脂肪酸アルキルエステルの酵素的合成のためのプロセス
バイオ燃料、食品および洗剤の各産業で使用される脂肪酸アルキルエステルの生成のための酵素のバッチ式プロセスまたは連続プロセスおよびそのシステムを開示する。該プロセスは、疎水性樹脂上に固定化された酵素を脂肪酸源と、アルコールまたはアルコール供与体とをアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水性緩衝液の存在下で、または水溶液の存在下で混合させて利用する。脂肪酸アルキルエステルの生成プロセスは、エステル交換またはエステル化を同時に、もしくは順次行うことによって実行される。生体触媒活性は、複数回の使用で何ら著しい活性消失もなく維持され、かつ生体触媒上でのグリセロールおよび水の副産物または他の親水性化合物の蓄積を防ぐ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
バイオ燃料、食品および海面活性剤の産業での使用用の脂肪酸アルキルエステルの生成のための酵素法が開示される。このプロセスでは、脂肪酸源およびアルコールまたはアルコール供与体は、疎水性樹脂上に固定化された酵素の存在下、アルカリ性水性緩衝液または水の存在下で、反応させる。開示されるプロセスは、または連続撹拌タンク反応器もしくは充填層反応器を連続で用いるバッチ式でまたは連続的でのいずれかで行われることができる。
【背景技術】
【０００２】
酵素の固定化は、全酵素法において酵素の費用分担を減少させること；生成物から酵素の回収を容易すること；および該プロセスの連続操作を可能にすることを基本的に目標とする夥しい数の技法によって説明されてきた。
【０００３】
固定化技法は、通常、以下によって分類される：
１．シリカ高分子および不溶性高分子などの固体担体への酵素の物理的吸着。
２．イオン交換樹脂への吸着。
３．エポキシ化無機担体または高分子担体などの固体担体材料との酵素の共有結合。
４．成長する高分子内での酵素の封入。
５．膜反応器または半透性ゲル内での酵素の封入。
６．架橋酵素結晶（ＣＬＥＣ）または架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）。
【０００４】
上述のすべての酵素固定化プロセスは、以下のステップで構成されている：
１．ｐＨ、温度、緩衝塩の種類およびイオン強度に関して適切な緩衝液系で酵素を溶解するステップ。
２．酵素溶液に固体担体を加えて、酵素分子が該固体担体上に固定化されるまで暫く混合するステップ。
３．固定化した酵素を含む固体担体を濾過するステップ。
４．固体担体を適切な緩衝液で洗浄して、結合が弱い酵素分子を除去し、次いで該固体担体を乾燥させるステップ。
【０００５】
大部分はリパーゼである界面酵素は、上述した技法の後に固定化されてきた。これらの技法は、低い合成活性および／または短い作用半減期を有する固定化酵素調製物を提供した。固定化リパーゼおよび他の界面酵素の合成活性と安定性を増加させる試みにおいて、様々な活性化法が適用されてきた。これらの方法は以下を含む：
１．脂肪酸またはポリエチレングリコールなどの疎水性残基に酵素の表面官能基を結合すること。
２．酵素の表面を、ポリオール脂肪酸エステルなどの界面活性物質で被覆すること。
３．エタノールまたはイソプロパノールなどの親水性溶媒で前処理されている疎水性担体（典型的にはポリプロピレン）と酵素を接触させること。
【０００６】
酵素逆変換を工業量で行うために、固定化界面酵素の安定化および対費用効果に関して、上述の方法のいずれも、満足な結果をもたらさなかった。また、上述した方法によって固定化される場合、固定化方法によって課せられるいくつかの制約のため、または反応媒体中にいくつかの酵素抑制物質が存在するために、その合成活性のかなりの部分を失う、もしくはその活性の完全な性能を示さないことが報告されている。
【０００７】
リパーゼおよびホスホリパーゼの別の主要な弱点は、親水性基質、特に短鎖アルコール類および短鎖脂肪酸（Ｃが４以下のもの）に対するそれらの耐性が低いことである。多くの研究調査では、短鎖アルコール類および短鎖脂肪酸（それぞれメタノールおよび酢酸など）がこれらの酵素の四次構造から重要な水分子が分離することに関与しており、それらの触媒活性の変性およびその結果、触媒活性の消失を引き起こすことが観察されている。この弱点のために、基質としてオイルトリグリセリドおよびメタノールを用いる、脂肪酸メチルエステル「バイオディーゼル」の商業量の生産のためにリパーゼの使用が妨げられてきた。
【０００８】
遊離アルコールによる脂肪酸源のエステル交換／エステル化のために固定化リパーゼを用いるさらなる弱点は、生体触媒上に形成されたグリセロールおよび水の副産物が蓄積され、したがって基質が固定化酵素の活性部位に自由に接近するのを妨げていることである。かかる生体触媒は通常、同じバッチの生体触媒が使用される場合、数サイクル後にその触媒性能を失う。
【０００９】
本発明者らは、多くの生成サイクルにわたり良好な安定性を示し、活性を持続する特別な固定化酵素調製物を開発した。かかる酵素調製物の例は、とりわけ、国際公開第ＷＯ２００８／０８４４７０号、同第ＷＯ２００８／１３９４５５号、および同第ＷＯ２００９／０６９１１６号に開示されている。
【００１０】
触媒反応が行われる条件は、固定化酵素調製物の安定性および効率に悪影響を与えることもある。触媒反応条件下で安定性および活性を保持する酵素調製物を有することは重要である。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の目的は、説明が進むにつれて明らかになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源をアルコールまたはアルコール供与体と反応させることを含む、脂肪酸源のアルコールでのエステル交換／エステル化を行うプロセスに関し、該固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水性アルカリ性緩衝液を含む。
【００１３】
前述の水性アルカリ性緩衝液は、弱アルカリ性水性緩衝液であってもよい。前述の水性アルカリ性緩衝液は、脂肪酸源の最高５重量％までの量で反応混合物に含まれてもよい。該水性緩衝液は、７から約１１、例えば、７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０および７〜１１のいずれか１つのｐＨ値であってよい。該緩衝液を含む補充した弱アルカリ性試薬のｐＫａは、脂肪酸源を含む酸類のｐＫａよりも高いまたは等しい。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源とアルコールとを反応させることを含む、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化を行うプロセスに関し、固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水を含有する。水は、３〜１１のｐＨ値を有する水溶液の形状である。反応媒体は、脂肪酸源の５重量％までの水または水溶液を含んでもよい。
【００１５】
本発明のすべての実施形態および態様では、アルコールは短鎖アルコール、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルアルコール、より具体的にはＣ１−Ｃ４アルキルアルコール、特にメタノールまたはエタノールであってもよい。前述のアルコールがメタノールである場合、結果として生じる脂肪酸エステルは、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ−Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）である。また、アルコールは、中鎖脂肪アルコール（Ｃ６−Ｃ１０）または長鎖脂肪アルコール（Ｃ１２−Ｃ２２）であってもよい。アルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジメチルもしくは炭酸ジエチルなどの炭酸ジアルキルであってもよい。
【００１６】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の固定化リパーゼは、遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルおよび副産物として水をもたらすことができ、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステル、および副産物としてグリセロールをもたらすことができる。
【００１７】
アルカリ性緩衝液またはアルカリ性溶液の使用に関する本発明のすべての実施形態および態様では、反応媒体中の前述のアルカリ性緩衝液またはアルカリ性溶液の量は、脂肪酸源の０．００１〜５重量％である。
【００１８】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の少なくとも１つのリパーゼは、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、サーモマイセスラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンのいずれか１つに由来するリパーゼであってもよい。リパーゼ調製物は、同じ疎水性担体上でそれぞれ別々に固定化されうる、または共固定化されてもよい。前述のリパーゼは、同一のまたは異なる位置特異性を有することもある。前述のリパーゼは、同時に、または連続的に遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルおよび副産物として水をもたらすことができ、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステルおよび副産物としてグリセロールをもたらすことができる。
【００１９】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の担体は、疎水性脂肪族高分子をベースにした担体および疎水性芳香族高分子をベースにした担体のうちのいずれか１つでありうる。前述の疎水性高分子担体は、線状または分岐状の有機鎖から構成されてもよい。前述の担体は、マクロ網状有機高分子鎖またはコポリマー鎖を含むこともある。前述の担体は多孔質、または非多孔質の無機担体であってもよく、これらは疎水性であってもよく、または疎水性有機材料で被覆されている。前述の有機材料は、線状、分岐状、または官能基を有する疎水性有機鎖であってもよい。
【００２０】
本発明のすべての実施形態および態様では、アルカリ性緩衝液が使用される場合、前述の水性アルカリ性緩衝液は、無機アルカリ塩または有機塩基の溶液でありうる。前述のアルカリ性緩衝液は、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩、第一級、第二級および第三級のアミン、ならびにそれらの任意の混合物のいずれか１つの溶液であってもよい。特定の実施形態では、前述のアルカリ性緩衝液は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムおよび炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムから選択される弱塩基の溶液であってもよい。本発明のプロセスについての一部の実施形態では、前述のアルカリ性緩衝液は、前述の脂肪酸源の予備混合の段階で、または直接的に反応媒体に加えられてもよい。
【００２１】
本発明のすべての実施形態および態様では、アルカリ性緩衝液が使用される場合、エステル交換／エステル化反応媒体中の前述のアルカリ性緩衝液の含有量は、油供給原料の０．００１〜５重量％、例えば１〜２重量％でありうる。
【００２２】
本発明の一部の実施形態では、脂肪酸源は、まずアルカリ性緩衝液と、または水もしくは水溶液と混合されてもよく、次いでこの混合物を前述の固定化リパーゼ調製物で処理してもよく、続いて前述のアルコールを加えることで、前述の脂肪酸源が脂肪酸エステルに変わるまで適切な条件下で反応が進行することが可能になる。
【００２３】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の脂肪酸源は、植物油、動物性脂肪、藻油、魚油、廃油およびそれらの任意の混合物のいずれか１つであってもよい。前述の脂肪酸源は、リン脂質およびステロールエステルなどの他の微量な脂肪酸誘導体の非存在下または存在下で、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、任意の割合でのそれらの混合物を含んでもよい。脂肪酸源は、未精製、精製、漂白、脱臭したものまたはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００２４】
本発明のすべての実施形態および態様では、反応は、１０℃と１００℃との間、具体的には、２５℃と３０℃との間の温度で行われうる。
【００２５】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の脂肪酸源は、プレ反応調整容器中で、前述のアルコールもしくはアルコール供与体と、および水もしくは緩衝液と予備混合させて、エマルジョンを形成し、次いで前述の固定化リパーゼ調製物とともにエステル交換／エステル化反応容器に供給されてもよい。
【００２６】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の固定化リパーゼを、バッチ方式でまたは連続方式で作動する充填層反応器で使用してもよい。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのシステムが提供され、該システムは脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含む反応媒体を固定化リパーゼ調製物の存在下で反応させるように構成された反応容器を含み、該固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、該反応媒体が水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを含む。
【００２８】
該システムは、任意の所望の組み合わせまたは順列で、以下の特徴の１つまたは複数を含みうる：
Ａ．前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、反応容器は固定化リパーゼ調製物を含むことができる。
Ｂ．Ａの特徴に加えてまたはその代わりに、前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、反応容器は脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含むことができる。
Ｃ．ＡもしくはＢの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、前述の反応媒体は混合物を含み、前述のシステムは前述の反応容器と選択的流体連通しているプレ反応容器をさらに含み、前述のプレ反応容器は前述の混合物を形成するために少なくとも脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを予備混合するように、および前述の混合物を前述の反応容器に選択的に送るように構成されている。該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述のプレ反応容器と選択的流体連通し、かつ脂肪酸を前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成された脂肪酸源と、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述のプレ反応容器と選択的流体連通し、かつアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つを前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成されたアルコール源とを随意にさらに含むことができる。該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述のプレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前述の混合物に含まれるべく水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成された緩衝液源を随意にさらに含む。
Ｄ．ＡからＣの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、脂肪酸および／またはアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つおよび／または水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つからの１つまたは複数を連続方式または別々のバッチでのいずれかでそれぞれ前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成されることができる。
Ｅ．ＡからＤの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該プレ反応容器は、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の混合物を連続方式および／または別々のバッチで前述の反応容器に選択的に送るように構成されることができる。
Ｆ．ＡからＥの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、少なくとも１つの脂肪酸と；アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つと；水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つとを前述の反応容器に選択的かつ直接的に送るように構成されることができる。
Ｇ．ＡからＦの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該反応容器は、前述の反応容器中の反応媒体を選択温度範囲内に維持するように構成された温度調節装置を含むことができる。
Ｈ．ＡからＧの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、固定化リパーゼ調製物を前述の反応容器内に保持するように構成された保持装置をさらに随意に含むことができる。
Ｉ．ＡからＨの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の反応容器と選択的流体連通している生成物分離容器をさらに随意に含むことができ、前述のシステムが反応産物を含む反応混合物を前述の反応容器から前述の生成物分離容器に選択的に送るように構成され、および前述の生成物分離容器がそこに送られた反応混合物から脂肪酸アルカルエステルの生成物を選択的に分離するように構成されている。例えば、生成物分離容器は、遠心分離機および重力分離装置のうちの１つでありうる。
Ｊ．ＡからＩの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該反応容器は、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の反応混合物を前述の生成物分離容器に連続方式でおよび／または別々のバッチで選択的に送るように構成される。
Ｋ．ＡからＩの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の生成物分離容器からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に送るように構成される。例えば、該システムは、前述の生成物分離容器からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を連続方式でおよび／または別々のバッチで選択的に送るように構成される。
Ｌ．ＡからＫの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を増加させるように構成される。この特徴を有するシステムの一構成では、該システムは、続いて前述の生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物をさらに増加させるために、脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に別のルートで送るように構成される。この特徴を有するシステムの別の構成では、該システムは、補助反応器のモジュールに脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に別のルートで送るように構成され、前述の補助反応器のモジュールが補助反応容器と補助生成物分離容器とを含み、脂肪酸アルキルエステルの前述のさらに増加した生成物は、続いて前述の補助生成物分離容器を介して選択的に送られる。
【００２９】
本発明を理解し、および本発明をどのようにして実際に行えうるかを調べるために、ここで添付の図面を参照して、非限定的な例だけの目的で、実施形態を説明する：
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】疎水性樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００（Ａｍｂ．ＸＡＤ１６００）上に、および親水性樹脂としてＤｕｏｌｉｔｅ Ｄ５６８（Ｄｕｏ Ｄ５６８）上に固定化されたリパーゼ・サーモマイセスラヌギノサ（ＴＬ）、ならびに疎水性樹脂としてＳｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ７０（ＳＢ ＳＰ７０）上に、および親水性樹脂として多孔質シリカ（Ｓｉｌ．）上に固定化されたリパーゼ・シュードモナスエスピー（ＰＳ）のエステル交換活性を示すグラフである。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図２】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図３】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの転換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図４】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、水を含まずに、および異なるレベルの水で６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水
【図５】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、異なるレベルの水で６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水
【図６】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで４時間エステル化／エステル交換を行った後の、ＦＦＡおよび大豆油の混合物のバイオディーゼルと、グリセロールおよび水の副産物とへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水
