脱色用プロテアーゼおよびその用途
【課題】人体に対する影響の少ない微生物を用いて、着色溶液等に含まれる着色成分を脱色する作用のある脱色用プロテアーゼを提供すること。
【解決手段】
［１］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養して得られる脱色用プロテアーゼ。
［２］前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、請求項１に記載の脱色用プロテアーゼ。
【解決手段】
［１］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養して得られる脱色用プロテアーゼ。
［２］前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、請求項１に記載の脱色用プロテアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脱色用プロテアーゼおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業活動の過程で排出される廃液の着色成分を脱色するためには硫酸アルミニウムや塩化第二鉄等の凝集剤を用いた沈殿法、オゾン等による分解法、活性炭等による吸着法等が使用されてきたが、これらの方法では経済性、操作性の面で大規模に実施することが容易ではなく、着色成分を除去できたとしても今度は使用済みの凝集剤や活性炭等の処理が問題となる。
この様な問題に対処するため、現在では微生物による脱色作用の応用が注目されていきている。
具体的には、リグニン、染料、フミンおよびメラノイジンの着色成分を効率よく脱色する優れたアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）による着色溶液の脱色方法が提案されている（特許文献１）。
このアスペルギルス・フミガタスによる脱色の際に前記アスペルギルス・フミガタス自体が着色してくることから、大部分は前記アスペルギルス・フミガタスの吸着による脱色作用であることが示唆されている（特許文献２）。
【特許文献１】特開平６−１５３９１３号公報
【特許文献２】特開平６−３９３９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら微生物は種類によっては人体に対する影響が未知のものも存在することから、人体に対して安全な微生物の用途拡大が期待されていた。
本発明の目的は人体に対する影響の少ない微生物を用いて、着色溶液等に含まれる着色成分を脱色する作用のある脱色用プロテアーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討した結果、鰹節かび菌を培養して得られるプロテアーゼが脱色作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
［１］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養して得られる脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［２］前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、上記［１］に記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［３］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養し、得られた培養液の不溶分を除去した溶液に含まれる、上記［１］または［２］に記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
［４］分子量が４５０００〜６６０００の範囲である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［５］Ｎ末端アミノ酸配列の末端の７個のアミノ酸がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの順に配列している、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［６］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養する工程と、得られた培養液の不溶分を除去する工程と、を含むことを特徴とする、脱色用プロテアーゼの生産方法を提供するものである。
また本発明は、
［７］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを用いることを特徴とする、着色成分の脱色方法を提供するものである。
また本発明は、
［８］前記着色成分が、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方である、上記［７］に記載の脱色方法を提供するものである。
また本発明は、
［９］独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の脱色用プロテアーゼは、ミオグロビン、ヘモグロビン等の着色成分を有効に脱色することができる。
また前記脱色用プロテアーゼは鰹節かび菌を培地で培養することにより簡便に得られることから量産性、経済性に優れる。
