脂肪腫および脂肪肉腫を治療する方法
本発明は、脂肪腫および脂肪肉腫を治療するための方法および組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２００９年２月１９日に出願された米国特許出願第６１／１５３７９８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、成人の６０％が、体重過多または臨床的に肥満とみなされるための臨床的要件を満たし、毎年３００，０００人の死亡につながると推測されている。Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら，Ｕｒｂａｎ ａｎｄ ｒｕｒａｌ ｈｅａｌｔｈ ｃｈａｒｔｂｏｏｋ．２００１年，Ｈｅａｌｔｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｈｙａｔｔｓｖｉｌｌｅ（ＭＤ）：ＮＣＨＳ．２９６頁；Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ． ２００１年参照のこと。２００１年に、米国の公衆衛生局長官が、体重過多または臨床的に肥満である個人の罹患率および有病率を防ぎ、低減するための呼びかけを公表した。Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅａｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年。興味深いことに、このレポートには、問題に対する薬剤アプローチの適用または使用については何も書かれていない。しかし、産業的研究機関および学術的研究機関の両方によって、薬剤アプローチの開発は相当注目されている。薬剤アプローチは、適用および使用が恐らくは容易であるために、より高いコンプライアンスの可能性が高いので魅力的である。
【０００３】
世界中からの疫学的研究によって、死亡率と肥満症の間の論争の余地のない相関が実証されている。感染症、心臓病、糖尿病および特定の癌の予防および制御に関する健康目標の達成において過去５０年にわたって成し遂げられた進歩は、肥満症の広がりつつある蔓延によって一掃されてしまった。２００１年には、小児および１０代の若者の約２５％が体重過多であり、ちょうど２０年前から２倍を超えるパーセンテージである。現在、成人の６０％をはるかに上回る人が、体重過多または肥満であるとわかっており、米国単独で、年に３００，０００人を上回る死亡が、これらの状態に直接的に起因し得る。これらの知見は、すべての人種、年齢、民族および両方の性別に広く及ぶが、特定の群、特に、少数民族および下層階級が、他のものよりもより傾向があることは明らかである。Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年．
【０００４】
肥満度指数として定義される体重過多（２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩ）および肥満症（ＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２）は、早死に、２型糖尿病、心臓病、卒中、高血圧症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、喘息、種々の呼吸器障害、特定の癌、高い血中コレステロール値、妊娠合併症、手術危険度の増大、精神的疾患および列挙するには多すぎるその他の病状と相関していた。Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年；ＮＨＬＢＩ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ，Ｎ． ＮＩＨ， Ｅｄｉｔｏｒ． １９９８年， ＨＨＳ， ＰＨＳ．２９〜４１頁．肥満の個体は、正常範囲のＢＭＩ（２０〜２５ｋｇ／ｍ２）を有する人と比較して、これらの原因のすべてから、５０〜１００％増大した早死にの危険を有する。適度な体重減少（過剰な全体重の５〜１５％）でさえ、これらの疾患の少なくともいくつかの、特に、心臓病の危険因子を短期間低減する。ＮＨＬＢＩ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ， Ｎ． ＮＩＨ， Ｅｄｉｔｏｒ．１９９８年，ＨＨＳ，ＰＨＳ．２９〜４１頁．現在の証拠は、効果は、同様に長期の利益を有し得ることを示唆する。同文献参照のこと；ＮＩＤＤＫ， Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｗｅｉｇｈｔ−ｌｏｓｓ（ＳＨＯＷ） ｔｒｉａｌ， ＮＩＤＤＫ， Ｅｄｉｔｏｒ． ２００１年， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【０００５】
公衆衛生局長官の、体重過多および肥満を防ぎ、低減するための２００１年の呼びかけは、高まり続ける貧弱な栄養の供給源への依存および座りがちな生活様式の増大を伴う、過去数十年の間のアメリカの生活様式の明らかな変化を強調する。彼の重要な呼びかけは、学校での教育を促進し、社会全体で健康的な食事、定期的な、適度な運動を後押しするためのものである。進行中の過程における現段階では、米国国民の大部分が、この重要なメッセージの少なくとも浅薄な知識を有する可能性が高いと思われる。しかし、肥満症に傾く現在の傾向は、弱まる兆しを全く示さず、実際、経時的に悪化すると予測されている。克服するべき主な障害は、一般の人々による指示されたガイドラインに従った食事および運動に関するコンプライアンスの必要性であることは明らかであり、これは先行きの暗い見通しを表す。
【０００６】
体重過多および肥満症の予防および治療のための薬剤アプローチについては、本質的に何も触れられていないことは、公衆衛生局長官の２００１年レポートの興味深い特徴である。このようなアプローチは、患者のコンプライアンスの必要性を低減し得る可能性があるので、これが、学術的機関および産業的機関の両方の間で強い関心のある領域であることは明らかである。脂肪組織の役割および機能の理解においては、近年、エネルギー貯蓄の調節の観点から、および分泌細胞としての両方で大きな進歩がなされた（Ｆｒａｙｎら，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ，２００３年．２７（８）：８７５〜８８頁に総説されている）。浮かび上がった図式は、自律神経系の活性、基質およびホルモンの複雑な混合物の送達、脂肪細胞によって分泌される自己分泌および傍分泌エフェクターからのフィードバックおよびまた脂肪組織への血管供給を含むので極めて複雑である。また、脂肪細胞によって分泌されるレプチンおよびアディポネクチンなどの因子は、全身の代謝に対して全体的な効果を有する。Ｇｕｅｒｒｅ−Ｍｉｌｌｏ， Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｒｍｏｎｅｓ． Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ，２００２年．２５（１０）：８５５〜６１頁；Ｋｉｓｈｉｄａ， Ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００３年．３０６（１）：２８６〜９２頁；Ｍｉｎｅｒ， Ｔｈｅ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ． Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ， ２００４年．８２（３）：９３５〜４１頁；Ｒａｂｉｎ，ら，Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ：ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｏ ｉｔｓ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｈｅｒ， ２００５年．３（３）：４６５〜７１頁；Ｈｏｕｓｅｋｎｅｃｈｔら，Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，１９９８年．７６（５）：１４０５〜２０頁；Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ， Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１９９９年．１３０（８）：６７１〜８０頁参照のこと。
【０００７】
このことから、上記の体重過多および肥満症に関連する現在の問題の基礎を形成する正常および病的状態の完全な理解を得るには、極めて統合的な、全体的なアプローチが必要であることは明らかである。
【０００８】
研究、農業および交流のために多数の種類の動物が使用される。場合によっては、このような動物を収容し、餌を与える費用は大きなものである。小さな大きさの動物は、餌を与え、収容するのに、通常の大きさの動物よりも少ない費用しかかからない。したがって、大きさを小さくした動物および／または体重を減らした動物を作製する組成物および方法は、有利であり得る。また、コンパニオンアニマルにおける肥満症は、１つの問題である。肥満症は、短い寿命およびヒトについて先に記載された同様の疾患および状態の多くを引き起こし得る。
【０００９】
脂肪腫は、薄い、線維性被膜中の脂肪細胞からなる良性腫瘍であり、通常、皮膚のすぐ下に見られる。脂肪腫は、身体中のほとんどどこにでも生じ得るが、胴体、頚部、大腿上部、上腕および腋窩で最も多く見られる。脂肪腫は、最もよく見られる種類の非悪性軟組織腫瘍である。脂肪腫は、多数の動物で生じるが、イヌにおいて最もよく見られる。ウシおよびウマ、ネコおよびブタは、脂肪腫の発生に対して感受性がある。脂肪腫の種類として、表在性皮下、筋肉内、紡錘細胞、血管脂肪腫、良性脂肪芽細胞腫および腱鞘、神経または滑膜の脂肪腫が挙げられる。
【００１０】
脂肪腫の原因は、完全にはわかっていないが、脂肪腫が生じる傾向は遺伝され得る。例えば、家族性多発性脂肪腫症などの遺伝性状態は、脂肪腫の発生を含み得る。ＨＭＧ Ｉ−Ｃ遺伝子（肥満症と関連する遺伝子として先に同定された）と脂肪腫の発生間の相関が、マウスにおいて実証されている。さらに、軽い傷がその成長を誘発し得る。現在、脂肪腫を防ぐ、またはその成長に影響を及ぼす既知治療はない。脂肪腫は、通常、脂肪腫が、有痛性もしくは圧痛があるようになる、伝染性もしくは繰り返し炎症性になる、悪臭のある分泌物を流す、動きもしくは機能と干渉する、大きさが大きくなる、または醜くなる、もしくは厄介になる場合に外科的に摘出される。脂肪腫を除去するために脂肪吸引も使用され得る。
【００１１】
脂肪腫の脂肪肉腫への悪性形質転換は稀であるが、悪性形質転換の少数例が、例えば、骨および腎臓脂肪腫において記載されている。脂肪腫および脂肪肉腫の治療方法は、当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態では、本発明は、脂肪腫にグリシンを投与することを含む、哺乳類において脂肪腫を治療する方法を提供する。グリシンは、グリシン類似体またはグリシンおよびグリシン類似体の組合せを含み得る。哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマであり得る。グリシンは、脂肪腫への注射によって、または経口投与によって脂肪腫に投与できる。注射される場合には、グリシンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中に存在し得る。グリシンは、哺乳類に経口的に投与される場合には、哺乳類の食事の約１０重量％〜３０重量％で、医薬上許容される担体または食品中にあり得る。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、脂肪肉腫にグリシンを投与することを含む、哺乳類において脂肪肉腫を治療する方法を提供する。グリシンは、グリシン類似体またはグリシンおよびグリシン類似体の組合せを含み得る。哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマであり得る。グリシンは、脂肪肉腫への注射によって脂肪肉腫に投与され得る。グリシンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中に存在し得る。本発明のさらに別の実施形態は、哺乳類にグリシンを経口的に投与することを含む、哺乳類において脂肪肉腫を治療する方法を提供する。グリシンは、哺乳類の食事の約１０重量％〜３０重量％で医薬上許容される担体または食品と合わせることができる。
【００１４】
本特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求に応じて必要な支払いにより事務所から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】成体の雄のフィッシャーラットにおける体重に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図２】成体の雄のフィッシャーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図３】成体の雌のフィッシャーラットにおける体重に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図４】成体の雌のフィッシャーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図５】成体の雄のフィッシャーラットにおけるに飼料消費に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図６】雄のＺＤＦラットの体重に対する、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図７】ＺＤＦラットの腹部脂肪含量に対する、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図８】雌のスプラーグ−ドーリーラットの体重に対する、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図９】スプラーグ−ドーリーラットの飼料消費に対する、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図１０】雌のスプラーグ−ドーリーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図１１Ａ】白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞におけるチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン３：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン５：２０％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。
【図１１Ｂ】白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞におけるチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン２：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン３：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：２０％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ）。
【図１２】高グリシン食で処理されたスプラーグ−ドーリーラットから得た肝臓組織におけるＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン２：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン３：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：１５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。
【図１３】高グリシン食で処理されたスプラーグ−ドーリーラットから得た筋肉組織におけるＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン３：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン５：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ レーン６：１５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。
【図１４】対照動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質の二重標識実験の結果を示す図である。
【図１５】食餌中２０％グリシンで処理された動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質の二重標識実験の結果を示す図である。黄色の円は、対照に対するダウンレギュレーションを示すのに対し、赤色の円は、目視検査によって認識できるようなアップレギュレーションを示す。
【図１６Ａ】グリシンの定量のＬＣ／ＭＳ法の代表的な結果を示す図である。上部の出力は、オンカラムで７８．１２５ｐＭでグリシン、プロリン、フェニルアラニン、リシンおよびロイシン各々について得られた複合ＴＩＣ（全イオン電流）である。中央の出力は、グリシンの抽出されたＴＩＣクロマトグラムである。底部の出力は、ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）による複合波長モニタリングによって得られたものである。
【図１６Ｂ】グリシンの定量のＬＣ／ＭＳ法の代表的な結果を示す図である。較正曲線を構築するためにグリシンについて抽出されたＴＩＣのピーク下面積が利用される場合に、グリシンについて得られた標準曲線を示す。各較正レベルで３連の注入を使用して較正曲線を構築した。
【図１７】（同位体コードアフィニティータグ）法を示す図である。
【図１８】グリシンに対する幼若な雌ラットの体重の用量反応を示す図である。
【図１９】グリシンに対する幼若な雌ラットの体長の用量反応を示す図である。
【図２０】グリシンに対する幼若な雄ラットの体重の用量反応を示す図である。
【図２１】グリシンに対する幼若な雄ラットの体長の用量反応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一般的なアミノ酸、グリシンは、実験室の動物の食餌に加えられると、体重の用量依存性減少を引き起こす効果を有するということを発見した。この効果は、いくつかのげっ歯類系統およびイヌで観察した。最適用量で、また実際に、最適以上の用量で、長期の投与の間に有害な副作用は観察されなかった。グリシンは、ほとんどの哺乳類によって、解糖経路から通常の中間代謝の一部として生じるセリンから合成される非必須アミノ酸である。その天然の形態および誘導体の形態で、いくつかの精神病、特に、統合失調症の原因および可能性ある治療におけるその役割に関して広く研究されている化合物である（例えば、Ｗａｚｉｒｉ ＆ Ｂａｒｕａｈ、Ａ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｉｎｅｒｇｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｆｉｎｄｉｎｇｓ． Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ，１９９９年．３７（３）：２０５〜１５頁；Ｗａｚｉｒｉ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９８８年．２３（２）：２１０〜１頁；Ｗａｚｉｒｉ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ： ｓｏｍｅ ｃａｖｅａｔｓ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９９６年．３９（３）：１５５〜６頁；Ｊａｖｉｔｔ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９９６年．４０（７）：６８４〜６頁；Ｊａｖｉｔｔ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，２００２年．３（７）：１０６７〜７２頁；Ｓｈｏｈａｍら，Ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｇｌｙｃｉｎｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２００１年．４９（１０）：８７６〜８５頁；Ｊａｖｉｔｔ， Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｃｕｒｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｐ，２００１年．３（５）：４１３〜７；Ｓｈｏｈａｍら，Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｌｙｃｉｎｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ． Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍｃｏｌ，１９９９年．２（１）：３５〜４０頁；Ｓｈｏｈａｍ，ら，Ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄ−ｃｙｃｌｏｓｅｒｉｎｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｖａｃｕｏｕｓ ｃｈｅｗｉｎｇ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔａｒｄｉｖｅ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２００４年．１００４（１−２）：１４２〜７頁；Ｔｕｏｍｉｎｅｎら，Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ： ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ，２００５年．７２（２−３）：２２５〜３４頁参照のこと）。これらの報告のうちいくつかで、グリシン投与の効果が、試験動物または被験体の体重に対して、小さいが、有意な影響を有すると言及されているが、この知見は、考察またはさらなる分析の主題には決してならなかった。これは、恐らくは、観察された効果が比較的小さく、場合によるとその他の医薬の反作用効果によるためである。Ｐｅｔｚｋｅら（１９８７）は、グリシンが、その他のアミノ酸、糖および脂肪と比較して比較的高い熱発生効果を有し、これは、酸素取り込みの増大と相関していると報告した。Ｐｅｔｚｋｅ ＆ Ａｌｂｒｅｃｈｔ，［Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ］。Ｎａｈｒｕｎｇ，１９８７年．３１（２）：１５７〜７２頁；Ｐｅｔｚｋｅら，Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ［１−１４Ｃ］ｃａｒｂｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ ｄｉｅｔ ｆｅｄ ｙｏｕｎｇ ａｎｄ ｏｌｄ ｒａｔｓ， Ｚｆａ，１９８７年．４２（６）：３２３〜８頁；Ｐｅｔｚｋｅら，［Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ］． Ｎａｈｒｕｎｇ，１９８７年．３１（３）：２０７〜１５頁。彼のグループは、実験ラットの成長における用量依存性低減を言及したが、可能性ある機序の生化学的根拠を提供できなかった。本発明者らは、以下に記載されるように、この知見を再現することに加えて、成体動物は、その食餌のグリシン補給を用いて用量依存性体重減少を示すことを実証した。グリシンまたはグリシン類似体は、観察できる有害な副作用を伴わずに肥満症に対抗するために使用できる。さらに、グリシンは、アポトーシスを、具体的には、脂肪細胞において、恐らくは、今までに認識されていない経路を使用して誘導するよう作用する。
【００１７】
グリシンおよびグリシン類似体
グリシンは、容易に入手可能な、非毒性のアミノ酸である。グリシン、グリシン類似体またはその組合せは、本発明の方法において使用できる。白色脂肪細胞などの脂肪細胞においてアポトーシスを直接的または間接的に誘導する任意のグリシン類似体を使用できる。本発明の一実施形態では、グリシン類似体は、式Ｉを含み得る。
【００１８】
【化１】
【００１９】
例えば、式Ｉでは、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｈであり得、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｍｅ、ＥｔまたはＰｒであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｂｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、（ＣＨ２）２−５であり得る。
【００２０】
式Ｉは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【００２１】
【化２】
【００２２】
その他のグリシン類似体は、式ＩＩを含み得る：
【００２３】
【化３】
【００２４】
例えば、式ＩＩでは、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｈであり得、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｍｅ、ＥｔまたはＰｒであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｂｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、（ＣＨ２）２−５であり得る。
【００２５】
式ＩＩは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【００２６】
【化４】
【００２７】
本発明の別の実施形態では、グリシン類似体は、式ＩＩＩを含み得る：
【００２８】
【化５】
【００２９】
式ＩＩＩでは、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｈであり得、Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｍｅ、ＥｔまたはＰｒであり得、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得；
Ｒ１は、Ｈであり得、Ｒ２は、ＢｎまたはＭｅであり得、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、（ＣＨ２）２−５またはＭｅであり得、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得る。
【００３０】
式ＩＩＩは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【００３１】
【化６】
【００３２】
高グリシン食