【図７】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム２％の存在下で４時間反応させた後の、大豆油加水分解産物のバイオディーゼルおよび水へのエステル化を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ａｃ．Ｖａｌ．−酸価；Ｃｙｃ．−サイクル
【図８】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム１重量％の存在下で６時間反応させた後の、魚油のエタノールとのエステル交換を示すグラフである。生体触媒は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼ（それぞれＴＬ Ｌｉｐ．、ＰＳ Ｌｉｐ．）であった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図９】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム２重量％の存在下で６時間反応させた後の、獣脂のエタノールとのエステル交換を示すグラフである。生体触媒は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ、シュードモナスエスピー由来のリパーゼ（ＰＳ Ｌｉｐ．；ＴＬ Ｌｉｐ．）であった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図１０】疎水性で多孔質の樹脂上に固定化されたカンジダアンタークティカとともに、疎水性で多孔質の樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーまたはサーモマイセスラヌギノサを用いて、７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含む、４時間後に得られたエステル交換／エステル化の反応媒体の処置を示すグラフである。略語：Ａｃ．Ｖａｌ．−酸価；Ｃｙｃ．−サイクル
【図１１】本発明の一態様によって脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムの第１の実施形態を示す概略図である。
【図１２】本発明の一態様によって脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムの第２の実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
酵素で触媒される工業プロセス、特に固定化リパーゼの存在下で、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化を行うプロセスについての改善を求めて、本発明者らは、固定化リパーゼの安定性が多数の生成サイクルにわたり維持される特定の条件を開発した。
【００３２】
本発明の一実施形態では、本発明は、脂肪酸のアルキルエステル、具体的には、脂肪酸メチルエステルおよびエチルエステル（バイオディーゼル）などの脂肪酸の短鎖アルキルエステルを無溶媒のアルカリ性微水系で調製するプロセスに関する。特定の実施形態では、アルカリ性微水系は、弱アルカリ性微水系である。前述のプロセスは、脂肪酸源を供給し、前述のアルカリ性もしくは弱アルカリ性の条件下で、固定化リパーゼ調製物の存在下で、脂肪酸源を遊離アルコールまたはアルコール供与体と反応させることを含む。理論に束縛されることなく、アルカリ性緩衝液による脂肪酸源の前処理は、酵素に阻害効果を及ぼすこともある酸の中和をもたらすであろう。最高１００％までの変換までの反応を完了するために必要とされるアルコールの量を段階的にまたは１つのバッチで添加してもよい。さらに、該アルコールは、短鎖アルコール、例えばメタノールまたはエタノールであってもよい。他のアルコール供与体を加水分解酵素の存在下で脂肪酸源との反応で用いてもよく、これにより前述の脂肪酸源が脂肪酸アルキルエステル、具体的には、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）または脂肪酸エチルエステルに変換されるまで、適切な条件下で該反応が進行することが可能になり、ここで前述の加水分解酵素調製物が適切なマクロ網状の多孔質疎水性高分子をベースにした担体上に別々にまたは一緒に固定化された１つまたは複数のリパーゼを含む。
【００３３】
さらなる実施形態では、脂肪酸源とアルコールまたはアルコール供与体との間のエステル交換／エステル化反応は、反応混合物に水を添加することで、水性微小環境で行われる。特定の実施形態では、水は、脂肪酸源の０．０００１〜５重量％で添加されてもよい。ここで用いられる水とは、純水または蒸留水、および「水溶液」も意味し、水溶液とは、水道水、海水もしくはいずれの他の天然水源もしくは貯水池からの水、脱塩水、化学的にもしくは酵素的に精製または処理された水、およびいずれの他の水溶液であってもよいがこれらに限定されるものではない。反応系または水溶液のｐＨ値は変化することがあり、例えば、約３〜１１、例えば４〜１０、５〜１０、５〜９、６〜１０、６〜９、または７〜９でありうる。
【００３４】
本発明のプロセスは、形成されるグリセロールおよびいずれの過剰な水を反応混合物から連続的に除去しながら、行われることも可能である。前述の脂肪酸源に含まれる遊離脂肪酸の脂肪酸アシル基の、脂肪酸アルキル、具体的にはメチルエステルへの変換は、反応の間、種々の時点でモニターされることができる。反応媒体は、反応の間、任意の所望の時点で適切な手法より除去されてもよく、それによって反応が停止され、形成された脂肪酸メチルエステルと、随意に、形成されたグリセロールとが該反応媒体から単離される。前述の脂肪酸源に含まれる脂肪酸アシル基または遊離脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換が少なくとも７０％、例えば少なくとも８５％、または少なくとも９０％に達したときに、該反応は明確に停止されてもよい。
【００３５】
該反応系は、同時係属中の国際公開第ＷＯ２００９／０６９１１６号に記述されているものと同じようでありうる。例えば、生成システは、反応器内に生体触媒を保持するが、しかし反応媒体が反応器を通って浸透することを可能する焼結ガラスまたはステンレス鋼フィルタの底部を有する撹拌タンク反応器を用いてもよい。かかる反応器の構成は、副産物、具体的にはグリセロールおよび水を考慮に入れている。副産物は、固定化酵素から、シンク、反応器の底部へと自己脱離し、フィルタを通って染み出る。形成され、脱離したグリセロールおよび過剰な水分も反応媒体から連続的に除去される結果、合成に向かって反応の変化がもたらされ、それによって９８％を超える変換が達成される。この反応器で用いられる生体触媒は、本明細書に記述するように、それらの位置特異性ならびにそれらの起源を考慮すると、単一種または複数種のリパーゼから構成されてもよい。代替の、底部フィルタを有する２つの連続した撹拌タンク反応器を用いてもよい。沈殿タンクまたは遠心分離機をこれら２つの反応器の間に用いてもよい。第１の反応器は、単一種または複数種のリパーゼから構成される固定化生体触媒を含んでもよい。両反応器の間の沈殿タンクまたは遠心分離機の役割は、形成されるグリセロールおよび過剰な水を反応媒体から除去することであり、それによって原料の対応する脂肪酸アルキルエステルへの変換が増加し、第２の反応器において適切な反応時間で９８％を超えることになる。一部の特定の反応系およびその方法は、後述する。
【００３６】
用語「反応混合物」、「反応系」および「反応媒体」とは、本明細書では同意語として使われることもある。
【００３７】
本発明の実施形態におけるように、アルカリ性緩衝液または水溶液の存在下で、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを用いることで、安定性の高い酵素を確保し、かつ水および形成されるグリセロール副産物などの親水性物質が生体触媒上に蓄積されないようにする。本発明のプロセスの特定の実施形態では、０．００１〜５％のアルカリ性または弱アルカリ性緩衝液、例えば、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、例えば０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、０．７５％、１%、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％。４．５％または５％などのアルカリ性または弱アルカリ性緩衝液を用いる。本発明のプロセスの特定の実施形態では、水を用いる場合、該水は０．０００１〜５％の水、例えば０．００１〜５％、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、例えば０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％などのレベルで用いる。上述のように、アルカリ性溶液を用いる場合、該溶液は、脂肪酸源中に典型的に存在するまたは副反応物のために生成される酸を中和することが可能である。これらの副産物を持続的かつ積極的に除去することで、プロセスの効率さえも上昇しうる。単離したグリセロールを、工業的に使用してもよい。
【００３８】
本発明のプロセスで用いられる脂肪酸源は、大豆油、カノーラ油、藻類油、菜種油、オリーブ油、ヒマシ油、パーム油、ひまわり油、落花生油、綿実油、ジャトロファ油、粗トウモロコシ油、魚油、動物性油脂、廃食油、ブラウングリース、非食油植物源に由来するオイルトリグリセリド、これらの油またはそれらの少なくとも２つの任意の混合物（任意の所望の割合で）に由来する部分グリセリドおよび遊離脂肪酸のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
【００３９】
本発明のすべてのプロセスでは、反応によって形成される脂肪酸短鎖アルキルエステルは、具体的には、脂肪酸メチル、エチル、イソプロピルまたはブチルエステル（バイオディーゼル）である。他の中鎖脂肪アルコール（Ｃ６−Ｃ１０）および長鎖脂肪アルコール（Ｃ１２−Ｃ２２）も本発明の生成プロセスで用いてもよい。これらの長鎖アルコールは、具体的にワックスの製造、例えば化粧品に適していることがある。
【００４０】
リパーゼは、サーモマイセスラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ムコールミーハイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉｅ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスエスピー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ペニシリウムロックフォルティ（Ｐａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンに由来するリパーゼであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
複数のリパーゼは、適切な担体、具体的には疎水性脂肪族高分子をベースした担体または疎水性芳香族高分子の担体上に一緒に固定化されることもある。前述のリパーゼの各々は、適切な担体上に固定化されてもよく、前述のリパーゼがその上に固定化される担体は、同一であるか、または異なっている。使用されるリパーゼは、それらの基質に対して位置特異的であるか、またはランダムであってもよい。複数のリパーゼが用いられる場合、リパーゼは、同一または異なる疎水性担体上に固定化されてもよい。同一の担体上に共固定化されるリパーゼは、それらの基質に対して同一もしくは異なる基質選択性または位置特異性を示すことができる。
【００４２】
複数のリパーゼは位置特異的（または部位特異的）であってもよく、各々は単独で、または同一もしくは異なる部位特異性のリパーゼとの組み合わせで用いられてもよい。ｓｎー１位、ｓｎ−２位またはｓｎ−３位と呼ぶとき、これらは種々のグリセリドのグリセロール骨格の位置である。このように、本発明のプロセスで用いられるリパーゼは、ランダムリパーゼのそれよりも高いｓｎ−２位に対する選択性（すなわち、アルコールもしくはアルコール供与体と、ｓｎ−２位の脂肪酸アシル基との間の反応を触媒することを好む）を有することもあるが、ランダムリパーゼは、グリセロール骨格上の３つのすべての位置で脂肪酸アシル基に対して同じエステル交換活性を示す。一部のリパーゼは、ｓｎ−２位で、特に、基質、生成物などによって決定される特定の条件下で、位置活性を独自に示す。本発明のプロセスで用いられる他のリパーゼは、ｓｎ−１、３位特異的である。それらのリパーゼは単独で、またはランダムリパーゼ、具体的には部分グリセリドに親和性を有するリパーゼとともに、およびｓｎ−２位に対して高親和性を有する第３のリパーゼと随意に用いられてもよい。
【００４３】
担体は、具体的には、多孔質およびマクロ網状疎水性担体であり、有機または無機担体であってもよい。担体の例としては、これらに限定されないが疎水化シリカまたは、およびアルミナをベースした担体などの多孔質無機担体、ならびにこれらに限定されないが高分子担体または高分子をベースにした担体などの疎水性有機担体がある。担体は、エポキシ基もしくは、およびアルデヒド基から選択される活性官能基、またはイオン基を随意に含んでもよい。
【００４４】
本発明のプロセスで用いられる不溶性担体は、具体的には、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０（両方とも、ジビニルベンゼンから、またはジビニルベンゼンとポリスチレンとの混合物から調製された多孔質のミクロ網状樹脂で構成されている）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ ７ＨＰ（ミクロ網状脂肪族アクリル高分子で構成されている）などの多孔質で網状の疎水性脂肪族高分子もしくは芳香族高分子をベースにした担体、および多孔質ポリプロピレン（Ａｃｃｕｒｅｌ（登録商標））などの多孔質脂肪族高分子である。
【００４５】
担体は、ジビニルベンゼン、またはジビニルベンゼンとスチレンとの混合物で構成された網状疎水性高分子、および脂肪族アクリル高分子、またはポリプロピレンなどのポリアルケンで構成された網状疎水性脂肪族高分子であってもよい。特定の担体は、孔径が２５〜１０００Åの範囲内、より具体的には８０〜２００Åの範囲内の多孔質母材である。また、担体は、粉末状もしくは顆粒状の多孔質疎水性シリカまたは他の無機酸化物であってもよい。また、担体は、粉末状もしくは顆粒状の多孔質疎水化シリカまたは他の無機酸化物であってもよい。特定の実施形態では、担体樹脂の表面積は、１００ｍ２／ｇよりも高い。
【００４６】
脂肪酸源とアルコールとの間のエステル交換／エステル化を触媒したリパーゼに補充されることになるアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水溶液の量は、通常、反応媒体の５重量％未満である。このアルカリ性溶液は、例えば、アルカリ性の無機塩基もしくは塩から、または有機塩基から調製される。無機塩基および塩類は、例えば、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩である。有機塩基は、例えば、第一級、第二級または第三級のアミンであってもよい。これらのアルカリ性薬剤の混合物も、考えられる。本発明によるプロセスでは、固定化酵素の微環境のｐＨは、アルカリ度または弱アルカリ度で維持される。図４および５に示すように、蒸留水を反応系に添加すると、疎水性担体（樹脂）上に固定化されたリパーゼの性能が向上するが、用いる塩基の種類に応じてｐＨ値が異なる種々のアルカリ性緩衝液を添加すると、例えば図２および３に示すように、疎水性担体（樹脂）上に固定化され、さらに安定したリパーゼがもたらされた。炭酸緩衝液および重炭酸緩衝液は、疎水性担体上に固定化されたリパーゼの安定性を増加させる際に効果的な弱塩基の例である。他の適切な塩基を本明細書に記述する。通常、緩衝液を構成する補充されたアルカリ性試薬または弱アルカリ性試薬のｐＫａは、脂肪酸源を含む酸類のｐＫａと等しいか、それよりも高い。本明細書で用いた弱アルカリ性溶液は、通常、７〜約１１、例えば７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０または７〜１１のｐＨ値を有する溶液である。通常、用いられるアルカリ性または弱アルカリ性水溶液の量は、反応で用いられる油の量に基づいて重量パーセント（重量％）で表される。
【００４７】
多孔質疎水性の高分子をベースにした担体（樹脂）上に固定化されたリパーゼをアルカリ性溶液または弱アルカリ性溶液の存在下で、例えば、０．０１〜５重量％、０．０５〜５重量％、０．０５〜４重量％、１〜５重量％、または１〜４重量％の量で用いると、脂肪酸源とアルコールとの間のエステル交換／エステル化反応において生体触媒の安定した活性がもたらされる。これは、以下の実施例で示す。
【００４８】
脂肪酸源は、トリグリセリド、部分グリセリド、遊離脂肪酸、リン脂質、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミド、または前述の少なくとも２つの源で構成される混合物のうちの少なくとも１つである。
【００４９】
脂肪酸アルキルエステルの生成は、エステル交換またはエステル化を同時にまたは順次行うことによって実行される。かかる反応系下で、生体触媒活性は、複数回の使用で何ら著しい活性消失もなく維持され、かつ生体触媒上にグリセロールおよび水の副産物または他の親水性化合物も蓄積されない。
【００５０】
本発明は。多数の生成サイクルにわたり高い活性および安定性を保持する特定の固定化界面酵素を使用するプロセスを提供する。具体的には、エステル交換／エステル化反応において、リパーゼおよびホスホリパーゼ調製物が使用される。これらの反応物は、食料品、化粧品およびバイオ燃料（「バイオディーゼル」）の生成で使用されることが可能である。特に興味深いのは、これらの酵素が、「バイオディーゼル」としての用途用の脂肪酸短鎖アルキルエステルの合成のために使用されることが可能なことである。
【００５１】
本発明は、メタノール、エタノールおよびグリセロールなどの短鎖アルコール、ならびに酢酸などの短鎖脂肪酸に対する耐用が高い、安定の固定化界面酵素を用いた。また、これらの酵素調製物を使用すると、親水性物質、特にグリセロールおよび水が固定化生体触媒上に蓄積されるのを防止する。
【００５２】
本発明の一実施形態では、適切な反応時間、典型的には５時間未満で、ほぼ完全な変換で所望の産物、すなわち脂肪酸アルキルエステルを得るために、疎水性担体（樹脂）上に固定化された１つまたは複数のリパーゼをアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水溶液の存在下で用いることによる、脂肪酸源とアルコールとの同時または順次のエステル交換／エステル化反応を行うプロセスが提供される。弱アルカリ性溶液、例えば、０．００１Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍまたは１Ｍの重炭酸ナトリウムは、反応で用いられる油の量の約５重量％未満、または約４重量％の量で、反応系中に存在してもよい。
【００５３】
以下の実施例で示すように、リパーゼの固定化のための疎水性樹脂担体をアルカリ性または弱アルカリ性の緩衝液の使用と組み合わせて、例えば、エステル交換／エステル化の反応媒体中０．００１〜５重量％の範囲で用いることで、リパーゼの作用寿命をのばすこともできる。以下の実施例でさらに示すように、ｐＨ値に関係なく、反応混合物の含水量は増加させてもよい。このように別の実施形態では、例えば、脂肪酸源の０．０００１〜５重量％で、または上で規定した特定の部分範囲のいずれかで水を添加することによって反応系の含水量を増加させることで、生体触媒の安定性が増加する。脂肪酸源の０．０００１〜５重量％の範囲のアルカリ性溶液（図２および３）を、または脂肪酸源の０．００１〜４重量％で水（図４および５）を添加することで、多数の反応サイクルにわたり酵素の活性および安定性が維持される結果となることをこの結果が示している。
【００５４】
本発明のプロセスで使用されるアルコールまたはアルコール供与体は、短鎖アルキルアルコール、具体的にはＣ１−Ｃ６アルキルアルコール、より具体的にはＣ１−Ｃ４アルキルアルコールであってもよく、特にメタノールもしくはエタノールもしくはアルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジメチルなどの炭酸ジアルキルであってもよい。例えば、炭酸ジアルキルなどのアルコール供与体は、反応系のアルカリ度または弱アルカリ度の源として役立つことも可能である。
【００５５】
本発明の別の態様によると、脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムが提供される。図１１を参照して、概して参照番号１００と称される、かかるシステムの第１の実施形態は、反応容器１２０、プレ反応調整容器１４０、および生成物分離容器１６０を含む。
【００５６】
プレ反応調整容器１４０は、供給原料と緩衝液（および／または水）を受け取り、それらから適切なエマルジョンを形成し、次いで調製したエマルジョンＰＥ（本明細書では乳化原料ともよぶ）を反応容器１２０に送るように構成される。特に、かかる供給原料は、脂肪酸源１８２からの脂肪酸ＦＡ（例えば廃食油）と、アルコール源１８４からのアルコールＡＬ（例えばメタノール）と、緩衝液／水源１８６からの緩衝液（および／または水）ＢＵとを含んでもよく、プレ反応調整容器１４０と、それぞれ容器注入口１７２、１７４、１７６および適切な弁（図示せず）を介して流体連通しているそれぞれ適切な供給ライン１５２、１５４、１５６を介して供給される。
【００５７】
プレ反応調整容器１４０は、内容積Ｖ１を規定し、容器注入口１７２、１７４、１７６を介してそこに供給される供給原料および緩衝液／水を含む反応混合物が、電動源（図示せず）によって駆動される適切な撹拌装置１４２を用いて一緒に混合され、エマルジョンＰＥが形成される。プレ反応調整容器１４０は、外部ジャケット１４９を含み、それを通って適切な作動流体が循環して、内容積Ｖ１を所望の定常温度に維持することが可能となる。例えば、作動流体は、油もしくは水であってもよく、別の容器（図示せず）で加熱または冷却されて、適切な注入口を介して外部ジャケット１４９にポンプで通し、ポート（図示せず）から出る。この実施形態の代替変形では、プレ反応調整容器１４０は、外部ジャケット１４９の代わりにまたはそれに追加して、加熱エレメントおよび／または冷却エレメントの系、例えば電動加熱エレメントおよび／または冷却エレメントを含んでもよい。
【００５８】
反応容器１２０は、プレ反応調整容器１４０から調製されたエマルジョンＰＥを受け取り、その中の供給原料を適切な生体触媒ＢＣの存在下で反応させて、反応産物ＲＰを生成し、次いで反応産物ＲＰを反応混合物から生成物分離容器１６０に送るように構成される。送出ライン１４８は、プレ反応調整容器１４０と、反応容器１２０との間に適切な弁（図示せず）を介して選択的流体連通をもたらし、かつプレ反応調整容器１４０で調製された調製エマルジョンＰＥが所望通り反応容器１２０に送られるのを可能にする。
【００５９】
反応容器１２０は、内容積Ｖ２を規定し、その中に反応容器注入口１２２を介して供給された反応混合物中の調製されたエマルジョンを反応させ、次いで反応混合物を適切な電動源（図示せず）によって駆動される撹拌装置１２４で撹拌して、反応産物ＲＰを形成する。生体触媒ＢＣは適切な酵素を含んでもよく、かつ固定化酵素ビーズの形状で提供される。該ビーズは無効になるまで、または十分な効果がなくなり、除去されて新しい生体触媒ＢＣと交換されることになるまで反応容器１２０に残存する。例えば、生体触媒ＢＣは、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼを含んでもよい。
