脂肪酸分析による特定疾患の検査方法
【課題】疾患特異的なバイオマーカーが発見されていない疾患や、画像検査が評価の対象とならないような特定の疾患に対して、早期診断や治療効果の判定、予後診断に適用可能な検査方法を提供する。
【解決手段】被験者より採取した検体についての脂肪酸分析結果を、予め取得した特定疾患患者及び健常者についての脂肪酸分析結果にあてはめることで、特定の疾患の検査、例えば早期診断、治療効果の判定、予後診断等を容易に行なうことが可能となる。
【解決手段】被験者より採取した検体についての脂肪酸分析結果を、予め取得した特定疾患患者及び健常者についての脂肪酸分析結果にあてはめることで、特定の疾患の検査、例えば早期診断、治療効果の判定、予後診断等を容易に行なうことが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者から採取した検体中の脂質を構成する脂肪酸分析を行い、予め取得した健常者グループ及び疾患患者グループの解析結果に基づき、特定疾患の検査を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の疾患診断、特にがん疾患診断は、血液、尿中のバイオマーカー測定による生化学的検査、カメラ、内視鏡等による画像検査が主体である。しかし、現状では、疾患特異的なバイオマーカーが発見されていないものや画像検査が評価の対象とならない疾患も数多く存在し、早期診断や治療効果の判定、予後診断を困難にしている。
【０００３】
現在、がんの検査は血液中の腫瘍マーカー[例えば、CA19-9(糖鎖抗原19-9)、CEA(がん胎児性抗原)、AFP(α-フェトプロテイン)、PIVKA-II、PSA(前立腺特異抗原)、CA125(糖鎖抗原125)など]の数値を指標に一次検査が行われている。大腸がんの罹患率の年次推移は、男女とも1990年代前半までは増加し、その後は横ばい傾向である。また、死亡率の年次推移は、男女とも戦後から1990年代半ばまで増加し、その後漸減傾向である。大腸がんの増加には、主として結腸がんの増加が影響している。大腸がんは、早期であればほぼ１００％近く完治するが、がんに特徴的な症状はなく、一般的には自覚症状はない。従って、無症状である早期の時期に発見することが重要となる。大腸がんのスクリーニング（検診）の代表的なものとして、大便の免疫学的潜血反応が挙げられるが、十分ではない。血液中の腫瘍マーカー（CEA、CA19-9など）の異常値により発見される場合もあるが、より早期の診断が求められる。
【０００４】
一方、創薬、薬理学、毒性学、診断に供する知見を得るための新たな研究手法として、メタボロームの解析が行われている。また、メタボロームの解析方法として、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗法（ＰＬＳ）などの統計分析を用い、取得したスコアの座標配置による群分けを行い、ローディングプロットによる化合物を同定してマーカーを選別する方法が報告されている。例えば、特開２００７−３１５８５２（特許文献１）は、「被験物質が薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測又は診断する方法を提供すこと」を開示している。
【０００５】
しかしながら、生体内の脂肪酸を解析して、疾患診断バイオマーカーとしての有用性を確認した報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３１５８５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、疾患特異的なバイオマーカーが発見されていない疾患や、画像検査が評価の対象とならないような特定の疾患に対して、早期診断や治療効果の判定、予後診断に適用可能な検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被験者より採取した検体についての脂肪酸分析結果を、予め取得した特定疾患患者及び健常者についての脂肪酸分析結果にあてはめることで、特定の疾患の検査、例えば早期診断、治療効果の判定、予後診断等を容易に行なうことが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の工程を含む特定疾患の検査方法：
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、検体中の脂質を構成する脂肪酸を分析し、当該脂肪酸分析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別し、当該解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法により脂肪酸分析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する工程。
２．前記工程（Ａ）に記載の検体中の脂質を構成する脂肪酸の分析が、以下により行なわれる、前項１に記載の検査方法：
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（４）前記取得したマススペクトルデータから、脂肪酸データベースに基づき解析対象脂肪酸を同定する工程；
（５）同定した脂肪酸のうち、脂肪酸データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別する工程。
３．前記工程（３）におけるマススペクトルデータが、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により得られたものである、前項２に記載の検査方法。
４．前記工程（４）における脂肪酸データベースが、ＧＣ／ＭＳ脂肪酸データベースである、前項３に記載の検査方法。
５．前記工程（５）における有限個の解析対象脂肪酸が以下に示す２６成分の脂肪酸である前項１〜６のいずれか１に記載の検査方法：
Ｃ１４：０，Ｃ１５：０，Ｃ１６：１ｎ−７，Ｃ１６：０，Ｃ１８：３ｎ−６，Ｃ１８：２ｎ−６，Ｃ１８：１ｎ−１２，Ｃ１８：１ｎ−９，Ｃ１８：１ｎ−７ｃ，Ｃ１８：０，Ｃ２０：４ｎ−６，Ｃ２０：５ｎ−３ｃ，Ｃ２０：３ｎ−６，Ｃ２０：２ｎ−６ｃ，Ｃ２０：１ｎ−９ｃ，Ｃ２０：０，Ｃ２１：０，Ｃ２２：６ｎ−３ｃ，Ｃ２２：５ｎ−３ｃ，Ｃ２２：０，Ｃ２３：０，Ｃ２４：０，Ｃ２５：０，Ｃ２６：０，Ｃ２８：０及びＣ３０：０。
６．特定の疾患が、がんである、前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
７．がんが、大腸がんである、前項６に記載の検査方法。
８．検体中の脂質を構成する脂肪酸において、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する、前項６又は７に記載の検査方法。
９．被験者から取得した検体中の脂質成分を構成する脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に、がんであると判断する、特定疾患の検査方法。
１０．以下の工程を含む、前項９に記載の検査方法：
（１）被験者から取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する工程。
１１．がんが、大腸がんである前項９又は１０に記載の検査方法。
１２．検体が、血液である前項１〜１１のいずれか１に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
特定疾患患者及び健常者について、検体中の脂質成分を構成する脂肪酸分析による本発明の方法により取得した疾患予測モデル式を保存しておくことで、被験者より採取した血液等の検体の測定時に、この疾患予測モデル式にあてはめ、特定疾患の検査を行なうことができる。即ち、被験者より採取した検体について、脂肪酸分析結果を疾患予測モデル式にあてはめ、得られた結果が特定の疾患の場合のパターンに重複するか、又は特定疾患のどのステージのパターンに重複するかを確認することで、特定の疾患の検査や、ステージの検査を行うことができる。
【００１１】
本発明の検査方法は、血液等に検体に存在する脂質成分を構成する脂肪酸の変動を網羅的に解析することにより、複数の物質の変動を特定疾患の総体として捉えて検査する手法であり、ひとつのバイオマーカーで検査する結果と比較して、迅速かつ容易に精度の高い検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】大腸がん及び健常者間において特徴的に変動する脂肪酸を探索するために部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）を実施し、作成したローディングプロットを示す図である。図２中の数字は、表１に示す解析対象脂肪酸の番号を示す。（実験例２）
【図２】４２名の大腸がん患者について、解析対象脂肪酸のうち、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の健常者との違いを分析した結果を示す図である。（実験例３）