「高グリシン食」は、グリシン、グリシン類似体もしくは複数の類似体もしくはそれらの組合せが高い食事、または高投与量のグリシン補給、グリシン類似体補給もしくはそれらの組合せである。本発明の一実施形態では、グリシン類似体、または、グリシンと組み合わせたグリシン類似体は、グリシンのみを含む食事が投与される場合に得られるものとほとんど同じ生理学的効果をもたらす。すなわち、グリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せは、高グリシン食で動物にグリシンが投与される場合の動物におけるグリシンの生理学的濃度とほとんど同じである、動物におけるグリシンの生理学的濃度をもたらす。いくつかの例では、グリシンとの組合せ中のグリシン類似体または複数のグリシン類似体は、グリシンが単独で使用される場合と同様の効果を達成するためにグリシン単独よりも低いパーセンテージで投与できる。例えば、グリシンとの組合せ中のグリシン類似体または複数のグリシン類似体は、食事中、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０重量パーセント以上で投与できる。
【００３３】
グリシンおよびグリシン類似体は、食事中に混合してもよく、その他の経路によって投与してもよい。補給は、液体、半固体、固体または任意のその他の形態であり得る。高グリシン食は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せを含む。本発明の一実施形態では、高グリシン食は、約５％〜約４０％以上、約１０％〜約４０％；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％；または約２０％〜約２５％のグリシンまたはグリシン類似体またはそれらの組合せを含み得る。
【００３４】
本発明はまた、約３．５％〜約４０％以上、約３．５％〜約４０％；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％または約２０％〜２５％のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ（すなわち、約３．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ）および約６０％〜約９６．５％（すなわち、約９６．５、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０％）のカロリーが少ない食事を含む、動物における体重減少のための食事組成物を提供する。
【００３５】
本発明はまた、約３．５％〜約４０％以上；約１０％〜約４０％以上；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％；または約２０％〜２５％のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ（すなわち、約３．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ）および約６０％〜約９６．５％（すなわち、約９６．５、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０％）の脂肪が少ない食事を含む、動物における体重減少のための食事組成物を提供する。低脂肪食は、低飽和脂肪食であり得る。
【００３６】
本発明はまた、約３．５％〜約４０％以上；１０％〜約４０％以上；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％；または約２０％〜２５％のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ（すなわち、約３．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ）および約６０％〜約９６．５％（すなわち、約９６．５、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０％）の炭水化物が少ない食事を含む、動物における体重減少のための食事組成物を提供する。
【００３７】
本発明の方法
ヒトなどの雄または雌の動物への高グリシン食の投与は、脂肪組織、特に、動物の白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導し得る。したがって、高グリシン食は、動物において脂肪組織を低減し得る、または脂肪細胞の大きさを低減し得る、またはその両方である。本発明の方法は、動物に高グリシン食を投与して、動物において、脂肪組織においてアポトーシスを誘導すること、脂肪組織を低減すること、脂肪細胞の大きさを低減することまたはそれらの組合せを含む。
【００３８】
特定の理論に拘束されようとは思わないが、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導は、グリシンの直接または間接効果によって引き起こされると考えられる。この作用機序は、このような食事が有する、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバーに対する観察された効果によって支持される。ＢＡＤの細胞死を促進する能力は、位置１３６でのリン酸化によって阻害される。高グリシン食の投与は、脂肪組織において位置１３６でのＢＡＤのリン酸化を低減または排除し、このことは、高グリシン食またはその等価物が投与される場合に観察される脂肪組織の減少が、アポトーシスの誘導によって起こることをを示す。
【００３９】
食事で、（すなわち、経口的な）またはその他の投与手段のいずれかによる高濃度のグリシンの投与は、動物において腹部脂肪含量を低減し得る。さらに、動物への、食事で、またはその他の投与手段のいずれかによるグリシンの投与は、動物において体重減少をもたらし得る。しかし、グリシンを補給した食事の最初の投与時に、体重増加が見られる場合がある。いずれか特定の理論に拘束されようとは思わないが、この観察結果は、脂肪組織の減少および筋肉組織の獲得の結果であり得ると考えられる。
【００４０】
本発明の方法および組成物を使用して、大きさを小さくした、およびまたは体重を減らした動物を作製できる。例えば、通常の大きさの動物よりも約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは７５％小さい動物または通常の体重の動物よりも約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは７５％軽い動物。通常の大きさまたは通常の体重の動物とは、年齢および全身の健康状態が考慮された場合に、動物種の平均または標準的な体重もしくは大きさの範囲内に入る動物である。
【００４１】
本発明は、動物に高グリシン食を投与することを含む、大きさを小さくした、または体重を減らした、または大きさを小さくし、体重を減らした両方の動物を作製する方法を提供する。大きさを小さくした動物のために、幼若動物に高グリシン食が給餌される。高グリシン食は、毎日投与され得る。動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、トリまたは魚であり得る。
【００４２】
本発明はまた、上記のように大きさを小さくした動物を作製し、続いて、動物を通常の大きさに戻す方法を提供する。本方法は、幼若動物に高グリシン食を投与して、大きさを小さくした動物を作製すること、次いで、動物に正常食を投与して、通常の大きさの動物を作製することを含む。正常食は、グリシンを補給していないが、正常な量のグリシンを含む食事である。
【００４３】
本発明はまた、成熟または幼若動物に高グリシン食を投与して、体重を減らした動物を作製し、次いで、動物に正常食を投与して通常の体重の動物を作製することを含む、体重を減らした動物を作製し、次いで、動物を通常の体重に戻す方法を提供する。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態は、幼若動物へ高グリシン食を投与して、恒久的に大きさを小さくした、または体重を減らした動物を作製することによって、恒久的に大きさを小さくした、およびまたは体重を減らした動物を作製する方法を提供する。高グリシン食の投与は、動物の生涯を通じて、または通常は成長の休止と関連している生理的プロセスによってさらなる成長が妨げられるまで継続できる。
【００４５】
本発明の方法および組成物を使用して、幼若または成熟動物などの動物において体重減少を引き起こすことができる。約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または７５％の体重減少が達成され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態は、動物に上記の高グリシン食を投与することを含む動物において体重減少を引き起こす方法を提供する。動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、トリ、魚または無脊椎動物であり得る。本発明の一実施形態では、動物は、健康であり、潜在する健康問題または関心事がない。本発明の別の実施形態では、動物は、体重過多または肥満症の健康問題のみを有し、その他の健康問題または関心事はない。
【００４７】
高グリシン食は、運動管理療法、低脂肪食、低カロリー食、低炭水化物食、胃形成術、胃の分割および胃バイパスなどの外科的介入、行動療法、薬物療法（例えば、シブトラミン、メリディア（登録商標）（シブトラミンＨＣｌ一水和物）、ゼニカル（登録商標）（オルリスタット）およびそれらの組合せの使用）、天然のダイエット補助食品または店頭販売の（ＯＴＣ）体重減少製品およびそれらの組合せなどの付属的体重減少治療とともに投与してもよい。
【００４８】
低脂肪食は、所与の年齢、体重および全身の健康状態の所与の種に通常推奨される量の食事中の脂肪より、約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない脂肪を含む食事である。例えば、ヒトにおける低脂肪食は、約０％、３％、５％、７％、１０％、１３％、１５％、２０％または２５％の脂肪からなる食事を含み得る。
【００４９】
低カロリー食は、所与の年齢、体重および全身の健康状態の特定の種に通常推奨される量のカロリーより、約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ないカロリーを含む食事である。
【００５０】
低炭水化物食は、所与の年齢、体重および全身の健康状態の特定の種に通常推奨される量のカロリーより、約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない炭水化物を含む食事である。
【００５１】
行動療法は、食事療法および／または運動療法に伴うコンプライアンスに対する障壁を克服するのに役立つ戦略を含む。このような戦略は、例えば、食習慣および運動の自己監視、ストレス管理、刺激制御、問題解決（例えば、摂食および運動と関連する問題領域の自己補正）、随伴性管理（例えば、特定の望ましい行動に対する報奨の使用、認知再構築（例えば、非現実的な目標および不正確な信念の改変）および社会的支援を含む。
【００５２】
グリシンおよびグリシン類似体は、例えば、従来の非毒性の医薬上許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含有する製剤を使用して、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入もしくは噴霧によって、または直腸性に投与できる。本明細書において、用語、非経口とは、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、腹膜内またはくも膜下腔内注射または注入技術などを含む。さらに、グリシンおよびグリシン類似体は、医薬上許容される担体と組み合わせてもよい。グリシンおよびグリシン類似体は、１種以上の非毒性の医薬上許容される担体、賦形剤、着色剤、防腐剤、矯味剤、希釈剤、アジュバントまたはそれらの組合せ、および必要に応じて、その他の有効成分と関連して存在し得る。グリシンおよびグリシン類似体は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性散剤または顆粒剤、エマルジョン、ハードもしくはソフトカプセル剤、持続放出製剤またはシロップ剤もしくはエリキシル剤のような経口使用に適した任意の形態であり得る。グリシンおよびグリシン類似体は、食品製剤中に存在し得る。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、脂肪細胞へ１種以上のグリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態は、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、白色脂肪細胞においてアミノ酸位置１３６でのＢＡＤのリン酸化を低減する方法を提供する。
【００５５】
グリシンは、約５、１０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で脂肪細胞に加えてもよい。
【００５６】
脂肪腫および脂肪肉腫
本発明は、脂肪腫または脂肪肉腫の治療方法を提供する。脂肪腫の種類として、例えば、血管脂肪腫、アンギオリポレイオミオーマ（ａｎｇｉｏｌｉｐｏｌｅｉｏｍｙｏｍａ）、神経線維肪腫、軟骨脂肪腫（ｃｈｏｎｄｒｏｉｄ ｌｉｐｏｍａ）、紡錘細胞脂肪腫、多形性脂肪腫、皮内紡錘細胞脂肪腫、褐色脂肪腫および表在性皮下脂肪腫が挙げられる。グリシンおよび／またはグリシン類似体を、約０．１、０．２、０．５、０．７５、１．０、２．０、２．５、５．０、７．５、１０．０または１５．０ｍｇ／ｍｌ以上の注射可能濃度で使用して、脂肪腫または脂肪肉腫を治療できる。あるいは、グリシンおよび／またはグリシン類似体を、約１５．０、１０．０、７．５、５．０、２．５、２．０、１．０、０．７５、０．５、０．２、０．１ｍｇ／ｍｌ以下または１５から０．１ｍｇ／ｍｌの間の任意の範囲の濃度で使用して、脂肪腫または脂肪肉腫を治療できる。グリシンおよびグリシン類似体は、約０．５、１、２、３、４、５、１０、１５％以上または約０．５％から約１５％の間の任意の範囲の濃度で存在し得る。中性グリシンは、水または任意の医薬上許容される担体の溶液中に存在し得る。グリシンおよび／またはグリシン類似体は、非経口的に、例えば、経皮的に、皮下に、血管内に（例えば、静脈内に）、筋肉内に、腹膜内に、またはくも膜下腔内注射、注入技術によって、または経口的に（上記のように）投与できる。グリシンおよび／またはグリシン類似体はまた、脂肪腫もしくは脂肪肉腫への直接注射によって、または脂肪腫もしくは脂肪肉腫周囲の領域への注射によって投与できる。脂肪腫または脂肪肉腫の治療は、脂肪腫または脂肪肉腫の低減または排除を意味する。
【００５７】
本明細書においてどこかで参照されるすべての特許、特許出願およびその他の科学的または技術的文書は、参照によりその全文が組み込まれる。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下で適宜実施できる。したがって、例えば、本明細書における各例では、用語「含む」、「本質的に、からなる」および「からなる」のいずれも、その元の意味を維持しながら、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。使用された用語および表現は、説明の用語として使用され、制限の用語ではなく、このような用語および表現の使用において、示され、説明される特徴またはその一部の任意の同等物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で種々の改変が可能であることは認識される。したがって、本発明は、実施形態、任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、当業者によって本明細書に開示される概念の改変および変法が用いられ得ることおよびこのような改変および変法は、本文および添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることは理解されるべきである。
【００５８】
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは代替のその他のグループ分けの用語で記載されている場合には、当業者ならば、それによって本発明はまた、マーカッシュグループまたはその他のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位グループの用語でも記載されるということは認識されよう。
【実施例１】
【００５９】
ラットを、無作為に分け、別個にケージに入れ、水を自由に与え、食餌ＴＤ ８０４０６食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を給餌した。食餌組成は、表１に示されている。ＴＤ ８０４０６食は、ラクトアルブミン成分中に存在する約１〜２％グリシンを有し、非補給食と考えられる。
【００６０】
【表１】
【００６１】
成体（１８０日齢）の雄のフィッシャーラットを、各群中、１０匹ラットの処理群で、その食餌中に５％または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。図１参照のこと。動物および食品重量測定値は、示された研究日に得た。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。バーは、示された観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。２０％グリシン食を給餌されたラットは、１４〜３０日間の処理の間、５％グリシン食またはグリシンが補給されていない食餌を給餌されたラットよりも統計的に軽かった。３０日目に、ひとたび、２０％グリシン食を給餌されたラットを非補給食に戻すと、それらは、急速に体重増加し、その体重は、非補給食を給餌されたラットのものと同様となった。研究の３２日目以降の対照と２０％グリシン群の動物の体重間に統計的な相違はなかった。
【００６２】
各処理群から５匹のラットを、無作為に選択し、研究の３０日目に安楽死させた。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は剖検で得た（図２）。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の処理群に関して盲検化された。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。２０％グリシン食を給餌されたラットは、５％グリシン食または非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に少ない腹部脂肪を有していた。
【００６３】
雌の成体（１８０日齢）フィッシャーラットを用いて同じ実験を実施した。得られた結果は、体重減少および腹部脂肪含量の両方に関して、グリシンの効果が、雄においてよりも雌において実際に幾分かより明白であった点を除いて全般的に同様であった（図３および図４）。処理された雌ラットの体重は、回復相の最後までに対照動物のレベルにリバウンドしなかったこと、および腹部脂肪の観察された低減は、雄について観察されたものよりも大きかったということは留意されたいものであった。実験の過程を通じて消費された食品または水の量では、群間で有意な相違は観察されなかった。
【００６４】
飼料消費測定値は、示された研究日に得た。図５参照のこと。これらのデータは、観察された体重減少は、食物摂取の減少によるカロリー制限の結果ではないことを示す。さらに、観察された体重減少は、食餌がボンベ熱量計によって分析され（表２参照のこと）、カロリー含量が有意に異なっていないことが示されたように、食品のカロリー含量の減少の結果ではない。
【００６５】
【表２】
【００６６】
研究下のラットの尾静脈から血液サンプルを採取し、Ｍｕｔｌｉ−Ａｎａｌｙｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ検査のためにＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。これらの試験の結果は、高グリシン食のラットは、その血清トリグリセリド、ＨＤＬおよびコレステロールレベルにおいて統計的に有意な（ｐ≦０．０５）低下を示すことを示した。これらの結果は、グリシンを用いる研究を実施する他者による文献における結果と一致する。Ｈａｆｉｄｉら，Ｇｌｙｃｉｎｅ ｉｎｔａｋｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｐｌａｓｍａ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ， ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ ｓｉｚｅ， ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｓｕｃｒｏｓｅ−ｆｅｄ ｒａｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４年．２８７（６）：Ｒ１３８７−９３；Ａｕｓｔら，Ｔｈｅ ｈｙｐｏｌｉｐａｅｍｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｉｅｔ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｎａｈｒｕｎｇ，１９８０年．２４（７）：６６３〜７１頁；Ｓｕｇｉｙａｍａら，Ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｌｆｕｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｗｉｎｇ ｒａｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ），１９８５年．３１（１）：１２１〜５頁；Ｓｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒら，Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ． Ｐｏｌ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００３． ５５（４）：６０３−１１；Ｐａｒｋら，Ｄｉｅｔａｒｙ ｔａｕｒｉｎｅ ｏｒ ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｅｄ ａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ． Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９年．１９（１２）：１７７７〜１７８９頁；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ， ｃｙｓｔｉｎｅ， ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ−ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ），１９８８年．３４（６）：５６７〜７６頁；Ｏｌｓｏｎら，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｅｔｓ ｕｐｏｎ ｓｅｒｕｍ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｍａｎ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ， １９７０年．２３（１２）：１６１４〜２５頁；Ｒｙｚｈｅｎｋｏｖら，［Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ］． Ｖｏｐｒ Ｍｅｄ Ｋｈｉｍ，１９８４年．３０（２）：７８〜８０頁；Ｙａｇａｓａｋｉら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ， ｃｙｓｔｉｎｅ， ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｍａ−ｂｅａｒｉｎｇ ｒａｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ），１９８６年．３２（６）：６４３〜５１頁；Ｅｍｉら，Ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ （Ｇｌｙ−−−−Ｇｌｕ１８８） ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｐａｒｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９０年．２６５（１０）：５９１０〜６頁参照のこと。白色脂肪細胞（ＷＡＴ）が減少する場合に期待されるように、有意な傾向のあるレプチンレベルの低下が観察された。ＷＡＴが減少している場合に期待されるように、アディポネクチンレベルが、有意な傾向で上がることが観察された。データは、高グリシン食が、これらの肥満症の病原性のバイオマーカーに正の効果をもたらすことを実証した。
【実施例２】
【００６７】
成体の雄のスッカー糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に２０％グリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。ＺＤＦラットは、肥満で、高血圧症で、インスリン抵抗性である。体重測定値は、示された研究日に得た。図６参照のこと。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。バーは、示された観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。２０％グリシン食を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたラットと比較して、研究の１５日目から３６日目の体重において統計的に有意な低下を有していた。やはり、飼料消費には群間に差異が観察されなかった。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は剖検で得た（図７）。２０％グリシン食を給餌されたラットは、５％グリシン食または非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に（ｐ≦０．０５）少ない腹部脂肪を有していた。
【実施例３】
【００６８】
成体の雌のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５、１０、１５または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。図８参照のこと。体重測定値は、示された研究日に得た。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。バーは、示された観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。２０％グリシン食を給餌されたラットの体重は、非補給食を給餌されたラットのものよりも少なかった。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。２０％グリシン食を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたラットと比較して研究の１５日目から３６日目の体重において統計的に有意な低下を有していた。
【実施例４】
【００６９】
成体の雌のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５、１０、１５または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に割り当てた。図９参照のこと。飼料消費測定値は、示された研究日に得た。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。これらのデータは、観察された体重減少は、食物摂取の減少によるカロリー制限の結果ではないことを示す。さらに、観察された体重減少は、食餌がボンベ熱量計によって分析され（表２参照のこと）、カロリー含量が有意に異なっていないことが示されたように、食品のカロリー含量の減少の結果ではない。
