脂溶性ビタミンの濃縮方法
【課題】微量なトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂から品質
低下を生じることなく効率的にトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮す
る方法であって、熱による品質劣化が生じる蒸留法を用いない方法を提供する。
【解決手段】トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法であって、トコ
フェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、お
よび得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶
液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程を含む、前記方法。
低下を生じることなく効率的にトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮す
る方法であって、熱による品質劣化が生じる蒸留法を用いない方法を提供する。
【解決手段】トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法であって、トコ
フェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、お
よび得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶
液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂からトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然油脂、特に植物油脂には、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ：カロチノイド、ビタミンＤ、ビタミンＥ：トコフェロール、トコトリエノール、ビタミンＫ）、脂肪酸およびステロールが含有されているが、その含有量は少なく、植物油脂から脂溶性ビタミンを精製して用いることは高コストでありほとんど行われてこなかった。その一方で、植物性油脂からトリグリセリドなどを製造する工程においては、脂溶性ビタミンは、その多くが廃棄分に移行するため廃棄されていた。例えば、米糠から油脂を抽出し精製する脱臭工程で除かれる成分である米脱臭スカム（以下、コメスカムという）には、１％程度のトコフェロールおよびトコトリエノールが含まれるが、従来はこれらのものは廃棄され有効に活用されていなかった。
【０００３】
一方、従来から、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂から、これらを選択的に精製する方法が模索されてきた。ところが、トコフェロールやトコトリエノールは、夾雑する脂肪酸と沸点が近く、油脂から分留によってトコフェロールやトコトリエノールを得ようとした場合、分子蒸留などの高性能な蒸留装置を用いる必要があるため、高コスト、低効率であった。この問題に対して、夾雑する脂肪酸をアルキル化することによって低沸点化し、分留する方法が提案されている（例えば、特許文献１、２）。しかしながらこの方法では、蒸留法を用いるため、加熱中にトコフェロールやトコトリエノールの分解が起こることや、アルキル化反応の際に、油脂中のトコフェロールおよびトコトリエノールの一部も変性してしまい回収率の低下が避けられないことなどの問題があった。
【０００４】
また、特許文献３では、油脂中の夾雑物であるステロールと脂肪酸とをエステラーゼを用いて不揮発性のエステルとし、これを除去することでトコフェロールを精製する方法が提案されている。しかしながらこの方法では、エステラーゼの作用によって油中に存在するトリグリセリドやモノグリセリドが分解されて脂肪酸が遊離し、かえって脂肪酸が増加するという問題があった。
【０００５】
特許文献４では、順相液体クロマトグラフィーを用いてトコトリエノールを分離する方法が提案されている。しかしながら、クロマトグラフィー法では、大量の有機溶媒を用いるうえ、大量精製には向かないという問題があった。
【０００６】
したがって、簡便で大量の植物成分を処理できるトコトリエノールの精製方法が切望されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１７５８０５号公報
【特許文献２】特開２００７−１７６８０１号公報
【特許文献３】特開２０００−３０２７７７号公報
【特許文献４】特開２００３−２９２４８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、微量なトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂から品質低下を生じることなく効率的にトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する方法であって、有機溶媒を大量に消費する蒸留法を用いない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂中に含まれる夾雑物をアルカリ条件下でケン化した後、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水の混合溶液を用いた分配抽出で脂肪酸ケン化物を除去することにより、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを極めて効率良く濃縮できることを見出した。
【００１０】
また、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂を、アセトン水溶液を用いて抽出・晶析すると、アセトンの濃度、量および抽出時の温度を調節することによって、夾雑物であるステロールを極めて効率的に除去できること、これを上記の分配抽出と組み合わせることによって、簡便かつ効率よくトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮できることを見出した。
【００１１】
さらに、上記で得られたトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物を、クロマト精製に付すことによって、熱による品質劣化を生じることなく、最初からクロマトグラフィーを行って精製した場合に比べて使用する溶媒量を劇的に低減することができ、しかもトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを極めて高い回収率で精製濃縮できるうえ、トコフェロールとトコトリエノールを分別して回収できることを見出した。
【００１２】
すなわち本発明は以下を包含する。
（１） トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法であって、
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および
得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程
を含む、前記方法。
（２）トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂が米に由来するものである、（１）記載の方法。
（３）得られた濃縮物に有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程をさらに含む、（１）または（２）記載の方法。
（４）得られた濃縮物を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）トコフェロールとトコトリエノールを選択的に濃縮する、（４）または（５）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、微量なトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂から品質低下を生じることなく効率的にトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮することができる。本発明の方法は、熱による品質の劣化が避けられない蒸留法を用いる必要がなく、しかも効率が高いため環境の観点からも望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、トコフェロールには、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールが包含される。また、本発明において、トコトリエノールには、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールが包含される。天然由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは全てｄ体であるが、合成由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは通常はｄｌ体である。本明細書において特に記載しない限り、トコフェロールおよびトコトリエノールはｄ体、ｌ体およびｄｌ体のいずれも包含するものとする。トコフェノールとトコトリエノールは構造が非常に類似していることから、通常、トコトリエノールを濃縮できる方法において、トコフェロールも同時に濃縮することができる。
