脂肪酸アミドヒドロラーゼ分析
本発明は、アンモニア生産酵素の活性を決定する方法、および、このような酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニア生産酵素の活性を決定する方法、および、酵素活性を調節する化合物の同定におけるそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）は膜内在性酵素であり、これは、オレアミドヒドロラーゼやアナンダミドアミドヒドロラーゼと称されることもある。ＦＡＡＨは、内因性シグナル伝達脂質として役立つことがわかっている脂肪酸の第一アミドとエタノールアミドを分解する。このような物質としては、内因性カンナビノイドであるアナンダミド、および、睡眠導入作用のあるオレアミドが挙げられる。（Ｍ．Ｐ．Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ等（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，１５１７７〜１５１８７；Ｍ．Ｍａｃｃａｒｒｏｎｅ等（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２３３２〜３２３３９）。ＦＡＡＨは各種の脂肪酸アミド（ＦＡＡ）を加水分解するが、ＦＡＡＨは、アラキドニルおよびオレイル基質に最も効果的に作用するようである（Ｂ．Ｆ．Ｃｒａｖａｔｔ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４，８３〜８７；および、Ｄ．Ｋ．Ｇｉａｎｇ等（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，２２３８〜２２４２）。ＦＡＡＨ阻害剤は、動物モデルにおいて痛み、炎症および不安を低減することが実証されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＦＡＡＨ活性を測定するための多数の分析が報告されている。これらの分析の大半は、ＦＡＡＨ活性を定量するために、放射標識した基質や薄層クロマトグラフィー、活性炭またはマススペクトロメトリーを利用している。加えて、基質としてｐ−ニトロアニリドを用いた分光光度分析や、蛍光置換分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ）が報告されている。しかしながら、これらの分析はいずれも、低いスループット、低い感度、または、放射活性物質を必要とするといった限定がある。ＦＡＡＨ活性を効率的に、迅速に、かつ正確に測定し、ＦＡＡＨを阻害または刺激する化合物を同定することができ、さらにハイスループットも可能な分析が有益であると予想される。
本明細書で引用された全ての公報、特許および特許出願は、本発明において参照によりその全体を加入させる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一形態において、本発明は、アンモニア生産酵素の活性を測定する方法を提供する。本方法は、二つの連動した反応を含む。その反応のうち一方は、生成物としてアンモニアを生産するアンモニア生産酵素によって触媒される。他方の反応は、基質としてアンモニアを利用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応である。本方法を実施するために、（１）アンモニア生産酵素、（２）アンモニア生産酵素のための、アンモニアを生産する基質、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼのための、アンモニア以外の還元的アミノ化基質、および、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼの還元型の補酵素を含む反応混合物が用意される。この反応混合物を、アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下でインキュベートする。アンモニア生産酵素の活性は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程によって測定される。具体的な一実施態様において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、前記還元型の補酵素の消費量を測定することによって測定される。
【０００５】
その他の形態において、本発明は、アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法を提供する。本方法は、本発明によって提供されるアンモニア生産酵素の活性を測定する方法を用いる。本方法を実施するために、上記反応混合物に試験化合物を添加し、アンモニア生産酵素の活性を測定する。一実施態様において、脂肪酸アミドヒドロラーゼの活性を調節することができる化合物を同定する方法が提供される。
【０００６】
図面の説明
図１は、一定濃度のオレアミドの存在下でＦＡＡＨ濃度を変化させる作用のグラフ表示である。
図２は、ＧＤＨと組み合わせたＦＡＡＨ反応の速度は、ミカエリス−メンテンの速度論式に従っていることを実証するグラフ表示である。
図３は、化合物Ａは、用量反応性の方式でＦＡＡＨ活性を阻害することを示す、ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析のグラフ表示である。
【０００７】
発明の詳細な説明
特に他の指定がない限り、本明細書で用いられるあらゆる専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に認識されている意味と同じ意味を有する。本明細書で用いられる以下の用語は、ここで記載される意味で用いられる。
【０００８】
用語「アンモニア生産酵素」は、生成物としてアンモニアを生産する反応を触媒するあらゆる酵素を意味する。この酵素は、どのような由来、どのような形態、どのような純度でもよく、さらに、天然に存在するものでもよいし、または、組換え酵素であってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。
【０００９】
用語「アンモニアを生産する基質」は、アンモニア生産酵素が作用して、生成物としてアンモニアを生産することができるような基質を意味する。
【００１０】
用語「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ」は、α−ケトグルタル酸（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）の還元的アミノ化を触媒して、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を形成する酵素を意味する。この酵素は、どのような由来、どのような形態、どのような純度でもよく、さらに、天然に存在するものでもよいし、または、組換え酵素であってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。。
【００１１】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの「還元的アミノ化基質」という用語は、還元的アミノ化が行われる際にグルタミン酸デヒドロゲナーゼが作用することができる、アンモニア以外の基質を意味する。
【００１２】
用語「〜を調節する」、「〜を調節すること」または「調節」は、アンモニア生産酵素の、アンモニアの生成を触媒する際の活性を変化させることを意味する。このような変化としては、酵素の阻害、または、酵素の活性化が挙げられ、全体的な変化でもよいし、または、部分的な変化でもよい。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「化合物」は、物質からなるあらゆる組成物を意味し、このような物質としては、あらゆる合成または天然化合物もしくは組成物が挙げられ、それらは有機でも無機でもよく、例えば、低分子物質、ペプチド、タンパク質、糖類（単糖類および多糖類）、核酸、脂肪酸などが挙げられる。用語「試験化合物」は、解析しようとするあらゆる化合物またはそれらの組み合わせを意味する。
【００１４】
一形態において、本発明は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応を組み合わせて用いて、アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアを定量的に検出することによる、アンモニア生産酵素の活性を測定する方法を提供する。用語「組み合わされる」は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応が、アンモニア生産酵素によって触媒される反応と同時に、かつ、同じ反応で行われることを意味する。本方法は、（ａ）既定量の（１）アンモニア生産酵素、（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについてのアンモニア以外の還元的アミノ化基質、および、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素を含む反応混合物を用意する工程；（ｂ）アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下で、該反応混合物をインキュベートする工程；および、（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程を含み、ここにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、アンモニア生産酵素の活性の指標である。この本発明によって提供される方法は、以下「酵素活性分析法」と称する場合もある。以下、本発明の酵素活性分析法で用いられる反応スキームの例を示すが、ここにおいて、アンモニア生産酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）であり、オレアミドは、脂肪酸アミドヒドロラーゼの基質として用いられる：
【００１５】
【化１】
【００１６】
この方法を用いて、生成物としてアンモニアを生産する適切な基質を用いることによって、あらゆるアンモニア生産酵素の活性を測定することができる。アンモニア生産酵素の一例は、ＦＡＡＨである。アンモニア生産酵素のその他の例は、ペプチジルアルギニンデアミナーゼであり、これは、様々なペプチドのカルボキシ末端のＡｒｇ残基の、シトルリン残基へのアンモニアの生成を伴う変換を触媒する。反応混合物で使用可能なアンモニア生産酵素の最適な量は、例えば酵素の由来または特異的な活性、および、インキュベート条件などの多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。この方法は、ＦＡＡＨの活性を測定するのに特に有用である。ＦＡＡＨは、どのような由来のものでもよく、天然に存在するものでもよいし、または、組換えであってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、それらのトランケーションされた形態であってもよい。反応混合物で用いられるＦＡＡＨの最適な量は、酵素の源または特異的な活性や、用いられる基質のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物中のＦＡＡＨの濃度は、一般的に約２ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きい。
【００１７】
特定のアンモニア生産酵素のための適切なアンモニアを生産する基質、加えて反応混合物で用いることができるその最適な量は、当業者であれば容易に選択することができる。ＦＡＡＨのための適切なアンモニアを生産する基質は、脂肪酸の第一アミドである。一般的に、ＦＡＡＨの適切なアンモニアを生産する基質としての第一アミドは、一般構造：ＮＨ2−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、ここにおいて、Ｒは、アルキル鎖であり、このアルキル鎖は不飽和であってもよく、さらに直鎖状であってもよいし、または、分岐状であってもよく、加えて置換または非置換であり、飽和または不飽和の環を含んでいてもよく、ここにおいて、これらの環は、融合していてもよいし、または、融合していなくてもよく、ヘテロ原子を含む。脂肪酸アルキル鎖の不飽和結合が存在する場合は、その脂肪酸アルキル鎖はシス立体配置を有する可能性があり、例えばシス−９,１０−オクタデセンアミド（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｍａｉｄｅ）、シス−８,９−オクタデセンアミド（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏａｍｉｄｅ）、シス−１１,１２−オクタデセンアミド（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｄｏａｍｉｄｅ）、または、シス−１３,１４−ドコセンアミド（ｄｏｃｏｓｅｎｏａｍｉｄｅ）が挙げられる。本発明のＦＡＡＨ活性分析法で使用可能な脂肪酸の第一アミドの例としては、オレアミド、ミリスチン酸（ｍｙｒｔｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）（テトラデカン酸）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）、ラウリン酸（ドデカン酸）、リノール酸（オクタデカジエン酸）、リノレン酸（オクタデカトリエン酸）、アラキジン酸（エイコサン酸）、アラキドン酸（エイコサテトラエン酸）、ベヘン酸（ドコサン酸）、および、リグノセリン酸（テトラコサン酸）のアミドが挙げられる。さらにその他の脂肪酸の第一アミドとしては、例えばウンデカン酸、オレイン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、および、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オンの第一アミドがそれぞれ挙げられる。脂肪酸の第一アミドは、広く市販され、どのような由来のものでもよい。反応混合物中の脂肪酸の第一アミドの最適な量は、用いられる特定の脂肪酸の第一アミド、または、その純度のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物における脂肪酸の第一アミドの量は、一般的には約１０μＭより大きく、典型的には約２０〜約５００μＭである。一実施態様において、反応混合物における脂肪酸の第一アミドの量は、約５０μＭである。