【図３】４２名の大腸がん患者の臨床病期について、解析対象脂肪酸のうち、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の健常者との違いを分析した結果を示す図である。（実験例４）
【図４】４２名の大腸がん患者の臨床病期について、解析対象脂肪酸のうち、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０について、感度及び特異性を、ＲＯＣ分析（Receiver Operating Characteristic curve）により分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下の工程を含む特定疾患の検査方法に関する。
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、検体中の脂質を構成する脂肪酸を分析し、当該脂肪酸分析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別し、当該解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法により脂肪酸分析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する工程。
【００１４】
上記において、工程（Ａ）の健常者グループ及び疾患患者グループとは、本発明の検査方法による検査結果を導くための標準となりうる者のグループをいう。健常者グループは、広義の意味で定義することができ、健常者に含まれるヒトが、何らかの疾患を有していても、採取した検体が検査対象となる特定の疾患に対して健常であると判断される場合には、健常者グループに含めることができる。疾患患者グループとしては、特定の疾患患者群、特定の疾患のステージが明らかな患者群、特定の疾患の悪性度が明らかな患者群などから構成される。特定の疾患としては特に限定されないが、がんや炎症性疾患などが挙げられる。がんとしては特に限定されないが、たとえば大腸がんやすい臓がんが挙げられ、特に好適には大腸がんが挙げられる。また、炎症性疾患としては、特に限定されないが、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）などが挙げられる。
【００１５】
上記において、工程（Ｂ）の被験者とは、特定の疾患に関する検査の対象、例えば特定の疾患に対する検査、早期診断のための検査、あるいは疾患のステージ、悪性度、治療効果の判定、予後診断などの検査について検査対象となる者をいう。
【００１６】
上記において、工程（Ａ）についての解析対象脂肪酸の多変量解析結果を予め取得しておき、その結果に対して（Ｂ）の被験者についての同分子の多変量解析結果を当てはめ、工程（Ｃ）による差異を確認するのが好適である。（Ａ）についての多変量解析結果を、解析モデルということもできる。
【００１７】
本発明の検査方法を行なうに際し、工程（Ａ）に記載の解析対象脂肪酸は、以下の工程により選別することができる。
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（４）前記取得したマススペクトルデータから、脂肪酸データベースに基づき解析対象脂肪酸を同定する工程；
（５）同定した脂肪酸のうち、脂肪酸データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別する工程。
【００１８】
本発明において、採取した検体とは、例えば血液、組織などが挙げられるが、血液を検体とするのが最も好適である。本明細書において、検体とは生体から採取したものをいい、検体に対して何らかの処理を行い、検査に供されるものを試料ということとする。例えば、上記検体には、脂質成分の他、水溶性の代謝物、例えば糖、アミノ酸や有機物の他、遊離脂肪酸などが含まれる。本発明においては、検体中に含まれる脂質成分を構成する脂肪酸について解析することを目的とするため、脂質成分中から抽出した脂肪酸を含むサンプルを、試料ということとする。上記検体から、脂質成分を抽出し、抽出した脂質成分を加水分解することで、脂質成分を構成する脂肪酸を抽出することができる。検体からの脂質成分の抽出方法及び当該脂質成分からの脂肪酸の抽出方法は、自体公知の方法によることができ、特に限定されない。
【００１９】
本明細書において、脂質成分とは、生体に含まれる脂質成分であって、当該技術分野において一般的に解釈される物質をいうが、例えば脂肪酸と各種アルコールとのエステルである単純脂質（中性脂肪）、脂肪酸・アルコール・リン酸・糖などから成る複合脂質（リン脂質・糖脂質など）及びコレステロールなどが挙げられる。
【００２０】
本発明におけるＭＳ分析とは、脂肪酸の質量分析(Mass spectrometry)を意味する。分析する試料をイオン化させて導入し、電気力や磁気力により質量ごとの差をつくり、イオンの質量を分析することである。上記分析を行う装置である質量分析計を含め以下ＭＳと略する場合がある。より詳しくは、原子、分子、クラスター等の粒子を何等かの方法で気体状のイオンとし、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する事をいう。質量電荷数比に応じて分離・検出されたイオンをもとに、横軸にm/z 、縦軸にイオンの相対強度をとった棒グラフをマススペクトルという。 質量分析をする為の機器を質量分析計といい、試料導入部、イオン源、分析部、イオン検出部そしてデータ処理部から構成される。また、質量分析計を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） や ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）に直結し、移動相を導入することも可能である。それぞれ ＬＣ／ＭＳ、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、ＣＥ−ＭＳと称される。本発明の質量分析計として最も好適には、ＧＣ／ＭＳが適用される。
【００２１】
本発明のＭＳ分析は、得られたマススペクトルデータ中における特定のマススペクトルの消失、出現時間、保持時間、及び／又はピーク強度の上昇若しくは減少を分析することにより行うことができる。
【００２２】
前記工程（４）における脂肪酸データベースに基づき、上記抽出した脂肪酸の質量分析により得られたマススペクトルデータから、脂肪酸を同定することができる。この場合において、質量分析がＧＣ／ＭＳによる場合は、ＧＣ／ＭＳ脂肪酸データベースを用いることができる。
【００２３】
前記工程（５）における有限個の解析対象脂肪酸として、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として適宜選別することができる。選別するための検出量の差の程度は、検査目的に応じて決定し、適宜選択することができる。
【００２４】
具体的には、がんの病態により影響を受ける脂肪酸として、内部標準として、Ｃ１７：０を用い、以下の２６種の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別することができる。
１．Ｃ１４：０
２．Ｃ１５：０
３．Ｃ１６：１ｎ−７
４．Ｃ１６：０
５．Ｃ１７：０（内部標準）
６．Ｃ１８：３ｎ−６
７．Ｃ１８：２ｎ−６
８．Ｃ１８：１ｎ−１２
９．Ｃ１８：１ｎ−９
１０．Ｃ１８：１ｎ−７ｃ
１１．Ｃ１８：０
１２．Ｃ２０：４ｎ−６
１３．Ｃ２０：５ｎ−３ｃ
１４．Ｃ２０：３ｎ−６
１５．Ｃ２０：２ｎ−６ｃ
１６．Ｃ２０：１ｎ−９ｃ
１７．Ｃ２０：０
１８．Ｃ２１：０
１９．Ｃ２２：６ｎ−３ｃ
２０．Ｃ２２：５ｎ−３ｃ
２１．Ｃ２２：０
２２．Ｃ２３：０
２３．Ｃ２４：０
２４．Ｃ２５：０
２５．Ｃ２６：０
２６．Ｃ２８：０
２７．Ｃ３０：０
【００２５】
本発明は、特定の疾患検査方法に限定されるものではなく、検査目的とする個々の疾患に応じて、必要な有限個の解析対象脂肪酸を上述の方法により選別し、解析対象脂肪酸について、多変量解析を行なうことで、検査することができる。大腸がんの場合には、上述の２６種類の解析対象脂肪酸について、多変量解析を行なうのが好適である。大腸がんの場合は、これらの２６種類の解析対象脂肪酸を主成分とし、分散（つまり、データ群のばらつき）が大きい順に、主成分１、主成分２、主成分３・・・・主成分２６とする。これにより、マススペクトルの変動を定性的に分析することができる。また、これにともない、共線性（＝説明変量間の相関が高いこと）の少ない独立な成分を重回帰解析に使用できるようになる。そして説明変量をスコア（Score）あるいはローディング（Loading）、目的変量を特定の疾患の関連物質量とする重回帰解析を適用することができる。これにより、取得したマススペクトルから特定疾患、具体的には大腸がん関連物質量を推定する解析モデルを作成することができる。
【００２６】
