脂肪組織から細胞集団を得る方法
少量の脂肪組織から、多数の、生存可能な、新鮮に単離された細胞を効率よく得る方法、および、その中に見出される標的細胞集団に対し、濃縮もしくは選択する方法が、本明細書中に提供される。特定の実施形態において、脂肪組織から細胞の集団を得る方法は、少なくとも２００Ｕ／ｍｌ溶液かつ約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下の濃度で酵素を含む溶液中で、その脂肪組織をインキュベートすることを含む。ある種の実施形態において、その方法には、得られたその細胞集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。特定の局面において、その方法はさらに、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得るための、陽性もしくは陰性選択工程を含む。患者への投与のための細胞を含む薬学的組成物を調製する関連した方法、および患者における疾患もしくは医学的状態を処置する方法が、本明細書中にさらに提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１０６３５３号に対する優先権を主張し、米国仮特許出願第６１／１０６３５３号の全体が参考により援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
疾患部位に幹細胞を投与することによって疾患を処置するために幹細胞を用いることは、科学者および医者の目標であり、そこでその細胞が組織を再生もしくは修復することが期待される。間葉系幹細胞（間質の幹細胞とも呼ばれる）は、広範囲にわたる増殖能および結合組織系統（骨、軟骨、腱、脂肪など）の子孫を生ずる能力を示すが、これらの細胞は、臨床使用にふさわしい数で収集することが困難であり得る。
【０００３】
ヒト脂肪組織は、広範囲にわたる増殖能、および複数の細胞系統に分化する能力を有する細胞集団を含むことが示されている。これらの細胞は、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）もしくは脂肪間質幹細胞（ＡＳＣ）と呼ばれており、間葉系幹細胞（骨髄間質細胞とも呼ばれる）と同一ではないが、一般的に類似する。非特許文献１。
【０００４】
脂肪組織から、細胞（例えば、ＡＤＳＣ）を得る方法は、当該分野において公知であるが、これらの方法は、少量の脂肪組織から最大数の生存可能な細胞を得るように、効率について依然として最適化されるべきである。例えば、上記の非特許文献１は、脂肪組織から細胞を得ることを開示しており、その中ではわずか２×１０４の細胞が組織から単離されているが、治療の目的での患者への注入のためには代表的に約１０７から１０９の細胞が必要とされる（特許文献１）。また、これらの方法の多くは、細胞の増殖および拡張の目的で、脂肪組織から得られた細胞のプレーティングもしくは組織培養工程を包含する。細胞の表現型は、組織培養における時間の関数として変化するため、インビトロの組織培養工程がほとんどない〜全くない、多数の細胞を得る方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０８０８０１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ４４９： ５９−６７ （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、当該分野において、少量の脂肪組織から、多数の、生存可能な、新鮮に単離された細胞を効率よく得る、最適化された方法の必要性が存在する。目的の細胞（例えば、ＣＤ３４陽性細胞）について、脂肪組織由来の細胞産物を濃縮するための方法がさらに必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
少量の脂肪組織から、多数の、生存可能な、新鮮に単離された細胞を効率よく得る方法、および、その中に見出される標的細胞集団を濃縮もしくは選択する方法が、本明細書中に提供される。
【０００９】
特定の実施形態において、脂肪組織から細胞の集団を得る方法は、少なくとも２００Ｕ／ｍｌ溶液かつ約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下の濃度で酵素を含む溶液中で、その脂肪組織をインキュベートすることを含む。ある種の実施形態において、その方法には、得られたその細胞集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。特定の局面において、その方法はさらに、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得るための、陽性もしくは陰性の選択工程を含む。この点で、本発明はまた、脂肪組織から細胞集団を得ること、ならびに一次抗体を含む第二の溶液内でその細胞集団をインキュベートし、それによって、標的細胞の濃縮された集団を得ることを含む、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法を提供する。この一次抗体は、その細胞集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分ける。
【００１０】
本発明はさらに、本明細書中に記載した方法にしたがって得られた細胞集団（例えば、標的細胞の濃縮された細胞集団）を提供する。
【００１１】
その脂肪組織から得られた細胞集団（例えば、標的細胞の濃縮された細胞集団）を含む薬学的組成物を調製する関連した方法、およびこれらの方法にしたがって調製された薬学的組成物、および患者における疾患もしくは医学的状態を処置する方法においてその薬学的組成物を用いる方法が、本明細書中に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、抗体を基にした陽性選択技術の概略図を表す。標的細胞（すなわち、「Ｓ」の印がつけられた選択された細胞）は、脂肪組織の間質血管画分（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ；ＳＶＦ）の一部であり、ＣＤ３４陽性細胞である。一次抗体（抗ＣＤ３４ ｍＡｂ）は、ＣＤ３４陽性細胞（「Ｓ」の印が付けられている）に結合し、二次抗体（ＳＡＭ Ｉｇ抗体）が次いで一次抗体に結合する。二次抗体を常磁性ビーズに結合し、免疫複合体をＳＶＦ画分から取り出すために磁石を用いた。ＣＤ３４陽性細胞を放出させるために、放出ペプチド（三角形として示される）が複合体に加えられ、標的細胞上の一次抗体およびＣＤ３４抗原の置換が起こり、精製されたＣＤ３４陽性細胞集団が提供される。
【図２】図２は、本明細書中に記載された、脂肪組織の分解後に得られた細胞のマルチカラーフローサイトメトリーのパネルを表す。明るい（明）およびうす暗い（暗）ＣＤ３４ ＡＳＣおよびＭＳＣ、ならびにリンパ球、内皮細胞および造血系前駆細胞が示される。破片もしくは死んだ細胞もまた、ゲートされた集団である。
【図３】図３は、図１で概略を述べた、選択前（左のパネル）および選択後（右のパネル）のＳＶＦのフローサイトメトリーのパネルを表す。ＣＤ３４（明）／ＣＤ４５−、ＣＤ３４（明）／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４（暗）／ＣＤ４５−集団が示される。
【図４】図４は、集団ＡからＣが標識されていることを除き、図２と同じフローサイトメトリーのデータを表す。
【図５】図５は、レーザードップラー画像の時間経過のグラフを表す。そのデータは、本明細書中に記載された、ＰＢＳのみ、非選択細胞、もしくはＣＤ３４陽性選択細胞を投与されたマウスの、非虚血肢と比較した虚血肢における灌流（％）として表される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、脂肪組織から細胞集団を得る方法を提供する。その方法は、細胞生存率を損なうことなく、脂肪組織１ｍｌ当たり最大数の細胞の放出を達成するように最適化された濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００１４】
脂肪組織
本発明に関して、脂肪組織は、脂肪細胞で構成された緩やかな結合組織である、あらゆる体脂肪（もしくは脂肪）であり得る。ある種の実施形態においては、その脂肪組織は、骨髄性脂肪組織、褐色脂肪組織、乳房脂肪組織（ｍａｍｍａｒｙ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、機械的な脂肪組織（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、もしくは白色脂肪組織である。その脂肪組織は、提供者のあらゆる体の部位から得られ得る。特定の実施形態において、その脂肪組織は、提供者の大腿部、臀部、腹部、もしくは上肢から得られる。他の実施形態では、その脂肪組織は、提供者の胸、首、背、もしくは、ふくらはぎから得られる。さらに、他の実施形態では、その脂肪組織は、心臓、腎臓、大動脈、生殖線、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）、もしくは手掌（ｐａｌｍａｒ）の脂肪パッドから得られる。特定の局面では、その脂肪組織は、皮下脂肪である。脂肪組織の提供者は、あらゆる宿主であり得る。その宿主としては、本明細書中に記載された任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、その提供者は哺乳動物である。特定の実施形態では、その提供者はヒトである。
【００１５】
その脂肪組織は、脂肪組織を得るための任意の適切な方法により、提供者から得られ得る。そのような方法は、当該分野において公知である。ある種の実施形態において、その脂肪組織は、手術もしくは脂肪吸引により、提供者から得られる。したがって、ある種の実施形態において、脂肪組織は脂肪吸引物（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）である。
【００１６】
本発明に関して、酵素溶液とともにインキュベートされる脂肪組織の量は、例えば、０．０１ｇ、０．１ｇ、もしくは、１ｇから５ｇ、１０ｇ、５０ｇ、もしくは、１００ｇの任意の脂肪組織の量であり得る。
【００１７】
酵素溶液
本発明に関して、本明細書中で用いられる用語「溶液」は、組織もしくは細胞を酵素と接触させるために適した、あらゆる媒体を指す。その溶液は、任意の粘性もしくは濃度を有し得、ある種の局面において、その溶液は水溶液である。代替の実施形態において、その溶液は、室温で半固体の媒体である。特定の具体的な局面において、その溶液は、本明細書中でさらに記載されるように、組織培養培地である。
【００１８】
溶液中に含まれる酵素は、組織、例えば、結合組織（例えば、脂肪組織内で見出される結合組織）を分解することが知られている、あらゆる酵素であり得る。ある種の局面において、その酵素は、結合組織を分解する酵素である。ある種の実施形態において、その酵素は、動物もしくは非動物源から得られるか、もしくは、それらに由来する。ある種の実施形態において、その酵素は、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、もしくは、プロテイナーゼである。特定の具体的な実施形態において、その酵素は、コラゲナーゼ、トリプシン、もしくは、ディスパーゼ、または、それらの機能的均等物、改変体、誘導体、変異体、もしくはアナログである。その酵素は、ある種の実施形態において、酵素の混合物、例えば、コラゲナーゼ、トリプシンもしくはディスパーゼのうちの少なくとも１つ、または２つを含む混合物である。その酵素は、特定の実施形態において、Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）である。本明細書中における、目的に適した酵素は、当該分野において公知であり、企業から市販されている。その企業としては、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｃｉａｌ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、および、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
酵素濃度
上記酵素の濃度は、上記脂肪組織からの最大量の細胞の放出のための、その脂肪組織の分解を達成するために十分に大きいものであるべきである。したがって、ある種の実施形態において、上記方法は、少なくとも約２００Ｕ／ｍｌ溶液（例えば、少なくとも約２０５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２１０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２１５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２２０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２２５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２３０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２３５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２４０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２４５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２５０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２６０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２６５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２７０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２８０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２８５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２９０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約３００Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約３１０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約３１５Ｕ／ｍｌ溶液、もしくは、それより大きい）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２０】
本発明に関して、細胞がもはや生存できないほど脂肪組織を過分解しないよう注意が払われるべきである。当業者は、過分解が、分解反応（以下に論じるように）において、酵素量を分解反応の時間と釣り合わせることによって避けられることを正しく認識する。したがって、ある種の実施形態において、上記方法は、約５００Ｕ／ｍｌ溶液以下（例えば、約４７５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約４５０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約４２５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約４００Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３７５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３５０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３２５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３２０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３１５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３１０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３０５Ｕ／ｍｌ溶液以下）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２１】
特定の実施形態において、上記方法は、約１９０Ｕ／ｍｌと３１９Ｕ／ｍｌの間（例えば、約２００Ｕ／ｍｌと約３００Ｕ／ｍｌの間、約２０５Ｕ／ｍｌと２９５Ｕ／ｍｌの間、約２１０Ｕ／ｍｌと２９０Ｕ／ｍｌの間、約２１５Ｕ／ｍｌと約２８５Ｕ／ｍｌの間、約２２０Ｕ／ｍｌと約２８０Ｕ／ｍｌの間、約２２５Ｕ／ｍｌと約２７５Ｕ／ｍｌの間、約２３０Ｕ／ｍｌと約２７０Ｕ／ｍｌの間、約２３５Ｕ／ｍｌと約２６５Ｕ／ｍｌの間、約２４０Ｕ／ｍｌと約２６０Ｕ／ｍｌの間、約２４５Ｕ／ｍｌと約２５５Ｕ／ｍｌの間）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２２】
特定の実施形態において、上記方法は、約２４５Ｕ／ｍｌ、約２４６Ｕ／ｍｌ、約２４７Ｕ／ｍｌ、約２４８Ｕ／ｍｌ、約２４９Ｕ／ｍｌ、約２５０Ｕ／ｍｌ、約２５１Ｕ／ｍｌ、約２５２Ｕ／ｍｌ、約２５３Ｕ／ｍｌ、約２５４Ｕ／ｍｌ、もしくは、約２５５Ｕ／ｍｌ）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２３】
ある種の実施形態において、脂肪組織の量（例えば、容量）と酵素の量（酵素溶液の容量）の比は、約１：１、１：２、２：１、１：３、３：１、１：４、４：１、１：５、５：１である。
【００２４】
分解時間
ある種の実施形態において、上記酵素を含む溶液と脂肪組織のインキュベーションは、約５分と５時間、もしくは、それより長くの間の時間行う。ある種の実施形態において、酵素溶液と脂肪組織のインキュベーションは、約１５分と約１．５時間の間、約２５分と約１．２５時間の間、もしくは、約３０分と約６０分の間の時間行う。ある種の局面において、脂肪組織は酵素溶液と約４５分と５５分の間の時間インキュベートされる。この点で、特定の実施形態における脂肪組織は、酵素溶液中で約４５分間、約４６分間、約４７分間、約４８分間、約４９分間、約５０分間、約５１分間、約５２分間、約５３分間、約５４分間、もしくは、約５５分間インキュベートされる。
【００２５】
再度、当業者は、過分解が、分解反応における酵素量（上で論じた通り）とその分解反応の時間とを釣り合わせることによって避けられることを認識する。
【００２６】
その他の分解条件および工程
ある種の実施形態において、上記酵素溶液中で上記脂肪組織がインキュベートされる温度は、分解を可能にする任意の適した温度（例えば、酵素を不活性化しない温度）である。ある種の実施形態における温度は、約２０℃と５０℃の間（例えば、約２５℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃）である。
【００２７】
ある種の実施形態における上記酵素溶液と脂肪組織のインキュベーションは、脂肪組織および酵素溶液を入れている容器の振とう、振動、回転、または、他の動きもしくは機械的な攪拌の存在下で行われる。他の実施形態において、インキュベーションは、前述のどれも存在せずに保たれる。
【００２８】
ある種の実施形態において、上記方法は、当該分野において記載された、任意の、組織の収集工程、組織の処理工程、および組織の洗浄工程のようなさらなる工程を含む。例えば、上記の特許文献１および非特許文献１を参照のこと。ある種の実施形態において、上記方法は、上記酵素が不活性化される不活性化工程を含む。ある種の実施形態において、高濃度のウシ胎仔血清を含む溶液が、上記酵素を不活性化するために用いられる。ある種の実施形態において、上記方法は、脂肪組織の分解画分と非分解画分とを分けることを含む。上記方法は、ある種の実施形態において、細胞ペレットを遠心分離すること、および／もしくは、濾過すること、および／もしくは、洗浄すること、および／もしくは、再懸濁することを含む。
【００２９】
このような追加的考慮点およびさらなる工程は、当該分野において公知であるか、もしくは、決定するための当業者の技術の範囲内であるかのいずれかである。例えば、米国特許第６，７７７，２３１号、特許文献１、上記の非特許文献１、Ｂｕｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ４５：１１５−１２０（２００８）；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ５：３６２：３６９（２００３）；Ｌｏｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、ＡＮＺ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ７９：２３５−２４４（２００９）；およびＢｏｑｕｅｓｔ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ３２５：３５−４６（２００６）を参照のこと。
【００３０】
特定の実施形態において、本明細書中に記載された方法は、細胞の増殖もしくは拡張の目的で得られた細胞を培養する必要なく、脂肪組織から多数の生存可能な細胞を得る。この点で、ある種の実施形態において、上記方法には、脂肪組織から得られた細胞集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。他の実施形態において、組織培養における時間は、限定的であり、かつ最小である。ある種の実施形態において、細胞は、８時間以下の間、１２時間以下の間、１８時間以下の間、２４時間以下の間、３６時間以下の間、もしくは４８時間以下の間、培養もしくはプレートされる。
【００３１】
分解された脂肪組織から得られた細胞集団
本発明の方法は、脂肪組織の酵素分解において最大数の生存可能な細胞を得るために最適化される。ある種の実施形態において、脂肪組織１ｍｌ当たり得られる生存可能な細胞数は、少なくとも約１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５、約５×１０５、約６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１０６、約１０７もしくは、それより多い。
【００３２】
ある種の実施形態における脂肪組織から得られた細胞集団は、異種細胞集団である。ある種の実施形態において、脂肪組織から得られた細胞集団は、脂肪間質幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、プレ脂肪細胞、内皮細胞もしくはそれらの前駆細胞、繊維芽細胞、マクロファージ、リンパ球、肥満細胞、または、それらの組み合わせを含む。ある種の実施形態において、細胞集団は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まないか、または最小限にしか含まない。特定の実施形態における細胞集団は、脂肪組織の間質血管画分である。脂肪由来の幹細胞は、米国特許第６，７７７，２３１号に、さらに記載されている。ヒトＣＤ３４＋幹細胞は、米国特許第５，１３０，１４４号；第５，０３５，９９４号；第４，９６５，２０４号に記載されている。ある種の実施形態において、得られた細胞集団は、接着細胞および／もしくは非接着細胞を含む。
【００３３】
脂肪組織から得られた集団の細胞は、細胞表面マーカーの表現型によって特徴づけられ得る。ある種の実施形態において、上記集団は、本明細書中に記載されたいずれかのような、細胞マーカーの発現について陽性の細胞を含む。ある種の実施形態において、上記集団は、ＣＤ３４に対して陽性である細胞を含む。得られる細胞のさらなる説明は、本明細書中に記載される。
【００３４】
脂肪組織から得られた細胞集団の選択／濃縮
本発明のある種の実施形態において、上記方法は、所望される細胞もしくは標的細胞のサブ集団に対して選択すること、単離すること、濃縮すること、もしくは精製することをさらに含む。この点で、本発明はまた、脂肪組織から、標的細胞の濃縮された集団を得る方法を提供する。標的細胞に対し、精製する方法、セルソーティングする方法および濃縮する方法は、当該分野において公知であり、例えば、蛍光活性化セルソーティング、遠心分離、および抗体を基にした捕捉技術を含む。
【００３５】
ある種の実施形態において、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法は、本明細書中に記載された方法にしたがって、脂肪組織から細胞の集団を得ることを含む。その方法は、例えば、脂肪組織を消化酵素を含む溶液とともにインキュベートすること、その細胞の集団を一次抗体とインキュベートし、それにより、標的細胞の濃縮された集団を得ることを含む。この一次抗体は、その細胞集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分ける。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「実質的に含まない」は、ある程度欠如していることを意味する。「実質的に含まない」は、相対的な用語であり、必ずしも、絶対的な非存在、もしくは、完全な非存在とみなされるべきではないことが認識される。したがって、ある種の局面において、標的細胞を実質的に含まないサブ集団は、標的細胞を含むが、そのサブ集団の約１５％またはそれ未満のみが標的細胞である。ある種の局面において、標的細胞を実質的に含まないサブ集団の約１０％以下が、標的細胞である。ある種の局面において、標的細胞を実質的に含まないサブ集団の約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、もしくは約１％以下が、標的細胞である。
【００３７】
陰性選択
上記分解された組織はまた、最終産物のためにあまり目的としていないか、もしくは、全く目的としていない細胞に対する抗体とともにインキュベートされ得る。ある種の実施形態において、標的細胞がＣＤ３４陽性細胞であるとき、非標的細胞に対する抗体は、脂肪組織分解のあとで、もしくは、その細胞特異的抗体に対する抗体で覆われた常磁性ビーズとのインキュベーションのあとで得られた細胞とともにインキュベートされ得る。上に記載されたプロセスを通して、そのような所望されない（非標的）細胞は、次いで、必要に応じて分解物から単離され、そこから除去される。得られた分解物は、今や、より低い濃度しか〜全く所望されない細胞を含まず、結果として、より高濃度の所望される細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む。このような細胞の取り出しの例は、ＣＤ４５、グリコホリン‐ａおよび／もしくは、ＣＤ３１を発現している細胞の脂肪分解物の減少を含む。
【００３８】
上記の通り、ある種の実施形態における標的細胞のサブ集団は、その標的細胞によって発現されないかもしくは低レベルで発現される細胞マーカーに対して特異的な抗体である一次抗体を用いることによって濃縮され、選択され、もしくは、精製される。特定の具体的な実施形態において、一次抗体は、ＣＤ４５、グリコホリンＡおよびＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに対して特異的な抗体である。
【００３９】
陽性選択
ある種の実施形態における標的細胞のサブ集団は、その標的細胞によって発現される細胞マーカーに対して特異的な抗体である一次抗体を用いることによって濃縮され、選択され、もしくは、精製される。ある種の実施形態において、その標的細胞によって発現される細胞マーカーは、ＣＤ３４である。ある種の実施形態において、その標的細胞は、ＣＤ３４陽性細胞である。特定の実施形態において、一次抗体は、ＣＤ３４に特異的に結合する抗体である。ＣＤ３４特異的抗体は、当該分野において公知であり、市販されている。例えば、米国特許第４，９６５，２０４号を参照のこと。ある種の実施形態において、そのＣＤ３４特異的抗体は、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉキット（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）において提供される抗体である。
【００４０】
ある種の局面において、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法は、陰性選択手順および陽性選択手順の両方を含む。
【００４１】
ある種の実施形態において、一次抗体は、１０６標的細胞当たり約０．０１μｇと１０６標的細胞当たり約１０μｇとの間、１０６標的細胞当たり約０．１μｇと１０６標的細胞当たり約５μｇとの間、もしくは、１０６標的細胞当たり約１μｇと１０６標的細胞当たり約３μｇとの間の終濃度で細胞の集団とともに存在する。ある種の実施形態において、一次抗体は、１０６標的細胞当たり約２．５μｇの終濃度にある。
【００４２】
ビーズ
ある種の実施形態において、細胞集団をサブ集団に分ける一次抗体は、固相支持体（例えば、ビーズ、膜）上に「捕捉される」。ある種の実施形態において、固相支持体は、ビーズであり、そのビーズは脂肪組織から得られた細胞の集団（例えば、脂肪組織の分解から得られた細胞の集団）とともにインキュベートされる。ある種の局面において、ビーズ（複数）とのインキュベーションは、これらの細胞の一次抗体とのインキュベーションの前もしくは後に行われる。ある種の実施形態において、そのビーズ（複数）は、一次抗体と同時に脂肪組織から得られた細胞の集団とともにインキュベートされる。一旦、細胞の集団がそのビーズ（複数）と一次抗体の両方とともにインキュベートされると、ビーズ、一次抗体、および標的細胞もしくは非標的細胞を含む複合体が形成される。
【００４３】
ある種の実施形態において、そのビーズは、一次抗体に結合するタンパク質を含む。特定の実施形態において、そのタンパク質は、一次抗体（例えば、一次抗体のＦｃ領域）に特異的に結合する二次抗体である。ある種の実施形態において、そのタンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ（例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ）である。
【００４４】
ある種の実施形態において、そのビーズは、約１：１と５：１の間のビーズ数と標的細胞数の比で、細胞の集団とともにインキュベートされる。ある種の実施形態において、その比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、もしくは約５：１である。
【００４５】
特定の局面において、標的細胞の濃縮された集団を得る方法は、ビーズと、一次抗体と、標的細胞または非標的細胞のいずれかとを含む複合体を、細胞、ビーズ、および一次抗体を含んだ細胞集団から取り出すことによって、細胞集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分けることを含む。ビーズを取り出す方法は、当該分野において公知である。ある種の実施形態において、そのビーズは、常磁性ビーズであり、そのビーズは、磁石で取り出される。ある種の実施形態において、ビーズは、遠心分離によって分けられる。
【００４６】
ある種の実施形態において、ビーズおよび一次抗体を含む複合体は、さらに標的細胞もしくは非標的細胞を含む。複合体が非標的細胞を含む実施形態において、標的細胞は、ビーズが取り出された溶液内に含まれる。ある種の実施形態において、標的細胞を濃縮もしくは精製するために、それ以上の工程は取られない。
【００４７】
放出ペプチド
複合体が標的細胞を含む、ある種の実施形態において、その方法は、標的細胞を複合体から放出するためのさらなる工程を含む。この目的のために、特定の局面において、その方法は、複合体を放出ペプチドとともにインキュベートすること含む。本明細書中で用いられる場合、用語「放出ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む、標的細胞から一次抗体を分離させるあらゆる分子である。