【００１５】
本発明において原料として用いる、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂としては、上記のトコフェロール、トコトリエノールのうちいずれか１種を含有するものであればよく、２種以上を含有するものであってもよい。
【００１６】
そのようなトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂としては、植物由来の油脂が好ましい。本発明の方法は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールに加えて、脂肪酸およびステロールを含む油脂からのトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮に好適に用いられる。コスト面、ならびにトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの含有量の点において、植物油脂を製造する工程で副生物として得られる脱臭スカムが特に好ましく用いられる。脱臭スカムは、油脂の製造工程の一つである脱臭工程において副産物として得られ、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールに加えて、脂肪酸およびステロールを含む。原料油脂の具体例としては、大豆油、米糠油、小麦胚芽油、紅花油、月見草油、パーム油、サフラワー油、コーン油、オリーブ油、ナタネ油、綿実油、落花生油、エゴマ油、シソ油およびアマニ油、ならびにこれらを製造する工程で副産物として得られる脱臭スカムなどが挙げられる。本発明の方法は、米に由来する油脂、特にコメスカム（米糠から油を抽出し精製する脱臭工程で除かれる成分）からのトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮に特に好適に用いられる。
【００１７】
原料油脂には、例えば、炭素数が６〜２４の飽和または不飽和の、直鎖または分岐の脂肪酸またはその塩が、通常、１種または複数種含まれる。ステロールは、ステロイド骨格に水酸基を有する物質をさし、コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、エルゴステロール等が挙げられる。原料油脂には、これらのステロールが、通常、１種または複数種含まれる。
【００１８】
本発明の方法は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程を含む（以下、第１工程と称する）。
【００１９】
第１工程は、主として、夾雑する不要な脂肪酸をアルカリ処理によってケン化物とした後に除去する工程である。ケン化反応に用いるアルカリは特に制限されるものではなく、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物が好適に用いられる。水酸化ナトリウムを用いてケン化を行う場合、油脂１ｋｇに対して、５〜８０ｗ／ｖ％、好ましくは１０〜５０ｗ／ｖ％の水酸化ナトリウム水溶液０．１〜２ｋｇ、ならびにアルコール（例えば、メタノール、エタノール、グリセリン等の炭素数１〜６の低級アルコール）を添加して、５〜８０℃、好ましくは２０〜６５℃の温度で、１０分〜２４時間反応させる方法を使用できる。ケン化反応が終了したアルカリ処理液にヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を添加してよく攪拌することにより、ケン化物を水相に分離し、かつ目的とするトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを油相中に抽出することができる。分配抽出は、分液漏斗法などの常法の分液手法によって実施でき、通常、下相に水相が上相に油相が分離される。下相の水相を取り除くことによりケン化物が除去される。得られたトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する上相（油相）を、そのままトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物としてもよいし、必要に応じて溶媒を除去してもよい。
【００２０】
分配抽出に用いる溶媒、すなわち、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水の割合は、原料油脂に対する体積比で、ヘキサンは５倍以上、エタノールは２．５倍以上、アセトンは２．５倍以上、水は１．５倍以上が好ましく、ヘキサン７〜１２倍、エタノール３〜９倍、アセトン３〜７倍、水１．５〜８倍がより好ましい。
【００２１】
第１工程で用いる溶媒のうち、ヘキサンおよびアセトンは回収して再利用することができるため、本工程は有用である。
【００２２】
本発明の方法では、上記第１工程で得られた濃縮物に、有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程（以下、第２工程と称する）をさらに実施してもよい。
【００２３】
第２工程は、主として、夾雑する不要なステロールを晶析によって除去する工程である。第２工程は、上記の第１工程で得られた濃縮物（好ましくは溶媒を蒸発させたもの）を有機溶媒に溶解し冷却することによって、ステロールを析出（晶析）させ、これを固液分離するものである。晶析に用いる有機溶媒は特に制限されるものではなく、目的とするトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの溶解度と、不要物であるステロールの溶解度とに差がある溶媒を適宜用いればよい。そのような溶媒の例として、ケトン、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルケトン、エチルメチルケトン、シクロヘキシルケトンおよびこれらの水溶液を例示できる。これらの中でもアセトン水溶液が好ましく、５０〜９９．９体積％のアセトン水溶液がさらに好ましく、７５〜９９体積％のアセトン水溶液が最も好ましい。晶析は、第１工程で得られた濃縮物（溶媒を蒸発させたもの）に対して５〜４０倍量（ｖ／ｗ）の溶媒を添加し、４〜−５０℃、好ましくは２〜−３５℃、さらに好ましくは０〜−２０℃の温度に冷却し、１０分〜２４時間反応させることにより実施できる。その際、有機溶媒の添加後、３０〜６０℃で１０分〜２時間攪拌して得られる不溶物を除去した後に上記晶析を行うと精製効率が増加するため好ましい。晶析によって得られた不要物の結晶を、ろ過、遠心ろ過などの常法の固液分離方法によって分離することにより、ステロールを除去する。液相として得られたトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する有機溶媒は、そのままトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物としてもよいし、必要に応じて有機溶媒を除去して用いてもよい。
【００２４】
第２工程においてアセトン水溶液中で晶析を行う場合、好ましくは固液分離後の液相からアセトンを蒸発させ、これにパラフィン炭化水素（例えば、ヘキサン）やエーテル（例えば、イソプロピルエーテル）などの有機溶媒を再度加えてトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを溶解させてよい。この溶液をそのままトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物としてもよいし、必要に応じて有機溶媒を除去して用いてもよい。本工程で用いるアセトンは回収して再利用することができるため、本工程は有用である。
【００２５】
本発明の方法では、上記第１工程または第２工程で得られた濃縮物を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程（以下、第３工程と称する）をさらに実施してもよい。
【００２６】
第３工程は、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーを用いてトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。クロマトグラフィーに用いる固相担体としては、二酸化ケイ素（シルカゲル）、酸化アルミニウム（アルミナ）、多孔性ポリマー等が挙げられる。移動相としては、上記第１工程または第２工程で得られた濃縮物が溶解する溶媒であればいずれのものも用いることができるが、例えば、ヘキサンなどのパラフィン炭化水素、イソプロピルエーテルなどのエーテル、ならびにアセトンおよび酢酸エチルなどのケトンから選択される１種または２種以上の混合溶液を用いることができる。これらの中で、アセトンまたはヘキサンを用いるのが好ましく、アセトンとヘキサンの混合溶媒を用いるのがさらに好ましい。その際のアセトン濃度は、０．１〜２０体積％、好ましくは０．５〜１０体積％である。
【００２７】
一実施形態において第３工程は、上記第１工程または第２工程で得られた濃縮物を、アセトン濃度が０．１〜２０体積％、好ましくは０．５〜１０体積％のアセトン／ヘキサンを移動相とし、シリカゲル粒子を固相とするクロマト処理に付すことによりトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。ここで用いるカラムは通常用いられるオープンタイプや中圧カラムなどを用いることができるため、操作が簡便である。また担体に対して負荷量を１０％以上にすることも可能であり、処理能力が大きい。更に移動相の量も抑えられるため有利である。