これら一連の作業（多変量解析）は主成分回帰法（ＰＣＲ: Principal Component Regression）あるいはＰＬＳ（Partial Least Squares）回帰法として確立されている（参考文献：尾崎幸洋、宇田明史、赤井俊男「化学者のための多変量解析−ケモメトリックス入門」、講談社、2002年）。回帰解析法としてはこのほかにＣＬＳ（Classical Least Squares）法、クロスバリデーション法などが挙げられる。
【００２７】
多変量解析を使用した解析モデルの作成は、自作ソフトウェアや市販の多変量解析ソフトウェアを用いて行うことができる。また、使用目的に特化したソフトウェアの作成により、迅速な解析が可能になる。例えば、市販されているメタボロミクス解析ソフトウェア ProfilerTM AM+、メタボノミクス用UPLC（登録商標）/SynaptTMHDMSTMシステム（販売元：日本ウォーターズ株式会社）、多変量解析ソフトウェアSIMCA-P+（Umetrics社）等を利用することができる。
【００２８】
このような多変量解析ソフトウェアを用いて組み立てられた解析モデルをファイルとして保存しておき、被験者より採取した検体の測定時にこのファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。これにより、特定疾患、例えば大腸がんについて、簡易迅速な判定が可能になる。なお解析モデルは、定量モデル、定性モデルなど複数の解析モデルをファイルとして保存しておき、各モデルは適宜更新されることが好ましい。このように、本発明の検査方法では、解析モデル作成、更新、あるいは作成した解析モデルを用いて試料のスペクトルデータから各臨床疾患に関する検査・診断・判定をコンピュータに実行させることも可能である。
【００２９】
なお、本発明の検査方法は、一つのバイオマーカーによるものではなく、マルチマーカーによる検査を主体としたものであり、患者の病態をより詳しく反映することができる。これにより、各種疾患の早期診断、治療効果の判定、予後診断などを行うことができると考えられる。
【００３０】
上記の方法により解析した結果、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量について、健常者を１としたときに、大腸がん患者については、１より低い値が認められた（図３及び図４参照）。特に、炭素数が１８以下の脂肪酸の存在量は、大腸がんのいずれの病期においても健常者より低い値を示し、炭素数が２０の脂肪酸では、がん病期の早い段階、即ちアデノーマ（Adenoma）において、健常者との違いが認められた（図４参照）。さらに、炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量について、健常者を１としたときに、大腸がん患者については、１より高い値が認められた（図３及び図４参照）。また、炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量についても、アデノーマの段階で、健常者とは明確な違いが認められた。これらの結果より、検体中の脂質成分中に含まれる脂肪酸を解析することで、早期のがんについて、がんか否かを判断することができ、有用な検査方法と考えられた。
【００３１】
例えば、大腸がんに着目した場合、背景技術の欄にも示したように、早期の発見によりほぼ１００％の完治が期待できる。大腸がんの臨床病期（ステージ）分類として、以下が挙げられる。
０期（Adenoma）： がんが粘膜にとどまるもの
I期： がんが大腸壁にとどまるもの
II期： がんが大腸壁を越えているが、隣接臓器に及んでいないもの
III期： リンパ節転移のあるもの
IV期： 腹膜、肝、肺などへの遠隔転移のあるもの
【００３２】
本発明は、以下の工程を含む大腸がんの検査方法に及ぶ。
（１）被験者から取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に大腸がんであると判断する工程。
【００３３】
なお、上記大腸がんの検査方法において、血液検体について、すでに検体中の脂質成分を構成する脂肪酸を含む試料がある場合には、当該試料から特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に大腸がんであると判断する工程のみの場合も、本発明の範囲に含まれるものと解釈される。
【実施例】
【００３４】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３５】
（実施例１）大腸がん検査
神戸大学大学院の倫理委員会の承認を得て、下記４２名の大腸がん患者及び８名の健康なボランティア（健常者）から取得した検体について、脂肪酸分析を行った。
【表１】
【００３６】
大腸がん患者は、以下の臨床病期と病変部位に分類された。ここでは４名が、大腸がんの非常に早い段階患者（Adenoma）であった。病変部位は、それぞれＲ：直腸（３３％）、Ｓ：Ｓ状結腸（３３％）、Ｄ：下行結腸（７％）、Ｔ：横行結腸（７％）、Ａ：上行結腸（１０％）及びＣ：盲腸（１０％）であった。
【表２】
【００３７】
（試料の調製）
上記大腸がん患者及び健常者から採取した血液を遠心分離処理（3000×g、10分間、4℃）を行い、血清を得た。当該血清は、使用時まで-80℃で保存した。
【００３８】
脂肪酸分析のための試料は、遊離脂肪酸又はエステル化脂肪酸をメチル化するために市販の脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク）を用い、メチル化した脂肪酸を脂肪酸メチルエステル精製キット（ナカライテスク）を用いて精製し、調製した。調製試料は、N2ガス雰囲気化で吸引乾燥し、得られた残留物を、100μLのヘキサンで溶解した。各試料は、ＧＣ／ＭＳの測定に供した。
【００３９】
（ＧＣ／ＭＳ分析）
ＧＣ／ＭＳ分析は、GCMS-2010plus（島津製作所）を用いて行った。ガスクロマトグラフィーのシステムでは、DB5MSカラム（30m×0.25mm I.D., フィルム厚 0.25μm）を用いた。
【００４０】
（マススペクトル解析）
島津製作所製GCMSsolutionソフトウェアver.2.53(島津製作所社)を用いてマススペクトル解析を行った。メチル化された脂肪酸の同定は、市販のＧＣ／ＭＳの代謝物質のマススペクトルのデータベース（島津製作所社）を用いて行なった。上記データベースには、５０のメチル化脂肪酸についての分析パラメータが含まれている。上記測定で得られたメチル化脂肪酸のマススペクトルのピークを検出し、得られたデータを保持時間の自動修正機能で補正後、ＧＣ／ＭＳメチル化脂肪酸データベースの保持指標につき、マススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標に基づき、検出されたピークの同定を行った。内部標準としてＣ１７：０（Sigma-Aldrich社）を用い、イオンのピーク面積から定量を行った。
【００４１】
４２名の大腸がん患者及び８名の健康なボランティアについて、上記方法により測定した結果、以下の２６種の解析対象脂肪酸を選別した。
１．Ｃ１４：０
２．Ｃ１５：０
３．Ｃ１６：１ｎ−７
４．Ｃ１６：０
５．Ｃ１７：０（内部標準）
６．Ｃ１８：３ｎ−６
７．Ｃ１８：２ｎ−６
８．Ｃ１８：１ｎ−１２
９．Ｃ１８：１ｎ−９
１０．Ｃ１８：１ｎ−７ｃ
１１．Ｃ１８：０
１２．Ｃ２０：４ｎ−６
１３．Ｃ２０：５ｎ−３ｃ
１４．Ｃ２０：３ｎ−６
１５．Ｃ２０：２ｎ−６ｃ
１６．Ｃ２０：１ｎ−９ｃ
１７．Ｃ２０：０
１８．Ｃ２１：０
１９．Ｃ２２：６ｎ−３ｃ
２０．Ｃ２２：５ｎ−３ｃ
２１．Ｃ２２：０
２２．Ｃ２３：０
２３．Ｃ２４：０
２４．Ｃ２５：０
２５．Ｃ２６：０
２６．Ｃ２８：０
２７．Ｃ３０：０
【００４２】
上記脂肪酸のＧＣ／ＭＳ分析データは、以下である。
【表３】
【００４３】
健常者の値と比較して、２６の脂肪酸のうちの９種について、大腸がん患者の中で著しく変動を認めた。また、９種の脂肪酸のうちの、５種については増加し、４種については減少した(P、スチューデントのt検定による<0.05)。著しく変更された代謝物質は、以下のとおりであった。
（１）大腸がん患者において減少した脂肪酸：Ｃ１４：０（×0.58）、Ｃ１５：０（×0.73）、Ｃ１８：３ｎ−６（×0.48）、Ｃ１８：０（×0.78）
（２）大腸がん患者において増加した脂肪酸：Ｃ２４：０（×1.34）、Ｃ２５：０（×1.40）、Ｃ２６：０（×1.33）、Ｃ２８：０（×1.62）、Ｃ３０：０（×1.51）
【００４４】
（実験例１）大腸がん患者と健常者の各種脂肪酸分布の違い
上記２６種の解析対象脂肪酸のうち、４２名の大腸がん患者及び８名の健康なボランティアについて、大腸がんの臨床病期及び健常者について、各種脂肪酸の分布を解析し、表４に示した。Ｃ１７：０は内部標準として使用した。
【００４５】
【表４】
【００４６】