【００４８】
ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、ＣＤ３４のエピトープもしくは一次抗体のエピトープ（例えば、一次抗体のＣＤＲ）であるエピトープを含む。ある種の局面において、その放出ペプチドは、可溶性のＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４の可溶性フラグメント）、もしくはＰＲ３４ペプチドであり、米国特許第５，９６８，７５３号および第６，０１７，７１９号に記載されている。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、これらの特許に記載された任意のものである。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉキット（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）の一部として提供されるものである。
【００４９】
ある種の実施形態において、その放出ペプチドの濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間、約０．１ｍｇ／ｍｌと約５ｍｇ／ｍｌとの間、もしくは約１ｍｇ／ｍｌと約２ｍｇ／ｍｌとの間の終濃度で複合体とともに存在する。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、約２ｍｇ／ｍｌの終濃度にある。
【００５０】
ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、回転、振とう、もしくは他の動きの間に複合体とともにインキュベートされる。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、動きなしでインキュベートされる。
【００５１】
特定の実施形態において、その複合体は、放出ペプチドを介した標的細胞からの一次抗体の置換の効率を高めるために、粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）される。ある種の実施形態において、粉砕すること（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｎｇ）は、注射器、ピペット、もしくは、細胞が通り得る比較的小さい穴を有し、複合体形成の際に形成された細胞凝集物の破壊を容易にする類似の道具で達成される。特定の局面において、その方法は、少なくとも約３０秒間、少なくとも約１分間、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約１５分間、少なくとも約２５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約９０分間、少なくとも約１２０分間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、粉砕することを含む。ある種の局面において、その方法は、約１０時間以下（例えば、約５時間以下）の間、粉砕することを含む。
【００５２】
特定の実施形態において、粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）は、放出ペプチドの存在下で行われる。他の実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの存在なしに行われる。例えば、粉砕は、放出ペプチドの添加前に行われる。ある種の実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの添加前に行われ、粉砕および放出ペプチドの添加は、互いの約３０秒以内に、互いの約６０秒以内に、互いの約１．５分以内に、互いの約２分以内に、互いの約５分以内に、互いの約１０分以内に、互いの約１５分以内に、互いの約３０分以内に、互いの約４５分以内に、互いの約６０分以内に、行われる。
【００５３】
例示的な実施形態
特定の実施形態において、コラゲナーゼもしくは類似の酵素での脂肪組織の分解後、分解された組織は、次に、抗ＣＤ３４陽性抗体とともに、または、ＣＤ３４＋細胞上もしくはＣＤ３４＋細胞内に含まれる他のエピトープ／酵素／タンパク質について選択する抗体とともに、インキュベートされる。その抗体／分解物の混合物は、続いて、ＣＤ３４陽性抗体に対する抗体で覆われた常磁性ビーズとともにインキュベートされる。そのビーズ−抗体は、ＣＤ３４＋細胞−抗体複合体と複合体を形成し、細胞−抗体−ビーズ複合体を形成する。この数珠状になった複合体は、次に磁石の使用によって、脂肪組織分解物の残りから分けられる。次いで、磁石に結合しない物質は結合した物質から洗い落とされ、得られた結合した物質は、次に、抗ＣＤ３４陽性抗体について競合するペプチドとともにインキュベートされる。このようなペプチドは、抗ＣＤ３４陽性抗体について、競合的であるかもしくはより高い親和性を有し、その結果、細胞が、ビーズ、抗体および磁性物質から放出される。このプロセスは、ペプチドが抗体およびビーズを取り除き、それによって細胞を放出するのを可能にするために、その細胞複合体の凝集物を壊すための穏やかな機械的な攪拌（粉砕）によって増進される。そのペプチド−抗体−ビーズ複合体は、次に、磁石の使用により取り出された。
【００５４】
抗体選択技術（Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）は、患者の血液もしくは骨髄からヒトＣＤ３４＋幹細胞を単離、精製および収集するために用いられる（米国特許第５，５３６，４７５号；第６，２５１，２９５号；第５，９６８，７５３号；第６，０１７，７１９号）。ある種の局面において、濃縮プロセスは、Ｉｓｏｌｅｘシステム、例えば、上記Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉシステムもしくは、それの改変（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）で行われる。
【００５５】
ある種の実施形態において、さらなる考慮点および追加的工程が取られ得る。本発明の局面は、本明細書中に記載された工程の組み合わせを含む。ある種の実施形態は、標的細胞をＣＤ３４陽性細胞として包含するが、類似のプロセスは、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１１７陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞もしくはＣＤ３１陽性細胞のような他の細胞について選択するために利用され得る。このような類似のプロセスは、例えば、抗‐ＣＤ２７１、抗‐ＣＤ１１７、抗‐ＣＤ１３３および抗ＣＤ３１のような抗体の使用を包含する。本発明は、最終の得られた増進された脂肪組織分解物がこれらの細胞もしくは、その細胞の混合物の１つ（増加した濃度の、上で列挙された細胞の全ての細胞を含む増進された組織が挙げられるが、これに限定されない）について濃縮されるような、単独での、または他の１もしくはそれより多くのプロセスと組み合わせての、任意のこれらの選択プロセスの使用を企図する。
【００５６】
特定の実施形態において、本明細書中に記載された方法は、細胞の増殖もしくは拡張の目的で細胞を培養する必要なく、脂肪組織から標的細胞の集団を得る。この点で、ある種の実施形態において、その方法には、得られた標的細胞の集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。他の実施形態において、組織培養における時間は、限定的であり、かつ最小である。ある種の実施形態において、標的細胞は、８時間以下の間、１２時間以下の間、１８時間以下の間、２４時間以下の間、３６時間以下の間、もしくは４８時間以下の間、培養もしくはプレートされる。
【００５７】
ある種の局面において、標的細胞は、一旦、脂肪組織から得られた細胞の集団から選択もしくは精製されると、さらに改変される。ひとつの代替としては、細胞は、標的細胞の集団を拡張する目的、遺伝子を標的細胞内に送達する目的、標的細胞を分化させる目的、または、治療剤もしくは診断剤などの化合物を標的細胞に結合体化する目的で、インビトロで培養される。これらのさらなる工程を実施する方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ８１：２８４４−２８５３（１９９３）；米国特許第７，１４４，７３１号；Ｌｉ ｅｔ ａｌ、ＦＡＳＥＢ Ｊ １５：５８６（２００１）；Ｎｏｒｏｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３５（４）：６５３−６６１（２００７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ａｎｄ Ｃｏｓｓｅｔ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ、ｅｄｓ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００７を参照のこと。
【００５８】
細胞集団
本発明の方法は、脂肪組織から細胞の集団を提供する。したがって、本発明は、脂肪組織から細胞の集団をさらに提供する。ある種の実施形態において、本発明の細胞の集団は、（ｉ）脂肪組織から得られたかもしくはそれに由来した、細胞拡張の目的での組織培養における時間がほとんどなかった〜全くなかった初代細胞の集団であり、（ｉｉ）接着細胞および非接着細胞を含み、（ｉｉｉ）ＣＤ３４陽性細胞を含み、または、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｖ）までの組み合わせ、である。本発明の細胞の集団がＣＤ３４陽性細胞を含むある種の実施形態において、その集団の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）が、ＣＤ３４陽性細胞である。細胞の集団が、脂肪組織から得られたか、もしくは、それに由来した、細胞拡張の目的での組織培養における時間がほとんどなかった〜全くなかった初代細胞の集団である、ある種の実施形態において、その細胞は限定的かつ最小で、組織培養中に存在していた。ある種の実施形態において、細胞は、８時間以下の間、１２時間以下の間、１８時間以下の間、２４時間以下の間、３６時間以下の間、もしくは４８時間以下の間、培養もしくはプレートされたものである。ある種の実施形態において、細胞は、培養もしくはプレートされなかったものである。
【００５９】
ある種の実施形態において、その細胞の集団は、選択工程を伴い、もしくは、伴わず、本明細書中に記載されたあらゆる方法にしたがって脂肪組織を分解する際に得られた集団である。
【００６０】
ある種の実施形態において、本発明の細胞集団は、実質的に単離される。本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」は、その天然な環境から取り出されたことを意味する。その集団の細胞は、脂肪組織から得られ、かつ取り出されたので、ほとんどの実施形態における細胞は、「単離された」細胞と考えられる。
【００６１】
ある種の実施形態において、本発明の細胞集団は、実質的に精製もしくは濃縮もしくは選択される。本明細書中で用いられる場合、用語「精製された」、「濃縮された」および「選択された」は、もとの組成物の他成分から分けられた結果、純度に関して高められたことを意味する。「純度」もしくは「濃縮」もしくは「選択」は、相対的な用語であり、必ずしも、絶対的な純度、もしくは、絶対的な濃縮、もしくは、絶対的な選択とみなされるべきではないことが認識される。ある種の局面において、純度は、少なくとも約５０％であり、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％より高く、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは、約１００％である。ある種の実施形態において、濃縮もしくは選択は、もとの組成物と比較すると１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍の濃縮もしくは選択である。ある種の実施形態において、濃縮された集団における標的細胞の割合は、選択前もしくは精製前の細胞の集団における標的細胞の割合の約１．５倍から約５倍である。ある種の実施形態において、濃縮された集団における標的細胞の割合は、抗体を基にした選択前だが酵素溶液で分解後の細胞の集団における標的細胞の割合の、約１．５倍から約５倍である。
【００６２】
ある種の実施形態において、本発明の細胞の集団は、脂肪細胞、白血球および／もしくは赤血球から実質的に精製される。すなわち、脂肪組織から得られた細胞の集団には、脂肪細胞、白血球および／もしくは赤血球が実質的に存在しない。ある種の局面において、本発明の細胞の集団は、破片もしくは死んだ細胞から実質的に精製される。
【００６３】
ある種の実施形態において、細胞の集団は、陽性選択工程を経たものである。ある種の実施形態において、細胞の集団は、陰性選択工程を経たものである。ある種の実施形態において、細胞の集団は、陽性選択工程および陰性選択工程の両方を経たものである。ある種の局面において、本発明の細胞の集団は、標的細胞の濃縮された集団である。ある種の実施形態において、本発明の細胞の集団は、本明細書中に記載されたあらゆる方法にしたがって脂肪組織から得られた標的細胞の濃縮された集団である。
【００６４】
ある種の実施形態において、細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）は、実質的に同質の細胞の集団である。ある種の局面において、細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）は、集団の各細胞が、集団の別の細胞と遺伝子学的に識別のつかない、標的細胞のクローンの集団である。
【００６５】
ある種の実施形態において、細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）は、異質性の細胞の集団である。ある種の実施形態において、その異質性の細胞の集団は、標的細胞のみを含むが、この集団はクローンの集団ではない（例えば、互いに遺伝子学的に識別がつかないわけではない）。ある種の実施形態において、細胞の集団の実質的な部分は、１つ、もしくはそれより多い共通の細胞マーカー（例えば、ＣＤ３４）を発現するが、他の細胞マーカーの発現レベルは、集団の細胞によって異なる。ある種の局面において、標的細胞はＣＤ３４＋細胞であり、そのＣＤ３４＋細胞は、脂肪細胞、リンパ球、マクロファージ、間葉系幹細胞である。
【００６６】
ある種の実施形態において、その異質性の集団は、標的細胞以外の細胞である、他のタイプの細胞を含む。ある種の局面において、その異質性の細胞の集団は、標的細胞に加え、白血球（骨髄性系統の白血球もしくはリンパ系系統の白血球）、赤血球、内皮細胞、循環する内皮前駆細胞、上皮細胞、腎細胞、肺細胞、骨細胞、骨髄球、ニューロン、平滑筋細胞を含む。
【００６７】
ある種の具体的な局面において、その集団はさまざまな細胞種を含み、その集団の実質的な部分は、共通の表現型、共通の生物学的機能、または、共通の成熟状態もしくは共通の分化状態を含む。具体的な局面において、その集団における細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、幹細胞（例えば、脂肪間質幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞）である。具体的な局面において、その集団における細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、内皮細胞である。
【００６８】
ある種の実施形態において、細胞の集団は、接着細胞もしくは非接着細胞を含む。ある種の実施形態において、脂肪組織から得られた細胞の集団は、接着細胞および非接着細胞の両方を含む。
【００６９】
特定の表現型を有する細胞を単離、精製、選択、濃縮する適切な方法は、当該分野において公知であり、例えば、光学フローソーター（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））を用いた方法、および非光学フローソーター（例えば、磁気活性化セルソーティング）を用いた方法、および本明細書中に記載された方法を含む。
【００７０】
細胞マーカー
脂肪組織から得られた細胞の集団（標的細胞の濃縮された集団を含む）は、ある種の実施形態において、異質性の細胞集団であり、そこでは、その集団における細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、特定の表現型（例えば、細胞マーカーの発現について陽性および／もしくは細胞マーカーの発現について陰性である）を有する。本発明のある種の実施形態において、脂肪組織から得られた集団の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ３４陽性細胞である。本発明のある種の実施形態において、その集団の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ４５陰性細胞である。本発明のある種の実施形態において、その細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、以下の任意の細胞マーカー：ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、の発現について陽性である。本発明のある種の実施形態において、その細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、以下の任意の細胞マーカー：ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、の発現について陰性である。
【００７１】
薬学的組成物を調製する方法
脂肪組織から得られた標的細胞の濃縮された集団を含む細胞の集団は、治療上の価値を有すると考えられる。この点で、本発明は、患者への投与のための細胞を含む薬学的組成物を調製する方法をさらに提供し、この方法は、本明細書中に記載されたあらゆる方法にしたがって得られた細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）を薬学的に受容可能なキャリアと調合することを含む。
【００７２】
ある種の局面において、脂肪組織の提供者は、患者と同一である。この点で、その細胞（例えば、標的細胞）は、患者にとって「自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」と考えられる。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）の提供者は、患者と異なるが、その提供者および患者は同じ種である。この点で、その細胞（例えば、標的細胞）は、「同種由来（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」と考えられる。
【００７３】
特定の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は、脂肪組織から新鮮に得られた。具体的な局面において、その細胞は限られた程度（例えば、４時間以下、６時間以下、８時間以下、１２時間以下、１８時間以下、２４時間以下、３６時間以下、もしくは４８時間以下）でのみ培養もしくはプレートされた。他の局面において、その細胞は、薬学的に受容可能なキャリアと調合される前に培養もしくはプレートされなかった。
【００７４】
薬学的組成物
本発明は、本明細書中に記載されたあらゆる方法によって得られ、薬学的に受容可能なキャリアと調合された細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）を含む薬学的組成物をしかるべく提供する。この点で、本発明は、細胞（例えば、標的細胞）および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。そのキャリアは、慣例的に使用される任意のものであり、可溶性および活性化合物（複数）との反応性の欠如のような物理化学的考慮点ならびに投与経路によってのみ制限される。本明細書中に記載された薬学的に受容可能なキャリア、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。１つの局面において、薬学的に受容可能なキャリアは、その細胞（例えば、標的細胞）について、化学的に活性のないものであり、使用条件の下、有害な副作用もしくは毒性を有さないものである。キャリアの選択は、薬学的組成物の細胞の特定のタイプにより、および薬学的組成物の投与に用いられる特定の経路により、部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物について、さまざまな適切な調合がある。
【００７５】
投与経路
ある種の実施形態において、細胞（例えば、標的細胞）を含む薬学的組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、もしくは、腹膜内（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）投与のために調合される。他の実施形態において、その薬学的組成物は、鼻投与、スプレー投与、経口投与、エアゾール投与、直腸投与、もしくは膣内投与によって投与される。
【００７６】
細胞（例えば、標的細胞）を投与する方法は、当該分野において公知である。例えば、以下の任意の米国特許を参照のこと。
【００７７】
【数１】
非経口
ある種の実施形態において、本明細書中に記載された薬学的組成物は、非経口投与のために調合される。本発明の目的のため、その非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、大脳内、脳室内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、膀胱内、および海綿体内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｓａｌ）注射もしくは注入を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
非経口投与に適した調合物は、水性および非水性の等張滅菌注射溶液ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。この注射溶液は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、およびその調合物を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含み得る。この懸濁液は、懸濁化剤、可溶化剤、糊料、安定剤、および保存剤を含み得る。薬学的組成物は、さまざま局面において、薬学的キャリアにおける生理学的に受容可能な希釈剤によって、薬学的に受容可能な界面活性剤（例えば、石鹸もしくは洗剤）、懸濁化剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース）、もしくは乳化剤および他の薬学的アジュバントの添加を伴い、もしくは伴わずに投与される。その希釈剤は、例えば、滅菌した液体もしくは液体の混合物（水、生理食塩水、水性のデキストロースおよび関連する糖溶液を含む）、グリコール（例えば、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）、グリセロール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリドまたはアセチル化された脂肪酸グリセリドである。
【００７９】
非経口調合物において、必要に応じて用いられる油は、石油、動物油、植物油、もしくは合成油（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｉｌ）を含む。油の具体的な例は、ピーナッツ、大豆、ごま、綿実、コーン、オリーブ、ペトロラタムおよびミネラルを含む。非経口調合物における使用に適切な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００８０】
ある種の実施形態における非経口調合物は、保存剤もしくは緩衝液を含む。注射箇所の刺激を最小限に、もしくは排除するため、そのような組成物は、必要に応じて、約１２から約１７の親水−親油平衡（ＨＬＢ）を有する１つもしくはそれより多くの非イオン性界面活性剤を含む。そのような調合物における界面活性剤の量は、代表的に、約５重量％から約１５重量％に及ぶ。適切な界面活性剤は、ソルビタンモノオレエートのようなポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、およびプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、疎水性の塩基とエチレンオキシドの高分子量付加物を含む。その非経口調合物は、さまざまな局面において、アンプルおよびバイアルのような単位用量もしくは複数回用量の密封容器の中に提供され、使用直前の滅菌液体賦形剤（例えば、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で保管され得る。即時の注射溶液および懸濁液は、特定の局面において、以前に記載されたような滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製される。
【００８１】
注射可能な調合物は、本発明に従うものである。注射可能な組成物に対し、有効な薬学的キャリアについての必要条件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ． Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ、ｅｄｓ．、２３８−２５０ページ（１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ、Ｔｏｉｓｓｅｌ、４ｔｈ ｅｄ．、６２２−６３０ページ（１９８６）を参照のこと）。
【００８２】
細胞送達マトリックス
ある種の実施形態において、細胞（例えば、標的細胞）は、細胞送達マトリックスによって投与される。その細胞送達マトリックスは、特定の実施形態において、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ポリエチレングリコール、デキストラン（化学的に架橋可能、もしくは光架橋可能なデキストランを含む）を含むポリマーおよびヒドロゲルなどのうちの任意の１つもしくはそれより多くを含む。特定の実施形態において、その細胞送達マトリックスは、１つもしくはそれより多くの：収縮および非収縮コラーゲンゲルを含むコラーゲン、ヒドロゲル、アルブミン、ポリアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ（ｎ‐ビニル‐２‐ピロリドン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ））、ポリ（メタクリル酸‐２‐ヒドロキシエチル）、親水性ポリウレタン、アクリル誘導体、ポリプロピレンオキシドおよびポリエチレンオキシドのコポリマーのようなプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、Ｐａｎａｃｒｙｌ（登録商標）生体吸収性構成物、Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）ポリグラクチン９１０、および自己集合性ペプチドならびにフルオロポリマー（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フルオロポリマー）、プラスチックおよび金属のような非再吸収物質を含む。ヒドロゲルとしては、例えば、フィブリン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、ヒアルロネート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、化学的架橋、光架橋、もしくはその両方に適したデキストランを含むデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
そのマトリックスは、ある種の場合において、非分解性物質もしくは選択的分解性物質を含む。非分解性物質としては、例えば、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｂｏｎａｔｅ）、ポリスチレン、シリコーンなどが挙げられるが、これらに限定されない。その選択的分解性物質は、例えば、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ；ＰＬＧＡ））、ＰＬＡもしくはＰＧＡである。（また、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：２３３５ ２３４６、２０００；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｍａｒｃｈ／ Ａｐｒｉｌ １９９８、３０ ３７ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｄｏｍｂ、Ｋｏｓｔ、ａｎｄ Ｄｏｍｂ、ｅｄｓ．、１９９７、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｒｏｇａｌｌａ、Ｍｉｎｉｍ． Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｓｕｒｇ． Ｎｕｒｓ． １１：６７６９、１９９７；Ｋｌｅｉｎ、Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔ． Ｓｕｒｇ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ． ９：２０５ １８、２００１ ；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． １ １：３３７ ３９、１９８５；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５４：８１２ １５、１９９５；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ４３：４２２ ２７、１９９８；および Ｋｕｉｊｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ５１：１３６４５、２０００を参照のこと）。
【００８４】
そのマトリックスは、ある種の実施形態において、生体吸収性または非生体吸収性の、液体、ゲルまたは固体の、生体適合性の足場、格子、自己集合性構築物などを含む。そのようなマトリックスは、治療上の細胞処置、外科的修復、組織工学、および創傷治癒の分野において公知である。特定の局面において、そのマトリックスは、細胞（例えば、標的細胞）と前処理される。他の実施形態において、そのマトリックスは、マトリックスもしくはその空間と密接に結びついた細胞（例えば、標的細胞）で占められる。その細胞（例えば、標的細胞）は、マトリックスに接着し得るか、またはマトリックス空間内に閉じ込められ得る、もしくは含まれ得る。特定の局面において、そのマトリックス−細胞（例えば、標的細胞）は複合体を形成し、そこでは、その細胞がマトリックスと密接に結びつき増殖し、それが治療で用いられるときには、患者自身の腎細胞の成長、修復、および／もしくは再生が刺激および支持され、適切な血管新生が同様に刺激もしくは支持される。そのマトリックス−細胞組成物は、当該分野において公知の任意の方法で患者の体内に導入され得る。その方法としては、埋め込み、注射、外科的連結（ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、他の組織とともに移植などが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、マトリックスは、インビボで形成、もしくはさらに好ましくはインサイチューで形成する。例えば、インサイチューで重合可能なゲルが本発明にしたがって用いられ得る。そのようなゲルの例は、当該分野などにおいて公知である。
