胚性幹細胞の分化を誘導する方法及びその用途
本発明は、胚性幹細胞の分化した神経細胞への分化を誘導する方法を提供する。本発明は、さらに、分化した神経細胞、及び分化した神経細胞を含む細胞の集団を生じさせる方法を提供する。さらに、本発明は、被験者において脊髄を再増殖させる方法、及び治療の必要がある被験者において神経組織の変性を治療する方法を提供する。本発明は、さらに、神経前駆細胞、分化した神経細胞、及び同用途を提供する。また、分化した神経細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物も提供される。本発明は、さらに、分化した神経細胞の集団を単離する方法に向けられる。最後に、本発明は、ニューロンの変性に関連した症状の治療における使用のための薬剤の同定方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
数百もの異なるニューロンの種類が脊椎の中枢神経系（ＣＮＳ）の発生の間に生成され、ニューロン回路の形成に必須の細胞の多様性を確立する。特定の種類又はクラスのＣＮＳニューロンの選択的な変性は、多くの神経学上の障害の根源である。この理解は、神経変性性障害を治療するという見地から、ニューロンの補給可能な源として作用するかもしれない前駆細胞の集団を規定することにおいて興味を生じさせてきた。系統的様式においてニューロンの分化の特定の経路に沿ったそのような前駆細胞を支配すること（directing）は難しいことが証明されたが、単に、ＣＮＳニューロンのほとんどのクラスを生じさせる通常の発生の経路がほとんど定義されていないままであるからではない。
【０００２】
前駆細胞の神経学上の潜在性の研究は、３つの主要なクラスに焦点が合わされてきた：（１）胚又は成人の神経組織由来の神経前駆細胞（Alvarez-Buylla et al.，A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells．Nat．Rev．Neurosci.，２：287-93，2001；Gage，F．H.，Mammalian neural stem cells．Science，287：1433-38，2000；Temple，S.，The development of neural stem cells．Nature，414：112-17，2001；Uchida et al.，Direct isolation of human central nervous system stem cells．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，97：14720-725，2000）；（２）他の組織及び器官由来の非神経前駆細胞（Brazelton et al.，From Marrow to brain：expression of neuronal phenotypes in adult mice．Science，290：1775-79，2000；Mezey et al.，Turning blood into brain：cells bearing neuronal antigens generated in vitro from bone marrow．Science，290：1779-82，2000；Terada et al.，Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous fusion．Nature，416：545-48，2002）；及び（３）胚性幹（ＥＳ）細胞（Bain et al.，Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro．Dev．Biol.，168：342-57，1995；Reubinoff et al.，Neural progenitors from human embryonic stem cells．Nat．Biotechnol.，19：1134-40，2001；Schuldiner et al.，Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells．Brain Res.，913：201-05，2001；Zhang et al.，In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells．Nat．Biotechnol.，19：1129-33，2001；Rathjen et al.，Directed differentiation of pluripotent cells to neural lineages：homogenous formation and differentiation of a neurectderm population.Development，129：2649-61，2002）。ＥＳ細胞は、ニューロン及び神経細胞の両方を生成し、そして幾つかの例においては、中脳ドーパミン作用性のニューロンを含む、特定のクラスのニューロンに特徴的な細胞種マーカーを発現する能力を有する（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity．Neuron，28：31-40，2000；Lee et al.，Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells．Nat．Biotechnol.，18：675-79，2000）。これらの利点にも拘わらず、しかしながら、本発明の前までは、ＥＳ細胞が容易に特定のニューロン細胞種を生成することができることも、それらが神経発生の正常なプログラムを再現できることも、知られていなかった。
【０００３】
脊髄の運動ニューロンは、ニューロン特異化（specification）の関連経路の多くが定義された一つのＣＮＳニューロンサブタイプを代表する（Jessell et al.，Neuronal specification in the spinal cord：inductive signals and transcriptional codes．Nat．Rev．Genet.，１：20-29，2000；Lee et al.，Transcriptional networks regulating neuronal identity in the developing spinal cord．Nat．Neurosci.，４補遺：1183-91，2001）。脊髄の運動ニューロンの生成は、幾つかの発生段階を含むことが明白である。最初に、外胚葉細胞が、吻側（rostral）神経特性−ＢＭＰ，ＦＧＦ，及びＷｎｔシグナリングの制御を通して達成されたプロセスを獲得する（Munoz-Sanjuan et al.，Neural induction，the default model and embryonic stem cells．Nat．Rev．Neurosci.，３：271-80，2002；Wilson et al.，Neural induction：toward a unifying mechanism．Nat．Neurosci.，３：４補遺：1161-68，2001）。これらの吻側神経前駆細胞はレチノイン酸（ＲＡ）を含む尾部側化シグナリングに応答して脊髄の位置的アイデンティティーを獲得する（Blumberg et al.，An essential role for retinoic signaling in anteroposterior neural patterning．Development，124：373-79，1997；Durston et al.，Retinoids and related signals in early development of the vertebrate central nerve system．Curr．Top．Dev．Biol.，40：111-75，1998；Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999）。次に、脊髄の前駆細胞は、ソニックヘッジホッグ蛋白質（ＳＨｈ）の腹側化アクションに対する応答として運動ニューロン前駆細胞のアイデンティティーを獲得する（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001）。
【０００４】
ＳＨｈシグナリングによる運動ニューロン前駆細胞のアイデンティティーの特異化は、ホメオドメイン（ＨＤ）及び基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の発現の背腹側パターンの確立を通して媒介する（Briscoe et al.，前掲）。相対的に高いレベルのＳＨｈシグナリングにおいては、ｐＭＮドメインと呼ばれる別の前駆ドメインが確立される；このドメイン内では、細胞は介在ニューロンよりも運動ニューロンの生成に委ねられるらしい（Briscoe et al.，A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube．Cell，101：435-45，2000）。
【０００５】
ＭＮドメイン内の前駆細胞は、２つのＨＤ蛋白質（Ｐａｘ６及びＮｋｘ６．１）及びｂＨＬＨ蛋白質（Ｏｌｉｇ２）の発現により特徴付けされる（Ericson et al.，Pax controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded SHh signaling．Cell，90：169-80，1997；Sander et al.，Ventral neural patterning by Nkx homeobox genes：Nkx6.1 controls somatic motor neuron and ventral interneuron fates．Genes Dev.，14：2134-39，2000；Vallstedt et al.，Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification．Neuron，31：743-55，2001；Novitch et al.，Coordination regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2 and neurogenin2 in the coordinate induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001）。これらの３つの転写因子の各々は、脊髄の運動ニューロンのアイデンティティーの明確化において本質的な役割を担う（Ericson et al.，Pax6 controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded SHh signaling．Cell，90：169-80，1997；Sander et al.，Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification．Neuron，31：743-55，2001；Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity anf pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001；Mizuguchi et al.，Combinatorial roles of olig2 and neurogenin2 in the coordinated induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001；Zhou et al.，The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple neuronal and glial subtype specification．Cell，109：61-73，2002；Lu et al.，Common developmental requirement for Olig function indicates a motor neuron/oligodendrocyte connection．Cell，109：75-86，2002）。さらに、それらの組み合わされた活性が細胞サイクルを離れて（out of）運動ニューロン前駆体を操作し（drive）（Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001；Mizuguchi et al.，Combinatorial roles of olig2 and neurogenin2 in the coordinated induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001）、そして有糸分裂後の運動ニューロンのアイデンティティーを強化する（consolidate）下流の転写因子（特に、ＨＤ蛋白質，ＨＢ９）の発現を指示する（Pfaff et al.，Requirement for LIM homeobox gene Isl1 in motor neuron generation reveals a motor neuron-dependent step in interneuron differentiation．Cell，84：309-20，1996；Arber et al.，Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，199；Thaler et al.，Active suppression of interneuron programs within developing motor neurons revealed by analysis of homeodomain factor HB9．Neuron，23：675-87．1999）。
【０００６】
上記の発見は、神経発生の通常の経路における洞察が、合理的な様式にて前駆細胞、例えばＥＳ細胞の異種セットを、特定のＣＮＳニューロンサブタイプへ向けるために適用できることを示唆する。ＥＳ細胞は運動ニューロンの分子特性の幾つかを伴う細胞を生成することが報告された（Renoncourt et al.，Neurons derived in vitro from ES cells express homeoproteins characteristic of motoneurons and interneurons．Mech．Dev.，79：185-97，1998）。しかしながら、本発明の前には、これらのニューロンの生成の経路も、それらのインビボ発生能力も、十分に探索されていなかった。
【０００７】
発明の概要
発明者らは、神経管の吻尾間の（rostrocaudal）軸索及び背腹間の軸索に沿って機能し、且つインビボにおいて運動ニューロンの運命を特定する細胞外シグナリング因子が、インビトロにおいて、マウスＥＳ細胞の分化を機能性脊髄運運動ニューロンへ向けるために利用され得るか否かを試験した。本明細書において開示されるとおり、発明者らは、神経化されたＥＳ細胞のＲＡへの暴露が脊髄の前駆細胞の分化を誘導すること、及びヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナリングの活性化が運動ニューロンを生成するためにこれらの細胞を指示することを確定した。発明者らは、Ｈｈシグナリングにより誘発された運動ニューロンの分化の固有の分子経路がインビボにおいて運動ニューロンの生成に関与する経路を模倣することも示した。ＧＦＰ−に基づく運動ニューロンマーキング法の使用は、ＥＳ−細胞−由来の運動ニューロンの純粋な集団の特性決定を許容した。そのような運動ニューロンは、インビボにおいて胚性脊髄を再増殖させ（repopulating）、軸索を末梢へ伸長させ、そして骨格筋との接触の部位においてシナプス分化を受けることができる。即ち、神経発生の通常の経路を合理的様式においてくつがえす（subverted）ことにより、ＥＳ細胞をＣＮＳニューロンの特定のサブクラスへ向かわせることができる。
【０００８】
従って、本発明は、胚性幹細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子及び背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、胚性幹細胞の分化した神経細胞への分化を誘導する方法を提供する。また、この方法により生産した、分化した神経細胞も提供される。
【０００９】
本発明は、分化した神経細胞を生産する方法も提供し、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることによる。また、この方法により生産された、分化した神経細胞を含む細胞集団も提供される。
【００１０】
本発明は、被験者において脊髄を再増殖させる（repopulation）方法も提供し、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植することによる。
【００１１】
本発明は、治療の必要な被験者において神経組織の変性を治療する方法にも向けられ、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）神経組織の変性を治療するのに有効な量にて分化した神経細胞を被験者に移植することによる。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｃ）任意に、神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることにより生じさせた神経前駆細胞を提供する。また、神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、これらの神経前駆細胞の用途も提供される。
【００１３】
本発明は、さらに、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることにより生じさせた神経前駆細胞を提供する。また、これらの分化した神経細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物及び神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、これらの分化した神経細胞の用途も提供される。
【００１４】
本発明は、分化した神経細胞の集団を単離及び又は精製する方法にも向けられ、（ａ）増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；（ｅ）分化した神経細胞においてｅＧＦＰの発現を検出し；そして（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離することによる。
【００１５】
最後に、本発明は、神経の変性に関連した症状を治療することにおける使用のための薬剤を同定する方法も提供され、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量のレチノイン酸に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞においてヘッジホッグシグナリング経路を活性化することによりニューロンを生じさせるが、但し、ニューロンの幾つか又は全てが変性しており；（ｄ）変性したニューロンを候補の薬剤と接触させ；そして（ｅ）当該薬剤が幾つか又は全ての変性したニューロンの再生を増強するか否かを決定することによる。
【００１６】
本発明の追加の側面は、続く説明から明らかになる。
【００１７】
発明の詳細な説明
発生の間、特定の方向特性又は位置特性を幹細胞に授与するシグナリング因子の制御を含む一連の発生段階を通して、神経細胞が胚性幹細胞から生成される。最初に、外胚葉の細胞が吻側又は尾部側の神経特性を獲得し、そして吻側化（rostralizing）及び／又は尾部側化（caudalizing）の胚性シグナリング因子の制御を通して、吻側の又は尾部側の前駆細胞に分化すると言える。その後、神経前駆細胞はさらに分化して、背側化（dorsalizing）及び／又は腹側化（ventralizing）胚性シグナリング因子の作用に応答して、前駆細胞のサブタイプのアイデンティティーを獲得するか、又は完全に分化した神経細胞になる。
【００１８】
例えば、運動ニューロンは様々なシグナリング因子に応答してＥＳ細胞から発生すると言える。最初に、ＢＭＰ，ＦＧＦ，及びＷｎｔシグナリングの制御により、外胚葉細胞が吻側神経特性を獲得する。結果の吻側の神経前駆細胞は、次に、レチノイン酸（ＲＡ）を含む尾部側のシグナルに応答して、脊髄の位置に関するアイデンティティーを獲得する。ＳＨｈシグナリングによる運動ニューロン前駆体のアイデンティティーの明確化は、ホメオドメイン（ＨＤ）及び基本的ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の発現の背腹パターンの確立を通して介在される。相対的に高いレベルのＳＨｈシグナリングにおいては、ｐＭＮドメインと呼ばれる別の前駆体ドメインが確立される。このドメイン内では、細胞が介在ニューロンよりも運動ニューロンの生成にかかわるらしい。ｐＭＮドメイン内の前駆細胞は、２つのＨＤ蛋白質、Ｐａｘ６及びＮｋｘ６．１、及びｂＨＬＨ蛋白質、Ｏｌｉｇ２の発現により特徴付けられる。これらの３つの転写因子の各々は、脊髄の運動ニューロンアイデンティティーの明確化において必須の役割を有する。さらに、それらの組み合わされた活性が細胞サイクルを離れて（out of）運動ニューロン前駆細胞を操作し（drive）、そして有糸分裂後の運動ニューロンのアイデンティティーを強化する下流の転写因子（特に、ＨＤ蛋白質、ＨＢ９）の発現を指示する。
【００１９】
脊髄の運動ニューロンは運動性挙動の制御において必須の役割を演じるし、それらの変性は多くの神経障害の基礎となる。運動ニューロンの生成に関与する誘導性シグナル及び転写因子が同定されたことから、正常な発生への洞察を用いて、合理的な様式にて幹細胞を運動ニューロンの運命に向けさせ得ることを示唆する。発明者らは、本明細書において、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞が外部からのシグナリング因子により誘導されることにより、最初に脊髄前駆細胞に分化でき、次に脊髄の運動ニューロンに分化できることを明らかにする。ＥＳ−細胞由来の神経前駆体からの運動ニューロンの生成の分子経路は、インビボにおいて配備されるそれを再現する。胚性脊髄へ導入されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンは、腹側角を増殖させ（populate）、軸索を末梢に伸ばし、そして標的の骨格筋との接触部位においてシナプス分化を受ける。即ち、通常の神経発生の経路に関与する誘導性シグナルは、ＥＳ細胞がＣＮＳニューロンの特定のクラスを形成することを指示できる。
【００２０】
従って、本発明は、分化した神経細胞への胚性幹細胞の分化を誘導する方法、及びこの方法により生成された分化した神経細胞を提供する。本明細書にて使用される用語「胚性幹細胞の分化を誘導する」は、胚性幹細胞を活性化するか、開始するか、又は刺激することにより分化を受けること−発生の間に細胞が構造上並びに機能上特化されることになる細胞プロセスを意味する。胚性幹（ＥＳ）細胞は、培養された細胞であり、胚盤胞のステージの胚の多能性内部細胞隗由来であり、無期限に複製することができる。一般に、ＥＳ細胞は他の細胞に分化する能力を有する（即ち、それらは多能性）；即ち、それらは新規な細胞の連続する源として機能するかもしれない。本発明の胚性幹細胞はあらゆる細胞から得て良いが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト、家畜動物、又は市販の動物）から得る。本発明の一つの態様において、胚性幹細胞はマウスの胚性幹細胞である。別の好ましい態様において、胚性幹細胞はヒトから得られる。
【００２１】
さらに本明細書において使用される「分化した神経細胞」は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）の一部分化した細胞又は完全に分化した細胞であり、そして、限定ではないが、完全に分化したガングリオン細胞、グリア（又は神経グリア）細胞（例えば、星状細胞、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞）、顆粒細胞、ニューロン細胞（又はニューロン）、及び星形細胞、並びにそれらのあらゆる神経前駆細胞を含む。前駆細胞は、発生及び分化の間に、一連の細胞分割により別の細胞系列を生じる親細胞である。神経前駆細胞は、例えば、最後にはＣＮＳ又はＰＮＳの完全に分化した神経細胞に発生する細胞系列に委ねられる（committed）；しかしながら、そのような神経前駆細胞は神経細胞の特定の種類、又はサブクラスに供されたことがまだない。最初に、神経前駆細胞は吻側の特性を獲得し（例えば、吻側神経前駆細胞）、続いて位置的アイデンティティーを獲得してよい（例えば、小脳前駆細胞、大脳前駆細胞、又は脊髄前駆細胞）。そのような一部分化した神経前駆細胞は、特定の種類の神経細胞に分化して（例えば、星状細胞、ガングリオン細胞、顆粒細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、又は星形細胞の前駆細胞）、そして以後は、完全に分化した前駆細胞（例えば星状細胞、ガングリオン細胞、顆粒細胞、ニューロン（背根ガングリオン（ＤＲＧ）ニューロン、運動ニューロン、末梢ニューロン、脊髄ニューロン、又は腹側介在ニューロン）、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、又は星形細胞）を生じるように委ねられるようになる。従って、本発明の一部分化した神経細胞は、神経のアイデンティティーを有し、方向アイデンティティー又は位置アイデンティティーを獲得した細胞であるか、又は特定のクラスの神経細胞に発生するが完全に分化した神経細胞には発生しないことを委ねられた細胞であってよい。
【００２２】
さらに、本明細書にて使用される「神経細胞」又は「ニューロン」は、核及び周囲の細胞質；幾つかの短い放射突起（processes）（星状細胞）；及び一つの長い突起（軸索）、小枝様のブランチで終わるもの（末端星状細胞（telodendrons））、及びそのコースに沿って伸びるブランチを有してよいもの（側枝（collaterals））を含む、細胞ボディー（周核体）から一般にはなる神経系の、伝導性（conducting）細胞又は神経細胞である。ニューロンの例は、限定ではないが、背根ガングリオン（ＤＲＧ）のニューロン、運動ニューロン、末梢ニューロン、知覚ニューロン、脊髄のニューロン、及び原側介在ニューロンを含み、それら全てはコリン作動性、ドーパミン作動性、又はセロトニン作動性であってよい。
【００２３】
ＥＳ細胞の一部分化したか又は完全に分化した神経細胞への分化は、公知の細胞又は分子の手法、及び本明細書にて開示されたアッセイ及び方法により検出してよい。本発明の一つの態様において、分化した神経細胞は、運動ニューロンである（例えば、有糸分裂後の運動ニューロン又は脊髄の運動ニューロン）。本発明の別の態様において、分化した神経細胞は遺伝子を標識され、本明細書にて記載されたように、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する。ｅＧＦＰ遺伝子マーカーは、分化した神経細胞の集団を単離及び／又は精製するための方法において、又は脊髄の制御を監視するための方法において特に有用かもしれず、以下に記載されるとおりである。
【００２４】
本発明の方法は、胚性幹細胞を、吻側化又は尾部側化の胚性シグナリング因子、及び背側化又は腹側化の敗勢シグナリング因子に、分化した神経細胞を精製するのに有効な量にて接触させることを含む。本明細書にて使用される「因子」は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、化合物、抗生物質、薬剤、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。Ｆａｂ断片は抗体の単価の抗原結合断片であり、パパイン消化により生成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は抗体の二価の抗原結合断片であり、ペプシン消化により生成される。
【００２５】
さらに本明細書にて使用される「胚性シグナリング因子」は、発生及び分化の推移の間に、胚の中で細胞へ情報を運ぶ因子である。そのような情報は、例えば、胚の中の細胞の方向又は位置に関してよく、そして情報を受けたそれらの細胞によりたどられる分化の経路を決定してよい。本発明の胚性シグナリング因子は、例えば、形態学上の因子又は神経因子であってよい。本発明における使用のための胚性シグナリング因子の例は、限定ではないが、レチノイン酸（ＲＡ）、骨形態蛋白質（ＢＭＰｓ）（例えば、ＢＭＰ１からＢＭＰ７，ＢＭＰ２及びＢＭＰ４を含む）、繊維芽成長因子（ＦＧＦｓ）（例えば、アルファＦＧＦ，ＦＧＦ８，ＦＧＦ１０，ＨＢＧＦ１，塩基性ＦＧＦ，ベータＦＧＦ，及びＨＢＧＦ）、ヘッジホッグ蛋白質（例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨｈ）及びインディアンヘッジホッグ（ＩＨｈ）、ヘッジホッグシグナリングのアゴニスト（例えば、Ｈｈ−Ａｇ１．３）、及びヘッジホッグシグナリング経路の他の活性化因子を含む。
【００２６】
さらに、本明細書にて使用される「吻側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の頭部又は上位の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。対照的に、「尾部側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の尻、尾又は下位の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。吻側アイデンティティーの割り当てに寄与する胚性シグナリング因子は、ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化をもたらすと言える。本発明における使用のための吻側化及び尾部側化胚性シグナリング因子の例は、限定ではないが、ＲＡ，ＢＭＰ，ＦＧＦ，及びＷｎｔを含む。ＲＡは発生の間に吻側アイデンティティーを割り当てる役割を担うことが知られている。最近、Ｗｎｔシグナリングも吻側アイデンティティーを割り当てる役割を担うことが示された（Nordstrom et al.，Progressive induction of caudal neural character be graded Wnt signaling．Nat．Neurosci.，5(6)：525-32，2002）。即ち、本発明の一つの態様において、吻側化胚性シグナリング因子はＲＡ又はＷｎｔである。発明の別の態様においては、尾部側化胚性シグナリング因子がＲＡ又はＷｎｔである。
【００２７】
本明細書にて使用される「背側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の背中又は後位の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。対照的に、本明細書にて使用される「腹側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の前部又は前方の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。背側アイデンティティーの割り当てに寄与する胚性シグナリング因子は、ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化又は完全に分化した神経細胞への分化をもたらすと言える。本発明における使用のための背側化及び腹側化胚性シグナリング因子の例は、限定ではないが、ＢＭＰ，Ｗｎｔ，ヘッジホッグ蛋白質、ヘッジホッグシグナリングのアゴニスト、及びヘッジホッグシグナリング経路の他の活性化因子を含む。ＳＨｈシグナリングは、例えば、運動ニューロン前駆細胞のアイデンティティーを脊髄前駆細胞に提供することが知られている。
【００２８】
本発明の一つの態様において、背側化胚性シグナリング因子は、ＢＭＰ又はＷｎｔである。本発明の別の態様において、腹側化胚性シグナリング因子は、ヘッジホッグシグナリング経路の他の活性化因子である。本明細書にて使用される「ヘッジホッグシグナリング」は、ヘッジホッグファミリーの蛋白質（例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨｈ）及びインディアンヘッジホッグ（ＩＨｈ））のあらゆるメンバーの生化学シグナリング、特に発生及び分化の間に胚中の細胞の方向及び位置に関係するシグナリングを意味する。ヘッジホッグシグナリング経路の「活性化因子」は、ヘッジホッグシグナリングを作用させるか又は生じさせる因子、及びヘッジホッグシグナリング経路においてヘッジホッグシグナリングを誘導するか、開始させるか、又は刺激する因子を含む。例示として、ヘッジホッグシグナリングの活性化因子はヘッジホッグ蛋白質（例えば、ＳＨｈ、ＩＨｈ）又はヘッジホッグシグナリングのアゴニスト（例えば、Ｈｈ−Ａｇ１．３）であってよい。本明細書にて使用されるヘッジホッグシグナリングの「アゴニスト」は、細胞中のヘッジホッグシグナリングが開始するか、刺激されるか、又は誘導されるように、天然に生じる物質により通常は刺激される細胞受容体に親和性を有し、且つ当該受容体において生理活性を刺激する因子である。
【００２９】
胚性シグナリング因子、ＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＳＨｈ，及びＩＨｈは蛋白質である。本明細書にて使用される「ＢＭＰ」はＢＭＰ蛋白質及びＢＭＰアナログの両方を含み；「ＦＧＦ」はＦＧＦ蛋白質及びＦＧＦアナログの両方を含み；「Ｗｎｔ」はＷｎｔ蛋白質及びＷｎｔアナログの両方を含み；「ＳＨｈ」はＳＨｈ蛋白質及びＳＨｈアナログの両方を含み；「ＩＨｈ」はＩＨｈ蛋白質及びＩＨｈアナログの両方を含む。他に示さない限り、「蛋白質」は、蛋白質、蛋白質ドメイン、ポリペプチド又はペプチドを含む。本明細書にて使用される特定の蛋白質の「アナログ」は、当該蛋白質の生物活性を有し、且つ当該蛋白質と６０％又はそれより高い（好ましくは、７０％又はそれより高い）のアミノ酸配列相同性を有する、当該蛋白質の機能性バリアントである。「アナログ」は、相同な三次元コンフォメーションを有する蛋白質のバリアントを含む。さらに本明細書にて使用される用語「生物活性」は、発生及び分化の間のＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＳＨｈ，又はＩＨｈ蛋白質のシグナリング活性を意味し、以下に記載される。
【００３０】
さらに、本明細書にて使用される「保存的置換」は、置換されたアミノ酸残基に機能上均等なアミノ酸置換であり、それらが極性又は立体の配置を有するか、又はそれらが置換された残基と同じクラスに属するためである（例えば、疎水性、酸性又は塩基性）。本明細書にて使用される用語「保存的置換」は、本発明の蛋白質が発生及び分化の間にシグナリングを作用させる能力に対して取るに足らない（inconsequential）効果を有する置換を含む。
【００３１】
本明細書にて論じられるとおり、ＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＳＨｈ，又はＩＨｈは蛋白質である。対照的に、ＲＡ及びビタミンＡはモルフォゲンであると信じられるアルデヒド分子である。ＲＡは容易に利用可能であり；例えばシグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ）から得てよい。本発明の他の因子は、合成によるか、組換えによるか、又は天然の細胞から単離してよい。好ましくは、蛋白質を組換えにより生産し、慣用の技術及び当該蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いる。ＳＨｈ及びＩＨｈ（並びにＨｈ−Ａｇ１．３）もキュリス社（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から得てよい。
【００３２】
本発明の方法は、胚性幹細胞を、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子及び背側化及び／又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることを含む。胚性シグナリング因子は、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて提供される。これらの量は、本明細書にて開示された公知の手法及び方法に基づいて、当業者により容易に決定される。本発明の好ましい態様においては、胚性幹細胞を、背側化及び／又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させる前に、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させる。
【００３３】
発明者らは、神経栄養性因子の存在下で培養されたニューロンが生存して且つ突起を念入りに作ることを証明した。従って、別の態様において、本発明の方法は、さらに、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子との接触後に、少なくとも一つの神経栄養性因子に胚性幹細胞を接触させる工程を含む。本明細書にて使用される「神経栄養性因子」は、神経組織の栄養又はメンテナンスに関与する因子である。神経栄養性因子は、委ねられた神経前駆細胞の発生及び分化であるか、又はそれらは分化した神経細胞の成長及び生存を誘導するかもしれない。古典的な例の神経栄養性因子は、ＮＧＦ（神経成長因子）である。本発明における使用のための神経栄養性因子の他の例は、限定ではないが、ＧＤＮＦ，ＮＧＦ，ＮＴ３，ＣＮＴＦ，及びＢＤＮＦを含む。これらの因子はＲ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ミネソタ）から得てよい。本発明の神経栄養性因子は、ＣＮＳ又はＰＮＳの完全に分化した神経細胞（例えば、ニューロン）を生産するのに有効な量で提供される。この量は、本明細書にて開示された公知の手法及び方法に基づいて、当業者により容易に決定してよい。
【００３４】
本発明の方法においては、胚性幹（ＥＳ）細胞を、被験者においてインビトロ又はインビボにて有効な量の胚性シグナリング因子に接触させてよい。胚性シグナリング因子を細胞内へ導入することにより当該因子をＥＳ細胞に接触させてよい。接触をインビトロにて行う場合、因子を直接培養培地に加えてよく、本明細書に記載されているとおりである。或いは、因子を被験者に導入するか（例えば、因子を被験者の細胞に導入することにより）、又は因子を被験者に投与することにより、被験者内でインビボにてＥＳに接触させてよい。被験者は胚性動物又は発生した動物であってよいが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト、家畜、又は市販の動物）である。より好ましくは、被験者はヒトである。胚性シグナリング因子をインビボにてＥＳ細胞に接触させる場合、被験者は好ましくは胚である。しかしながら、ＥＳ細胞を完全に成長したヒト又は動物被験者に移植すること、及び胚性シグナリング因子を次にヒトに移植することにより、ＥＳ細胞の分化した神経細胞への被験者内でのインビボにての分化を作用させることは、本発明の範囲内である。
【００３５】
本発明の因子は、インビトロ又はインビボの何れかにおいて被験者の中で、蛋白質、核酸及び他の薬剤の導入及び投与に使用される公知の技術により、ＥＳ細胞と接触させてよく、例えば注射及び輸液（transfusion）である。標的のＥＳ細胞を被験者の特定の部分に局在化する場合は、注射によるか又は幾つかの他の手段により（例えば、因子を血液又は他の体液に導入することにより）、ＥＳ細胞へ直接導入することが望まれるかもしれない。
【００３６】
胚性シグナリング因子が蛋白質又は他の分子である場合、本明細書に開示された慣用の技術及び方法により、直接ＥＳ細胞に導入してよい。さらに、蛋白質の胚性シグナリング因子は、蛋白質阻害剤の発現を許容する様式にて、因子をコードする核酸をＥＳ細胞に導入することにより、間接にＥＳ細胞に導入してよい。因子は、限定ではないが、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、モノカチオンリポソーム融合、ポリカチオンリポソーム融合、プロトプラスト融合、インビボの電場の創製、ＤＮＡ−コートされたマイクロ発射砲撃（microprojectile bombardment）、組換え体複製欠損ウイルスを用いた注入、相同組換え、インビボ遺伝子治療、エクスビボ遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸のＤＮＡの移行（transfer）、又はそれらのあらゆる組み合わせを含む、慣用の当業界公知の手法を用いて、インビトロ又はインビボにて、ＥＳ細胞に導入してよい。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターは、限定ではないが、レトロウイルス、ＨＳＶ，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、セミリキフォレストウイルス、サイトメガロウイルス、及びワクシニアウイルスのようなウイルスのゲノム由来のベクターを含む。使用される核酸の量は、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な蛋白質因子の量を発現するのに十分な量である。これらの量は、当業者により容易に決定してよい。蛋白質の胚性シグナリング因子をコードする核酸を適当なＥＳ細胞中へ慣用の手法を用いてインビトロにて導入することにより、ＥＳ細胞中の蛋白質因子の発現を達成してよい。蛋白質の胚性シグナリング因子を発現するＥＳ細胞は、次に、インビボにおいて分化した神経細胞を生じさせるために被験者に導入されてよい。
【００３７】
本発明の方法によれば、胚性シグナリング因子は、限定ではないが、経口投与、非経口投与、及び経皮投与を含む公知の手法によりヒト又は動物被験者に投与してよい。好ましくは、因子を頭蓋内、脊髄内（intraspinal）、脳髄内、又は皮下注射により、非経口により投与する。本発明の因子は、ＥＳ細胞と胚性シグナリング因子の間のインビボの接触をもたらすための上記の方法の何れかに従い、被験者に投与してよい。
【００３８】
経口投与のためには、胚性シグナリング因子製剤をカプセル、タブレット、粉末、顆粒としてか、又はサスペンジョンとして与えてよい。製剤は、慣用の付加物、例えば、ラクトース、マニトール、コーンスターチ、又はポテトスターチを有してよい。製剤は、結合剤、例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンと共に与えてもよい。さらに、製剤は、崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムと共に与えてもよい。製剤は、二塩基カルシウムリン酸無水物又はスターチグリコール酸ナトリウムと共に与えてもよい。最後に、製剤は、潤滑剤、例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウムと共に与えてもよい。
【００３９】
非経口投与のためには（即ち、消化管以外の経路を通した注入による投与）、胚性シグナリング因子を、好ましくは被験者の血液と等張の滅菌水溶液と化合してよい。そのような製剤は、固形活性成分を、生理学上融和性の物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、且つ生理条件に融和性の緩衝化されたｐＨを有する水の中に溶解することにより、調製してよい。製剤は、ユニット又は複数用量コンテナー、例えばシールされたアンプル又はバイアル内にて与えてよい。製剤は、限定ではないが、筋膜上（epifascial）、関節内（intracapsular）、頭蓋内、皮膚内、髄腔内、筋肉内、眼窩内（intraorbital）、腹腔内、脊髄内（intraspinal）、胸骨内、血管内、静脈内、柔組織、皮下又は舌下を含むあらゆる注入様式によりデリバリーしてよい。
