脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物
【課題】 哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく合成できる、組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を提供する。
【解決手段】 本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含有する組換え発現ベクター、およびこの組換え発現ベクターを用いた脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物細胞、および、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物である。
【解決手段】 本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含有する組換え発現ベクター、およびこの組換え発現ベクターを用いた脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物細胞、および、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト動物細胞に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪は、エネルギー源として非常に重要である。脂肪は、同時に、動物にとって正常な発育と機能維持に欠くことができない、不飽和脂肪酸（リノール酸（１８：２ｎ−６）、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）、およびアラキドン酸（２０：４ｎ−６））などの摂取源でもある。脂肪酸の合成では、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素により、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２ｎ−６）が合成され、さらに、ω３脂肪酸不飽和化酵素により、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が合成される。
【０００３】
ここで、多価不飽和脂肪酸は、生合成の経路別に、ｎ−３系、ｎ−６系、ｎ−９系などに分類される。ここで、「ｎ−」に続く数字３、６および９は、多価不飽和脂肪酸の炭素鎖のメチル基から数えて最初の二重結合が何番目の炭素にあるかを示す。例えば、「ｎ−３」系は、炭素数が１８個の脂肪酸のメチル基の炭素を１位の炭素とし、カルボキシル基側に向かって順次２位、３位・・・としたとき、メチル基から数えて最初の二重結合が３位の炭素にある多価不飽和脂肪酸を示す。「ｎ−３」系は、「ω３」系とも表示される。また、「ｎ−」の前に記載される数字は、一分子内に含まれる二重結合の数を示す。一方、「Δ」は、多価不飽和脂肪酸の炭素鎖のカルボキシル基から数えて最初の二重結合が何番目の炭素にあるかを示す。また、ω３脂肪酸不飽和化酵素、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素は、それぞれ、脂肪酸の炭素鎖のメチル基から数えて３位の位置に二重結合を作る酵素を、脂肪酸の炭素鎖のカルボキシル基から数えて１２位の位置に二重結合を作る酵素を、意味する。
【０００４】
しかし、哺乳動物などの高等動物では、上記の酵素を有さない。したがって、動物によれば、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２ｎ−６）の合成や、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成は行えないものもいる。
【０００５】
α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）からはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）が、ＥＰＡからはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）などが合成される。ＥＰＡやＤＨＡなどのｎ−３系多価不飽和脂肪酸は、アトピー性皮膚炎、血栓性疾患、ガン、冠動脈心疾患などに低減効果があることが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００６】
これらのｎ−３系多価不飽和脂肪酸は、魚類や海草類などの海産物に多く含まれている。したがって、海産物を経口摂取することが非常に重要である。しかし、牛や豚などの畜肉やパーム油などの植物油に代表される陸生生物由来食品を過剰に摂取し、海産物の摂食が不足している、現在の先進国の食生活では、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸は摂取されにくい。
【０００７】
このため、高等動物細胞が合成できない多価不飽和脂肪酸を高等動物細胞や高等動物中で合成しようとすることが試みられている。
【０００８】
本発明者らは、ブタに、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｎｃｅａ）根部由来のリノール酸（１８：２ｎ−６）を生成するΔ１２脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子である、ＦＡＤ２（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ２）を導入したものを提案した（例えば、特許文献１参照）。また、ＦＡＤ２が導入されたブタでは、リノール酸（１８：２ｎ−６）が新規に合成されることを証明した。
【０００９】
リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）を合成するω３脂肪酸不飽和化酵素については、例えば、植物等におけるω３脂肪酸不飽和化酵素の発現量や活性を、遺伝子操作等によって人為的に制御するための技術に使用できるω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子等が提供されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１０】
また、子嚢菌と脂質生成菌であるモルティエレラ・アルピナのΔ１２脂肪酸不飽和酵素と、子嚢菌のω３脂肪酸不飽和化酵素の推定アミノ酸配列を比較し、相同性の高いアミノ酸配列に対応するプライマーを設計し、これから、ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを得る技術が開示されている（例えば、特許文献３参照）。この文献中には、設計したプライマーから得られるポリヌクレオチドを含むベクターを動物に導入してよいことが記載されている。
【００１１】
また、アラキドン酸産生糸状菌であるモルティエレラ・アルピナのΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をマウスのＬ細胞に導入することで、哺乳動物細胞内でΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が機能することを証明している。また、リノール酸だけでなく、リノール酸以降のｎ−６系脂肪酸の増加も確認している。このことから、哺乳動物がもたないΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を哺乳動物細胞に導入でき、機能的に発現することが示されている（例えば、非特許文献３参照）。
【００１２】
線虫由来のω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子であるｆａｔ−１をマウスの乳腺で発現させ、乳中のｎ−３系脂肪酸の増加を確認しており、哺乳動物でω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が機能的に発現することが示されている。また、乳腺をターゲットにすることで乳の脂肪酸組成を改変できることを示し、授乳した仔マウスへの効果も確認されている（例えば、非特許文献４参照）。
【非特許文献１】Ｃｏｎｎｏｒ ＷＥ， Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ７１， １７１Ｓ−１７５Ｓ （２０００）．
【非特許文献２】Ｔｅｒｒｙ ＰＤ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔａｋｅｓ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｎｄ ｍａｒｉｎｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｎｄ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ７７，ｐ．５３２−５５４３ （２００３）．
【非特許文献３】Ｋｅｌｄｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１９，ｐ．７−１１（２００１）
【非特許文献４】Ｋａｏ ＢＴ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ｎ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ８９， ｐ．３１９５−３２０１（２００６）
【特許文献１】特開２００３−２４５０７０号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５８８
【特許文献３】特開２００６−５５１０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸が合成されれば、食肉等からｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく摂取することができる。しかし、いずれの文献においても、哺乳動物において、ω３脂肪酸不飽和化酵素が機能し、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸の合成されたことについては、開示されていない。非特許文献４の場合では、遺伝子改変マウスの作出効率が極めて低く、中性脂肪への影響も少なかった。
【００１４】
すなわち、本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく合成できる、組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成に対して酵素活性の高い脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を用いて、組換え発現ベクターとすることで、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸が多く合成される、組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を提供できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１６】
本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【００１７】
本発明の組換え発現ベクターは、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含有する。
【００１８】
上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子である。
【００１９】
上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子であるとよい。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２０】
上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ヒト化遺伝子であると好ましい。
【００２１】
上記組換え発現ベクターは、レポーター遺伝子、ＩＲＥＳ配列、および選択マーカー遺伝子を含むと、好ましい。
【００２２】
本発明の非ヒト動物細胞は、上記組換え発現ベクターを用いて、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されている。
【００２３】
本発明の非ヒト動物は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の組換え発現ベクターを用いて非ヒト動物を形質変換すれば、非ヒト動物内で、非ヒト動物に内在する脂肪酸を不飽和化する反応を触媒することができる。この結果、従来動物ではできなかった、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成を可能とする。
【００２５】
また、非ヒト動物内で、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）を基質とするｎ−３系多価不飽和脂肪酸が合成される。この結果、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸に富む食肉、乳製品などの畜産品の供給を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子］
本発明の組換え発現ベクターに用いられる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、α−リノレン酸の生成に関わるω３脂肪酸不飽和酵素をコードする遺伝子（例えば、ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ３、ＦＡＤ３など）である。ＦＡＤ３は、通常、植物、細菌、線虫などの下等動物に多く存在する遺伝子である。ＦＡＤ３は、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、大豆などから単離されている。本発明で用いることのできるＦＡＤ３は、ＦＡＤ３を有する植物から取得すればよく、その由来は問わない。好ましくは、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成能力の高い植物のＦＡＤ３を用いればよい。例えば、アマ科の植物である。また、植物由来のＦＡＤ３以外に、線虫から単離されるｆａｔ−１を用いてもよい。
【００２８】
また、植物由来の遺伝子は、動物細胞内では発現されにくい場合がある。本発明で用いられる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をそのまま用いてもよく、この遺伝子をヒト化処理したものを用いてもよい（Ｋａｎｇ ＪＸ， ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ：ｆａｔ−１ ｍｉｃｅ ｃｏｎｖｅｒｔ ｎ−６ ｔｏ ｎ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ，４２７，ｐ．５０４（２００４）、Ｌａｉ Ｌ， ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｉｇｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｏｍｅｇａ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４，ｐ．１４７２−１４７３ （２００６））。ヒト化処理を行うと、遺伝子の発現効率を向上させることができる。本明細書中で、ヒト化処理とは、植物由来の遺伝子を、アミノ酸配列を変更することなく、哺乳動物でのコドン使用頻度に準じて、塩基配列の変更を行うことをいう。ヒト化処理は、例えば以下のように行う。以下の例では、アマ由来のＦＡＤ３を用いる。
【００２９】
アマ由来のＦＡＤ３は、以下のようにして得られる。ベニバナアマ（Ｌｉｎｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）の幼若種子から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。縮重ポリメレースチェーン反応（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ）法と、ＲＡＣＥ法とを用いて、ＦＡＤ３ ｃＤＮＡの配列を調べる。
【００３０】
植物の脂肪酸不飽和化酵素には、葉緑体で機能する型と小胞体膜上で機能する型がある。この植物の脂肪酸不飽和化酵素を動物で機能させるには、小胞体型の脂肪酸不飽和化酵素を用いる必要がある。小胞体型の脂肪酸不飽和化酵素は、細胞の小胞体膜に結合したタンパク質であり、３つのヒスチジンクラスターに鉄（Ｆｅ）原子が挟まれた活性中心を有する。得られたｃＤＮＡがＦＡＤ３遺伝子であるかどうかは、まず得られたｃＤＮＡに、小胞体移行シグナルを有していることを確認する。小胞体移行シグナルは、アミノ酸３’末端に「ＫＸＫＸＸ」（Ｋ：リシン、Ｘはアミノ酸）配列を有する。ＦＡＤ３の小胞体移行シグナルは、「ＫＳＫＳＡ」（Ｓ：セリン、Ａ：アラニン）である。したがって、ｃＤＮＡ中に上記ＦＡＤ３の小胞体移行シグナルのアミノ酸配列に該当する塩基配列を有していることを確認すればよい。
【００３１】
次に、３つのヒスチジンクラスターがあることを確認する。３つのヒスチジンクラスターは、「ＨＣＤＨ」、「ＨｘｘｘｘｘＨＲＴＨＨ」、「ＨＨｘｘｘｘＨＶＩＨＨ」（Ｈ：ヒスチジン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｒ：アルギニン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン、Ｉ：イソロイシン、Ｘ：アミノ酸）配列である。３つのヒスチジンクラスターの存在は、この配列と配列が存在する場所で特定することができる。ＦＡＤ３の３つのヒスチジンクラスターは、「ＨＣＤＨ」、「ＨＧＷＫＩＳＨＲＴＨＨ」、「ＨＨＤＩＧＴＨＶＩＨＨ」（Ｇ：グリシン、Ｗ：トリプトファン）である。したがって、ｃＤＮＡ中に上記ＦＡＤ３の３つヒスチジンクラスターのアミノ酸配列に該当する塩基配列を有していることを確認すればよい。
【００３２】
次に、推定された配列をもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、遺伝子ＦＡＤ３を得る。得られたアマ由来ｃＤＮＡの酵素活性を検討するため、公知の方法により酵母発現ベクターを構築し、酵母での酵素活性を確認する（Ｒｅｅｄ ＤＷ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｅｘｔｒａｐｌａｓｔｉｄｉａｌ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２２，ｐ．７１５−７２０（２０００））。非形質転換酵母と比較して、形質転換酵母においてα―リノレン酸（１８：３ｎ−３）の増加を確認して、得られたｃＤＮＡをアマ由来のＦＡＤ３とする。
【００３３】
哺乳動物（ヒト）のコドンの使用頻度と、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドン使用頻度を、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂｅｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を用いて比較する。その結果をもとに、ＦＡＤ３遺伝子の配列を設計する。たとえば、アルギニンは、ヒトではＣＧＣのコドンの使用頻度が高いが、アマ由来ＦＡＤ３では、ＣＧＣのコドンの使用頻度は低く、代わりにＡＧＡの使用頻度が高い。また、アスパラギンは、ヒトではＡＡＵの使用頻度が７８％を占めるが、アマ由来ＦＡＤ３では５４％とやや低くなる。ヒト化処理では、これらのコドン使用頻度を比較して、アマ由来ＦＡＤ３の使用するコドンを、ヒトのコドンに代えて、ヒト化ＦＡＤ３（ｈＦＡＤ３）遺伝子の配列を設計する。なお、コドンの変更は、必ず、ヒトのコドンの使用頻度に合わせる必要はない。コドンの使用頻度に近づければよい。また、遺伝子発現を効率化するために開始コドン付近にコザック配列を挿入してもよい。
【００３４】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３をヒト化処理した（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）ポリヌクレオチド（ｈＦＡＤ３）の一例を示す。
（塩基配列１）
【表１】
【００３５】
本発明では、前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子を使用することができる。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【００３６】
上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００３７】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．以後“モレキュラークローニング第２版”と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００３８】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３９】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００４０】