【００２８】
本発明の方法では、上記第１工程〜第３工程のいずれかで得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程（第４工程）をさらに実施してもよい。
【００２９】
第４工程は、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィー法を用いてトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。この工程は、合成吸着剤の樹脂表面の疎水性と、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの疎水性部分との間に働く、ファンデルワールス力（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｅｓ力）による吸着を利用して、分離・濃縮するものである。クロマトグラフィーに用いる固相担体としては、ポリスチレン系合成吸着剤、修飾ポリスチレン系合成吸着剤、メタクリル系合成吸着剤、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤等が挙げられる。市販品として販売されているものを使用してもよい。ポリスチレン系合成吸着剤として、例えば、三菱化学（株）製のダイヤイオンＨＰ、セパビーズＳＰなどが挙げられ、修飾ポリスチレン系合成吸着剤としては、例えば、三菱化学（株）製のセパビーズＳＰ２０７が挙げられ、メタクリル系合成吸着剤としては、例えば、ダイヤイオンＨＰ１ＭＧ、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧなどが挙げられる。移動相としては、本発明の第１工程〜第３工程で得られた濃縮物が溶解する溶媒であればいずれのものも用いることができるが、例えば、ヘキサンなどのパラフィン炭化水素、イソプロピルエーテルなどのエーテル、ならびにアセトンおよび酢酸エチルなどのケトンから選択される１種または２種以上の混合溶液を用いることができる。これらの中で、アセトンまたはアセトン水溶液を用いるのが好ましく、アセトン水溶液を用いるのがさらに好ましい。アセトン水溶液におけるアセトン濃度は、５０〜９９体積％、好ましくは６５〜９０体積％である。一実施形態において、第４工程は、上記第１工程〜第３工程のいずれかで得られた濃縮物を、アセトン濃度３０〜９９体積％のアセトン水溶液を移動相とし、ポリスチレン系合成吸着剤粒子を固相とするクロマト処理に付すことによりトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。
【００３０】
第３工程および第４工程においては、移動相である溶媒を適切に選択することにより、また適切な画分を選択することにより、トコトリエノールとトコフェロールを選択的に濃縮・精製することができる。
【００３１】
本発明によって得られる濃縮物における総トコトリエノール含量の測定は、例えば、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において、ｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールの含量を決定した混合物を標準試薬として標準液を調製し、検液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さまたはピーク面積、ならびに標準液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さまたはピーク面積などを測定することにより実施できる。総トコフェロール含量の測定も同様に、標準試薬として、ｄ−α−トコフェロール、ｄ−β−トコフェロール、ｄ−γ−トコフェロールおよびｄ−δ−トコフェロールの含量を決定した混合物を用いることにより実施できる。
【００３２】
本発明の方法は、上記第１工程〜第４工程をすべて含むことが最も好ましい。従って、一実施形態において本発明のトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法は、
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程（第１工程）
第１工程で得られた濃縮物（好ましくは溶媒を蒸発させたもの）に有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程（第２工程）
第２工程で得られた濃縮物（好ましくは溶媒を蒸発させたもの）を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程（第３工程）、ならびに
第３工程で得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程を含むものである。
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
出発原料として、米糠油脱臭スカム（以下コメスカムという）、すなわち、コメ油を蒸留した際に除去される留分で、トコトリエノールおよびトコフェロールを各約１％含有するオイルを用いた。
【００３５】
第１工程：
（１）コメスカム１ｋｇをエタノール１Ｌで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液０．４ｋｇを加え、温度６０℃で５０分間ケン化反応を行った。
（２）ヘキサン１０Ｌ、３０％エタノール水１０Ｌおよびアセトン５Ｌを（１）に加え、撹拌・静置して下相の水相を抜き取り、上相の溶媒を除去することにより、ケン化物を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は原料コメスカムを基準として約３０％（重量収率）、総トコトリエノール含量は１．９重量％であった。
【００３６】
第２工程：
（３）上記第１工程で得られた濃縮物０．３ｋｇに８５％アセトン水溶液６Ｌを加え、４５〜４８℃の範囲に調節しながら撹拌後、静置して下相のオイルを抜き取った。
（４）（３）で残ったアセトン水溶液を撹拌しながら徐々に冷却し、１２時間で液温０〜−１０℃まで下げて晶析を行った。生成した結晶を濾過し、得られた結晶を冷アセトンで洗浄した。
（５）（４）の濾液および洗浄液を合一し、加熱してアセトンを蒸発させて濃縮し、ここにヘキサン１．５Ｌを加えて撹拌し、静置して下相の水相を抜き取った。上相を数回水で洗浄して水相を廃棄した。上相の溶媒を除去して、植物ステロール等を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は出発原料である第１工程の濃縮物を基準として約２０％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は７．１重量％であった。
【００３７】
第３工程：
（６）上記第２工程で得られた濃縮物０．０６ｋｇをシリカゲル充填したカラムにアプライした。アセトン濃度が３体積％のアセトン／ヘキサン混合溶液を移動相としてクロマト精製し、濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は第２工程の濃縮物を基準として約１９％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は約３８重量％であった。
【００３８】
第４工程
（７）さらに上記第３工程で得られた濃縮物を、ポリスチレン系合成吸着剤を充填したカラムを用い、７０体積％アセトン水溶液を移動相としてクロマト精製し、濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は第３工程の濃縮物を基準として約６０％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は約６０重量％であった。
【００３９】
なお、総トコトリエノール含量は以下のように定量した。
試料０．１０ｇを褐色ナスフラスコに精密に量り、ヘキサンに溶かして、正確に５０ｍＬとし、検液とした。別にビタミンＥ定量用標準試薬でｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールの含量を決定したビタミンＥ類混合物を褐色メスフラスコに精密に量り、ヘキサンに溶かして、正確に５０ｍＬとし、標準液とした。検液および標準液をそれぞれ２０μＬずつ量り、次の操作条件で液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。検液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さＨαＴ、ＨβＴ、ＨγＴ、ＨδＴ、ならびに標準液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さＨαｓ、Ｈβｓ、Ｈγｓ、Ｈδｓを測定した。液体クロマトグラフィーの操作条件は以下のとおりである。
【００４０】
（操作条件）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長 ２９２ｎｍ）
カラム充てん剤：５μｍの液体クロマトグラフィー用シリカゲル
