗体（ＹＭ５０２４）を用いることができる。
【００３１】
前記した抗体を用いて単離された細胞集団の表面でのこれらのマーカーの存在を測定するに加えて、当業者であれば単離技術におけるそのような抗体を用いて所望の細胞集団を単離することができるのを理解するであろう。従って、例示的な具体例において、単独、あるいはフィーダー細胞系の存在下で、妊娠後のヒト３月齢以降の肝臓を切り裂くことによって単離された一次細胞が培養において拡大培養され、拡大培養された培養は、本発明で言うような細胞の存在につき、豊富化される。そのような豊富化技術は、有利には免疫学的手法に基づく技術を使用することができる。これらは、限定されるものではないが、免疫接着、蛍光−活性化フローサイトメトリー免疫学的に基づくカラムクロマトグラフィー、抗体−コンジュゲーテッドセファロースビーズ（または他の不活性のビーズ）、または他の免疫学的ベースの適用、例えば、免疫−磁気分類）よりなる。しかし、これらの手法は肝臓細胞の集団を否定するものではなく、むしろ、その単離に導く。
【００３２】
他の物理的分離手法は抗原精製に先立ち、またはその後に適用することができる。それらは、限定されるものではないが、平衡密度遠心、速度沈積、または対向流遠心溶出法よりなる。同様に、他の抗原マーカーを陽性または陰性態様で用いることができ、さらに、これらの細胞を否定する。これらは、限定されるものではないが、動物主要組織適合性遺伝子が、（特に、ＨＬＡ ＤＲＡ）の抗原、造血性抗原（例えば、ＣＤ３３，ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ９、ＣＤ２０）、または他の肝臓蛋白質よりなる。
【００３３】
本発明の肝臓細胞は、細胞の平衡−密度遠心によって豊富化することができる。細胞の平衡−密度遠心は、適当な細胞が幾分豊富化された低密度細胞を供する。ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配を用いることができる。１つの具体例において、平衡−密度遠心は、免疫アフイニティー工程の前に行うことができる。この具体例おいて、抗体精製技術の工程は、所望の密度を持つ肝臓細胞で行う。さらなる具体例において、平衡−密度遠心が、細胞の抗体精製後に行うことができる。あるいは、平衡−密度遠心精製工程は、抗体精製前に１回、抗体精製工程の後に１回の２回行うことができる。
【００３４】
もう１つの態様において、肝臓細胞の集団は、プラスチックへの接着を用いることによって豊富化することができる。本発明の好ましい集団はプラスチック−接着性肝臓細胞である。肝臓細胞の集団は、細胞の単離された集団に存在する非接着性細胞を除去することによって豊富化することができる。これらの非接着性細胞の除去は、肝臓細胞集団を接着性、表面、典型的には、組織培養プラスチックまたはガラスに暴露することによって達成することができる。接着性肝臓細胞は、組織培養プラスチックまたはガラスに接着し、他方、非接着性細胞は懸濁液中に留まる。懸濁液中の細胞は、上澄みを除去し、接着性細胞を洗浄することによって容易に除去することができる。非接着性細胞は免疫精製工程の前または後に除去することができる。好ましくは間質細胞は、免疫精製工程に組織培養プラスチックまたはガラスのような固体表面の使用は当該分野でよく知られている。組織培養プラスチックおよびガラスを処理して（例えば、シリコーン、ニトロセルロース、ニッケル、リシンなど）、細胞の接着を促進し、または阻害することができる。処理されたおよび処理されていない表面は商業的に入手可能である。
【００３５】
もう１つの態様において、細胞の豊富化された集団は細部に従ってさらに分画される。好ましい具体例において、細部分画は、例えば、ＦＡＣＳcanフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって達成することができる。本発明の細胞は直径が４０ミクロン未満、より好ましくは約１０ないし約３０ミクロンの平均直径を有する。
【００３６】
ＦＡＣＳは、それらがレーザービームを通過する場合の光散乱特性に基づいて細胞のサブ−集団の分離を可能とする。前方光散乱（ＦＡＬＳ）は細胞のサイズに関連し、側方散乱特徴（ＳＳＣ）としても知られた右側角光散乱は細胞密度、細胞含有量および核−細胞質の比率、すなわち、細胞の複雑性に関連する。細胞は蛍光コンジュゲートと抗体で標識することができるので、それは抗体（蛍光）強度によってさらに特徴付けることができる。例示的な具体例において、ＦＡＣＳ医薬ＣＳマシーンはＣＳ３４−（低蛍光）およびＣＳ３４＋（高蛍光）を分離するように設定することができる。
【００３７】
抗体、例えば、ＣＤ３４＋モノクローナル抗体で肝臓細胞を標識するためには、細胞を肝臓から引き裂き、それらを実施例１に記載したようにプロテアーゼで処理することによって調製することができる。細胞調製物は遠心管においてｍｌ当たり、たとえば、約１×１０５ないし１×１０６細胞を含むアリコットに分割される。次いで、この懸濁液をベンチトップまたは他の遠心管にて遠心する。次いで、そのように生成された細胞ペレットを、選択されたモノクローナル抗体を含有する適当な緩衝液に再懸濁させ、適当な時間の間インキュベートする。標識された細胞を洗浄し、標識された細胞のアリコットをフルオレセイン−標識抗−マウス免疫グロブリンと共にインキュベートする。この懸濁液を洗浄し、細胞ソーティングのための適当な緩衝液に再懸濁させる。
【００３８】
ＦＡＣＳによって細胞をソーティングするにおいて、低ＳＳＣおよび中間細胞（ＦＡＬＳ）についてのウインドウ（すなわち、電子的に規定された領域）を設定する。このウインドウにおける細胞を、抗体−蛍光活性によってさらに分けることができる。ＦＡＣＳの設定をキャリブレートして、特定の抗原に対して陽性および陰性の細胞を収集する。
【００３９】
本発明の特別な具体例において、肝臓細胞はＦＡＣＳによって特徴付けることができる。ＣＤ３４−細胞を同定し、単離するための前記技術を、先に例示したもののような特異的抗体を用いて他の抗原決定基につき反復する。このようにして当業者であれば、本発明の細胞の高度に豊富化された集団を生じさせることができる。
【００４０】
ＦＡＣＳに対する代替法として、免疫単離を用いて細胞を単離することができる。注目する特定の抗原に対する抗体の利用性は、注目する肝臓細胞の特異的分離を可能とする。そのような具体例において、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４−細胞から分離し、次いで、（例えば、抗−アルファフェトプロテイン抗体；抗−グリコホリン抗体；抗−アルブミン抗体等を用いて）細胞上の他の抗原決定基の存在に従ってさらに分離する。精製技術は当業者によく知られている。これらの技術は、限定されるものではないが、イムノマグネティックス、免疫吸着などのような標準的な免疫学的手法を用い、混合物の他の成分から所望の細胞を含有する肝臓細胞画分を分離するための、肝臓から細胞環境の切り裂きおよび分画を用いる傾向がある。前記したようにして所望の肝臓細胞画分を分離すれば、種々の分離手段を用いてさらに精製して、さらなる精製を達成することができる。分析方法は、特に、純粋な細胞表面抗原の調製に特に適した分析方法はクロマトグラフィーを用いる。
【００４１】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離するべき物質、およびそれが特異的に結合することができる分子の間の特異的親和性に依拠するクロマトグラフィー手法である。これは受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム物質は、結合パートナー（この場合は抗体）の１つを不溶性マトリックスに共有結合カップリングさせることによって合成される。従って、カラム物質は溶液から当該物質を特異的に吸着することができる。結合が起こらないものに条件を変化（ｐＨ、イオン強度、温度等を変化させる）させることによって、溶出が起こる。
【００４２】
アフィニティークロマトグラフィーの最も通常の形態の１つは、免疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明に従って用いるのに適した抗体の創成は後に議論する。抗体または抗原を不溶性の不活性なマトリックスに付着させる。分離すべき細胞集団を、特異的な抗体−抗原相互作用があるようにマトリックスに適用する。結合した抗原／抗体を、低いｐＨ緩衝液、高塩濃度等のような、中程度の変性溶媒への暴露によって吸着剤から溶出させる。
【００４３】
特定の具体例において、本発明の細胞は、イムノマグネティックスクロマトグラフィーを用いて単離される。例えば、抗−ＣＤ３４または他の抗体を磁性ビーズに付着させる。これらの抗体−標識磁性ビーズは、アフィニティー精製についての基礎として用いられる。細胞の抗体−標識全肝臓細胞調製物は、ここに、例えば、抗−ＣＤ３４抗体含有磁性アフィニティーカラムに適用される。非−接着性細胞を収集し、磁場の除去によって、磁性カラムから接着性細胞を捨てる。もう１つの具体例において、細胞をまず抗体（例えば、抗−ＣＤ３４抗体）で標識し、次いで、二次抗体を運ぶ磁性ビーズまたはスフィアで標識する。
【００４４】
炭水化物含有化合物の精製で有用なもう１つのタイプのアフィニティークロマトグラフィーはレクチンアフィニティークロマトグラフィーである、このタイプのクロマトグラフィーはＣＤ３４＋細胞を除去するのに有用である。レクチンは、種々の多糖および糖蛋白質に結合するクラスの物質である。レクチンは、通常、臭化シアンによってアガロースにカップリングされる。SepharoseにカップリングしたコンカナバリンＡは、用いられるこの種の最初の物質であり、多糖の単離で広く用いられており、レクチン以外の糖蛋白質はヒラマメレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製で用いられてきた小麦胚芽アグルチニン、およびＨｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａレクチンを含む。レクチンそれ自体は、炭水化物リガンドでのアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。ラクトースは、ヒマおよび落花生からレクチンを精製するのに用いられており；マルトースはヒラマメおよびタチナタマメからレクチンを抽出するのに有用であり；Ｎ−アセチル−Ｄガラクトサミンは大豆からレクチンを精製するのに用いられており；Ｎ−アセチルグルコサミニルは小麦胚芽からのレクチンに結合し；Ｄ−ガラクトサミンは二枚貝からレクチンを得るのに用いられており；Ｌ−７コースはハスからのレクチンに結合する。
【００４５】
磁性ビーズを用いる免疫選択は、所望のモノクローナル抗体で予め被覆されたビーズを使用する。細胞をモノクローナル抗体で予め被覆し、ビーズに付着した二次抗−マウス免疫グロブリンを通じて磁性ビーズに付着させることができる。次いで、ビーズに結合した細胞を磁石で除去する。これは、所望の細胞の高い回収率を可能とする迅速な方法である。
【００４６】
免疫接着において、プラスチック被覆表面を用いて、細胞を混合物から単離する。ペトリ皿のような表面を、所望の表現型を保有する細胞を選択する抗体で被覆する。細胞を被覆された皿の上に置き、細胞および皿のコーティングの間の相互作用を行う適当な時間の間インキュベートする。インキュベーション時間の後、非接着性細胞を適当な緩衝液で穏和に洗浄することのよって除去する。次いで、皿に付着したままの抗体−接着性細胞を培養し、および／またはトリプシン処理、または当業者によく知られた他の細胞収穫技術を用いて回収する。
【００４７】
本発明の望ましい肝臓細胞集団は、アルファフェトプロテイン、アルブミン、およびグリコホリンに向けられた抗体と免疫反応性（すなわち、該集団の細胞は、これらのマーカーの各々に対して陽性であり、それを含む）であるが、抗ＣＤ３４抗体と免疫反応性ではない（ＣＤ３４を含まないものである）。かくして、抗体を用いて、肝臓細胞の集団を豊富化する。肝臓細胞はさらに特徴付けられるので、肝臓細胞と免疫反応する他の抗体は他の当業者によって作成できるであろう。肝臓細胞抗原決定基と免疫反応性であるこれらの他の抗体の使用も同様に考えられる。
【００４８】
もう１つの具体例において、肝臓細胞上の決定基と免疫反応性である抗体と免疫反応性である第２の抗体を用いて、肝臓細胞の集団を豊富化することができる。二次抗体の使用は一般に当該分野で知られている。典型的には、二次抗体は、第一の抗体の定常基と免疫反応性である抗体である。好ましい二次抗体は抗−ウサギ、抗−マウス、抗−ラット、抗−ヤギおよび抗−ウマ免疫グロブリンであって、商業的に入手可能である。好ましい具体例において、二次抗体は、組織培養皿、アガロース、ポリアクリルアミド、および磁性粒子を含めた固体基材にコンジュゲートさせる。この具体例において、肝臓細胞の細胞表面の決定基に対して特異的な抗体を、まず、単離すべき肝臓細胞の集団に免疫反応させる。次いで、抗体が付着した細胞を含有する肝臓細胞集団を、固体基材にコンジュゲートする二次抗体に暴露する。細胞の豊富化が達成される。なぜならば、抗体で標識された細胞のみが二次抗体と免疫反応するからである。磁性粒子にコンジュゲートした二次抗体を供する市販のキットが利用できる。このシステムにおいては、抗体を表す適切に標識された肝臓細胞は、磁場への暴露によって精製される。
【００４９】
特別な具体例において、本発明の細胞は低温保存される。肝臓細胞の低温保存の方法は、当業者に知られている。肝臓細胞の低温保存のためのある種の低温保護媒体を記載する米国特許５,７２３,２８２号；米国特許第６,５２１,４０２号、特に、米国特許第６,１３６,５２５号(ここに引用してその全体を援用する)を参照されたし。
【００５０】