【００４０】
経皮投与のためには、胚性シグナリング因子を、皮膚の因子に対する浸透性を増加させ、そして因子が皮膚を通して血流に浸透することを可能にさせる皮膚浸透増強剤、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドン等と組み合わせてよい。因子／増強剤組成物は、さらに、ポリマー物質、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニルアセテート、ポリビニルピロリドン等と組み合わせることにより、上記組成物をゲル形態にて提供してもよく、溶剤、例えば塩化メチレンに溶解することにより、所望の粘度まで蒸発させ、そして次にベーキング物質に塗布することによりパッチを提供してよい。
【００４１】
本発明は、ＥＳ細胞の分化した神経細胞（脊髄運動ニューロンを含む）への分化を誘導し、そして、そうして生成された神経細胞を、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を遺伝子マーカーとして使用して精製及び単離する方法を提供する。本明細書に記載されたインビトロＥＳ細胞分化誘導方法は、ニューロンの源、又は被験者への移植物のために利用可能なＣＮＳ又はＰＮＳの他の神経細胞を提供する。即ち、この方法は、神経組織の変性に関連した症状を治療することにおける使用のために、神経細胞を生成するのに特に有用である。
【００４２】
本明細書にて使用される用語「神経組織」は、本発明の分化した神経細胞及びそれらの前駆細胞（progenitors）を含む、神経系の組織を意味する。本明細書にて使用される神経組織が低下したか又は劣った機能活性形態に変化する、神経組織の劣化の状態を意味する。ＥＳ細胞の（例えば、脊髄運動ニューロンへの）分化を誘導することにより、本明細書に記載された方法は、分化した神経細胞の生成及び続く移植の必要がある被験者へのその移植を通して、被験者内の様々な損傷した及び／又は変性した神経組織を再増殖させる（repopulating）こと（例えば、脊髄の再増殖）において有用であると信じられる。
【００４３】
従って、本発明は、神経組織変性の治療の必要のある被験者において神経組織変性を治療する方法を提供し、上記の方法に従い、ＥＳ細胞の分化した神経細胞への分化を誘導し、そして分化した神経細胞を被験者に移植し、それにより神経組織の変性を治療することを含む。例示として、本発明の方法は、以下の工程：（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、神経細胞のサブクラスを、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）神経組織の変性を治療するのに有効な量にて、分化した神経細胞を被験者に移植することを含む。発明の一つの態様において、被験者は胚である。発明の別の態様において、被験者はヒトである。好ましくは、被験者は神経組織の変性を有する。
【００４４】
神経組織の変性は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）において生じてよく、そして限定ではないが、初期の神経病の症状（例えば、神経変性疾患）、ＣＮＳ及びＰＮＳ外傷（trauma）及び損傷、及び非神経の機能不全の後天性の二次作用（例えば、変性事象、病原性事象、又は外傷性事象に対して二次的な神経の損失を含む、様々な異常、症状、及び因子に起因するか又は関連するかもしれない。ＣＮＳ外傷の例は、限定ではないが、しみ（blunt）の外傷、低酸素症、及び侵入性外傷を含む。非神経の機能不全の後天性の二次作用の例は、限定ではないが、脳性麻痺、先天的水頭症、筋ジストロフィー、発作（stroke）、及び血管性痴呆（vascular dementia）、並びに以下：脳出血、発生障害（例えば、脳の欠損、例えば先天的水頭症、又は脊髄の欠損、例えば脊髄披裂（spina bifida））、糖尿病性脳障害、過敏性脳障害、頭蓋内動脈瘤、貧血、腎不全、クモ膜下出血、脳及び脊髄に対する外傷、化学治療剤及び抗ウイルス剤のような治療剤による治療、脳及び脊髄の血管損傷、及び神経組織が変性しやすい他の疾患又は症状の何れかによりもたらされる神経変性を含む。
【００４５】
本発明の一つの態様において、神経組織の変性はＰＮＳ中の末梢神経障害である。本明細書にて使用される用語「末梢神経障害」は、感覚の損失、筋肉の弱化、筋肉の萎縮、深部反射の低下の症候群、及び／又は血管運動神経の兆候を意味する。末梢神経障害を有する被験者においては、ミエリン鞘（シュワン細胞）が主に冒されているかもしれないか、又は軸索が主に冒されているかもしれない。末梢神経障害は、単一の神経（単一神経障害（mononeuropathy））、別のエリアの２つ又はそれより多い神経（複合性単一神経障害（multiple neuropathy））又は多数の神経を同時に（多発性神経障害（polyneuropathy））冒すかもしれない。
【００４６】
本明細書に開示された方法により治療されるかもしれない末梢神経障害の例は、限定ではないが、急性又は慢性の炎症性の多発性神経障害に関連する末梢神経障害、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、コラーゲン血管障害（例えば、多発性動脈瘤紅斑、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、又は全身性紅斑性踉狼瘡）、ジフテリア、ギラン−バレー症候群、遺伝性末梢神経障害（例えば、シャルコー−マリー−ツース病（Charcot-Marie-Tooth disease）（タイプＩ，タイプＩＩ及び全てのタイプを含む）、遺伝性の運動ニューロン障害及び知覚ニューロン障害（タイプＩ，ＩＩ及びＩＩＩ及び腓骨筋肉萎縮）、遺伝性圧脆弱性神経障害（ＨＮＰＰ）、感染性疾患（例えば、後天性免役不全症候群（ＡＩＤＳ））、ライム病（例えば、Borrelia burgdorferiによる感染）、微生物の侵入（例えば、ハンセン病−神経の外傷後の神経障害の全世界での主な原因）、大脳白質萎縮症、代謝性の疾患又は障害（例えば、アミロイド症、真性糖尿病、甲状腺機能低下症、ポルフィリン症、類肉腫症、又は尿毒症）、神経繊維腫症、栄養不足、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、腓骨神経麻痺、ポリオ、ポルフィリン症、ポリオ後症候群、プロテウス症候群、圧迫麻痺（pressure paralysis）（例えば、手根管症候群）、進行性延髄麻痺、橈骨神経麻痺、脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）、毒性薬剤（例えば、バルビツール、一酸化炭素、クロロブタノール、ダプソン、エメチン、重金属、ヘキソバルビツール、鉛、ニトロフラントニン、オルソジニトロフェナル、フェニトイン、ピリドキシン、スルフォナミド、トリオルトクレシルリン酸、ビンカのアルカロイド、多くの溶剤、他の工業性の毒、及び特定のＡＩＤＳ薬（ジダノシン及びザルシタビンを含む）、外傷（神経の外傷−末梢神経障害の全世界的な主な原因）、尺骨麻痺（Beers and Berkow，編纂、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第１７版（Whitehouse Station，NJ：Merck Research Laboratories，1999）第183章）。本発明の好ましい態様において、末梢神経障害はＡＬＳ又はＳＭＡである。
【００４７】
本発明の別の態様において、神経組織の変性は神経変性疾患である。本明細書に記載された方法により処置してよい神経変性疾患の例は、限定ではないが、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）を含む。脱髄の症状に関連した神経組織変性を治療するために本明細書に記載された方法を使用することも、本発明の範囲内である。脱髄症の例は、限定ではないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性横断性脊髄炎、急性ウイルス性脳炎、副腎白質萎縮症（ＡＬＤ）、副腎脊髄神経障害（adrenomyeloneuropathy）、ＡＩＤＳ−液胞脊髄障害、ＨＴＬＶ−付随性脊髄障害、レーベル遺伝子視神経症、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性の多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、準急性硬化症汎脳炎、及び熱帯性痙攣性不全対麻痺を含む。
【００４８】
本発明の分化した神経細胞は、当業界において公知の標準手法、並びに本明細書に記載された方法により、治療の必要がある被験者に移植してよい。例示として、胚のボディー（多能性ＥＳ細胞に由来してよい）を適当な胚性シグナリング因子（例えば、ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３）により誘導することにより、分化した神経細胞を生成してよい。誘導から適当な時間の後に（例えば、誘導の３−４日後）、胚のボディー（ＥＢｓ）を移植のために調製し（例えば、部分的に粉砕された）、そして次に被験者に移植してよい（例えば、チキン、ＨＨステージ１５−１７の脊髄へ）。移植された組織を順応させる（accommodate）ため、移植の前に被験者に吸引による外傷を与えてよい（suction-lesioned）。約１／２−１のＥＢ（又はＥＢ均等物）を、次に、被験者の吻側頸部、尾部側頸部、胸部又は腰部領域において２−５の体節にわたるセグメントへ移植してよい。
【００４９】
本発明の一つの態様において、分化した神経細胞は被験者の脊髄に移植されて、それにより被験者の脊髄を再増殖させ、そして神経組織の変性はＡＬＳ又はＳＭＡに関連した神経障害である。移植されたニューロンが脊髄の運動ニューロンである場合、吻側化及び尾部側化胚性シグナリング因子は、好ましくはレチノイン酸であり、そして背側化又は腹側化胚性シグナリング因子は、好ましくはヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である。
【００５０】
本発明の方法において、分化した神経細胞は、神経組織の変性を治療するのに有効な量において、治療の必要のある被験者に移植される。本明細書にて使用される用語「神経組織の変性を治療するのに有効」は、神経組織の変性の臨床上の障害又は兆候を改善するか又は最小にするのに有効なことを意味する。例えば、神経組織の変性が末梢神経障害である場合、末梢神経障害の臨床上の障害又は兆候は、血管運動神経の兆候を緩和すること、深部反射を増加させること、筋肉萎縮を減少させること、感覚の機能を回復させること、及び筋肉を強化することにより、改善するか又は最小化してよい。治療の必要な被験者において神経組織の変性を治療するのに有効な分化した神経組織細胞の量は、各ケースの特定の因子に依存して変更され、神経組織変性の種類、神経組織変性のステージ、被験者の体重、被験者の症状の重度、分化した神経細胞の種類及び移植の方法を含む。この量は、当業者により、臨床試験及び本明細書に開示された方法を含む公知の手法に基づいて、容易に決定してよい。
【００５１】
分化した神経細胞へのＥＳ細胞の分化を誘導する上記の方法に関して、本発明は、さらに、分化した神経細胞を生成する方法を提供するが、（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることを含む。本発明は、細胞の集団も提供し、この方法により生成した、分化した神経細胞を含む。一つの態様において、細胞の全て又は一部がｅＧＦＰを発現する。本発明の分化した神経細胞が脊髄の運動ニューロンである場合、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子は、好ましくはレチノイン酸であり、そして背側化又は腹側化胚性シグナリング因子は、好ましくはヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である。
【００５２】
本発明の方法において、工程（ｂ）−（ｄ）の何れかは、インビトロか、又は被験者中でインビボにて実施してよい。インビトロの工程の後に、細胞を被験者に移植するが、残りの工程はインビボにて実施される。従って、本発明の方法は、さらに、神経前駆細胞又は分化した神経細胞を被験者に移植する工程を含む。例えば、ＥＳ細胞の培養物を、インビトロにおいて吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、神経前駆細胞を生成してよい。そうして生成された神経前駆細胞を次に被験者に移植してよいが、工程（ｃ）及び（ｄ）はインビボにて実施する。
【００５３】
別の態様においては、ＥＳ細胞の培養物を、インビトロにおいて吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、神経前駆細胞を生成してよい。神経前駆細胞を、次に、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子にインビトロにて接触させることにより、分化した神経細胞を生成してよい。以後、分化した神経細胞を被験者に移植してよく、工程（ｄ）をインビボにて実施する。
【００５４】
さらなる別法においては、ＥＳ細胞の培養物を、インビトロにおいて吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、神経前駆細胞を生成し；神経前駆細胞を、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子にインビトロにて接触させることにより、分化した神経細胞を生成し；そして、任意に、分化した神経細胞を、インビトロにおいて少なくとも一つの神経栄養因子と接触させてよい。分化した神経細胞を、次に、被験者に移植してよい。本発明の一つの態様において、ニューロンを被験者の脊髄に移植する。
【００５５】
本発明は、さらに、被験者の脊髄を再増殖させる方法を提供するが、（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量にて、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）分化した神経細胞を、被験者の脊髄に移植することを含む。分化した神経細胞は、脊髄を再増殖させるのに有効な量にて被験者の脊髄に移植される。この量は、公知の手法及び本明細書に開示された方法に基づいて、当業者により容易に決定してよい。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子は、レチノイン酸であり、そして背側化又は腹側化胚性シグナリング因子は、ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である。本発明のこの方法は、神経組織の変性、特に末梢神経障害の被験者を治療するのに有用かもしれない。従って、本発明の別の態様において、被験者は末梢神経障害を有する。好ましくは、末梢神経障害はＡＬＳ又はＳＭＡである。本発明のさらに別の態様において、移植された、分化した神経細胞は、ｅＧＦＰを発現し、それにより、脊髄再増殖の監視を容易にさせる。
【００５７】
本発明は、さらに、工程：（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量にて、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｃ）任意に、神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることを含む方法により生産される神経前駆細胞を提供する。また、工程：（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量にて、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることを含む方法により生産される神経前駆細胞も提供する。発明の一つの態様において、分化した神経細胞はｅＧＦＰを発現する。
【００５８】
ＣＮＳニューロンの特定のクラスの選択的変性は多くの神経障害の基になるから、ニューロンの成長、生存、及び活性の研究は、相変わらず優先事項である。不幸なことに、しかしながら、生きているニューロンは、そのような研究において容易に利用可能ではない。そのため、本発明は研究される神経細胞の可能性を秘めた無制限な源を提供するため、神経科学及び神経学の分野の研究者に特に重要になる。従って、本発明は、特定の研究エリアにおいて上記の前駆細胞及び分化した神経細胞の用途も提供する。
【００５９】
本発明の神経前駆細胞及び分化した神経細胞は、ニューロン（特に、運動ニューロン）の発生、機能及び死の分析−運動ニューロン疾患の完全な理解に必須の研究において有用になる。さらに、本発明の神経前駆細胞及び分化した神経細胞は、標的筋肉との接触のブイにおいてシナプスの分化を監視するのに有用になる。最後に、本発明の神経前駆細胞及び分化した神経細胞は、ＡＬＳ又はＳＭＡ患者において検出された変異の一つを運ぶ変性した運動ニューロンと正常な健康な運動ニューロンの直接の比較を容易にする（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）又は生存運動ニューロン蛋白質（ＳＭＮ）遺伝子内の変異）。そのような比較のために、よく知られた技術及び本明細書に記載された方法を用いて、健康な神経細胞及び疾患の神経細胞の両方を生産してよい。あるいは、ＳＯＤ又はＳＭＮ変異を有する細胞を、ＡＬＳ又はＳＭＡを有する生きた患者又は死んだ患者から単離してよい。
【００６０】
本明細書に記載されるとおり、発明者らは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）発現のおかげで生きた運動ニューロンが同定できたＥＳ細胞系を構築した。運動ニューロン特異的トランス遺伝子発現を授与するマウスＨＢ９遺伝子の９−ｋｂ ５’領域の制御下でｅＧＦＰのｃＤＮＡを発現するトランスジェニックマウス系列を生じさせた。トランスジェニックファウンダーマウスをＨＢ９とｅＧＦＰの発現の比較によりスクリーニングした。一つのマウス系列、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂは高レベルのｅＧＦＰをＥ９．５−Ｐ１０マウスの脊髄運動にの細胞ボディーにおいて発現し、内生ＨＢ９のパターンと平行なパターンにおいてであった。さらに、ｅＧＦＰの発現が運動ニューロンの軸索及び樹状突起において高レベルで検出された。ＥＳ細胞系（ＨＢＧ３）はｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂトランスジェニックマウス由来であった；これらの細胞は生殖系（germ line）を通してｅＧｆｐ遺伝子を伝搬して、類似の運動ニューロン選択的パターンにおいてｅＧＦＰの発現を指示した。
【００６１】
従って、本発明は、ＥＳ細胞がｅＧＦＰを発現する、本発明の方法においての使用のための胚性幹（ＥＳ）細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物系をさらに提供する。非ヒト動物は適当な動物（例えば、ネコ、家畜、イヌ、ウマ、ヒヤギ、齧歯類、及びヒツジ）であってよいが、それは好ましくは齧歯類である。より好ましくは、非ヒト動物はラット又はマウスである。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子操作されたトランスジェニック動物のための様々な技術により製造してよく、当業界公知のものを含む。発明の一つの態様において、トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）遺伝子を含む。このトランスジェニック動物から確立された動物系列は、その胚の中に、ｅＧＦＰを発現するＥＳ細胞を含む。
【００６２】
本明細書にて使用される用語「トランスジェニック非ヒト動物」は、そのゲノムがトランス遺伝子の導入により変更された、実験操作により製造された、遺伝子操作された非ヒト動物を意味する。さらに本明細書にて使用される用語「トランス遺伝子」は、実験操作により動物のゲノムに導入された核酸分子（例えば、ＤＮＡ、遺伝子、又はそれらの断片）を意味し、導入された遺伝子は当該動物にとって内生ではないか、又は動物にとって内生の遺伝子の修飾形態か又は変異形態である。内生遺伝子の修飾形態又は変異形態は、ヒトの介入を通して製造してよい（例えば、点変異の導入、フレームシフトの導入、内生遺伝子の部分又は断片の欠失、選択可能なマーカー遺伝子の挿入、停止コドンの挿入等による）。
【００６３】
トランスジェニック非ヒト動物は、ヒトの介入を含む幾つかの方法により製造してよく、限定ではないが、非ヒト動物の胚生幹細胞、新たに受精した卵、又は初期胚へのトランス遺伝子の導入；非ヒト動物の体細胞及び／又は生殖細胞の染色体へのトランス遺伝子の組込み；及び本明細書に記載されたあらゆる方法を含む。本発明の好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、トランス遺伝子のＥＳ細胞への導入により製造される。
【００６４】
例示として、本発明のトランスジェニックマウス系は、マウスＨＢ９遺伝子の５’上流領域（Arber et al.，Requirement for the homeobox gene HB9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，1999）、続く５’スプライス基質（Choi et al.，A generic intron increases gene expression in transgenic mice．Mol．Cell Biol.，11：3070-74，1991）、ｅＧＦＰ遺伝子、及びウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナルを含む断片（例えば、約９ｋＢ）を使用する構築物の前核注入により確立してよい。ＥＳ細胞系を、次に、異型接合胚盤胞から遊動してよく、以前に記載されたとおりである（Abbondanzo et al.，Derivation of embryonic stem cell lines．Methods Enzymol.，225：803-23，1993）。遺伝子系列は、マウス胚盤胞を発生させるその能力及び生殖系の遺伝（germ transmission）に関するその能力に基づいて選択してよい。胚生幹細胞は、次に、本明細書に記載された方法における使用のために、トランスジェニック動物から単離してよい。
【００６５】
本発明の一つの態様において、トランスジェニック動物は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）又は生存運動ニューロン蛋白質（ＳＭＮ）遺伝子が変異した（例えば、ＳＯＤ−１−Ｇ９３Ｓ変異）か又は選択的に不活性化されることによりその内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に破壊をもたらす、ゲノムを有する。本明細書にて使用される「破壊」は、機能するＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の正常な発現を妨害する、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内の変異（即ち、遺伝物質内の永遠の遺伝性の変化）を意味する（例えば、それが変異ＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質をもたらすか；それが正常な量のＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を妨害するか；又はそれがＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を妨害する）。破壊の例は、限定ではないが、点変異、フレームシフト変異の導入、内生遺伝子の一部又は断片の欠失、選択可能なマーカー遺伝子の挿入、及び停止コドンの挿入を含む。本明細書にて使用される「変異体」は、野生型遺伝子（又はその遺伝子産物）に比較して、その配列内（又はその機能特性）に少なくとも一つの修飾を呈する遺伝子（又はその遺伝子産物）を意味する。対照的に、用語「野生型」は、その天然源（例えば、天然集団）中でもっとも頻繁に見いだされる、特定の遺伝子（又はその遺伝子産物）に関して特徴的な遺伝子型（又は表現型）を意味する。野生型動物は、例えば、ＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質を発現する。
【００６６】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物における選択的不活性化は、様々な方法により達成してよく、そして異型接合破壊（一つのＳＯＤ対立遺伝子又は一つのＳＭＮ対立遺伝子が破壊されて、結果のトランスジェニック動物が変異に関して異型接合である）又は同型接合破壊（ＳＯＤ又はＳＭＮの対立遺伝子両方が破壊されて、結果のトランスジェニック動物が変異に関して同型接合である）の何れかをもたらしてよい。本発明の一つの態様において、トランスジェニック動物の内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子は、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子産物に共通の領域をコードする核酸配列との相同組換えにより破壊される。例示として、相同組換えによる破壊は、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内のノックアウト変異、特に少なくとも一つの欠失がＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子の少なくとも一つのエクソン内に導入されたノックアウト変異を生じてよい。さらに、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内の破壊が、異種選択可能マーカー遺伝子の内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子への挿入をもたらしてよい。
【００６７】
ｅＧＦＰ遺伝子を発現し、そしてＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内にノックアウト変異を有するトランスジェニック非ヒト動物の系列を確立する一つの方法は、以下の工程を含んでよい：（ａ）ＳＯＤ又はＳＭＮ標的ベクターを生成し；（ｂ）標的ベクターを非ヒト動物のレシピエント細胞に導入し；（ｃ）処理されたレシピエント細胞を非ヒト動物の胚盤胞に導入することにより、処理された胚盤胞を生成し；（ｄ）処理された胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物に導入し；（ｅ）移植された胚盤胞を予定日まで発生させ；（ｆ）そのゲノムがノックアウト破壊をその内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に含むトランスジェニック非ヒト動物を同定し；（ｇ）トランスジェニック非ヒト動物を繁殖させることにより、野生型に比較して低下したＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を呈するトランスジェニック非ヒト動物を得て；そして（ｈ）ｅＧＦＰを発現し、そして野生型に比較して低下したＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を呈するトランスジェニック非ヒト動物を得るために、当該トランスジェニック非ヒト動物を、そのゲノムがｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物と交配させることを含む。ｅＧＦＰを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、上記の方法に従い得てよい。ＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質を過剰に発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供することも、本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明のｅＧＦＰ発現トランスジェニック動物系は、ＥＳ細胞の源及び移植、キメラ、及び二重標識組換え実験のための組織を提供する。本発明のトランスジェニック動物系は、運動ニューロン変性の遺伝モデルも提供する。例えば、トランスジェニック動物系由来の動物のゲノムがそのＳＯＤ遺伝子内に変異を有する場合、それは運動ニューロン変性、特にＡＬＳを治療するのに有用かもしれない薬剤をスクリーニングするための薬学モデルとして使用してよい。このモデルは緩慢な変性の開始を呈し得るはずであるが、その結果は劇的であると予測される。さらに、トランスジェニック動物のゲノムがそのＳＭＮ遺伝子内に変異を有する場合、それは運動ニューロン変性、特にＳＭＡを治療するのに有用かもしれない薬剤をスクリーニングするための薬学モデルとして使用してよい。このモデルは素早い変性の開始を呈すると予測される。
【００６９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物由来のＥＳ細胞は、本明細書に記載された方法において使用してよく、インビトロ又はインビボの分化、及び被験者への再導入を含む。さらに、ｅＧＦＰを発現するトランスジェニック動物系由来のＥＳ細胞及びＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に変異を有するトランスジェニック動物系由来のＥＳ細胞を交配してよい。変異体ＥＰＡ細胞の挙動を、次に、細胞及び／又は組織がｅＧＦＰを発現する、発生した動物又はキメラ胚の顕微鏡観察により追跡する。
【００７０】
本発明は、さらに、分化した神経細胞の純粋な集団を単離する方法、及び／又は分化した神経細胞の集団を精製する方法を提供し、工程：（ａ）増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現するＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させるが、但し、神経前駆細胞の幾つか又は全てもｅＧＦＰを発現し；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させるが、但し、分化した神経細胞もｅＧＦＰを発現し；（ｄ）任意に、分化した神経細胞のサブクラスを、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；（ｅ）分化した神経細胞の中でｅＧＦＰの発現を検出し；そして（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離することを含む。発明の一つの態様において、分化した神経細胞は、運動ニューロンである。ｅＧＦＰを発現するＥＳ細胞は、上記に通りにして本発明のトランスジェニック動物から得てよく、あるいは本明細書に開示された他の方法に従い作成してよい。
【００７１】
本発明の方法によると、ｅＧＦＰの発現は、インビトロ又はインビボの何れかのアッセイにより分化した神経細胞中で検出してよい。本明細書にて使用された「発現」は、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物中のｅＧＦＰ遺伝子の転写、又は少なくとも一つのｍＲＮＡのｅＧＦＰ蛋白質への翻訳を意味する。分化した神経細胞は、ｅＧＦＰ蛋白質、ｅＧＦＰのｃＤＮＡ、又はｅＧＦＰのｍＲＮＡをアッセイすることによる、ｅＧＦＰ発現をアッセイしてよい。ｅＧＦＰの適切な形態は、本明細書に開示された特定の技術に基づいて明らかとなる。
【００７２】
分化した神経細胞は、ｅＧＦＰ発現に関してアッセイしてよく、そしてｅＧＦＰ発現は当業界で公知のアッセイ及び方法を用いて、分化した神経細胞内で検出してよい。ｅＧＦＰは培養物中及びインビボにおいて細胞を標識するための非侵入性マーカーを提供するから、ｅＧＦＰの発現は、好ましくは、イメージング技術、特にブライトフィールド、相、及び蛍光イメージング技術を用いて、分化した神経細胞中で検出され、本明細書に開示されるとおりである。高レベルのｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞は、次に、以下に記載される、それらのｅＧＦＰ蛍光及びフォワードライトスキャンに基づいて、分類することにより（例えば、Beckman-Coulter Altraフローサイトメトリーを用いた、ＦＡＣＳソーティング）、細胞懸濁液から単離してよい。
【００７３】
他の方法も、本発明の分化した神経細胞内でｅＧＦＰ発現を検出するのに使用してよい。そのような検出方法の例は、限定ではないが、ハイブリダイゼーション分析、イメージング技術、免疫学上の技術、免疫沈殿、放射検出、ウエスタンブロット分析、及び本明細書に開示されたあらゆる追加のアッセイ又は検出方法を含む。例えば、ｅＧＦＰ蛋白質又はｅＧＦＰ核酸と反応性の薬剤を用いて、ｅＧＦＰ発現に関して分化した神経細胞をアッセイしてよい。本明細書にて使用される「反応性」は、ｅＧＦＰに親和性を有するか、ｅＧＦＰに結合するか、又はｅＧＦＰに対して向けられる薬剤を意味する。さらに本明細書にて使用される「薬剤」は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、化合物、抗生物質、薬品（drug）、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。本発明の一つの態様において、ｅＧＦＰと反応性の薬剤は、抗体である（例えば、αＧＦＰ（Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR））。
【００７４】
分化した神経細胞内でのｅＧＦＰ発現の検出の後に、細胞中のｅＧＦＰ発現の程度を、もし必要なら様々な定量アッセイのうちの一つを用いて、測定するか又は定量してよい。そのようなアッセイは当業者に知られており、ｅＧＦＰ蛋白質の量を測定するための、免疫組織化学、免疫細胞学、フローサイトメトリー、質量分光分析、ウエスタンブロット分析、又はＥＬＩＳＡを含んでよい。
【００７５】
本発明は、さらに、ニューロン（例えば、運動ニューロン）の変性に関連した症状を治療することにおける使用のための薬剤を同定する方法を提供する。本明細書にて使用される「ニューロンの変性」は、ニューロンが劣ったか又は低い機能活性の形態に変化するニューロンの変性の症状を意味する。ニューロンの変性に関連した症状の例は、本明細書に記載された、末梢神経障害、脱ミエリン症状、及び根本的な神経学の症状（例えば、神経変性疾患）、ＣＮＳ及びＰＮＳ外傷及び障害、及び非神経機能不全の後天性二次作用（例えば、変性性、病理性、又は外傷性の自己に対して二次的な神経損失）を含む。
【００７６】
本発明の方法は、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）神経前駆細胞を生成するのに有効なレチノイン酸の量に、当該胚性幹細胞の培養物を接触させ；（ｃ）神経前駆細胞中のヘッジホッグシグナリング経路を活性化することにより、神経の幾つか又は全てが変性したニューロンを生成し；（ｄ）変性したニューロンを候補薬剤に接触させ；そして（ｅ）薬剤が変性したニューロンの幾つか又は全ての再生を増強するか否か決定する工程を含む。本明細書にて使用される「再生を増強する」は、変性していたニューロン（神経突起及びミエリン鞘）の部分的又は完全な成長（又は再成長）を増大させるか（augment）、改善するか、又は増加させる（increase）ことを意味する。ニューロンの再生は、中枢神経系及び末梢神経系の両方のニューロンにおいて生じてよい。本発明の一つの態様において、上記薬剤は、変性した運動ニューロンの再生を増強する。
【００７７】
本発明の方法においては、本明細書に記載された、因子（又は薬剤）と細胞の間の接触をもたらすあらゆる方法、及び誘導及び投与のあらゆる方法により、変性したニューロンを候補の薬剤と接触させてよい。ニューロンの再生、及び増強された再生は、公知の手法により測定するか又は検出してよく、ミエリン−特異的且つ軸索特異的な蛋白質のためのウエスタンブロッティング、形態計測を伴う電子顕微鏡、及び当業者に知られているあらゆる方法、分子手法、及びアッセイを含む。さらに、ミエリンの成長を、ｇ−比、軸索：ミエリン結合の完全性の一つの測定法を用いてアッセイしてよい。ｇ−比は軸索とミエリンの全直径割る軸索の直径として定義される。この比は、何れかの一定のサイズの軸索に関しての相対的なミエリンの信頼できる測定値を提供する（Bieri et al.，Abnormal nerve conduction studies in mice expressing a mutant form of the POU transcription factor，SCIP．J．Neurosci．Res.，50：821-28，1997）。多数の研究が証明したことは、０．６のｇ−比がほとんどの繊維には標準であるということである（Waxman and Bennett,Relative conduction velocities of small melinated and nonmyelinated fibers in the central nervous system．Nature New Biol.，238：217，1972）。
【００７８】
本発明の一つの態様において、変性したニューロン内のゲノミックＤＮＡはＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に変異を有する。そのような変性したニューロンは、例えば、上記のとおり、そのゲノムが変異したＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子を含む本発明のトランスジェニック動物から単離してよい。発明の一つの態様において、変性したニューロンは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する。そのような変性したニューロンは、上記のとおり、そのゲノムがｅＧＦＰ遺伝子を含む本発明のトランスジェニック動物から単離してよい。ＳＯＤ及びｅＧＦＰ遺伝子の両方を発現するか、又はＳＭＮ及びｅＧＦＰ遺伝子の両方を発現する変性したニューロンは、ＳＯＤ又はＳＭＮ変異を有するＥＳ細胞を、ｅＧＦＰ遺伝子を含むＥＳ細胞と交配することにより生成してよい。
【００７９】
本発明は以下の実施例において記載されるが、発明の理解を助けるために記載されるのであり、以後の請求の範囲において定義される発明の範囲を、如何なる意味においても、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８０】
実施例
実施例１−ＥＳ−細胞培養
野生型（ＭＭ１３又はＷ９．５）又はＨＢ９：：ＧＦＰトランスジェニックマウス由来の（ＨＢＧ３）ＥＳ細胞を、ＥＳ−細胞培地（４５００ｍｇ／ｌのグルコース及び２２５０ｍｇ／ｌの重炭酸ナトリウムと共に、１ｘ非必須アミノ酸、１ｘヌクレオシド（全てがSpecialty Media，Lavellette，ニュージャージーから）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Sigma Chemical Co.，セントルイス、ミズーリ）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco BRL，ガイセルスベルグ、メリーランド）、１５％のＦＢＳ（HyClone，ロウガン、ユタ）、及び１０００μ／ｍｌのＬＩＦ（Chemicon，テメキュラ、カリフォルニア）の中で初期マウス胚繊維芽細胞の供給層上で生育させた。ＥＳ−細胞のコロニーをプレートから２日後に一部解離させ（dissociated）、そしてＤＦ培地（グルコース（４５００ｍｇ／ｌ，Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Sigma）、１ｘインスリン−トランスフェリン−セレニウムサプリメント（Gibco）、２０ｎＭのプロゲステロン（Sigma）、及び６０μＭのプトレシン（Sigma）を付加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２をＥＳＫ１０培地（ＬＩＦとＦＢＳを除いたが、１０％のノックアウト血清補充（Gibco）を追加したＥＳ細胞培地）と１：１混合した）からなるＤＦＫ５培地の中で培養した。培地を２日後に、レチノイン酸（ＲＡ）（１００ｎＭから２μＭ）（Sigma）、ソニックヘッジホッグ蛋白質（ＳＨｈ−Ｎ；３００ｎＭ）（Curis，Inc.，ケンブリッジ、マサチューセッツ）、ヘッジホッグアゴニストＨｈ−Ａｇ１．３（１−１０００ｎＭ）（Curis，Inc.）、又はヘッジホッグブロッキング抗体（５ＥＩ，３０μｇ／ｍｌ）を付加した新鮮な培地と交換した。胚のボディー（ＥＢｓ）をさらに２−５日間培養した。幾つかの実験のために、ＥＳ細胞をストロマＰＡ６細胞系（Riken Cell Bank，日本）の単層上で、ＤＦＫ５培地単独か、又は記載されたとおりに（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons fom ES cells by stromal cell-derived inducing activity．Neuron，28：31-40，2000）、２μＭのＲＡを追加して生育させた。
【００８１】
幾つかのＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来のＥＢｓを誘導の４日後にパパイン分離システム（Worthington Biochemical Corp.，フリーホールド、ニュージャージー）を用いて分離し、内生ｅＧＦＰ発現に基づいてＦＡＣＳ分類し、マトリゲル（ＢＤ）をコートされたペトリ皿又はテラサキウエル上にプレートし、そして５％のウマ血清（Gibco）、１ｘのＢ−２７サプリメント（Gibco）、１ｘのインスリン−トランスフェリン−セレンサプリメント（Gibco）、２０ｎＭのプロゲステロン（Sigma）、及び６０μＭのプトレシン（Sigma）を付加されたＦ１２培地（Specialty Media）内で培養した。神経栄養生因子（ＧＤＮＦ，ＮＴ３，ＣＮＴＦ，及びＢＤＮＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems，Inc.，ミネアポリス、ミネソタ）の混合物を、選択された実験に含ませた。
【００８２】
実施例２−免役細胞化学
胚ボディー（ＥＢｓ）を４％パラホルムアルデヒドにより固定化し、そしてアクリオスタット上で切片化した。免役染色のため、以下の抗体を使用した：ウサギαＨＢ９，αＯｌｉｇ２，αＮｋｘ２．２，αＬｈｘ３，αＤｂｘ１（Pierani et al.，Control of interneuron fate in the developing spinal cord by the progenitor homeodomain protein Dbx1．Neuroon，29(2)：367-84，2001），αＩｒｘ３，αｅＧＦＰ（１：２０００，Molecular Probes，Inc.，ユージーン、オレゴン），αＳｏｘ１（１：５００）（Pevny et al.，Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection．Curr．Biol.，8：971-74，1998），αＯｔｘ２（１：１０００）（Mallamacu et al.，OTX2 homeoprotein in the developing central nervous system and migratory cells of the olfactory area．Mech．Dev.，58：165-78，1996），αＨｏｘＣ５（Liu et al．，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001），及びαｃＨＸ１０；マウスαＰａｘ７，αＰａｘ６，αＨＢ９，αＬｉｍ１，αＮｋｘ６．１，αＮｋｘ２．２，αＥｎ１，αＬｉｍ２（マウス特異的），αＮＣＡＭ（マウス特異的），αＳＣ１（チキン特異的），αＮｅｕＮ（１：５００，Chemicon），αＴｕｊ１（１：２０００）（BabCo，バークレー、カリフォルニア），αＳｙｂ（マウス特異的；１：１０００）（Synaptic Systems），αＳｙｎ（１：１０００，Synaptic Systems），及びα神経繊維；モルモットα−Ｉｓｌ１，抗−Ｏｌｉｇ２，抗−Ｈｏｘｃ６（Liu et al.，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）；ヤギ−αＣｈＡＴ（１：２００）（Chemicon），αＶＡＣｈＴ（マウス特異的；１：１０００）（Chemicon）（Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001,特定しない限り）。
