脂肪由来幹細胞と塩基性線維芽細胞増殖因子を組み合わせた線維性病変の治療法
【課題】これまで治療が困難であった各種の線維性病変に対して，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ること。
【解決手段】脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤。本発明はまた、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。本発明はさらに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。本発明はなおさらに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。
【解決手段】脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤。本発明はまた、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。本発明はさらに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。本発明はなおさらに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪由来幹細胞に関する新たな利用法に関する。より詳細には、本発明は、線維性病変の新たな治療に関する。本発明はまた、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などのサイトカインの新たな生産方法に関する。本発明はさらに、脂肪由来幹細胞（脂肪由来幹／間質細胞とも呼ばれる、ＡＳＣ）の新たな増殖刺激剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、組織特異的な前駆細胞として機能するだけでなく、多能性であり、そして、特定の状況下で、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような血管新生性増殖因子を分泌する。しかし、この分泌の生物学的な役割と調節機構とは、十分に研究されていない。
【０００３】
脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、組織特異的な前駆細胞として機能し、種々の系統の細胞へと分化し得（非特許文献１）、そして、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような多くの強力な増殖因子およびサイトカインを分泌し得る（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。分泌された因子のパラクリン作用は、ＡＳＣを用いて処置された虚血性の後肢の血管分布の改善を説明する（非特許文献２；非特許文献４）；しかし、ＡＳＣの内皮細胞への分化は、血管分布の改善にも寄与し得る（非特許文献５；非特許文献６）。血管新生と組織修復を促進するためにＡＳＣを使用することは、可能性ある治療戦略としての興味を獲得し[非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、そして、ＡＳＣにより媒介される骨・脂肪の再生および血管新生の促進に関する臨床治験が進行中である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００４】
ＡＳＣは、強力な増殖因子とサイトカインを分泌するだけでなく、その分泌した増殖因子やサイトカインからも影響を受ける。線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）は、ＡＳＣの増殖を刺激し、そして、その自己再生の維持に寄与する（非特許文献１３）。ＦＧＦ−２は、ＡＳＣの脂肪生成性（非特許文献１４）、および、軟骨形成性（非特許文献１５）の分化を促進するが、骨形成性の分化は阻害することが示されている（非特許文献１６）。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、ＡＳＣの増殖および移動を誘導する（非特許文献１７）。ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびインシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含有する培養培地は、ＡＳＣの増殖を顕著に加速し、そして、その多能性を保存した（非特許文献１８）。このことは、ＡＳＣ増殖に対するこれらの増殖因子の間での相乗作用を示唆する。
【０００５】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、増殖因子による細胞調節の多くの面に関与する、重要なシグナル伝達系の酵素である（非特許文献１９）。ＭＡＰＫの中でも、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）は、ＦＧＦ−２により媒介されるＡＳＣの自己再生に部分的に関与し（非特許文献１３）、そして、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、ＰＤＧＦにより誘導されるＡＳＣの増殖および移動において重要な役割を果たす（非特許文献１７）ことが報告されている。また、ＡＳＣが、ｐ３８ ＭＡＰＫ依存性の機構により、腫瘍壊死因子αに応答して、ＶＥＧＦ、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を産生することを示す研究もある（非特許文献２０）。
【０００６】
本研究において、本発明者らは、ＡＳＣに対する、障害関連増殖因子の影響を評価した。損傷およびその後の創傷治癒の過程で、種々の増殖因子および炎症性サイトカインが、細胞の再生活性を調節する。本発明者らは、以前に、脂肪吸引手術後の創傷流体を解析し、そして、それに続く増殖因子の発現を報告した：ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、創傷治癒の早期段階において放出され、一方で、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、後期段階において発現された（非特許文献２１）。増殖因子の投与は、熱傷に対してのＦＧＦ−２（非特許文献２２、および心筋梗塞に対してのＨＧＦ（非特許文献２３）などのように、損傷を受けた組織の再生を促進することが報告されている。しかし、おそらく、脂肪組織障害の良好なモデルが存在しないために、脂肪組織における損傷および修復の過程と、ＡＳＣの潜在的な役割について焦点を当てた研究はほとんどない。そして、これらの文献は、（１）術後ドレーンを解析したのみであり各ＧＦ量変化のメカニズムやパラクライン的な作用についてはなし（２）ＡＳＣの遺伝子発現等についてはデータなし（３）ＡＳＣがＨＧＦを分泌するとは結論していないなどの欠点が存在する。
【０００７】
上記のように、皮膚（ケロイドや肥厚性瘢痕），肝臓（肝硬変），肺（肺線維症），心臓（心筋梗塞後）など，身体の様々な部位において線維性病変は起こりうるが，線維性病変に対する効果的な治療法は存在しないのが現状であった。抗線維化作用のある物質としては肝細胞増殖因子（以下HGF）が知られていたが，血中半減期が非常に短く，これを持続的・効果的に生体に投与する方法は実用化されていなかった。また，脂肪由来幹細胞を用いた治療自体は，脂肪注入術と組み合わせた方法が組織増大を目的に行われているが，線維性病変に対する治療としては行われていなかった。
【非特許文献１】Zuk P.A., Zhu M.,Ashjian P. et al. 「Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells」MolBiol Cell 2002; 13: 4279-4295
【非特許文献２】Rehman J., Traktuev D., Li J. et al. 「Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adiposestromal cells」Circulation 2004; 109: 1292-1298
【非特許文献３】Kilroy G.E.,Foster S.J., Wu X. et al. 「Cytokine profile of human adipose-derived stemcells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors」JCell Physiol 2007; 212: 702-709
【非特許文献４】Nakagami H.,Maeda K., Morishita R. et al. 「Novel autologous cell therapy in ischemic limbdisease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derivedstromal cells」Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25: 2542-2547
【非特許文献５】Planat-BenardV., Silvestre J.S., Cousin B. et al. 「Plasticity of human adipose lineage cellstoward endothelial cells: Physiological and therapeutic perspectives」Circulation2004; 109: 656-663
【非特許文献６】Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. 「Improvement of postnatalneovascularization by human adipose tissue-derived stem cells」Circulation 2004;110: 349-355
【非特許文献７】Miyahara Y.,Nagaya N, Kataoka M. et al. 「Monolayered mesenchymal stem cells repair scarredmyocardium after myocardial infarction」Nat Med 2006; 12: 459-465
【非特許文献８】Rodriguez A.M,Pisani D., Dechesne C.A. et al. 「Transplantation of a multipotent cellpopulation from human adipose tissue induces dystrophin expression in theimmunocompetent mdx mouse」J Exp Med 2005; 201: 1397-1405
【非特許文献９】Matsumoto D.,Sato K., Gonda K. et al. 「Cell-assisted lipotransfer: supportive use of humanadipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection」TissueEng 2006; 12: 3375-3382
【非特許文献１０】Lendeckel S.,Jodicke A., Christophis P. et al. 「Autologous stem cells (adipose) and fibringlue used to treat widespread traumatic calvarial defects: case report」JCraniomaxillofac Surg 2004; 32: 370-373
【非特許文献１１】Garcia-Olmo D.,Garcia-Arranz M., Herreros D. et al. 「A phase I clinical trial of the treatmentof Crohn’s fistula by adipose mesenchymal stem cell transplantation」Dis ColonRectum 2005; 48: 1416-1423
【非特許文献１２】Yoshimura K.,Sato K., Aoi N. et al. 「Cell-assisted lipotransfer (CAL) for cosmetic breastaugmentation -supportive use of adipose-derived stem/stromal cells-」AestheticPlast Surg 2008; 32: 48-55
【非特許文献１３】Zaragosi L.E.,Aihaud G., Dani C. 「Autocrine fibroblast growth factor 2 signaling is criticalfor self-renewal of human multipotent adipose-derived stem cells」Stem Cells2006; 24: 2412-2419
【非特許文献１４】Kakudo N.,Shimotsuma A., Kusumoto K. 「Fibroblast growth factor-2 stimulates adipogenicdifferentiation of human adipose-derived stem cells」Biochem Biophys Res Commun2007; 359: 239-244
【非特許文献１５】Chiou M., Xu Y.,Longaker M.T. 「Mitogenic and chondrogenic effects of fibroblast growth factor-2in adipose-derived mesenchymal cells」Biochem Biophys Res Commun 2006; 343:644-652
【非特許文献１６】Quarto N.,Longaker M.T. 「FGF-2 inhibits osteogenesis in mouse adipose tissuederivedstromal cells and sustains their proliferative and osteogenic potential state」TissueEng 2006; 12: 1-14
【非特許文献１７】Kang Y.J., JeonE.S., Song H.Y. et al. 「Role of c-Jun N-terminal kinase in the PDGFinducedproliferation and migration of human adipose tissue-derived mesenchymal stemcells」J Cell Biochem 2005; 95: 1135-1145
【非特許文献１８】Suga H.,Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Rapid expansion of human adiposederivedstromal cells preserving multipotency」Cytotherapy 2007; 9: 738-745
【非特許文献１９】Chang L., KarinM. 「Mammalian MAP kinase signaling cascades」Nature 2001; 410: 37-40
【非特許文献２０】Wang M.,Crisostomo PR., Herring C. et al. 「Human progenitor cells from bone marrow oradipose tissue produce VEGF, HGF, and IGF-1 in response to TNF by a p38MAPK-dependent mechanism」Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2006; 291:R880-R884
【非特許文献２１】Aiba-Kojima E.,Tsuno N.H., Inoue K. et al. 「Characterization of wound drainage fluids as asource of soluble factors associated with wound healing: Comparison withplatelet-rich plasma and potential use in cell culture」Wound Repair Regen 2007;15: 511-520
【非特許文献２２】Akita S., AkinoK., Imaizumi T. et al. 「A basic fibroblast growth factor improved the qualityof skin grafting in burn patients」Burns 2005; 31: 855-858]
【非特許文献２３】Nakamura T.,Mizuno S., Matsumoto K. et al. 「Myocardial protection from ischemia/reperfusioninjury by endogeneous and exogenous HGF」J Clin Invest 2000; 106: 1511-1519
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまで治療が困難であった各種の線維性病変に対して，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ることを本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、脂肪由来幹細胞と特定のサイトカイン（たとえば、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下ＦＧＦ−２ともいう））を組み合わせた方法を用い，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ることにより解決された。
【００１０】
詳細には、本発明者らは、損傷を受けた組織から放出された因子によって刺激されたＡＳＣが、おそらくは、再生関連増殖因子を分泌することによって、または、脂肪細胞、内皮細胞もしくは他の細胞型へと分化することによって、脂肪組織の修復過程において重要な役割を果たすと仮定した。本発明者らは、インビトロにおけるヒトおよびマウスのＡＳＣに対する、損傷関連因子の影響および機構を検討した。さらに、本発明者らは、再生過程の間のＡＳＣの役割を説明するために、脂肪組織に対する虚血再灌流障害の最初のマウスモデルを用いて、細胞レベルおよび分子レベルにおける損傷関連増殖因子の発現を評価した。
【００１１】
その結果、本発明により、線維性病変が顕著に治癒することが明らかになった。
【００１２】
本発明者らの研究により，脂肪由来幹細胞を培養する際にＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインを添加すると，増殖が促進されるのみならず，ＨＧＦの分泌が促進されることが判明した。この作用は、とくにＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインの刺激を長期的に投与した場合に特に顕著に見られた。また，マウス脂肪組織の創傷モデルを用いた実験により，通常の創傷治癒過程でもＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインによって脂肪由来幹細胞からのＨＧＦ分泌が亢進しており，これが治癒過程での線維化を抑制しているということが明らかになった。
【００１３】
したがって，本発明では、線維性病変に対する以下のような治療法が可能であることになる。
【００１４】
患者から採取した脂肪組織をコラゲナーゼで分解し，遠心処理を行うことにより，脂肪由来幹細胞を抽出する。この細胞をＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインとともに線維性病変部に投与し，脂肪由来幹細胞からのＨＧＦ分泌を亢進させ，ＨＧＦの線維化抑制作用による病変部の改善を図る。
【００１５】
別の実施形態では、本発明では、創傷時に発現が見られる代表的な増殖因子（ＶＥＧＦ，ＦＧＦ−２，ＨＧＦ，ＰＤＧＦ）によるＡＳＣの細胞増殖および自らの増殖因子分泌に対する影響を調べた。さらに、影響を持つ増殖因子のシグナル伝達系を同定するための阻害実験を行った。また、脂肪組織の創傷（虚血再潅流障害）モデル（マウス）を確立し、創傷治癒過程における増殖因子の発現および組織内の変化を検討した。
【００１６】
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは濃度依存的にＡＳＣの増殖を促進した。また、ＦＧＦ−２により、ＡＳＣからのＨＧＦ分泌がｍＲＮＡおよび蛋白レベルで著明に促進された。このＦＧＦ−２による細胞増殖およびＨＧＦ分泌の促進は、ＪＮＫ阻害剤によって最も抑制された。虚血再潅流障害脂肪組織においては、直後からＦＧＦ−２の蛋白発現が見られ、引き続きＨＧＦのｍＲＮＡおよび蛋白発現が上昇した。また、このＨＧＦの発現はＪＮＫ阻害剤によって抑制され、さらにその抑制により治癒後の線維化が増すことが示された。
【００１７】
ＡＳＣは、創傷時に周囲の細胞外マトリックスから大量に放出されるＦＧＦ−２に刺激を受け、主にＪＮＫの経路を介して細胞増殖およびＨＧＦ分泌を促進し、創傷治癒過程における血管新生、線維化抑制において重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００１８】
本発明は、線維化抑制作用のあるＨＧＦを生体に持続的・効果的に投与する手段として脂肪由来幹細胞を用いること，特に，ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインによる刺激を加えてＨＧＦ分泌を促進させた状態で投与すること、およびＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインの徐放製剤とともに脂肪由来幹細胞を投与することを意図する。
【００１９】
したがって、本発明は、以下を提供する。
【００２０】
１つの局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤を提供する。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明の治療剤または予防剤は、線維性病変を処置または予防するためのものである。
【００２２】
１つの実施形態において、この線維性病変は、慢性炎症時のものである。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明において用いられるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。
【００２４】
別の局面では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。
【００２５】
この生産方法において好ましい実施形態では、本発明において用いられるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。
【００２６】
別の局面では、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。
【００２７】
さらに別の局面では、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。
【００２８】
なおさらなる別の局面では、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。
【００２９】
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
【発明の効果】
【００３０】
ＨＧＦには線維化抑制作用があることは以前から知られている。ＦＧＦ−２によってＨＧＦ分泌が促進された脂肪由来幹細胞を投与することにより，線維性病変部でＨＧＦが持続的，効果的に作用することが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３２】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００３３】
用語「細胞」は、当該分野におけるその最も広義の意味で本明細書において使用され、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有し、そして細胞のような生物体を外界から隔離する膜構造に包まれる、多細胞生物の組織の構成単位をいう。本発明の方法において、任意の細胞が対象として使用され得る。本発明で使用される細胞の数は、光学顕微鏡により計数することができる。光学顕微鏡を使用して計数する場合は、核の数が計数される。組織を組織切片スライスとし、次いでヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色し、細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を識別する。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であってもよい。細胞の供給源の例としては、単一の細胞培養物；正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織；あるいは正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるが、それらに限定されない。このような供給源自体が、細胞として使用され得る。
【００３４】
本明細書において使用される脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）およびそれに対応する物質は、生物が脂肪細胞またはそれに対応する細胞を有しさえすれば、任意の生物（例えば、哺乳動物など）、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）に由来し得る。１つの実施形態において、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「幹細胞」とは、単分化能性、多能性、または全能性を有する、分化細胞の前駆体（または前駆細胞）をいう。幹細胞は、特定の刺激に応答して分化され得る。代表的に、幹細胞は、損傷された組織を再生することができる。本明細書で使用される幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、あるいは他の前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。上述の能力を有している限り、幹細胞は、人工的に作製した細胞（例えば、融合細胞、再プログラム化された細胞など）であってもよい。胚性幹細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、相対的に限定されたレベルの分化能を有する。組織幹細胞は、組織中に存在し、未分化な細胞内構造を有する。組織幹細胞は、より高い核／細胞質比を有し、そしてわずかな細胞内オルガネラを有する。ほとんどの組織幹細胞は、多能性を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合、脂肪由来幹細胞も使用され得る。
【００３６】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「前駆細胞」とは、子孫にあたる細胞が特定の分化形質を発現することが明らかな場合、分化形質を発現していない未分化な親細胞をいい、多能性未分化細胞だけでなく単分化能性未分化細胞も含む。例えば、子孫にあたる細胞が、血管内皮細胞である場合、その前駆細胞を血管内皮前駆細胞という。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。しかし、幹細胞の分化により得られる前駆細胞は、その幹細胞から見ると「分化細胞」に対応するということができる。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」または「ＬＡＦ」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。
【００３８】
いわゆる吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）（脂肪吸引物の脂肪部分）から単離された細胞は、回収した起源にちなんでＰＬＡ（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）細胞と呼ばれている（例えば、Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２００２；１３：４２７９−４２９５）。そこで、本明細書中でも同様に、脂肪吸引物の脂肪部分から単離した細胞を、ＰＬＡ細胞という。また、本明細書中、脂肪吸引物の液体部分から単離された細胞を、ＬＡＦ（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ ａｓｐｉｒａｔｅ ｆｌｕｉｄ：脂肪吸引物液）細胞という。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪由来前駆細胞」、「脂肪由来幹細胞」および「脂肪由来幹／間質細胞」は、交換可能に使用される用語であり、本明細書では、「ASC」と省略され、脂肪吸引より得られた、幹細胞および前駆細胞をいう。ここでいう前駆細胞は、この脂肪吸引により得られた、末梢血由来の幹細胞または血管間質細胞（脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ））のようなものである。脂肪由来前駆細胞は、脂肪組織または脂肪吸引法により得られた任意の多能性前駆細胞または単分化能性前駆細胞の集団を意味する。この細胞としては、脂肪由来血管間質細胞（＝脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、脂肪由来間質細胞）、脂肪由来幹細胞、脂肪幹細胞、内皮前駆細胞、造血性幹細胞などが挙げられる。このような幹細胞を単離するためのいくつかの技術が、例えば、Ｎａｋａｔｓｕｊｉら「幹細胞研究プロトコール［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ／Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ］」、Ｙｏｄｏｓｈａ（２００１）；ＷＯ００／５３７９５；ＷＯ０３／０２２９８８；ＷＯ０１／６２９０１に記載されるように知られている。これらの文献は、その関連部分において、参考として本明細書中に援用される。本明細書中において使用される場合、ASCとは、これらの公知な単離方法により得られた脂肪組織由来幹細胞を含む、全ての脂肪組織由来幹細胞をいう。本明細書中で使用される場合、「前駆細胞」は、多能性未分化細胞だけでなく、単分化能性未分化細胞も含む。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。
【００４０】
語句「脂肪吸引由来物質」とは、脂肪吸引が行われた際に生成する任意の物質をいう。代表的に、このような脂肪吸引由来物質は、脂肪組織および脂肪吸引物を含む。
【００４１】
語句「脂肪吸引物」とは、脂肪吸引が行われる際に生成する液体をいう。このような脂肪吸引物は、以下：（１）脂肪吸引時に一緒に吸引された液体（例えば、トゥメセント液および血液を含む）または、（２）吸引脂肪を溶液（例えば、生理食塩水）で洗浄する際に生じた廃液、をいう。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）」とは、組織間に位置されるか、あるいは、疎性結合組織または毛細血管周辺の一群として脂肪組織を形成し、そして大量の脂質を含む細胞をいう。脂肪細胞（Ｆａｔ Ｃｅｌｌ）としては、黄色脂肪細胞（ｙｅｌｌｏｗ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）または褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）が挙げられる。これらの細胞は、本明細書中において等価に使用され得る。細胞内の脂肪は、スダンＩＩＩ（Ｓｕｄａｎ ＩＩＩ）または四酸化オスミウムを用いて容易に検出され得る。
【００４３】
本明細書において「線維芽細胞増殖因子」または「繊維芽細胞増殖因子」（ＦＧＦ）とは、中胚葉と神経外胚葉から発生した幅広い細胞の増殖を促進する因子のファミリーであり、具体的には、ＦＧＦ−１ （酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）、ｉｎｔ−２（ＦＧＦ−３）、ｈｓｔ−１（ＦＧＦ−４）、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ−２（ＦＧＦ−６）、ＫＧＦ （ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ−７）、ＦＧＦ−８（ＡＩＧＦ；ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−９（ＧＡＦ；Ｇｌｉａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）などの２０種類以上の分子が含まれる。なお、後述する実施例では、これらＦＧＦのなかでも、ＦＧＦ−２を用いているが、これに限定されるものではなく、他のＦＧＦも適宜用いることができる。なお、ＦＧＦの濃度等は、当業者であれば適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、特に、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４４】