本出願においては、低温保存すべき細胞は、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清の最終濃度を含む培地に再懸濁させる。次いで、細胞をフリーザーの安全容器に分注し、特定の条件、窒素、液体または蒸気、該容器のソーティング、および用いる場合の該細胞の解凍下で、容器を特定の時間凍結させる。一般的に言って、低温保護剤は、細胞内氷の凍結の間おける形成のような低温保存の有害な効果を最小化するのに用いる化合物である。説明のために、限定されるものではないが、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、アミノ酸、プロパンジオールを挙げることができる。
【００５１】
好ましい肝臓細胞培養基は、細胞を、最小細胞劣化にて、液体窒素貯蔵で遭遇する極端な温度変化に耐えるものとするものである。ある具体例においては、培地は、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾン（ＨＤＭ２）を含有し、さらに、チミジン、アルブミン、インスリン、デキサメタゾン、グルタミンおよび哺乳動物血清のような１以上の補足物を含有することができるＤＭＥＭ培地と定義される。以下の表は用いることができ、その変形であり得る培地の例示的濃度を提供する。
【００５２】
【表１】
【００５３】
哺乳動物血清が胎児ウシ血清、胎児子ウシ血清、および１０％ないし９０％の濃度範囲のブタ血清を含むことができる。特に好ましい具体例において、培地は、加えて、約１０ないし約１５％の範囲のＤＭＳＯ、約３．５ないし約１５％の範囲のアルブミン、および約１０ないし約２０％の範囲のグリセロールを補足する。特別な具体例において、低温保存用の培地は胎児ウシ血清（以下、ＦＢＳ）と、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）とを含む。より具体的には、低温保護培地は約５ないし約２０％のＦＢＳおよび約５ないし約１５％のＤＭＳＯを含む。最も好ましいのは、１０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを含む低温保護培地である。
【００５４】
前記定義の単離された肝臓細胞集団は、特定の密度にてフリーザー抵抗性容器に分注することによって低温保存用に調製される。そのような容器は、限定されるものではないが、バイアル、バッグ、カン等を含む。好ましいのはプラスチックバックであって、最も好ましいのは、約２５０ｍｌないし約５００ｍｌの範囲の容量を有するＢａｘｔｅｒプラスチックバックのＣｒｙｏｃｙｔｅ商標である。
【００５５】
細胞を容器に分注し、例えば、機械的アルミニウムシール、熱的インパルスヒートシーラー、ルーエルロックプラグ等を用いて容器をシールする。熱シーリングが最も好ましい。そのようにシールされた容器は好ましくは、低温保存すべき全ての容器が満たされ、シールされ、従って、それらが同時に低温保存できるまで０ないし４℃に保たれる。
【００５６】
低温保存すべき細胞の細胞密度は変化し得る。例えば、細胞は約５×１０６細胞／ｍｌないし約１０×１０６細胞／ｍｌの密度で低温保存することができる。約１０ないし約５０ｍｌの範囲の容量を２５０ｍｌのフリージング容器中で維持することができ、他方、約５０ないし約１５０ｍｌを５００ｍｌのフリージング容器中で低温保存することができる。加えて、細胞を接種して、制御された結晶化、またはフリージング前に既に冷却されている溶液中での氷の形成を生じさせることができる。接種の方法は当業者に知られており、冷金属ロッドをフリージング溶液に挿入し、液体窒素のブラストをフリージング容器に導入することを含む。
【００５７】
細胞の均一なフリージングが好ましく、凍結すべき容器がフリージングプレートの間に置かれるフリージングプレートを用いて達成することができる。
【００５８】
肝臓細胞が一旦フリージング容器に分注されたならば、それはフリーザーに入れる準備ができている。約４℃ないし約−９０℃で凍結することができるいずれのフリーザーも考えられるが、制御速度フリーザーが好ましい。非−制御速度フリーザーを用いる場合、低温保存すべきであって、細胞を含有する容器を、好ましくは発泡スチロールの箱に貯蔵し、フリーザー中に約２ないし約２４時間入れられるフリーザー安全容器に入れる。その後、容器をフリーザーから取り出し、直ちに液体窒素中で長時間保存用に冷却する。用いる準備ができたならば、細胞を３７ないし４２℃の水浴中で解凍し、残存する低温保存剤を順次の洗浄によって除去する。
【００５９】
制御速度フリーザーを用いる場合、フリージングプロフィールを該フリーザーにプログラムして、均一なフリージングを確保する。全てのそのようなフリージングプロフィールは、一旦試料の温度が−４℃に到達したならば開始すべきである。そのような制御速度温度についての冷却速度は当業者に知られており、米国特許第６，１３６，５２５号はそのような冷却速度の例を提供している。好ましくは、制御速度フリーザープロフィールは、潜熱の放出に対して補償するようにプログラムされた窒素のブラストを含む。潜熱の放出の補償は、細胞の低温保存の間における細胞損傷の尤度を減少させる。このプログラムされた冷ブラストは、フリージングサイクルにおける全てのフリージング容器上の外部の氷のシーディングを同調させるのを助ける。これは特に有利である。というのは、低温保存細胞の臨界点は氷形成の段階の間に起こるからである。氷形成が、液体相における分子のランダムに起こるクラスターであり得る核形成部位で開始する。核形成氷結晶は、氷の全面に形成されて、これは固化が完了するまで液体全体にわたって拡大する。
【００６０】
細胞を低温保存するための好ましい方法は、１０％ＤＭＳＯおよび１０％ＦＣＳを含有する培地中に細胞を２×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁させ、次いで、バイアル当たり該懸濁液の１ｍｌを２ｍｌのクリオバイアルに分注することである。次いで、それをＮａｌｇｅｎｅ低温１℃フリージング容器（カタログ番号１００−０００１）に挿入することによって制御された速度にてバイアルを凍結させ、次いで、これを−７０℃のフリーザーに一晩入れる。次いで、バイアルを、長期貯蔵用の液体窒素貯蔵タンクの蒸気相に移す。
【００６１】
一旦細胞を前記したフリーザー技術を介して凍結したならば、それを、窒素貯蔵フリーザー中にて、長期間貯蔵用の低温発生貯蔵ボックス中に置くことができる。長期間貯蔵では、細胞を再懸濁に先立って数週間、数ヶ月または数年さえの間貯蔵することができると考えられる。フリージング容器を蒸気または液体窒素中で貯蔵することができる。
【００６２】
使用に先立って、細胞は解凍しなければならず、ＤＭＳＯは除去しなければならない。解凍は３７ないし４２℃の浴を介して達成される。スラッシュが出現すると、細胞を容器から取り出す。次いで、細胞を、冷培養基を含有する遠心管に注ぐ。初期細胞容量を新鮮な冷培養基に５ないし１０回加えることによって、初期の細胞容量を遠心管中で希釈する。次いで、懸濁液を５ないし１５ｇにおいて２ないし５分間回転して沈める。上澄みを吸引して、残存するＤＭＳＯを含有する培地を除去する。その後、約２ないし４回、新鮮な培地を細胞ペレットに加える。
【００６３】
本発明の細胞は、低温保存の前、後、または前および後に、増殖させ、細胞培養において拡大培養する。しかしながら、本発明の細胞集団を調製する方法は低温保存および解凍工程を省略することができるのに注意すべきである。
【００６４】
好ましい具体例において、細胞が本明細書中においてはホルモン的に規定される培地中で増殖させる。本発明の１つの具体例において、本発明の組成物を共培養し、フィーダー細胞と共に用いるか、さらにフィーダー細胞を含む。フィーダー細胞は細胞内マトリックス、および肝臓細胞の増殖および拡大培養のための成長因子のような拡散可能な因子を提供する。１つの具体例において、フィーダー細胞はＨＣＶに感染する能力をほとんどまたは全く有しない。もう１つの具体例において、フィーダー細胞は線維芽細胞である。もう１つの具体例において、フィーダー細胞は胚性腸間膜線維芽細胞である。
【００６５】
本発明によるフィーダー細胞の例はＳＰＯのような胚線維芽細胞（ＭＥＦ）およびラット胚線維芽細胞である。例えば、Hogan et al., Manipulating The Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 第２版 Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Robertson, E.J.編(1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, ed. Robertson, E.J. (IRS, Oxford), pp. 71-112。ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞は有用なフィーダー細胞の１つのタイプである。ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ−９９）細胞は、ブダペスト条約の条件の下で、２００１年３月２７日に、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 2209に寄託した（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−３２３６）。フィーダー細胞を培養し、維持する方法は、当該分野で知られている。例えば、Methods for culturing and maintaining feeder cells are known in the art. See, for example, in Methods for Tissue Engineering, Ed. Robert Lanza, Academic Press, NY (2002), pp. 151-202参照。
【００６６】
フィーダー細胞は、当該分野で知られた方法に従って、増殖阻止することができる。例えば、ＳＰＯ細胞を細胞培養プレートに２ないし４８時間で接着させることができる。次に、ＳＴＯ細胞をインキュベートする培地を除去し、２ｕｇ／ｍｌマイトマイシンＣを含有する培地で置き換える。次いで、ＳＴＯ細胞を約３７℃にて約２時間インキュベートする。インキュベーション後に、マイトマイシンＣを含有する培地を除去する。細胞を２回洗浄し、次いで、ＳＴＯ細胞培養を、本発明の細胞混合物を加える前に０ないし４８時間維持する。
【００６７】
１つの具体例において、本発明の細胞の再懸濁液で用いられる培地は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＧＬ）および微量元素を含む培地である。
【００６８】
動物またはヒトの一次細胞、細胞系および組織を本発明の培地で培養することができる。１つの具体例において、培養基は無血清培地、カルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、ニコチンアミド、微量元素、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む。もう１つの具体例によると、培養基は、更に以下の成分：グルカゴン、肝臓増殖因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子のいずれか１つ、組合せ、または全てを含むことができる。さらなる具体例において、培養基は、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まない。
【００６９】
前記プロセスに従って、細胞混合物を調製した後、該細胞および、必要であれば、フィーダー細胞を維持するのに適当な培地中で培養すべきである。本発明の１つの具体例において、培地は、ＨＣＶ感染で用いる細胞混合物について最適化される。この目的で言うような１つの培地は、カルシウム、ウシ血清アルブミン（ＢｓＡ）、遊離脂肪酸（ＦＡＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、ニコチンアミド、微量元素、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンを含み、所望により以下の成分：グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子のいずれか１つ、組合せ、または全てを含む無血清培地（例えば、（ダルベッコウの修飾句培地ＤＭＥＭ））を含む。本発明の１つの具体例によると、培養基は低密度リポ蛋白質（ＬＤＤ）を含まない。
【００７０】
この目的で有用なもう１つの培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む無血清培地を含む。
【００７１】
１つの具体例において、培地は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まない。もう１つの具体例において、培地は遊離脂肪酸（ＦＡＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、または微量元素を含まない。
【００７２】
もう１つの具体例において、培地は、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含有しない。
【００７３】
もう１つの具体例において、培地は、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、遊離脂肪酸（ＦＡＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、または微量元素、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子を含まない。もう１つの具体例において、培地は無血清である。
【００７４】