【００８３】
実施例３−ｅＧＦＰトランスジェニックマウス系の生成
マウスＨＢ９遺伝子の５’上流領域（Arber et al.，Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，1999）、続く５’スプライス基質（Choi et al.，A generic intron increases gene expression in transgenic mice．Mol．Cell Biol.，11：3070-74：1991）、ｅＧＦＰ遺伝子、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む約９ｋｂの断片を用いた構築物の前核注入により、トランスジェニックマウス系を確立した。ＨＢ９の約９ｋＢのＮｏｔＩ断片は、Ｅ９．５からＰ１０を試験したトランスジェニック胚内でｅＧＦＰ発現が運動ニューロンを発生させるよう指令するのに十分である。一つのトランスジェニック系において（ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ）、ｅＧＦＰ発現のパターンは内生ＨＢ９の発現のプロフィールにぴったりと一致した。ＥＳ−細胞系を、前に記載されたとおりに（Abbondanzo et al.，Derivation of embryonic stem cell lines．Methods Enzymol.，225：803-23，1993）、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ異型接合胚盤胞から誘導した。一つの選択された系（ＨＢＧ３）について、マウス胚盤胞を発生させるように統合するその能力及び生殖系列の移行（germline transmission）のためのその能力に関して検査した。
【００８４】
実施例４−ＨＢＧ３−細胞−由来の運動ニューロンのＦＡＣＳ単離
ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞の胚ボディーをパパイン分離系（Worthington Biochemical Corp.）を用いて分離した。高いレベルのｅＧＦＰを発現する細胞を、Beckman-Counter Altraフローサイトメトリーを用いて、プロット中に示されたゲートを用いてそれらのｅＧＦＰ蛍光及びフォーワード光散乱に基づいて、細胞懸濁液から分類した。一般に、入力した細胞の２０−３０％は高いレベルのｅＧＦＰを発現した。上記分析は、このｅＧＦＰ−高（Hi)細胞群が＞９５％純粋な集団の運動ニューロンを構成要素としたことを確証した。典型的なＦＡＣＳ分類の収量はＥＢあたり３０００−５０００のＧＦＰ−高細胞である。
【００８５】
実施例５−ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞−由来の運動ニューロンのインビボ移植
ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来のＥＢｓを２μＭのＲＡ及び１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３により誘導した。誘導の３−４日後に、ＥＢｓを一部粉砕して、チキンのＨＨステージ１５−１７の脊髄に移植し、吸引損傷して移植された組織を適応させた。約１／２−１のＥＢ均等物が、チキン胚脊髄の吻側頸部、尾部側頸部、胸部、又は腰部領域において２から５の体節にわたるセグメントに移植した。幾つかの胚を移植の３日後に回収し、固定化し、ビブラトーム上で切片化し、そしてｅＧＦＰに対する抗体及び細胞−又は種−特異的抗体により染色した。他の胚（胸部脊髄への移植物を受ける）は７日目に回収した。それらの胸郭を切開し、ローダミン−コンジュゲートされたα−ブンガロトキシン（２μｇ／ｍｌ，Molecular Probe，Inc.）及びＧＦＰ，Ｓｙｂ，Ｓｙｎ，又はＶＡＣｈＴに対する抗体によりホウルマウント（wholemount）として染色した。
【００８６】
以下に記載されるとおり、発明者らの実験結果は、レチノイン酸が胚ボディー（ＥＢｓ）中の神経前駆細胞上に尾部側化効果を有すること、運動ニューロン前駆体特異化が尾部側化ＥＢｓにおいてはヘッジホッグ依存性であること、ｅＧＦＰ−標識されたＥＳ−由来のニューロンは生成及び単離に成功するかもしれないこと、そしてｅＧＦＰ−標識されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンは胚の脊髄内で分化することを示す。
【００８７】
ＲＡは胚ボディー中で神経前駆体を尾部側化する
マウスＥＳ細胞が運動ニューロンを生じさせる能力を検査し始めるため、発明者らは、凝集培養において２日間マウスＥＳ細胞を生育させたが、胚ボディー（ＥＢｓ）の形成をもたらす方法であった（Bain et al.，Embryonic stem cells express neuronal propertiesin vitro．Dev．Biol.．168：342-57，1995）。最初に約１０００の細胞からなったＥＢｓは、さらに１−７日間、追加の因子の存在又は不在下で、懸濁培養にて保持した。
【００８８】
制御条件下では、２−３日間生育させたＥＢｓは、全神経前駆体マーカーＳｏｘ１発現する細胞を、あるとしても僅かしか含まなかった（図１）（Pevny et al.，Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection．Curr．Biol.，8：971-74，1998；Wood et al.，Comparative expression of the mouse Sox1，Sox2 and Sox3 genes from pre-gastrulation to early somite stages．Mech．Dev.，86：19-201，1999）。同様に、５日目に検査されたＥＢｓは、神経核マーカーＮｅｕＮの発現により評価されるニューロン及びＭＡｂ ＴｕＪ１により認識される神経βチューブリンアイソフォームを、あったとしても僅かしか含まなかった（図１Ｂ及び示さないデータ）。対照的に、ＥＢｓのＲＡ（１００ｎＭから２μＭ）への２−３日の暴露は、多数のＳｏｘ１＋細胞の存在をもたらし；５日間で、多数のＮｅｕＮ＋，ＴｕＪ１＋有糸分裂後のニューロンが検出された（図１Ｂ及び示さないデータ）。即ち、マウスＥＳ細胞由来のＥＢｓはニューロンを生じさせるように誘導することができる。Bain et al.，Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro．Dev．Biol.，168：342-57，1995；及びXiam et al.，Peering into early neurogenesis with embryonic stem cells．Trends in Neurosci.，24：685-86，2001も参照。
【００８９】
発明者らは、次に、両者の同時発現が初期中脳の位置アイデンティティーの指標である、Ｏｔｘ２とＥｎ１の発現をアッセイすることにより（Davis et al.，Expression pattern of the homeobox-containing genes En-1 and En-2 and the proto-oncogene int-1 diverge during mouse development．Genes Dev.，2：1736-44，1988；Mallamaci et al.，OTX2 homeoprotein in the developing central nervous system and migratory cells of the olfactory area．Mech．Dev.，58：165-78，1996）、そして、脊髄の位置アイデンティティーマーカーであるＨｏｘ蛋白質Ｈｏｘｃ５，Ｈｏｘｃ６及びＨｏｘｃ８の発現をアッセイすることにより（Belting et al.，Multiple phases of expression and regulation of mouse Hoxc8 during early embryogenesis．J．Exp．Zool.，282：196-222，1998；Liu et al.,Assigning the pisitional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）、ＲＡ−暴露されたＥＢｓ内に形成された神経前駆細胞の吻側位置のアイデンティティーを決定した。３日間ＲＡに暴露されたＥＢｓ中の細胞はＯｔｘ２とＥｎ１の発現を欠き、そしてＨｏｘｃ５及びＨｏｘｃ６を発現したが、Ｈｏｘｃ８は発現しなかった（図１Ｂ及び示さなかったデータ）。神経Ｈｏｘ−ｃ発現のこのプロフィールは、吻側頸部脊髄の位置的特性を伴う細胞の指標である（Belting et al.，Multiple phases of expression and regulation of mouse Hoxc8 during early embryogenesis．J．Exp．Zool.，282：196-222，1998；Liu et al.,Assigning the pisitional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。
【００９０】
ＥＳ細胞のＲＡへの暴露は神経の分化及び脊髄位置的マーカーの発現の両方を促進させるから、このプロトコルはＲＡのＥＳ−由来の神経細胞に対する尾部側化作用の直接の試験を可能にさせない。よって、発明者らは、ＲＡ−非依存性経路を通してＥＳ細胞を神経化する手段を探した。これを達成するため、発明者らは、神経誘導性シグナルの源としてＰＡ６ストロマ細胞系を使用した（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells to PA6 cell activity for 5 days induced activity．Neuron，28：31-40，2000）。マウスＥＳ細胞のＰＡ６細胞活性への５日間の暴露は、莫大な数のＳｏｘ１＋細胞を誘導し、それらの多くはＯｔｘ２及びＥｎ１を同時に発現した；対照的に、Ｈｏｘｃ５又はＨｏｘｃ６を発現した細胞はなかった（図１Ｃ及び示さなかったデータ）。さらに、６日間で、多数のＯｔｘ２＋，ＴｕＪ１＋ニューロンが検出された（図１Ｃ）。ＥＳ細胞のＰＡ６細胞活性及びＲＡ（２μＭ）への暴露は、なおも多数のＳｏｘ１＋を誘導した；しかしながら、これらの細胞はＯｔｘ２及びＥｎ１の発現を欠いたし、多くが今はＨｏｘｃ５及びＨｏｘｃ６を発現した（図１Ｃ及び示さなかったデータ）。合わせると、これらの発見は、インビボにおけるように（Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999）、初期中脳と同様な位置的特性の神経化ＥＳ細胞が尾部側化されることにより、ＲＡへの暴露に際して脊髄と同様な位置的特性になり得ることを示す。
【００９１】
運動ニューロン前駆体特異化は尾部側化胚ボディーにおいてＨｈ−依存性である
ＲＡに暴露されたＥＢｓ内に存在した、脊髄の位置的特性を有する神経前駆体が運動ニューロン前駆体に分化できるか否かを検査するため、発明者らは、運動ニューロン前駆体アイデンティティーの特異化において連続的な工程を規定するＨＤ及びｂＨＬＨの転写因子の発現を監視した（図２Ａ）。神経前駆細胞のＰａｘ７，Ｉｒｘ３，Ｄｂｘ１，Ｐａｘ６，Ｎｋｘ６．１，Ｎｋｘ２．２，及びＯｌｉｇ２の詳述された別個のセットが、神経管の背−腹軸に沿って配置された（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral axis of the neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001；図２Ｂ）。脊髄の運動ニューロン前駆体がｐＭＮドメイン中に発見された；それらはＰａｘ６，Ｎｋｘ６．１及びＯｌｉｇ２を発現し、そしてＰａｘ７，Ｉｒｘ３，Ｄｂｘ１及びＮｋｘ２．２を排除した（図２Ｂ及び示さなかったデータ）。ＲＡに３日間暴露されたＥＢｓは、Ｐａｘ７，Ｐａｘ６，Ｉｒｘ３及びＤｂｘ１を発現する細胞を多数含み、そしてＮｋｘ６．１，Ｏｌｉｇ２又はＮｋｘ２．２を発現する細胞はあったとしてもほとんど含まなかった（図２Ｃ及び２Ｄ及び示さなかったデータ）。転写因子の発現のこのプロフィールは、介在ニューロンを生じる背側及び中間の脊髄内に位置する前駆細胞の特徴である（図２Ｂ）（Lee et al.，The specification of dorsal cell fates in the vertebrate central nervous system．Annu．Rev．Neurosci.，22：261-94，1999）。
【００９２】
運動ニューロン前駆体の誘導は、ＳＨｈ活性に依存する（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral axis of the neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001）。よって、発明者らは、ＳＨｈシグナリングがＲＡに暴露されたＥＢｓにおいて前駆細胞転写因子発現のプロフィールを変化させるか否かを検査した。ＳＨｈシグナリング経路を達成するため、発明者らは、ＳＨｈシグナリングの特異的小分子アゴニストであるＨｈ−Ａｇ１．３（Frank-Kamenetsky et al.，Chemical genetics of Hh signaling：Identification and characterization of Smoothened agonists and antagonists．Submitted，2002）又は組換えＳＨｈ−Ｎ蛋白質（Roelink et al.，Floor plate and motor neuron induction by different concentration of the amino-terminal cleavage product of sonic hedgehog antoproteolysis．Cell，81：445-55，1995）を使用し、本質的に同一の結果を得た。
【００９３】
ＲＡ処理されたＥＢｓの１０ｎＭのＨｈ−Ａｇ１．３への３日間の暴露は、転写因子発現のプロフィールに顕著な変化をもたらした。Ｐａｘ７発現は完全に抑圧され、Ｐａｘ６＋及びＩｒｘ３＋細胞の数は増加し、Ｄｂｘ１＋細胞の数は減少し、そして僅かなＮｋｘ６．１＋及びＯｌｉｇ２＋細胞が検出された（図２Ｃ及び２Ｄ及び示さなかったデータ）。ＲＡ処理されたＥＢｓの１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３への暴露は、Ｄｂｘ１発現を事実上は除去し、Ｉｒｘ３＋及びＰａｘ６＋細胞の数を顕著に減少させ、そして大きく増加した数のＮｋｘ６．１＋及びＯｌｉｇ２＋細胞を誘導した（図２Ｃ及び２Ｄ）。Ｈｈ−Ａｇ１．３に暴露されたＥＢｓ内のＯｌｉｇ２＋細胞の多くがＢｒｄＵを取込んだことから（図１０）、それらは循環する前駆体であることが示された。この濃度のＨｈ−Ａｇ１．３において、僅かなＮｋｘ２．２＋細胞も検出された（図２Ｃ及び２Ｄ）が、ＨＮＦ３β＋フロアープレート細胞は検出されなかった（データは示さず）。Ｈｈシグナリングに応答性のＥＢｓ内の前駆細胞転写因子マーカーの発現のプロフィールの背側から腹側へのシフトは、神経管前駆体の挙動によく似ている（Ericson et al.，Two critical periods of Sonic Hedgehog signaling required for the specification of motor neuron identity．Cell，87：661-73，1996；Ericson et al.，Pax6 controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded SHh signaling．Cell，90：169-80，1997;Ericson et al.，A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube．Cell，101：435-45，2000）。特に、高レベルのＳＨｈシグナリングは、運動ニューロン前駆体のＨＤ及びｂＨＬＨ蛋白質発現の特徴のプロフィールを発現した多数の細胞を生じさせた。
【００９４】
運動ニューロンがＲＡ−及びＨｈ−暴露されたＥＢｓ内に存在する尾部側化され且つ腹側化された前駆細胞から生じたか否かを決定するため、発明者らは、体細胞の運動ニューロンにより選択的且つ不変に発現されるＨＤ蛋白質、ＨＢ９の発現を分析した（Pfaff et al.，Requirement for LIM homeobox gene Isl1 in motor neuron generation reveals a motor neuron-dependent step in interneuron differentiation．Cell，84：309-20，1996；Arber et al.，Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，659-764，1999；Thaler et al.，Active suppression of interneuron programs within developing motor neuron revealed by analysis of homeodomain factor HB9．Neuron，23：675-87，1999）（図３Ａ）。５日間単独で生育されたＲＡに暴露されたＥＢｓは僅かなＨＢ９＋ニューロンを確かに含んだ（図３Ｂ；７±２ ＨＢ９＋ニューロン／切片）。これらのニューロンがＨｈ−依存性様式にて生じたのか否かを試験するため、発明者らは、機能をブロックする抗−Ｈｈ抗体の存在下でＲＡ−暴露ＥＢｓを生育させた（ｍＡｂ ５Ｅ１ Ｉｇ，３０μｇ／ｍｌ）（Ericson et al.，Two critical periods of Sonic Hedgehog signalng required for the specification of motor neuron identity．Cell，87：661-73，1996）。抗−Ｈｈ存在下で生育させたＲＡに暴露されたＥＢｓはＨＢ９＋ニューロンを含まなかったことから（図３Ｂ）、Ｈｈの体内の源は、ＲＡに暴露されたＥＢｓに見いだされる僅かな運動ニューロンの分化のために必要とされる。
【００９５】
発明者らは、運動ニューロンの生成がＲＡに暴露されたＥＢｓ内のＨｈシグナリングのレベルを評価することにより増強できるか否かも検査した。ＲＡ処理されたＥＢｓのＳＨｈ（３００ｎＭ）又はＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）への暴露は、生じた運動ニューロンの数を顕著に増加させ；典型的には、これらのＥＢｓ中の２０−３０％の細胞がＨＢ９を発現した（約５０００のＨＢ９＋ニューロン；５０９±５７のＨＢ９＋ニューロン／切片；約１０−１５の切片／ＥＢ）（図３Ｂ及び示さなかったデータ）。これらのＨＢ９＋細胞はＮｅｕＮとＴｕＪ１を同時発現し（図３Ｃ及び３Ｄ）、そしてＢｒｄＵを取込まなかった（図１０）ことからそれらは有糸分裂後のニューロンであることが示される。ＨＢ９＋ニューロンは、ＲＡ暴露なしでＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）により５日間処理されたＥＢｓにおいて生じなかった（図３）。即ち、ＥＢｓ内の運動ニューロンの生成はＲＡの尾部側化作用及びＨｈシグナルの腹側化作用の両方に依存する。
【００９６】
有糸分裂後の運動ニューロンの分子特性をより詳細に査定するため、発明者らは、脊髄の運動ニューロンのサブセット：Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３及びＬｉｍ１により発現されるＬＩＭ ＨＤ蛋白質の発現を検査した（Tsuchida et al.，Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes．Cell，79：957-70，1994；Sharma et al.，LIM homeodomain factors Lhx3 and Lhx4 assign subtype identities for motor neurons．Cell，95：817-28，1998；Kania et al.，Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb．Cell，102：161-73，2000）（図３Ａ）。３つの全てのＬＩＭ ＨＤ蛋白質はＲＡ及びＨｈに暴露されたＥＢｓにおいてＨＢ９＋運動ニューロンにより発現された。７０％を超えるＨＢ９＋運動ニューロンがＩｓｌ１とＬｈｘ３を同時発現した（図３Ｅ及び３Ｆ）が、はるかに少ないフラクション（＜５％）がＬｉｍ１を同時発現した（図３Ｇ）。ＨＢ９＋ニューロンは何れも後脳（hindbrain）の内臓の（visceral）運動ニューロンのマーカーＰｈｏｘ２ｂを同時発現しなかった（Pattyn et al.，Control of hindbrain motor neuron differentiation by the homeobox gene Phox2b．Development，127：1349-58，2000）。側面の（lateral）運動柱（ＬＭＣ）ニューロンのプロフィールの指標である、ＨＢ９とＬｉｍ１を同時発現する運動ニューロンの低い比率（Kania et al.，Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb．Cell，102：161-73，2000）は、運動ニューロンの吻側頸部のアイデンティティーと一致しており、Ｈｏｘ−ｃ蛋白質発現のプロフィールにより明らかになった（Belting et al.，Multiple phases of expression and regulation of mouse Hoxc8 during early embryogenesis．J．Exp．Zool.，282：196-222，1998；Liu et al.，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。
【００９７】
ＳＨｈは特別な（graded）様式にて作用するから、腹側の介在ニューロンは運動ニューロンの生成に十分な濃度よりほんの僅か低い濃度にて誘導される（Briscoe and Ericson，Specification of neuronal fates in the ventral tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11(1)：43-49，2001）。よって、発明者らは、腹側の介在ニューロンも１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３に暴露されたＲＡ処理したＥＢｓにおいて生じるか否かを検査した。Ｌｈｘ３＋，Ｃｈｘ１０＋Ｖ２介在ニューロン及びＬｉｍ１／２＋（Ｖ０及びＶ１同様）介在ニューロンがこれらのＥＢｓ内で検出された（図３Ｇ及び３Ｈ及び示されなかったデータ）。即ち、初期神経組織を用いたように（Briscoe and Ericson，Specification of neuronal fates in the ventral tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11(1)：43-49，2001）、ＥＢｓ中の細胞が暴露されたＨｈシグナリングのレベルにおける小さなバリエーションが、腹側の介在ニューロン及び脊髄の運動ニューロンの両方の生成をもたらす。
【００９８】
ｅＧＦＰ標識されたＥＳ細胞由来の運動ニューロンが生成されて単離されるかもしれない
ＲＡ及びＨｈシグナリングによりＥＢｓ内で誘導された腹側の神経の不均一性は、発明者らが、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンを同定し、精製し、そして操作する方法を開発することを促した。よって、発明者らは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）の発現により同定可能な運動ニューロンを生じさせ得るＥＳ細胞系をデザインした。運動ニューロン特異的トランス遺伝子発現を授与するマウスＨＢ９遺伝子の９−ｋｂの５’領域の制御下でｅＧＦＰのｃＤＮＡを発現する、トランスジェニックマウス系を生成した（図４Ａ）（Arber et al.，Requirement for the homeobox gene HB9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，1999）。ＨＢ９とｅＧＦＰの発現のパターンを比較することにより、トランスジェニックファウンダーマウスをスクリーニングした。一つのマウス系列、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂが高いレベルのｅＧＦＰをＥ９．５−Ｐ１０マウスにて脊髄運動ニューロンの細胞ボディー内で、内生ＨＢ９と平行したパターンで発現したことがわかった（図４Ｂ−４Ｇ）。さらに、ｅＧＦＰ発現が高レベルで運動ニューロンの軸索及び樹状突起内に検出された（図４Ｃ及び示されなかったデータ）。ＥＳ細胞系（ＨＢＧ３）をｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂトランスジェニックマウスから誘導した；これらの細胞は、生殖系を通してｅＧＦＰ遺伝子を遺伝し、そして類似の運動ニューロン選択パターンにてｅＧＦＰの発現を指示した（データは示さず）。
【００９９】
発明者らは、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞が、ＲＡ及びＨｈ暴露の条件下で、他のマウスＥＳ細胞によく似た様式にて運動ニューロンに分化したことを発見した。Ｈｈ−Ａｇ１．３なしでＲＡ中に５日間生育させたＨＢＧ３ ＥＳ細胞から生じさせたＥＢｓは、僅かなＨＢ９＋運動ニューロンを含み、これらの全てはそれらの身体及び神経突起中でｅＧＦＰを同時発現した（図５Ａ）。ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンの数はＨｈ−Ａｇ１．３への暴露に際して増加し、濃度依存様式であった（図５Ｂ及び５Ｃ）。典型的には、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンは、ＲＡ及び１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３へ暴露されたＥＢｓ中に存在する細胞の全数の２０−３０％を占めた（１０００；図５Ｃ）。ＲＡ存在下におけるＥＢｓのＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）への暴露は、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンを生じさせなかった（−１０００；図５Ｃ）。即ち、ＨＢＧ３ ＥＢ細胞は、ＲＡ及びＨｈシグナリング経路の活性化を通して十分な様式にてｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンを生じさせるために誘導することもできる。
【０１００】
発明者らは、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが胚由来の運動ニューロンの特徴であるインビトロの分化の局面を経験するか否かを試験するためにｅＧＦＰ発現を使用した。ＲＡ−及びＨｈ−暴露されたＥＢｓ（図５Ｄ）を単一の細胞又は小さな凝集体に分離し、そして神経栄養因子の存在下でマトリゲル基質上にプレートした。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは接着して長い突起を延ばし、ｅＧＦＰ発現により可視化できた（図５Ｒ−５Ｆ）。これらのＥＳ細胞由来の運動ニューロンの形態上の特徴はｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂマウスの胚脊髄から単離されたｅＧＦＰ標識運動ニューロンの特徴と似ていた（図６Ｊ及び６Ｋ及び示さなかったデータ）。さらに、生じさせたｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンは、インビトロにてコリンアセチルトランスフラーゼを発現した（図５Ｇ及び５Ｈ）ことから、それらのコリン作用性神経伝達物質の状態の指標である。
【０１０１】
発明者らは、初期胚運動ニューロンとの直接の比較において、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの神経栄養性因子依存性も検査した。発明者らは、ＲＡ及びＨｈに暴露されたＨＢＧ３−由来のＥＢｓを単一細胞懸濁液へ分離し、そして蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて高いレベルのｅＧＦＰを発現する細胞を単離した（図６Ａ）。平行して、発明者らは、Ｅ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の吻側頸部脊髄から初期胚運動ニューロンをＦＡＣＳにより単離した（データは示さず）。何れかの源から、高レベルのｅＧＦＰを発現したニューロンの＞９８％はＨＢも発現し（図６Ｂ及び６Ｃ）、そしてこれらのニューロンは長い突起を延ばした（図６Ｄ、及び６Ｅ及び示さなかったデータ）。ＨＢＧ３ ＥＳ細胞から生じさせた（図６Ｆ−６Ｉ及び６Ｌ）か又はＥ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚から単離した（図６Ｊ−６Ｌ）精製されたｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンの生存は、神経栄養性因子に対する類似の依存性を呈した（例えば、Bloch-Gallego et al.，Survival in vitro of motoneurons identified or purified by novel antibody-based methods is selectively enhanced by muscle-derived factors．Development，111：221-32，1991；及びCamu et al.，Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor．J．Neurosci．Methods，44：59-70，1992を参照）。
【０１０２】
ＥＳ細胞由来のｅＧＦＰ＋運動ニューロンは胚脊髄内で分化する
ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンのインビトロ生存及び分化は、発明者らが、インビボにて脊髄へ再導入された場合にこれらのニューロンの挙動を検査することを促した。ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３暴露の３−４日後にＥＢｓを単離して（有糸分裂後の運動ニューロンが最初に出現したとき）、小凝集体に分散させ、そしてＨＨステージ１５−１７のチキン胚の脊髄の将来の吻側（又は尾部側）頸部、胸部又は腰部レベルに移植した（図７Ａ）が、当該ステージは内生運動ニューロンの分化が始まるステージである（Hollyday et al.，An antoradiographic study of the formation of the lateral motor column in the chick embryo．Brain Res.，132：197-208，1977）。操作された胚をさらに３−７日間、ＨＨステージ２７−３６まで発生させた。
【０１０３】
ＨＨステージ２７において操作された胚の脊髄の分析は、多数のｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンの存在を明らかにした（図７Ｂ−７Ｊ及び７Ｏ−７Ｑ）。ＥＢグラフトの最初の背腹の置き換えは制御されなかったが、発明者らは、３−７日後に検査したときに、チキンの脊髄内のマウスの運動ニューロン及び介在ニューロンの位置において著しい分離を検出した（図７Ｅ）。ほとんど一定して、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンが内生運動ニューロンのそれに特徴的な腹側両面の位置内に見いだされたが、ＥＢ由来のＬｉｍ２＋介在ニューロン（齧歯類特異的抗体により認識される）は脊髄の背腹軸に沿って散在した（図７Ｅ）。莫大なｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンが、グラフティングのセグメントレベルの除去にも拘わらず、Ｌｈｘ３を同時発現し、そしてＬｉｍ１の発現を欠いた（図７Ｆ及び示さなかったデータ）。即ち、インビトロにおいて観察されたｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋のＥＳ細胞の運動ニューロンはインビボグラフティングにより変化しなかったことが明白である。
【０１０４】
Ｏｌｉｇ２＋運動ニューロン前駆体がグラフト化されたＥＢｓ内に存在したことから、インサイチュにて末期の分化を受けたグラフト化前駆細胞由来のチキンの脊髄の中に見いだされた幾つか又は全部のｅＧＦＰ＋運動ニューロンであり得る。従って、発明者らは、インビトロにおいてＨＢＧ３細胞から生じさせた有糸分裂後運動ニューロンがインビボにおいて脊髄の中で生存することもできるか否かを試験した。ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋のＥＳ細胞由来の運動ニューロンを分離したＥＢｓからＦＡＣＳ分類により単離して、次に、チキンの脊髄にグラフト化した。３日後、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンが脊髄の腹側領域内に見いだされた（図７Ｃ及び７Ｄ）。即ち、有糸分裂後のＥＳ細胞由来の運動ニューロンはインビボにおいて生存も分化もできる。
【０１０５】
特定の幹細胞集団が体細胞との融合を受けることが報告された（Terada et al.，Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion．Nature，416：542-45，2002；Ying et al.，Changing potency by spontaneous cell fusion．Nature，545-48，2002）ことから、発明者らが、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来のｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンがチキンの脊髄のニューロンと体細胞ハイブリッドを形成したかもしれない可能性を試験することを促した。発明者らは、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロン細胞ボディーがマウスオリジンのニューロン表面蛋白質、例えば齧歯類特異的抗体により認識される−ＮＣＡＭ（図７Ｇ）を発現したが、チキンオリジンの表面蛋白質、例えばチキン特異的抗体により認識されるＳＣＩ（図７Ｉ）は発現しなかったことを発見した。同様に、グラフト化された運動ニューロンの軸索はマウスの表面蛋白質を発現したが、チキンの表面蛋白質は発現しなかった（図７Ｈ及び７Ｉ）。これらの発見は、体細胞融合が起こることに対する直接の証拠を提供する。
【０１０６】
追加の対照として、発明者らは、インビトロにおけるＲＡへの暴露によりニューロン化及び尾部側化されたが、抗Ｈｈ抗体（５Ｅ１；３０μｇ／ｍｌ）の注入により腹側化を妨げられたＨＢＧ３ ＥＢｓのグラフトの運命を検査した。多数のマウスＮＣＡＭ＋細胞及びＬｉｍ２＋介在ニューロンが見いだされたが、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンは検出されなかった（図７Ｋ−７Ｎ）。即ち、ＲＡに暴露されたＥＢｓ内に存在する細胞は、宿主チキン組織により提供されたシグナルへの暴露に際してインビボの運動ニューロンの運命には向けられなかった。
【０１０７】
さらに、発明者らは、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが脊髄の外側に伸びるか否かを検査した。多数のｅＧＦＰ＋軸索が腹側の根（roots）に検出された（図７Ｂ，７Ｃ，７Ｄ及び７Ｏ）。ＨＨステージ２７の胚のｅＧＦＰ＋運動軸索の末梢突起のパターンの分析は、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが吻側頸部レベルにてグラフト化されて、軸索筋肉組織に突起したこと（データは示さず）、胸部レベルでグラフト化された運動ニューロンが軸索及び体壁筋肉組織の両方に対して突起したこと（図７Ｏ及び７Ｐ）、そして四肢のレベル（尾部側頸部又は腰部脊髄）でグラフト化された運動ニューロンが四肢の背側及び腹側の二等分に軸索を突起させたことを明らかにした（図７Ｑ及び示さなかったデータ）。即ち、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは、脊髄の異なるセグメントレベルを集団化し（populate）、そしてインビボにて宿主体細胞運動ニューロンにより選択された主要な末梢軸索経路に沿って突起することが可能である。
【０１０８】
発明者らは、ｅＧＦＰ＋運動ニューロンの軸索が筋肉標的に到達することも発見した。例えば、ｅＧＦＰ＋運動軸索の広範囲な内部への成長及び分枝化が、ＨＨステージ３０−３５において肋間筋肉中に検出された（図８Ａ）。発明者らは、これらのｅＧＦＰ＋運動軸索が筋肉接触の部位において末端シナプスの分化の側面を呈するか否かを検査した。特に、発明者らは、神経の末端分化の３つのマーカー：齧歯類特異的抗体により認識されるシナプトブレビン（Ｓｙｂ）；齧歯類特異的抗体により認識される小胞性（vesicular）ＡＣｈトランスポーター（ＶＡＣｈＴ）；及び齧歯類及びチキンの両方の蛋白質を検出する抗体により認識されるシナプトタグミン（Ｓｙｎ）を分析した。筋肉と接触した部位において、ｅＧＦＰ＋運動軸索ブランチが前シナプス分化（specializations）のサインを示したことが、Ｓｙｂ，Ｓｙｎ及びＶＡＣｈＴの局所（focal）発現により明らかにされた（図８Ｂ−８Ｅ）。
【０１０９】
発明者らは、次に、ｅＧＦＰ＋運動軸索の前シナプス末端分化がＡＣｈ受容体の分配を分析することにより筋肉表面膜の後シナプス分化と整列化された（aligned）か否かを検査した。ｅＧＦＰ＋運動軸索の末端分化の多くが筋肉表面上でＡＣｈ受容体の局所クラスターと整列化されたことが、ローダミン−α−ブンガロトキシン（Ｒｈ−α−ＢＴＸ）標識により定義された（図８Ｆ）。即ち、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索は、インビボにおいて標的の骨格筋によりシナプスを形成することが明白であった。
【０１１０】
上で詳述されたとおり、発明者らは、インビボにおいて特定のニューロンのサブタイプへの神経前駆細胞の変換に関与する、細胞外誘導性シグナル及び転写因子の描写が、ＣＮＳニューロンの特定のクラスへのＥＳ細胞の分化に対する、発生学に基づく合理的なアプローチを可能にさせる。発明者らの発見は、高い効率で脊髄運動ニューロンを生じさせることが可能なこと、及びＥＳ細胞からの運動ニューロンの生成の経路がインビボにおいて運動ニューロンの生成の工程を再現することを示す。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは、インビボにて腹側脊髄を再増殖し、軸索を末梢に伸長し、そして筋肉標的によりシナプスを形成する。これらの研究は、正常な発生シグナリングカスケード、特に細胞外誘導性シグナルの調節へ洞察を適用する可能性を確立することにより、ＣＮＳニューロンの特定のクラスへのＥＳ細胞の分化を指示する。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが標的筋肉細胞に神経を分布させる能力は、脊髄の損傷及び運動ニューロンの変性疾患の哺乳類モデルにおいて運動機能を回復させるための、そのようなニューロンの使用の系統的評価の可能性を提供する。
【０１１１】
ＥＳ細胞からの運動ニューロン生成の経路
インビボの運動ニューロンの運命の特異化は、３つの連続する工程：（ａ）外胚葉細胞の初期神経化；（ｂ）神経細胞の二次的尾部側化；及び（ｃ）尾部側化された神経細胞の腹側化にあると考えることができる（Jessell et al.，Neuronal specification in the spinal cord：inductive signals and transcriptional codes．Nat．Rev．Genet.，1：20-29，2000；Wilson et al.，Neural induction：toward a unifying mechanism．Nat．Neurosci.，補遺４：1161-1168，2001）。本明細書中で論じられた、発明者らの結果は、ＥＳ細胞の運動ニューロンへの分化の経路が神経細胞の尾部側化及び腹側化に関与する通常のプログラムに似ている証拠を提供する。
【０１１２】
それらの最終的な位置的アイデンティティーにも拘わらず、神経プレート細胞は最初に吻側特性を有するらしい（Munoz-Sanjuan et al.，Neural induction：the default model and embryonic stem cells．Nat．Rev．Neurosci.3：271-80，2002）。脊髄の特性の次の負担（imposition）は、軸に近い中胚葉により提供されるＲＡ−媒介性シグナルを含むらしい（Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999；Wilson et al.，Neural induction：toward a unifying mechanism．Nat．Neurosci.，補遺４：1161-68，2001）。特に、ＲＡは中脳又は吻側後脳アイデンティティーを犠牲にして脊髄の特性を特定することが示された（Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999）。発明者らは、ＰＡ６細胞活性への暴露により神経化されたＥＳ細胞が中脳の位置的特性を発現する（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells to PA6 cell activity for 5 days induced activity．Neuron，28：31-40，2000も参照）が、ＲＡへの暴露に際して頸部脊髄位置アイデンティティーに変換できることを発見した。この研究において記載された運動ニューロン生成におけるＲＡ暴露のための要求は、中脳のドーパミン作用性神経分化のＲＡが媒介する阻害により補われる（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells to PA6 cell activity for 5 days induced activity．Neuron，28：31-40，2000）。合わせて、これらの発見は、神経管の吻側尾部側の軸をパターン化することにおけるその通常の役割に平行した様式にて、神経化されたＥＢｓ内でＲＡが脊髄の位置的アイデンティティーを促進させるという見解を支持する。