本明細書において「塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）」または「塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）」とは、代表的にアクセッション番号NM_002006（ヒト）で示される配列を有するものをいう。
【００４５】
本明細書において「血小板由来増殖因子」（ＰＤＧＦ）とは、血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす哺乳動物血小板由来増殖因子を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦ−Ａを含むＰＤＧＦの様々なサブタイプを包含する。さらに、ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、コグネイトＰＤＧＦ受容体を通して血管新生又は血管新生過程を刺激するように働く、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−ＤなどのＰＤＧＦ関連血管新生因子を指す。特に、「ＰＤＧＦ」という用語は、（ｉ）ＰＤＧＦＲ−Ｂ又はＰＤＧＦＲ−ＡなどのＰＤＧＦ受容体に結合する；（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化する；及び（ｉｉｉ）これによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす、増殖因子のクラスの成員を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、一般に、応答性細胞型上の血小板由来増殖因子細胞表面受容体（すなわちＰＤＧＦＲ）の結合及び活性化を通してＤＮＡ合成及び有糸分裂誘発を誘導する増殖因子のクラスの成員を指す。ＰＤＧＦは、例えば：定方向細胞遊走（走化性）及び細胞活性化；ホスホリパーゼ活性化；ホスファチジルイノシトール代謝回転及びプロスタグランジン代謝の上昇；応答性細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼ合成の刺激；マトリックス合成、サイトカイン産生及びリポタンパク質取込みを含む細胞代謝活性の変調；間接的に、ＰＤＧＦ受容体を持たない細胞における増殖応答の誘導；及び強力な血管収縮剤作用を含む、特異的生物作用を生じさせる。「ＰＤＧＦ」という用語は、「ＰＤＧＦ」ポリペプチド及びこの対応する「ＰＤＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を包含することが意図されている。
【００４６】
本明細書において「肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）」とは、劇症肝炎患者の血清から見出されたサイトカインで、分子量が約10万のタンパク質であり、その生理作用は非常に広く、肝硬変やアルコール肝炎の治療、糖尿病に起因する虚血性疾患の治療などにも用いられている。ここで使用する、「ＨＧＦ」という用語は、様々なサブタイプを包含する。代表的にアクセッション番号NM_010427（ヒト）で示される配列を有するものをいう
本明細書において使用される「増殖刺激剤」とは、細胞の増殖を正の方向に加速する任意の因子（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子など）をいう。標的が脂肪由来幹細胞であれば、脂肪由来幹細胞増殖刺激剤という。
【００４７】
以上に記載したサイトカイン類は、必要に応じて、GenBankなどから遺伝子の情報（アクセッション番号）を入手して、生産し、またはプローブなどの調製を行うことができる。そのようなアクセッション番号の例としては、上記のほか、実施例において引用したものを挙げることができる。
【００４８】
本明細書において使用される「生産刺激剤」とは、任意の生産物の生産を正の方向に加速する任意の因子（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子など）をいう。標的が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）であれば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤という。
【００４９】
本明細書において、細胞を培養する際に用いることができる培地は、通常の細胞培養用の培地を用いることができ、その具体的な組成等は限定されるものではない。例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）やＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地に、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものを用いることができる。この際、必要に応じて、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合してもよい。なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。さらに、本発明において、培地中にトランスフェリン、インスリン、セレン酸、及びリノール酸からなる群より選択される１種又は２種以上の添加剤を添加することにより、培地中の血清濃度が低い場合でも、通常の血清の使用量と同等若しくはそれ以上の増殖効果を得ることができる。
【００５０】
本明細書において「線維性病変」または「繊維性病変」とは、線維が変性する任意の病変を言う。代表的には、線維性病変としては、慢性関節リウマチ、肺線維症、肝硬変、腎硬化症、心筋梗塞、皮膚筋炎、SLE（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群、強皮症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自己免疫性肝炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化、ASO（閉塞性動脈硬化症）、バージャー病などをあげることができるが、これに限定されない。
【００５１】
本明細書において使用される虚血還流は、線維化形成のモデルでありうる。そして、このような虚血還流の実験は、本明細書中実施例において例証されている。
【００５２】
本明細書において使用される「慢性炎症」とは、あらゆる臓器、組織でおこりうる慢性の炎症一般を指し、たとえば、阻血、感染（微生物）、自己免疫反応（これは非常に多く範囲も広い）、アレルギー、膠原病、リウマチ、毒性物質への暴露（アスベスト、ヒ素、異物など）、毒性物質への暴露（アスベスト、ヒ素など）、動脈硬化などで起こる炎症であり、広く予防、処置が期待されるものである。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「診断、予防、処置または予後のために有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技術を用いて種々のパラメータを参酌することにより、当業者により決定され得る。
【００５４】
本発明が医薬として使用される場合、その医薬は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。当該分野において公知な任意の薬学的に受容可能なキャリアが、本発明の医薬において使用され得る。
【００５５】
薬学的に受容可能なキャリアまたは適切な処方材料としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、および／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞および他の活性成分を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般に使用される他の物質を補充することが可能である。
【００５６】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくはレシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして好ましくは、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
適切なキャリアの例としては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤が、所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらはさらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００５８】
本発明の医薬組成物の一般的な調製法を以下に記載する。動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物なども、公知の技術により製造することができる。
【００５９】
本発明の細胞などは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと配合され、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊インヒビター、吸収促進剤、吸収剤、保湿剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物も、必要に応じて使用され得る。本発明の組成物は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合され得る。非経口の投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。全身投与される場合、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当該技術の範囲内である。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤をさらに含み得る。
【００６１】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。頻度の例としては、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）が挙げられる。好ましくは、投与は、経過を見ながら１週間〜１ヶ月に１回施される。投薬量は、処置される部位が必要とする量を見積もることによって、確定され得る。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「指示書」は、医薬を投与する方法または診断のための方法などを、医師、患者など投与を行う人または投与される人、診断する人（例えば、医師、患者など）または診断される人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与するための適切な方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供される。この指示書は、これに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供される電子媒体（例えば、ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００６３】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用可能なアッセイもしくは機器を使用する標準的な臨床検査の結果または意図される処置に関連する疾患（例えば、創傷など）に特徴的な臨床症状の消滅あるいは美容状態の回復（例えば、外見の回復など）によって支持され得る。治療は、疾患（例えば、創傷）の再発または美容状態の損傷により再開され得る。
【００６４】
本発明はまた、１つ以上の医薬組成物を満たした１つ以上の容器を備える医薬品パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属され得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。このキットは、注射用デバイスを備え得る。
【００６５】
（脂肪由来幹細胞）
脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞は、脂肪吸引物の液体部分（脂肪吸引液）から、例えば以下のように調製することができる。処理方法（１）脂肪組織と等量の０．０７５％コラゲナーゼを加え３７℃で３０分酵素処理する（２）処理後に８００Ｇ×１０分遠心する（３）上層を除去し、沈殿した細胞にＰＢＳを加え、１００μｍポアフィルターを通す（４）フィルターを通った細胞を回収する。（より詳細な条件は、文献Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ ７：２１１−２２８（２００１）、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０８：６４−７６（２００６）などに記載されており、これらを参酌して当業者は脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞を調製することができる。）
脂肪吸引方法は、当業者に周知である技術を用いて、実施することができる。脂肪吸引方法に用いられる装置としては、ケイセイ脱脂吸引機サルポンプＳＡＬ ７６−Ａ（ケイセイ医科工業（株）、東京都文京区本郷３−１９−６）が挙げられるが、これらに限定されない。例えばヒトの場合、０．０００１％アドレナリン入り生理食塩水などの液体を、予定吸引脂肪量の等量から２倍量、脂肪組織内に注入し、その後、内径２〜３ｍｍのカニューレ（金属製吸引管）を用いて、−２５０〜９００ｍｍＨｇ程度の陰圧で吸引することによって行う。
【００６６】
吸引した脂肪細胞を洗浄するために使用される液体として通常は、生理食塩水が用いられる。しかし、生理食塩水以外にも、単離すべき幹細胞に悪影響を与えない液体であれば、任意の液体が使用可能である。具体的には、例えば、リンゲル液、および哺乳動物培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、およびＭＣＤＢ１５３など）のような、任意の等張液が、本発明において使用可能である。
【００６７】
脂肪吸引物から幹細胞を調製する場合、必要に応じて、脂肪吸引物にコラゲナーゼなどの酵素処理を行なうことが可能である。しかし、脂肪吸引物中に含まれるコラーゲンの量は、脂肪組織と比較して相対的に少ないため、幹細胞調製の原料として脂肪吸引物を用いる場合、コラゲナーゼ処理に必要とされる時間、および／または酵素処理に必要とされる酵素量が、脂肪組織の場合よりも、相対的に低い。
【００６８】
脂肪吸引物を遠心分離して細胞画分を得る工程においては、細胞画分と、その他の成分（例えば、血漿、手術時に注入した生理食塩水、麻酔薬、止血薬、破壊された脂肪細胞から漏出した脂質成分）とを分離する任意の条件を用いることができる。例えば、４００〜８００×ｇでの５〜１５分程度の遠心分離を用いることが可能である。
【００６９】
比重による遠心分離により細胞を単離する工程においては、例えば単離された細胞画分を、密度勾配遠心分離にかけることができる。任意の密度勾配遠心分離のために使用可能な媒体が、この媒体として使用され得る。好ましい媒体は、１．０７６〜１．０７８ｇ／ｍｌの比重を有し得る。さらに、好ましい媒体のｐＨは、４．５と７．５との間である。媒体中の好ましいエンドトキシンレベルは、０．１２ＥＵ／ｍｌ以下である。代表的な媒体としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンとの共重合物）、およびパーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられる。フィコールは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク株式会社、東京）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東京）などの名称で市販されている。パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東京）という名称で市販されている。
【００７０】
比重による遠心分離の条件は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを媒体として用いる場合、４００×ｇ、３０〜４０分が用いられ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を媒体として用いる場合、３７０ｃｇ、約３０分が用いられる。リンフォプレップを媒体として用いる場合、条件としては８００×ｇ、約２０分または１１００×ｇ、約１０分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
比重による遠心分離が用いられるときに、最も多い細胞は、通常赤血球細胞であり、赤色の細胞層として確認することができる。幹細胞は、赤血球よりも比重が軽いため、幹細胞を分離する場合には、赤血球よりも軽い細胞層を収集する。好ましくは、比重１．０５０〜１．０７５の範囲の細胞層を収集する。
【００７２】
おおまかな細胞の比重は、パーコール、レディグラッドのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液やスクロース溶液で調製し、収集した細胞と共にデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｒｋｅｒ ｂｅａｄｓ）を加えて遠心し、ビーズによって分けられた５〜１０層のうち、どの層に細胞があるかを確認することで、試験され得る。
【００７３】
さらに、層に分離した細胞の回収は、例えば、ピペットを用いて行なうことができる。
【００７４】
比重による遠心分離においては、セルセパレーター（例えば、血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ）を使用することが可能である。
【００７５】
細胞が脂肪組織から分離される条件は、細胞が脂肪組織から分離され、かつ細胞の単離を促進する条件であり得る。このような条件としては、例えば、Ｗａｋｏより入手可能なコラゲナーゼ（細胞分散のためのコラゲナーゼ、０３２−１０５３４）を添加するような、細胞外マトリクスの分解が挙げられるが、これに限定されない。このようなコラゲナーゼは、濃度０．０７５％にてＰＢＳ中に溶解し、この溶液を３７℃まで温めて脂肪と等量を添加する。そのサンプルを３７℃にて８０ｒｐｍで３０分間攪拌するために、アジテーターが使用される。
【００７６】
好ましくは、本発明の方法は、高度の幹細胞純度を達成するために、血球細胞を除去する工程をさらに包含する。しかし、このような血球細胞は、続いてディッシュ上で培養し、この細胞集団を継代し、８０％を超える（好ましくは、９０％を超える）幹細胞を生じさせることにより除去され得る。このような血球細胞は、血球細胞を分解する成分を添加する工程を包含する血球除去工程により、除去され得る。
【００７７】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態が説明される。以下の実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。本明細書中を参酌して、本発明の範囲を逸脱することなく、変更および修正を行い得ることが、当業者に明らかに理解される。
【００７８】
本発明者らは、ヒトおよびマウスの脂肪由来幹細胞／間質細胞（ＡＳＣ）に対する障害関連増殖因子の作用を分析し、ＦＧＦ−２が、ＪＮＫシグナル伝達経路を介してＡＳＣによるＨＧＦ分泌を誘導すること、そして、アップレギュレートされたＨＧＦの産生が、損傷を受けた脂肪組織における線維化を防ぐ助けとなることを見出した。
【００７９】
本発明者らの結果は、損傷後の脂肪組織修復においてＡＳＣが主要な増殖細胞集団として重要な役割を果たすことを示した。ＦＧＦ−２−ＪＮＫ−ＨＧＦ機構を通じて、ＡＳＣは、損傷後に、線維化を防ぎ、脂肪組織の体積を維持し、そして、脂肪組織の機能を向上する助けとなる。
【００８０】
本発明者らは、脂肪の損傷および修復についての新規動物モデルを開発および使用した。この動物モデルは、脂肪細胞および毛細管の再構築を伴う脂肪組織の損傷および再生の再現性のある結果を提供し、この全ては、２週間以内に完了した。
【００８１】
本研究の結果は、損傷応答におけるＡＳＣについての新しい役割を明らかにし、そして、ＡＳＣの治療上の可能性に新しい見通しを提供した。ＡＳＣを用いた細胞治療は、特に、ＦＧＦ−２で前処理をするか、または、ＦＧＦ−２と組み合わせたとき、組織の修復を加速し、線維化を減らし、そして、ＨＧＦの作用によって急性または慢性の炎症により損ねられた臓器の機能を改善し、同様に、自家脂肪移植片の活着を改善する。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明者らは、脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの役割に焦点を当て、そして、損傷に関連する増殖因子の中でも、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増殖とＨＧＦ分泌を強く促進したことを見出した。脂肪組織の虚血再潅流障害のマウスモデルにおいて、壊死性およびアポトーシス性の変化に続く再生性の変化が２週間にわたり見られた。損傷を受けた脂肪組織によるＦＧＦ−２の短時間の放出の後、ＨＧＦのアップレギュレーションが続いた。脂肪組織の再構築過程の間に、ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は、ＣＤ３４＋であり、そして、ＡＳＣではないかと疑われた。ＪＮＫシグナル伝達の阻害は、ＡＳＣの増殖と移動を阻害し、そして、再構築過程の進行を妨げた。さらに、ＦＧＦ−２またはＪＮＫシグナル伝達の阻害は、損傷後のＨＧＦのアップレギュレーションを妨げ、そして、損傷を受けた脂肪組織における線維化の増加をもたらした。線維化の増加はまた、ＨＧＦに対する中和抗体の投与の後にも起こった。
【００８３】
したがって、結論として、損傷を受けた組織から放出されるＦＧＦ−２は、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣを刺激して増殖させ、そしてＨＧＦを分泌するように機能し、損傷後の脂肪組織の再生と線維化抑制に寄与する。本研究は、損傷に対する応答におけるＡＳＣについての機能的な役割を明らかにし、そして、ＡＳＣの治療的な可能性に、新しい見通しを提供することができる。
【００８４】
（治療剤および予防剤）
１つの局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤を提供する。
【００８５】
本発明の治療剤または予防剤は、従来の技術に比べて、以下の点で顕著な効果を奏する。理論に束縛されることを望まないが、たとえば、本発明の治療剤または予防剤は、従来のものに比べて、線維性病変を効率的に治療する、より効果的に線維化を予防する、より効果的に血管新生を促進する、より効果的に組織の再生・正常なターンオーバーを促進するなどの効果を奏する。また、本発明において細胞を用いることにより、持続的かつ安全なＨＧＦの分泌（投与）が実現できるという利点もある。
【００８６】
特に、本発明の脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤は、線維性病変を処置または予防するために使用されることが本発明において実証された。
【００８７】
ここで、本発明によって治療または予防されうる「線維性病変」としては、たとえば、性関節リウマチ、肺線維症、肝硬変、腎硬化症、心筋梗塞、皮膚筋炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群、強皮症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自己免疫性肝炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化、ＡＳＯ（閉塞性動脈硬化症）、バージャー病などを挙げることができるが、これらに限定されない。線維性の病変の改善が所望される任意の疾患が本発明の対象であるというべきである。
【００８８】
１つの実施形態では、特に、本発明が標的とする線維性病変は、慢性炎症時のものである。慢性炎症時のものの処置については、従来有効な処置法が提供されているとはいいがたく、よりよい治療・予防剤の提供が望まれていた。そこで、本発明の治療剤または予防剤は、従来の技術に比べて、以下の点で顕著な効果を奏する。理論に束縛されることを望まないが、形質転換されていない細胞が分泌するものであるため副作用が小さいと考えられることから、慢性炎症が従来に増して抑制されることが期待される。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦ−２が好ましい理由としては、たとえば、ＦＧＦ−２はすでに医薬品として承認されており、その安全性についての情報が十分であること（科研製薬から販売されているものを使用することができる。）、また、徐放化製剤の治験も行われており、将来的に使用が容易になることが予想されること、形質転換されていない自己の細胞を使うことにより、その安全性が高いと思われること、他の因子の分泌など付随した利益が期待できることなど、種々の有利な点が存在する。
【００９０】
（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。この生産方法では、驚くべきことに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養することによって、予想外にＨＧＦの生産が促進された。また、従来の文献（たとえば、非特許文献１７、２１など）でも、術後ドレーンを解析したのみであり各ＧＦ量変化のメカニズムやパラクライン的な作用については記載はなく、ＡＳＣの遺伝子発現等についてはデータがなく、ＡＳＣがＨＧＦを分泌することはなんら記載も示唆もしていない。したがって、本発明のＨＧＦ生産刺激剤としての効果は、予想外であったといえる。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦ−２がＨＧＦ生産を促進することが予想外であった理由は、以下のとおりである：従来技術で想定されていたものより、本発明のものはその分泌能が非常に高く、その分泌能がｂＦＧＦを継続的に投与した場合に特に飛躍的に高い分泌能が見られることは通常他の因子や細胞においても稀にしか見られないことから、従来のＨＧＦ生産技術から飛躍的な効果が期待される。また、本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９１】
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。
【００９２】
本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９３】
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦが脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激することが予想外であった理由は、以下のとおりである：ＨＧＦが分泌されることは予想外ではないが、その分泌能が非常に高く、その分泌能がｂＦＧＦを継続的に投与した場合に特に飛躍的に高い分泌能が見られることは通常他の因子や細胞においても稀にしか見られないことである。本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９４】
（脂肪由来幹細胞を用いる疾患または障害を治療または予防する方法）
別の局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。また、本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９５】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９６】
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ等から得ることができる。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、事前に同意（インフォームドコンセント）を得た上で実験を行った。
【００９７】
（実施例１：脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの効果）
本実施例では、脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの効果を実証した。
【００９８】
（材料および方法）
細胞の単離および培養
腹部または大腿部の脂肪吸引を受けた健康な女性ドナーからインフォームドコンセントを得た後に、倫理調査委員会により承認されたプロトコールを用いて、脂肪吸引術による吸引物をこれらのドナーから得た。ＡＳＣを、以前に記載されたようにして、吸引された脂肪から単離した（Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Characterization offreshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portionsof liposuction aspirates」J Cell Physiol 2006; 208: 64-76）。簡単に述べると、吸引された脂肪を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして、シェーカー上で、０．０７５％コラゲナーゼを含むＰＢＳ中、３７℃にて３０分間、消化した。遠心分離（８００×ｇ、１０分間）により、ペレットから成熟脂肪細胞と結合組織を分離した。細胞ペレットを再懸濁し、１００μｍメッシュを通してろ過し、そして、５×１０５の有核細胞／１０ｃｍシャーレの密度で播種し、そして、加湿空気中５％ ＣＯ２の雰囲気において、３７℃で培養した。培養培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）であった。始原細胞を７日間培養し、そして、「パッセージ０」として規定した。培地は、３日毎に交換した。細胞を、トリプシン処理により毎週継代した。パッセージ１〜３のヒトＡＳＣを実験に使用した。マウスＡＳＣを分離するために、６週齢の雄性ＩＣＲマウスの鼠径部の脂肪パッドから脂肪組織を得た。この脂肪組織を、２〜３ｍｍ角に細かく切り、そして、上記のように処理した。パッセージ１〜３のマウスＡＳＣを実験に使用した。ヒト真皮線維芽細胞（ｈＤＦ）を、別々のドナーからの皮膚サンプルの外植片から得た；パッセージ３〜５のｈＤＦを実験に使用した。パッセージ２で凍結された、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した；パッセージ３〜５のｈＢＭ−ＭＳＣを実験に使用した。
【００９９】
増殖アッセイ
ヒトＡＳＣを２×１０４細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。障害関連増殖因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦおよびＰＤＧＦ；全て、和光純薬製）の各々を、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度でコントロール培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）に加えた。細胞カウンター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒＴＭ，Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、培地中で３日後、６日後および９日後に、細胞数をカウントした。他の細胞型について、１０ｃｍシャーレに２×１０５細胞を播種し、そして、７日後に細胞数をカウントした。
【０１００】
フローサイトメトリー
１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に７日間培養したヒトＡＳＣを、フローサイトメトリーを用いて、表面マーカー発現について調べた。以下の蛍光色素結合化モノクローナル抗体を使用した：抗ＣＤ３１−ＰＥ、抗ＣＤ３４−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗Ｆｌｋ−１−ＰＥおよび抗Ｔｉｅ−２−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。細胞を、各抗体と共に３０分間インキュベートし、次いで、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ゲートは、問題とされる抗体と無関係の抗体との組み合わせを用いた染色に基づき、無関係の抗体を用いた場合に細胞の０．１％以下が陽性となるように設定した。