さらに前記脱色用プロテアーゼは食品用途に応用されている鰹節かび菌により得られることから比較的人体に対する影響が少ないプロセスにより得ることができ、特に食品、化粧品分野等の脱色用途に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の脱色用プロテアーゼは鰹節かび菌であるアスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養することにより得られる。
前記アスペルギルス レペンスの培養には、鰹節かび菌の培養に用いられている公知の培地用成分を使用することができる。
【０００８】
例えば、培養に使用する炭素源としては、グルコース、マンノース、フラクトース、マンノース、リボース、キシロース等のアルドース類、グルコン酸、マンノン酸等のアルドン酸類、グルカル酸、マンナル酸等のアルダル酸類、ソルビトール、マンニトール等のアルジトール類、グルクロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸類等、
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
また培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。
【０００９】
前記炭素源、窒素源、リン源、カリウム源等は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００１０】
前記培地用成分として、必要に応じてｐＨを調整するための緩衝成分、ポリアクリル酸誘導体等のゲル化成分等を配合することができる。
【００１１】
前記アスペルギルス レペンスを培養するときの条件は以下の通りである。
【００１２】
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときの温度は、１５〜５５℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２５〜４５℃の範囲である。
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときの時間は、１２時間〜１２日の範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜１１日の範囲であり、さらに好ましくは３〜１０日の範囲である。
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときのｐＨは、２〜８の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは３〜７の範囲であり、さらに好ましくは４〜６の範囲である。
【００１３】
前記アスペルギルス レペンスの培養の際に使用する水に特に限定はなく、イオン交換水、蒸留水、水道水、通常の水道水から塩素を除去した工業用水等が使用される。
【００１４】
前記アスペルギルス レペンスの培養後、前記培地のうち水に溶けない成分を遠心分離、濾過等の操作により除去することにより、前記脱色用プロテアーゼを含む溶液を得ることができる。
この様にして得られた脱色用プロテアーゼを、ミオグロビン、ヘモグロビン等の着色成分と接触させることにより、前記着色成分を脱色させることができる。
前記着色成分の脱色は、前記脱色用プロテアーゼと前記着色成分とを水溶液中で接触させる方法等により行うことができる。
【００１５】
次に本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
本実施例に使用したアスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されているものである。
前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２の微生物学上の特徴は次の通りである。
【００１７】
（１）生育温度
２５〜３０℃の範囲で良好に生育する。
（２）生育ｐＨ
ｐＨ３．０〜ｐＨ８．０の範囲で生育が可能である。
（３）培地選択性
寒天培地上で、ツァペック・ドッグス培地、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天培地）、ＭＹ２０培地（ぶどう糖２００ｇ、ペプトン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、酵母エキス３ｇおよび蒸留水１リットルの組成）、サブロー培地で生育が可能であったが、コーンミール培地で生育させることはできなかった。
（４）顕微鏡を使用した形態観察結果
ホウキ状に配列した梗子をもち、その先端に分生子の数珠上の連鎖を生じる形態が観察された。
（５）ＭＹ２０寒天培地上でのコロニーの様子
観察開始初期には白色の毛足の長いコロニーを形成した。その後、次第に黒褐色の毛足の短いコロニーへと変化することが確認された。
【００１８】
［アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２の培養］
（１−１）前培養の工程
表１に示す液体培地７．０ｍｌを培養チューブに入れ、アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２を白金耳により一回植菌し、３０℃の温度で２日間振盪培養した。この際の振盪速度は２１０ｒｐｍとした。
【００１９】
（１−２）本培養の工程