【実施例５】
【００７０】
成体の雌のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５、１０、１５または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に割り当てた。各処理群中のラットを研究の３０日目に安楽死させた。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は剖検で得た。図１０参照のこと。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の処理群に関して盲検化された。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。５％〜２０％の示された量のグリシンを含有する食餌を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に少ない腹部脂肪を有していた。
【実施例６】
【００７１】
スプラーグ−ドーリーラット、２４日齢に、１５％グリシンおよび８５％ ＴＤ８０４０６の食餌を給餌した。１５％グリシンおよび８５％ ＴＤ８０４０６を含有する食餌を６週間給餌された動物の剖検で、肉眼的病変または体重以外の処理に関連する異常は報告されなかった。６週間、１００％ ＴＤ８０４０６を給餌された対照動物と１５％グリシンおよび８５％ ＴＤ８０４０６を含有する食餌を給餌された動物間で、血液化学および全血球計算における相違は観察されなかった。高グリシンを補給した食餌を給餌された一動物から採取した組織の病理組織学的検査を実施した。トリミングされ、処理され、包埋され、ミクロトーム処理され、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した組織の鏡検は、脳、肺、肝臓、副腎、腎臓、膀胱、心臓、胃、大腸または小腸について顕著な結果を示さなかった。手短に言えば、正常な組織診断から顕微鏡的変化はなかった。
【実施例７】
【００７２】
成体の雄のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５％または２０％のグリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。研究の２０日目に動物を安楽死させ、剖検で脂肪組織を得た。総タンパク質を脂肪組織から抽出した。高グリシン食を給餌されたラットから得た脂肪組織が、アポトーシスを起こしたことを示すために、対照またはグリシン含有食を給餌された動物の抽出物を、位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力についてアッセイした。図１１Ａおよび１１Ｂに見られるように、データは、（ＷＡＴ）においてチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化において用量依存性減少を明らかに示したのに対し、褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）では、このような減少は観察されず、このことは、高グリシン食が白色脂肪細胞におけるアポトーシスにつながることを示す。図１２および図１３は、同じ動物に由来する肝臓組織（図１２）または筋肉（図１３）の抽出物がアッセイされた場合には、チロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化状態におけるこのような減少がないことが観察されたことを明らかに示す。
【００７３】
データは、チロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化における用量依存性減少を明らかに示し、このことは、高グリシン食が脂肪組織におけるアポトーシスにつながることを示す。
【００７４】
セリン位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力についての組織抽出物のアッセイを、以下のとおりに実施した：１ｍｇの組織抽出物を、ＢＡＤアガロース（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に加えた。反応容量をＲＩＰＡバッファー（抗ホスファターゼおよび抗プロテアーゼを含む）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］５０ｍＭ；ＮＰ−４０ １％；デオキシコール酸Ｎａ ０．２５％；ＮａＣｌ １５０ｍＭ；ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＰＭＳＦ １ｍＭ；Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｒｒｅｓｔ １００μｌ；オルトバナジン酸ナトリウム １ｍＭ；フッ化ナトリウム １ｍＭ）を使用して１ｍｌに調整し、３０℃で０．５時間インキュベートした。遠心分離（１２，０００×ｇで５秒）によってアガロースビーズを集めた。上清を除去し、ビーズを洗浄し、氷冷ＴＢＳで３回洗浄した。ＢＡＤ−アガロースを４０μｌのサンプルバッファーに再懸濁し、５分間沸騰させ、遠心分離した（１２，０００×ｇで５分）。７マイクロリットルのサンプルを、１５％ゲル（Ｔｒｉｓ−グリシン）で電気泳動した。ウエスタンブロッティングによってタンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、ＴＴＢＳ中、５％ ＮＦＭを用い、４℃で振盪しながらブロッキングした。ＴＴＢＳ中、２％ ＮＦＭを用いてメンブレンを洗浄した。（２％ ＮＦＭ／ＴＴＢＳ中、１：１０００）でウサギ抗ホスホＢＡＤ １３６抗体を用いて各レーンを、室温で２時間ブロッティングした。ブロットをＴＴＢＳを用いて５分間３回洗浄した。ブロットを、ヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ（２％ ＮＦＭ／ＴＴＢＳ中、１：５０００）とともにインキュベートした。ブロットをＴＴＢＳを用いて５分間３回洗浄し、ＴＢＳを用いて５分間２回洗浄した。リン酸化ＢＡＤの可視化は、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商標））を用いて達成した。
【００７５】
本発明者らは、グリシンが観察された生物学的効果を誘発する作用機序をさらに解明するために、ゲル電気泳動における２Ｄ−ディファレンシャル（２Ｄ−ＤＩＧＥ）を使用した。２Ｄ−ＤＩＧＥは、異なっている生物学的状態からの組織のプロテオームにおける発現の相違の迅速な評価を可能にする強力な方法である。Ｐａｔｔｏｎ， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２００２年．７７１（１−２）：３〜３１頁；Ｕｎｌｕら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ： ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９７．１８（１１）：２０７１〜７頁；Ｖｏｎ Ｅｇｇｅｌｉｎｇら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｕｒ ２Ｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２００１年．８（４）：３７３〜７頁参照のこと。
【００７６】
対照（図１４）および２０％グリシン処理（図１５）から得た組織から抽出したタンパク質の二重標識実験の予備的結果を、未来の２Ｄ−ＤＩＧＥ実験を受けるための調製物において得た。対照動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質が、図１４に示されている。図１５は、食餌中２０％グリシンで処理された動物の脂肪組織から得たＣｙ５フルオロフォアで標識された得られたタンパク質を用いて得られた結果を示す。黄色の円は、目視検査によって識別可能なものとしての、対照に対するダウンレギュレーションを示し、赤い円は、アップレギュレーションを示す。
【００７７】
対照食または２０重量％グリシンを補給した食餌のいずれかを給餌した雌のスプラーグ−ドーリーラットから得た脂肪組織の２Ｄ−ＤＩＧＥ分析。組織サンプルは、７Ｘ１１０ ｍｉｎｉ−Ｔｉｐ Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ Ｐｒｏｂｅｓが取り付けられたＰｏｗｅｒＧｅｎ １２５モデルＦＴＨ１１５ホモジナイザーを使用して氷上でホモジナイズし、Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ （ＴＰＥ）キット（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、９２−Ｗｅｌｄｏｎ Ｐａｒｋｗａｙ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３０４３−９９８９ Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用し、キットに同梱されているプロトコールに従ってタンパク質を抽出した。すべてのバッファーは、使用の前の抽出および保存の間のタンパク質分解を最小にするためにＰｒｏｔｅａｓｅ Ａｒｒｅｓｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、９２−Ｗｅｌｄｏｎ Ｐａｒｋｗａｙ、 Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３０４３−９９８９ Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含有していた。Ｂｉｏ Ｒａｄ ２Ｄ精製キット（カタログ番号１６３−２１３０）を使用して、抽出されたタンパク質を沈殿させ、Ｃｙ標識バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、４％ ＣＨＡＰＳ、８Ｍ 尿素）に再懸濁した。対照動物および処理された動物から得た等量のタンパク質（５０μｇ）を、ＤＭＦで希釈した４００ｐｍｏｌのＣｙ３またはＣｙ５フルオロフォアを用い、製造業者の仕様書にしたがって各々標識した。標識反応は、氷上、暗所で３０分間実施し、１ｍＭリシンの添加によってクエンチした。標識されたタンパク質の２つの集団をＢｉｏｌｙｔｅ両性電解質（Ｂｉｏ Ｒａｄカタログ番号１６３−１１１２）および再水和バッファー（Ｂｉｏ Ｒａｄカタログ番号１６３−２０８３）と混合した。次いで、混合物を、再水和ＩＰＧストリップ（Ｂｉｏ Ｒａｄカタログ番号１６３−２０９９）上に、室温で一晩ロードした。再水和ＩＰＧストリップ中のタンパク質をＢｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＥＦゲル装置で集め、Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅａｎ Ｓｌａｂゲル装置で製造業者の使用説明書に従って二次元に流した。ゲル中のＣｙ３およびＣｙ５標識されたタンパク質の可視化を、ＫＯＤＡＫ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ２０００ＭＭを使用し、それぞれ、５３５および６２０ｎｍ励起ならびに６００および６７０ｎｍ発光フィルターを使用して行った。
【実施例８】
【００７８】
血液および組織（脂肪の）中のグリシンの濃度の正確な測定のための高感度アッセイ
脂肪組織量の低減に関するグリシンの薬物動態および薬力学モデルの開発には、投与されるグリシンの濃度の測定のための正確な方法が必要である。方法は、内因性グリシンを除く、投与されたグリシンの吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、分布、代謝および排泄（ＡＤＭＥ）をたどることができることが理想的である。さらに、開発される方法は、グリシン類似体を用いる将来の研究に適用するために容易に改変され得るべきである。ＬＣ／ＭＳ法はこの目的のために使用できる。このアプローチによって、研究におけるＣ１３−グリシンの利用が可能となり、これは、投薬されたＣ１３−グリシンおよび内因性グリシンのＡＤＭＥの同時決定を可能にする。
【００７９】
手短には、方法論は、ＬＣ／ＭＳによる分析の前の、タンパク質および核酸夾雑物が、酸沈殿によって除去されるサンプル精製ステップからなる。各研究の開始に先立って、サンプルマトリックス（すなわち、未処理動物から得た血漿または透析された組織抽出物）中に既知量のグリシン／Ｃ１３−グリシンを含有するＱＣサンプルを調製する。褐色の１．５ｍｌ微量遠心管中の１００μｌの血漿サンプルに、１％メタリン酸を含有する１００μｌの氷冷１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過塩素酸を添加することによって、サンプルの酸沈殿を達成し、これを氷上で１０分間インキュベートし、その後、４℃、１２，０００×ｇでで５分間遠心分離する。次いで、得られた上清を０．２μｍフィルターを通して濾過し、Ｓａｖａｎｔ ＳＣ１１０ Ｓｐｅｅｄｖａｃ（または等価物）で真空乾燥させる。研究サンプルおよびＱＣサンプルは、分析に付されるまで−８０℃で保存する。分析に先立って、サンプルを、室温に加温し、５０μｌの脱イオン化ＬＣ／ＭＳ等級の水（ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２Ｏ）で再構成し、ガラス自動注入装置バイアルに移し、次いで、Ｍｉｃｒｏ ＡＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）自動注入装置にロードする。２０μｌの各サンプルを、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）供給源を介してＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰ イオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）と接続されたＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｐｌｕｓ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）で５０×２．１ｍｍ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（商標）カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に注入する。クロマトグラフィーによる分離は、１０分で、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、２０ｍＭペルフルオロペンタン酸からＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、１５％アセトニトリル、次いで、さらに１０分でＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、２６％アセトニトリル、次いで、１０分で、最終ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、５０％アセトニトリルの勾配を流すことによって達成される。条件を、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、最終５０％アセトニトリルおよび２０ｍＭペルフルオロペンタン酸で１０分間維持し、続いて、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、１００％の２０ｍＭペルフルオロペンタン酸に５分間戻し、その後、次の注入とする。
【００８０】
図１６は、グリシンの定量において使用するための代表的なクロマトグラムおよび標準曲線を示す。データは、カラム上にロードされた２４種の一般的なアミノ酸を含有していた既知標準ならびにグリシン、プロリン、フェニルアラニン、リシンおよびロイシンの選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を使用して得た。結果は、アッセイが、提案された研究においてその意図される目的にとって必要な感度を有することを明らかに示す。アッセイは、Ｃ１３−グリシンを用いて、さらに正確にされ、確認され得る。
【実施例９】
【００８１】
高用量グリシンの単回用量薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティ
以下の実験計画を使用して、グリシンの薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティを決定できる。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した、外科的に埋め込まれた頚静脈カテーテルを有し、２００〜２２５ｇの間の体重の成体（１８０日齢）スプラーグ−ドーリーラットを使用できる。１８匹のラットを、６匹のラット（３匹の雄３匹の雌）の３群に無作為に分け、３つの投与量群の各々：高（５ｍｇ／ｋｇ）、中（２．５ｍｇ／ｋｇ）および低（０．２５ｍｇ／ｋｇ）に無作為に割り当てる。２０重量％のグリシンを含有する食餌を給餌された雄のＺＤＦラットから、２４時間の絶食後に剖検で得た血漿サンプルの予備的分析は、１６．９μｇ／ｍＬレベルのグリシンを示した。実際の定常状態レベルのグリシンは、動物が絶食している前は、恐らくはかなり高かった。本発明者らが選択した用量は、約１５０μｇ／ｍ、高用量群、７５μｇ／ｍ、中用量群、および７．５μｇ／ｍ、低用量群のピーク血漿レベルをもたらすはずである。グリシンは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に溶解し、まず、ＩＶボーラスによって投与する。以下の時点、Ｔ＝０分、Ｔ＝０．５分、Ｔ＝１分、Ｔ＝５分、Ｔ＝１５分、Ｔ＝３０分、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、Ｔ＝４時間、Ｔ＝８時間、Ｔ＝６時間、Ｔ＝２４時間およＴ＝４時間で、血漿サンプル（０．１ｍｌ）を、クエン酸塩を含有するライトブルーのふたのバキュテナーチューブ（ＢＤ３６３０８０番）中に採取する。各時点で集められた分離された血漿を、液体窒素中で急速凍結し、分析されるまで−８０℃で保存する。動物は、７日間回復させ、再度秤量し、次いで、経口胃管栄養法による高、中および低投与量のグリシンで処理する。以下の時点Ｔ＝０分、Ｔ＝３０分、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、Ｔ＝４時間、Ｔ＝６時間、Ｔ＝８時間、Ｔ＝１６時間、Ｔ＝２４時間、Ｔ＝４８時間、Ｔ＝７２時間およびＴ＝９６時間で、血漿サンプル、０．１ｍｌを、ＩＶボーラス投与について先に記載されるように、ライトブルーのふたのバキュテナー中に採取する。各時点で集められた分離された血漿を、液体窒素中で急速凍結し、分析されるまで−８０℃で保存する。データを、薬物動態分析のためのＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン４．１ソフトウェアを使用して分析する。これらの実験から得られた薬物動態モデルを使用して、その後の実験において使用される複数の投与計画を設計する。さらに、このモデルは、さらなる開発のための類似体の選択において使用するためのベースモデルとして役立つ。
【実施例１０】
【００８２】
グリシンの複数回用量薬物動態学
本研究者らの予備的研究では、グリシンを、試験動物の正常食の一部として経口的に投与した。この投与方法は、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導に関する、グリシンの作用の薬力学モデルを構築するのに必要な投薬の正確度および再現性を提供しなかった。本発明者らは、この研究に取り掛かるために、本研究者らが、観察される薬理学的効果（すなわち、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導）を正確に熟考するのを可能にする投与計画を開発しなくてはならない。高用量グリシンの単回用量薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティを規定するために本発明者らの研究において得られた薬物動態パラメータを使用して、高用量グリシンの複数回投与計画設計する。開発される計画を使用して、食餌中、２０重量％、１０重量％および５重量％グリシンからなる食餌を給餌された動物において観察されるものの±１０％に等しいレベルで試験動物の血液中のレベルでグリシンを維持する。各投与群中の動物の数およびサンプルのタイミングについての詳細な記載は、薬物動態パラメータおよび先の単回用量研究から確認されたパラメータの変動性に基づいて決定する。しかし、本発明者らは、研究デザインは、計画を検証するのに投与群あたり１０匹（５匹の雄、５匹の雌）未満の動物しか必要でないと見込んでいる。本発明者らは、投与計画の設計においてＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）のシミュレーション機能を使用して、計画を検証するために使用されるデータを得るためにサンプリングする時点を開発する。
【００８３】
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアは、投与スケジュールを検証するための複数回投与スケジュールおよびサンプリングスキームの設計においてシミュレーションを利用するための優れたツールセットを提供する。Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ ＳｔａｔＭａｔｅバージョン２．００を使用して、各投与群中の動物の数が、統計的妥当性を実証するための適切な検出力を達成するために必要とされるものであることを確認する。統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔバージョン３．０６ ３２ビットを使用して実施する。投与計画は、血液中のグリシンのＰＫパラメータおよび循環レベルが、統計的に有意な方法で、実験的に得られたものと異ならないと示される場合に妥当であると考えられる。
【００８４】
研究動物は、研究の最後に安楽死させ、剖検を実施する。脂肪組織におけるｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、抗ＢＡＤ ｓｅｒ−１３６抗体を用いる免疫沈降およびウエスタンブロット解析または親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析のいずれかによって決定する。Ｐａｐａｃ ＆ Ｓｈａｈｒｏｋｈ， Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００１年．１８（２）：１３１〜４５頁；Ｃｒｅａｓｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，１９９８年．７９４（１−２）：３７〜４３頁；Ｇａｌｌｏら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ａｆｔｅｒ ａｌｆａ−１−ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２００５年．１９（４）：５７４〜９頁参照のこと。脂肪組織はまた、活性なアポトーシスのマーカーとしてのＴＵＮＥＬタンパク質の免疫組織化学的染色に付す。Ｐａｖｌｏｖｓｋｙ ＆ Ｖａｇｕｎｄａ， ［Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−−ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ］． Ｃｅｓｋ Ｐａｔｏｌ，２００３年．３９（１）：６〜１０頁；Ｈｅａｔｗｏｌｅ， Ｖ．Ｍ．， ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９年．１１５：１４１〜８頁；Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ ＆ Ｌａｓｓｍａｎｎ， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ． Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ，２０００年．３０１（１）：１９〜３１頁参照のこと。
【００８５】
主要な臓器も摘出し、毒性の任意の顕在的な兆候について観察し、毒性の任意の顕在的な兆候が見られる場合には、さらなる分析のために保存する。
【実施例１１】
【００８６】
グリシンの、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導による体重減少を誘発するその能力に関する、連結ＰＫ／ＰＤ（薬物動態／薬力学モデル）。
薬動力学とは、作用部位での薬物濃度と、その相互作用に影響を及ぼす生化学的作用および生理学的効果をはじめとする薬理反応の間の関係を指す。Ｓｈａｒｇｅｌ ＆ Ｙｕ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．第４版 １９９９年， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ． ５７３〜６０５頁参照のこと。
【００８７】
薬力学モデルの形態は、薬物がその薬理作用を行使する機序に応じて変わる。したがって、このモデルにおいて得られる情報は、グリシンが脂肪組織においてその生物学的効果を誘発する方法に関して有用な情報を提供する。本発明者らの予備的研究では、本発明者らは、高グリシン食は、ｓｅｒ−１３６で脱リン酸化された状態にあるＢＡＤをもたらすと示した。本発明者らは、ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、本発明者らの薬力学モデリングのアポトーシスのマーカーとして使用することを提案する。本発明者らは、グリシン作用の、ＢＡＤのリン酸化状態に対するその効果に関するＰＫ／ＰＤ連結モデルを構築する。ＰＫ／ＰＤ連結モデルは、固定された薬物動態パラメータを仮定して、ＰＤモデルによって使用される作用部位での薬物の局所濃度をモデリングする。Ｊｕｓｋｏ， Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ： ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ａ ｂｒｏａｄ ａｒｒａｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９０年．３０（４）：３０３〜１０頁；Ｄａｙｎｅｋａら， Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｂａｓｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍ，１９９３年．２１（４）：４５７〜７８頁。本発明者らは、単回用量および複数回用量研究から導かれた薬物動態モデルを使用して、ＰＫ／ＰＤ連結モデルの固定ＰＫパラメータを供給する。白色脂肪細胞（ＷＡＴ）の生体外器官培養を使用して、ＰＫ／ＰＤ連結モデルのＰＤ部分をモデリングする。ＷＡＴの生体外培養を確立するための方法および手順は、十分に記載されている。Ｍｏｕｓｔａｉｄ−Ｍｏｕｓｓａ ＆ Ｆｒｉｅｄ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ， ｉｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇ． Ａｉｌｈａｕｄ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．：Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ． １９７〜２１３頁；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら， Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ，１９７８年．２７３（５６６１）：３９４〜６ｌ頁；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｒａｔ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｉｅｃｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｒｃｏａｌ−ｔｒｅａｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，１９８２年．２３（２）：３６０〜３頁；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，１９７９年．２０（７）：８４８〜５６頁；Ｍａｌｏｆｆら，Ｄｉｒｅｃｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８０年．１０７（２）：５３８〜４４頁参照のこと。器官培養は、ＷＡＴの複雑な生化学をより十分に反映し、ｉｎ ｖｉｖｏ状態をより反映する濃度対効果のＰＤモデルをもたらすので、これらの実験では、ＷＡＴ器官培養を、単離された脂肪細胞に対立するものとしてとして使用する。Ｐａｐａｃ ＆ Ｓｈａｈｒｏｋｈ， Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００１年．１８（２）：１３１〜４５頁．