【０１０１】
定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
本発明者らは、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に培養したヒトＡＳＣからＲＮＡを単離した。他の細胞型については、ＲＮＡを、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ってか、または伴わずに培養した細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２μｇの総ＲＮＡを単離し、その後、逆転写反応を行った。本発明者らは、ＡＢＩ ７７００配列検出システム、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと、以下の予め設計されたプライマーおよびフルオレセイン標識プローブとを用いて、ｃＤＮＡを４０サイクル増幅した：ヒトＶＥＧＦ（Ｈｓ００９０００５４＿ｍ１）；ＦＧＦ−２（Ｈｓ００２６６６４５＿ｍ１）；ＨＧＦ（Ｈｓ００３００１５９＿ｍ１）；ＰＤＧＦ（Ｈｓ００２３４０４２＿ｍ１）；ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）；マウスＶＥＧＦ（Ｍｍ００４３７３０４＿ｍ１）；ＦＧＦ−２（Ｍｍ００４３３２８７＿ｍ１）；ＨＧＦ（Ｍｍ０１１３５１８２＿ｍ１）；およびＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１；全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製）。本発明者らは、ＧＡＰＤＨを内部参照遺伝子として用いて、相対的ＣＴ法により発現レベルを算出した。
【０１０２】
酵素結合免疫吸着定量法による、ＨＧＦタンパク質の定量
ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ってか、または伴わずに７２時間培養したヒトＡＳＣの馴化培地を、ヒトＨＧＦ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）についてのＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。データは、収穫の時点での１０６細胞あたりの分泌された因子として表した。
【０１０３】
ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害
３つのシグナル伝達経路の各々について１つの選択的なインヒビター（ＥＲＫインヒビターであるＵ０１２６、ｐ３８タンパク質インヒビターであるＳＢ２０２１９０、およびＪＮＫインヒビターであるＳＰ６００１２５；全て、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製）を１０μＭの濃度で、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に加え、そして、増殖アッセイおよびリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、増殖および遺伝子発現に対する作用を調べた。
【０１０４】
ＪＮＫ活性アッセイ
細胞ベースのＥＬＩＳＡキット（ＣＡＳＥＴＭ Ｋｉｔ，ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を製品説明書に従って使用して、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の程度によりＪＮＫの活性を測定した。簡単に述べると、ヒトＡＳＣを、１ウェルあたり２×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに播種し、そして、一晩静着させた。次いで、細胞を無血清培地中で２４時間養分を絶った。細胞をビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ）、Ｕ０１２６、ＳＢ２０２１９０またはＳＰ６００１２５と共に１５分間前処理した後、これらを、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）に１５分間曝露した。抗ホスホ−ｃ−Ｊｕｎ（セリン７３）抗体および抗汎Ｃ−Ｊｕｎ抗体を用いて、活性化された（リン酸化された）ｃ−Ｊｕｎタンパク質と、総ｃ−Ｊｕｎタンパク質の量を測定した。
【０１０５】
脂肪組織に対する虚血再潅流障害についてのマウスモデル
動物の世話は、施設のガイドラインに従った。６週齢のＩＣＲマウスを、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて麻酔し、そして、鼠径部領域に２ｃｍの切開をつくった。インタクトな大腿動脈から延びる栄養大動脈と共に、鼠径部皮下の脂肪パッドを持ち上げた。脂肪パッドから皮膚まで延びる細い交通枝を、電気凝固した。大動脈を、血管マイクロクリップで３時間にわたり締め付け、次いで、解放して再潅流させた。虚血再潅流障害後、種々の時間間隔（１日目、３日目、７日目および１４日目）で脂肪組織サンプルを採取し、そして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび組織学（ヘマトキシリン−エオジン染色、Ａｚａｎ染色など；以下を参照のこと）により調べた。擬似手術を行った動物（虚血再潅流なし）からの脂肪サンプルをコントロールサンプルとして使用した。
【０１０６】
インビボ阻害アッセイ
０．５μｌ／ｈの速度で液体を放出する浸透性ポンプ（Ｍｏｄｅｌ １００７Ｄ，ＡＬＺＥＴ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を用いて、約７日間にわたり、インヒビター溶液を注入した。１００μｌのＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５；１０μＭ）、ヤギ抗ＦＧＦ−２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５０μｇ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５０μｇ／ｍｌ）を含むポンプ、または、コントロールのＰＢＳを含むポンプを再潅流時に皮下に移植した。
【０１０７】
アポトーシスおよび増殖の組織学的検出
脂肪組織における虚血再潅流障害後のアポトーシスを検出するために、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼにより媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を行った。増殖細胞を検出するために、組織を採取する６時間前および３時間前に、１ｍｇの５−ブロモ−２−デキシウリジン（ＢｒｄＵ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内投与した。ＢｒｄＵ Ｉｎ−Ｓｉｔｕ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＢｒｄＵ陽性細胞を検出した。切片１枚あたり３つの無作為に選択した視野を用いて、ＴＵＮＥＬまたはＢｒｄＵ陽性細胞の数を、倍率２００×でカウントした。
【０１０８】
免疫組織化学
採取した脂肪組織サンプルを、亜鉛固定し（Ｚｉｎｃ Ｆｉｘａｔｉｖｅ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、そして、パラフィン包埋した。本発明者らは、６μｍ厚の切片を調製し、そして、以下の一次抗体を用いて免疫染色を行った：ヤギ抗ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＣＤ６８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ヤギ抗マウスＣＤ３４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびビオチン化マウス抗ＢｒｄＵ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた可視化のために、各一次抗体に適切なペルキシダーゼを結合した二次抗体（ニチレイ生化学Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、または、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。二重蛍光染色のために、以下の二次抗体または試薬を使用した：Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８を結合したウサギ抗ラットＩｇＧ、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８または５６８を結合したロバ抗ヤギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５６８を結合したストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【０１０９】
生存組織の画像化
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの手順を用いて、生存脂肪組織の可視化を行った（Nishimura S., Manabe I., NagasakiM. et al. 「Adipogenesis in obesity requires close interplay betweendifferentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes 2007; 56:1517-1526）。簡単に述べると、脂肪組織を３ｍｍ角に細かく切り、そして、以下の試薬とともに３０分間インキュベートした：脂肪細胞を染色するためのＢＯＤＩＰＹＴＭ ５５８／５６８またはＢＯＤＩＰＹＴＭ−ＦＬ（両方とも、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）、内皮細胞を染色するためのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８を結合したイソレクチンｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ−ＩＢ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、全核を染色するためのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（同仁堂Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、または、壊死細胞の核を染色するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。次いで、サンプルを洗浄し、そして、共焦点顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を用いて直接観察した。
【０１１０】
統計的解析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。２群間の比較は、Ｗｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。多群間の比較は、複数比較のための補正を行って、分散解析により行った。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。
【０１１１】
（結果）
ヒトＡＳＣ増殖に対する障害関連増殖因子の作用
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、濃度依存的にヒトＡＳＣの増殖を促進し、一方で、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、ＡＳＣの増殖を促進しなかった（図１Ａ）。形態学的には、ＦＧＦ−２と共に培養したＡＳＣは、他の増殖因子と共に培養したＡＳＣよりも小さかった（図１Ｂ）。
【０１１２】
ヒトＡＳＣに対する障害関連増殖因子の表現型による作用
フローサイトメトリーは、あらゆる障害関連増殖因子による内皮表面マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１およびＴｉｅ−２）の発現において有意な差は示さず、少なくともいかなる細胞外マトリックスもなしで培養した場合に、単一の因子の補充だけでは、ヒトＡＳＣの内皮性の分化を誘導するには不十分であることが示唆された（図１Ｃ）。
【０１１３】
ヒトＡＳＣによる発現に対する障害関連増殖因子の相互作用
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、ヒトＡＳＣによるその自己転写体の発現を有意にダウンレギュレートし、そして、ＦＧＦ−２はまた、ＰＤＧＦ ｍＲＮＡ発現も有意に抑制した（図２Ａ）。より興味深いことに、ＦＧＦ−２は、ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現において顕著な増加を促進した。経時的な評価により、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは二相性であり、６時間で最初のピークに達し、そして２４時間後に顕著な増加が始まることが明らかとなった（図２Ｂ）。培養培地のＥＬＩＳＡにより、ＦＧＦ−２により刺激されたヒトＡＳＣによるＨＧＦタンパク質の分泌は、３日目に有意に増加したことが実証された（図２Ｃ）。
【０１１４】
ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２誘導性作用の細胞内シグナル伝達経路
ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２の増殖促進作用は、ＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５）により有意に阻害されたが、ＥＲＫインヒビター（Ｕ０１２６）またはｐ３８インヒビター（ＳＢ２０２１９０）では阻害されなかった（図３Ａ）。ＦＧＦ−２によるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションもまた、ＪＮＫインヒビターによって有意に阻害された（図３Ｂ）。ＥＲＫインヒビターおよびｐ３８インヒビターの投与は、ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現レベルをわずかに減少したが、この変化は、統計的に有意ではなく、ＪＮＫと他のシグナル伝達経路との間の混線が示唆された。ＦＧＦ−２処理により増加されたＪＮＫシグナル伝達経路の典型的な核エフェクターであるｃ−Ｊｕｎのリン酸化と、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のＦＧＦ−２誘導性のアップレギュレーションとは、ＪＮＫインヒビターを用いた前処理により完全に防止された（図３Ｃ）。これらの結果は、ＦＧＦ−２が、ＪＮＫシグナル伝達経路を通じて、増殖とＨＧＦ ｍＲＮＡ発現とを優先的に促進することを示す。
【０１１５】
ヒトＡＳＣおよび他の細胞型におけるＦＧＦ−２誘導性作用
細胞増殖は、研究に用いた４つ全ての細胞型（ヒトＡＳＣ、ヒトＤＦ、ヒトＢＭ−ＭＳＣおよびマウスＡＳＣ）により促進されたが、基礎的な増殖能力は、細胞型間で異なった。ＦＧＦ−２により増進された細胞増殖は、検討した全ての細胞型においてＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５）によって有意に阻害された（図３Ｄ）。ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現もまた、全ての細胞型において、ＦＧＦ−２により促進され、そして、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣを除いて、ＪＮＫインヒビターにより有意に阻害された（図３Ｅ）。これらのことから、ＦＧＦ−２によるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣにおいてはＪＮＫ以外のシグナル伝達経路により媒介されることが示唆された。
【０１１６】
マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の修復
マウス鼠径部の脂肪パッドは、一貫して、解剖学的に異常のない栄養大動脈および大静脈を有し、このことにより、再現性のある虚血再潅流障害実験が可能となった（図４Ａ）。組織学的には、早くも１日目には血球の間質浸潤が観察され、そして、この間質浸潤は３日目に最も顕著であった。小さなサイズの脂肪細胞が１日目に現れ、そして、３日目には数が増えていた。このことから、脂肪分解または脂肪生成は、脂肪組織の全体にわたって起こることが示唆された。７日目には、浸潤性の赤血球が消失し、そして、いくつかの脂肪細胞はサイズが大きくなる一方で、相当数の有核細胞は、脂肪細胞間の間隙空間に残ったままであった（図４Ｂ）。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞数は、１日目から増加し、そして、３日目にピークを迎えたが（図４Ｃ）、ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞は、１日目に有意に高い頻度（有核細胞の６〜９％）で観察され、そして、その後減少した（図４Ｄ）。さらに、ＰＩ陽性の壊死細胞の増加が３日目に観察され、そして、これらの細胞の中には、レクチン陽性のものもあった。これらのことから、毛細管内皮細胞の中には、壊死を起こしているものもあり、そして、毛細管の再構築が進行中であったことが示唆された（図４Ｅ）。これらの結果は、脂肪組織が再潅流直後に損傷を受け、アポトーシスおよび壊死が脂肪変質過程に関与し、そして、その後に、再生上の変化が生じることを示唆する。
【０１１７】
ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも１日目には免疫組織化学により間質組織において検出され、その検出ピークは３日目であったが、そう多くないＦＧＦ−２が、７日目に発現されていた（図５Ａ）。一方、そう多くないＨＧＦタンパク質が１日目に検出されたが、ＨＧＦの発現は、３日目から、少なくとも７日目までに上昇した（図５Ｂ）。興味深いことに、ＦＧＦ−２ ｍＲＮＡは、損傷直後から第一週目を通じてダウンレギュレートされており、ＦＧＦ−２は、ＡＳＣのような生存細胞により産生されるのではなく、細胞外マトリックスまたは瀕死の細胞のような損傷を受けた脂肪組織の貯蔵庫から放出されることが示唆された。放出されたＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣにおいてインビトロで観察されるように、損傷を受けた脂肪組織においてＡＳＣによるＦＧＦ−２ ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートし得る。対照的に、組織におけるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現は、３日目に有意に上昇したが、１日目と７日目には上昇しておらず（図５Ｃ）、ＨＧＦ ｍＲＮＡの遅れたアップレギュレーションと、ＨＧＦの分泌とは、おそらく、先行するＦＧＦ−２タンパク質の放出により誘導されるということが示唆された。
【０１１８】
損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象
損傷を受ける前、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞（ＡＳＣとみなす）は、インタクトな脂肪組織の全体にわたって見られ、成熟な脂肪細胞の間に位置し、そして、特に、血管周辺で豊富であった（図６Ａ）。ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞の数は、明らかにＣＤ３１＋内皮細胞（ＣＤ３４について、陰性、または、かすかに陽性であった）の数よりもかなり多かった。損傷後３日で検出されることが多かったＢｒｄＵ陽性増殖細胞の大部分はまた、ＣＤ３４についても陽性であり（図６Ｂ上段）、そして、ＣＤ３４＋細胞の多くは、レクチン陰性であり（図６Ｂ下段）、ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣが、修復過程において実質的な役割を担うことが示唆された。生存組織の画像化により、間隙空間と小さなサイズの脂肪細胞の増加、レクチン陽性の円形細胞を含む有核細胞数の増加（図６Ｃ）、そして、特に小さなサイズの脂肪細胞の周囲での毛細管（図８Ａ）が明らかとなった。７日目には、大きなサイズの脂肪細胞はＪＮＫインヒビターで処理したサンプルにおいては観察されず、一方で、未処理のモデルにおいては大きなサイズの脂肪組織が観察された（図６Ｃ）。さらに、ＰＩ陽性の核は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞において観察された。このことから、毛細管の内皮細胞（図４Ｄ）だけでなく、脂肪細胞（図６Ｄ）もまた、壊死を起こしていたことが示唆される。７日目には、ＰＩ陽性の核が依然としてＪＮＫで処置したサンプルにおいては観察されたが、未処理のモデルにおいてはほとんど検出されなかった（図６Ｄ）。ＪＮＫインヒビターはまた、３日目と７日目に、ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣの増殖および移動を抑制した（図６Ｅ）。これらの結果は、脂肪細胞および毛細管を伴う脂肪組織の再構築が、損傷後の第一週の間に進行中であり、そして、組織修復過程は、ＪＮＫインヒビターでの処置により損ねられたことを示唆する。ＣＤ６８＋細胞は、浸潤性のマクロファージとして、インタクトな脂肪組織においてほとんど検出されなかった（図８Ｂ）。しかし、浸潤したマクロファージは、損傷後の小さなサイズの脂肪細胞様の細胞の周囲に凝集したのが観察され、これは、食作用を示唆するものである。ＣＤ６８＋細胞のこの凝集は、損傷後３日目に最も多く観察された。
【０１１９】
虚血再潅流障害後のＨＧＦ発現および線維化に対するシグナル阻害の影響
ＪＮＫインヒビター、または、ＦＧＦ−２に対する中和抗体の投与は、３日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを完全に妨げ（図７Ａ）、そして、７日目には、ＨＧＦの分泌を抑制した（図７Ｂ）。２週間目の線維性領域の組織学的測量は、脂肪組織に対する再潅流障害は、線維性領域の有意な増加（１０％から２３％への増加）をもたらしたことを明らかにした。さらに、ＪＮＫまたはＦＧＦ−２シグナル伝達の阻害は、ビヒクルのみの投与と比べて、線維性領域のさらに有意な増加をもたらした。有意に増加した線維化はまた、抗ＨＧＦ抗体で処置した群においても観察された（図７Ｃ）。これらの結果は、損傷を受けた脂肪組織において見られる線維化が、脂肪組織の修復過程においてＨＧＦにより抑制されたことを示し、そして、主にＡＳＣからのＨＧＦの分泌が、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＦＧＦ−２により誘導されたことが示唆された。
【０１２０】
（考察）
ヒト脂肪組織に対して機械的に損傷を加えた後、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βおよびＰＤＧＦがまず、創傷治癒の早い段階で分泌される。その後、上記増殖因子が低下するにつれ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌が、損傷後の第一週の間に次第に増加する（Aiba-Kojima E., Tsuno N.H., Inoue K. et al. 「Characterization ofwound drainage fluids as a source of soluble factors associated with woundhealing: Comparison with platelet-rich plasma and potential use in cell culture」WoundRepair Regen 2007; 15: 511-520）。本発明者らの結果から、これらの障害関連増殖因子の中でも、ＦＧＦ−２が主にＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増殖と、ＡＳＣによるＨＧＦの分泌とを促進したことが示唆された。ＦＧＦ−２は、血管新生（MontesanoR., Vassalli JD., Baird A. et al. 「Basic fibroblast growth factor inducesangiogenesis in vitro」Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 7297-7301）と、細胞増殖（NissenN.N., Polverini P.J., Gamelli R.L. et al. 「Basic fibroblast growth factormediates angiogenic activity in early surgical wounds」Surgery 1996; 119:457-465）の重要な内因性刺激因子であり、創傷治癒の早い時期に放出されることが知られる（Cordon-Cardo C., Vlodavsky I.,Haimovitz-Friedman A. et al. 「Expression of basic fibroblast growth factor innormal human tissues」Lab Invest 1990; 63: 832-840；Schulze-Osthoff K., Risau W.,Vollmer E. et al. 「In situ detection of basic fibroblast growth factor by highlyspecific antibodies」Am J Pathol 1990; 137: 85-92）。細胞のＦＧＦ−２は、種々の細胞型（例えば、線維芽細胞（TakimiyaM., Saigusa K., Aoki Y. 「Immunohistochemical study of basic fibroblast growthfactor and vascular endothelial growth factor expression for age determinationof cutaneous wound」Am J Forensic Med Pathol 2002; 23: 264-267）および内皮細胞（MuthukrishnanL., Warder E., McNeil P.L. 「Basic fibroblast growth factor is efficientlyreleased from a cytolsolic storage site through plasma membrane disruptions ofendothelial cells」J Cell Physiol 1991; 148: 1-16））が溶解する間に創傷の周囲で放出され、一方で、細胞外マトリックス内に束縛されたＦＧＦ−２は、種々の創傷プロテアーゼの作用により解放される（BashkinP., Doctrow S., Klagsburn M. et al. 「Basic fibroblast growth factor binds tosubendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase andheparin-like molecules」Biochemistry 1989; 28: 1737-1743；Ishai-Michaeli R.,Eldor A., Vlodavsky I. 「Heparanase activity expressed by platelets,neutrophils, and lymphoma cells releases active fibroblast growth factor fromextracellular matrix」Cell Regul 1990; 1: 833-842）。ＪＮＫシグナル伝達は、本研究において明らかにされたように、ＦＧＦ誘導性のＡＳＣ増殖においてのみ関与するのではなく、ヒトＡＳＣのＰＤＧＦ誘導性の増殖および移動にも関与する（KangY.J., Jeon E.S., Song H.Y. et al. 「Role of c-Jun N-terminal kinase in thePDGFinduced proliferation and migration of human adipose tissue-derivedmesenchymal stem cells」J Cell Biochem 2005; 95: 1135-1145）。それゆえ、本研究に使用したＪＮＫインヒビターは、ＡＳＣに対するＦＧＦ−２およびＰＤＧＦの両方の生物学的な作用を阻害するようである。ＰＤＧＦは、ＡＳＣの増殖を促進したが、ＡＳＣによるＨＧＦの発現に対しては有意な作用を示さなかった。他の研究者が報告するように、ＦＧＦ−２およびＥＧＦの両方が、ＡＳＣによるＨＧＦの分泌を促進した（KilroyG.E., Foster S.J., Wu X. et al. 「Cytokine profile of human adipose-derived stemcells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors」JCell Physiol 2007; 212: 702-709）；それゆえ、ＪＮＫはまた、ＡＳＣによるＥＧＦ誘導性のＨＧＦの分泌に関与し得る。
【０１２１】
本発明者らがＡＳＣについて観察したＦＧＦ−２により増強された細胞増殖とＨＧＦの産生とが、ＢＭ−ＭＳＣおよびＤＦのような他の間葉系細胞型においても観察されたが、ヒトＢＭ−ＭＳＣにおけるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＪＮＫ以外のシグナルにより媒介されたことは興味深い。ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦのアップレギュレーションは、平滑筋細胞（Onimaru M., Yonemitsu Y., Tanii M. et al. 「Fibroblast growthfactor-2 gene transfer can stimulate hepatocyte growth factor expressionirrespective of hypoxia-mediated downregulation in ischemic limbs」Circ Res2002; 91: 923-930）、肺組織に由来する線維芽細胞様細胞（Roletto F., Galvani A.P., Cristiani C. etal. 「Basic fibroblast growth factor stimulates hepatocyte growth factor/scatterfactor secretion by human mesenchymal cells」J Cell Physiol 1996; 166: 105-111）および骨芽細胞（BlanquaertF., Delany A.M., Canalis E. 「Fibroblast growth factor-2 induces hepatocytesgrowth factor/scatter factor expression in osteoblasts」Endocrinology 1999; 140:1069-1074）;のような他の細胞型において観察された；しかしながら、細胞内シグナル伝達機構は、十分には研究されていない。インターロイキン−１（MatsumotoK., Okazaki H., Nakamura T. 「Up-regulation of hepatocyte growth factor geneexpression by interleukin-1 in human skin fibroblasts」Biochem Biophys ResCommun 1992; 188: 235-243）、インターフェロン−γ（Takami Y., Motoki T., Yamamoto I. et al. 「Synergisticinduction of hepatocyte growth factor in human skin fibroblasts by theinflammatory cytokines interleukin-1 and interferon-gamma」Biochem Biophys ResCommun 2005; 327: 212-217）およびアスコルビン酸（Wu Y.L., Gohda E., Iwao M. et al. 「Stimulationof hepatocyte growth factor production by ascorbic acid and its stable2-glucoside」Growth Horm IGF Res 1998; 8: 421-428）のような他の因子もまた、ＨＧＦの産生を刺激することが報告されている。ＨＧＦは、血管新生および創傷治癒の重要なメディエーターであり、そしてその発現は、種々の細胞および組織において多数の因子によって調節されているようである。