前培養により得られた前記培養チューブ３本を、表１に示す液体培地４００ｍｌを含む３リットルフラスコに添加し３０℃で振盪培養した。この際の振盪速度は１４０ｒｐｍとした。培養後、培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）して不溶分を除去し、得られた上清を脱色用プロテアーゼ溶液として以後使用した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
［脱色測定法］
ミオグロビン溶液（１．２ｍｇ / ｍｌ）、ヘモグロビン溶液（１．２ｍｇ/ｍｌ）０．７５ｍｌに、前記脱色用プロテアーゼ溶液０．１１ｍｌを添加し撹拌した。２４時間後、反応溶液を遠心分離（１３０００×g、１０分）し、上澄み液を希釈して吸光度を測定した。ミオグロビンの場合は４０８ｎｍで、ヘモグロビンの場合は４０４ｎｍにおいて吸光度を測定した。脱色反応は２５℃、２４時間反応させた。
【００２２】
比較基準（コントロール）として、前記脱色用プロテアーゼ溶液のかわりに無菌の表１に示す液体培地を添加し２４時間反応させた。
【００２３】
２４時間後の反応溶液の上澄み液の吸光度が低いほど、反応溶液は脱色し沈殿が出来たことを示す。
【００２４】
脱色用プロテアーゼ１ｕｎｉｔは、２４時間で反応溶液の上澄み液の吸光度を１．０減少させる量と定義した。
１ｕｎｉｔ ＝ （Ｋ‐Ｓ）× 希釈倍率×１／０．１１
Ｋ：コントロールの吸光度
Ｓ：培養液を添加した反応溶液の吸光度
【００２５】
［培養経過］
前培養により得られた前記培養チューブ３本を、表１に示す液体培地４００ｍｌを含む３リットルフラスコで培養し、培養液を経時的に無菌でサンプリングし、１３０００ｒｐｍ、４℃、１０分の条件で遠心した。
前記遠心分離の際の速度は６０００〜２００００ｒｐｍの範囲が好ましく、８０００〜１６０００ｒｐｍの範囲であればより好ましい。
得られた上清を脱色活性測定に用いた。結果を図１に示す。
【００２６】
脱色用プロテアーゼは３日目から菌体外に出てきた。８日目以降は上清中の脱色用プロテアーゼの活性に変化は見られなかった。
【実施例２】
【００２７】
［脱色用プロテアーゼの精製］ゲル濾過クロマトグラフィー
（２−１）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
脱色用プロテアーゼ溶液を濃縮してからゲル濾過クロマトグラフィーを行い、前記脱色用プロテアーゼを精製した。
まず脱色用プロテアーゼ溶液をエバポレーターにより減圧下に濃縮し、濃縮液を０．２Ｍ ＮａＣｌを含む酢酸緩衝液（ｐＨ５、２０ｍＭ、以下「buffer A」という。）により平衡化した商品名TOYOPEARL HW−55F（東ソー社製）を充填したカラム（４．０×３３ｃｍ）により分離した。
前記buffer Aを用いて流速２０ｍｌ／ｈで前記脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション（２．５ ｍｌ／ｔｕｂｅ）の前記脱色用プロテアーゼの活性を測定し，高活性画分（ピーク時の活性の５０％以上の活性を持つ画分）を集めた。これをフラクション１とする。
【００２８】
前記フラクション１を遠心ろ過で濃縮し、同じく商品名TOYOPEARL HW−55F を充填したカラム（２．０×９５ｃｍ）により分離した。前記buffer Aを用いて流速２０ ｍｌ／ｈで前記脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション（２ ｍｌ／ｔｕｂｅ）の前記脱色用プロテアーゼの活性を測定し、高活性画分を集めた。これをフラクション２とする。
【００２９】
（２−２）ＤＥ−５２ celluloseカラムクロマトグラフィー
前記フラクション２を前記buffer A １リットルに対して１回目は３時間、２回目は１２時間透析した。前記buffer Aで平衡化したＤＥ−５２ cellulose（Whatman Chemical Separation社製、商品名Clifton、米国）を充填したカラム（１．６×１２．５ｃｍ）により分離した。buffer Aでカラムを洗浄した後、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含むbuffer Aを用いてリニアグラジエント法により、流速４０ ｍｌ／ｈで脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション（３．０ ｍｌ／ｔｕｂｅ）の脱色活性活性を測定した。結果を図２に示す。
【００３０】
ゲルろ過クロマトグラフィーおよびＤＥ−５２ celluloseカラムクロマトグラフィーにより脱色用プロテアーゼを単一に精製することができた。
【００３１】
［比較例１］硫安分画
脱色用プロテアーゼ溶液に、３０％、５０％、８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。各段階で得られた沈殿を酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２０ｍＭ）で溶解し、透析した後脱色測定を行った。その結果、脱色用プロテアーゼの活性は見られなかった。
【００３２】
［比較例２］ＤＥ−５２ カラムクロマトグラフィー
脱色用プロテアーゼ溶液を透析したのち、ＤＥ−５２ カラムクロマトグラフィーに供することによって脱色用プロテアーゼの活性の精製を行った。その結果、脱色用プロテアーゼの活性はＤＥ−５２に吸着し、ＮａＣｌを含む酢酸緩衝液で溶出されたが、活性は非常に低い値となった。
【００３３】
［比較例３］溶媒抽出