１つの具体例において、培養基におけるカルシウムの濃度は０．１ｍＭないし０．６ｍＭの間である。もう１つの具体例において、カルシウムの濃度はほぼ０．５ｍＭである。１つの具体例において、ＢＳＡ濃度は５００ｕｇ／ｍｌである。もう１つの具体例において、ニコチンアミドの濃度は５ｍＭである。１つの具体例において、インスリンの濃度は１０ｕｇ／ｍｌである。１つの具体例において、遊離脂肪酸の濃度は７．６ｅＥｑ／Ｌである。１つの具体例において、ＥＧＦの濃度は１００ｍｇ／ｍｌである。１つの具体例において、肝臓成長因子の濃度は２０ｕｇ／ｍｌである。１つの具体例において、エタノールアミンの濃度は１０−６Ｍである。１つの具体例において、チロトロピン放出因の濃度は、１０７−６Ｍである。１つの具体例において、ＨＤＬの濃度は５ｕｇ／ｍｌである。１つの具体例において、ヒドロコルチゾンの濃度は１０−６Ｍである。１つの具体例において、培地はＩＭ−ＨＤＭ培地である。
【００７５】
ＤＭＥＭ（高グルコース）、500ug/ml BSA, 7.6uEq/L遊離脂肪酸(FAA), 5ug/ml HDL, 5mM ニコチンアミド、1x 微量元素 [1x10-7M銅, 5x10-11M亜鉛, 3x10 10Mセレン], 100ng/ml EGF, 10 ng/mlインスリン, 5ug/mlトランスフェリン, 10-6Mヒドロコルチゾン, 2ug/ml グルカゴン、20ug/ml肝臓増殖因子、10-6Mエタノールアミン10-6Mチロトロピン放出因子を含む。１つの具体例において、7.6uEq/Lの全ＦＦＡら、2.36μＭパルミチン酸(16:0), 0.21uM パルミトレイン酸(cis-16:1 n-7), 0.88μMステアリン酸(18:0), 1.02μMオレイン酸(cis-18:1 n-9), 2.71μMリノール酸(cis-18:2 n-6),および0.43μMリノレン酸(cis 18:3 n-3)の混合物を含む。培地は、細菌の増殖を妨げるための抗生物質、例えば、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むこともできる。
【００７６】
もう１つの具体例において、培地はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＩＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、およびヒドロコルチゾンを含む無血清培地を含む。
【００７７】
本発明の組成物の細胞混合物は、細胞外マトリックスで被覆したプラスチック基材上で平板培養することができる。細胞外マトリックス成分の例は、限定されるものではないが、例えば、コラーゲンＩ型、コラーゲン型ＩＶ型または接着蛋白質、フィブロネクチンおよびラミンまたはマトリゲル（Matrigel）(ICN Biochemicals Inc.)を含む。
【００７８】
コラーゲンは、用いる場合、単独で、あるいはラミンまたはフィブロネクチンと組み合わせて、あるいはプロテオグリカンと組み合わせて、あるいは細胞外マトリックス材料が豊富化された組織抽出物と一緒に用いることができる。細胞外マトリックスは前記したフィーダー細胞によって供することもできる。そのような細胞混合物および細胞外マトリックスの組合せは、本発明によってＨＣＶアッセイ方法で用いることができる。
【００７９】
本発明の細胞組成物は、ＨＣＶ感染させることができるイン・ビトロ細胞を供するのに有用であり、従って、ＨＣＶに罹った患者を治療するのに有用であり得る化合物の同定および迅速なスクリーニングのためのおよび／またはＨＣＶ感染に関連する研究のために有用なイン・ビトロ培養系を提供する。従って、好ましい具体例において、本発明の細胞組成物は、ＲＮＡ８９８、またはＲＮＡ８９８のＨＣＶ感染同等体と接触させることができる。ＲＮＡ８９８感染同等体は、本発明の方法に従って調製された組成物の４×１０４細胞をＨＣＶウイルスと接触させてから７２時間後に約５０００コピーを超える、約１００００コピーを超える、または約５００００コピーを超えるＨＣＶ ＲＮＡを生じさせることができるＲＮＡ８９８以外のＨＣＶ株である。１つの具体例によると、細胞は、ｃｍ２当たり約０．５２ｍｌの容量において、約３７℃で、本発明の組成物をＲＮＡ８９８または感染同等体と約２４時間接触させることによって感染させる。本発明の１つの具体例によると、ＨＣＶで感染させるべき細胞を細胞外マトリックスと共に培養する。本発明のもう１つの具体例において、細胞外マトリックスはフィーダー細胞（例えば、ＳＴＯ−（Ｒｅｉｄ９９）細胞）によって供される。
【００８０】
本発明の組成物における細胞から生じたＨＣＶの量は、例えば、ＨＣＶ蛋白質または核酸の生産を測定することによって決定することができる。
【００８１】
例えば、（その中またはそれに付着された）細胞および／または細胞が培養される培地に関連して見出されるＨＣＶ ＲＮＡのコピーの数を定量することができる。ＨＣＶ蛋白質または核酸分子が生産されたか否かを観察するために用いることができる当該分野で知られた技術がある。例えば、ＨＣＶ蛋白質に対して向けられた抗体でプローブされた蛋白質のウエスタンブロットまたはＨＣＶ核酸配列に対して相補的である標識核酸分子でプローブされたゲルのブロット０細胞および細胞培養基から蛋白質および核酸分子を抽出するための方法は、当該分野でよく知られており、この目的のためのキットは商業的に入手可能である。
【００８２】
本発明に従って生産されたＨＣＶ粒子のコピーの数をかなり正確に定量するためには、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が有用である。本発明の１つの具体例によると、ＲＴ−ＰＣＲ方法は、第２のウイルスまたは第２の核酸分子のいずれかの形態でアッセイされるべき細胞、細胞抽出物および／または培地の試料に加えられる既知の量の第２の核酸分子に対してその値と比較することによって、ＨＣＶ ＲＮＡのコピー数が決定されるように修飾される。第２のウイルスはＨＣＶに密接に関連するか、あるいは第２の核酸分子はＨＣＶ ＲＮＡに密接に関連する（すなわち、長さ、核酸の組成およびウイルスキャプシド構造が類似）のが望ましい。１つの具体例において、第２の核酸分子はフラビウイルスキャプシドにおけるものである。１つの具体例において、第２のＲＮＡ分子はウシウイルス下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）、例えば、ＢＶＤＶ ＮＡＤＬ株（ＡＴＣＣ受託番号：ＶＲ−５３４）からのＲＮＡである。
【００８３】
第２のウイルスまたは核酸分子の存在は、それが、第１の核酸分子の定量用の内部対照として働く点で有利である。この内部対照はランダム変動およびアッセイ変動のモニタリングおよび修正を可能とする。
【００８４】
例えば、本発明は：
１．該ＨＣＶを、既知の量のウシウイルス下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）と合わせ、ここに、該ＢＶＤＶは本発明の組成物と共に第２の核酸分子を含有し；
２．組成物の細胞、または細胞が培養される培地から、ＨＣＶに由来する第１の核酸分子およびＢＶＤＶに由来する第２の核酸分子を抽出して、組み合せた核酸抽出物を形成し；
３．該第１の核酸分子に対して特異的な第１の検出可能なプローブ、および該第２の核酸分子に対して特異的な第２の検出可能なプローブを、該組み合わせられた核酸抽出物に加え；
４．該組み合わせられた核酸抽出物をＰＣＲ手段によって増幅し；
５．該第１の検出可能なプローブおよび該第２の検出可能なプローブから独立して放出された検出可能なシグナルを、該増幅の間において種々のサイクルで定量し；
６．工程（ｅ）の結果を外挿し、該ＨＣＶにおける該第１の核酸分子の量、およびＢＶＤＶにおける該第２の核酸分子の量を計算し；次いで
７．工程（ｆ）における該第２の核酸の該計算された量を、工程（ａ）で用いた該第２の核酸の該既知の量と比較することによって、工程（ｆ）において決定された該第１の核酸分子の該計算された量の精度を評価する；
工程を含む方法を提供する。
【００８５】
もう１つの具体例によると、前記方法は、工程（ｆ）における該第２の核酸の該計算された量を工程（ａ）で用いた該第２の核酸の該既知の量と比較することによって決定されたファクターによって、工程（ｆ）において決定された該第１の核酸の該計算された量を調整するさらなる工程を含む。
【００８６】
もう１つの具体例によると、本発明は、ＨＣＶを投与する前または後に化合物を本発明の組成物に加え、引き続いて、組成物中の細胞および／または感染した細胞が培養される培地に関連するＨＣＶの存在を決定する工程を含む、ＨＣＶの生産に対する化合物の効果を決定する方法を提供する。もし該化合物がＨＣＶが組成物と接触された後に投与されるのを望むならば、ＨＣＶから１０日後以内に投与すべき化合物を組成物と接触させるのが好ましい。本発明に従ってテストすべき化合物はＨＣＶの生産を阻害し、または活性化することができる。従って、化合物はＨＣＶのライフサイクルのいずれかの段階を阻害して、その効果を達成することができる。そのような化合物の例は、限定されるものではないが、合成または精製された化学化合物、蛋白質および核酸分子を含む。化合物が加えられた試料は、同一条件下で処理されたものであるが、該化合物に暴露されていないか、またはＨＣＶ生産に対してほとんどまたは全く効果を有しないことが知られているもう１つの化合物に暴露された他の試料と比較することができる。
【００８７】
本発明の細胞集団をイン・ビトロスクリーニングアッセイで使用することが考えられ、そこでは、肝臓細胞のＨＣＶ感染に影響する剤がモニターされる。そのような方法はマルチウエル（例えば、９６−ウエル）プレートで行うことができる。該アッセイは、所望により、適当な培養基および適当な容器中にてフィーダー層と一緒に、本発明の細胞集団をインキュベートすることを含む。次いで、前記したように、細胞を適当なＨＣＶと接触させる。テスト化合物の存在下および不存在下におけるＨＣＶによる細胞の感染を評価する。種々の濃度の、テストすべきテスト化合物をウイルスの存在下および不存在下で細胞の共培養に加えることができると考えられる。さらに、細胞をウイルスの増殖細胞におけるいずれかの与えられた相においてテスト化合物に暴露することができる。例えば、いくつかの具体例において、細胞のウイルス感染が開始されたのと同時に（すなわち、ウイルスが加えられたのと同時に）ウイルス粒子を化合物に接触させるのが望ましいであろう。別法として、ウイルスライフサイクルにおける後の段階において（すなわち、細胞がウイルスで感染した状態となった後に）化合物を加えるのが好ましいであろう。さらに他の具体例において、ウイルスの添加に先立って細胞をテスト化合物と接触させて、テスト化合物がウイルスによる感染に対して予防効果を有するか否かを判断することができる。ウイルスのライフサイクルの特定の段階を決定するのは、当業者によく知られた方法を介して達成される。
【００８８】
種々の濃度の与えられたテスト化合物を、毒性効果が観察されないいくつかの濃度、および毒性効果が観察される少なくとも２以上のより高い濃度を含むことを目標として選択される。例えば、０マイクロモラーないし約３００マイクロモラーの範囲内のテスト化合物のいくつかの濃度をアッセイするのは、これらの目標を達成するのに通常は有用である。例えば、３５０マイクロモラー、４００マイクロモラー、４５０マイクロモラー、５００マイクロモラー、６００マイクロモラー、７００マイクロモラー、８００マイクロモラー、９００マイクロモラーのような３００マイクロモラーよりも高い濃度にて、あるいはマルチモラー濃度においてさえこれらのアッセイのあるものを行うのが可能であるか、あるいは望ましくさえある。化合物の見積もられた治療的に有効な濃度は、テストする濃度の上方範囲に関して最初のガイダンスを提供する。
【００８９】
アッセイの例示的な組においては、アッセイが行われるテスト化合物の濃度範囲は、アッセイ培地中の化合物の０．０５マイクロモラー、０．１マイクロモラー、１．０マイクロモラー、５．０マイクロモラー、１０．０マイクロモラー、２０．０マイクロモラー、５０．０マイクロモラー、１００マイクロモラー、および３００マイクロモラーの最終テスト化合物アッセイ濃度を生じる溶液の投与を含む。前記したように、これらは例示的な範囲であって、少なくとも４つの異なる濃度でいずれかの与えられたアッセイを行うことが考えられ、より好ましくは、濃度用量は、例えば、テストすべき化合物の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上の濃度を含むであろう。そのような濃度が、例えば、テスト組成物中の０．０５マイクロモラー、０．１マイクロモラー、０．５マイクロモラー、１．０マイクロモラー、２．０マイクロモラー、３．０マイクロモラー、４．０マイクロモラー、５．０マイクロモラー、１０．０マイクロモラー、１５．０マイクロモラー、２０．０マイクロモラー、２５．０マイクロモラー、３０．０マイクロモラー、３５．０マイクロモラー、４０．０マイクロモラー、４５．０マイクロモラー、５０．０マイクロモラー、５５．０マイクロモラー、６０．０マイクロモラー、６５．０マイクロモラー、７０．０マイクロモラー、７５．０マイクロモラー、８０．０マイクロモラー、８５．０マイクロモラー、９０．０マイクロモラー、９５．０マイクロモラー、１００マイクロモラー、１１０．０マイクロモラー、１２０．０マイクロモラー、１３０．０マイクロモラー、１４０．０マイクロモラー、１５０．０マイクロモラー、１６０．０マイクロモラー、１７０．０マイクロモラー、１８０．０マイクロモラー、１９０．０マイクロモラー、２００．０マイクロモラー、２１０．０マイクロモラー、２２０．０マイクロモラー、２３０．０マイクロモラー、２４０．０マイクロモラー、２５０．０マイクロモラー、２６０．０マイクロモラー、２７０．０マイクロモラー、２８０．０マイクロモラー、２９０．０マイクロモラー、および３００マイクロモラーの培地濃度を生じさせることができる。
【００９０】
テストすべき化合物は、天然に生じる化合物の断片または部分を含むことができるが、合理的な薬物設計スキームにより既に知られた化合物から誘導することができる。動物、細菌、真菌、葉および幹を含めた植物源および海洋試料のような天然の源から単離された化合物を、潜在的に言うような医薬組成物の存在についての候補としてアッセイすることができる。別法として、毒性につきスクリーニングすべき医薬抽出物合成することもできる（すなわち、人造化合物）。