【０１２２】
脂肪組織における損傷および修復の過程は、おそらくは、標準的な動物モデルが存在しないことが原因で、十分には研究されていない。損傷を受けた脂肪組織において、損傷後の早い段階での壊死性およびアポトーシス性の変化とその後の浮腫および出血、ならびに、食作用、細胞の浸潤および増殖のような炎症性および再生性の変化が、第一週を通じて観察された。壊死性の変化は、毛細管の内皮細胞および脂肪細胞において見られ、脂肪組織の再構築と、その修復過程とが、ＪＮＫインヒビターにより損ねられることが示唆された。ＨＧＦが分泌された後、この組織から束縛されていたかまたは他の形態にあったＦＧＦ−２が放出された；ＨＧＦのアップレギュレーションは、主に、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＦＧＦ−２により刺激されたＡＳＣから導かれるようである。というのも、ＡＳＣは、脂肪組織に由来する間質の血管画分内の間葉系細胞の半分より多くを構成することが知られているからである（Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Characterization offreshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portionsof liposuction aspirates」J Cell Physiol 2006; 208: 64-76）。この研究において使用した虚血再潅流モデルは、脂肪組織の損傷および再生の再現性のある結果を提供し、損傷および再生は全て、２週間以内に完了した。
【０１２３】
脂肪組織において、ＡＳＣであることが示唆されたＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞は、損傷前は、脂肪細胞（毛細管に密接に関連するもの）と周囲の血管壁（特に、外膜において）との間に多く見られた。血管内皮細胞へと分化して、毛細管の新芽を形成する能力を有するＣＤ３４＋血管壁内在前駆細胞は、以前に報告されており（Zengin E., Chalajour F., Gehling U.M. et al. 「Vascular wall residentprogenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis」Development 2006;133:1543-1551）、そしてこの集団は、ＡＳＣを構成する一部分である可能性がある。一方で、血管周皮細胞の特徴を有するＡＳＣの血管周皮亜集団もまた特徴付けられている（TraktuevD., Merfeld-Clauss S., Li J. et al. 「A population of multipotent CD34-positiveadipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside ina periendothelial location, and stabilize endothelial networks」Circ Res 2008;102: 77-85）。ＡＳＣは、異種性の亜集団を構成し得、そして、インビボにおけるＡＳＣの特徴および機能を解明する際の複雑さを説明し得る。以前に示唆されたように、脂肪生成と血管新生との間には密接な関係性が存在し、それゆえ、最初は脂肪細胞の前駆体細胞とみなされていたＡＳＣは、脂肪生成と血管新生の前駆体として機能し得（非特許文献５）、そして、肥満（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526）、脂肪組織のターンオーバー、および損傷後の脂肪組織の修復のような種々の状況において、脂肪細胞と血球と血管との間の相互関係を管理し得る。組織再生の間、コントロールと比べてより多くのＣＤ３４＋／ＣＤ３１−のＡＳＣが、脂肪細胞の間に見られ、３日目に見られたＢｒｄＵ陽性の増殖細胞の多くは、ＣＤ３４＋／レクチン−であった。これらのことから、ＡＳＣが増殖し、そして、脂肪生成および血管新生のような修復過程に関与していることが示唆された。ＡＳＣの増殖および移動は、ＪＮＫインヒビターの処置により強く阻害され、その結果、組織修復が遅延され、かつ損ねられ、同時に、線維化が増加した。マクロファージは、脂肪組織における炎症と肥満とに関与することが知られる（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526）。この研究においては、ＣＤ６８＋のマクロファージはコントロールにおいてはほとんど検出されなかったが、３日目には多数観察されたものの、その数はASCよりもかなり少ないレベルであった。損傷を受けた脂肪組織におけるマクロファージの役割は、明らかにすべきままであるが、マクロファージは、食作用および／または血管新生に関与する可能性がある（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526]。
【０１２４】
ＨＧＦは、心臓（NakamuraT., Mizuno S., Matsumoto K. et al. 「Myocardial protection fromischemia/reperfusion injury by endogeneous and exogenous HGF」J Clin Invest2000; 106: 1511-1519）、肝臓（Ueki T., Kaneda Y., Tsutsui H. et al. 「Hepatocytegrowth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats」Nat Med 1999; 5: 226-230]および腎臓（LiuY. 「Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential andmechanisms of action」Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16）を含む種々の臓器において抗線維形成作用を有することが報告されている。最近の研究では、ＨＧＦが、種々の機構によりＳｍａｄシグナル伝達を中断することにより、ＴＧＦ−βの線維化促進作用に拮抗することが明らかとなった（LiuY. 「Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential andmechanisms of action」Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16；Conway K.,Price P., Harding K.G. et al. 「The molecular and clinical impact of hepatocytegrowth factor, its receptor, activators, and inhibitors in wound healing」WoundRepair Regen 2006; 14: 2-10）。本研究において、ＦＧＦ−２のシグナル伝達を阻害することにより、ＡＳＣによるＨＧＦの産生が抑制され、そして、ＨＧＦを阻害することにより、損傷を受けた脂肪組織における線維化が増加した。さらに、ＪＮＫインヒビターまたは抗ＦＧＦ−２抗体を投与することもまた、損傷後の重篤な線維化をもたらし、これは、線維化のＦＧＦ−２誘導性の防止が、少なくとも部分的に、ＡＳＣに由来するＨＧＦにより媒介されること、そして、ＨＧＦは、線維化を防止し、そして、損傷後に脂肪の体積を維持することにおいて重要な因子であることを意味する。ＦＧＦ−２は、線維芽細胞および内皮細胞に対するその直接的な作用により創傷治癒を促進することが知られる（BikfalviA., Klein S., Pintucci G. et al. 「Biological roles of fibroblast growthfactor-2」Endocr Rev 1997; 18: 26-45）。しかしながら、本研究は、ＦＧＦ−２はまた、ＡＳＣおよび／またはＤＦからＨＧＦを誘導することにより、組織修復を促進し、かつ、線維化を防止することもできることが明らかとなった。脂肪組織は、多くの臓器内またはその周辺に存在するので、ＦＧＦ−２誘導性のＡＳＣからのＨＧＦの分泌は、心筋梗塞、肝炎および腎炎のような臓器損傷の後の修復過程において重要である可能性がある。
【０１２５】
本研究の結果は、ＡＳＣの治療的な可能性に新しい見通しを提供する。ＡＳＣを用いた細胞治療は、特に、ＦＧＦ−２で前処置されたか、またはＦＧＦ−２と併用したとき、組織修復を加速し、線維化を減らし、そして、ＨＧＦの作用を通じて、急性または慢性の炎症により損傷を受けた臓器の機能を改善する可能性がある。ＡＳＣにより分泌されたＨＧＦは、自家脂肪移植術において重要な役割を担う可能性があり（非特許文献９；非特許文献１２）；脂肪移植片の生存を促進し、そして、瘢痕の形成を防止することが示唆されている。ＨＧＦは抗線維形成性であるだけでなく、血管新生性でもあること（Conway K., Price P., Harding KG. et al. 「The molecular and clinicalimpact of hepatocyte growth factor, its receptor, activators, and inhibitors inwound healing」Wound Repair Regen 200; 14: 2-10）、そして、ＡＳＣによるＨＧＦ産生が、虚血の肢の改善に寄与するようであること（CaiL., Johnstone B.H., Cook TG. et al. 「Suppression of hepatocyte growth factorproduction impairs the ability of adipose-derived stem cells to promoteischemic tissue revascularization」Stem Cells. 2007; 25: 3234-3243）を考慮すると、ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦの分泌はまた、毛細管の総量が改善しているが、損傷を受けた脂肪組織における血管密度が有意に増大していなかった場合でさえも、組織修復の間に血管新生を促進することができた（図９）。ＡＳＣにおいて、ＶＥＧＦの分泌は、虚血により誘導されるようである（RehmanJ., Traktuev D., Li J. et al. 「Secretion of angiogenic and antiapoptoticfactors by human adipose stromal cells」Circulation 2004; 109: 1292-1298）。本発明者らが本研究において使用したモデルは、虚血モデルではなく、損傷モデルであり、ＶＥＧＦの発現は、損傷後すぐにダウンレギュレートされた（データ示さず）。脂肪組織における血管新生を研究し、そして、血管新生を増進するための治療戦略を確立するために、脂肪組織における慢性的な虚血の特定のモデルを用いる研究が必要とされる。
【０１２６】
（結論）
ＦＧＦ−２は、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増幅とＡＳＣによるＨＧＦの分泌を促進する。損傷を受けた脂肪組織において、損傷を受けた組織から放出されたＦＧＦ−２により刺激されたＡＳＣは、脂肪修復過程において、主要な増殖細胞集団であることが示唆される。このＪＮＫ媒介性のシグナルは、線維化の防止、そして、損傷後の脂肪体積の維持において重要な役割を担う。本研究はまた、損傷応答におけるＡＳＣについての新しい役割を明らかにし、そして、将来的にASCを治療に利用するための戦略に見通しを提供する。
【０１２７】
（実施例２：肝硬変での治療実験）
本実施例では、肝硬変モデルマウスを用いて、ＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤を投与したときの、線維化の改善を観察する。
【０１２８】
ここで、肝硬変モデルマウスとしては、四塩化炭素連続投与モデルを用いる。0.5mg/kgの四塩化炭素を週２回、４週間連続投与し肝硬変を誘発させる。
【０１２９】
また、ＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤は、以下のように調製する。
【０１３０】
ＡＳＣ処理方法
（１）脂肪組織と等量の０．０７５％コラゲナーゼ（和光純薬等から入手可能。）を加え３７℃で３０分酵素処理する。
【０１３１】
（２）処理後に８００Ｇ×１０分遠心する。
【０１３２】
（３）上層を除去し、沈殿した細胞にリン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、１００μｍポアフィルター（Millipore等から入手可能。）を通す。
【０１３３】
（４）フィルターを通った細胞を回収する。
【０１３４】
ｂＦＧＦ徐放剤の調製法
（１）ゼラチン溶液をウォーターバス内で攪拌して、マイクロスフィアを作成して、冷却し乾燥させる。
【０１３５】
（２）グルタルアルデヒド（和光純薬等から入手可能。）処理により、ゼラチンスフィアを架橋する。
【０１３６】
（３）ｂFGF溶液を含浸させ、ｂＦＧＦ徐放剤とする。
【０１３７】
上記のように調製したＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤を上記肝硬変モデルマウスに投与し、線維化の改善状況を観察する。ここでは、線維化の改善が期待される。
【０１３８】
（実施例３：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産）
本実施例では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を実証する。
【０１３９】
実施例２に記載のように調製したＡＳＣをｂＦＧＦ添加培地にて培養し、１週間おきに培地を継続的に回収して、ＨＧＦタンパクを回収、精製する。
【０１４０】
ＨＧＦタンパク質の回収および精製は、以下のとおりである。
【０１４１】
（１）ＨＧＦに対する抗体カラムを常法により作製する。
【０１４２】
（２）回収した培地を抗体カラムに通し、常法により吸着させる。
【０１４３】
（３）抗体カラムから吸着したＨＧＦを常法により溶出させ回収する。
【０１４４】
このようにして調製したＨＧＦの収量等を測定し、本発明の調製法による効果を確認することができる。
【０１４５】
（実施例４：脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤および複合剤としての効果）
本実施例では、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤の効果を確認する。
実施例２において記載されるように調製したＡＳＣをｂＦＧＦ添加培地にて培養する。
【０１４６】
ＡＳＣの増殖を、ｂＦＧＦ添加のないコントロールサンプルと比較して、増殖刺激効果を確認する。
【０１４７】
このようにして調製したＡＳＣをｂＦＧＦ徐放剤とともに体内に投与する。
【０１４８】
投与された被検体の体内を調べることにより、移植したＡＳＣが増殖し、さらには脂肪新生および血管新生が亢進していることがわかる。
【０１４９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
脂肪由来幹細胞を用いた細胞治療は，すでに実用化（臨床応用）されている。また，FGF-2は既に医薬品として製品化され，熱傷や皮膚潰瘍の治療薬として用いられている。今後はFGF-2を徐放する製剤も商品化される可能性がある。脂肪由来幹細胞とFGF-2はともにこれまでの実績から，生体に対する安全性は高いと考えられる。このような状況から，今回の細胞治療も実用化のめどは立っている。線維化は、局所もしくは全身において慢性炎症を伴うあらゆる疾患に共通しており、本発明はまた、局所投与だけでなく、全身投与も可能であるため、広い範囲での臨床治療に役立つ可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１Ａ】図１は、ヒトＡＳＣの増殖および表面マーカー発現に対する障害関連増殖因子の作用を示す。（Ａ）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に培養してから、３日後、６日後または９日後のＡＳＣのカウント。ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、用量依存的にヒトＡＳＣの増殖を促進したが、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、増殖作用を示さなかった（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｂ】図１は、ヒトＡＳＣの増殖および表面マーカー発現に対する障害関連増殖因子の作用を示す。（Ｂ）各増殖因子と共に６日間培養したヒトＡＳＣの光学顕微鏡写真。ＦＧＦ−２と共に培養した細胞は、他の増殖因子と共に培養した細胞よりも小さかった。スケールバー＝２００μｍ。
【図１Ｃ】図１は、ヒトＡＳＣの増殖および表面マーカー発現に対する障害関連増殖因子の作用を示す。（Ｃ）各増殖因子と共に７日間培養したヒトＡＳＣのフローサイトメトリー解析。血管内皮マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１およびＴｉｅ−２）の発現における有意な変化は観察されなかった。
【図２Ａ】図２は、ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現に対する障害関連増殖因子の相互作用を示す。（Ａ）ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現。ＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣによるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現の顕著なアップレギュレーションを誘導したが、ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、それぞれ、ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦの発現をダウンレギュレートした（ｎ＝７；＊ｐ＜０．０５）。
【図２Ｂ】図２は、ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現に対する障害関連増殖因子の相互作用を示す。（Ｂ）ＦＧＦ−２により誘導されるＨＧＦ ｍＲＮＡ発現の時間経過。ＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣによる二相性のＨＧＦ ｍＲＮＡ発言を促進し、最初のピークは６時間後に生じ、そして、第２の増加は２４時間後に始まった（ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図２Ｃ】図２は、ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現に対する障害関連増殖因子の相互作用を示す。（Ｃ）ヒトＡＳＣによるＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦタンパク質の分泌。７日目の培養培地のＥＬＩＳＡは、ＦＧＦ−２がヒトＡＳＣからのＨＧＦタンパク質の分泌を促進したことを示した（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ａ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ａ）ＦＧＦ−２および下流にあるシグナルインヒビターのうちの１つと共に培養した後のＡＳＣのカウント。ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５（ＳＰ）は、ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２の増殖作用を有意に阻害したが、Ｕ１０２６（ＥＲＫインヒビター）およびＳＢ２０２１９０（ＳＢ、ｐ３８タンパク質インヒビター）は、ＡＳＣの増殖に対して阻害作用を示さないか、または、限られた阻害作用を示した（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ｂ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｂ）７日目のヒトＡＳＣによるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現。ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＳＰによって有意に阻害され（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）、一方、Ｕ１０２６およびＳＢは、限られた阻害作用を有した。
【図３Ｃ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｃ）インヒビターの特異性。ｃ−Ｊｕｎのリン酸化は、ＦＧＦ−２での処理と共に増加した。ＦＧＦ−２誘導性のｃ−Ｊｕｎのリン酸化は、ＳＰでの前処理により完全に妨げられた（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ｄ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｄ）培養における７日後の細胞のカウント。ＦＧＦ−２誘導性の細胞増殖は、検討した全ての細胞型においてＪＮＫインヒビターであるＳＰにより有意に阻害された（ｈＡＳＣ、ヒト脂肪由来幹／間質細胞；ｈＢＭ−ＭＳＣ、骨髄由来間葉系幹細胞；ｈＤＦ、ヒト真皮線維芽細胞；ｍＡＳＣ、マウス脂肪由来幹／間質細胞；ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ｅ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｅ）ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現についてのリアルタイムＰＣＲアッセイ。ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現は、全ての細胞型においてＦＧＦ−２により促進されたが、ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣを除いてＪＮＫインヒビターにより有意に阻害された（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図４Ａ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。虚血再潅流障害モデル。上段：マウス鼠径部の脂肪パッド。矢印は、大腿動脈から延びる栄養大動脈を示す。矢印の先は、皮膚への交通枝を示す。下段：交通枝を切断し、そして、血管クリップで栄養大動脈を３時間にわたり締め付けた。
【図４Ｂ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ヘマトキシリン−エオシン染色は、早くも１日目に血球の間質性浸潤が観察され、そして、７日目にはこの浸潤は消失していたことを明らかにした。第一週を通じて、再生性の変化が損傷を受けた脂肪組織において観察された。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｃ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。
【図４Ｄ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は損傷後に増加し、３日目にピークを迎えた（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｅ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は損傷後に増加し、３日目にピークを迎えた（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｆ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。
【図４Ｇ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞（矢印）は、損傷後、１日目に最も高い頻度で観察された（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｈ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞（矢印）は、損傷後、１日目に最も高い頻度で観察された（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｉ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。
【図４Ｊ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。生存細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）、レクチン（上皮細胞；赤色）またはＰＩ（壊死細胞；緑色）で染色して画像化し、その干渉コントラスト像と重ね合わせた。ＰＩ陽性の壊死細胞は３日目に増加しており、そして、その中には、レクチン陽性の毛細管内皮細胞であるように見えた。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ａ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。ＦＧＦ−２の免疫染色。ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも損傷後１日目には検出され、その検出ピークは３日目であった。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ｂ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも損傷後１日目には検出され、その検出ピークは３日目であった。
【図５Ｃ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。ＨＧＦの免疫染色。損傷の１日後にはわずかなＨＧＦタンパク質が検出されたが、ＨＧＦの発現は、損傷後３日目から検出され、その検出ピークは損傷後７日目であった。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ｄ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。損傷の１日後にはわずかなＨＧＦタンパク質が検出されたが、ＨＧＦの発現は、損傷後３日目から検出され、その検出ピークは損傷後７日目であった。
【図５Ｅ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。損傷を受けた脂肪組織におけるＦＧＦ−２ ｍＲＮＡおよびＨＧＦ ｍＲＮＡの発現のリアルタイムＰＣＲアッセイ。ＦＧＦ−２ ｍＲＮＡは、損傷後すぐにダウンレギュレートされ（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）、一方で、ＨＧＦ ｍＲＮＡは、損傷の３日後に、有意にアップレギュレートされた（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。（Ａ）ＣＤ３１（緑色）、ＣＤ３４（赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）についてのコントロール組織の免疫染色。損傷を受ける前、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞は、脂肪組織の全体にわたって、特に、血管周辺で観察された。スケールバー＝２０μｍ。
【図６Ｂ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。（Ｂ）３日目の損傷を受けた組織。上段：ＣＤ３４（緑色）、ＢｒｄＵ（赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）についての染色。損傷後３日で観察されることが多かったＢｒｄＵ陽性細胞の大部分はまた、ＣＤ３４についての陽性であった。スケールバー＝２０μｍ。下段：ＣＤ３４（緑色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した３日目の組織の生存組織像。３日目に、ＣＤ３４＋細胞の多くは、レクチン陰性であり、これらの細胞がＡＳＣであったことが示唆された。スケールバー＝２０μｍ。
【図６Ｃ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。（Ｃ）ＢＯＤＩＰＹ（脂肪細胞；黄色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した生存組織像。有核細胞および小さなサイズの脂肪細胞の数の増加が、１日目および３日目に観察された。浸潤血球由来の細胞である可能性があるレクチン＋の小さな円形細胞が１日目に見られたが、これらは、特徴付けられていないままである。大きなサイズの脂肪細胞は７日目に増加したが、ＪＮＫインヒビターで処理した場合には見られなかった。青いスケールバー＝２００μｍ、白いスケールバー＝５０μｍ。
【図６Ｄ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。有核細胞および小さなサイズの脂肪細胞の数の増加が、１日目および３日目に観察された。浸潤血球由来の細胞である可能性があるレクチン＋の小さな円形細胞が１日目に見られたが、これらは、特徴付けられていないままである。大きなサイズの脂肪細胞は７日目に増加したが、ＪＮＫインヒビターで処理した場合には見られなかった。
【図６Ｅ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。ＢＯＤＩＰＹ（脂肪細胞；黄色）、ＰＩ（有核細胞の核；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（すべての核；青色）で染色した生存組織の三次元像；白い破線のレベルで水平方向および垂直方向に切断した像もまた示す。ＰＩ陽性細胞は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞であることが分かった。ＪＮＫインヒビターでの処理は、７日目にＰＩ陽性細胞数の増加をもたらした。スケールバー＝５０μｍ。
【図６Ｆ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。ＰＩ陽性細胞は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞であることが分かった。ＪＮＫインヒビターでの処理は、７日目にＰＩ陽性細胞数の増加をもたらした。
【図６Ｇ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。Ｃ３４（緑色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した生存組織像。ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣの増殖および移動は、３日目および７日目に、ＪＮＫインヒビターにより損ねられた。スケールバー＝５０μｍ。
【図７Ａ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。
【図７Ｂ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。３日目の、脂肪組織によるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現。ＪＮＫインヒビターであるＳＰ６００１２５（ＳＰ）または抗ＦＧＦ−２抗体の継続的な投与は、３日目に、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを妨げた（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図７Ｃ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。７日目のＨＧＦについての免疫染色。ＳＰまたは抗ＦＧＦ−２抗体の継続的な投与は、７日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦの分泌を阻害した。スケールバー＝１００μｍ。