３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチドは、上記した３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルの確認方法と、真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性の発現を確認することにより行う。
【００４１】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作成］
本発明で用いる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、例えば以下のようにして作成する。
【００４２】
まず、上記で設計したｈＦＡＤ３から最適化遺伝子の塩基配列を設計する。具体的には、上記配列番号１の塩基配列の５’末端と３’末端には、ベクターに導入する際に用いる、制限酵素認識部位を設ける。例えば、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を設け、３’末端にＢａｍＨＩ認識部位を設けるなどである。また、効率的に翻訳を行うために、開始コドンの近傍に、リボソーム結合部位であるコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を挿入すると好ましい。
【００４３】
このようにして設計した最適化遺伝子の塩基配列から、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（２００２）と、Ｋｉｍら（１９９７）のＰＣＲ法を用いて、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子を作成する。図１は、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子の作成方法を説明する図である。
【００４４】
設計した鋳型ｈＦＡＤ３の塩基配列をもとに、７０〜９０塩基ずつのＰＣＲプライマーを設計する。これらのプライマーは、相互に補足するように１２〜２０塩基をオーバーラップさせる。表２には、このようにして設計した１０組２０個のＰＣＲプライマーの例を示す。
【表２】
【００４５】
次に、設計したプライマーを組み合わせて、ＰＣＲ法で、ｈＦＡＤ３遺伝子の合成を行う。上記の例では、Ｎｏ．１と２、Ｎｏ．３と４、Ｎｏ．５と６、Ｎｏ．７と８、Ｎｏ．９と１０、Ｎｏ．１１と１２、Ｎｏ．１３と１４、Ｎｏ．１５と１６、Ｎｏ．１７と１８、Ｎｏ．１９と２０とを組み合わせてＰＣＲを行う。各々のプライマーの組み合わせにおいて、事前にアニーリング温度の最適条件を求めておくと良い。
【００４６】
上記各々のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物を合わせて、Ｎｏ１と２０のプライマーを組み合わせてＰＣＲを行う。これにより、ｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物が得られる。
【００４７】
ｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物から、所望の大きさ（上記の例では、１．２ｋｂ）のＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は、公知のＤＮＡ抽出キットを用いればよい。抽出したＤＮＡは、エタノールを用いて沈殿させて回収する。沈殿したＤＮＡを、トリス塩酸バッファーを加えて溶解し、以下の操作に用いる。
【００４８】
得られたＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングにより、直接ベクターにクローニングする。ＰＣＲに用いるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは弱い末端転移酵素活性を持っており、ＰＣＲ反応によって合成された産物の末端にＡ（アデニン）を１塩基付加することができる。ＰＣＲ産物をプラスミドにクローニングする際、開環したプラスミドベクターの末端にＴ（チミン）を１塩基付加したものを用いると、ＡとＴが水素結合を作ることによって、平滑末端同士のライゲーションよりもクローニング効率が上がる。使用するベクターとしては、プロメガ社のｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙが挙げられる。このベクターでは挿入断片を制限酵素ＥｃｏＲＩに切り出すことが可能である。
【００４９】
クローニング産物を、選択培養用の大腸菌に入れて形質転換する。選択培地中で生育した大腸菌のコロニーを、液体培地中で増殖させる。増殖した大腸菌培養液を公知のアルカリプレップ法を用いて、大腸菌の細胞壁を分解し、プラスミドを回収する。
【００５０】
回収したプラスミドをポリエチレングリコールで沈殿させる。これをＰＣＲ法で増幅させる。必要に応じて、ＰＣＲ産物の一部を公知の方法で、ＤＮＡ塩基配列の分析をし、ｈＦＡＤ３の配列であることを確認する。
【００５１】
［組換え発現ベクター］
本発明の組換え発現ベクターは、上記脂肪酸不飽和化酵素を発現するためのベクターである。本発明の組換え発現ベクターは、非ヒト動物で脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現できるものであればよい。
【００５２】
本発明の発現ベクターとして用いられるベクターには、遺伝子操作技術において広く用いられているものが含まれ、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはレトロウイルスなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の組換え発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためのプロモーター領域を有する。プロモーター領域の下流に、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する。
【００５４】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を調節するプロモーターとしては、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、哺乳動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子（例、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存蛋白キナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドPコンポーネント、レニンなど。また、脂肪細胞特異的に発現するアディポサイトＰ２（ａＰ２）プロモーターや褐色脂肪細胞特異的に発現する脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＵＣＰ）プロモーターなど）のプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーターなどを用いることができる。ＣＡＧプロモーターは、哺乳動物細胞で最も強く発現するので、好ましい。
【００５５】
上記ベクターは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００５６】
本発明の組換え発現ベクターは、目的とする脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を同定するためのレポーター遺伝子を含んでいてもよい。レポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、青緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化青緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子などが好ましい。また、遺伝子導入するのではなく、胚の成育段階に応じて胚の表面に生じる表面抗原を利用してもよい。
【００５７】
特に、プロモーターとしてＣＡＧプロモーターを用いる場合は、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰを用いるとよい。ＥＧＦＰとは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子改変体で、紫外光で蛋白質を励起した際より強い蛍光を発する蛋白質である。この遺伝子はＣｌｏｎｔｅｃｈ社などから購入することができる。ＣＡＧプロモーターとともに導入された細胞でＥＧＦＰ遺伝子の発現が起こり、蛍光を発する細胞として、同定でき、遺伝子導入を確認できる。
【００５８】
ベクターへのレポーター遺伝子の導入は、公知の方法が利用できる。好ましくは、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）とともに、ＩＲＥＳの下流に導入するとよい。ＩＲＥＳを含むベクターは、同一のプロモーターから複数の遺伝子を共発現させることができる。したがって、本発明のベクターがＩＲＥＳを含んでいると、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とレポーター遺伝子とを共発現させることができるので、レポーター遺伝子の発現、すなわち発色を確認することで、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を同定することができる。
【００５９】
ＩＲＥＳを含むベクターとしては、市販のバイシストロン性ベクターを用いることもできる。
【００６０】
また、本発明のベクターには、導入遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子など）をさらに含むことが好ましい。これにより、適当な選択薬剤を使用することにより、目的遺伝子が導入されたベクターを選択的に回収できる。
【００６１】
［非ヒト動物］
本発明において脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入される非ヒト動物としては、魚類、鳥類、哺乳類など食用にできる非ヒト動物であればよい。高等動物は、ｎ−３系脂肪酸を産生していない。したがって、本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することで、ｎ−３系脂肪酸の合成ができる非ヒト動物を得ることができる。
【００６２】
使用できる魚類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する魚類であればよい。例えば、養殖の対象とされている魚類、筋肉組織等の可食部分において選択的に不飽和脂肪酸含量が高まる魚類や、子孫にまで安定的に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現する魚類等が好ましく、魚の種類としては硬骨魚類が好ましく、硬骨魚類の中でもで、Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Siluridae、Ictaluridaeに属する魚類が好ましい。具体的には、ブリ、マダイ、ヒラメ、トラフグ、ヒラマサ、クルマエビ、ニジマス、カンパチ、シマアジ、マハタ、クロマグロなどの養殖魚の他、コイ、ゼブラフィッシュ、アフリカナマズ、テラピア、タイセイヨウサケ、メダカなどを好適に例示することができる。
【００６３】
使用できる鳥類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する鳥類であればよい。具体的には、ニワトリ、ウズラ、ダチョウ、アイガモなどである。
【００６４】
使用できる哺乳類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する非ヒト哺乳類であればよい。例えば、ウシ、スイギュウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウシ、スイギュウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどのヒトが食用にできる非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくはウシである
【００６５】
本発明の組換え発現ベクターが導入される非ヒト動物細胞としては、上記非ヒト動物由来の細胞であれば、初期胚、体細胞、胚性幹細胞であってもよい。好ましくは、体細胞であり、さらに好ましくは筋衛星細胞である。筋衛星細胞は骨格筋内に通常、休止状態で存在する組織特異的幹細胞で、骨格筋の再生や肥大に中心的な役割を担うことが知られている（Ｓｅａｌｅ ａｎｄ Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ａ ｎｅｗ ｌｏｏｋ ａｔ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ “ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ” ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１８， １１５−１２４ （２０００））。また、適切な細胞外環境を整えることにより、骨、軟骨、心筋、脂肪細胞などの他の細胞群へも分化する性質を有する多能性幹細胞としても位置づけられている（Ａｓａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｍｙｏｇｅｎｉｃ，ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ，ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６８，ｐ．２４５−２５３（２００１））。
【００６６】
［非ヒト動物細胞への遺伝子導入］
本発明の組換え発現ベクターを導入する非ヒト動物細胞としては、非ヒト動物の体細胞から樹立した細胞を培養して用いる。体細胞の培養培地、培養条件は、公知の方法を用いる。
【００６７】
上記培養した体細胞培養細胞の培地中に、遺伝子導入試薬と組換え発現ベクターとを加え、所定期間培養して、体細胞培養細胞中に遺伝子を導入する。
【００６８】
上記遺伝子導入細胞をさらに培地中で培養を続け、細胞数を増加させる。その後、遺伝子導入細胞を、抗生物質などの選択薬剤を添加した培地中で選択培養する。選択培地中で生存した細胞について、顕微鏡下観察し、蛍光が認められたものを、クローニングリングにより単離し、通常の培地中で継代培養する。所定期間培養を続けた後にも、安定して蛍光が観察されたものを、遺伝子導入細胞とする。
【００６９】
本発明の非ヒト動物細胞では、この遺伝子導入細胞の一部を脂肪細胞に分化させて、脂肪酸組成を分析することにより、遺伝子導入細胞のα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸の合成能を、事前に評価することができる。
【００７０】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物］
（クローン胚の作成）
クローン胚のもとになるレシピエント卵子としては、成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、屠場由来の卵巣から採取した卵子や生体の卵巣から経膣的に採取した卵子を体外成熟させたもののほか、プロスタグランジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子であっても使用できる。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００７１】
上記レシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンB処理を施した卵子を使用するのが好ましい。より具体的には、体外成熟卵子等のレシピエント卵子をホールディングピペットで保定し、微細なガラス針によりその透明帯を迅速・的確に切開したのち、サイトカラシンBを含有する培地でそれらのレシピエント卵子を処理し、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移して、除核用ピペットあるいは除核用ガラス針により第一極体の付近の細胞質を極体ごと吸引又は押し出して行う。なお、それらの極体を含む細胞質を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンBを除去することが好ましい。
【００７２】
ドナー細胞としては、上記遺伝子導入細胞を培養したものを用いる。また、ドナー細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0／Ｇ1期に同調させた体細胞が好ましい。なお、細胞周期Ｇ0／Ｇ1期に同調させた体細胞は、例えば一定期間培養し続けコンフルエントな状態まで培養するあるいは、培養液中の血清濃度を極端に低下させた培養液に交換し血清飢餓状態で培養することにより得ることができる。
【００７３】
体細胞クローン胚は、定法に従って、例えば、ドナー細胞を細胞導入用ピペットに吸い込み、このピペットの先端を除核されたレシピエント卵子の囲卵腔に差し込んでドナー細胞を注入したのち、細胞融合装置による電気融合処理、カルシウムショックによる活性化処理を行うことにより作製される。
【００７４】
上記クローン胚を、所定の培養培地を用いて、体外培養する。クローン胚の卵割、胚盤胞期胚への発生を観察し、卵割しない胚、胚盤胞期胚へ発生しない胚を除く。次に、これらの胚において、リポーター遺伝子の発生を、蛍光により観察する。蛍光が認められるクローン胚を選択して、仮母の子宮内に移植することで、哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく合成できる非ヒト動物を得ることができる。
【００７５】
本発明では、ベクター中に、蛍光により、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を確認できるリポーター遺伝子を含む。このため、ベクターを非ヒト動物細胞に導入した状態と、クローン胚を作成した状態において、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を容易に確認できる。
【００７６】
また、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を確認した非ヒト動物細胞を脂肪細胞に分化させることができる。これにより、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物細胞のα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸の合成能をあらかじめ評価することができる。
【００７７】
すなわち、本発明の組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を用いれば、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸の合成能の高い非ヒト動物を容易に得ることができる。
【実施例】
【００７８】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げて説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７９】
［ｈＦＡＤ３遺伝子］
ベニバナアマ（Ｌｉｎｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）の幼若種子から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。縮重ポリメレースチェーン反応（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ）法と、ＲＡＣＥ法とを用いて、ＦＡＤ３ ｃＤＮＡの配列を調べた。推定された配列をもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、全長のｃＤＮＡを得た。このアマ由来のｃＤＮＡは、既知の植物のＦＡＤ３との相同性が高く、ＦＡＤ３の特徴を有していた。このｃＤＮＡの酵素活性を、酵母を用いて検討したところ、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が増加したことから、このｃＤＮＡを遺伝子ＦＡＤ３とした。
【００８０】
（ヒト化脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の設計）