【０１１３】
ＥＢｓ中でＲＡにより誘導された脊髄細胞が何故吻側頸部の位置的アイデンティティーを有するのであろうか？これに対するもっともらしい理由は、一般的脊髄前駆体のアイデンティティーの特異化の後の時点で、脊髄細胞の吻側尾部側の位置的アイデンティティーが進行中のＲＡシグナリングにより影響され続けるという発見から来る（Liu et al．，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。特に、ＲＡが媒介するシグナリングは、胸部及び腰部の位置的アイデンティティーの犠牲として吻側頸部脊髄の位置的特性の獲得を促進する（Liu et al．，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。即ち、神経化されたＥＳ細胞のＲＡへの暴露は、最初の脊髄の位置的特性の創発（emergence）、及びこれらの細胞の吻側頸部アイデンティティーへの限定の両方の説明となるらしい。
【０１１４】
脊髄の前駆体アイデンティティーを獲得したＥＳ細胞も、運動ニューロン前駆体特異化の通常の経路をたどるらしい。これに関する証拠の一つのラインは、Ｈｈシグナリングに対するそれらの細胞の感受性である。インビボにおけるような（Chiang et al.，Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic Hedgehog gene function．Nature，383，407-13，1996）、ＥＳ細胞由来の脊髄前駆体からの運動ニューロンの生成は、完全にＨｈシグナリングに依存する。即ち、追加されたＨｈの不在下での僅かな運動ニューロンの生成は、ＥＢｓ内の低レベルの内生Ｈｈ活性の発現によりもたらされるらしく、おそらくは、ＩＨｈ又はＳＨｈにより媒介される（Byrd et al.，Hedgehog is required for murine yolk sac angiogenesis．Development，129：361-72，2002；Dyer et al.，Indian hedgehog activates hematopoiesis and vasculogenesis and can respecify prospective neurectodermal cell fate in the mouse embryo．Development，128：1717-30，2001）。逆に、ＥＢｓ内でＨｈシグナリングのレベルを上昇させると、運動ニューロン生成を顕著に増強する。
【０１１５】
証拠の第２のラインは、Ｈｈシグナリングにより導き出される前駆体転写因子の発現のプロフィールにより提供される。Ｈｈシグナリングの不在下では、ＥＢｓ内の脊髄前駆体は、背及び中間の神経前駆体アイデンティティーを呈する。Ｈｈシグナリングの活性化は初期脊髄前駆細胞の応答を厳密に模倣する濃度依存性様式において背側前駆体決定基の発現を失わせる（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral axis of the neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001）。さらに、高レベルのＨｈシグナリング活性はＮｋｘ６．１とＯｌｉｇ２の発現を誘導し−当該２つの前駆細胞転写因子はインビボにおいては深く運動ニューロン生成にリンクする（Sander et al.，Ventral neural patterning by Nkx homeobox genes：Nkx6.1 controls somatic motor neuron and ventral interneuron fates．Genes Dev.，14：2134-39，2000；Vallstedt et al.，Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification．Neuron，31：743-55，2001；Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001；Mizuguchi et al.，Combinatorial roles of olig2 and neurogenin2 in the coordinated induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001）。合わせると、これらの発見は、神経化ＥＳ細胞が初期神経プレート細胞の挙動によく似た様式で吻側及び背腹側パターン化シグナルの両方に応答し、最初に脊髄前駆細胞を生じ、そして次に運動ニューロン前駆体を生じることを示す。
【０１１６】
発明者らの研究は、ＥＳ細胞からの神経分化の初期の相に関与する工程を扱ってこなかった。インビボでは、神経の誘導が阻害性（blockade）ＢＭＰシグナリングに依存するらしく（Munoz-Sanjuan et al.，Neural induction，the default model and embryonic stem cells．Nat．Rev．Neurosci.，３：271-80，2002）、そして少なくともチキンにおいてはＦＧＦｓへの暴露に依存するらしい（Streit et al.，Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation．Nature，406：74-78，2000；Wilson et al.，An early requirement for FGF signalling in the acquisition of neural cell fate in the chick embryo．Curr．Biol.，10421-429，2000；Wilson et al.，The status of Wnt signalling regulates neural and epidermal fates in the chick embryo．Nature，411：325-30，2001）。最近の研究は、ＥＳ細胞中の神経誘導におけるＢＭＰシグナリングの阻害のための役割を示唆している（Gratsch et al.，Noggin and chordin have distinct activities in promoting lineage commitment of mouse embryonic stem (ES) cells．Dev．Biol.，245：83-94，2002；Tropepe et al.，Direct neural fate specification from embryonic stem cells：a primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism．Neuron，30：65-78，2001）。しかしながら、ＥＳ細胞における神経特異化の初期の工程がインビボにおいて神経誘導の経路に如何にして順応するかを決定するには、追加の研究が必要である。
【０１１７】
インビボにおけるＥＳ細胞由来の運動ニューロンの分化
幾つかの観察は、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンも、それらの胚の類似物（counterpart）に似た様式にて挙動することを示す。最初に、ｅＧＦＰ＋運動ニューロンが典型的には吻側脊髄に制限され、しばしば内生運動ニューロンの特徴である腹側面（ventrolateral）位置における。対照的に、ＥＳ細胞由来の脊髄介在ニューロンは脊髄の背腹軸のいたるところに散在する。これらの観察は、ＥＳ細胞由来の運動ニューロン及び介在ニューロンが宿主脊髄へのそれらの誘導後に分離の活動的なプロセスを受けることを示唆する。別の可能性は、腹側脊髄を増殖させられない運動ニューロンが、死ぬか又はｅＧＦＰ発現を失うことである。このあとの可能性に対する一つの意見は、Ｎｋｘ６又はＭＮＲ２蛋白質の発現の欠如（misexpression）に応答して背側脊髄中で生じた運動ニューロンが正規の場所ではない背側の位置において生存及び分化しないことである（Tanabe et al.，Specification of motor neuron identity by the MNR2 homeodomain protein．Cell，95：67-80，1998；Briscoe et al.，A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube．Cell，101：435-45，2000）。
【０１１８】
第２に、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは腹側の根（ventral root）を通して脊髄から軸索を突出させ、そして体細胞の運動ニューロンにより選択される（taken）主要な末梢経路を選択する。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索の四肢（limb）への突起は注目に値するが、これらのニューロンのうち極めて僅かなものしか、四肢−突起ＬＭＣニューロンに適したＬＩＭ ＨＤコードを発現しないからである（Tsuchida et al.，Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes．Cell，79：957-70，1994）。運動ニューロンのＬＩＭ ＨＤコードと末梢軸索の軌道の間の類似のミスマッチが２つの他の実験コンテクストにおいて発見された。Ｌｈｘ３の過剰発現は、脊髄の四肢レベルにおいて運動ニューロンに対してＭＭＣ分子アイデンティティーを授与する；しかし、これらの運動ニューロンの多くは四肢へ軸索を突出させる（Sharma et al.，Genetic and epigenetic mechanisms contribute to motor neuron pathfinding．Nature，406：515-19，2000）。さらに、脊髄の四肢レベルに位置した胸部レベルの運動ニューロンはなおも四肢に突出することができる（O'Braien et al.，Development and survival of thoracic motorneurons and hindlimb musculture following transplantation of the thoracic neural tube to the lumbar region in the chick embryo：anatomical aspects．J．Neurobiol.，21：313-40，1990）。即ち、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索の四肢への突起は、運動ニューロンが末梢経路の変更されたか又は制限された選択に対向する（face）ような環境においてＬＩＭ ＨＤコードが無効にされ（overridden）得るという事実を反映するらしい。
【０１１９】
第３に、標的筋肉へ到着すると、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索は、前シナプス分化の多数のサイン、注目すべきはコリン作用性神経伝達物質の特性の発現を呈する。さらに、これらの前シナプス特異化が、後シナプス筋膜上のＡＣｈ受容体の局所クラスターとの一列整列（in alignment with）において見いだされることから、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンと骨格筋の間に形成されるシナプス接触が機能することが示唆される。合わせると、これらのインビボの研究は、脊髄中の新たに生じた運動ニューロンがその骨格筋標的に神経を分布させることを通して、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが通常の発生プログラムにて連続工程をうまく通り抜けることができることを示す。
【０１２０】
最後に、誘導性シグナルがＥＳ細胞を運動ニューロンに変換できることによる効果は、ＥＳ細胞が暴露される吻側尾部側及び背側腹側パターン化シグナルのアイデンティティーと濃度の系統的なバリエーションを通して、ＣＮＳニューロンの他の予め定義されたクラスを生じさせるための一般的な戦略を示唆する。ＥＳ細胞を遺伝的に操作する要求無しに、単に細胞外因子の使用を通して、細胞の運命を指示する可能性（例えば、Kyba et al.，HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors．Cell，109:29-37，2002）は、この戦略のヒトＥＳ細胞及び神経前駆細胞の他のクラスへの直接の拡張を可能にするかもしれない。
【０１２１】
前記の発明は明確化及び理解のためにいくらか詳細に説明されたが、開示を読んで、当業者は、形式及び細部の様々な変化が特許請求の範囲の発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、神経化された胚性細胞においてレチノイン酸が尾部側の位置のアイデンティティーを誘導することを示す。（Ａ）脊髄の運動ニューロンアイデンティティーの明確化の連続する工程。神経誘導性シグナルは初期（primitive）外胚葉細胞を神経の運命に変換する。神経誘導の初期の相の間は、前駆細胞が腹側の（anterior）アイデンティティーを発現する。レチノイン酸（ＲＡ）を含む外来性のシグナルは、吻側の神経プレート細胞を進行性のより尾部側のアイデンティティーへ変換する。尾部側の神経前駆体はソニックヘッジホッグ（ＳＨｈ）シグナリングの影響下では運動ニューロンに変換される。（Ｂ）ＲＡ（２μＭ）の存在又は不在下で生育された胚のボディー（ＥＢｓ）内の全神経（pan-neural）及び吻側尾部側（rostrocaudal）のマーカーの発現。初期神経プレートマーカーＳｏｘ１の発現が、ＲＡ存在下で３日間培養されたＥＢｓにおいて増加した。ｏｔｘ２発現は、ＲＡ不在下で３日間生育させたＥＢｓにおいて存在したが、ＲＡ存在下では消失した。Ｈｏｘｃ６はＲＡへ５日間暴露されたＥＢｓにおいて発現した。ＮｅｕＮ発現により特徴付けされた多数の有糸分裂後のニューロンがＲＡ存在下でＥＢｓを５日間生育させた時に、観察された。（Ｃ）ＰＡ６細胞上で６日間培養されたＥＳ細胞はニューロンマーカー、Ｓｏｘ１を発現した。多くのＳｏｘ１＋細胞がＥｎ１を同時発現したが、Ｈｏｘｃ６を発現しなかった。多くのＴｕＪ１＋ニューロンがＯｔｘ２を同時発現した。ＲＡ（２μＭ）のＰＡ６細胞上で生育させたＥＳ細胞への添加はＥｎ１及びＯｔｘ２発現の消滅、及び前駆細胞及びＴｕＪ１＋有糸分裂後のニューロン内でのＨｏｘｃ６の発現をもたらした。これらニューロンの多くはＨＢ９を発現したため、運動ニューロンであった（図９参照）。
【図２】図２は、胚ボディー（ＥＢｓ）内の神経前駆細胞のヘッジホッグ−依存性腹側化を示す。（Ａ）脊髄の運動ニューロン生成のＳＨｈ−活性化転写経路の模式的概要。運動ニューロンの生成を阻害する蛋白質はｌｒｘ３及びＮｋｘ２．２である。残りの蛋白質は運動ニューロンの生成に必要である。（Ｂ）Ｅ９．５マウス胚の尾部側の神経管内のＨＤ及びｂＨＬＨ転写因子の発現のパターン。運動ニューロンを生じる前駆体ドメインを、Ｏｌｉｇ２，Ｎｋｘ６．１の同時発現及び低レベルのＰａｘ６により特徴付けした。（Ｃ）ＲＡ（２μＭ）単独又は１０ｎＭ又は１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３共存下の何れかでの、３日間生育させたＥＳ−細胞由来のＥＢｓにおける転写因子発現のプロフィール。（Ｄ）ＲＡ及び異なる濃度のＨｈ−Ａｇ１．３の存在下でのＥＢｓ内の転写因子発現の定量化。描写されたのは、各条件下でアッセイされた８つのＥＢｓからの、セクションあたりの、平均±ｓ．ｅ．ｍ．の値である。
【図３】図３は、胚ボディー（ＥＢｓ）内の運動ニューロン及び介在ニューロン転写因子の発現を描写する。（Ａ）ＨＢ９及びＬｈｘ３の同時発現は新たに生成された運動ニューロンを定義した。Ｌｈｘ３は単独でＶ２介在ニューロンにより発現された。ＨＢ９とＩｓｌ１の同時発現は運動ニューロンのサブセットを定義した。幾つかの側面（lateral）運動柱（ＬＭＣ）ニューロンはＩｓｌ１不在下で高いレベルのＨＢ９を発現した；対照的に、他のＬＭＣニューロンはＩｓｌ１を発現したが、極めて低レベルでＨＢ９を発現したにすぎなかった。Ｉｓｌ１は幾つかの背面側の介在ニューロンによっても発現された。ＨＢ９とＬｉｎ１の同時発現は、側面のＬＭＣニューロンを定義した。多数の介在ニューロンがＬｉｍ１も発現した。（Ｂ）Ｈｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）の存在下であるがＲＡ不在下で５日間生育させたＥＢｓはＨＢ９＋ニューロンを含まなかった。ＲＡ（２μＭ）の存在下であるがＨｈ−Ａｇ１．３不在下で５日間生育させたＥＢｓはＨＢ９＋ニューロンを少量含んだ。ＲＡ及び抗−Ｈｈ抗体（ｍＡｂ ５Ｅ１；３０μｇ／ｍｌ）の存在下で５日間生育させたＥＢｓは、ＨＢ９＋ニューロンを含まなかった。ＲＡ及び組換えＳＨｈ−Ｎ（３００ｎＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓは、多くのＨＢ９＋ニューロンを含んだ。（Ｃ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓのニューロン内のＨＢ９及びＮｅｕＮの同時発現。（Ｄ）ＲＡ存在下で５日間生育させて、さらに２日間培養されたＥＢｓの分離により得られたＴｕＪ１＋によりの核内のＨＢ９の局在。ＨＢ９発現を欠いた他のニューロンも存在した。（Ｅ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内の運動ニューロン内のＨＢ９とＬｈｘ３の同時発現。Ｌｈｘ３のみを発現した細胞はＶ２介在ニューロンであった。（Ｆ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内の運動ニューロン内のＨＢ９とＩｓｌ１の同時発現。（Ｇ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内の少数のニューロン内でＨＢ９とＬｉｍ１が同時発現された。Ｌｉｍ１のみを発現した細胞は介在ニューロンであった。（Ｈ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内のＶ２介在ニューロン内のＣｈｘ１０とＬｈｘ３の同時発現。
【図４】図４は、トランスジェニックマウスの胚の脊髄内のｅＧＦＰ−標識された運動ニューロンを示す。（Ａ）ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂトランスジェニックマウスの系の生成のためのコンストラクト。（Ｂ）Ｅ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂマウス胚における増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）発現のパターン。ｅＧＦＰは、腹側の脊髄及び脊髄から伸びた運動神経において高度に発現された。（Ｃ）ｅＧＦＰ発現が、Ｅ１０．５ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の腹側角内の運動ニューロン細胞ボディー及び樹上突起中に検出された。ｅＧＦＰ発現は、腹根により脊髄を興奮させる運動ニューロン軸索内でも検出された。このラインにおいては、Ｅ１０．５において、後ではなく、極めて低い発現が背根のガングリオンのニューロン（運動ニューロン内のそれより＜２０倍）及び腹側の介在ニューロン（図４Ｃ及び４Ｅ中の矢印）において検出された。（Ｄ）最初の有糸分裂後の運動ニューロンが生成されたとき（Ｅ９．５）の、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の前肢レベルの脊髄内のＨＢ９及びｅＧＦＰの発現のパターン。（Ｅ−Ｇ）Ｅ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の胸部脊髄内のＨＢ９及びｅＧＦＰの発現のパターン。ｅＧＦＰは運動ニューロン内でＨＢ９と共に発現された。空洞ゾーンの近くに位置する新たな有糸分裂後の運動ニューロンは、脊髄の側面領域内の成熟運動ニューロンよりも低いレベルのｅＧＦＰを発現したことに注目されたい。
【図５】図５は、ＨＢＧ ＥＳ細胞にインビトロで由来するｅＧＦＰ−標識された運動ニューロンを描写する。（Ａ）ＲＡ存在下で５日間生育させた胚ボディー（ＥＢｓ）内のＨＢ９＋，Ｉｓｌ１＋運動ニューロンは、細胞ボディー及び軸索内でｅＧＦＰを発現した。（Ｂ）ｅＧＦＰ＋運動ニューロンの数はＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）への暴露に際して増加した。（Ｃ）ＲＡ及び濃度を増加させたＨｈ−Ａｇ１．３（０から２２μＭ）の存在下で５日間生育させたＥＢｓ内のｅＧＦＰ＋運動ニューロンの定量化。２．２μＭのＨｈ−Ａｇ１．３において、ＥＢｓ中の２２．５％の細胞がｅＧＦＰを発現した。高い濃度（１０μＭ）においては、ｈｈ−Ａｇ１．３はＥＢｓにおける細胞の分化に有害となった。「−１０００」と記されたデータ点は、１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３存在下であるがＲＡ不在下で生育させたＥＢｓの培養物を意味する。（Ｄ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内でのｅＧＦＰ発現を示す、明視野及び蛍光イメージ。（Ｅ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させ、そしてさらに２日間マトリゲル基質上にプレートされた胚ボディー内でのｅＧＦＰ発現を示す相及び蛍光イメージ。多数のｅＧＦＰ＋運動軸索がこれらの凝集物から出現した。（Ｆ）運動ニューロンから伸びた神経をｅＧＦＰが標識することを示す相及び蛍光イメージ。（Ｇ，Ｈ）７日間インビトロにおいて生育させたＥＢｓ−細胞由来の運動ニューロン内のＨＢ９，ｅＧＦＰ，及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の同時発現。ＨＢ９及びｅＧＦＰ発現を欠いたＣｈＡＴ＋ニューロンはおそらく介在ニューロンであった。
【図６】図６は、ｅＧＦＰ＋ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞由来の運動ニューロンの単離を示す。（Ａ）Ｈｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）単独、ＲＡ（１μＭ）単独、又は当該２つの因子の組み合わせの存在下で分化した、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析（細胞密度プロット）。高いレベルのｅＧＦＰを発現する運動ニューロンを分離するために使用されたゲートは、ダッシュの長方形により記した。（Ｂ，Ｃ）ＦＡＣＳ分離により単離された、精製されたＥＳ−細胞運動ニューロンは高いレベルのｅＧＦＰを発現した。（Ｄ，Ｅ）２４時間マトリゲル上で生育させた場合の、ｅＧＦＰ＋ニューロン及び伸びた神経突起。（Ｆ，Ｇ）神経栄養因子（ＮＴ３，ＢＤＮＦ，ＣＮＴＦ，及びＧＤＮＦ）の存在下で培養された、ＦＡＣＳ分離されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンは、インビトロにおいて３日間生存し、そして突起（processes）を念入りに作る（elaborate）（Ｆ）。生存した運動ニューロンはｅＧＦＰの発現を維持した（Ｇ）。（Ｈ，Ｉ）神経栄養因子の不在下で培養したほとんどのＦＡＣＳ分離されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンはインビトロにおいて３日以内に死んだ。（Ｊ，Ｋ）ＦＡＣＳ分離された初期吻側頸部運動ニューロンは、ＥＳ−細胞由来の運動ニューロンのそれと同じ様式で挙動した。神経栄養因子の不在下では、ニューロンは生存してｅＧＦＰ＋突起を念入りに作った。（Ｌ）神経栄養因子の存在下（ＮＴ）又は不在下（対照）での培養物中の３日後の初期頸部運動ニューロン（ｃＭＮ）及びＥＳ−細胞由来の運動ニューロン（ＥＳ−ＭＮ）生存の定量化（プレートされた細胞のパーセンテージ）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．；６ウエルをスコアした。
【図７】図７は、インビボにおける移植されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンの完成（integration）を描写する。（Ａ）ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞由来の運動ニューロン富裕化ＥＢｓの、ハンブルガー−ハミルトン（ＨＨ）ステージの１５匹のチキン脊髄への移植を示す模式的ダイアグラム。レシピエントのチキンの胚の脊髄を吸引により損傷させ、そして約１／２−１の部分的に粉砕されたＥＢをガラス製のマイクロピペットを用いて確実なスペースに移植した。（Ｂ）ＨＨステージ２７の宿主のチキン胚の胸部及び腰部の脊髄内のｅＧＦＰ＋運動ニューロン（運動ニューロン富裕化されたＥＢｓをＨＨステージ２７において移植した）の位置を示す明視野／蛍光イメージ（腹側の視野）。脊髄から出現するｅＧＦＰ＋軸索に注目。（Ｃ，Ｄ）ＦＡＣＳ−分離された運動ニューロンの（ＨＨステージ１６の胚に移植）ステージ２７における胸部脊髄内の位置。横断面は、腹側の脊髄中のｅＧＦＰ＋運動ニューロンを明らかにした（Ｄ）。（Ｅ−Ｊ）ステージ１５における運動ニューロン富裕化ＥＢｓの片側のみの移植後の、吻側頸部レベルのＨＨステージ２７のチキンの脊髄の横断面図。運動ニューロンは脊髄の腹側角において主に見いだされ、マウス特異的Ｌｉｍ２抗体により標識された移植された介在ニューロンから分離される（Ｅ）。多数のＥＳ−細胞由来の運動ニューロンがｅＧＦＰとＬｈｘ３を同時発現した（Ｆ）。移植されたマウスＥＳ−細胞由来の運動ニューロン（Ｇ）及び軸索（矢印、Ｈ）を齧歯類特異的ＮＣＡＭ抗体で標識したが、それらはチキン運動ニューロンマーカー蛋白質、ＳＣＩを発現しなかった（Ｉ，Ｊ）。ｅＧＦＰ−，ＮＣＡＭ＋の軸索は床板（floor plate）を横切ったが、脊髄から突き出なかった（矢印、Ｇ，Ｈ）。（Ｋ−Ｎ）ＨＨステージ１６において尾部側化されたＥＢｓの移植物（ＲＡ（２μＭ）及び抗−Ｈｈ抗体（５Ｅ１，３０μｇ／ｍｌ）の存在下で生育させた）を受けた、ＨＨステージ２７における胸部の脊髄の横断面図。非マウス由来の運動ニューロンが、ｅＧＦＰ発現（Ｋ）によるか又はマウス特異的ＨＢ９抗体（Ｌ）の何れかにより、検出された。対照的に、多数のマウス由来のＮＣＡＭ＋（Ｍ）及びＬｉｍ２＋（Ｎ）ニューロンが存在した。（Ｏ−Ｑ）ステージ１６−１７における運動ニューロン富裕化ＥＢｓの移植物を受けた、胸部（Ｏ，Ｐ）、又は腰部（Ｑ）レベルにおけるＨＨステージ２７のチキン脊髄の横断面図。ｅＧＦＰ＋運動ニューロン細胞ボディーが腹側脊髄において濃縮された。グラフト化された組織内の幾つかの異所性のｅＧＦＰ＋運動ニューロンは脊髄のルーメン内にトラップされたままであった。ｅＧＦＰ＋軸索は脊髄を興奮させたが、主に、腹根を通してであり、そして軸索（Ｏ−Ｑ）、ボディーの壁（Ｏ，Ｐ）及び背側及び腹側の肢（Ｑ）を供給する全ての主要な神経ブランチに沿って突き出た。全ての末梢の軸索の経路は神経繊維（ＮＦ）発現により検出された。前ガングリオン運動軸索により占められた腹側正中に並んだ神経内のｅＧＦＰ＋軸索の不在に注目。
【図８】図８は、インビボにおけるＥＳ−細胞由来の運動ニューロンのシナプス分化を示す。（Ａ）ＨＨステージ３５のチキン胚胸郭のホールマウント（wholemount）調製。ＥＳ−細胞由来のｅＧＦＰ＋軸索は肋間筋を脈状にしなかった（innervated）。（Ｂ，Ｃ）神経の部位のｅＧＦＰ＋軸索の末端のシナプトブレビン（Ｓｙｂ）と小胞性のＡＣｈ輸送体（ＶＡＣｈＴ）が筋肉と接触する。抗−Ｓｙｂ及びＶＡＣｈＴ抗体はマウスの蛋白質を認識したが、チキンの蛋白質を認識しなかった。（Ｄ）肋間筋を供給する５つの神経ブランチ内の神経繊維（ＮＦ）とｅＧＦＰの発現。幾つかのｅＧＦＰ＋軸索はＮＦ発現を欠いたことに注目されたい。α−ブンガロトキシン（αＢＴＸ）発現により定義されたとおり、ｅＧＦＰ＋軸索の末端はＡＣｈ受容体クラスターと同時に生じた（coincided）。（Ｅ）ｅＧＦＰ＋運動軸索におけるシナプトタグミン発現とαＢＴＸ標識の一致（coincidence）。（Ｆ）ｅＧＦＰ＋運動軸索におけるＳｙｂ発現とαＢＴＸ標識の一致。
【図９】図９は、ＰＡ６細胞上で生育した尾部側化されたＥＳ細胞は運動ニューロンに分化することを示す。（Ａ，Ｂ）１０日間ＰＡ６細胞上で生育したＥＳ細胞はＨＢ９＋上でニューロンに分化しなかった（Ａ）。２μＭのＲＡの２日目の培養培地への添加は、多数のＨＢ９＋上でニューロンの生成、並びにＯｌｉｇ２−発現前駆体の生成をもたらした（Ｂ）。（Ｃ）２μＭのＲＡ存在下で１０日間ＰＡ６細胞上で生育した運動ニューロン含有ＥＳ細胞コロニーの定量。平均±ｓ．ｄ．；３ウエル。
【図１０】図１０は、ＥＳ内の運動ニューロン前駆体がＢｒｄＵを取込むことを示す。（Ａ−Ｃ）固定化前の１時間のＢｒｄＵ標識（２０μｇ／ｍｌ）は、ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３存在下で３日間生育したＥＳ内の多数のＢｒｄＵ＋，Ｏｌｉｇ２＋前駆体を明らかにした。５日間生育したＥＳ内のＨＢ９＋運動ニューロンはＢｒｄＵを取り込まなかった（Ｂ）が、少数のＢｒｄＵ＋，Ｏｌｉｇ２＋は存在した（Ｃ）。
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
数百もの異なるニューロンの種類が脊椎の中枢神経系（ＣＮＳ）の発生の間に生成され、ニューロン回路の形成に必須の細胞の多様性を確立する。特定の種類又はクラスのＣＮＳニューロンの選択的な変性は、多くの神経学上の障害の根源である。この理解は、神経変性性障害を治療するという見地から、ニューロンの補給可能な源として作用するかもしれない前駆細胞の集団を規定することにおいて興味を生じさせてきた。系統的様式においてニューロンの分化の特定の経路に沿ったそのような前駆細胞を支配すること（directing）は難しいことが証明されたが、単に、ＣＮＳニューロンのほとんどのクラスを生じさせる通常の発生の経路がほとんど定義されていないままであるからではない。
【０００２】
前駆細胞の神経学上の潜在性の研究は、３つの主要なクラスに焦点が合わされてきた：（１）胚又は成人の神経組織由来の神経前駆細胞（Alvarez-Buylla et al.，A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells．Nat．Rev．Neurosci.，２：287-93，2001；Gage，F．H.，Mammalian neural stem cells．Science，287：1433-38，2000；Temple，S.，The development of neural stem cells．Nature，414：112-17，2001；Uchida et al.，Direct isolation of human central nervous system stem cells．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，97：14720-725，2000）；（２）他の組織及び器官由来の非神経前駆細胞（Brazelton et al.，From Marrow to brain：expression of neuronal phenotypes in adult mice．Science，290：1775-79，2000；Mezey et al.，Turning blood into brain：cells bearing neuronal antigens generated in vitro from bone marrow．Science，290：1779-82，2000；Terada et al.，Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous fusion．Nature，416：545-48，2002）；及び（３）胚性幹（ＥＳ）細胞（Bain et al.，Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro．Dev．Biol.，168：342-57，1995；Reubinoff et al.，Neural progenitors from human embryonic stem cells．Nat．Biotechnol.，19：1134-40，2001；Schuldiner et al.，Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells．Brain Res.，913：201-05，2001；Zhang et al.，In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells．Nat．Biotechnol.，19：1129-33，2001；Rathjen et al.，Directed differentiation of pluripotent cells to neural lineages：homogenous formation and differentiation of a neurectderm population.Development，129：2649-61，2002）。ＥＳ細胞は、ニューロン及び神経細胞の両方を生成し、そして幾つかの例においては、中脳ドーパミン作用性のニューロンを含む、特定のクラスのニューロンに特徴的な細胞種マーカーを発現する能力を有する（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity．Neuron，28：31-40，2000；Lee et al.，Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells．Nat．Biotechnol.，18：675-79，2000）。これらの利点にも拘わらず、しかしながら、本発明の前までは、ＥＳ細胞が容易に特定のニューロン細胞種を生成することができることも、それらが神経発生の正常なプログラムを再現できることも、知られていなかった。
【０００３】
脊髄の運動ニューロンは、ニューロン特異化（specification）の関連経路の多くが定義された一つのＣＮＳニューロンサブタイプを代表する（Jessell et al.，Neuronal specification in the spinal cord：inductive signals and transcriptional codes．Nat．Rev．Genet.，１：20-29，2000；Lee et al.，Transcriptional networks regulating neuronal identity in the developing spinal cord．Nat．Neurosci.，４補遺：1183-91，2001）。脊髄の運動ニューロンの生成は、幾つかの発生段階を含むことが明白である。最初に、外胚葉細胞が、吻側（rostral）神経特性−ＢＭＰ，ＦＧＦ，及びＷｎｔシグナリングの制御を通して達成されたプロセスを獲得する（Munoz-Sanjuan et al.，Neural induction，the default model and embryonic stem cells．Nat．Rev．Neurosci.，３：271-80，2002；Wilson et al.，Neural induction：toward a unifying mechanism．Nat．Neurosci.，３：４補遺：1161-68，2001）。これらの吻側神経前駆細胞はレチノイン酸（ＲＡ）を含む尾部側化シグナリングに応答して脊髄の位置的アイデンティティーを獲得する（Blumberg et al.，An essential role for retinoic signaling in anteroposterior neural patterning．Development，124：373-79，1997；Durston et al.，Retinoids and related signals in early development of the vertebrate central nerve system．Curr．Top．Dev．Biol.，40：111-75，1998；Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999）。次に、脊髄の前駆細胞は、ソニックヘッジホッグ蛋白質（ＳＨｈ）の腹側化アクションに対する応答として運動ニューロン前駆細胞のアイデンティティーを獲得する（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001）。
【０００４】
ＳＨｈシグナリングによる運動ニューロン前駆細胞のアイデンティティーの特異化は、ホメオドメイン（ＨＤ）及び基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の発現の背腹側パターンの確立を通して媒介する（Briscoe et al.，前掲）。相対的に高いレベルのＳＨｈシグナリングにおいては、ｐＭＮドメインと呼ばれる別の前駆ドメインが確立される；このドメイン内では、細胞は介在ニューロンよりも運動ニューロンの生成に委ねられるらしい（Briscoe et al.，A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube．Cell，101：435-45，2000）。
【０００５】
ＭＮドメイン内の前駆細胞は、２つのＨＤ蛋白質（Ｐａｘ６及びＮｋｘ６．１）及びｂＨＬＨ蛋白質（Ｏｌｉｇ２）の発現により特徴付けされる（Ericson et al.，Pax controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded SHh signaling．Cell，90：169-80，1997；Sander et al.，Ventral neural patterning by Nkx homeobox genes：Nkx6.1 controls somatic motor neuron and ventral interneuron fates．Genes Dev.，14：2134-39，2000；Vallstedt et al.，Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification．Neuron，31：743-55，2001；Novitch et al.，Coordination regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2 and neurogenin2 in the coordinate induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001）。これらの３つの転写因子の各々は、脊髄の運動ニューロンのアイデンティティーの明確化において本質的な役割を担う（Ericson et al.，Pax6 controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded SHh signaling．Cell，90：169-80，1997；Sander et al.，Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification．Neuron，31：743-55，2001；Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity anf pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001；Mizuguchi et al.，Combinatorial roles of olig2 and neurogenin2 in the coordinated induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001；Zhou et al.，The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple neuronal and glial subtype specification．Cell，109：61-73，2002；Lu et al.，Common developmental requirement for Olig function indicates a motor neuron/oligodendrocyte connection．Cell，109：75-86，2002）。さらに、それらの組み合わされた活性が細胞サイクルを離れて（out of）運動ニューロン前駆体を操作し（drive）（Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001；Mizuguchi et al.，Combinatorial roles of olig2 and neurogenin2 in the coordinated induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001）、そして有糸分裂後の運動ニューロンのアイデンティティーを強化する（consolidate）下流の転写因子（特に、ＨＤ蛋白質，ＨＢ９）の発現を指示する（Pfaff et al.，Requirement for LIM homeobox gene Isl1 in motor neuron generation reveals a motor neuron-dependent step in interneuron differentiation．Cell，84：309-20，1996；Arber et al.，Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，199；Thaler et al.，Active suppression of interneuron programs within developing motor neurons revealed by analysis of homeodomain factor HB9．Neuron，23：675-87．1999）。
【０００６】
上記の発見は、神経発生の通常の経路における洞察が、合理的な様式にて前駆細胞、例えばＥＳ細胞の異種セットを、特定のＣＮＳニューロンサブタイプへ向けるために適用できることを示唆する。ＥＳ細胞は運動ニューロンの分子特性の幾つかを伴う細胞を生成することが報告された（Renoncourt et al.，Neurons derived in vitro from ES cells express homeoproteins characteristic of motoneurons and interneurons．Mech．Dev.，79：185-97，1998）。しかしながら、本発明の前には、これらのニューロンの生成の経路も、それらのインビボ発生能力も、十分に探索されていなかった。
【０００７】
発明の概要