【図７Ｄ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。ＳＰまたは抗ＦＧＦ−２抗体の継続的な投与は、７日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦの分泌を阻害した。
【図７Ｅ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。損傷後２週間目の、損傷を受けた脂肪組織における線維化。線維性領域をＡｚａｎ染色で染色した。スケールバー＝１ｍｍ。虚血再潅流障害は、有意な線維化を誘導した；線維化領域は、損傷を受けていない動物の２倍であった。ＳＰ、抗ＦＧＦ−２抗体または抗ＨＧＦ抗体の継続的な投与は、線維化を有意に増大した（ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図８Ａ】ＢＯＤＩＰＹ（脂肪細胞；黄色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した生存組織像。有核細胞および毛細管の数の増加が、小さなサイズの脂肪細胞の周囲で観察された。スケールバー＝２０μｍ。
【図８Ｂ】ＣＤ６８についての組織の免疫染色。ＣＤ６８＋のマクロファージは、脂肪組織においてほとんど検出されなかったが、これらのマクロファージの凝集（食作用を示唆する）が、損傷後３日目に最も多く観察された。スケールバー＝１００μｍ。
【図９】図９は、損傷から２週間後の脂肪組織における血管密度を示す。血管密度は、ＣＤ３１について免疫染色を行った顕微鏡写真における血管をカウントすることにより計算した。スケールバー＝１００μｍ。脂肪領域は線維化により減少したが（図７）、最終的な血管密度は、ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５（ＳＰ）の継続的な投与を行った場合も、行っていない場合も、損傷後に有意に変化しなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪由来幹細胞に関する新たな利用法に関する。より詳細には、本発明は、線維性病変の新たな治療に関する。本発明はまた、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などのサイトカインの新たな生産方法に関する。本発明はさらに、脂肪由来幹細胞（脂肪由来幹／間質細胞とも呼ばれる、ＡＳＣ）の新たな増殖刺激剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、組織特異的な前駆細胞として機能するだけでなく、多能性であり、そして、特定の状況下で、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような血管新生性増殖因子を分泌する。しかし、この分泌の生物学的な役割と調節機構とは、十分に研究されていない。
【０００３】
脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、組織特異的な前駆細胞として機能し、種々の系統の細胞へと分化し得（非特許文献１）、そして、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような多くの強力な増殖因子およびサイトカインを分泌し得る（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。分泌された因子のパラクリン作用は、ＡＳＣを用いて処置された虚血性の後肢の血管分布の改善を説明する（非特許文献２；非特許文献４）；しかし、ＡＳＣの内皮細胞への分化は、血管分布の改善にも寄与し得る（非特許文献５；非特許文献６）。血管新生と組織修復を促進するためにＡＳＣを使用することは、可能性ある治療戦略としての興味を獲得し[非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、そして、ＡＳＣにより媒介される骨・脂肪の再生および血管新生の促進に関する臨床治験が進行中である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００４】
ＡＳＣは、強力な増殖因子とサイトカインを分泌するだけでなく、その分泌した増殖因子やサイトカインからも影響を受ける。線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）は、ＡＳＣの増殖を刺激し、そして、その自己再生の維持に寄与する（非特許文献１３）。ＦＧＦ−２は、ＡＳＣの脂肪生成性（非特許文献１４）、および、軟骨形成性（非特許文献１５）の分化を促進するが、骨形成性の分化は阻害することが示されている（非特許文献１６）。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、ＡＳＣの増殖および移動を誘導する（非特許文献１７）。ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびインシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含有する培養培地は、ＡＳＣの増殖を顕著に加速し、そして、その多能性を保存した（非特許文献１８）。このことは、ＡＳＣ増殖に対するこれらの増殖因子の間での相乗作用を示唆する。
【０００５】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、増殖因子による細胞調節の多くの面に関与する、重要なシグナル伝達系の酵素である（非特許文献１９）。ＭＡＰＫの中でも、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）は、ＦＧＦ−２により媒介されるＡＳＣの自己再生に部分的に関与し（非特許文献１３）、そして、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、ＰＤＧＦにより誘導されるＡＳＣの増殖および移動において重要な役割を果たす（非特許文献１７）ことが報告されている。また、ＡＳＣが、ｐ３８ ＭＡＰＫ依存性の機構により、腫瘍壊死因子αに応答して、ＶＥＧＦ、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を産生することを示す研究もある（非特許文献２０）。
【０００６】
本研究において、本発明者らは、ＡＳＣに対する、障害関連増殖因子の影響を評価した。損傷およびその後の創傷治癒の過程で、種々の増殖因子および炎症性サイトカインが、細胞の再生活性を調節する。本発明者らは、以前に、脂肪吸引手術後の創傷流体を解析し、そして、それに続く増殖因子の発現を報告した：ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、創傷治癒の早期段階において放出され、一方で、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、後期段階において発現された（非特許文献２１）。増殖因子の投与は、熱傷に対してのＦＧＦ−２（非特許文献２２、および心筋梗塞に対してのＨＧＦ（非特許文献２３）などのように、損傷を受けた組織の再生を促進することが報告されている。しかし、おそらく、脂肪組織障害の良好なモデルが存在しないために、脂肪組織における損傷および修復の過程と、ＡＳＣの潜在的な役割について焦点を当てた研究はほとんどない。そして、これらの文献は、（１）術後ドレーンを解析したのみであり各ＧＦ量変化のメカニズムやパラクライン的な作用についてはなし（２）ＡＳＣの遺伝子発現等についてはデータなし（３）ＡＳＣがＨＧＦを分泌するとは結論していないなどの欠点が存在する。
【０００７】
上記のように、皮膚（ケロイドや肥厚性瘢痕），肝臓（肝硬変），肺（肺線維症），心臓（心筋梗塞後）など，身体の様々な部位において線維性病変は起こりうるが，線維性病変に対する効果的な治療法は存在しないのが現状であった。抗線維化作用のある物質としては肝細胞増殖因子（以下HGF）が知られていたが，血中半減期が非常に短く，これを持続的・効果的に生体に投与する方法は実用化されていなかった。また，脂肪由来幹細胞を用いた治療自体は，脂肪注入術と組み合わせた方法が組織増大を目的に行われているが，線維性病変に対する治療としては行われていなかった。
【非特許文献１】Zuk P.A., Zhu M.,Ashjian P. et al. 「Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells」MolBiol Cell 2002; 13: 4279-4295
【非特許文献２】Rehman J., Traktuev D., Li J. et al. 「Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adiposestromal cells」Circulation 2004; 109: 1292-1298
【非特許文献３】Kilroy G.E.,Foster S.J., Wu X. et al. 「Cytokine profile of human adipose-derived stemcells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors」JCell Physiol 2007; 212: 702-709
【非特許文献４】Nakagami H.,Maeda K., Morishita R. et al. 「Novel autologous cell therapy in ischemic limbdisease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derivedstromal cells」Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25: 2542-2547
【非特許文献５】Planat-BenardV., Silvestre J.S., Cousin B. et al. 「Plasticity of human adipose lineage cellstoward endothelial cells: Physiological and therapeutic perspectives」Circulation2004; 109: 656-663
【非特許文献６】Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. 「Improvement of postnatalneovascularization by human adipose tissue-derived stem cells」Circulation 2004;110: 349-355
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【非特許文献２１】Aiba-Kojima E.,Tsuno N.H., Inoue K. et al. 「Characterization of wound drainage fluids as asource of soluble factors associated with wound healing: Comparison withplatelet-rich plasma and potential use in cell culture」Wound Repair Regen 2007;15: 511-520
【非特許文献２２】Akita S., AkinoK., Imaizumi T. et al. 「A basic fibroblast growth factor improved the qualityof skin grafting in burn patients」Burns 2005; 31: 855-858]
【非特許文献２３】Nakamura T.,Mizuno S., Matsumoto K. et al. 「Myocardial protection from ischemia/reperfusioninjury by endogeneous and exogenous HGF」J Clin Invest 2000; 106: 1511-1519
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまで治療が困難であった各種の線維性病変に対して，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ることを本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、脂肪由来幹細胞と特定のサイトカイン（たとえば、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下ＦＧＦ−２ともいう））を組み合わせた方法を用い，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ることにより解決された。
【００１０】
詳細には、本発明者らは、損傷を受けた組織から放出された因子によって刺激されたＡＳＣが、おそらくは、再生関連増殖因子を分泌することによって、または、脂肪細胞、内皮細胞もしくは他の細胞型へと分化することによって、脂肪組織の修復過程において重要な役割を果たすと仮定した。本発明者らは、インビトロにおけるヒトおよびマウスのＡＳＣに対する、損傷関連因子の影響および機構を検討した。さらに、本発明者らは、再生過程の間のＡＳＣの役割を説明するために、脂肪組織に対する虚血再灌流障害の最初のマウスモデルを用いて、細胞レベルおよび分子レベルにおける損傷関連増殖因子の発現を評価した。
【００１１】
その結果、本発明により、線維性病変が顕著に治癒することが明らかになった。
【００１２】
本発明者らの研究により，脂肪由来幹細胞を培養する際にＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインを添加すると，増殖が促進されるのみならず，ＨＧＦの分泌が促進されることが判明した。この作用は、とくにＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインの刺激を長期的に投与した場合に特に顕著に見られた。また，マウス脂肪組織の創傷モデルを用いた実験により，通常の創傷治癒過程でもＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインによって脂肪由来幹細胞からのＨＧＦ分泌が亢進しており，これが治癒過程での線維化を抑制しているということが明らかになった。
【００１３】
したがって，本発明では、線維性病変に対する以下のような治療法が可能であることになる。
【００１４】
患者から採取した脂肪組織をコラゲナーゼで分解し，遠心処理を行うことにより，脂肪由来幹細胞を抽出する。この細胞をＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインとともに線維性病変部に投与し，脂肪由来幹細胞からのＨＧＦ分泌を亢進させ，ＨＧＦの線維化抑制作用による病変部の改善を図る。
【００１５】
別の実施形態では、本発明では、創傷時に発現が見られる代表的な増殖因子（ＶＥＧＦ，ＦＧＦ−２，ＨＧＦ，ＰＤＧＦ）によるＡＳＣの細胞増殖および自らの増殖因子分泌に対する影響を調べた。さらに、影響を持つ増殖因子のシグナル伝達系を同定するための阻害実験を行った。また、脂肪組織の創傷（虚血再潅流障害）モデル（マウス）を確立し、創傷治癒過程における増殖因子の発現および組織内の変化を検討した。
【００１６】
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは濃度依存的にＡＳＣの増殖を促進した。また、ＦＧＦ−２により、ＡＳＣからのＨＧＦ分泌がｍＲＮＡおよび蛋白レベルで著明に促進された。このＦＧＦ−２による細胞増殖およびＨＧＦ分泌の促進は、ＪＮＫ阻害剤によって最も抑制された。虚血再潅流障害脂肪組織においては、直後からＦＧＦ−２の蛋白発現が見られ、引き続きＨＧＦのｍＲＮＡおよび蛋白発現が上昇した。また、このＨＧＦの発現はＪＮＫ阻害剤によって抑制され、さらにその抑制により治癒後の線維化が増すことが示された。
【００１７】
ＡＳＣは、創傷時に周囲の細胞外マトリックスから大量に放出されるＦＧＦ−２に刺激を受け、主にＪＮＫの経路を介して細胞増殖およびＨＧＦ分泌を促進し、創傷治癒過程における血管新生、線維化抑制において重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００１８】
本発明は、線維化抑制作用のあるＨＧＦを生体に持続的・効果的に投与する手段として脂肪由来幹細胞を用いること，特に，ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインによる刺激を加えてＨＧＦ分泌を促進させた状態で投与すること、およびＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインの徐放製剤とともに脂肪由来幹細胞を投与することを意図する。
【００１９】
したがって、本発明は、以下を提供する。
【００２０】
１つの局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤を提供する。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明の治療剤または予防剤は、線維性病変を処置または予防するためのものである。
【００２２】
１つの実施形態において、この線維性病変は、慢性炎症時のものである。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明において用いられるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。
【００２４】
別の局面では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。
【００２５】
この生産方法において好ましい実施形態では、本発明において用いられるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。
【００２６】
別の局面では、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。
【００２７】
さらに別の局面では、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。
【００２８】
なおさらなる別の局面では、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。
【００２９】
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
【発明の効果】
【００３０】
ＨＧＦには線維化抑制作用があることは以前から知られている。ＦＧＦ−２によってＨＧＦ分泌が促進された脂肪由来幹細胞を投与することにより，線維性病変部でＨＧＦが持続的，効果的に作用することが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３２】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００３３】
用語「細胞」は、当該分野におけるその最も広義の意味で本明細書において使用され、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有し、そして細胞のような生物体を外界から隔離する膜構造に包まれる、多細胞生物の組織の構成単位をいう。本発明の方法において、任意の細胞が対象として使用され得る。本発明で使用される細胞の数は、光学顕微鏡により計数することができる。光学顕微鏡を使用して計数する場合は、核の数が計数される。組織を組織切片スライスとし、次いでヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色し、細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を識別する。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であってもよい。細胞の供給源の例としては、単一の細胞培養物；正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織；あるいは正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるが、それらに限定されない。このような供給源自体が、細胞として使用され得る。
【００３４】
本明細書において使用される脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）およびそれに対応する物質は、生物が脂肪細胞またはそれに対応する細胞を有しさえすれば、任意の生物（例えば、哺乳動物など）、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）に由来し得る。１つの実施形態において、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「幹細胞」とは、単分化能性、多能性、または全能性を有する、分化細胞の前駆体（または前駆細胞）をいう。幹細胞は、特定の刺激に応答して分化され得る。代表的に、幹細胞は、損傷された組織を再生することができる。本明細書で使用される幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、あるいは他の前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。上述の能力を有している限り、幹細胞は、人工的に作製した細胞（例えば、融合細胞、再プログラム化された細胞など）であってもよい。胚性幹細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、相対的に限定されたレベルの分化能を有する。組織幹細胞は、組織中に存在し、未分化な細胞内構造を有する。組織幹細胞は、より高い核／細胞質比を有し、そしてわずかな細胞内オルガネラを有する。ほとんどの組織幹細胞は、多能性を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合、脂肪由来幹細胞も使用され得る。
【００３６】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「前駆細胞」とは、子孫にあたる細胞が特定の分化形質を発現することが明らかな場合、分化形質を発現していない未分化な親細胞をいい、多能性未分化細胞だけでなく単分化能性未分化細胞も含む。例えば、子孫にあたる細胞が、血管内皮細胞である場合、その前駆細胞を血管内皮前駆細胞という。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。しかし、幹細胞の分化により得られる前駆細胞は、その幹細胞から見ると「分化細胞」に対応するということができる。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」または「ＬＡＦ」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。
【００３８】
いわゆる吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）（脂肪吸引物の脂肪部分）から単離された細胞は、回収した起源にちなんでＰＬＡ（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）細胞と呼ばれている（例えば、Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２００２；１３：４２７９−４２９５）。そこで、本明細書中でも同様に、脂肪吸引物の脂肪部分から単離した細胞を、ＰＬＡ細胞という。また、本明細書中、脂肪吸引物の液体部分から単離された細胞を、ＬＡＦ（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ ａｓｐｉｒａｔｅ ｆｌｕｉｄ：脂肪吸引物液）細胞という。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪由来前駆細胞」、「脂肪由来幹細胞」および「脂肪由来幹／間質細胞」は、交換可能に使用される用語であり、本明細書では、「ASC」と省略され、脂肪吸引より得られた、幹細胞および前駆細胞をいう。ここでいう前駆細胞は、この脂肪吸引により得られた、末梢血由来の幹細胞または血管間質細胞（脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ））のようなものである。脂肪由来前駆細胞は、脂肪組織または脂肪吸引法により得られた任意の多能性前駆細胞または単分化能性前駆細胞の集団を意味する。この細胞としては、脂肪由来血管間質細胞（＝脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、脂肪由来間質細胞）、脂肪由来幹細胞、脂肪幹細胞、内皮前駆細胞、造血性幹細胞などが挙げられる。このような幹細胞を単離するためのいくつかの技術が、例えば、Ｎａｋａｔｓｕｊｉら「幹細胞研究プロトコール［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ／Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ］」、Ｙｏｄｏｓｈａ（２００１）；ＷＯ００／５３７９５；ＷＯ０３／０２２９８８；ＷＯ０１／６２９０１に記載されるように知られている。これらの文献は、その関連部分において、参考として本明細書中に援用される。本明細書中において使用される場合、ASCとは、これらの公知な単離方法により得られた脂肪組織由来幹細胞を含む、全ての脂肪組織由来幹細胞をいう。本明細書中で使用される場合、「前駆細胞」は、多能性未分化細胞だけでなく、単分化能性未分化細胞も含む。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。
【００４０】
語句「脂肪吸引由来物質」とは、脂肪吸引が行われた際に生成する任意の物質をいう。代表的に、このような脂肪吸引由来物質は、脂肪組織および脂肪吸引物を含む。
【００４１】
語句「脂肪吸引物」とは、脂肪吸引が行われる際に生成する液体をいう。このような脂肪吸引物は、以下：（１）脂肪吸引時に一緒に吸引された液体（例えば、トゥメセント液および血液を含む）または、（２）吸引脂肪を溶液（例えば、生理食塩水）で洗浄する際に生じた廃液、をいう。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）」とは、組織間に位置されるか、あるいは、疎性結合組織または毛細血管周辺の一群として脂肪組織を形成し、そして大量の脂質を含む細胞をいう。脂肪細胞（Ｆａｔ Ｃｅｌｌ）としては、黄色脂肪細胞（ｙｅｌｌｏｗ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）または褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）が挙げられる。これらの細胞は、本明細書中において等価に使用され得る。細胞内の脂肪は、スダンＩＩＩ（Ｓｕｄａｎ ＩＩＩ）または四酸化オスミウムを用いて容易に検出され得る。
【００４３】
本明細書において「線維芽細胞増殖因子」または「繊維芽細胞増殖因子」（ＦＧＦ）とは、中胚葉と神経外胚葉から発生した幅広い細胞の増殖を促進する因子のファミリーであり、具体的には、ＦＧＦ−１ （酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）、ｉｎｔ−２（ＦＧＦ−３）、ｈｓｔ−１（ＦＧＦ−４）、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ−２（ＦＧＦ−６）、ＫＧＦ （ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ−７）、ＦＧＦ−８（ＡＩＧＦ；ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−９（ＧＡＦ；Ｇｌｉａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）などの２０種類以上の分子が含まれる。なお、後述する実施例では、これらＦＧＦのなかでも、ＦＧＦ−２を用いているが、これに限定されるものではなく、他のＦＧＦも適宜用いることができる。なお、ＦＧＦの濃度等は、当業者であれば適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、特に、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４４】
本明細書において「塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）」または「塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）」とは、代表的にアクセッション番号NM_002006（ヒト）で示される配列を有するものをいう。
【００４５】
本明細書において「血小板由来増殖因子」（ＰＤＧＦ）とは、血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす哺乳動物血小板由来増殖因子を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦ−Ａを含むＰＤＧＦの様々なサブタイプを包含する。さらに、ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、コグネイトＰＤＧＦ受容体を通して血管新生又は血管新生過程を刺激するように働く、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−ＤなどのＰＤＧＦ関連血管新生因子を指す。特に、「ＰＤＧＦ」という用語は、（ｉ）ＰＤＧＦＲ−Ｂ又はＰＤＧＦＲ−ＡなどのＰＤＧＦ受容体に結合する；（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化する；及び（ｉｉｉ）これによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす、増殖因子のクラスの成員を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、一般に、応答性細胞型上の血小板由来増殖因子細胞表面受容体（すなわちＰＤＧＦＲ）の結合及び活性化を通してＤＮＡ合成及び有糸分裂誘発を誘導する増殖因子のクラスの成員を指す。ＰＤＧＦは、例えば：定方向細胞遊走（走化性）及び細胞活性化；ホスホリパーゼ活性化；ホスファチジルイノシトール代謝回転及びプロスタグランジン代謝の上昇；応答性細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼ合成の刺激；マトリックス合成、サイトカイン産生及びリポタンパク質取込みを含む細胞代謝活性の変調；間接的に、ＰＤＧＦ受容体を持たない細胞における増殖応答の誘導；及び強力な血管収縮剤作用を含む、特異的生物作用を生じさせる。「ＰＤＧＦ」という用語は、「ＰＤＧＦ」ポリペプチド及びこの対応する「ＰＤＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を包含することが意図されている。
【００４６】
本明細書において「肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）」とは、劇症肝炎患者の血清から見出されたサイトカインで、分子量が約10万のタンパク質であり、その生理作用は非常に広く、肝硬変やアルコール肝炎の治療、糖尿病に起因する虚血性疾患の治療などにも用いられている。ここで使用する、「ＨＧＦ」という用語は、様々なサブタイプを包含する。代表的にアクセッション番号NM_010427（ヒト）で示される配列を有するものをいう
本明細書において使用される「増殖刺激剤」とは、細胞の増殖を正の方向に加速する任意の因子（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子など）をいう。標的が脂肪由来幹細胞であれば、脂肪由来幹細胞増殖刺激剤という。
【００４７】
以上に記載したサイトカイン類は、必要に応じて、GenBankなどから遺伝子の情報（アクセッション番号）を入手して、生産し、またはプローブなどの調製を行うことができる。そのようなアクセッション番号の例としては、上記のほか、実施例において引用したものを挙げることができる。
【００４８】
本明細書において使用される「生産刺激剤」とは、任意の生産物の生産を正の方向に加速する任意の因子（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子など）をいう。標的が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）であれば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤という。
【００４９】