【００９１】
モニターすべき化合物のタイプはとりわけ、抗ウイルス化合物、抗生物質、抗炎症化合物、抗うつ剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、利尿剤、抗高血圧化合物、抗不整脈薬物、抗癌、癌の治療用の化学療法化合物、抗微生物化合物であってよい。
【００９２】
細胞傷害性についてテストすべき化合物の源またはタイプにかかわらず、化合物の生物学的活性をモニターして、特定の化合物、または化合物の群の治療効果の適応症を供するのが必要であろう。もちろん、そのようなアッセイはテストすべき特定の治療適応症に依存するであろう。例示的な適応症は、ＨＣＶまたは他のウイルス感染を含む。
【００９３】
好ましい具体例において、本発明のアッセイは、薬物発見プログラムの一部として用いて、ＨＣＶ感染に対する増大した効果を持つ推定治療化合物を同定することができる。薬物の発見は、標的化治療領域において、有望性を示すある範囲の候補物質の同定で始まる。例示的な具体例において、ＶＸ−９５０のような例示的なコアまたは鋳型構造をさらなる薬物開発の努力のために用いることができる。他の構造は、同様に、合理的薬物設計を介して、抗−ＨＣＶ剤として設計された有用な特別な構造を提供する。一旦、鋳型が選択されれば、さらなる化学および構造活性分析を行って、化合物の効力を増加させる。このプロセスはリードプロセスを生じさせる。該プロセスのこの段階において本発明の方法を用いるスクリーニングを行って、これらの潜在的リード化合物に対する効力データを提供することができる。最高のリード化合物は、前臨床動物試験にエンターするように選択される。発見プロセスの初期に本発明の選択方法を取り込むと、この後期段階の間に失敗する化合物を大いに低下させる。
【００９４】
本発明の細胞集団に用いるイン・ビトロスクリーニングは薬物発見プログラムにおいていずれかの段階に使用することができるが、発見プロセスの初期に価値あることが判明するであろう。そのような分析から得られた情報は、化学者に、新しい鋳型における効力および効果を最大限とする適切な情報を与える。これらの方法を用い、推定治療化合物を、その相対的結合効果に基づいてランク付けし、または優先順位をつけることができ、同一治療またはクラスにおける既知の薬物と比較することができる。
【００９５】
ＶＳ−９５０は新しい抗−ＨＣＶ剤のための参照化合物として用いることができよう。
ＶＳ−９５０の構造
【化１】
【００９６】
本発明の細胞集団を用いて、効率につき多数の化合物をスクリーニングするための高スループットアッセイは特に考えられる。
【００９７】
ある具体例においては、高スループットスクリーニングを自動化することができる。高スループットスクリーニングアッセイにおいては、化合物の群を、ＨＣＶに感染させた本発明の細胞を含む細胞培養、およびＨＣＶに暴露されていない同様な培養に暴露させる。化合物のこれらの群は、以前個々に調製された化合物のコレクションから組み立てることができ、化合物バンクに貯蔵されているので、該組み立てはランダムなものであって、あるいは、同様な構造が形成された同様性プログラムを用いることによってガイドされる。
【００９８】
加えて、化合物のライブラリーおよび／またはアレイの慎重な調製および使用において迅速な成長もあった。各ライブラリーは、酵素または受容体のような生物学的標的に対してスクリーニングされる多数の化合物を含有する。生物学的ヒットが見出されると、該ヒットの原因となる化合物を同定する。そのような化合物またはリードは、一般に、スクリーニングにおいて比較的弱い活性を呈するが、より伝統的な医薬化学プログラムの実行のための基礎を形成して、活性を増強させる。ライブラリーはコンビナトーリアル化学の迅速に発展する技術を用いて、または平行した合成によって調製することができる（DeWitt et al, Proc Natl Acad Sci, 90, 6909, 1993; Jung et al, Angew Chem Int Ed Engl, 31:367-83, 1992; Pavia et al., Bioorg Med Chem Lett, 3:387-96, 1993）。
【００９９】
別法として、スクリーニングすべき化合物は、例えば、前記したＶＸ−９５０構造のような通常の鋳型またはコア構造にもとづいてライブラリーを形成することができる。そのような技術は、例えば、ＷＯ ９５／３２１８４（オキサゾロンおよびアミニジン鋳型）、ＷＯ ９５／３０６４２（ジヒドロベンゾピラン鋳型）およびＷＯ ９５／３５２７８（ピロリジン鋳型）に記載されている。該鋳型は、その各々を、段階的な様式で、多数の異なる試薬、例えば５つの試薬と反応させて、置換基の５×５×５の異なる組合せを導入し、１２５の成分を含有するライブラリーを与えることができる多数の機能的部位、例えば３つの機能的部位を有するであろう。該ライブラリーは、通常、置換基の全ての、または実質的に全ての可能な組合せを含むであろう。該鋳型は、例えば、ベンゾジアゼピン環のような既知のファルマコフォアを取り込む「偏った」鋳型、あるいは「偏っていない」鋳型であってよく、その選択は生物学的考慮よりも化学によってより影響される。
【０１００】
かくして、本発明の細胞集団および方法を用いて、薬物発見のためのリード化合物を同定することができる。前記したライブラリースクリーニングに加えて、そのようなリード化合物は、実験室において個々に作成された単一合成化合物のランダム交差スクリーニングによって、または微生物代謝産物、海洋海綿および植物のような天然産物源から得られた抽出物をスクリーニングすることによって作り出すことができる。
【０１０１】
もう１つの代替法において、化合物は、既知の生物学的に活性な化合物の構造および／または生物学的作用のその部位に基づいて合理的薬物設計を通じて作り出すことができる。これは、今回、コンピュータ−援助薬物設計の強力な技術によって実行された。合理的薬物設計の目標は、注目する生物学的に活性な分子の構造的アナログを作り出すことである。そのような技術は、本発明を用いて抗−ＨＣＶ活性につきスクリーニングすることができる特定の適用症につき潜在的に数千の化合物を生じるであろう。
【０１０２】
１つの具体例によると、前記方法を用いて、ＨＣＶ集団に対する複数の化合物の影響を同時にスクリーニングする。例えば、９６−ウエルプレートの各ウエルは、本発明の方法に従ってスクリーニングされるべき異なる化合物を含有し得る。さらなる具体例において、本発明の方法を用いて、ＨＣＶの生産を阻害する化合物を同定する。
【０１０３】
１つの具体例において、本発明の方法で用いるプライマーおよびプローブは、ＨＣＶ株の最も保存された領域に基づいて設計される。また、以下のさらなる基準に基づいてプローブを構築することもできる；ａ）プローブの融解温度はプライマーのそれよりも８℃ないし１０℃高い；ｂ）５’末端にＧは存在しない；ｃ）４を超えるＧのストレッチはない；および／またはｄ）プローブは高い融解温度をもつ内部構造を形成しないか、あるいはそれ自体とで、あるいはプライマーのいずれかとでデュプレックスを形成する。１つの具体例において、全ＰＣＲ領域は長さが約１５０塩基対であった。
【０１０４】
ＢＶＤＶの５’ＵＴＲについての有用なプライマーおよびプローブは同一の基準の組に基づいて設計することができる。加えて、ＨＣＶのプライマーまたはプローブはＢＶＤＶのそれに対して最小量の相同性を有することを確認するよう注意した。プライマーおよびプローブは、修飾された核酸分子を合成し、調製する商業的源から得ることができる（例えば、ＯｌｉｇｏおよびＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＢＶＤＶはＭＤＢＫ細胞の感染によって維持することができる。
【０１０５】
本発明の１つの具体例において、２つの異なるデュアル標識発蛍光性プローブを用い、各々は、ＨＣＶ核酸分子および第２の核酸分子の他方を除いて一方に対して特異的である。さらなる具体例において、各発蛍光性プローブは、典型的には、５’末端におけるレポーター色素および３’末端におけるクエンチャー色素を有する。２つの異なる発蛍光性プローブは、２つのピークの間で交差干渉なくして検出することができる区別される蛍光ピークをそれらが与えるように選択される。例えば、先に議論したように、第１の検出可能なプローブの５’末端は６カルボキシフルオレセイン（「６ＦＡＮ」）のようなレポーター色素で標識することができ、第２の検出可能なプローブの５’末端はＶＩＣのようなレポーター色素で標識することができる。双方の検出可能なプローブの３’末端は６カルボキシメチルローダミン（「６ＰＡＭＲＡ」）のようなクエンチャー色素で標識することができる。従って、第１の核酸および第２の核酸に結合すると、プローブの３’末端におけるクエンチャー色素に対する５’末端におけるレポーター色素の近接性の結果、蛍光の抑制がもたらされる。増幅の間、Ｔ番目のポリメラーゼが核酸配列にそって移動すると、クエンチャーは５’３’エキソの作用によってプローブから除去され、それにより、発蛍光性プローブを分解する。その結果、蛍光が発せられ、これは増幅サイクルの関数として記録される。従って、蛍光発光をモニターすると、リアルタイム増幅キネティックスを測定するための基礎が提供される。
【０１０６】
ＨＣＶ遺伝子型１についての有用なプライマーおよびプローブの例は（配列番号：１）５’ＣＣＡＴＧＡＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧ ３’（順方向プライマー）、（配列番号：２）５’ＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣ ３’（逆方向プライマー），およびＨＣＶプローブ、（配列番号：５）５’６ ＦＡＭ−ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ ３’である。ＢＶＤＶについてのプライマーおよびプローブは順方向プライマー、（配列番号：３）５’−ＣＡＧＧＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＧ−３’、逆方向プライマー、（配列番号：４）５’−ＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣ−３’、およびプローブ、５’ ＶＩＣ （配列番号：６）−ＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣＡＴＣＴＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ ３’よりなるものである。
【０１０７】
ＲＴおよびＰＣＲ反応は、キャップ付きの９６ウエルプレート光学トロイの同一ウエルで行うことができる（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）。本発明の１つの具体例において、多重ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いる（すなわち、同一チューブ中で２つの異なるＲＮＡ種、例えば、ＨＣＶ ＲＮＡおよびＢＶＤＶ ＲＮＡを同時に増幅し測定するＲＴ−ＰＣＲ反応）。該多重反応は、もしＨＣＶ陰性の結果が、培養が真に陰性であるか、あるいは抽出またはＲＴ−ＰＣＲ工程において何らかの技術的失敗があったという事実によるものか実行者が決定することができる利点を有する。１０または２０μｌのウイルスＲＮＡまたはＲＮＡ標準を、１ＸＴａｑｍａｎ緩衝液（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、各々３００ ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ，およびｄＵＴＰ、５ユニットのＴ番目ポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、４．０％増強剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）、ある濃度のプローブおよびプライマーを含む５０ｕｌのＲＴ−ＰＣＴ反応で増幅することができる。Ｔａｑｍａｎ ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、６０℃にて２５分間（ＲＴ）、９５℃にて５分間、続いて、４５サイクルの２−工程ＰＣＲ反応（１分間の６０℃、および１５秒間の９５℃）を行うことができる。ＨＣＶおよびもう１つの核酸を用いるアッセイ（多重）Ｔａｑｍａｎアッセイでは、種々の濃度のプライマーの双方の組のマトリックス混合物を用い、ＨＣＶおよびＢＶＤＶプライマーの量を最適化することができる。最終アッセイ溶液は、２０ｍＭの６−ＦＡＮ−標識ＨＣＶプローブおよびＶＩＣ−標識ＢＶＤＶプローブ双方、４００ｎＭの双方のＨＣＶプライマー、および４５ｎＭの双方のＢＶＤＶプライマーを含む。
【０１０８】
明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」、または「を含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、いずれかのため整数または整数の群を排除するものではないと理解されるであろう。
【０１０９】
２００１年３月２７２に出願された米国仮出願第６０／２７９，１７４号および米国特許出願第２００２０１４２４４９およびそこで引用された論文をここに引用して援用する。
【０１１０】
本発明の多数の具体例を示してきたが、基本的な工程を変化させて、本発明の組成物および方法を利用する他の具体例を提供できることが明らかであろう。従って、本発明の範囲は、ここに例示された特別な具体例よりはむしろ特許請求の範囲または明細書によって定義されるべきだと認識されるであろう。
【０１１１】