【００１８】
本発明の方法は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を組み合わせた分析においてＧＤＨを利用する。また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、他の名称で認識されている可能性もある、例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。ＧＤＨによる還元的アミノ化は、アンモニア、α−ケトグルタル酸、および、補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）を必要とする。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応を以下で説明する：
【００１９】
【化２】
【００２０】
この還元的アミノ化反応において、消費されたアンモニアの量は、消費されたＮＡＤＨの量に正比例するか、または、生産されたグルタミン酸、または、生産されたＮＡＤＰの量に正比例する。本酵素活性分析法において使用可能なＧＤＨは、どのような由来のものでもよく、天然に存在するものでもよいし、または、組換えであってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。この酵素は、市販されている。（カタログ番号４９３９２；シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ），セントルイス，ミズーリ州）。アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアをグルタミン酸にする反応を迅速で完全に行うためには、反応混合物におけるＧＤＨの量を十分に高くするべきである。反応混合物におけるＧＤＨの量は、一般的に約１ユニット／ｍｌ以上であり、典型的には約７ユニット／ｍｌまたはそれを超える量である。
【００２１】
本発明の酵素活性分析法において、どのようなＧＤＨの適切な還元的アミノ化基質でも使用可能である。ＧＤＨの適切な還元的アミノ化基質の例としては、α−ケトグルタル酸（また、「アルファ−ケトグルタル酸」、「２−オキソグルタル酸」、「α−オキソグルタル酸」、または、「２−オキソペンタンジオアート」としても知られている）、および、２−ケト−６−ヒドロキシヘキサン酸が挙げられる。アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアをグルタミン酸にする反応を迅速で完全に行うためには、反応混合物におけるＧＤＨの還元的アミノ化基質の量を十分に高くするべきである。最適な量は、アンモニア生産酵素の活性、ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の量、および、用いられるＧＤＨの量または活性のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。α−ケトグルタル酸が基質として用いられる場合、その反応混合物における量は、一般的に０.１ｍＭ以上であり、典型的には約０.３〜約１０ｍＭである。一実施態様において、反応混合物におけるα−ケトグルタル酸の濃度は、約３ｍＭである。
【００２２】
本発明の酵素活性分析法において用いられる還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかであり得る。アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアをグルタミン酸にする反応を迅速で完全に行うためには、反応混合物におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量を十分に高くするべきである。最適な量は、アンモニア生産酵素の活性、α−ケトグルタル酸の量、および、用いられるＧＤＨの量または活性のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量は、一般的に約５μＭ〜約１０００μＭであり、好ましくは約５０μＭ〜約３００μＭ、より好ましくは約１００μＭ〜約２００μＭである。
【００２３】
本発明の方法を強化するために、反応混合物にその他の成分が含まれていてもよい。例えば、ＧＤＨの活性を強化するためには、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）、または、グアノシン５’−二リン酸（ＧＤＰ）が反応混合物に含まれていてもよい。反応混合物におけるＡＤＰまたはＧＤＰは、どのような量でもよいが、一般的に２０μＭより多い量である。一実施態様において、ＡＤＰは、反応混合物中で約２ｍＭで存在する。加えて、反応混合物中の酵素、基質またはその他のあらゆる成分の溶解性を高めるためには、界面活性剤またはその他の可溶化剤が反応混合物に含まれていてもよい。適切な界面活性剤または可溶化剤の例としては、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ(R)Ｘ−１００）（シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ，セントルイス，ミズーリ州）、および、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００２４】
反応混合物は、アンモニア生産酵素およびＧＤＨによって触媒される反応が起こるような条件下でインキュベートされる。典型的には、反応混合物は、比較的一定の温度で、通常１５℃〜５０℃で、より典型的には約２０℃〜約３７℃の温度で、インキュベートされる。一般的に、反応混合物は、反応に最適な比較的一定のｐＨに維持され、通常約４.０〜約１２である。一実施態様において、反応混合物は、約７.４〜約１０.５のｐＨで維持される。反応混合物のｐＨは、適切な緩衝液を用いて調節し、維持することができる。適切な緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ，セントルイス，ミズーリ州）、および、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ，セントルイス，ミズーリ州）が挙げられる。反応混合物のインキュベート時間はいくらでもよいが、２〜３分間またはそれより短い時間から、２〜３時間またはそれより長い時間の範囲である。最適な時間は、アンモニア生産酵素またはＧＤＨの活性、インキュベート温度、反応混合物中の基質の初期量等のような多数の要因に基づいて決定することができ、当業者であれば容易に決定することができる。
【００２５】
ＧＤＨによって触媒される還元的アミノ化の速度は、当業界既知の適切な方法のいずれで決定してもよい。例えば、還元的アミノ化の速度は、以下のパラメーターの１種またはそれ以上を測定することによって決定してもよい：（１）還元的アミノ化基質の消費、（２）還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）の消費、（３）酸化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+）の生成、および、（４）還元的アミノ化産物の生成。ＧＤＨによって触媒される還元的アミノ化の速度を決定する具体的な方法の一つは、分光光度法により、反応混合物中の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）の消費量を測定することである。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれぞれ、約２９０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長で光を強く吸収するが、一方でＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+およびその他の基質、または反応生成物は吸収しないことがわかっている。従って、反応混合物におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが消費されるため（すなわちＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+に酸化される）、上記の波長での反応混合物の吸光度は減少する。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費速度は、吸光度の減少に正比例する。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費速度は、アンモニア生成の速度、すなわちアンモニア生産酵素の活性にも正比例するため、上記の波長において吸光度が減少する速度は、アンモニア生産酵素活性の指標であり、ここにおいて、吸光度が減少する速度が速いということは、アンモニア生産酵素の活性がより高いことを示し、逆もまた同様である。
【００２６】
典型的には、反応混合物の吸光度は、約３３０〜約３７０の波長で、好ましくは約３４０ｎｍの波長で測定される。吸光度は、当業者であれば従来の分光光度の手法を用いて容易に測定することができる。還元的アミノ化のパラメーターの測定は、インキュベート期間の最後に１回行ってもよいし、インキュベート期間中に複数の時点で行ってもよいし、または、インキュベート期間中連続的に行ってもよい。アンモニア生産酵素活性は、当業界で既知の方法によって定量することができる。
【００２７】
その他の形態において、本発明は、アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法を提供し、ここにおいて、アンモニア生産酵素の活性は、上述の酵素活性分析法を用いて決定される。この方法は、以降、本発明の「化合物スクリーニング方法」と述べる場合もある。
【００２８】
アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定するために、反応混合物を、試験化合物の非存在下および存在下でインキュベートし、アンモニア生産酵素の活性を、上述の本発明の酵素活性分析法によって決定する。具体的には、本方法は：（ａ）既定量の（１）アンモニア生産酵素、（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについてのアンモニア以外の還元的アミノ化基質、および、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素を含む反応混合物を提供する工程；（ｂ）該反応混合物を、試験化合物の非存在下および存在下で、さらに、アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下でインキュベートする工程；および、（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程を含み、ここにおいて、該試験化合物の存在下と非存在下における還元的アミノ化の速度の違いは、その試験化合物が、アンモニア生産酵素の活性を調節可能であることを示す。試験化合物の存在下での還元的アミノ化の速度が、試験化合物の非存在下での速度よりも低い場合、その試験化合物は、アンモニア生産酵素の阻害剤と同定される。逆に言えば、試験化合物の存在下での還元的アミノ化の速度は、試験化合物の非存在下での速度よりも高い場合、その試験化合物は、アンモニア生産酵素の活性化因子と同定される。
【００２９】