本明細書において、細胞を培養する際に用いることができる培地は、通常の細胞培養用の培地を用いることができ、その具体的な組成等は限定されるものではない。例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）やＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地に、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものを用いることができる。この際、必要に応じて、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合してもよい。なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。さらに、本発明において、培地中にトランスフェリン、インスリン、セレン酸、及びリノール酸からなる群より選択される１種又は２種以上の添加剤を添加することにより、培地中の血清濃度が低い場合でも、通常の血清の使用量と同等若しくはそれ以上の増殖効果を得ることができる。
【００５０】
本明細書において「線維性病変」または「繊維性病変」とは、線維が変性する任意の病変を言う。代表的には、線維性病変としては、慢性関節リウマチ、肺線維症、肝硬変、腎硬化症、心筋梗塞、皮膚筋炎、SLE（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群、強皮症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自己免疫性肝炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化、ASO（閉塞性動脈硬化症）、バージャー病などをあげることができるが、これに限定されない。
【００５１】
本明細書において使用される虚血還流は、線維化形成のモデルでありうる。そして、このような虚血還流の実験は、本明細書中実施例において例証されている。
【００５２】
本明細書において使用される「慢性炎症」とは、あらゆる臓器、組織でおこりうる慢性の炎症一般を指し、たとえば、阻血、感染（微生物）、自己免疫反応（これは非常に多く範囲も広い）、アレルギー、膠原病、リウマチ、毒性物質への暴露（アスベスト、ヒ素、異物など）、毒性物質への暴露（アスベスト、ヒ素など）、動脈硬化などで起こる炎症であり、広く予防、処置が期待されるものである。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「診断、予防、処置または予後のために有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技術を用いて種々のパラメータを参酌することにより、当業者により決定され得る。
【００５４】
本発明が医薬として使用される場合、その医薬は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。当該分野において公知な任意の薬学的に受容可能なキャリアが、本発明の医薬において使用され得る。
【００５５】
薬学的に受容可能なキャリアまたは適切な処方材料としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、および／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞および他の活性成分を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般に使用される他の物質を補充することが可能である。
【００５６】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくはレシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして好ましくは、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
適切なキャリアの例としては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤が、所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらはさらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００５８】
本発明の医薬組成物の一般的な調製法を以下に記載する。動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物なども、公知の技術により製造することができる。
【００５９】
本発明の細胞などは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと配合され、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊インヒビター、吸収促進剤、吸収剤、保湿剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物も、必要に応じて使用され得る。本発明の組成物は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合され得る。非経口の投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。全身投与される場合、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当該技術の範囲内である。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤をさらに含み得る。
【００６１】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。頻度の例としては、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）が挙げられる。好ましくは、投与は、経過を見ながら１週間〜１ヶ月に１回施される。投薬量は、処置される部位が必要とする量を見積もることによって、確定され得る。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「指示書」は、医薬を投与する方法または診断のための方法などを、医師、患者など投与を行う人または投与される人、診断する人（例えば、医師、患者など）または診断される人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与するための適切な方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供される。この指示書は、これに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供される電子媒体（例えば、ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００６３】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用可能なアッセイもしくは機器を使用する標準的な臨床検査の結果または意図される処置に関連する疾患（例えば、創傷など）に特徴的な臨床症状の消滅あるいは美容状態の回復（例えば、外見の回復など）によって支持され得る。治療は、疾患（例えば、創傷）の再発または美容状態の損傷により再開され得る。
【００６４】
本発明はまた、１つ以上の医薬組成物を満たした１つ以上の容器を備える医薬品パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属され得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。このキットは、注射用デバイスを備え得る。
【００６５】
（脂肪由来幹細胞）
脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞は、脂肪吸引物の液体部分（脂肪吸引液）から、例えば以下のように調製することができる。処理方法（１）脂肪組織と等量の０．０７５％コラゲナーゼを加え３７℃で３０分酵素処理する（２）処理後に８００Ｇ×１０分遠心する（３）上層を除去し、沈殿した細胞にＰＢＳを加え、１００μｍポアフィルターを通す（４）フィルターを通った細胞を回収する。（より詳細な条件は、文献Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ ７：２１１−２２８（２００１）、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０８：６４−７６（２００６）などに記載されており、これらを参酌して当業者は脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞を調製することができる。）
脂肪吸引方法は、当業者に周知である技術を用いて、実施することができる。脂肪吸引方法に用いられる装置としては、ケイセイ脱脂吸引機サルポンプＳＡＬ ７６−Ａ（ケイセイ医科工業（株）、東京都文京区本郷３−１９−６）が挙げられるが、これらに限定されない。例えばヒトの場合、０．０００１％アドレナリン入り生理食塩水などの液体を、予定吸引脂肪量の等量から２倍量、脂肪組織内に注入し、その後、内径２〜３ｍｍのカニューレ（金属製吸引管）を用いて、−２５０〜９００ｍｍＨｇ程度の陰圧で吸引することによって行う。
【００６６】
吸引した脂肪細胞を洗浄するために使用される液体として通常は、生理食塩水が用いられる。しかし、生理食塩水以外にも、単離すべき幹細胞に悪影響を与えない液体であれば、任意の液体が使用可能である。具体的には、例えば、リンゲル液、および哺乳動物培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、およびＭＣＤＢ１５３など）のような、任意の等張液が、本発明において使用可能である。
【００６７】
脂肪吸引物から幹細胞を調製する場合、必要に応じて、脂肪吸引物にコラゲナーゼなどの酵素処理を行なうことが可能である。しかし、脂肪吸引物中に含まれるコラーゲンの量は、脂肪組織と比較して相対的に少ないため、幹細胞調製の原料として脂肪吸引物を用いる場合、コラゲナーゼ処理に必要とされる時間、および／または酵素処理に必要とされる酵素量が、脂肪組織の場合よりも、相対的に低い。
【００６８】
脂肪吸引物を遠心分離して細胞画分を得る工程においては、細胞画分と、その他の成分（例えば、血漿、手術時に注入した生理食塩水、麻酔薬、止血薬、破壊された脂肪細胞から漏出した脂質成分）とを分離する任意の条件を用いることができる。例えば、４００〜８００×ｇでの５〜１５分程度の遠心分離を用いることが可能である。
【００６９】
比重による遠心分離により細胞を単離する工程においては、例えば単離された細胞画分を、密度勾配遠心分離にかけることができる。任意の密度勾配遠心分離のために使用可能な媒体が、この媒体として使用され得る。好ましい媒体は、１．０７６〜１．０７８ｇ／ｍｌの比重を有し得る。さらに、好ましい媒体のｐＨは、４．５と７．５との間である。媒体中の好ましいエンドトキシンレベルは、０．１２ＥＵ／ｍｌ以下である。代表的な媒体としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンとの共重合物）、およびパーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられる。フィコールは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク株式会社、東京）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東京）などの名称で市販されている。パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東京）という名称で市販されている。
【００７０】
比重による遠心分離の条件は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを媒体として用いる場合、４００×ｇ、３０〜４０分が用いられ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を媒体として用いる場合、３７０ｃｇ、約３０分が用いられる。リンフォプレップを媒体として用いる場合、条件としては８００×ｇ、約２０分または１１００×ｇ、約１０分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
比重による遠心分離が用いられるときに、最も多い細胞は、通常赤血球細胞であり、赤色の細胞層として確認することができる。幹細胞は、赤血球よりも比重が軽いため、幹細胞を分離する場合には、赤血球よりも軽い細胞層を収集する。好ましくは、比重１．０５０〜１．０７５の範囲の細胞層を収集する。
【００７２】
おおまかな細胞の比重は、パーコール、レディグラッドのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液やスクロース溶液で調製し、収集した細胞と共にデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｒｋｅｒ ｂｅａｄｓ）を加えて遠心し、ビーズによって分けられた５〜１０層のうち、どの層に細胞があるかを確認することで、試験され得る。
【００７３】
さらに、層に分離した細胞の回収は、例えば、ピペットを用いて行なうことができる。
【００７４】
比重による遠心分離においては、セルセパレーター（例えば、血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ）を使用することが可能である。
【００７５】
細胞が脂肪組織から分離される条件は、細胞が脂肪組織から分離され、かつ細胞の単離を促進する条件であり得る。このような条件としては、例えば、Ｗａｋｏより入手可能なコラゲナーゼ（細胞分散のためのコラゲナーゼ、０３２−１０５３４）を添加するような、細胞外マトリクスの分解が挙げられるが、これに限定されない。このようなコラゲナーゼは、濃度０．０７５％にてＰＢＳ中に溶解し、この溶液を３７℃まで温めて脂肪と等量を添加する。そのサンプルを３７℃にて８０ｒｐｍで３０分間攪拌するために、アジテーターが使用される。
【００７６】
好ましくは、本発明の方法は、高度の幹細胞純度を達成するために、血球細胞を除去する工程をさらに包含する。しかし、このような血球細胞は、続いてディッシュ上で培養し、この細胞集団を継代し、８０％を超える（好ましくは、９０％を超える）幹細胞を生じさせることにより除去され得る。このような血球細胞は、血球細胞を分解する成分を添加する工程を包含する血球除去工程により、除去され得る。
【００７７】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態が説明される。以下の実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。本明細書中を参酌して、本発明の範囲を逸脱することなく、変更および修正を行い得ることが、当業者に明らかに理解される。
【００７８】
本発明者らは、ヒトおよびマウスの脂肪由来幹細胞／間質細胞（ＡＳＣ）に対する障害関連増殖因子の作用を分析し、ＦＧＦ−２が、ＪＮＫシグナル伝達経路を介してＡＳＣによるＨＧＦ分泌を誘導すること、そして、アップレギュレートされたＨＧＦの産生が、損傷を受けた脂肪組織における線維化を防ぐ助けとなることを見出した。
【００７９】
本発明者らの結果は、損傷後の脂肪組織修復においてＡＳＣが主要な増殖細胞集団として重要な役割を果たすことを示した。ＦＧＦ−２−ＪＮＫ−ＨＧＦ機構を通じて、ＡＳＣは、損傷後に、線維化を防ぎ、脂肪組織の体積を維持し、そして、脂肪組織の機能を向上する助けとなる。
【００８０】
本発明者らは、脂肪の損傷および修復についての新規動物モデルを開発および使用した。この動物モデルは、脂肪細胞および毛細管の再構築を伴う脂肪組織の損傷および再生の再現性のある結果を提供し、この全ては、２週間以内に完了した。
【００８１】
本研究の結果は、損傷応答におけるＡＳＣについての新しい役割を明らかにし、そして、ＡＳＣの治療上の可能性に新しい見通しを提供した。ＡＳＣを用いた細胞治療は、特に、ＦＧＦ−２で前処理をするか、または、ＦＧＦ−２と組み合わせたとき、組織の修復を加速し、線維化を減らし、そして、ＨＧＦの作用によって急性または慢性の炎症により損ねられた臓器の機能を改善し、同様に、自家脂肪移植片の活着を改善する。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明者らは、脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの役割に焦点を当て、そして、損傷に関連する増殖因子の中でも、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増殖とＨＧＦ分泌を強く促進したことを見出した。脂肪組織の虚血再潅流障害のマウスモデルにおいて、壊死性およびアポトーシス性の変化に続く再生性の変化が２週間にわたり見られた。損傷を受けた脂肪組織によるＦＧＦ−２の短時間の放出の後、ＨＧＦのアップレギュレーションが続いた。脂肪組織の再構築過程の間に、ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は、ＣＤ３４＋であり、そして、ＡＳＣではないかと疑われた。ＪＮＫシグナル伝達の阻害は、ＡＳＣの増殖と移動を阻害し、そして、再構築過程の進行を妨げた。さらに、ＦＧＦ−２またはＪＮＫシグナル伝達の阻害は、損傷後のＨＧＦのアップレギュレーションを妨げ、そして、損傷を受けた脂肪組織における線維化の増加をもたらした。線維化の増加はまた、ＨＧＦに対する中和抗体の投与の後にも起こった。
【００８３】
したがって、結論として、損傷を受けた組織から放出されるＦＧＦ−２は、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣを刺激して増殖させ、そしてＨＧＦを分泌するように機能し、損傷後の脂肪組織の再生と線維化抑制に寄与する。本研究は、損傷に対する応答におけるＡＳＣについての機能的な役割を明らかにし、そして、ＡＳＣの治療的な可能性に、新しい見通しを提供することができる。
【００８４】
（治療剤および予防剤）
１つの局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤を提供する。
【００８５】
本発明の治療剤または予防剤は、従来の技術に比べて、以下の点で顕著な効果を奏する。理論に束縛されることを望まないが、たとえば、本発明の治療剤または予防剤は、従来のものに比べて、線維性病変を効率的に治療する、より効果的に線維化を予防する、より効果的に血管新生を促進する、より効果的に組織の再生・正常なターンオーバーを促進するなどの効果を奏する。また、本発明において細胞を用いることにより、持続的かつ安全なＨＧＦの分泌（投与）が実現できるという利点もある。
【００８６】
特に、本発明の脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤は、線維性病変を処置または予防するために使用されることが本発明において実証された。
【００８７】
ここで、本発明によって治療または予防されうる「線維性病変」としては、たとえば、性関節リウマチ、肺線維症、肝硬変、腎硬化症、心筋梗塞、皮膚筋炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群、強皮症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自己免疫性肝炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化、ＡＳＯ（閉塞性動脈硬化症）、バージャー病などを挙げることができるが、これらに限定されない。線維性の病変の改善が所望される任意の疾患が本発明の対象であるというべきである。
【００８８】
１つの実施形態では、特に、本発明が標的とする線維性病変は、慢性炎症時のものである。慢性炎症時のものの処置については、従来有効な処置法が提供されているとはいいがたく、よりよい治療・予防剤の提供が望まれていた。そこで、本発明の治療剤または予防剤は、従来の技術に比べて、以下の点で顕著な効果を奏する。理論に束縛されることを望まないが、形質転換されていない細胞が分泌するものであるため副作用が小さいと考えられることから、慢性炎症が従来に増して抑制されることが期待される。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦ−２が好ましい理由としては、たとえば、ＦＧＦ−２はすでに医薬品として承認されており、その安全性についての情報が十分であること（科研製薬から販売されているものを使用することができる。）、また、徐放化製剤の治験も行われており、将来的に使用が容易になることが予想されること、形質転換されていない自己の細胞を使うことにより、その安全性が高いと思われること、他の因子の分泌など付随した利益が期待できることなど、種々の有利な点が存在する。
【００９０】
（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。この生産方法では、驚くべきことに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養することによって、予想外にＨＧＦの生産が促進された。また、従来の文献（たとえば、非特許文献１７、２１など）でも、術後ドレーンを解析したのみであり各ＧＦ量変化のメカニズムやパラクライン的な作用については記載はなく、ＡＳＣの遺伝子発現等についてはデータがなく、ＡＳＣがＨＧＦを分泌することはなんら記載も示唆もしていない。したがって、本発明のＨＧＦ生産刺激剤としての効果は、予想外であったといえる。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦ−２がＨＧＦ生産を促進することが予想外であった理由は、以下のとおりである：従来技術で想定されていたものより、本発明のものはその分泌能が非常に高く、その分泌能がｂＦＧＦを継続的に投与した場合に特に飛躍的に高い分泌能が見られることは通常他の因子や細胞においても稀にしか見られないことから、従来のＨＧＦ生産技術から飛躍的な効果が期待される。また、本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９１】
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。
【００９２】
本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９３】
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦが脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激することが予想外であった理由は、以下のとおりである：ＨＧＦが分泌されることは予想外ではないが、その分泌能が非常に高く、その分泌能がｂＦＧＦを継続的に投与した場合に特に飛躍的に高い分泌能が見られることは通常他の因子や細胞においても稀にしか見られないことである。本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９４】
（脂肪由来幹細胞を用いる疾患または障害を治療または予防する方法）
別の局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。また、本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
【００９５】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９６】
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ等から得ることができる。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、事前に同意（インフォームドコンセント）を得た上で実験を行った。
【００９７】
（実施例１：脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの効果）
本実施例では、脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの効果を実証した。
【００９８】
（材料および方法）
細胞の単離および培養
腹部または大腿部の脂肪吸引を受けた健康な女性ドナーからインフォームドコンセントを得た後に、倫理調査委員会により承認されたプロトコールを用いて、脂肪吸引術による吸引物をこれらのドナーから得た。ＡＳＣを、以前に記載されたようにして、吸引された脂肪から単離した（Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Characterization offreshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portionsof liposuction aspirates」J Cell Physiol 2006; 208: 64-76）。簡単に述べると、吸引された脂肪を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして、シェーカー上で、０．０７５％コラゲナーゼを含むＰＢＳ中、３７℃にて３０分間、消化した。遠心分離（８００×ｇ、１０分間）により、ペレットから成熟脂肪細胞と結合組織を分離した。細胞ペレットを再懸濁し、１００μｍメッシュを通してろ過し、そして、５×１０５の有核細胞／１０ｃｍシャーレの密度で播種し、そして、加湿空気中５％ ＣＯ２の雰囲気において、３７℃で培養した。培養培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）であった。始原細胞を７日間培養し、そして、「パッセージ０」として規定した。培地は、３日毎に交換した。細胞を、トリプシン処理により毎週継代した。パッセージ１〜３のヒトＡＳＣを実験に使用した。マウスＡＳＣを分離するために、６週齢の雄性ＩＣＲマウスの鼠径部の脂肪パッドから脂肪組織を得た。この脂肪組織を、２〜３ｍｍ角に細かく切り、そして、上記のように処理した。パッセージ１〜３のマウスＡＳＣを実験に使用した。ヒト真皮線維芽細胞（ｈＤＦ）を、別々のドナーからの皮膚サンプルの外植片から得た；パッセージ３〜５のｈＤＦを実験に使用した。パッセージ２で凍結された、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した；パッセージ３〜５のｈＢＭ−ＭＳＣを実験に使用した。
【００９９】
増殖アッセイ
ヒトＡＳＣを２×１０４細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。障害関連増殖因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦおよびＰＤＧＦ；全て、和光純薬製）の各々を、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度でコントロール培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）に加えた。細胞カウンター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒＴＭ，Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、培地中で３日後、６日後および９日後に、細胞数をカウントした。他の細胞型について、１０ｃｍシャーレに２×１０５細胞を播種し、そして、７日後に細胞数をカウントした。
【０１００】
フローサイトメトリー
１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に７日間培養したヒトＡＳＣを、フローサイトメトリーを用いて、表面マーカー発現について調べた。以下の蛍光色素結合化モノクローナル抗体を使用した：抗ＣＤ３１−ＰＥ、抗ＣＤ３４−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗Ｆｌｋ−１−ＰＥおよび抗Ｔｉｅ−２−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。細胞を、各抗体と共に３０分間インキュベートし、次いで、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ゲートは、問題とされる抗体と無関係の抗体との組み合わせを用いた染色に基づき、無関係の抗体を用いた場合に細胞の０．１％以下が陽性となるように設定した。
【０１０１】
定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
本発明者らは、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に培養したヒトＡＳＣからＲＮＡを単離した。他の細胞型については、ＲＮＡを、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ってか、または伴わずに培養した細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２μｇの総ＲＮＡを単離し、その後、逆転写反応を行った。本発明者らは、ＡＢＩ ７７００配列検出システム、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと、以下の予め設計されたプライマーおよびフルオレセイン標識プローブとを用いて、ｃＤＮＡを４０サイクル増幅した：ヒトＶＥＧＦ（Ｈｓ００９０００５４＿ｍ１）；ＦＧＦ−２（Ｈｓ００２６６６４５＿ｍ１）；ＨＧＦ（Ｈｓ００３００１５９＿ｍ１）；ＰＤＧＦ（Ｈｓ００２３４０４２＿ｍ１）；ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）；マウスＶＥＧＦ（Ｍｍ００４３７３０４＿ｍ１）；ＦＧＦ−２（Ｍｍ００４３３２８７＿ｍ１）；ＨＧＦ（Ｍｍ０１１３５１８２＿ｍ１）；およびＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１；全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製）。本発明者らは、ＧＡＰＤＨを内部参照遺伝子として用いて、相対的ＣＴ法により発現レベルを算出した。
【０１０２】
酵素結合免疫吸着定量法による、ＨＧＦタンパク質の定量
ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ってか、または伴わずに７２時間培養したヒトＡＳＣの馴化培地を、ヒトＨＧＦ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）についてのＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。データは、収穫の時点での１０６細胞あたりの分泌された因子として表した。
【０１０３】
ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害
３つのシグナル伝達経路の各々について１つの選択的なインヒビター（ＥＲＫインヒビターであるＵ０１２６、ｐ３８タンパク質インヒビターであるＳＢ２０２１９０、およびＪＮＫインヒビターであるＳＰ６００１２５；全て、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製）を１０μＭの濃度で、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に加え、そして、増殖アッセイおよびリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、増殖および遺伝子発現に対する作用を調べた。
【０１０４】
ＪＮＫ活性アッセイ
細胞ベースのＥＬＩＳＡキット（ＣＡＳＥＴＭ Ｋｉｔ，ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を製品説明書に従って使用して、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の程度によりＪＮＫの活性を測定した。簡単に述べると、ヒトＡＳＣを、１ウェルあたり２×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに播種し、そして、一晩静着させた。次いで、細胞を無血清培地中で２４時間養分を絶った。細胞をビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ）、Ｕ０１２６、ＳＢ２０２１９０またはＳＰ６００１２５と共に１５分間前処理した後、これらを、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）に１５分間曝露した。抗ホスホ−ｃ−Ｊｕｎ（セリン７３）抗体および抗汎Ｃ−Ｊｕｎ抗体を用いて、活性化された（リン酸化された）ｃ−Ｊｕｎタンパク質と、総ｃ−Ｊｕｎタンパク質の量を測定した。
【０１０５】
脂肪組織に対する虚血再潅流障害についてのマウスモデル