【００６０】
反応容器１２０は、外部ジャケット１２９の形状で温度調節装置を含み、それを通って適切な作動流体が循環して、内容積Ｖ２を所望の定常温度で維持することが可能になる。例えば、作動液体は、油もしくは水であってもよく、別の容器（図示せず）で加熱または冷却されて、適切な注入口を介して外部ジャケット１２９にポンプで通し、ポート１２３から出る。この実施形態の代替変形では、温度調節装置は、外部ジャケット１２９の代わりにまたはそれに追加して、加熱エレメントおよび／または冷却エレメント、例えば電動加熱エレメントおよび／または冷却エレメントを含む。
【００６１】
反応容器１２０の下方部分は送出口１２７を含み、および反応容器１２０から除去される前に、反応混合物、特に反応産物ＲＰを濾過し、次いで生体触媒ＢＣを反応産物ＲＰとともに除去されることから防ぐように構成された適切な保持装置が、フィルタ１２５の形状で送出口１２７の上流に具備される。
【００６２】
生成物分離容器１６０は、反応産物ＲＰから所望の生成物Ｐ（脂肪酸アルキルエステル）を取り出し、過剰な水およびグリセロールＧを含む副産物を分離するように構成される。送出ライン１４７は、生成物分離容器１６０と、反応容器１２０との間に適切な弁（図示せず）を介して選択的流体連通をもたらし、かつ反応産物ＲＰが所望通り反応容器１２０から生成物分離容器１６０に送られるのを可能にする。この実施形態では、生成物分離容器１６０は、前述の分離を行うための遠心分離機または重力分離装置を含み、かつ生成物Ｐをアウトプットするための第１の送出口１６２と、過剰な水およびグリセロールＧを収集するための第２の送出口１６４とを含む。生成物Ｐはタップ１６３を介して収集されてもよい。
【００６３】
このように、本システムは、連続生成方式で操作されることが可能であり、該方式では調製されたエマルジョンＰＥは、反応容器１２０に送られ、次いで所望の生成物Ｐはタップ１６３を介して連続方式で収集される。エマルジョンＰＥは調製されて、連続方式で反応容器１２０に送られ、反応産物ＲＰが送出口１２７から取り出されるのと同じ速度でその中の反応物の量を補給することができる。あるいは、エマルジョンＰＥは調製されて、反応容器１２０にバッチで送られ、送出口１２７を介して反応産物ＲＰが連続的に取り出された後に、反応容器１２０内の反応物のレベルが特定の最低レベルまで低下したときはいつでも不連続の間隔で反応混合物中の反応物の量を補給することができるもちろん、システム１００が連続的よりはむしろバッチで所望の生成物Ｐをもたらすように操作することも可能である。
【００６４】
あるいは、システム１００は、歩留り改善方式で操作されることも可能であり、生成物Ｐは、タップ１６３を介して即時収集される代わりに、ライン１６５、容器注入口１２１および弁１６６を含む、随意に別ルートに切り替えるシステムを介して反応容器１２０に別のルートで送られ、弁１６６が選択的に操作されて、タップ１６３から生成物Ｐの方向を転換させることも可能である。別のルートから反応容器１２０に送られる場合、歩留りの高い生成物Ｐを生成するために、生成物Ｐは、アルコール源１８４から、別のアルコール源（図示せず）から、またはプレ反応調整容器１４０を介してアルコ−ル源１８４から別のライン（図示せず）を介して供給されるアルコールＡＬと反応容器内でさらに反応させてもよい。生成物Ｐは、生成物分離容器１６０を用いて、副産物から再度分離されることも可能である。アルコールが反応調整容器１４０を介して供給される場合、反応調整容器は、まず調製されたエマルジョンＰＥが空の状態であり、次いで適切な弁で脂肪酸Ｆを止めて、随意に緩衝液／水がそれぞれの源１８２および１８６から供給される。適切なポンプまたは重力送り装置および制御可能な弁は、それぞれのライン１５２、１５４、１５６、１４８、１４７、１６５を介してそれぞれの原料を選択的に運ぶために具備されることも可能であり、および適切な制御装置（図示せず）が該システムの操作をモニターして制御する。
【００６５】
第１の実施形態の少なくとも一部の代替変形では、プレ反応調整容器１４０は、反応容器１２０との一体型であってもよい。例えば、それぞれの内容積Ｖ１およびＶ２は、ライン１４８に対応する開口装置を有する壁によって分離されてもよい。あるいは、それぞれの内容積Ｖ１およびＶ２は、隣接していてもよいが、内容積Ｖ１は、生体触媒ＢＣから十分に間隔を空けることで、生体触媒ＢＣに達する前にエマルジョンＰＥが形成されるのに十分な時間をもたらすことが可能である。
【００６６】
第１の実施形態の代替変形では、脂肪酸ＦＡ、アルコールＡＬ、および緩衝液／水ＢＵのうちの１、２またはすべては、プレ反応調整容器１４０を迂回して、反応容器１２０に直接供給されてもよい。例えば、脂肪酸源１８２、アルコール源１８４、および緩衝液／水源１８６のうちの１または複数は、プレ反応調整容器１４０を迂回して、適切な供給ライン（図示せず）を介して反応容器１２０と直接、選択的流体連結されてもよい。
【００６７】
第１の実施形態、またはその代替変形によって、システム１００のすべての構成部品は、温度、圧力、ｐＨなどを含むそれぞれの条件で各構成部品がそれぞれの機能を果たすことを可能にするためなど、当技術分野で知られている適切な形状であり、かつ適切な原料から作られていると理解される。
【００６８】
図１２を参照して、参照番号２００と称される該システムの第２の実施形態は、図１１で同様の番号が付いたすべての部品を含み、必要な変更を加えて一部の相違とともに、その代替変形を含む第１の実施形態のエレメントおよび特徴のすべてを含む。例えば、システム２００も以下を含む：第１の実施形態で開示され、必要な変更を加えた、反応容器１２０、プレ反応調整容器１４０、生成物分離容器１６０、脂肪酸源１８２、アルコール源１８４、緩衝液／水源１８６、供給ライン１５２、１５４、１５６、容器注入口１７２、１７４、１７６、撹拌装置１４２、外部ジャケット１４９、送出ライン１４８、容器注入口１２２、撹拌装置１２４、生体触媒ＢＣ外部ジャケット１２９、注入および排出ポート１２３、送出口１２７、フィルタ１２５、送出ライン１４７、第１の送出口１６２、第２の送出口１６４。
【００６９】
しかしながら、第２の実施形態では、第１の実施形態のライン１６５、タップ１６３および弁１６６は除外されており、代わりに補助反応モジュール３００が、生成物分離容器１６０の第１の送出口１６２に作動可能なように接続されている。
【００７０】
補助反応モジュール３００は、補助反応容器２２０および補助生成物分離容器２６０を含み、この実施形態では、必要な変更を加えた反応容器１２０および生成物分離容器１６０にそれぞれ実質的に類似している。作動中、生成物分離容器１６０からの所望の生成物Ｐは、ライン２６６、弁２６７および容器注入口２２１を介して補助反応容器２２０に送られる。補助反応容器２２０に送られると、生成物Ｐはその中で、アルコール源１８４からまたは別のアルコール源（図示せず）からの別個のライン（図示せず）を介して供給されるアルコールＡＬとさらに反応して、さらに反応した生成物ＦＲＰを生成する。ライン２４９は、さらに反応した生成物ＦＲＰが補助生成物分離容器２６０に送られるのを可能し、次いで補助生成物分離容器は、より歩留りの高い生成物Ｐ’を副産物から分離するように作動する。
【００７１】
システム２００は、必要な変更を加えて、システム１００と同様のプロセスで操作されうる。
【００７２】
開示されかつ記述されるように、本発明は、本明細書に開示される特定の実施例、プロセスのステップ、および原料に限定されるものではなく、かかるプロセスのステップおよび原料は、いくらか変わりうると理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲とその均等物によってのみ限定されることから、本明細書で用いた専門用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられ、かつ限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００７３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用した単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意すべきである。
【００７４】
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および以下に続く特許請求の範囲全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変形は、記述した整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を含むが、いかなる他の整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されよう。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって用いられた技法の代表例である。これらの技法が本発明の実行のための好適な実施形態の好例であり、本開示を踏まえて、当業者は多数の修正が本発明の意図する範囲から逸脱することなく行われうることを認識するであろう。
（実施例）
（概要）
【００７６】
すべての実験を、ガラスフィルタが中心に位置する底部を有する３０ｍＬの容量のガラス管または１５０〜２５０μｍの多孔性の焼結ガラスフィルタの底部を有する５００ｍＬの容量の機械撹拌反応器のいずれかで実行した。典型的な反応媒体は、脂肪酸源、アルコール、通常は、遊離またはグリセロール骨格上に結合しているかにかかわらず脂肪酸に関して１：１のモルベース（遊離脂肪酸およびモノグリセリドの場合は１：１、ジグリセリドの場合は１：２、およびトリグイセリドの場合は１：３とアルコールが多め）でのメタノールまたはエタノールを含んでいた。脂肪酸源を異なる量のアルカリ性緩衝液（特定の実施形態では重炭酸ナトリウム）と予備混合した。疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを添加する（１０〜１５重量％）ことで反応を開始し、反応媒体を３０℃で機械的に振盪させるかまたは撹拌させた。別段示さない限り、アルコール量は、各１時間空けて３段階で同量を添加した。反応変換の後に、異なる時間間隔で反応媒体から試料を採取して、脂肪酸成分を分析した。バイオディーゼルへの変換を、以下のように算出した：１００＊脂肪酸アルキルエステルのピーク面積／すべてのピーク面積の合計
【００７７】
リパーゼ固定化：特定の微生物に由来するリパーゼを特定のｐＨ値（例えば７．５）の０．１Ｍの緩衝液に可溶化する標準手順に従ってリパーゼを固定化した。有機または無機高分子樹脂を該リパーゼ溶液に導入した。混合物を室温で８時間振盪した。樹脂上でのタンパク質酵素沈殿を増加させるために、冷アセトンを随意に混合物に添加した。該混合物を濾過して、酵素ビーズを乾燥させて含水量を５％未満まで減少させた。
【００７８】
疎水性高分子樹脂をベースにしたポリスチレン・ジビニルベンゼン、パラフィンまたはそれらの任意の組み合わせを含む種々の樹脂を用いて、樹脂の疎水性特徴を得た。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ，ＵＳＡ）およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）を含む典型的な疎水性樹脂を用いた。Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ）および多孔質シリカゲルを含む典型的な親水性樹脂を用いた。リパーゼは樹脂上に別々に固定化してもよく、または異なるリパーゼを同一の樹脂上に共固定化する。
（実施例１）
【００７９】
疎水性樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に、および親水性樹脂としてＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８上に固定化したサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼ、ならびに疎水性樹脂としてＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０上に、および親水性樹脂として多孔質シリカ上に固定化したシュードモナスエスピーに由来するリパーゼのエステル交換活性。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％含む精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。１０重量％リパーゼ調製物を含む反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１に示す。
【００８０】
図１に示した結果は、異なる樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピー由来の両リパーゼが、１重量％の重炭酸ナトリウム溶液の存在下で、同じバッチの酵素を用いた最初の５サイクルの間、高いエステル交換活性を示したことを表している。５回目のバッチの後、同じバッチの酵素を用いると、親水性樹脂、すなわちＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８および多孔質シリカ上に固定化された両リパーゼのビーズの周りにゲル様沈着物が形成されたために、システムからの反応媒体の濾過は困難になったことが観察された。親水性樹脂上に固定化された両リパーゼのエステル交換活性は、さらなる連続的なバッチで急激に減少し、次いで両リパーゼは、１０回目のサイクルの後、不活性になった。対照的に、疎水性樹脂、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼは７０サイクル後もその初期活性の８０％以上を保持したが、一方疎水性樹脂Ａｍｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼは、７０を超えるサイクル後、その初期活性の２０％以上を保持した。
（実施例２）
【００８１】
Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオ燃料およびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図２に示す。
【００８２】
Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオ燃料およびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図３に示す。
【００８３】
図２および３は、反応媒体中の炭酸ナトリウムの量が疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピー由来のリパーゼの作用寿命に主要な役割を有することを示している。アルカリ性溶液の非存在下で両固定化リパーゼは、数サイクル後にそれらの活性を急激に消失するが、一方、同固定化リパーゼは、反応系におけるベースとして重炭酸ナトリウム溶液の存在下で複数回使用にわたりそれらのエステル交換活性を維持することが図２および３から理解される。両固定化酵素の結果は、０〜４重量％の範囲で反応媒体中の重炭酸ナトリウム溶液の量が増加すると、同じバッチの固定化酵素の複数回使用での酵素活性の消失が減少する結果になることを示している。
（実施例３）
【００８４】
Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図４に示す。
【００８５】
Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図５に示す。
【００８６】
図４および５は、複数の実験において疎水性樹脂上に固定化された同じバッチのリパーゼ（サーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピー由来）を用いるエステル交換活性も、反応系での水の量によって影響されることを示す。連続サイクルで用いる場合、何もない（ゼロ）から４重量％まで水の量を増加させると、生体触媒の残留するエステル交換活性をより高く維持するという結果になったことがわかる。図２〜５に示した結果は、連続サイクルで用いる場合、エステル交換反応物中の重炭酸ナトリウム溶液などの弱塩基は、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼの活性を維持するために有利に働くことを明らかに示している。
（実施例４）
【００８７】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて４時間のエステル化／エステル交換を行った後の、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）と大豆油との混合物のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる量で含有する、遊離脂肪酸大豆の加水分解物（５０重量％）と、初期のＦＦＡ値７２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの大豆油（５０重量％）との混合物。メタノール（４．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（２０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図６に示す。
【００８８】
図６は、異なる量の塩基性溶液が、大豆油加水分解物と大豆油トリグリセリドとを等量比率で含む反応混合物中に存在するＦＦＡの同時エステル化反応に主要な影響を及ぼすことを示す。エステル化／エステル交換反応系にアルカリ性溶液が何も添加されないと、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼはそのエステル化活性を消失するが、一方、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％および２重量％、該反応系に別々に添加すると、同じ生体触媒は連続サイクルにおいてその活性を維持したことがわかる。図６に示した結果は、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液の１重量％および２重量％の存在下で、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いると、ＦＦＡ含有量が、７２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの初期値からそれぞれ平均８ｍｇ ＫＯＨ／１ｇおよび６ｍｇ ＫＯＨ／１ｇまで減少し、かつ２２回の連続サイクルでこの活性を維持したことを示している。
（実施例５）
【００８９】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて４時間の反応を行った後の、大豆油加水分解物のバイオディーゼルおよび水への変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％含有する、ＦＦＡ値１５０ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの遊離脂肪酸大豆の加水分解物（２０ｇ）。メタノール（２ｍＬ）を１バッチで反応物に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図７に示す。
【００９０】
図７は、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼが遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸メチルエステルと水の副産物とを形成することもできることを示している。リパーゼ調製物は、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１％含有する媒体中で、同じバッチの生体触媒を用いて２５を超えるサイクルにわたりいずれの著しい活性消失も観察されることなく、そのエステル化／エステル交換活性を維持したことを結果が示している。
（実施例６）
【００９１】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間の反応を行った後の、魚油のエタノールとのエステル交換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１％含有する精製魚油（２０ｇ）。エタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化したサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼを別々に用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図８に示す。
【００９２】
図８は、疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイミセスラヌギノサおよびシュードモナススピー由来の両リパーゼが、魚油トリグリセリドのエタノールとのエステル交換を触媒して、脂肪酸エチルエステルとグリセロール副産物とを形成することもできることを示している。両生体触媒調製物は、１％重炭酸ナトリウム溶液の存在下で、同じバッチの生体触媒を用いて２０を超えるサイクルにわたり著しい活性消失もなく、それらのエステル交換活性を維持したことを結果が示している。
（実施例７）
【００９３】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間の反応を行った後の、獣脂のエタノールとのエステル交換。
反応条件：獣脂（４ｇ）の脂肪酸エチルエステルおよび１Ｍの炭酸カリウム溶液を１％含有する獣脂（１６ｇ）。エタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化したサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼを別々にまたは等量比の組み合わせで用いた（１０重量％）。反応媒体を３７℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図９に示す。
【００９４】
図９は、疎水性樹脂上に別々にまたは組み合わせて固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナススピー由来の両リパーゼが、獣脂トリグリセリドのエタノールとのエステル交換を触媒して、脂肪酸エチルエステルとグリセロール副産物とを形成することもできることを示している。反応媒体の供給原料は、該反応媒体の融点を下げるために、獣脂（８０％）と、獣脂に由来する脂肪酸エチルエステルとを含んでいた。図９に示した結果は、１Ｍの炭酸カリウムなどの弱アルカリ性溶液の存在下で、同じバッチの生体触媒を１００連続サイクルで用いたとき、すべての生体触媒がそれらの初期活性の８０％以上を保持したことを示している。
（実施例８）
【００９５】
疎水性多孔質の樹脂上に固定化されたシュードモナススピー由来のリパーゼおよびサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼを用いて４時間後に得た、７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含有するエステル交換／エステル化反応媒体の、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（１０重量％）を用いる、疎水性多孔質の樹脂上に固定化されたカンジダアンタークティカＢ由来のリパーゼおよびメタノール（ＦＦＡとメタノールとのモルベースで、それぞれ１：１０の比）での処理。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１０に示す。