哺乳動物（ヒト）のコドンの使用頻度と、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドン使用頻度を、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂｅｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を用いて比較した。その結果をもとに、ＦＡＤ３遺伝子の配列を設計した。結果を表３に示す。表３は、アミノ酸：Ａｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｙｓ（リシン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖａｌ（バリン）における哺乳動物（ヒト）のコドンの使用頻度と、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドン使用頻度と、本実施例で設計した遺伝子ｈＦＡＤ３におけるコドン使用頻度を示している。Ａｌａ（アラニン）に基づいて説明すると、Ａｌａには、「ＧＣＵ」、「ＧＣＣ」、「ＧＣＡ」、「ＧＣＣ」という４個のコドンが存在する。ヒトのコドンでは、「ＧＣＵ」は１７％、「ＧＣＣ」は５３％、「ＧＣＡ」は１３％、「ＧＣＣ」は１４％使用されている。一方、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドンでは、「ＧＣＵ」は２８％、「ＧＣＣ」は４８％、「ＧＣＡ」は１７％、「ＧＣＣ」は７％使用されている。この結果に基づいて、設計する遺伝子ｈＦＡＤ３においては、ヒトのコドンに近づけるように、「ＧＣＵ」を１７％、「ＧＣＣ」を５２％、「ＧＣＡ」を１４％、「ＧＣＣ」を１７％使用することとしたものである。他のアミノ酸に基づく、コドンについても同様にした。なお、表中、ｈＦＡＤ３で空欄になっているものは、使用頻度を変更しなかったものを意味する。
【表３】
【００８１】
上記設計されたヒト化脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ｈＦＡＤ３）の塩基配列は、表１に示す。
【００８２】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作成］
次に、上記配列番号１の塩基配列の５’末端と３’末端には、ベクターに導入する際に用いる、制限酵素認識部位として、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を設け、３’末端にＢａｍＨＩ認識部位を設けた。また、効率的に翻訳を行うために、開始コドンの近傍に、リボソーム結合部位であるコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を挿入した。
【００８３】
このようにして設計した最適化遺伝子の塩基配列から、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｂｉａｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２６，ｐ．９６−１０５（２００２））と、Ｋｉｍら（Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ （ＥＰＯ） ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ １９９， ｐ．２９３−３０１（１９９７））のＰＣＲ法を用いて、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子を作成した。
【００８４】
表１に示す、設計した鋳型ｈＦＡＤ３の塩基配列をもとに、７０〜９０塩基ずつのＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは、相互に補足するように１２〜２０塩基をオーバーラップさせた。
【００８５】
（各プライマーセットにおけるＰＣＲ条件の検討）
表２に示す、Ｎｏ．１と２、Ｎｏ．３と４、Ｎｏ．５と６、Ｎｏ．７と８、Ｎｏ．９と１０、Ｎｏ．１１と１２、Ｎｏ．１３と１４、Ｎｏ．１５と１６、Ｎｏ．１７と１８、Ｎｏ．１９と２０の組み合わせ１０サンプルについて、ＰＣＲ条件の検討を、以下のように行った。
【００８６】
アマ由来ＦＡＤ３ ｃＤＮＡ４００ｎｇを鋳型とし、４μｌ １０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、３．２μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．２μｌ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、０．５ｐｍｏｌ／μｌ 各プライマーセットを合わせて、全量を４０μｌとした。これを１０μｌずつ、４本のＰＣＲチューブに分注した。アニーリング温度を、それぞれ５５℃、５８℃、６０℃、６３℃に設定して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、以下のとおりである。まず、９４℃で１０分間反応させた後、９４℃で３０秒、アニーリング３０秒、７２℃で１分を、３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を、４％アガロース／ＴＡＥ（トリス酢酸緩衝液）を用い、１×ＴＡＥ中で２５分間電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターで、ＤＮＡの泳動パターンを観察した。泳導パターンがより明確なバンドを示したサンプルにおける、アニーリング温度を、最適のアニーリング温度とした。各プライマーセットにおける最適のアニーリング温度を表４に示す。
【表４】
【００８７】
次に、設計したプライマーを組み合わせて、ＰＣＲ法で、ｈＦＡＤ３遺伝子の合成を行った。Ｎｏ．１と２、Ｎｏ．３と４、Ｎｏ．５と６、Ｎｏ．７と８、Ｎｏ．９と１０、Ｎｏ．１１と１２、Ｎｏ．１３と１４、Ｎｏ．１５と１６、Ｎｏ．１７と１８、Ｎｏ．１９と２０とを組み合わせてＰＣＲを行った。アマ由来ＦＡＤ３ ｃＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、１μｌ １０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、０．８μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．０５μｌ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、０．５ｐｍｏｌ／μｌ 各プライマーセットを合わせて、全量を１０μｌとした。これらを、９４℃で１０分間反応させた後、９４℃で３０秒、最適のアニーリング温度で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００８８】
上記ＰＣＲ反応後のそれぞれのＰＣＲ産物 ３．５μｌに、５μｌ １０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、４μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．２５μｌ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、２．５μｌのＮｏ．１とＮｏ．２０のプライマーを加え、全量を５０μｌとした。これを、９４℃で１０分間反応させた後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。これにより、ｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物を得た。
【００８９】
（ＰＣＲ産物のサブクローニング）
上記得られたｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物から、１．２ｋｂのＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（ＧＦＸ（登録商標） ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、 ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて回収した。抽出したＤＮＡは、エタノールを用いて沈殿させて回収した。沈殿したＤＮＡを、トリス塩酸バッファーを加えて溶解し、以下の操作に用いた。
【００９０】
得られた１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２（タカラバイオ（株）製）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクター（プロメガ社製）へ、ＴＡクローニングした。
【００９１】
クローニング産物を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（タカラバイオ（株）製）に入れて形質転換した。この形質転換した大腸菌を抗生物質カルベニシリン（和光純薬（株）製）を用いて、ＬＢプレート（ナカライテスク製）で選択培養した。生育したコロニーをＬＢ／Ｃａｒ（カルベニシリン）培地で、３７℃、一晩振とう培養した。増殖した大腸菌をアルカリプレップ法を用いて、大腸菌の細胞壁を分解し、プラスミドを回収した。
【００９２】
（取得クローンの塩基配列解析）
回収したプラスミドをポリエチレングリコールで沈殿させた後、ＤＮＡの濃度測定をした。得られたＤＮＡ ２００ｎｇに、０．８μｌの２．０μＭ Ｍ１３ プライマー（終濃度１．６μＭ）、０．５μｌ Ｂｉｇ ｄｙｅ ｐｒｅｍｉｘ（アプライド バイオシステムズ製）、１．５μｌ ５×ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（アプライド バイオシステムズ製）を加え、滅菌水で１０μｌにした。この液を、９６℃で１分の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を２５サイクルの条件で、ＰＣＲ法を行った。反応後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、乾燥させた。乾燥させて得たペレットに、１５μｌ Ｈｉ−Ｄｉ ホルムアミド（アプライド バイオシステムズ製）を加えた。ペレットを溶解させ、攪拌した後、９５℃で３分間変性処理をした。その後、氷上で急冷し、３１７０ ＤＮＡ アナライザー（アプライド バイオシステムズ製）により、塩基配列を調べた。得られた塩基配列は、設計したｈＦＡＤ３の塩基配列と同じであることを確認した。
【００９３】
［組換え発現ベクターの作成］
ネオマイシン耐性遺伝子を有するｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰベクター（タカラバイオ（株）製）を、ＮｏｔＩ（タカラバイオ（株）製）で消化した。この末端をＴａｋａｒａ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）製）で平滑化し、ＮｏｔＩサイトを除去した。このベクターのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩサイトを消化し、脱リン酸化処理を行った。
【００９４】
上記ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクター（プロメガ社製）にクローニングされたｈＦＡＤ３配列をＥｃｏＲＩで消化して切り出した。この切り出したｈＦＡＤ３配列を、上記ｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰベクターの脱リン酸化処理を行ったＥｃｏＲＩサイトに連結し、ｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ−ｈＦＡＤ３とした。
【００９５】
次に、ｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ−ｈＦＡＤ３ベクターを、ＡｓｅＩ、ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ（株）製）で消化し、ＣＭＶプロモーター配列を除去した。この部分に、両端にＢｇｌＩＩに結合できる配列を持ち、内側にＮｏｔＩサイトを配した合成ポリヌクレオチドを挿入した。次に、このベクターを、ＳａｃＩ（タカラバイオ（株）製）で消化した。この部分に、両端にＳａｃＩ配列結合を持ち、内側にＭｌｕＩ配列を持つ、合成ポリヌクレオチドを挿入した。
【００９６】
次に、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）にサブクローニングされた、ＣＡＧプロモーターを、ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩ（タカラバイオ（株）製）で消化し、切り出した。切り出されたＣＡＧプロモーターを、上記ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩで消化したｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ−ｈＦＡＤ３ベクターに組み込んだ。これを、ｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）とした。構成したｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を図２に示す。
【００９７】
上記構築したベクターを大腸菌に形質転換して大量培養した。培養した大腸菌を、アルカリプレップ法により、プラスミドを回収した。回収したプラスミドを、終濃度が５μｇ／μｌとなるように、精製ＰＢＳ（ギブコ社（製））で溶解した。
【００９８】
［ウシ筋衛星細胞への遺伝子導入および導入細胞の単離］
（ウシ筋衛星細胞株の樹立と培養）
ウシ筋衛星細胞は、２週齢雌ウシの胸腺付近の筋組織より樹立した。培地には、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）−２／ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、アップステート製）および２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したＤＭＥＭ培地（ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）を用いた。まず、ウシより得た筋組織を細切してトリプシン処理した。この後、５００ｇで４分間の遠心分離を３回繰り返し、そのつど上清を回収、事前播種した。２時間後浮遊細胞を回収し、この浮遊細胞を、コラーゲン（高研製）でコートしたディッシュに播種した。播種２４時間後に培地を交換し、得られた細胞の培養を行った。これらの細胞は継代培養した後に、以下の実験に用いた。
【００９９】
（ウシ筋衛星細胞への遺伝子導入）
上記細胞株を樹立したウシ筋衛星細胞を、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭを入れた４ウェル ディッシュに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２、飽和湿度で２４時間培養した。その後、培地を交換した（１５０μｌ／ウェル）。次に、１．５ｍｌの試験管に無血清の１００μｌ ＤＭＥＭと３μｌの遺伝子導入試薬（Ｇｅｎｅ Ｊａｍｍｅｒ（登録商標）トランスフェクション試薬）を加え、１０分間室温で静置した。そこに、１μｇ／μｌに調整したｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を１μｌ加え、１０分間室温で静置した。上記筋衛星細胞を入れた培養液に、この遺伝子導入試薬と導入遺伝子の混合液を１００μｌ加え、３７℃、５％ ＣＯ２、飽和湿度で３時間培養した。その後、４００μｌのｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭを加え、３７℃、５％ ＣＯ２、飽和湿度で２４時間培養した。
【０１００】
（選択培養と遺伝子導入細胞の獲得）
遺伝子を導入したウシ筋衛星細胞を培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で細胞数が５倍になるよう継代し、２４時間培養した。その後、５００μｇ／ｍｌ アミノグリコシド系抗生物質であるＧ４１８添加、ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭを培地として選択培養を行った。選択培養は、９日間行い、培養液は３日ごとに交換した。９日間培養を行うとほとんどの細胞は死滅したが、一部の細胞は生存し、コロニー状に増殖していた。増殖した細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。ＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群をクローニングリングを用いて単離した。単離した遺伝子導入細胞を培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で継代培養した（細胞群ａ〜ｅ）。４代以上継代培養した後、再び蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰ蛍光を観察した。安定してＥＧＦＰ蛍光が観察された細胞を、遺伝子導入細胞とした（細胞群ｂ〜ｄ）。図３は、選択培養した後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）と、継代培養後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）とを示すグラフである。このグラフから、細胞群ｂ、ｃ、ｄは、安定してＥＧＦＰ蛍光が観察される（９２．０→９０．３、９８．１→１００．０、１００．０→１００．０）ことがわかる。細胞群ａ、ｅは、ＥＧＦＰ蛍光が安定していない（９４．７→８５．９、７４．０→２６．７）ことがわかる。また、細胞群aは他の細胞群と比較して蛍光強度が極端に低かった。以下の実験では、細胞群ｂ、ｃ、ｄを用いた。
【０１０１】
（脂肪細胞への分化能力の検討）
細胞群ｂ、ｃ、ｄの各細胞における、脂質を蓄積する能力を検討した。まず、１μＭ デキサメタゾン（シグマ社製）、２ｍＭ オクタン酸（シグマ社製）を添加したｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（分化誘導培地）を用いて、細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞を、脂肪細胞へ分化誘導した。脂肪細胞への分化は、具体的には以下のようにして行った。ｈＦＡＤ３導入ウシ筋衛星細胞を、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で７０％集密になるまで培養した。その後、この分化誘導培地を用いて９日間培養し、多胞性の脂肪細胞へ分化誘導した。培地は３日おきに交換した。分化誘導した後、Ｏｉｌ Ｒｅｄ ０により脂質を染色した。これを、ＮＩＨｉｍａｇｅ（ｖｅｒ。１．６２、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／、１９９９）で、染色された面積を測定して、蓄積された脂質量を定量した。結果を図４に示す。図４は、非遺伝子導入細胞と、細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞における脂質の蓄積を調べた結果を示すグラフである。各棒の上に記載されている「ａ」「ｂ」は、異なる文字間で有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。細胞群ｂおよびｄは、非遺伝子導入細胞と脂質量が同様であった（ｐ＜０．０５）が、細胞群ｃの脂質蓄積量は、非遺伝子導入細胞と比べ少なかった（ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
［染色体検査］
７０％集密になるまで培養した遺伝子導入細胞である細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞を、０．０２μｇ／ｍｌ デメコルシン（シグマ社製）を加えた培地で３時間培養し、デメコルシン処理を行った。その後、酢酸メタノールで３０分間固定し、スライドグラスに滴下した。これを、ギムザ染色し、カバーグラスをかぶせマニキュアで封入して染色体標本を作成した。対照区として遺伝子が導入されていない細胞についても、同様に行った。倒立顕微鏡下１０００倍で、５０個の細胞について１個あたりの染色体を調べた。結果を表５に示す。図５は、ｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）が導入されたウシ筋衛星細胞において染色体数が正常な細胞の割合を示す表である。
【表５】
【０１０３】
表５から、細胞株ｃ、ｄにおける正常細胞（染色体数６０）の割合は、対照区の遺伝子導入細胞と同等であった（ｐ＜０．０１）。一方、細胞群ｂでは、正常な染色体数を有する細胞の割合は、２６％と小さかった（ｐ＜０．０１）。以下の実験では、細胞群ｃ、ｄの遺伝子導入細胞を用いて行った。
【０１０４】
［遺伝子導入細胞におけるｈＦＡＤ３遺伝子の発現］
ｈＦＡＤ３遺伝子の下流には、ＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子が連結されているので、染色体数が正常な細胞群ｃ、ｄのｈＦＡＤ３遺伝子の発現を、ＥＧＦＰ蛍光量として定量した。
【０１０５】