動物の世話は、施設のガイドラインに従った。６週齢のＩＣＲマウスを、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて麻酔し、そして、鼠径部領域に２ｃｍの切開をつくった。インタクトな大腿動脈から延びる栄養大動脈と共に、鼠径部皮下の脂肪パッドを持ち上げた。脂肪パッドから皮膚まで延びる細い交通枝を、電気凝固した。大動脈を、血管マイクロクリップで３時間にわたり締め付け、次いで、解放して再潅流させた。虚血再潅流障害後、種々の時間間隔（１日目、３日目、７日目および１４日目）で脂肪組織サンプルを採取し、そして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび組織学（ヘマトキシリン−エオジン染色、Ａｚａｎ染色など；以下を参照のこと）により調べた。擬似手術を行った動物（虚血再潅流なし）からの脂肪サンプルをコントロールサンプルとして使用した。
【０１０６】
インビボ阻害アッセイ
０．５μｌ／ｈの速度で液体を放出する浸透性ポンプ（Ｍｏｄｅｌ １００７Ｄ，ＡＬＺＥＴ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を用いて、約７日間にわたり、インヒビター溶液を注入した。１００μｌのＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５；１０μＭ）、ヤギ抗ＦＧＦ−２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５０μｇ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５０μｇ／ｍｌ）を含むポンプ、または、コントロールのＰＢＳを含むポンプを再潅流時に皮下に移植した。
【０１０７】
アポトーシスおよび増殖の組織学的検出
脂肪組織における虚血再潅流障害後のアポトーシスを検出するために、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼにより媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を行った。増殖細胞を検出するために、組織を採取する６時間前および３時間前に、１ｍｇの５−ブロモ−２−デキシウリジン（ＢｒｄＵ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内投与した。ＢｒｄＵ Ｉｎ−Ｓｉｔｕ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＢｒｄＵ陽性細胞を検出した。切片１枚あたり３つの無作為に選択した視野を用いて、ＴＵＮＥＬまたはＢｒｄＵ陽性細胞の数を、倍率２００×でカウントした。
【０１０８】
免疫組織化学
採取した脂肪組織サンプルを、亜鉛固定し（Ｚｉｎｃ Ｆｉｘａｔｉｖｅ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、そして、パラフィン包埋した。本発明者らは、６μｍ厚の切片を調製し、そして、以下の一次抗体を用いて免疫染色を行った：ヤギ抗ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＣＤ６８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ヤギ抗マウスＣＤ３４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびビオチン化マウス抗ＢｒｄＵ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた可視化のために、各一次抗体に適切なペルキシダーゼを結合した二次抗体（ニチレイ生化学Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、または、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。二重蛍光染色のために、以下の二次抗体または試薬を使用した：Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８を結合したウサギ抗ラットＩｇＧ、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８または５６８を結合したロバ抗ヤギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５６８を結合したストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【０１０９】
生存組織の画像化
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの手順を用いて、生存脂肪組織の可視化を行った（Nishimura S., Manabe I., NagasakiM. et al. 「Adipogenesis in obesity requires close interplay betweendifferentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes 2007; 56:1517-1526）。簡単に述べると、脂肪組織を３ｍｍ角に細かく切り、そして、以下の試薬とともに３０分間インキュベートした：脂肪細胞を染色するためのＢＯＤＩＰＹＴＭ ５５８／５６８またはＢＯＤＩＰＹＴＭ−ＦＬ（両方とも、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）、内皮細胞を染色するためのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８を結合したイソレクチンｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ−ＩＢ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、全核を染色するためのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（同仁堂Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、または、壊死細胞の核を染色するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。次いで、サンプルを洗浄し、そして、共焦点顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を用いて直接観察した。
【０１１０】
統計的解析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。２群間の比較は、Ｗｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。多群間の比較は、複数比較のための補正を行って、分散解析により行った。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。
【０１１１】
（結果）
ヒトＡＳＣ増殖に対する障害関連増殖因子の作用
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、濃度依存的にヒトＡＳＣの増殖を促進し、一方で、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、ＡＳＣの増殖を促進しなかった（図１Ａ）。形態学的には、ＦＧＦ−２と共に培養したＡＳＣは、他の増殖因子と共に培養したＡＳＣよりも小さかった（図１Ｂ）。
【０１１２】
ヒトＡＳＣに対する障害関連増殖因子の表現型による作用
フローサイトメトリーは、あらゆる障害関連増殖因子による内皮表面マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１およびＴｉｅ−２）の発現において有意な差は示さず、少なくともいかなる細胞外マトリックスもなしで培養した場合に、単一の因子の補充だけでは、ヒトＡＳＣの内皮性の分化を誘導するには不十分であることが示唆された（図１Ｃ）。
【０１１３】
ヒトＡＳＣによる発現に対する障害関連増殖因子の相互作用
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、ヒトＡＳＣによるその自己転写体の発現を有意にダウンレギュレートし、そして、ＦＧＦ−２はまた、ＰＤＧＦ ｍＲＮＡ発現も有意に抑制した（図２Ａ）。より興味深いことに、ＦＧＦ−２は、ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現において顕著な増加を促進した。経時的な評価により、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは二相性であり、６時間で最初のピークに達し、そして２４時間後に顕著な増加が始まることが明らかとなった（図２Ｂ）。培養培地のＥＬＩＳＡにより、ＦＧＦ−２により刺激されたヒトＡＳＣによるＨＧＦタンパク質の分泌は、３日目に有意に増加したことが実証された（図２Ｃ）。
【０１１４】
ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２誘導性作用の細胞内シグナル伝達経路
ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２の増殖促進作用は、ＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５）により有意に阻害されたが、ＥＲＫインヒビター（Ｕ０１２６）またはｐ３８インヒビター（ＳＢ２０２１９０）では阻害されなかった（図３Ａ）。ＦＧＦ−２によるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションもまた、ＪＮＫインヒビターによって有意に阻害された（図３Ｂ）。ＥＲＫインヒビターおよびｐ３８インヒビターの投与は、ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現レベルをわずかに減少したが、この変化は、統計的に有意ではなく、ＪＮＫと他のシグナル伝達経路との間の混線が示唆された。ＦＧＦ−２処理により増加されたＪＮＫシグナル伝達経路の典型的な核エフェクターであるｃ−Ｊｕｎのリン酸化と、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のＦＧＦ−２誘導性のアップレギュレーションとは、ＪＮＫインヒビターを用いた前処理により完全に防止された（図３Ｃ）。これらの結果は、ＦＧＦ−２が、ＪＮＫシグナル伝達経路を通じて、増殖とＨＧＦ ｍＲＮＡ発現とを優先的に促進することを示す。
【０１１５】
ヒトＡＳＣおよび他の細胞型におけるＦＧＦ−２誘導性作用
細胞増殖は、研究に用いた４つ全ての細胞型（ヒトＡＳＣ、ヒトＤＦ、ヒトＢＭ−ＭＳＣおよびマウスＡＳＣ）により促進されたが、基礎的な増殖能力は、細胞型間で異なった。ＦＧＦ−２により増進された細胞増殖は、検討した全ての細胞型においてＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５）によって有意に阻害された（図３Ｄ）。ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現もまた、全ての細胞型において、ＦＧＦ−２により促進され、そして、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣを除いて、ＪＮＫインヒビターにより有意に阻害された（図３Ｅ）。これらのことから、ＦＧＦ−２によるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣにおいてはＪＮＫ以外のシグナル伝達経路により媒介されることが示唆された。
【０１１６】
マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の修復
マウス鼠径部の脂肪パッドは、一貫して、解剖学的に異常のない栄養大動脈および大静脈を有し、このことにより、再現性のある虚血再潅流障害実験が可能となった（図４Ａ）。組織学的には、早くも１日目には血球の間質浸潤が観察され、そして、この間質浸潤は３日目に最も顕著であった。小さなサイズの脂肪細胞が１日目に現れ、そして、３日目には数が増えていた。このことから、脂肪分解または脂肪生成は、脂肪組織の全体にわたって起こることが示唆された。７日目には、浸潤性の赤血球が消失し、そして、いくつかの脂肪細胞はサイズが大きくなる一方で、相当数の有核細胞は、脂肪細胞間の間隙空間に残ったままであった（図４Ｂ）。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞数は、１日目から増加し、そして、３日目にピークを迎えたが（図４Ｃ）、ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞は、１日目に有意に高い頻度（有核細胞の６〜９％）で観察され、そして、その後減少した（図４Ｄ）。さらに、ＰＩ陽性の壊死細胞の増加が３日目に観察され、そして、これらの細胞の中には、レクチン陽性のものもあった。これらのことから、毛細管内皮細胞の中には、壊死を起こしているものもあり、そして、毛細管の再構築が進行中であったことが示唆された（図４Ｅ）。これらの結果は、脂肪組織が再潅流直後に損傷を受け、アポトーシスおよび壊死が脂肪変質過程に関与し、そして、その後に、再生上の変化が生じることを示唆する。
【０１１７】
ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも１日目には免疫組織化学により間質組織において検出され、その検出ピークは３日目であったが、そう多くないＦＧＦ−２が、７日目に発現されていた（図５Ａ）。一方、そう多くないＨＧＦタンパク質が１日目に検出されたが、ＨＧＦの発現は、３日目から、少なくとも７日目までに上昇した（図５Ｂ）。興味深いことに、ＦＧＦ−２ ｍＲＮＡは、損傷直後から第一週目を通じてダウンレギュレートされており、ＦＧＦ−２は、ＡＳＣのような生存細胞により産生されるのではなく、細胞外マトリックスまたは瀕死の細胞のような損傷を受けた脂肪組織の貯蔵庫から放出されることが示唆された。放出されたＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣにおいてインビトロで観察されるように、損傷を受けた脂肪組織においてＡＳＣによるＦＧＦ−２ ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートし得る。対照的に、組織におけるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現は、３日目に有意に上昇したが、１日目と７日目には上昇しておらず（図５Ｃ）、ＨＧＦ ｍＲＮＡの遅れたアップレギュレーションと、ＨＧＦの分泌とは、おそらく、先行するＦＧＦ−２タンパク質の放出により誘導されるということが示唆された。
【０１１８】
損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象
損傷を受ける前、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞（ＡＳＣとみなす）は、インタクトな脂肪組織の全体にわたって見られ、成熟な脂肪細胞の間に位置し、そして、特に、血管周辺で豊富であった（図６Ａ）。ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞の数は、明らかにＣＤ３１＋内皮細胞（ＣＤ３４について、陰性、または、かすかに陽性であった）の数よりもかなり多かった。損傷後３日で検出されることが多かったＢｒｄＵ陽性増殖細胞の大部分はまた、ＣＤ３４についても陽性であり（図６Ｂ上段）、そして、ＣＤ３４＋細胞の多くは、レクチン陰性であり（図６Ｂ下段）、ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣが、修復過程において実質的な役割を担うことが示唆された。生存組織の画像化により、間隙空間と小さなサイズの脂肪細胞の増加、レクチン陽性の円形細胞を含む有核細胞数の増加（図６Ｃ）、そして、特に小さなサイズの脂肪細胞の周囲での毛細管（図８Ａ）が明らかとなった。７日目には、大きなサイズの脂肪細胞はＪＮＫインヒビターで処理したサンプルにおいては観察されず、一方で、未処理のモデルにおいては大きなサイズの脂肪組織が観察された（図６Ｃ）。さらに、ＰＩ陽性の核は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞において観察された。このことから、毛細管の内皮細胞（図４Ｄ）だけでなく、脂肪細胞（図６Ｄ）もまた、壊死を起こしていたことが示唆される。７日目には、ＰＩ陽性の核が依然としてＪＮＫで処置したサンプルにおいては観察されたが、未処理のモデルにおいてはほとんど検出されなかった（図６Ｄ）。ＪＮＫインヒビターはまた、３日目と７日目に、ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣの増殖および移動を抑制した（図６Ｅ）。これらの結果は、脂肪細胞および毛細管を伴う脂肪組織の再構築が、損傷後の第一週の間に進行中であり、そして、組織修復過程は、ＪＮＫインヒビターでの処置により損ねられたことを示唆する。ＣＤ６８＋細胞は、浸潤性のマクロファージとして、インタクトな脂肪組織においてほとんど検出されなかった（図８Ｂ）。しかし、浸潤したマクロファージは、損傷後の小さなサイズの脂肪細胞様の細胞の周囲に凝集したのが観察され、これは、食作用を示唆するものである。ＣＤ６８＋細胞のこの凝集は、損傷後３日目に最も多く観察された。
【０１１９】
虚血再潅流障害後のＨＧＦ発現および線維化に対するシグナル阻害の影響
ＪＮＫインヒビター、または、ＦＧＦ−２に対する中和抗体の投与は、３日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを完全に妨げ（図７Ａ）、そして、７日目には、ＨＧＦの分泌を抑制した（図７Ｂ）。２週間目の線維性領域の組織学的測量は、脂肪組織に対する再潅流障害は、線維性領域の有意な増加（１０％から２３％への増加）をもたらしたことを明らかにした。さらに、ＪＮＫまたはＦＧＦ−２シグナル伝達の阻害は、ビヒクルのみの投与と比べて、線維性領域のさらに有意な増加をもたらした。有意に増加した線維化はまた、抗ＨＧＦ抗体で処置した群においても観察された（図７Ｃ）。これらの結果は、損傷を受けた脂肪組織において見られる線維化が、脂肪組織の修復過程においてＨＧＦにより抑制されたことを示し、そして、主にＡＳＣからのＨＧＦの分泌が、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＦＧＦ−２により誘導されたことが示唆された。
【０１２０】
（考察）
ヒト脂肪組織に対して機械的に損傷を加えた後、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βおよびＰＤＧＦがまず、創傷治癒の早い段階で分泌される。その後、上記増殖因子が低下するにつれ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌が、損傷後の第一週の間に次第に増加する（Aiba-Kojima E., Tsuno N.H., Inoue K. et al. 「Characterization ofwound drainage fluids as a source of soluble factors associated with woundhealing: Comparison with platelet-rich plasma and potential use in cell culture」WoundRepair Regen 2007; 15: 511-520）。本発明者らの結果から、これらの障害関連増殖因子の中でも、ＦＧＦ−２が主にＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増殖と、ＡＳＣによるＨＧＦの分泌とを促進したことが示唆された。ＦＧＦ−２は、血管新生（MontesanoR., Vassalli JD., Baird A. et al. 「Basic fibroblast growth factor inducesangiogenesis in vitro」Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 7297-7301）と、細胞増殖（NissenN.N., Polverini P.J., Gamelli R.L. et al. 「Basic fibroblast growth factormediates angiogenic activity in early surgical wounds」Surgery 1996; 119:457-465）の重要な内因性刺激因子であり、創傷治癒の早い時期に放出されることが知られる（Cordon-Cardo C., Vlodavsky I.,Haimovitz-Friedman A. et al. 「Expression of basic fibroblast growth factor innormal human tissues」Lab Invest 1990; 63: 832-840；Schulze-Osthoff K., Risau W.,Vollmer E. et al. 「In situ detection of basic fibroblast growth factor by highlyspecific antibodies」Am J Pathol 1990; 137: 85-92）。細胞のＦＧＦ−２は、種々の細胞型（例えば、線維芽細胞（TakimiyaM., Saigusa K., Aoki Y. 「Immunohistochemical study of basic fibroblast growthfactor and vascular endothelial growth factor expression for age determinationof cutaneous wound」Am J Forensic Med Pathol 2002; 23: 264-267）および内皮細胞（MuthukrishnanL., Warder E., McNeil P.L. 「Basic fibroblast growth factor is efficientlyreleased from a cytolsolic storage site through plasma membrane disruptions ofendothelial cells」J Cell Physiol 1991; 148: 1-16））が溶解する間に創傷の周囲で放出され、一方で、細胞外マトリックス内に束縛されたＦＧＦ−２は、種々の創傷プロテアーゼの作用により解放される（BashkinP., Doctrow S., Klagsburn M. et al. 「Basic fibroblast growth factor binds tosubendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase andheparin-like molecules」Biochemistry 1989; 28: 1737-1743；Ishai-Michaeli R.,Eldor A., Vlodavsky I. 「Heparanase activity expressed by platelets,neutrophils, and lymphoma cells releases active fibroblast growth factor fromextracellular matrix」Cell Regul 1990; 1: 833-842）。ＪＮＫシグナル伝達は、本研究において明らかにされたように、ＦＧＦ誘導性のＡＳＣ増殖においてのみ関与するのではなく、ヒトＡＳＣのＰＤＧＦ誘導性の増殖および移動にも関与する（KangY.J., Jeon E.S., Song H.Y. et al. 「Role of c-Jun N-terminal kinase in thePDGFinduced proliferation and migration of human adipose tissue-derivedmesenchymal stem cells」J Cell Biochem 2005; 95: 1135-1145）。それゆえ、本研究に使用したＪＮＫインヒビターは、ＡＳＣに対するＦＧＦ−２およびＰＤＧＦの両方の生物学的な作用を阻害するようである。ＰＤＧＦは、ＡＳＣの増殖を促進したが、ＡＳＣによるＨＧＦの発現に対しては有意な作用を示さなかった。他の研究者が報告するように、ＦＧＦ−２およびＥＧＦの両方が、ＡＳＣによるＨＧＦの分泌を促進した（KilroyG.E., Foster S.J., Wu X. et al. 「Cytokine profile of human adipose-derived stemcells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors」JCell Physiol 2007; 212: 702-709）；それゆえ、ＪＮＫはまた、ＡＳＣによるＥＧＦ誘導性のＨＧＦの分泌に関与し得る。
【０１２１】
本発明者らがＡＳＣについて観察したＦＧＦ−２により増強された細胞増殖とＨＧＦの産生とが、ＢＭ−ＭＳＣおよびＤＦのような他の間葉系細胞型においても観察されたが、ヒトＢＭ−ＭＳＣにおけるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＪＮＫ以外のシグナルにより媒介されたことは興味深い。ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦのアップレギュレーションは、平滑筋細胞（Onimaru M., Yonemitsu Y., Tanii M. et al. 「Fibroblast growthfactor-2 gene transfer can stimulate hepatocyte growth factor expressionirrespective of hypoxia-mediated downregulation in ischemic limbs」Circ Res2002; 91: 923-930）、肺組織に由来する線維芽細胞様細胞（Roletto F., Galvani A.P., Cristiani C. etal. 「Basic fibroblast growth factor stimulates hepatocyte growth factor/scatterfactor secretion by human mesenchymal cells」J Cell Physiol 1996; 166: 105-111）および骨芽細胞（BlanquaertF., Delany A.M., Canalis E. 「Fibroblast growth factor-2 induces hepatocytesgrowth factor/scatter factor expression in osteoblasts」Endocrinology 1999; 140:1069-1074）;のような他の細胞型において観察された；しかしながら、細胞内シグナル伝達機構は、十分には研究されていない。インターロイキン−１（MatsumotoK., Okazaki H., Nakamura T. 「Up-regulation of hepatocyte growth factor geneexpression by interleukin-1 in human skin fibroblasts」Biochem Biophys ResCommun 1992; 188: 235-243）、インターフェロン−γ（Takami Y., Motoki T., Yamamoto I. et al. 「Synergisticinduction of hepatocyte growth factor in human skin fibroblasts by theinflammatory cytokines interleukin-1 and interferon-gamma」Biochem Biophys ResCommun 2005; 327: 212-217）およびアスコルビン酸（Wu Y.L., Gohda E., Iwao M. et al. 「Stimulationof hepatocyte growth factor production by ascorbic acid and its stable2-glucoside」Growth Horm IGF Res 1998; 8: 421-428）のような他の因子もまた、ＨＧＦの産生を刺激することが報告されている。ＨＧＦは、血管新生および創傷治癒の重要なメディエーターであり、そしてその発現は、種々の細胞および組織において多数の因子によって調節されているようである。
【０１２２】
脂肪組織における損傷および修復の過程は、おそらくは、標準的な動物モデルが存在しないことが原因で、十分には研究されていない。損傷を受けた脂肪組織において、損傷後の早い段階での壊死性およびアポトーシス性の変化とその後の浮腫および出血、ならびに、食作用、細胞の浸潤および増殖のような炎症性および再生性の変化が、第一週を通じて観察された。壊死性の変化は、毛細管の内皮細胞および脂肪細胞において見られ、脂肪組織の再構築と、その修復過程とが、ＪＮＫインヒビターにより損ねられることが示唆された。ＨＧＦが分泌された後、この組織から束縛されていたかまたは他の形態にあったＦＧＦ−２が放出された；ＨＧＦのアップレギュレーションは、主に、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＦＧＦ−２により刺激されたＡＳＣから導かれるようである。というのも、ＡＳＣは、脂肪組織に由来する間質の血管画分内の間葉系細胞の半分より多くを構成することが知られているからである（Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Characterization offreshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portionsof liposuction aspirates」J Cell Physiol 2006; 208: 64-76）。この研究において使用した虚血再潅流モデルは、脂肪組織の損傷および再生の再現性のある結果を提供し、損傷および再生は全て、２週間以内に完了した。
【０１２３】
脂肪組織において、ＡＳＣであることが示唆されたＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞は、損傷前は、脂肪細胞（毛細管に密接に関連するもの）と周囲の血管壁（特に、外膜において）との間に多く見られた。血管内皮細胞へと分化して、毛細管の新芽を形成する能力を有するＣＤ３４＋血管壁内在前駆細胞は、以前に報告されており（Zengin E., Chalajour F., Gehling U.M. et al. 「Vascular wall residentprogenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis」Development 2006;133:1543-1551）、そしてこの集団は、ＡＳＣを構成する一部分である可能性がある。一方で、血管周皮細胞の特徴を有するＡＳＣの血管周皮亜集団もまた特徴付けられている（TraktuevD., Merfeld-Clauss S., Li J. et al. 「A population of multipotent CD34-positiveadipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside ina periendothelial location, and stabilize endothelial networks」Circ Res 2008;102: 77-85）。ＡＳＣは、異種性の亜集団を構成し得、そして、インビボにおけるＡＳＣの特徴および機能を解明する際の複雑さを説明し得る。以前に示唆されたように、脂肪生成と血管新生との間には密接な関係性が存在し、それゆえ、最初は脂肪細胞の前駆体細胞とみなされていたＡＳＣは、脂肪生成と血管新生の前駆体として機能し得（非特許文献５）、そして、肥満（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526）、脂肪組織のターンオーバー、および損傷後の脂肪組織の修復のような種々の状況において、脂肪細胞と血球と血管との間の相互関係を管理し得る。組織再生の間、コントロールと比べてより多くのＣＤ３４＋／ＣＤ３１−のＡＳＣが、脂肪細胞の間に見られ、３日目に見られたＢｒｄＵ陽性の増殖細胞の多くは、ＣＤ３４＋／レクチン−であった。これらのことから、ＡＳＣが増殖し、そして、脂肪生成および血管新生のような修復過程に関与していることが示唆された。ＡＳＣの増殖および移動は、ＪＮＫインヒビターの処置により強く阻害され、その結果、組織修復が遅延され、かつ損ねられ、同時に、線維化が増加した。マクロファージは、脂肪組織における炎症と肥満とに関与することが知られる（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526）。この研究においては、ＣＤ６８＋のマクロファージはコントロールにおいてはほとんど検出されなかったが、３日目には多数観察されたものの、その数はASCよりもかなり少ないレベルであった。損傷を受けた脂肪組織におけるマクロファージの役割は、明らかにすべきままであるが、マクロファージは、食作用および／または血管新生に関与する可能性がある（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526]。