【００９６】
図１０は、上述したサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼまたはシュードモナススピー由来のリパーゼのいずれかでの処理の後に得たエステル交換反応媒体が、典型的には３〜７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含有し、親水性または疎水性のいずれかの担体上に固定化されたカンジダアンタークティカＢ由来のリパーゼで処理されることができ、その結果ＦＦＡ値が２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇ未満まで低下することを示している。固定化されたリパーゼは、１００サイクルを超えてその活性を維持することができる。
（実施例９）
【００９７】
バイオディーゼル、水およびグリセロールを形成するために、図１１に図示したシステムの第１の実施形態を用いることによる、１０％ＦＦＡを含有する廃食油のメタノールでのエステル交換／エステル化。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を２％含有する廃食油（１１００ｇ）およびメタノール（１４０ｇ）をまず、プレ反応調整容器１４０で予備混合して、エマルジョンを形成し、次いでこれを約２リットルの内容積Ｖ２を有する反応容器１２０に導入した。反応容器１２０中で反応混合物を、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼ（油の３０重量％）と３０℃で６時間混合した。フィルタ１２５を介して反応混合物を濾過して、生成物分離容器１６０に送った。生成物分離容器１６０中の反応混合物からグリセロールおよび過剰な水を除去した。脂肪酸メチルエステルを含有する上相および非反応グリセリドを、別ルートライン１６５を介して反応容器１２０に再導入し、次いでメタノール（１１０ｇ）を反応容器１２０中の反応媒体に添加してから、反応容器１２０での撹拌を再び始めた。２時間後のメチルエステルへの変換は、９８％であった。廃食油（８３重量％）、メタノール（１５％）および０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液（２％）を含有する乳化反応媒体（調製したエマルジョン）をおよそ３０ｍＬ／分の流量で反応容器１２０に連続的に送った。マクロ多孔質の疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサリパーゼに由来する同じバッチの生体触媒を用いると、脂肪酸メチルエステルへの変換は、著しい活性消失もなく、３カ月以上維持された。
【技術分野】
【０００１】
バイオ燃料、食品および海面活性剤の産業での使用用の脂肪酸アルキルエステルの生成のための酵素法が開示される。このプロセスでは、脂肪酸源およびアルコールまたはアルコール供与体は、疎水性樹脂上に固定化された酵素の存在下、アルカリ性水性緩衝液または水の存在下で、反応させる。開示されるプロセスは、または連続撹拌タンク反応器もしくは充填層反応器を連続で用いるバッチ式でまたは連続的でのいずれかで行われることができる。
【背景技術】
【０００２】
酵素の固定化は、全酵素法において酵素の費用分担を減少させること；生成物から酵素の回収を容易すること；および該プロセスの連続操作を可能にすることを基本的に目標とする夥しい数の技法によって説明されてきた。
【０００３】
固定化技法は、通常、以下によって分類される：
１．シリカ高分子および不溶性高分子などの固体担体への酵素の物理的吸着。
２．イオン交換樹脂への吸着。
３．エポキシ化無機担体または高分子担体などの固体担体材料との酵素の共有結合。
４．成長する高分子内での酵素の封入。
５．膜反応器または半透性ゲル内での酵素の封入。
６．架橋酵素結晶（ＣＬＥＣ）または架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）。
【０００４】
上述のすべての酵素固定化プロセスは、以下のステップで構成されている：
１．ｐＨ、温度、緩衝塩の種類およびイオン強度に関して適切な緩衝液系で酵素を溶解するステップ。
２．酵素溶液に固体担体を加えて、酵素分子が該固体担体上に固定化されるまで暫く混合するステップ。
３．固定化した酵素を含む固体担体を濾過するステップ。
４．固体担体を適切な緩衝液で洗浄して、結合が弱い酵素分子を除去し、次いで該固体担体を乾燥させるステップ。
【０００５】
大部分はリパーゼである界面酵素は、上述した技法の後に固定化されてきた。これらの技法は、低い合成活性および／または短い作用半減期を有する固定化酵素調製物を提供した。固定化リパーゼおよび他の界面酵素の合成活性と安定性を増加させる試みにおいて、様々な活性化法が適用されてきた。これらの方法は以下を含む：
１．脂肪酸またはポリエチレングリコールなどの疎水性残基に酵素の表面官能基を結合すること。
２．酵素の表面を、ポリオール脂肪酸エステルなどの界面活性物質で被覆すること。
３．エタノールまたはイソプロパノールなどの親水性溶媒で前処理されている疎水性担体（典型的にはポリプロピレン）と酵素を接触させること。
【０００６】
酵素逆変換を工業量で行うために、固定化界面酵素の安定化および対費用効果に関して、上述の方法のいずれも、満足な結果をもたらさなかった。また、上述した方法によって固定化される場合、固定化方法によって課せられるいくつかの制約のため、または反応媒体中にいくつかの酵素抑制物質が存在するために、その合成活性のかなりの部分を失う、もしくはその活性の完全な性能を示さないことが報告されている。
【０００７】
リパーゼおよびホスホリパーゼの別の主要な弱点は、親水性基質、特に短鎖アルコール類および短鎖脂肪酸（Ｃが４以下のもの）に対するそれらの耐性が低いことである。多くの研究調査では、短鎖アルコール類および短鎖脂肪酸（それぞれメタノールおよび酢酸など）がこれらの酵素の四次構造から重要な水分子が分離することに関与しており、それらの触媒活性の変性およびその結果、触媒活性の消失を引き起こすことが観察されている。この弱点のために、基質としてオイルトリグリセリドおよびメタノールを用いる、脂肪酸メチルエステル「バイオディーゼル」の商業量の生産のためにリパーゼの使用が妨げられてきた。
【０００８】
遊離アルコールによる脂肪酸源のエステル交換／エステル化のために固定化リパーゼを用いるさらなる弱点は、生体触媒上に形成されたグリセロールおよび水の副産物が蓄積され、したがって基質が固定化酵素の活性部位に自由に接近するのを妨げていることである。かかる生体触媒は通常、同じバッチの生体触媒が使用される場合、数サイクル後にその触媒性能を失う。
【０００９】
本発明者らは、多くの生成サイクルにわたり良好な安定性を示し、活性を持続する特別な固定化酵素調製物を開発した。かかる酵素調製物の例は、とりわけ、国際公開第ＷＯ２００８／０８４４７０号、同第ＷＯ２００８／１３９４５５号、および同第ＷＯ２００９／０６９１１６号に開示されている。
【００１０】
触媒反応が行われる条件は、固定化酵素調製物の安定性および効率に悪影響を与えることもある。触媒反応条件下で安定性および活性を保持する酵素調製物を有することは重要である。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の目的は、説明が進むにつれて明らかになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源をアルコールまたはアルコール供与体と反応させることを含む、脂肪酸源のアルコールでのエステル交換／エステル化を行うプロセスに関し、該固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水性アルカリ性緩衝液を含む。
【００１３】
前述の水性アルカリ性緩衝液は、弱アルカリ性水性緩衝液であってもよい。前述の水性アルカリ性緩衝液は、脂肪酸源の最高５重量％までの量で反応混合物に含まれてもよい。該水性緩衝液は、７から約１１、例えば、７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０および７〜１１のいずれか１つのｐＨ値であってよい。該緩衝液を含む補充した弱アルカリ性試薬のｐＫａは、脂肪酸源を含む酸類のｐＫａよりも高いまたは等しい。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源とアルコールとを反応させることを含む、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化を行うプロセスに関し、固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水を含有する。水は、３〜１１のｐＨ値を有する水溶液の形状である。反応媒体は、脂肪酸源の５重量％までの水または水溶液を含んでもよい。
【００１５】
本発明のすべての実施形態および態様では、アルコールは短鎖アルコール、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルアルコール、より具体的にはＣ１−Ｃ４アルキルアルコール、特にメタノールまたはエタノールであってもよい。前述のアルコールがメタノールである場合、結果として生じる脂肪酸エステルは、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ−Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）である。また、アルコールは、中鎖脂肪アルコール（Ｃ６−Ｃ１０）または長鎖脂肪アルコール（Ｃ１２−Ｃ２２）であってもよい。アルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジメチルもしくは炭酸ジエチルなどの炭酸ジアルキルであってもよい。
【００１６】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の固定化リパーゼは、遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルおよび副産物として水をもたらすことができ、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステル、および副産物としてグリセロールをもたらすことができる。
【００１７】
アルカリ性緩衝液またはアルカリ性溶液の使用に関する本発明のすべての実施形態および態様では、反応媒体中の前述のアルカリ性緩衝液またはアルカリ性溶液の量は、脂肪酸源の０．００１〜５重量％である。
【００１８】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の少なくとも１つのリパーゼは、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、サーモマイセスラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンのいずれか１つに由来するリパーゼであってもよい。リパーゼ調製物は、同じ疎水性担体上でそれぞれ別々に固定化されうる、または共固定化されてもよい。前述のリパーゼは、同一のまたは異なる位置特異性を有することもある。前述のリパーゼは、同時に、または連続的に遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルおよび副産物として水をもたらすことができ、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステルおよび副産物としてグリセロールをもたらすことができる。
【００１９】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の担体は、疎水性脂肪族高分子をベースにした担体および疎水性芳香族高分子をベースにした担体のうちのいずれか１つでありうる。前述の疎水性高分子担体は、線状または分岐状の有機鎖から構成されてもよい。前述の担体は、マクロ網状有機高分子鎖またはコポリマー鎖を含むこともある。前述の担体は多孔質、または非多孔質の無機担体であってもよく、これらは疎水性であってもよく、または疎水性有機材料で被覆されている。前述の有機材料は、線状、分岐状、または官能基を有する疎水性有機鎖であってもよい。
【００２０】
本発明のすべての実施形態および態様では、アルカリ性緩衝液が使用される場合、前述の水性アルカリ性緩衝液は、無機アルカリ塩または有機塩基の溶液でありうる。前述のアルカリ性緩衝液は、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩、第一級、第二級および第三級のアミン、ならびにそれらの任意の混合物のいずれか１つの溶液であってもよい。特定の実施形態では、前述のアルカリ性緩衝液は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムおよび炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムから選択される弱塩基の溶液であってもよい。本発明のプロセスについての一部の実施形態では、前述のアルカリ性緩衝液は、前述の脂肪酸源の予備混合の段階で、または直接的に反応媒体に加えられてもよい。
【００２１】
本発明のすべての実施形態および態様では、アルカリ性緩衝液が使用される場合、エステル交換／エステル化反応媒体中の前述のアルカリ性緩衝液の含有量は、油供給原料の０．００１〜５重量％、例えば１〜２重量％でありうる。
【００２２】
本発明の一部の実施形態では、脂肪酸源は、まずアルカリ性緩衝液と、または水もしくは水溶液と混合されてもよく、次いでこの混合物を前述の固定化リパーゼ調製物で処理してもよく、続いて前述のアルコールを加えることで、前述の脂肪酸源が脂肪酸エステルに変わるまで適切な条件下で反応が進行することが可能になる。
【００２３】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の脂肪酸源は、植物油、動物性脂肪、藻油、魚油、廃油およびそれらの任意の混合物のいずれか１つであってもよい。前述の脂肪酸源は、リン脂質およびステロールエステルなどの他の微量な脂肪酸誘導体の非存在下または存在下で、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、任意の割合でのそれらの混合物を含んでもよい。脂肪酸源は、未精製、精製、漂白、脱臭したものまたはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００２４】
本発明のすべての実施形態および態様では、反応は、１０℃と１００℃との間、具体的には、２５℃と３０℃との間の温度で行われうる。
【００２５】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の脂肪酸源は、プレ反応調整容器中で、前述のアルコールもしくはアルコール供与体と、および水もしくは緩衝液と予備混合させて、エマルジョンを形成し、次いで前述の固定化リパーゼ調製物とともにエステル交換／エステル化反応容器に供給されてもよい。
【００２６】
本発明のすべての実施形態および態様では、前述の固定化リパーゼを、バッチ方式でまたは連続方式で作動する充填層反応器で使用してもよい。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのシステムが提供され、該システムは脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含む反応媒体を固定化リパーゼ調製物の存在下で反応させるように構成された反応容器を含み、該固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、該反応媒体が水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを含む。
【００２８】
該システムは、任意の所望の組み合わせまたは順列で、以下の特徴の１つまたは複数を含みうる：
Ａ．前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、反応容器は固定化リパーゼ調製物を含むことができる。
Ｂ．Ａの特徴に加えてまたはその代わりに、前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、反応容器は脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含むことができる。
Ｃ．ＡもしくはＢの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、前述の反応媒体は混合物を含み、前述のシステムは前述の反応容器と選択的流体連通しているプレ反応容器をさらに含み、前述のプレ反応容器は前述の混合物を形成するために少なくとも脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを予備混合するように、および前述の混合物を前述の反応容器に選択的に送るように構成されている。該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述のプレ反応容器と選択的流体連通し、かつ脂肪酸を前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成された脂肪酸源と、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述のプレ反応容器と選択的流体連通し、かつアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つを前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成されたアルコール源とを随意にさらに含むことができる。該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述のプレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前述の混合物に含まれるべく水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成された緩衝液源を随意にさらに含む。
Ｄ．ＡからＣの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、脂肪酸および／またはアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つおよび／または水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つからの１つまたは複数を連続方式または別々のバッチでのいずれかでそれぞれ前述のプレ反応容器に選択的に送るように構成されることができる。
Ｅ．ＡからＤの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該プレ反応容器は、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の混合物を連続方式および／または別々のバッチで前述の反応容器に選択的に送るように構成されることができる。
Ｆ．ＡからＥの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、少なくとも１つの脂肪酸と；アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つと；水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つとを前述の反応容器に選択的かつ直接的に送るように構成されることができる。
Ｇ．ＡからＦの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該反応容器は、前述の反応容器中の反応媒体を選択温度範囲内に維持するように構成された温度調節装置を含むことができる。
Ｈ．ＡからＧの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、固定化リパーゼ調製物を前述の反応容器内に保持するように構成された保持装置をさらに随意に含むことができる。
Ｉ．ＡからＨの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の反応容器と選択的流体連通している生成物分離容器をさらに随意に含むことができ、前述のシステムが反応産物を含む反応混合物を前述の反応容器から前述の生成物分離容器に選択的に送るように構成され、および前述の生成物分離容器がそこに送られた反応混合物から脂肪酸アルカルエステルの生成物を選択的に分離するように構成されている。例えば、生成物分離容器は、遠心分離機および重力分離装置のうちの１つでありうる。
Ｊ．ＡからＩの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該反応容器は、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の反応混合物を前述の生成物分離容器に連続方式でおよび／または別々のバッチで選択的に送るように構成される。
Ｋ．ＡからＩの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の生成物分離容器からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に送るように構成される。例えば、該システムは、前述の生成物分離容器からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を連続方式でおよび／または別々のバッチで選択的に送るように構成される。
Ｌ．ＡからＫの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を増加させるように構成される。この特徴を有するシステムの一構成では、該システムは、続いて前述の生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物をさらに増加させるために、脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に別のルートで送るように構成される。この特徴を有するシステムの別の構成では、該システムは、補助反応器のモジュールに脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に別のルートで送るように構成され、前述の補助反応器のモジュールが補助反応容器と補助生成物分離容器とを含み、脂肪酸アルキルエステルの前述のさらに増加した生成物は、続いて前述の補助生成物分離容器を介して選択的に送られる。
【００２９】
本発明を理解し、および本発明をどのようにして実際に行えうるかを調べるために、ここで添付の図面を参照して、非限定的な例だけの目的で、実施形態を説明する：
