脂肪蓄積抑制剤
【課題】脂肪細胞の分化成熟又は脂肪蓄積を抑制することができ、体脂肪蓄積に起因する症状の予防、改善に有効な素材の提供
【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞の分化成熟抑制剤、脂肪蓄積抑制剤、ならびに肥満予防及び／又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化、運動不足、ストレス等により、肥満人口は増加の一途を辿っている。肥満は、インスリン抵抗性や動脈硬化といった種々の生活習慣病の発症原因にもなることが報告されており、国民の健康維持・増進の観点において大きな社会問題となっている。
【０００３】
肥満は、体脂肪が過剰に蓄積した状態を指し、摂取エネルギー量が消費エネルギー量を上回ることにより生じる。従って、摂取エネルギー量を減らすか又は消費エネルギー量を増やすことは、肥満の予防・改善につながると考えられる。肥満及び肥満に関連する各種生活習慣病を予防・改善する方法としては、例えば、運動、カロリー制限、生活習慣の改善等が挙げられる。これらは一般には肥満の予防・改善に有効とされているが、これらのみでは大抵の場合充分な効果が得られないことが多い。
【０００４】
そこで、これまで、肥満改善剤や脂質代謝促進剤の開発を目指し、盛んに研究がなされてきた。例えば、エネルギー代謝の促進を目的とするものとして、PPAR（Peroxisome Proliferator Activated Receptor：ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）活性化剤（非特許文献１〜３）又は阻害剤（非特許文献４）、AMPK（AMP-activated protein kinase）活性化剤（非特許文献５、６）等が挙げられる。また脂肪合成の抑制を目的とするものとして、ACC-1（acetyl-CoA carboxylase）阻害剤（非特許文献７）、FAS（Fatty Acid Synthase）阻害剤（特許文献１）等が挙げられる。しかしこれらの効果もやはり、必ずしも充分なものではなかった。
【０００５】
肥満はまた、脂肪細胞の肥大化及び細胞数の増加と密接に連動しており、従って、前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化を抑制すること、あるいは脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制することは、肥満の治療及び予防に有効と考えられる。脂肪細胞を成熟脂肪細胞へと分化させる誘導刺激としては、インスリン、デキサメタゾンおよびイソブチルメチルキサンチンが知られている。これらの分化誘導刺激に伴い、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとされる転写因子群、PPARsおよびC/EBPsの発現が上昇し、次いで、脂質合成に関わるACC-1、FAS及びDGAT（diacylglycerol acyltransferase）や、糖・脂質の取り込みに関わるGLUT4（glucose transporter 4）及びLPL（lipoprotein lipase）等の成熟脂肪細胞に特異的に発現する種々の脂質代謝関連遺伝子の発現が上昇する。また、脂肪酸輸送担体であるFabp4（fatty acid binding protein 4）も、分化した脂肪細胞特異的に発現する脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られている。
【０００６】
脂肪細胞は、他の細胞種と同様、細胞周囲を細胞外マトリックス（ＥＣＭ；extracellular matrix）に囲まれている。ＥＣＭは、単に細胞接着のための足場を提供するだけでなく、細胞膜表面に存在する受容体を介し、細胞の増殖、分化、遊走など多くの生理活性に寄与することが報告されている。ＥＣＭの分子組成は細胞により異なっており、細胞は、特定の分子組成からなるＥＣＭという環境を自ら形成することで、細胞機能を適当な状態に発現・維持していると考えられる。
【０００７】
ラミニンは、上皮細胞層と間質細胞層との間に存在するＥＣＭである基底膜の、主要構成成分として知られているタンパク質である。ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖からなるヘテロトリマーを形成しており、基底膜への細胞接着に中心的な役割を果たしている。ラミニンはまた、細胞の増殖、遊走、神経突起伸長等の多くの生物学的活性を有することが知られている。
ラミニンの活性は、ラミニンと細胞表面の受容体との結合及びそれに共役した細胞内シグナル伝達を介したラミニンシグナル系を通じて発揮されると考えられている。ラミニンを受容する主要な受容体としては、インテグリンα６β１、α３β１、α６β４、α７β１、ジストログリカン、シンデカン等が知られている（非特許文献８）。
【０００８】
ラミニンは種々の組織に存在しており、脂肪組織においても発現している。脂肪細胞においては、特にラミニン−８（α４β１γ１）が多く発現していること、及びその遺伝子発現が分化成熟に伴い増加することが報告されている（非特許文献９）。しかし、脂肪組織におけるラミニンの発現量変化や生理的意義ついては、未だ充分には明らかにされていない。また、ラミニンが、分化成熟や脂肪蓄積といった脂肪細胞特性に与える影響についても解明されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−６３１５６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Curr. Opin. Lipidol., 1999, 10: 151-159
【非特許文献２】BMC Pharmacol., 2004, 4(23)
【非特許文献３】Cell 113, 2003: 159-170
【非特許文献４】Folia.Pharmacol.Jpn., 2003, 122: 294-300
【非特許文献５】Molecular Medicine., 2002, 39(4): 398-407
【非特許文献６】Diabetes., 2001, 50(5): 1076-1082
【非特許文献７】Nat.Med., 2000, 6(10): 1115-1120
【非特許文献８】Matrix Biology, 2006, 25(3): 189-197
【非特許文献９】Matrix Biology, 1997, 16(4): 223-230
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ラミニンの部分ペプチドを有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤、ならびに肥満予防及び／又は改善剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、細胞外マトリックスを含む細胞外環境が脂肪細胞特性に及ぼす効果について調べた。その結果、ラミニンが脂肪細胞の分化成熟及び脂肪蓄積を亢進させる作用を有しており、この作用をラミニン−受容体結合を阻害する作用を有するペプチドにより妨げることにより、脂肪細胞の分化成熟及び脂肪蓄積を抑制することができることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
（２）上記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、（１）記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
（３）上記ポリペプチドのＣ末アミド化体がポリエチレングリコールと結合されている、（１）又は（２）のいずれか１に記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、肥満予防及び／又は改善剤。
（５）上記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、（４）記載の肥満予防及び／又は改善剤。
（６）上記ポリペプチドのＣ末アミド化体がポリエチレングリコールと結合されている、（４）又は（５）記載の肥満予防及び／又は改善剤。
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする医薬又は医薬部外品。
（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする外用剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、脂肪細胞の分化成熟又は脂肪蓄積を抑制することができ、ひいては全身又は局所的に体脂肪を低減させ、さらには体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防、改善に有効な素材を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラミニンによる脂肪細胞の分化成熟促進効果：分化した脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子の発現量に対するラミニンの影響。ＬＭ；ラミニン、＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；Ｐ＜０．０１、＊＊＊；Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、エラーバー＝標準誤差、ｎ＝３。