【００８８】
手短には、２００〜２２５ｇの体重の３匹の雄および３匹の雌のスプラーグ−ドーリーラットの各々から、後腹膜、鼠径部および生殖腺脂肪パッドの外科的切除によって安楽死の１０分以内にＷＡＴを得る。各動物から約１２〜１５ｇｍのＷＡＴが得られる。同じ性別の動物に由来するＷＡＴを合わせ、粗く分割して、滅菌、室温Ｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給した重炭酸緩衝された液体）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するコニカルプラスチック遠心分離管に入れる（チューブあたり３ｇ）。材料のすべてのさらなる処理は、Ｆｒｉｅｄ ａｎｄ Ｍｏｕｓｔａｉｄ−Ｍｏｕｓｓａ （Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ， ｉｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇ． Ａｉｌｈａｕｄ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ．１９７〜２１３頁）によって記載されるように層流フード中で無菌で実施する。ＷＡＴを、よく切れるはさみを使用して５〜１０ｍｇの断片にさらに分割する。組織を、細かく分割すれば、ＲＴで最大１時間とどめてもよい（その他のチューブの組織が分割されている間）。組織は、現段階ではその代謝速度の増大を避けるために、３７℃に置かない。次いで、各チューブの内容物を、約５００ｍＬのビンの上部に置かれる、ナイロンメッシュ（漏斗に取り付けられた）を通して注ぐことによってＷＡＴ器官培養物を洗浄して脂肪小滴および血液を除く。これに、漏斗上の組織の上からの少なくとも３００ｍＬの３７℃の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の洗浄を続ける。洗浄された組織を、無菌の風袋を測られたペトリ皿中に入れ、ピンセットで大きな血餅はいずれも除去する。ＷＡＴ器官培養物を含有する風袋を測られたペトリ皿を、無菌性を維持するために密閉し次いで、秤量する。次いで、ピンセットまたは穴の開いたスプーンを使用して、ＷＡＴを６ウェルの組織培養プレート中に等分に入れる（約０．５ｇ湿重量／ウェル）。次いで、新鮮なＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給した重炭酸緩衝された液体）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを直ちに加え、５％ ＣＯ２-９５％空気の雰囲気下、加湿された、３７℃のインキュベーター中で４８時間培養物を維持して、汚染がないことおよび無菌性を確実にする。
【００８９】
上記のように調製された、雄および雌のスプラーグ−ドーリーラットに由来するＷＡＴ器官培養物を含有する３連のウェルを、新鮮なＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給した重炭酸緩衝された液体）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンで３回洗浄する。以下の濃度のグリシンを補給した新鮮なＭ１９９培地の添加によって実験を開始する。対照ウェルには、グリシンが添加されていない新鮮培地を与え、実験ウェルには、複数回用量ＰＫ研究の最高用量群の血液中のグリシンの循環レベルの２倍に匹敵する最高濃度で、５つの等間隔の濃度でグリシンを補給したＭ１９９培地を与える。培地は、３日間の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳを用いて５回洗浄する。先に記載されるＬＣ／ＭＳ法によるグリシンの定量のためにサンプルを調製する。
【実施例１２】
【００９０】
グリシンの生物活性類似体のスクリーニングのための迅速な生化学アッセイ
高レベル（２０重量％）の食餌性グリシンは、大幅な体重減少をもたらす。この体重減少は、グリシンの、ＷＡＴにおいてアポトーシスを誘発する能力の結果であり得る。これは、処理された動物のＷＡＴから得たタンパク質抽出物が、セリン位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力を有さなかったことを示す予備的データに基づく（図１１、１２および１３）。Ｍａｓｔｅｒｓら，１４−３−３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｂａｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉｎｅ−１３６． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１年．６０（６）：１３２５〜３１頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｐｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｐ ｏｎ ａｋｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００４年．２２（２０）：４２１７〜２６頁参照のこと。
【００９１】
体重減少が起こる機序は、解明されないままである。本発明者らは、グリシンは、ＢＡＤのリン酸化状態の調節によってＷＡＴに対して直接的な生化学的効果を有し、アポトーシスの誘導につながると考えている。これは、本発明者らの予備的実験における、ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのこのような脱リン酸化がないことがＢＡＴで観察された、またはＢＡＴ組織の大幅な減少は起こらなかったという観察結果に基づいている。さらに、本発明者らは、脂肪細胞に分化される３Ｔ３−Ｌ１細胞の培地中の高濃度のグリシンが、非処理細胞と比較すると、ＴＵＮＥＬの染色の増大を示したことを観察した。Ｈｅａｔｗｏｌｅ， ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９年．１１５：１４１〜８頁参照のこと。この実施例の目的は、グリシンの生物活性類似体をスクリーニングするために使用できる迅速な生物検定法を開発することである。
【００９２】
本発明者らは、雌のスプラーグ−ドーリーラットは、食餌中の高グリシンの作用に対して特に感受性が高く、迅速な大幅な体重減少を受けることを見い出した。したがって、雌のスプラーグ−ドーリーラットにおける大幅な体重減少を使用して、グリシンの類似体の活性をスクリーニングすることが可能であろう。しかし、このアッセイは、時間がかかり、大規模な類似体の合成を必要とし、多数の化合物のスクリーニングにとって効率的ではないであろう。本発明者らは、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞株およびｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態の測定を使用する迅速な生物学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を開発することを提案する。Ｇａｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｏｄｅｎｔｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１９８４年．２０（２）：７９〜８８頁。
【００９３】
このようなアッセイが確信を持って使用されるために、本発明者らは、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪細胞と同様に高グリシンレベルに応答することを示す。以下の実験は、この目的のために、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＳｅｒ １３６でのＢＡＤの脱リン酸化を使用することの有用性および妥当性を実証することを目的とする。
【００９４】
ＷＡＴに由来する脂肪細胞は、ＷＡＴの器官培養について先に記載される精製方法の改変によって得る。手短には、ＷＡＴを先に記載されるように単離し、単離された脂肪細胞および間質−血管画分を得るために以下のさらなるステップに付す。単離された脂肪細胞および間質画分は、刻まれたＷＡＴを、Ｍ１９９培地中、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＩ型コラゲナーゼを用いる３７℃で６０分間の消化に付すことによって得る。次いで、コラゲナーゼ処理された組織を、滅菌ナイロンフィルター（３５０μｍメッシュ）を通して濾過し、滅菌遠心分離管に入れる。この懸濁液を、５００×ｇで１分間遠心分離すると、その結果、脂肪細胞含有画分から間質−血管画分（ペレット）が分離される。それぞれの細胞画分を、ハンクス緩衝塩溶液でさらに３回洗浄する。次いで、それぞれの脂肪細胞および間質−血管画分をカウントし、新鮮なＭ１９９培地で希釈し、６ウェル培養プレートのウェルに入れる。細胞を、５％ ＣＯ２-９５％空気の雰囲気下、３７℃のインキュベーター中で一晩インキュベートする。生存力および汚染がないことを確実にするために細胞を観察し、培地中の、以下の漸増濃度のグリシンを補給した新鮮なＭ１９９培地の添加によって実験を開始する。対照ウェルには、グリシンが添加されていない新鮮培地を与え、実験ウェルには、ＰＤ実験に使用したグリシンの同一濃度でグリシンを補給したＭ１９９培地を与える。培地は、３日間の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳを用いて５回洗浄する。細胞を、低張バッファーに曝露することによって溶解し、遠心分離によって清澄化し、溶解物のアリコートを液体窒素中で即時凍結し、使用まで−８０℃で保存する。サンプルの細胞内グリシン含量を、ＬＣ／ＭＳ法によって調べる。Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、ＢＡＤ−Ｓｅｒ １３６に対するＥＬＩＳＡを使用して、または親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析によってのいずれかで調べる。各サンプル条件の３連のウェルを置き、活性アポトーシスを実証するためにＴＵＮＥＬの免疫組織化学的染色を実施する。本発明者らは、以下の実験は、グリシンが、ＷＡＴに由来する脂肪細胞に直接的に作用するという決定的な証拠を提供すると考えている。
【実施例１３】
【００９５】
グリシンは、ＢＡＤの脱リン酸化およびアポトーシスを誘導するよう、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞に対して作用する。
標準法によって、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、培養で増殖させ、脂肪細胞に分化させる。Ｎｅｇｒｅｌ ＆ Ｄａｎｉ， Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｃｌｏｎａｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｎｉｍａｌ Ｗｈｉｔｅ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ， ｉｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇ． Ａｉｌｈａｕｄ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ．２２５〜２２７頁参照のこと。実験の開始に先立って、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をトリプシン処理し、ｄＤＭＥＭ［３．７ｇ／Ｌ重炭酸Ｎａ、３３μＭビオチン、１７μＭ パントテン酸塩、抗生物質（６２ｍｇ／Ｌ ペニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシンまたは１０ｍｇ／Ｌ テトラサイクリン）、１７ｎＭ インスリンおよび２ｎＭ Ｔ３および１０％ ＦＢＳを補給した、１ｇ／Ｌ グルコースおよび１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸Ｎａを含有する］で５回洗浄する。細胞を、８．５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で６ウェル培養プレートのウェルに入れる。生存力、および汚染がないことを確実にするために、細胞を観察し、培地中に、以下の漸増濃度のグリシンを補給した新鮮なｄＤＭＥＭ培地の添加によって実験を開始する。対照ウェルには、さらなるグリシンが添加されていない新鮮培地を与え、実験ウェルには、ＰＤ実験に使用したグリシンの同一濃度でグリシンを補給したｄＤＭＥＭ培地を与える。培地は、３日間の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳを用いて５回洗浄する。細胞を、低張バッファーに曝露することによって溶解し、遠心分離によって清澄化し、溶解物のアリコートを液体窒素中で即時凍結し、使用まで−８０℃で保存する。サンプルの細胞内グリシン含量を、ＬＣ／ＭＳ法によって調べる。Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、ＢＡＤ−Ｓｅｒ １３６に対するＥＬＩＳＡを使用して、または親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析によってのいずれかで調べる。予備的実験は、血液中の正常な循環レベルの２倍に匹敵する培地中の濃度のグリシンは、陽性ＴＵＮＥＬ染色によって明らかなように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にアポトーシスを引き起こさせることを示す。各サンプル条件の３連のウェルを置き、活性アポトーシスを実証するためにＴＵＮＥＬの免疫組織化学的染色を実施する。
【実施例１４】
【００９６】
グリシン処理が、ＷＡＴおよび分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞において同等な生物学的応答を誘発することを確認するための２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ（同位体標識親和性タグ）分析。
２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ分析を使用して、グリシン処理で誘発される異なって発現されるタンパク質のパターンが、グリシン処理されたＷＡＴタンパク質抽出物において見られるパターンと同様であることを示すことによって、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に由来する脂肪細胞の有用性をさらに検証する。Ｐａｔｔｏｎら， Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ａ ｐｏｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ＩＣＡＴ？ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２年． １３（４）：３２１〜８頁参照のこと。
【００９７】
手短には、ＷＡＴおよび３Ｔ３−Ｌ１由来脂肪細胞を、先に記載されるように得る。対照および実験ウェルにおけるグリシンの濃度を、上記のように処理する。分析のためのサンプルを、先に記載されるように調製し、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞およびＷＡＴ由来脂肪細胞が、グリシン処理に対して生物学的に同等に応答することを実証するために、等量のサンプルを２Ｄ−ゲルによる分析およびＩＣＡＴ分析に付す。ＩＣＡＴによる分析は、グリシンがＷＡＴに由来する脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する作用機序を解明するための出発点を提供し得る。ＩＣＡＴは、グリシンおよび処理された細胞間で異なるタンパク質を数量化できる方法で同定できる強力な方法である。ＩＣＡＴ法は、図１７において図式的に提示されている。
【実施例１５】
【００９８】
グリシンの構造的類似体のライブラリーの合成および３Ｔ３−脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する能力についての化合物のプレスクリーニング。
グリシンは、容易に入手可能な、非毒性のアミノ酸である。グリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せは、ＷＡＴにおけるアポトーシスの誘導によって体重減少を誘発するはずである。以下の一連のグリシン類似体を合成できる：
【００９９】
【化７】
【０１００】
式Ｉのシリーズは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【０１０１】
【化８】
【０１０２】
ジメチルアミンなどの種々のジアルキルアミンをクロロメタンスルホン酸で処理することによって、上記のスキーム中で提案されるアミノスルホン酸類似体を合成する。式ＩＩのシリーズは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【０１０３】
【化９】
【０１０４】
上記で示される類似体は、還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを使用して還元条件下で、ジアルキルアミンまたは第一級アミンを、オキソ−酢酸メチルエステルで処理することによって合成する。生成物を、クロマトグラフィーによって精製する。式ＩＩＩは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【０１０５】
【化１０】
【０１０６】
Ｎ（アルキル）またはＮ，Ｎ−ジアルキルグリシンの遊離カルボキシ末端を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で、アミンを用いてアミド化する。すべての場合において、生成物は、クロマトグラフィーによって精製する。同一性、純度および量は、必要に応じて、質量分析、ＮＭＲ、分析的液体クロマトグラフィーおよび任意のその他の分析的方法によって確認する。
【０１０７】
合成された類似体は、Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤの脱リン酸化を促進するその能力についての第１のスクリーニングに付す。類似体を、グリシンを補給していない対照ならびに同じ濃度および既知有効濃度の培地中のグリシンの陽性対照と同一濃度でスクリーニングする。すべてのアッセイは、３連で実施する。すべての可能性ある陽性類似体を、反復スクリーニングに付す。その化学特性を確認するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において同定された陽性化合物の第２のスクリーニングによって、ｉｎ ｖｉｖｏ試験のための良好な薬物候補となる。
【０１０８】
一実施例では、成体（１８０日齢）雄のフィッシャーラットを、各群中３匹のラットの処理群中で、その餌中に０．１％、０．２５％、０．５％、２％、３．５％または５％アミノメタンスルホン酸（「ＡＭＳ」）を含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。水および飼料消費および動物の体重の測定値は、２６日の研究を通じて得た。非補給食を消費するラットは、２６日の研究の過程にわたって６．６％の体重増加を示したが、３．５％ ＡＭＳ食を給餌されたラットは、統計的に軽く、０．６％の平均体重増加を示し、５％ ＡＭＳ食を給餌されたラットは、そのベースライン体重から２．８％の減少を有していた。群間で、実験の過程を通じて消費された食物または水の量においては有意な相違は観察されなかった。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は、剖検で得た。体脂肪の低下％は、ＡＭＳが補給された食餌を用いて観察され、この低下は、食餌中のＡＭＳの量と直接的に関連している。３．５％または５％ ＡＭＳ食を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に（ｐ≦０．０５）少ない腹部脂肪を有していた。対照群の平均体脂肪％は３．６２％であったのに対し、３．５％および５％ ＡＭＳ群の平均体脂肪％は、それぞれ１．５９％および１．１２％であった。
【実施例１６】
【０１０９】
幼若動物
図１８および１９はそれぞれ、幼若の雌のスプラーグ−ドーリーラットの食餌へのグリシンの添加が、体重増加および成長における用量依存性低減をもたらしたことを示す。グリシンを補給した食餌で４週間処理された動物を、グリシン補給を含有しない食餌に切り替えた（図１８および１９、１０％から０％）。このことは、急速な成長および体重増加をもたらし、その結果、１ヶ月以内に、それらは、群１中の対照動物と同様の大きさおよび体重であった。図２０および２１はそれぞれ、幼若の雄のスプラーグ−ドーリーラットの食餌へのグリシンの添加が、体重増加および成長における用量依存性低減をもたらしたことを示す。グリシンを補給した食餌で４週間処理された動物を、グリシン補給を含有しない食餌に切り替えた（図２０および２１、１０％から０％）。このことは、急速な成長および体重増加をもたらし、その結果、１ヶ月以内に、それらは、群１中の対照動物と同様の大きさおよび体重であった。
【０１１０】
以下の先見的実施例は、本発明を例示するために提供する。しかし、本発明の趣旨および範囲は、特定の条件または本実施例において詳細に記載されるものに制限されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ制限されるべきであるということは理解されるべできある。
【実施例１７】
【０１１１】
動物における脂肪腫または脂肪肉腫の治療
公知の技術（例えば、医学の専門家による診断）を使用して、脂肪腫または脂肪肉腫の治療を必要とする動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）を同定できる。グリシンおよび／またはグリシン類似体の治療上有効な量は、非経口的に、例えば、経皮的に、皮下に、血管内に（例えば、静脈内に）、筋肉内に、腹膜内に、またはくも膜下腔内注射、注入技術によって、または経口的に投与してよい。
【０１１２】
治療計画の間、周期的に、動物を、脂肪腫または脂肪肉腫の兆候および症状についてモニタリングする。治療期間が終わった後、やはり公知の技術を使用して、動物は、減少した脂肪腫または脂肪肉腫の兆候および症状を有すると、かつ／または、脂肪腫もしくは脂肪肉腫のための治療をもはや必要としない、または低減した治療を必要とすると見られる。脂肪腫または脂肪肉腫の大きさは、約５、１０、２５、５０、７５もしくは１００％または約５％と１００％の間のいずれかの範囲、低減される。
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２００９年２月１９日に出願された米国特許出願第６１／１５３７９８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、成人の６０％が、体重過多または臨床的に肥満とみなされるための臨床的要件を満たし、毎年３００，０００人の死亡につながると推測されている。Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら，Ｕｒｂａｎ ａｎｄ ｒｕｒａｌ ｈｅａｌｔｈ ｃｈａｒｔｂｏｏｋ．２００１年，Ｈｅａｌｔｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｈｙａｔｔｓｖｉｌｌｅ（ＭＤ）：ＮＣＨＳ．２９６頁；Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ． ２００１年参照のこと。２００１年に、米国の公衆衛生局長官が、体重過多または臨床的に肥満である個人の罹患率および有病率を防ぎ、低減するための呼びかけを公表した。Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅａｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年。興味深いことに、このレポートには、問題に対する薬剤アプローチの適用または使用については何も書かれていない。しかし、産業的研究機関および学術的研究機関の両方によって、薬剤アプローチの開発は相当注目されている。薬剤アプローチは、適用および使用が恐らくは容易であるために、より高いコンプライアンスの可能性が高いので魅力的である。
【０００３】
世界中からの疫学的研究によって、死亡率と肥満症の間の論争の余地のない相関が実証されている。感染症、心臓病、糖尿病および特定の癌の予防および制御に関する健康目標の達成において過去５０年にわたって成し遂げられた進歩は、肥満症の広がりつつある蔓延によって一掃されてしまった。２００１年には、小児および１０代の若者の約２５％が体重過多であり、ちょうど２０年前から２倍を超えるパーセンテージである。現在、成人の６０％をはるかに上回る人が、体重過多または肥満であるとわかっており、米国単独で、年に３００，０００人を上回る死亡が、これらの状態に直接的に起因し得る。これらの知見は、すべての人種、年齢、民族および両方の性別に広く及ぶが、特定の群、特に、少数民族および下層階級が、他のものよりもより傾向があることは明らかである。Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年．
【０００４】