本発明の実施に関連する一般的方法は、ＷＯ０２／０７７２０６に見出すことができる。肝臓細胞の単離および低温保存についての一般的方法に関しては、Mitry, R. R., Hughes, R. D., and Dhawan, A. (2002)。Progress in human hepatocytes: isolation, culture & cryopreservation. Cell & Developmental Biology 13, 463-467。（ラットからの）胎児肝臓細胞単離についての詳細な方法に関してはArahyetes, R. M., Sierra, E., Codesal, J., Barrutia, M. S. G., Arza, E., Cubero, J., Ortiz, A., and Magnanto, P. (2001)。Optimization of the technique to isolate fetal hepatocytes, and assessment of their functionality by transplantation. Life Sciences 68, 763-772参照。
【０１１２】
一旦スクリーニングアッセイが適切な抗ＨＣＶ剤を同定したならば、該剤を医薬組成物として処方することができ、さらに、ＨＣＶ感染について、イン・ビトロモデルでテストすることができる。
【０１１３】
本発明のある態様においては、選択およびスクリーニングアッセイを行うための全ての必要成分は、キットにパッケージングすることができる。具体的には、本発明は、アッセイを含むための試薬のパッケージされた組、ならびにテストまたは参照化合物、該試薬を用いて本発明のアッセイの１以上の変形を行うための試薬がパッケージされた指示書を含むそのようなアッセイで用いられるキットを提供する。
【０１１４】
指示は、印刷された紙、またはコンピューターリーダブル磁性または光学媒体のようないずれかの有形媒体、またはインターネットを介してアクセスできるワールドワイドウエブページのような遠隔コンピュータデータ源を参照する指示書に固定することができる。
本発明で引用した書類の全ては、ここに引用して援用する。
【実施例】
【０１１５】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すために含める。本発明の実施でよく機能することが発明者らによって発見された技術を以下に表す実施例に開示された技術は、従って、その実施のための好ましい形態を構成すると考えることができるのは当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示され、なお同様な結果を得る特別な具体例において多くの変形をなすことができるのを認識するであろう。
【０１１６】
実施例１
低温保存
ヒト胎児肝臓細胞はコラゲナーゼ消化、７０ｕｍフィルターを通す濾過、および３回の低速遠心によって単離した。細胞を１０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭに２×１０６／ｍｌまで懸濁させ、制御速度フリージングによって凍結した。３７℃の水浴中へ、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の懸濁液を浸漬することによって細胞のバイアルを解凍し、低速遠心によってペレット化し、１０ｍｌのＤＭＥＭ １０％ＦＣＳに再度懸濁させ、コラーゲン被覆プラスチックに一晩付着させた。非−接着性細胞を単層を穏和にすすぐことによって除去し、次いで、ホルモン的に規定された培地によって培地を置き換えた。１０×対物レンズおよびＨｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔオプティックスを用いて顕微鏡写真を撮った。図１参照。
【０１１７】
実施例２
タイムコース分析
低温保存したヒト胎児肝臓細胞を解凍し、コラーゲン被覆９６−ウエルプレートのウエルに一晩接着させた。非−接着性細胞を除去し、ＤＭＥＭ、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、およびヒドロコルチゾンを含有するホルモン的に規定された培地（ＨＤＭ２）で培地を置き換えた。細胞をＨＣＶウイルスで接種し、３７℃にて８時間インキュベートした。非−吸着ウイルスを除去し、培養をＨＤＭ２で２回洗浄し、次いで、新鮮なＨＤＭ２を加えた。示された接種の後（接種開始後）、４ウエルをＰＢＳで２回すすぎ、次いで、細胞をカオトロピック緩衝液で溶解させ、Ｑｉａｇｅｎ９６−ウエルＲＮｅａｓｙ手法を用いてＲＮＡを単離した。多重ＲＴ−ＰＣＲを用いてＨＣＶ ＲＮＡを定量し、四連試料（ウエル当たりのＨＣＶコピー数）の平均および標準偏差を求める。ダネット検定での結果の分析は、接種後４６および５６時間に収穫された試料は、２２時間の時点より早い時点より有意に多いＨＣＶ ＲＮＡを含有することを示した。図２参照。
【０１１８】
実施例３
ＨＣＶ感染の阻害
低温保存したヒト胎児肝臓細胞を解凍し、コラーゲン被覆９６−ウエルプレートのウエルに３７℃にて６時間接着させた。非−接着性細胞を除去し、ＤＭＥＭ、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、およびコルチゾンを含有するホルモン的に規定された培地（ＨＤＭ２）で培地を置き換えた。異なる濃度のＶＸ−９５０の存在下でウエルをＨＣＶで接種し、３７℃にて１５時間インキュベートした。非−吸着ウイルスを除去し、培養をＤＭＥＭで２回洗浄し、次いで、同一濃度のＶＸ−９５０を含有する新鮮なＨＤＭ２を加えた。さらに４７時間のインキュベーションの後、ウエルをＰＢＳで２回すすぎ、次いで、カオトロピック緩衝液で細胞を溶解させ、Ｑｉａｇｅｎ９６−ウエルＲＮｅａｓｙ手法を用いてＲＮＡを単離した。多重ＲＴ−ＰＣＲ方法を用いて、ＨＣＶ ＲＮＡを定量し、各濃度の阻害剤における三連試料の平均および標準偏差を表す（ウエル当たりのＨＣＶコピー数）。０．２ｕＭ以上のＶＸ−９５０の濃度は、ほとんど完全なＨＣＶ複製の阻害を示した。図３参照。
【０１１９】
本明細書中に開示し、特許請求する組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして過度な実験を行うことなく為し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい具体例にて記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、種々の変形を、組成物および／または方法、および工程、または方法の工程の系列に適用できるのは当業者に明であろう。より具体的には、化学的におよび生理学的に関連するある種の剤は本明細書中に記載した剤に代えて置き換えることができ、他方、同一または類似の結果を達成するであろうことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような同様な代替法および修飾は、添付の請求の範囲によって定義される発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０１２０】
本明細書を通じて引用された文献は、本明細書中に記載されたものを補足する例示的手法または他の詳細を供する程度に、全て、ここに引用して援用される。
【０１２１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の態様をさらに説明することを意図する。本発明は、ここに示した特別な具体例の詳細な記載と組み合わされて、図面を参照することによって良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、解凍、およびコラーゲン−被覆組織培養ウエルへの付着後における低温保存したヒト胎児肝臓細胞を示す。低温保存した胎児肝臓細胞を解凍し、付着から５時間（図１Ａ）または２４時間（図１Ｂ）後に、ホルモン的に規定された培地中で、コラーゲンＩ被覆組織培養皿で培養した。代表的な顕微鏡視野を示す。４０×対物レンズ、Hoffman Differentialオプティックス。
【図２】図２は、低温保存したヒト胎児肝臓細胞の感染後における細胞関連ＨＣＶ ＲＮＡの増加のタイムコースを示す。
【図３】図３は、ＨＣＶ ＮＳ３・４ａプロテアーゼ阻害剤ＶＸ−９５０による低温保存ヒト胎児肝臓細胞のＨＣＶ感染の阻害を示す（ＷＯ０２／１８３６９参照）。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から単離された肝細胞および造血細胞を含む低温保存細胞混合物を含む組成物であって、ここに、培養基中でのフィーダー細胞系の存在下における該低温保存細胞混合物の４×１０４解凍細胞を含む調製物が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ウイルスＲＮＡ８９８の該調製物への投与から７２時間後に該培地中において約５０００を超えるコピーのＨＣＶ ＲＮＡを生じることを特徴とする該組成物。
【請求項２】
該組成物が、４×１０４細胞を含む調製物へのＲＮＡ８９８の投与から７２時間後に約１０，０００コピーを超えるＨＣＶ ＲＮＡを生じる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該組成物が、４×１０４細胞を含む調製物へのＲＮＡ８９８の投与から７２時間後に約５０，０００コピーを超えるＨＣＶ ＲＮＡを生じる請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
該フィーダー細胞がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, VA 201110 2209 に２００１年３月２７日に寄託されたＳＰＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞（「ＳＰＯ（Ｒｅｉｄ ９９）」）；ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−３２３６である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
以下の：
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処置することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の妊娠後ヒト３月齢以降からの肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は、４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ、肝臓細胞の該懸濁液は赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）肝臓細胞の該懸濁液を１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清に再懸濁させ；
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を低温保存し；
（ｄ）工程（ｃ）の組成物を解凍し；
（ｅ）工程（ｆ）の細胞を、カルシウム、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、ニコチンアミド、微量元素、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含みおよび、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミン、およびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｆ）工程（ｅ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項６】
以下の：
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ、肝臓細胞の該懸濁液は赤血球細胞を含有せず、
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＢＳＡ、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、および、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子。エタノールアミン、およびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｃ）工程（ｂ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項７】
さらに、
（ｄ）工程（ａ）の細胞を、工程（ｂ）に先立って、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む懸濁液中で低温保存し；次いで、
（ｅ）工程（ｄ）における再懸濁に先立って工程（ｄ）の組成物を解凍することを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
肝臓細胞の該懸濁液が、ＥＧＴＡを含む緩衝液中で妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を切り裂くことによって得られる請求項５または６記載の組成物。
【請求項９】
ＥＧＴＡを含む該懸濁液が、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択されるプロテアーゼを含む緩衝液で補足された、または置き換えられた請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
ＥＧＴＡを含む該懸濁液が、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択される２以上のプロテアーゼのカクテルを含む緩衝液で補足された、または置き換えられた請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