カラム管：内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレス管
カラム温度：４０℃
移動相：ヘキサン／１，４−ジオキサン／２−プロパノール混液（９８５：１０：５）
流量：ｄ−α−トコフェロールの保持時間が約７〜８分になるように調整
式Ｉに基づいて各トコトリエノール含量を求め、式IIに基づいて総トコトリエノール含量を求めた。
【００４１】
【数１】
【００４２】
【数２】
【００４３】
総トコフェロール含量は、標準試薬として、ｄ−α−トコフェロール、ｄ−β−トコフェロール、ｄ−γ−トコフェロールおよびｄ−δ−トコフェロールの含量を決定した混合物を用いた以外は、上記トコトリエノール含量の測定方法と同様に測定した。
【００４４】
実施例２
コメスカム２０ｇ（２０ｍＬ）をエタノール２０ｍＬで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液８ｇを加え、温度６０℃で５０分間ケン化反応を行った。ケン化した後、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水の混合比率を変えて実施例１の第１工程（２）と同様に抽出を行った。得られたオイルの原料コメスカムに対する収率（重量収率）、および総トコトリエノール含量（重量％）を測定した。総トコトリエノール含量は実施例１と同様にＨＰＬＣで測定した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
抽出状態はいずれも良好で、条件５はオイル収率も高く、得られたオイルの総トコトリエノール含量は２．３重量％であった。表１から抽出時に使用する溶媒の量は、コメスカムに対して、体積比で、ヘキサンは５倍以上、エタノールは３．５倍以上、アセトンは２．５倍以上、水は１．５倍以上が好ましく、ヘキサン１０倍、エタノール７倍、アセトン５倍、水３倍がより好ましいことがわかった。
【００４７】
実施例３
実施例１の第１工程で得られた濃縮物（総トコトリエノール含量１．９重量％）１０ｇに対し、アセトン水溶液におけるアセトン濃度（体積％）を変えて実施例１の第２工程と同様に抽出・晶析を行った。得られたオイルの原料である第１工程の濃縮物に対する収率（重量収率）、得られた濃縮物における総トコトリエノール含量（重量％）、および原料である第１工程の濃縮物中の総トコトリエノールに対する回収率は表２の通りであった。総トコトリエノール含量は実施例１と同様にＨＰＬＣで測定した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
アセトン濃度が高いとオイル収率は高くなる一方で、得られるオイルの総トコトリエノール含量は低下した。しかし、アセトン濃度が高いほど総トコトリエノール回収率は高かった。
【００５０】
実施例４
実施例１の第２工程で得られた濃縮物（総トコトリエノール含量７．１重量％）１０ｇをシリカゲル充填（１００ｇ）したオープンカラムで３％アセトン／ヘキサンを展開溶媒として精製した。各画分で得られた濃縮物の収量（ｇ）、収率（重量収率）、総トコトリエノール含量（重量％）および総トコフェロール含量（重量％）を測定した。総トコトリエノール含量は実施例１と同様にＨＰＬＣで測定した。総トコフェロール含量も総トコトリエノール含量と同様に測定した。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
表３から、画分を選択することによって、濃縮物におけるトコトリエノールとトコフェロールの含有量を適宜調整できることがわかる。
【００５３】
実施例５
実施例１の第３工程で得られた総トコトリエノール含量約３８重量％のオイル９．４７ｇを原料にして、ポリスチレン系合成樹脂粒子を充填（９４．７ｇ）したオープンカラムで７０％アセトン／水を展開溶媒として、トコフェロールおよびトコトリエノールの濃縮・精製を行った。結果を以下の表４に示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】
実施例４と同様に、本工程はオープンカラムで実施することができ、充填材として負荷量が１０％と高く、処理能力が大きい。表４から明らかなように、トコトリエノールをほぼ選択的に８０％まで精製することが可能であった。また、画分を選択することによりトコフェロールとトコトリエノールを選択的に濃縮・精製することが可能であった。
【００５６】
比較例１
実施例１の第１工程（２）において抽出溶媒をＩＰＥ（イソプロピエルエーテル）と置き換えて精製を行った。
【００５７】
コメスカム（総トコトリエノール含量０．９重量％）２０ｇをエタノール２０ｍＬで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液８ｇを加え、温度６０℃で５０分間ケン化反応を行った。ケン化した後、ＩＰＥで抽出した。得られたオイルの原料コメスカムに対する収率（重量収率）およびオイルにおける総トコトリエノール含量（重量％）は表５の通りであった。
【００５８】
【表５】
【００５９】
ＩＰＥ単一溶媒で抽出できる利点はあるが、オイル収率および総トコトリエノール含量ともに実施例１の第１工程で得られた濃縮物と比較して劣っていた。また、結果として総トコトリエノール回収率は４０％未満であった。また、食品素材の開発を想定した場合、ＩＰＥを使用することは望ましくない。
【００６０】
比較例２
実施例１の第３工程を分子蒸留と置き換えて精製を行った。
実施例１の第１工程で得られた濃縮物（総トコトリエノール含量１．９重量％）１０ｇを、アセトン水溶液の代わりにアセトン１００％を用いて実施例１の第２工程と同様に抽出・晶析を行った。得られた濃縮物（総トコトリエノール含量２．２重量％）６８４ｇを分子蒸留（蒸留装置名：MS-150、日本車両（株）製）にて精製を行った。得られたオイルの収量（ｇ）および原料コメスカムに対する収率（重量収率）、ならびにオイルにおける総トコトリエノール含量（重量％）は表６のとおりであった。
【００６１】
【表６】
【００６２】
分子蒸留では蒸留初期からトコトリエノールが検出された。また、総トコトリエノール含量はいずれの画分においても６重量％に達せず、実施例１の第３工程と比較すると精製効率は低かった。
【００６３】
実施例６
出発原料として、トコトリエノールを約０．７％含有するコメスカムを使用し、スケールアップ製造を実施した。
【００６４】
第１工程：
（１）コメスカム１２０ｋｇをエタノール３０Ｌとヘキサン１２０Ｌで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液４８ｋｇを加え、温度６０℃で１００分間ケン化反応を行った。
（２）ヘキサン１０００Ｌ、３０％エタノール水１２００Ｌおよびアセトン６００Ｌを（１）に加え、撹拌・静置して下層の水相を抜き取り、上層の溶媒を除去することにより、ケン化物を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は原料コメスカムを基準として約３３％（重量収率）、総トコトリエノール含量は１．２重量％であった。
【００６５】
第２工程：
（３）上記第１工程で得られた濃縮物３９ｋｇに８５％アセトン水溶液８８０Ｌを加え、４５〜４８℃の範囲に調節しながら撹拌後、静置して下層のオイルを抜き取った。
（４）（３）で残ったアセトン水溶液を撹拌しながら徐々に冷却し、１２時間で液温０〜−１０℃まで下げて晶析を行った。精製した結晶を濾過し、得られた結晶を冷アセトンで洗浄した。
（５）（４）の濾液および洗浄液を合一し、過熱してアセトンを蒸発させて濃縮し、ここにヘキサン２００Ｌを加えて撹拌し、静置して下層の水相を抜き取った。上層を数回水で洗浄して水相を廃棄した。上層の溶媒を除去して、植物ステロール等を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は出発原料である第１工程の濃縮物を基準として約１７％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は９．１％重量％であった。
【００６６】
第３工程：
（６）上記第２工程で得られた濃縮物６．６ｋｇをシリカゲル（３５ｋｇ）充填したカラム（φ３００×１０００）にアプライした。アセトン濃度が２体積％のアセトン／ヘキサン混合溶液を移動相としてクロマト精製し、濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は第２工程の濃縮物を基準として約９．４％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は約７７重量％であった。
【００６７】
なお、総トコトリエノール含量は、実施例１と同様に定量した。ただし、ピークの高さ（ＨαＴ、ＨβＴ、ＨγＴ、ＨδＴ、Ｈαｓ、Ｈβｓ、Ｈγｓ、Ｈδｓ）の代わりに、ピークの面積（ＡαＴ、ＡβＴ、ＡγＴ、ＡδＴ、Ａαｓ、Ａβｓ、Ａγｓ、Ａδｓ）を測定して定量した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂からトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然油脂、特に植物油脂には、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ：カロチノイド、ビタミンＤ、ビタミンＥ：トコフェロール、トコトリエノール、ビタミンＫ）、脂肪酸およびステロールが含有されているが、その含有量は少なく、植物油脂から脂溶性ビタミンを精製して用いることは高コストでありほとんど行われてこなかった。その一方で、植物性油脂からトリグリセリドなどを製造する工程においては、脂溶性ビタミンは、その多くが廃棄分に移行するため廃棄されていた。例えば、米糠から油脂を抽出し精製する脱臭工程で除かれる成分である米脱臭スカム（以下、コメスカムという）には、１％程度のトコフェロールおよびトコトリエノールが含まれるが、従来はこれらのものは廃棄され有効に活用されていなかった。