同様に、大腸がんの病変部位及び健常者について、各種脂肪酸の分布を解析し、表５に示した。表中、Ｒは直腸、ＳはＳ状結腸、Ｄは下行結腸、Ｔは横行結腸、Ａは上行結腸及びＣは盲腸を示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
（実験例２）多変量解析（PLS-DA）
本実験例では、Ｃ１７：０は内部標準とし、上記２６種の解析対象脂肪酸について、４２名の大腸がん患者及び８名の健常者の間に違いがあるかを多変量解析により解析した。PLS-DAは、市販の多変量解析ソフトウェアSIMCAP+ver.12.0.1（Umetrics社）を使用して行った。
【００４９】
大腸がん及び健常者間において特徴的に変動する脂肪酸を探索するために部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）を実施した。部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）では負荷プロット（ローディングプロット、図１）解析を施行することにより、二群間を分離するのに有効な変数を抽出することが可能である。本解析により、Ｃ１８：３ｎ−６(6)、Ｃ１８：０(11)、Ｃ２０：０(17)、Ｃ２４：０(23)及びＣ２８：０(26)が大腸がん及び健常者において変動することが示された。
【００５０】
（実験例３）大腸がん患者と各種脂肪酸の存在比
上記解析により、大腸がん患者及び健常者について、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の存在比（fold induction）を確認したものを図２に示した。健常者の値を１としたときの値をfold inductionとした。その結果、Ｃ１８：３ｎ−６(6)については大腸がん患者で減少傾向を示し(×0.48、p=0.013)、Ｃ１８：０(×0.76、p=0.007)及びＣ２０：０(×0.82、p=0.056)でもやや減少傾向を示した。一方、Ｃ２４：０(×1.34、p=0.020)及びＣ２８：０(×1.62、p=0.002)では増加傾向を示した。
【００５１】
（実験例４）臨床病期と各種脂肪酸の存在比
本実験例では、各臨床病期の大腸がん患者及び健常者について、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の存在比（fold induction）を確認し、図３に示した。
【００５２】
Ｃ１８：３ｎ−６及びＣ１８：０については、いずれの臨床病期においても健常人に比べて、低い値を示した。また、Ｃ２０：０についても、腺腫（Adenoma）の段階で健常人より低い値を示した。一方、Ｃ２４：０及びＣ２８：０は、いずれの臨床病期においても、健常人に比べて高い値を示した。また、上記各傾向は、臨床病期のより早期の段階であるAdenomaの段階であっても、健常人に比べて、顕著な違いが認められた。これらの結果より、血液検体に含まれる脂肪成分に存在する脂肪酸の分布を指標として検査を行うことにより、大腸がんに関して、早期がんの検出が可能であることが示唆された。
【００５３】
（比較例）従来の腫瘍マーカーとの比較
上記各種脂肪酸と、従来より腫瘍のマーカーとして周知のCA19-9(糖鎖抗原19-9)及びCEA(がん胎児性抗原)について、感度及び特異性を比較した。また、感度及び特異性から、ＪＭＰ(R)ソフトウェアを用いて、ＡＵＣ値も比較した。また、ＲＯＣ分析（Receiver Operating Characteristic curve）結果を図４に示した。その結果、本発明の各種脂肪酸分析では、従来の腫瘍マーカーに比べて、感度は優れていることが確認された。これにより、本発明の脂肪酸の分析結果より、腫瘍の検査が可能と考えられた。
【００５４】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上、詳述したように、特定疾患患者及び健常者について、検体中の脂質成分を構成する脂肪酸分析による本発明の方法により取得した疾患予測モデル式を保存しておくことで、被験者より採取した血液等の検体の測定時に、この疾患予測モデル式にあてはめ、特定疾患の検査を行なうことができる。即ち、被験者より採取した検体について、脂肪酸分析結果を疾患予測モデル式にあてはめ、得られた結果が特定の疾患の場合のパターンに重複するか、又は特定疾患のどのステージのパターンに重複するかを確認することで、特定の疾患の検査や、ステージの検査を行うことができる。
【００５６】
本発明の検査方法は、血液等に検体に存在する脂質成分を構成する脂肪酸の変動を網羅的に解析することにより、複数の物質の変動を特定疾患の総体として捉えて検査する手法であり、ひとつのバイオマーカーで検査する結果と比較して、迅速かつ容易に精度の高い検査を行うことができる。
【００５７】
本発明の方法により、被験者について検体中の脂質成分を構成する脂肪酸分析、例えば２６種類の脂肪酸を分析することで、がんの検査を行うことができる。本発明の方法により、臨床病期の早い段階、例えばアデノーマの段階でも、早期に検出することができ、その後の対応について、早期に判断することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者から採取した検体中の脂質を構成する脂肪酸分析を行い、予め取得した健常者グループ及び疾患患者グループの解析結果に基づき、特定疾患の検査を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の疾患診断、特にがん疾患診断は、血液、尿中のバイオマーカー測定による生化学的検査、カメラ、内視鏡等による画像検査が主体である。しかし、現状では、疾患特異的なバイオマーカーが発見されていないものや画像検査が評価の対象とならない疾患も数多く存在し、早期診断や治療効果の判定、予後診断を困難にしている。
【０００３】
現在、がんの検査は血液中の腫瘍マーカー[例えば、CA19-9(糖鎖抗原19-9)、CEA(がん胎児性抗原)、AFP(α-フェトプロテイン)、PIVKA-II、PSA(前立腺特異抗原)、CA125(糖鎖抗原125)など]の数値を指標に一次検査が行われている。大腸がんの罹患率の年次推移は、男女とも1990年代前半までは増加し、その後は横ばい傾向である。また、死亡率の年次推移は、男女とも戦後から1990年代半ばまで増加し、その後漸減傾向である。大腸がんの増加には、主として結腸がんの増加が影響している。大腸がんは、早期であればほぼ１００％近く完治するが、がんに特徴的な症状はなく、一般的には自覚症状はない。従って、無症状である早期の時期に発見することが重要となる。大腸がんのスクリーニング（検診）の代表的なものとして、大便の免疫学的潜血反応が挙げられるが、十分ではない。血液中の腫瘍マーカー（CEA、CA19-9など）の異常値により発見される場合もあるが、より早期の診断が求められる。
【０００４】
一方、創薬、薬理学、毒性学、診断に供する知見を得るための新たな研究手法として、メタボロームの解析が行われている。また、メタボロームの解析方法として、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗法（ＰＬＳ）などの統計分析を用い、取得したスコアの座標配置による群分けを行い、ローディングプロットによる化合物を同定してマーカーを選別する方法が報告されている。例えば、特開２００７−３１５８５２（特許文献１）は、「被験物質が薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測又は診断する方法を提供すこと」を開示している。
【０００５】
しかしながら、生体内の脂肪酸を解析して、疾患診断バイオマーカーとしての有用性を確認した報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３１５８５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、疾患特異的なバイオマーカーが発見されていない疾患や、画像検査が評価の対象とならないような特定の疾患に対して、早期診断や治療効果の判定、予後診断に適用可能な検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被験者より採取した検体についての脂肪酸分析結果を、予め取得した特定疾患患者及び健常者についての脂肪酸分析結果にあてはめることで、特定の疾患の検査、例えば早期診断、治療効果の判定、予後診断等を容易に行なうことが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の工程を含む特定疾患の検査方法：
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、検体中の脂質を構成する脂肪酸を分析し、当該脂肪酸分析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別し、当該解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法により脂肪酸分析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する工程。