【００８５】
ある種の実施形態における細胞（例えば、標的細胞）は、三次元の骨組もしくはマトリックス（例えば、足場、発泡体、もしくはヒドロゲル）に播種され、しかるべく投与される。その骨組は、特定の局面において、さまざまな形状（例えば、実質的に平坦、実質的に円筒形もしくは管状）に設計されるか、または考慮中の矯正的な構築物について必要とされ得るかもしくは所望され得るような完全に自由な形態であり得る。ある種の局面における２つ、もしくはそれより多くの実質的に平坦な骨組は、別の骨組の上に横たえられ、必要に応じて一緒に固定されて、多層の骨組を生成する。
【００８６】
マトリックスの例、例えば、本発明の局面に用いられ得る足場は、マット（織った、編んだ、およびより好ましくは、不織の）、多孔性もしくは半多孔性の発泡体、自己集合性ペプチドなどを含む。不織のマットは、例えば、天然もしく合成のポリマーから構成される繊維を用いて形成され得る。ある種の実施形態において、ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）の商用名で販売されるグリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の吸収性コポリマーがマットを形成するために用いられる。例えば、ポリ（イプシロン‐カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される、米国特許第６，３５５，６９９号で論じられるようにフリーズドライすなわち凍結乾燥といったプロセスにより形成される、発泡体もまた、足場として機能し得る。ゲルもまた、本明細書中で用いられる場合、適切なマトリックスを形成する。例は、例えば自己集合性ペプチドで構成される、インサイチューで重合可能なゲル、およびヒドロゲルを含む。これらの物質は、ある種の局面において、組織の成長の支持として用いられる。インサイチューで形成する分解性ネットワークもまた、本発明における使用に適している（例えば、Ａｎｓｅｔｈ、Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８：１９９−２０９；Ｗａｎｇ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：３９６９−３９８０；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許公報第２００２／００２２６７６号を参照のこと）。これらの物質は、ある種の局面において、注射に適した液体として調合され、後に、インサイチューもしくはインビボで分解性ヒドロゲルネットワークを形成するためにさまざまな手段（例えば、温度、ｐＨ、光への曝露における変化）によって誘導され得る。
【００８７】
ある種の実施形態において、上記骨組はフェルトであり、それは生体吸収性物質（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸）から作られるマルチフィラメントヤーンを含む。特定の局面におけるヤーンは、クリンプ（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）、裁断（ｃｕｔｔｉｎｇ）、カーディングおよび針で縫う（ｎｅｅｄｌｉｎｇ）からなる標準テキスタイル加工技術を用いてフェルトにされる。特定の局面における細胞（例えば、標的細胞）は、複合構築物であり得る発泡体足場の上に播種される。加えて、その三次元の骨組は、ある種の局面において、有用な形状にかたどられる。その形状は、例えば、修復され、置換され、もしくは増大される腎臓内もしくは腎臓周りの特定の構築物である。
【００８８】
特定の局面における骨組は、細胞連結を増進するために細胞（例えば、標的細胞）の接種前に処理される。例えば、細胞（例えば、標的細胞）の接種前に、ナイロンマトリックスは、ナイロンをコートするために０．１Ｍの酢酸で処理され、ポリリジン、ＰＢＳおよび／もしくはコラーゲンの中でインキュベートされる。ある種の局面におけるポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理される。
【００８９】
追加的実施形態において、三次元骨組の外表面は、細胞の連結もしくは増殖および組織の分化を改善するために改変される。例えば、骨組のプラズマコーティングによって、またはタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン４‐硫酸、コンドロイチン６‐硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸（ｋｅｒａｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ））、細胞マトリックス、および／もしくは他の物質（特にゼラチン、アルギネート、寒天、アガロースおよび植物ゴムが挙げられるが、これらに限定されない）のうちの１つもしくはそれより多くの添加によって改変される。
【００９０】
ある種の実施形態における足場は、その足場を非血栓形成性（ｎｏｎ‐ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ）にする物質を含む。これらの物質は、特定の実施形態において、内皮の増殖、移動、および細胞外マトリックスの堆積を促進および維持する。そのような物質の例は、天然物質（例えば、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンのような基底膜タンパク質）、合成物質（例えば、ｅＰＴＦＥ）およびセグメント化ポリウレタンウレアシリコーン（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅｕｒｅａ ｓｉｌｉｃｏｎｅ）（例えば、ＰＵＲＳＰＡＮ（登録商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．））が挙げられるが、これらに限定されない。これらの物質は、その足場を非血栓形成性にするためにさらに処理され得る。そのような処理は、ヘパリンのような抗血栓剤、およびプラズマコーティングのような物質の表面電荷を変える処理を含む。
【００９１】
細胞（例えば、標的細胞）を含む薬学的組成物は、特定の実施形態において、本明細書中に記載された任意の成分を含む任意の細胞送達マトリックスの成分を含む。
【００９２】
ある種の実施形態において、その薬学的組成物は、幹細胞を含む。虚血性損傷の動物への幹細胞の投与は、米国特許第５，９８０，８８７号に記載されている。
【００９３】
本発明の局面において、標的細胞は、脂肪由来のＣＤ３４＋細胞である。全てもしくは実質的に全ての処理試薬が存在しない増進されたＣＤ３４＋細胞の混合物は、次に、患者への治療上の注射に適切な媒体に入れられ得る。そのような媒体は、一般に当業者に公知であり、灌注溶液、細胞培養溶液などを含むが、これらに限定されない。ある種の局面において、そのＣＤ３４＋細胞は、いくつかの手段の１つによって患者に送達される。ある種の実施形態において、そのＣＤ３４＋細胞は、筋肉内に、腹膜内に、頭蓋内に、血管内に、静脈内に、組織成分（例えば、砕けた（ｆｒａｃｔｕｒｅｄ）もしくは折れた（ｂｒｏｋｅｎ）骨もしくは軟骨）の間に送達される。
【００９４】
標的について可能性のある送達の選択肢は、以下を含むが、これらに限定されない：直接注射（針および注射器)；注射カテーテル（より深い組織）；表面のためのスプレー；あらかじめ作られたフィブリン（皮下の、もしくは組織層内のより深くの）を生体足場（内部および外部の両方）とともに埋め込むこと。本発明の局面において、送達のための標的身体の場所は、心臓、肢、目、脳、腎臓、神経、肝臓、腎臓、心臓、肺、目、胃腸管の器官、皮膚および脳であり得る。
【００９５】
用量
本発明における目的のため、投与される薬学的組成物の量もしくは用量は、無理のない時間枠にわたって、例えば、治療上もしくは予防の応答を、被験体もしくは動物において達成するのに十分である。例えば、薬学的組成物の用量は、投与時から、約１２時間、約１８時間、約１日から４日もしくはそれより長い期間（例えば、５日、６日、１週間、１０日、２週間、１６日から２０日、もしくはそれより長く）に疾患もしくは医学的状態を処置もしくは予防するのに十分である。特定の実施形態において、その期間はさらに長い。その用量は、特定の薬学的組成物の効果および処置される動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに処置される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【００９６】
投与される用量を決定する多くの分析が、当該分野において公知である。ある種の実施形態において、哺乳動物へのそのような細胞（例えば、標的細胞）の所定の用量の投与の際にその細胞（例えば、標的細胞）が損傷部位に局在する程度をそれぞれに異なる用量の細胞（例えば、標的細胞）が与えられる一組の哺乳動物の間で比較することを含む分析が、哺乳動物に投与される開始用量を決定するのに用いられる。特定の用量の投与の際に細胞（例えば、標的細胞）が損傷部位に局在する程度は、当該分野において公知の方法によって分析され得る。
【００９７】
また、哺乳動物へのそのような細胞（例えば、標的細胞）の所定の用量の投与の際にその細胞（例えば、標的細胞）が損傷した後肢の再灌流を引き起こす程度をそれぞれに異なる用量の細胞（例えば、標的細胞）が与えられる一組の哺乳動物の間で比較することを含む分析が、哺乳動物に投与される開始用量を決定するのに用いられる。特定の用量の投与の際に細胞（例えば、標的細胞）が損傷した後肢の再灌流を引き起こす程度は、当該分野において公知の方法によって分析され得、本明細書中に記載されている。
【００９８】
薬学的組成物の用量はまた、特定の薬学的組成物の投与に付随して起こり得る任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。代表的に、主治医がさまざまな要因（例えば、年齢、体重、全体的な健康、食事、性別、治療剤（複数）（例えば、投与される薬学的組成物の細胞（例えば、標的細胞）、投与経路、および処置されている状態の重症度）を考慮し、個々の患者それぞれを処置する薬学的組成物の用量を決める。例示であり、本発明を制限することを意図しないが、薬学的組成物の用量は、少なくとも約０．５×１０６（例えば、少なくとも約１×１０６、少なくとも約１．５×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約２．５×１０６、少なくとも約３．０×１０６、少なくとも約５．０×１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８）の細胞（例えば、標的細胞）が患者に投与されるようなものであり得る。
【００９９】
投与のタイミング
本発明の特定の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）の投与は遅らされる；すなわち、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷直後に投与されない（例えば、損傷後、約３０分より前ではなく、約１時間より前ではなく、約２時間より前ではなく、約３時間より前ではなく、約４時間より前ではなく、約５時間より前ではなく、約６時間より前ではなく、約７時間より前ではなく、約８時間より前ではなく、約９時間より前ではなく、約１０時間より前ではなく、約１１時間より前ではなく、もしくは約１２時間より前ではなく）。
【０１００】
本発明のある種の局面において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷の修復期の最初に患者に投与される。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後、少なくとも約１２時間（例えば、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５２時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約５６時間、少なくとも約５８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６２時間、少なくとも約６４時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約６８時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約７２時間）に投与される。
【０１０１】
さらなる実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は上に記載されたような時点、および損傷後、約１４日より前（例えば、約１３日より前、約１２日より前、約１１日より前、約１０日より前、約９日より前、約８日より前、約７日より前、約６日より前、約５日より前、約４日より前、約３日より前）に患者に投与される。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後約２４時間、もしくはその後のいつか、しかし損傷後約１４日より前に患者に投与される。
【０１０２】
ある種の局面において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後Ｘより後かつ損傷後Ｙより前に投与され、ここで、Ｘは約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４８時間、約５２時間、約５８時間、約６４時間、約７２時間、約３．５日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日からなる群から選択され、Ｙは約１６日、約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約１週間からなる群から選択され、ＸはＹより少ない。本発明のある種の局面において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間に投与される。
【０１０３】
本発明のある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は１回より多く患者に投与される。その細胞（例えば、標的細胞）は１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、週１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、８日に１回、９日に１回、１０日に１回、１１日に１回、１２日に１回、１３日に１回、もしくは１４日に１回、または月１回、投与され得る。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後約２４時間より後（例えば、２４時間）に投与され、損傷後約４８時間より後（例えば、４８時間）に再投与される。
【０１０４】
制御放出調合物
薬学的組成物は、特定の局面において、その薬学的組成物が投与される体の中に放出される方法が体内での時間および位置について制御されるように、デポ剤の形態に改変される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照のこと）。デポ剤の形態は、さまざまな局面において、細胞（例えば、標的細胞）および多孔性もしくは非多孔性物質（例えば、ポリマー）を含む埋め込み可能な組成物であり、ここでは、その細胞（例えば、標的細胞）は、その物質および／もしくは非多孔性物質の分解物によって包まれるか、もしくは、その物質および／もしくは非多孔性物質の分解物にわたって拡散される。そのデポ剤は次に、体内の所望する位置に埋め込まれ、その細胞（例えば、標的細胞）は、あらかじめ決められた速度でそのインプラントから放出される。
【０１０５】
したがって、特定の局面における薬学的組成物は、インビボ放出プロフィールの任意のタイプを有するように改変される。本発明のある種の局面において、その薬学的組成物は、即時放出の、制御放出の、持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）の、徐放放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）の、遅延放出の、もしくは二相性放出の調合物である。
【０１０６】
結合体
本発明のある種の実施形態において、細胞（例えば、標的細胞）は、第二の部分（例えば、治療剤もしくは診断剤）に、連結（ａｔｔａｃｈｅｄ）されるか、もしくはつなげられる（ｌｉｎｋｅｄ）。これらの実施形態の細胞（例えば、標的細胞）は、損傷した腎臓組織に特異的に局在できるので、標的化剤として働く。したがって、本発明は、１つの局面において、治療剤もしくは診断剤に連結した細胞（例えば、標的細胞）を含む組成物を提供する。本発明における目的に適した治療剤および診断剤は、当該分野において公知であり、本明細書中に言及された任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
組み合わせ
上記結合体を含む本明細書中に記載された薬学的組成物は、ある種の実施形態において、それだけで投与される。他の実施形態において、上記結合体を含む薬学的組成物は、他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて投与される。ある種の実施形態において、その薬学的組成物は、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を処置すると知られている別の治療剤（例えば、サイトカインもしくは成長因子、抗炎症剤、ＴＬＲ２阻害剤、ＡＴＦ３遺伝子もしくは遺伝子産物、およびミネラルコルチコイド受容体ブロッカー（例えば、スピロノラクトン）を含む）、リゾホスファチド酸、２−メチルアミノクロマン（例えば、Ｕ８３８３６Ｅ）、２１−アミノステロイド（例えば、ラゾロイド（ｌａｚｏｒｏｉｄ）（Ｕ７４３８９Ｆ））、トリメタジジン、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、もしくはアンギオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、およびスラミンと投与される。
【０１０８】
ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は、他の追加的治療剤と投与される。その追加的治療剤としては、抗血栓剤、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン）、抗酸化剤、もしくは当該分野において腎臓損傷もしくは腎疾患を処置するために通常用いられる他の剤（例えば、エプロジセート（ｅｐｒｏｄｉｓａｔｅ）およびトリプトリド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンおよびアトルバスタチン）、細胞溶解物、可溶性細胞画分、膜濃縮細胞画分、細胞培地（例えば、馴化培地）、もしくは細胞外マトリックス栄養因子（例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
特定の実施形態において、標的細胞のサブ集団は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、および任意の他の幹細胞からなる群から選択される他の幹細胞と組み合わせられる。ある種の実施形態において、その標的細胞は、非造血幹細胞と組み合わせられる。その非造血幹細胞としては、例えば、間葉性の細胞が挙げられるが、これに限定されない。ある種の実施形態における標的細胞は、足場と組み合わせられる。その足場としては、フィブリン、コラーゲン、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ある種の実施形態における選択された細胞は、さまざまな成長因子もしくは他の生物活性剤と組み合わせて用いられる。これらは、上方調節因子もしくは下方調節因子としての使用のために、遺伝子療法を用いて改変され得る。
【０１１１】
使用
本明細書中に記載された薬学的組成物は、多くの疾患および医学的状態の治療上の処置において、有用であると考えられる。したがって、上記方法は、疾患もしくは医学的状態を処置するのに効果的な量で本明細書中に記載された任意の薬学的組成物を患者に投与することを含む、その疾患もしくは医学的状態を処置する方法を追加的に提供する。用語「処置する」およびそこから派生する用語は、本明細書中で用いられる場合、標的とされた状態の、必ずしも１００％もしくは完全な改善を意図するものではない。むしろ、当業者が利益を有すると認識するさまざまな程度の治療効果が存在する。この点、本明細書中に記載された方法は、腎臓損傷について、任意の量もしくは任意のレベルの治療上の利益を提供し、ゆえにその損傷を「処置する」。
【０１１２】
ある種の局面において、その疾患もしくは医学的状態は、慢性心筋虚血、重大な四肢の虚血、急性心筋梗塞、心血管疾患、糖尿病、自己免疫疾患、脳卒中、脳損傷および／もしくは脊髄損傷、熱傷損傷、骨欠陥、腎虚血、および黄斑変性である。ある種の実施形態において、その薬学的組成物は、虚血、血流の損失、裂傷、体温の極端な状態、外傷、または、代謝病もしくは遺伝病に起因する組織損傷を処置するために用いられる。
【０１１３】
その薬学的組成物が脂肪由来の幹細胞を含むある種の局面において、上記方法は、治療効果を提供することを含む。その治療効果としては、例えば：虚血に対抗する血管新生促進効果（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）、細胞、組織および／もしくは臓器再生の生成、創傷治癒、分化、血液供給の再構成、アポトーシスの減少、パラクリンシグナル伝達、および免疫調節が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３４およびＣＤ２７１に対する抗体を用いた陽性選択手順を用いて細胞が選択されるある種の局面において、その方法は、炎症を処置する。上記薬学的組成物がＣＤ３４＋細胞を含む局面において、その方法は、抗アポトーシス効果を提供する。
【０１１４】
脂肪組織内の細胞は、分化の可能性を有することが示されており、ゆえに複数の組織の修復および再生ならびに複数の損傷タイプに用いられ得る。これらの細胞はまた、美容外科の領域において有益であり得る。処理の容易さ、および脂肪吸引の比較的非侵襲な性質に起因して、これらの細胞は、組織を修復する能力のために選択され得るか、もしくは回復を早めるために創傷治癒剤と併用され得る。
【０１１５】
腎臓損傷
本発明のさまざまな局面において、提供される方法は、患者における腎臓損傷を処置することが意図されている。その腎臓損傷は、さらに本明細書中に記載された、以下の１つもしくはそれより多くの任意のものにより引き起こされる腎臓に対する任意の損傷である：虚血、毒素への曝露、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）もしくはアンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカーの使用、輸血反応、筋肉に対する損傷もしくは外傷、手術、ショック、低血圧、または、任意のＡＲＦもしくは慢性腎臓病の原因。
【０１１６】
標的とされる腎臓損傷は、腎臓内に見出される任意の組織に対する損傷を含む。その組織としては、髄質、皮質、腎錐体、葉間動脈、腎動脈、腎静脈、腎門、腎盤、尿管、小腎杯、腎被膜、下腎臓被膜（ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｐｓｕｌｅ）、上腎臓被膜（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｐｓｕｌｅ）、葉間静脈、ネフロン、大腎杯、腎乳頭、糸球体、ボーマン嚢、腎柱の組織が挙げられるが、これらに限定されず、その組織が十分に損傷すると、部分的もしくは完全な機能喪失という結果になる。その損傷した腎臓組織は、任意の１つもしくはそれより多い腎臓に存在するはっきり識別できる細胞型含む。その細胞型としては、腎糸球体の壁細胞、腎糸球体の足細胞、糸球体内血管間膜細胞、糸球体の内皮細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の薄いセグメント細胞（ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｅｌｌ）、厚い上行脚細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、および間質性の腎細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、その腎臓損傷は、腎臓の管周囲微小血管系に対する損傷を含む。特定の局面において、その腎臓損傷は、管周囲毛細血管に対する損傷を含む。ある種の実施形態において、その腎臓損傷は、細管（管状）上皮細胞に対する損傷を含む。
【０１１７】
腎臓病および腎臓の医学的状態の予防
腎臓は自己修復もしくは自己再生に対してすさまじい能力を有するが、腎臓損傷は、しばしば、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態に対して増加した素因につながる。本明細書中において提供される、患者における腎臓損傷を処置する方法は、成功する腎臓の修復および再生を可能にすると理論づけられ、そのため、その患者は腎臓病もしくは腎臓の医学的状態に対して増加した素因を有さない。ゆえに、本発明は、腎臓損傷を含む、患者における腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を予防する方法をさらに提供する。その方法は、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を予防するのに効果的な量で患者に細胞（例えば、標的細胞）を投与することを含む。ある種の実施形態において、その量は、その腎臓損傷を処置するのに効果的である。例えば、腎臓の機能を回復するのに効果的な量、腎臓の管周囲微小血管系を再生するのに効果的な量である。
【０１１８】
本明細書中で用いられる場合、用語「予防する」およびそこから派生する用語は、必ずしも１００％もしくは完全な予防を意図するものではない。むしろ、当業者が予防について潜在的利益を有すると認識するさまざまな程度の予防が存在する。この点、本明細書に記載された予防する方法は、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態について任意の量もしくは任意のレベルの予防を提供する。さまざまな局面において、その予防する方法は、その腎臓病もしくは腎臓の医学的状態またはその兆候もしくは状態の開始、発症、発生、もしくは進行を遅延する、ゆっくりにする、減少させる、もしくは軽減する方法である。
【０１１９】
ある種の実施形態において、予防される腎臓病もしくは腎臓の医学的状態は、急性腎不全、慢性腎疾患、腎間質性線維症、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、水腎、間質性腎炎、腎石（腎石症）、腎腫瘍（例えば、ウィルムス腫、腎細胞癌）、ループス腎炎、微小変化群、ネフローゼ症候群、腎盂腎炎、腎不全（例えば、急性腎不全および慢性腎疾患以外の）である。
【０１２０】
急性腎不全
本明細書中で用いられる場合、用語「急性腎不全」は、「急性の腎臓損傷」もしくは「ＡＲＦ」と同義であり、腎臓に対する損傷に起因する腎機能の急速な喪失を指す。ＡＲＦは、通常は腎臓によって排出される窒素性不用物（例えば、血清クレアチンおよび／もしくは尿排出物）および非窒素性不用物のレベルにおける急な変化により特徴づけられる複合症候群である。ＡＲＦの兆候および診断は、当該分野において公知である。例えば、Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５６、ｖｏｌ．ｅｄｓ．Ｒｏｎｃｏ ｅｔ ａｌ．、Ｋａｒｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、２００７、およびＢｅｌｌｏｍｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ８（４）：Ｒ２０４−Ｒ２１２、２００４を参照のこと。
【０１２１】
さまざまな局面において、そのＡＲＦは、原因によって、腎前性ＡＲＦ、内因性ＡＲＦもしくは腎後性ＡＲＦである。この点で、その腎前性ＡＲＦは、以下の１つもしくはそれより多くのものにより引き起こされ得る：血液量減少（例えば、ショック、脱水、流体の喪失、もしくは過剰な利尿薬（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）の使用に起因する）、肝腎症候群、血管の問題（例えば、アテローム塞栓性疾患、腎静脈血栓症、ネフローゼ症候群に関係するもの）、感染（例えば、敗血症）、重症の熱傷、腐骨形成（例えば、心膜炎、膵炎に起因する）、および低血圧（例えば、抗高血圧性、血管拡張薬の使用に起因する）。
【０１２２】
その内在性ＡＲＦは、以下の１つもしくはそれより多くのものにより引き起こされ得る：毒素もしくは薬物（例えば、ＮＳＡＩＤ、アミノ配糖体抗生物質、ヨウ素化造影剤、リチウム）、リン酸腎症（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）（例えば、結腸鏡検査の腸の、リン酸ナトリウムとの調製に関連した）、横紋筋融解症（例えば、損傷（例えば、圧挫もしくは広範囲な鈍的外傷）、スタチン、興奮薬の使用により引き起こされる）、溶血、多発性骨髄腫、急性糸球体腎炎。
【０１２３】
その腎後性ＡＲＦは、以下の１つもしくはそれより多くのものにより引き起こされ得る：薬物（例えば、抗コリン作用性の）、良性前立腺肥大もしくは前立腺癌、腎石、腹部の悪性腫瘍（例えば、卵巣癌、結腸直腸癌）、塞がれた尿路カテーテル、および結晶尿もしくはミオグロブリン尿、または膀胱炎を引き起こす薬。
【０１２４】
ＡＲＦは、患者における虚血、毒素、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）もしくはアンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカーの使用、輸血反応、筋肉に対する損傷もしくは外傷、手術、ショック、および低血圧により引き起こされ得る。ＡＲＦを引き起こす毒素は、抗真菌性の色素、もしくは放射線写真の色素であり得る。また、ある種の実施形態において、ＡＲＦは急性尿細管壊死もしくは腎虚血再灌流障害を包含する。
【０１２５】
慢性腎疾患
腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を予防する方法のある種の実施形態において、その腎臓病は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）である。本明細書中で用いられる場合、「慢性腎臓病」としても知られる「慢性腎疾患」は、何ヶ月もしくは何年にもわたる進行性の腎機能の喪失を指す。処置されるＣＫＤは、任意の病期である。その病期は、例えば、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４、もしくはＳｔａｇｅ５（確立したＣＫＤ、末期の腎臓病（ＥＳＲＤ）、慢性腎不全（ＣＫＦ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、もしくは慢性腎不全（ＣＲＦ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）としても知られる）を含む。
【０１２６】
そのＣＫＤは、多数の要因のうちの任意の１つにより引き起こされ得る。その要因としては、急性腎臓損傷、急性腎臓損傷の原因、糖尿病性腎症につながるＩ型およびＩＩ型の真性糖尿病、高い血圧（高血圧）、糸球体腎炎（腎臓の濾過系の炎症および損傷）、多嚢胞腎疾患、鎮痛薬性腎症につながる鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン）の使用（例えば、定期的な、および長期間にわたる）、虚血性腎症につながるアテローム性動脈硬化症、石による尿の流れの閉塞、拡大した前立腺、狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ）（狭窄（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ））、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球症、ヘロイン乱用、アミロイドーシス、腎石、慢性腎臓感染、および特定の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