ＥＧＴＡを含む該懸濁液が、さらに、組織の炭水化物成分を破壊するための酵素を含み、該酵素はヒアルロニダーゼおよびノイラミニターゼよりなる群から選択される請求項９または１０記載の組成物。
【請求項１２】
以下の：
（ａ）妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を、ＥＧＴＡを含む緩衝液中で切り裂き；
（ｂ）コラゲナーゼを含む緩衝液中で切り裂かれた肝臓をインキュベートして、該肝臓から細胞を分離し；
（ｃ）分離された細胞から４０ミクロン以上の物体を除去し、分離された細胞から赤血球細胞を除去し、
（ｅ）１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清に該細胞を再懸濁させ；
（ｆ）工程５の組成物を低温保存し；
（ｇ）工程６の組成物を解凍し；
（ｈ）工程（ｆ）の細胞を、カルシウム、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、ニコチンアミド、微量元素、表皮細胞、成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、および、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子。エタノールアミン、およびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｉ）工程（ｅ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項１３】
以下の；
（ａ）妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を、ＥＧＴＡを含む緩衝液中で切り裂き；
（ｂ）該切り裂かれた肝臓をコラゲナーゼを含む緩衝液中でインキュベートして、肝臓から細胞を分離し；
（ｃ）分離された細胞から４０ミクロン以上の物体を除去し、
（ｄ）分離された細胞から赤血球細胞を除去し；
（ｅ）工程（ｄ）の細胞を、ＢＳＡニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、および、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｆ）工程（ｅ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項１４】
さらに、工程（ｄ）および（ｅ）の間に工程；
（ｇ）工程（ｄ）の細胞を１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清に再懸濁し；
（ｈ）工程（ｅ）の組成物を低温保存し、次いで；
（ｉ）工程ｈの組成物を解凍する；
ことを含む請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
該組成物がさらに、ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ９９）細胞を含む請求項５ないし請求項１４いずれか１記載の組成物。
【請求項１６】
細胞混合物中の細胞が４０ミクロンフィルターを通過することができる請求項１ないし１５いずれか１記載の組成物。
【請求項１７】
該細胞混合物がアルファフェトプロテインを発現する細胞、アルブミンを発現する細胞およびグリコホリンを発現する細胞を含むが、ＣＤ３４蛋白質を発現する細胞を実質的に含まない請求項１ないし１６いずれか１記載の組成物。
【請求項１８】
妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された肝臓細胞および造血細胞の拡大培養された混合細胞集団を含む組成物であって、該混合細胞集団はＣＤ３４＋を発現する細胞を排除するように選択されるが、アルファフェトプロテイン、アルブミンおよびグリコホリンを発現する細胞を含むことを特徴とする該組成物。
【請求項１９】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の細胞に由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳはＣＤ３４−細胞を選択する請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳがアルブミン＋細胞を選択する請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳがアルファフェトプロテイン＋細胞を選択する請求項１９または２０記載の組成物。
【請求項２２】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳが糖蛋白質＋細胞を選択する請求項１９ないし２１いずれか１記載の組成物。
【請求項２３】
さらに、以下の成分：ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む培養基を含む請求項１ないし２２いずれか１記載の組成物。
【請求項２４】
該培養基が低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まず；および／または該培養基がカルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、微量元素、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミン、またはチロトロピン放出因子を含有せず；および／または該培養基が無血清である請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
細胞外マトリックスをさらに含む請求項１ないし２４いずれか１記載の組成物。
【請求項２６】
ＣＤ３４蛋白質の存在が、免疫蛍光または免疫ペルオキシダーゼ染色から選択される手法によって検出される請求項１ないし２５いずれか１記載の組成物。
【請求項２７】
さらに、ＨＣＶを含む請求項１ないし２６いずれか１記載の組成物。
【請求項２８】
該ＨＣＶがＲＮＡ８９８である請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
培地、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、およびヒドロクロチゾンを含み、および、所望により、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まず、および所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３０】
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ肝臓細胞に該懸濁液は赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物中の工程（ａ）の懸濁液の細胞を低温保存し；
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を解凍し；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞を、カルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、ニコチンアミド、微量元素、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ヒドロクロチゾンを含み、所望により、さらに、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つをさらに含む無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｅ）工程（ｄ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程を含むことを特徴とする、細胞混合物を単離し、培養する方法。
【請求項３１】
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ肝臓細胞の該懸濁液は赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンを含む培地に再懸濁させ；次いで
（ｃ）工程（ｂ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程を含むことを特徴とする、細胞混合物を単離し、培養する方法。
【請求項３２】
さらに、工程（ａ）および（ｂ）の間に工程：
（ｄ）１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物中で、工程（ａ）の懸濁液の細胞を低温保存し；次いで、
（ｅ）工程（ｂ）に先立って工程（ｄ）の低温保存された細胞を解凍する；
ことを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
肝臓細胞の該懸濁液が、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓をＥＧＴＡを含む緩衝液中で切り裂くことによって工程（ａ）で得られる請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３４】
ＥＧＴＡを含む該緩衝液がプロテアーゼ含有緩衝液で補足されまたは置き換えられ、ここに、該プロテアーゼはコラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＥＧＴＡを含む該緩衝液がプロテアーゼ含有緩衝液で補足されまたは置き換えられ、ここに、該プロテアーゼはコラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択される２以上のプロテアーゼを含む請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
ＥＧＴＡを含む該緩衝液は、さらに、組織の炭水化物成分を破壊するための酵素を含み、該酵素がヒアルロニダーゼ、およびノイラミニダーゼよりなる群から選択される請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
該赤血球細胞が、懸濁化された細胞を低速（５０×ｇ）で遠心して、より大きな細胞をほぼ３ないし４分間でペレット化し、ペレット化する細胞を洗浄し、次いで、遠心および洗浄工程を反復することによって除去される請求項３０ないし３６いずれか１記載の方法。
【請求項３８】
該培地が低密度リポ蛋白質（ＮＤＬ）を含有せず；および／または培地がカルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、または微量元素を含有せず；および／または培地がグルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンまたはチロトロピン放出因子を含有せず；および／または培地は無血清培地ではない請求項３０ないし３７いずれか１記載の方法。
【請求項３９】
請求項１ないし２９いずれか１記載の組成物、または請求項３０ないし３８いずれか１に従って調製された細胞混合物を、ＨＣＶウイルスＲＮＡ８９８またはその感染性同等物と接触させる工程を含む、細胞をＨＣＶで感染させる方法。
【請求項４０】
ＨＣＶウイルスを組成物に加え、組成物中の細胞を洗浄するに先立って、ｃｍ２当たり約０．５２ｍｌの容量にて、約３７℃で２４時間インキュベートする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項１ないし２９いずれか１記載の組成物、または請求項３０ないし３６いずれか１記載の細胞混合物を、フィーダー細胞と共にインキュベートし；
（ｂ）該組成物をＲＮＡ８９８またはその感染性同等物と接触させ；次いで、
（ｃ）組成物の細胞、細胞が培養された培地、または細胞および培地双方と関連するＨＣＶ ＲＮＡの存在を測定する；
工程を含む、ＨＣＶ感染をアッセイする方法。
【請求項４２】
該フィーダー細胞がＳＴＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＨＣＶ ＲＮＡの量が、（ａ）該細胞、または細胞が（ｂ）と共に培養された培地と関連する存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を、（ｂ）内部対照として用いられる第２のウイルスからのＲＮＡの量と比較することによって測定される請求項４１または請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該第２のウイルスＲＮＡがウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）請求項１ないし２９いずれか１記載の組成物、または請求項３０ないし３６いずれか１記載の細胞混合物を、フィーダー細胞と共にインキュベートし；
（ｂ）組成物中の細胞をＲＮＡ８９８と接触させ；
（ｃ）細胞をＲＮＡ８９８またはその感染性同等物と接触させる前または後に、化合物を組成物に投与し；次いで、
（ｄ）該細胞、該細胞が培養された培地、または該細胞および該培地双方と関連するＨＣＶを測定する；
工程を含む、ＨＣＶの生産に影響する化合物の能力を評価する方法。
【請求項４６】
該化合物がＨＣＶ生産を阻害する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
複数の化合物が、ＨＣＶ生産を阻害するその能力について同時にスクリーニングされる請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｄ）の測定を、対照細胞、対照細胞が培養された培地、または対照細胞および培地の双方に関連するＨＣＶの量と比較するさらなる工程を含み、ここに、化合物が投下されていないか、または既知の不活性化合物が投与されていることを除いて、該対照細胞が工程（ａ）ないし（ｄ）に付されている請求項４５ないし４７いずれか１記載の方法。