発明者らは、神経管の吻尾間の（rostrocaudal）軸索及び背腹間の軸索に沿って機能し、且つインビボにおいて運動ニューロンの運命を特定する細胞外シグナリング因子が、インビトロにおいて、マウスＥＳ細胞の分化を機能性脊髄運運動ニューロンへ向けるために利用され得るか否かを試験した。本明細書において開示されるとおり、発明者らは、神経化されたＥＳ細胞のＲＡへの暴露が脊髄の前駆細胞の分化を誘導すること、及びヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナリングの活性化が運動ニューロンを生成するためにこれらの細胞を指示することを確定した。発明者らは、Ｈｈシグナリングにより誘発された運動ニューロンの分化の固有の分子経路がインビボにおいて運動ニューロンの生成に関与する経路を模倣することも示した。ＧＦＰ−に基づく運動ニューロンマーキング法の使用は、ＥＳ−細胞−由来の運動ニューロンの純粋な集団の特性決定を許容した。そのような運動ニューロンは、インビボにおいて胚性脊髄を再増殖させ（repopulating）、軸索を末梢へ伸長させ、そして骨格筋との接触の部位においてシナプス分化を受けることができる。即ち、神経発生の通常の経路を合理的様式においてくつがえす（subverted）ことにより、ＥＳ細胞をＣＮＳニューロンの特定のサブクラスへ向かわせることができる。
【０００８】
従って、本発明は、胚性幹細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子及び背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、胚性幹細胞の分化した神経細胞への分化を誘導する方法を提供する。また、この方法により生産した、分化した神経細胞も提供される。
【０００９】
本発明は、分化した神経細胞を生産する方法も提供し、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることによる。また、この方法により生産された、分化した神経細胞を含む細胞集団も提供される。
【００１０】
本発明は、被験者において脊髄を再増殖させる（repopulation）方法も提供し、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植することによる。
【００１１】
本発明は、治療の必要な被験者において神経組織の変性を治療する方法にも向けられ、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）神経組織の変性を治療するのに有効な量にて分化した神経細胞を被験者に移植することによる。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｃ）任意に、神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることにより生じさせた神経前駆細胞を提供する。また、神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、これらの神経前駆細胞の用途も提供される。
【００１３】
本発明は、さらに、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることにより生じさせた神経前駆細胞を提供する。また、これらの分化した神経細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物及び神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、これらの分化した神経細胞の用途も提供される。
【００１４】
本発明は、分化した神経細胞の集団を単離及び又は精製する方法にも向けられ、（ａ）増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；（ｅ）分化した神経細胞においてｅＧＦＰの発現を検出し；そして（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離することによる。
【００１５】
最後に、本発明は、神経の変性に関連した症状を治療することにおける使用のための薬剤を同定する方法も提供され、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量のレチノイン酸に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞においてヘッジホッグシグナリング経路を活性化することによりニューロンを生じさせるが、但し、ニューロンの幾つか又は全てが変性しており；（ｄ）変性したニューロンを候補の薬剤と接触させ；そして（ｅ）当該薬剤が幾つか又は全ての変性したニューロンの再生を増強するか否かを決定することによる。
【００１６】
本発明の追加の側面は、続く説明から明らかになる。
【００１７】
発明の詳細な説明
発生の間、特定の方向特性又は位置特性を幹細胞に授与するシグナリング因子の制御を含む一連の発生段階を通して、神経細胞が胚性幹細胞から生成される。最初に、外胚葉の細胞が吻側又は尾部側の神経特性を獲得し、そして吻側化（rostralizing）及び／又は尾部側化（caudalizing）の胚性シグナリング因子の制御を通して、吻側の又は尾部側の前駆細胞に分化すると言える。その後、神経前駆細胞はさらに分化して、背側化（dorsalizing）及び／又は腹側化（ventralizing）胚性シグナリング因子の作用に応答して、前駆細胞のサブタイプのアイデンティティーを獲得するか、又は完全に分化した神経細胞になる。
【００１８】
例えば、運動ニューロンは様々なシグナリング因子に応答してＥＳ細胞から発生すると言える。最初に、ＢＭＰ，ＦＧＦ，及びＷｎｔシグナリングの制御により、外胚葉細胞が吻側神経特性を獲得する。結果の吻側の神経前駆細胞は、次に、レチノイン酸（ＲＡ）を含む尾部側のシグナルに応答して、脊髄の位置に関するアイデンティティーを獲得する。ＳＨｈシグナリングによる運動ニューロン前駆体のアイデンティティーの明確化は、ホメオドメイン（ＨＤ）及び基本的ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の発現の背腹パターンの確立を通して介在される。相対的に高いレベルのＳＨｈシグナリングにおいては、ｐＭＮドメインと呼ばれる別の前駆体ドメインが確立される。このドメイン内では、細胞が介在ニューロンよりも運動ニューロンの生成にかかわるらしい。ｐＭＮドメイン内の前駆細胞は、２つのＨＤ蛋白質、Ｐａｘ６及びＮｋｘ６．１、及びｂＨＬＨ蛋白質、Ｏｌｉｇ２の発現により特徴付けられる。これらの３つの転写因子の各々は、脊髄の運動ニューロンアイデンティティーの明確化において必須の役割を有する。さらに、それらの組み合わされた活性が細胞サイクルを離れて（out of）運動ニューロン前駆細胞を操作し（drive）、そして有糸分裂後の運動ニューロンのアイデンティティーを強化する下流の転写因子（特に、ＨＤ蛋白質、ＨＢ９）の発現を指示する。
【００１９】
脊髄の運動ニューロンは運動性挙動の制御において必須の役割を演じるし、それらの変性は多くの神経障害の基礎となる。運動ニューロンの生成に関与する誘導性シグナル及び転写因子が同定されたことから、正常な発生への洞察を用いて、合理的な様式にて幹細胞を運動ニューロンの運命に向けさせ得ることを示唆する。発明者らは、本明細書において、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞が外部からのシグナリング因子により誘導されることにより、最初に脊髄前駆細胞に分化でき、次に脊髄の運動ニューロンに分化できることを明らかにする。ＥＳ−細胞由来の神経前駆体からの運動ニューロンの生成の分子経路は、インビボにおいて配備されるそれを再現する。胚性脊髄へ導入されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンは、腹側角を増殖させ（populate）、軸索を末梢に伸ばし、そして標的の骨格筋との接触部位においてシナプス分化を受ける。即ち、通常の神経発生の経路に関与する誘導性シグナルは、ＥＳ細胞がＣＮＳニューロンの特定のクラスを形成することを指示できる。
【００２０】
従って、本発明は、分化した神経細胞への胚性幹細胞の分化を誘導する方法、及びこの方法により生成された分化した神経細胞を提供する。本明細書にて使用される用語「胚性幹細胞の分化を誘導する」は、胚性幹細胞を活性化するか、開始するか、又は刺激することにより分化を受けること−発生の間に細胞が構造上並びに機能上特化されることになる細胞プロセスを意味する。胚性幹（ＥＳ）細胞は、培養された細胞であり、胚盤胞のステージの胚の多能性内部細胞隗由来であり、無期限に複製することができる。一般に、ＥＳ細胞は他の細胞に分化する能力を有する（即ち、それらは多能性）；即ち、それらは新規な細胞の連続する源として機能するかもしれない。本発明の胚性幹細胞はあらゆる細胞から得て良いが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト、家畜動物、又は市販の動物）から得る。本発明の一つの態様において、胚性幹細胞はマウスの胚性幹細胞である。別の好ましい態様において、胚性幹細胞はヒトから得られる。
【００２１】
さらに本明細書において使用される「分化した神経細胞」は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）の一部分化した細胞又は完全に分化した細胞であり、そして、限定ではないが、完全に分化したガングリオン細胞、グリア（又は神経グリア）細胞（例えば、星状細胞、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞）、顆粒細胞、ニューロン細胞（又はニューロン）、及び星形細胞、並びにそれらのあらゆる神経前駆細胞を含む。前駆細胞は、発生及び分化の間に、一連の細胞分割により別の細胞系列を生じる親細胞である。神経前駆細胞は、例えば、最後にはＣＮＳ又はＰＮＳの完全に分化した神経細胞に発生する細胞系列に委ねられる（committed）；しかしながら、そのような神経前駆細胞は神経細胞の特定の種類、又はサブクラスに供されたことがまだない。最初に、神経前駆細胞は吻側の特性を獲得し（例えば、吻側神経前駆細胞）、続いて位置的アイデンティティーを獲得してよい（例えば、小脳前駆細胞、大脳前駆細胞、又は脊髄前駆細胞）。そのような一部分化した神経前駆細胞は、特定の種類の神経細胞に分化して（例えば、星状細胞、ガングリオン細胞、顆粒細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、又は星形細胞の前駆細胞）、そして以後は、完全に分化した前駆細胞（例えば星状細胞、ガングリオン細胞、顆粒細胞、ニューロン（背根ガングリオン（ＤＲＧ）ニューロン、運動ニューロン、末梢ニューロン、脊髄ニューロン、又は腹側介在ニューロン）、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、又は星形細胞）を生じるように委ねられるようになる。従って、本発明の一部分化した神経細胞は、神経のアイデンティティーを有し、方向アイデンティティー又は位置アイデンティティーを獲得した細胞であるか、又は特定のクラスの神経細胞に発生するが完全に分化した神経細胞には発生しないことを委ねられた細胞であってよい。
【００２２】
さらに、本明細書にて使用される「神経細胞」又は「ニューロン」は、核及び周囲の細胞質；幾つかの短い放射突起（processes）（星状細胞）；及び一つの長い突起（軸索）、小枝様のブランチで終わるもの（末端星状細胞（telodendrons））、及びそのコースに沿って伸びるブランチを有してよいもの（側枝（collaterals））を含む、細胞ボディー（周核体）から一般にはなる神経系の、伝導性（conducting）細胞又は神経細胞である。ニューロンの例は、限定ではないが、背根ガングリオン（ＤＲＧ）のニューロン、運動ニューロン、末梢ニューロン、知覚ニューロン、脊髄のニューロン、及び原側介在ニューロンを含み、それら全てはコリン作動性、ドーパミン作動性、又はセロトニン作動性であってよい。
【００２３】
ＥＳ細胞の一部分化したか又は完全に分化した神経細胞への分化は、公知の細胞又は分子の手法、及び本明細書にて開示されたアッセイ及び方法により検出してよい。本発明の一つの態様において、分化した神経細胞は、運動ニューロンである（例えば、有糸分裂後の運動ニューロン又は脊髄の運動ニューロン）。本発明の別の態様において、分化した神経細胞は遺伝子を標識され、本明細書にて記載されたように、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する。ｅＧＦＰ遺伝子マーカーは、分化した神経細胞の集団を単離及び／又は精製するための方法において、又は脊髄の制御を監視するための方法において特に有用かもしれず、以下に記載されるとおりである。
【００２４】
本発明の方法は、胚性幹細胞を、吻側化又は尾部側化の胚性シグナリング因子、及び背側化又は腹側化の敗勢シグナリング因子に、分化した神経細胞を精製するのに有効な量にて接触させることを含む。本明細書にて使用される「因子」は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、化合物、抗生物質、薬剤、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。Ｆａｂ断片は抗体の単価の抗原結合断片であり、パパイン消化により生成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は抗体の二価の抗原結合断片であり、ペプシン消化により生成される。
【００２５】
さらに本明細書にて使用される「胚性シグナリング因子」は、発生及び分化の推移の間に、胚の中で細胞へ情報を運ぶ因子である。そのような情報は、例えば、胚の中の細胞の方向又は位置に関してよく、そして情報を受けたそれらの細胞によりたどられる分化の経路を決定してよい。本発明の胚性シグナリング因子は、例えば、形態学上の因子又は神経因子であってよい。本発明における使用のための胚性シグナリング因子の例は、限定ではないが、レチノイン酸（ＲＡ）、骨形態蛋白質（ＢＭＰｓ）（例えば、ＢＭＰ１からＢＭＰ７，ＢＭＰ２及びＢＭＰ４を含む）、繊維芽成長因子（ＦＧＦｓ）（例えば、アルファＦＧＦ，ＦＧＦ８，ＦＧＦ１０，ＨＢＧＦ１，塩基性ＦＧＦ，ベータＦＧＦ，及びＨＢＧＦ）、ヘッジホッグ蛋白質（例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨｈ）及びインディアンヘッジホッグ（ＩＨｈ）、ヘッジホッグシグナリングのアゴニスト（例えば、Ｈｈ−Ａｇ１．３）、及びヘッジホッグシグナリング経路の他の活性化因子を含む。
【００２６】
さらに、本明細書にて使用される「吻側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の頭部又は上位の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。対照的に、「尾部側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の尻、尾又は下位の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。吻側アイデンティティーの割り当てに寄与する胚性シグナリング因子は、ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化をもたらすと言える。本発明における使用のための吻側化及び尾部側化胚性シグナリング因子の例は、限定ではないが、ＲＡ，ＢＭＰ，ＦＧＦ，及びＷｎｔを含む。ＲＡは発生の間に吻側アイデンティティーを割り当てる役割を担うことが知られている。最近、Ｗｎｔシグナリングも吻側アイデンティティーを割り当てる役割を担うことが示された（Nordstrom et al.，Progressive induction of caudal neural character be graded Wnt signaling．Nat．Neurosci.，5(6)：525-32，2002）。即ち、本発明の一つの態様において、吻側化胚性シグナリング因子はＲＡ又はＷｎｔである。発明の別の態様においては、尾部側化胚性シグナリング因子がＲＡ又はＷｎｔである。
【００２７】
本明細書にて使用される「背側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の背中又は後位の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。対照的に、本明細書にて使用される「腹側化胚性シグナリング因子」は、対象又は被験者の前部又は前方の方向に誘導するか、寄与する（contribute）か、又は発生する因子を意味する。背側アイデンティティーの割り当てに寄与する胚性シグナリング因子は、ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化又は完全に分化した神経細胞への分化をもたらすと言える。本発明における使用のための背側化及び腹側化胚性シグナリング因子の例は、限定ではないが、ＢＭＰ，Ｗｎｔ，ヘッジホッグ蛋白質、ヘッジホッグシグナリングのアゴニスト、及びヘッジホッグシグナリング経路の他の活性化因子を含む。ＳＨｈシグナリングは、例えば、運動ニューロン前駆細胞のアイデンティティーを脊髄前駆細胞に提供することが知られている。
【００２８】
本発明の一つの態様において、背側化胚性シグナリング因子は、ＢＭＰ又はＷｎｔである。本発明の別の態様において、腹側化胚性シグナリング因子は、ヘッジホッグシグナリング経路の他の活性化因子である。本明細書にて使用される「ヘッジホッグシグナリング」は、ヘッジホッグファミリーの蛋白質（例えば、ソニックヘッジホッグ（ＳＨｈ）及びインディアンヘッジホッグ（ＩＨｈ））のあらゆるメンバーの生化学シグナリング、特に発生及び分化の間に胚中の細胞の方向及び位置に関係するシグナリングを意味する。ヘッジホッグシグナリング経路の「活性化因子」は、ヘッジホッグシグナリングを作用させるか又は生じさせる因子、及びヘッジホッグシグナリング経路においてヘッジホッグシグナリングを誘導するか、開始させるか、又は刺激する因子を含む。例示として、ヘッジホッグシグナリングの活性化因子はヘッジホッグ蛋白質（例えば、ＳＨｈ、ＩＨｈ）又はヘッジホッグシグナリングのアゴニスト（例えば、Ｈｈ−Ａｇ１．３）であってよい。本明細書にて使用されるヘッジホッグシグナリングの「アゴニスト」は、細胞中のヘッジホッグシグナリングが開始するか、刺激されるか、又は誘導されるように、天然に生じる物質により通常は刺激される細胞受容体に親和性を有し、且つ当該受容体において生理活性を刺激する因子である。
【００２９】
胚性シグナリング因子、ＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＳＨｈ，及びＩＨｈは蛋白質である。本明細書にて使用される「ＢＭＰ」はＢＭＰ蛋白質及びＢＭＰアナログの両方を含み；「ＦＧＦ」はＦＧＦ蛋白質及びＦＧＦアナログの両方を含み；「Ｗｎｔ」はＷｎｔ蛋白質及びＷｎｔアナログの両方を含み；「ＳＨｈ」はＳＨｈ蛋白質及びＳＨｈアナログの両方を含み；「ＩＨｈ」はＩＨｈ蛋白質及びＩＨｈアナログの両方を含む。他に示さない限り、「蛋白質」は、蛋白質、蛋白質ドメイン、ポリペプチド又はペプチドを含む。本明細書にて使用される特定の蛋白質の「アナログ」は、当該蛋白質の生物活性を有し、且つ当該蛋白質と６０％又はそれより高い（好ましくは、７０％又はそれより高い）のアミノ酸配列相同性を有する、当該蛋白質の機能性バリアントである。「アナログ」は、相同な三次元コンフォメーションを有する蛋白質のバリアントを含む。さらに本明細書にて使用される用語「生物活性」は、発生及び分化の間のＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＳＨｈ，又はＩＨｈ蛋白質のシグナリング活性を意味し、以下に記載される。
【００３０】
さらに、本明細書にて使用される「保存的置換」は、置換されたアミノ酸残基に機能上均等なアミノ酸置換であり、それらが極性又は立体の配置を有するか、又はそれらが置換された残基と同じクラスに属するためである（例えば、疎水性、酸性又は塩基性）。本明細書にて使用される用語「保存的置換」は、本発明の蛋白質が発生及び分化の間にシグナリングを作用させる能力に対して取るに足らない（inconsequential）効果を有する置換を含む。
【００３１】
本明細書にて論じられるとおり、ＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＳＨｈ，又はＩＨｈは蛋白質である。対照的に、ＲＡ及びビタミンＡはモルフォゲンであると信じられるアルデヒド分子である。ＲＡは容易に利用可能であり；例えばシグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ）から得てよい。本発明の他の因子は、合成によるか、組換えによるか、又は天然の細胞から単離してよい。好ましくは、蛋白質を組換えにより生産し、慣用の技術及び当該蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いる。ＳＨｈ及びＩＨｈ（並びにＨｈ−Ａｇ１．３）もキュリス社（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から得てよい。
【００３２】
本発明の方法は、胚性幹細胞を、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子及び背側化及び／又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることを含む。胚性シグナリング因子は、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて提供される。これらの量は、本明細書にて開示された公知の手法及び方法に基づいて、当業者により容易に決定される。本発明の好ましい態様においては、胚性幹細胞を、背側化及び／又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させる前に、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させる。
【００３３】
発明者らは、神経栄養性因子の存在下で培養されたニューロンが生存して且つ突起を念入りに作ることを証明した。従って、別の態様において、本発明の方法は、さらに、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子との接触後に、少なくとも一つの神経栄養性因子に胚性幹細胞を接触させる工程を含む。本明細書にて使用される「神経栄養性因子」は、神経組織の栄養又はメンテナンスに関与する因子である。神経栄養性因子は、委ねられた神経前駆細胞の発生及び分化であるか、又はそれらは分化した神経細胞の成長及び生存を誘導するかもしれない。古典的な例の神経栄養性因子は、ＮＧＦ（神経成長因子）である。本発明における使用のための神経栄養性因子の他の例は、限定ではないが、ＧＤＮＦ，ＮＧＦ，ＮＴ３，ＣＮＴＦ，及びＢＤＮＦを含む。これらの因子はＲ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ミネソタ）から得てよい。本発明の神経栄養性因子は、ＣＮＳ又はＰＮＳの完全に分化した神経細胞（例えば、ニューロン）を生産するのに有効な量で提供される。この量は、本明細書にて開示された公知の手法及び方法に基づいて、当業者により容易に決定してよい。
【００３４】
本発明の方法においては、胚性幹（ＥＳ）細胞を、被験者においてインビトロ又はインビボにて有効な量の胚性シグナリング因子に接触させてよい。胚性シグナリング因子を細胞内へ導入することにより当該因子をＥＳ細胞に接触させてよい。接触をインビトロにて行う場合、因子を直接培養培地に加えてよく、本明細書に記載されているとおりである。或いは、因子を被験者に導入するか（例えば、因子を被験者の細胞に導入することにより）、又は因子を被験者に投与することにより、被験者内でインビボにてＥＳに接触させてよい。被験者は胚性動物又は発生した動物であってよいが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト、家畜、又は市販の動物）である。より好ましくは、被験者はヒトである。胚性シグナリング因子をインビボにてＥＳ細胞に接触させる場合、被験者は好ましくは胚である。しかしながら、ＥＳ細胞を完全に成長したヒト又は動物被験者に移植すること、及び胚性シグナリング因子を次にヒトに移植することにより、ＥＳ細胞の分化した神経細胞への被験者内でのインビボにての分化を作用させることは、本発明の範囲内である。
【００３５】
本発明の因子は、インビトロ又はインビボの何れかにおいて被験者の中で、蛋白質、核酸及び他の薬剤の導入及び投与に使用される公知の技術により、ＥＳ細胞と接触させてよく、例えば注射及び輸液（transfusion）である。標的のＥＳ細胞を被験者の特定の部分に局在化する場合は、注射によるか又は幾つかの他の手段により（例えば、因子を血液又は他の体液に導入することにより）、ＥＳ細胞へ直接導入することが望まれるかもしれない。
【００３６】
胚性シグナリング因子が蛋白質又は他の分子である場合、本明細書に開示された慣用の技術及び方法により、直接ＥＳ細胞に導入してよい。さらに、蛋白質の胚性シグナリング因子は、蛋白質阻害剤の発現を許容する様式にて、因子をコードする核酸をＥＳ細胞に導入することにより、間接にＥＳ細胞に導入してよい。因子は、限定ではないが、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、モノカチオンリポソーム融合、ポリカチオンリポソーム融合、プロトプラスト融合、インビボの電場の創製、ＤＮＡ−コートされたマイクロ発射砲撃（microprojectile bombardment）、組換え体複製欠損ウイルスを用いた注入、相同組換え、インビボ遺伝子治療、エクスビボ遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸のＤＮＡの移行（transfer）、又はそれらのあらゆる組み合わせを含む、慣用の当業界公知の手法を用いて、インビトロ又はインビボにて、ＥＳ細胞に導入してよい。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターは、限定ではないが、レトロウイルス、ＨＳＶ，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、セミリキフォレストウイルス、サイトメガロウイルス、及びワクシニアウイルスのようなウイルスのゲノム由来のベクターを含む。使用される核酸の量は、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な蛋白質因子の量を発現するのに十分な量である。これらの量は、当業者により容易に決定してよい。蛋白質の胚性シグナリング因子をコードする核酸を適当なＥＳ細胞中へ慣用の手法を用いてインビトロにて導入することにより、ＥＳ細胞中の蛋白質因子の発現を達成してよい。蛋白質の胚性シグナリング因子を発現するＥＳ細胞は、次に、インビボにおいて分化した神経細胞を生じさせるために被験者に導入されてよい。
【００３７】
本発明の方法によれば、胚性シグナリング因子は、限定ではないが、経口投与、非経口投与、及び経皮投与を含む公知の手法によりヒト又は動物被験者に投与してよい。好ましくは、因子を頭蓋内、脊髄内（intraspinal）、脳髄内、又は皮下注射により、非経口により投与する。本発明の因子は、ＥＳ細胞と胚性シグナリング因子の間のインビボの接触をもたらすための上記の方法の何れかに従い、被験者に投与してよい。
【００３８】
経口投与のためには、胚性シグナリング因子製剤をカプセル、タブレット、粉末、顆粒としてか、又はサスペンジョンとして与えてよい。製剤は、慣用の付加物、例えば、ラクトース、マニトール、コーンスターチ、又はポテトスターチを有してよい。製剤は、結合剤、例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンと共に与えてもよい。さらに、製剤は、崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムと共に与えてもよい。製剤は、二塩基カルシウムリン酸無水物又はスターチグリコール酸ナトリウムと共に与えてもよい。最後に、製剤は、潤滑剤、例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウムと共に与えてもよい。
【００３９】
非経口投与のためには（即ち、消化管以外の経路を通した注入による投与）、胚性シグナリング因子を、好ましくは被験者の血液と等張の滅菌水溶液と化合してよい。そのような製剤は、固形活性成分を、生理学上融和性の物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、且つ生理条件に融和性の緩衝化されたｐＨを有する水の中に溶解することにより、調製してよい。製剤は、ユニット又は複数用量コンテナー、例えばシールされたアンプル又はバイアル内にて与えてよい。製剤は、限定ではないが、筋膜上（epifascial）、関節内（intracapsular）、頭蓋内、皮膚内、髄腔内、筋肉内、眼窩内（intraorbital）、腹腔内、脊髄内（intraspinal）、胸骨内、血管内、静脈内、柔組織、皮下又は舌下を含むあらゆる注入様式によりデリバリーしてよい。
【００４０】
経皮投与のためには、胚性シグナリング因子を、皮膚の因子に対する浸透性を増加させ、そして因子が皮膚を通して血流に浸透することを可能にさせる皮膚浸透増強剤、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドン等と組み合わせてよい。因子／増強剤組成物は、さらに、ポリマー物質、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニルアセテート、ポリビニルピロリドン等と組み合わせることにより、上記組成物をゲル形態にて提供してもよく、溶剤、例えば塩化メチレンに溶解することにより、所望の粘度まで蒸発させ、そして次にベーキング物質に塗布することによりパッチを提供してよい。
【００４１】
本発明は、ＥＳ細胞の分化した神経細胞（脊髄運動ニューロンを含む）への分化を誘導し、そして、そうして生成された神経細胞を、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を遺伝子マーカーとして使用して精製及び単離する方法を提供する。本明細書に記載されたインビトロＥＳ細胞分化誘導方法は、ニューロンの源、又は被験者への移植物のために利用可能なＣＮＳ又はＰＮＳの他の神経細胞を提供する。即ち、この方法は、神経組織の変性に関連した症状を治療することにおける使用のために、神経細胞を生成するのに特に有用である。
【００４２】
本明細書にて使用される用語「神経組織」は、本発明の分化した神経細胞及びそれらの前駆細胞（progenitors）を含む、神経系の組織を意味する。本明細書にて使用される神経組織が低下したか又は劣った機能活性形態に変化する、神経組織の劣化の状態を意味する。ＥＳ細胞の（例えば、脊髄運動ニューロンへの）分化を誘導することにより、本明細書に記載された方法は、分化した神経細胞の生成及び続く移植の必要がある被験者へのその移植を通して、被験者内の様々な損傷した及び／又は変性した神経組織を再増殖させる（repopulating）こと（例えば、脊髄の再増殖）において有用であると信じられる。
【００４３】
従って、本発明は、神経組織変性の治療の必要のある被験者において神経組織変性を治療する方法を提供し、上記の方法に従い、ＥＳ細胞の分化した神経細胞への分化を誘導し、そして分化した神経細胞を被験者に移植し、それにより神経組織の変性を治療することを含む。例示として、本発明の方法は、以下の工程：（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、神経細胞のサブクラスを、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）神経組織の変性を治療するのに有効な量にて、分化した神経細胞を被験者に移植することを含む。発明の一つの態様において、被験者は胚である。発明の別の態様において、被験者はヒトである。好ましくは、被験者は神経組織の変性を有する。
【００４４】
神経組織の変性は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）において生じてよく、そして限定ではないが、初期の神経病の症状（例えば、神経変性疾患）、ＣＮＳ及びＰＮＳ外傷（trauma）及び損傷、及び非神経の機能不全の後天性の二次作用（例えば、変性事象、病原性事象、又は外傷性事象に対して二次的な神経の損失を含む、様々な異常、症状、及び因子に起因するか又は関連するかもしれない。ＣＮＳ外傷の例は、限定ではないが、しみ（blunt）の外傷、低酸素症、及び侵入性外傷を含む。非神経の機能不全の後天性の二次作用の例は、限定ではないが、脳性麻痺、先天的水頭症、筋ジストロフィー、発作（stroke）、及び血管性痴呆（vascular dementia）、並びに以下：脳出血、発生障害（例えば、脳の欠損、例えば先天的水頭症、又は脊髄の欠損、例えば脊髄披裂（spina bifida））、糖尿病性脳障害、過敏性脳障害、頭蓋内動脈瘤、貧血、腎不全、クモ膜下出血、脳及び脊髄に対する外傷、化学治療剤及び抗ウイルス剤のような治療剤による治療、脳及び脊髄の血管損傷、及び神経組織が変性しやすい他の疾患又は症状の何れかによりもたらされる神経変性を含む。
【００４５】
本発明の一つの態様において、神経組織の変性はＰＮＳ中の末梢神経障害である。本明細書にて使用される用語「末梢神経障害」は、感覚の損失、筋肉の弱化、筋肉の萎縮、深部反射の低下の症候群、及び／又は血管運動神経の兆候を意味する。末梢神経障害を有する被験者においては、ミエリン鞘（シュワン細胞）が主に冒されているかもしれないか、又は軸索が主に冒されているかもしれない。末梢神経障害は、単一の神経（単一神経障害（mononeuropathy））、別のエリアの２つ又はそれより多い神経（複合性単一神経障害（multiple neuropathy））又は多数の神経を同時に（多発性神経障害（polyneuropathy））冒すかもしれない。
【００４６】
本明細書に開示された方法により治療されるかもしれない末梢神経障害の例は、限定ではないが、急性又は慢性の炎症性の多発性神経障害に関連する末梢神経障害、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、コラーゲン血管障害（例えば、多発性動脈瘤紅斑、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、又は全身性紅斑性踉狼瘡）、ジフテリア、ギラン−バレー症候群、遺伝性末梢神経障害（例えば、シャルコー−マリー−ツース病（Charcot-Marie-Tooth disease）（タイプＩ，タイプＩＩ及び全てのタイプを含む）、遺伝性の運動ニューロン障害及び知覚ニューロン障害（タイプＩ，ＩＩ及びＩＩＩ及び腓骨筋肉萎縮）、遺伝性圧脆弱性神経障害（ＨＮＰＰ）、感染性疾患（例えば、後天性免役不全症候群（ＡＩＤＳ））、ライム病（例えば、Borrelia burgdorferiによる感染）、微生物の侵入（例えば、ハンセン病−神経の外傷後の神経障害の全世界での主な原因）、大脳白質萎縮症、代謝性の疾患又は障害（例えば、アミロイド症、真性糖尿病、甲状腺機能低下症、ポルフィリン症、類肉腫症、又は尿毒症）、神経繊維腫症、栄養不足、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、腓骨神経麻痺、ポリオ、ポルフィリン症、ポリオ後症候群、プロテウス症候群、圧迫麻痺（pressure paralysis）（例えば、手根管症候群）、進行性延髄麻痺、橈骨神経麻痺、脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）、毒性薬剤（例えば、バルビツール、一酸化炭素、クロロブタノール、ダプソン、エメチン、重金属、ヘキソバルビツール、鉛、ニトロフラントニン、オルソジニトロフェナル、フェニトイン、ピリドキシン、スルフォナミド、トリオルトクレシルリン酸、ビンカのアルカロイド、多くの溶剤、他の工業性の毒、及び特定のＡＩＤＳ薬（ジダノシン及びザルシタビンを含む）、外傷（神経の外傷−末梢神経障害の全世界的な主な原因）、尺骨麻痺（Beers and Berkow，編纂、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第１７版（Whitehouse Station，NJ：Merck Research Laboratories，1999）第183章）。本発明の好ましい態様において、末梢神経障害はＡＬＳ又はＳＭＡである。
【００４７】
本発明の別の態様において、神経組織の変性は神経変性疾患である。本明細書に記載された方法により処置してよい神経変性疾患の例は、限定ではないが、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）を含む。脱髄の症状に関連した神経組織変性を治療するために本明細書に記載された方法を使用することも、本発明の範囲内である。脱髄症の例は、限定ではないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性横断性脊髄炎、急性ウイルス性脳炎、副腎白質萎縮症（ＡＬＤ）、副腎脊髄神経障害（adrenomyeloneuropathy）、ＡＩＤＳ−液胞脊髄障害、ＨＴＬＶ−付随性脊髄障害、レーベル遺伝子視神経症、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性の多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、準急性硬化症汎脳炎、及び熱帯性痙攣性不全対麻痺を含む。
【００４８】
本発明の分化した神経細胞は、当業界において公知の標準手法、並びに本明細書に記載された方法により、治療の必要がある被験者に移植してよい。例示として、胚のボディー（多能性ＥＳ細胞に由来してよい）を適当な胚性シグナリング因子（例えば、ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３）により誘導することにより、分化した神経細胞を生成してよい。誘導から適当な時間の後に（例えば、誘導の３−４日後）、胚のボディー（ＥＢｓ）を移植のために調製し（例えば、部分的に粉砕された）、そして次に被験者に移植してよい（例えば、チキン、ＨＨステージ１５−１７の脊髄へ）。移植された組織を順応させる（accommodate）ため、移植の前に被験者に吸引による外傷を与えてよい（suction-lesioned）。約１／２−１のＥＢ（又はＥＢ均等物）を、次に、被験者の吻側頸部、尾部側頸部、胸部又は腰部領域において２−５の体節にわたるセグメントへ移植してよい。
【００４９】
本発明の一つの態様において、分化した神経細胞は被験者の脊髄に移植されて、それにより被験者の脊髄を再増殖させ、そして神経組織の変性はＡＬＳ又はＳＭＡに関連した神経障害である。移植されたニューロンが脊髄の運動ニューロンである場合、吻側化及び尾部側化胚性シグナリング因子は、好ましくはレチノイン酸であり、そして背側化又は腹側化胚性シグナリング因子は、好ましくはヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である。
【００５０】
本発明の方法において、分化した神経細胞は、神経組織の変性を治療するのに有効な量において、治療の必要のある被験者に移植される。本明細書にて使用される用語「神経組織の変性を治療するのに有効」は、神経組織の変性の臨床上の障害又は兆候を改善するか又は最小にするのに有効なことを意味する。例えば、神経組織の変性が末梢神経障害である場合、末梢神経障害の臨床上の障害又は兆候は、血管運動神経の兆候を緩和すること、深部反射を増加させること、筋肉萎縮を減少させること、感覚の機能を回復させること、及び筋肉を強化することにより、改善するか又は最小化してよい。治療の必要な被験者において神経組織の変性を治療するのに有効な分化した神経組織細胞の量は、各ケースの特定の因子に依存して変更され、神経組織変性の種類、神経組織変性のステージ、被験者の体重、被験者の症状の重度、分化した神経細胞の種類及び移植の方法を含む。この量は、当業者により、臨床試験及び本明細書に開示された方法を含む公知の手法に基づいて、容易に決定してよい。
【００５１】
分化した神経細胞へのＥＳ細胞の分化を誘導する上記の方法に関して、本発明は、さらに、分化した神経細胞を生成する方法を提供するが、（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることを含む。本発明は、細胞の集団も提供し、この方法により生成した、分化した神経細胞を含む。一つの態様において、細胞の全て又は一部がｅＧＦＰを発現する。本発明の分化した神経細胞が脊髄の運動ニューロンである場合、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子は、好ましくはレチノイン酸であり、そして背側化又は腹側化胚性シグナリング因子は、好ましくはヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である。
【００５２】
本発明の方法において、工程（ｂ）−（ｄ）の何れかは、インビトロか、又は被験者中でインビボにて実施してよい。インビトロの工程の後に、細胞を被験者に移植するが、残りの工程はインビボにて実施される。従って、本発明の方法は、さらに、神経前駆細胞又は分化した神経細胞を被験者に移植する工程を含む。例えば、ＥＳ細胞の培養物を、インビトロにおいて吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、神経前駆細胞を生成してよい。そうして生成された神経前駆細胞を次に被験者に移植してよいが、工程（ｃ）及び（ｄ）はインビボにて実施する。
【００５３】
別の態様においては、ＥＳ細胞の培養物を、インビトロにおいて吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、神経前駆細胞を生成してよい。神経前駆細胞を、次に、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子にインビトロにて接触させることにより、分化した神経細胞を生成してよい。以後、分化した神経細胞を被験者に移植してよく、工程（ｄ）をインビボにて実施する。
【００５４】
さらなる別法においては、ＥＳ細胞の培養物を、インビトロにおいて吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させることにより、神経前駆細胞を生成し；神経前駆細胞を、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子にインビトロにて接触させることにより、分化した神経細胞を生成し；そして、任意に、分化した神経細胞を、インビトロにおいて少なくとも一つの神経栄養因子と接触させてよい。分化した神経細胞を、次に、被験者に移植してよい。本発明の一つの態様において、ニューロンを被験者の脊髄に移植する。
【００５５】
本発明は、さらに、被験者の脊髄を再増殖させる方法を提供するが、（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量にて、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして（ｅ）分化した神経細胞を、被験者の脊髄に移植することを含む。分化した神経細胞は、脊髄を再増殖させるのに有効な量にて被験者の脊髄に移植される。この量は、公知の手法及び本明細書に開示された方法に基づいて、当業者により容易に決定してよい。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子は、レチノイン酸であり、そして背側化又は腹側化胚性シグナリング因子は、ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である。本発明のこの方法は、神経組織の変性、特に末梢神経障害の被験者を治療するのに有用かもしれない。従って、本発明の別の態様において、被験者は末梢神経障害を有する。好ましくは、末梢神経障害はＡＬＳ又はＳＭＡである。本発明のさらに別の態様において、移植された、分化した神経細胞は、ｅＧＦＰを発現し、それにより、脊髄再増殖の監視を容易にさせる。