【０００３】
一方、従来から、トコフェロールおよびトコトリエノールを含有する油脂から、これらを選択的に精製する方法が模索されてきた。ところが、トコフェロールやトコトリエノールは、夾雑する脂肪酸と沸点が近く、油脂から分留によってトコフェロールやトコトリエノールを得ようとした場合、分子蒸留などの高性能な蒸留装置を用いる必要があるため、高コスト、低効率であった。この問題に対して、夾雑する脂肪酸をアルキル化することによって低沸点化し、分留する方法が提案されている（例えば、特許文献１、２）。しかしながらこの方法では、蒸留法を用いるため、加熱中にトコフェロールやトコトリエノールの分解が起こることや、アルキル化反応の際に、油脂中のトコフェロールおよびトコトリエノールの一部も変性してしまい回収率の低下が避けられないことなどの問題があった。
【０００４】
また、特許文献３では、油脂中の夾雑物であるステロールと脂肪酸とをエステラーゼを用いて不揮発性のエステルとし、これを除去することでトコフェロールを精製する方法が提案されている。しかしながらこの方法では、エステラーゼの作用によって油中に存在するトリグリセリドやモノグリセリドが分解されて脂肪酸が遊離し、かえって脂肪酸が増加するという問題があった。
【０００５】
特許文献４では、順相液体クロマトグラフィーを用いてトコトリエノールを分離する方法が提案されている。しかしながら、クロマトグラフィー法では、大量の有機溶媒を用いるうえ、大量精製には向かないという問題があった。
【０００６】
したがって、簡便で大量の植物成分を処理できるトコトリエノールの精製方法が切望されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１７５８０５号公報
【特許文献２】特開２００７−１７６８０１号公報
【特許文献３】特開２０００−３０２７７７号公報
【特許文献４】特開２００３−２９２４８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、微量なトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂から品質低下を生じることなく効率的にトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する方法であって、有機溶媒を大量に消費する蒸留法を用いない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂中に含まれる夾雑物をアルカリ条件下でケン化した後、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水の混合溶液を用いた分配抽出で脂肪酸ケン化物を除去することにより、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを極めて効率良く濃縮できることを見出した。
【００１０】
また、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂を、アセトン水溶液を用いて抽出・晶析すると、アセトンの濃度、量および抽出時の温度を調節することによって、夾雑物であるステロールを極めて効率的に除去できること、これを上記の分配抽出と組み合わせることによって、簡便かつ効率よくトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮できることを見出した。
【００１１】
さらに、上記で得られたトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物を、クロマト精製に付すことによって、熱による品質劣化を生じることなく、最初からクロマトグラフィーを行って精製した場合に比べて使用する溶媒量を劇的に低減することができ、しかもトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを極めて高い回収率で精製濃縮できるうえ、トコフェロールとトコトリエノールを分別して回収できることを見出した。
【００１２】
すなわち本発明は以下を包含する。
（１） トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法であって、
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および
得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程
を含む、前記方法。
（２）トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂が米に由来するものである、（１）記載の方法。
（３）得られた濃縮物に有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程をさらに含む、（１）または（２）記載の方法。
（４）得られた濃縮物を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）トコフェロールとトコトリエノールを選択的に濃縮する、（４）または（５）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、微量なトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂から品質低下を生じることなく効率的にトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮することができる。本発明の方法は、熱による品質の劣化が避けられない蒸留法を用いる必要がなく、しかも効率が高いため環境の観点からも望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、トコフェロールには、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールが包含される。また、本発明において、トコトリエノールには、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールが包含される。天然由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは全てｄ体であるが、合成由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは通常はｄｌ体である。本明細書において特に記載しない限り、トコフェロールおよびトコトリエノールはｄ体、ｌ体およびｄｌ体のいずれも包含するものとする。トコフェノールとトコトリエノールは構造が非常に類似していることから、通常、トコトリエノールを濃縮できる方法において、トコフェロールも同時に濃縮することができる。
【００１５】
本発明において原料として用いる、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂としては、上記のトコフェロール、トコトリエノールのうちいずれか１種を含有するものであればよく、２種以上を含有するものであってもよい。
【００１６】
そのようなトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂としては、植物由来の油脂が好ましい。本発明の方法は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールに加えて、脂肪酸およびステロールを含む油脂からのトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮に好適に用いられる。コスト面、ならびにトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの含有量の点において、植物油脂を製造する工程で副生物として得られる脱臭スカムが特に好ましく用いられる。脱臭スカムは、油脂の製造工程の一つである脱臭工程において副産物として得られ、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールに加えて、脂肪酸およびステロールを含む。原料油脂の具体例としては、大豆油、米糠油、小麦胚芽油、紅花油、月見草油、パーム油、サフラワー油、コーン油、オリーブ油、ナタネ油、綿実油、落花生油、エゴマ油、シソ油およびアマニ油、ならびにこれらを製造する工程で副産物として得られる脱臭スカムなどが挙げられる。本発明の方法は、米に由来する油脂、特にコメスカム（米糠から油を抽出し精製する脱臭工程で除かれる成分）からのトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮に特に好適に用いられる。
【００１７】