２．前記工程（Ａ）に記載の検体中の脂質を構成する脂肪酸の分析が、以下により行なわれる、前項１に記載の検査方法：
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（４）前記取得したマススペクトルデータから、脂肪酸データベースに基づき解析対象脂肪酸を同定する工程；
（５）同定した脂肪酸のうち、脂肪酸データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別する工程。
３．前記工程（３）におけるマススペクトルデータが、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により得られたものである、前項２に記載の検査方法。
４．前記工程（４）における脂肪酸データベースが、ＧＣ／ＭＳ脂肪酸データベースである、前項３に記載の検査方法。
５．前記工程（５）における有限個の解析対象脂肪酸が以下に示す２６成分の脂肪酸である前項１〜６のいずれか１に記載の検査方法：
Ｃ１４：０，Ｃ１５：０，Ｃ１６：１ｎ−７，Ｃ１６：０，Ｃ１８：３ｎ−６，Ｃ１８：２ｎ−６，Ｃ１８：１ｎ−１２，Ｃ１８：１ｎ−９，Ｃ１８：１ｎ−７ｃ，Ｃ１８：０，Ｃ２０：４ｎ−６，Ｃ２０：５ｎ−３ｃ，Ｃ２０：３ｎ−６，Ｃ２０：２ｎ−６ｃ，Ｃ２０：１ｎ−９ｃ，Ｃ２０：０，Ｃ２１：０，Ｃ２２：６ｎ−３ｃ，Ｃ２２：５ｎ−３ｃ，Ｃ２２：０，Ｃ２３：０，Ｃ２４：０，Ｃ２５：０，Ｃ２６：０，Ｃ２８：０及びＣ３０：０。
６．特定の疾患が、がんである、前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
７．がんが、大腸がんである、前項６に記載の検査方法。
８．検体中の脂質を構成する脂肪酸において、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する、前項６又は７に記載の検査方法。
９．被験者から取得した検体中の脂質成分を構成する脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に、がんであると判断する、特定疾患の検査方法。
１０．以下の工程を含む、前項９に記載の検査方法：
（１）被験者から取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する工程。
１１．がんが、大腸がんである前項９又は１０に記載の検査方法。
１２．検体が、血液である前項１〜１１のいずれか１に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
特定疾患患者及び健常者について、検体中の脂質成分を構成する脂肪酸分析による本発明の方法により取得した疾患予測モデル式を保存しておくことで、被験者より採取した血液等の検体の測定時に、この疾患予測モデル式にあてはめ、特定疾患の検査を行なうことができる。即ち、被験者より採取した検体について、脂肪酸分析結果を疾患予測モデル式にあてはめ、得られた結果が特定の疾患の場合のパターンに重複するか、又は特定疾患のどのステージのパターンに重複するかを確認することで、特定の疾患の検査や、ステージの検査を行うことができる。
【００１１】
本発明の検査方法は、血液等に検体に存在する脂質成分を構成する脂肪酸の変動を網羅的に解析することにより、複数の物質の変動を特定疾患の総体として捉えて検査する手法であり、ひとつのバイオマーカーで検査する結果と比較して、迅速かつ容易に精度の高い検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】大腸がん及び健常者間において特徴的に変動する脂肪酸を探索するために部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）を実施し、作成したローディングプロットを示す図である。図２中の数字は、表１に示す解析対象脂肪酸の番号を示す。（実験例２）
【図２】４２名の大腸がん患者について、解析対象脂肪酸のうち、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の健常者との違いを分析した結果を示す図である。（実験例３）
【図３】４２名の大腸がん患者の臨床病期について、解析対象脂肪酸のうち、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の健常者との違いを分析した結果を示す図である。（実験例４）
【図４】４２名の大腸がん患者の臨床病期について、解析対象脂肪酸のうち、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０について、感度及び特異性を、ＲＯＣ分析（Receiver Operating Characteristic curve）により分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下の工程を含む特定疾患の検査方法に関する。
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、検体中の脂質を構成する脂肪酸を分析し、当該脂肪酸分析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別し、当該解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法により脂肪酸分析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する工程。
【００１４】
上記において、工程（Ａ）の健常者グループ及び疾患患者グループとは、本発明の検査方法による検査結果を導くための標準となりうる者のグループをいう。健常者グループは、広義の意味で定義することができ、健常者に含まれるヒトが、何らかの疾患を有していても、採取した検体が検査対象となる特定の疾患に対して健常であると判断される場合には、健常者グループに含めることができる。疾患患者グループとしては、特定の疾患患者群、特定の疾患のステージが明らかな患者群、特定の疾患の悪性度が明らかな患者群などから構成される。特定の疾患としては特に限定されないが、がんや炎症性疾患などが挙げられる。がんとしては特に限定されないが、たとえば大腸がんやすい臓がんが挙げられ、特に好適には大腸がんが挙げられる。また、炎症性疾患としては、特に限定されないが、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）などが挙げられる。
【００１５】
上記において、工程（Ｂ）の被験者とは、特定の疾患に関する検査の対象、例えば特定の疾患に対する検査、早期診断のための検査、あるいは疾患のステージ、悪性度、治療効果の判定、予後診断などの検査について検査対象となる者をいう。
【００１６】
上記において、工程（Ａ）についての解析対象脂肪酸の多変量解析結果を予め取得しておき、その結果に対して（Ｂ）の被験者についての同分子の多変量解析結果を当てはめ、工程（Ｃ）による差異を確認するのが好適である。（Ａ）についての多変量解析結果を、解析モデルということもできる。
【００１７】
本発明の検査方法を行なうに際し、工程（Ａ）に記載の解析対象脂肪酸は、以下の工程により選別することができる。
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（４）前記取得したマススペクトルデータから、脂肪酸データベースに基づき解析対象脂肪酸を同定する工程；
（５）同定した脂肪酸のうち、脂肪酸データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別する工程。
【００１８】
本発明において、採取した検体とは、例えば血液、組織などが挙げられるが、血液を検体とするのが最も好適である。本明細書において、検体とは生体から採取したものをいい、検体に対して何らかの処理を行い、検査に供されるものを試料ということとする。例えば、上記検体には、脂質成分の他、水溶性の代謝物、例えば糖、アミノ酸や有機物の他、遊離脂肪酸などが含まれる。本発明においては、検体中に含まれる脂質成分を構成する脂肪酸について解析することを目的とするため、脂質成分中から抽出した脂肪酸を含むサンプルを、試料ということとする。上記検体から、脂質成分を抽出し、抽出した脂質成分を加水分解することで、脂質成分を構成する脂肪酸を抽出することができる。検体からの脂質成分の抽出方法及び当該脂質成分からの脂肪酸の抽出方法は、自体公知の方法によることができ、特に限定されない。
【００１９】
本明細書において、脂質成分とは、生体に含まれる脂質成分であって、当該技術分野において一般的に解釈される物質をいうが、例えば脂肪酸と各種アルコールとのエステルである単純脂質（中性脂肪）、脂肪酸・アルコール・リン酸・糖などから成る複合脂質（リン脂質・糖脂質など）及びコレステロールなどが挙げられる。
【００２０】