【請求項４９】
該フィーダー細胞がＳＴＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞である請求項４５ないし４８いずれか１記載の方法。
【請求項５０】
ＨＣＶの存在が、細胞、または該細胞が培養された培地に関連するＨＣＶ ＲＮＡの量を決定することによって測定される請求項４５ないし４９いずれか１記載の方法。
【請求項５１】
ＨＣＶ ＲＮＡの量が逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）によって決定される請求項４５ないし５０いずれか１記載の方法。
【請求項５２】
ＨＣＶ ＲＮＡの量が、（ａ）細胞、または細胞が培養された培地に関連するＨＣＶ ＲＮＡの量を、（ｂ）内部対照として用いられた第２のウイルスからのＲＮＡの量と比較することによって測定される請求項４５ないし５１いずれか１記載の方法。
【請求項５３】
第２のウイルスがウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である請求項４５ないし５２いずれか１記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ肝臓細胞の該懸濁液が赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）肝臓細胞の該懸濁液からＣＤ３４−／アルファフェトプロテイン＋／糖蛋白質＋／アルブミン＋細胞を単離し；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を、ＢＳＡ、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含有する培地に再懸濁させ；次いで、
（ｄ）工程（ｃ）からの該細胞を、フィーダー細胞を含む培地中で共培養して、肝臓細胞の該集団を拡大培養する；
ことを特徴とする、肝臓細胞の混合集団を調製する方法。
【請求項５５】
工程（ａ）の懸濁液の細胞、または工程（ｂ）後に単離された細胞を、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物中で低温保存し；次いで、工程（ｃ）に先立って該低温保存した細胞を解凍する請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
肝臓細胞の該懸濁液からのＣＤ３４−／アルファフェトプロテイン＋／糖蛋白質＋／アルブミン＋細胞の該単離が、ＦＡＣＳを用いて該肝臓細胞をソーティングすることを含む請求項５４記載の方法。
【請求項１】
妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から単離された肝細胞および造血細胞を含む低温保存細胞混合物を含む組成物であって、ここに、培養基中でのフィーダー細胞系の存在下における該低温保存細胞混合物の４×１０４解凍細胞を含む調製物が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ウイルスＲＮＡ８９８の該調製物への投与から７２時間後に該培地中において約５０００を超えるコピーのＨＣＶ ＲＮＡを生じることを特徴とする該組成物。
【請求項２】
該組成物が、４×１０４細胞を含む調製物へのＲＮＡ８９８の投与から７２時間後に約１０，０００コピーを超えるＨＣＶ ＲＮＡを生じる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該組成物が、４×１０４細胞を含む調製物へのＲＮＡ８９８の投与から７２時間後に約５０，０００コピーを超えるＨＣＶ ＲＮＡを生じる請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
該フィーダー細胞がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, VA 201110 2209 に２００１年３月２７日に寄託されたＳＰＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞（「ＳＰＯ（Ｒｅｉｄ ９９）」）；ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−３２３６である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
以下の：
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処置することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の妊娠後ヒト３月齢以降からの肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は、４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ、肝臓細胞の該懸濁液は赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）肝臓細胞の該懸濁液を１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清に再懸濁させ；
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を低温保存し；
（ｄ）工程（ｃ）の組成物を解凍し；
（ｅ）工程（ｆ）の細胞を、カルシウム、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、ニコチンアミド、微量元素、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含みおよび、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミン、およびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｆ）工程（ｅ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項６】
以下の：
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ、肝臓細胞の該懸濁液は赤血球細胞を含有せず、
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＢＳＡ、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、および、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子。エタノールアミン、およびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｃ）工程（ｂ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項７】
さらに、
（ｄ）工程（ａ）の細胞を、工程（ｂ）に先立って、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む懸濁液中で低温保存し；次いで、
（ｅ）工程（ｄ）における再懸濁に先立って工程（ｄ）の組成物を解凍することを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
肝臓細胞の該懸濁液が、ＥＧＴＡを含む緩衝液中で妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を切り裂くことによって得られる請求項５または６記載の組成物。
【請求項９】
ＥＧＴＡを含む該懸濁液が、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択されるプロテアーゼを含む緩衝液で補足された、または置き換えられた請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
ＥＧＴＡを含む該懸濁液が、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択される２以上のプロテアーゼのカクテルを含む緩衝液で補足された、または置き換えられた請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
ＥＧＴＡを含む該懸濁液が、さらに、組織の炭水化物成分を破壊するための酵素を含み、該酵素はヒアルロニダーゼおよびノイラミニターゼよりなる群から選択される請求項９または１０記載の組成物。
【請求項１２】
以下の：
（ａ）妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を、ＥＧＴＡを含む緩衝液中で切り裂き；
（ｂ）コラゲナーゼを含む緩衝液中で切り裂かれた肝臓をインキュベートして、該肝臓から細胞を分離し；
（ｃ）分離された細胞から４０ミクロン以上の物体を除去し、分離された細胞から赤血球細胞を除去し、
（ｅ）１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清に該細胞を再懸濁させ；
（ｆ）工程５の組成物を低温保存し；
（ｇ）工程６の組成物を解凍し；
（ｈ）工程（ｆ）の細胞を、カルシウム、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、ニコチンアミド、微量元素、表皮細胞、成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、および、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子。エタノールアミン、およびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｉ）工程（ｅ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項１３】
以下の；
（ａ）妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓を、ＥＧＴＡを含む緩衝液中で切り裂き；
（ｂ）該切り裂かれた肝臓をコラゲナーゼを含む緩衝液中でインキュベートして、肝臓から細胞を分離し；
（ｃ）分離された細胞から４０ミクロン以上の物体を除去し、
（ｄ）分離された細胞から赤血球細胞を除去し；
（ｅ）工程（ｄ）の細胞を、ＢＳＡニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、および、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含んでもよい無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｆ）工程（ｅ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程によって調製された細胞混合物を含む組成物。
【請求項１４】
さらに、工程（ｄ）および（ｅ）の間に工程；
（ｇ）工程（ｄ）の細胞を１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清に再懸濁し；
（ｈ）工程（ｅ）の組成物を低温保存し、次いで；
（ｉ）工程ｈの組成物を解凍する；
ことを含む請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
該組成物がさらに、ＳＴＯ（Ｒｅｉｄ９９）細胞を含む請求項５ないし請求項１４いずれか１記載の組成物。
【請求項１６】
細胞混合物中の細胞が４０ミクロンフィルターを通過することができる請求項１ないし１５いずれか１記載の組成物。
【請求項１７】
該細胞混合物がアルファフェトプロテインを発現する細胞、アルブミンを発現する細胞およびグリコホリンを発現する細胞を含むが、ＣＤ３４蛋白質を発現する細胞を実質的に含まない請求項１ないし１６いずれか１記載の組成物。
【請求項１８】
妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から放出された肝臓細胞および造血細胞の拡大培養された混合細胞集団を含む組成物であって、該混合細胞集団はＣＤ３４＋を発現する細胞を排除するように選択されるが、アルファフェトプロテイン、アルブミンおよびグリコホリンを発現する細胞を含むことを特徴とする該組成物。
【請求項１９】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の細胞に由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳはＣＤ３４−細胞を選択する請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳがアルブミン＋細胞を選択する請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳがアルファフェトプロテイン＋細胞を選択する請求項１９または２０記載の組成物。
【請求項２２】
該混合細胞集団が、蛍光活性化スキャニング（ＦＡＣＳ）を用いて、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓から由来する細胞組成物から細胞集団を単離して調製され、ここに、該ＦＡＣＳが糖蛋白質＋細胞を選択する請求項１９ないし２１いずれか１記載の組成物。
【請求項２３】
さらに、以下の成分：ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む培養基を含む請求項１ないし２２いずれか１記載の組成物。
【請求項２４】