分化誘導前の遺伝子導入細胞は、１０μＭ リノール酸ナトリウムを添加した、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で、９日間培養し、１００倍の倍率で明視野とＵＶ照射下で、それぞれ撮影を行った。培地は、３日おきに交換した。
【０１０６】
分化誘導後の遺伝子導入細胞は、１μＭ デキサメタゾン、２ｍＭ オクタン酸、および１０μＭ リノール酸ナトリウムを添加した、ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（分化誘導培地）中で、９日間培養し、分化誘導していない細胞と同条件で写真の撮影を行った。培地は、３日おきに交換した。
【０１０７】
撮影後、画像解析ソフト・アクアコスモス（浜松フォトニクス（株）製）を用いて、取得した画像フィルムの蛍光部分のピクセル数を計測することで、細胞の蛍光強度を測定した。結果を、図５、６に示す。図５は、非遺伝子導入細胞と、細胞群ｃ、ｄの分化誘導前と分化誘導後の、透過光像と、ＥＧＦＰ蛍光像である。また、図６は、細胞群ｃ、ｄの分化誘導前と分化誘導後の傾向強度の変化を示すグラフである。
【０１０８】
図５から、筋衛星細胞では、分化誘導により脂肪細胞に分化し、脂肪が蓄積されることがわかる。非遺伝子導入細胞からは、分化誘導後の脂肪細胞においても蛍光が発生していないことがわかった。また、遺伝子を導入した細胞群からは、透過光像で認められた分化誘導後の脂肪細胞から、ＥＧＦＰ蛍光が認められた。図６：分化誘導前の細胞であるｃ「−」、ｄ「−」から、分化誘導前の細胞では、細胞群ｃ、ｄの細胞とも遺伝子発現量は低いことがわかった。一方、図６：分化誘導後の細胞であるｃ「＋」、ｄ「＋」から、分化誘導して、脂肪滴を蓄積した脂肪細胞では、細胞群ｃ、ｄの細胞とも、ＥＧＦＰ蛍光量は多かった（ｐ＜０．０５）。また、細胞群ｄは、細胞群ｃより、ＥＧＦＰの発現は多かった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
［遺伝子導入細胞の脂肪酸組成解析］
（分化誘導を行う前の遺伝子導入細胞の脂肪酸解析）
ｈＦＡＤ３遺伝子を導入したウシ筋衛星細胞を１０μＭリノール酸ナトリウムを添加した、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で９日間培養した。培地は、３日おきに交換した。培養後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）で３回洗浄し、培地を除去した。次に、０．５％ ２，６−ジ−ターシャルブチル−４−メチル−フェノール（ＢＨＴ）を添加したメタノール（ナカライテスク製）を１０ｍｌ加え、セルスクレーパー（旭テクノグラス製）を用いて、細胞ごと掻き採ることで、全脂質を抽出した。細胞の脂質は、プラスチックシャーレ（直径１００ｍｍ、ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー製）１０枚を１サンプルとして、０．５％ ＢＨＴ添加メタノールごとガラス試験管（１７ｍｌ）に移した。これら脂質の脂肪酸は、カラムＤＢ−２３（φ０．２５ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗ サイエンテフィック製）を用いてガスクロマトグラフィ（ＧＣ−１７００、島津製作所（株）製）を用いて分析した（検出器：ＦＩＤ、温度：試料注入口 ２５０℃、検出器：２５０℃、カラム：５０℃で１分間保持し、１分間につき１０℃、１７０℃まで昇温させた。１７０℃に達した後、１分間につき１．２℃、２１０℃まで昇温させた。試料導入系：スプリットレス、ガス流量：ヘリウム（キャリヤーガス）１．５ｍｌ／分、ヘリウム（メイクアップガス）８０ｋＰａ、ガス圧力：水素６０ｋＰａ、空気 ５０ｋＰａ（ＡＯＣＳ ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ １ｂ−８９（２００５）に準じた。））。脂質の分析は、遺伝子非導入細胞と、細胞群ｃ、ｄの細胞について、分化誘導前と分化誘導後の細胞で行った。結果を、表６、７に示す。表６は、分化誘導前の細胞の脂質の分析結果であり、表７は、分化誘導後の細胞の脂質の分析結果である。表中、脂肪酸組成で、「：」の前に記載されている数字は、脂肪酸の炭素数を、「：」の後に記載されている数字は、二重結合の数を、（ｎ−）の後に記載されている数字は、多価不飽和脂肪酸の炭素鎖のメチル基から数えて最初の二重結合が存在する位置を示す。「↑」は、コントロール（遺伝子非導入細胞）と細胞群ｃまたはｄの細胞間で脂肪酸が有意に上昇しているものを、「↓」は、コントロール（遺伝子非導入細胞）と細胞群ｃまたはｄの細胞間で脂肪酸が有意に減少しているものを示した。
【０１１０】
脂肪酸組成は、遺伝子導入細胞の脂肪細胞への分化実験を３回反復した。各区で抽出した全脂質の脂肪酸組成比を分散分析法及びＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤテストによる多重比較検定を行った。有意差水準は、ｐ＜０．０５とした。
【表６】
【表７】
【０１１１】
表６から、分化誘導前の筋衛星細胞では、細胞群ｃ、ｄの細胞ともに、遺伝子非導入細胞と比べて、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）をはじめとするｎ−３系脂肪酸脂肪酸などの脂肪酸組成に変化は認められなかったことがわかる（ｐ＜０．０５）。
【０１１２】
表７から、分化誘導後の細胞では、ｈＦＡＤ３が低発現の細胞群ｃの細胞では、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が０．３０％と、対照区の遺伝子非導入細胞０．０３％に対し、有意に増加していたことがわかる（ｐ＜０．０５）。ＦＡＤ３の基質であるリノール酸（１８：２ｎ−６）は９．３７％と、対照区の遺伝子非導入細胞１２．４％に対し、有意に減少していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸のドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）は、５．８０％と、対照区の遺伝子非導入細胞４．２７％に対し、１．５％増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸の総計では、１１．５％と、対照区の遺伝子非導入細胞９．１％に対し、約２．４％増加していた（ｐ＜０．０５）。
【０１１３】
分化誘導後の細胞では、ｈＦＡＤ３が強発現の細胞群ｄの細胞でも、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が０．２７％と、対照区の遺伝子非導入細胞０．０３％に対し、有意に増加していた（ｐ＜０．０５）。ＦＡＤ３の基質であるリノール酸（１８：２ｎ−６）は、９．４０％と、対照区の遺伝子非導入細胞１２．４％に対し、３％と、大いに減少していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸のドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）は、５．３０％と、対照区の遺伝子非導入細胞４．２７％に対し、約１％増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：５ｎ−３）は、６．４０％と、対照区の遺伝子非導入細胞３．５７％に対し、約２．８％と大いに増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸の総計では、１２．５％と、対照区の遺伝子非導入細胞９．１％に対し、約２．４％増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−６系の脂肪酸の総計では、１９．２３％と、対照区の遺伝子非導入細胞２３．９％に対し、約４．７％も減少していた（ｐ＜０．０５）。
【０１１４】
また、（ｎ−６）系の脂肪酸／（ｎ−３）系の脂肪酸の割合は、細胞群ｃの細胞では、２．１０、細胞群ｄの細胞では、１．５７と、対照区の非遺伝子導入細胞の２．６３に比べ有意に減少していることがわかった（ｐ＜０．０５）。
【０１１５】
以上から、分化誘導した本発明の遺伝子導入細胞では、（ｎ−６）系の脂肪酸から（ｎ−３）系の脂肪酸への変化が進行していることがわかった。
【０１１６】
［遺伝子導入細胞をドナー細胞に用いたクローン胚の作製］
（ドナー細胞の調整）
遺伝子を導入した細胞群ｃ、ｄの細胞を集密になるまで培養した。その後、細胞の増殖を停止させて、Ｇ０／Ｇ１期に細胞周期を同調させた。培養後、細胞ｃ、ｄの細胞を回収し、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭで洗浄し、核移植に用いた。また、コントロールとして、遺伝子非導入筋衛星細胞を、同様に培養、回収して用いた。
【０１１７】
（ウシ卵子の体外熟成）
大阪市食肉衛生検査所において、ウシ屠体より採取されたウシの卵巣を用いた。卵巣から２１Ｇの注射針（テルモ社製）と１０ｍｌのシリンジ（テルモ社製）を用いて、ウシ卵子を卵胞液とともに吸引し回収した。卵胞より回収した卵胞液から、実体顕微鏡下で２〜４重層の卵丘細胞が付着した卵丘細胞卵子複合体のみを選別して回収した。その後、洗浄用成熟培養ドロップに、２０個ずつ移し、洗浄した。次に、成熟培養ドロップに１０個ずつ移動させ、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度の炭酸ガスインキュベーター内で２１時間培養した。
【０１１８】
（ウシ卵子の裸化）
２１時間成熟培養した卵丘細胞卵子複合体を、０．５％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および２．５ｍｌ／ｍｌゲンタマイシン溶液を添加した２５ｍＭ ヘペス緩衝ＴＣＭ−１９９（ギブコ社製）に、０．２５％ ヒアルロニダーゼを加えた培地（１９９Ｈ＋５％ ＮＢＣＳ＋０．２５％ ヒアルロニダーゼ）に移し、５分間静置した。静置後、ピペッティングにより、卵丘細胞卵子複合体を完全に取り除いた。
【０１１９】
（除核）
倒立顕微鏡下において、第１極体を放出し、第二減数分裂中期（ＭｅｔａｐｈａｓｅＩＩ期）に達し、成熟していると思われる正常な卵子を選別した。この卵子の第１極体付近の透明帯を透明帯カット用ニードルで切開した。透明帯を切開した卵子を除核用培地（１９９Ｈ＋５％ ＮＢＣＳ＋５μｇ／ｍｌ サイトカラシンＢ）に入れ、１５分間静置した。静置後、除核用スティックで卵子を上から押さえつけ、第一極体及びその周辺卵細胞質を切開部位から２〜３割ほど押し出した。この卵子を、（１９９（Ｅａ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地に移し、ピペッティングにより卵子と押し出した卵細胞質に切り離した。切り離した卵細胞質のみを１２μｇ／ｍｌ ヘキストＮｏ．３３３４２添加１９９（Ｅａ）に移し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度で、３０分間培養し、染色した。倒立顕微鏡下でＵＶ照射により、核の確認を行った。核が確認できた卵細胞質に対応した卵子のみをレシピエント卵子として用いた。
【０１２０】
（細胞の導入）
除核した卵子を１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に、上記ドナー細胞をＰＶＰ（ポリビニルピロリドン Ｋ−９０（ナカライ社製））に移した。細胞導入用ピペットにドナー細胞を５〜１０個吸引した後、除核卵子の透明帯切開部位から囲卵腔内にドナー細胞を１個ずつ導入した。細胞導入したウシ卵子を、１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に移した。
【０１２１】
（電気融合）
電気融合には、ＥＣＭ２００（ＢＴＸ社製）に接続した微小電極（ユニークメディカ イマダ 製）を用いた。除核卵子を、１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に移し、ミネラルオイルを洗い流した。この除核卵子を、新たに、１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に移し、（１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地＋細胞融合液混合液（１：１）、細胞融合液の順に移していった。卵子が底に沈んだ後、細胞融合液の楕円形のドロップを作製し、細胞導入した卵子をそこに移した。微小電極でウシ卵子細胞質および導入電極が一直線になるように挟み、交流２．７ｋＶ／ｃｍ・１０μ秒を２回印加し、電気パルスによって融合処理を行った。その後、電気融合処理卵を細胞融合液、細胞融合液＋（１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地混合液（１：１）、（１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地の順に移動させた。最後に、電気融合処理卵を、（１９９（Ｅａ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地で洗浄し、（１９９（Ｅａ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地のドロップへ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度で、３０分間培養した。培養後、実体顕微鏡下でドナー細胞と卵子細胞質との融合を確認した。
【０１２２】
（活性化処理）
電気融合処理後、遮光下でカルシウムイオノフォア活性化処理を行った。融合確認ができた再構築胚を、５μＭ Ｃａ２＋イオノマイシン培地に移し、５分間静置した。静置後、シクロへキシミド処理液をＣａ２＋イオノマイシン培地に加え、反応を停止させた。カルシウムイオノフォア処理後の再構築胚を、修正合成卵管液培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｖｉｄａｕｔａｌ Ｆｌｕｉｄ （ｍＳＯＦ）ｍｅｄｉｕｍ、合成卵管液培養液（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｖｉｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ， ＳＯＦＭ， Ｔｅｒｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９７２）に必須および非必須アミノ酸を添加して修正した培養液（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｆｉｒｓｔ， １９９２）からさらに無機リン酸塩を除いた培養液（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＯＦ ｍｅｄｉｕｍ，ｍＳＯＦＭ））＋１０μｇ／ｍｌ シクロへキシミド培地のドロップに移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度のインキュベーター内で６時間培養し、活性化を誘起した。
【０１２３】
（体外培養）
カルシウムイオノフォア−シクロへキシミド複合活性化処理の６時間後に、再構築胚をｍＳＯＦｍ培地に移し、洗浄した。洗浄後、ｍＳＯＦ培地のドロップに、１ドロップに付き２０〜４０個の再構築胚を移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度のインキュベーター内で１２０時間培養した。１２０時間培養後、再構築胚を、２０％ ＦＢＳ１９９＋ベータメルカプトエタノール（βＭＥ）培地に移し洗浄した。洗浄後、２０％ ＦＢＳ１９９＋βＭＥ培地のドロップに移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度のインキュベーター内で４８時間培養した。４８時間培養後、再構築胚の卵割率および胚盤胞期胚への発生率を検討した。また、胚盤胞期胚におけるＥＧＦＰ蛍光の観察、胚盤胞期胚の回収を行った。表８に、再構築胚の卵割率および胚盤胞期胚への発生率を示す。コントロールとして、遺伝子非導入細胞を用いたクローン胚（表中、「ｎｏｎＴＧ細胞」と記載）を用いた。表中、「卵割胚数」は、２、４、８細胞期の卵数を、％は培養した胚数に対する卵割した胚数の割合を示す。また、「胚盤胞期胚数」の％は、培養した胚数に対する胚盤胞期胚の割合を示す。
【表８】
【０１２４】
表８から、細胞群ｄの細胞を導入したクローン胚（表中、「ＴＧ細胞」と記載）の胚盤胞への発生率は２１％と、遺伝子非導入細胞を用いたクローン胚の３５％と比較してやや低かったが、有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１２５】
また、図７に示すように、胚盤胞胚期へ発現した遺伝子導入クローン胚の全ての胚で蛍光を確認した。
【０１２６】
［遺伝子導入細胞クローン胚における導入遺伝子の発現の検討］
活性化処理後１６８時間で胚盤胞排気まで発生した胚１０個を１サンプルとして回収した。このサンプルから、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、ＲＮＡ抽出を常法に従って行った。
【０１２７】
抽出したＲＮＡを用いて、ＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使って、ｃＤＮＡを合成した。
【０１２８】
得られたｃＤＮＡは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ（株）製）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、ｈＦＡＤのプライマーを用い、９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分３０秒、７２℃で１分３０秒を３５サイクルで行った。また、コントロールとしてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのプライマーを用いた。
【０１２９】
反応後、ＰＣＲ産物を、１．２％寒天／ＴＡＥを用い、１×ＴＡＥ中で２５分間電気泳動を行った。泳動後、エチレンブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターでＤＮＡの泳動パターンを観察した。結果を、図８に示す。図中、用いた胚の数は、非遺伝子導入細胞については、１：１０個、２：１０個、３：９個、遺伝子導入細胞では、１：１０個、２：６個、３：１０個であった。
【０１３０】
図８から、遺伝子導入株ｄを用いて作製したクローン胚では、ｈＦＡＤ３が発現していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子の作成方法を説明する図である。
【図２】図２は、構成したｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を示す図である。
【図３】図３は、選択培養した後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）と、継代培養後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）とを示すグラフである。
【図４】図４は、非遺伝子導入細胞と、細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞における脂質の蓄積を調べた結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を導入したウシ筋衛星細胞の分化誘導前と分化誘導後の透過光像および蛍光像である。
【図６】図６は、細胞群ｃ、ｄの分化誘導前と分化誘導後の傾向強度の変化を示すグラフである。
【図７】図７は、遺伝子導入細胞株ｄを用いたクローン胚の胚盤胞期胚の透過光像と、ＥＧＦＰ蛍光像を示す図である。
【図８】図８は、胚盤胞に発生したクローン胚を用いた、ＲＴ−ＰＣＲによる、ｈＦＡＤ３遺伝子の発現を確認した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト動物細胞に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪は、エネルギー源として非常に重要である。脂肪は、同時に、動物にとって正常な発育と機能維持に欠くことができない、不飽和脂肪酸（リノール酸（１８：２ｎ−６）、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）、およびアラキドン酸（２０：４ｎ−６））などの摂取源でもある。脂肪酸の合成では、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素により、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２ｎ−６）が合成され、さらに、ω３脂肪酸不飽和化酵素により、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が合成される。
【０００３】