一実施態様において、ＦＡＡＨの活性を調節することができる化合物を同定する方法が提供され、本方法は：（ａ）既定量の（１）ＦＡＡＨ、（２）ＦＡＡＨについてのアンモニアを生産する基質として、脂肪酸の第一アミド、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質として、α−ケトグルタル酸、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての補酵素として、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含む反応混合物を用意する工程；（ｂ）該反応混合物を、ＦＡＡＨおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下で、試験化合物の非存在下および存在下でインキュベートすること；および、（ｃ）反応混合物中でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費を測定することによって、還元的アミノ化の速度を測定することを含み、ここにおいて、試験化合物の存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費と、試験化合物の非存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費の違いは、その試験化合物が、ＦＡＡＨの活性を調節することができることを示す。試験化合物の存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費が、試験化合物の非存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費よりも低い場合、その試験化合物は、ＦＡＡＨの阻害剤と同定されるとする。逆に言えば、試験化合物の存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費が、試験化合物の非存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費よりも高い場合、その試験化合物は、ＦＡＡＨの活性化因子と同定されるとする。ＦＡＡＨは、どのような由来のものでもよく、天然に存在するものでもよいし、または、組換えであってもよく、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。反応混合物で用いられるＦＡＡＨの最適な量は、酵素の源または特異的な活性や、用いられる基質のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物中のＦＡＡＨの濃度は、一般的に約２ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きい。具体的な一実施態様において、脂肪酸の第一アミドとしてオレアミドが用いられ、ＧＤＨの補酵素としてＮＡＤＨが用いられ、ＮＡＤＨの消費は、反応混合物の吸光度を３４０ｎｍの波長で測定することによって決定される。
【００３０】
本発明の化合物スクリーニング方法は、ＦＡＡＨのようなアンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を自動化された手法を用いて迅速にスクリーニングするのに有用である。このような自動化法は、市販の自動化機器やソフトウェア、加えて既知の自動化観察および検出法を用いることによって容易に実施することができる。マルチウェルフォーマットは、ハイスループットや自動化化合物スクリーニングにとって特に魅力的である。スクリーニング方法は、例えば標準的なマイクロプレートウェルフォーマットを用いて行うことができる。マイクロプレートリーダーは、マイクロプレート（例えば、９６および３８４ウェルプレート）からシグナルを読むことができるあらゆる装置を含む。このようなシグナルは、分光光度法により検出してもよく、例えば、３４０ｎｍの波長でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの吸光度の光学密度を読み取ることによって検出される。しかしながら、その他の検出手段を利用してもよく、このような手段としては、例えば、評価項目の分析または反応速度論分析のいずれかにおける、蛍光分析（標準的、または、時間分解）、発光分析（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、または、光度計測法が挙げられる。このような技術を用いれば、多種多様の化合物を、それらそれぞれのＦＡＡＨのようなアンモニア生産酵素に対する作用に関して迅速かつ効率的にスクリーニングすることができる。サンプルの取り扱いや検出法は、迅速で再現性のある試薬の適用、および、標的化合物の自動スクリーニングのための市販の機器やソフトウェアシステムを用いて自動化することができる。化合物投入のスループットを高めるために現在のところ利用可能なロボット利用のシステムは、例えば、キアゲン社（Ｑｕａｇｅｎ，Ｉｎｃ．バレンシア，カリフォルニア州）製のバイオロボット９６００（ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００）、ザイマーク（Ｚｙｍａｒｋ，ホプキントン，マサチューセッツ州）製のザイメート（Ｚｙｍａｔｅ）、または、ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，フラトン，カリフォルニア州）製のバイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）などが利用することができ、これらの多くは、マルチウェルプレートフォーマットを使用している。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例は、ＦＡＡＨの活性、および、ＦＡＡＨの活性を調節することができる化合物を同定することに関するそれらの有用性を測定する分析に関する。これらの実施例は単に説明のためであって、特許請求された発明を限定するために提供されたものではない。当業者であれば、これらの実施例に関して様々な改変または変更が予見できると思われ、それらは本出願の本質と範囲、ならびに特許請求の範囲に包含される。
【００３２】
実施例１：トランケーションされたヒトＦＡＡＨの調製
この実施例で説明する方法に従ってトランケーションされたヒトＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ）を調製し、以下の実施例２〜４で説明する実験で用いた。配列番号１に、このトランケーションされたヒトＦＡＡＨのアミノ酸配列を示すが、これは、全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９を含む。配列番号２に、全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉのコドンが最適化されたＤＮＡ配列を示す。
【００３３】
Ａ．ｈＦＡＡＨプラスミドのクローニングと構築
既知の分子生物学的な技術を利用して、本明細書で説明されているコンストラクトのクローニングと構築を実施した。このような技術は、例えば、Ｄａｖｉｓ等，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，エルゼビア・サイエンス・パブリッシング社（Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク，ニューヨーク州，１９８６；Ｈａｍｅｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＬプレス（ＩＬ Ｐｒｅｓｓ），１９８５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，編Ａｕｓｕｂｅｌ等，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズに記載されている。
【００３４】
ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（ヒト（ｈ）ＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードする）
以下のｃＤＮＡを注文合成し、ｐＵＣ１１９ベクター（ブルー・ヘロン・バイオテクノロジー（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ボセル，ワシントン州）にサブクローニングした。最適化アルゴリズム（ブルー・ヘロン・バイオテクノロジー（ボセル，ワシントン州））を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン最適化を行った。
【００３５】
−ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨのアミノ酸１〜５７９をコードする）：ｈＦＡＡＨのＥ．ｃｏｌｉのコドンを最適化したＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡ（アミノ酸１〜５７９をコードする）であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位、３’停止コドン、および、３’−ＥｃｏＲ Ｉ部位を含む（配列番号３）。
【００３６】
−ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ、アミノ酸３０〜１０４をコードする）：ｈＦＡＡＨのＥ．ｃｏｌｉのコドンを最適化したＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡ（配列番号３の９４〜３１９ｂｐ）であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位を含む（配列番号４）。
【００３７】
ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨのアミノ酸１〜５７９をコードする）をＸｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉで消化し、そのインサートを、Ｘｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉで消化したｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ３６０〜２０）にサブクローニングし、ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９をコードする）を作製した。ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨベクターをＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIで消化し、得られたＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ III（約４.５ｋｂ）断片、および、Ｈｉｎｄ III−Ｈｉｎｄ III（約１.５ｋｂ）断片を、ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜１０４をコードする）コンストラクトを消化して生成したＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメント（２２５ｂｐ）とライゲーションし、ＮＨ2−末端にＨｉｓ−タグを有するｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（全長ｈＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードする）を作製した。
【００３８】
ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９をコードする）
原核性の発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ），カタログ番号６９８６４〜３）にサブクローニングするためのヒトＦＡＡＨコンストラクトを、ＰＣＲで以下のプライマーを用いて、ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜５７９）コンストラクトから作製した：センスプライマー、５’−GGAATTCCATATGTCAGGTCGTCGTACCGCACGTG−３’（配列番号５）；および、アンチセンスプライマー、５’−CCGCTCGAGTTATGAGGATTGTTTTTCCGGAGTCAT−３’（配列番号６）。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉで消化し、Ｎｄｅ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉで消化したｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにサブクローニングし、ＮＨ2−末端にＨｉｓ−タグを有するｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３２〜５７９をコードする）を作製した。
【００３９】
ヒトＦＡＡＨコンストラクトの要約：
ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３０〜５７９）をコードする：
MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRTLYDDDDKDRWGSELE----hFAAH
ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３２〜５７９）をコードする：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM----hFAAH
「−−−−」は、アミノ酸位置を示さない。それぞれ指定されたｈＦＡＡＨ位置は、具体的に指定されたＨＨＨＨＨＨを含むリーディング鎖のアミノ酸配列と隣接している。
【００４０】
Ｂ．トランケーションされたｈＦＡＡＨの発現および精製