非腎臓病および非腎臓の医学的状態の予防
慢性腎疾患は、心血管疾患および心血管死の主要な独立した危険因子として同定されている。本明細書中に記載された細胞（例えば、標的細胞）の投与は、腎臓病および腎臓の医学的状態以外の疾患もしくは医学的状態を予防するのにさらに有用であると理論づけられる。したがって、腎臓損傷を含む、患者における腎臓病もしくは腎臓の医学的状態により引き起こされるか、または腎臓損傷を含む、患者における腎臓病もしくは腎臓の医学的状態に関連する、非腎臓病もしくは非腎臓の医学的状態を予防する方法が、本明細書中にさらに提供される。その方法は、その非腎臓病もしくは非腎臓の医学的状態を予防するのに効果的な量で患者に細胞（例えば、標的細胞）を投与することを含む。特定の実施形態において、その非腎臓病もしくは非腎臓の医学的状態は、心血管疾患である。
【０１２８】
ある種の実施形態において、本明細書中に提供される方法により処置される疾患もしくは医学的状態は、自己免疫疾患である。本明細書中における目的のため、「自己免疫疾患」は、身体が自らの組織のある種の構成成分に対して免疫原性（例えば、免疫系）応答を起こす疾患を指す。換言すると、その免疫系は体内のある種の組織もしくは機構を「自己」として認識する能力を失い、まるでそれが外来性であるかのようにそれを標的にし、攻撃する。自己免疫疾患は、優先的に１つの臓器が影響されるもの（例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎）と、その自己免疫疾患のプロセスが多くの組織に拡散するもの（例えば、全身性エリテマドーデス）とに分類され得る。例えば、多発性硬化症は、Ｔ細胞が脳および脊髄の神経線維をとり囲む鞘を攻撃することにより引き起こされると考えられる。このことは、協調の喪失、衰弱（ｗｅａｋｎｅｓｓ）、および不鮮明な視界という結果になる。自己免疫疾患は、当該分野において公知であり、例えば、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性動脈炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマドーデス、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などを含む。
【０１２９】
ある種の実施形態において、その疾患は癌である。具体的な実施形態において、その癌は、以下のものからなる群から選択される：急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門の、肛門間の、もしくは肛門直腸の癌、目の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸の、胆嚢の、もしくは胸膜の癌、鼻の、鼻腔の、もしくは中耳の癌、口腔の癌、外陰の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、頸部の癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮種、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜の、網の、および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟組織癌、胃癌、精巣（睾丸）癌、甲状腺癌、尿管癌、および膀胱癌。
【０１３０】
患者の型
本明細書中に記載された発明の方法に関して、その患者は任意の宿主である。ある種の実施形態において、その宿主は哺乳動物である。本明細書中で用いられる場合、用語「哺乳動物」は、哺乳綱の任意の脊椎動物を指す。その脊椎動物としては、任意の、単孔類、有袋類、および有胎盤哺乳類の分類群が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、その哺乳動物は、マウスおよびハムスターのようなげっ歯目の哺乳動物およびウサギのようなウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳動物の１つである。特定の実施形態において、その哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目由来である。特定の実施形態において、その哺乳動物は、ウシ属（ウシ）およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来もしくはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものである。ある種の場合において、その哺乳動物は、霊長目、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄ）、もしくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄ）（サル）もしくは類人の目（ｏｒｄｅｒ Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）（ヒトおよび類人猿）である。特定の実施形態において、その哺乳動物はヒトである。
【０１３１】
以下の実施例は、本発明を単に説明するために与えられ、どんな様式でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
分解工程の最適化
組織から細胞を放出するために脂肪組織を分解するための標準プロトコルを酵素の濃縮および分解時間に関して最適化した。細胞の生存率を保ちながら、脂肪組織１ｍｌ当たり放出される最大の細胞量を得るために、２つのパラメーターおよび全体の分解技術を最適化した。
【０１３３】
１９１Ｕ／ｍｌ、２５０Ｕ／ｍｌおよび３１９Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ濃度を試験した。脂肪組織（脂肪吸引物）の容量に対して１：１の容量の割合で使用したコラゲナーゼ溶液は、以下の成分を含んだ。コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ５０：５０（Ｇｉｂｃｏ）；ｗ／Ｌ−グルタミン；１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ。
【０１３４】
コラゲナーゼ溶液とのインキュベーション時間は、１５と６０分との間で変動した。分解は常に振とうしながら３７℃で行った。ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する洗浄緩衝液もまたこれらの実験に用いて、酵素を不活性化し、放出された細胞の総合的な健常性および生存率を促進した。
【０１３５】
脂肪組織から放出された細胞総数に加えて、放出された細胞の生存率を測定した。細胞生存率を細胞膜が傷ついたときにのみ細胞を透過する色素（７ＡＡＤ）を用いて分析した。色素を、したがって細胞生存率を、次にフローサイトメトリーを用いて定量化した。
【０１３６】
異なる濃度のコラゲナーゼを含む培地とのインキュベーション時において、脂肪組織から放出された細胞総数、および生存可能であったこれらの細胞の割合を表１に示す。
【０１３７】
【表１】
これらのデータは、２５０Ｕ／ｍＬ濃度のコラゲナーゼを含む培地で４５分間、約３７℃、攪拌、振とう、混合しながらのインキュベーションがこの応用に最適であることを示した。これらの条件下で処理された組織１ｍｌ当たりに放出される細胞数は２５０Ｕ／ｍｌにおいて最大であった。そして細胞の生存率は大幅には損なわれなかった。
【０１３８】
選択工程の最適化
コラゲナーゼ分解において脂肪組織から放出された細胞を、標的細胞集団に対して抗体を基にした捕捉方法を用いて濃縮、もしくは選択した。細胞の生存率を保ちながら最大の純度および回収率を達成するために、図１に概説する選択工程を最適化した。
【０１３９】
抗体濃度、ビーズと標的細胞の比、放出ペプチド濃度、および粉砕技術を脂肪組織放出細胞集団内に含有されるＣＤ３４陽性細胞に対して選択することによって分析した。蛍光球を用いて所定のサンプル中のＣＤ３４陽性細胞の総数を計算するＳｔｅｍ Ｋｉｔ ＣＤ３４ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、ＣＤ３４の発現、ならびに選択細胞および非選択細胞の定量化を分析した。ＣＤ４５の発現および細胞の生存率（７ＡＡＤによる）をさらに評価した。
【０１４０】
これらの実験に用いた溶液は、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ならびにＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂａｘｔｅｒ）の成分を含んだ。Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒはＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（Ｂａｘｔｅｒ）；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；２．６８ｍＭ ＫＣｌ；３．２１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ×１２ Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２）；４１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）；および１％ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂａｘｔｅｒ）を含んだ。Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂａｘｔｅｒ）は、抗ＣＤ３４抗体（Ｃｌｏｎｅ９Ｃ５）；Ｄｙｎａｌ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ常磁性ビーズ（ＳＡＭ）；およびＰＲ３４放出ペプチドを含んだ。
【０１４１】
Ｉｓｏｌｅｘキット濃度を模倣する抗体濃度（１００万標的細胞当たりの抗体量）および過剰と考えられる抗体濃度を使用した。１００万標的細胞当たり１μｇの抗体を使用し、使用された特定の種類の細胞に対して最適化することにより、抗ＣＤ３４抗体の濃度を決定した。特に１００万標的細胞当たり約１μｇと２．５μｇの間の抗体濃度を試験した。放出された細胞および抗体を含む培地を回転装置の上で３０分間インキュベートした。細胞を６００ｇの遠心分離によって洗浄した。
【０１４２】
ビーズと細胞の比は、選択法の重大な側面であり、処理される細胞／組織の型に基づいて変動し得る。末梢血由来細胞よりも高い頻度でＣＤ３４抗原を発現する接着細胞を使用したこの分析のために、ビーズと標的細胞の比１：１、２：１、４：１、５：１、７．５：１および１０：１を試験した。標的細胞は、選択されなかった、放出された細胞の総集団の５０％と見積もった。ビーズを細胞とともに回転装置の上で約４５分間インキュベートした。混合物を、免疫複合体を捕らえるために磁石に３回曝した。１：１から５：１（ビーズと標的細胞の比）の標的範囲を、最適であると決定した。この範囲は脂肪組織のみに対して最適であり得る。
【０１４３】
他のビーズと標的細胞の比が有用であるように見えるが、きわめて高い捕捉能力を考慮すると、高すぎるビーズと標的細胞の比においては放出能力が欠点になると考えられた。
【０１４４】
最適な放出ペプチド濃度を、１ｍｇ／ｍｌもしくは２ｍｇ／ｍｌでＰＲ３４ペプチドの量を変動させることによって決めた。細胞、ＣＤ３４抗体、ビーズ、放出ペプチドを含む培地を、回転装置の上で４５分間から６０分間インキュベートした。
【０１４５】
ＣＤ３４陽性標的細胞の接着性質は、細胞の集団を分散する方法、および放出ペプチドの結合のための空間を作る方法を必要とした。放出工程の間に、集団を破壊し、細胞を放出するために粉砕を使用した。具体的には、放出工程の間に３度別個に、集団を、培地を注射器の小さな穴から吸い込むことによって粉砕し、ゆっくり注射器から吐き出した。試験した粉砕時間は０分、１５分、３０分および４５分を含んだ。
【０１４６】
これらの実験から、粉砕を伴う放出ペプチドＰＲ３４の使用が最良の結果を生むことが見出された。このタイプの粉砕技術は脂肪組織に特有であり、かつ新規である。この技術を用いて、２０％より高いおおよその放出割合が観察された。
【０１４７】
選択されたＣＤ３４陽性細胞の生存率および純度を、選択されていない細胞のものと比較した。表２に示すように、抗体を基にした選択工程は、２３％の総回収率を伴い、純度において約２倍の上昇（４０％から７５％へ）を達成した。別の一組の実験では、その選択工程は、ＣＤ３４陽性細胞の３６％から７３％への純度上昇を達成した（データ示さず）。特に、その選択工程は、細胞の生存率を有意には損なわなかった（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）。
【０１４８】
【表２】
この例については、ｎ＝３である。純度は、ＣＤ３４陽性細胞の総数を総細胞（破片を除く）で除算した度合いである。回収率（％）は、選択されなかった集団内におけるＣＤ３４陽性細胞の総数で除算した、選択された集団内におけるＣＤ３４陽性細胞の総数である。
【０１４９】
選択された細胞の表現型は、選択されなかった細胞と異なるものであることが測定された。例えば、ＣＤ４５の発現は、ＣＤ３４選択細胞（７．５４％）において、選択されなかった細胞（１５．８２％）と比較すると減少した。さらに、選択の際に、リンパ球も減少した。また、明るいＣＤ３４細胞（ＣＤ３４をより高い度合いで発現する細胞）の数は、選択された細胞集団において、選択されなかった集団と比較すると減少した。その明るいＣＤ３４細胞を捕捉するために、選択工程を調節し得る。選択の際に、ＣＤ１４０ｂ陽性細胞の数は増加したが、選択の際に、ＡＳＣおよびＣＤ１４４陰性細胞の数は維持された。
【０１５０】
実施例２
脂肪吸引処置由来のヒト脂肪組織を、実施例１で決定したように最適な酵素分解手順を用いて分解した。具体的には、２５０Ｕ／ｍｌの培地を含む溶液を、等しい容量の脂肪組織に加えた。混合物を、継続的に振とうしながら３７℃でインキュベートした。酵素を、高濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液で不活性化した。不活性化された酵素混合物を３００ｇで５分間、遠心分離した。そして、細胞ペレットを新たな溶液に再懸濁した。細胞懸濁液を、一連の濾過工程に供した。次いで、濾過された溶液を３００ｇで５分間、遠心分離した。細胞ペレットを新たな溶液に再懸濁した。この細胞産物を間質血管画分（ＳＶＦ）と呼んだ。
【０１５１】
ＳＶＦサンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＦＡＣＳｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。マルチカラーフローサイトメトリーのパネルを、ＳＶＦの細胞組成を定量的に測定するために使用した（図２）。明るいＣＤ３４細胞（脂肪性の間質細胞；ＡＳＣ）、リンパ球、うす暗いＣＤ３４陽性細胞（間葉性の間質細胞；ＭＳＣ）、内皮細胞および破片（死んだ細胞）の存在を測定ならびに定量した（図３）。
【０１５２】
ＣＤ３４陽性細胞に対するＳＶＦの標的化選択を、ＣＤ３４抗体および常磁性ビーズを用いて行った。細胞は、ＣＤ３４特異的抗体に対する二次抗体を提示する常磁性ビーズとインキュベートした際にロゼットを形成した。放出工程を経て抗体‐ビーズ複合体からＣＤ３４陽性細胞を放出した。この選択手順により、このように、精製されたＣＤ３４陽性細胞を得た。
【０１５３】
フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３４陽性細胞の表現型を測定した。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１４４、およびその他を含む細胞マーカーの発現を、この方法で測定した。ＣＤ３４は、あらゆる細胞源の幹細胞、芽細胞、ならびに骨髄および臍帯における種々の細胞を含む、さまざまな細胞種に存在する幹細胞マーカーである。ＣＤ１４０ｂ（またＰＤＧＦＲ２として知られる）は、ＭＳＣマーカーとして報告されている。ＣＤ９０は、またＴｈｙ−１胸腺細胞抗原として知られており、多くの細胞種に存在する。この細胞種としては、ＭＳＣ、ＨＳＣ、ＮＫ細胞、内皮および繊維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３１はまた、ＰＥＣＡＭ‐１（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として知られており、内皮細胞に存在する。ＣＤ１０５（またＴＧＦ−ベータ受容体‐細胞複合体の制御成分であるＥｎｄｏｇｌｉｎとして知られる）は、ＴＧＦ−ベータに対する細胞応答を媒介する。ＣＤ１０５は増殖およびアポトーシス経路の制御を補助するので、さまざまな細胞に存在する。ＣＤ７３は、Ｅｃｔｏ−５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴ）であり、白血球に存在するが、ＡＳＣマーカーとして報告されている。ＣＤ４５は白血球共通抗原であり、赤血球を除く、すべての造血細胞に存在する。ＣＤ１４４はまた、細胞間の結合部におけるカルシウム依存性接着分子であるＶＥ−カドヘリンとして知られており、主に血管内皮に見出される。最近の研究は、ＣＤ１４４が、ある種の白血球にも存在し得ることを示している。
【０１５４】
その非選択集団のＣＤ３４陽性選択細胞の集団内で、少なくとも３つのはっきり認識できるサブ集団が存在するようである：集団Ａは、全体の２０＋／−６％を構成し、３４（明）／４５−／９０＋／１４０ｂ＋／３１−／７３＋／４４＋／１０５−／１４６−の発現プロフィールを有する；集団Ｂは、全体の８＋／−４％を構成し、３４（明）／４５−／９０＋／１４０ｂ−／１０５＋／１４６＋／１４４＋／３１＋／４４＋の発現プロフィールを有する；および集団Ｃは、全体の３１＋１−１６％を構成し、３４（暗）／４５−／９０＋／１０５＋／１４６＋／３１＋／４４（暗）、の発現プロフィールを有する。集団Ａおよび集団Ｂの約９６％はＣＤ３４陽性であり、これらの集団の約７８％はＣＤ１４０ｂの発現について陽性である。これらの集団の約９２％はＣＤ４５の発現について陰性である。
【０１５５】
選択方法に対する改変は、これらの細胞集団の保持もしくは除去という結果になった。
【０１５６】
集団Ａは、多分化能性の脂肪性間質細胞であるようであった。これらの細胞は、幹細胞マーカーおよび４５−／１０５＋／３１−のプロフィールを提示し、このことは、これらの細胞が間質の特性を有することを示している。この集団のその間質の特性によって、これらの細胞が組織工学品質を有することが可能であり得る。これらの細胞はまた、ＰＤＧＦＲ２抗原も発現し、このことは、より間葉の性質を示す。これらのマーカーの組み合わせによって、これらの細胞が骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロンもしくはその他に分化することが可能になり得る。
【０１５７】
集団Ｂは、内皮細胞のプロフィール（３１＋／１４４＋／１４６＋）を有したが、また、幹細胞マーカーならびにＴＧＦＢ受容体の一部であるエンドグリンマーカーＣＤ１０５も提示する。これらの細胞は、血管新生および脈管形成を容易にし得、そして組織修復に寄与し得る。
【０１５８】
集団Ｃは、プロフィール３４＋／３１＋／１４６＋／１０５（暗）／９０＋／４５−を提示した。これは、骨髄性細胞およびリンパ系細胞を形成できる造血系前駆細胞のプロフィールとして公開されている。他のマーカーは、これらの細胞の内皮特性が存在し得ることもまた、示唆する。
【０１５９】
ＳＶＦは、治療上の可能性に富んだ細胞画分である。各集団は、それぞれの表面マーカープロフィールに示される特定の特徴を含む。これらの各集団に対する選択方法は、ある集団を、他の集団によるコンタミネーションなく単離するように設計され得た。これらの特定の細胞産物は、複数の特定治療用途を有し、個々の患者の要求に特殊化され得た。
【０１６０】
実施例３
新鮮なＡＳＣを、ヒト脂肪吸引物から調製した。コラゲナーゼ処理および１００ミクロンのフィルターを通す濾過後、サンプルを分割した：３／４を、実施例１および２において本質的に記載したように、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＤ３４陽性画分の選択に使用し、１／４を標準的な濾過方法で処理した。ＣＤ３４選択は、約３倍のＣＤ３４陽性細胞の濃縮を達成し、ＣＤ３４陽性細胞の純度を１３％から３６％に上昇させた。
【０１６１】
後肢虚血のモデルをヌードマウスで作製した。手術の１日後、動物を３つのグループ：ＰＢＳコントロール；非選択（総集団）；およびＣＤ３４選択、のうちの１つに割り当てた。処置（ＰＢＳ、非選択細胞、もしくはＣＤ３４選択細胞）を、虚血肢の、ひ腹筋および大腿四頭筋への直接的な筋肉注射により行った。
【０１６２】
レーザードップラー灌流画像（ＬＤＩ）を、１日目、５日目、１０日目、１５日目および２０日目に行い、虚血肢の灌流を評価した。１日目に最も低い相対的灌流を有したコントロール処理マウスの大部分は、５日目までに深刻な壊死（虚血の脚の半分より多くに作用した）を発症し、安楽死させなければならなかった。その結果、コントロールグループについての平均値は、より高い相対的灌流に向かって傾いた。どの動物も、１日目の相対的灌流値の範囲外（すなわち、＞２０％）であることに基づく除外をしなかった。これは、残り５匹のコントロールマウスのうち３匹を除くことを必要としたからである。
【０１６３】
図５に示すように、高い相対的灌流値を５日目および１０日目に観察した。この観察は、より多くのコントロールグループマウスの除外数により説明し得る。
【０１６４】
ＣＤ３４＋ ＡＳＣの３倍濃縮物は、虚血後肢を有したマウスの冒された筋肉組織に直接注射したとき、非選択細胞よりも効力があった。
【０１６５】
公報、特許出願および特許を含む、本明細書中で引用されたすべての参考文献は、あたかも各参考文献が、個々に、かつ具体的に参考として援用することが示され、その全体が本明細書中に明記されたかのごとく、その同程度まで、本明細書により参考として援用される。
【０１６６】
発明を記載する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示対象の用語の使用は、本明細書中にそうでないと示されない限り、もしくは文脈によって明白に否定されない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、そうでないと言及されない限り、オープンエンドな用語（すなわち、「を含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中における値の範囲についての記載は、本明細書中にそうでないと言及されないかぎり、その範囲内に入る各々の別個の値を個々に指す簡略な方法として機能することを単に意図され、各々の別個の値は、あたかも本明細書中で個々に記載されたかのごとく、明細書に組み込まれる。本明細書中に記載されたすべての方法は、本明細書中にそうでないと示されない限り、もしくは文脈によって明白に否定されない限り、あらゆる適切な順序で行われ得る。本明細書に提供された、あらゆる例、およびすべての例、もしくは例示的な用語（たとえば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、そうではないと請求されない限り、本発明をより明確にすることを単に意図し、本発明の範囲に限定を与えない。本明細書における用語はいずれも、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１６７】
本発明を実施するために、本発明者らに知られている最良の形態を含め、本発明の特定の実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態の改変は、前述記載を読めば、当業者には明白になり得る。本発明者らは、当業者がこのような改変を適切に利用することを予想し、そして本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたものとは異なるように本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付された、特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および均等を含む。さらに、それらの可能性のある改変のすべてにおいて、上に記載された要素のあらゆる組み合わせが、本明細書においてそうでないと言及されない限り、もしくは文脈により明白に否定されない限り、本発明によって包含される。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１０６３５３号に対する優先権を主張し、米国仮特許出願第６１／１０６３５３号の全体が参考により援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
疾患部位に幹細胞を投与することによって疾患を処置するために幹細胞を用いることは、科学者および医者の目標であり、そこでその細胞が組織を再生もしくは修復することが期待される。間葉系幹細胞（間質の幹細胞とも呼ばれる）は、広範囲にわたる増殖能および結合組織系統（骨、軟骨、腱、脂肪など）の子孫を生ずる能力を示すが、これらの細胞は、臨床使用にふさわしい数で収集することが困難であり得る。
【０００３】
ヒト脂肪組織は、広範囲にわたる増殖能、および複数の細胞系統に分化する能力を有する細胞集団を含むことが示されている。これらの細胞は、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）もしくは脂肪間質幹細胞（ＡＳＣ）と呼ばれており、間葉系幹細胞（骨髄間質細胞とも呼ばれる）と同一ではないが、一般的に類似する。非特許文献１。
【０００４】
脂肪組織から、細胞（例えば、ＡＤＳＣ）を得る方法は、当該分野において公知であるが、これらの方法は、少量の脂肪組織から最大数の生存可能な細胞を得るように、効率について依然として最適化されるべきである。例えば、上記の非特許文献１は、脂肪組織から細胞を得ることを開示しており、その中ではわずか２×１０４の細胞が組織から単離されているが、治療の目的での患者への注入のためには代表的に約１０７から１０９の細胞が必要とされる（特許文献１）。また、これらの方法の多くは、細胞の増殖および拡張の目的で、脂肪組織から得られた細胞のプレーティングもしくは組織培養工程を包含する。細胞の表現型は、組織培養における時間の関数として変化するため、インビトロの組織培養工程がほとんどない〜全くない、多数の細胞を得る方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０８０８０１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ４４９： ５９−６７ （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、当該分野において、少量の脂肪組織から、多数の、生存可能な、新鮮に単離された細胞を効率よく得る、最適化された方法の必要性が存在する。目的の細胞（例えば、ＣＤ３４陽性細胞）について、脂肪組織由来の細胞産物を濃縮するための方法がさらに必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
少量の脂肪組織から、多数の、生存可能な、新鮮に単離された細胞を効率よく得る方法、および、その中に見出される標的細胞集団を濃縮もしくは選択する方法が、本明細書中に提供される。
【０００９】
特定の実施形態において、脂肪組織から細胞の集団を得る方法は、少なくとも２００Ｕ／ｍｌ溶液かつ約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下の濃度で酵素を含む溶液中で、その脂肪組織をインキュベートすることを含む。ある種の実施形態において、その方法には、得られたその細胞集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。特定の局面において、その方法はさらに、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得るための、陽性もしくは陰性の選択工程を含む。この点で、本発明はまた、脂肪組織から細胞集団を得ること、ならびに一次抗体を含む第二の溶液内でその細胞集団をインキュベートし、それによって、標的細胞の濃縮された集団を得ることを含む、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法を提供する。この一次抗体は、その細胞集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分ける。
【００１０】
本発明はさらに、本明細書中に記載した方法にしたがって得られた細胞集団（例えば、標的細胞の濃縮された細胞集団）を提供する。
【００１１】
その脂肪組織から得られた細胞集団（例えば、標的細胞の濃縮された細胞集団）を含む薬学的組成物を調製する関連した方法、およびこれらの方法にしたがって調製された薬学的組成物、および患者における疾患もしくは医学的状態を処置する方法においてその薬学的組成物を用いる方法が、本明細書中に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、抗体を基にした陽性選択技術の概略図を表す。標的細胞（すなわち、「Ｓ」の印がつけられた選択された細胞）は、脂肪組織の間質血管画分（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ；ＳＶＦ）の一部であり、ＣＤ３４陽性細胞である。一次抗体（抗ＣＤ３４ ｍＡｂ）は、ＣＤ３４陽性細胞（「Ｓ」の印が付けられている）に結合し、二次抗体（ＳＡＭ Ｉｇ抗体）が次いで一次抗体に結合する。二次抗体を常磁性ビーズに結合し、免疫複合体をＳＶＦ画分から取り出すために磁石を用いた。ＣＤ３４陽性細胞を放出させるために、放出ペプチド（三角形として示される）が複合体に加えられ、標的細胞上の一次抗体およびＣＤ３４抗原の置換が起こり、精製されたＣＤ３４陽性細胞集団が提供される。
【図２】図２は、本明細書中に記載された、脂肪組織の分解後に得られた細胞のマルチカラーフローサイトメトリーのパネルを表す。明るい（明）およびうす暗い（暗）ＣＤ３４ ＡＳＣおよびＭＳＣ、ならびにリンパ球、内皮細胞および造血系前駆細胞が示される。破片もしくは死んだ細胞もまた、ゲートされた集団である。
【図３】図３は、図１で概略を述べた、選択前（左のパネル）および選択後（右のパネル）のＳＶＦのフローサイトメトリーのパネルを表す。ＣＤ３４（明）／ＣＤ４５−、ＣＤ３４（明）／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４（暗）／ＣＤ４５−集団が示される。
【図４】図４は、集団ＡからＣが標識されていることを除き、図２と同じフローサイトメトリーのデータを表す。
【図５】図５は、レーザードップラー画像の時間経過のグラフを表す。そのデータは、本明細書中に記載された、ＰＢＳのみ、非選択細胞、もしくはＣＤ３４陽性選択細胞を投与されたマウスの、非虚血肢と比較した虚血肢における灌流（％）として表される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、脂肪組織から細胞集団を得る方法を提供する。その方法は、細胞生存率を損なうことなく、脂肪組織１ｍｌ当たり最大数の細胞の放出を達成するように最適化された濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００１４】
脂肪組織