ここで、多価不飽和脂肪酸は、生合成の経路別に、ｎ−３系、ｎ−６系、ｎ−９系などに分類される。ここで、「ｎ−」に続く数字３、６および９は、多価不飽和脂肪酸の炭素鎖のメチル基から数えて最初の二重結合が何番目の炭素にあるかを示す。例えば、「ｎ−３」系は、炭素数が１８個の脂肪酸のメチル基の炭素を１位の炭素とし、カルボキシル基側に向かって順次２位、３位・・・としたとき、メチル基から数えて最初の二重結合が３位の炭素にある多価不飽和脂肪酸を示す。「ｎ−３」系は、「ω３」系とも表示される。また、「ｎ−」の前に記載される数字は、一分子内に含まれる二重結合の数を示す。一方、「Δ」は、多価不飽和脂肪酸の炭素鎖のカルボキシル基から数えて最初の二重結合が何番目の炭素にあるかを示す。また、ω３脂肪酸不飽和化酵素、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素は、それぞれ、脂肪酸の炭素鎖のメチル基から数えて３位の位置に二重結合を作る酵素を、脂肪酸の炭素鎖のカルボキシル基から数えて１２位の位置に二重結合を作る酵素を、意味する。
【０００４】
しかし、哺乳動物などの高等動物では、上記の酵素を有さない。したがって、動物によれば、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２ｎ−６）の合成や、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成は行えないものもいる。
【０００５】
α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）からはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）が、ＥＰＡからはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）などが合成される。ＥＰＡやＤＨＡなどのｎ−３系多価不飽和脂肪酸は、アトピー性皮膚炎、血栓性疾患、ガン、冠動脈心疾患などに低減効果があることが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００６】
これらのｎ−３系多価不飽和脂肪酸は、魚類や海草類などの海産物に多く含まれている。したがって、海産物を経口摂取することが非常に重要である。しかし、牛や豚などの畜肉やパーム油などの植物油に代表される陸生生物由来食品を過剰に摂取し、海産物の摂食が不足している、現在の先進国の食生活では、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸は摂取されにくい。
【０００７】
このため、高等動物細胞が合成できない多価不飽和脂肪酸を高等動物細胞や高等動物中で合成しようとすることが試みられている。
【０００８】
本発明者らは、ブタに、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｎｃｅａ）根部由来のリノール酸（１８：２ｎ−６）を生成するΔ１２脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子である、ＦＡＤ２（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ２）を導入したものを提案した（例えば、特許文献１参照）。また、ＦＡＤ２が導入されたブタでは、リノール酸（１８：２ｎ−６）が新規に合成されることを証明した。
【０００９】
リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）を合成するω３脂肪酸不飽和化酵素については、例えば、植物等におけるω３脂肪酸不飽和化酵素の発現量や活性を、遺伝子操作等によって人為的に制御するための技術に使用できるω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子等が提供されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１０】
また、子嚢菌と脂質生成菌であるモルティエレラ・アルピナのΔ１２脂肪酸不飽和酵素と、子嚢菌のω３脂肪酸不飽和化酵素の推定アミノ酸配列を比較し、相同性の高いアミノ酸配列に対応するプライマーを設計し、これから、ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを得る技術が開示されている（例えば、特許文献３参照）。この文献中には、設計したプライマーから得られるポリヌクレオチドを含むベクターを動物に導入してよいことが記載されている。
【００１１】
また、アラキドン酸産生糸状菌であるモルティエレラ・アルピナのΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をマウスのＬ細胞に導入することで、哺乳動物細胞内でΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が機能することを証明している。また、リノール酸だけでなく、リノール酸以降のｎ−６系脂肪酸の増加も確認している。このことから、哺乳動物がもたないΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を哺乳動物細胞に導入でき、機能的に発現することが示されている（例えば、非特許文献３参照）。
【００１２】
線虫由来のω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子であるｆａｔ−１をマウスの乳腺で発現させ、乳中のｎ−３系脂肪酸の増加を確認しており、哺乳動物でω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が機能的に発現することが示されている。また、乳腺をターゲットにすることで乳の脂肪酸組成を改変できることを示し、授乳した仔マウスへの効果も確認されている（例えば、非特許文献４参照）。
【非特許文献１】Ｃｏｎｎｏｒ ＷＥ， Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ７１， １７１Ｓ−１７５Ｓ （２０００）．
【非特許文献２】Ｔｅｒｒｙ ＰＤ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔａｋｅｓ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｎｄ ｍａｒｉｎｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｎｄ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ７７，ｐ．５３２−５５４３ （２００３）．
【非特許文献３】Ｋｅｌｄｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１９，ｐ．７−１１（２００１）
【非特許文献４】Ｋａｏ ＢＴ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ｎ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ８９， ｐ．３１９５−３２０１（２００６）
【特許文献１】特開２００３−２４５０７０号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５８８
【特許文献３】特開２００６−５５１０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸が合成されれば、食肉等からｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく摂取することができる。しかし、いずれの文献においても、哺乳動物において、ω３脂肪酸不飽和化酵素が機能し、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸の合成されたことについては、開示されていない。非特許文献４の場合では、遺伝子改変マウスの作出効率が極めて低く、中性脂肪への影響も少なかった。
【００１４】
すなわち、本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく合成できる、組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成に対して酵素活性の高い脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を用いて、組換え発現ベクターとすることで、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸が多く合成される、組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を提供できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１６】
本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【００１７】
本発明の組換え発現ベクターは、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含有する。
【００１８】
上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子である。
【００１９】
上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子であるとよい。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２０】
上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ヒト化遺伝子であると好ましい。
【００２１】
上記組換え発現ベクターは、レポーター遺伝子、ＩＲＥＳ配列、および選択マーカー遺伝子を含むと、好ましい。
【００２２】
本発明の非ヒト動物細胞は、上記組換え発現ベクターを用いて、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されている。
【００２３】
本発明の非ヒト動物は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の組換え発現ベクターを用いて非ヒト動物を形質変換すれば、非ヒト動物内で、非ヒト動物に内在する脂肪酸を不飽和化する反応を触媒することができる。この結果、従来動物ではできなかった、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成を可能とする。
【００２５】
また、非ヒト動物内で、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）を基質とするｎ−３系多価不飽和脂肪酸が合成される。この結果、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸に富む食肉、乳製品などの畜産品の供給を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子］
本発明の組換え発現ベクターに用いられる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、α−リノレン酸の生成に関わるω３脂肪酸不飽和酵素をコードする遺伝子（例えば、ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ３、ＦＡＤ３など）である。ＦＡＤ３は、通常、植物、細菌、線虫などの下等動物に多く存在する遺伝子である。ＦＡＤ３は、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、大豆などから単離されている。本発明で用いることのできるＦＡＤ３は、ＦＡＤ３を有する植物から取得すればよく、その由来は問わない。好ましくは、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）の合成能力の高い植物のＦＡＤ３を用いればよい。例えば、アマ科の植物である。また、植物由来のＦＡＤ３以外に、線虫から単離されるｆａｔ−１を用いてもよい。
【００２８】
また、植物由来の遺伝子は、動物細胞内では発現されにくい場合がある。本発明で用いられる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をそのまま用いてもよく、この遺伝子をヒト化処理したものを用いてもよい（Ｋａｎｇ ＪＸ， ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ：ｆａｔ−１ ｍｉｃｅ ｃｏｎｖｅｒｔ ｎ−６ ｔｏ ｎ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ，４２７，ｐ．５０４（２００４）、Ｌａｉ Ｌ， ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｉｇｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｏｍｅｇａ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４，ｐ．１４７２−１４７３ （２００６））。ヒト化処理を行うと、遺伝子の発現効率を向上させることができる。本明細書中で、ヒト化処理とは、植物由来の遺伝子を、アミノ酸配列を変更することなく、哺乳動物でのコドン使用頻度に準じて、塩基配列の変更を行うことをいう。ヒト化処理は、例えば以下のように行う。以下の例では、アマ由来のＦＡＤ３を用いる。
【００２９】
アマ由来のＦＡＤ３は、以下のようにして得られる。ベニバナアマ（Ｌｉｎｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）の幼若種子から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。縮重ポリメレースチェーン反応（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ）法と、ＲＡＣＥ法とを用いて、ＦＡＤ３ ｃＤＮＡの配列を調べる。
【００３０】
植物の脂肪酸不飽和化酵素には、葉緑体で機能する型と小胞体膜上で機能する型がある。この植物の脂肪酸不飽和化酵素を動物で機能させるには、小胞体型の脂肪酸不飽和化酵素を用いる必要がある。小胞体型の脂肪酸不飽和化酵素は、細胞の小胞体膜に結合したタンパク質であり、３つのヒスチジンクラスターに鉄（Ｆｅ）原子が挟まれた活性中心を有する。得られたｃＤＮＡがＦＡＤ３遺伝子であるかどうかは、まず得られたｃＤＮＡに、小胞体移行シグナルを有していることを確認する。小胞体移行シグナルは、アミノ酸３’末端に「ＫＸＫＸＸ」（Ｋ：リシン、Ｘはアミノ酸）配列を有する。ＦＡＤ３の小胞体移行シグナルは、「ＫＳＫＳＡ」（Ｓ：セリン、Ａ：アラニン）である。したがって、ｃＤＮＡ中に上記ＦＡＤ３の小胞体移行シグナルのアミノ酸配列に該当する塩基配列を有していることを確認すればよい。
【００３１】
次に、３つのヒスチジンクラスターがあることを確認する。３つのヒスチジンクラスターは、「ＨＣＤＨ」、「ＨｘｘｘｘｘＨＲＴＨＨ」、「ＨＨｘｘｘｘＨＶＩＨＨ」（Ｈ：ヒスチジン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｒ：アルギニン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン、Ｉ：イソロイシン、Ｘ：アミノ酸）配列である。３つのヒスチジンクラスターの存在は、この配列と配列が存在する場所で特定することができる。ＦＡＤ３の３つのヒスチジンクラスターは、「ＨＣＤＨ」、「ＨＧＷＫＩＳＨＲＴＨＨ」、「ＨＨＤＩＧＴＨＶＩＨＨ」（Ｇ：グリシン、Ｗ：トリプトファン）である。したがって、ｃＤＮＡ中に上記ＦＡＤ３の３つヒスチジンクラスターのアミノ酸配列に該当する塩基配列を有していることを確認すればよい。
【００３２】
次に、推定された配列をもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、遺伝子ＦＡＤ３を得る。得られたアマ由来ｃＤＮＡの酵素活性を検討するため、公知の方法により酵母発現ベクターを構築し、酵母での酵素活性を確認する（Ｒｅｅｄ ＤＷ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｅｘｔｒａｐｌａｓｔｉｄｉａｌ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２２，ｐ．７１５−７２０（２０００））。非形質転換酵母と比較して、形質転換酵母においてα―リノレン酸（１８：３ｎ−３）の増加を確認して、得られたｃＤＮＡをアマ由来のＦＡＤ３とする。
【００３３】
哺乳動物（ヒト）のコドンの使用頻度と、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドン使用頻度を、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂｅｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を用いて比較する。その結果をもとに、ＦＡＤ３遺伝子の配列を設計する。たとえば、アルギニンは、ヒトではＣＧＣのコドンの使用頻度が高いが、アマ由来ＦＡＤ３では、ＣＧＣのコドンの使用頻度は低く、代わりにＡＧＡの使用頻度が高い。また、アスパラギンは、ヒトではＡＡＵの使用頻度が７８％を占めるが、アマ由来ＦＡＤ３では５４％とやや低くなる。ヒト化処理では、これらのコドン使用頻度を比較して、アマ由来ＦＡＤ３の使用するコドンを、ヒトのコドンに代えて、ヒト化ＦＡＤ３（ｈＦＡＤ３）遺伝子の配列を設計する。なお、コドンの変更は、必ず、ヒトのコドンの使用頻度に合わせる必要はない。コドンの使用頻度に近づければよい。また、遺伝子発現を効率化するために開始コドン付近にコザック配列を挿入してもよい。
【００３４】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３をヒト化処理した（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）ポリヌクレオチド（ｈＦＡＤ３）の一例を示す。
（塩基配列１）
【表１】
【００３５】
本発明では、前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子を使用することができる。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【００３６】
上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００３７】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．以後“モレキュラークローニング第２版”と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００３８】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３９】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００４０】
３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチドは、上記した３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルの確認方法と、真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性の発現を確認することにより行う。
【００４１】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作成］
本発明で用いる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、例えば以下のようにして作成する。
【００４２】
まず、上記で設計したｈＦＡＤ３から最適化遺伝子の塩基配列を設計する。具体的には、上記配列番号１の塩基配列の５’末端と３’末端には、ベクターに導入する際に用いる、制限酵素認識部位を設ける。例えば、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を設け、３’末端にＢａｍＨＩ認識部位を設けるなどである。また、効率的に翻訳を行うために、開始コドンの近傍に、リボソーム結合部位であるコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を挿入すると好ましい。
【００４３】
このようにして設計した最適化遺伝子の塩基配列から、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（２００２）と、Ｋｉｍら（１９９７）のＰＣＲ法を用いて、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子を作成する。図１は、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子の作成方法を説明する図である。
【００４４】
設計した鋳型ｈＦＡＤ３の塩基配列をもとに、７０〜９０塩基ずつのＰＣＲプライマーを設計する。これらのプライマーは、相互に補足するように１２〜２０塩基をオーバーラップさせる。表２には、このようにして設計した１０組２０個のＰＣＲプライマーの例を示す。
【表２】
【００４５】