「ＲＴ」は、室温を意味し、典型的には２５℃±３℃である。野生型ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９に対応するアミノ酸をコードするｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨコンストラクトを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ株に形質転換した。新たに形質転換された発現株の培養液１.２リットルを、スーパーブロス（ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ）培地中で、３０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下で、３７℃で増殖させた。ＯＤ600が約０.１２で、この培養液を室温に移し、ＯＤ600が０.６〜０.６５で１００μＭのＩＰＴＧと０.２％Ｌ−アラビノースとで室温で２０時間誘導した。以下の全ての操作は、特に他の規定がない限り、４℃でなされた。次に、この細胞を、遠心分離によって５０００×ｇで回収した。細胞ペレットを、ＰＢＳ（７００ｍｌ）に再懸濁することによって２回洗浄し、遠心分離によって５０００×ｇで回収した。この時点で、細胞のペーストを凍結して、−８０℃で必要になるまで保存してもよい。この細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／１００ｍＭのＮａＣｌ／１％トリトンＸ−１００）６０ｍｌに撹拌しながら再懸濁した。ＤＮアーゼとＲＮアーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉのペレット２５ｇあたり１ｍｇ）を添加した後に、この細胞懸濁液を、断続的にを混合しながら室温で１時間インキュベートし、氷上で１０分間冷却し、約４０〜６０回の１０秒のパルスで超音波破砕した。得られた溶解産物を１０,０００×ｇで３５分間遠心分離し、上清を、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製の５ｍｌのＮｉ−カラム（ハイトラップ・キレーティングＨＰカラム（ＨｉＴｒａｐ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ），カタログ番号１７−０４０９−０１，製造元の説明書に従ってＮｉを装填）に、０.５〜１ｍｌ／分でローディングし、これを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８.０／３００ｍＭのＮａＣｌ／１％トリトンＸ−１００）で平衡化した。得られた流出液をカラムに再度ローディングした。カラムを緩衝液Ｂ（１００ｍｌ）で洗浄し、さらに、それぞれ１０、２０および５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍｌ）で順番に洗浄した。溶出は、それぞれ１００、２００、４００および７００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（２５ｍｌ）の順番でなされた。ＦＡＡＨの大半を、１００〜２００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｂで溶出させた。溶出したＦＡＡＨを、緩衝液Ｂに対して一晩透析し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００４１】
実施例２：１００μＭオレアミドでのＦＡＡＨの用量応答曲線
ＦＡＡＨ活性の定量検出が可能な分析かどうかを決定するために、ＦＡＡＨの濃度を高めながら分析を行った。反応は、９６ウェルの透明なポリスチレンプレートで行った。反応混合物（２５０μｌ）は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１００μＭオレアミド、１５０μＭのＮＡＤＨ、３ｍＭのα−ケトグルタル酸、２ｍＭのＡＤＰ、６.０ユニット／ｍｌのＧＤＨ、０.１％トリトン(R)Ｘ−１００、および、既定量の約１５０ｎＭのＦＡＡＨを含んでいた。この反応液を３７℃でインキュベートし、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ(R) ソフトウェア（モレキュラー・デバイス，パロアルト，カリフォルニア州）を備えた、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ(R)（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）を用いて、３４０ｎｍでの吸光度を３０分にわたり１０秒のインターバルで測定値を読み取り回収した。図１で示されるように、ＦＡＡＨの濃度が高くなるにつれて、反応の速度も増加した。
【００４２】
実施例３：オレアミド濃度におけるＦＡＡＨの初速度の依存性
濃度
ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析が、酵素動力学に適合しているかどうかを決定するために、さらに、ＦＡＡＨが典型的なミカエリス−メンテンの酵素動力学に従っていることを実証するために分析を行った。反応は、９６ウェルの透明なポリスチレンプレートで行われた。反応混合物（２５０μｌ）は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１５０μＭのＮＡＤＨ、３ｍＭのα−ケトグルタル酸、２ｍＭのＡＤＰ、１２ユニット／ｍｌのＧＤＨ、０.１％トリトン(R)Ｘ−１００、既定濃度のオレアミド、および、約１０ｎＭのＦＡＡＨを含んでいた。この反応液を３７℃でインキュベートし、実施例１で説明されたようにしてデータを回収した。ｘ軸にオレアミド濃度をプロットし、ｙ軸に初速度をプロットした。そのデータを、ミカエリス−メンテン式にフィッティングした。図２で示されるように、このＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析は、ＦＡＡＨの速度定数の測定が可能である。また、このデータは、ＦＡＡＨが典型的なミカエリス−メンテンの速度論に従っていることも実証する。Ｋｍ値は、反応速度がその最大値の半分になった時点のオレアミド基質濃度であり、これは１９.８μＭと決定された。
【００４３】
実施例４：化合物ＡによるＦＡＡＨ阻害の測定
分析の有用性をさらに実証するために、ＦＡＡＨ活性に対する１−オキサゾロ［４,５−ｂ］ピリジン−２−イル−５−フェニル−ペンタン−１−オン（（ＰＮＡＳ，（２０００）ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１０：ｐ５０４２）、以降、化合物Ａ）の阻害作用を、ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析を用いて試験した。反応は、９６ウェルの透明なポリスチレンプレートで行われた。反応混合物（２００μｌ）は、５０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ７.４）、５０μＭオレアミド、１５０μＭのＮＡＤＨ、３ｍＭのα−ケトグルタル酸、２ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１２ユニット／ｍｌのＧＤＨ、０.１％トリトンＸ−１００(R)、図３で指定された濃度の化合物Ａ、および、約１０ｎＭのＦＡＡＨを含んでいた。オレアミド（５００μＭ）を２５％ＤＭＳＯに溶解させ、２５％ＥｔＯＨをストック溶液として用いた。化合物Ａのストック溶液を５０％ＤＭＳＯに溶解させて用いた。ＤＭＳＯとＥｔＯＨの最終濃度はそれぞれ７.５％であった。この反応液を３７℃でインキュベートし、実施例１で説明されたようにしてデータを回収した。図３に示した結果から、化合物Ａは、ＦＡＡＨを用量反応性の方式で阻害することが実証される。
【００４４】
配列表の説明
配列番号１−全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９。
配列番号２−Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化した、全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３−Ｅ．ｃｏｌｉのコドンを最適化したｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９）配列のＤＮＡ配列であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位、３’停止コドン、および、３’−ＥｃｏＲ Ｉ部位を含む。
配列番号４−配列番号３の９４ｂｐ〜３１９ｂｐのＤＮＡ配列であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位を含む。
配列番号５および６−プライマー。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】一定濃度のオレアミドの存在下でＦＡＡＨ濃度を変化させる作用のグラフ表示である。
【図２】ＧＤＨと組み合わせたＦＡＡＨ反応の速度は、ミカエリス−メンテンの速度論式に従っていることを実証するグラフ表示である。
【図３】化合物Ａは、用量反応性の方式でＦＡＡＨ活性を阻害することを示す、ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析のグラフ表示である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニア生産酵素の活性を決定する方法、および、酵素活性を調節する化合物の同定におけるそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）は膜内在性酵素であり、これは、オレアミドヒドロラーゼやアナンダミドアミドヒドロラーゼと称されることもある。ＦＡＡＨは、内因性シグナル伝達脂質として役立つことがわかっている脂肪酸の第一アミドとエタノールアミドを分解する。このような物質としては、内因性カンナビノイドであるアナンダミド、および、睡眠導入作用のあるオレアミドが挙げられる。（Ｍ．Ｐ．Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ等（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，１５１７７〜１５１８７；Ｍ．Ｍａｃｃａｒｒｏｎｅ等（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２３３２〜３２３３９）。ＦＡＡＨは各種の脂肪酸アミド（ＦＡＡ）を加水分解するが、ＦＡＡＨは、アラキドニルおよびオレイル基質に最も効果的に作用するようである（Ｂ．Ｆ．Ｃｒａｖａｔｔ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４，８３〜８７；および、Ｄ．Ｋ．Ｇｉａｎｇ等（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，２２３８〜２２４２）。ＦＡＡＨ阻害剤は、動物モデルにおいて痛み、炎症および不安を低減することが実証されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＦＡＡＨ活性を測定するための多数の分析が報告されている。これらの分析の大半は、ＦＡＡＨ活性を定量するために、放射標識した基質や薄層クロマトグラフィー、活性炭またはマススペクトロメトリーを利用している。加えて、基質としてｐ−ニトロアニリドを用いた分光光度分析や、蛍光置換分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ）が報告されている。しかしながら、これらの分析はいずれも、低いスループット、低い感度、または、放射活性物質を必要とするといった限定がある。ＦＡＡＨ活性を効率的に、迅速に、かつ正確に測定し、ＦＡＡＨを阻害または刺激する化合物を同定することができ、さらにハイスループットも可能な分析が有益であると予想される。
本明細書で引用された全ての公報、特許および特許出願は、本発明において参照によりその全体を加入させる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一形態において、本発明は、アンモニア生産酵素の活性を測定する方法を提供する。本方法は、二つの連動した反応を含む。その反応のうち一方は、生成物としてアンモニアを生産するアンモニア生産酵素によって触媒される。他方の反応は、基質としてアンモニアを利用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応である。本方法を実施するために、（１）アンモニア生産酵素、（２）アンモニア生産酵素のための、アンモニアを生産する基質、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼのための、アンモニア以外の還元的アミノ化基質、および、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼの還元型の補酵素を含む反応混合物が用意される。この反応混合物を、アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下でインキュベートする。アンモニア生産酵素の活性は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程によって測定される。具体的な一実施態様において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、前記還元型の補酵素の消費量を測定することによって測定される。
【０００５】
その他の形態において、本発明は、アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法を提供する。本方法は、本発明によって提供されるアンモニア生産酵素の活性を測定する方法を用いる。本方法を実施するために、上記反応混合物に試験化合物を添加し、アンモニア生産酵素の活性を測定する。一実施態様において、脂肪酸アミドヒドロラーゼの活性を調節することができる化合物を同定する方法が提供される。
【０００６】
図面の説明
図１は、一定濃度のオレアミドの存在下でＦＡＡＨ濃度を変化させる作用のグラフ表示である。
図２は、ＧＤＨと組み合わせたＦＡＡＨ反応の速度は、ミカエリス−メンテンの速度論式に従っていることを実証するグラフ表示である。