本発明に関して、脂肪組織は、脂肪細胞で構成された緩やかな結合組織である、あらゆる体脂肪（もしくは脂肪）であり得る。ある種の実施形態においては、その脂肪組織は、骨髄性脂肪組織、褐色脂肪組織、乳房脂肪組織（ｍａｍｍａｒｙ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、機械的な脂肪組織（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、もしくは白色脂肪組織である。その脂肪組織は、提供者のあらゆる体の部位から得られ得る。特定の実施形態において、その脂肪組織は、提供者の大腿部、臀部、腹部、もしくは上肢から得られる。他の実施形態では、その脂肪組織は、提供者の胸、首、背、もしくは、ふくらはぎから得られる。さらに、他の実施形態では、その脂肪組織は、心臓、腎臓、大動脈、生殖線、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）、もしくは手掌（ｐａｌｍａｒ）の脂肪パッドから得られる。特定の局面では、その脂肪組織は、皮下脂肪である。脂肪組織の提供者は、あらゆる宿主であり得る。その宿主としては、本明細書中に記載された任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、その提供者は哺乳動物である。特定の実施形態では、その提供者はヒトである。
【００１５】
その脂肪組織は、脂肪組織を得るための任意の適切な方法により、提供者から得られ得る。そのような方法は、当該分野において公知である。ある種の実施形態において、その脂肪組織は、手術もしくは脂肪吸引により、提供者から得られる。したがって、ある種の実施形態において、脂肪組織は脂肪吸引物（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）である。
【００１６】
本発明に関して、酵素溶液とともにインキュベートされる脂肪組織の量は、例えば、０．０１ｇ、０．１ｇ、もしくは、１ｇから５ｇ、１０ｇ、５０ｇ、もしくは、１００ｇの任意の脂肪組織の量であり得る。
【００１７】
酵素溶液
本発明に関して、本明細書中で用いられる用語「溶液」は、組織もしくは細胞を酵素と接触させるために適した、あらゆる媒体を指す。その溶液は、任意の粘性もしくは濃度を有し得、ある種の局面において、その溶液は水溶液である。代替の実施形態において、その溶液は、室温で半固体の媒体である。特定の具体的な局面において、その溶液は、本明細書中でさらに記載されるように、組織培養培地である。
【００１８】
溶液中に含まれる酵素は、組織、例えば、結合組織（例えば、脂肪組織内で見出される結合組織）を分解することが知られている、あらゆる酵素であり得る。ある種の局面において、その酵素は、結合組織を分解する酵素である。ある種の実施形態において、その酵素は、動物もしくは非動物源から得られるか、もしくは、それらに由来する。ある種の実施形態において、その酵素は、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、もしくは、プロテイナーゼである。特定の具体的な実施形態において、その酵素は、コラゲナーゼ、トリプシン、もしくは、ディスパーゼ、または、それらの機能的均等物、改変体、誘導体、変異体、もしくはアナログである。その酵素は、ある種の実施形態において、酵素の混合物、例えば、コラゲナーゼ、トリプシンもしくはディスパーゼのうちの少なくとも１つ、または２つを含む混合物である。その酵素は、特定の実施形態において、Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）である。本明細書中における、目的に適した酵素は、当該分野において公知であり、企業から市販されている。その企業としては、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｃｉａｌ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、および、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
酵素濃度
上記酵素の濃度は、上記脂肪組織からの最大量の細胞の放出のための、その脂肪組織の分解を達成するために十分に大きいものであるべきである。したがって、ある種の実施形態において、上記方法は、少なくとも約２００Ｕ／ｍｌ溶液（例えば、少なくとも約２０５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２１０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２１５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２２０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２２５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２３０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２３５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２４０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２４５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２５０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２６０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２６５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２７０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２８０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２８５Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約２９０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約３００Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約３１０Ｕ／ｍｌ溶液、少なくとも約３１５Ｕ／ｍｌ溶液、もしくは、それより大きい）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２０】
本発明に関して、細胞がもはや生存できないほど脂肪組織を過分解しないよう注意が払われるべきである。当業者は、過分解が、分解反応（以下に論じるように）において、酵素量を分解反応の時間と釣り合わせることによって避けられることを正しく認識する。したがって、ある種の実施形態において、上記方法は、約５００Ｕ／ｍｌ溶液以下（例えば、約４７５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約４５０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約４２５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約４００Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３７５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３５０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３２５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３２０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３１５Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３１０Ｕ／ｍｌ溶液以下、約３０５Ｕ／ｍｌ溶液以下）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２１】
特定の実施形態において、上記方法は、約１９０Ｕ／ｍｌと３１９Ｕ／ｍｌの間（例えば、約２００Ｕ／ｍｌと約３００Ｕ／ｍｌの間、約２０５Ｕ／ｍｌと２９５Ｕ／ｍｌの間、約２１０Ｕ／ｍｌと２９０Ｕ／ｍｌの間、約２１５Ｕ／ｍｌと約２８５Ｕ／ｍｌの間、約２２０Ｕ／ｍｌと約２８０Ｕ／ｍｌの間、約２２５Ｕ／ｍｌと約２７５Ｕ／ｍｌの間、約２３０Ｕ／ｍｌと約２７０Ｕ／ｍｌの間、約２３５Ｕ／ｍｌと約２６５Ｕ／ｍｌの間、約２４０Ｕ／ｍｌと約２６０Ｕ／ｍｌの間、約２４５Ｕ／ｍｌと約２５５Ｕ／ｍｌの間）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２２】
特定の実施形態において、上記方法は、約２４５Ｕ／ｍｌ、約２４６Ｕ／ｍｌ、約２４７Ｕ／ｍｌ、約２４８Ｕ／ｍｌ、約２４９Ｕ／ｍｌ、約２５０Ｕ／ｍｌ、約２５１Ｕ／ｍｌ、約２５２Ｕ／ｍｌ、約２５３Ｕ／ｍｌ、約２５４Ｕ／ｍｌ、もしくは、約２５５Ｕ／ｍｌ）の濃度で酵素を含む溶液中で、脂肪組織をインキュベートすることを含む。
【００２３】
ある種の実施形態において、脂肪組織の量（例えば、容量）と酵素の量（酵素溶液の容量）の比は、約１：１、１：２、２：１、１：３、３：１、１：４、４：１、１：５、５：１である。
【００２４】
分解時間
ある種の実施形態において、上記酵素を含む溶液と脂肪組織のインキュベーションは、約５分と５時間、もしくは、それより長くの間の時間行う。ある種の実施形態において、酵素溶液と脂肪組織のインキュベーションは、約１５分と約１．５時間の間、約２５分と約１．２５時間の間、もしくは、約３０分と約６０分の間の時間行う。ある種の局面において、脂肪組織は酵素溶液と約４５分と５５分の間の時間インキュベートされる。この点で、特定の実施形態における脂肪組織は、酵素溶液中で約４５分間、約４６分間、約４７分間、約４８分間、約４９分間、約５０分間、約５１分間、約５２分間、約５３分間、約５４分間、もしくは、約５５分間インキュベートされる。
【００２５】
再度、当業者は、過分解が、分解反応における酵素量（上で論じた通り）とその分解反応の時間とを釣り合わせることによって避けられることを認識する。
【００２６】
その他の分解条件および工程
ある種の実施形態において、上記酵素溶液中で上記脂肪組織がインキュベートされる温度は、分解を可能にする任意の適した温度（例えば、酵素を不活性化しない温度）である。ある種の実施形態における温度は、約２０℃と５０℃の間（例えば、約２５℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃）である。
【００２７】
ある種の実施形態における上記酵素溶液と脂肪組織のインキュベーションは、脂肪組織および酵素溶液を入れている容器の振とう、振動、回転、または、他の動きもしくは機械的な攪拌の存在下で行われる。他の実施形態において、インキュベーションは、前述のどれも存在せずに保たれる。
【００２８】
ある種の実施形態において、上記方法は、当該分野において記載された、任意の、組織の収集工程、組織の処理工程、および組織の洗浄工程のようなさらなる工程を含む。例えば、上記の特許文献１および非特許文献１を参照のこと。ある種の実施形態において、上記方法は、上記酵素が不活性化される不活性化工程を含む。ある種の実施形態において、高濃度のウシ胎仔血清を含む溶液が、上記酵素を不活性化するために用いられる。ある種の実施形態において、上記方法は、脂肪組織の分解画分と非分解画分とを分けることを含む。上記方法は、ある種の実施形態において、細胞ペレットを遠心分離すること、および／もしくは、濾過すること、および／もしくは、洗浄すること、および／もしくは、再懸濁することを含む。
【００２９】
このような追加的考慮点およびさらなる工程は、当該分野において公知であるか、もしくは、決定するための当業者の技術の範囲内であるかのいずれかである。例えば、米国特許第６，７７７，２３１号、特許文献１、上記の非特許文献１、Ｂｕｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ４５：１１５−１２０（２００８）；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ５：３６２：３６９（２００３）；Ｌｏｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、ＡＮＺ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ７９：２３５−２４４（２００９）；およびＢｏｑｕｅｓｔ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ３２５：３５−４６（２００６）を参照のこと。
【００３０】
特定の実施形態において、本明細書中に記載された方法は、細胞の増殖もしくは拡張の目的で得られた細胞を培養する必要なく、脂肪組織から多数の生存可能な細胞を得る。この点で、ある種の実施形態において、上記方法には、脂肪組織から得られた細胞集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。他の実施形態において、組織培養における時間は、限定的であり、かつ最小である。ある種の実施形態において、細胞は、８時間以下の間、１２時間以下の間、１８時間以下の間、２４時間以下の間、３６時間以下の間、もしくは４８時間以下の間、培養もしくはプレートされる。
【００３１】
分解された脂肪組織から得られた細胞集団
本発明の方法は、脂肪組織の酵素分解において最大数の生存可能な細胞を得るために最適化される。ある種の実施形態において、脂肪組織１ｍｌ当たり得られる生存可能な細胞数は、少なくとも約１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５、約５×１０５、約６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１０６、約１０７もしくは、それより多い。
【００３２】
ある種の実施形態における脂肪組織から得られた細胞集団は、異種細胞集団である。ある種の実施形態において、脂肪組織から得られた細胞集団は、脂肪間質幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、プレ脂肪細胞、内皮細胞もしくはそれらの前駆細胞、繊維芽細胞、マクロファージ、リンパ球、肥満細胞、または、それらの組み合わせを含む。ある種の実施形態において、細胞集団は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まないか、または最小限にしか含まない。特定の実施形態における細胞集団は、脂肪組織の間質血管画分である。脂肪由来の幹細胞は、米国特許第６，７７７，２３１号に、さらに記載されている。ヒトＣＤ３４＋幹細胞は、米国特許第５，１３０，１４４号；第５，０３５，９９４号；第４，９６５，２０４号に記載されている。ある種の実施形態において、得られた細胞集団は、接着細胞および／もしくは非接着細胞を含む。
【００３３】
脂肪組織から得られた集団の細胞は、細胞表面マーカーの表現型によって特徴づけられ得る。ある種の実施形態において、上記集団は、本明細書中に記載されたいずれかのような、細胞マーカーの発現について陽性の細胞を含む。ある種の実施形態において、上記集団は、ＣＤ３４に対して陽性である細胞を含む。得られる細胞のさらなる説明は、本明細書中に記載される。
【００３４】
脂肪組織から得られた細胞集団の選択／濃縮
本発明のある種の実施形態において、上記方法は、所望される細胞もしくは標的細胞のサブ集団に対して選択すること、単離すること、濃縮すること、もしくは精製することをさらに含む。この点で、本発明はまた、脂肪組織から、標的細胞の濃縮された集団を得る方法を提供する。標的細胞に対し、精製する方法、セルソーティングする方法および濃縮する方法は、当該分野において公知であり、例えば、蛍光活性化セルソーティング、遠心分離、および抗体を基にした捕捉技術を含む。
【００３５】
ある種の実施形態において、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法は、本明細書中に記載された方法にしたがって、脂肪組織から細胞の集団を得ることを含む。その方法は、例えば、脂肪組織を消化酵素を含む溶液とともにインキュベートすること、その細胞の集団を一次抗体とインキュベートし、それにより、標的細胞の濃縮された集団を得ることを含む。この一次抗体は、その細胞集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分ける。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「実質的に含まない」は、ある程度欠如していることを意味する。「実質的に含まない」は、相対的な用語であり、必ずしも、絶対的な非存在、もしくは、完全な非存在とみなされるべきではないことが認識される。したがって、ある種の局面において、標的細胞を実質的に含まないサブ集団は、標的細胞を含むが、そのサブ集団の約１５％またはそれ未満のみが標的細胞である。ある種の局面において、標的細胞を実質的に含まないサブ集団の約１０％以下が、標的細胞である。ある種の局面において、標的細胞を実質的に含まないサブ集団の約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、もしくは約１％以下が、標的細胞である。
【００３７】
陰性選択
上記分解された組織はまた、最終産物のためにあまり目的としていないか、もしくは、全く目的としていない細胞に対する抗体とともにインキュベートされ得る。ある種の実施形態において、標的細胞がＣＤ３４陽性細胞であるとき、非標的細胞に対する抗体は、脂肪組織分解のあとで、もしくは、その細胞特異的抗体に対する抗体で覆われた常磁性ビーズとのインキュベーションのあとで得られた細胞とともにインキュベートされ得る。上に記載されたプロセスを通して、そのような所望されない（非標的）細胞は、次いで、必要に応じて分解物から単離され、そこから除去される。得られた分解物は、今や、より低い濃度しか〜全く所望されない細胞を含まず、結果として、より高濃度の所望される細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む。このような細胞の取り出しの例は、ＣＤ４５、グリコホリン‐ａおよび／もしくは、ＣＤ３１を発現している細胞の脂肪分解物の減少を含む。
【００３８】
上記の通り、ある種の実施形態における標的細胞のサブ集団は、その標的細胞によって発現されないかもしくは低レベルで発現される細胞マーカーに対して特異的な抗体である一次抗体を用いることによって濃縮され、選択され、もしくは、精製される。特定の具体的な実施形態において、一次抗体は、ＣＤ４５、グリコホリンＡおよびＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに対して特異的な抗体である。
【００３９】
陽性選択
ある種の実施形態における標的細胞のサブ集団は、その標的細胞によって発現される細胞マーカーに対して特異的な抗体である一次抗体を用いることによって濃縮され、選択され、もしくは、精製される。ある種の実施形態において、その標的細胞によって発現される細胞マーカーは、ＣＤ３４である。ある種の実施形態において、その標的細胞は、ＣＤ３４陽性細胞である。特定の実施形態において、一次抗体は、ＣＤ３４に特異的に結合する抗体である。ＣＤ３４特異的抗体は、当該分野において公知であり、市販されている。例えば、米国特許第４，９６５，２０４号を参照のこと。ある種の実施形態において、そのＣＤ３４特異的抗体は、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉキット（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）において提供される抗体である。
【００４０】
ある種の局面において、脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法は、陰性選択手順および陽性選択手順の両方を含む。
【００４１】
ある種の実施形態において、一次抗体は、１０６標的細胞当たり約０．０１μｇと１０６標的細胞当たり約１０μｇとの間、１０６標的細胞当たり約０．１μｇと１０６標的細胞当たり約５μｇとの間、もしくは、１０６標的細胞当たり約１μｇと１０６標的細胞当たり約３μｇとの間の終濃度で細胞の集団とともに存在する。ある種の実施形態において、一次抗体は、１０６標的細胞当たり約２．５μｇの終濃度にある。
【００４２】
ビーズ
ある種の実施形態において、細胞集団をサブ集団に分ける一次抗体は、固相支持体（例えば、ビーズ、膜）上に「捕捉される」。ある種の実施形態において、固相支持体は、ビーズであり、そのビーズは脂肪組織から得られた細胞の集団（例えば、脂肪組織の分解から得られた細胞の集団）とともにインキュベートされる。ある種の局面において、ビーズ（複数）とのインキュベーションは、これらの細胞の一次抗体とのインキュベーションの前もしくは後に行われる。ある種の実施形態において、そのビーズ（複数）は、一次抗体と同時に脂肪組織から得られた細胞の集団とともにインキュベートされる。一旦、細胞の集団がそのビーズ（複数）と一次抗体の両方とともにインキュベートされると、ビーズ、一次抗体、および標的細胞もしくは非標的細胞を含む複合体が形成される。
【００４３】
ある種の実施形態において、そのビーズは、一次抗体に結合するタンパク質を含む。特定の実施形態において、そのタンパク質は、一次抗体（例えば、一次抗体のＦｃ領域）に特異的に結合する二次抗体である。ある種の実施形態において、そのタンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ（例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ）である。
【００４４】
ある種の実施形態において、そのビーズは、約１：１と５：１の間のビーズ数と標的細胞数の比で、細胞の集団とともにインキュベートされる。ある種の実施形態において、その比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、もしくは約５：１である。
【００４５】
特定の局面において、標的細胞の濃縮された集団を得る方法は、ビーズと、一次抗体と、標的細胞または非標的細胞のいずれかとを含む複合体を、細胞、ビーズ、および一次抗体を含んだ細胞集団から取り出すことによって、細胞集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分けることを含む。ビーズを取り出す方法は、当該分野において公知である。ある種の実施形態において、そのビーズは、常磁性ビーズであり、そのビーズは、磁石で取り出される。ある種の実施形態において、ビーズは、遠心分離によって分けられる。
【００４６】
ある種の実施形態において、ビーズおよび一次抗体を含む複合体は、さらに標的細胞もしくは非標的細胞を含む。複合体が非標的細胞を含む実施形態において、標的細胞は、ビーズが取り出された溶液内に含まれる。ある種の実施形態において、標的細胞を濃縮もしくは精製するために、それ以上の工程は取られない。
【００４７】
放出ペプチド
複合体が標的細胞を含む、ある種の実施形態において、その方法は、標的細胞を複合体から放出するためのさらなる工程を含む。この目的のために、特定の局面において、その方法は、複合体を放出ペプチドとともにインキュベートすること含む。本明細書中で用いられる場合、用語「放出ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む、標的細胞から一次抗体を分離させるあらゆる分子である。
【００４８】
ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、ＣＤ３４のエピトープもしくは一次抗体のエピトープ（例えば、一次抗体のＣＤＲ）であるエピトープを含む。ある種の局面において、その放出ペプチドは、可溶性のＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４の可溶性フラグメント）、もしくはＰＲ３４ペプチドであり、米国特許第５，９６８，７５３号および第６，０１７，７１９号に記載されている。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、これらの特許に記載された任意のものである。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉキット（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）の一部として提供されるものである。
【００４９】
ある種の実施形態において、その放出ペプチドの濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間、約０．１ｍｇ／ｍｌと約５ｍｇ／ｍｌとの間、もしくは約１ｍｇ／ｍｌと約２ｍｇ／ｍｌとの間の終濃度で複合体とともに存在する。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、約２ｍｇ／ｍｌの終濃度にある。
【００５０】
ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、回転、振とう、もしくは他の動きの間に複合体とともにインキュベートされる。ある種の実施形態において、その放出ペプチドは、動きなしでインキュベートされる。
【００５１】
特定の実施形態において、その複合体は、放出ペプチドを介した標的細胞からの一次抗体の置換の効率を高めるために、粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）される。ある種の実施形態において、粉砕すること（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｎｇ）は、注射器、ピペット、もしくは、細胞が通り得る比較的小さい穴を有し、複合体形成の際に形成された細胞凝集物の破壊を容易にする類似の道具で達成される。特定の局面において、その方法は、少なくとも約３０秒間、少なくとも約１分間、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約１５分間、少なくとも約２５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約６０分間、少なくとも約９０分間、少なくとも約１２０分間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、粉砕することを含む。ある種の局面において、その方法は、約１０時間以下（例えば、約５時間以下）の間、粉砕することを含む。
【００５２】
特定の実施形態において、粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）は、放出ペプチドの存在下で行われる。他の実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの存在なしに行われる。例えば、粉砕は、放出ペプチドの添加前に行われる。ある種の実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの添加前に行われ、粉砕および放出ペプチドの添加は、互いの約３０秒以内に、互いの約６０秒以内に、互いの約１．５分以内に、互いの約２分以内に、互いの約５分以内に、互いの約１０分以内に、互いの約１５分以内に、互いの約３０分以内に、互いの約４５分以内に、互いの約６０分以内に、行われる。
【００５３】
例示的な実施形態
特定の実施形態において、コラゲナーゼもしくは類似の酵素での脂肪組織の分解後、分解された組織は、次に、抗ＣＤ３４陽性抗体とともに、または、ＣＤ３４＋細胞上もしくはＣＤ３４＋細胞内に含まれる他のエピトープ／酵素／タンパク質について選択する抗体とともに、インキュベートされる。その抗体／分解物の混合物は、続いて、ＣＤ３４陽性抗体に対する抗体で覆われた常磁性ビーズとともにインキュベートされる。そのビーズ−抗体は、ＣＤ３４＋細胞−抗体複合体と複合体を形成し、細胞−抗体−ビーズ複合体を形成する。この数珠状になった複合体は、次に磁石の使用によって、脂肪組織分解物の残りから分けられる。次いで、磁石に結合しない物質は結合した物質から洗い落とされ、得られた結合した物質は、次に、抗ＣＤ３４陽性抗体について競合するペプチドとともにインキュベートされる。このようなペプチドは、抗ＣＤ３４陽性抗体について、競合的であるかもしくはより高い親和性を有し、その結果、細胞が、ビーズ、抗体および磁性物質から放出される。このプロセスは、ペプチドが抗体およびビーズを取り除き、それによって細胞を放出するのを可能にするために、その細胞複合体の凝集物を壊すための穏やかな機械的な攪拌（粉砕）によって増進される。そのペプチド−抗体−ビーズ複合体は、次に、磁石の使用により取り出された。
【００５４】
抗体選択技術（Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）は、患者の血液もしくは骨髄からヒトＣＤ３４＋幹細胞を単離、精製および収集するために用いられる（米国特許第５，５３６，４７５号；第６，２５１，２９５号；第５，９６８，７５３号；第６，０１７，７１９号）。ある種の局面において、濃縮プロセスは、Ｉｓｏｌｅｘシステム、例えば、上記Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉシステムもしくは、それの改変（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）で行われる。
【００５５】
ある種の実施形態において、さらなる考慮点および追加的工程が取られ得る。本発明の局面は、本明細書中に記載された工程の組み合わせを含む。ある種の実施形態は、標的細胞をＣＤ３４陽性細胞として包含するが、類似のプロセスは、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１１７陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞もしくはＣＤ３１陽性細胞のような他の細胞について選択するために利用され得る。このような類似のプロセスは、例えば、抗‐ＣＤ２７１、抗‐ＣＤ１１７、抗‐ＣＤ１３３および抗ＣＤ３１のような抗体の使用を包含する。本発明は、最終の得られた増進された脂肪組織分解物がこれらの細胞もしくは、その細胞の混合物の１つ（増加した濃度の、上で列挙された細胞の全ての細胞を含む増進された組織が挙げられるが、これに限定されない）について濃縮されるような、単独での、または他の１もしくはそれより多くのプロセスと組み合わせての、任意のこれらの選択プロセスの使用を企図する。
【００５６】
特定の実施形態において、本明細書中に記載された方法は、細胞の増殖もしくは拡張の目的で細胞を培養する必要なく、脂肪組織から標的細胞の集団を得る。この点で、ある種の実施形態において、その方法には、得られた標的細胞の集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない。他の実施形態において、組織培養における時間は、限定的であり、かつ最小である。ある種の実施形態において、標的細胞は、８時間以下の間、１２時間以下の間、１８時間以下の間、２４時間以下の間、３６時間以下の間、もしくは４８時間以下の間、培養もしくはプレートされる。
【００５７】
ある種の局面において、標的細胞は、一旦、脂肪組織から得られた細胞の集団から選択もしくは精製されると、さらに改変される。ひとつの代替としては、細胞は、標的細胞の集団を拡張する目的、遺伝子を標的細胞内に送達する目的、標的細胞を分化させる目的、または、治療剤もしくは診断剤などの化合物を標的細胞に結合体化する目的で、インビトロで培養される。これらのさらなる工程を実施する方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ８１：２８４４−２８５３（１９９３）；米国特許第７，１４４，７３１号；Ｌｉ ｅｔ ａｌ、ＦＡＳＥＢ Ｊ １５：５８６（２００１）；Ｎｏｒｏｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３５（４）：６５３−６６１（２００７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ａｎｄ Ｃｏｓｓｅｔ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ、ｅｄｓ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００７を参照のこと。