次に、設計したプライマーを組み合わせて、ＰＣＲ法で、ｈＦＡＤ３遺伝子の合成を行う。上記の例では、Ｎｏ．１と２、Ｎｏ．３と４、Ｎｏ．５と６、Ｎｏ．７と８、Ｎｏ．９と１０、Ｎｏ．１１と１２、Ｎｏ．１３と１４、Ｎｏ．１５と１６、Ｎｏ．１７と１８、Ｎｏ．１９と２０とを組み合わせてＰＣＲを行う。各々のプライマーの組み合わせにおいて、事前にアニーリング温度の最適条件を求めておくと良い。
【００４６】
上記各々のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物を合わせて、Ｎｏ１と２０のプライマーを組み合わせてＰＣＲを行う。これにより、ｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物が得られる。
【００４７】
ｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物から、所望の大きさ（上記の例では、１．２ｋｂ）のＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は、公知のＤＮＡ抽出キットを用いればよい。抽出したＤＮＡは、エタノールを用いて沈殿させて回収する。沈殿したＤＮＡを、トリス塩酸バッファーを加えて溶解し、以下の操作に用いる。
【００４８】
得られたＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングにより、直接ベクターにクローニングする。ＰＣＲに用いるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは弱い末端転移酵素活性を持っており、ＰＣＲ反応によって合成された産物の末端にＡ（アデニン）を１塩基付加することができる。ＰＣＲ産物をプラスミドにクローニングする際、開環したプラスミドベクターの末端にＴ（チミン）を１塩基付加したものを用いると、ＡとＴが水素結合を作ることによって、平滑末端同士のライゲーションよりもクローニング効率が上がる。使用するベクターとしては、プロメガ社のｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙが挙げられる。このベクターでは挿入断片を制限酵素ＥｃｏＲＩに切り出すことが可能である。
【００４９】
クローニング産物を、選択培養用の大腸菌に入れて形質転換する。選択培地中で生育した大腸菌のコロニーを、液体培地中で増殖させる。増殖した大腸菌培養液を公知のアルカリプレップ法を用いて、大腸菌の細胞壁を分解し、プラスミドを回収する。
【００５０】
回収したプラスミドをポリエチレングリコールで沈殿させる。これをＰＣＲ法で増幅させる。必要に応じて、ＰＣＲ産物の一部を公知の方法で、ＤＮＡ塩基配列の分析をし、ｈＦＡＤ３の配列であることを確認する。
【００５１】
［組換え発現ベクター］
本発明の組換え発現ベクターは、上記脂肪酸不飽和化酵素を発現するためのベクターである。本発明の組換え発現ベクターは、非ヒト動物で脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現できるものであればよい。
【００５２】
本発明の発現ベクターとして用いられるベクターには、遺伝子操作技術において広く用いられているものが含まれ、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはレトロウイルスなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の組換え発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためのプロモーター領域を有する。プロモーター領域の下流に、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する。
【００５４】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を調節するプロモーターとしては、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、哺乳動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子（例、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存蛋白キナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドPコンポーネント、レニンなど。また、脂肪細胞特異的に発現するアディポサイトＰ２（ａＰ２）プロモーターや褐色脂肪細胞特異的に発現する脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＵＣＰ）プロモーターなど）のプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーターなどを用いることができる。ＣＡＧプロモーターは、哺乳動物細胞で最も強く発現するので、好ましい。
【００５５】
上記ベクターは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００５６】
本発明の組換え発現ベクターは、目的とする脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を同定するためのレポーター遺伝子を含んでいてもよい。レポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、青緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化青緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子などが好ましい。また、遺伝子導入するのではなく、胚の成育段階に応じて胚の表面に生じる表面抗原を利用してもよい。
【００５７】
特に、プロモーターとしてＣＡＧプロモーターを用いる場合は、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰを用いるとよい。ＥＧＦＰとは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子改変体で、紫外光で蛋白質を励起した際より強い蛍光を発する蛋白質である。この遺伝子はＣｌｏｎｔｅｃｈ社などから購入することができる。ＣＡＧプロモーターとともに導入された細胞でＥＧＦＰ遺伝子の発現が起こり、蛍光を発する細胞として、同定でき、遺伝子導入を確認できる。
【００５８】
ベクターへのレポーター遺伝子の導入は、公知の方法が利用できる。好ましくは、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）とともに、ＩＲＥＳの下流に導入するとよい。ＩＲＥＳを含むベクターは、同一のプロモーターから複数の遺伝子を共発現させることができる。したがって、本発明のベクターがＩＲＥＳを含んでいると、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とレポーター遺伝子とを共発現させることができるので、レポーター遺伝子の発現、すなわち発色を確認することで、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を同定することができる。
【００５９】
ＩＲＥＳを含むベクターとしては、市販のバイシストロン性ベクターを用いることもできる。
【００６０】
また、本発明のベクターには、導入遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子など）をさらに含むことが好ましい。これにより、適当な選択薬剤を使用することにより、目的遺伝子が導入されたベクターを選択的に回収できる。
【００６１】
［非ヒト動物］
本発明において脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入される非ヒト動物としては、魚類、鳥類、哺乳類など食用にできる非ヒト動物であればよい。高等動物は、ｎ−３系脂肪酸を産生していない。したがって、本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することで、ｎ−３系脂肪酸の合成ができる非ヒト動物を得ることができる。
【００６２】
使用できる魚類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する魚類であればよい。例えば、養殖の対象とされている魚類、筋肉組織等の可食部分において選択的に不飽和脂肪酸含量が高まる魚類や、子孫にまで安定的に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現する魚類等が好ましく、魚の種類としては硬骨魚類が好ましく、硬骨魚類の中でもで、Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Siluridae、Ictaluridaeに属する魚類が好ましい。具体的には、ブリ、マダイ、ヒラメ、トラフグ、ヒラマサ、クルマエビ、ニジマス、カンパチ、シマアジ、マハタ、クロマグロなどの養殖魚の他、コイ、ゼブラフィッシュ、アフリカナマズ、テラピア、タイセイヨウサケ、メダカなどを好適に例示することができる。
【００６３】
使用できる鳥類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する鳥類であればよい。具体的には、ニワトリ、ウズラ、ダチョウ、アイガモなどである。
【００６４】
使用できる哺乳類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する非ヒト哺乳類であればよい。例えば、ウシ、スイギュウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウシ、スイギュウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどのヒトが食用にできる非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくはウシである
【００６５】
本発明の組換え発現ベクターが導入される非ヒト動物細胞としては、上記非ヒト動物由来の細胞であれば、初期胚、体細胞、胚性幹細胞であってもよい。好ましくは、体細胞であり、さらに好ましくは筋衛星細胞である。筋衛星細胞は骨格筋内に通常、休止状態で存在する組織特異的幹細胞で、骨格筋の再生や肥大に中心的な役割を担うことが知られている（Ｓｅａｌｅ ａｎｄ Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ａ ｎｅｗ ｌｏｏｋ ａｔ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ “ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ” ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１８， １１５−１２４ （２０００））。また、適切な細胞外環境を整えることにより、骨、軟骨、心筋、脂肪細胞などの他の細胞群へも分化する性質を有する多能性幹細胞としても位置づけられている（Ａｓａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｍｙｏｇｅｎｉｃ，ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ，ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６８，ｐ．２４５−２５３（２００１））。
【００６６】
［非ヒト動物細胞への遺伝子導入］
本発明の組換え発現ベクターを導入する非ヒト動物細胞としては、非ヒト動物の体細胞から樹立した細胞を培養して用いる。体細胞の培養培地、培養条件は、公知の方法を用いる。
【００６７】
上記培養した体細胞培養細胞の培地中に、遺伝子導入試薬と組換え発現ベクターとを加え、所定期間培養して、体細胞培養細胞中に遺伝子を導入する。
【００６８】
上記遺伝子導入細胞をさらに培地中で培養を続け、細胞数を増加させる。その後、遺伝子導入細胞を、抗生物質などの選択薬剤を添加した培地中で選択培養する。選択培地中で生存した細胞について、顕微鏡下観察し、蛍光が認められたものを、クローニングリングにより単離し、通常の培地中で継代培養する。所定期間培養を続けた後にも、安定して蛍光が観察されたものを、遺伝子導入細胞とする。
【００６９】
本発明の非ヒト動物細胞では、この遺伝子導入細胞の一部を脂肪細胞に分化させて、脂肪酸組成を分析することにより、遺伝子導入細胞のα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸の合成能を、事前に評価することができる。
【００７０】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物］
（クローン胚の作成）
クローン胚のもとになるレシピエント卵子としては、成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、屠場由来の卵巣から採取した卵子や生体の卵巣から経膣的に採取した卵子を体外成熟させたもののほか、プロスタグランジンＦ２α、クロプロステノール、絨毛ゴナドトロピン等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子であっても使用できる。卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００７１】
上記レシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンB処理を施した卵子を使用するのが好ましい。より具体的には、体外成熟卵子等のレシピエント卵子をホールディングピペットで保定し、微細なガラス針によりその透明帯を迅速・的確に切開したのち、サイトカラシンBを含有する培地でそれらのレシピエント卵子を処理し、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移して、除核用ピペットあるいは除核用ガラス針により第一極体の付近の細胞質を極体ごと吸引又は押し出して行う。なお、それらの極体を含む細胞質を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンBを除去することが好ましい。
【００７２】
ドナー細胞としては、上記遺伝子導入細胞を培養したものを用いる。また、ドナー細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0／Ｇ1期に同調させた体細胞が好ましい。なお、細胞周期Ｇ0／Ｇ1期に同調させた体細胞は、例えば一定期間培養し続けコンフルエントな状態まで培養するあるいは、培養液中の血清濃度を極端に低下させた培養液に交換し血清飢餓状態で培養することにより得ることができる。
【００７３】
体細胞クローン胚は、定法に従って、例えば、ドナー細胞を細胞導入用ピペットに吸い込み、このピペットの先端を除核されたレシピエント卵子の囲卵腔に差し込んでドナー細胞を注入したのち、細胞融合装置による電気融合処理、カルシウムショックによる活性化処理を行うことにより作製される。
【００７４】
上記クローン胚を、所定の培養培地を用いて、体外培養する。クローン胚の卵割、胚盤胞期胚への発生を観察し、卵割しない胚、胚盤胞期胚へ発生しない胚を除く。次に、これらの胚において、リポーター遺伝子の発生を、蛍光により観察する。蛍光が認められるクローン胚を選択して、仮母の子宮内に移植することで、哺乳動物において、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸を効率よく合成できる非ヒト動物を得ることができる。
【００７５】
本発明では、ベクター中に、蛍光により、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を確認できるリポーター遺伝子を含む。このため、ベクターを非ヒト動物細胞に導入した状態と、クローン胚を作成した状態において、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を容易に確認できる。
【００７６】
また、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を確認した非ヒト動物細胞を脂肪細胞に分化させることができる。これにより、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された非ヒト動物細胞のα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸の合成能をあらかじめ評価することができる。
【００７７】
すなわち、本発明の組換え発現ベクター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を用いれば、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびｎ−３系不飽和脂肪酸の合成能の高い非ヒト動物を容易に得ることができる。
【実施例】
【００７８】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げて説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７９】
［ｈＦＡＤ３遺伝子］
ベニバナアマ（Ｌｉｎｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）の幼若種子から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。縮重ポリメレースチェーン反応（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ）法と、ＲＡＣＥ法とを用いて、ＦＡＤ３ ｃＤＮＡの配列を調べた。推定された配列をもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、全長のｃＤＮＡを得た。このアマ由来のｃＤＮＡは、既知の植物のＦＡＤ３との相同性が高く、ＦＡＤ３の特徴を有していた。このｃＤＮＡの酵素活性を、酵母を用いて検討したところ、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が増加したことから、このｃＤＮＡを遺伝子ＦＡＤ３とした。
【００８０】
（ヒト化脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の設計）
哺乳動物（ヒト）のコドンの使用頻度と、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドン使用頻度を、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂｅｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を用いて比較した。その結果をもとに、ＦＡＤ３遺伝子の配列を設計した。結果を表３に示す。表３は、アミノ酸：Ａｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｙｓ（リシン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖａｌ（バリン）における哺乳動物（ヒト）のコドンの使用頻度と、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドン使用頻度と、本実施例で設計した遺伝子ｈＦＡＤ３におけるコドン使用頻度を示している。Ａｌａ（アラニン）に基づいて説明すると、Ａｌａには、「ＧＣＵ」、「ＧＣＣ」、「ＧＣＡ」、「ＧＣＣ」という４個のコドンが存在する。ヒトのコドンでは、「ＧＣＵ」は１７％、「ＧＣＣ」は５３％、「ＧＣＡ」は１３％、「ＧＣＣ」は１４％使用されている。一方、アマ由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ３のコドンでは、「ＧＣＵ」は２８％、「ＧＣＣ」は４８％、「ＧＣＡ」は１７％、「ＧＣＣ」は７％使用されている。この結果に基づいて、設計する遺伝子ｈＦＡＤ３においては、ヒトのコドンに近づけるように、「ＧＣＵ」を１７％、「ＧＣＣ」を５２％、「ＧＣＡ」を１４％、「ＧＣＣ」を１７％使用することとしたものである。他のアミノ酸に基づく、コドンについても同様にした。なお、表中、ｈＦＡＤ３で空欄になっているものは、使用頻度を変更しなかったものを意味する。
【表３】
【００８１】
上記設計されたヒト化脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ｈＦＡＤ３）の塩基配列は、表１に示す。
【００８２】
［脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作成］
次に、上記配列番号１の塩基配列の５’末端と３’末端には、ベクターに導入する際に用いる、制限酵素認識部位として、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を設け、３’末端にＢａｍＨＩ認識部位を設けた。また、効率的に翻訳を行うために、開始コドンの近傍に、リボソーム結合部位であるコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を挿入した。