脱色用プロテアーゼの活性が、低分子有機化合物でアミン類、またはカルボン酸類、フェノール類・中性物質に由来するものであるかどうかを検討するために溶媒抽出を行った。
脱色用プロテアーゼ溶液をジエチルエーテルにより抽出し、このエーテル抽出液を用いて公知の方法によりアミン類、カルボン酸類、フェノール類・中性物質へと分類する操作を行った。
【００３４】
各物質について脱色測定を行った結果、エーテル抽出液から得られた化合物は脱色しなかった。よって、脱色用プロテアーゼはアミン類、カルボン酸類およびフェノール類・中性物質のいずれでもないことが確認された。
【００３５】
［比較例４］培養液の透析
脱色用プロテアーゼ溶液を透析して脱色活性を測定した結果、残存活性は５０％であった。
【実施例３】
【００３６】
［脱色用プロテアーゼの単一性の確認］
（３−１）ディスクポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
Ｄａｖｉｓらの方法（B. J.Davis：Disk electrophoresis. ll. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci.,404-427（1964））により、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８．０）、Tris−glycine（ｐＨ８．３）の泳動用緩衝液を用いて、２．５ｍＡ／ｔｕｂｅの条件で３．０時間泳動した。タンパク質の染色は０．２５％（ｗ／ｖ）Coomassie brilliant blue Ｒ−２５０／エタノール−酢酸−水（９：２：９）溶液で１時間行い、エタノール−酢酸−水（２５：８：６５）溶液に３時間浸漬して脱色後、エタノール−酢酸−水（１０：１５：１７５）溶液中に保存した。
結果を図３（ａ）に示す。単一なタンパク質のバンドが得られた。
【００３７】
（３−２）スラブＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
脱色用プロテアーゼを１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−Tris−glycine（ｐＨ８．３）の泳動用bufferを用いて、２００Ｖの条件で４０分間泳動した。分子量マーカーとして、Low Molecular Weight [LMW] Calibration kit（Amarsham Pharmacia Biotech、Uppsala）を使用した。すなわち、α‐ラクトアルブミン（分子量14,400）、トリプシンインヒビター（分子量20,100）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量30,000）、オブアルブミン（分子量45,000）、ウシ血清アルブミン（分子量66,000）、ホスホリラーゼb（分子量97,000）である。染色および脱色は、B. J.Davis：Disk electrophoresis. ll. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci.,404-427（1964）、生化学実験講座１ タンパク質の化学１（東京化学同人）に記載の方法に従った。
結果を図３（ｂ）に示す。分子量45,000〜66,000の範囲内にある単一なタンパク質のバンドが得られた。
【実施例４】
【００３８】
［脱色用プロテアーゼの分子量］
実施例２のゲル濾過法の結果を図４に示す。脱色用プロテアーゼの分子量は45,000であった。
また実施例３のスラブＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果、分子量は54,000であった。
以上より、前記脱色用プロテアーゼの分子量は好ましくは45,000〜54,000の範囲内にああることが判明した。
【実施例５】
【００３９】
［脱色用プロテアーゼの吸収スペクトルの測定］
紫外線吸光度測定装置 HITACHI U−2800A spectrophtometerにより脱色用プロテアーゼ２４８μｇ／ｍｌの吸収スペクトルを測定したところ、２７６ｎｍで極大吸収がみられた。結果を図５に示す。
【実施例６】
【００４０】
［脱色用プロテアーゼの性質］
（６−１）脱色用プロテアーゼに与えるｐＨの影響
５０ｍＭ酒石酸−酒石酸カリウム・ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５〜３．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）および５０ｍＭリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）を用いて、ミオグロビン、ヘモグロビンのｐＨを調製し、２４時間脱色活性反応を行なった。結果を図６に示す。
なお脱色用プロテアーゼのタンパク質量は０．３８μｇである。
脱色用プロテアーゼはｐＨ２．０〜４．０において最も高い脱色活性を示した。
【００４１】
（６−２）脱色用プロテアーゼに与える温度の影響
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて，２０〜９０℃の各温度で１５時間脱色活性反応を行なった。結果を図７に示す。
なお脱色用プロテアーゼのタンパク質量は０．６５μｇである。
５０℃において最大活性を示した。また９０℃以上においては活性を示さなかった。
【００４２】
（６−３）ｐＨ安定性