【００５８】
細胞集団
本発明の方法は、脂肪組織から細胞の集団を提供する。したがって、本発明は、脂肪組織から細胞の集団をさらに提供する。ある種の実施形態において、本発明の細胞の集団は、（ｉ）脂肪組織から得られたかもしくはそれに由来した、細胞拡張の目的での組織培養における時間がほとんどなかった〜全くなかった初代細胞の集団であり、（ｉｉ）接着細胞および非接着細胞を含み、（ｉｉｉ）ＣＤ３４陽性細胞を含み、または、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｖ）までの組み合わせ、である。本発明の細胞の集団がＣＤ３４陽性細胞を含むある種の実施形態において、その集団の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）が、ＣＤ３４陽性細胞である。細胞の集団が、脂肪組織から得られたか、もしくは、それに由来した、細胞拡張の目的での組織培養における時間がほとんどなかった〜全くなかった初代細胞の集団である、ある種の実施形態において、その細胞は限定的かつ最小で、組織培養中に存在していた。ある種の実施形態において、細胞は、８時間以下の間、１２時間以下の間、１８時間以下の間、２４時間以下の間、３６時間以下の間、もしくは４８時間以下の間、培養もしくはプレートされたものである。ある種の実施形態において、細胞は、培養もしくはプレートされなかったものである。
【００５９】
ある種の実施形態において、その細胞の集団は、選択工程を伴い、もしくは、伴わず、本明細書中に記載されたあらゆる方法にしたがって脂肪組織を分解する際に得られた集団である。
【００６０】
ある種の実施形態において、本発明の細胞集団は、実質的に単離される。本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」は、その天然な環境から取り出されたことを意味する。その集団の細胞は、脂肪組織から得られ、かつ取り出されたので、ほとんどの実施形態における細胞は、「単離された」細胞と考えられる。
【００６１】
ある種の実施形態において、本発明の細胞集団は、実質的に精製もしくは濃縮もしくは選択される。本明細書中で用いられる場合、用語「精製された」、「濃縮された」および「選択された」は、もとの組成物の他成分から分けられた結果、純度に関して高められたことを意味する。「純度」もしくは「濃縮」もしくは「選択」は、相対的な用語であり、必ずしも、絶対的な純度、もしくは、絶対的な濃縮、もしくは、絶対的な選択とみなされるべきではないことが認識される。ある種の局面において、純度は、少なくとも約５０％であり、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％より高く、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは、約１００％である。ある種の実施形態において、濃縮もしくは選択は、もとの組成物と比較すると１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍の濃縮もしくは選択である。ある種の実施形態において、濃縮された集団における標的細胞の割合は、選択前もしくは精製前の細胞の集団における標的細胞の割合の約１．５倍から約５倍である。ある種の実施形態において、濃縮された集団における標的細胞の割合は、抗体を基にした選択前だが酵素溶液で分解後の細胞の集団における標的細胞の割合の、約１．５倍から約５倍である。
【００６２】
ある種の実施形態において、本発明の細胞の集団は、脂肪細胞、白血球および／もしくは赤血球から実質的に精製される。すなわち、脂肪組織から得られた細胞の集団には、脂肪細胞、白血球および／もしくは赤血球が実質的に存在しない。ある種の局面において、本発明の細胞の集団は、破片もしくは死んだ細胞から実質的に精製される。
【００６３】
ある種の実施形態において、細胞の集団は、陽性選択工程を経たものである。ある種の実施形態において、細胞の集団は、陰性選択工程を経たものである。ある種の実施形態において、細胞の集団は、陽性選択工程および陰性選択工程の両方を経たものである。ある種の局面において、本発明の細胞の集団は、標的細胞の濃縮された集団である。ある種の実施形態において、本発明の細胞の集団は、本明細書中に記載されたあらゆる方法にしたがって脂肪組織から得られた標的細胞の濃縮された集団である。
【００６４】
ある種の実施形態において、細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）は、実質的に同質の細胞の集団である。ある種の局面において、細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）は、集団の各細胞が、集団の別の細胞と遺伝子学的に識別のつかない、標的細胞のクローンの集団である。
【００６５】
ある種の実施形態において、細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）は、異質性の細胞の集団である。ある種の実施形態において、その異質性の細胞の集団は、標的細胞のみを含むが、この集団はクローンの集団ではない（例えば、互いに遺伝子学的に識別がつかないわけではない）。ある種の実施形態において、細胞の集団の実質的な部分は、１つ、もしくはそれより多い共通の細胞マーカー（例えば、ＣＤ３４）を発現するが、他の細胞マーカーの発現レベルは、集団の細胞によって異なる。ある種の局面において、標的細胞はＣＤ３４＋細胞であり、そのＣＤ３４＋細胞は、脂肪細胞、リンパ球、マクロファージ、間葉系幹細胞である。
【００６６】
ある種の実施形態において、その異質性の集団は、標的細胞以外の細胞である、他のタイプの細胞を含む。ある種の局面において、その異質性の細胞の集団は、標的細胞に加え、白血球（骨髄性系統の白血球もしくはリンパ系系統の白血球）、赤血球、内皮細胞、循環する内皮前駆細胞、上皮細胞、腎細胞、肺細胞、骨細胞、骨髄球、ニューロン、平滑筋細胞を含む。
【００６７】
ある種の具体的な局面において、その集団はさまざまな細胞種を含み、その集団の実質的な部分は、共通の表現型、共通の生物学的機能、または、共通の成熟状態もしくは共通の分化状態を含む。具体的な局面において、その集団における細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、幹細胞（例えば、脂肪間質幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞）である。具体的な局面において、その集団における細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、内皮細胞である。
【００６８】
ある種の実施形態において、細胞の集団は、接着細胞もしくは非接着細胞を含む。ある種の実施形態において、脂肪組織から得られた細胞の集団は、接着細胞および非接着細胞の両方を含む。
【００６９】
特定の表現型を有する細胞を単離、精製、選択、濃縮する適切な方法は、当該分野において公知であり、例えば、光学フローソーター（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））を用いた方法、および非光学フローソーター（例えば、磁気活性化セルソーティング）を用いた方法、および本明細書中に記載された方法を含む。
【００７０】
細胞マーカー
脂肪組織から得られた細胞の集団（標的細胞の濃縮された集団を含む）は、ある種の実施形態において、異質性の細胞集団であり、そこでは、その集団における細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、特定の表現型（例えば、細胞マーカーの発現について陽性および／もしくは細胞マーカーの発現について陰性である）を有する。本発明のある種の実施形態において、脂肪組織から得られた集団の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ３４陽性細胞である。本発明のある種の実施形態において、その集団の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ４５陰性細胞である。本発明のある種の実施形態において、その細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、以下の任意の細胞マーカー：ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、の発現について陽性である。本発明のある種の実施形態において、その細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、以下の任意の細胞マーカー：ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、の発現について陰性である。
【００７１】
薬学的組成物を調製する方法
脂肪組織から得られた標的細胞の濃縮された集団を含む細胞の集団は、治療上の価値を有すると考えられる。この点で、本発明は、患者への投与のための細胞を含む薬学的組成物を調製する方法をさらに提供し、この方法は、本明細書中に記載されたあらゆる方法にしたがって得られた細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）を薬学的に受容可能なキャリアと調合することを含む。
【００７２】
ある種の局面において、脂肪組織の提供者は、患者と同一である。この点で、その細胞（例えば、標的細胞）は、患者にとって「自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」と考えられる。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）の提供者は、患者と異なるが、その提供者および患者は同じ種である。この点で、その細胞（例えば、標的細胞）は、「同種由来（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」と考えられる。
【００７３】
特定の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は、脂肪組織から新鮮に得られた。具体的な局面において、その細胞は限られた程度（例えば、４時間以下、６時間以下、８時間以下、１２時間以下、１８時間以下、２４時間以下、３６時間以下、もしくは４８時間以下）でのみ培養もしくはプレートされた。他の局面において、その細胞は、薬学的に受容可能なキャリアと調合される前に培養もしくはプレートされなかった。
【００７４】
薬学的組成物
本発明は、本明細書中に記載されたあらゆる方法によって得られ、薬学的に受容可能なキャリアと調合された細胞の集団（例えば、標的細胞の濃縮された集団）を含む薬学的組成物をしかるべく提供する。この点で、本発明は、細胞（例えば、標的細胞）および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。そのキャリアは、慣例的に使用される任意のものであり、可溶性および活性化合物（複数）との反応性の欠如のような物理化学的考慮点ならびに投与経路によってのみ制限される。本明細書中に記載された薬学的に受容可能なキャリア、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。１つの局面において、薬学的に受容可能なキャリアは、その細胞（例えば、標的細胞）について、化学的に活性のないものであり、使用条件の下、有害な副作用もしくは毒性を有さないものである。キャリアの選択は、薬学的組成物の細胞の特定のタイプにより、および薬学的組成物の投与に用いられる特定の経路により、部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物について、さまざまな適切な調合がある。
【００７５】
投与経路
ある種の実施形態において、細胞（例えば、標的細胞）を含む薬学的組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、もしくは、腹膜内（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）投与のために調合される。他の実施形態において、その薬学的組成物は、鼻投与、スプレー投与、経口投与、エアゾール投与、直腸投与、もしくは膣内投与によって投与される。
【００７６】
細胞（例えば、標的細胞）を投与する方法は、当該分野において公知である。例えば、以下の任意の米国特許を参照のこと。
【００７７】
【数１】
非経口
ある種の実施形態において、本明細書中に記載された薬学的組成物は、非経口投与のために調合される。本発明の目的のため、その非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、大脳内、脳室内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、膀胱内、および海綿体内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｓａｌ）注射もしくは注入を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
非経口投与に適した調合物は、水性および非水性の等張滅菌注射溶液ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。この注射溶液は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、およびその調合物を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含み得る。この懸濁液は、懸濁化剤、可溶化剤、糊料、安定剤、および保存剤を含み得る。薬学的組成物は、さまざま局面において、薬学的キャリアにおける生理学的に受容可能な希釈剤によって、薬学的に受容可能な界面活性剤（例えば、石鹸もしくは洗剤）、懸濁化剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース）、もしくは乳化剤および他の薬学的アジュバントの添加を伴い、もしくは伴わずに投与される。その希釈剤は、例えば、滅菌した液体もしくは液体の混合物（水、生理食塩水、水性のデキストロースおよび関連する糖溶液を含む）、グリコール（例えば、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）、グリセロール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリドまたはアセチル化された脂肪酸グリセリドである。
【００７９】
非経口調合物において、必要に応じて用いられる油は、石油、動物油、植物油、もしくは合成油（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｉｌ）を含む。油の具体的な例は、ピーナッツ、大豆、ごま、綿実、コーン、オリーブ、ペトロラタムおよびミネラルを含む。非経口調合物における使用に適切な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００８０】
ある種の実施形態における非経口調合物は、保存剤もしくは緩衝液を含む。注射箇所の刺激を最小限に、もしくは排除するため、そのような組成物は、必要に応じて、約１２から約１７の親水−親油平衡（ＨＬＢ）を有する１つもしくはそれより多くの非イオン性界面活性剤を含む。そのような調合物における界面活性剤の量は、代表的に、約５重量％から約１５重量％に及ぶ。適切な界面活性剤は、ソルビタンモノオレエートのようなポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、およびプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、疎水性の塩基とエチレンオキシドの高分子量付加物を含む。その非経口調合物は、さまざまな局面において、アンプルおよびバイアルのような単位用量もしくは複数回用量の密封容器の中に提供され、使用直前の滅菌液体賦形剤（例えば、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で保管され得る。即時の注射溶液および懸濁液は、特定の局面において、以前に記載されたような滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製される。
【００８１】
注射可能な調合物は、本発明に従うものである。注射可能な組成物に対し、有効な薬学的キャリアについての必要条件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ． Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ、ｅｄｓ．、２３８−２５０ページ（１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ、Ｔｏｉｓｓｅｌ、４ｔｈ ｅｄ．、６２２−６３０ページ（１９８６）を参照のこと）。
【００８２】
細胞送達マトリックス
ある種の実施形態において、細胞（例えば、標的細胞）は、細胞送達マトリックスによって投与される。その細胞送達マトリックスは、特定の実施形態において、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ポリエチレングリコール、デキストラン（化学的に架橋可能、もしくは光架橋可能なデキストランを含む）を含むポリマーおよびヒドロゲルなどのうちの任意の１つもしくはそれより多くを含む。特定の実施形態において、その細胞送達マトリックスは、１つもしくはそれより多くの：収縮および非収縮コラーゲンゲルを含むコラーゲン、ヒドロゲル、アルブミン、ポリアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ（ｎ‐ビニル‐２‐ピロリドン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ））、ポリ（メタクリル酸‐２‐ヒドロキシエチル）、親水性ポリウレタン、アクリル誘導体、ポリプロピレンオキシドおよびポリエチレンオキシドのコポリマーのようなプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、Ｐａｎａｃｒｙｌ（登録商標）生体吸収性構成物、Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）ポリグラクチン９１０、および自己集合性ペプチドならびにフルオロポリマー（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フルオロポリマー）、プラスチックおよび金属のような非再吸収物質を含む。ヒドロゲルとしては、例えば、フィブリン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、ヒアルロネート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、化学的架橋、光架橋、もしくはその両方に適したデキストランを含むデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
そのマトリックスは、ある種の場合において、非分解性物質もしくは選択的分解性物質を含む。非分解性物質としては、例えば、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｂｏｎａｔｅ）、ポリスチレン、シリコーンなどが挙げられるが、これらに限定されない。その選択的分解性物質は、例えば、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ；ＰＬＧＡ））、ＰＬＡもしくはＰＧＡである。（また、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：２３３５ ２３４６、２０００；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｍａｒｃｈ／ Ａｐｒｉｌ １９９８、３０ ３７ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｄｏｍｂ、Ｋｏｓｔ、ａｎｄ Ｄｏｍｂ、ｅｄｓ．、１９９７、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｒｏｇａｌｌａ、Ｍｉｎｉｍ． Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｓｕｒｇ． Ｎｕｒｓ． １１：６７６９、１９９７；Ｋｌｅｉｎ、Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔ． Ｓｕｒｇ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ． ９：２０５ １８、２００１ ；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． １ １：３３７ ３９、１９８５；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５４：８１２ １５、１９９５；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ４３：４２２ ２７、１９９８；および Ｋｕｉｊｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ５１：１３６４５、２０００を参照のこと）。
【００８４】
そのマトリックスは、ある種の実施形態において、生体吸収性または非生体吸収性の、液体、ゲルまたは固体の、生体適合性の足場、格子、自己集合性構築物などを含む。そのようなマトリックスは、治療上の細胞処置、外科的修復、組織工学、および創傷治癒の分野において公知である。特定の局面において、そのマトリックスは、細胞（例えば、標的細胞）と前処理される。他の実施形態において、そのマトリックスは、マトリックスもしくはその空間と密接に結びついた細胞（例えば、標的細胞）で占められる。その細胞（例えば、標的細胞）は、マトリックスに接着し得るか、またはマトリックス空間内に閉じ込められ得る、もしくは含まれ得る。特定の局面において、そのマトリックス−細胞（例えば、標的細胞）は複合体を形成し、そこでは、その細胞がマトリックスと密接に結びつき増殖し、それが治療で用いられるときには、患者自身の腎細胞の成長、修復、および／もしくは再生が刺激および支持され、適切な血管新生が同様に刺激もしくは支持される。そのマトリックス−細胞組成物は、当該分野において公知の任意の方法で患者の体内に導入され得る。その方法としては、埋め込み、注射、外科的連結（ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、他の組織とともに移植などが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、マトリックスは、インビボで形成、もしくはさらに好ましくはインサイチューで形成する。例えば、インサイチューで重合可能なゲルが本発明にしたがって用いられ得る。そのようなゲルの例は、当該分野などにおいて公知である。
【００８５】
ある種の実施形態における細胞（例えば、標的細胞）は、三次元の骨組もしくはマトリックス（例えば、足場、発泡体、もしくはヒドロゲル）に播種され、しかるべく投与される。その骨組は、特定の局面において、さまざまな形状（例えば、実質的に平坦、実質的に円筒形もしくは管状）に設計されるか、または考慮中の矯正的な構築物について必要とされ得るかもしくは所望され得るような完全に自由な形態であり得る。ある種の局面における２つ、もしくはそれより多くの実質的に平坦な骨組は、別の骨組の上に横たえられ、必要に応じて一緒に固定されて、多層の骨組を生成する。
【００８６】
マトリックスの例、例えば、本発明の局面に用いられ得る足場は、マット（織った、編んだ、およびより好ましくは、不織の）、多孔性もしくは半多孔性の発泡体、自己集合性ペプチドなどを含む。不織のマットは、例えば、天然もしく合成のポリマーから構成される繊維を用いて形成され得る。ある種の実施形態において、ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）の商用名で販売されるグリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の吸収性コポリマーがマットを形成するために用いられる。例えば、ポリ（イプシロン‐カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される、米国特許第６，３５５，６９９号で論じられるようにフリーズドライすなわち凍結乾燥といったプロセスにより形成される、発泡体もまた、足場として機能し得る。ゲルもまた、本明細書中で用いられる場合、適切なマトリックスを形成する。例は、例えば自己集合性ペプチドで構成される、インサイチューで重合可能なゲル、およびヒドロゲルを含む。これらの物質は、ある種の局面において、組織の成長の支持として用いられる。インサイチューで形成する分解性ネットワークもまた、本発明における使用に適している（例えば、Ａｎｓｅｔｈ、Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８：１９９−２０９；Ｗａｎｇ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：３９６９−３９８０；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許公報第２００２／００２２６７６号を参照のこと）。これらの物質は、ある種の局面において、注射に適した液体として調合され、後に、インサイチューもしくはインビボで分解性ヒドロゲルネットワークを形成するためにさまざまな手段（例えば、温度、ｐＨ、光への曝露における変化）によって誘導され得る。
【００８７】
ある種の実施形態において、上記骨組はフェルトであり、それは生体吸収性物質（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸）から作られるマルチフィラメントヤーンを含む。特定の局面におけるヤーンは、クリンプ（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）、裁断（ｃｕｔｔｉｎｇ）、カーディングおよび針で縫う（ｎｅｅｄｌｉｎｇ）からなる標準テキスタイル加工技術を用いてフェルトにされる。特定の局面における細胞（例えば、標的細胞）は、複合構築物であり得る発泡体足場の上に播種される。加えて、その三次元の骨組は、ある種の局面において、有用な形状にかたどられる。その形状は、例えば、修復され、置換され、もしくは増大される腎臓内もしくは腎臓周りの特定の構築物である。
【００８８】
特定の局面における骨組は、細胞連結を増進するために細胞（例えば、標的細胞）の接種前に処理される。例えば、細胞（例えば、標的細胞）の接種前に、ナイロンマトリックスは、ナイロンをコートするために０．１Ｍの酢酸で処理され、ポリリジン、ＰＢＳおよび／もしくはコラーゲンの中でインキュベートされる。ある種の局面におけるポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理される。
【００８９】
追加的実施形態において、三次元骨組の外表面は、細胞の連結もしくは増殖および組織の分化を改善するために改変される。例えば、骨組のプラズマコーティングによって、またはタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン４‐硫酸、コンドロイチン６‐硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸（ｋｅｒａｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ））、細胞マトリックス、および／もしくは他の物質（特にゼラチン、アルギネート、寒天、アガロースおよび植物ゴムが挙げられるが、これらに限定されない）のうちの１つもしくはそれより多くの添加によって改変される。
【００９０】
ある種の実施形態における足場は、その足場を非血栓形成性（ｎｏｎ‐ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ）にする物質を含む。これらの物質は、特定の実施形態において、内皮の増殖、移動、および細胞外マトリックスの堆積を促進および維持する。そのような物質の例は、天然物質（例えば、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンのような基底膜タンパク質）、合成物質（例えば、ｅＰＴＦＥ）およびセグメント化ポリウレタンウレアシリコーン（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅｕｒｅａ ｓｉｌｉｃｏｎｅ）（例えば、ＰＵＲＳＰＡＮ（登録商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．））が挙げられるが、これらに限定されない。これらの物質は、その足場を非血栓形成性にするためにさらに処理され得る。そのような処理は、ヘパリンのような抗血栓剤、およびプラズマコーティングのような物質の表面電荷を変える処理を含む。
【００９１】
細胞（例えば、標的細胞）を含む薬学的組成物は、特定の実施形態において、本明細書中に記載された任意の成分を含む任意の細胞送達マトリックスの成分を含む。
【００９２】
ある種の実施形態において、その薬学的組成物は、幹細胞を含む。虚血性損傷の動物への幹細胞の投与は、米国特許第５，９８０，８８７号に記載されている。
【００９３】
本発明の局面において、標的細胞は、脂肪由来のＣＤ３４＋細胞である。全てもしくは実質的に全ての処理試薬が存在しない増進されたＣＤ３４＋細胞の混合物は、次に、患者への治療上の注射に適切な媒体に入れられ得る。そのような媒体は、一般に当業者に公知であり、灌注溶液、細胞培養溶液などを含むが、これらに限定されない。ある種の局面において、そのＣＤ３４＋細胞は、いくつかの手段の１つによって患者に送達される。ある種の実施形態において、そのＣＤ３４＋細胞は、筋肉内に、腹膜内に、頭蓋内に、血管内に、静脈内に、組織成分（例えば、砕けた（ｆｒａｃｔｕｒｅｄ）もしくは折れた（ｂｒｏｋｅｎ）骨もしくは軟骨）の間に送達される。
【００９４】
標的について可能性のある送達の選択肢は、以下を含むが、これらに限定されない：直接注射（針および注射器)；注射カテーテル（より深い組織）；表面のためのスプレー；あらかじめ作られたフィブリン（皮下の、もしくは組織層内のより深くの）を生体足場（内部および外部の両方）とともに埋め込むこと。本発明の局面において、送達のための標的身体の場所は、心臓、肢、目、脳、腎臓、神経、肝臓、腎臓、心臓、肺、目、胃腸管の器官、皮膚および脳であり得る。
【００９５】
用量
本発明における目的のため、投与される薬学的組成物の量もしくは用量は、無理のない時間枠にわたって、例えば、治療上もしくは予防の応答を、被験体もしくは動物において達成するのに十分である。例えば、薬学的組成物の用量は、投与時から、約１２時間、約１８時間、約１日から４日もしくはそれより長い期間（例えば、５日、６日、１週間、１０日、２週間、１６日から２０日、もしくはそれより長く）に疾患もしくは医学的状態を処置もしくは予防するのに十分である。特定の実施形態において、その期間はさらに長い。その用量は、特定の薬学的組成物の効果および処置される動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに処置される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【００９６】