【図２】ラミニンによる脂肪蓄積促進効果。Ａ：Oil-red O染色された脂肪細胞、Ｂ：細胞の染色度（Oil-red O染色細胞のイソプロパノール抽出物の相対吸光度）。ＬＭ；ラミニン、＊；Ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、エラーバー＝標準誤差、ｎ＝３。
【図３】実施例で使用したラミニン部分ペプチド。
【図４】ラミニン部分ペプチドによる脂肪細胞におけるFabp4発現抑制。＊＊；Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
【００１７】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１８】
本明細書において、「改善」とは、疾患又は症状の好転、疾患又は症状の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１９】
本明細書において、ラミニンシグナルとは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一種であるラミニンより、細胞膜表面上に存在するラミニン受容体を介して、細胞内にシグナルが伝達される一連の過程を指す。すなわち、ラミニンシグナルとは、例えば、細胞によるラミニンの発現量又はラミニン受容体の発現量、細胞表面のラミニン受容体とラミニンとの結合、ラミニンに起因する細胞内シグナル伝達等であり得る。
【００２０】
後述の参考例に示すように、ラミニンは、脂肪細胞の分化成熟を促進する作用や、脂肪細胞への脂肪蓄積を促進する作用を有する。すなわち、ラミニンによって引き起こされる細胞のシグナル伝達（ラミニンシグナル）とそれに続く細胞活動を抑制することができる物質は、脂肪細胞の分化成熟を抑制し、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制する効果を有する物質として有用である。
ラミニンシグナルの抑制方法としては、ペプチドや、ラミニン又はその受容体に対する中和抗体を用いて、ラミニンとインテグリンの結合を競合的に阻害するか、又はインテグリンシグナルを負に制御する方法、あるいはラミニン又はその受容体に対するｓｉＲＮＡ等を用いて、脂肪細胞におけるラミニン又はその受容体の発現量を下げる方法が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００２１】
さらに後述の実施例に示すように、ラミニン部分ペプチドに由来する特定の配列を有するポリペプチドのＣ末アミド化体は、ラミニンと細胞のラミニン受容体との結合を阻害することによって、ラミニンによって引き起こされる脂肪細胞の分化成熟プロセスの進行を抑える作用を有する。従って、当該ラミニン部分ペプチドのＣ末アミド化体やそれと同等のラミニン−受容体結合の阻害作用を有するペプチドやその修飾体は、脂肪細胞の分化成熟抑制のため、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制のため、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００２２】
従って、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤を提供する。
また本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、肥満予防及び／又は改善剤を提供する。
一態様において、上記の剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体のみから本質的に構成されていてもよい。
【００２３】
本発明の有効成分として用いられるポリペプチドのＣ末アミド化体は、アミノ酸配列ＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ：配列番号１）のＮ末端方向に０〜３個のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｃ末端アミノ酸残基のカルボキシル基−ＣＯＯＨが、アミド化されて−ＣＯＮＨ2になっているものであり、且つラミニンと細胞のラミニン受容体との結合を阻害する作用を有するものであればよい。すなわち、本発明の有効成分として用いられるポリペプチドのＣ末アミド化体は、（Ｘ）ｎ−ＹＩＧＳＲ（Ｘは任意のアミノ酸残基、ｎは０〜３の整数）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体である。当該ポリペプチドの例としては、配列番号１からなるポリペプチド、および配列番号２（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
上記配列番号１で示されるポリペプチドは、マウスラミニンβ１鎖の９９８−１００２番アミノ酸からなるラミニンフラグメント、又はヒトラミニンβ１鎖の９５０−９５４番アミノ酸からなるラミニンフラグメントに相当する。マウス及びヒトのラミニンβ１鎖のアミノ酸配列は、データベース（ＮＣＢＩ）に、それぞれ（ＮＭ＿００８４８２）及び（ＮＭ＿００２２９１）として登録されている。従って、上記データベースの情報に基づいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む任意の領域を選択することによって、本発明に用いられるポリペプチドを同定することが可能である。
【００２５】
上記のように選択されたラミニンの部分ペプチドは、配列番号１で示されるポリペプチドを含む限りにおいて、且つラミニンと細胞のラミニン受容体との結合を阻害する作用を有する限りにおいて、さらにアミノ酸が変異されていてもよい。例えば、１個〜３個、好ましくは１個〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が変異されていてもよい。ここで、変異とは、アミノ酸の欠失、置換、付加を意味する。
【００２６】
本発明で使用されるポリペプチドのＣ末アミド化体は、Ｃ末端α−アミド化酵素等を用いた生化学的な手法、有機合成的な手法等の公知の方法に従って、任意のポリペプチドのＣ末端をアミド化することにより作製することができる。あるいは、Ｃ末アミド化されたポリペプチドは、Biomatik Corporation、Greiner-Bio One等から購入することができる。
【００２７】
上記ポリペプチドのＣ末アミド化体は、修飾されていてもよい。当該修飾されたポリペプチドのＣ末アミド化体は、そのラミニンと受容体との結合を阻害する作用が本質的に失われない限りにおいて、当該分野で一般的に利用されている任意の手段で修飾されたものであり得る。好ましい例としては、配列番号１のポリペプチドのＣ末アミド化体にポリエチレングリコールを結合させた修飾体が挙げられる。
【００２８】
上記ポリペプチドのＣ末アミド化体はまた、脂肪細胞の分化成熟抑制のため、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制のため、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のための組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等の製造のために使用することができる。
これらの組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。上記ポリペプチドのＣ末アミド化体は、当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等に配合され、脂肪細胞の分化成熟抑制のため、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制のため、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のための有効成分であり得る。当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等もまた、本発明の範囲内である。
【００２９】
上記医薬、医薬部外品又は外用剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよいが、経口投与が好ましい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシロール、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。外用剤の剤型としては、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、貼布剤、スプレー等が挙げられる。