肥満度指数として定義される体重過多（２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩ）および肥満症（ＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２）は、早死に、２型糖尿病、心臓病、卒中、高血圧症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、喘息、種々の呼吸器障害、特定の癌、高い血中コレステロール値、妊娠合併症、手術危険度の増大、精神的疾患および列挙するには多すぎるその他の病状と相関していた。Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ’ｓ ｃａｌｌ ｔｏ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｖｅｒｗｅｉｇｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：２００１年，Ｒ．Ｍ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年；ＮＨＬＢＩ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ，Ｎ． ＮＩＨ， Ｅｄｉｔｏｒ． １９９８年， ＨＨＳ， ＰＨＳ．２９〜４１頁．肥満の個体は、正常範囲のＢＭＩ（２０〜２５ｋｇ／ｍ２）を有する人と比較して、これらの原因のすべてから、５０〜１００％増大した早死にの危険を有する。適度な体重減少（過剰な全体重の５〜１５％）でさえ、これらの疾患の少なくともいくつかの、特に、心臓病の危険因子を短期間低減する。ＮＨＬＢＩ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ， Ｎ． ＮＩＨ， Ｅｄｉｔｏｒ．１９９８年，ＨＨＳ，ＰＨＳ．２９〜４１頁．現在の証拠は、効果は、同様に長期の利益を有し得ることを示唆する。同文献参照のこと；ＮＩＤＤＫ， Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｗｅｉｇｈｔ−ｌｏｓｓ（ＳＨＯＷ） ｔｒｉａｌ， ＮＩＤＤＫ， Ｅｄｉｔｏｒ． ２００１年， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【０００５】
公衆衛生局長官の、体重過多および肥満を防ぎ、低減するための２００１年の呼びかけは、高まり続ける貧弱な栄養の供給源への依存および座りがちな生活様式の増大を伴う、過去数十年の間のアメリカの生活様式の明らかな変化を強調する。彼の重要な呼びかけは、学校での教育を促進し、社会全体で健康的な食事、定期的な、適度な運動を後押しするためのものである。進行中の過程における現段階では、米国国民の大部分が、この重要なメッセージの少なくとも浅薄な知識を有する可能性が高いと思われる。しかし、肥満症に傾く現在の傾向は、弱まる兆しを全く示さず、実際、経時的に悪化すると予測されている。克服するべき主な障害は、一般の人々による指示されたガイドラインに従った食事および運動に関するコンプライアンスの必要性であることは明らかであり、これは先行きの暗い見通しを表す。
【０００６】
体重過多および肥満症の予防および治療のための薬剤アプローチについては、本質的に何も触れられていないことは、公衆衛生局長官の２００１年レポートの興味深い特徴である。このようなアプローチは、患者のコンプライアンスの必要性を低減し得る可能性があるので、これが、学術的機関および産業的機関の両方の間で強い関心のある領域であることは明らかである。脂肪組織の役割および機能の理解においては、近年、エネルギー貯蓄の調節の観点から、および分泌細胞としての両方で大きな進歩がなされた（Ｆｒａｙｎら，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ，２００３年．２７（８）：８７５〜８８頁に総説されている）。浮かび上がった図式は、自律神経系の活性、基質およびホルモンの複雑な混合物の送達、脂肪細胞によって分泌される自己分泌および傍分泌エフェクターからのフィードバックおよびまた脂肪組織への血管供給を含むので極めて複雑である。また、脂肪細胞によって分泌されるレプチンおよびアディポネクチンなどの因子は、全身の代謝に対して全体的な効果を有する。Ｇｕｅｒｒｅ−Ｍｉｌｌｏ， Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｒｍｏｎｅｓ． Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ，２００２年．２５（１０）：８５５〜６１頁；Ｋｉｓｈｉｄａ， Ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００３年．３０６（１）：２８６〜９２頁；Ｍｉｎｅｒ， Ｔｈｅ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ． Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ， ２００４年．８２（３）：９３５〜４１頁；Ｒａｂｉｎ，ら，Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ：ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｏ ｉｔｓ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｈｅｒ， ２００５年．３（３）：４６５〜７１頁；Ｈｏｕｓｅｋｎｅｃｈｔら，Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，１９９８年．７６（５）：１４０５〜２０頁；Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ， Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１９９９年．１３０（８）：６７１〜８０頁参照のこと。
【０００７】
このことから、上記の体重過多および肥満症に関連する現在の問題の基礎を形成する正常および病的状態の完全な理解を得るには、極めて統合的な、全体的なアプローチが必要であることは明らかである。
【０００８】
研究、農業および交流のために多数の種類の動物が使用される。場合によっては、このような動物を収容し、餌を与える費用は大きなものである。小さな大きさの動物は、餌を与え、収容するのに、通常の大きさの動物よりも少ない費用しかかからない。したがって、大きさを小さくした動物および／または体重を減らした動物を作製する組成物および方法は、有利であり得る。また、コンパニオンアニマルにおける肥満症は、１つの問題である。肥満症は、短い寿命およびヒトについて先に記載された同様の疾患および状態の多くを引き起こし得る。
【０００９】
脂肪腫は、薄い、線維性被膜中の脂肪細胞からなる良性腫瘍であり、通常、皮膚のすぐ下に見られる。脂肪腫は、身体中のほとんどどこにでも生じ得るが、胴体、頚部、大腿上部、上腕および腋窩で最も多く見られる。脂肪腫は、最もよく見られる種類の非悪性軟組織腫瘍である。脂肪腫は、多数の動物で生じるが、イヌにおいて最もよく見られる。ウシおよびウマ、ネコおよびブタは、脂肪腫の発生に対して感受性がある。脂肪腫の種類として、表在性皮下、筋肉内、紡錘細胞、血管脂肪腫、良性脂肪芽細胞腫および腱鞘、神経または滑膜の脂肪腫が挙げられる。
【００１０】
脂肪腫の原因は、完全にはわかっていないが、脂肪腫が生じる傾向は遺伝され得る。例えば、家族性多発性脂肪腫症などの遺伝性状態は、脂肪腫の発生を含み得る。ＨＭＧ Ｉ−Ｃ遺伝子（肥満症と関連する遺伝子として先に同定された）と脂肪腫の発生間の相関が、マウスにおいて実証されている。さらに、軽い傷がその成長を誘発し得る。現在、脂肪腫を防ぐ、またはその成長に影響を及ぼす既知治療はない。脂肪腫は、通常、脂肪腫が、有痛性もしくは圧痛があるようになる、伝染性もしくは繰り返し炎症性になる、悪臭のある分泌物を流す、動きもしくは機能と干渉する、大きさが大きくなる、または醜くなる、もしくは厄介になる場合に外科的に摘出される。脂肪腫を除去するために脂肪吸引も使用され得る。
【００１１】
脂肪腫の脂肪肉腫への悪性形質転換は稀であるが、悪性形質転換の少数例が、例えば、骨および腎臓脂肪腫において記載されている。脂肪腫および脂肪肉腫の治療方法は、当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態では、本発明は、脂肪腫にグリシンを投与することを含む、哺乳類において脂肪腫を治療する方法を提供する。グリシンは、グリシン類似体またはグリシンおよびグリシン類似体の組合せを含み得る。哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマであり得る。グリシンは、脂肪腫への注射によって、または経口投与によって脂肪腫に投与できる。注射される場合には、グリシンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中に存在し得る。グリシンは、哺乳類に経口的に投与される場合には、哺乳類の食事の約１０重量％〜３０重量％で、医薬上許容される担体または食品中にあり得る。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、脂肪肉腫にグリシンを投与することを含む、哺乳類において脂肪肉腫を治療する方法を提供する。グリシンは、グリシン類似体またはグリシンおよびグリシン類似体の組合せを含み得る。哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマであり得る。グリシンは、脂肪肉腫への注射によって脂肪肉腫に投与され得る。グリシンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中に存在し得る。本発明のさらに別の実施形態は、哺乳類にグリシンを経口的に投与することを含む、哺乳類において脂肪肉腫を治療する方法を提供する。グリシンは、哺乳類の食事の約１０重量％〜３０重量％で医薬上許容される担体または食品と合わせることができる。
【００１４】
本特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求に応じて必要な支払いにより事務所から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】成体の雄のフィッシャーラットにおける体重に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図２】成体の雄のフィッシャーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図３】成体の雌のフィッシャーラットにおける体重に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図４】成体の雌のフィッシャーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図５】成体の雄のフィッシャーラットにおけるに飼料消費に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図６】雄のＺＤＦラットの体重に対する、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図７】ＺＤＦラットの腹部脂肪含量に対する、２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図８】雌のスプラーグ−ドーリーラットの体重に対する、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図９】スプラーグ−ドーリーラットの飼料消費に対する、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図１０】雌のスプラーグ−ドーリーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および非補給食の効果を示す図である。
【図１１Ａ】白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞におけるチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン３：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン５：２０％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。
【図１１Ｂ】白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞におけるチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン２：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン３：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：２０％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ）。
【図１２】高グリシン食で処理されたスプラーグ−ドーリーラットから得た肝臓組織におけるＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン２：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン３：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：１５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。
【図１３】高グリシン食で処理されたスプラーグ−ドーリーラットから得た筋肉組織におけるＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン３：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン５：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ レーン６：１５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。
【図１４】対照動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質の二重標識実験の結果を示す図である。
【図１５】食餌中２０％グリシンで処理された動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質の二重標識実験の結果を示す図である。黄色の円は、対照に対するダウンレギュレーションを示すのに対し、赤色の円は、目視検査によって認識できるようなアップレギュレーションを示す。
【図１６Ａ】グリシンの定量のＬＣ／ＭＳ法の代表的な結果を示す図である。上部の出力は、オンカラムで７８．１２５ｐＭでグリシン、プロリン、フェニルアラニン、リシンおよびロイシン各々について得られた複合ＴＩＣ（全イオン電流）である。中央の出力は、グリシンの抽出されたＴＩＣクロマトグラムである。底部の出力は、ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）による複合波長モニタリングによって得られたものである。
【図１６Ｂ】グリシンの定量のＬＣ／ＭＳ法の代表的な結果を示す図である。較正曲線を構築するためにグリシンについて抽出されたＴＩＣのピーク下面積が利用される場合に、グリシンについて得られた標準曲線を示す。各較正レベルで３連の注入を使用して較正曲線を構築した。
【図１７】（同位体コードアフィニティータグ）法を示す図である。
【図１８】グリシンに対する幼若な雌ラットの体重の用量反応を示す図である。
【図１９】グリシンに対する幼若な雌ラットの体長の用量反応を示す図である。
【図２０】グリシンに対する幼若な雄ラットの体重の用量反応を示す図である。
【図２１】グリシンに対する幼若な雄ラットの体長の用量反応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一般的なアミノ酸、グリシンは、実験室の動物の食餌に加えられると、体重の用量依存性減少を引き起こす効果を有するということを発見した。この効果は、いくつかのげっ歯類系統およびイヌで観察した。最適用量で、また実際に、最適以上の用量で、長期の投与の間に有害な副作用は観察されなかった。グリシンは、ほとんどの哺乳類によって、解糖経路から通常の中間代謝の一部として生じるセリンから合成される非必須アミノ酸である。その天然の形態および誘導体の形態で、いくつかの精神病、特に、統合失調症の原因および可能性ある治療におけるその役割に関して広く研究されている化合物である（例えば、Ｗａｚｉｒｉ ＆ Ｂａｒｕａｈ、Ａ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｉｎｅｒｇｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｆｉｎｄｉｎｇｓ． Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ，１９９９年．３７（３）：２０５〜１５頁；Ｗａｚｉｒｉ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９８８年．２３（２）：２１０〜１頁；Ｗａｚｉｒｉ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ： ｓｏｍｅ ｃａｖｅａｔｓ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９９６年．３９（３）：１５５〜６頁；Ｊａｖｉｔｔ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９９６年．４０（７）：６８４〜６頁；Ｊａｖｉｔｔ， Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，２００２年．３（７）：１０６７〜７２頁；Ｓｈｏｈａｍら，Ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｇｌｙｃｉｎｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２００１年．４９（１０）：８７６〜８５頁；Ｊａｖｉｔｔ， Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ． Ｃｕｒｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｐ，２００１年．３（５）：４１３〜７；Ｓｈｏｈａｍら，Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｌｙｃｉｎｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ． Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍｃｏｌ，１９９９年．２（１）：３５〜４０頁；Ｓｈｏｈａｍ，ら，Ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄ−ｃｙｃｌｏｓｅｒｉｎｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｖａｃｕｏｕｓ ｃｈｅｗｉｎｇ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔａｒｄｉｖｅ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２００４年．１００４（１−２）：１４２〜７頁；Ｔｕｏｍｉｎｅｎら，Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ： ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ，２００５年．７２（２−３）：２２５〜３４頁参照のこと）。これらの報告のうちいくつかで、グリシン投与の効果が、試験動物または被験体の体重に対して、小さいが、有意な影響を有すると言及されているが、この知見は、考察またはさらなる分析の主題には決してならなかった。これは、恐らくは、観察された効果が比較的小さく、場合によるとその他の医薬の反作用効果によるためである。Ｐｅｔｚｋｅら（１９８７）は、グリシンが、その他のアミノ酸、糖および脂肪と比較して比較的高い熱発生効果を有し、これは、酸素取り込みの増大と相関していると報告した。Ｐｅｔｚｋｅ ＆ Ａｌｂｒｅｃｈｔ，［Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ］。Ｎａｈｒｕｎｇ，１９８７年．３１（２）：１５７〜７２頁；Ｐｅｔｚｋｅら，Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ［１−１４Ｃ］ｃａｒｂｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ ｄｉｅｔ ｆｅｄ ｙｏｕｎｇ ａｎｄ ｏｌｄ ｒａｔｓ， Ｚｆａ，１９８７年．４２（６）：３２３〜８頁；Ｐｅｔｚｋｅら，［Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ］． Ｎａｈｒｕｎｇ，１９８７年．３１（３）：２０７〜１５頁。彼のグループは、実験ラットの成長における用量依存性低減を言及したが、可能性ある機序の生化学的根拠を提供できなかった。本発明者らは、以下に記載されるように、この知見を再現することに加えて、成体動物は、その食餌のグリシン補給を用いて用量依存性体重減少を示すことを実証した。グリシンまたはグリシン類似体は、観察できる有害な副作用を伴わずに肥満症に対抗するために使用できる。さらに、グリシンは、アポトーシスを、具体的には、脂肪細胞において、恐らくは、今までに認識されていない経路を使用して誘導するよう作用する。
【００１７】
グリシンおよびグリシン類似体
グリシンは、容易に入手可能な、非毒性のアミノ酸である。グリシン、グリシン類似体またはその組合せは、本発明の方法において使用できる。白色脂肪細胞などの脂肪細胞においてアポトーシスを直接的または間接的に誘導する任意のグリシン類似体を使用できる。本発明の一実施形態では、グリシン類似体は、式Ｉを含み得る。
【００１８】
【化１】
【００１９】
例えば、式Ｉでは、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｈであり得、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｍｅ、ＥｔまたはＰｒであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｂｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、（ＣＨ２）２−５であり得る。
【００２０】
式Ｉは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【００２１】
【化２】
【００２２】
その他のグリシン類似体は、式ＩＩを含み得る：
【００２３】
【化３】
【００２４】
例えば、式ＩＩでは、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｈであり得、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｍｅ、ＥｔまたはＰｒであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｂｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、（ＣＨ２）２−５であり得る。
【００２５】
式ＩＩは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【００２６】
【化４】
【００２７】
本発明の別の実施形態では、グリシン類似体は、式ＩＩＩを含み得る：
【００２８】
【化５】
【００２９】
式ＩＩＩでは、
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｈであり得、Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、Ｍｅ、ＥｔまたはＰｒであり得、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得；
Ｒ１は、Ｈであり得、Ｒ２は、ＢｎまたはＭｅであり得、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得；
Ｒ１および／またはＲ２は、（ＣＨ２）２−５またはＭｅであり得、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであり得る。
【００３０】
式ＩＩＩは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【００３１】
【化６】
【００３２】
高グリシン食
「高グリシン食」は、グリシン、グリシン類似体もしくは複数の類似体もしくはそれらの組合せが高い食事、または高投与量のグリシン補給、グリシン類似体補給もしくはそれらの組合せである。本発明の一実施形態では、グリシン類似体、または、グリシンと組み合わせたグリシン類似体は、グリシンのみを含む食事が投与される場合に得られるものとほとんど同じ生理学的効果をもたらす。すなわち、グリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せは、高グリシン食で動物にグリシンが投与される場合の動物におけるグリシンの生理学的濃度とほとんど同じである、動物におけるグリシンの生理学的濃度をもたらす。いくつかの例では、グリシンとの組合せ中のグリシン類似体または複数のグリシン類似体は、グリシンが単独で使用される場合と同様の効果を達成するためにグリシン単独よりも低いパーセンテージで投与できる。例えば、グリシンとの組合せ中のグリシン類似体または複数のグリシン類似体は、食事中、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０重量パーセント以上で投与できる。
【００３３】
グリシンおよびグリシン類似体は、食事中に混合してもよく、その他の経路によって投与してもよい。補給は、液体、半固体、固体または任意のその他の形態であり得る。高グリシン食は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せを含む。本発明の一実施形態では、高グリシン食は、約５％〜約４０％以上、約１０％〜約４０％；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％；または約２０％〜約２５％のグリシンまたはグリシン類似体またはそれらの組合せを含み得る。
【００３４】
本発明はまた、約３．５％〜約４０％以上、約３．５％〜約４０％；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％または約２０％〜２５％のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ（すなわち、約３．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ）および約６０％〜約９６．５％（すなわち、約９６．５、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０％）のカロリーが少ない食事を含む、動物における体重減少のための食事組成物を提供する。
【００３５】
本発明はまた、約３．５％〜約４０％以上；約１０％〜約４０％以上；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％；または約２０％〜２５％のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ（すなわち、約３．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ）および約６０％〜約９６．５％（すなわち、約９６．５、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０％）の脂肪が少ない食事を含む、動物における体重減少のための食事組成物を提供する。低脂肪食は、低飽和脂肪食であり得る。