図３は、化合物Ａは、用量反応性の方式でＦＡＡＨ活性を阻害することを示す、ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析のグラフ表示である。
【０００７】
発明の詳細な説明
特に他の指定がない限り、本明細書で用いられるあらゆる専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に認識されている意味と同じ意味を有する。本明細書で用いられる以下の用語は、ここで記載される意味で用いられる。
【０００８】
用語「アンモニア生産酵素」は、生成物としてアンモニアを生産する反応を触媒するあらゆる酵素を意味する。この酵素は、どのような由来、どのような形態、どのような純度でもよく、さらに、天然に存在するものでもよいし、または、組換え酵素であってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。
【０００９】
用語「アンモニアを生産する基質」は、アンモニア生産酵素が作用して、生成物としてアンモニアを生産することができるような基質を意味する。
【００１０】
用語「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ」は、α−ケトグルタル酸（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）の還元的アミノ化を触媒して、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を形成する酵素を意味する。この酵素は、どのような由来、どのような形態、どのような純度でもよく、さらに、天然に存在するものでもよいし、または、組換え酵素であってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。。
【００１１】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの「還元的アミノ化基質」という用語は、還元的アミノ化が行われる際にグルタミン酸デヒドロゲナーゼが作用することができる、アンモニア以外の基質を意味する。
【００１２】
用語「〜を調節する」、「〜を調節すること」または「調節」は、アンモニア生産酵素の、アンモニアの生成を触媒する際の活性を変化させることを意味する。このような変化としては、酵素の阻害、または、酵素の活性化が挙げられ、全体的な変化でもよいし、または、部分的な変化でもよい。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「化合物」は、物質からなるあらゆる組成物を意味し、このような物質としては、あらゆる合成または天然化合物もしくは組成物が挙げられ、それらは有機でも無機でもよく、例えば、低分子物質、ペプチド、タンパク質、糖類（単糖類および多糖類）、核酸、脂肪酸などが挙げられる。用語「試験化合物」は、解析しようとするあらゆる化合物またはそれらの組み合わせを意味する。
【００１４】
一形態において、本発明は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応を組み合わせて用いて、アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアを定量的に検出することによる、アンモニア生産酵素の活性を測定する方法を提供する。用語「組み合わされる」は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応が、アンモニア生産酵素によって触媒される反応と同時に、かつ、同じ反応で行われることを意味する。本方法は、（ａ）既定量の（１）アンモニア生産酵素、（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについてのアンモニア以外の還元的アミノ化基質、および、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素を含む反応混合物を用意する工程；（ｂ）アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下で、該反応混合物をインキュベートする工程；および、（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程を含み、ここにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、アンモニア生産酵素の活性の指標である。この本発明によって提供される方法は、以下「酵素活性分析法」と称する場合もある。以下、本発明の酵素活性分析法で用いられる反応スキームの例を示すが、ここにおいて、アンモニア生産酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）であり、オレアミドは、脂肪酸アミドヒドロラーゼの基質として用いられる：
【００１５】
【化１】
【００１６】
この方法を用いて、生成物としてアンモニアを生産する適切な基質を用いることによって、あらゆるアンモニア生産酵素の活性を測定することができる。アンモニア生産酵素の一例は、ＦＡＡＨである。アンモニア生産酵素のその他の例は、ペプチジルアルギニンデアミナーゼであり、これは、様々なペプチドのカルボキシ末端のＡｒｇ残基の、シトルリン残基へのアンモニアの生成を伴う変換を触媒する。反応混合物で使用可能なアンモニア生産酵素の最適な量は、例えば酵素の由来または特異的な活性、および、インキュベート条件などの多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。この方法は、ＦＡＡＨの活性を測定するのに特に有用である。ＦＡＡＨは、どのような由来のものでもよく、天然に存在するものでもよいし、または、組換えであってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、それらのトランケーションされた形態であってもよい。反応混合物で用いられるＦＡＡＨの最適な量は、酵素の源または特異的な活性や、用いられる基質のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物中のＦＡＡＨの濃度は、一般的に約２ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きい。
【００１７】
特定のアンモニア生産酵素のための適切なアンモニアを生産する基質、加えて反応混合物で用いることができるその最適な量は、当業者であれば容易に選択することができる。ＦＡＡＨのための適切なアンモニアを生産する基質は、脂肪酸の第一アミドである。一般的に、ＦＡＡＨの適切なアンモニアを生産する基質としての第一アミドは、一般構造：ＮＨ2−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、ここにおいて、Ｒは、アルキル鎖であり、このアルキル鎖は不飽和であってもよく、さらに直鎖状であってもよいし、または、分岐状であってもよく、加えて置換または非置換であり、飽和または不飽和の環を含んでいてもよく、ここにおいて、これらの環は、融合していてもよいし、または、融合していなくてもよく、ヘテロ原子を含む。脂肪酸アルキル鎖の不飽和結合が存在する場合は、その脂肪酸アルキル鎖はシス立体配置を有する可能性があり、例えばシス−９,１０−オクタデセンアミド（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｍａｉｄｅ）、シス−８,９−オクタデセンアミド（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏａｍｉｄｅ）、シス−１１,１２−オクタデセンアミド（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｄｏａｍｉｄｅ）、または、シス−１３,１４−ドコセンアミド（ｄｏｃｏｓｅｎｏａｍｉｄｅ）が挙げられる。本発明のＦＡＡＨ活性分析法で使用可能な脂肪酸の第一アミドの例としては、オレアミド、ミリスチン酸（ｍｙｒｔｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）（テトラデカン酸）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）、ラウリン酸（ドデカン酸）、リノール酸（オクタデカジエン酸）、リノレン酸（オクタデカトリエン酸）、アラキジン酸（エイコサン酸）、アラキドン酸（エイコサテトラエン酸）、ベヘン酸（ドコサン酸）、および、リグノセリン酸（テトラコサン酸）のアミドが挙げられる。さらにその他の脂肪酸の第一アミドとしては、例えばウンデカン酸、オレイン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、および、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オンの第一アミドがそれぞれ挙げられる。脂肪酸の第一アミドは、広く市販され、どのような由来のものでもよい。反応混合物中の脂肪酸の第一アミドの最適な量は、用いられる特定の脂肪酸の第一アミド、または、その純度のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物における脂肪酸の第一アミドの量は、一般的には約１０μＭより大きく、典型的には約２０〜約５００μＭである。一実施態様において、反応混合物における脂肪酸の第一アミドの量は、約５０μＭである。
【００１８】
本発明の方法は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を組み合わせた分析においてＧＤＨを利用する。また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、他の名称で認識されている可能性もある、例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。ＧＤＨによる還元的アミノ化は、アンモニア、α−ケトグルタル酸、および、補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）を必要とする。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化反応を以下で説明する：
【００１９】
【化２】
【００２０】
この還元的アミノ化反応において、消費されたアンモニアの量は、消費されたＮＡＤＨの量に正比例するか、または、生産されたグルタミン酸、または、生産されたＮＡＤＰの量に正比例する。本酵素活性分析法において使用可能なＧＤＨは、どのような由来のものでもよく、天然に存在するものでもよいし、または、組換えであってもよく、さらに、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。この酵素は、市販されている。（カタログ番号４９３９２；シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ），セントルイス，ミズーリ州）。アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアをグルタミン酸にする反応を迅速で完全に行うためには、反応混合物におけるＧＤＨの量を十分に高くするべきである。反応混合物におけるＧＤＨの量は、一般的に約１ユニット／ｍｌ以上であり、典型的には約７ユニット／ｍｌまたはそれを超える量である。
【００２１】
本発明の酵素活性分析法において、どのようなＧＤＨの適切な還元的アミノ化基質でも使用可能である。ＧＤＨの適切な還元的アミノ化基質の例としては、α−ケトグルタル酸（また、「アルファ−ケトグルタル酸」、「２−オキソグルタル酸」、「α−オキソグルタル酸」、または、「２−オキソペンタンジオアート」としても知られている）、および、２−ケト−６−ヒドロキシヘキサン酸が挙げられる。アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアをグルタミン酸にする反応を迅速で完全に行うためには、反応混合物におけるＧＤＨの還元的アミノ化基質の量を十分に高くするべきである。最適な量は、アンモニア生産酵素の活性、ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の量、および、用いられるＧＤＨの量または活性のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。α−ケトグルタル酸が基質として用いられる場合、その反応混合物における量は、一般的に０.１ｍＭ以上であり、典型的には約０.３〜約１０ｍＭである。一実施態様において、反応混合物におけるα−ケトグルタル酸の濃度は、約３ｍＭである。
【００２２】
本発明の酵素活性分析法において用いられる還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかであり得る。アンモニア生産酵素によって生産されたアンモニアをグルタミン酸にする反応を迅速で完全に行うためには、反応混合物におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量を十分に高くするべきである。最適な量は、アンモニア生産酵素の活性、α−ケトグルタル酸の量、および、用いられるＧＤＨの量または活性のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量は、一般的に約５μＭ〜約１０００μＭであり、好ましくは約５０μＭ〜約３００μＭ、より好ましくは約１００μＭ〜約２００μＭである。
【００２３】