【００５７】
本発明は、さらに、工程：（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量にて、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｃ）任意に、神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることを含む方法により生産される神経前駆細胞を提供する。また、工程：（ａ）ＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量にて、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量にて、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることを含む方法により生産される神経前駆細胞も提供する。発明の一つの態様において、分化した神経細胞はｅＧＦＰを発現する。
【００５８】
ＣＮＳニューロンの特定のクラスの選択的変性は多くの神経障害の基になるから、ニューロンの成長、生存、及び活性の研究は、相変わらず優先事項である。不幸なことに、しかしながら、生きているニューロンは、そのような研究において容易に利用可能ではない。そのため、本発明は研究される神経細胞の可能性を秘めた無制限な源を提供するため、神経科学及び神経学の分野の研究者に特に重要になる。従って、本発明は、特定の研究エリアにおいて上記の前駆細胞及び分化した神経細胞の用途も提供する。
【００５９】
本発明の神経前駆細胞及び分化した神経細胞は、ニューロン（特に、運動ニューロン）の発生、機能及び死の分析−運動ニューロン疾患の完全な理解に必須の研究において有用になる。さらに、本発明の神経前駆細胞及び分化した神経細胞は、標的筋肉との接触のブイにおいてシナプスの分化を監視するのに有用になる。最後に、本発明の神経前駆細胞及び分化した神経細胞は、ＡＬＳ又はＳＭＡ患者において検出された変異の一つを運ぶ変性した運動ニューロンと正常な健康な運動ニューロンの直接の比較を容易にする（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）又は生存運動ニューロン蛋白質（ＳＭＮ）遺伝子内の変異）。そのような比較のために、よく知られた技術及び本明細書に記載された方法を用いて、健康な神経細胞及び疾患の神経細胞の両方を生産してよい。あるいは、ＳＯＤ又はＳＭＮ変異を有する細胞を、ＡＬＳ又はＳＭＡを有する生きた患者又は死んだ患者から単離してよい。
【００６０】
本明細書に記載されるとおり、発明者らは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）発現のおかげで生きた運動ニューロンが同定できたＥＳ細胞系を構築した。運動ニューロン特異的トランス遺伝子発現を授与するマウスＨＢ９遺伝子の９−ｋｂ ５’領域の制御下でｅＧＦＰのｃＤＮＡを発現するトランスジェニックマウス系列を生じさせた。トランスジェニックファウンダーマウスをＨＢ９とｅＧＦＰの発現の比較によりスクリーニングした。一つのマウス系列、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂは高レベルのｅＧＦＰをＥ９．５−Ｐ１０マウスの脊髄運動にの細胞ボディーにおいて発現し、内生ＨＢ９のパターンと平行なパターンにおいてであった。さらに、ｅＧＦＰの発現が運動ニューロンの軸索及び樹状突起において高レベルで検出された。ＥＳ細胞系（ＨＢＧ３）はｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂトランスジェニックマウス由来であった；これらの細胞は生殖系（germ line）を通してｅＧｆｐ遺伝子を伝搬して、類似の運動ニューロン選択的パターンにおいてｅＧＦＰの発現を指示した。
【００６１】
従って、本発明は、ＥＳ細胞がｅＧＦＰを発現する、本発明の方法においての使用のための胚性幹（ＥＳ）細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物系をさらに提供する。非ヒト動物は適当な動物（例えば、ネコ、家畜、イヌ、ウマ、ヒヤギ、齧歯類、及びヒツジ）であってよいが、それは好ましくは齧歯類である。より好ましくは、非ヒト動物はラット又はマウスである。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子操作されたトランスジェニック動物のための様々な技術により製造してよく、当業界公知のものを含む。発明の一つの態様において、トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）遺伝子を含む。このトランスジェニック動物から確立された動物系列は、その胚の中に、ｅＧＦＰを発現するＥＳ細胞を含む。
【００６２】
本明細書にて使用される用語「トランスジェニック非ヒト動物」は、そのゲノムがトランス遺伝子の導入により変更された、実験操作により製造された、遺伝子操作された非ヒト動物を意味する。さらに本明細書にて使用される用語「トランス遺伝子」は、実験操作により動物のゲノムに導入された核酸分子（例えば、ＤＮＡ、遺伝子、又はそれらの断片）を意味し、導入された遺伝子は当該動物にとって内生ではないか、又は動物にとって内生の遺伝子の修飾形態か又は変異形態である。内生遺伝子の修飾形態又は変異形態は、ヒトの介入を通して製造してよい（例えば、点変異の導入、フレームシフトの導入、内生遺伝子の部分又は断片の欠失、選択可能なマーカー遺伝子の挿入、停止コドンの挿入等による）。
【００６３】
トランスジェニック非ヒト動物は、ヒトの介入を含む幾つかの方法により製造してよく、限定ではないが、非ヒト動物の胚生幹細胞、新たに受精した卵、又は初期胚へのトランス遺伝子の導入；非ヒト動物の体細胞及び／又は生殖細胞の染色体へのトランス遺伝子の組込み；及び本明細書に記載されたあらゆる方法を含む。本発明の好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、トランス遺伝子のＥＳ細胞への導入により製造される。
【００６４】
例示として、本発明のトランスジェニックマウス系は、マウスＨＢ９遺伝子の５’上流領域（Arber et al.，Requirement for the homeobox gene HB9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，1999）、続く５’スプライス基質（Choi et al.，A generic intron increases gene expression in transgenic mice．Mol．Cell Biol.，11：3070-74，1991）、ｅＧＦＰ遺伝子、及びウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナルを含む断片（例えば、約９ｋＢ）を使用する構築物の前核注入により確立してよい。ＥＳ細胞系を、次に、異型接合胚盤胞から遊動してよく、以前に記載されたとおりである（Abbondanzo et al.，Derivation of embryonic stem cell lines．Methods Enzymol.，225：803-23，1993）。遺伝子系列は、マウス胚盤胞を発生させるその能力及び生殖系の遺伝（germ transmission）に関するその能力に基づいて選択してよい。胚生幹細胞は、次に、本明細書に記載された方法における使用のために、トランスジェニック動物から単離してよい。
【００６５】
本発明の一つの態様において、トランスジェニック動物は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）又は生存運動ニューロン蛋白質（ＳＭＮ）遺伝子が変異した（例えば、ＳＯＤ−１−Ｇ９３Ｓ変異）か又は選択的に不活性化されることによりその内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に破壊をもたらす、ゲノムを有する。本明細書にて使用される「破壊」は、機能するＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の正常な発現を妨害する、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内の変異（即ち、遺伝物質内の永遠の遺伝性の変化）を意味する（例えば、それが変異ＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質をもたらすか；それが正常な量のＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を妨害するか；又はそれがＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を妨害する）。破壊の例は、限定ではないが、点変異、フレームシフト変異の導入、内生遺伝子の一部又は断片の欠失、選択可能なマーカー遺伝子の挿入、及び停止コドンの挿入を含む。本明細書にて使用される「変異体」は、野生型遺伝子（又はその遺伝子産物）に比較して、その配列内（又はその機能特性）に少なくとも一つの修飾を呈する遺伝子（又はその遺伝子産物）を意味する。対照的に、用語「野生型」は、その天然源（例えば、天然集団）中でもっとも頻繁に見いだされる、特定の遺伝子（又はその遺伝子産物）に関して特徴的な遺伝子型（又は表現型）を意味する。野生型動物は、例えば、ＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質を発現する。
【００６６】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物における選択的不活性化は、様々な方法により達成してよく、そして異型接合破壊（一つのＳＯＤ対立遺伝子又は一つのＳＭＮ対立遺伝子が破壊されて、結果のトランスジェニック動物が変異に関して異型接合である）又は同型接合破壊（ＳＯＤ又はＳＭＮの対立遺伝子両方が破壊されて、結果のトランスジェニック動物が変異に関して同型接合である）の何れかをもたらしてよい。本発明の一つの態様において、トランスジェニック動物の内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子は、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子産物に共通の領域をコードする核酸配列との相同組換えにより破壊される。例示として、相同組換えによる破壊は、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内のノックアウト変異、特に少なくとも一つの欠失がＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子の少なくとも一つのエクソン内に導入されたノックアウト変異を生じてよい。さらに、ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内の破壊が、異種選択可能マーカー遺伝子の内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子への挿入をもたらしてよい。
【００６７】
ｅＧＦＰ遺伝子を発現し、そしてＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内にノックアウト変異を有するトランスジェニック非ヒト動物の系列を確立する一つの方法は、以下の工程を含んでよい：（ａ）ＳＯＤ又はＳＭＮ標的ベクターを生成し；（ｂ）標的ベクターを非ヒト動物のレシピエント細胞に導入し；（ｃ）処理されたレシピエント細胞を非ヒト動物の胚盤胞に導入することにより、処理された胚盤胞を生成し；（ｄ）処理された胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物に導入し；（ｅ）移植された胚盤胞を予定日まで発生させ；（ｆ）そのゲノムがノックアウト破壊をその内生ＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に含むトランスジェニック非ヒト動物を同定し；（ｇ）トランスジェニック非ヒト動物を繁殖させることにより、野生型に比較して低下したＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を呈するトランスジェニック非ヒト動物を得て；そして（ｈ）ｅＧＦＰを発現し、そして野生型に比較して低下したＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質の発現を呈するトランスジェニック非ヒト動物を得るために、当該トランスジェニック非ヒト動物を、そのゲノムがｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物と交配させることを含む。ｅＧＦＰを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、上記の方法に従い得てよい。ＳＯＤ又はＳＭＮ蛋白質を過剰に発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供することも、本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明のｅＧＦＰ発現トランスジェニック動物系は、ＥＳ細胞の源及び移植、キメラ、及び二重標識組換え実験のための組織を提供する。本発明のトランスジェニック動物系は、運動ニューロン変性の遺伝モデルも提供する。例えば、トランスジェニック動物系由来の動物のゲノムがそのＳＯＤ遺伝子内に変異を有する場合、それは運動ニューロン変性、特にＡＬＳを治療するのに有用かもしれない薬剤をスクリーニングするための薬学モデルとして使用してよい。このモデルは緩慢な変性の開始を呈し得るはずであるが、その結果は劇的であると予測される。さらに、トランスジェニック動物のゲノムがそのＳＭＮ遺伝子内に変異を有する場合、それは運動ニューロン変性、特にＳＭＡを治療するのに有用かもしれない薬剤をスクリーニングするための薬学モデルとして使用してよい。このモデルは素早い変性の開始を呈すると予測される。
【００６９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物由来のＥＳ細胞は、本明細書に記載された方法において使用してよく、インビトロ又はインビボの分化、及び被験者への再導入を含む。さらに、ｅＧＦＰを発現するトランスジェニック動物系由来のＥＳ細胞及びＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に変異を有するトランスジェニック動物系由来のＥＳ細胞を交配してよい。変異体ＥＰＡ細胞の挙動を、次に、細胞及び／又は組織がｅＧＦＰを発現する、発生した動物又はキメラ胚の顕微鏡観察により追跡する。
【００７０】
本発明は、さらに、分化した神経細胞の純粋な集団を単離する方法、及び／又は分化した神経細胞の集団を精製する方法を提供し、工程：（ａ）増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現するＥＳ細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）ＥＳ細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の、吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させるが、但し、神経前駆細胞の幾つか又は全てもｅＧＦＰを発現し；（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の、背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させるが、但し、分化した神経細胞もｅＧＦＰを発現し；（ｄ）任意に、分化した神経細胞のサブクラスを、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；（ｅ）分化した神経細胞の中でｅＧＦＰの発現を検出し；そして（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離することを含む。発明の一つの態様において、分化した神経細胞は、運動ニューロンである。ｅＧＦＰを発現するＥＳ細胞は、上記に通りにして本発明のトランスジェニック動物から得てよく、あるいは本明細書に開示された他の方法に従い作成してよい。
【００７１】
本発明の方法によると、ｅＧＦＰの発現は、インビトロ又はインビボの何れかのアッセイにより分化した神経細胞中で検出してよい。本明細書にて使用された「発現」は、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物中のｅＧＦＰ遺伝子の転写、又は少なくとも一つのｍＲＮＡのｅＧＦＰ蛋白質への翻訳を意味する。分化した神経細胞は、ｅＧＦＰ蛋白質、ｅＧＦＰのｃＤＮＡ、又はｅＧＦＰのｍＲＮＡをアッセイすることによる、ｅＧＦＰ発現をアッセイしてよい。ｅＧＦＰの適切な形態は、本明細書に開示された特定の技術に基づいて明らかとなる。
【００７２】
分化した神経細胞は、ｅＧＦＰ発現に関してアッセイしてよく、そしてｅＧＦＰ発現は当業界で公知のアッセイ及び方法を用いて、分化した神経細胞内で検出してよい。ｅＧＦＰは培養物中及びインビボにおいて細胞を標識するための非侵入性マーカーを提供するから、ｅＧＦＰの発現は、好ましくは、イメージング技術、特にブライトフィールド、相、及び蛍光イメージング技術を用いて、分化した神経細胞中で検出され、本明細書に開示されるとおりである。高レベルのｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞は、次に、以下に記載される、それらのｅＧＦＰ蛍光及びフォワードライトスキャンに基づいて、分類することにより（例えば、Beckman-Coulter Altraフローサイトメトリーを用いた、ＦＡＣＳソーティング）、細胞懸濁液から単離してよい。
【００７３】
他の方法も、本発明の分化した神経細胞内でｅＧＦＰ発現を検出するのに使用してよい。そのような検出方法の例は、限定ではないが、ハイブリダイゼーション分析、イメージング技術、免疫学上の技術、免疫沈殿、放射検出、ウエスタンブロット分析、及び本明細書に開示されたあらゆる追加のアッセイ又は検出方法を含む。例えば、ｅＧＦＰ蛋白質又はｅＧＦＰ核酸と反応性の薬剤を用いて、ｅＧＦＰ発現に関して分化した神経細胞をアッセイしてよい。本明細書にて使用される「反応性」は、ｅＧＦＰに親和性を有するか、ｅＧＦＰに結合するか、又はｅＧＦＰに対して向けられる薬剤を意味する。さらに本明細書にて使用される「薬剤」は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、化合物、抗生物質、薬品（drug）、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。本発明の一つの態様において、ｅＧＦＰと反応性の薬剤は、抗体である（例えば、αＧＦＰ（Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR））。
【００７４】
分化した神経細胞内でのｅＧＦＰ発現の検出の後に、細胞中のｅＧＦＰ発現の程度を、もし必要なら様々な定量アッセイのうちの一つを用いて、測定するか又は定量してよい。そのようなアッセイは当業者に知られており、ｅＧＦＰ蛋白質の量を測定するための、免疫組織化学、免疫細胞学、フローサイトメトリー、質量分光分析、ウエスタンブロット分析、又はＥＬＩＳＡを含んでよい。
【００７５】
本発明は、さらに、ニューロン（例えば、運動ニューロン）の変性に関連した症状を治療することにおける使用のための薬剤を同定する方法を提供する。本明細書にて使用される「ニューロンの変性」は、ニューロンが劣ったか又は低い機能活性の形態に変化するニューロンの変性の症状を意味する。ニューロンの変性に関連した症状の例は、本明細書に記載された、末梢神経障害、脱ミエリン症状、及び根本的な神経学の症状（例えば、神経変性疾患）、ＣＮＳ及びＰＮＳ外傷及び障害、及び非神経機能不全の後天性二次作用（例えば、変性性、病理性、又は外傷性の自己に対して二次的な神経損失）を含む。
【００７６】
本発明の方法は、（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；（ｂ）神経前駆細胞を生成するのに有効なレチノイン酸の量に、当該胚性幹細胞の培養物を接触させ；（ｃ）神経前駆細胞中のヘッジホッグシグナリング経路を活性化することにより、神経の幾つか又は全てが変性したニューロンを生成し；（ｄ）変性したニューロンを候補薬剤に接触させ；そして（ｅ）薬剤が変性したニューロンの幾つか又は全ての再生を増強するか否か決定する工程を含む。本明細書にて使用される「再生を増強する」は、変性していたニューロン（神経突起及びミエリン鞘）の部分的又は完全な成長（又は再成長）を増大させるか（augment）、改善するか、又は増加させる（increase）ことを意味する。ニューロンの再生は、中枢神経系及び末梢神経系の両方のニューロンにおいて生じてよい。本発明の一つの態様において、上記薬剤は、変性した運動ニューロンの再生を増強する。
【００７７】
本発明の方法においては、本明細書に記載された、因子（又は薬剤）と細胞の間の接触をもたらすあらゆる方法、及び誘導及び投与のあらゆる方法により、変性したニューロンを候補の薬剤と接触させてよい。ニューロンの再生、及び増強された再生は、公知の手法により測定するか又は検出してよく、ミエリン−特異的且つ軸索特異的な蛋白質のためのウエスタンブロッティング、形態計測を伴う電子顕微鏡、及び当業者に知られているあらゆる方法、分子手法、及びアッセイを含む。さらに、ミエリンの成長を、ｇ−比、軸索：ミエリン結合の完全性の一つの測定法を用いてアッセイしてよい。ｇ−比は軸索とミエリンの全直径割る軸索の直径として定義される。この比は、何れかの一定のサイズの軸索に関しての相対的なミエリンの信頼できる測定値を提供する（Bieri et al.，Abnormal nerve conduction studies in mice expressing a mutant form of the POU transcription factor，SCIP．J．Neurosci．Res.，50：821-28，1997）。多数の研究が証明したことは、０．６のｇ−比がほとんどの繊維には標準であるということである（Waxman and Bennett,Relative conduction velocities of small melinated and nonmyelinated fibers in the central nervous system．Nature New Biol.，238：217，1972）。
【００７８】
本発明の一つの態様において、変性したニューロン内のゲノミックＤＮＡはＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子内に変異を有する。そのような変性したニューロンは、例えば、上記のとおり、そのゲノムが変異したＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子を含む本発明のトランスジェニック動物から単離してよい。発明の一つの態様において、変性したニューロンは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する。そのような変性したニューロンは、上記のとおり、そのゲノムがｅＧＦＰ遺伝子を含む本発明のトランスジェニック動物から単離してよい。ＳＯＤ及びｅＧＦＰ遺伝子の両方を発現するか、又はＳＭＮ及びｅＧＦＰ遺伝子の両方を発現する変性したニューロンは、ＳＯＤ又はＳＭＮ変異を有するＥＳ細胞を、ｅＧＦＰ遺伝子を含むＥＳ細胞と交配することにより生成してよい。
【００７９】
本発明は以下の実施例において記載されるが、発明の理解を助けるために記載されるのであり、以後の請求の範囲において定義される発明の範囲を、如何なる意味においても、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８０】
実施例
実施例１−ＥＳ−細胞培養
野生型（ＭＭ１３又はＷ９．５）又はＨＢ９：：ＧＦＰトランスジェニックマウス由来の（ＨＢＧ３）ＥＳ細胞を、ＥＳ−細胞培地（４５００ｍｇ／ｌのグルコース及び２２５０ｍｇ／ｌの重炭酸ナトリウムと共に、１ｘ非必須アミノ酸、１ｘヌクレオシド（全てがSpecialty Media，Lavellette，ニュージャージーから）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Sigma Chemical Co.，セントルイス、ミズーリ）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco BRL，ガイセルスベルグ、メリーランド）、１５％のＦＢＳ（HyClone，ロウガン、ユタ）、及び１０００μ／ｍｌのＬＩＦ（Chemicon，テメキュラ、カリフォルニア）の中で初期マウス胚繊維芽細胞の供給層上で生育させた。ＥＳ−細胞のコロニーをプレートから２日後に一部解離させ（dissociated）、そしてＤＦ培地（グルコース（４５００ｍｇ／ｌ，Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Sigma）、１ｘインスリン−トランスフェリン−セレニウムサプリメント（Gibco）、２０ｎＭのプロゲステロン（Sigma）、及び６０μＭのプトレシン（Sigma）を付加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２をＥＳＫ１０培地（ＬＩＦとＦＢＳを除いたが、１０％のノックアウト血清補充（Gibco）を追加したＥＳ細胞培地）と１：１混合した）からなるＤＦＫ５培地の中で培養した。培地を２日後に、レチノイン酸（ＲＡ）（１００ｎＭから２μＭ）（Sigma）、ソニックヘッジホッグ蛋白質（ＳＨｈ−Ｎ；３００ｎＭ）（Curis，Inc.，ケンブリッジ、マサチューセッツ）、ヘッジホッグアゴニストＨｈ−Ａｇ１．３（１−１０００ｎＭ）（Curis，Inc.）、又はヘッジホッグブロッキング抗体（５ＥＩ，３０μｇ／ｍｌ）を付加した新鮮な培地と交換した。胚のボディー（ＥＢｓ）をさらに２−５日間培養した。幾つかの実験のために、ＥＳ細胞をストロマＰＡ６細胞系（Riken Cell Bank，日本）の単層上で、ＤＦＫ５培地単独か、又は記載されたとおりに（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons fom ES cells by stromal cell-derived inducing activity．Neuron，28：31-40，2000）、２μＭのＲＡを追加して生育させた。
【００８１】
幾つかのＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来のＥＢｓを誘導の４日後にパパイン分離システム（Worthington Biochemical Corp.，フリーホールド、ニュージャージー）を用いて分離し、内生ｅＧＦＰ発現に基づいてＦＡＣＳ分類し、マトリゲル（ＢＤ）をコートされたペトリ皿又はテラサキウエル上にプレートし、そして５％のウマ血清（Gibco）、１ｘのＢ−２７サプリメント（Gibco）、１ｘのインスリン−トランスフェリン−セレンサプリメント（Gibco）、２０ｎＭのプロゲステロン（Sigma）、及び６０μＭのプトレシン（Sigma）を付加されたＦ１２培地（Specialty Media）内で培養した。神経栄養生因子（ＧＤＮＦ，ＮＴ３，ＣＮＴＦ，及びＢＤＮＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems，Inc.，ミネアポリス、ミネソタ）の混合物を、選択された実験に含ませた。
【００８２】
実施例２−免役細胞化学
胚ボディー（ＥＢｓ）を４％パラホルムアルデヒドにより固定化し、そしてアクリオスタット上で切片化した。免役染色のため、以下の抗体を使用した：ウサギαＨＢ９，αＯｌｉｇ２，αＮｋｘ２．２，αＬｈｘ３，αＤｂｘ１（Pierani et al.，Control of interneuron fate in the developing spinal cord by the progenitor homeodomain protein Dbx1．Neuroon，29(2)：367-84，2001），αＩｒｘ３，αｅＧＦＰ（１：２０００，Molecular Probes，Inc.，ユージーン、オレゴン），αＳｏｘ１（１：５００）（Pevny et al.，Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection．Curr．Biol.，8：971-74，1998），αＯｔｘ２（１：１０００）（Mallamacu et al.，OTX2 homeoprotein in the developing central nervous system and migratory cells of the olfactory area．Mech．Dev.，58：165-78，1996），αＨｏｘＣ５（Liu et al．，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001），及びαｃＨＸ１０；マウスαＰａｘ７，αＰａｘ６，αＨＢ９，αＬｉｍ１，αＮｋｘ６．１，αＮｋｘ２．２，αＥｎ１，αＬｉｍ２（マウス特異的），αＮＣＡＭ（マウス特異的），αＳＣ１（チキン特異的），αＮｅｕＮ（１：５００，Chemicon），αＴｕｊ１（１：２０００）（BabCo，バークレー、カリフォルニア），αＳｙｂ（マウス特異的；１：１０００）（Synaptic Systems），αＳｙｎ（１：１０００，Synaptic Systems），及びα神経繊維；モルモットα−Ｉｓｌ１，抗−Ｏｌｉｇ２，抗−Ｈｏｘｃ６（Liu et al.，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）；ヤギ−αＣｈＡＴ（１：２００）（Chemicon），αＶＡＣｈＴ（マウス特異的；１：１０００）（Chemicon）（Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001,特定しない限り）。
【００８３】
実施例３−ｅＧＦＰトランスジェニックマウス系の生成
マウスＨＢ９遺伝子の５’上流領域（Arber et al.，Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，1999）、続く５’スプライス基質（Choi et al.，A generic intron increases gene expression in transgenic mice．Mol．Cell Biol.，11：3070-74：1991）、ｅＧＦＰ遺伝子、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む約９ｋｂの断片を用いた構築物の前核注入により、トランスジェニックマウス系を確立した。ＨＢ９の約９ｋＢのＮｏｔＩ断片は、Ｅ９．５からＰ１０を試験したトランスジェニック胚内でｅＧＦＰ発現が運動ニューロンを発生させるよう指令するのに十分である。一つのトランスジェニック系において（ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ）、ｅＧＦＰ発現のパターンは内生ＨＢ９の発現のプロフィールにぴったりと一致した。ＥＳ−細胞系を、前に記載されたとおりに（Abbondanzo et al.，Derivation of embryonic stem cell lines．Methods Enzymol.，225：803-23，1993）、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ異型接合胚盤胞から誘導した。一つの選択された系（ＨＢＧ３）について、マウス胚盤胞を発生させるように統合するその能力及び生殖系列の移行（germline transmission）のためのその能力に関して検査した。
【００８４】
実施例４−ＨＢＧ３−細胞−由来の運動ニューロンのＦＡＣＳ単離
ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞の胚ボディーをパパイン分離系（Worthington Biochemical Corp.）を用いて分離した。高いレベルのｅＧＦＰを発現する細胞を、Beckman-Counter Altraフローサイトメトリーを用いて、プロット中に示されたゲートを用いてそれらのｅＧＦＰ蛍光及びフォーワード光散乱に基づいて、細胞懸濁液から分類した。一般に、入力した細胞の２０−３０％は高いレベルのｅＧＦＰを発現した。上記分析は、このｅＧＦＰ−高（Hi)細胞群が＞９５％純粋な集団の運動ニューロンを構成要素としたことを確証した。典型的なＦＡＣＳ分類の収量はＥＢあたり３０００−５０００のＧＦＰ−高細胞である。
【００８５】
実施例５−ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞−由来の運動ニューロンのインビボ移植
ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来のＥＢｓを２μＭのＲＡ及び１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３により誘導した。誘導の３−４日後に、ＥＢｓを一部粉砕して、チキンのＨＨステージ１５−１７の脊髄に移植し、吸引損傷して移植された組織を適応させた。約１／２−１のＥＢ均等物が、チキン胚脊髄の吻側頸部、尾部側頸部、胸部、又は腰部領域において２から５の体節にわたるセグメントに移植した。幾つかの胚を移植の３日後に回収し、固定化し、ビブラトーム上で切片化し、そしてｅＧＦＰに対する抗体及び細胞−又は種−特異的抗体により染色した。他の胚（胸部脊髄への移植物を受ける）は７日目に回収した。それらの胸郭を切開し、ローダミン−コンジュゲートされたα−ブンガロトキシン（２μｇ／ｍｌ，Molecular Probe，Inc.）及びＧＦＰ，Ｓｙｂ，Ｓｙｎ，又はＶＡＣｈＴに対する抗体によりホウルマウント（wholemount）として染色した。
【００８６】
以下に記載されるとおり、発明者らの実験結果は、レチノイン酸が胚ボディー（ＥＢｓ）中の神経前駆細胞上に尾部側化効果を有すること、運動ニューロン前駆体特異化が尾部側化ＥＢｓにおいてはヘッジホッグ依存性であること、ｅＧＦＰ−標識されたＥＳ−由来のニューロンは生成及び単離に成功するかもしれないこと、そしてｅＧＦＰ−標識されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンは胚の脊髄内で分化することを示す。
【００８７】
ＲＡは胚ボディー中で神経前駆体を尾部側化する
マウスＥＳ細胞が運動ニューロンを生じさせる能力を検査し始めるため、発明者らは、凝集培養において２日間マウスＥＳ細胞を生育させたが、胚ボディー（ＥＢｓ）の形成をもたらす方法であった（Bain et al.，Embryonic stem cells express neuronal propertiesin vitro．Dev．Biol.．168：342-57，1995）。最初に約１０００の細胞からなったＥＢｓは、さらに１−７日間、追加の因子の存在又は不在下で、懸濁培養にて保持した。
【００８８】
制御条件下では、２−３日間生育させたＥＢｓは、全神経前駆体マーカーＳｏｘ１発現する細胞を、あるとしても僅かしか含まなかった（図１）（Pevny et al.，Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection．Curr．Biol.，8：971-74，1998；Wood et al.，Comparative expression of the mouse Sox1，Sox2 and Sox3 genes from pre-gastrulation to early somite stages．Mech．Dev.，86：19-201，1999）。同様に、５日目に検査されたＥＢｓは、神経核マーカーＮｅｕＮの発現により評価されるニューロン及びＭＡｂ ＴｕＪ１により認識される神経βチューブリンアイソフォームを、あったとしても僅かしか含まなかった（図１Ｂ及び示さないデータ）。対照的に、ＥＢｓのＲＡ（１００ｎＭから２μＭ）への２−３日の暴露は、多数のＳｏｘ１＋細胞の存在をもたらし；５日間で、多数のＮｅｕＮ＋，ＴｕＪ１＋有糸分裂後のニューロンが検出された（図１Ｂ及び示さないデータ）。即ち、マウスＥＳ細胞由来のＥＢｓはニューロンを生じさせるように誘導することができる。Bain et al.，Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro．Dev．Biol.，168：342-57，1995；及びXiam et al.，Peering into early neurogenesis with embryonic stem cells．Trends in Neurosci.，24：685-86，2001も参照。
【００８９】
発明者らは、次に、両者の同時発現が初期中脳の位置アイデンティティーの指標である、Ｏｔｘ２とＥｎ１の発現をアッセイすることにより（Davis et al.，Expression pattern of the homeobox-containing genes En-1 and En-2 and the proto-oncogene int-1 diverge during mouse development．Genes Dev.，2：1736-44，1988；Mallamaci et al.，OTX2 homeoprotein in the developing central nervous system and migratory cells of the olfactory area．Mech．Dev.，58：165-78，1996）、そして、脊髄の位置アイデンティティーマーカーであるＨｏｘ蛋白質Ｈｏｘｃ５，Ｈｏｘｃ６及びＨｏｘｃ８の発現をアッセイすることにより（Belting et al.，Multiple phases of expression and regulation of mouse Hoxc8 during early embryogenesis．J．Exp．Zool.，282：196-222，1998；Liu et al.,Assigning the pisitional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）、ＲＡ−暴露されたＥＢｓ内に形成された神経前駆細胞の吻側位置のアイデンティティーを決定した。３日間ＲＡに暴露されたＥＢｓ中の細胞はＯｔｘ２とＥｎ１の発現を欠き、そしてＨｏｘｃ５及びＨｏｘｃ６を発現したが、Ｈｏｘｃ８は発現しなかった（図１Ｂ及び示さなかったデータ）。神経Ｈｏｘ−ｃ発現のこのプロフィールは、吻側頸部脊髄の位置的特性を伴う細胞の指標である（Belting et al.，Multiple phases of expression and regulation of mouse Hoxc8 during early embryogenesis．J．Exp．Zool.，282：196-222，1998；Liu et al.,Assigning the pisitional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。
【００９０】
ＥＳ細胞のＲＡへの暴露は神経の分化及び脊髄位置的マーカーの発現の両方を促進させるから、このプロトコルはＲＡのＥＳ−由来の神経細胞に対する尾部側化作用の直接の試験を可能にさせない。よって、発明者らは、ＲＡ−非依存性経路を通してＥＳ細胞を神経化する手段を探した。これを達成するため、発明者らは、神経誘導性シグナルの源としてＰＡ６ストロマ細胞系を使用した（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells to PA6 cell activity for 5 days induced activity．Neuron，28：31-40，2000）。マウスＥＳ細胞のＰＡ６細胞活性への５日間の暴露は、莫大な数のＳｏｘ１＋細胞を誘導し、それらの多くはＯｔｘ２及びＥｎ１を同時に発現した；対照的に、Ｈｏｘｃ５又はＨｏｘｃ６を発現した細胞はなかった（図１Ｃ及び示さなかったデータ）。さらに、６日間で、多数のＯｔｘ２＋，ＴｕＪ１＋ニューロンが検出された（図１Ｃ）。ＥＳ細胞のＰＡ６細胞活性及びＲＡ（２μＭ）への暴露は、なおも多数のＳｏｘ１＋を誘導した；しかしながら、これらの細胞はＯｔｘ２及びＥｎ１の発現を欠いたし、多くが今はＨｏｘｃ５及びＨｏｘｃ６を発現した（図１Ｃ及び示さなかったデータ）。合わせると、これらの発見は、インビボにおけるように（Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999）、初期中脳と同様な位置的特性の神経化ＥＳ細胞が尾部側化されることにより、ＲＡへの暴露に際して脊髄と同様な位置的特性になり得ることを示す。
【００９１】
運動ニューロン前駆体特異化は尾部側化胚ボディーにおいてＨｈ−依存性である
ＲＡに暴露されたＥＢｓ内に存在した、脊髄の位置的特性を有する神経前駆体が運動ニューロン前駆体に分化できるか否かを検査するため、発明者らは、運動ニューロン前駆体アイデンティティーの特異化において連続的な工程を規定するＨＤ及びｂＨＬＨの転写因子の発現を監視した（図２Ａ）。神経前駆細胞のＰａｘ７，Ｉｒｘ３，Ｄｂｘ１，Ｐａｘ６，Ｎｋｘ６．１，Ｎｋｘ２．２，及びＯｌｉｇ２の詳述された別個のセットが、神経管の背−腹軸に沿って配置された（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral axis of the neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001；図２Ｂ）。脊髄の運動ニューロン前駆体がｐＭＮドメイン中に発見された；それらはＰａｘ６，Ｎｋｘ６．１及びＯｌｉｇ２を発現し、そしてＰａｘ７，Ｉｒｘ３，Ｄｂｘ１及びＮｋｘ２．２を排除した（図２Ｂ及び示さなかったデータ）。ＲＡに３日間暴露されたＥＢｓは、Ｐａｘ７，Ｐａｘ６，Ｉｒｘ３及びＤｂｘ１を発現する細胞を多数含み、そしてＮｋｘ６．１，Ｏｌｉｇ２又はＮｋｘ２．２を発現する細胞はあったとしてもほとんど含まなかった（図２Ｃ及び２Ｄ及び示さなかったデータ）。転写因子の発現のこのプロフィールは、介在ニューロンを生じる背側及び中間の脊髄内に位置する前駆細胞の特徴である（図２Ｂ）（Lee et al.，The specification of dorsal cell fates in the vertebrate central nervous system．Annu．Rev．Neurosci.，22：261-94，1999）。
【００９２】
運動ニューロン前駆体の誘導は、ＳＨｈ活性に依存する（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral axis of the neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001）。よって、発明者らは、ＳＨｈシグナリングがＲＡに暴露されたＥＢｓにおいて前駆細胞転写因子発現のプロフィールを変化させるか否かを検査した。ＳＨｈシグナリング経路を達成するため、発明者らは、ＳＨｈシグナリングの特異的小分子アゴニストであるＨｈ−Ａｇ１．３（Frank-Kamenetsky et al.，Chemical genetics of Hh signaling：Identification and characterization of Smoothened agonists and antagonists．Submitted，2002）又は組換えＳＨｈ−Ｎ蛋白質（Roelink et al.，Floor plate and motor neuron induction by different concentration of the amino-terminal cleavage product of sonic hedgehog antoproteolysis．Cell，81：445-55，1995）を使用し、本質的に同一の結果を得た。