【００３６】
本発明はまた、約３．５％〜約４０％以上；１０％〜約４０％以上；約１０％〜約３０％；約１５％〜約２５％；または約２０％〜２５％のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ（すなわち、約３．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％またはそれ以上のグリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せ）および約６０％〜約９６．５％（すなわち、約９６．５、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０％）の炭水化物が少ない食事を含む、動物における体重減少のための食事組成物を提供する。
【００３７】
本発明の方法
ヒトなどの雄または雌の動物への高グリシン食の投与は、脂肪組織、特に、動物の白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導し得る。したがって、高グリシン食は、動物において脂肪組織を低減し得る、または脂肪細胞の大きさを低減し得る、またはその両方である。本発明の方法は、動物に高グリシン食を投与して、動物において、脂肪組織においてアポトーシスを誘導すること、脂肪組織を低減すること、脂肪細胞の大きさを低減することまたはそれらの組合せを含む。
【００３８】
特定の理論に拘束されようとは思わないが、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導は、グリシンの直接または間接効果によって引き起こされると考えられる。この作用機序は、このような食事が有する、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバーに対する観察された効果によって支持される。ＢＡＤの細胞死を促進する能力は、位置１３６でのリン酸化によって阻害される。高グリシン食の投与は、脂肪組織において位置１３６でのＢＡＤのリン酸化を低減または排除し、このことは、高グリシン食またはその等価物が投与される場合に観察される脂肪組織の減少が、アポトーシスの誘導によって起こることをを示す。
【００３９】
食事で、（すなわち、経口的な）またはその他の投与手段のいずれかによる高濃度のグリシンの投与は、動物において腹部脂肪含量を低減し得る。さらに、動物への、食事で、またはその他の投与手段のいずれかによるグリシンの投与は、動物において体重減少をもたらし得る。しかし、グリシンを補給した食事の最初の投与時に、体重増加が見られる場合がある。いずれか特定の理論に拘束されようとは思わないが、この観察結果は、脂肪組織の減少および筋肉組織の獲得の結果であり得ると考えられる。
【００４０】
本発明の方法および組成物を使用して、大きさを小さくした、およびまたは体重を減らした動物を作製できる。例えば、通常の大きさの動物よりも約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは７５％小さい動物または通常の体重の動物よりも約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは７５％軽い動物。通常の大きさまたは通常の体重の動物とは、年齢および全身の健康状態が考慮された場合に、動物種の平均または標準的な体重もしくは大きさの範囲内に入る動物である。
【００４１】
本発明は、動物に高グリシン食を投与することを含む、大きさを小さくした、または体重を減らした、または大きさを小さくし、体重を減らした両方の動物を作製する方法を提供する。大きさを小さくした動物のために、幼若動物に高グリシン食が給餌される。高グリシン食は、毎日投与され得る。動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、トリまたは魚であり得る。
【００４２】
本発明はまた、上記のように大きさを小さくした動物を作製し、続いて、動物を通常の大きさに戻す方法を提供する。本方法は、幼若動物に高グリシン食を投与して、大きさを小さくした動物を作製すること、次いで、動物に正常食を投与して、通常の大きさの動物を作製することを含む。正常食は、グリシンを補給していないが、正常な量のグリシンを含む食事である。
【００４３】
本発明はまた、成熟または幼若動物に高グリシン食を投与して、体重を減らした動物を作製し、次いで、動物に正常食を投与して通常の体重の動物を作製することを含む、体重を減らした動物を作製し、次いで、動物を通常の体重に戻す方法を提供する。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態は、幼若動物へ高グリシン食を投与して、恒久的に大きさを小さくした、または体重を減らした動物を作製することによって、恒久的に大きさを小さくした、およびまたは体重を減らした動物を作製する方法を提供する。高グリシン食の投与は、動物の生涯を通じて、または通常は成長の休止と関連している生理的プロセスによってさらなる成長が妨げられるまで継続できる。
【００４５】
本発明の方法および組成物を使用して、幼若または成熟動物などの動物において体重減少を引き起こすことができる。約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または７５％の体重減少が達成され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態は、動物に上記の高グリシン食を投与することを含む動物において体重減少を引き起こす方法を提供する。動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、トリ、魚または無脊椎動物であり得る。本発明の一実施形態では、動物は、健康であり、潜在する健康問題または関心事がない。本発明の別の実施形態では、動物は、体重過多または肥満症の健康問題のみを有し、その他の健康問題または関心事はない。
【００４７】
高グリシン食は、運動管理療法、低脂肪食、低カロリー食、低炭水化物食、胃形成術、胃の分割および胃バイパスなどの外科的介入、行動療法、薬物療法（例えば、シブトラミン、メリディア（登録商標）（シブトラミンＨＣｌ一水和物）、ゼニカル（登録商標）（オルリスタット）およびそれらの組合せの使用）、天然のダイエット補助食品または店頭販売の（ＯＴＣ）体重減少製品およびそれらの組合せなどの付属的体重減少治療とともに投与してもよい。
【００４８】
低脂肪食は、所与の年齢、体重および全身の健康状態の所与の種に通常推奨される量の食事中の脂肪より、約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない脂肪を含む食事である。例えば、ヒトにおける低脂肪食は、約０％、３％、５％、７％、１０％、１３％、１５％、２０％または２５％の脂肪からなる食事を含み得る。
【００４９】
低カロリー食は、所与の年齢、体重および全身の健康状態の特定の種に通常推奨される量のカロリーより、約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ないカロリーを含む食事である。
【００５０】
低炭水化物食は、所与の年齢、体重および全身の健康状態の特定の種に通常推奨される量のカロリーより、約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない炭水化物を含む食事である。
【００５１】
行動療法は、食事療法および／または運動療法に伴うコンプライアンスに対する障壁を克服するのに役立つ戦略を含む。このような戦略は、例えば、食習慣および運動の自己監視、ストレス管理、刺激制御、問題解決（例えば、摂食および運動と関連する問題領域の自己補正）、随伴性管理（例えば、特定の望ましい行動に対する報奨の使用、認知再構築（例えば、非現実的な目標および不正確な信念の改変）および社会的支援を含む。
【００５２】
グリシンおよびグリシン類似体は、例えば、従来の非毒性の医薬上許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含有する製剤を使用して、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入もしくは噴霧によって、または直腸性に投与できる。本明細書において、用語、非経口とは、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、腹膜内またはくも膜下腔内注射または注入技術などを含む。さらに、グリシンおよびグリシン類似体は、医薬上許容される担体と組み合わせてもよい。グリシンおよびグリシン類似体は、１種以上の非毒性の医薬上許容される担体、賦形剤、着色剤、防腐剤、矯味剤、希釈剤、アジュバントまたはそれらの組合せ、および必要に応じて、その他の有効成分と関連して存在し得る。グリシンおよびグリシン類似体は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性散剤または顆粒剤、エマルジョン、ハードもしくはソフトカプセル剤、持続放出製剤またはシロップ剤もしくはエリキシル剤のような経口使用に適した任意の形態であり得る。グリシンおよびグリシン類似体は、食品製剤中に存在し得る。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、脂肪細胞へ１種以上のグリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態は、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、白色脂肪細胞においてアミノ酸位置１３６でのＢＡＤのリン酸化を低減する方法を提供する。
【００５５】
グリシンは、約５、１０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で脂肪細胞に加えてもよい。
【００５６】
脂肪腫および脂肪肉腫
本発明は、脂肪腫または脂肪肉腫の治療方法を提供する。脂肪腫の種類として、例えば、血管脂肪腫、アンギオリポレイオミオーマ（ａｎｇｉｏｌｉｐｏｌｅｉｏｍｙｏｍａ）、神経線維肪腫、軟骨脂肪腫（ｃｈｏｎｄｒｏｉｄ ｌｉｐｏｍａ）、紡錘細胞脂肪腫、多形性脂肪腫、皮内紡錘細胞脂肪腫、褐色脂肪腫および表在性皮下脂肪腫が挙げられる。グリシンおよび／またはグリシン類似体を、約０．１、０．２、０．５、０．７５、１．０、２．０、２．５、５．０、７．５、１０．０または１５．０ｍｇ／ｍｌ以上の注射可能濃度で使用して、脂肪腫または脂肪肉腫を治療できる。あるいは、グリシンおよび／またはグリシン類似体を、約１５．０、１０．０、７．５、５．０、２．５、２．０、１．０、０．７５、０．５、０．２、０．１ｍｇ／ｍｌ以下または１５から０．１ｍｇ／ｍｌの間の任意の範囲の濃度で使用して、脂肪腫または脂肪肉腫を治療できる。グリシンおよびグリシン類似体は、約０．５、１、２、３、４、５、１０、１５％以上または約０．５％から約１５％の間の任意の範囲の濃度で存在し得る。中性グリシンは、水または任意の医薬上許容される担体の溶液中に存在し得る。グリシンおよび／またはグリシン類似体は、非経口的に、例えば、経皮的に、皮下に、血管内に（例えば、静脈内に）、筋肉内に、腹膜内に、またはくも膜下腔内注射、注入技術によって、または経口的に（上記のように）投与できる。グリシンおよび／またはグリシン類似体はまた、脂肪腫もしくは脂肪肉腫への直接注射によって、または脂肪腫もしくは脂肪肉腫周囲の領域への注射によって投与できる。脂肪腫または脂肪肉腫の治療は、脂肪腫または脂肪肉腫の低減または排除を意味する。
【００５７】
本明細書においてどこかで参照されるすべての特許、特許出願およびその他の科学的または技術的文書は、参照によりその全文が組み込まれる。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下で適宜実施できる。したがって、例えば、本明細書における各例では、用語「含む」、「本質的に、からなる」および「からなる」のいずれも、その元の意味を維持しながら、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。使用された用語および表現は、説明の用語として使用され、制限の用語ではなく、このような用語および表現の使用において、示され、説明される特徴またはその一部の任意の同等物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で種々の改変が可能であることは認識される。したがって、本発明は、実施形態、任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、当業者によって本明細書に開示される概念の改変および変法が用いられ得ることおよびこのような改変および変法は、本文および添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることは理解されるべきである。
【００５８】
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは代替のその他のグループ分けの用語で記載されている場合には、当業者ならば、それによって本発明はまた、マーカッシュグループまたはその他のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位グループの用語でも記載されるということは認識されよう。
【実施例１】
【００５９】
ラットを、無作為に分け、別個にケージに入れ、水を自由に与え、食餌ＴＤ ８０４０６食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を給餌した。食餌組成は、表１に示されている。ＴＤ ８０４０６食は、ラクトアルブミン成分中に存在する約１〜２％グリシンを有し、非補給食と考えられる。
【００６０】
【表１】
【００６１】
成体（１８０日齢）の雄のフィッシャーラットを、各群中、１０匹ラットの処理群で、その食餌中に５％または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。図１参照のこと。動物および食品重量測定値は、示された研究日に得た。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。バーは、示された観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。２０％グリシン食を給餌されたラットは、１４〜３０日間の処理の間、５％グリシン食またはグリシンが補給されていない食餌を給餌されたラットよりも統計的に軽かった。３０日目に、ひとたび、２０％グリシン食を給餌されたラットを非補給食に戻すと、それらは、急速に体重増加し、その体重は、非補給食を給餌されたラットのものと同様となった。研究の３２日目以降の対照と２０％グリシン群の動物の体重間に統計的な相違はなかった。
【００６２】
各処理群から５匹のラットを、無作為に選択し、研究の３０日目に安楽死させた。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は剖検で得た（図２）。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の処理群に関して盲検化された。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。２０％グリシン食を給餌されたラットは、５％グリシン食または非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に少ない腹部脂肪を有していた。
【００６３】
雌の成体（１８０日齢）フィッシャーラットを用いて同じ実験を実施した。得られた結果は、体重減少および腹部脂肪含量の両方に関して、グリシンの効果が、雄においてよりも雌において実際に幾分かより明白であった点を除いて全般的に同様であった（図３および図４）。処理された雌ラットの体重は、回復相の最後までに対照動物のレベルにリバウンドしなかったこと、および腹部脂肪の観察された低減は、雄について観察されたものよりも大きかったということは留意されたいものであった。実験の過程を通じて消費された食品または水の量では、群間で有意な相違は観察されなかった。
【００６４】
飼料消費測定値は、示された研究日に得た。図５参照のこと。これらのデータは、観察された体重減少は、食物摂取の減少によるカロリー制限の結果ではないことを示す。さらに、観察された体重減少は、食餌がボンベ熱量計によって分析され（表２参照のこと）、カロリー含量が有意に異なっていないことが示されたように、食品のカロリー含量の減少の結果ではない。
【００６５】
【表２】
【００６６】
研究下のラットの尾静脈から血液サンプルを採取し、Ｍｕｔｌｉ−Ａｎａｌｙｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ検査のためにＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。これらの試験の結果は、高グリシン食のラットは、その血清トリグリセリド、ＨＤＬおよびコレステロールレベルにおいて統計的に有意な（ｐ≦０．０５）低下を示すことを示した。これらの結果は、グリシンを用いる研究を実施する他者による文献における結果と一致する。Ｈａｆｉｄｉら，Ｇｌｙｃｉｎｅ ｉｎｔａｋｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｐｌａｓｍａ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ， ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ ｓｉｚｅ， ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｓｕｃｒｏｓｅ−ｆｅｄ ｒａｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４年．２８７（６）：Ｒ１３８７−９３；Ａｕｓｔら，Ｔｈｅ ｈｙｐｏｌｉｐａｅｍｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｉｅｔ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｎａｈｒｕｎｇ，１９８０年．２４（７）：６６３〜７１頁；Ｓｕｇｉｙａｍａら，Ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｌｆｕｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｗｉｎｇ ｒａｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ），１９８５年．３１（１）：１２１〜５頁；Ｓｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒら，Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ． Ｐｏｌ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００３． ５５（４）：６０３−１１；Ｐａｒｋら，Ｄｉｅｔａｒｙ ｔａｕｒｉｎｅ ｏｒ ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｅｄ ａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ． Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９年．１９（１２）：１７７７〜１７８９頁；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ， ｃｙｓｔｉｎｅ， ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ−ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ），１９８８年．３４（６）：５６７〜７６頁；Ｏｌｓｏｎら，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｅｔｓ ｕｐｏｎ ｓｅｒｕｍ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｍａｎ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ， １９７０年．２３（１２）：１６１４〜２５頁；Ｒｙｚｈｅｎｋｏｖら，［Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ］． Ｖｏｐｒ Ｍｅｄ Ｋｈｉｍ，１９８４年．３０（２）：７８〜８０頁；Ｙａｇａｓａｋｉら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ， ｃｙｓｔｉｎｅ， ａｎｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｏｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｍａ−ｂｅａｒｉｎｇ ｒａｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ），１９８６年．３２（６）：６４３〜５１頁；Ｅｍｉら，Ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ （Ｇｌｙ−−−−Ｇｌｕ１８８） ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｐａｒｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９０年．２６５（１０）：５９１０〜６頁参照のこと。白色脂肪細胞（ＷＡＴ）が減少する場合に期待されるように、有意な傾向のあるレプチンレベルの低下が観察された。ＷＡＴが減少している場合に期待されるように、アディポネクチンレベルが、有意な傾向で上がることが観察された。データは、高グリシン食が、これらの肥満症の病原性のバイオマーカーに正の効果をもたらすことを実証した。
【実施例２】
【００６７】
成体の雄のスッカー糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に２０％グリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。ＺＤＦラットは、肥満で、高血圧症で、インスリン抵抗性である。体重測定値は、示された研究日に得た。図６参照のこと。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。バーは、示された観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。２０％グリシン食を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたラットと比較して、研究の１５日目から３６日目の体重において統計的に有意な低下を有していた。やはり、飼料消費には群間に差異が観察されなかった。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は剖検で得た（図７）。２０％グリシン食を給餌されたラットは、５％グリシン食または非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に（ｐ≦０．０５）少ない腹部脂肪を有していた。
【実施例３】
【００６８】
成体の雌のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５、１０、１５または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。図８参照のこと。体重測定値は、示された研究日に得た。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。バーは、示された観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。２０％グリシン食を給餌されたラットの体重は、非補給食を給餌されたラットのものよりも少なかった。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。２０％グリシン食を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたラットと比較して研究の１５日目から３６日目の体重において統計的に有意な低下を有していた。
【実施例４】
【００６９】
成体の雌のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５、１０、１５または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に割り当てた。図９参照のこと。飼料消費測定値は、示された研究日に得た。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の食餌に関して盲検化された。これらのデータは、観察された体重減少は、食物摂取の減少によるカロリー制限の結果ではないことを示す。さらに、観察された体重減少は、食餌がボンベ熱量計によって分析され（表２参照のこと）、カロリー含量が有意に異なっていないことが示されたように、食品のカロリー含量の減少の結果ではない。
【実施例５】
【００７０】
成体の雌のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５、１０、１５または２０％グリシンを含む食餌または非補給食に割り当てた。各処理群中のラットを研究の３０日目に安楽死させた。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は剖検で得た。図１０参照のこと。重量測定を行う分析者は、観察結果が記録されている動物の処理群に関して盲検化された。一元配置分散分析を使用して、データを分析し、ダネットの多重比較検定を使用するポスト−ホック分析に付した。５％〜２０％の示された量のグリシンを含有する食餌を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に少ない腹部脂肪を有していた。
【実施例６】
【００７１】
スプラーグ−ドーリーラット、２４日齢に、１５％グリシンおよび８５％ ＴＤ８０４０６の食餌を給餌した。１５％グリシンおよび８５％ ＴＤ８０４０６を含有する食餌を６週間給餌された動物の剖検で、肉眼的病変または体重以外の処理に関連する異常は報告されなかった。６週間、１００％ ＴＤ８０４０６を給餌された対照動物と１５％グリシンおよび８５％ ＴＤ８０４０６を含有する食餌を給餌された動物間で、血液化学および全血球計算における相違は観察されなかった。高グリシンを補給した食餌を給餌された一動物から採取した組織の病理組織学的検査を実施した。トリミングされ、処理され、包埋され、ミクロトーム処理され、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した組織の鏡検は、脳、肺、肝臓、副腎、腎臓、膀胱、心臓、胃、大腸または小腸について顕著な結果を示さなかった。手短に言えば、正常な組織診断から顕微鏡的変化はなかった。
【実施例７】
【００７２】