原料油脂には、例えば、炭素数が６〜２４の飽和または不飽和の、直鎖または分岐の脂肪酸またはその塩が、通常、１種または複数種含まれる。ステロールは、ステロイド骨格に水酸基を有する物質をさし、コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、エルゴステロール等が挙げられる。原料油脂には、これらのステロールが、通常、１種または複数種含まれる。
【００１８】
本発明の方法は、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程を含む（以下、第１工程と称する）。
【００１９】
第１工程は、主として、夾雑する不要な脂肪酸をアルカリ処理によってケン化物とした後に除去する工程である。ケン化反応に用いるアルカリは特に制限されるものではなく、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物が好適に用いられる。水酸化ナトリウムを用いてケン化を行う場合、油脂１ｋｇに対して、５〜８０ｗ／ｖ％、好ましくは１０〜５０ｗ／ｖ％の水酸化ナトリウム水溶液０．１〜２ｋｇ、ならびにアルコール（例えば、メタノール、エタノール、グリセリン等の炭素数１〜６の低級アルコール）を添加して、５〜８０℃、好ましくは２０〜６５℃の温度で、１０分〜２４時間反応させる方法を使用できる。ケン化反応が終了したアルカリ処理液にヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を添加してよく攪拌することにより、ケン化物を水相に分離し、かつ目的とするトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを油相中に抽出することができる。分配抽出は、分液漏斗法などの常法の分液手法によって実施でき、通常、下相に水相が上相に油相が分離される。下相の水相を取り除くことによりケン化物が除去される。得られたトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する上相（油相）を、そのままトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物としてもよいし、必要に応じて溶媒を除去してもよい。
【００２０】
分配抽出に用いる溶媒、すなわち、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水の割合は、原料油脂に対する体積比で、ヘキサンは５倍以上、エタノールは２．５倍以上、アセトンは２．５倍以上、水は１．５倍以上が好ましく、ヘキサン７〜１２倍、エタノール３〜９倍、アセトン３〜７倍、水１．５〜８倍がより好ましい。
【００２１】
第１工程で用いる溶媒のうち、ヘキサンおよびアセトンは回収して再利用することができるため、本工程は有用である。
【００２２】
本発明の方法では、上記第１工程で得られた濃縮物に、有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程（以下、第２工程と称する）をさらに実施してもよい。
【００２３】
第２工程は、主として、夾雑する不要なステロールを晶析によって除去する工程である。第２工程は、上記の第１工程で得られた濃縮物（好ましくは溶媒を蒸発させたもの）を有機溶媒に溶解し冷却することによって、ステロールを析出（晶析）させ、これを固液分離するものである。晶析に用いる有機溶媒は特に制限されるものではなく、目的とするトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの溶解度と、不要物であるステロールの溶解度とに差がある溶媒を適宜用いればよい。そのような溶媒の例として、ケトン、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルケトン、エチルメチルケトン、シクロヘキシルケトンおよびこれらの水溶液を例示できる。これらの中でもアセトン水溶液が好ましく、５０〜９９．９体積％のアセトン水溶液がさらに好ましく、７５〜９９体積％のアセトン水溶液が最も好ましい。晶析は、第１工程で得られた濃縮物（溶媒を蒸発させたもの）に対して５〜４０倍量（ｖ／ｗ）の溶媒を添加し、４〜−５０℃、好ましくは２〜−３５℃、さらに好ましくは０〜−２０℃の温度に冷却し、１０分〜２４時間反応させることにより実施できる。その際、有機溶媒の添加後、３０〜６０℃で１０分〜２時間攪拌して得られる不溶物を除去した後に上記晶析を行うと精製効率が増加するため好ましい。晶析によって得られた不要物の結晶を、ろ過、遠心ろ過などの常法の固液分離方法によって分離することにより、ステロールを除去する。液相として得られたトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する有機溶媒は、そのままトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物としてもよいし、必要に応じて有機溶媒を除去して用いてもよい。
【００２４】
第２工程においてアセトン水溶液中で晶析を行う場合、好ましくは固液分離後の液相からアセトンを蒸発させ、これにパラフィン炭化水素（例えば、ヘキサン）やエーテル（例えば、イソプロピルエーテル）などの有機溶媒を再度加えてトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを溶解させてよい。この溶液をそのままトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮物としてもよいし、必要に応じて有機溶媒を除去して用いてもよい。本工程で用いるアセトンは回収して再利用することができるため、本工程は有用である。
【００２５】
本発明の方法では、上記第１工程または第２工程で得られた濃縮物を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程（以下、第３工程と称する）をさらに実施してもよい。
【００２６】
第３工程は、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーを用いてトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。クロマトグラフィーに用いる固相担体としては、二酸化ケイ素（シルカゲル）、酸化アルミニウム（アルミナ）、多孔性ポリマー等が挙げられる。移動相としては、上記第１工程または第２工程で得られた濃縮物が溶解する溶媒であればいずれのものも用いることができるが、例えば、ヘキサンなどのパラフィン炭化水素、イソプロピルエーテルなどのエーテル、ならびにアセトンおよび酢酸エチルなどのケトンから選択される１種または２種以上の混合溶液を用いることができる。これらの中で、アセトンまたはヘキサンを用いるのが好ましく、アセトンとヘキサンの混合溶媒を用いるのがさらに好ましい。その際のアセトン濃度は、０．１〜２０体積％、好ましくは０．５〜１０体積％である。
【００２７】
一実施形態において第３工程は、上記第１工程または第２工程で得られた濃縮物を、アセトン濃度が０．１〜２０体積％、好ましくは０．５〜１０体積％のアセトン／ヘキサンを移動相とし、シリカゲル粒子を固相とするクロマト処理に付すことによりトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。ここで用いるカラムは通常用いられるオープンタイプや中圧カラムなどを用いることができるため、操作が簡便である。また担体に対して負荷量を１０％以上にすることも可能であり、処理能力が大きい。更に移動相の量も抑えられるため有利である。
【００２８】
本発明の方法では、上記第１工程〜第３工程のいずれかで得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程（第４工程）をさらに実施してもよい。
【００２９】
第４工程は、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィー法を用いてトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。この工程は、合成吸着剤の樹脂表面の疎水性と、トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの疎水性部分との間に働く、ファンデルワールス力（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｅｓ力）による吸着を利用して、分離・濃縮するものである。クロマトグラフィーに用いる固相担体としては、ポリスチレン系合成吸着剤、修飾ポリスチレン系合成吸着剤、メタクリル系合成吸着剤、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤等が挙げられる。市販品として販売されているものを使用してもよい。ポリスチレン系合成吸着剤として、例えば、三菱化学（株）製のダイヤイオンＨＰ、セパビーズＳＰなどが挙げられ、修飾ポリスチレン系合成吸着剤としては、例えば、三菱化学（株）製のセパビーズＳＰ２０７が挙げられ、メタクリル系合成吸着剤としては、例えば、ダイヤイオンＨＰ１ＭＧ、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧなどが挙げられる。移動相としては、本発明の第１工程〜第３工程で得られた濃縮物が溶解する溶媒であればいずれのものも用いることができるが、例えば、ヘキサンなどのパラフィン炭化水素、イソプロピルエーテルなどのエーテル、ならびにアセトンおよび酢酸エチルなどのケトンから選択される１種または２種以上の混合溶液を用いることができる。これらの中で、アセトンまたはアセトン水溶液を用いるのが好ましく、アセトン水溶液を用いるのがさらに好ましい。アセトン水溶液におけるアセトン濃度は、５０〜９９体積％、好ましくは６５〜９０体積％である。一実施形態において、第４工程は、上記第１工程〜第３工程のいずれかで得られた濃縮物を、アセトン濃度３０〜９９体積％のアセトン水溶液を移動相とし、ポリスチレン系合成吸着剤粒子を固相とするクロマト処理に付すことによりトコフェロールおよび／またはトコトリエノールを濃縮する工程である。