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】疎水性樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００（Ａｍｂ．ＸＡＤ１６００）上に、および親水性樹脂としてＤｕｏｌｉｔｅ Ｄ５６８（Ｄｕｏ Ｄ５６８）上に固定化されたリパーゼ・サーモマイセスラヌギノサ（ＴＬ）、ならびに疎水性樹脂としてＳｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ７０（ＳＢ ＳＰ７０）上に、および親水性樹脂として多孔質シリカ（Ｓｉｌ．）上に固定化されたリパーゼ・シュードモナスエスピー（ＰＳ）のエステル交換活性を示すグラフである。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図２】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図３】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの転換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図４】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、水を含まずに、および異なるレベルの水で６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水
【図５】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、異なるレベルの水で６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水
【図６】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで４時間エステル化／エステル交換を行った後の、ＦＦＡおよび大豆油の混合物のバイオディーゼルと、グリセロールおよび水の副産物とへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水
【図７】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム２％の存在下で４時間反応させた後の、大豆油加水分解産物のバイオディーゼルおよび水へのエステル化を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ａｃ．Ｖａｌ．−酸価；Ｃｙｃ．−サイクル
【図８】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム１重量％の存在下で６時間反応させた後の、魚油のエタノールとのエステル交換を示すグラフである。生体触媒は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼ（それぞれＴＬ Ｌｉｐ．、ＰＳ Ｌｉｐ．）であった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図９】複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム２重量％の存在下で６時間反応させた後の、獣脂のエタノールとのエステル交換を示すグラフである。生体触媒は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ、シュードモナスエスピー由来のリパーゼ（ＰＳ Ｌｉｐ．；ＴＬ Ｌｉｐ．）であった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル
【図１０】疎水性で多孔質の樹脂上に固定化されたカンジダアンタークティカとともに、疎水性で多孔質の樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーまたはサーモマイセスラヌギノサを用いて、７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含む、４時間後に得られたエステル交換／エステル化の反応媒体の処置を示すグラフである。略語：Ａｃ．Ｖａｌ．−酸価；Ｃｙｃ．−サイクル
【図１１】本発明の一態様によって脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムの第１の実施形態を示す概略図である。
【図１２】本発明の一態様によって脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムの第２の実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
酵素で触媒される工業プロセス、特に固定化リパーゼの存在下で、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化を行うプロセスについての改善を求めて、本発明者らは、固定化リパーゼの安定性が多数の生成サイクルにわたり維持される特定の条件を開発した。
【００３２】
本発明の一実施形態では、本発明は、脂肪酸のアルキルエステル、具体的には、脂肪酸メチルエステルおよびエチルエステル（バイオディーゼル）などの脂肪酸の短鎖アルキルエステルを無溶媒のアルカリ性微水系で調製するプロセスに関する。特定の実施形態では、アルカリ性微水系は、弱アルカリ性微水系である。前述のプロセスは、脂肪酸源を供給し、前述のアルカリ性もしくは弱アルカリ性の条件下で、固定化リパーゼ調製物の存在下で、脂肪酸源を遊離アルコールまたはアルコール供与体と反応させることを含む。理論に束縛されることなく、アルカリ性緩衝液による脂肪酸源の前処理は、酵素に阻害効果を及ぼすこともある酸の中和をもたらすであろう。最高１００％までの変換までの反応を完了するために必要とされるアルコールの量を段階的にまたは１つのバッチで添加してもよい。さらに、該アルコールは、短鎖アルコール、例えばメタノールまたはエタノールであってもよい。他のアルコール供与体を加水分解酵素の存在下で脂肪酸源との反応で用いてもよく、これにより前述の脂肪酸源が脂肪酸アルキルエステル、具体的には、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）または脂肪酸エチルエステルに変換されるまで、適切な条件下で該反応が進行することが可能になり、ここで前述の加水分解酵素調製物が適切なマクロ網状の多孔質疎水性高分子をベースにした担体上に別々にまたは一緒に固定化された１つまたは複数のリパーゼを含む。
【００３３】
さらなる実施形態では、脂肪酸源とアルコールまたはアルコール供与体との間のエステル交換／エステル化反応は、反応混合物に水を添加することで、水性微小環境で行われる。特定の実施形態では、水は、脂肪酸源の０．０００１〜５重量％で添加されてもよい。ここで用いられる水とは、純水または蒸留水、および「水溶液」も意味し、水溶液とは、水道水、海水もしくはいずれの他の天然水源もしくは貯水池からの水、脱塩水、化学的にもしくは酵素的に精製または処理された水、およびいずれの他の水溶液であってもよいがこれらに限定されるものではない。反応系または水溶液のｐＨ値は変化することがあり、例えば、約３〜１１、例えば４〜１０、５〜１０、５〜９、６〜１０、６〜９、または７〜９でありうる。
【００３４】
本発明のプロセスは、形成されるグリセロールおよびいずれの過剰な水を反応混合物から連続的に除去しながら、行われることも可能である。前述の脂肪酸源に含まれる遊離脂肪酸の脂肪酸アシル基の、脂肪酸アルキル、具体的にはメチルエステルへの変換は、反応の間、種々の時点でモニターされることができる。反応媒体は、反応の間、任意の所望の時点で適切な手法より除去されてもよく、それによって反応が停止され、形成された脂肪酸メチルエステルと、随意に、形成されたグリセロールとが該反応媒体から単離される。前述の脂肪酸源に含まれる脂肪酸アシル基または遊離脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換が少なくとも７０％、例えば少なくとも８５％、または少なくとも９０％に達したときに、該反応は明確に停止されてもよい。
【００３５】
該反応系は、同時係属中の国際公開第ＷＯ２００９／０６９１１６号に記述されているものと同じようでありうる。例えば、生成システは、反応器内に生体触媒を保持するが、しかし反応媒体が反応器を通って浸透することを可能する焼結ガラスまたはステンレス鋼フィルタの底部を有する撹拌タンク反応器を用いてもよい。かかる反応器の構成は、副産物、具体的にはグリセロールおよび水を考慮に入れている。副産物は、固定化酵素から、シンク、反応器の底部へと自己脱離し、フィルタを通って染み出る。形成され、脱離したグリセロールおよび過剰な水分も反応媒体から連続的に除去される結果、合成に向かって反応の変化がもたらされ、それによって９８％を超える変換が達成される。この反応器で用いられる生体触媒は、本明細書に記述するように、それらの位置特異性ならびにそれらの起源を考慮すると、単一種または複数種のリパーゼから構成されてもよい。代替の、底部フィルタを有する２つの連続した撹拌タンク反応器を用いてもよい。沈殿タンクまたは遠心分離機をこれら２つの反応器の間に用いてもよい。第１の反応器は、単一種または複数種のリパーゼから構成される固定化生体触媒を含んでもよい。両反応器の間の沈殿タンクまたは遠心分離機の役割は、形成されるグリセロールおよび過剰な水を反応媒体から除去することであり、それによって原料の対応する脂肪酸アルキルエステルへの変換が増加し、第２の反応器において適切な反応時間で９８％を超えることになる。一部の特定の反応系およびその方法は、後述する。
【００３６】
用語「反応混合物」、「反応系」および「反応媒体」とは、本明細書では同意語として使われることもある。
【００３７】
本発明の実施形態におけるように、アルカリ性緩衝液または水溶液の存在下で、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを用いることで、安定性の高い酵素を確保し、かつ水および形成されるグリセロール副産物などの親水性物質が生体触媒上に蓄積されないようにする。本発明のプロセスの特定の実施形態では、０．００１〜５％のアルカリ性または弱アルカリ性緩衝液、例えば、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、例えば０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、０．７５％、１%、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％。４．５％または５％などのアルカリ性または弱アルカリ性緩衝液を用いる。本発明のプロセスの特定の実施形態では、水を用いる場合、該水は０．０００１〜５％の水、例えば０．００１〜５％、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、例えば０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％などのレベルで用いる。上述のように、アルカリ性溶液を用いる場合、該溶液は、脂肪酸源中に典型的に存在するまたは副反応物のために生成される酸を中和することが可能である。これらの副産物を持続的かつ積極的に除去することで、プロセスの効率さえも上昇しうる。単離したグリセロールを、工業的に使用してもよい。
【００３８】
本発明のプロセスで用いられる脂肪酸源は、大豆油、カノーラ油、藻類油、菜種油、オリーブ油、ヒマシ油、パーム油、ひまわり油、落花生油、綿実油、ジャトロファ油、粗トウモロコシ油、魚油、動物性油脂、廃食油、ブラウングリース、非食油植物源に由来するオイルトリグリセリド、これらの油またはそれらの少なくとも２つの任意の混合物（任意の所望の割合で）に由来する部分グリセリドおよび遊離脂肪酸のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
【００３９】
本発明のすべてのプロセスでは、反応によって形成される脂肪酸短鎖アルキルエステルは、具体的には、脂肪酸メチル、エチル、イソプロピルまたはブチルエステル（バイオディーゼル）である。他の中鎖脂肪アルコール（Ｃ６−Ｃ１０）および長鎖脂肪アルコール（Ｃ１２−Ｃ２２）も本発明の生成プロセスで用いてもよい。これらの長鎖アルコールは、具体的にワックスの製造、例えば化粧品に適していることがある。
【００４０】
リパーゼは、サーモマイセスラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ムコールミーハイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉｅ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスエスピー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ペニシリウムロックフォルティ（Ｐａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンに由来するリパーゼであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
複数のリパーゼは、適切な担体、具体的には疎水性脂肪族高分子をベースした担体または疎水性芳香族高分子の担体上に一緒に固定化されることもある。前述のリパーゼの各々は、適切な担体上に固定化されてもよく、前述のリパーゼがその上に固定化される担体は、同一であるか、または異なっている。使用されるリパーゼは、それらの基質に対して位置特異的であるか、またはランダムであってもよい。複数のリパーゼが用いられる場合、リパーゼは、同一または異なる疎水性担体上に固定化されてもよい。同一の担体上に共固定化されるリパーゼは、それらの基質に対して同一もしくは異なる基質選択性または位置特異性を示すことができる。
【００４２】
複数のリパーゼは位置特異的（または部位特異的）であってもよく、各々は単独で、または同一もしくは異なる部位特異性のリパーゼとの組み合わせで用いられてもよい。ｓｎー１位、ｓｎ−２位またはｓｎ−３位と呼ぶとき、これらは種々のグリセリドのグリセロール骨格の位置である。このように、本発明のプロセスで用いられるリパーゼは、ランダムリパーゼのそれよりも高いｓｎ−２位に対する選択性（すなわち、アルコールもしくはアルコール供与体と、ｓｎ−２位の脂肪酸アシル基との間の反応を触媒することを好む）を有することもあるが、ランダムリパーゼは、グリセロール骨格上の３つのすべての位置で脂肪酸アシル基に対して同じエステル交換活性を示す。一部のリパーゼは、ｓｎ−２位で、特に、基質、生成物などによって決定される特定の条件下で、位置活性を独自に示す。本発明のプロセスで用いられる他のリパーゼは、ｓｎ−１、３位特異的である。それらのリパーゼは単独で、またはランダムリパーゼ、具体的には部分グリセリドに親和性を有するリパーゼとともに、およびｓｎ−２位に対して高親和性を有する第３のリパーゼと随意に用いられてもよい。
【００４３】
担体は、具体的には、多孔質およびマクロ網状疎水性担体であり、有機または無機担体であってもよい。担体の例としては、これらに限定されないが疎水化シリカまたは、およびアルミナをベースした担体などの多孔質無機担体、ならびにこれらに限定されないが高分子担体または高分子をベースにした担体などの疎水性有機担体がある。担体は、エポキシ基もしくは、およびアルデヒド基から選択される活性官能基、またはイオン基を随意に含んでもよい。
【００４４】
本発明のプロセスで用いられる不溶性担体は、具体的には、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０（両方とも、ジビニルベンゼンから、またはジビニルベンゼンとポリスチレンとの混合物から調製された多孔質のミクロ網状樹脂で構成されている）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ ７ＨＰ（ミクロ網状脂肪族アクリル高分子で構成されている）などの多孔質で網状の疎水性脂肪族高分子もしくは芳香族高分子をベースにした担体、および多孔質ポリプロピレン（Ａｃｃｕｒｅｌ（登録商標））などの多孔質脂肪族高分子である。
【００４５】
担体は、ジビニルベンゼン、またはジビニルベンゼンとスチレンとの混合物で構成された網状疎水性高分子、および脂肪族アクリル高分子、またはポリプロピレンなどのポリアルケンで構成された網状疎水性脂肪族高分子であってもよい。特定の担体は、孔径が２５〜１０００Åの範囲内、より具体的には８０〜２００Åの範囲内の多孔質母材である。また、担体は、粉末状もしくは顆粒状の多孔質疎水性シリカまたは他の無機酸化物であってもよい。また、担体は、粉末状もしくは顆粒状の多孔質疎水化シリカまたは他の無機酸化物であってもよい。特定の実施形態では、担体樹脂の表面積は、１００ｍ２／ｇよりも高い。
【００４６】
脂肪酸源とアルコールとの間のエステル交換／エステル化を触媒したリパーゼに補充されることになるアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水溶液の量は、通常、反応媒体の５重量％未満である。このアルカリ性溶液は、例えば、アルカリ性の無機塩基もしくは塩から、または有機塩基から調製される。無機塩基および塩類は、例えば、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩である。有機塩基は、例えば、第一級、第二級または第三級のアミンであってもよい。これらのアルカリ性薬剤の混合物も、考えられる。本発明によるプロセスでは、固定化酵素の微環境のｐＨは、アルカリ度または弱アルカリ度で維持される。図４および５に示すように、蒸留水を反応系に添加すると、疎水性担体（樹脂）上に固定化されたリパーゼの性能が向上するが、用いる塩基の種類に応じてｐＨ値が異なる種々のアルカリ性緩衝液を添加すると、例えば図２および３に示すように、疎水性担体（樹脂）上に固定化され、さらに安定したリパーゼがもたらされた。炭酸緩衝液および重炭酸緩衝液は、疎水性担体上に固定化されたリパーゼの安定性を増加させる際に効果的な弱塩基の例である。他の適切な塩基を本明細書に記述する。通常、緩衝液を構成する補充されたアルカリ性試薬または弱アルカリ性試薬のｐＫａは、脂肪酸源を含む酸類のｐＫａと等しいか、それよりも高い。本明細書で用いた弱アルカリ性溶液は、通常、７〜約１１、例えば７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０または７〜１１のｐＨ値を有する溶液である。通常、用いられるアルカリ性または弱アルカリ性水溶液の量は、反応で用いられる油の量に基づいて重量パーセント（重量％）で表される。
【００４７】
多孔質疎水性の高分子をベースにした担体（樹脂）上に固定化されたリパーゼをアルカリ性溶液または弱アルカリ性溶液の存在下で、例えば、０．０１〜５重量％、０．０５〜５重量％、０．０５〜４重量％、１〜５重量％、または１〜４重量％の量で用いると、脂肪酸源とアルコールとの間のエステル交換／エステル化反応において生体触媒の安定した活性がもたらされる。これは、以下の実施例で示す。
【００４８】
脂肪酸源は、トリグリセリド、部分グリセリド、遊離脂肪酸、リン脂質、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミド、または前述の少なくとも２つの源で構成される混合物のうちの少なくとも１つである。
【００４９】
脂肪酸アルキルエステルの生成は、エステル交換またはエステル化を同時にまたは順次行うことによって実行される。かかる反応系下で、生体触媒活性は、複数回の使用で何ら著しい活性消失もなく維持され、かつ生体触媒上にグリセロールおよび水の副産物または他の親水性化合物も蓄積されない。
【００５０】
本発明は。多数の生成サイクルにわたり高い活性および安定性を保持する特定の固定化界面酵素を使用するプロセスを提供する。具体的には、エステル交換／エステル化反応において、リパーゼおよびホスホリパーゼ調製物が使用される。これらの反応物は、食料品、化粧品およびバイオ燃料（「バイオディーゼル」）の生成で使用されることが可能である。特に興味深いのは、これらの酵素が、「バイオディーゼル」としての用途用の脂肪酸短鎖アルキルエステルの合成のために使用されることが可能なことである。
【００５１】
本発明は、メタノール、エタノールおよびグリセロールなどの短鎖アルコール、ならびに酢酸などの短鎖脂肪酸に対する耐用が高い、安定の固定化界面酵素を用いた。また、これらの酵素調製物を使用すると、親水性物質、特にグリセロールおよび水が固定化生体触媒上に蓄積されるのを防止する。
【００５２】
本発明の一実施形態では、適切な反応時間、典型的には５時間未満で、ほぼ完全な変換で所望の産物、すなわち脂肪酸アルキルエステルを得るために、疎水性担体（樹脂）上に固定化された１つまたは複数のリパーゼをアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水溶液の存在下で用いることによる、脂肪酸源とアルコールとの同時または順次のエステル交換／エステル化反応を行うプロセスが提供される。弱アルカリ性溶液、例えば、０．００１Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍまたは１Ｍの重炭酸ナトリウムは、反応で用いられる油の量の約５重量％未満、または約４重量％の量で、反応系中に存在してもよい。
【００５３】
以下の実施例で示すように、リパーゼの固定化のための疎水性樹脂担体をアルカリ性または弱アルカリ性の緩衝液の使用と組み合わせて、例えば、エステル交換／エステル化の反応媒体中０．００１〜５重量％の範囲で用いることで、リパーゼの作用寿命をのばすこともできる。以下の実施例でさらに示すように、ｐＨ値に関係なく、反応混合物の含水量は増加させてもよい。このように別の実施形態では、例えば、脂肪酸源の０．０００１〜５重量％で、または上で規定した特定の部分範囲のいずれかで水を添加することによって反応系の含水量を増加させることで、生体触媒の安定性が増加する。脂肪酸源の０．０００１〜５重量％の範囲のアルカリ性溶液（図２および３）を、または脂肪酸源の０．００１〜４重量％で水（図４および５）を添加することで、多数の反応サイクルにわたり酵素の活性および安定性が維持される結果となることをこの結果が示している。
【００５４】
本発明のプロセスで使用されるアルコールまたはアルコール供与体は、短鎖アルキルアルコール、具体的にはＣ１−Ｃ６アルキルアルコール、より具体的にはＣ１−Ｃ４アルキルアルコールであってもよく、特にメタノールもしくはエタノールもしくはアルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジメチルなどの炭酸ジアルキルであってもよい。例えば、炭酸ジアルキルなどのアルコール供与体は、反応系のアルカリ度または弱アルカリ度の源として役立つことも可能である。
【００５５】
本発明の別の態様によると、脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムが提供される。図１１を参照して、概して参照番号１００と称される、かかるシステムの第１の実施形態は、反応容器１２０、プレ反応調整容器１４０、および生成物分離容器１６０を含む。
【００５６】
プレ反応調整容器１４０は、供給原料と緩衝液（および／または水）を受け取り、それらから適切なエマルジョンを形成し、次いで調製したエマルジョンＰＥ（本明細書では乳化原料ともよぶ）を反応容器１２０に送るように構成される。特に、かかる供給原料は、脂肪酸源１８２からの脂肪酸ＦＡ（例えば廃食油）と、アルコール源１８４からのアルコールＡＬ（例えばメタノール）と、緩衝液／水源１８６からの緩衝液（および／または水）ＢＵとを含んでもよく、プレ反応調整容器１４０と、それぞれ容器注入口１７２、１７４、１７６および適切な弁（図示せず）を介して流体連通しているそれぞれ適切な供給ライン１５２、１５４、１５６を介して供給される。
【００５７】