【００９３】
ＲＡ処理されたＥＢｓの１０ｎＭのＨｈ−Ａｇ１．３への３日間の暴露は、転写因子発現のプロフィールに顕著な変化をもたらした。Ｐａｘ７発現は完全に抑圧され、Ｐａｘ６＋及びＩｒｘ３＋細胞の数は増加し、Ｄｂｘ１＋細胞の数は減少し、そして僅かなＮｋｘ６．１＋及びＯｌｉｇ２＋細胞が検出された（図２Ｃ及び２Ｄ及び示さなかったデータ）。ＲＡ処理されたＥＢｓの１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３への暴露は、Ｄｂｘ１発現を事実上は除去し、Ｉｒｘ３＋及びＰａｘ６＋細胞の数を顕著に減少させ、そして大きく増加した数のＮｋｘ６．１＋及びＯｌｉｇ２＋細胞を誘導した（図２Ｃ及び２Ｄ）。Ｈｈ−Ａｇ１．３に暴露されたＥＢｓ内のＯｌｉｇ２＋細胞の多くがＢｒｄＵを取込んだことから（図１０）、それらは循環する前駆体であることが示された。この濃度のＨｈ−Ａｇ１．３において、僅かなＮｋｘ２．２＋細胞も検出された（図２Ｃ及び２Ｄ）が、ＨＮＦ３β＋フロアープレート細胞は検出されなかった（データは示さず）。Ｈｈシグナリングに応答性のＥＢｓ内の前駆細胞転写因子マーカーの発現のプロフィールの背側から腹側へのシフトは、神経管前駆体の挙動によく似ている（Ericson et al.，Two critical periods of Sonic Hedgehog signaling required for the specification of motor neuron identity．Cell，87：661-73，1996；Ericson et al.，Pax6 controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded SHh signaling．Cell，90：169-80，1997;Ericson et al.，A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube．Cell，101：435-45，2000）。特に、高レベルのＳＨｈシグナリングは、運動ニューロン前駆体のＨＤ及びｂＨＬＨ蛋白質発現の特徴のプロフィールを発現した多数の細胞を生じさせた。
【００９４】
運動ニューロンがＲＡ−及びＨｈ−暴露されたＥＢｓ内に存在する尾部側化され且つ腹側化された前駆細胞から生じたか否かを決定するため、発明者らは、体細胞の運動ニューロンにより選択的且つ不変に発現されるＨＤ蛋白質、ＨＢ９の発現を分析した（Pfaff et al.，Requirement for LIM homeobox gene Isl1 in motor neuron generation reveals a motor neuron-dependent step in interneuron differentiation．Cell，84：309-20，1996；Arber et al.，Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，659-764，1999；Thaler et al.，Active suppression of interneuron programs within developing motor neuron revealed by analysis of homeodomain factor HB9．Neuron，23：675-87，1999）（図３Ａ）。５日間単独で生育されたＲＡに暴露されたＥＢｓは僅かなＨＢ９＋ニューロンを確かに含んだ（図３Ｂ；７±２ ＨＢ９＋ニューロン／切片）。これらのニューロンがＨｈ−依存性様式にて生じたのか否かを試験するため、発明者らは、機能をブロックする抗−Ｈｈ抗体の存在下でＲＡ−暴露ＥＢｓを生育させた（ｍＡｂ ５Ｅ１ Ｉｇ，３０μｇ／ｍｌ）（Ericson et al.，Two critical periods of Sonic Hedgehog signalng required for the specification of motor neuron identity．Cell，87：661-73，1996）。抗−Ｈｈ存在下で生育させたＲＡに暴露されたＥＢｓはＨＢ９＋ニューロンを含まなかったことから（図３Ｂ）、Ｈｈの体内の源は、ＲＡに暴露されたＥＢｓに見いだされる僅かな運動ニューロンの分化のために必要とされる。
【００９５】
発明者らは、運動ニューロンの生成がＲＡに暴露されたＥＢｓ内のＨｈシグナリングのレベルを評価することにより増強できるか否かも検査した。ＲＡ処理されたＥＢｓのＳＨｈ（３００ｎＭ）又はＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）への暴露は、生じた運動ニューロンの数を顕著に増加させ；典型的には、これらのＥＢｓ中の２０−３０％の細胞がＨＢ９を発現した（約５０００のＨＢ９＋ニューロン；５０９±５７のＨＢ９＋ニューロン／切片；約１０−１５の切片／ＥＢ）（図３Ｂ及び示さなかったデータ）。これらのＨＢ９＋細胞はＮｅｕＮとＴｕＪ１を同時発現し（図３Ｃ及び３Ｄ）、そしてＢｒｄＵを取込まなかった（図１０）ことからそれらは有糸分裂後のニューロンであることが示される。ＨＢ９＋ニューロンは、ＲＡ暴露なしでＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）により５日間処理されたＥＢｓにおいて生じなかった（図３）。即ち、ＥＢｓ内の運動ニューロンの生成はＲＡの尾部側化作用及びＨｈシグナルの腹側化作用の両方に依存する。
【００９６】
有糸分裂後の運動ニューロンの分子特性をより詳細に査定するため、発明者らは、脊髄の運動ニューロンのサブセット：Ｉｓｌ１，Ｌｈｘ３及びＬｉｍ１により発現されるＬＩＭ ＨＤ蛋白質の発現を検査した（Tsuchida et al.，Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes．Cell，79：957-70，1994；Sharma et al.，LIM homeodomain factors Lhx3 and Lhx4 assign subtype identities for motor neurons．Cell，95：817-28，1998；Kania et al.，Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb．Cell，102：161-73，2000）（図３Ａ）。３つの全てのＬＩＭ ＨＤ蛋白質はＲＡ及びＨｈに暴露されたＥＢｓにおいてＨＢ９＋運動ニューロンにより発現された。７０％を超えるＨＢ９＋運動ニューロンがＩｓｌ１とＬｈｘ３を同時発現した（図３Ｅ及び３Ｆ）が、はるかに少ないフラクション（＜５％）がＬｉｍ１を同時発現した（図３Ｇ）。ＨＢ９＋ニューロンは何れも後脳（hindbrain）の内臓の（visceral）運動ニューロンのマーカーＰｈｏｘ２ｂを同時発現しなかった（Pattyn et al.，Control of hindbrain motor neuron differentiation by the homeobox gene Phox2b．Development，127：1349-58，2000）。側面の（lateral）運動柱（ＬＭＣ）ニューロンのプロフィールの指標である、ＨＢ９とＬｉｍ１を同時発現する運動ニューロンの低い比率（Kania et al.，Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb．Cell，102：161-73，2000）は、運動ニューロンの吻側頸部のアイデンティティーと一致しており、Ｈｏｘ−ｃ蛋白質発現のプロフィールにより明らかになった（Belting et al.，Multiple phases of expression and regulation of mouse Hoxc8 during early embryogenesis．J．Exp．Zool.，282：196-222，1998；Liu et al.，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。
【００９７】
ＳＨｈは特別な（graded）様式にて作用するから、腹側の介在ニューロンは運動ニューロンの生成に十分な濃度よりほんの僅か低い濃度にて誘導される（Briscoe and Ericson，Specification of neuronal fates in the ventral tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11(1)：43-49，2001）。よって、発明者らは、腹側の介在ニューロンも１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３に暴露されたＲＡ処理したＥＢｓにおいて生じるか否かを検査した。Ｌｈｘ３＋，Ｃｈｘ１０＋Ｖ２介在ニューロン及びＬｉｍ１／２＋（Ｖ０及びＶ１同様）介在ニューロンがこれらのＥＢｓ内で検出された（図３Ｇ及び３Ｈ及び示されなかったデータ）。即ち、初期神経組織を用いたように（Briscoe and Ericson，Specification of neuronal fates in the ventral tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11(1)：43-49，2001）、ＥＢｓ中の細胞が暴露されたＨｈシグナリングのレベルにおける小さなバリエーションが、腹側の介在ニューロン及び脊髄の運動ニューロンの両方の生成をもたらす。
【００９８】
ｅＧＦＰ標識されたＥＳ細胞由来の運動ニューロンが生成されて単離されるかもしれない
ＲＡ及びＨｈシグナリングによりＥＢｓ内で誘導された腹側の神経の不均一性は、発明者らが、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンを同定し、精製し、そして操作する方法を開発することを促した。よって、発明者らは、増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）の発現により同定可能な運動ニューロンを生じさせ得るＥＳ細胞系をデザインした。運動ニューロン特異的トランス遺伝子発現を授与するマウスＨＢ９遺伝子の９−ｋｂの５’領域の制御下でｅＧＦＰのｃＤＮＡを発現する、トランスジェニックマウス系を生成した（図４Ａ）（Arber et al.，Requirement for the homeobox gene HB9 in the consolidation of motor neuron identity．Neuron，23：659-764，1999）。ＨＢ９とｅＧＦＰの発現のパターンを比較することにより、トランスジェニックファウンダーマウスをスクリーニングした。一つのマウス系列、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂが高いレベルのｅＧＦＰをＥ９．５−Ｐ１０マウスにて脊髄運動ニューロンの細胞ボディー内で、内生ＨＢ９と平行したパターンで発現したことがわかった（図４Ｂ−４Ｇ）。さらに、ｅＧＦＰ発現が高レベルで運動ニューロンの軸索及び樹状突起内に検出された（図４Ｃ及び示されなかったデータ）。ＥＳ細胞系（ＨＢＧ３）をｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂトランスジェニックマウスから誘導した；これらの細胞は、生殖系を通してｅＧＦＰ遺伝子を遺伝し、そして類似の運動ニューロン選択パターンにてｅＧＦＰの発現を指示した（データは示さず）。
【００９９】
発明者らは、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞が、ＲＡ及びＨｈ暴露の条件下で、他のマウスＥＳ細胞によく似た様式にて運動ニューロンに分化したことを発見した。Ｈｈ−Ａｇ１．３なしでＲＡ中に５日間生育させたＨＢＧ３ ＥＳ細胞から生じさせたＥＢｓは、僅かなＨＢ９＋運動ニューロンを含み、これらの全てはそれらの身体及び神経突起中でｅＧＦＰを同時発現した（図５Ａ）。ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンの数はＨｈ−Ａｇ１．３への暴露に際して増加し、濃度依存様式であった（図５Ｂ及び５Ｃ）。典型的には、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンは、ＲＡ及び１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３へ暴露されたＥＢｓ中に存在する細胞の全数の２０−３０％を占めた（１０００；図５Ｃ）。ＲＡ存在下におけるＥＢｓのＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）への暴露は、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンを生じさせなかった（−１０００；図５Ｃ）。即ち、ＨＢＧ３ ＥＢ細胞は、ＲＡ及びＨｈシグナリング経路の活性化を通して十分な様式にてｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンを生じさせるために誘導することもできる。
【０１００】
発明者らは、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが胚由来の運動ニューロンの特徴であるインビトロの分化の局面を経験するか否かを試験するためにｅＧＦＰ発現を使用した。ＲＡ−及びＨｈ−暴露されたＥＢｓ（図５Ｄ）を単一の細胞又は小さな凝集体に分離し、そして神経栄養因子の存在下でマトリゲル基質上にプレートした。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは接着して長い突起を延ばし、ｅＧＦＰ発現により可視化できた（図５Ｒ−５Ｆ）。これらのＥＳ細胞由来の運動ニューロンの形態上の特徴はｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂマウスの胚脊髄から単離されたｅＧＦＰ標識運動ニューロンの特徴と似ていた（図６Ｊ及び６Ｋ及び示さなかったデータ）。さらに、生じさせたｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンは、インビトロにてコリンアセチルトランスフラーゼを発現した（図５Ｇ及び５Ｈ）ことから、それらのコリン作用性神経伝達物質の状態の指標である。
【０１０１】
発明者らは、初期胚運動ニューロンとの直接の比較において、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの神経栄養性因子依存性も検査した。発明者らは、ＲＡ及びＨｈに暴露されたＨＢＧ３−由来のＥＢｓを単一細胞懸濁液へ分離し、そして蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて高いレベルのｅＧＦＰを発現する細胞を単離した（図６Ａ）。平行して、発明者らは、Ｅ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の吻側頸部脊髄から初期胚運動ニューロンをＦＡＣＳにより単離した（データは示さず）。何れかの源から、高レベルのｅＧＦＰを発現したニューロンの＞９８％はＨＢも発現し（図６Ｂ及び６Ｃ）、そしてこれらのニューロンは長い突起を延ばした（図６Ｄ、及び６Ｅ及び示さなかったデータ）。ＨＢＧ３ ＥＳ細胞から生じさせた（図６Ｆ−６Ｉ及び６Ｌ）か又はＥ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚から単離した（図６Ｊ−６Ｌ）精製されたｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンの生存は、神経栄養性因子に対する類似の依存性を呈した（例えば、Bloch-Gallego et al.，Survival in vitro of motoneurons identified or purified by novel antibody-based methods is selectively enhanced by muscle-derived factors．Development，111：221-32，1991；及びCamu et al.，Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor．J．Neurosci．Methods，44：59-70，1992を参照）。
【０１０２】
ＥＳ細胞由来のｅＧＦＰ＋運動ニューロンは胚脊髄内で分化する
ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンのインビトロ生存及び分化は、発明者らが、インビボにて脊髄へ再導入された場合にこれらのニューロンの挙動を検査することを促した。ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３暴露の３−４日後にＥＢｓを単離して（有糸分裂後の運動ニューロンが最初に出現したとき）、小凝集体に分散させ、そしてＨＨステージ１５−１７のチキン胚の脊髄の将来の吻側（又は尾部側）頸部、胸部又は腰部レベルに移植した（図７Ａ）が、当該ステージは内生運動ニューロンの分化が始まるステージである（Hollyday et al.，An antoradiographic study of the formation of the lateral motor column in the chick embryo．Brain Res.，132：197-208，1977）。操作された胚をさらに３−７日間、ＨＨステージ２７−３６まで発生させた。
【０１０３】
ＨＨステージ２７において操作された胚の脊髄の分析は、多数のｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンの存在を明らかにした（図７Ｂ−７Ｊ及び７Ｏ−７Ｑ）。ＥＢグラフトの最初の背腹の置き換えは制御されなかったが、発明者らは、３−７日後に検査したときに、チキンの脊髄内のマウスの運動ニューロン及び介在ニューロンの位置において著しい分離を検出した（図７Ｅ）。ほとんど一定して、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンが内生運動ニューロンのそれに特徴的な腹側両面の位置内に見いだされたが、ＥＢ由来のＬｉｍ２＋介在ニューロン（齧歯類特異的抗体により認識される）は脊髄の背腹軸に沿って散在した（図７Ｅ）。莫大なｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンが、グラフティングのセグメントレベルの除去にも拘わらず、Ｌｈｘ３を同時発現し、そしてＬｉｍ１の発現を欠いた（図７Ｆ及び示さなかったデータ）。即ち、インビトロにおいて観察されたｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋のＥＳ細胞の運動ニューロンはインビボグラフティングにより変化しなかったことが明白である。
【０１０４】
Ｏｌｉｇ２＋運動ニューロン前駆体がグラフト化されたＥＢｓ内に存在したことから、インサイチュにて末期の分化を受けたグラフト化前駆細胞由来のチキンの脊髄の中に見いだされた幾つか又は全部のｅＧＦＰ＋運動ニューロンであり得る。従って、発明者らは、インビトロにおいてＨＢＧ３細胞から生じさせた有糸分裂後運動ニューロンがインビボにおいて脊髄の中で生存することもできるか否かを試験した。ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋のＥＳ細胞由来の運動ニューロンを分離したＥＢｓからＦＡＣＳ分類により単離して、次に、チキンの脊髄にグラフト化した。３日後、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンが脊髄の腹側領域内に見いだされた（図７Ｃ及び７Ｄ）。即ち、有糸分裂後のＥＳ細胞由来の運動ニューロンはインビボにおいて生存も分化もできる。
【０１０５】
特定の幹細胞集団が体細胞との融合を受けることが報告された（Terada et al.，Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion．Nature，416：542-45，2002；Ying et al.，Changing potency by spontaneous cell fusion．Nature，545-48，2002）ことから、発明者らが、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来のｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンがチキンの脊髄のニューロンと体細胞ハイブリッドを形成したかもしれない可能性を試験することを促した。発明者らは、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロン細胞ボディーがマウスオリジンのニューロン表面蛋白質、例えば齧歯類特異的抗体により認識される−ＮＣＡＭ（図７Ｇ）を発現したが、チキンオリジンの表面蛋白質、例えばチキン特異的抗体により認識されるＳＣＩ（図７Ｉ）は発現しなかったことを発見した。同様に、グラフト化された運動ニューロンの軸索はマウスの表面蛋白質を発現したが、チキンの表面蛋白質は発現しなかった（図７Ｈ及び７Ｉ）。これらの発見は、体細胞融合が起こることに対する直接の証拠を提供する。
【０１０６】
追加の対照として、発明者らは、インビトロにおけるＲＡへの暴露によりニューロン化及び尾部側化されたが、抗Ｈｈ抗体（５Ｅ１；３０μｇ／ｍｌ）の注入により腹側化を妨げられたＨＢＧ３ ＥＢｓのグラフトの運命を検査した。多数のマウスＮＣＡＭ＋細胞及びＬｉｍ２＋介在ニューロンが見いだされたが、ｅＧＦＰ＋／ＨＢ９＋運動ニューロンは検出されなかった（図７Ｋ−７Ｎ）。即ち、ＲＡに暴露されたＥＢｓ内に存在する細胞は、宿主チキン組織により提供されたシグナルへの暴露に際してインビボの運動ニューロンの運命には向けられなかった。
【０１０７】
さらに、発明者らは、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが脊髄の外側に伸びるか否かを検査した。多数のｅＧＦＰ＋軸索が腹側の根（roots）に検出された（図７Ｂ，７Ｃ，７Ｄ及び７Ｏ）。ＨＨステージ２７の胚のｅＧＦＰ＋運動軸索の末梢突起のパターンの分析は、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが吻側頸部レベルにてグラフト化されて、軸索筋肉組織に突起したこと（データは示さず）、胸部レベルでグラフト化された運動ニューロンが軸索及び体壁筋肉組織の両方に対して突起したこと（図７Ｏ及び７Ｐ）、そして四肢のレベル（尾部側頸部又は腰部脊髄）でグラフト化された運動ニューロンが四肢の背側及び腹側の二等分に軸索を突起させたことを明らかにした（図７Ｑ及び示さなかったデータ）。即ち、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは、脊髄の異なるセグメントレベルを集団化し（populate）、そしてインビボにて宿主体細胞運動ニューロンにより選択された主要な末梢軸索経路に沿って突起することが可能である。
【０１０８】
発明者らは、ｅＧＦＰ＋運動ニューロンの軸索が筋肉標的に到達することも発見した。例えば、ｅＧＦＰ＋運動軸索の広範囲な内部への成長及び分枝化が、ＨＨステージ３０−３５において肋間筋肉中に検出された（図８Ａ）。発明者らは、これらのｅＧＦＰ＋運動軸索が筋肉接触の部位において末端シナプスの分化の側面を呈するか否かを検査した。特に、発明者らは、神経の末端分化の３つのマーカー：齧歯類特異的抗体により認識されるシナプトブレビン（Ｓｙｂ）；齧歯類特異的抗体により認識される小胞性（vesicular）ＡＣｈトランスポーター（ＶＡＣｈＴ）；及び齧歯類及びチキンの両方の蛋白質を検出する抗体により認識されるシナプトタグミン（Ｓｙｎ）を分析した。筋肉と接触した部位において、ｅＧＦＰ＋運動軸索ブランチが前シナプス分化（specializations）のサインを示したことが、Ｓｙｂ，Ｓｙｎ及びＶＡＣｈＴの局所（focal）発現により明らかにされた（図８Ｂ−８Ｅ）。
【０１０９】
発明者らは、次に、ｅＧＦＰ＋運動軸索の前シナプス末端分化がＡＣｈ受容体の分配を分析することにより筋肉表面膜の後シナプス分化と整列化された（aligned）か否かを検査した。ｅＧＦＰ＋運動軸索の末端分化の多くが筋肉表面上でＡＣｈ受容体の局所クラスターと整列化されたことが、ローダミン−α−ブンガロトキシン（Ｒｈ−α−ＢＴＸ）標識により定義された（図８Ｆ）。即ち、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索は、インビボにおいて標的の骨格筋によりシナプスを形成することが明白であった。
【０１１０】
上で詳述されたとおり、発明者らは、インビボにおいて特定のニューロンのサブタイプへの神経前駆細胞の変換に関与する、細胞外誘導性シグナル及び転写因子の描写が、ＣＮＳニューロンの特定のクラスへのＥＳ細胞の分化に対する、発生学に基づく合理的なアプローチを可能にさせる。発明者らの発見は、高い効率で脊髄運動ニューロンを生じさせることが可能なこと、及びＥＳ細胞からの運動ニューロンの生成の経路がインビボにおいて運動ニューロンの生成の工程を再現することを示す。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは、インビボにて腹側脊髄を再増殖し、軸索を末梢に伸長し、そして筋肉標的によりシナプスを形成する。これらの研究は、正常な発生シグナリングカスケード、特に細胞外誘導性シグナルの調節へ洞察を適用する可能性を確立することにより、ＣＮＳニューロンの特定のクラスへのＥＳ細胞の分化を指示する。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが標的筋肉細胞に神経を分布させる能力は、脊髄の損傷及び運動ニューロンの変性疾患の哺乳類モデルにおいて運動機能を回復させるための、そのようなニューロンの使用の系統的評価の可能性を提供する。
【０１１１】
ＥＳ細胞からの運動ニューロン生成の経路
インビボの運動ニューロンの運命の特異化は、３つの連続する工程：（ａ）外胚葉細胞の初期神経化；（ｂ）神経細胞の二次的尾部側化；及び（ｃ）尾部側化された神経細胞の腹側化にあると考えることができる（Jessell et al.，Neuronal specification in the spinal cord：inductive signals and transcriptional codes．Nat．Rev．Genet.，1：20-29，2000；Wilson et al.，Neural induction：toward a unifying mechanism．Nat．Neurosci.，補遺４：1161-1168，2001）。本明細書中で論じられた、発明者らの結果は、ＥＳ細胞の運動ニューロンへの分化の経路が神経細胞の尾部側化及び腹側化に関与する通常のプログラムに似ている証拠を提供する。
【０１１２】
それらの最終的な位置的アイデンティティーにも拘わらず、神経プレート細胞は最初に吻側特性を有するらしい（Munoz-Sanjuan et al.，Neural induction：the default model and embryonic stem cells．Nat．Rev．Neurosci.3：271-80，2002）。脊髄の特性の次の負担（imposition）は、軸に近い中胚葉により提供されるＲＡ−媒介性シグナルを含むらしい（Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999；Wilson et al.，Neural induction：toward a unifying mechanism．Nat．Neurosci.，補遺４：1161-68，2001）。特に、ＲＡは中脳又は吻側後脳アイデンティティーを犠牲にして脊髄の特性を特定することが示された（Muhr et al.，Convergent inductive signals specify midbrain，hindbrain，and spinal cord identity in gastrula stage chick embryos．Neuron，23：689-702，1999）。発明者らは、ＰＡ６細胞活性への暴露により神経化されたＥＳ細胞が中脳の位置的特性を発現する（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells to PA6 cell activity for 5 days induced activity．Neuron，28：31-40，2000も参照）が、ＲＡへの暴露に際して頸部脊髄位置アイデンティティーに変換できることを発見した。この研究において記載された運動ニューロン生成におけるＲＡ暴露のための要求は、中脳のドーパミン作用性神経分化のＲＡが媒介する阻害により補われる（Kawasaki et al.，Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells to PA6 cell activity for 5 days induced activity．Neuron，28：31-40，2000）。合わせて、これらの発見は、神経管の吻側尾部側の軸をパターン化することにおけるその通常の役割に平行した様式にて、神経化されたＥＢｓ内でＲＡが脊髄の位置的アイデンティティーを促進させるという見解を支持する。
【０１１３】
ＥＢｓ中でＲＡにより誘導された脊髄細胞が何故吻側頸部の位置的アイデンティティーを有するのであろうか？これに対するもっともらしい理由は、一般的脊髄前駆体のアイデンティティーの特異化の後の時点で、脊髄細胞の吻側尾部側の位置的アイデンティティーが進行中のＲＡシグナリングにより影響され続けるという発見から来る（Liu et al．，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。特に、ＲＡが媒介するシグナリングは、胸部及び腰部の位置的アイデンティティーの犠牲として吻側頸部脊髄の位置的特性の獲得を促進する（Liu et al．，Assigning the positional identity of spinal motor neurons．Rostrocaudal patterning of Hox-c expression by FGFs，Gdf11，and retinoids．Neuron，32：997-1012，2001）。即ち、神経化されたＥＳ細胞のＲＡへの暴露は、最初の脊髄の位置的特性の創発（emergence）、及びこれらの細胞の吻側頸部アイデンティティーへの限定の両方の説明となるらしい。
【０１１４】
脊髄の前駆体アイデンティティーを獲得したＥＳ細胞も、運動ニューロン前駆体特異化の通常の経路をたどるらしい。これに関する証拠の一つのラインは、Ｈｈシグナリングに対するそれらの細胞の感受性である。インビボにおけるような（Chiang et al.，Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic Hedgehog gene function．Nature，383，407-13，1996）、ＥＳ細胞由来の脊髄前駆体からの運動ニューロンの生成は、完全にＨｈシグナリングに依存する。即ち、追加されたＨｈの不在下での僅かな運動ニューロンの生成は、ＥＢｓ内の低レベルの内生Ｈｈ活性の発現によりもたらされるらしく、おそらくは、ＩＨｈ又はＳＨｈにより媒介される（Byrd et al.，Hedgehog is required for murine yolk sac angiogenesis．Development，129：361-72，2002；Dyer et al.，Indian hedgehog activates hematopoiesis and vasculogenesis and can respecify prospective neurectodermal cell fate in the mouse embryo．Development，128：1717-30，2001）。逆に、ＥＢｓ内でＨｈシグナリングのレベルを上昇させると、運動ニューロン生成を顕著に増強する。
【０１１５】
証拠の第２のラインは、Ｈｈシグナリングにより導き出される前駆体転写因子の発現のプロフィールにより提供される。Ｈｈシグナリングの不在下では、ＥＢｓ内の脊髄前駆体は、背及び中間の神経前駆体アイデンティティーを呈する。Ｈｈシグナリングの活性化は初期脊髄前駆細胞の応答を厳密に模倣する濃度依存性様式において背側前駆体決定基の発現を失わせる（Briscoe et al.，Specification of neuronal fates in the ventral axis of the neural tube．Curr．Opin．Neurobiol.，11：43-49，2001）。さらに、高レベルのＨｈシグナリング活性はＮｋｘ６．１とＯｌｉｇ２の発現を誘導し−当該２つの前駆細胞転写因子はインビボにおいては深く運動ニューロン生成にリンクする（Sander et al.，Ventral neural patterning by Nkx homeobox genes：Nkx6.1 controls somatic motor neuron and ventral interneuron fates．Genes Dev.，14：2134-39，2000；Vallstedt et al.，Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification．Neuron，31：743-55，2001；Novitch et al.，Coordinate regulation of motor neuron subtype identity and pan-neuronal properties by the bHLH repressor Olig2．Neuron，31：773-89，2001；Mizuguchi et al.，Combinatorial roles of olig2 and neurogenin2 in the coordinated induction of pan-neuronal and subtype-specific properties of motoneurons．Neuron，31：757-71，2001）。合わせると、これらの発見は、神経化ＥＳ細胞が初期神経プレート細胞の挙動によく似た様式で吻側及び背腹側パターン化シグナルの両方に応答し、最初に脊髄前駆細胞を生じ、そして次に運動ニューロン前駆体を生じることを示す。
【０１１６】
発明者らの研究は、ＥＳ細胞からの神経分化の初期の相に関与する工程を扱ってこなかった。インビボでは、神経の誘導が阻害性（blockade）ＢＭＰシグナリングに依存するらしく（Munoz-Sanjuan et al.，Neural induction，the default model and embryonic stem cells．Nat．Rev．Neurosci.，３：271-80，2002）、そして少なくともチキンにおいてはＦＧＦｓへの暴露に依存するらしい（Streit et al.，Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation．Nature，406：74-78，2000；Wilson et al.，An early requirement for FGF signalling in the acquisition of neural cell fate in the chick embryo．Curr．Biol.，10421-429，2000；Wilson et al.，The status of Wnt signalling regulates neural and epidermal fates in the chick embryo．Nature，411：325-30，2001）。最近の研究は、ＥＳ細胞中の神経誘導におけるＢＭＰシグナリングの阻害のための役割を示唆している（Gratsch et al.，Noggin and chordin have distinct activities in promoting lineage commitment of mouse embryonic stem (ES) cells．Dev．Biol.，245：83-94，2002；Tropepe et al.，Direct neural fate specification from embryonic stem cells：a primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism．Neuron，30：65-78，2001）。しかしながら、ＥＳ細胞における神経特異化の初期の工程がインビボにおいて神経誘導の経路に如何にして順応するかを決定するには、追加の研究が必要である。
【０１１７】
インビボにおけるＥＳ細胞由来の運動ニューロンの分化
幾つかの観察は、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンも、それらの胚の類似物（counterpart）に似た様式にて挙動することを示す。最初に、ｅＧＦＰ＋運動ニューロンが典型的には吻側脊髄に制限され、しばしば内生運動ニューロンの特徴である腹側面（ventrolateral）位置における。対照的に、ＥＳ細胞由来の脊髄介在ニューロンは脊髄の背腹軸のいたるところに散在する。これらの観察は、ＥＳ細胞由来の運動ニューロン及び介在ニューロンが宿主脊髄へのそれらの誘導後に分離の活動的なプロセスを受けることを示唆する。別の可能性は、腹側脊髄を増殖させられない運動ニューロンが、死ぬか又はｅＧＦＰ発現を失うことである。このあとの可能性に対する一つの意見は、Ｎｋｘ６又はＭＮＲ２蛋白質の発現の欠如（misexpression）に応答して背側脊髄中で生じた運動ニューロンが正規の場所ではない背側の位置において生存及び分化しないことである（Tanabe et al.，Specification of motor neuron identity by the MNR2 homeodomain protein．Cell，95：67-80，1998；Briscoe et al.，A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube．Cell，101：435-45，2000）。
【０１１８】
第２に、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンは腹側の根（ventral root）を通して脊髄から軸索を突出させ、そして体細胞の運動ニューロンにより選択される（taken）主要な末梢経路を選択する。ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索の四肢（limb）への突起は注目に値するが、これらのニューロンのうち極めて僅かなものしか、四肢−突起ＬＭＣニューロンに適したＬＩＭ ＨＤコードを発現しないからである（Tsuchida et al.，Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes．Cell，79：957-70，1994）。運動ニューロンのＬＩＭ ＨＤコードと末梢軸索の軌道の間の類似のミスマッチが２つの他の実験コンテクストにおいて発見された。Ｌｈｘ３の過剰発現は、脊髄の四肢レベルにおいて運動ニューロンに対してＭＭＣ分子アイデンティティーを授与する；しかし、これらの運動ニューロンの多くは四肢へ軸索を突出させる（Sharma et al.，Genetic and epigenetic mechanisms contribute to motor neuron pathfinding．Nature，406：515-19，2000）。さらに、脊髄の四肢レベルに位置した胸部レベルの運動ニューロンはなおも四肢に突出することができる（O'Braien et al.，Development and survival of thoracic motorneurons and hindlimb musculture following transplantation of the thoracic neural tube to the lumbar region in the chick embryo：anatomical aspects．J．Neurobiol.，21：313-40，1990）。即ち、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索の四肢への突起は、運動ニューロンが末梢経路の変更されたか又は制限された選択に対向する（face）ような環境においてＬＩＭ ＨＤコードが無効にされ（overridden）得るという事実を反映するらしい。
【０１１９】
第３に、標的筋肉へ到着すると、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの軸索は、前シナプス分化の多数のサイン、注目すべきはコリン作用性神経伝達物質の特性の発現を呈する。さらに、これらの前シナプス特異化が、後シナプス筋膜上のＡＣｈ受容体の局所クラスターとの一列整列（in alignment with）において見いだされることから、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンと骨格筋の間に形成されるシナプス接触が機能することが示唆される。合わせると、これらのインビボの研究は、脊髄中の新たに生じた運動ニューロンがその骨格筋標的に神経を分布させることを通して、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンが通常の発生プログラムにて連続工程をうまく通り抜けることができることを示す。
【０１２０】
最後に、誘導性シグナルがＥＳ細胞を運動ニューロンに変換できることによる効果は、ＥＳ細胞が暴露される吻側尾部側及び背側腹側パターン化シグナルのアイデンティティーと濃度の系統的なバリエーションを通して、ＣＮＳニューロンの他の予め定義されたクラスを生じさせるための一般的な戦略を示唆する。ＥＳ細胞を遺伝的に操作する要求無しに、単に細胞外因子の使用を通して、細胞の運命を指示する可能性（例えば、Kyba et al.，HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors．Cell，109:29-37，2002）は、この戦略のヒトＥＳ細胞及び神経前駆細胞の他のクラスへの直接の拡張を可能にするかもしれない。
【０１２１】
前記の発明は明確化及び理解のためにいくらか詳細に説明されたが、開示を読んで、当業者は、形式及び細部の様々な変化が特許請求の範囲の発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、神経化された胚性細胞においてレチノイン酸が尾部側の位置のアイデンティティーを誘導することを示す。（Ａ）脊髄の運動ニューロンアイデンティティーの明確化の連続する工程。神経誘導性シグナルは初期（primitive）外胚葉細胞を神経の運命に変換する。神経誘導の初期の相の間は、前駆細胞が腹側の（anterior）アイデンティティーを発現する。レチノイン酸（ＲＡ）を含む外来性のシグナルは、吻側の神経プレート細胞を進行性のより尾部側のアイデンティティーへ変換する。尾部側の神経前駆体はソニックヘッジホッグ（ＳＨｈ）シグナリングの影響下では運動ニューロンに変換される。（Ｂ）ＲＡ（２μＭ）の存在又は不在下で生育された胚のボディー（ＥＢｓ）内の全神経（pan-neural）及び吻側尾部側（rostrocaudal）のマーカーの発現。初期神経プレートマーカーＳｏｘ１の発現が、ＲＡ存在下で３日間培養されたＥＢｓにおいて増加した。ｏｔｘ２発現は、ＲＡ不在下で３日間生育させたＥＢｓにおいて存在したが、ＲＡ存在下では消失した。Ｈｏｘｃ６はＲＡへ５日間暴露されたＥＢｓにおいて発現した。ＮｅｕＮ発現により特徴付けされた多数の有糸分裂後のニューロンがＲＡ存在下でＥＢｓを５日間生育させた時に、観察された。（Ｃ）ＰＡ６細胞上で６日間培養されたＥＳ細胞はニューロンマーカー、Ｓｏｘ１を発現した。多くのＳｏｘ１＋細胞がＥｎ１を同時発現したが、Ｈｏｘｃ６を発現しなかった。多くのＴｕＪ１＋ニューロンがＯｔｘ２を同時発現した。ＲＡ（２μＭ）のＰＡ６細胞上で生育させたＥＳ細胞への添加はＥｎ１及びＯｔｘ２発現の消滅、及び前駆細胞及びＴｕＪ１＋有糸分裂後のニューロン内でのＨｏｘｃ６の発現をもたらした。これらニューロンの多くはＨＢ９を発現したため、運動ニューロンであった（図９参照）。