【００３０】
第３工程および第４工程においては、移動相である溶媒を適切に選択することにより、また適切な画分を選択することにより、トコトリエノールとトコフェロールを選択的に濃縮・精製することができる。
【００３１】
本発明によって得られる濃縮物における総トコトリエノール含量の測定は、例えば、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において、ｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールの含量を決定した混合物を標準試薬として標準液を調製し、検液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さまたはピーク面積、ならびに標準液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さまたはピーク面積などを測定することにより実施できる。総トコフェロール含量の測定も同様に、標準試薬として、ｄ−α−トコフェロール、ｄ−β−トコフェロール、ｄ−γ−トコフェロールおよびｄ−δ−トコフェロールの含量を決定した混合物を用いることにより実施できる。
【００３２】
本発明の方法は、上記第１工程〜第４工程をすべて含むことが最も好ましい。従って、一実施形態において本発明のトコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法は、
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程（第１工程）
第１工程で得られた濃縮物（好ましくは溶媒を蒸発させたもの）に有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程（第２工程）
第２工程で得られた濃縮物（好ましくは溶媒を蒸発させたもの）を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程（第３工程）、ならびに
第３工程で得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程を含むものである。
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
出発原料として、米糠油脱臭スカム（以下コメスカムという）、すなわち、コメ油を蒸留した際に除去される留分で、トコトリエノールおよびトコフェロールを各約１％含有するオイルを用いた。
【００３５】
第１工程：
（１）コメスカム１ｋｇをエタノール１Ｌで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液０．４ｋｇを加え、温度６０℃で５０分間ケン化反応を行った。
（２）ヘキサン１０Ｌ、３０％エタノール水１０Ｌおよびアセトン５Ｌを（１）に加え、撹拌・静置して下相の水相を抜き取り、上相の溶媒を除去することにより、ケン化物を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は原料コメスカムを基準として約３０％（重量収率）、総トコトリエノール含量は１．９重量％であった。
【００３６】
第２工程：
（３）上記第１工程で得られた濃縮物０．３ｋｇに８５％アセトン水溶液６Ｌを加え、４５〜４８℃の範囲に調節しながら撹拌後、静置して下相のオイルを抜き取った。
（４）（３）で残ったアセトン水溶液を撹拌しながら徐々に冷却し、１２時間で液温０〜−１０℃まで下げて晶析を行った。生成した結晶を濾過し、得られた結晶を冷アセトンで洗浄した。
（５）（４）の濾液および洗浄液を合一し、加熱してアセトンを蒸発させて濃縮し、ここにヘキサン１．５Ｌを加えて撹拌し、静置して下相の水相を抜き取った。上相を数回水で洗浄して水相を廃棄した。上相の溶媒を除去して、植物ステロール等を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は出発原料である第１工程の濃縮物を基準として約２０％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は７．１重量％であった。
【００３７】
第３工程：
（６）上記第２工程で得られた濃縮物０．０６ｋｇをシリカゲル充填したカラムにアプライした。アセトン濃度が３体積％のアセトン／ヘキサン混合溶液を移動相としてクロマト精製し、濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は第２工程の濃縮物を基準として約１９％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は約３８重量％であった。
【００３８】
第４工程
（７）さらに上記第３工程で得られた濃縮物を、ポリスチレン系合成吸着剤を充填したカラムを用い、７０体積％アセトン水溶液を移動相としてクロマト精製し、濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は第３工程の濃縮物を基準として約６０％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は約６０重量％であった。
【００３９】
なお、総トコトリエノール含量は以下のように定量した。
試料０．１０ｇを褐色ナスフラスコに精密に量り、ヘキサンに溶かして、正確に５０ｍＬとし、検液とした。別にビタミンＥ定量用標準試薬でｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールの含量を決定したビタミンＥ類混合物を褐色メスフラスコに精密に量り、ヘキサンに溶かして、正確に５０ｍＬとし、標準液とした。検液および標準液をそれぞれ２０μＬずつ量り、次の操作条件で液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。検液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さＨαＴ、ＨβＴ、ＨγＴ、ＨδＴ、ならびに標準液のｄ−α−トコトリエノール、ｄ−β−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノールおよびｄ−δ−トコトリエノールのピーク高さＨαｓ、Ｈβｓ、Ｈγｓ、Ｈδｓを測定した。液体クロマトグラフィーの操作条件は以下のとおりである。
【００４０】
（操作条件）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長 ２９２ｎｍ）
カラム充てん剤：５μｍの液体クロマトグラフィー用シリカゲル
カラム管：内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレス管
カラム温度：４０℃
移動相：ヘキサン／１，４−ジオキサン／２−プロパノール混液（９８５：１０：５）
流量：ｄ−α−トコフェロールの保持時間が約７〜８分になるように調整
式Ｉに基づいて各トコトリエノール含量を求め、式IIに基づいて総トコトリエノール含量を求めた。
【００４１】
【数１】
【００４２】
【数２】
【００４３】
総トコフェロール含量は、標準試薬として、ｄ−α−トコフェロール、ｄ−β−トコフェロール、ｄ−γ−トコフェロールおよびｄ−δ−トコフェロールの含量を決定した混合物を用いた以外は、上記トコトリエノール含量の測定方法と同様に測定した。
【００４４】
実施例２
コメスカム２０ｇ（２０ｍＬ）をエタノール２０ｍＬで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液８ｇを加え、温度６０℃で５０分間ケン化反応を行った。ケン化した後、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水の混合比率を変えて実施例１の第１工程（２）と同様に抽出を行った。得られたオイルの原料コメスカムに対する収率（重量収率）、および総トコトリエノール含量（重量％）を測定した。総トコトリエノール含量は実施例１と同様にＨＰＬＣで測定した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
抽出状態はいずれも良好で、条件５はオイル収率も高く、得られたオイルの総トコトリエノール含量は２．３重量％であった。表１から抽出時に使用する溶媒の量は、コメスカムに対して、体積比で、ヘキサンは５倍以上、エタノールは３．５倍以上、アセトンは２．５倍以上、水は１．５倍以上が好ましく、ヘキサン１０倍、エタノール７倍、アセトン５倍、水３倍がより好ましいことがわかった。
【００４７】
実施例３