【００３０】
上記医薬、医薬部外品又は外用剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を単独で含有していてもよく、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬や医薬部外品、外用剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体のラミニン−受容体結合の阻害作用が失われない限り、他の有効成分や薬理成分を含有していてもよい。
【００３１】
上記飲食品又は飼料は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分として含有する。本発明の飲食品又は飼料は、脂肪細胞の分化成熟抑制、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制、体脂肪蓄積抑制、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善等の機能を企図して、必要に応じて当該機能が表示された、美容用飲食品、栄養機能飲食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品等の機能性飲食品又は飼料であり得る。
【００３２】
上記飲食品は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を単独で含有していてもよく、又は、当該ポリペプチドのＣ末アミド化体のラミニン−受容体結合の阻害作用が失われない限りにおいて、他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。
飲料としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、ニアウォーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等、あらゆる飲料が挙げられる。また、飲料は、容器に充填した容器詰飲料とすることができる。
食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態であってもよく、また錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。例えば、食品としては、パン類、ケーキ類、麺類、パスタ、菓子類、ゼリー類、各種スナック類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料、スープ類、食用油等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
【００３３】
上記飼料は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を単独で含有していてもよく、又は、当該ポリペプチドのＣ末アミド化体のラミニン−受容体結合の阻害作用が失われない限りにおいて、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて含有していてもよい。飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
【００３４】
上記医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品又は飼料は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体から、あるいは必要に応じて上記担体、添加剤、あるいは他の有効成分、薬理成分、食材又は原料を組みあわせて、常法により製造することができる。
当該医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品又は飼料における上記ポリペプチドの含有量は、通常０．００００１〜１０質量％であればよく、０．０００１〜５質量％とするのが好ましい。
【００３５】
また本発明は、脂肪細胞の分化成熟及び／又は脂肪蓄積を抑制する方法を提供する。当該方法は、脂肪細胞に、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を添加又は投与する工程を含む。投与対象としては、動物由来の脂肪組織、脂肪細胞、又はそれらの培養物、ならびに動物であって、脂肪細胞の分化成熟及び／又は脂肪蓄積の抑制を必要とするものが挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３６】
また本発明は、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のための方法を提供する。当該方法は、体脂肪蓄積抑制、あるいは上記疾患の予防及び／又は改善を必要とする動物に、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を投与する工程を含む。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。好ましい態様において、当該方法は肥満の予防及び／又は改善方法である。
【００３７】
上述した本発明の方法において、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を添加又は投与する濃度は、対象が培養細胞の場合は、培養物中の最終濃度として０．０００５〜２０％（ｗ/ｖ）、好ましくは０．００５〜１０％（ｗ/ｖ）であり、成人に投与する場合は、一日当たり、外用の場合０．０００１〜１０％、好ましくは０．０００５〜５％、経口投与の場合０．０００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０００５〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。上述した本発明の方法は、一態様において、美容目的の痩身をコンセプトとした、非治療的方法であり得る。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００３９】
参考例１ ラミニンによる脂肪細胞の分化成熟促進効果
実験には、マウス前駆脂肪細胞由来細胞株３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を用いた。通常の培地は、１０％calf serumを添加したhigh glucose Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2条件下にて培養した。
ラミニンでコートした６穴ディッシュ（ＢＤ社）に３Ｔ３−Ｌ１細胞を撒き、１００％コンフルエントになるまで通常培養した後、分化誘導培地に培地交換した。分化誘導培地は、通常培地に５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、０．１１５ｍｇ／ｍｌイソブチルメチルキサンチンを添加したものを用いた。分化誘導培地に交換した日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に再び通常培地に培地交換した。以後は２日おきに培地交換を行い、ｄａｙ１０に細胞を回収した（ラミニン群）。対照として、ラミニンコートなしのディッシュを用いて同様の条件下で培養した細胞を回収した（コントロール群）。
【００４０】
得られた細胞について、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として、7500 Fast Real-Time PCR System（アプライドバイオシステム社）を用いた定量的ＰＣＲにより、Fabp4、PPARγ、GLUT4、LPL、ACC-1、FAS、DGAT、HSL及びATGLの各遺伝子の発現量を測定した。
Fabp4は脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られている。PPARγは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして知られている。またGLUT4及びLPLは糖・脂質取り込みに関連する遺伝子であり、ACC-1、FAS及びDGATは脂質合成関連遺伝子であり、HSL及びATGLは脂質分解関連遺伝子であり、これらはいずれも、エネルギー代謝に関わる主要遺伝子として知られている。
測定した各遺伝子の発現量は、内部標準（３６Ｂ４遺伝子発現量）により補正した。得られた値は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【００４１】