投与される用量を決定する多くの分析が、当該分野において公知である。ある種の実施形態において、哺乳動物へのそのような細胞（例えば、標的細胞）の所定の用量の投与の際にその細胞（例えば、標的細胞）が損傷部位に局在する程度をそれぞれに異なる用量の細胞（例えば、標的細胞）が与えられる一組の哺乳動物の間で比較することを含む分析が、哺乳動物に投与される開始用量を決定するのに用いられる。特定の用量の投与の際に細胞（例えば、標的細胞）が損傷部位に局在する程度は、当該分野において公知の方法によって分析され得る。
【００９７】
また、哺乳動物へのそのような細胞（例えば、標的細胞）の所定の用量の投与の際にその細胞（例えば、標的細胞）が損傷した後肢の再灌流を引き起こす程度をそれぞれに異なる用量の細胞（例えば、標的細胞）が与えられる一組の哺乳動物の間で比較することを含む分析が、哺乳動物に投与される開始用量を決定するのに用いられる。特定の用量の投与の際に細胞（例えば、標的細胞）が損傷した後肢の再灌流を引き起こす程度は、当該分野において公知の方法によって分析され得、本明細書中に記載されている。
【００９８】
薬学的組成物の用量はまた、特定の薬学的組成物の投与に付随して起こり得る任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。代表的に、主治医がさまざまな要因（例えば、年齢、体重、全体的な健康、食事、性別、治療剤（複数）（例えば、投与される薬学的組成物の細胞（例えば、標的細胞）、投与経路、および処置されている状態の重症度）を考慮し、個々の患者それぞれを処置する薬学的組成物の用量を決める。例示であり、本発明を制限することを意図しないが、薬学的組成物の用量は、少なくとも約０．５×１０６（例えば、少なくとも約１×１０６、少なくとも約１．５×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約２．５×１０６、少なくとも約３．０×１０６、少なくとも約５．０×１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８）の細胞（例えば、標的細胞）が患者に投与されるようなものであり得る。
【００９９】
投与のタイミング
本発明の特定の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）の投与は遅らされる；すなわち、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷直後に投与されない（例えば、損傷後、約３０分より前ではなく、約１時間より前ではなく、約２時間より前ではなく、約３時間より前ではなく、約４時間より前ではなく、約５時間より前ではなく、約６時間より前ではなく、約７時間より前ではなく、約８時間より前ではなく、約９時間より前ではなく、約１０時間より前ではなく、約１１時間より前ではなく、もしくは約１２時間より前ではなく）。
【０１００】
本発明のある種の局面において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷の修復期の最初に患者に投与される。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後、少なくとも約１２時間（例えば、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５２時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約５６時間、少なくとも約５８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６２時間、少なくとも約６４時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約６８時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約７２時間）に投与される。
【０１０１】
さらなる実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は上に記載されたような時点、および損傷後、約１４日より前（例えば、約１３日より前、約１２日より前、約１１日より前、約１０日より前、約９日より前、約８日より前、約７日より前、約６日より前、約５日より前、約４日より前、約３日より前）に患者に投与される。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後約２４時間、もしくはその後のいつか、しかし損傷後約１４日より前に患者に投与される。
【０１０２】
ある種の局面において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後Ｘより後かつ損傷後Ｙより前に投与され、ここで、Ｘは約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４８時間、約５２時間、約５８時間、約６４時間、約７２時間、約３．５日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日からなる群から選択され、Ｙは約１６日、約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約１週間からなる群から選択され、ＸはＹより少ない。本発明のある種の局面において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間に投与される。
【０１０３】
本発明のある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は１回より多く患者に投与される。その細胞（例えば、標的細胞）は１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、週１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、８日に１回、９日に１回、１０日に１回、１１日に１回、１２日に１回、１３日に１回、もしくは１４日に１回、または月１回、投与され得る。ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は損傷後約２４時間より後（例えば、２４時間）に投与され、損傷後約４８時間より後（例えば、４８時間）に再投与される。
【０１０４】
制御放出調合物
薬学的組成物は、特定の局面において、その薬学的組成物が投与される体の中に放出される方法が体内での時間および位置について制御されるように、デポ剤の形態に改変される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照のこと）。デポ剤の形態は、さまざまな局面において、細胞（例えば、標的細胞）および多孔性もしくは非多孔性物質（例えば、ポリマー）を含む埋め込み可能な組成物であり、ここでは、その細胞（例えば、標的細胞）は、その物質および／もしくは非多孔性物質の分解物によって包まれるか、もしくは、その物質および／もしくは非多孔性物質の分解物にわたって拡散される。そのデポ剤は次に、体内の所望する位置に埋め込まれ、その細胞（例えば、標的細胞）は、あらかじめ決められた速度でそのインプラントから放出される。
【０１０５】
したがって、特定の局面における薬学的組成物は、インビボ放出プロフィールの任意のタイプを有するように改変される。本発明のある種の局面において、その薬学的組成物は、即時放出の、制御放出の、持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）の、徐放放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）の、遅延放出の、もしくは二相性放出の調合物である。
【０１０６】
結合体
本発明のある種の実施形態において、細胞（例えば、標的細胞）は、第二の部分（例えば、治療剤もしくは診断剤）に、連結（ａｔｔａｃｈｅｄ）されるか、もしくはつなげられる（ｌｉｎｋｅｄ）。これらの実施形態の細胞（例えば、標的細胞）は、損傷した腎臓組織に特異的に局在できるので、標的化剤として働く。したがって、本発明は、１つの局面において、治療剤もしくは診断剤に連結した細胞（例えば、標的細胞）を含む組成物を提供する。本発明における目的に適した治療剤および診断剤は、当該分野において公知であり、本明細書中に言及された任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
組み合わせ
上記結合体を含む本明細書中に記載された薬学的組成物は、ある種の実施形態において、それだけで投与される。他の実施形態において、上記結合体を含む薬学的組成物は、他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて投与される。ある種の実施形態において、その薬学的組成物は、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を処置すると知られている別の治療剤（例えば、サイトカインもしくは成長因子、抗炎症剤、ＴＬＲ２阻害剤、ＡＴＦ３遺伝子もしくは遺伝子産物、およびミネラルコルチコイド受容体ブロッカー（例えば、スピロノラクトン）を含む）、リゾホスファチド酸、２−メチルアミノクロマン（例えば、Ｕ８３８３６Ｅ）、２１−アミノステロイド（例えば、ラゾロイド（ｌａｚｏｒｏｉｄ）（Ｕ７４３８９Ｆ））、トリメタジジン、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、もしくはアンギオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、およびスラミンと投与される。
【０１０８】
ある種の実施形態において、その細胞（例えば、標的細胞）は、他の追加的治療剤と投与される。その追加的治療剤としては、抗血栓剤、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン）、抗酸化剤、もしくは当該分野において腎臓損傷もしくは腎疾患を処置するために通常用いられる他の剤（例えば、エプロジセート（ｅｐｒｏｄｉｓａｔｅ）およびトリプトリド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンおよびアトルバスタチン）、細胞溶解物、可溶性細胞画分、膜濃縮細胞画分、細胞培地（例えば、馴化培地）、もしくは細胞外マトリックス栄養因子（例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
特定の実施形態において、標的細胞のサブ集団は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、および任意の他の幹細胞からなる群から選択される他の幹細胞と組み合わせられる。ある種の実施形態において、その標的細胞は、非造血幹細胞と組み合わせられる。その非造血幹細胞としては、例えば、間葉性の細胞が挙げられるが、これに限定されない。ある種の実施形態における標的細胞は、足場と組み合わせられる。その足場としては、フィブリン、コラーゲン、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ある種の実施形態における選択された細胞は、さまざまな成長因子もしくは他の生物活性剤と組み合わせて用いられる。これらは、上方調節因子もしくは下方調節因子としての使用のために、遺伝子療法を用いて改変され得る。
【０１１１】
使用
本明細書中に記載された薬学的組成物は、多くの疾患および医学的状態の治療上の処置において、有用であると考えられる。したがって、上記方法は、疾患もしくは医学的状態を処置するのに効果的な量で本明細書中に記載された任意の薬学的組成物を患者に投与することを含む、その疾患もしくは医学的状態を処置する方法を追加的に提供する。用語「処置する」およびそこから派生する用語は、本明細書中で用いられる場合、標的とされた状態の、必ずしも１００％もしくは完全な改善を意図するものではない。むしろ、当業者が利益を有すると認識するさまざまな程度の治療効果が存在する。この点、本明細書中に記載された方法は、腎臓損傷について、任意の量もしくは任意のレベルの治療上の利益を提供し、ゆえにその損傷を「処置する」。
【０１１２】
ある種の局面において、その疾患もしくは医学的状態は、慢性心筋虚血、重大な四肢の虚血、急性心筋梗塞、心血管疾患、糖尿病、自己免疫疾患、脳卒中、脳損傷および／もしくは脊髄損傷、熱傷損傷、骨欠陥、腎虚血、および黄斑変性である。ある種の実施形態において、その薬学的組成物は、虚血、血流の損失、裂傷、体温の極端な状態、外傷、または、代謝病もしくは遺伝病に起因する組織損傷を処置するために用いられる。
【０１１３】
その薬学的組成物が脂肪由来の幹細胞を含むある種の局面において、上記方法は、治療効果を提供することを含む。その治療効果としては、例えば：虚血に対抗する血管新生促進効果（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）、細胞、組織および／もしくは臓器再生の生成、創傷治癒、分化、血液供給の再構成、アポトーシスの減少、パラクリンシグナル伝達、および免疫調節が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３４およびＣＤ２７１に対する抗体を用いた陽性選択手順を用いて細胞が選択されるある種の局面において、その方法は、炎症を処置する。上記薬学的組成物がＣＤ３４＋細胞を含む局面において、その方法は、抗アポトーシス効果を提供する。
【０１１４】
脂肪組織内の細胞は、分化の可能性を有することが示されており、ゆえに複数の組織の修復および再生ならびに複数の損傷タイプに用いられ得る。これらの細胞はまた、美容外科の領域において有益であり得る。処理の容易さ、および脂肪吸引の比較的非侵襲な性質に起因して、これらの細胞は、組織を修復する能力のために選択され得るか、もしくは回復を早めるために創傷治癒剤と併用され得る。
【０１１５】
腎臓損傷
本発明のさまざまな局面において、提供される方法は、患者における腎臓損傷を処置することが意図されている。その腎臓損傷は、さらに本明細書中に記載された、以下の１つもしくはそれより多くの任意のものにより引き起こされる腎臓に対する任意の損傷である：虚血、毒素への曝露、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）もしくはアンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカーの使用、輸血反応、筋肉に対する損傷もしくは外傷、手術、ショック、低血圧、または、任意のＡＲＦもしくは慢性腎臓病の原因。
【０１１６】
標的とされる腎臓損傷は、腎臓内に見出される任意の組織に対する損傷を含む。その組織としては、髄質、皮質、腎錐体、葉間動脈、腎動脈、腎静脈、腎門、腎盤、尿管、小腎杯、腎被膜、下腎臓被膜（ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｐｓｕｌｅ）、上腎臓被膜（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｐｓｕｌｅ）、葉間静脈、ネフロン、大腎杯、腎乳頭、糸球体、ボーマン嚢、腎柱の組織が挙げられるが、これらに限定されず、その組織が十分に損傷すると、部分的もしくは完全な機能喪失という結果になる。その損傷した腎臓組織は、任意の１つもしくはそれより多い腎臓に存在するはっきり識別できる細胞型含む。その細胞型としては、腎糸球体の壁細胞、腎糸球体の足細胞、糸球体内血管間膜細胞、糸球体の内皮細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の薄いセグメント細胞（ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｅｌｌ）、厚い上行脚細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、および間質性の腎細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、その腎臓損傷は、腎臓の管周囲微小血管系に対する損傷を含む。特定の局面において、その腎臓損傷は、管周囲毛細血管に対する損傷を含む。ある種の実施形態において、その腎臓損傷は、細管（管状）上皮細胞に対する損傷を含む。
【０１１７】
腎臓病および腎臓の医学的状態の予防
腎臓は自己修復もしくは自己再生に対してすさまじい能力を有するが、腎臓損傷は、しばしば、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態に対して増加した素因につながる。本明細書中において提供される、患者における腎臓損傷を処置する方法は、成功する腎臓の修復および再生を可能にすると理論づけられ、そのため、その患者は腎臓病もしくは腎臓の医学的状態に対して増加した素因を有さない。ゆえに、本発明は、腎臓損傷を含む、患者における腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を予防する方法をさらに提供する。その方法は、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を予防するのに効果的な量で患者に細胞（例えば、標的細胞）を投与することを含む。ある種の実施形態において、その量は、その腎臓損傷を処置するのに効果的である。例えば、腎臓の機能を回復するのに効果的な量、腎臓の管周囲微小血管系を再生するのに効果的な量である。
【０１１８】
本明細書中で用いられる場合、用語「予防する」およびそこから派生する用語は、必ずしも１００％もしくは完全な予防を意図するものではない。むしろ、当業者が予防について潜在的利益を有すると認識するさまざまな程度の予防が存在する。この点、本明細書に記載された予防する方法は、腎臓病もしくは腎臓の医学的状態について任意の量もしくは任意のレベルの予防を提供する。さまざまな局面において、その予防する方法は、その腎臓病もしくは腎臓の医学的状態またはその兆候もしくは状態の開始、発症、発生、もしくは進行を遅延する、ゆっくりにする、減少させる、もしくは軽減する方法である。
【０１１９】
ある種の実施形態において、予防される腎臓病もしくは腎臓の医学的状態は、急性腎不全、慢性腎疾患、腎間質性線維症、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、水腎、間質性腎炎、腎石（腎石症）、腎腫瘍（例えば、ウィルムス腫、腎細胞癌）、ループス腎炎、微小変化群、ネフローゼ症候群、腎盂腎炎、腎不全（例えば、急性腎不全および慢性腎疾患以外の）である。
【０１２０】
急性腎不全
本明細書中で用いられる場合、用語「急性腎不全」は、「急性の腎臓損傷」もしくは「ＡＲＦ」と同義であり、腎臓に対する損傷に起因する腎機能の急速な喪失を指す。ＡＲＦは、通常は腎臓によって排出される窒素性不用物（例えば、血清クレアチンおよび／もしくは尿排出物）および非窒素性不用物のレベルにおける急な変化により特徴づけられる複合症候群である。ＡＲＦの兆候および診断は、当該分野において公知である。例えば、Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５６、ｖｏｌ．ｅｄｓ．Ｒｏｎｃｏ ｅｔ ａｌ．、Ｋａｒｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、２００７、およびＢｅｌｌｏｍｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ８（４）：Ｒ２０４−Ｒ２１２、２００４を参照のこと。
【０１２１】
さまざまな局面において、そのＡＲＦは、原因によって、腎前性ＡＲＦ、内因性ＡＲＦもしくは腎後性ＡＲＦである。この点で、その腎前性ＡＲＦは、以下の１つもしくはそれより多くのものにより引き起こされ得る：血液量減少（例えば、ショック、脱水、流体の喪失、もしくは過剰な利尿薬（ｄｉｒｕｒｅｔｉｃ）の使用に起因する）、肝腎症候群、血管の問題（例えば、アテローム塞栓性疾患、腎静脈血栓症、ネフローゼ症候群に関係するもの）、感染（例えば、敗血症）、重症の熱傷、腐骨形成（例えば、心膜炎、膵炎に起因する）、および低血圧（例えば、抗高血圧性、血管拡張薬の使用に起因する）。
【０１２２】
その内在性ＡＲＦは、以下の１つもしくはそれより多くのものにより引き起こされ得る：毒素もしくは薬物（例えば、ＮＳＡＩＤ、アミノ配糖体抗生物質、ヨウ素化造影剤、リチウム）、リン酸腎症（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）（例えば、結腸鏡検査の腸の、リン酸ナトリウムとの調製に関連した）、横紋筋融解症（例えば、損傷（例えば、圧挫もしくは広範囲な鈍的外傷）、スタチン、興奮薬の使用により引き起こされる）、溶血、多発性骨髄腫、急性糸球体腎炎。
【０１２３】
その腎後性ＡＲＦは、以下の１つもしくはそれより多くのものにより引き起こされ得る：薬物（例えば、抗コリン作用性の）、良性前立腺肥大もしくは前立腺癌、腎石、腹部の悪性腫瘍（例えば、卵巣癌、結腸直腸癌）、塞がれた尿路カテーテル、および結晶尿もしくはミオグロブリン尿、または膀胱炎を引き起こす薬。
【０１２４】
ＡＲＦは、患者における虚血、毒素、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）もしくはアンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカーの使用、輸血反応、筋肉に対する損傷もしくは外傷、手術、ショック、および低血圧により引き起こされ得る。ＡＲＦを引き起こす毒素は、抗真菌性の色素、もしくは放射線写真の色素であり得る。また、ある種の実施形態において、ＡＲＦは急性尿細管壊死もしくは腎虚血再灌流障害を包含する。
【０１２５】
慢性腎疾患
腎臓病もしくは腎臓の医学的状態を予防する方法のある種の実施形態において、その腎臓病は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）である。本明細書中で用いられる場合、「慢性腎臓病」としても知られる「慢性腎疾患」は、何ヶ月もしくは何年にもわたる進行性の腎機能の喪失を指す。処置されるＣＫＤは、任意の病期である。その病期は、例えば、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４、もしくはＳｔａｇｅ５（確立したＣＫＤ、末期の腎臓病（ＥＳＲＤ）、慢性腎不全（ＣＫＦ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、もしくは慢性腎不全（ＣＲＦ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）としても知られる）を含む。
【０１２６】
そのＣＫＤは、多数の要因のうちの任意の１つにより引き起こされ得る。その要因としては、急性腎臓損傷、急性腎臓損傷の原因、糖尿病性腎症につながるＩ型およびＩＩ型の真性糖尿病、高い血圧（高血圧）、糸球体腎炎（腎臓の濾過系の炎症および損傷）、多嚢胞腎疾患、鎮痛薬性腎症につながる鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン）の使用（例えば、定期的な、および長期間にわたる）、虚血性腎症につながるアテローム性動脈硬化症、石による尿の流れの閉塞、拡大した前立腺、狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ）（狭窄（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ））、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球症、ヘロイン乱用、アミロイドーシス、腎石、慢性腎臓感染、および特定の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
非腎臓病および非腎臓の医学的状態の予防
慢性腎疾患は、心血管疾患および心血管死の主要な独立した危険因子として同定されている。本明細書中に記載された細胞（例えば、標的細胞）の投与は、腎臓病および腎臓の医学的状態以外の疾患もしくは医学的状態を予防するのにさらに有用であると理論づけられる。したがって、腎臓損傷を含む、患者における腎臓病もしくは腎臓の医学的状態により引き起こされるか、または腎臓損傷を含む、患者における腎臓病もしくは腎臓の医学的状態に関連する、非腎臓病もしくは非腎臓の医学的状態を予防する方法が、本明細書中にさらに提供される。その方法は、その非腎臓病もしくは非腎臓の医学的状態を予防するのに効果的な量で患者に細胞（例えば、標的細胞）を投与することを含む。特定の実施形態において、その非腎臓病もしくは非腎臓の医学的状態は、心血管疾患である。
【０１２８】
ある種の実施形態において、本明細書中に提供される方法により処置される疾患もしくは医学的状態は、自己免疫疾患である。本明細書中における目的のため、「自己免疫疾患」は、身体が自らの組織のある種の構成成分に対して免疫原性（例えば、免疫系）応答を起こす疾患を指す。換言すると、その免疫系は体内のある種の組織もしくは機構を「自己」として認識する能力を失い、まるでそれが外来性であるかのようにそれを標的にし、攻撃する。自己免疫疾患は、優先的に１つの臓器が影響されるもの（例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎）と、その自己免疫疾患のプロセスが多くの組織に拡散するもの（例えば、全身性エリテマドーデス）とに分類され得る。例えば、多発性硬化症は、Ｔ細胞が脳および脊髄の神経線維をとり囲む鞘を攻撃することにより引き起こされると考えられる。このことは、協調の喪失、衰弱（ｗｅａｋｎｅｓｓ）、および不鮮明な視界という結果になる。自己免疫疾患は、当該分野において公知であり、例えば、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性動脈炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマドーデス、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などを含む。
【０１２９】
ある種の実施形態において、その疾患は癌である。具体的な実施形態において、その癌は、以下のものからなる群から選択される：急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門の、肛門間の、もしくは肛門直腸の癌、目の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸の、胆嚢の、もしくは胸膜の癌、鼻の、鼻腔の、もしくは中耳の癌、口腔の癌、外陰の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、頸部の癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮種、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜の、網の、および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟組織癌、胃癌、精巣（睾丸）癌、甲状腺癌、尿管癌、および膀胱癌。
【０１３０】
患者の型
本明細書中に記載された発明の方法に関して、その患者は任意の宿主である。ある種の実施形態において、その宿主は哺乳動物である。本明細書中で用いられる場合、用語「哺乳動物」は、哺乳綱の任意の脊椎動物を指す。その脊椎動物としては、任意の、単孔類、有袋類、および有胎盤哺乳類の分類群が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、その哺乳動物は、マウスおよびハムスターのようなげっ歯目の哺乳動物およびウサギのようなウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳動物の１つである。特定の実施形態において、その哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目由来である。特定の実施形態において、その哺乳動物は、ウシ属（ウシ）およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来もしくはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものである。ある種の場合において、その哺乳動物は、霊長目、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄ）、もしくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄ）（サル）もしくは類人の目（ｏｒｄｅｒ Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）（ヒトおよび類人猿）である。特定の実施形態において、その哺乳動物はヒトである。
【０１３１】
以下の実施例は、本発明を単に説明するために与えられ、どんな様式でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
分解工程の最適化
組織から細胞を放出するために脂肪組織を分解するための標準プロトコルを酵素の濃縮および分解時間に関して最適化した。細胞の生存率を保ちながら、脂肪組織１ｍｌ当たり放出される最大の細胞量を得るために、２つのパラメーターおよび全体の分解技術を最適化した。
【０１３３】
１９１Ｕ／ｍｌ、２５０Ｕ／ｍｌおよび３１９Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ濃度を試験した。脂肪組織（脂肪吸引物）の容量に対して１：１の容量の割合で使用したコラゲナーゼ溶液は、以下の成分を含んだ。コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ５０：５０（Ｇｉｂｃｏ）；ｗ／Ｌ−グルタミン；１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ。
【０１３４】
コラゲナーゼ溶液とのインキュベーション時間は、１５と６０分との間で変動した。分解は常に振とうしながら３７℃で行った。ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する洗浄緩衝液もまたこれらの実験に用いて、酵素を不活性化し、放出された細胞の総合的な健常性および生存率を促進した。
【０１３５】
脂肪組織から放出された細胞総数に加えて、放出された細胞の生存率を測定した。細胞生存率を細胞膜が傷ついたときにのみ細胞を透過する色素（７ＡＡＤ）を用いて分析した。色素を、したがって細胞生存率を、次にフローサイトメトリーを用いて定量化した。
【０１３６】
異なる濃度のコラゲナーゼを含む培地とのインキュベーション時において、脂肪組織から放出された細胞総数、および生存可能であったこれらの細胞の割合を表１に示す。
【０１３７】
【表１】
これらのデータは、２５０Ｕ／ｍＬ濃度のコラゲナーゼを含む培地で４５分間、約３７℃、攪拌、振とう、混合しながらのインキュベーションがこの応用に最適であることを示した。これらの条件下で処理された組織１ｍｌ当たりに放出される細胞数は２５０Ｕ／ｍｌにおいて最大であった。そして細胞の生存率は大幅には損なわれなかった。
【０１３８】
選択工程の最適化
コラゲナーゼ分解において脂肪組織から放出された細胞を、標的細胞集団に対して抗体を基にした捕捉方法を用いて濃縮、もしくは選択した。細胞の生存率を保ちながら最大の純度および回収率を達成するために、図１に概説する選択工程を最適化した。
【０１３９】
抗体濃度、ビーズと標的細胞の比、放出ペプチド濃度、および粉砕技術を脂肪組織放出細胞集団内に含有されるＣＤ３４陽性細胞に対して選択することによって分析した。蛍光球を用いて所定のサンプル中のＣＤ３４陽性細胞の総数を計算するＳｔｅｍ Ｋｉｔ ＣＤ３４ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、ＣＤ３４の発現、ならびに選択細胞および非選択細胞の定量化を分析した。ＣＤ４５の発現および細胞の生存率（７ＡＡＤによる）をさらに評価した。
【０１４０】