実施例１の第１工程で得られた濃縮物（総トコトリエノール含量１．９重量％）１０ｇに対し、アセトン水溶液におけるアセトン濃度（体積％）を変えて実施例１の第２工程と同様に抽出・晶析を行った。得られたオイルの原料である第１工程の濃縮物に対する収率（重量収率）、得られた濃縮物における総トコトリエノール含量（重量％）、および原料である第１工程の濃縮物中の総トコトリエノールに対する回収率は表２の通りであった。総トコトリエノール含量は実施例１と同様にＨＰＬＣで測定した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
アセトン濃度が高いとオイル収率は高くなる一方で、得られるオイルの総トコトリエノール含量は低下した。しかし、アセトン濃度が高いほど総トコトリエノール回収率は高かった。
【００５０】
実施例４
実施例１の第２工程で得られた濃縮物（総トコトリエノール含量７．１重量％）１０ｇをシリカゲル充填（１００ｇ）したオープンカラムで３％アセトン／ヘキサンを展開溶媒として精製した。各画分で得られた濃縮物の収量（ｇ）、収率（重量収率）、総トコトリエノール含量（重量％）および総トコフェロール含量（重量％）を測定した。総トコトリエノール含量は実施例１と同様にＨＰＬＣで測定した。総トコフェロール含量も総トコトリエノール含量と同様に測定した。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
表３から、画分を選択することによって、濃縮物におけるトコトリエノールとトコフェロールの含有量を適宜調整できることがわかる。
【００５３】
実施例５
実施例１の第３工程で得られた総トコトリエノール含量約３８重量％のオイル９．４７ｇを原料にして、ポリスチレン系合成樹脂粒子を充填（９４．７ｇ）したオープンカラムで７０％アセトン／水を展開溶媒として、トコフェロールおよびトコトリエノールの濃縮・精製を行った。結果を以下の表４に示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】
実施例４と同様に、本工程はオープンカラムで実施することができ、充填材として負荷量が１０％と高く、処理能力が大きい。表４から明らかなように、トコトリエノールをほぼ選択的に８０％まで精製することが可能であった。また、画分を選択することによりトコフェロールとトコトリエノールを選択的に濃縮・精製することが可能であった。
【００５６】
比較例１
実施例１の第１工程（２）において抽出溶媒をＩＰＥ（イソプロピエルエーテル）と置き換えて精製を行った。
【００５７】
コメスカム（総トコトリエノール含量０．９重量％）２０ｇをエタノール２０ｍＬで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液８ｇを加え、温度６０℃で５０分間ケン化反応を行った。ケン化した後、ＩＰＥで抽出した。得られたオイルの原料コメスカムに対する収率（重量収率）およびオイルにおける総トコトリエノール含量（重量％）は表５の通りであった。
【００５８】
【表５】
【００５９】
ＩＰＥ単一溶媒で抽出できる利点はあるが、オイル収率および総トコトリエノール含量ともに実施例１の第１工程で得られた濃縮物と比較して劣っていた。また、結果として総トコトリエノール回収率は４０％未満であった。また、食品素材の開発を想定した場合、ＩＰＥを使用することは望ましくない。
【００６０】
比較例２
実施例１の第３工程を分子蒸留と置き換えて精製を行った。
実施例１の第１工程で得られた濃縮物（総トコトリエノール含量１．９重量％）１０ｇを、アセトン水溶液の代わりにアセトン１００％を用いて実施例１の第２工程と同様に抽出・晶析を行った。得られた濃縮物（総トコトリエノール含量２．２重量％）６８４ｇを分子蒸留（蒸留装置名：MS-150、日本車両（株）製）にて精製を行った。得られたオイルの収量（ｇ）および原料コメスカムに対する収率（重量収率）、ならびにオイルにおける総トコトリエノール含量（重量％）は表６のとおりであった。
【００６１】
【表６】
【００６２】
分子蒸留では蒸留初期からトコトリエノールが検出された。また、総トコトリエノール含量はいずれの画分においても６重量％に達せず、実施例１の第３工程と比較すると精製効率は低かった。
【００６３】
実施例６
出発原料として、トコトリエノールを約０．７％含有するコメスカムを使用し、スケールアップ製造を実施した。
【００６４】
第１工程：
（１）コメスカム１２０ｋｇをエタノール３０Ｌとヘキサン１２０Ｌで加熱溶解し、２５％水酸化ナトリウム水溶液４８ｋｇを加え、温度６０℃で１００分間ケン化反応を行った。
（２）ヘキサン１０００Ｌ、３０％エタノール水１２００Ｌおよびアセトン６００Ｌを（１）に加え、撹拌・静置して下層の水相を抜き取り、上層の溶媒を除去することにより、ケン化物を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は原料コメスカムを基準として約３３％（重量収率）、総トコトリエノール含量は１．２重量％であった。
【００６５】
第２工程：
（３）上記第１工程で得られた濃縮物３９ｋｇに８５％アセトン水溶液８８０Ｌを加え、４５〜４８℃の範囲に調節しながら撹拌後、静置して下層のオイルを抜き取った。
（４）（３）で残ったアセトン水溶液を撹拌しながら徐々に冷却し、１２時間で液温０〜−１０℃まで下げて晶析を行った。精製した結晶を濾過し、得られた結晶を冷アセトンで洗浄した。
（５）（４）の濾液および洗浄液を合一し、過熱してアセトンを蒸発させて濃縮し、ここにヘキサン２００Ｌを加えて撹拌し、静置して下層の水相を抜き取った。上層を数回水で洗浄して水相を廃棄した。上層の溶媒を除去して、植物ステロール等を除去した濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は出発原料である第１工程の濃縮物を基準として約１７％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は９．１％重量％であった。
【００６６】
第３工程：
（６）上記第２工程で得られた濃縮物６．６ｋｇをシリカゲル（３５ｋｇ）充填したカラム（φ３００×１０００）にアプライした。アセトン濃度が２体積％のアセトン／ヘキサン混合溶液を移動相としてクロマト精製し、濃縮物を得た。得られた濃縮物の収率は第２工程の濃縮物を基準として約９．４％（重量収率）、また得られた濃縮物の総トコトリエノール含量は約７７重量％であった。
【００６７】
なお、総トコトリエノール含量は、実施例１と同様に定量した。ただし、ピークの高さ（ＨαＴ、ＨβＴ、ＨγＴ、ＨδＴ、Ｈαｓ、Ｈβｓ、Ｈγｓ、Ｈδｓ）の代わりに、ピークの面積（ＡαＴ、ＡβＴ、ＡγＴ、ＡδＴ、Ａαｓ、Ａβｓ、Ａγｓ、Ａδｓ）を測定して定量した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法であって、
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および
得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂が米に由来するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
得られた濃縮物に有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
得られた濃縮物を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
トコフェロールとトコトリエノールを選択的に濃縮する、請求項４または５記載の方法。
【請求項１】
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールの濃縮方法であって、
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂をアルカリ処理する工程、および
得られたアルカリ処理液を、ヘキサン、エタノール、アセトンおよび水を含む混合溶液を用いる分配抽出に付し、ケン化物を除去する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
トコフェロールおよび／またはトコトリエノールを含有する油脂が米に由来するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
得られた濃縮物に有機溶媒を加えて冷却し、生成した析出物を除去する工程をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
得られた濃縮物を、分配クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
得られた濃縮物を、合成吸着剤を用いたクロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
トコフェロールとトコトリエノールを選択的に濃縮する、請求項４または５記載の方法。
【公開番号】特開２００９−１４３８９６（Ｐ２００９−１４３８９６Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９４０２６（Ｐ２００８−２９４０２６）
【出願日】平成２０年１１月１８日（２００８．１１．１８）
【出願人】（３０１０４９７４４）日清ファルマ株式会社 (61)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１８日（２００８．１１．１８）
【出願人】（３０１０４９７４４）日清ファルマ株式会社 (61)
【Ｆターム（参考）】
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