本発明におけるＭＳ分析とは、脂肪酸の質量分析(Mass spectrometry)を意味する。分析する試料をイオン化させて導入し、電気力や磁気力により質量ごとの差をつくり、イオンの質量を分析することである。上記分析を行う装置である質量分析計を含め以下ＭＳと略する場合がある。より詳しくは、原子、分子、クラスター等の粒子を何等かの方法で気体状のイオンとし、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する事をいう。質量電荷数比に応じて分離・検出されたイオンをもとに、横軸にm/z 、縦軸にイオンの相対強度をとった棒グラフをマススペクトルという。 質量分析をする為の機器を質量分析計といい、試料導入部、イオン源、分析部、イオン検出部そしてデータ処理部から構成される。また、質量分析計を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） や ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）に直結し、移動相を導入することも可能である。それぞれ ＬＣ／ＭＳ、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、ＣＥ−ＭＳと称される。本発明の質量分析計として最も好適には、ＧＣ／ＭＳが適用される。
【００２１】
本発明のＭＳ分析は、得られたマススペクトルデータ中における特定のマススペクトルの消失、出現時間、保持時間、及び／又はピーク強度の上昇若しくは減少を分析することにより行うことができる。
【００２２】
前記工程（４）における脂肪酸データベースに基づき、上記抽出した脂肪酸の質量分析により得られたマススペクトルデータから、脂肪酸を同定することができる。この場合において、質量分析がＧＣ／ＭＳによる場合は、ＧＣ／ＭＳ脂肪酸データベースを用いることができる。
【００２３】
前記工程（５）における有限個の解析対象脂肪酸として、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として適宜選別することができる。選別するための検出量の差の程度は、検査目的に応じて決定し、適宜選択することができる。
【００２４】
具体的には、がんの病態により影響を受ける脂肪酸として、内部標準として、Ｃ１７：０を用い、以下の２６種の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別することができる。
１．Ｃ１４：０
２．Ｃ１５：０
３．Ｃ１６：１ｎ−７
４．Ｃ１６：０
５．Ｃ１７：０（内部標準）
６．Ｃ１８：３ｎ−６
７．Ｃ１８：２ｎ−６
８．Ｃ１８：１ｎ−１２
９．Ｃ１８：１ｎ−９
１０．Ｃ１８：１ｎ−７ｃ
１１．Ｃ１８：０
１２．Ｃ２０：４ｎ−６
１３．Ｃ２０：５ｎ−３ｃ
１４．Ｃ２０：３ｎ−６
１５．Ｃ２０：２ｎ−６ｃ
１６．Ｃ２０：１ｎ−９ｃ
１７．Ｃ２０：０
１８．Ｃ２１：０
１９．Ｃ２２：６ｎ−３ｃ
２０．Ｃ２２：５ｎ−３ｃ
２１．Ｃ２２：０
２２．Ｃ２３：０
２３．Ｃ２４：０
２４．Ｃ２５：０
２５．Ｃ２６：０
２６．Ｃ２８：０
２７．Ｃ３０：０
【００２５】
本発明は、特定の疾患検査方法に限定されるものではなく、検査目的とする個々の疾患に応じて、必要な有限個の解析対象脂肪酸を上述の方法により選別し、解析対象脂肪酸について、多変量解析を行なうことで、検査することができる。大腸がんの場合には、上述の２６種類の解析対象脂肪酸について、多変量解析を行なうのが好適である。大腸がんの場合は、これらの２６種類の解析対象脂肪酸を主成分とし、分散（つまり、データ群のばらつき）が大きい順に、主成分１、主成分２、主成分３・・・・主成分２６とする。これにより、マススペクトルの変動を定性的に分析することができる。また、これにともない、共線性（＝説明変量間の相関が高いこと）の少ない独立な成分を重回帰解析に使用できるようになる。そして説明変量をスコア（Score）あるいはローディング（Loading）、目的変量を特定の疾患の関連物質量とする重回帰解析を適用することができる。これにより、取得したマススペクトルから特定疾患、具体的には大腸がん関連物質量を推定する解析モデルを作成することができる。
【００２６】
これら一連の作業（多変量解析）は主成分回帰法（ＰＣＲ: Principal Component Regression）あるいはＰＬＳ（Partial Least Squares）回帰法として確立されている（参考文献：尾崎幸洋、宇田明史、赤井俊男「化学者のための多変量解析−ケモメトリックス入門」、講談社、2002年）。回帰解析法としてはこのほかにＣＬＳ（Classical Least Squares）法、クロスバリデーション法などが挙げられる。
【００２７】
多変量解析を使用した解析モデルの作成は、自作ソフトウェアや市販の多変量解析ソフトウェアを用いて行うことができる。また、使用目的に特化したソフトウェアの作成により、迅速な解析が可能になる。例えば、市販されているメタボロミクス解析ソフトウェア ProfilerTM AM+、メタボノミクス用UPLC（登録商標）/SynaptTMHDMSTMシステム（販売元：日本ウォーターズ株式会社）、多変量解析ソフトウェアSIMCA-P+（Umetrics社）等を利用することができる。
【００２８】
このような多変量解析ソフトウェアを用いて組み立てられた解析モデルをファイルとして保存しておき、被験者より採取した検体の測定時にこのファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。これにより、特定疾患、例えば大腸がんについて、簡易迅速な判定が可能になる。なお解析モデルは、定量モデル、定性モデルなど複数の解析モデルをファイルとして保存しておき、各モデルは適宜更新されることが好ましい。このように、本発明の検査方法では、解析モデル作成、更新、あるいは作成した解析モデルを用いて試料のスペクトルデータから各臨床疾患に関する検査・診断・判定をコンピュータに実行させることも可能である。
【００２９】
なお、本発明の検査方法は、一つのバイオマーカーによるものではなく、マルチマーカーによる検査を主体としたものであり、患者の病態をより詳しく反映することができる。これにより、各種疾患の早期診断、治療効果の判定、予後診断などを行うことができると考えられる。
【００３０】
上記の方法により解析した結果、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量について、健常者を１としたときに、大腸がん患者については、１より低い値が認められた（図３及び図４参照）。特に、炭素数が１８以下の脂肪酸の存在量は、大腸がんのいずれの病期においても健常者より低い値を示し、炭素数が２０の脂肪酸では、がん病期の早い段階、即ちアデノーマ（Adenoma）において、健常者との違いが認められた（図４参照）。さらに、炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量について、健常者を１としたときに、大腸がん患者については、１より高い値が認められた（図３及び図４参照）。また、炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量についても、アデノーマの段階で、健常者とは明確な違いが認められた。これらの結果より、検体中の脂質成分中に含まれる脂肪酸を解析することで、早期のがんについて、がんか否かを判断することができ、有用な検査方法と考えられた。
【００３１】
例えば、大腸がんに着目した場合、背景技術の欄にも示したように、早期の発見によりほぼ１００％の完治が期待できる。大腸がんの臨床病期（ステージ）分類として、以下が挙げられる。
０期（Adenoma）： がんが粘膜にとどまるもの
I期： がんが大腸壁にとどまるもの
II期： がんが大腸壁を越えているが、隣接臓器に及んでいないもの
III期： リンパ節転移のあるもの
IV期： 腹膜、肝、肺などへの遠隔転移のあるもの
【００３２】
本発明は、以下の工程を含む大腸がんの検査方法に及ぶ。
（１）被験者から取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に大腸がんであると判断する工程。
【００３３】
なお、上記大腸がんの検査方法において、血液検体について、すでに検体中の脂質成分を構成する脂肪酸を含む試料がある場合には、当該試料から特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に大腸がんであると判断する工程のみの場合も、本発明の範囲に含まれるものと解釈される。
【実施例】
【００３４】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３５】
（実施例１）大腸がん検査
神戸大学大学院の倫理委員会の承認を得て、下記４２名の大腸がん患者及び８名の健康なボランティア（健常者）から取得した検体について、脂肪酸分析を行った。
【表１】
【００３６】