これらの実験に用いた溶液は、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ならびにＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂａｘｔｅｒ）の成分を含んだ。Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒはＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（Ｂａｘｔｅｒ）；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；２．６８ｍＭ ＫＣｌ；３．２１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ×１２ Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２）；４１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）；および１％ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂａｘｔｅｒ）を含んだ。Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂａｘｔｅｒ）は、抗ＣＤ３４抗体（Ｃｌｏｎｅ９Ｃ５）；Ｄｙｎａｌ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ常磁性ビーズ（ＳＡＭ）；およびＰＲ３４放出ペプチドを含んだ。
【０１４１】
Ｉｓｏｌｅｘキット濃度を模倣する抗体濃度（１００万標的細胞当たりの抗体量）および過剰と考えられる抗体濃度を使用した。１００万標的細胞当たり１μｇの抗体を使用し、使用された特定の種類の細胞に対して最適化することにより、抗ＣＤ３４抗体の濃度を決定した。特に１００万標的細胞当たり約１μｇと２．５μｇの間の抗体濃度を試験した。放出された細胞および抗体を含む培地を回転装置の上で３０分間インキュベートした。細胞を６００ｇの遠心分離によって洗浄した。
【０１４２】
ビーズと細胞の比は、選択法の重大な側面であり、処理される細胞／組織の型に基づいて変動し得る。末梢血由来細胞よりも高い頻度でＣＤ３４抗原を発現する接着細胞を使用したこの分析のために、ビーズと標的細胞の比１：１、２：１、４：１、５：１、７．５：１および１０：１を試験した。標的細胞は、選択されなかった、放出された細胞の総集団の５０％と見積もった。ビーズを細胞とともに回転装置の上で約４５分間インキュベートした。混合物を、免疫複合体を捕らえるために磁石に３回曝した。１：１から５：１（ビーズと標的細胞の比）の標的範囲を、最適であると決定した。この範囲は脂肪組織のみに対して最適であり得る。
【０１４３】
他のビーズと標的細胞の比が有用であるように見えるが、きわめて高い捕捉能力を考慮すると、高すぎるビーズと標的細胞の比においては放出能力が欠点になると考えられた。
【０１４４】
最適な放出ペプチド濃度を、１ｍｇ／ｍｌもしくは２ｍｇ／ｍｌでＰＲ３４ペプチドの量を変動させることによって決めた。細胞、ＣＤ３４抗体、ビーズ、放出ペプチドを含む培地を、回転装置の上で４５分間から６０分間インキュベートした。
【０１４５】
ＣＤ３４陽性標的細胞の接着性質は、細胞の集団を分散する方法、および放出ペプチドの結合のための空間を作る方法を必要とした。放出工程の間に、集団を破壊し、細胞を放出するために粉砕を使用した。具体的には、放出工程の間に３度別個に、集団を、培地を注射器の小さな穴から吸い込むことによって粉砕し、ゆっくり注射器から吐き出した。試験した粉砕時間は０分、１５分、３０分および４５分を含んだ。
【０１４６】
これらの実験から、粉砕を伴う放出ペプチドＰＲ３４の使用が最良の結果を生むことが見出された。このタイプの粉砕技術は脂肪組織に特有であり、かつ新規である。この技術を用いて、２０％より高いおおよその放出割合が観察された。
【０１４７】
選択されたＣＤ３４陽性細胞の生存率および純度を、選択されていない細胞のものと比較した。表２に示すように、抗体を基にした選択工程は、２３％の総回収率を伴い、純度において約２倍の上昇（４０％から７５％へ）を達成した。別の一組の実験では、その選択工程は、ＣＤ３４陽性細胞の３６％から７３％への純度上昇を達成した（データ示さず）。特に、その選択工程は、細胞の生存率を有意には損なわなかった（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）。
【０１４８】
【表２】
この例については、ｎ＝３である。純度は、ＣＤ３４陽性細胞の総数を総細胞（破片を除く）で除算した度合いである。回収率（％）は、選択されなかった集団内におけるＣＤ３４陽性細胞の総数で除算した、選択された集団内におけるＣＤ３４陽性細胞の総数である。
【０１４９】
選択された細胞の表現型は、選択されなかった細胞と異なるものであることが測定された。例えば、ＣＤ４５の発現は、ＣＤ３４選択細胞（７．５４％）において、選択されなかった細胞（１５．８２％）と比較すると減少した。さらに、選択の際に、リンパ球も減少した。また、明るいＣＤ３４細胞（ＣＤ３４をより高い度合いで発現する細胞）の数は、選択された細胞集団において、選択されなかった集団と比較すると減少した。その明るいＣＤ３４細胞を捕捉するために、選択工程を調節し得る。選択の際に、ＣＤ１４０ｂ陽性細胞の数は増加したが、選択の際に、ＡＳＣおよびＣＤ１４４陰性細胞の数は維持された。
【０１５０】
実施例２
脂肪吸引処置由来のヒト脂肪組織を、実施例１で決定したように最適な酵素分解手順を用いて分解した。具体的には、２５０Ｕ／ｍｌの培地を含む溶液を、等しい容量の脂肪組織に加えた。混合物を、継続的に振とうしながら３７℃でインキュベートした。酵素を、高濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液で不活性化した。不活性化された酵素混合物を３００ｇで５分間、遠心分離した。そして、細胞ペレットを新たな溶液に再懸濁した。細胞懸濁液を、一連の濾過工程に供した。次いで、濾過された溶液を３００ｇで５分間、遠心分離した。細胞ペレットを新たな溶液に再懸濁した。この細胞産物を間質血管画分（ＳＶＦ）と呼んだ。
【０１５１】
ＳＶＦサンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＦＡＣＳｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。マルチカラーフローサイトメトリーのパネルを、ＳＶＦの細胞組成を定量的に測定するために使用した（図２）。明るいＣＤ３４細胞（脂肪性の間質細胞；ＡＳＣ）、リンパ球、うす暗いＣＤ３４陽性細胞（間葉性の間質細胞；ＭＳＣ）、内皮細胞および破片（死んだ細胞）の存在を測定ならびに定量した（図３）。
【０１５２】
ＣＤ３４陽性細胞に対するＳＶＦの標的化選択を、ＣＤ３４抗体および常磁性ビーズを用いて行った。細胞は、ＣＤ３４特異的抗体に対する二次抗体を提示する常磁性ビーズとインキュベートした際にロゼットを形成した。放出工程を経て抗体‐ビーズ複合体からＣＤ３４陽性細胞を放出した。この選択手順により、このように、精製されたＣＤ３４陽性細胞を得た。
【０１５３】
フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３４陽性細胞の表現型を測定した。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１４４、およびその他を含む細胞マーカーの発現を、この方法で測定した。ＣＤ３４は、あらゆる細胞源の幹細胞、芽細胞、ならびに骨髄および臍帯における種々の細胞を含む、さまざまな細胞種に存在する幹細胞マーカーである。ＣＤ１４０ｂ（またＰＤＧＦＲ２として知られる）は、ＭＳＣマーカーとして報告されている。ＣＤ９０は、またＴｈｙ−１胸腺細胞抗原として知られており、多くの細胞種に存在する。この細胞種としては、ＭＳＣ、ＨＳＣ、ＮＫ細胞、内皮および繊維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３１はまた、ＰＥＣＡＭ‐１（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として知られており、内皮細胞に存在する。ＣＤ１０５（またＴＧＦ−ベータ受容体‐細胞複合体の制御成分であるＥｎｄｏｇｌｉｎとして知られる）は、ＴＧＦ−ベータに対する細胞応答を媒介する。ＣＤ１０５は増殖およびアポトーシス経路の制御を補助するので、さまざまな細胞に存在する。ＣＤ７３は、Ｅｃｔｏ−５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴ）であり、白血球に存在するが、ＡＳＣマーカーとして報告されている。ＣＤ４５は白血球共通抗原であり、赤血球を除く、すべての造血細胞に存在する。ＣＤ１４４はまた、細胞間の結合部におけるカルシウム依存性接着分子であるＶＥ−カドヘリンとして知られており、主に血管内皮に見出される。最近の研究は、ＣＤ１４４が、ある種の白血球にも存在し得ることを示している。
【０１５４】
その非選択集団のＣＤ３４陽性選択細胞の集団内で、少なくとも３つのはっきり認識できるサブ集団が存在するようである：集団Ａは、全体の２０＋／−６％を構成し、３４（明）／４５−／９０＋／１４０ｂ＋／３１−／７３＋／４４＋／１０５−／１４６−の発現プロフィールを有する；集団Ｂは、全体の８＋／−４％を構成し、３４（明）／４５−／９０＋／１４０ｂ−／１０５＋／１４６＋／１４４＋／３１＋／４４＋の発現プロフィールを有する；および集団Ｃは、全体の３１＋１−１６％を構成し、３４（暗）／４５−／９０＋／１０５＋／１４６＋／３１＋／４４（暗）、の発現プロフィールを有する。集団Ａおよび集団Ｂの約９６％はＣＤ３４陽性であり、これらの集団の約７８％はＣＤ１４０ｂの発現について陽性である。これらの集団の約９２％はＣＤ４５の発現について陰性である。
【０１５５】
選択方法に対する改変は、これらの細胞集団の保持もしくは除去という結果になった。
【０１５６】
集団Ａは、多分化能性の脂肪性間質細胞であるようであった。これらの細胞は、幹細胞マーカーおよび４５−／１０５＋／３１−のプロフィールを提示し、このことは、これらの細胞が間質の特性を有することを示している。この集団のその間質の特性によって、これらの細胞が組織工学品質を有することが可能であり得る。これらの細胞はまた、ＰＤＧＦＲ２抗原も発現し、このことは、より間葉の性質を示す。これらのマーカーの組み合わせによって、これらの細胞が骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロンもしくはその他に分化することが可能になり得る。
【０１５７】
集団Ｂは、内皮細胞のプロフィール（３１＋／１４４＋／１４６＋）を有したが、また、幹細胞マーカーならびにＴＧＦＢ受容体の一部であるエンドグリンマーカーＣＤ１０５も提示する。これらの細胞は、血管新生および脈管形成を容易にし得、そして組織修復に寄与し得る。
【０１５８】
集団Ｃは、プロフィール３４＋／３１＋／１４６＋／１０５（暗）／９０＋／４５−を提示した。これは、骨髄性細胞およびリンパ系細胞を形成できる造血系前駆細胞のプロフィールとして公開されている。他のマーカーは、これらの細胞の内皮特性が存在し得ることもまた、示唆する。
【０１５９】
ＳＶＦは、治療上の可能性に富んだ細胞画分である。各集団は、それぞれの表面マーカープロフィールに示される特定の特徴を含む。これらの各集団に対する選択方法は、ある集団を、他の集団によるコンタミネーションなく単離するように設計され得た。これらの特定の細胞産物は、複数の特定治療用途を有し、個々の患者の要求に特殊化され得た。
【０１６０】
実施例３
新鮮なＡＳＣを、ヒト脂肪吸引物から調製した。コラゲナーゼ処理および１００ミクロンのフィルターを通す濾過後、サンプルを分割した：３／４を、実施例１および２において本質的に記載したように、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＤ３４陽性画分の選択に使用し、１／４を標準的な濾過方法で処理した。ＣＤ３４選択は、約３倍のＣＤ３４陽性細胞の濃縮を達成し、ＣＤ３４陽性細胞の純度を１３％から３６％に上昇させた。
【０１６１】
後肢虚血のモデルをヌードマウスで作製した。手術の１日後、動物を３つのグループ：ＰＢＳコントロール；非選択（総集団）；およびＣＤ３４選択、のうちの１つに割り当てた。処置（ＰＢＳ、非選択細胞、もしくはＣＤ３４選択細胞）を、虚血肢の、ひ腹筋および大腿四頭筋への直接的な筋肉注射により行った。
【０１６２】
レーザードップラー灌流画像（ＬＤＩ）を、１日目、５日目、１０日目、１５日目および２０日目に行い、虚血肢の灌流を評価した。１日目に最も低い相対的灌流を有したコントロール処理マウスの大部分は、５日目までに深刻な壊死（虚血の脚の半分より多くに作用した）を発症し、安楽死させなければならなかった。その結果、コントロールグループについての平均値は、より高い相対的灌流に向かって傾いた。どの動物も、１日目の相対的灌流値の範囲外（すなわち、＞２０％）であることに基づく除外をしなかった。これは、残り５匹のコントロールマウスのうち３匹を除くことを必要としたからである。
【０１６３】
図５に示すように、高い相対的灌流値を５日目および１０日目に観察した。この観察は、より多くのコントロールグループマウスの除外数により説明し得る。
【０１６４】
ＣＤ３４＋ ＡＳＣの３倍濃縮物は、虚血後肢を有したマウスの冒された筋肉組織に直接注射したとき、非選択細胞よりも効力があった。
【０１６５】
公報、特許出願および特許を含む、本明細書中で引用されたすべての参考文献は、あたかも各参考文献が、個々に、かつ具体的に参考として援用することが示され、その全体が本明細書中に明記されたかのごとく、その同程度まで、本明細書により参考として援用される。
【０１６６】
発明を記載する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示対象の用語の使用は、本明細書中にそうでないと示されない限り、もしくは文脈によって明白に否定されない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、そうでないと言及されない限り、オープンエンドな用語（すなわち、「を含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中における値の範囲についての記載は、本明細書中にそうでないと言及されないかぎり、その範囲内に入る各々の別個の値を個々に指す簡略な方法として機能することを単に意図され、各々の別個の値は、あたかも本明細書中で個々に記載されたかのごとく、明細書に組み込まれる。本明細書中に記載されたすべての方法は、本明細書中にそうでないと示されない限り、もしくは文脈によって明白に否定されない限り、あらゆる適切な順序で行われ得る。本明細書に提供された、あらゆる例、およびすべての例、もしくは例示的な用語（たとえば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、そうではないと請求されない限り、本発明をより明確にすることを単に意図し、本発明の範囲に限定を与えない。本明細書における用語はいずれも、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１６７】
本発明を実施するために、本発明者らに知られている最良の形態を含め、本発明の特定の実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態の改変は、前述記載を読めば、当業者には明白になり得る。本発明者らは、当業者がこのような改変を適切に利用することを予想し、そして本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたものとは異なるように本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付された、特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および均等を含む。さらに、それらの可能性のある改変のすべてにおいて、上に記載された要素のあらゆる組み合わせが、本明細書においてそうでないと言及されない限り、もしくは文脈により明白に否定されない限り、本発明によって包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織から細胞の集団を得る方法であって、該方法は、少なくとも約２００Ｕ／ｍｌ溶液かつ約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下の濃度で酵素を含む溶液中で、該脂肪組織を約３０分と６０分の間の時間インキュベートする工程を包含し、そのことにより該脂肪組織から細胞の集団を得る方法。
【請求項２】
前記酵素の濃度が約２００Ｕ／ｍｌ溶液と約３００Ｕ／ｍｌ溶液の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素の濃度が約２２５Ｕ／ｍｌ溶液と約２７５Ｕ／ｍｌ溶液の間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素の濃度が約２４５Ｕ／ｍｌ溶液と２５５Ｕ／ｍｌ溶液の間である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記時間が約４５分と約５５分の間である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、もしくは少なくとも前述のうちの１つを含む酵素の混合物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
脂肪組織の容量と酵素溶液の容量の比が約１：１である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
脂肪組織１ｍｌ当たり少なくとも６．０×１０５個細胞が得られる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
脂肪組織１ｍｌ当たり少なくとも８．０×１０５個細胞が得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法であって、以下：
ａ．請求項１から９のいずれか１項に記載の方法に従って脂肪組織から細胞の集団を得る工程；および
ｂ．一次抗体を含む第二の溶液内で該細胞の集団をインキュベートする工程であって、該一次抗体は、該細胞の集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分けるものであり、そのことにより、標的細胞の濃縮された集団を得る工程
を包含する方法。
【請求項１１】
前記一次抗体が、前記標的細胞によって発現されない細胞マーカーに対して特異的な抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記一次抗体がＣＤ４５、グリコホリン‐ＡおよびＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに対して特異的な抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一次抗体が、前記標的細胞によって発現される細胞マーカーに対して特異的な抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞マーカーがＣＤ３４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞がＣＤ３４陽性細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の集団をビーズとインキュベートする工程を包含し、そのことによりビーズおよび前記一次抗体を含む複合体を形成する、請求項１０から１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビーズが前記一次抗体に結合するタンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が：（ｉ）前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）プロテインＡ、（ｉｉｉ）プロテインＧ、および（ｉｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ビーズが、１：１と５：１の間のビーズと標的細胞の比で存在する、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ビーズと標的細胞の比が約４：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の溶液から前記複合体を取り出す工程を包含する、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ビーズが常磁性ビーズであり、前記複合体が前記溶液から磁石で取り出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複合体を放出ペプチドとともにインキュベートする工程を包含する、請求項１３から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記放出ペプチドが、ＣＤ３４のエピトープもしくは前記一次抗体のエピトープであるエピトープを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記放出ペプチドが、可溶性のＣＤ３４もしくはＰＲ３４放出ペプチドである、請求項２３もしくは２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合体を注射器で粉砕する工程を包含する、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
得られた前記集団が、１日より短い間、培養もしくはプレートされる、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
得られた前記集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１０から２８のいずれか１項に記載の方法にしたがって、脂肪組織から得られた標的細胞の濃縮された集団。
【請求項３０】
前記濃縮された集団における標的細胞の割合が、（ａ）の前記細胞の集団における標的細胞の割合の約１．５倍から約５倍である、請求項２９に記載の濃縮された集団。
【請求項３１】
前記標的細胞がＣＤ３４陽性細胞である、請求項２９もしくは３０に記載の濃縮された集団。
【請求項３２】
患者への投与のための細胞を含む薬学的組成物を調製する方法であって、該方法は、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の標的細胞の濃縮された集団を薬学的に受容可能なキャリアと調合する工程を包含する方法。
【請求項３３】
前記細胞が患者にとって自己由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、１日以下の間、培養もしくはプレートされた、請求項３２もしくは３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬学的組成物の前記細胞の少なくとも５０％がＣＤ３４陽性細胞である、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２から３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって調製された薬学的組成物。
【請求項３７】
患者における疾患もしくは医学的状態を処置する方法であって、該方法は、該疾患もしくは医学的状態を処置するのに効果的な量で、請求項３６に記載の薬学的組成物を該患者に投与する工程を包含する方法。
【請求項１】
脂肪組織から細胞の集団を得る方法であって、該方法は、少なくとも約２００Ｕ／ｍｌ溶液かつ約３１９Ｕ／ｍｌ溶液以下の濃度で酵素を含む溶液中で、該脂肪組織を約３０分と６０分の間の時間インキュベートする工程を包含し、そのことにより該脂肪組織から細胞の集団を得る方法。
【請求項２】
前記酵素の濃度が約２００Ｕ／ｍｌ溶液と約３００Ｕ／ｍｌ溶液の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素の濃度が約２２５Ｕ／ｍｌ溶液と約２７５Ｕ／ｍｌ溶液の間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素の濃度が約２４５Ｕ／ｍｌ溶液と２５５Ｕ／ｍｌ溶液の間である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記時間が約４５分と約５５分の間である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、もしくは少なくとも前述のうちの１つを含む酵素の混合物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
脂肪組織の容量と酵素溶液の容量の比が約１：１である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
脂肪組織１ｍｌ当たり少なくとも６．０×１０５個細胞が得られる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
脂肪組織１ｍｌ当たり少なくとも８．０×１０５個細胞が得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脂肪組織から標的細胞の濃縮された集団を得る方法であって、以下：
ａ．請求項１から９のいずれか１項に記載の方法に従って脂肪組織から細胞の集団を得る工程；および
ｂ．一次抗体を含む第二の溶液内で該細胞の集団をインキュベートする工程であって、該一次抗体は、該細胞の集団を、標的細胞を含むサブ集団と標的細胞を実質的に含まないサブ集団とに分けるものであり、そのことにより、標的細胞の濃縮された集団を得る工程
を包含する方法。
【請求項１１】
前記一次抗体が、前記標的細胞によって発現されない細胞マーカーに対して特異的な抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記一次抗体がＣＤ４５、グリコホリン‐ＡおよびＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに対して特異的な抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一次抗体が、前記標的細胞によって発現される細胞マーカーに対して特異的な抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞マーカーがＣＤ３４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞がＣＤ３４陽性細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の集団をビーズとインキュベートする工程を包含し、そのことによりビーズおよび前記一次抗体を含む複合体を形成する、請求項１０から１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビーズが前記一次抗体に結合するタンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が：（ｉ）前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）プロテインＡ、（ｉｉｉ）プロテインＧ、および（ｉｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ビーズが、１：１と５：１の間のビーズと標的細胞の比で存在する、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ビーズと標的細胞の比が約４：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の溶液から前記複合体を取り出す工程を包含する、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ビーズが常磁性ビーズであり、前記複合体が前記溶液から磁石で取り出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複合体を放出ペプチドとともにインキュベートする工程を包含する、請求項１３から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記放出ペプチドが、ＣＤ３４のエピトープもしくは前記一次抗体のエピトープであるエピトープを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記放出ペプチドが、可溶性のＣＤ３４もしくはＰＲ３４放出ペプチドである、請求項２３もしくは２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合体を注射器で粉砕する工程を包含する、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
得られた前記集団が、１日より短い間、培養もしくはプレートされる、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
得られた前記集団を拡張する、あらゆる工程が存在しない、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１０から２８のいずれか１項に記載の方法にしたがって、脂肪組織から得られた標的細胞の濃縮された集団。
【請求項３０】
前記濃縮された集団における標的細胞の割合が、（ａ）の前記細胞の集団における標的細胞の割合の約１．５倍から約５倍である、請求項２９に記載の濃縮された集団。
【請求項３１】
前記標的細胞がＣＤ３４陽性細胞である、請求項２９もしくは３０に記載の濃縮された集団。
【請求項３２】
患者への投与のための細胞を含む薬学的組成物を調製する方法であって、該方法は、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の標的細胞の濃縮された集団を薬学的に受容可能なキャリアと調合する工程を包含する方法。
【請求項３３】
前記細胞が患者にとって自己由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、１日以下の間、培養もしくはプレートされた、請求項３２もしくは３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬学的組成物の前記細胞の少なくとも５０％がＣＤ３４陽性細胞である、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２から３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって調製された薬学的組成物。
【請求項３７】
患者における疾患もしくは医学的状態を処置する方法であって、該方法は、該疾患もしくは医学的状態を処置するのに効果的な量で、請求項３６に記載の薬学的組成物を該患者に投与する工程を包含する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０５６６５（Ｐ２０１２−５０５６６５Ａ）
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３２３１６（Ｐ２０１１−５３２３１６）
【出願日】平成２１年１０月１９日（２００９．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１１８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４５６４５
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１９日（２００９．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１１８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４５６４５
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]