該培養基が低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まず；および／または該培養基がカルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、微量元素、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミン、またはチロトロピン放出因子を含有せず；および／または該培養基が無血清である請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
細胞外マトリックスをさらに含む請求項１ないし２４いずれか１記載の組成物。
【請求項２６】
ＣＤ３４蛋白質の存在が、免疫蛍光または免疫ペルオキシダーゼ染色から選択される手法によって検出される請求項１ないし２５いずれか１記載の組成物。
【請求項２７】
さらに、ＨＣＶを含む請求項１ないし２６いずれか１記載の組成物。
【請求項２８】
該ＨＣＶがＲＮＡ８９８である請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
培地、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、およびヒドロクロチゾンを含み、および、所望により、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を含まず、および所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３０】
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ肝臓細胞に該懸濁液は赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物中の工程（ａ）の懸濁液の細胞を低温保存し；
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を解凍し；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞を、カルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、ニコチンアミド、微量元素、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ヒドロクロチゾンを含み、所望により、さらに、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つをさらに含む無血清培地に再懸濁させ；次いで、
（ｅ）工程（ｄ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程を含むことを特徴とする、細胞混合物を単離し、培養する方法。
【請求項３１】
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ肝臓細胞の該懸濁液は赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＢＳＡ、ニコチンアミド、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンを含む培地に再懸濁させ；次いで
（ｃ）工程（ｂ）の無血清培地中で該細胞を培養する；
工程を含むことを特徴とする、細胞混合物を単離し、培養する方法。
【請求項３２】
さらに、工程（ａ）および（ｂ）の間に工程：
（ｄ）１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物中で、工程（ａ）の懸濁液の細胞を低温保存し；次いで、
（ｅ）工程（ｂ）に先立って工程（ｄ）の低温保存された細胞を解凍する；
ことを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
肝臓細胞の該懸濁液が、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓をＥＧＴＡを含む緩衝液中で切り裂くことによって工程（ａ）で得られる請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３４】
ＥＧＴＡを含む該緩衝液がプロテアーゼ含有緩衝液で補足されまたは置き換えられ、ここに、該プロテアーゼはコラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＥＧＴＡを含む該緩衝液がプロテアーゼ含有緩衝液で補足されまたは置き換えられ、ここに、該プロテアーゼはコラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼおよびジパーゼよりなる群から選択される２以上のプロテアーゼを含む請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
ＥＧＴＡを含む該緩衝液は、さらに、組織の炭水化物成分を破壊するための酵素を含み、該酵素がヒアルロニダーゼ、およびノイラミニダーゼよりなる群から選択される請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
該赤血球細胞が、懸濁化された細胞を低速（５０×ｇ）で遠心して、より大きな細胞をほぼ３ないし４分間でペレット化し、ペレット化する細胞を洗浄し、次いで、遠心および洗浄工程を反復することによって除去される請求項３０ないし３６いずれか１記載の方法。
【請求項３８】
該培地が低密度リポ蛋白質（ＮＤＬ）を含有せず；および／または培地がカルシウム、ＦＦＡ、ＨＤＬ、または微量元素を含有せず；および／または培地がグルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンまたはチロトロピン放出因子を含有せず；および／または培地は無血清培地ではない請求項３０ないし３７いずれか１記載の方法。
【請求項３９】
請求項１ないし２９いずれか１記載の組成物、または請求項３０ないし３８いずれか１に従って調製された細胞混合物を、ＨＣＶウイルスＲＮＡ８９８またはその感染性同等物と接触させる工程を含む、細胞をＨＣＶで感染させる方法。
【請求項４０】
ＨＣＶウイルスを組成物に加え、組成物中の細胞を洗浄するに先立って、ｃｍ２当たり約０．５２ｍｌの容量にて、約３７℃で２４時間インキュベートする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項１ないし２９いずれか１記載の組成物、または請求項３０ないし３６いずれか１記載の細胞混合物を、フィーダー細胞と共にインキュベートし；
（ｂ）該組成物をＲＮＡ８９８またはその感染性同等物と接触させ；次いで、
（ｃ）組成物の細胞、細胞が培養された培地、または細胞および培地双方と関連するＨＣＶ ＲＮＡの存在を測定する；
工程を含む、ＨＣＶ感染をアッセイする方法。
【請求項４２】
該フィーダー細胞がＳＴＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＨＣＶ ＲＮＡの量が、（ａ）該細胞、または細胞が（ｂ）と共に培養された培地と関連する存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を、（ｂ）内部対照として用いられる第２のウイルスからのＲＮＡの量と比較することによって測定される請求項４１または請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該第２のウイルスＲＮＡがウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）請求項１ないし２９いずれか１記載の組成物、または請求項３０ないし３６いずれか１記載の細胞混合物を、フィーダー細胞と共にインキュベートし；
（ｂ）組成物中の細胞をＲＮＡ８９８と接触させ；
（ｃ）細胞をＲＮＡ８９８またはその感染性同等物と接触させる前または後に、化合物を組成物に投与し；次いで、
（ｄ）該細胞、該細胞が培養された培地、または該細胞および該培地双方と関連するＨＣＶを測定する；
工程を含む、ＨＣＶの生産に影響する化合物の能力を評価する方法。
【請求項４６】
該化合物がＨＣＶ生産を阻害する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
複数の化合物が、ＨＣＶ生産を阻害するその能力について同時にスクリーニングされる請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｄ）の測定を、対照細胞、対照細胞が培養された培地、または対照細胞および培地の双方に関連するＨＣＶの量と比較するさらなる工程を含み、ここに、化合物が投下されていないか、または既知の不活性化合物が投与されていることを除いて、該対照細胞が工程（ａ）ないし（ｄ）に付されている請求項４５ないし４７いずれか１記載の方法。
【請求項４９】
該フィーダー細胞がＳＴＯ（Ｒｅｉｄ ９９）細胞である請求項４５ないし４８いずれか１記載の方法。
【請求項５０】
ＨＣＶの存在が、細胞、または該細胞が培養された培地に関連するＨＣＶ ＲＮＡの量を決定することによって測定される請求項４５ないし４９いずれか１記載の方法。
【請求項５１】
ＨＣＶ ＲＮＡの量が逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）によって決定される請求項４５ないし５０いずれか１記載の方法。
【請求項５２】
ＨＣＶ ＲＮＡの量が、（ａ）細胞、または細胞が培養された培地に関連するＨＣＶ ＲＮＡの量を、（ｂ）内部対照として用いられた第２のウイルスからのＲＮＡの量と比較することによって測定される請求項４５ないし５１いずれか１記載の方法。
【請求項５３】
第２のウイルスがウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である請求項４５ないし５２いずれか１記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）肝臓細胞をプロテアーゼで処理することによって、ＥＧＴＡを含む緩衝液中の、妊娠後ヒト３月齢以降の肝臓細胞の懸濁液を得、ここに、肝臓細胞の該懸濁液は４０ミクロン以上の物体を除去するように処理されており、かつ肝臓細胞の該懸濁液が赤血球細胞を含有せず；
（ｂ）肝臓細胞の該懸濁液からＣＤ３４−／アルファフェトプロテイン＋／糖蛋白質＋／アルブミン＋細胞を単離し；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を、ＢＳＡ、ニコチンアミド、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含み、所望により、グルカゴン、肝臓成長因子、エタノールアミンおよびチロトロピン放出因子よりなる群から選択される成分のいずれか１つを含有する培地に再懸濁させ；次いで、
（ｄ）工程（ｃ）からの該細胞を、フィーダー細胞を含む培地中で共培養して、肝臓細胞の該集団を拡大培養する；
ことを特徴とする、肝臓細胞の混合集団を調製する方法。
【請求項５５】
工程（ａ）の懸濁液の細胞、または工程（ｂ）後に単離された細胞を、１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児ウシ血清を含む組成物中で低温保存し；次いで、工程（ｃ）に先立って該低温保存した細胞を解凍する請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
肝臓細胞の該懸濁液からのＣＤ３４−／アルファフェトプロテイン＋／糖蛋白質＋／アルブミン＋細胞の該単離が、ＦＡＣＳを用いて該肝臓細胞をソーティングすることを含む請求項５４記載の方法。
【図２】
【図３】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５１６７０６（Ｐ２００７−５１６７０６Ａ）
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４２６６３（Ｐ２００６−５４２６６３）
【出願日】平成１６年１２月１日（２００４．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９９６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４５０
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５９８０３２１０６）バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (414)
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１３０ Ｗａｖｅｒｌｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９−４２４２， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１日（２００４．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９９６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４５０
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５９８０３２１０６）バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (414)
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１３０ Ｗａｖｅｒｌｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９−４２４２， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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