大腸がん患者は、以下の臨床病期と病変部位に分類された。ここでは４名が、大腸がんの非常に早い段階患者（Adenoma）であった。病変部位は、それぞれＲ：直腸（３３％）、Ｓ：Ｓ状結腸（３３％）、Ｄ：下行結腸（７％）、Ｔ：横行結腸（７％）、Ａ：上行結腸（１０％）及びＣ：盲腸（１０％）であった。
【表２】
【００３７】
（試料の調製）
上記大腸がん患者及び健常者から採取した血液を遠心分離処理（3000×g、10分間、4℃）を行い、血清を得た。当該血清は、使用時まで-80℃で保存した。
【００３８】
脂肪酸分析のための試料は、遊離脂肪酸又はエステル化脂肪酸をメチル化するために市販の脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク）を用い、メチル化した脂肪酸を脂肪酸メチルエステル精製キット（ナカライテスク）を用いて精製し、調製した。調製試料は、N2ガス雰囲気化で吸引乾燥し、得られた残留物を、100μLのヘキサンで溶解した。各試料は、ＧＣ／ＭＳの測定に供した。
【００３９】
（ＧＣ／ＭＳ分析）
ＧＣ／ＭＳ分析は、GCMS-2010plus（島津製作所）を用いて行った。ガスクロマトグラフィーのシステムでは、DB5MSカラム（30m×0.25mm I.D., フィルム厚 0.25μm）を用いた。
【００４０】
（マススペクトル解析）
島津製作所製GCMSsolutionソフトウェアver.2.53(島津製作所社)を用いてマススペクトル解析を行った。メチル化された脂肪酸の同定は、市販のＧＣ／ＭＳの代謝物質のマススペクトルのデータベース（島津製作所社）を用いて行なった。上記データベースには、５０のメチル化脂肪酸についての分析パラメータが含まれている。上記測定で得られたメチル化脂肪酸のマススペクトルのピークを検出し、得られたデータを保持時間の自動修正機能で補正後、ＧＣ／ＭＳメチル化脂肪酸データベースの保持指標につき、マススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標に基づき、検出されたピークの同定を行った。内部標準としてＣ１７：０（Sigma-Aldrich社）を用い、イオンのピーク面積から定量を行った。
【００４１】
４２名の大腸がん患者及び８名の健康なボランティアについて、上記方法により測定した結果、以下の２６種の解析対象脂肪酸を選別した。
１．Ｃ１４：０
２．Ｃ１５：０
３．Ｃ１６：１ｎ−７
４．Ｃ１６：０
５．Ｃ１７：０（内部標準）
６．Ｃ１８：３ｎ−６
７．Ｃ１８：２ｎ−６
８．Ｃ１８：１ｎ−１２
９．Ｃ１８：１ｎ−９
１０．Ｃ１８：１ｎ−７ｃ
１１．Ｃ１８：０
１２．Ｃ２０：４ｎ−６
１３．Ｃ２０：５ｎ−３ｃ
１４．Ｃ２０：３ｎ−６
１５．Ｃ２０：２ｎ−６ｃ
１６．Ｃ２０：１ｎ−９ｃ
１７．Ｃ２０：０
１８．Ｃ２１：０
１９．Ｃ２２：６ｎ−３ｃ
２０．Ｃ２２：５ｎ−３ｃ
２１．Ｃ２２：０
２２．Ｃ２３：０
２３．Ｃ２４：０
２４．Ｃ２５：０
２５．Ｃ２６：０
２６．Ｃ２８：０
２７．Ｃ３０：０
【００４２】
上記脂肪酸のＧＣ／ＭＳ分析データは、以下である。
【表３】
【００４３】
健常者の値と比較して、２６の脂肪酸のうちの９種について、大腸がん患者の中で著しく変動を認めた。また、９種の脂肪酸のうちの、５種については増加し、４種については減少した(P、スチューデントのt検定による<0.05)。著しく変更された代謝物質は、以下のとおりであった。
（１）大腸がん患者において減少した脂肪酸：Ｃ１４：０（×0.58）、Ｃ１５：０（×0.73）、Ｃ１８：３ｎ−６（×0.48）、Ｃ１８：０（×0.78）
（２）大腸がん患者において増加した脂肪酸：Ｃ２４：０（×1.34）、Ｃ２５：０（×1.40）、Ｃ２６：０（×1.33）、Ｃ２８：０（×1.62）、Ｃ３０：０（×1.51）
【００４４】
（実験例１）大腸がん患者と健常者の各種脂肪酸分布の違い
上記２６種の解析対象脂肪酸のうち、４２名の大腸がん患者及び８名の健康なボランティアについて、大腸がんの臨床病期及び健常者について、各種脂肪酸の分布を解析し、表４に示した。Ｃ１７：０は内部標準として使用した。
【００４５】
【表４】
【００４６】
同様に、大腸がんの病変部位及び健常者について、各種脂肪酸の分布を解析し、表５に示した。表中、Ｒは直腸、ＳはＳ状結腸、Ｄは下行結腸、Ｔは横行結腸、Ａは上行結腸及びＣは盲腸を示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】
（実験例２）多変量解析（PLS-DA）
本実験例では、Ｃ１７：０は内部標準とし、上記２６種の解析対象脂肪酸について、４２名の大腸がん患者及び８名の健常者の間に違いがあるかを多変量解析により解析した。PLS-DAは、市販の多変量解析ソフトウェアSIMCAP+ver.12.0.1（Umetrics社）を使用して行った。
【００４９】
大腸がん及び健常者間において特徴的に変動する脂肪酸を探索するために部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）を実施した。部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）では負荷プロット（ローディングプロット、図１）解析を施行することにより、二群間を分離するのに有効な変数を抽出することが可能である。本解析により、Ｃ１８：３ｎ−６(6)、Ｃ１８：０(11)、Ｃ２０：０(17)、Ｃ２４：０(23)及びＣ２８：０(26)が大腸がん及び健常者において変動することが示された。
【００５０】
（実験例３）大腸がん患者と各種脂肪酸の存在比
上記解析により、大腸がん患者及び健常者について、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の存在比（fold induction）を確認したものを図２に示した。健常者の値を１としたときの値をfold inductionとした。その結果、Ｃ１８：３ｎ−６(6)については大腸がん患者で減少傾向を示し(×0.48、p=0.013)、Ｃ１８：０(×0.76、p=0.007)及びＣ２０：０(×0.82、p=0.056)でもやや減少傾向を示した。一方、Ｃ２４：０(×1.34、p=0.020)及びＣ２８：０(×1.62、p=0.002)では増加傾向を示した。
【００５１】
（実験例４）臨床病期と各種脂肪酸の存在比
本実験例では、各臨床病期の大腸がん患者及び健常者について、Ｃ１８：３ｎ−６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２８：０の各脂肪酸の存在比（fold induction）を確認し、図３に示した。
【００５２】
Ｃ１８：３ｎ−６及びＣ１８：０については、いずれの臨床病期においても健常人に比べて、低い値を示した。また、Ｃ２０：０についても、腺腫（Adenoma）の段階で健常人より低い値を示した。一方、Ｃ２４：０及びＣ２８：０は、いずれの臨床病期においても、健常人に比べて高い値を示した。また、上記各傾向は、臨床病期のより早期の段階であるAdenomaの段階であっても、健常人に比べて、顕著な違いが認められた。これらの結果より、血液検体に含まれる脂肪成分に存在する脂肪酸の分布を指標として検査を行うことにより、大腸がんに関して、早期がんの検出が可能であることが示唆された。
【００５３】
（比較例）従来の腫瘍マーカーとの比較
上記各種脂肪酸と、従来より腫瘍のマーカーとして周知のCA19-9(糖鎖抗原19-9)及びCEA(がん胎児性抗原)について、感度及び特異性を比較した。また、感度及び特異性から、ＪＭＰ(R)ソフトウェアを用いて、ＡＵＣ値も比較した。また、ＲＯＣ分析（Receiver Operating Characteristic curve）結果を図４に示した。その結果、本発明の各種脂肪酸分析では、従来の腫瘍マーカーに比べて、感度は優れていることが確認された。これにより、本発明の脂肪酸の分析結果より、腫瘍の検査が可能と考えられた。
【００５４】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上、詳述したように、特定疾患患者及び健常者について、検体中の脂質成分を構成する脂肪酸分析による本発明の方法により取得した疾患予測モデル式を保存しておくことで、被験者より採取した血液等の検体の測定時に、この疾患予測モデル式にあてはめ、特定疾患の検査を行なうことができる。即ち、被験者より採取した検体について、脂肪酸分析結果を疾患予測モデル式にあてはめ、得られた結果が特定の疾患の場合のパターンに重複するか、又は特定疾患のどのステージのパターンに重複するかを確認することで、特定の疾患の検査や、ステージの検査を行うことができる。
【００５６】
本発明の検査方法は、血液等に検体に存在する脂質成分を構成する脂肪酸の変動を網羅的に解析することにより、複数の物質の変動を特定疾患の総体として捉えて検査する手法であり、ひとつのバイオマーカーで検査する結果と比較して、迅速かつ容易に精度の高い検査を行うことができる。
【００５７】