結果を図１に示す。脂肪細胞の分化成熟マーカーであるFabp4のｍＲＮＡ発現量は、ラミニンにより有意に上昇し、コントロール群の２．４倍に達した。また脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとされる転写因子PPARγのｍＲＮＡ発現量も、ラミニンにより有意に上昇し、コントロール群の３．５倍に達した。さらに、エネルギー代謝に関わる主要遺伝子（GLUT4、LPL、ACC-1、FASおよびDGAT）の発現も、ラミニンにより有意に上昇した。これらの結果より、ラミニンが脂肪細胞の分化成熟を促進することが示された。さらに、GLUT4、LPL、ACC-1、FASおよびDGATは糖・脂質の取り込みや脂質合成に関わる遺伝子であることから、ラミニンが、脂肪細胞における脂肪蓄積を促進することが示された。従って、ラミニンシグナルを抑制することは、脂肪細胞の分化成熟及び脂肪蓄積を抑制することにつながり、またラミニンシグナルは、脂肪細胞の分化成熟抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤の探索の指標として有効である。
【００４２】
参考例２ ラミニンによる脂肪蓄積促進効果
実施例１と同様の手法にて回収された脂肪細胞を１０％ホルマリンで固定後、細胞内の脂肪滴をＯｉｌ−ｒｅｄ Ｏ染色液により染色し、実体顕微鏡により観察、撮影を行った。Ｏｉｌ−ｒｅｄ Ｏ染色液は、Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏストック溶液（０．５％Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏ／イソプロパノール）とＤＤＷを３：２で混合し、０．５ｍｍフィルターにてろ過したものを用いた。細胞の染色度（脂肪含有量）を定量するため、イソプロパノールにより細胞から色素を抽出し、吸光度ＯＤ４５０を測定し、コントロール群の吸光度を１とした相対吸光度を求めた。得られた吸光度は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【００４３】
結果を図２に示す。ラミニン群のＯｉｌ−ｒｅｄ Ｏ染色度は、コントロール群と比較し強く（図２Ａ）、染色度の定量解析でも有意な差が見られた（図２Ｂ）。これらの結果より、ラミニンが脂肪細胞の脂肪蓄積を促進することが示された。従って、ラミニンシグナルを抑制することは、脂肪細胞の脂肪蓄積を抑制することにつながり、またラミニンシグナルは、脂肪細胞の脂肪蓄積抑制剤の探索の指標として有効である。
【００４４】
実施例１ ラミニンシグナル抑制による脂肪細胞の分化成熟抑制効果
ラミニン部分ペプチドＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ：配列番号１）は、ラミニンβ１鎖の部分ペプチドである。このペプチドは、ラミニンの主要な受容体結合配列であり、ラミニンがラミニン受容体へ結合することを競合的に阻害する（Graf et al, Biochemistry, 1987, 26(22):6896-6900、及び野水基義，蛋白質・核酸・酵素, 2000, 45(14):2475-2482を参照）。このラミニン部分ペプチドによる脂肪細胞の分化成熟抑制効果を調べた。
【００４５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み鎖長の異なる以下の５つのペプチド（配列番号１〜５）のＣ末端がアミド化されたＣ末アミド化ペプチド、及び配列番号１で示される非アミド化ペプチドを、Biomatik Corporationから購入した。これらの６種類のペプチド（表１及び図３）を、以下の実験に使用した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
ラット皮下脂肪由来の初代培養細胞を、試験ペプチド１〜６のいずれか（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加した通常培地に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした後、ラミニンでコートした６穴ディッシュ（ＢＤ社）に播種した。以後、全ての培地に上記試験ペプチド１〜６のいずれか（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加した。
１０％calf serumを添加したhigh glucose Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ2条件下にて、細胞を１００％コンフルエントになるまで通常培養した後、分化誘導培地に培地交換した。分化誘導培地は、通常培地に５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、０．１１５ｍｇ／ｍｌイソブチルメチルキサンチンを添加したものを用いた。分化誘導培地に交換した日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に再び通常培地に培地交換した。以後は２日おきに培地交換を行い、ｄａｙ１０に細胞を回収した（ラミニン群）。対照として、ラミニンコートなしのディッシュを用いて同様の条件下で培養した細胞を回収した（コントロール群）。
得られた細胞について、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られているFabp4の発現について定量的ＰＣＲを行った。Fabp4遺伝子発現量は、内部標準（３６Ｂ４遺伝子発現量）により補正した。得られた値は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【００４８】
結果を図４に示す。脂肪細胞の分化成熟マーカーであるFabp4の発現はラミニン存在下で増加するが（ラミニンコート群）、配列番号１で示されるラミニン部分ペプチドのＣ末アミド化体（試験ペプチド１）を添加すると、ラミニンとその受容体との結合が競合的に阻害され、Fabp4発現量は有意に低下した（抑制率４４％）。また配列番号２で示されるラミニン部分ペプチド（試験ペプチド２）によっても、Fabp4発現量は低下傾向を示した（抑制率１４％）。一方、Ｃ末端をアミド化しない配列番号１で示されるラミニン部分ペプチド（試験ペプチド６）を添加した場合には、Fabp4発現低下は見られなかった。配列番号１及び２で示されるラミニン部分ペプチドのＣ末アミド化体は、ラミニンによって引き起こされる脂肪細胞の分化成熟プロセスの進行を抑え、成熟脂肪細胞による脂肪蓄積を抑制することができる。
【００４９】
製造実施例
製造例１ 錠剤
下記組成を有する組成物を打錠し、錠剤を製造した（１錠＝２５０ｍｇ）。
組成 配合量（質量％）
ポリペプチド（配列番号１） １０
コーンスターチ ５０
セルロース １０
乳糖 ３０
【００５０】
製造例２ カプセル剤
下記組成を有する組成物をカプセル中に封入し、カプセル剤を製造した（１カプセル＝３００ｍｇ）。
組成 配合量（質量％）
ポリペプチド（配列番号１） １５
ビタミンＣ ２０
セルロース １０
コーンスターチ ４０
トコフェロール ２
乳糖 １３
【００５１】
製造例３ 外用剤
下記組成の原料を定法にて混合し、外用剤を製造した。
組成 配合量（質量％）
ポリペプチド（配列番号１） ０．５
グリセリンモノステオレート １
エタノール １５
プロピレングリコール ４
イソプロピルパルミテート ３
ラノリン １
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
香料、色素 微量
精製水 残量
【００５２】
製造例４ 注射剤
下記組成の原料を定法にて混合し、加熱滅菌して注射剤を製造した（１アンプル＝５ｍＬ）。
組成 配合量
ポリペプチド（配列番号１） １５ｍｇ
ブドウ糖 １００ｍｇ
注射用蒸留水 ５ｍＬ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞の分化成熟抑制剤、脂肪蓄積抑制剤、ならびに肥満予防及び／又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化、運動不足、ストレス等により、肥満人口は増加の一途を辿っている。肥満は、インスリン抵抗性や動脈硬化といった種々の生活習慣病の発症原因にもなることが報告されており、国民の健康維持・増進の観点において大きな社会問題となっている。
【０００３】
肥満は、体脂肪が過剰に蓄積した状態を指し、摂取エネルギー量が消費エネルギー量を上回ることにより生じる。従って、摂取エネルギー量を減らすか又は消費エネルギー量を増やすことは、肥満の予防・改善につながると考えられる。肥満及び肥満に関連する各種生活習慣病を予防・改善する方法としては、例えば、運動、カロリー制限、生活習慣の改善等が挙げられる。これらは一般には肥満の予防・改善に有効とされているが、これらのみでは大抵の場合充分な効果が得られないことが多い。
【０００４】