成体の雄のスプラーグ−ドーリーラットを、各群中、３匹のラットの処理群で、その食餌中に５％または２０％のグリシンを含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。研究の２０日目に動物を安楽死させ、剖検で脂肪組織を得た。総タンパク質を脂肪組織から抽出した。高グリシン食を給餌されたラットから得た脂肪組織が、アポトーシスを起こしたことを示すために、対照またはグリシン含有食を給餌された動物の抽出物を、位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力についてアッセイした。図１１Ａおよび１１Ｂに見られるように、データは、（ＷＡＴ）においてチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化において用量依存性減少を明らかに示したのに対し、褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）では、このような減少は観察されず、このことは、高グリシン食が白色脂肪細胞におけるアポトーシスにつながることを示す。図１２および図１３は、同じ動物に由来する肝臓組織（図１２）または筋肉（図１３）の抽出物がアッセイされた場合には、チロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化状態におけるこのような減少がないことが観察されたことを明らかに示す。
【００７３】
データは、チロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化における用量依存性減少を明らかに示し、このことは、高グリシン食が脂肪組織におけるアポトーシスにつながることを示す。
【００７４】
セリン位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力についての組織抽出物のアッセイを、以下のとおりに実施した：１ｍｇの組織抽出物を、ＢＡＤアガロース（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に加えた。反応容量をＲＩＰＡバッファー（抗ホスファターゼおよび抗プロテアーゼを含む）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ［ｐＨ ７．４］５０ｍＭ；ＮＰ−４０ １％；デオキシコール酸Ｎａ ０．２５％；ＮａＣｌ １５０ｍＭ；ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＰＭＳＦ １ｍＭ；Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｒｒｅｓｔ １００μｌ；オルトバナジン酸ナトリウム １ｍＭ；フッ化ナトリウム １ｍＭ）を使用して１ｍｌに調整し、３０℃で０．５時間インキュベートした。遠心分離（１２，０００×ｇで５秒）によってアガロースビーズを集めた。上清を除去し、ビーズを洗浄し、氷冷ＴＢＳで３回洗浄した。ＢＡＤ−アガロースを４０μｌのサンプルバッファーに再懸濁し、５分間沸騰させ、遠心分離した（１２，０００×ｇで５分）。７マイクロリットルのサンプルを、１５％ゲル（Ｔｒｉｓ−グリシン）で電気泳動した。ウエスタンブロッティングによってタンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、ＴＴＢＳ中、５％ ＮＦＭを用い、４℃で振盪しながらブロッキングした。ＴＴＢＳ中、２％ ＮＦＭを用いてメンブレンを洗浄した。（２％ ＮＦＭ／ＴＴＢＳ中、１：１０００）でウサギ抗ホスホＢＡＤ １３６抗体を用いて各レーンを、室温で２時間ブロッティングした。ブロットをＴＴＢＳを用いて５分間３回洗浄した。ブロットを、ヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ（２％ ＮＦＭ／ＴＴＢＳ中、１：５０００）とともにインキュベートした。ブロットをＴＴＢＳを用いて５分間３回洗浄し、ＴＢＳを用いて５分間２回洗浄した。リン酸化ＢＡＤの可視化は、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商標））を用いて達成した。
【００７５】
本発明者らは、グリシンが観察された生物学的効果を誘発する作用機序をさらに解明するために、ゲル電気泳動における２Ｄ−ディファレンシャル（２Ｄ−ＤＩＧＥ）を使用した。２Ｄ−ＤＩＧＥは、異なっている生物学的状態からの組織のプロテオームにおける発現の相違の迅速な評価を可能にする強力な方法である。Ｐａｔｔｏｎ， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２００２年．７７１（１−２）：３〜３１頁；Ｕｎｌｕら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ： ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９７．１８（１１）：２０７１〜７頁；Ｖｏｎ Ｅｇｇｅｌｉｎｇら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｕｒ ２Ｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２００１年．８（４）：３７３〜７頁参照のこと。
【００７６】
対照（図１４）および２０％グリシン処理（図１５）から得た組織から抽出したタンパク質の二重標識実験の予備的結果を、未来の２Ｄ−ＤＩＧＥ実験を受けるための調製物において得た。対照動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質が、図１４に示されている。図１５は、食餌中２０％グリシンで処理された動物の脂肪組織から得たＣｙ５フルオロフォアで標識された得られたタンパク質を用いて得られた結果を示す。黄色の円は、目視検査によって識別可能なものとしての、対照に対するダウンレギュレーションを示し、赤い円は、アップレギュレーションを示す。
【００７７】
対照食または２０重量％グリシンを補給した食餌のいずれかを給餌した雌のスプラーグ−ドーリーラットから得た脂肪組織の２Ｄ−ＤＩＧＥ分析。組織サンプルは、７Ｘ１１０ ｍｉｎｉ−Ｔｉｐ Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ Ｐｒｏｂｅｓが取り付けられたＰｏｗｅｒＧｅｎ １２５モデルＦＴＨ１１５ホモジナイザーを使用して氷上でホモジナイズし、Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ （ＴＰＥ）キット（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、９２−Ｗｅｌｄｏｎ Ｐａｒｋｗａｙ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３０４３−９９８９ Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用し、キットに同梱されているプロトコールに従ってタンパク質を抽出した。すべてのバッファーは、使用の前の抽出および保存の間のタンパク質分解を最小にするためにＰｒｏｔｅａｓｅ Ａｒｒｅｓｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、９２−Ｗｅｌｄｏｎ Ｐａｒｋｗａｙ、 Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３０４３−９９８９ Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含有していた。Ｂｉｏ Ｒａｄ ２Ｄ精製キット（カタログ番号１６３−２１３０）を使用して、抽出されたタンパク質を沈殿させ、Ｃｙ標識バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、４％ ＣＨＡＰＳ、８Ｍ 尿素）に再懸濁した。対照動物および処理された動物から得た等量のタンパク質（５０μｇ）を、ＤＭＦで希釈した４００ｐｍｏｌのＣｙ３またはＣｙ５フルオロフォアを用い、製造業者の仕様書にしたがって各々標識した。標識反応は、氷上、暗所で３０分間実施し、１ｍＭリシンの添加によってクエンチした。標識されたタンパク質の２つの集団をＢｉｏｌｙｔｅ両性電解質（Ｂｉｏ Ｒａｄカタログ番号１６３−１１１２）および再水和バッファー（Ｂｉｏ Ｒａｄカタログ番号１６３−２０８３）と混合した。次いで、混合物を、再水和ＩＰＧストリップ（Ｂｉｏ Ｒａｄカタログ番号１６３−２０９９）上に、室温で一晩ロードした。再水和ＩＰＧストリップ中のタンパク質をＢｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＥＦゲル装置で集め、Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅａｎ Ｓｌａｂゲル装置で製造業者の使用説明書に従って二次元に流した。ゲル中のＣｙ３およびＣｙ５標識されたタンパク質の可視化を、ＫＯＤＡＫ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ２０００ＭＭを使用し、それぞれ、５３５および６２０ｎｍ励起ならびに６００および６７０ｎｍ発光フィルターを使用して行った。
【実施例８】
【００７８】
血液および組織（脂肪の）中のグリシンの濃度の正確な測定のための高感度アッセイ
脂肪組織量の低減に関するグリシンの薬物動態および薬力学モデルの開発には、投与されるグリシンの濃度の測定のための正確な方法が必要である。方法は、内因性グリシンを除く、投与されたグリシンの吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、分布、代謝および排泄（ＡＤＭＥ）をたどることができることが理想的である。さらに、開発される方法は、グリシン類似体を用いる将来の研究に適用するために容易に改変され得るべきである。ＬＣ／ＭＳ法はこの目的のために使用できる。このアプローチによって、研究におけるＣ１３−グリシンの利用が可能となり、これは、投薬されたＣ１３−グリシンおよび内因性グリシンのＡＤＭＥの同時決定を可能にする。
【００７９】
手短には、方法論は、ＬＣ／ＭＳによる分析の前の、タンパク質および核酸夾雑物が、酸沈殿によって除去されるサンプル精製ステップからなる。各研究の開始に先立って、サンプルマトリックス（すなわち、未処理動物から得た血漿または透析された組織抽出物）中に既知量のグリシン／Ｃ１３−グリシンを含有するＱＣサンプルを調製する。褐色の１．５ｍｌ微量遠心管中の１００μｌの血漿サンプルに、１％メタリン酸を含有する１００μｌの氷冷１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過塩素酸を添加することによって、サンプルの酸沈殿を達成し、これを氷上で１０分間インキュベートし、その後、４℃、１２，０００×ｇでで５分間遠心分離する。次いで、得られた上清を０．２μｍフィルターを通して濾過し、Ｓａｖａｎｔ ＳＣ１１０ Ｓｐｅｅｄｖａｃ（または等価物）で真空乾燥させる。研究サンプルおよびＱＣサンプルは、分析に付されるまで−８０℃で保存する。分析に先立って、サンプルを、室温に加温し、５０μｌの脱イオン化ＬＣ／ＭＳ等級の水（ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２Ｏ）で再構成し、ガラス自動注入装置バイアルに移し、次いで、Ｍｉｃｒｏ ＡＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）自動注入装置にロードする。２０μｌの各サンプルを、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）供給源を介してＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰ イオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）と接続されたＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｐｌｕｓ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）で５０×２．１ｍｍ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（商標）カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に注入する。クロマトグラフィーによる分離は、１０分で、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、２０ｍＭペルフルオロペンタン酸からＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、１５％アセトニトリル、次いで、さらに１０分でＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、２６％アセトニトリル、次いで、１０分で、最終ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、５０％アセトニトリルの勾配を流すことによって達成される。条件を、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、最終５０％アセトニトリルおよび２０ｍＭペルフルオロペンタン酸で１０分間維持し、続いて、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ２０中、１００％の２０ｍＭペルフルオロペンタン酸に５分間戻し、その後、次の注入とする。
【００８０】
図１６は、グリシンの定量において使用するための代表的なクロマトグラムおよび標準曲線を示す。データは、カラム上にロードされた２４種の一般的なアミノ酸を含有していた既知標準ならびにグリシン、プロリン、フェニルアラニン、リシンおよびロイシンの選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を使用して得た。結果は、アッセイが、提案された研究においてその意図される目的にとって必要な感度を有することを明らかに示す。アッセイは、Ｃ１３−グリシンを用いて、さらに正確にされ、確認され得る。
【実施例９】
【００８１】
高用量グリシンの単回用量薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティ
以下の実験計画を使用して、グリシンの薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティを決定できる。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した、外科的に埋め込まれた頚静脈カテーテルを有し、２００〜２２５ｇの間の体重の成体（１８０日齢）スプラーグ−ドーリーラットを使用できる。１８匹のラットを、６匹のラット（３匹の雄３匹の雌）の３群に無作為に分け、３つの投与量群の各々：高（５ｍｇ／ｋｇ）、中（２．５ｍｇ／ｋｇ）および低（０．２５ｍｇ／ｋｇ）に無作為に割り当てる。２０重量％のグリシンを含有する食餌を給餌された雄のＺＤＦラットから、２４時間の絶食後に剖検で得た血漿サンプルの予備的分析は、１６．９μｇ／ｍＬレベルのグリシンを示した。実際の定常状態レベルのグリシンは、動物が絶食している前は、恐らくはかなり高かった。本発明者らが選択した用量は、約１５０μｇ／ｍ、高用量群、７５μｇ／ｍ、中用量群、および７．５μｇ／ｍ、低用量群のピーク血漿レベルをもたらすはずである。グリシンは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に溶解し、まず、ＩＶボーラスによって投与する。以下の時点、Ｔ＝０分、Ｔ＝０．５分、Ｔ＝１分、Ｔ＝５分、Ｔ＝１５分、Ｔ＝３０分、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、Ｔ＝４時間、Ｔ＝８時間、Ｔ＝６時間、Ｔ＝２４時間およＴ＝４時間で、血漿サンプル（０．１ｍｌ）を、クエン酸塩を含有するライトブルーのふたのバキュテナーチューブ（ＢＤ３６３０８０番）中に採取する。各時点で集められた分離された血漿を、液体窒素中で急速凍結し、分析されるまで−８０℃で保存する。動物は、７日間回復させ、再度秤量し、次いで、経口胃管栄養法による高、中および低投与量のグリシンで処理する。以下の時点Ｔ＝０分、Ｔ＝３０分、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、Ｔ＝４時間、Ｔ＝６時間、Ｔ＝８時間、Ｔ＝１６時間、Ｔ＝２４時間、Ｔ＝４８時間、Ｔ＝７２時間およびＴ＝９６時間で、血漿サンプル、０．１ｍｌを、ＩＶボーラス投与について先に記載されるように、ライトブルーのふたのバキュテナー中に採取する。各時点で集められた分離された血漿を、液体窒素中で急速凍結し、分析されるまで−８０℃で保存する。データを、薬物動態分析のためのＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン４．１ソフトウェアを使用して分析する。これらの実験から得られた薬物動態モデルを使用して、その後の実験において使用される複数の投与計画を設計する。さらに、このモデルは、さらなる開発のための類似体の選択において使用するためのベースモデルとして役立つ。
【実施例１０】
【００８２】
グリシンの複数回用量薬物動態学
本研究者らの予備的研究では、グリシンを、試験動物の正常食の一部として経口的に投与した。この投与方法は、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導に関する、グリシンの作用の薬力学モデルを構築するのに必要な投薬の正確度および再現性を提供しなかった。本発明者らは、この研究に取り掛かるために、本研究者らが、観察される薬理学的効果（すなわち、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導）を正確に熟考するのを可能にする投与計画を開発しなくてはならない。高用量グリシンの単回用量薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティを規定するために本発明者らの研究において得られた薬物動態パラメータを使用して、高用量グリシンの複数回投与計画設計する。開発される計画を使用して、食餌中、２０重量％、１０重量％および５重量％グリシンからなる食餌を給餌された動物において観察されるものの±１０％に等しいレベルで試験動物の血液中のレベルでグリシンを維持する。各投与群中の動物の数およびサンプルのタイミングについての詳細な記載は、薬物動態パラメータおよび先の単回用量研究から確認されたパラメータの変動性に基づいて決定する。しかし、本発明者らは、研究デザインは、計画を検証するのに投与群あたり１０匹（５匹の雄、５匹の雌）未満の動物しか必要でないと見込んでいる。本発明者らは、投与計画の設計においてＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）のシミュレーション機能を使用して、計画を検証するために使用されるデータを得るためにサンプリングする時点を開発する。
【００８３】
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアは、投与スケジュールを検証するための複数回投与スケジュールおよびサンプリングスキームの設計においてシミュレーションを利用するための優れたツールセットを提供する。Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ ＳｔａｔＭａｔｅバージョン２．００を使用して、各投与群中の動物の数が、統計的妥当性を実証するための適切な検出力を達成するために必要とされるものであることを確認する。統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔバージョン３．０６ ３２ビットを使用して実施する。投与計画は、血液中のグリシンのＰＫパラメータおよび循環レベルが、統計的に有意な方法で、実験的に得られたものと異ならないと示される場合に妥当であると考えられる。
【００８４】
研究動物は、研究の最後に安楽死させ、剖検を実施する。脂肪組織におけるｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、抗ＢＡＤ ｓｅｒ−１３６抗体を用いる免疫沈降およびウエスタンブロット解析または親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析のいずれかによって決定する。Ｐａｐａｃ ＆ Ｓｈａｈｒｏｋｈ， Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００１年．１８（２）：１３１〜４５頁；Ｃｒｅａｓｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，１９９８年．７９４（１−２）：３７〜４３頁；Ｇａｌｌｏら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ａｆｔｅｒ ａｌｆａ−１−ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２００５年．１９（４）：５７４〜９頁参照のこと。脂肪組織はまた、活性なアポトーシスのマーカーとしてのＴＵＮＥＬタンパク質の免疫組織化学的染色に付す。Ｐａｖｌｏｖｓｋｙ ＆ Ｖａｇｕｎｄａ， ［Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−−ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ］． Ｃｅｓｋ Ｐａｔｏｌ，２００３年．３９（１）：６〜１０頁；Ｈｅａｔｗｏｌｅ， Ｖ．Ｍ．， ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９年．１１５：１４１〜８頁；Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ ＆ Ｌａｓｓｍａｎｎ， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ． Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ，２０００年．３０１（１）：１９〜３１頁参照のこと。
【００８５】
主要な臓器も摘出し、毒性の任意の顕在的な兆候について観察し、毒性の任意の顕在的な兆候が見られる場合には、さらなる分析のために保存する。
【実施例１１】
【００８６】
グリシンの、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導による体重減少を誘発するその能力に関する、連結ＰＫ／ＰＤ（薬物動態／薬力学モデル）。
薬動力学とは、作用部位での薬物濃度と、その相互作用に影響を及ぼす生化学的作用および生理学的効果をはじめとする薬理反応の間の関係を指す。Ｓｈａｒｇｅｌ ＆ Ｙｕ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．第４版 １９９９年， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ． ５７３〜６０５頁参照のこと。
【００８７】
薬力学モデルの形態は、薬物がその薬理作用を行使する機序に応じて変わる。したがって、このモデルにおいて得られる情報は、グリシンが脂肪組織においてその生物学的効果を誘発する方法に関して有用な情報を提供する。本発明者らの予備的研究では、本発明者らは、高グリシン食は、ｓｅｒ−１３６で脱リン酸化された状態にあるＢＡＤをもたらすと示した。本発明者らは、ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、本発明者らの薬力学モデリングのアポトーシスのマーカーとして使用することを提案する。本発明者らは、グリシン作用の、ＢＡＤのリン酸化状態に対するその効果に関するＰＫ／ＰＤ連結モデルを構築する。ＰＫ／ＰＤ連結モデルは、固定された薬物動態パラメータを仮定して、ＰＤモデルによって使用される作用部位での薬物の局所濃度をモデリングする。Ｊｕｓｋｏ， Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ： ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ａ ｂｒｏａｄ ａｒｒａｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９０年．３０（４）：３０３〜１０頁；Ｄａｙｎｅｋａら， Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｂａｓｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍ，１９９３年．２１（４）：４５７〜７８頁。本発明者らは、単回用量および複数回用量研究から導かれた薬物動態モデルを使用して、ＰＫ／ＰＤ連結モデルの固定ＰＫパラメータを供給する。白色脂肪細胞（ＷＡＴ）の生体外器官培養を使用して、ＰＫ／ＰＤ連結モデルのＰＤ部分をモデリングする。ＷＡＴの生体外培養を確立するための方法および手順は、十分に記載されている。Ｍｏｕｓｔａｉｄ−Ｍｏｕｓｓａ ＆ Ｆｒｉｅｄ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ， ｉｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇ． Ａｉｌｈａｕｄ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．：Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ． １９７〜２１３頁；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら， Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ，１９７８年．２７３（５６６１）：３９４〜６ｌ頁；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｒａｔ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｉｅｃｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｒｃｏａｌ−ｔｒｅａｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，１９８２年．２３（２）：３６０〜３頁；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，１９７９年．２０（７）：８４８〜５６頁；Ｍａｌｏｆｆら，Ｄｉｒｅｃｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８０年．１０７（２）：５３８〜４４頁参照のこと。器官培養は、ＷＡＴの複雑な生化学をより十分に反映し、ｉｎ ｖｉｖｏ状態をより反映する濃度対効果のＰＤモデルをもたらすので、これらの実験では、ＷＡＴ器官培養を、単離された脂肪細胞に対立するものとしてとして使用する。Ｐａｐａｃ ＆ Ｓｈａｈｒｏｋｈ， Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００１年．１８（２）：１３１〜４５頁．
【００８８】