プレ反応調整容器１４０は、内容積Ｖ１を規定し、容器注入口１７２、１７４、１７６を介してそこに供給される供給原料および緩衝液／水を含む反応混合物が、電動源（図示せず）によって駆動される適切な撹拌装置１４２を用いて一緒に混合され、エマルジョンＰＥが形成される。プレ反応調整容器１４０は、外部ジャケット１４９を含み、それを通って適切な作動流体が循環して、内容積Ｖ１を所望の定常温度に維持することが可能となる。例えば、作動流体は、油もしくは水であってもよく、別の容器（図示せず）で加熱または冷却されて、適切な注入口を介して外部ジャケット１４９にポンプで通し、ポート（図示せず）から出る。この実施形態の代替変形では、プレ反応調整容器１４０は、外部ジャケット１４９の代わりにまたはそれに追加して、加熱エレメントおよび／または冷却エレメントの系、例えば電動加熱エレメントおよび／または冷却エレメントを含んでもよい。
【００５８】
反応容器１２０は、プレ反応調整容器１４０から調製されたエマルジョンＰＥを受け取り、その中の供給原料を適切な生体触媒ＢＣの存在下で反応させて、反応産物ＲＰを生成し、次いで反応産物ＲＰを反応混合物から生成物分離容器１６０に送るように構成される。送出ライン１４８は、プレ反応調整容器１４０と、反応容器１２０との間に適切な弁（図示せず）を介して選択的流体連通をもたらし、かつプレ反応調整容器１４０で調製された調製エマルジョンＰＥが所望通り反応容器１２０に送られるのを可能にする。
【００５９】
反応容器１２０は、内容積Ｖ２を規定し、その中に反応容器注入口１２２を介して供給された反応混合物中の調製されたエマルジョンを反応させ、次いで反応混合物を適切な電動源（図示せず）によって駆動される撹拌装置１２４で撹拌して、反応産物ＲＰを形成する。生体触媒ＢＣは適切な酵素を含んでもよく、かつ固定化酵素ビーズの形状で提供される。該ビーズは無効になるまで、または十分な効果がなくなり、除去されて新しい生体触媒ＢＣと交換されることになるまで反応容器１２０に残存する。例えば、生体触媒ＢＣは、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼを含んでもよい。
【００６０】
反応容器１２０は、外部ジャケット１２９の形状で温度調節装置を含み、それを通って適切な作動流体が循環して、内容積Ｖ２を所望の定常温度で維持することが可能になる。例えば、作動液体は、油もしくは水であってもよく、別の容器（図示せず）で加熱または冷却されて、適切な注入口を介して外部ジャケット１２９にポンプで通し、ポート１２３から出る。この実施形態の代替変形では、温度調節装置は、外部ジャケット１２９の代わりにまたはそれに追加して、加熱エレメントおよび／または冷却エレメント、例えば電動加熱エレメントおよび／または冷却エレメントを含む。
【００６１】
反応容器１２０の下方部分は送出口１２７を含み、および反応容器１２０から除去される前に、反応混合物、特に反応産物ＲＰを濾過し、次いで生体触媒ＢＣを反応産物ＲＰとともに除去されることから防ぐように構成された適切な保持装置が、フィルタ１２５の形状で送出口１２７の上流に具備される。
【００６２】
生成物分離容器１６０は、反応産物ＲＰから所望の生成物Ｐ（脂肪酸アルキルエステル）を取り出し、過剰な水およびグリセロールＧを含む副産物を分離するように構成される。送出ライン１４７は、生成物分離容器１６０と、反応容器１２０との間に適切な弁（図示せず）を介して選択的流体連通をもたらし、かつ反応産物ＲＰが所望通り反応容器１２０から生成物分離容器１６０に送られるのを可能にする。この実施形態では、生成物分離容器１６０は、前述の分離を行うための遠心分離機または重力分離装置を含み、かつ生成物Ｐをアウトプットするための第１の送出口１６２と、過剰な水およびグリセロールＧを収集するための第２の送出口１６４とを含む。生成物Ｐはタップ１６３を介して収集されてもよい。
【００６３】
このように、本システムは、連続生成方式で操作されることが可能であり、該方式では調製されたエマルジョンＰＥは、反応容器１２０に送られ、次いで所望の生成物Ｐはタップ１６３を介して連続方式で収集される。エマルジョンＰＥは調製されて、連続方式で反応容器１２０に送られ、反応産物ＲＰが送出口１２７から取り出されるのと同じ速度でその中の反応物の量を補給することができる。あるいは、エマルジョンＰＥは調製されて、反応容器１２０にバッチで送られ、送出口１２７を介して反応産物ＲＰが連続的に取り出された後に、反応容器１２０内の反応物のレベルが特定の最低レベルまで低下したときはいつでも不連続の間隔で反応混合物中の反応物の量を補給することができるもちろん、システム１００が連続的よりはむしろバッチで所望の生成物Ｐをもたらすように操作することも可能である。
【００６４】
あるいは、システム１００は、歩留り改善方式で操作されることも可能であり、生成物Ｐは、タップ１６３を介して即時収集される代わりに、ライン１６５、容器注入口１２１および弁１６６を含む、随意に別ルートに切り替えるシステムを介して反応容器１２０に別のルートで送られ、弁１６６が選択的に操作されて、タップ１６３から生成物Ｐの方向を転換させることも可能である。別のルートから反応容器１２０に送られる場合、歩留りの高い生成物Ｐを生成するために、生成物Ｐは、アルコール源１８４から、別のアルコール源（図示せず）から、またはプレ反応調整容器１４０を介してアルコ−ル源１８４から別のライン（図示せず）を介して供給されるアルコールＡＬと反応容器内でさらに反応させてもよい。生成物Ｐは、生成物分離容器１６０を用いて、副産物から再度分離されることも可能である。アルコールが反応調整容器１４０を介して供給される場合、反応調整容器は、まず調製されたエマルジョンＰＥが空の状態であり、次いで適切な弁で脂肪酸Ｆを止めて、随意に緩衝液／水がそれぞれの源１８２および１８６から供給される。適切なポンプまたは重力送り装置および制御可能な弁は、それぞれのライン１５２、１５４、１５６、１４８、１４７、１６５を介してそれぞれの原料を選択的に運ぶために具備されることも可能であり、および適切な制御装置（図示せず）が該システムの操作をモニターして制御する。
【００６５】
第１の実施形態の少なくとも一部の代替変形では、プレ反応調整容器１４０は、反応容器１２０との一体型であってもよい。例えば、それぞれの内容積Ｖ１およびＶ２は、ライン１４８に対応する開口装置を有する壁によって分離されてもよい。あるいは、それぞれの内容積Ｖ１およびＶ２は、隣接していてもよいが、内容積Ｖ１は、生体触媒ＢＣから十分に間隔を空けることで、生体触媒ＢＣに達する前にエマルジョンＰＥが形成されるのに十分な時間をもたらすことが可能である。
【００６６】
第１の実施形態の代替変形では、脂肪酸ＦＡ、アルコールＡＬ、および緩衝液／水ＢＵのうちの１、２またはすべては、プレ反応調整容器１４０を迂回して、反応容器１２０に直接供給されてもよい。例えば、脂肪酸源１８２、アルコール源１８４、および緩衝液／水源１８６のうちの１または複数は、プレ反応調整容器１４０を迂回して、適切な供給ライン（図示せず）を介して反応容器１２０と直接、選択的流体連結されてもよい。
【００６７】
第１の実施形態、またはその代替変形によって、システム１００のすべての構成部品は、温度、圧力、ｐＨなどを含むそれぞれの条件で各構成部品がそれぞれの機能を果たすことを可能にするためなど、当技術分野で知られている適切な形状であり、かつ適切な原料から作られていると理解される。
【００６８】
図１２を参照して、参照番号２００と称される該システムの第２の実施形態は、図１１で同様の番号が付いたすべての部品を含み、必要な変更を加えて一部の相違とともに、その代替変形を含む第１の実施形態のエレメントおよび特徴のすべてを含む。例えば、システム２００も以下を含む：第１の実施形態で開示され、必要な変更を加えた、反応容器１２０、プレ反応調整容器１４０、生成物分離容器１６０、脂肪酸源１８２、アルコール源１８４、緩衝液／水源１８６、供給ライン１５２、１５４、１５６、容器注入口１７２、１７４、１７６、撹拌装置１４２、外部ジャケット１４９、送出ライン１４８、容器注入口１２２、撹拌装置１２４、生体触媒ＢＣ外部ジャケット１２９、注入および排出ポート１２３、送出口１２７、フィルタ１２５、送出ライン１４７、第１の送出口１６２、第２の送出口１６４。
【００６９】
しかしながら、第２の実施形態では、第１の実施形態のライン１６５、タップ１６３および弁１６６は除外されており、代わりに補助反応モジュール３００が、生成物分離容器１６０の第１の送出口１６２に作動可能なように接続されている。
【００７０】
補助反応モジュール３００は、補助反応容器２２０および補助生成物分離容器２６０を含み、この実施形態では、必要な変更を加えた反応容器１２０および生成物分離容器１６０にそれぞれ実質的に類似している。作動中、生成物分離容器１６０からの所望の生成物Ｐは、ライン２６６、弁２６７および容器注入口２２１を介して補助反応容器２２０に送られる。補助反応容器２２０に送られると、生成物Ｐはその中で、アルコール源１８４からまたは別のアルコール源（図示せず）からの別個のライン（図示せず）を介して供給されるアルコールＡＬとさらに反応して、さらに反応した生成物ＦＲＰを生成する。ライン２４９は、さらに反応した生成物ＦＲＰが補助生成物分離容器２６０に送られるのを可能し、次いで補助生成物分離容器は、より歩留りの高い生成物Ｐ’を副産物から分離するように作動する。
【００７１】
システム２００は、必要な変更を加えて、システム１００と同様のプロセスで操作されうる。
【００７２】
開示されかつ記述されるように、本発明は、本明細書に開示される特定の実施例、プロセスのステップ、および原料に限定されるものではなく、かかるプロセスのステップおよび原料は、いくらか変わりうると理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲とその均等物によってのみ限定されることから、本明細書で用いた専門用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられ、かつ限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００７３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用した単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意すべきである。
【００７４】
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および以下に続く特許請求の範囲全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変形は、記述した整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を含むが、いかなる他の整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されよう。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって用いられた技法の代表例である。これらの技法が本発明の実行のための好適な実施形態の好例であり、本開示を踏まえて、当業者は多数の修正が本発明の意図する範囲から逸脱することなく行われうることを認識するであろう。
（実施例）
（概要）
【００７６】
すべての実験を、ガラスフィルタが中心に位置する底部を有する３０ｍＬの容量のガラス管または１５０〜２５０μｍの多孔性の焼結ガラスフィルタの底部を有する５００ｍＬの容量の機械撹拌反応器のいずれかで実行した。典型的な反応媒体は、脂肪酸源、アルコール、通常は、遊離またはグリセロール骨格上に結合しているかにかかわらず脂肪酸に関して１：１のモルベース（遊離脂肪酸およびモノグリセリドの場合は１：１、ジグリセリドの場合は１：２、およびトリグイセリドの場合は１：３とアルコールが多め）でのメタノールまたはエタノールを含んでいた。脂肪酸源を異なる量のアルカリ性緩衝液（特定の実施形態では重炭酸ナトリウム）と予備混合した。疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを添加する（１０〜１５重量％）ことで反応を開始し、反応媒体を３０℃で機械的に振盪させるかまたは撹拌させた。別段示さない限り、アルコール量は、各１時間空けて３段階で同量を添加した。反応変換の後に、異なる時間間隔で反応媒体から試料を採取して、脂肪酸成分を分析した。バイオディーゼルへの変換を、以下のように算出した：１００＊脂肪酸アルキルエステルのピーク面積／すべてのピーク面積の合計
【００７７】
リパーゼ固定化：特定の微生物に由来するリパーゼを特定のｐＨ値（例えば７．５）の０．１Ｍの緩衝液に可溶化する標準手順に従ってリパーゼを固定化した。有機または無機高分子樹脂を該リパーゼ溶液に導入した。混合物を室温で８時間振盪した。樹脂上でのタンパク質酵素沈殿を増加させるために、冷アセトンを随意に混合物に添加した。該混合物を濾過して、酵素ビーズを乾燥させて含水量を５％未満まで減少させた。
【００７８】
疎水性高分子樹脂をベースにしたポリスチレン・ジビニルベンゼン、パラフィンまたはそれらの任意の組み合わせを含む種々の樹脂を用いて、樹脂の疎水性特徴を得た。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ，ＵＳＡ）およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）を含む典型的な疎水性樹脂を用いた。Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ）および多孔質シリカゲルを含む典型的な親水性樹脂を用いた。リパーゼは樹脂上に別々に固定化してもよく、または異なるリパーゼを同一の樹脂上に共固定化する。
（実施例１）
【００７９】
疎水性樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に、および親水性樹脂としてＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８上に固定化したサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼ、ならびに疎水性樹脂としてＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０上に、および親水性樹脂として多孔質シリカ上に固定化したシュードモナスエスピーに由来するリパーゼのエステル交換活性。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％含む精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。１０重量％リパーゼ調製物を含む反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１に示す。
【００８０】
図１に示した結果は、異なる樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピー由来の両リパーゼが、１重量％の重炭酸ナトリウム溶液の存在下で、同じバッチの酵素を用いた最初の５サイクルの間、高いエステル交換活性を示したことを表している。５回目のバッチの後、同じバッチの酵素を用いると、親水性樹脂、すなわちＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８および多孔質シリカ上に固定化された両リパーゼのビーズの周りにゲル様沈着物が形成されたために、システムからの反応媒体の濾過は困難になったことが観察された。親水性樹脂上に固定化された両リパーゼのエステル交換活性は、さらなる連続的なバッチで急激に減少し、次いで両リパーゼは、１０回目のサイクルの後、不活性になった。対照的に、疎水性樹脂、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼは７０サイクル後もその初期活性の８０％以上を保持したが、一方疎水性樹脂Ａｍｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼは、７０を超えるサイクル後、その初期活性の２０％以上を保持した。
（実施例２）
【００８１】
Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオ燃料およびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図２に示す。
【００８２】
Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオ燃料およびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図３に示す。
【００８３】
図２および３は、反応媒体中の炭酸ナトリウムの量が疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピー由来のリパーゼの作用寿命に主要な役割を有することを示している。アルカリ性溶液の非存在下で両固定化リパーゼは、数サイクル後にそれらの活性を急激に消失するが、一方、同固定化リパーゼは、反応系におけるベースとして重炭酸ナトリウム溶液の存在下で複数回使用にわたりそれらのエステル交換活性を維持することが図２および３から理解される。両固定化酵素の結果は、０〜４重量％の範囲で反応媒体中の重炭酸ナトリウム溶液の量が増加すると、同じバッチの固定化酵素の複数回使用での酵素活性の消失が減少する結果になることを示している。
（実施例３）
【００８４】
Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図４に示す。
【００８５】
Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図５に示す。
【００８６】
図４および５は、複数の実験において疎水性樹脂上に固定化された同じバッチのリパーゼ（サーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピー由来）を用いるエステル交換活性も、反応系での水の量によって影響されることを示す。連続サイクルで用いる場合、何もない（ゼロ）から４重量％まで水の量を増加させると、生体触媒の残留するエステル交換活性をより高く維持するという結果になったことがわかる。図２〜５に示した結果は、連続サイクルで用いる場合、エステル交換反応物中の重炭酸ナトリウム溶液などの弱塩基は、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼの活性を維持するために有利に働くことを明らかに示している。
（実施例４）
【００８７】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて４時間のエステル化／エステル交換を行った後の、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）と大豆油との混合物のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる量で含有する、遊離脂肪酸大豆の加水分解物（５０重量％）と、初期のＦＦＡ値７２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの大豆油（５０重量％）との混合物。メタノール（４．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（２０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図６に示す。
【００８８】
図６は、異なる量の塩基性溶液が、大豆油加水分解物と大豆油トリグリセリドとを等量比率で含む反応混合物中に存在するＦＦＡの同時エステル化反応に主要な影響を及ぼすことを示す。エステル化／エステル交換反応系にアルカリ性溶液が何も添加されないと、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼはそのエステル化活性を消失するが、一方、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％および２重量％、該反応系に別々に添加すると、同じ生体触媒は連続サイクルにおいてその活性を維持したことがわかる。図６に示した結果は、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液の１重量％および２重量％の存在下で、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いると、ＦＦＡ含有量が、７２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの初期値からそれぞれ平均８ｍｇ ＫＯＨ／１ｇおよび６ｍｇ ＫＯＨ／１ｇまで減少し、かつ２２回の連続サイクルでこの活性を維持したことを示している。
（実施例５）
【００８９】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて４時間の反応を行った後の、大豆油加水分解物のバイオディーゼルおよび水への変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％含有する、ＦＦＡ値１５０ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの遊離脂肪酸大豆の加水分解物（２０ｇ）。メタノール（２ｍＬ）を１バッチで反応物に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図７に示す。
【００９０】
図７は、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼが遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸メチルエステルと水の副産物とを形成することもできることを示している。リパーゼ調製物は、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１％含有する媒体中で、同じバッチの生体触媒を用いて２５を超えるサイクルにわたりいずれの著しい活性消失も観察されることなく、そのエステル化／エステル交換活性を維持したことを結果が示している。
（実施例６）
【００９１】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間の反応を行った後の、魚油のエタノールとのエステル交換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１％含有する精製魚油（２０ｇ）。エタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化したサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼを別々に用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図８に示す。
【００９２】
図８は、疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイミセスラヌギノサおよびシュードモナススピー由来の両リパーゼが、魚油トリグリセリドのエタノールとのエステル交換を触媒して、脂肪酸エチルエステルとグリセロール副産物とを形成することもできることを示している。両生体触媒調製物は、１％重炭酸ナトリウム溶液の存在下で、同じバッチの生体触媒を用いて２０を超えるサイクルにわたり著しい活性消失もなく、それらのエステル交換活性を維持したことを結果が示している。
（実施例７）
【００９３】