【００８３】
このようにして設計した最適化遺伝子の塩基配列から、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｂｉａｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２６，ｐ．９６−１０５（２００２））と、Ｋｉｍら（Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ （ＥＰＯ） ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ １９９， ｐ．２９３−３０１（１９９７））のＰＣＲ法を用いて、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子を作成した。
【００８４】
表１に示す、設計した鋳型ｈＦＡＤ３の塩基配列をもとに、７０〜９０塩基ずつのＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは、相互に補足するように１２〜２０塩基をオーバーラップさせた。
【００８５】
（各プライマーセットにおけるＰＣＲ条件の検討）
表２に示す、Ｎｏ．１と２、Ｎｏ．３と４、Ｎｏ．５と６、Ｎｏ．７と８、Ｎｏ．９と１０、Ｎｏ．１１と１２、Ｎｏ．１３と１４、Ｎｏ．１５と１６、Ｎｏ．１７と１８、Ｎｏ．１９と２０の組み合わせ１０サンプルについて、ＰＣＲ条件の検討を、以下のように行った。
【００８６】
アマ由来ＦＡＤ３ ｃＤＮＡ４００ｎｇを鋳型とし、４μｌ １０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、３．２μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．２μｌ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、０．５ｐｍｏｌ／μｌ 各プライマーセットを合わせて、全量を４０μｌとした。これを１０μｌずつ、４本のＰＣＲチューブに分注した。アニーリング温度を、それぞれ５５℃、５８℃、６０℃、６３℃に設定して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、以下のとおりである。まず、９４℃で１０分間反応させた後、９４℃で３０秒、アニーリング３０秒、７２℃で１分を、３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を、４％アガロース／ＴＡＥ（トリス酢酸緩衝液）を用い、１×ＴＡＥ中で２５分間電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターで、ＤＮＡの泳動パターンを観察した。泳導パターンがより明確なバンドを示したサンプルにおける、アニーリング温度を、最適のアニーリング温度とした。各プライマーセットにおける最適のアニーリング温度を表４に示す。
【表４】
【００８７】
次に、設計したプライマーを組み合わせて、ＰＣＲ法で、ｈＦＡＤ３遺伝子の合成を行った。Ｎｏ．１と２、Ｎｏ．３と４、Ｎｏ．５と６、Ｎｏ．７と８、Ｎｏ．９と１０、Ｎｏ．１１と１２、Ｎｏ．１３と１４、Ｎｏ．１５と１６、Ｎｏ．１７と１８、Ｎｏ．１９と２０とを組み合わせてＰＣＲを行った。アマ由来ＦＡＤ３ ｃＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、１μｌ １０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、０．８μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．０５μｌ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、０．５ｐｍｏｌ／μｌ 各プライマーセットを合わせて、全量を１０μｌとした。これらを、９４℃で１０分間反応させた後、９４℃で３０秒、最適のアニーリング温度で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００８８】
上記ＰＣＲ反応後のそれぞれのＰＣＲ産物 ３．５μｌに、５μｌ １０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、４μｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．２５μｌ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、２．５μｌのＮｏ．１とＮｏ．２０のプライマーを加え、全量を５０μｌとした。これを、９４℃で１０分間反応させた後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。これにより、ｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物を得た。
【００８９】
（ＰＣＲ産物のサブクローニング）
上記得られたｈＦＡＤ３を含むＰＣＲ産物から、１．２ｋｂのＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（ＧＦＸ（登録商標） ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、 ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて回収した。抽出したＤＮＡは、エタノールを用いて沈殿させて回収した。沈殿したＤＮＡを、トリス塩酸バッファーを加えて溶解し、以下の操作に用いた。
【００９０】
得られた１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２（タカラバイオ（株）製）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクター（プロメガ社製）へ、ＴＡクローニングした。
【００９１】
クローニング産物を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（タカラバイオ（株）製）に入れて形質転換した。この形質転換した大腸菌を抗生物質カルベニシリン（和光純薬（株）製）を用いて、ＬＢプレート（ナカライテスク製）で選択培養した。生育したコロニーをＬＢ／Ｃａｒ（カルベニシリン）培地で、３７℃、一晩振とう培養した。増殖した大腸菌をアルカリプレップ法を用いて、大腸菌の細胞壁を分解し、プラスミドを回収した。
【００９２】
（取得クローンの塩基配列解析）
回収したプラスミドをポリエチレングリコールで沈殿させた後、ＤＮＡの濃度測定をした。得られたＤＮＡ ２００ｎｇに、０．８μｌの２．０μＭ Ｍ１３ プライマー（終濃度１．６μＭ）、０．５μｌ Ｂｉｇ ｄｙｅ ｐｒｅｍｉｘ（アプライド バイオシステムズ製）、１．５μｌ ５×ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（アプライド バイオシステムズ製）を加え、滅菌水で１０μｌにした。この液を、９６℃で１分の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を２５サイクルの条件で、ＰＣＲ法を行った。反応後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、乾燥させた。乾燥させて得たペレットに、１５μｌ Ｈｉ−Ｄｉ ホルムアミド（アプライド バイオシステムズ製）を加えた。ペレットを溶解させ、攪拌した後、９５℃で３分間変性処理をした。その後、氷上で急冷し、３１７０ ＤＮＡ アナライザー（アプライド バイオシステムズ製）により、塩基配列を調べた。得られた塩基配列は、設計したｈＦＡＤ３の塩基配列と同じであることを確認した。
【００９３】
［組換え発現ベクターの作成］
ネオマイシン耐性遺伝子を有するｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰベクター（タカラバイオ（株）製）を、ＮｏｔＩ（タカラバイオ（株）製）で消化した。この末端をＴａｋａｒａ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）製）で平滑化し、ＮｏｔＩサイトを除去した。このベクターのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩサイトを消化し、脱リン酸化処理を行った。
【００９４】
上記ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクター（プロメガ社製）にクローニングされたｈＦＡＤ３配列をＥｃｏＲＩで消化して切り出した。この切り出したｈＦＡＤ３配列を、上記ｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰベクターの脱リン酸化処理を行ったＥｃｏＲＩサイトに連結し、ｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ−ｈＦＡＤ３とした。
【００９５】
次に、ｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ−ｈＦＡＤ３ベクターを、ＡｓｅＩ、ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ（株）製）で消化し、ＣＭＶプロモーター配列を除去した。この部分に、両端にＢｇｌＩＩに結合できる配列を持ち、内側にＮｏｔＩサイトを配した合成ポリヌクレオチドを挿入した。次に、このベクターを、ＳａｃＩ（タカラバイオ（株）製）で消化した。この部分に、両端にＳａｃＩ配列結合を持ち、内側にＭｌｕＩ配列を持つ、合成ポリヌクレオチドを挿入した。
【００９６】
次に、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）にサブクローニングされた、ＣＡＧプロモーターを、ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩ（タカラバイオ（株）製）で消化し、切り出した。切り出されたＣＡＧプロモーターを、上記ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩで消化したｐＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ−ｈＦＡＤ３ベクターに組み込んだ。これを、ｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）とした。構成したｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を図２に示す。
【００９７】
上記構築したベクターを大腸菌に形質転換して大量培養した。培養した大腸菌を、アルカリプレップ法により、プラスミドを回収した。回収したプラスミドを、終濃度が５μｇ／μｌとなるように、精製ＰＢＳ（ギブコ社（製））で溶解した。
【００９８】
［ウシ筋衛星細胞への遺伝子導入および導入細胞の単離］
（ウシ筋衛星細胞株の樹立と培養）
ウシ筋衛星細胞は、２週齢雌ウシの胸腺付近の筋組織より樹立した。培地には、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）−２／ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、アップステート製）および２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したＤＭＥＭ培地（ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）を用いた。まず、ウシより得た筋組織を細切してトリプシン処理した。この後、５００ｇで４分間の遠心分離を３回繰り返し、そのつど上清を回収、事前播種した。２時間後浮遊細胞を回収し、この浮遊細胞を、コラーゲン（高研製）でコートしたディッシュに播種した。播種２４時間後に培地を交換し、得られた細胞の培養を行った。これらの細胞は継代培養した後に、以下の実験に用いた。
【００９９】
（ウシ筋衛星細胞への遺伝子導入）
上記細胞株を樹立したウシ筋衛星細胞を、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭを入れた４ウェル ディッシュに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２、飽和湿度で２４時間培養した。その後、培地を交換した（１５０μｌ／ウェル）。次に、１．５ｍｌの試験管に無血清の１００μｌ ＤＭＥＭと３μｌの遺伝子導入試薬（Ｇｅｎｅ Ｊａｍｍｅｒ（登録商標）トランスフェクション試薬）を加え、１０分間室温で静置した。そこに、１μｇ／μｌに調整したｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を１μｌ加え、１０分間室温で静置した。上記筋衛星細胞を入れた培養液に、この遺伝子導入試薬と導入遺伝子の混合液を１００μｌ加え、３７℃、５％ ＣＯ２、飽和湿度で３時間培養した。その後、４００μｌのｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭを加え、３７℃、５％ ＣＯ２、飽和湿度で２４時間培養した。
【０１００】
（選択培養と遺伝子導入細胞の獲得）
遺伝子を導入したウシ筋衛星細胞を培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で細胞数が５倍になるよう継代し、２４時間培養した。その後、５００μｇ／ｍｌ アミノグリコシド系抗生物質であるＧ４１８添加、ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭを培地として選択培養を行った。選択培養は、９日間行い、培養液は３日ごとに交換した。９日間培養を行うとほとんどの細胞は死滅したが、一部の細胞は生存し、コロニー状に増殖していた。増殖した細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。ＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群をクローニングリングを用いて単離した。単離した遺伝子導入細胞を培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で継代培養した（細胞群ａ〜ｅ）。４代以上継代培養した後、再び蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰ蛍光を観察した。安定してＥＧＦＰ蛍光が観察された細胞を、遺伝子導入細胞とした（細胞群ｂ〜ｄ）。図３は、選択培養した後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）と、継代培養後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）とを示すグラフである。このグラフから、細胞群ｂ、ｃ、ｄは、安定してＥＧＦＰ蛍光が観察される（９２．０→９０．３、９８．１→１００．０、１００．０→１００．０）ことがわかる。細胞群ａ、ｅは、ＥＧＦＰ蛍光が安定していない（９４．７→８５．９、７４．０→２６．７）ことがわかる。また、細胞群aは他の細胞群と比較して蛍光強度が極端に低かった。以下の実験では、細胞群ｂ、ｃ、ｄを用いた。
【０１０１】
（脂肪細胞への分化能力の検討）
細胞群ｂ、ｃ、ｄの各細胞における、脂質を蓄積する能力を検討した。まず、１μＭ デキサメタゾン（シグマ社製）、２ｍＭ オクタン酸（シグマ社製）を添加したｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（分化誘導培地）を用いて、細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞を、脂肪細胞へ分化誘導した。脂肪細胞への分化は、具体的には以下のようにして行った。ｈＦＡＤ３導入ウシ筋衛星細胞を、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で７０％集密になるまで培養した。その後、この分化誘導培地を用いて９日間培養し、多胞性の脂肪細胞へ分化誘導した。培地は３日おきに交換した。分化誘導した後、Ｏｉｌ Ｒｅｄ ０により脂質を染色した。これを、ＮＩＨｉｍａｇｅ（ｖｅｒ。１．６２、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／、１９９９）で、染色された面積を測定して、蓄積された脂質量を定量した。結果を図４に示す。図４は、非遺伝子導入細胞と、細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞における脂質の蓄積を調べた結果を示すグラフである。各棒の上に記載されている「ａ」「ｂ」は、異なる文字間で有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。細胞群ｂおよびｄは、非遺伝子導入細胞と脂質量が同様であった（ｐ＜０．０５）が、細胞群ｃの脂質蓄積量は、非遺伝子導入細胞と比べ少なかった（ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
［染色体検査］
７０％集密になるまで培養した遺伝子導入細胞である細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞を、０．０２μｇ／ｍｌ デメコルシン（シグマ社製）を加えた培地で３時間培養し、デメコルシン処理を行った。その後、酢酸メタノールで３０分間固定し、スライドグラスに滴下した。これを、ギムザ染色し、カバーグラスをかぶせマニキュアで封入して染色体標本を作成した。対照区として遺伝子が導入されていない細胞についても、同様に行った。倒立顕微鏡下１０００倍で、５０個の細胞について１個あたりの染色体を調べた。結果を表５に示す。図５は、ｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）が導入されたウシ筋衛星細胞において染色体数が正常な細胞の割合を示す表である。
【表５】
【０１０３】
表５から、細胞株ｃ、ｄにおける正常細胞（染色体数６０）の割合は、対照区の遺伝子導入細胞と同等であった（ｐ＜０．０１）。一方、細胞群ｂでは、正常な染色体数を有する細胞の割合は、２６％と小さかった（ｐ＜０．０１）。以下の実験では、細胞群ｃ、ｄの遺伝子導入細胞を用いて行った。
【０１０４】
［遺伝子導入細胞におけるｈＦＡＤ３遺伝子の発現］
ｈＦＡＤ３遺伝子の下流には、ＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子が連結されているので、染色体数が正常な細胞群ｃ、ｄのｈＦＡＤ３遺伝子の発現を、ＥＧＦＰ蛍光量として定量した。
【０１０５】
分化誘導前の遺伝子導入細胞は、１０μＭ リノール酸ナトリウムを添加した、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で、９日間培養し、１００倍の倍率で明視野とＵＶ照射下で、それぞれ撮影を行った。培地は、３日おきに交換した。
【０１０６】
分化誘導後の遺伝子導入細胞は、１μＭ デキサメタゾン、２ｍＭ オクタン酸、および１０μＭ リノール酸ナトリウムを添加した、ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（分化誘導培地）中で、９日間培養し、分化誘導していない細胞と同条件で写真の撮影を行った。培地は、３日おきに交換した。
【０１０７】
撮影後、画像解析ソフト・アクアコスモス（浜松フォトニクス（株）製）を用いて、取得した画像フィルムの蛍光部分のピクセル数を計測することで、細胞の蛍光強度を測定した。結果を、図５、６に示す。図５は、非遺伝子導入細胞と、細胞群ｃ、ｄの分化誘導前と分化誘導後の、透過光像と、ＥＧＦＰ蛍光像である。また、図６は、細胞群ｃ、ｄの分化誘導前と分化誘導後の傾向強度の変化を示すグラフである。
【０１０８】
図５から、筋衛星細胞では、分化誘導により脂肪細胞に分化し、脂肪が蓄積されることがわかる。非遺伝子導入細胞からは、分化誘導後の脂肪細胞においても蛍光が発生していないことがわかった。また、遺伝子を導入した細胞群からは、透過光像で認められた分化誘導後の脂肪細胞から、ＥＧＦＰ蛍光が認められた。図６：分化誘導前の細胞であるｃ「−」、ｄ「−」から、分化誘導前の細胞では、細胞群ｃ、ｄの細胞とも遺伝子発現量は低いことがわかった。一方、図６：分化誘導後の細胞であるｃ「＋」、ｄ「＋」から、分化誘導して、脂肪滴を蓄積した脂肪細胞では、細胞群ｃ、ｄの細胞とも、ＥＧＦＰ蛍光量は多かった（ｐ＜０．０５）。また、細胞群ｄは、細胞群ｃより、ＥＧＦＰの発現は多かった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
［遺伝子導入細胞の脂肪酸組成解析］
（分化誘導を行う前の遺伝子導入細胞の脂肪酸解析）