本発明の方法を強化するために、反応混合物にその他の成分が含まれていてもよい。例えば、ＧＤＨの活性を強化するためには、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）、または、グアノシン５’−二リン酸（ＧＤＰ）が反応混合物に含まれていてもよい。反応混合物におけるＡＤＰまたはＧＤＰは、どのような量でもよいが、一般的に２０μＭより多い量である。一実施態様において、ＡＤＰは、反応混合物中で約２ｍＭで存在する。加えて、反応混合物中の酵素、基質またはその他のあらゆる成分の溶解性を高めるためには、界面活性剤またはその他の可溶化剤が反応混合物に含まれていてもよい。適切な界面活性剤または可溶化剤の例としては、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ(R)Ｘ−１００）（シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ，セントルイス，ミズーリ州）、および、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００２４】
反応混合物は、アンモニア生産酵素およびＧＤＨによって触媒される反応が起こるような条件下でインキュベートされる。典型的には、反応混合物は、比較的一定の温度で、通常１５℃〜５０℃で、より典型的には約２０℃〜約３７℃の温度で、インキュベートされる。一般的に、反応混合物は、反応に最適な比較的一定のｐＨに維持され、通常約４.０〜約１２である。一実施態様において、反応混合物は、約７.４〜約１０.５のｐＨで維持される。反応混合物のｐＨは、適切な緩衝液を用いて調節し、維持することができる。適切な緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ，セントルイス，ミズーリ州）、および、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ−アルドリッチ・ケミカルズ，セントルイス，ミズーリ州）が挙げられる。反応混合物のインキュベート時間はいくらでもよいが、２〜３分間またはそれより短い時間から、２〜３時間またはそれより長い時間の範囲である。最適な時間は、アンモニア生産酵素またはＧＤＨの活性、インキュベート温度、反応混合物中の基質の初期量等のような多数の要因に基づいて決定することができ、当業者であれば容易に決定することができる。
【００２５】
ＧＤＨによって触媒される還元的アミノ化の速度は、当業界既知の適切な方法のいずれで決定してもよい。例えば、還元的アミノ化の速度は、以下のパラメーターの１種またはそれ以上を測定することによって決定してもよい：（１）還元的アミノ化基質の消費、（２）還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）の消費、（３）酸化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+）の生成、および、（４）還元的アミノ化産物の生成。ＧＤＨによって触媒される還元的アミノ化の速度を決定する具体的な方法の一つは、分光光度法により、反応混合物中の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）の消費量を測定することである。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれぞれ、約２９０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長で光を強く吸収するが、一方でＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+およびその他の基質、または反応生成物は吸収しないことがわかっている。従って、反応混合物におけるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが消費されるため（すなわちＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+に酸化される）、上記の波長での反応混合物の吸光度は減少する。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費速度は、吸光度の減少に正比例する。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費速度は、アンモニア生成の速度、すなわちアンモニア生産酵素の活性にも正比例するため、上記の波長において吸光度が減少する速度は、アンモニア生産酵素活性の指標であり、ここにおいて、吸光度が減少する速度が速いということは、アンモニア生産酵素の活性がより高いことを示し、逆もまた同様である。
【００２６】
典型的には、反応混合物の吸光度は、約３３０〜約３７０の波長で、好ましくは約３４０ｎｍの波長で測定される。吸光度は、当業者であれば従来の分光光度の手法を用いて容易に測定することができる。還元的アミノ化のパラメーターの測定は、インキュベート期間の最後に１回行ってもよいし、インキュベート期間中に複数の時点で行ってもよいし、または、インキュベート期間中連続的に行ってもよい。アンモニア生産酵素活性は、当業界で既知の方法によって定量することができる。
【００２７】
その他の形態において、本発明は、アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法を提供し、ここにおいて、アンモニア生産酵素の活性は、上述の酵素活性分析法を用いて決定される。この方法は、以降、本発明の「化合物スクリーニング方法」と述べる場合もある。
【００２８】
アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定するために、反応混合物を、試験化合物の非存在下および存在下でインキュベートし、アンモニア生産酵素の活性を、上述の本発明の酵素活性分析法によって決定する。具体的には、本方法は：（ａ）既定量の（１）アンモニア生産酵素、（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについてのアンモニア以外の還元的アミノ化基質、および、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素を含む反応混合物を提供する工程；（ｂ）該反応混合物を、試験化合物の非存在下および存在下で、さらに、アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下でインキュベートする工程；および、（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程を含み、ここにおいて、該試験化合物の存在下と非存在下における還元的アミノ化の速度の違いは、その試験化合物が、アンモニア生産酵素の活性を調節可能であることを示す。試験化合物の存在下での還元的アミノ化の速度が、試験化合物の非存在下での速度よりも低い場合、その試験化合物は、アンモニア生産酵素の阻害剤と同定される。逆に言えば、試験化合物の存在下での還元的アミノ化の速度は、試験化合物の非存在下での速度よりも高い場合、その試験化合物は、アンモニア生産酵素の活性化因子と同定される。
【００２９】
一実施態様において、ＦＡＡＨの活性を調節することができる化合物を同定する方法が提供され、本方法は：（ａ）既定量の（１）ＦＡＡＨ、（２）ＦＡＡＨについてのアンモニアを生産する基質として、脂肪酸の第一アミド、（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質として、α−ケトグルタル酸、（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての補酵素として、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含む反応混合物を用意する工程；（ｂ）該反応混合物を、ＦＡＡＨおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下で、試験化合物の非存在下および存在下でインキュベートすること；および、（ｃ）反応混合物中でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費を測定することによって、還元的アミノ化の速度を測定することを含み、ここにおいて、試験化合物の存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費と、試験化合物の非存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費の違いは、その試験化合物が、ＦＡＡＨの活性を調節することができることを示す。試験化合物の存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費が、試験化合物の非存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費よりも低い場合、その試験化合物は、ＦＡＡＨの阻害剤と同定されるとする。逆に言えば、試験化合物の存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費が、試験化合物の非存在下でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費よりも高い場合、その試験化合物は、ＦＡＡＨの活性化因子と同定されるとする。ＦＡＡＨは、どのような由来のものでもよく、天然に存在するものでもよいし、または、組換えであってもよく、全長酵素であってもよいし、または、酵素的に活性なそれらのトランケーションされた形態であってもよい。反応混合物で用いられるＦＡＡＨの最適な量は、酵素の源または特異的な活性や、用いられる基質のような多数の要因に応じて様々であってよく、当業者であれば容易に決定することができる。反応混合物中のＦＡＡＨの濃度は、一般的に約２ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きい。具体的な一実施態様において、脂肪酸の第一アミドとしてオレアミドが用いられ、ＧＤＨの補酵素としてＮＡＤＨが用いられ、ＮＡＤＨの消費は、反応混合物の吸光度を３４０ｎｍの波長で測定することによって決定される。
【００３０】
本発明の化合物スクリーニング方法は、ＦＡＡＨのようなアンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を自動化された手法を用いて迅速にスクリーニングするのに有用である。このような自動化法は、市販の自動化機器やソフトウェア、加えて既知の自動化観察および検出法を用いることによって容易に実施することができる。マルチウェルフォーマットは、ハイスループットや自動化化合物スクリーニングにとって特に魅力的である。スクリーニング方法は、例えば標準的なマイクロプレートウェルフォーマットを用いて行うことができる。マイクロプレートリーダーは、マイクロプレート（例えば、９６および３８４ウェルプレート）からシグナルを読むことができるあらゆる装置を含む。このようなシグナルは、分光光度法により検出してもよく、例えば、３４０ｎｍの波長でのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの吸光度の光学密度を読み取ることによって検出される。しかしながら、その他の検出手段を利用してもよく、このような手段としては、例えば、評価項目の分析または反応速度論分析のいずれかにおける、蛍光分析（標準的、または、時間分解）、発光分析（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、または、光度計測法が挙げられる。このような技術を用いれば、多種多様の化合物を、それらそれぞれのＦＡＡＨのようなアンモニア生産酵素に対する作用に関して迅速かつ効率的にスクリーニングすることができる。サンプルの取り扱いや検出法は、迅速で再現性のある試薬の適用、および、標的化合物の自動スクリーニングのための市販の機器やソフトウェアシステムを用いて自動化することができる。化合物投入のスループットを高めるために現在のところ利用可能なロボット利用のシステムは、例えば、キアゲン社（Ｑｕａｇｅｎ，Ｉｎｃ．バレンシア，カリフォルニア州）製のバイオロボット９６００（ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００）、ザイマーク（Ｚｙｍａｒｋ，ホプキントン，マサチューセッツ州）製のザイメート（Ｚｙｍａｔｅ）、または、ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，フラトン，カリフォルニア州）製のバイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）などが利用することができ、これらの多くは、マルチウェルプレートフォーマットを使用している。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例は、ＦＡＡＨの活性、および、ＦＡＡＨの活性を調節することができる化合物を同定することに関するそれらの有用性を測定する分析に関する。これらの実施例は単に説明のためであって、特許請求された発明を限定するために提供されたものではない。当業者であれば、これらの実施例に関して様々な改変または変更が予見できると思われ、それらは本出願の本質と範囲、ならびに特許請求の範囲に包含される。
【００３２】
実施例１：トランケーションされたヒトＦＡＡＨの調製
この実施例で説明する方法に従ってトランケーションされたヒトＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ）を調製し、以下の実施例２〜４で説明する実験で用いた。配列番号１に、このトランケーションされたヒトＦＡＡＨのアミノ酸配列を示すが、これは、全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９を含む。配列番号２に、全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉのコドンが最適化されたＤＮＡ配列を示す。