【０１２４】
ＨＧＦは、心臓（NakamuraT., Mizuno S., Matsumoto K. et al. 「Myocardial protection fromischemia/reperfusion injury by endogeneous and exogenous HGF」J Clin Invest2000; 106: 1511-1519）、肝臓（Ueki T., Kaneda Y., Tsutsui H. et al. 「Hepatocytegrowth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats」Nat Med 1999; 5: 226-230]および腎臓（LiuY. 「Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential andmechanisms of action」Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16）を含む種々の臓器において抗線維形成作用を有することが報告されている。最近の研究では、ＨＧＦが、種々の機構によりＳｍａｄシグナル伝達を中断することにより、ＴＧＦ−βの線維化促進作用に拮抗することが明らかとなった（LiuY. 「Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential andmechanisms of action」Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16；Conway K.,Price P., Harding K.G. et al. 「The molecular and clinical impact of hepatocytegrowth factor, its receptor, activators, and inhibitors in wound healing」WoundRepair Regen 2006; 14: 2-10）。本研究において、ＦＧＦ−２のシグナル伝達を阻害することにより、ＡＳＣによるＨＧＦの産生が抑制され、そして、ＨＧＦを阻害することにより、損傷を受けた脂肪組織における線維化が増加した。さらに、ＪＮＫインヒビターまたは抗ＦＧＦ−２抗体を投与することもまた、損傷後の重篤な線維化をもたらし、これは、線維化のＦＧＦ−２誘導性の防止が、少なくとも部分的に、ＡＳＣに由来するＨＧＦにより媒介されること、そして、ＨＧＦは、線維化を防止し、そして、損傷後に脂肪の体積を維持することにおいて重要な因子であることを意味する。ＦＧＦ−２は、線維芽細胞および内皮細胞に対するその直接的な作用により創傷治癒を促進することが知られる（BikfalviA., Klein S., Pintucci G. et al. 「Biological roles of fibroblast growthfactor-2」Endocr Rev 1997; 18: 26-45）。しかしながら、本研究は、ＦＧＦ−２はまた、ＡＳＣおよび／またはＤＦからＨＧＦを誘導することにより、組織修復を促進し、かつ、線維化を防止することもできることが明らかとなった。脂肪組織は、多くの臓器内またはその周辺に存在するので、ＦＧＦ−２誘導性のＡＳＣからのＨＧＦの分泌は、心筋梗塞、肝炎および腎炎のような臓器損傷の後の修復過程において重要である可能性がある。
【０１２５】
本研究の結果は、ＡＳＣの治療的な可能性に新しい見通しを提供する。ＡＳＣを用いた細胞治療は、特に、ＦＧＦ−２で前処置されたか、またはＦＧＦ−２と併用したとき、組織修復を加速し、線維化を減らし、そして、ＨＧＦの作用を通じて、急性または慢性の炎症により損傷を受けた臓器の機能を改善する可能性がある。ＡＳＣにより分泌されたＨＧＦは、自家脂肪移植術において重要な役割を担う可能性があり（非特許文献９；非特許文献１２）；脂肪移植片の生存を促進し、そして、瘢痕の形成を防止することが示唆されている。ＨＧＦは抗線維形成性であるだけでなく、血管新生性でもあること（Conway K., Price P., Harding KG. et al. 「The molecular and clinicalimpact of hepatocyte growth factor, its receptor, activators, and inhibitors inwound healing」Wound Repair Regen 200; 14: 2-10）、そして、ＡＳＣによるＨＧＦ産生が、虚血の肢の改善に寄与するようであること（CaiL., Johnstone B.H., Cook TG. et al. 「Suppression of hepatocyte growth factorproduction impairs the ability of adipose-derived stem cells to promoteischemic tissue revascularization」Stem Cells. 2007; 25: 3234-3243）を考慮すると、ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦの分泌はまた、毛細管の総量が改善しているが、損傷を受けた脂肪組織における血管密度が有意に増大していなかった場合でさえも、組織修復の間に血管新生を促進することができた（図９）。ＡＳＣにおいて、ＶＥＧＦの分泌は、虚血により誘導されるようである（RehmanJ., Traktuev D., Li J. et al. 「Secretion of angiogenic and antiapoptoticfactors by human adipose stromal cells」Circulation 2004; 109: 1292-1298）。本発明者らが本研究において使用したモデルは、虚血モデルではなく、損傷モデルであり、ＶＥＧＦの発現は、損傷後すぐにダウンレギュレートされた（データ示さず）。脂肪組織における血管新生を研究し、そして、血管新生を増進するための治療戦略を確立するために、脂肪組織における慢性的な虚血の特定のモデルを用いる研究が必要とされる。
【０１２６】
（結論）
ＦＧＦ−２は、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増幅とＡＳＣによるＨＧＦの分泌を促進する。損傷を受けた脂肪組織において、損傷を受けた組織から放出されたＦＧＦ−２により刺激されたＡＳＣは、脂肪修復過程において、主要な増殖細胞集団であることが示唆される。このＪＮＫ媒介性のシグナルは、線維化の防止、そして、損傷後の脂肪体積の維持において重要な役割を担う。本研究はまた、損傷応答におけるＡＳＣについての新しい役割を明らかにし、そして、将来的にASCを治療に利用するための戦略に見通しを提供する。
【０１２７】
（実施例２：肝硬変での治療実験）
本実施例では、肝硬変モデルマウスを用いて、ＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤を投与したときの、線維化の改善を観察する。
【０１２８】
ここで、肝硬変モデルマウスとしては、四塩化炭素連続投与モデルを用いる。0.5mg/kgの四塩化炭素を週２回、４週間連続投与し肝硬変を誘発させる。
【０１２９】
また、ＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤は、以下のように調製する。
【０１３０】
ＡＳＣ処理方法
（１）脂肪組織と等量の０．０７５％コラゲナーゼ（和光純薬等から入手可能。）を加え３７℃で３０分酵素処理する。
【０１３１】
（２）処理後に８００Ｇ×１０分遠心する。
【０１３２】
（３）上層を除去し、沈殿した細胞にリン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、１００μｍポアフィルター（Millipore等から入手可能。）を通す。
【０１３３】
（４）フィルターを通った細胞を回収する。
【０１３４】
ｂＦＧＦ徐放剤の調製法
（１）ゼラチン溶液をウォーターバス内で攪拌して、マイクロスフィアを作成して、冷却し乾燥させる。
【０１３５】
（２）グルタルアルデヒド（和光純薬等から入手可能。）処理により、ゼラチンスフィアを架橋する。
【０１３６】
（３）ｂFGF溶液を含浸させ、ｂＦＧＦ徐放剤とする。
【０１３７】
上記のように調製したＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤を上記肝硬変モデルマウスに投与し、線維化の改善状況を観察する。ここでは、線維化の改善が期待される。
【０１３８】
（実施例３：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産）
本実施例では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を実証する。
【０１３９】
実施例２に記載のように調製したＡＳＣをｂＦＧＦ添加培地にて培養し、１週間おきに培地を継続的に回収して、ＨＧＦタンパクを回収、精製する。
【０１４０】
ＨＧＦタンパク質の回収および精製は、以下のとおりである。
【０１４１】
（１）ＨＧＦに対する抗体カラムを常法により作製する。
【０１４２】
（２）回収した培地を抗体カラムに通し、常法により吸着させる。
【０１４３】
（３）抗体カラムから吸着したＨＧＦを常法により溶出させ回収する。
【０１４４】
このようにして調製したＨＧＦの収量等を測定し、本発明の調製法による効果を確認することができる。
【０１４５】
（実施例４：脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤および複合剤としての効果）
本実施例では、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤の効果を確認する。
実施例２において記載されるように調製したＡＳＣをｂＦＧＦ添加培地にて培養する。
【０１４６】
ＡＳＣの増殖を、ｂＦＧＦ添加のないコントロールサンプルと比較して、増殖刺激効果を確認する。
【０１４７】
このようにして調製したＡＳＣをｂＦＧＦ徐放剤とともに体内に投与する。
【０１４８】
投与された被検体の体内を調べることにより、移植したＡＳＣが増殖し、さらには脂肪新生および血管新生が亢進していることがわかる。
【０１４９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
脂肪由来幹細胞を用いた細胞治療は，すでに実用化（臨床応用）されている。また，FGF-2は既に医薬品として製品化され，熱傷や皮膚潰瘍の治療薬として用いられている。今後はFGF-2を徐放する製剤も商品化される可能性がある。脂肪由来幹細胞とFGF-2はともにこれまでの実績から，生体に対する安全性は高いと考えられる。このような状況から，今回の細胞治療も実用化のめどは立っている。線維化は、局所もしくは全身において慢性炎症を伴うあらゆる疾患に共通しており、本発明はまた、局所投与だけでなく、全身投与も可能であるため、広い範囲での臨床治療に役立つ可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１Ａ】図１は、ヒトＡＳＣの増殖および表面マーカー発現に対する障害関連増殖因子の作用を示す。（Ａ）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に培養してから、３日後、６日後または９日後のＡＳＣのカウント。ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、用量依存的にヒトＡＳＣの増殖を促進したが、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、増殖作用を示さなかった（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図１Ｂ】図１は、ヒトＡＳＣの増殖および表面マーカー発現に対する障害関連増殖因子の作用を示す。（Ｂ）各増殖因子と共に６日間培養したヒトＡＳＣの光学顕微鏡写真。ＦＧＦ−２と共に培養した細胞は、他の増殖因子と共に培養した細胞よりも小さかった。スケールバー＝２００μｍ。
【図１Ｃ】図１は、ヒトＡＳＣの増殖および表面マーカー発現に対する障害関連増殖因子の作用を示す。（Ｃ）各増殖因子と共に７日間培養したヒトＡＳＣのフローサイトメトリー解析。血管内皮マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１およびＴｉｅ−２）の発現における有意な変化は観察されなかった。
【図２Ａ】図２は、ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現に対する障害関連増殖因子の相互作用を示す。（Ａ）ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現。ＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣによるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現の顕著なアップレギュレーションを誘導したが、ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、それぞれ、ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦの発現をダウンレギュレートした（ｎ＝７；＊ｐ＜０．０５）。
【図２Ｂ】図２は、ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現に対する障害関連増殖因子の相互作用を示す。（Ｂ）ＦＧＦ−２により誘導されるＨＧＦ ｍＲＮＡ発現の時間経過。ＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣによる二相性のＨＧＦ ｍＲＮＡ発言を促進し、最初のピークは６時間後に生じ、そして、第２の増加は２４時間後に始まった（ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図２Ｃ】図２は、ヒトＡＳＣによる障害関連増殖因子ｍＲＮＡの発現に対する障害関連増殖因子の相互作用を示す。（Ｃ）ヒトＡＳＣによるＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦタンパク質の分泌。７日目の培養培地のＥＬＩＳＡは、ＦＧＦ−２がヒトＡＳＣからのＨＧＦタンパク質の分泌を促進したことを示した（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ａ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ａ）ＦＧＦ−２および下流にあるシグナルインヒビターのうちの１つと共に培養した後のＡＳＣのカウント。ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５（ＳＰ）は、ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２の増殖作用を有意に阻害したが、Ｕ１０２６（ＥＲＫインヒビター）およびＳＢ２０２１９０（ＳＢ、ｐ３８タンパク質インヒビター）は、ＡＳＣの増殖に対して阻害作用を示さないか、または、限られた阻害作用を示した（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ｂ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｂ）７日目のヒトＡＳＣによるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現。ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＳＰによって有意に阻害され（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）、一方、Ｕ１０２６およびＳＢは、限られた阻害作用を有した。
【図３Ｃ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｃ）インヒビターの特異性。ｃ−Ｊｕｎのリン酸化は、ＦＧＦ−２での処理と共に増加した。ＦＧＦ−２誘導性のｃ−Ｊｕｎのリン酸化は、ＳＰでの前処理により完全に妨げられた（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ｄ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｄ）培養における７日後の細胞のカウント。ＦＧＦ−２誘導性の細胞増殖は、検討した全ての細胞型においてＪＮＫインヒビターであるＳＰにより有意に阻害された（ｈＡＳＣ、ヒト脂肪由来幹／間質細胞；ｈＢＭ−ＭＳＣ、骨髄由来間葉系幹細胞；ｈＤＦ、ヒト真皮線維芽細胞；ｍＡＳＣ、マウス脂肪由来幹／間質細胞；ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図３Ｅ】図３は、ＦＧＦ−２細胞内シグナル伝達経路の阻害を示す。（Ｅ）ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現についてのリアルタイムＰＣＲアッセイ。ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現は、全ての細胞型においてＦＧＦ−２により促進されたが、ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣを除いてＪＮＫインヒビターにより有意に阻害された（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図４Ａ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。虚血再潅流障害モデル。上段：マウス鼠径部の脂肪パッド。矢印は、大腿動脈から延びる栄養大動脈を示す。矢印の先は、皮膚への交通枝を示す。下段：交通枝を切断し、そして、血管クリップで栄養大動脈を３時間にわたり締め付けた。
【図４Ｂ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ヘマトキシリン−エオシン染色は、早くも１日目に血球の間質性浸潤が観察され、そして、７日目にはこの浸潤は消失していたことを明らかにした。第一週を通じて、再生性の変化が損傷を受けた脂肪組織において観察された。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｃ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。
【図４Ｄ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は損傷後に増加し、３日目にピークを迎えた（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｅ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は損傷後に増加し、３日目にピークを迎えた（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｆ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。
【図４Ｇ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞（矢印）は、損傷後、１日目に最も高い頻度で観察された（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｈ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞（矢印）は、損傷後、１日目に最も高い頻度で観察された（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｉ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。
【図４Ｊ】図４は、マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の再生性の変化を示す。生存細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）、レクチン（上皮細胞；赤色）またはＰＩ（壊死細胞；緑色）で染色して画像化し、その干渉コントラスト像と重ね合わせた。ＰＩ陽性の壊死細胞は３日目に増加しており、そして、その中には、レクチン陽性の毛細管内皮細胞であるように見えた。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ａ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。ＦＧＦ−２の免疫染色。ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも損傷後１日目には検出され、その検出ピークは３日目であった。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ｂ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも損傷後１日目には検出され、その検出ピークは３日目であった。
【図５Ｃ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。ＨＧＦの免疫染色。損傷の１日後にはわずかなＨＧＦタンパク質が検出されたが、ＨＧＦの発現は、損傷後３日目から検出され、その検出ピークは損傷後７日目であった。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ｄ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。損傷の１日後にはわずかなＨＧＦタンパク質が検出されたが、ＨＧＦの発現は、損傷後３日目から検出され、その検出ピークは損傷後７日目であった。
【図５Ｅ】図５は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後のＦＧＦ−２およびＨＧＦの発現を示す。損傷を受けた脂肪組織におけるＦＧＦ−２ ｍＲＮＡおよびＨＧＦ ｍＲＮＡの発現のリアルタイムＰＣＲアッセイ。ＦＧＦ−２ ｍＲＮＡは、損傷後すぐにダウンレギュレートされ（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）、一方で、ＨＧＦ ｍＲＮＡは、損傷の３日後に、有意にアップレギュレートされた（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。（Ａ）ＣＤ３１（緑色）、ＣＤ３４（赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）についてのコントロール組織の免疫染色。損傷を受ける前、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞は、脂肪組織の全体にわたって、特に、血管周辺で観察された。スケールバー＝２０μｍ。
【図６Ｂ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。（Ｂ）３日目の損傷を受けた組織。上段：ＣＤ３４（緑色）、ＢｒｄＵ（赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青色）についての染色。損傷後３日で観察されることが多かったＢｒｄＵ陽性細胞の大部分はまた、ＣＤ３４についての陽性であった。スケールバー＝２０μｍ。下段：ＣＤ３４（緑色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した３日目の組織の生存組織像。３日目に、ＣＤ３４＋細胞の多くは、レクチン陰性であり、これらの細胞がＡＳＣであったことが示唆された。スケールバー＝２０μｍ。
【図６Ｃ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。（Ｃ）ＢＯＤＩＰＹ（脂肪細胞；黄色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した生存組織像。有核細胞および小さなサイズの脂肪細胞の数の増加が、１日目および３日目に観察された。浸潤血球由来の細胞である可能性があるレクチン＋の小さな円形細胞が１日目に見られたが、これらは、特徴付けられていないままである。大きなサイズの脂肪細胞は７日目に増加したが、ＪＮＫインヒビターで処理した場合には見られなかった。青いスケールバー＝２００μｍ、白いスケールバー＝５０μｍ。
【図６Ｄ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。有核細胞および小さなサイズの脂肪細胞の数の増加が、１日目および３日目に観察された。浸潤血球由来の細胞である可能性があるレクチン＋の小さな円形細胞が１日目に見られたが、これらは、特徴付けられていないままである。大きなサイズの脂肪細胞は７日目に増加したが、ＪＮＫインヒビターで処理した場合には見られなかった。
【図６Ｅ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。ＢＯＤＩＰＹ（脂肪細胞；黄色）、ＰＩ（有核細胞の核；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（すべての核；青色）で染色した生存組織の三次元像；白い破線のレベルで水平方向および垂直方向に切断した像もまた示す。ＰＩ陽性細胞は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞であることが分かった。ＪＮＫインヒビターでの処理は、７日目にＰＩ陽性細胞数の増加をもたらした。スケールバー＝５０μｍ。
【図６Ｆ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。ＰＩ陽性細胞は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞であることが分かった。ＪＮＫインヒビターでの処理は、７日目にＰＩ陽性細胞数の増加をもたらした。
【図６Ｇ】図６は、損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象を示す。Ｃ３４（緑色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した生存組織像。ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣの増殖および移動は、３日目および７日目に、ＪＮＫインヒビターにより損ねられた。スケールバー＝５０μｍ。
【図７Ａ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。
【図７Ｂ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。３日目の、脂肪組織によるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現。ＪＮＫインヒビターであるＳＰ６００１２５（ＳＰ）または抗ＦＧＦ−２抗体の継続的な投与は、３日目に、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを妨げた（ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５）。
【図７Ｃ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。７日目のＨＧＦについての免疫染色。ＳＰまたは抗ＦＧＦ−２抗体の継続的な投与は、７日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦの分泌を阻害した。スケールバー＝１００μｍ。
【図７Ｄ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。ＳＰまたは抗ＦＧＦ−２抗体の継続的な投与は、７日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦの分泌を阻害した。
【図７Ｅ】図７は、脂肪組織に対する虚血再潅流障害後の、ＨＧＦの発現および線維化に対するシグナル阻害の影響を示す。損傷後２週間目の、損傷を受けた脂肪組織における線維化。線維性領域をＡｚａｎ染色で染色した。スケールバー＝１ｍｍ。虚血再潅流障害は、有意な線維化を誘導した；線維化領域は、損傷を受けていない動物の２倍であった。ＳＰ、抗ＦＧＦ−２抗体または抗ＨＧＦ抗体の継続的な投与は、線維化を有意に増大した（ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図８Ａ】ＢＯＤＩＰＹ（脂肪細胞；黄色）、レクチン（内皮細胞；赤色）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核；青色）で染色した生存組織像。有核細胞および毛細管の数の増加が、小さなサイズの脂肪細胞の周囲で観察された。スケールバー＝２０μｍ。
【図８Ｂ】ＣＤ６８についての組織の免疫染色。ＣＤ６８＋のマクロファージは、脂肪組織においてほとんど検出されなかったが、これらのマクロファージの凝集（食作用を示唆する）が、損傷後３日目に最も多く観察された。スケールバー＝１００μｍ。
【図９】図９は、損傷から２週間後の脂肪組織における血管密度を示す。血管密度は、ＣＤ３１について免疫染色を行った顕微鏡写真における血管をカウントすることにより計算した。スケールバー＝１００μｍ。脂肪領域は線維化により減少したが（図７）、最終的な血管密度は、ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５（ＳＰ）の継続的な投与を行った場合も、行っていない場合も、損傷後に有意に変化しなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤。
【請求項２】
線維性病変を処置または予防するためのものである請求項１に記載の治療剤または予防剤。
【請求項３】
前記線維性病変は、慢性炎症時のものである請求項２に記載の治療剤または予防剤。
【請求項４】
前記ＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である、請求項１に記載の治療剤または予防剤。
【請求項５】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である、請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤。
【請求項８】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項１】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤。
【請求項２】
線維性病変を処置または予防するためのものである請求項１に記載の治療剤または予防剤。
【請求項３】
前記線維性病変は、慢性炎症時のものである請求項２に記載の治療剤または予防剤。
【請求項４】
前記ＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である、請求項１に記載の治療剤または予防剤。
【請求項５】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である、請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤。
【請求項８】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−３７２９２（Ｐ２０１０−３７２９２Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０３６５３（Ｐ２００８−２０３６５３）
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者：日本再生医療学会、刊行物名・巻数・号数：再生医療 日本再生医療学会雑誌 ＶＯＬ．７ Ｓｕｐｐｌ ２００８ 第７回日本再生医療学会総会 プログラム・抄録、発行年月日：平成２０年２月２２日
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（５０３３６８４９８）株式会社バイオマスター (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者：日本再生医療学会、刊行物名・巻数・号数：再生医療 日本再生医療学会雑誌 ＶＯＬ．７ Ｓｕｐｐｌ ２００８ 第７回日本再生医療学会総会 プログラム・抄録、発行年月日：平成２０年２月２２日
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（５０３３６８４９８）株式会社バイオマスター (11)
【Ｆターム（参考）】
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