複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間の反応を行った後の、獣脂のエタノールとのエステル交換。
反応条件：獣脂（４ｇ）の脂肪酸エチルエステルおよび１Ｍの炭酸カリウム溶液を１％含有する獣脂（１６ｇ）。エタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化したサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼを別々にまたは等量比の組み合わせで用いた（１０重量％）。反応媒体を３７℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図９に示す。
【００９４】
図９は、疎水性樹脂上に別々にまたは組み合わせて固定化されたサーモマイセスラヌギノサおよびシュードモナススピー由来の両リパーゼが、獣脂トリグリセリドのエタノールとのエステル交換を触媒して、脂肪酸エチルエステルとグリセロール副産物とを形成することもできることを示している。反応媒体の供給原料は、該反応媒体の融点を下げるために、獣脂（８０％）と、獣脂に由来する脂肪酸エチルエステルとを含んでいた。図９に示した結果は、１Ｍの炭酸カリウムなどの弱アルカリ性溶液の存在下で、同じバッチの生体触媒を１００連続サイクルで用いたとき、すべての生体触媒がそれらの初期活性の８０％以上を保持したことを示している。
（実施例８）
【００９５】
疎水性多孔質の樹脂上に固定化されたシュードモナススピー由来のリパーゼおよびサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼを用いて４時間後に得た、７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含有するエステル交換／エステル化反応媒体の、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（１０重量％）を用いる、疎水性多孔質の樹脂上に固定化されたカンジダアンタークティカＢ由来のリパーゼおよびメタノール（ＦＦＡとメタノールとのモルベースで、それぞれ１：１０の比）での処理。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１０に示す。
【００９６】
図１０は、上述したサーモマイセスラヌギノサ由来のリパーゼまたはシュードモナススピー由来のリパーゼのいずれかでの処理の後に得たエステル交換反応媒体が、典型的には３〜７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含有し、親水性または疎水性のいずれかの担体上に固定化されたカンジダアンタークティカＢ由来のリパーゼで処理されることができ、その結果ＦＦＡ値が２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇ未満まで低下することを示している。固定化されたリパーゼは、１００サイクルを超えてその活性を維持することができる。
（実施例９）
【００９７】
バイオディーゼル、水およびグリセロールを形成するために、図１１に図示したシステムの第１の実施形態を用いることによる、１０％ＦＦＡを含有する廃食油のメタノールでのエステル交換／エステル化。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を２％含有する廃食油（１１００ｇ）およびメタノール（１４０ｇ）をまず、プレ反応調整容器１４０で予備混合して、エマルジョンを形成し、次いでこれを約２リットルの内容積Ｖ２を有する反応容器１２０に導入した。反応容器１２０中で反応混合物を、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサに由来するリパーゼ（油の３０重量％）と３０℃で６時間混合した。フィルタ１２５を介して反応混合物を濾過して、生成物分離容器１６０に送った。生成物分離容器１６０中の反応混合物からグリセロールおよび過剰な水を除去した。脂肪酸メチルエステルを含有する上相および非反応グリセリドを、別ルートライン１６５を介して反応容器１２０に再導入し、次いでメタノール（１１０ｇ）を反応容器１２０中の反応媒体に添加してから、反応容器１２０での撹拌を再び始めた。２時間後のメチルエステルへの変換は、９８％であった。廃食油（８３重量％）、メタノール（１５％）および０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液（２％）を含有する乳化反応媒体（調製したエマルジョン）をおよそ３０ｍＬ／分の流量で反応容器１２０に連続的に送った。マクロ多孔質の疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサリパーゼに由来する同じバッチの生体触媒を用いると、脂肪酸メチルエステルへの変換は、著しい活性消失もなく、３カ月以上維持された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのプロセスであって、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源と、アルコールまたはアルコール供与体とを反応させることを含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水性アルカリ性緩衝液を含むプロセス。
【請求項２】
前記水性アルカリ性緩衝液が水性弱アルカリ性緩衝液である請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記水性アルカリ性緩衝液が脂肪酸源の最高５重量％までの量で含まれる請求項１または請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記水性緩衝液が７から約１１までのｐＨ値を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ｐＨ値が７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０および７〜１１のいずれか１つである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記緩衝液を含む補充された弱アルカリ性試薬のｐＫａが、前記脂肪酸源を含む酸類のｐＫａよりも高いまたは等しい、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのプロセスであって、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源と、アルコールとを反応させることを含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水を含む、プロセス。
【請求項８】
前記水が３〜１１のｐＨ値の水溶液の形状である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記反応媒体が前記脂肪酸源の最高５重量％までの水または水溶液を含有する、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記アルコールが短鎖アルコールである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記アルコール供与体が、酢酸メチルなどのモノアルキルエステル、または炭酸ジメチルなどの炭酸ジアルキルであり、反応媒体中で弱アルカリ性試薬の源としても役立つ、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのリパーゼが、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、サーモマイセスラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンいずれか１つに由来するリパーゼである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記固定化リパーゼが、遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物として水とをもたらすことができ、ならびにトリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して、脂肪酸アルキルエステルと副産物としてグリセロールとをもたらすことができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記反応媒体中の前記アルカリ性溶液の量が、脂肪酸源の０．００１〜５重量％である、請求項１〜６および１０〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記リパーゼ調製物が、疎水性担体上に各々別々に固定化されうる、または同じ疎水性担体上に共固定化されうる少なくとも２つのリパーゼを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記リパーゼが同一のまたは異なる位置特異性を有する、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記リパーゼが、遊離脂肪酸のエステル化を同時にもしくは連続的に触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物として水とをもたらすことができ、ならびにトリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を同時にもしくは連続的に触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物としてグリセロールとをもたらすことができる、請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記担体が、疎水性脂肪族高分子をベースした担体および疎水性芳香族高分子をベースにした担体のいずれか１つである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記疎水性高分子担体が線状または分岐状の有機鎖から構成される、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記担体がマクロ網状有機高分子またはコポリマー鎖を含む、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記担体が、疎水性でありうるまたは疎水性の有機材料で被覆されている、多孔質もしくは非多孔質の無機担体であり、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記有機材料が線状、分岐状、または官能基を有する疎水性有機鎖である、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記水性アルカリ性緩衝液が無機アルカリ塩または有機塩基の溶液である、請求項１〜６および１０〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記アルカリ性緩衝液が、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩、第一級、第二級および第三級のアミン、ならびにそれらの混合物である、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記アルカリ性緩衝液が、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムおよび炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムから選択される弱塩基性溶液である、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記アルカリ性緩衝液が、予備混合の段階で前記脂肪酸源に、または反応媒体に直接的に添加される、請求項１〜６および１０〜２５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２７】
エステル交換／エステル化の反応媒体中の前記アルカリ性緩衝液の含有量が、油供給原料の０．００１〜５重量％の範囲にある、請求項１〜６および１０〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記アルカリ性緩衝液の含有量が油供給原料の１〜２重量％である、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記脂肪酸源が、まず前記アルカリ性緩衝液と混合され、次いで該混合物が前記固定化リパーゼ調製物で処理され、続いて前記アルコールが添加され、前記脂肪酸源が脂肪酸エステルに変換するまで適切な条件下で該反応が進行することができる、請求項１〜６および１０〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記脂肪酸源が、植物油、動物性脂肪、藻油、魚油、廃油およびそれらの任意の混合物のいずれか１つである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記脂肪酸源が、リン脂質およびステロールエステルなどの他の微量な脂肪酸誘導体の非存在下または存在下で、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、任意の割合でのそれらの混合物を含み、より具体的には前記脂肪酸源が、未精製、精製、漂白、脱臭されたものまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記アルコールが、短鎖アルキルアルコール、具体的にはＣ１−Ｃ６アルキルアルコール、より具体的にはＣ１−Ｃ４アルキルアルコール、特にメタノールまたはエタノールである、請求項１〜１０および１２〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３３】
前記アルコールがメタノールであり、結果としてもたらされる前記脂肪酸エステルが脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ−Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）である、請求項１〜１０および１２〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３４】
前記アルコールが中鎖脂肪アルコール（Ｃ６−Ｃ１０）または長鎖脂肪アルコール（Ｃ１２−Ｃ２２）である、請求項１〜１０および１２〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記反応が１０℃と１００℃の間、具体的には２５℃と３０℃の間の温度で行われる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３６】
前記脂肪源が、プレ反応調整容器内で前記アルコールもしくはアルコール供与体と、次いで前記水もしくは緩衝液と予備混合されて、エマルジョンを形成し、次いで前記固定化リパーゼ調製物とともに、エステル交換／エステル化反応容器に送られる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３７】
前記固定化リパーゼが、バッチ方式でもしくは連続方式で作動する連続撹拌タンク反応器または充填層反応器で用いられる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３８】
脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸とアルコールとのエステル交換／エステル化を行うシステムであって、脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体の少なくとも１つとを含む反応媒体を固定化リパーゼ調製物の存在下で反応させるように構成された反応容器を含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、前記反応媒体が水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを含有する、システム。
【請求項３９】
前記反応容器が、前記脂肪酸アルキルエステルの生成のための前記システムの少なくとも作動中に固定化リパーゼ調製物を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記反応容器が、前記脂肪酸アルキルエステルの生成のための前記システムの少なくとも作動中に脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含む、請求項３８または３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記反応媒体が混合物を含み、前記システムが、前記反応容器と選択的流体連通しているプレ反応容器をさらに含み、前記脂肪酸アルキルエステルの生成のための前記システムの少なくとも作動中に、前記プレ反応容器が、少なくとも脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを予備混合して前記混合物を形成し、前記混合物を前記反応容器に選択的に送るように構成される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記プレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前記システムの少なくとも前記作動中に脂肪酸を前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された脂肪酸源と、前記プレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前記システムの少なくとも前記作動中にアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つを前記プレ反応容器に送るように構成されたアルコール源とをさらに含む、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記プレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前記システムの少なくとも前記作動中に、前記混合物に含まれるべく、水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された緩衝液源をさらに含む、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記システムの少なくとも前記作動中に、１つまたは複数の脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを連続方式で前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４２または４５に記載のシステム。
【請求項４５】
前記システムの少なくとも前記作動中に、水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを連続方式で前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４３または４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記システムの少なくとも前記作動中に、１つまたは複数の脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体の少なくとも１つとを別々のバッチで前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４７】
前記システムの少なくとも前記作動中に、水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを別々のバッチで前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４８】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記プレ反応容器が前記混合物を連続方式で前記反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４９】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記プレ反応容器が前記混合物を別々のバッチで前記反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記システムが、少なくとも１つの脂肪酸と；アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つと；水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つとを前記反応容器に選択的におよび直接的に送るように構成される、請求項３８〜４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記反応容器が、前記反応容器中の反応媒体を選択温度範囲内で維持するように構成された温度調節装置を含む、請求項３８〜５０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記システムの少なくとも前記作動中に、固定化リパーゼ調製物を前記反応容器内に保持するように構成された保持装置をさらに含む、請求項３８〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記反応容器と選択的流体連通した生成物分離容器をさらに含み、前記システムが反応産物を含む反応混合物を前記反応容器から前記生成物分離容器に選択的に送るように構成され、および前記生成物分離容器がそこに送られた反応混合物から脂肪酸アルキルエステルの生成物を選択的に分離するように構成される、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記生成物分離容器が遠心分離機および重力分離装置のうちの１つを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記反応容器が、前記反応混合物を連続方式で前記生成物分離容器に選択的に送るように構成される、請求項５３および５４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５６】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記反応容器が、前記反応混合物を別々のバッチで前記生成物分離容器に選択的に送るように構成される、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５７】
脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を前記生成物分離容器から選択的に送るように構成された、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５８】
脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を連続方式で前記生成物分離容器から選択的に送るように構成された、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を別々のバッチで前記生成物分離容器から選択的に送るように構成された、請求項５７に記載のシステム。