本発明の方法により、被験者について検体中の脂質成分を構成する脂肪酸分析、例えば２６種類の脂肪酸を分析することで、がんの検査を行うことができる。本発明の方法により、臨床病期の早い段階、例えばアデノーマの段階でも、早期に検出することができ、その後の対応について、早期に判断することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む特定疾患の検査方法：
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、検体中の脂質を構成する脂肪酸を分析し、当該脂肪酸分析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別し、当該解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法により脂肪酸分析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する工程。
【請求項２】
前記工程（Ａ）に記載の検体中の脂質を構成する脂肪酸の分析が、以下により行なわれる、請求項１に記載の検査方法：
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（４）前記取得したマススペクトルデータから、脂肪酸データベースに基づき解析対象脂肪酸を同定する工程；
（５）同定した脂肪酸のうち、脂肪酸データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別する工程。
【請求項３】
前記工程（３）におけるマススペクトルデータが、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により得られたものである、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記工程（４）における脂肪酸データベースが、ＧＣ／ＭＳ脂肪酸データベースである、請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
前記工程（５）における有限個の解析対象脂肪酸が以下に示す２６成分の脂肪酸である請求項１〜６のいずれか１に記載の検査方法：
Ｃ１４：０，Ｃ１５：０，Ｃ１６：１ｎ−７，Ｃ１６：０，Ｃ１８：３ｎ−６，Ｃ１８：２ｎ−６，Ｃ１８：１ｎ−１２，Ｃ１８：１ｎ−９，Ｃ１８：１ｎ−７ｃ，Ｃ１８：０，Ｃ２０：４ｎ−６，Ｃ２０：５ｎ−３ｃ，Ｃ２０：３ｎ−６，Ｃ２０：２ｎ−６ｃ，Ｃ２０：１ｎ−９ｃ，Ｃ２０：０，Ｃ２１：０，Ｃ２２：６ｎ−３ｃ，Ｃ２２：５ｎ−３ｃ，Ｃ２２：０，Ｃ２３：０，Ｃ２４：０，Ｃ２５：０，Ｃ２６：０，Ｃ２８：０及びＣ３０：０。
【請求項６】
特定の疾患が、がんである、請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項７】
がんが、大腸がんである、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
検体中の脂質を構成する脂肪酸において、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する、請求項６又は７に記載の検査方法。
【請求項９】
被験者から取得した検体中の脂質成分を構成する脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に、がんであると判断する、特定疾患の検査方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項９に記載の検査方法：
（１）被験者から取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する工程。
【請求項１１】
がんが、大腸がんである請求項９又は１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
検体が、血液である請求項１〜１１のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項１】
以下の工程を含む特定疾患の検査方法：
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、検体中の脂質を構成する脂肪酸を分析し、当該脂肪酸分析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別し、当該解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法により脂肪酸分析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象脂肪酸の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する工程。
【請求項２】
前記工程（Ａ）に記載の検体中の脂質を構成する脂肪酸の分析が、以下により行なわれる、請求項１に記載の検査方法：
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（４）前記取得したマススペクトルデータから、脂肪酸データベースに基づき解析対象脂肪酸を同定する工程；
（５）同定した脂肪酸のうち、脂肪酸データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各脂肪酸のマススペクトルパターン、各脂肪酸に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の脂肪酸を解析対象脂肪酸として選別する工程。
【請求項３】
前記工程（３）におけるマススペクトルデータが、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により得られたものである、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記工程（４）における脂肪酸データベースが、ＧＣ／ＭＳ脂肪酸データベースである、請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
前記工程（５）における有限個の解析対象脂肪酸が以下に示す２６成分の脂肪酸である請求項１〜６のいずれか１に記載の検査方法：
Ｃ１４：０，Ｃ１５：０，Ｃ１６：１ｎ−７，Ｃ１６：０，Ｃ１８：３ｎ−６，Ｃ１８：２ｎ−６，Ｃ１８：１ｎ−１２，Ｃ１８：１ｎ−９，Ｃ１８：１ｎ−７ｃ，Ｃ１８：０，Ｃ２０：４ｎ−６，Ｃ２０：５ｎ−３ｃ，Ｃ２０：３ｎ−６，Ｃ２０：２ｎ−６ｃ，Ｃ２０：１ｎ−９ｃ，Ｃ２０：０，Ｃ２１：０，Ｃ２２：６ｎ−３ｃ，Ｃ２２：５ｎ−３ｃ，Ｃ２２：０，Ｃ２３：０，Ｃ２４：０，Ｃ２５：０，Ｃ２６：０，Ｃ２８：０及びＣ３０：０。
【請求項６】
特定の疾患が、がんである、請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項７】
がんが、大腸がんである、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
検体中の脂質を構成する脂肪酸において、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する、請求項６又は７に記載の検査方法。
【請求項９】
被験者から取得した検体中の脂質成分を構成する脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合に、がんであると判断する、特定疾患の検査方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項９に記載の検査方法：
（１）被験者から取得した検体から、検体中の脂質を抽出する工程；
（２）前記抽出した脂質を加水分解することにより、当該脂質を構成する脂肪酸を分離し、当該脂肪酸を抽出する工程；
（３）前記抽出した脂肪酸について、特定の脂肪酸の存在量について健常者を１としたときに、炭素数が２０以下の脂肪酸の存在量が、被験者において１より低い場合に、及び／又は炭素数が２４以上の脂肪酸の存在量が、被験者において１より高い場合にがんであると判断する工程。
【請求項１１】
がんが、大腸がんである請求項９又は１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
検体が、血液である請求項１〜１１のいずれか１に記載の検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１１７９９８（Ｐ２０１２−１１７９９８Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７００８４（Ｐ２０１０−２７００８４）
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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