【００３３】
Ａ．ｈＦＡＡＨプラスミドのクローニングと構築
既知の分子生物学的な技術を利用して、本明細書で説明されているコンストラクトのクローニングと構築を実施した。このような技術は、例えば、Ｄａｖｉｓ等，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，エルゼビア・サイエンス・パブリッシング社（Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク，ニューヨーク州，１９８６；Ｈａｍｅｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＬプレス（ＩＬ Ｐｒｅｓｓ），１９８５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，編Ａｕｓｕｂｅｌ等，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズに記載されている。
【００３４】
ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（ヒト（ｈ）ＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードする）
以下のｃＤＮＡを注文合成し、ｐＵＣ１１９ベクター（ブルー・ヘロン・バイオテクノロジー（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ボセル，ワシントン州）にサブクローニングした。最適化アルゴリズム（ブルー・ヘロン・バイオテクノロジー（ボセル，ワシントン州））を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン最適化を行った。
【００３５】
−ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨのアミノ酸１〜５７９をコードする）：ｈＦＡＡＨのＥ．ｃｏｌｉのコドンを最適化したＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡ（アミノ酸１〜５７９をコードする）であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位、３’停止コドン、および、３’−ＥｃｏＲ Ｉ部位を含む（配列番号３）。
【００３６】
−ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ、アミノ酸３０〜１０４をコードする）：ｈＦＡＡＨのＥ．ｃｏｌｉのコドンを最適化したＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡ（配列番号３の９４〜３１９ｂｐ）であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位を含む（配列番号４）。
【００３７】
ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨのアミノ酸１〜５７９をコードする）をＸｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉで消化し、そのインサートを、Ｘｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉで消化したｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ３６０〜２０）にサブクローニングし、ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９をコードする）を作製した。ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨベクターをＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIで消化し、得られたＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ III（約４.５ｋｂ）断片、および、Ｈｉｎｄ III−Ｈｉｎｄ III（約１.５ｋｂ）断片を、ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜１０４をコードする）コンストラクトを消化して生成したＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメント（２２５ｂｐ）とライゲーションし、ＮＨ2−末端にＨｉｓ−タグを有するｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（全長ｈＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードする）を作製した。
【００３８】
ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９をコードする）
原核性の発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ），カタログ番号６９８６４〜３）にサブクローニングするためのヒトＦＡＡＨコンストラクトを、ＰＣＲで以下のプライマーを用いて、ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜５７９）コンストラクトから作製した：センスプライマー、５’−GGAATTCCATATGTCAGGTCGTCGTACCGCACGTG−３’（配列番号５）；および、アンチセンスプライマー、５’−CCGCTCGAGTTATGAGGATTGTTTTTCCGGAGTCAT−３’（配列番号６）。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉで消化し、Ｎｄｅ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉで消化したｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにサブクローニングし、ＮＨ2−末端にＨｉｓ−タグを有するｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３２〜５７９をコードする）を作製した。
【００３９】
ヒトＦＡＡＨコンストラクトの要約：
ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３０〜５７９）をコードする：
MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRTLYDDDDKDRWGSELE----hFAAH
ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３２〜５７９）をコードする：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM----hFAAH
「−−−−」は、アミノ酸位置を示さない。それぞれ指定されたｈＦＡＡＨ位置は、具体的に指定されたＨＨＨＨＨＨを含むリーディング鎖のアミノ酸配列と隣接している。
【００４０】
Ｂ．トランケーションされたｈＦＡＡＨの発現および精製
「ＲＴ」は、室温を意味し、典型的には２５℃±３℃である。野生型ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９に対応するアミノ酸をコードするｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨコンストラクトを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ株に形質転換した。新たに形質転換された発現株の培養液１.２リットルを、スーパーブロス（ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ）培地中で、３０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下で、３７℃で増殖させた。ＯＤ600が約０.１２で、この培養液を室温に移し、ＯＤ600が０.６〜０.６５で１００μＭのＩＰＴＧと０.２％Ｌ−アラビノースとで室温で２０時間誘導した。以下の全ての操作は、特に他の規定がない限り、４℃でなされた。次に、この細胞を、遠心分離によって５０００×ｇで回収した。細胞ペレットを、ＰＢＳ（７００ｍｌ）に再懸濁することによって２回洗浄し、遠心分離によって５０００×ｇで回収した。この時点で、細胞のペーストを凍結して、−８０℃で必要になるまで保存してもよい。この細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／１００ｍＭのＮａＣｌ／１％トリトンＸ−１００）６０ｍｌに撹拌しながら再懸濁した。ＤＮアーゼとＲＮアーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉのペレット２５ｇあたり１ｍｇ）を添加した後に、この細胞懸濁液を、断続的にを混合しながら室温で１時間インキュベートし、氷上で１０分間冷却し、約４０〜６０回の１０秒のパルスで超音波破砕した。得られた溶解産物を１０,０００×ｇで３５分間遠心分離し、上清を、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製の５ｍｌのＮｉ−カラム（ハイトラップ・キレーティングＨＰカラム（ＨｉＴｒａｐ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ），カタログ番号１７−０４０９−０１，製造元の説明書に従ってＮｉを装填）に、０.５〜１ｍｌ／分でローディングし、これを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８.０／３００ｍＭのＮａＣｌ／１％トリトンＸ−１００）で平衡化した。得られた流出液をカラムに再度ローディングした。カラムを緩衝液Ｂ（１００ｍｌ）で洗浄し、さらに、それぞれ１０、２０および５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍｌ）で順番に洗浄した。溶出は、それぞれ１００、２００、４００および７００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（２５ｍｌ）の順番でなされた。ＦＡＡＨの大半を、１００〜２００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｂで溶出させた。溶出したＦＡＡＨを、緩衝液Ｂに対して一晩透析し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００４１】
実施例２：１００μＭオレアミドでのＦＡＡＨの用量応答曲線
ＦＡＡＨ活性の定量検出が可能な分析かどうかを決定するために、ＦＡＡＨの濃度を高めながら分析を行った。反応は、９６ウェルの透明なポリスチレンプレートで行った。反応混合物（２５０μｌ）は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１００μＭオレアミド、１５０μＭのＮＡＤＨ、３ｍＭのα−ケトグルタル酸、２ｍＭのＡＤＰ、６.０ユニット／ｍｌのＧＤＨ、０.１％トリトン(R)Ｘ−１００、および、既定量の約１５０ｎＭのＦＡＡＨを含んでいた。この反応液を３７℃でインキュベートし、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ(R) ソフトウェア（モレキュラー・デバイス，パロアルト，カリフォルニア州）を備えた、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ(R)（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）を用いて、３４０ｎｍでの吸光度を３０分にわたり１０秒のインターバルで測定値を読み取り回収した。図１で示されるように、ＦＡＡＨの濃度が高くなるにつれて、反応の速度も増加した。
【００４２】
実施例３：オレアミド濃度におけるＦＡＡＨの初速度の依存性
濃度
ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析が、酵素動力学に適合しているかどうかを決定するために、さらに、ＦＡＡＨが典型的なミカエリス−メンテンの酵素動力学に従っていることを実証するために分析を行った。反応は、９６ウェルの透明なポリスチレンプレートで行われた。反応混合物（２５０μｌ）は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１５０μＭのＮＡＤＨ、３ｍＭのα−ケトグルタル酸、２ｍＭのＡＤＰ、１２ユニット／ｍｌのＧＤＨ、０.１％トリトン(R)Ｘ−１００、既定濃度のオレアミド、および、約１０ｎＭのＦＡＡＨを含んでいた。この反応液を３７℃でインキュベートし、実施例１で説明されたようにしてデータを回収した。ｘ軸にオレアミド濃度をプロットし、ｙ軸に初速度をプロットした。そのデータを、ミカエリス−メンテン式にフィッティングした。図２で示されるように、このＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析は、ＦＡＡＨの速度定数の測定が可能である。また、このデータは、ＦＡＡＨが典型的なミカエリス−メンテンの速度論に従っていることも実証する。Ｋｍ値は、反応速度がその最大値の半分になった時点のオレアミド基質濃度であり、これは１９.８μＭと決定された。