【請求項６０】
前記システムが、前記生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を増加するように構成される、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６１】
前記システムが、続いて前記生成物分離容器に送られる反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前記生成物をさらに増加させるために、脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を前記反応容器に選択的に別のルートで送るように構成される、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
前記システムが、脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を選択的に別のルートで補助反応モジュールに送るように構成され、前記補助反応モジュールが補助反応容器および補助生成物分離容器を含み、脂肪酸アルキルエステルのさらに増加した前記生成物が、続いて前記補助生成物分離容器を介して選択的に送られる、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
請求項３８〜６２のいずれか１項に記載のシステムにおいて行われる、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１】
脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのプロセスであって、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源と、アルコールまたはアルコール供与体とを反応させることを含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水性アルカリ性緩衝液を含むプロセス。
【請求項２】
前記水性アルカリ性緩衝液が水性弱アルカリ性緩衝液である請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記水性アルカリ性緩衝液が脂肪酸源の最高５重量％までの量で含まれる請求項１または請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記水性緩衝液が７から約１１までのｐＨ値を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ｐＨ値が７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０および７〜１１のいずれか１つである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記緩衝液を含む補充された弱アルカリ性試薬のｐＫａが、前記脂肪酸源を含む酸類のｐＫａよりも高いまたは等しい、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのプロセスであって、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源と、アルコールとを反応させることを含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水を含む、プロセス。
【請求項８】
前記水が３〜１１のｐＨ値の水溶液の形状である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記反応媒体が前記脂肪酸源の最高５重量％までの水または水溶液を含有する、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記アルコールが短鎖アルコールである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記アルコール供与体が、酢酸メチルなどのモノアルキルエステル、または炭酸ジメチルなどの炭酸ジアルキルであり、反応媒体中で弱アルカリ性試薬の源としても役立つ、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのリパーゼが、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、サーモマイセスラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンいずれか１つに由来するリパーゼである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記固定化リパーゼが、遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物として水とをもたらすことができ、ならびにトリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して、脂肪酸アルキルエステルと副産物としてグリセロールとをもたらすことができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記反応媒体中の前記アルカリ性溶液の量が、脂肪酸源の０．００１〜５重量％である、請求項１〜６および１０〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記リパーゼ調製物が、疎水性担体上に各々別々に固定化されうる、または同じ疎水性担体上に共固定化されうる少なくとも２つのリパーゼを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記リパーゼが同一のまたは異なる位置特異性を有する、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記リパーゼが、遊離脂肪酸のエステル化を同時にもしくは連続的に触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物として水とをもたらすことができ、ならびにトリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を同時にもしくは連続的に触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物としてグリセロールとをもたらすことができる、請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記担体が、疎水性脂肪族高分子をベースした担体および疎水性芳香族高分子をベースにした担体のいずれか１つである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記疎水性高分子担体が線状または分岐状の有機鎖から構成される、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記担体がマクロ網状有機高分子またはコポリマー鎖を含む、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記担体が、疎水性でありうるまたは疎水性の有機材料で被覆されている、多孔質もしくは非多孔質の無機担体であり、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記有機材料が線状、分岐状、または官能基を有する疎水性有機鎖である、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記水性アルカリ性緩衝液が無機アルカリ塩または有機塩基の溶液である、請求項１〜６および１０〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記アルカリ性緩衝液が、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩、第一級、第二級および第三級のアミン、ならびにそれらの混合物である、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記アルカリ性緩衝液が、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムおよび炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムから選択される弱塩基性溶液である、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記アルカリ性緩衝液が、予備混合の段階で前記脂肪酸源に、または反応媒体に直接的に添加される、請求項１〜６および１０〜２５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２７】
エステル交換／エステル化の反応媒体中の前記アルカリ性緩衝液の含有量が、油供給原料の０．００１〜５重量％の範囲にある、請求項１〜６および１０〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記アルカリ性緩衝液の含有量が油供給原料の１〜２重量％である、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記脂肪酸源が、まず前記アルカリ性緩衝液と混合され、次いで該混合物が前記固定化リパーゼ調製物で処理され、続いて前記アルコールが添加され、前記脂肪酸源が脂肪酸エステルに変換するまで適切な条件下で該反応が進行することができる、請求項１〜６および１０〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記脂肪酸源が、植物油、動物性脂肪、藻油、魚油、廃油およびそれらの任意の混合物のいずれか１つである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記脂肪酸源が、リン脂質およびステロールエステルなどの他の微量な脂肪酸誘導体の非存在下または存在下で、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、任意の割合でのそれらの混合物を含み、より具体的には前記脂肪酸源が、未精製、精製、漂白、脱臭されたものまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記アルコールが、短鎖アルキルアルコール、具体的にはＣ１−Ｃ６アルキルアルコール、より具体的にはＣ１−Ｃ４アルキルアルコール、特にメタノールまたはエタノールである、請求項１〜１０および１２〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３３】
前記アルコールがメタノールであり、結果としてもたらされる前記脂肪酸エステルが脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ−Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）である、請求項１〜１０および１２〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３４】
前記アルコールが中鎖脂肪アルコール（Ｃ６−Ｃ１０）または長鎖脂肪アルコール（Ｃ１２−Ｃ２２）である、請求項１〜１０および１２〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記反応が１０℃と１００℃の間、具体的には２５℃と３０℃の間の温度で行われる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３６】
前記脂肪源が、プレ反応調整容器内で前記アルコールもしくはアルコール供与体と、次いで前記水もしくは緩衝液と予備混合されて、エマルジョンを形成し、次いで前記固定化リパーゼ調製物とともに、エステル交換／エステル化反応容器に送られる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３７】
前記固定化リパーゼが、バッチ方式でもしくは連続方式で作動する連続撹拌タンク反応器または充填層反応器で用いられる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３８】
脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸とアルコールとのエステル交換／エステル化を行うシステムであって、脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体の少なくとも１つとを含む反応媒体を固定化リパーゼ調製物の存在下で反応させるように構成された反応容器を含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、前記反応媒体が水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを含有する、システム。
【請求項３９】
前記反応容器が、前記脂肪酸アルキルエステルの生成のための前記システムの少なくとも作動中に固定化リパーゼ調製物を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記反応容器が、前記脂肪酸アルキルエステルの生成のための前記システムの少なくとも作動中に脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含む、請求項３８または３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記反応媒体が混合物を含み、前記システムが、前記反応容器と選択的流体連通しているプレ反応容器をさらに含み、前記脂肪酸アルキルエステルの生成のための前記システムの少なくとも作動中に、前記プレ反応容器が、少なくとも脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを予備混合して前記混合物を形成し、前記混合物を前記反応容器に選択的に送るように構成される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記プレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前記システムの少なくとも前記作動中に脂肪酸を前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された脂肪酸源と、前記プレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前記システムの少なくとも前記作動中にアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つを前記プレ反応容器に送るように構成されたアルコール源とをさらに含む、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記プレ反応容器と選択的流体連通し、かつ前記システムの少なくとも前記作動中に、前記混合物に含まれるべく、水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された緩衝液源をさらに含む、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記システムの少なくとも前記作動中に、１つまたは複数の脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを連続方式で前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４２または４５に記載のシステム。
【請求項４５】
前記システムの少なくとも前記作動中に、水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを連続方式で前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４３または４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記システムの少なくとも前記作動中に、１つまたは複数の脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体の少なくとも１つとを別々のバッチで前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４７】
前記システムの少なくとも前記作動中に、水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを別々のバッチで前記プレ反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４８】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記プレ反応容器が前記混合物を連続方式で前記反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４９】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記プレ反応容器が前記混合物を別々のバッチで前記反応容器に選択的に送るように構成された、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記システムが、少なくとも１つの脂肪酸と；アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つと；水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つとを前記反応容器に選択的におよび直接的に送るように構成される、請求項３８〜４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記反応容器が、前記反応容器中の反応媒体を選択温度範囲内で維持するように構成された温度調節装置を含む、請求項３８〜５０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記システムの少なくとも前記作動中に、固定化リパーゼ調製物を前記反応容器内に保持するように構成された保持装置をさらに含む、請求項３８〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記反応容器と選択的流体連通した生成物分離容器をさらに含み、前記システムが反応産物を含む反応混合物を前記反応容器から前記生成物分離容器に選択的に送るように構成され、および前記生成物分離容器がそこに送られた反応混合物から脂肪酸アルキルエステルの生成物を選択的に分離するように構成される、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記生成物分離容器が遠心分離機および重力分離装置のうちの１つを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記反応容器が、前記反応混合物を連続方式で前記生成物分離容器に選択的に送るように構成される、請求項５３および５４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５６】
前記システムの少なくとも前記作動中に、前記反応容器が、前記反応混合物を別々のバッチで前記生成物分離容器に選択的に送るように構成される、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５７】
脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を前記生成物分離容器から選択的に送るように構成された、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５８】
脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を連続方式で前記生成物分離容器から選択的に送るように構成された、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を別々のバッチで前記生成物分離容器から選択的に送るように構成された、請求項５７に記載のシステム。
【請求項６０】
前記システムが、前記生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を増加するように構成される、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６１】
前記システムが、続いて前記生成物分離容器に送られる反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前記生成物をさらに増加させるために、脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を前記反応容器に選択的に別のルートで送るように構成される、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
前記システムが、脂肪酸アルキルエステルの前記生成物を選択的に別のルートで補助反応モジュールに送るように構成され、前記補助反応モジュールが補助反応容器および補助生成物分離容器を含み、脂肪酸アルキルエステルのさらに増加した前記生成物が、続いて前記補助生成物分離容器を介して選択的に送られる、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
請求項３８〜６２のいずれか１項に記載のシステムにおいて行われる、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のプロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１３−５２０９８５（Ｐ２０１３−５２０９８５Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５５３８（Ｐ２０１２−５５５５３８）
【出願日】平成２３年２月２日（２０１１．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１１／０００１２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７９７７
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０９１９２８０２）トランスバイオディーゼル リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２日（２０１１．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１１／０００１２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７９７７
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０９１９２８０２）トランスバイオディーゼル リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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