手短には、２００〜２２５ｇの体重の３匹の雄および３匹の雌のスプラーグ−ドーリーラットの各々から、後腹膜、鼠径部および生殖腺脂肪パッドの外科的切除によって安楽死の１０分以内にＷＡＴを得る。各動物から約１２〜１５ｇｍのＷＡＴが得られる。同じ性別の動物に由来するＷＡＴを合わせ、粗く分割して、滅菌、室温Ｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給した重炭酸緩衝された液体）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するコニカルプラスチック遠心分離管に入れる（チューブあたり３ｇ）。材料のすべてのさらなる処理は、Ｆｒｉｅｄ ａｎｄ Ｍｏｕｓｔａｉｄ−Ｍｏｕｓｓａ （Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ， ｉｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇ． Ａｉｌｈａｕｄ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ．１９７〜２１３頁）によって記載されるように層流フード中で無菌で実施する。ＷＡＴを、よく切れるはさみを使用して５〜１０ｍｇの断片にさらに分割する。組織を、細かく分割すれば、ＲＴで最大１時間とどめてもよい（その他のチューブの組織が分割されている間）。組織は、現段階ではその代謝速度の増大を避けるために、３７℃に置かない。次いで、各チューブの内容物を、約５００ｍＬのビンの上部に置かれる、ナイロンメッシュ（漏斗に取り付けられた）を通して注ぐことによってＷＡＴ器官培養物を洗浄して脂肪小滴および血液を除く。これに、漏斗上の組織の上からの少なくとも３００ｍＬの３７℃の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の洗浄を続ける。洗浄された組織を、無菌の風袋を測られたペトリ皿中に入れ、ピンセットで大きな血餅はいずれも除去する。ＷＡＴ器官培養物を含有する風袋を測られたペトリ皿を、無菌性を維持するために密閉し次いで、秤量する。次いで、ピンセットまたは穴の開いたスプーンを使用して、ＷＡＴを６ウェルの組織培養プレート中に等分に入れる（約０．５ｇ湿重量／ウェル）。次いで、新鮮なＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給した重炭酸緩衝された液体）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを直ちに加え、５％ ＣＯ２-９５％空気の雰囲気下、加湿された、３７℃のインキュベーター中で４８時間培養物を維持して、汚染がないことおよび無菌性を確実にする。
【００８９】
上記のように調製された、雄および雌のスプラーグ−ドーリーラットに由来するＷＡＴ器官培養物を含有する３連のウェルを、新鮮なＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給した重炭酸緩衝された液体）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンで３回洗浄する。以下の濃度のグリシンを補給した新鮮なＭ１９９培地の添加によって実験を開始する。対照ウェルには、グリシンが添加されていない新鮮培地を与え、実験ウェルには、複数回用量ＰＫ研究の最高用量群の血液中のグリシンの循環レベルの２倍に匹敵する最高濃度で、５つの等間隔の濃度でグリシンを補給したＭ１９９培地を与える。培地は、３日間の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳを用いて５回洗浄する。先に記載されるＬＣ／ＭＳ法によるグリシンの定量のためにサンプルを調製する。
【実施例１２】
【００９０】
グリシンの生物活性類似体のスクリーニングのための迅速な生化学アッセイ
高レベル（２０重量％）の食餌性グリシンは、大幅な体重減少をもたらす。この体重減少は、グリシンの、ＷＡＴにおいてアポトーシスを誘発する能力の結果であり得る。これは、処理された動物のＷＡＴから得たタンパク質抽出物が、セリン位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力を有さなかったことを示す予備的データに基づく（図１１、１２および１３）。Ｍａｓｔｅｒｓら，１４−３−３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｂａｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉｎｅ−１３６． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１年．６０（６）：１３２５〜３１頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｐｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｐ ｏｎ ａｋｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００４年．２２（２０）：４２１７〜２６頁参照のこと。
【００９１】
体重減少が起こる機序は、解明されないままである。本発明者らは、グリシンは、ＢＡＤのリン酸化状態の調節によってＷＡＴに対して直接的な生化学的効果を有し、アポトーシスの誘導につながると考えている。これは、本発明者らの予備的実験における、ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのこのような脱リン酸化がないことがＢＡＴで観察された、またはＢＡＴ組織の大幅な減少は起こらなかったという観察結果に基づいている。さらに、本発明者らは、脂肪細胞に分化される３Ｔ３−Ｌ１細胞の培地中の高濃度のグリシンが、非処理細胞と比較すると、ＴＵＮＥＬの染色の増大を示したことを観察した。Ｈｅａｔｗｏｌｅ， ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９年．１１５：１４１〜８頁参照のこと。この実施例の目的は、グリシンの生物活性類似体をスクリーニングするために使用できる迅速な生物検定法を開発することである。
【００９２】
本発明者らは、雌のスプラーグ−ドーリーラットは、食餌中の高グリシンの作用に対して特に感受性が高く、迅速な大幅な体重減少を受けることを見い出した。したがって、雌のスプラーグ−ドーリーラットにおける大幅な体重減少を使用して、グリシンの類似体の活性をスクリーニングすることが可能であろう。しかし、このアッセイは、時間がかかり、大規模な類似体の合成を必要とし、多数の化合物のスクリーニングにとって効率的ではないであろう。本発明者らは、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞株およびｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態の測定を使用する迅速な生物学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を開発することを提案する。Ｇａｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｏｄｅｎｔｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１９８４年．２０（２）：７９〜８８頁。
【００９３】
このようなアッセイが確信を持って使用されるために、本発明者らは、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪細胞と同様に高グリシンレベルに応答することを示す。以下の実験は、この目的のために、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＳｅｒ １３６でのＢＡＤの脱リン酸化を使用することの有用性および妥当性を実証することを目的とする。
【００９４】
ＷＡＴに由来する脂肪細胞は、ＷＡＴの器官培養について先に記載される精製方法の改変によって得る。手短には、ＷＡＴを先に記載されるように単離し、単離された脂肪細胞および間質−血管画分を得るために以下のさらなるステップに付す。単離された脂肪細胞および間質画分は、刻まれたＷＡＴを、Ｍ１９９培地中、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＩ型コラゲナーゼを用いる３７℃で６０分間の消化に付すことによって得る。次いで、コラゲナーゼ処理された組織を、滅菌ナイロンフィルター（３５０μｍメッシュ）を通して濾過し、滅菌遠心分離管に入れる。この懸濁液を、５００×ｇで１分間遠心分離すると、その結果、脂肪細胞含有画分から間質−血管画分（ペレット）が分離される。それぞれの細胞画分を、ハンクス緩衝塩溶液でさらに３回洗浄する。次いで、それぞれの脂肪細胞および間質−血管画分をカウントし、新鮮なＭ１９９培地で希釈し、６ウェル培養プレートのウェルに入れる。細胞を、５％ ＣＯ２-９５％空気の雰囲気下、３７℃のインキュベーター中で一晩インキュベートする。生存力および汚染がないことを確実にするために細胞を観察し、培地中の、以下の漸増濃度のグリシンを補給した新鮮なＭ１９９培地の添加によって実験を開始する。対照ウェルには、グリシンが添加されていない新鮮培地を与え、実験ウェルには、ＰＤ実験に使用したグリシンの同一濃度でグリシンを補給したＭ１９９培地を与える。培地は、３日間の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳを用いて５回洗浄する。細胞を、低張バッファーに曝露することによって溶解し、遠心分離によって清澄化し、溶解物のアリコートを液体窒素中で即時凍結し、使用まで−８０℃で保存する。サンプルの細胞内グリシン含量を、ＬＣ／ＭＳ法によって調べる。Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、ＢＡＤ−Ｓｅｒ １３６に対するＥＬＩＳＡを使用して、または親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析によってのいずれかで調べる。各サンプル条件の３連のウェルを置き、活性アポトーシスを実証するためにＴＵＮＥＬの免疫組織化学的染色を実施する。本発明者らは、以下の実験は、グリシンが、ＷＡＴに由来する脂肪細胞に直接的に作用するという決定的な証拠を提供すると考えている。
【実施例１３】
【００９５】
グリシンは、ＢＡＤの脱リン酸化およびアポトーシスを誘導するよう、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞に対して作用する。
標準法によって、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、培養で増殖させ、脂肪細胞に分化させる。Ｎｅｇｒｅｌ ＆ Ｄａｎｉ， Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｃｌｏｎａｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｎｉｍａｌ Ｗｈｉｔｅ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ， ｉｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇ． Ａｉｌｈａｕｄ， Ｅｄｉｔｏｒ．２００１年，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ．２２５〜２２７頁参照のこと。実験の開始に先立って、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をトリプシン処理し、ｄＤＭＥＭ［３．７ｇ／Ｌ重炭酸Ｎａ、３３μＭビオチン、１７μＭ パントテン酸塩、抗生物質（６２ｍｇ／Ｌ ペニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシンまたは１０ｍｇ／Ｌ テトラサイクリン）、１７ｎＭ インスリンおよび２ｎＭ Ｔ３および１０％ ＦＢＳを補給した、１ｇ／Ｌ グルコースおよび１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸Ｎａを含有する］で５回洗浄する。細胞を、８．５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で６ウェル培養プレートのウェルに入れる。生存力、および汚染がないことを確実にするために、細胞を観察し、培地中に、以下の漸増濃度のグリシンを補給した新鮮なｄＤＭＥＭ培地の添加によって実験を開始する。対照ウェルには、さらなるグリシンが添加されていない新鮮培地を与え、実験ウェルには、ＰＤ実験に使用したグリシンの同一濃度でグリシンを補給したｄＤＭＥＭ培地を与える。培地は、３日間の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳを用いて５回洗浄する。細胞を、低張バッファーに曝露することによって溶解し、遠心分離によって清澄化し、溶解物のアリコートを液体窒素中で即時凍結し、使用まで−８０℃で保存する。サンプルの細胞内グリシン含量を、ＬＣ／ＭＳ法によって調べる。Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を、ＢＡＤ−Ｓｅｒ １３６に対するＥＬＩＳＡを使用して、または親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析によってのいずれかで調べる。予備的実験は、血液中の正常な循環レベルの２倍に匹敵する培地中の濃度のグリシンは、陽性ＴＵＮＥＬ染色によって明らかなように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にアポトーシスを引き起こさせることを示す。各サンプル条件の３連のウェルを置き、活性アポトーシスを実証するためにＴＵＮＥＬの免疫組織化学的染色を実施する。
【実施例１４】
【００９６】
グリシン処理が、ＷＡＴおよび分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞において同等な生物学的応答を誘発することを確認するための２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ（同位体標識親和性タグ）分析。
２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ分析を使用して、グリシン処理で誘発される異なって発現されるタンパク質のパターンが、グリシン処理されたＷＡＴタンパク質抽出物において見られるパターンと同様であることを示すことによって、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に由来する脂肪細胞の有用性をさらに検証する。Ｐａｔｔｏｎら， Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ａ ｐｏｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ＩＣＡＴ？ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２年． １３（４）：３２１〜８頁参照のこと。
【００９７】
手短には、ＷＡＴおよび３Ｔ３−Ｌ１由来脂肪細胞を、先に記載されるように得る。対照および実験ウェルにおけるグリシンの濃度を、上記のように処理する。分析のためのサンプルを、先に記載されるように調製し、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞およびＷＡＴ由来脂肪細胞が、グリシン処理に対して生物学的に同等に応答することを実証するために、等量のサンプルを２Ｄ−ゲルによる分析およびＩＣＡＴ分析に付す。ＩＣＡＴによる分析は、グリシンがＷＡＴに由来する脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する作用機序を解明するための出発点を提供し得る。ＩＣＡＴは、グリシンおよび処理された細胞間で異なるタンパク質を数量化できる方法で同定できる強力な方法である。ＩＣＡＴ法は、図１７において図式的に提示されている。
【実施例１５】
【００９８】
グリシンの構造的類似体のライブラリーの合成および３Ｔ３−脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する能力についての化合物のプレスクリーニング。
グリシンは、容易に入手可能な、非毒性のアミノ酸である。グリシン、グリシン類似体またはそれらの組合せは、ＷＡＴにおけるアポトーシスの誘導によって体重減少を誘発するはずである。以下の一連のグリシン類似体を合成できる：
【００９９】
【化７】
【０１００】
式Ｉのシリーズは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【０１０１】
【化８】
【０１０２】
ジメチルアミンなどの種々のジアルキルアミンをクロロメタンスルホン酸で処理することによって、上記のスキーム中で提案されるアミノスルホン酸類似体を合成する。式ＩＩのシリーズは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【０１０３】
【化９】
【０１０４】
上記で示される類似体は、還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを使用して還元条件下で、ジアルキルアミンまたは第一級アミンを、オキソ−酢酸メチルエステルで処理することによって合成する。生成物を、クロマトグラフィーによって精製する。式ＩＩＩは、例えば、以下のスキームによって合成できる：
【０１０５】
【化１０】
【０１０６】
Ｎ（アルキル）またはＮ，Ｎ−ジアルキルグリシンの遊離カルボキシ末端を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で、アミンを用いてアミド化する。すべての場合において、生成物は、クロマトグラフィーによって精製する。同一性、純度および量は、必要に応じて、質量分析、ＮＭＲ、分析的液体クロマトグラフィーおよび任意のその他の分析的方法によって確認する。
【０１０７】
合成された類似体は、Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤの脱リン酸化を促進するその能力についての第１のスクリーニングに付す。類似体を、グリシンを補給していない対照ならびに同じ濃度および既知有効濃度の培地中のグリシンの陽性対照と同一濃度でスクリーニングする。すべてのアッセイは、３連で実施する。すべての可能性ある陽性類似体を、反復スクリーニングに付す。その化学特性を確認するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において同定された陽性化合物の第２のスクリーニングによって、ｉｎ ｖｉｖｏ試験のための良好な薬物候補となる。
【０１０８】
一実施例では、成体（１８０日齢）雄のフィッシャーラットを、各群中３匹のラットの処理群中で、その餌中に０．１％、０．２５％、０．５％、２％、３．５％または５％アミノメタンスルホン酸（「ＡＭＳ」）を含む食餌または非補給食に無作為に割り当てた。水および飼料消費および動物の体重の測定値は、２６日の研究を通じて得た。非補給食を消費するラットは、２６日の研究の過程にわたって６．６％の体重増加を示したが、３．５％ ＡＭＳ食を給餌されたラットは、統計的に軽く、０．６％の平均体重増加を示し、５％ ＡＭＳ食を給餌されたラットは、そのベースライン体重から２．８％の減少を有していた。群間で、実験の過程を通じて消費された食物または水の量においては有意な相違は観察されなかった。各ラットの腹部脂肪含量の測定値は、剖検で得た。体脂肪の低下％は、ＡＭＳが補給された食餌を用いて観察され、この低下は、食餌中のＡＭＳの量と直接的に関連している。３．５％または５％ ＡＭＳ食を給餌されたラットは、非補給食を給餌されたものよりも統計的に有意に（ｐ≦０．０５）少ない腹部脂肪を有していた。対照群の平均体脂肪％は３．６２％であったのに対し、３．５％および５％ ＡＭＳ群の平均体脂肪％は、それぞれ１．５９％および１．１２％であった。
【実施例１６】
【０１０９】
幼若動物
図１８および１９はそれぞれ、幼若の雌のスプラーグ−ドーリーラットの食餌へのグリシンの添加が、体重増加および成長における用量依存性低減をもたらしたことを示す。グリシンを補給した食餌で４週間処理された動物を、グリシン補給を含有しない食餌に切り替えた（図１８および１９、１０％から０％）。このことは、急速な成長および体重増加をもたらし、その結果、１ヶ月以内に、それらは、群１中の対照動物と同様の大きさおよび体重であった。図２０および２１はそれぞれ、幼若の雄のスプラーグ−ドーリーラットの食餌へのグリシンの添加が、体重増加および成長における用量依存性低減をもたらしたことを示す。グリシンを補給した食餌で４週間処理された動物を、グリシン補給を含有しない食餌に切り替えた（図２０および２１、１０％から０％）。このことは、急速な成長および体重増加をもたらし、その結果、１ヶ月以内に、それらは、群１中の対照動物と同様の大きさおよび体重であった。
【０１１０】
以下の先見的実施例は、本発明を例示するために提供する。しかし、本発明の趣旨および範囲は、特定の条件または本実施例において詳細に記載されるものに制限されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ制限されるべきであるということは理解されるべできある。
【実施例１７】
【０１１１】
動物における脂肪腫または脂肪肉腫の治療
公知の技術（例えば、医学の専門家による診断）を使用して、脂肪腫または脂肪肉腫の治療を必要とする動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）を同定できる。グリシンおよび／またはグリシン類似体の治療上有効な量は、非経口的に、例えば、経皮的に、皮下に、血管内に（例えば、静脈内に）、筋肉内に、腹膜内に、またはくも膜下腔内注射、注入技術によって、または経口的に投与してよい。
【０１１２】
治療計画の間、周期的に、動物を、脂肪腫または脂肪肉腫の兆候および症状についてモニタリングする。治療期間が終わった後、やはり公知の技術を使用して、動物は、減少した脂肪腫または脂肪肉腫の兆候および症状を有すると、かつ／または、脂肪腫もしくは脂肪肉腫のための治療をもはや必要としない、または低減した治療を必要とすると見られる。脂肪腫または脂肪肉腫の大きさは、約５、１０、２５、５０、７５もしくは１００％または約５％と１００％の間のいずれかの範囲、低減される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類において脂肪腫を治療する方法であって、脂肪腫にグリシンを投与するステップを含む方法。
【請求項２】
グリシンが、グリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グリシンが、脂肪腫への注射によって脂肪腫に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グリシンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中にある、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
グリシンが、哺乳類に経口的に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グリシンが、医薬上許容される担体または食品中にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グリシンが、哺乳類の食餌の約１０重量％〜３０重量％として投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類における脂肪肉腫の治療方法であって、脂肪肉腫にグリシンを投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
グリシンが、グリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
グリシンが、脂肪肉腫への注射によって脂肪肉腫に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
グリシンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
グリシンが、哺乳類に経口的に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
グリシンが、医薬上許容される担体または食品中にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
グリシンが、哺乳類の食餌の約１０重量％〜３０重量％として投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
哺乳類において脂肪腫を治療する方法であって、脂肪腫にグリシンを投与するステップを含む方法。
【請求項２】
グリシンが、グリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グリシンが、脂肪腫への注射によって脂肪腫に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グリシンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中にある、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
グリシンが、哺乳類に経口的に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グリシンが、医薬上許容される担体または食品中にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グリシンが、哺乳類の食餌の約１０重量％〜３０重量％として投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類における脂肪肉腫の治療方法であって、脂肪肉腫にグリシンを投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
グリシンが、グリシン類似体、または、グリシンおよびグリシン類似体の組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタまたはウマである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
グリシンが、脂肪肉腫への注射によって脂肪肉腫に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
グリシンが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬上許容される担体中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
グリシンが、哺乳類に経口的に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
グリシンが、医薬上許容される担体または食品中にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
グリシンが、哺乳類の食餌の約１０重量％〜３０重量％として投与される、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２０１２−５１８６４１（Ｐ２０１２−５１８６４１Ａ）
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５１２１２（Ｐ２０１１−５５１２１２）
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４５６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９６５３９
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０６０４７９０５）オラジェニックス，インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４５６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９６５３９
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０６０４７９０５）オラジェニックス，インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
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