【図２】図２は、胚ボディー（ＥＢｓ）内の神経前駆細胞のヘッジホッグ−依存性腹側化を示す。（Ａ）脊髄の運動ニューロン生成のＳＨｈ−活性化転写経路の模式的概要。運動ニューロンの生成を阻害する蛋白質はｌｒｘ３及びＮｋｘ２．２である。残りの蛋白質は運動ニューロンの生成に必要である。（Ｂ）Ｅ９．５マウス胚の尾部側の神経管内のＨＤ及びｂＨＬＨ転写因子の発現のパターン。運動ニューロンを生じる前駆体ドメインを、Ｏｌｉｇ２，Ｎｋｘ６．１の同時発現及び低レベルのＰａｘ６により特徴付けした。（Ｃ）ＲＡ（２μＭ）単独又は１０ｎＭ又は１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３共存下の何れかでの、３日間生育させたＥＳ−細胞由来のＥＢｓにおける転写因子発現のプロフィール。（Ｄ）ＲＡ及び異なる濃度のＨｈ−Ａｇ１．３の存在下でのＥＢｓ内の転写因子発現の定量化。描写されたのは、各条件下でアッセイされた８つのＥＢｓからの、セクションあたりの、平均±ｓ．ｅ．ｍ．の値である。
【図３】図３は、胚ボディー（ＥＢｓ）内の運動ニューロン及び介在ニューロン転写因子の発現を描写する。（Ａ）ＨＢ９及びＬｈｘ３の同時発現は新たに生成された運動ニューロンを定義した。Ｌｈｘ３は単独でＶ２介在ニューロンにより発現された。ＨＢ９とＩｓｌ１の同時発現は運動ニューロンのサブセットを定義した。幾つかの側面（lateral）運動柱（ＬＭＣ）ニューロンはＩｓｌ１不在下で高いレベルのＨＢ９を発現した；対照的に、他のＬＭＣニューロンはＩｓｌ１を発現したが、極めて低レベルでＨＢ９を発現したにすぎなかった。Ｉｓｌ１は幾つかの背面側の介在ニューロンによっても発現された。ＨＢ９とＬｉｎ１の同時発現は、側面のＬＭＣニューロンを定義した。多数の介在ニューロンがＬｉｍ１も発現した。（Ｂ）Ｈｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）の存在下であるがＲＡ不在下で５日間生育させたＥＢｓはＨＢ９＋ニューロンを含まなかった。ＲＡ（２μＭ）の存在下であるがＨｈ−Ａｇ１．３不在下で５日間生育させたＥＢｓはＨＢ９＋ニューロンを少量含んだ。ＲＡ及び抗−Ｈｈ抗体（ｍＡｂ ５Ｅ１；３０μｇ／ｍｌ）の存在下で５日間生育させたＥＢｓは、ＨＢ９＋ニューロンを含まなかった。ＲＡ及び組換えＳＨｈ−Ｎ（３００ｎＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓは、多くのＨＢ９＋ニューロンを含んだ。（Ｃ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓのニューロン内のＨＢ９及びＮｅｕＮの同時発現。（Ｄ）ＲＡ存在下で５日間生育させて、さらに２日間培養されたＥＢｓの分離により得られたＴｕＪ１＋によりの核内のＨＢ９の局在。ＨＢ９発現を欠いた他のニューロンも存在した。（Ｅ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内の運動ニューロン内のＨＢ９とＬｈｘ３の同時発現。Ｌｈｘ３のみを発現した細胞はＶ２介在ニューロンであった。（Ｆ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内の運動ニューロン内のＨＢ９とＩｓｌ１の同時発現。（Ｇ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内の少数のニューロン内でＨＢ９とＬｉｍ１が同時発現された。Ｌｉｍ１のみを発現した細胞は介在ニューロンであった。（Ｈ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内のＶ２介在ニューロン内のＣｈｘ１０とＬｈｘ３の同時発現。
【図４】図４は、トランスジェニックマウスの胚の脊髄内のｅＧＦＰ−標識された運動ニューロンを示す。（Ａ）ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂトランスジェニックマウスの系の生成のためのコンストラクト。（Ｂ）Ｅ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂマウス胚における増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）発現のパターン。ｅＧＦＰは、腹側の脊髄及び脊髄から伸びた運動神経において高度に発現された。（Ｃ）ｅＧＦＰ発現が、Ｅ１０．５ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の腹側角内の運動ニューロン細胞ボディー及び樹上突起中に検出された。ｅＧＦＰ発現は、腹根により脊髄を興奮させる運動ニューロン軸索内でも検出された。このラインにおいては、Ｅ１０．５において、後ではなく、極めて低い発現が背根のガングリオンのニューロン（運動ニューロン内のそれより＜２０倍）及び腹側の介在ニューロン（図４Ｃ及び４Ｅ中の矢印）において検出された。（Ｄ）最初の有糸分裂後の運動ニューロンが生成されたとき（Ｅ９．５）の、ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の前肢レベルの脊髄内のＨＢ９及びｅＧＦＰの発現のパターン。（Ｅ−Ｇ）Ｅ１０．５ ｍＨＢ９−Ｇｆｐ１ｂ胚の胸部脊髄内のＨＢ９及びｅＧＦＰの発現のパターン。ｅＧＦＰは運動ニューロン内でＨＢ９と共に発現された。空洞ゾーンの近くに位置する新たな有糸分裂後の運動ニューロンは、脊髄の側面領域内の成熟運動ニューロンよりも低いレベルのｅＧＦＰを発現したことに注目されたい。
【図５】図５は、ＨＢＧ ＥＳ細胞にインビトロで由来するｅＧＦＰ−標識された運動ニューロンを描写する。（Ａ）ＲＡ存在下で５日間生育させた胚ボディー（ＥＢｓ）内のＨＢ９＋，Ｉｓｌ１＋運動ニューロンは、細胞ボディー及び軸索内でｅＧＦＰを発現した。（Ｂ）ｅＧＦＰ＋運動ニューロンの数はＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）への暴露に際して増加した。（Ｃ）ＲＡ及び濃度を増加させたＨｈ−Ａｇ１．３（０から２２μＭ）の存在下で５日間生育させたＥＢｓ内のｅＧＦＰ＋運動ニューロンの定量化。２．２μＭのＨｈ−Ａｇ１．３において、ＥＢｓ中の２２．５％の細胞がｅＧＦＰを発現した。高い濃度（１０μＭ）においては、ｈｈ−Ａｇ１．３はＥＢｓにおける細胞の分化に有害となった。「−１０００」と記されたデータ点は、１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３存在下であるがＲＡ不在下で生育させたＥＢｓの培養物を意味する。（Ｄ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させたＥＢｓ内でのｅＧＦＰ発現を示す、明視野及び蛍光イメージ。（Ｅ）ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）存在下で５日間生育させ、そしてさらに２日間マトリゲル基質上にプレートされた胚ボディー内でのｅＧＦＰ発現を示す相及び蛍光イメージ。多数のｅＧＦＰ＋運動軸索がこれらの凝集物から出現した。（Ｆ）運動ニューロンから伸びた神経をｅＧＦＰが標識することを示す相及び蛍光イメージ。（Ｇ，Ｈ）７日間インビトロにおいて生育させたＥＢｓ−細胞由来の運動ニューロン内のＨＢ９，ｅＧＦＰ，及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の同時発現。ＨＢ９及びｅＧＦＰ発現を欠いたＣｈＡＴ＋ニューロンはおそらく介在ニューロンであった。
【図６】図６は、ｅＧＦＰ＋ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞由来の運動ニューロンの単離を示す。（Ａ）Ｈｈ−Ａｇ１．３（１μＭ）単独、ＲＡ（１μＭ）単独、又は当該２つの因子の組み合わせの存在下で分化した、ＨＢＧ３ ＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析（細胞密度プロット）。高いレベルのｅＧＦＰを発現する運動ニューロンを分離するために使用されたゲートは、ダッシュの長方形により記した。（Ｂ，Ｃ）ＦＡＣＳ分離により単離された、精製されたＥＳ−細胞運動ニューロンは高いレベルのｅＧＦＰを発現した。（Ｄ，Ｅ）２４時間マトリゲル上で生育させた場合の、ｅＧＦＰ＋ニューロン及び伸びた神経突起。（Ｆ，Ｇ）神経栄養因子（ＮＴ３，ＢＤＮＦ，ＣＮＴＦ，及びＧＤＮＦ）の存在下で培養された、ＦＡＣＳ分離されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンは、インビトロにおいて３日間生存し、そして突起（processes）を念入りに作る（elaborate）（Ｆ）。生存した運動ニューロンはｅＧＦＰの発現を維持した（Ｇ）。（Ｈ，Ｉ）神経栄養因子の不在下で培養したほとんどのＦＡＣＳ分離されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンはインビトロにおいて３日以内に死んだ。（Ｊ，Ｋ）ＦＡＣＳ分離された初期吻側頸部運動ニューロンは、ＥＳ−細胞由来の運動ニューロンのそれと同じ様式で挙動した。神経栄養因子の不在下では、ニューロンは生存してｅＧＦＰ＋突起を念入りに作った。（Ｌ）神経栄養因子の存在下（ＮＴ）又は不在下（対照）での培養物中の３日後の初期頸部運動ニューロン（ｃＭＮ）及びＥＳ−細胞由来の運動ニューロン（ＥＳ−ＭＮ）生存の定量化（プレートされた細胞のパーセンテージ）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．；６ウエルをスコアした。
【図７】図７は、インビボにおける移植されたＥＳ−細胞由来の運動ニューロンの完成（integration）を描写する。（Ａ）ＨＢＧ３ ＥＳ−細胞由来の運動ニューロン富裕化ＥＢｓの、ハンブルガー−ハミルトン（ＨＨ）ステージの１５匹のチキン脊髄への移植を示す模式的ダイアグラム。レシピエントのチキンの胚の脊髄を吸引により損傷させ、そして約１／２−１の部分的に粉砕されたＥＢをガラス製のマイクロピペットを用いて確実なスペースに移植した。（Ｂ）ＨＨステージ２７の宿主のチキン胚の胸部及び腰部の脊髄内のｅＧＦＰ＋運動ニューロン（運動ニューロン富裕化されたＥＢｓをＨＨステージ２７において移植した）の位置を示す明視野／蛍光イメージ（腹側の視野）。脊髄から出現するｅＧＦＰ＋軸索に注目。（Ｃ，Ｄ）ＦＡＣＳ−分離された運動ニューロンの（ＨＨステージ１６の胚に移植）ステージ２７における胸部脊髄内の位置。横断面は、腹側の脊髄中のｅＧＦＰ＋運動ニューロンを明らかにした（Ｄ）。（Ｅ−Ｊ）ステージ１５における運動ニューロン富裕化ＥＢｓの片側のみの移植後の、吻側頸部レベルのＨＨステージ２７のチキンの脊髄の横断面図。運動ニューロンは脊髄の腹側角において主に見いだされ、マウス特異的Ｌｉｍ２抗体により標識された移植された介在ニューロンから分離される（Ｅ）。多数のＥＳ−細胞由来の運動ニューロンがｅＧＦＰとＬｈｘ３を同時発現した（Ｆ）。移植されたマウスＥＳ−細胞由来の運動ニューロン（Ｇ）及び軸索（矢印、Ｈ）を齧歯類特異的ＮＣＡＭ抗体で標識したが、それらはチキン運動ニューロンマーカー蛋白質、ＳＣＩを発現しなかった（Ｉ，Ｊ）。ｅＧＦＰ−，ＮＣＡＭ＋の軸索は床板（floor plate）を横切ったが、脊髄から突き出なかった（矢印、Ｇ，Ｈ）。（Ｋ−Ｎ）ＨＨステージ１６において尾部側化されたＥＢｓの移植物（ＲＡ（２μＭ）及び抗−Ｈｈ抗体（５Ｅ１，３０μｇ／ｍｌ）の存在下で生育させた）を受けた、ＨＨステージ２７における胸部の脊髄の横断面図。非マウス由来の運動ニューロンが、ｅＧＦＰ発現（Ｋ）によるか又はマウス特異的ＨＢ９抗体（Ｌ）の何れかにより、検出された。対照的に、多数のマウス由来のＮＣＡＭ＋（Ｍ）及びＬｉｍ２＋（Ｎ）ニューロンが存在した。（Ｏ−Ｑ）ステージ１６−１７における運動ニューロン富裕化ＥＢｓの移植物を受けた、胸部（Ｏ，Ｐ）、又は腰部（Ｑ）レベルにおけるＨＨステージ２７のチキン脊髄の横断面図。ｅＧＦＰ＋運動ニューロン細胞ボディーが腹側脊髄において濃縮された。グラフト化された組織内の幾つかの異所性のｅＧＦＰ＋運動ニューロンは脊髄のルーメン内にトラップされたままであった。ｅＧＦＰ＋軸索は脊髄を興奮させたが、主に、腹根を通してであり、そして軸索（Ｏ−Ｑ）、ボディーの壁（Ｏ，Ｐ）及び背側及び腹側の肢（Ｑ）を供給する全ての主要な神経ブランチに沿って突き出た。全ての末梢の軸索の経路は神経繊維（ＮＦ）発現により検出された。前ガングリオン運動軸索により占められた腹側正中に並んだ神経内のｅＧＦＰ＋軸索の不在に注目。
【図８】図８は、インビボにおけるＥＳ−細胞由来の運動ニューロンのシナプス分化を示す。（Ａ）ＨＨステージ３５のチキン胚胸郭のホールマウント（wholemount）調製。ＥＳ−細胞由来のｅＧＦＰ＋軸索は肋間筋を脈状にしなかった（innervated）。（Ｂ，Ｃ）神経の部位のｅＧＦＰ＋軸索の末端のシナプトブレビン（Ｓｙｂ）と小胞性のＡＣｈ輸送体（ＶＡＣｈＴ）が筋肉と接触する。抗−Ｓｙｂ及びＶＡＣｈＴ抗体はマウスの蛋白質を認識したが、チキンの蛋白質を認識しなかった。（Ｄ）肋間筋を供給する５つの神経ブランチ内の神経繊維（ＮＦ）とｅＧＦＰの発現。幾つかのｅＧＦＰ＋軸索はＮＦ発現を欠いたことに注目されたい。α−ブンガロトキシン（αＢＴＸ）発現により定義されたとおり、ｅＧＦＰ＋軸索の末端はＡＣｈ受容体クラスターと同時に生じた（coincided）。（Ｅ）ｅＧＦＰ＋運動軸索におけるシナプトタグミン発現とαＢＴＸ標識の一致（coincidence）。（Ｆ）ｅＧＦＰ＋運動軸索におけるＳｙｂ発現とαＢＴＸ標識の一致。
【図９】図９は、ＰＡ６細胞上で生育した尾部側化されたＥＳ細胞は運動ニューロンに分化することを示す。（Ａ，Ｂ）１０日間ＰＡ６細胞上で生育したＥＳ細胞はＨＢ９＋上でニューロンに分化しなかった（Ａ）。２μＭのＲＡの２日目の培養培地への添加は、多数のＨＢ９＋上でニューロンの生成、並びにＯｌｉｇ２−発現前駆体の生成をもたらした（Ｂ）。（Ｃ）２μＭのＲＡ存在下で１０日間ＰＡ６細胞上で生育した運動ニューロン含有ＥＳ細胞コロニーの定量。平均±ｓ．ｄ．；３ウエル。
【図１０】図１０は、ＥＳ内の運動ニューロン前駆体がＢｒｄＵを取込むことを示す。（Ａ−Ｃ）固定化前の１時間のＢｒｄＵ標識（２０μｇ／ｍｌ）は、ＲＡ及びＨｈ−Ａｇ１．３存在下で３日間生育したＥＳ内の多数のＢｒｄＵ＋，Ｏｌｉｇ２＋前駆体を明らかにした。５日間生育したＥＳ内のＨＢ９＋運動ニューロンはＢｒｄＵを取り込まなかった（Ｂ）が、少数のＢｒｄＵ＋，Ｏｌｉｇ２＋は存在した（Ｃ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子及び背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることを含む、胚性幹細胞の分化した神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項２】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
吻側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
背側化胚性シグナリング因子がＢＭＰ又はＷｎｔである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させる前に、胚性幹細胞を吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させた後に、胚性幹細胞を少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
接触をインビボにて被験者において作用させる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
胚性シグナリング因子を被験者に投与することにより、接触をインビボにて被験者において作用させる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
接触をインビトロにて作用させる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
分化した神経細胞を被験者に移植する工程をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
被験者が胚である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
被験者がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
被験者が神経組織の変性を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
請求項１記載の方法により生じた、分化した神経細胞。
【請求項２８】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項２７記載の分化した神経細胞。
【請求項２９】
分化した神経細胞を生産する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させる
工程を含む方法。
【請求項３０】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
吻側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
背側化胚性シグナリング因子がＢＭＰ又はＷｎｔである、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
神経前駆細胞が、ＤＲＧニューロンの神経前駆細胞、運動ニューロンの神経前駆細胞、末梢ニューロンの神経前駆細胞、脊髄ニューロンの神経前駆細胞、及び腹側介在ニューロンの神経前駆細胞からなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３９】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項４０】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
分化した神経細胞が有糸分裂後である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項２９記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｂ）−（ｄ）をインビボにて被験者において実施する、請求項２９記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）をインビトロにて実施する、請求項２９記載の方法。
【請求項４６】
分化した神経細胞を被験者に移植する工程をさらに含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
神経前駆細胞を被験者に移植すること及び分化した神経細胞を被験者に移植することからなる群から選択される追加の工程をさらに含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
被験者が胚である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
被験者がヒトである、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
被験者が神経組織の変性を有する、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）からなる群から選択される、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
請求項２９記載の方法により生じた分化した神経細胞を含む、細胞の集団。
【請求項５６】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項５５記載の分化した神経細胞。
【請求項５７】
被験者において脊髄を再増殖させる方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして
（ｅ）分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植する
工程を含む方法。
【請求項５８】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸である、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
神経前駆細胞が、ＤＲＧニューロンの神経前駆細胞、運動ニューロンの神経前駆細胞、末梢ニューロンの神経前駆細胞、脊髄ニューロンの神経前駆細胞、及び腹側介在ニューロンの神経前駆細胞からなる群から選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項６５】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項６６】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
分化した神経細胞が有糸分裂後である、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項５７記載の方法。
【請求項７０】
被験者が胚である、請求項５７記載の方法。
【請求項７１】
被験者がヒトである、請求項５７記載の方法。
【請求項７２】
被験者が神経組織の変性を有する、請求項５７記載の方法。
【請求項７３】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
末梢神経障害がＡＬＳ又はＳＭＡである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
治療の必要な被験者において神経組織の変性を治療する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして
（ｅ）神経組織の変性を治療するのに有効な量にて分化した神経細胞を被験者に移植する
工程を含む方法。
【請求項７７】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）からなる群から選択される、請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項８１】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項８２】
吻側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項７６記載の方法。
【請求項８３】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項７６記載の方法。
【請求項８４】
背側化胚性シグナリング因子がＢＭＰ又はＷｎｔである、請求項７６記載の方法。
【請求項８５】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項７６記載の方法。
【請求項８６】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
神経前駆細胞が、ＤＲＧニューロンの神経前駆細胞、運動ニューロンの神経前駆細胞、末梢ニューロンの神経前駆細胞、脊髄ニューロンの神経前駆細胞、及び腹側介在ニューロンの神経前駆細胞からなる群から選択される、請求項７６記載の方法。
【請求項８９】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項７６記載の方法。
【請求項９０】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
分化した神経細胞が有糸分裂後である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
被験者が胚である、請求項７６記載の方法。
【請求項９４】
被験者がヒトである、請求項７６記載の方法。
【請求項９５】
工程：
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして
（ｃ）任意に、神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させること
により生じさせた神経前駆細胞。
【請求項９６】
増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項９５記載の神経前駆細胞。
【請求項９７】
神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、請求項９５記載の神経前駆細胞の使用。
【請求項９８】
工程：
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させること
により生じさせた、分化した神経細胞。
【請求項９９】
増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項９８記載の分化した神経細胞。
【請求項１００】
神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、請求項９５記載の分化した神経細胞の使用。
【請求項１０１】
増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する請求項９８記載の胚性幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト動物系。
【請求項１０１】
分化した神経細胞の集団を単離及び又は精製する方法であって、
（ａ）増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；
（ｅ）分化した神経細胞においてｅＧＦＰの発現を検出し；そして
（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離する
工程を含む方法。
【請求項１０３】
神経の変性に関連した症状を治療することにおける使用のための薬剤を同定する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量のレチノイン酸に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞においてヘッジホッグシグナリング経路を活性化することによりニューロンを生じさせるが、但し、ニューロンの幾つか又は全てが変性しており；
（ｄ）変性したニューロンを候補の薬剤と接触させ；そして
（ｅ）当該薬剤が幾つか又は全ての変性したニューロンの再生を増強するか否かを決定する
工程を含む方法。
【請求項１０４】
変性した神経ニューロン中のゲノミックＤＮＡがＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子中に変異を有する、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
変性した神経ニューロンが増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項９８記載の方法。
【請求項１】
胚性幹細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子及び背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させることを含む、胚性幹細胞の分化した神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項２】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
吻側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
背側化胚性シグナリング因子がＢＭＰ又はＷｎｔである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させる前に、胚性幹細胞を吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させた後に、胚性幹細胞を少なくとも一つの神経栄養因子と接触させることをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
接触をインビボにて被験者において作用させる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
胚性シグナリング因子を被験者に投与することにより、接触をインビボにて被験者において作用させる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
接触をインビトロにて作用させる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
分化した神経細胞を被験者に移植する工程をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
被験者が胚である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
被験者がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
被験者が神経組織の変性を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
請求項１記載の方法により生じた、分化した神経細胞。
【請求項２８】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項２７記載の分化した神経細胞。
【請求項２９】
分化した神経細胞を生産する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させる
工程を含む方法。
【請求項３０】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
吻側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
背側化胚性シグナリング因子がＢＭＰ又はＷｎｔである、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
神経前駆細胞が、ＤＲＧニューロンの神経前駆細胞、運動ニューロンの神経前駆細胞、末梢ニューロンの神経前駆細胞、脊髄ニューロンの神経前駆細胞、及び腹側介在ニューロンの神経前駆細胞からなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３９】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項４０】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
分化した神経細胞が有糸分裂後である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項２９記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｂ）−（ｄ）をインビボにて被験者において実施する、請求項２９記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）をインビトロにて実施する、請求項２９記載の方法。
【請求項４６】
分化した神経細胞を被験者に移植する工程をさらに含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
神経前駆細胞を被験者に移植すること及び分化した神経細胞を被験者に移植することからなる群から選択される追加の工程をさらに含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
被験者が胚である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
被験者がヒトである、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
被験者が神経組織の変性を有する、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）からなる群から選択される、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
請求項２９記載の方法により生じた分化した神経細胞を含む、細胞の集団。
【請求項５６】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項５５記載の分化した神経細胞。
【請求項５７】
被験者において脊髄を再増殖させる方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして
（ｅ）分化した神経細胞を被験者の脊髄に移植する
工程を含む方法。
【請求項５８】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸である、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
神経前駆細胞が、ＤＲＧニューロンの神経前駆細胞、運動ニューロンの神経前駆細胞、末梢ニューロンの神経前駆細胞、脊髄ニューロンの神経前駆細胞、及び腹側介在ニューロンの神経前駆細胞からなる群から選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項６５】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項６６】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
分化した神経細胞が有糸分裂後である、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
分化した神経細胞が増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項５７記載の方法。
【請求項７０】
被験者が胚である、請求項５７記載の方法。
【請求項７１】
被験者がヒトである、請求項５７記載の方法。
【請求項７２】
被験者が神経組織の変性を有する、請求項５７記載の方法。
【請求項７３】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
末梢神経障害がＡＬＳ又はＳＭＡである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
治療の必要な被験者において神経組織の変性を治療する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；そして
（ｅ）神経組織の変性を治療するのに有効な量にて分化した神経細胞を被験者に移植する
工程を含む方法。
【請求項７７】
神経組織の変性が末梢神経障害又は神経変性疾患である、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
末梢神経障害が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経の外傷、準新生物形成（paraneoplastic）疾患、ポリオ、ポリオ後症候群、進行性延髄麻痺、及び脊髄筋肉萎縮（ＳＭＡ）からなる群から選択される症状に関連する、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントンコレラ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病（Pick's disease）からなる群から選択される、請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
胚性幹細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項８１】
胚性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、請求項７６記載の方法。
【請求項８２】
吻側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項７６記載の方法。
【請求項８３】
尾部側化胚性シグナリング因子がレチノイン酸又はＷｎｔである、請求項７６記載の方法。
【請求項８４】
背側化胚性シグナリング因子がＢＭＰ又はＷｎｔである、請求項７６記載の方法。
【請求項８５】
腹側化胚性シグナリング因子がヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子である、請求項７６記載の方法。
【請求項８６】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグシグナリングのアゴニストである、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
ヘッジホッグシグナリング経路の活性化因子がＳＨｈ又はＨｈ−Ａｇ１．３である、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
神経前駆細胞が、ＤＲＧニューロンの神経前駆細胞、運動ニューロンの神経前駆細胞、末梢ニューロンの神経前駆細胞、脊髄ニューロンの神経前駆細胞、及び腹側介在ニューロンの神経前駆細胞からなる群から選択される、請求項７６記載の方法。
【請求項８９】
分化した神経細胞が、星状細胞、ニューロン、乏突起神経膠細胞、又はシュワン細胞からなる群から選択される、請求項７６記載の方法。
【請求項９０】
分化した神経細胞が運動ニューロンである、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
分化した神経細胞が有糸分裂後である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
運動ニューロンが脊髄運動ニューロンである、請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
被験者が胚である、請求項７６記載の方法。
【請求項９４】
被験者がヒトである、請求項７６記載の方法。
【請求項９５】
工程：
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして
（ｃ）任意に、神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させること
により生じさせた神経前駆細胞。
【請求項９６】
増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項９５記載の神経前駆細胞。
【請求項９７】
神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、請求項９５記載の神経前駆細胞の使用。
【請求項９８】
工程：
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；そして
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させること
により生じさせた、分化した神経細胞。
【請求項９９】
増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項９８記載の分化した神経細胞。
【請求項１００】
神経の発生、機能、及び死を分析すること、又はシナプスの分化を監視することにおける、請求項９５記載の分化した神経細胞の使用。
【請求項１０１】
増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する請求項９８記載の胚性幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト動物系。
【請求項１０１】
分化した神経細胞の集団を単離及び又は精製する方法であって、
（ａ）増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量の吻側化及び／又は尾部側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞を、ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を生じさせるのに有効な量の背側化又は腹側化胚性シグナリング因子に接触させ；
（ｄ）任意に、分化した神経細胞を、少なくとも一つの神経栄養因子と接触させ；
（ｅ）分化した神経細胞においてｅＧＦＰの発現を検出し；そして
（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離する
工程を含む方法。
【請求項１０３】
神経の変性に関連した症状を治療することにおける使用のための薬剤を同定する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の培養物を得るか又は生じさせ；
（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、神経前駆細胞を生じさせるのに有効な量のレチノイン酸に接触させ；
（ｃ）神経前駆細胞においてヘッジホッグシグナリング経路を活性化することによりニューロンを生じさせるが、但し、ニューロンの幾つか又は全てが変性しており；
（ｄ）変性したニューロンを候補の薬剤と接触させ；そして
（ｅ）当該薬剤が幾つか又は全ての変性したニューロンの再生を増強するか否かを決定する
工程を含む方法。
【請求項１０４】
変性した神経ニューロン中のゲノミックＤＮＡがＳＯＤ又はＳＭＮ遺伝子中に変異を有する、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
変性した神経ニューロンが増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）を発現する、請求項９８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００６−５１７０８４（Ｐ２００６−５１７０８４Ａ）
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２１５０１（Ｐ２００４−５２１５０１）
【出願日】平成１５年６月２６日（２００３．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０３９９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００７６６５
【国際公開日】平成１６年１月２２日（２００４．１．２２）
【出願人】（５０５０１９９９８）トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月２６日（２００３．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０３９９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００７６６５
【国際公開日】平成１６年１月２２日（２００４．１．２２）
【出願人】（５０５０１９９９８）トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
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