そこで、これまで、肥満改善剤や脂質代謝促進剤の開発を目指し、盛んに研究がなされてきた。例えば、エネルギー代謝の促進を目的とするものとして、PPAR（Peroxisome Proliferator Activated Receptor：ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）活性化剤（非特許文献１〜３）又は阻害剤（非特許文献４）、AMPK（AMP-activated protein kinase）活性化剤（非特許文献５、６）等が挙げられる。また脂肪合成の抑制を目的とするものとして、ACC-1（acetyl-CoA carboxylase）阻害剤（非特許文献７）、FAS（Fatty Acid Synthase）阻害剤（特許文献１）等が挙げられる。しかしこれらの効果もやはり、必ずしも充分なものではなかった。
【０００５】
肥満はまた、脂肪細胞の肥大化及び細胞数の増加と密接に連動しており、従って、前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化を抑制すること、あるいは脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制することは、肥満の治療及び予防に有効と考えられる。脂肪細胞を成熟脂肪細胞へと分化させる誘導刺激としては、インスリン、デキサメタゾンおよびイソブチルメチルキサンチンが知られている。これらの分化誘導刺激に伴い、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとされる転写因子群、PPARsおよびC/EBPsの発現が上昇し、次いで、脂質合成に関わるACC-1、FAS及びDGAT（diacylglycerol acyltransferase）や、糖・脂質の取り込みに関わるGLUT4（glucose transporter 4）及びLPL（lipoprotein lipase）等の成熟脂肪細胞に特異的に発現する種々の脂質代謝関連遺伝子の発現が上昇する。また、脂肪酸輸送担体であるFabp4（fatty acid binding protein 4）も、分化した脂肪細胞特異的に発現する脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られている。
【０００６】
脂肪細胞は、他の細胞種と同様、細胞周囲を細胞外マトリックス（ＥＣＭ；extracellular matrix）に囲まれている。ＥＣＭは、単に細胞接着のための足場を提供するだけでなく、細胞膜表面に存在する受容体を介し、細胞の増殖、分化、遊走など多くの生理活性に寄与することが報告されている。ＥＣＭの分子組成は細胞により異なっており、細胞は、特定の分子組成からなるＥＣＭという環境を自ら形成することで、細胞機能を適当な状態に発現・維持していると考えられる。
【０００７】
ラミニンは、上皮細胞層と間質細胞層との間に存在するＥＣＭである基底膜の、主要構成成分として知られているタンパク質である。ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖からなるヘテロトリマーを形成しており、基底膜への細胞接着に中心的な役割を果たしている。ラミニンはまた、細胞の増殖、遊走、神経突起伸長等の多くの生物学的活性を有することが知られている。
ラミニンの活性は、ラミニンと細胞表面の受容体との結合及びそれに共役した細胞内シグナル伝達を介したラミニンシグナル系を通じて発揮されると考えられている。ラミニンを受容する主要な受容体としては、インテグリンα６β１、α３β１、α６β４、α７β１、ジストログリカン、シンデカン等が知られている（非特許文献８）。
【０００８】
ラミニンは種々の組織に存在しており、脂肪組織においても発現している。脂肪細胞においては、特にラミニン−８（α４β１γ１）が多く発現していること、及びその遺伝子発現が分化成熟に伴い増加することが報告されている（非特許文献９）。しかし、脂肪組織におけるラミニンの発現量変化や生理的意義ついては、未だ充分には明らかにされていない。また、ラミニンが、分化成熟や脂肪蓄積といった脂肪細胞特性に与える影響についても解明されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−６３１５６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Curr. Opin. Lipidol., 1999, 10: 151-159
【非特許文献２】BMC Pharmacol., 2004, 4(23)
【非特許文献３】Cell 113, 2003: 159-170
【非特許文献４】Folia.Pharmacol.Jpn., 2003, 122: 294-300
【非特許文献５】Molecular Medicine., 2002, 39(4): 398-407
【非特許文献６】Diabetes., 2001, 50(5): 1076-1082
【非特許文献７】Nat.Med., 2000, 6(10): 1115-1120
【非特許文献８】Matrix Biology, 2006, 25(3): 189-197
【非特許文献９】Matrix Biology, 1997, 16(4): 223-230
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ラミニンの部分ペプチドを有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤、ならびに肥満予防及び／又は改善剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、細胞外マトリックスを含む細胞外環境が脂肪細胞特性に及ぼす効果について調べた。その結果、ラミニンが脂肪細胞の分化成熟及び脂肪蓄積を亢進させる作用を有しており、この作用をラミニン−受容体結合を阻害する作用を有するペプチドにより妨げることにより、脂肪細胞の分化成熟及び脂肪蓄積を抑制することができることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
（２）上記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、（１）記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
（３）上記ポリペプチドのＣ末アミド化体がポリエチレングリコールと結合されている、（１）又は（２）のいずれか１に記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、肥満予防及び／又は改善剤。
（５）上記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、（４）記載の肥満予防及び／又は改善剤。
（６）上記ポリペプチドのＣ末アミド化体がポリエチレングリコールと結合されている、（４）又は（５）記載の肥満予防及び／又は改善剤。
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする医薬又は医薬部外品。
（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする外用剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、脂肪細胞の分化成熟又は脂肪蓄積を抑制することができ、ひいては全身又は局所的に体脂肪を低減させ、さらには体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防、改善に有効な素材を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラミニンによる脂肪細胞の分化成熟促進効果：分化した脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子の発現量に対するラミニンの影響。ＬＭ；ラミニン、＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；Ｐ＜０．０１、＊＊＊；Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、エラーバー＝標準誤差、ｎ＝３。
【図２】ラミニンによる脂肪蓄積促進効果。Ａ：Oil-red O染色された脂肪細胞、Ｂ：細胞の染色度（Oil-red O染色細胞のイソプロパノール抽出物の相対吸光度）。ＬＭ；ラミニン、＊；Ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、エラーバー＝標準誤差、ｎ＝３。
【図３】実施例で使用したラミニン部分ペプチド。
【図４】ラミニン部分ペプチドによる脂肪細胞におけるFabp4発現抑制。＊＊；Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
【００１７】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１８】