【００４３】
実施例４：化合物ＡによるＦＡＡＨ阻害の測定
分析の有用性をさらに実証するために、ＦＡＡＨ活性に対する１−オキサゾロ［４,５−ｂ］ピリジン−２−イル−５−フェニル−ペンタン−１−オン（（ＰＮＡＳ，（２０００）ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１０：ｐ５０４２）、以降、化合物Ａ）の阻害作用を、ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析を用いて試験した。反応は、９６ウェルの透明なポリスチレンプレートで行われた。反応混合物（２００μｌ）は、５０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ７.４）、５０μＭオレアミド、１５０μＭのＮＡＤＨ、３ｍＭのα−ケトグルタル酸、２ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１２ユニット／ｍｌのＧＤＨ、０.１％トリトンＸ−１００(R)、図３で指定された濃度の化合物Ａ、および、約１０ｎＭのＦＡＡＨを含んでいた。オレアミド（５００μＭ）を２５％ＤＭＳＯに溶解させ、２５％ＥｔＯＨをストック溶液として用いた。化合物Ａのストック溶液を５０％ＤＭＳＯに溶解させて用いた。ＤＭＳＯとＥｔＯＨの最終濃度はそれぞれ７.５％であった。この反応液を３７℃でインキュベートし、実施例１で説明されたようにしてデータを回収した。図３に示した結果から、化合物Ａは、ＦＡＡＨを用量反応性の方式で阻害することが実証される。
【００４４】
配列表の説明
配列番号１−全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９。
配列番号２−Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化した、全長ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３−Ｅ．ｃｏｌｉのコドンを最適化したｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９）配列のＤＮＡ配列であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位、３’停止コドン、および、３’−ＥｃｏＲ Ｉ部位を含む。
配列番号４−配列番号３の９４ｂｐ〜３１９ｂｐのＤＮＡ配列であり、５’−Ｘｈｏ Ｉ部位を含む。
配列番号５および６−プライマー。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】一定濃度のオレアミドの存在下でＦＡＡＨ濃度を変化させる作用のグラフ表示である。
【図２】ＧＤＨと組み合わせたＦＡＡＨ反応の速度は、ミカエリス−メンテンの速度論式に従っていることを実証するグラフ表示である。
【図３】化合物Ａは、用量反応性の方式でＦＡＡＨ活性を阻害することを示す、ＧＤＨを組み合わせたＦＡＡＨ分析のグラフ表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）既定量の：
（１）アンモニア生産酵素、
（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、
（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質、および、
（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素、
を含む反応混合物を用意する工程；
（ｂ）アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下で、該反応混合物をインキュベートする工程；および、
（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程；
を含み、ここにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、アンモニア生産酵素の活性の指標である、アンモニア生産酵素の活性を測定する方法。
【請求項２】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質は、α−ケトグルタル酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、還元型の補酵素の消費量を測定することによって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
還元型の補酵素の消費量は、分光光度法で、約２９０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長で測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンモニア生産酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）既定量の：
（１）アンモニア生産酵素、
（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、
（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質、および、
（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素、
を含む反応混合物を用意する工程；
（ｂ）該反応混合物を、試験化合物の非存在下および存在下で、さらに、アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下でインキュベートする工程；および、
（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程；
を含み、ここにおいて、該試験化合物の存在下と非存在下における還元的アミノ化の速度の違いは、その試験化合物が、アンモニア生産酵素の活性を調節可能であることを示す、アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法。
【請求項８】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質は、α−ケトグルタル酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、還元型の補酵素の消費量を測定することによって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
還元型の補酵素の消費量は、分光光度法で、約２９０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長で測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アンモニア生産酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素は、ＮＡＤＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
還元型の補酵素の消費量は、分光光度法で、約３４０ｎｍの波長で測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アンモニアを生産する基質は、オレアミドである請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）既定量の：
（１）アンモニア生産酵素、
（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、
（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質、および、
（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素、
を含む反応混合物を用意する工程；
（ｂ）アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下で、該反応混合物をインキュベートする工程；および、
（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程；
を含み、ここにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、アンモニア生産酵素の活性の指標である、アンモニア生産酵素の活性を測定する方法。
【請求項２】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質は、α−ケトグルタル酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、還元型の補酵素の消費量を測定することによって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
還元型の補酵素の消費量は、分光光度法で、約２９０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長で測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンモニア生産酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）既定量の：
（１）アンモニア生産酵素、
（２）アンモニア生産酵素についてのアンモニアを生産する基質、
（３）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
（４）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質、および、
（５）グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素、
を含む反応混合物を用意する工程；
（ｂ）該反応混合物を、試験化合物の非存在下および存在下で、さらに、アンモニア生産酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応が可能な条件下でインキュベートする工程；および、
（ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度を測定する工程；
を含み、ここにおいて、該試験化合物の存在下と非存在下における還元的アミノ化の速度の違いは、その試験化合物が、アンモニア生産酵素の活性を調節可能であることを示す、アンモニア生産酵素の活性を調節することができる化合物を同定する方法。
【請求項８】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元的アミノ化基質は、α−ケトグルタル酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される還元的アミノ化の速度は、還元型の補酵素の消費量を測定することによって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
還元型の補酵素の消費量は、分光光度法で、約２９０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長で測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アンモニア生産酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての還元型の補酵素は、ＮＡＤＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
還元型の補酵素の消費量は、分光光度法で、約３４０ｎｍの波長で測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アンモニアを生産する基質は、オレアミドである請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５２９５１９（Ｐ２００８−５２９５１９Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４６６７（Ｐ２００７−５５４６６７）
【出願日】平成１８年２月１日（２００６．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００２５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５１９６
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０３１８１２６６）ワーナー−ランバート カンパニー リミテッド ライアビリティー カンパニー (167)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１日（２００６．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００２５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５１９６
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０３１８１２６６）ワーナー−ランバート カンパニー リミテッド ライアビリティー カンパニー (167)
【Ｆターム（参考）】
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