ｈＦＡＤ３遺伝子を導入したウシ筋衛星細胞を１０μＭリノール酸ナトリウムを添加した、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で９日間培養した。培地は、３日おきに交換した。培養後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）で３回洗浄し、培地を除去した。次に、０．５％ ２，６−ジ−ターシャルブチル−４−メチル−フェノール（ＢＨＴ）を添加したメタノール（ナカライテスク製）を１０ｍｌ加え、セルスクレーパー（旭テクノグラス製）を用いて、細胞ごと掻き採ることで、全脂質を抽出した。細胞の脂質は、プラスチックシャーレ（直径１００ｍｍ、ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー製）１０枚を１サンプルとして、０．５％ ＢＨＴ添加メタノールごとガラス試験管（１７ｍｌ）に移した。これら脂質の脂肪酸は、カラムＤＢ−２３（φ０．２５ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗ サイエンテフィック製）を用いてガスクロマトグラフィ（ＧＣ−１７００、島津製作所（株）製）を用いて分析した（検出器：ＦＩＤ、温度：試料注入口 ２５０℃、検出器：２５０℃、カラム：５０℃で１分間保持し、１分間につき１０℃、１７０℃まで昇温させた。１７０℃に達した後、１分間につき１．２℃、２１０℃まで昇温させた。試料導入系：スプリットレス、ガス流量：ヘリウム（キャリヤーガス）１．５ｍｌ／分、ヘリウム（メイクアップガス）８０ｋＰａ、ガス圧力：水素６０ｋＰａ、空気 ５０ｋＰａ（ＡＯＣＳ ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ １ｂ−８９（２００５）に準じた。））。脂質の分析は、遺伝子非導入細胞と、細胞群ｃ、ｄの細胞について、分化誘導前と分化誘導後の細胞で行った。結果を、表６、７に示す。表６は、分化誘導前の細胞の脂質の分析結果であり、表７は、分化誘導後の細胞の脂質の分析結果である。表中、脂肪酸組成で、「：」の前に記載されている数字は、脂肪酸の炭素数を、「：」の後に記載されている数字は、二重結合の数を、（ｎ−）の後に記載されている数字は、多価不飽和脂肪酸の炭素鎖のメチル基から数えて最初の二重結合が存在する位置を示す。「↑」は、コントロール（遺伝子非導入細胞）と細胞群ｃまたはｄの細胞間で脂肪酸が有意に上昇しているものを、「↓」は、コントロール（遺伝子非導入細胞）と細胞群ｃまたはｄの細胞間で脂肪酸が有意に減少しているものを示した。
【０１１０】
脂肪酸組成は、遺伝子導入細胞の脂肪細胞への分化実験を３回反復した。各区で抽出した全脂質の脂肪酸組成比を分散分析法及びＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤテストによる多重比較検定を行った。有意差水準は、ｐ＜０．０５とした。
【表６】
【表７】
【０１１１】
表６から、分化誘導前の筋衛星細胞では、細胞群ｃ、ｄの細胞ともに、遺伝子非導入細胞と比べて、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）をはじめとするｎ−３系脂肪酸脂肪酸などの脂肪酸組成に変化は認められなかったことがわかる（ｐ＜０．０５）。
【０１１２】
表７から、分化誘導後の細胞では、ｈＦＡＤ３が低発現の細胞群ｃの細胞では、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が０．３０％と、対照区の遺伝子非導入細胞０．０３％に対し、有意に増加していたことがわかる（ｐ＜０．０５）。ＦＡＤ３の基質であるリノール酸（１８：２ｎ−６）は９．３７％と、対照区の遺伝子非導入細胞１２．４％に対し、有意に減少していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸のドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）は、５．８０％と、対照区の遺伝子非導入細胞４．２７％に対し、１．５％増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸の総計では、１１．５％と、対照区の遺伝子非導入細胞９．１％に対し、約２．４％増加していた（ｐ＜０．０５）。
【０１１３】
分化誘導後の細胞では、ｈＦＡＤ３が強発現の細胞群ｄの細胞でも、α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が０．２７％と、対照区の遺伝子非導入細胞０．０３％に対し、有意に増加していた（ｐ＜０．０５）。ＦＡＤ３の基質であるリノール酸（１８：２ｎ−６）は、９．４０％と、対照区の遺伝子非導入細胞１２．４％に対し、３％と、大いに減少していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸のドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ｎ−３）は、５．３０％と、対照区の遺伝子非導入細胞４．２７％に対し、約１％増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：５ｎ−３）は、６．４０％と、対照区の遺伝子非導入細胞３．５７％に対し、約２．８％と大いに増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−３系の脂肪酸の総計では、１２．５％と、対照区の遺伝子非導入細胞９．１％に対し、約２．４％増加していた（ｐ＜０．０５）。ｎ−６系の脂肪酸の総計では、１９．２３％と、対照区の遺伝子非導入細胞２３．９％に対し、約４．７％も減少していた（ｐ＜０．０５）。
【０１１４】
また、（ｎ−６）系の脂肪酸／（ｎ−３）系の脂肪酸の割合は、細胞群ｃの細胞では、２．１０、細胞群ｄの細胞では、１．５７と、対照区の非遺伝子導入細胞の２．６３に比べ有意に減少していることがわかった（ｐ＜０．０５）。
【０１１５】
以上から、分化誘導した本発明の遺伝子導入細胞では、（ｎ−６）系の脂肪酸から（ｎ−３）系の脂肪酸への変化が進行していることがわかった。
【０１１６】
［遺伝子導入細胞をドナー細胞に用いたクローン胚の作製］
（ドナー細胞の調整）
遺伝子を導入した細胞群ｃ、ｄの細胞を集密になるまで培養した。その後、細胞の増殖を停止させて、Ｇ０／Ｇ１期に細胞周期を同調させた。培養後、細胞ｃ、ｄの細胞を回収し、培地ｂＦＧＦ−ＦＢＳ−ＤＭＥＭで洗浄し、核移植に用いた。また、コントロールとして、遺伝子非導入筋衛星細胞を、同様に培養、回収して用いた。
【０１１７】
（ウシ卵子の体外熟成）
大阪市食肉衛生検査所において、ウシ屠体より採取されたウシの卵巣を用いた。卵巣から２１Ｇの注射針（テルモ社製）と１０ｍｌのシリンジ（テルモ社製）を用いて、ウシ卵子を卵胞液とともに吸引し回収した。卵胞より回収した卵胞液から、実体顕微鏡下で２〜４重層の卵丘細胞が付着した卵丘細胞卵子複合体のみを選別して回収した。その後、洗浄用成熟培養ドロップに、２０個ずつ移し、洗浄した。次に、成熟培養ドロップに１０個ずつ移動させ、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度の炭酸ガスインキュベーター内で２１時間培養した。
【０１１８】
（ウシ卵子の裸化）
２１時間成熟培養した卵丘細胞卵子複合体を、０．５％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および２．５ｍｌ／ｍｌゲンタマイシン溶液を添加した２５ｍＭ ヘペス緩衝ＴＣＭ−１９９（ギブコ社製）に、０．２５％ ヒアルロニダーゼを加えた培地（１９９Ｈ＋５％ ＮＢＣＳ＋０．２５％ ヒアルロニダーゼ）に移し、５分間静置した。静置後、ピペッティングにより、卵丘細胞卵子複合体を完全に取り除いた。
【０１１９】
（除核）
倒立顕微鏡下において、第１極体を放出し、第二減数分裂中期（ＭｅｔａｐｈａｓｅＩＩ期）に達し、成熟していると思われる正常な卵子を選別した。この卵子の第１極体付近の透明帯を透明帯カット用ニードルで切開した。透明帯を切開した卵子を除核用培地（１９９Ｈ＋５％ ＮＢＣＳ＋５μｇ／ｍｌ サイトカラシンＢ）に入れ、１５分間静置した。静置後、除核用スティックで卵子を上から押さえつけ、第一極体及びその周辺卵細胞質を切開部位から２〜３割ほど押し出した。この卵子を、（１９９（Ｅａ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地に移し、ピペッティングにより卵子と押し出した卵細胞質に切り離した。切り離した卵細胞質のみを１２μｇ／ｍｌ ヘキストＮｏ．３３３４２添加１９９（Ｅａ）に移し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和湿度で、３０分間培養し、染色した。倒立顕微鏡下でＵＶ照射により、核の確認を行った。核が確認できた卵細胞質に対応した卵子のみをレシピエント卵子として用いた。
【０１２０】
（細胞の導入）
除核した卵子を１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に、上記ドナー細胞をＰＶＰ（ポリビニルピロリドン Ｋ−９０（ナカライ社製））に移した。細胞導入用ピペットにドナー細胞を５〜１０個吸引した後、除核卵子の透明帯切開部位から囲卵腔内にドナー細胞を１個ずつ導入した。細胞導入したウシ卵子を、１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に移した。
【０１２１】
（電気融合）
電気融合には、ＥＣＭ２００（ＢＴＸ社製）に接続した微小電極（ユニークメディカ イマダ 製）を用いた。除核卵子を、１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に移し、ミネラルオイルを洗い流した。この除核卵子を、新たに、１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ培地に移し、（１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地＋細胞融合液混合液（１：１）、細胞融合液の順に移していった。卵子が底に沈んだ後、細胞融合液の楕円形のドロップを作製し、細胞導入した卵子をそこに移した。微小電極でウシ卵子細胞質および導入電極が一直線になるように挟み、交流２．７ｋＶ／ｃｍ・１０μ秒を２回印加し、電気パルスによって融合処理を行った。その後、電気融合処理卵を細胞融合液、細胞融合液＋（１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地混合液（１：１）、（１９９（Ｈ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地の順に移動させた。最後に、電気融合処理卵を、（１９９（Ｅａ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地で洗浄し、（１９９（Ｅａ）＋５％ ＮＢＣＳ）培地のドロップへ移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度で、３０分間培養した。培養後、実体顕微鏡下でドナー細胞と卵子細胞質との融合を確認した。
【０１２２】
（活性化処理）
電気融合処理後、遮光下でカルシウムイオノフォア活性化処理を行った。融合確認ができた再構築胚を、５μＭ Ｃａ２＋イオノマイシン培地に移し、５分間静置した。静置後、シクロへキシミド処理液をＣａ２＋イオノマイシン培地に加え、反応を停止させた。カルシウムイオノフォア処理後の再構築胚を、修正合成卵管液培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｖｉｄａｕｔａｌ Ｆｌｕｉｄ （ｍＳＯＦ）ｍｅｄｉｕｍ、合成卵管液培養液（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｖｉｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ， ＳＯＦＭ， Ｔｅｒｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９７２）に必須および非必須アミノ酸を添加して修正した培養液（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｆｉｒｓｔ， １９９２）からさらに無機リン酸塩を除いた培養液（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＯＦ ｍｅｄｉｕｍ，ｍＳＯＦＭ））＋１０μｇ／ｍｌ シクロへキシミド培地のドロップに移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度のインキュベーター内で６時間培養し、活性化を誘起した。
【０１２３】
（体外培養）
カルシウムイオノフォア−シクロへキシミド複合活性化処理の６時間後に、再構築胚をｍＳＯＦｍ培地に移し、洗浄した。洗浄後、ｍＳＯＦ培地のドロップに、１ドロップに付き２０〜４０個の再構築胚を移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度のインキュベーター内で１２０時間培養した。１２０時間培養後、再構築胚を、２０％ ＦＢＳ１９９＋ベータメルカプトエタノール（βＭＥ）培地に移し洗浄した。洗浄後、２０％ ＦＢＳ１９９＋βＭＥ培地のドロップに移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、飽和湿度のインキュベーター内で４８時間培養した。４８時間培養後、再構築胚の卵割率および胚盤胞期胚への発生率を検討した。また、胚盤胞期胚におけるＥＧＦＰ蛍光の観察、胚盤胞期胚の回収を行った。表８に、再構築胚の卵割率および胚盤胞期胚への発生率を示す。コントロールとして、遺伝子非導入細胞を用いたクローン胚（表中、「ｎｏｎＴＧ細胞」と記載）を用いた。表中、「卵割胚数」は、２、４、８細胞期の卵数を、％は培養した胚数に対する卵割した胚数の割合を示す。また、「胚盤胞期胚数」の％は、培養した胚数に対する胚盤胞期胚の割合を示す。
【表８】
【０１２４】
表８から、細胞群ｄの細胞を導入したクローン胚（表中、「ＴＧ細胞」と記載）の胚盤胞への発生率は２１％と、遺伝子非導入細胞を用いたクローン胚の３５％と比較してやや低かったが、有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１２５】
また、図７に示すように、胚盤胞胚期へ発現した遺伝子導入クローン胚の全ての胚で蛍光を確認した。
【０１２６】
［遺伝子導入細胞クローン胚における導入遺伝子の発現の検討］
活性化処理後１６８時間で胚盤胞排気まで発生した胚１０個を１サンプルとして回収した。このサンプルから、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、ＲＮＡ抽出を常法に従って行った。
【０１２７】
抽出したＲＮＡを用いて、ＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使って、ｃＤＮＡを合成した。
【０１２８】
得られたｃＤＮＡは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ、タカラバイオ（株）製）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、ｈＦＡＤのプライマーを用い、９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分３０秒、７２℃で１分３０秒を３５サイクルで行った。また、コントロールとしてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのプライマーを用いた。
【０１２９】
反応後、ＰＣＲ産物を、１．２％寒天／ＴＡＥを用い、１×ＴＡＥ中で２５分間電気泳動を行った。泳動後、エチレンブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターでＤＮＡの泳動パターンを観察した。結果を、図８に示す。図中、用いた胚の数は、非遺伝子導入細胞については、１：１０個、２：１０個、３：９個、遺伝子導入細胞では、１：１０個、２：６個、３：１０個であった。
【０１３０】
図８から、遺伝子導入株ｄを用いて作製したクローン胚では、ｈＦＡＤ３が発現していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、ｈＦＡＤ３の再構築遺伝子の作成方法を説明する図である。
【図２】図２は、構成したｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を示す図である。
【図３】図３は、選択培養した後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）と、継代培養後にＥＧＦＰ蛍光が陽性の細胞群における蛍光が観察された細胞数の割合（％）とを示すグラフである。
【図４】図４は、非遺伝子導入細胞と、細胞群ｂ、ｃ、ｄの細胞における脂質の蓄積を調べた結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＣＡＧ／ｈＦＡＤ３／ＩＲＥＳ２／ＥＧＦＰ／ＳＶ４０（ｎｅｏｒ）を導入したウシ筋衛星細胞の分化誘導前と分化誘導後の透過光像および蛍光像である。
【図６】図６は、細胞群ｃ、ｄの分化誘導前と分化誘導後の傾向強度の変化を示すグラフである。
【図７】図７は、遺伝子導入細胞株ｄを用いたクローン胚の胚盤胞期胚の透過光像と、ＥＧＦＰ蛍光像を示す図である。
【図８】図８は、胚盤胞に発生したクローン胚を用いた、ＲＴ−ＰＣＲによる、ｈＦＡＤ３遺伝子の発現を確認した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【請求項２】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含有する、組換え発現ベクター。
【請求項３】
前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子である、請求項２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子である、請求項２に記載の組換え発現ベクター。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【請求項５】
前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ヒト化遺伝子である、請求項２ないし４のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
前記組換え発現ベクターは、レポーター遺伝子、ＩＲＥＳ配列、および選択マーカー遺伝子を含む、請求項２〜５のいずれかに記載の組換え発現ベクター
【請求項７】
請求項２〜６のいずれかに記載の組換え発現ベクターを用いて、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞。
【請求項８】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物。
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【請求項２】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含有する、組換え発現ベクター。
【請求項３】
前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子である、請求項２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子である、請求項２に記載の組換え発現ベクター。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω３脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）３つのヒスチジンクラスターと小胞体膜移行シグナルを有し、発現させると真核細胞内でω３脂肪酸不飽和化酵素活性を示すポリヌクレオチド
【請求項５】
前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ヒト化遺伝子である、請求項２ないし４のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
前記組換え発現ベクターは、レポーター遺伝子、ＩＲＥＳ配列、および選択マーカー遺伝子を含む、請求項２〜５のいずれかに記載の組換え発現ベクター
【請求項７】
請求項２〜６のいずれかに記載の組換え発現ベクターを用いて、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞。
【請求項８】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された、非ヒト動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−５５８７６（Ｐ２００９−５５８７６Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２７８１８（Ｐ２００７−２２７８１８）
【出願日】平成１９年９月３日（２００７．９．３）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月３日（２００７．９．３）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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