本明細書において、「改善」とは、疾患又は症状の好転、疾患又は症状の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１９】
本明細書において、ラミニンシグナルとは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一種であるラミニンより、細胞膜表面上に存在するラミニン受容体を介して、細胞内にシグナルが伝達される一連の過程を指す。すなわち、ラミニンシグナルとは、例えば、細胞によるラミニンの発現量又はラミニン受容体の発現量、細胞表面のラミニン受容体とラミニンとの結合、ラミニンに起因する細胞内シグナル伝達等であり得る。
【００２０】
後述の参考例に示すように、ラミニンは、脂肪細胞の分化成熟を促進する作用や、脂肪細胞への脂肪蓄積を促進する作用を有する。すなわち、ラミニンによって引き起こされる細胞のシグナル伝達（ラミニンシグナル）とそれに続く細胞活動を抑制することができる物質は、脂肪細胞の分化成熟を抑制し、脂肪細胞への脂肪蓄積を抑制する効果を有する物質として有用である。
ラミニンシグナルの抑制方法としては、ペプチドや、ラミニン又はその受容体に対する中和抗体を用いて、ラミニンとインテグリンの結合を競合的に阻害するか、又はインテグリンシグナルを負に制御する方法、あるいはラミニン又はその受容体に対するｓｉＲＮＡ等を用いて、脂肪細胞におけるラミニン又はその受容体の発現量を下げる方法が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００２１】
さらに後述の実施例に示すように、ラミニン部分ペプチドに由来する特定の配列を有するポリペプチドのＣ末アミド化体は、ラミニンと細胞のラミニン受容体との結合を阻害することによって、ラミニンによって引き起こされる脂肪細胞の分化成熟プロセスの進行を抑える作用を有する。従って、当該ラミニン部分ペプチドのＣ末アミド化体やそれと同等のラミニン−受容体結合の阻害作用を有するペプチドやその修飾体は、脂肪細胞の分化成熟抑制のため、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制のため、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００２２】
従って、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤を提供する。
また本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、肥満予防及び／又は改善剤を提供する。
一態様において、上記の剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体のみから本質的に構成されていてもよい。
【００２３】
本発明の有効成分として用いられるポリペプチドのＣ末アミド化体は、アミノ酸配列ＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ：配列番号１）のＮ末端方向に０〜３個のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｃ末端アミノ酸残基のカルボキシル基−ＣＯＯＨが、アミド化されて−ＣＯＮＨ2になっているものであり、且つラミニンと細胞のラミニン受容体との結合を阻害する作用を有するものであればよい。すなわち、本発明の有効成分として用いられるポリペプチドのＣ末アミド化体は、（Ｘ）ｎ−ＹＩＧＳＲ（Ｘは任意のアミノ酸残基、ｎは０〜３の整数）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体である。当該ポリペプチドの例としては、配列番号１からなるポリペプチド、および配列番号２（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
上記配列番号１で示されるポリペプチドは、マウスラミニンβ１鎖の９９８−１００２番アミノ酸からなるラミニンフラグメント、又はヒトラミニンβ１鎖の９５０−９５４番アミノ酸からなるラミニンフラグメントに相当する。マウス及びヒトのラミニンβ１鎖のアミノ酸配列は、データベース（ＮＣＢＩ）に、それぞれ（ＮＭ＿００８４８２）及び（ＮＭ＿００２２９１）として登録されている。従って、上記データベースの情報に基づいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む任意の領域を選択することによって、本発明に用いられるポリペプチドを同定することが可能である。
【００２５】
上記のように選択されたラミニンの部分ペプチドは、配列番号１で示されるポリペプチドを含む限りにおいて、且つラミニンと細胞のラミニン受容体との結合を阻害する作用を有する限りにおいて、さらにアミノ酸が変異されていてもよい。例えば、１個〜３個、好ましくは１個〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が変異されていてもよい。ここで、変異とは、アミノ酸の欠失、置換、付加を意味する。
【００２６】
本発明で使用されるポリペプチドのＣ末アミド化体は、Ｃ末端α−アミド化酵素等を用いた生化学的な手法、有機合成的な手法等の公知の方法に従って、任意のポリペプチドのＣ末端をアミド化することにより作製することができる。あるいは、Ｃ末アミド化されたポリペプチドは、Biomatik Corporation、Greiner-Bio One等から購入することができる。
【００２７】
上記ポリペプチドのＣ末アミド化体は、修飾されていてもよい。当該修飾されたポリペプチドのＣ末アミド化体は、そのラミニンと受容体との結合を阻害する作用が本質的に失われない限りにおいて、当該分野で一般的に利用されている任意の手段で修飾されたものであり得る。好ましい例としては、配列番号１のポリペプチドのＣ末アミド化体にポリエチレングリコールを結合させた修飾体が挙げられる。
【００２８】
上記ポリペプチドのＣ末アミド化体はまた、脂肪細胞の分化成熟抑制のため、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制のため、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のための組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等の製造のために使用することができる。
これらの組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。上記ポリペプチドのＣ末アミド化体は、当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等に配合され、脂肪細胞の分化成熟抑制のため、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制のため、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のための有効成分であり得る。当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品、飼料等もまた、本発明の範囲内である。
【００２９】
上記医薬、医薬部外品又は外用剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよいが、経口投与が好ましい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシロール、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。外用剤の剤型としては、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、貼布剤、スプレー等が挙げられる。
【００３０】
上記医薬、医薬部外品又は外用剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を単独で含有していてもよく、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬や医薬部外品、外用剤は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体のラミニン−受容体結合の阻害作用が失われない限り、他の有効成分や薬理成分を含有していてもよい。
【００３１】
上記飲食品又は飼料は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分として含有する。本発明の飲食品又は飼料は、脂肪細胞の分化成熟抑制、脂肪細胞への脂肪蓄積抑制、体脂肪蓄積抑制、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善等の機能を企図して、必要に応じて当該機能が表示された、美容用飲食品、栄養機能飲食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品等の機能性飲食品又は飼料であり得る。
【００３２】
上記飲食品は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を単独で含有していてもよく、又は、当該ポリペプチドのＣ末アミド化体のラミニン−受容体結合の阻害作用が失われない限りにおいて、他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。
飲料としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、ニアウォーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等、あらゆる飲料が挙げられる。また、飲料は、容器に充填した容器詰飲料とすることができる。
食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態であってもよく、また錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。例えば、食品としては、パン類、ケーキ類、麺類、パスタ、菓子類、ゼリー類、各種スナック類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料、スープ類、食用油等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
【００３３】
上記飼料は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を単独で含有していてもよく、又は、当該ポリペプチドのＣ末アミド化体のラミニン−受容体結合の阻害作用が失われない限りにおいて、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて含有していてもよい。飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
【００３４】
上記医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品又は飼料は、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体から、あるいは必要に応じて上記担体、添加剤、あるいは他の有効成分、薬理成分、食材又は原料を組みあわせて、常法により製造することができる。
当該医薬、医薬部外品、外用剤、飲食品又は飼料における上記ポリペプチドの含有量は、通常０．００００１〜１０質量％であればよく、０．０００１〜５質量％とするのが好ましい。
【００３５】
また本発明は、脂肪細胞の分化成熟及び／又は脂肪蓄積を抑制する方法を提供する。当該方法は、脂肪細胞に、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を添加又は投与する工程を含む。投与対象としては、動物由来の脂肪組織、脂肪細胞、又はそれらの培養物、ならびに動物であって、脂肪細胞の分化成熟及び／又は脂肪蓄積の抑制を必要とするものが挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３６】
また本発明は、体脂肪蓄積抑制のため、あるいは体脂肪蓄積に起因する肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、心血管疾患等の症状の予防及び／又は改善のための方法を提供する。当該方法は、体脂肪蓄積抑制、あるいは上記疾患の予防及び／又は改善を必要とする動物に、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を投与する工程を含む。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。好ましい態様において、当該方法は肥満の予防及び／又は改善方法である。
【００３７】
上述した本発明の方法において、上記ポリペプチドのＣ末アミド化体を添加又は投与する濃度は、対象が培養細胞の場合は、培養物中の最終濃度として０．０００５〜２０％（ｗ/ｖ）、好ましくは０．００５〜１０％（ｗ/ｖ）であり、成人に投与する場合は、一日当たり、外用の場合０．０００１〜１０％、好ましくは０．０００５〜５％、経口投与の場合０．０００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０００５〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。上述した本発明の方法は、一態様において、美容目的の痩身をコンセプトとした、非治療的方法であり得る。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００３９】
参考例１ ラミニンによる脂肪細胞の分化成熟促進効果
実験には、マウス前駆脂肪細胞由来細胞株３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を用いた。通常の培地は、１０％calf serumを添加したhigh glucose Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2条件下にて培養した。
ラミニンでコートした６穴ディッシュ（ＢＤ社）に３Ｔ３−Ｌ１細胞を撒き、１００％コンフルエントになるまで通常培養した後、分化誘導培地に培地交換した。分化誘導培地は、通常培地に５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、０．１１５ｍｇ／ｍｌイソブチルメチルキサンチンを添加したものを用いた。分化誘導培地に交換した日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に再び通常培地に培地交換した。以後は２日おきに培地交換を行い、ｄａｙ１０に細胞を回収した（ラミニン群）。対照として、ラミニンコートなしのディッシュを用いて同様の条件下で培養した細胞を回収した（コントロール群）。
【００４０】
得られた細胞について、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として、7500 Fast Real-Time PCR System（アプライドバイオシステム社）を用いた定量的ＰＣＲにより、Fabp4、PPARγ、GLUT4、LPL、ACC-1、FAS、DGAT、HSL及びATGLの各遺伝子の発現量を測定した。
Fabp4は脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られている。PPARγは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして知られている。またGLUT4及びLPLは糖・脂質取り込みに関連する遺伝子であり、ACC-1、FAS及びDGATは脂質合成関連遺伝子であり、HSL及びATGLは脂質分解関連遺伝子であり、これらはいずれも、エネルギー代謝に関わる主要遺伝子として知られている。
測定した各遺伝子の発現量は、内部標準（３６Ｂ４遺伝子発現量）により補正した。得られた値は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【００４１】
結果を図１に示す。脂肪細胞の分化成熟マーカーであるFabp4のｍＲＮＡ発現量は、ラミニンにより有意に上昇し、コントロール群の２．４倍に達した。また脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとされる転写因子PPARγのｍＲＮＡ発現量も、ラミニンにより有意に上昇し、コントロール群の３．５倍に達した。さらに、エネルギー代謝に関わる主要遺伝子（GLUT4、LPL、ACC-1、FASおよびDGAT）の発現も、ラミニンにより有意に上昇した。これらの結果より、ラミニンが脂肪細胞の分化成熟を促進することが示された。さらに、GLUT4、LPL、ACC-1、FASおよびDGATは糖・脂質の取り込みや脂質合成に関わる遺伝子であることから、ラミニンが、脂肪細胞における脂肪蓄積を促進することが示された。従って、ラミニンシグナルを抑制することは、脂肪細胞の分化成熟及び脂肪蓄積を抑制することにつながり、またラミニンシグナルは、脂肪細胞の分化成熟抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤の探索の指標として有効である。
【００４２】
参考例２ ラミニンによる脂肪蓄積促進効果
実施例１と同様の手法にて回収された脂肪細胞を１０％ホルマリンで固定後、細胞内の脂肪滴をＯｉｌ−ｒｅｄ Ｏ染色液により染色し、実体顕微鏡により観察、撮影を行った。Ｏｉｌ−ｒｅｄ Ｏ染色液は、Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏストック溶液（０．５％Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏ／イソプロパノール）とＤＤＷを３：２で混合し、０．５ｍｍフィルターにてろ過したものを用いた。細胞の染色度（脂肪含有量）を定量するため、イソプロパノールにより細胞から色素を抽出し、吸光度ＯＤ４５０を測定し、コントロール群の吸光度を１とした相対吸光度を求めた。得られた吸光度は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【００４３】
結果を図２に示す。ラミニン群のＯｉｌ−ｒｅｄ Ｏ染色度は、コントロール群と比較し強く（図２Ａ）、染色度の定量解析でも有意な差が見られた（図２Ｂ）。これらの結果より、ラミニンが脂肪細胞の脂肪蓄積を促進することが示された。従って、ラミニンシグナルを抑制することは、脂肪細胞の脂肪蓄積を抑制することにつながり、またラミニンシグナルは、脂肪細胞の脂肪蓄積抑制剤の探索の指標として有効である。
【００４４】
実施例１ ラミニンシグナル抑制による脂肪細胞の分化成熟抑制効果
ラミニン部分ペプチドＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ：配列番号１）は、ラミニンβ１鎖の部分ペプチドである。このペプチドは、ラミニンの主要な受容体結合配列であり、ラミニンがラミニン受容体へ結合することを競合的に阻害する（Graf et al, Biochemistry, 1987, 26(22):6896-6900、及び野水基義，蛋白質・核酸・酵素, 2000, 45(14):2475-2482を参照）。このラミニン部分ペプチドによる脂肪細胞の分化成熟抑制効果を調べた。
【００４５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み鎖長の異なる以下の５つのペプチド（配列番号１〜５）のＣ末端がアミド化されたＣ末アミド化ペプチド、及び配列番号１で示される非アミド化ペプチドを、Biomatik Corporationから購入した。これらの６種類のペプチド（表１及び図３）を、以下の実験に使用した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
ラット皮下脂肪由来の初代培養細胞を、試験ペプチド１〜６のいずれか（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加した通常培地に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした後、ラミニンでコートした６穴ディッシュ（ＢＤ社）に播種した。以後、全ての培地に上記試験ペプチド１〜６のいずれか（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加した。
１０％calf serumを添加したhigh glucose Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ2条件下にて、細胞を１００％コンフルエントになるまで通常培養した後、分化誘導培地に培地交換した。分化誘導培地は、通常培地に５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、０．１１５ｍｇ／ｍｌイソブチルメチルキサンチンを添加したものを用いた。分化誘導培地に交換した日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に再び通常培地に培地交換した。以後は２日おきに培地交換を行い、ｄａｙ１０に細胞を回収した（ラミニン群）。対照として、ラミニンコートなしのディッシュを用いて同様の条件下で培養した細胞を回収した（コントロール群）。
得られた細胞について、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、脂肪細胞の分化成熟マーカーとして知られているFabp4の発現について定量的ＰＣＲを行った。Fabp4遺伝子発現量は、内部標準（３６Ｂ４遺伝子発現量）により補正した。得られた値は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【００４８】
結果を図４に示す。脂肪細胞の分化成熟マーカーであるFabp4の発現はラミニン存在下で増加するが（ラミニンコート群）、配列番号１で示されるラミニン部分ペプチドのＣ末アミド化体（試験ペプチド１）を添加すると、ラミニンとその受容体との結合が競合的に阻害され、Fabp4発現量は有意に低下した（抑制率４４％）。また配列番号２で示されるラミニン部分ペプチド（試験ペプチド２）によっても、Fabp4発現量は低下傾向を示した（抑制率１４％）。一方、Ｃ末端をアミド化しない配列番号１で示されるラミニン部分ペプチド（試験ペプチド６）を添加した場合には、Fabp4発現低下は見られなかった。配列番号１及び２で示されるラミニン部分ペプチドのＣ末アミド化体は、ラミニンによって引き起こされる脂肪細胞の分化成熟プロセスの進行を抑え、成熟脂肪細胞による脂肪蓄積を抑制することができる。
【００４９】
製造実施例
製造例１ 錠剤
下記組成を有する組成物を打錠し、錠剤を製造した（１錠＝２５０ｍｇ）。
組成 配合量（質量％）
ポリペプチド（配列番号１） １０
コーンスターチ ５０
セルロース １０
乳糖 ３０
【００５０】
製造例２ カプセル剤
下記組成を有する組成物をカプセル中に封入し、カプセル剤を製造した（１カプセル＝３００ｍｇ）。
組成 配合量（質量％）
ポリペプチド（配列番号１） １５
ビタミンＣ ２０
セルロース １０
コーンスターチ ４０
トコフェロール ２
乳糖 １３
【００５１】
製造例３ 外用剤
下記組成の原料を定法にて混合し、外用剤を製造した。
組成 配合量（質量％）
ポリペプチド（配列番号１） ０．５
グリセリンモノステオレート １
エタノール １５
プロピレングリコール ４
イソプロピルパルミテート ３
ラノリン １
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
香料、色素 微量
精製水 残量
【００５２】
製造例４ 注射剤
下記組成の原料を定法にて混合し、加熱滅菌して注射剤を製造した（１アンプル＝５ｍＬ）。
組成 配合量
ポリペプチド（配列番号１） １５ｍｇ
ブドウ糖 １００ｍｇ
注射用蒸留水 ５ｍＬ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【請求項３】
前記ポリペプチドがポリエチレングリコールと結合されている、請求項１又は２記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、肥満予防及び／又は改善剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、請求項４記載の肥満予防及び／又は改善剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドがポリエチレングリコールと結合されている、請求項４又は５記載の肥満予防及び／又は改善剤。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする医薬又は医薬部外品。
【請求項８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする外用剤。
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【請求項３】
前記ポリペプチドがポリエチレングリコールと結合されている、請求項１又は２記載の脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする、肥満予防及び／又は改善剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、請求項４記載の肥満予防及び／又は改善剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドがポリエチレングリコールと結合されている、請求項４又は５記載の肥満予防及び／又は改善剤。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする医薬又は医薬部外品。
【請求項８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に０〜３個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末アミド化体を有効成分とする外用剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−３５７６３（Ｐ２０１３−３５７６３Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７１６５８（Ｐ２０１１−１７１６５８）
【出願日】平成２３年８月５日（２０１１．８．５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月５日（２０１１．８．５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]