脱色用プロテアーゼをそれぞれ５０ ｍＭ酒石酸−酒石酸カリウム・ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０〜３．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）および５０ｍＭリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）で、４℃、２４時間透析処理後、処理前のｐＨに戻して残存する脱色活性をｐＨ５．０で測定した。結果を図８に示す。
脱色用プロテアーゼはｐＨ２．０〜５．０では、４℃で２４時間処理しても高い残存活性を示した。またｐＨ３．０〜５．０の処理において最も安定であった。脱色用プロテアーゼはｐＨ８．０で完全に失活した。
【００４３】
（６−４）熱安定性
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、脱色用プロテアーゼを２０〜７５℃の各温度で２０分間加熱処理した後、２４時間脱色活性反応を行い残存する活性を測定した。結果を図９に示す。
【００４４】
脱色用プロテアーゼは６０℃までの熱処理では８０%以上の活性を維持した。しかし、それ以上の温度では急速に不安定となり、７５℃の熱処理で完全に失活した。
【実施例７】
【００４５】
［脱色用プロテアーゼに与える各種試薬の影響］
脱色用プロテアーゼに与える金属イオン、システインプロテアーゼ阻害試薬、金属プロテアーゼ阻害試薬、セリンプロテアーゼ阻害試薬および酸性プロテアーゼ阻害試薬の影響を調べた。脱色用プロテアーゼに終濃度が１．０ｍＭとなるように各種試薬溶液を添加して２５℃で２４時間反応させ、これら各種試薬存在下で脱色活性を測定した。
脱色用プロテアーゼの脱色活性はＨｇ２＋によって促進された。Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋およびＣｕ２＋は脱色用プロテアーゼの脱色活性を阻害した。また、Papstatinも脱色用プロテアーゼの脱色活性を阻害した。
結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【実施例８】
【００４７】
［脱色用プロテアーゼの基質特異性］
ＢＳＡ、卵白アルブミン、チトクロームｃ、ペルオキシダーゼ、フェリチンに対する凝集（脱色）活性測定を行なった。ＢＳＡ、卵白アルブミンは反応後０時間と２４時間後の上清の２７８ｎｍにおける吸光度とタンパク質濃度を測定した。
【００４８】
チトクロームｃ、ペルオキシダーゼ、フェリチンはミオグロビンおよびヘモグロビンの場合と同様に極大吸収における吸光度を測定した。
【００４９】
脱色用プロテアーゼはＢＳＡ、卵白アルブミン、チトクロームｃ、ペルオキシダーゼ、フェリチンに対して、凝集作用（沈殿形成なし）を示さなかった。
【実施例９】
【００５０】
［脱色用プロテアーゼの各種ヘモグロビンに対する脱色活性］
上記実施例１〜７により使用したヘモグロビンはウシ由来である。ブタ由来、ヒト由来のヘモグロビンに対する脱色活性について調べた。
【００５１】
脱色用プロテアーゼはブタ由来、ヒト由来のヘモグロビンに対しての方がウシ由来より高い脱色活性を示した。
結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【実施例１０】
【００５３】
［脱色用プロテアーゼに与える塩濃度の影響］
脱色用プロテアーゼ溶液を各塩濃度に調製し脱色活性を測定した。
【００５４】
脱色用プロテアーゼはヘモグロビンに対しては塩濃度１５０ｍＭのとき最も高い活性を示した。ミオグロビンに対しては１５０ｍＭまで活性は安定であった。
【００５５】
なお蒸留水で脱色用プロテアーゼを透析したところ、脱色活性を示さなかった。透析前と同じ塩濃度となるように脱色用プロテアーゼにＮａＣｌを添加して脱色活性を測定したが活性を示さなかった。失活したと考えられる。
結果を図１０に示す。
【実施例１１】
【００５６】
［基質濃度と脱色用プロテアーゼの脱色活性の関係］
異なる基質濃度で脱色用プロテアーゼの脱色活性を測定した。基質濃度の単位はｍｇ/ｍｌである。反応液のｐＨ５．０で、ミオグロビン、ヘモグロビンとも基質濃度０．８ｍｇ/ｍｌ以上では活性に変化が見られなかった。結果を図１１〜図１３に示す。
【実施例１２】
【００５７】
［脱色用プロテアーゼのN末端アミノ酸配列の分析］
脱色用プロテアーゼ２９μｇを、プロティアンミニ II（商品名Bio−Rad、Richmond社製）を用いたスラブゲル‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、BIO−RADミニトランスブロット（Bio−Rad社製）を用いて、スラブゲルから脱色用プロテアーゼをポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（商品名GVHP304FO、ミリポア社製）に転移した。
ＰＶＤＦ膜を、０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーR−250を含む５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液で染色した後、メタノール−酢酸−水（５：１：４）の溶液で脱色した。ＰＶＤＦ膜上で染色した脱色用プロテアーゼを膜ごと切り出し、N末端配列の分析に用いた。Ｎ末端アミノ酸配列は、プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（嶋津社製）を用い、自動エドマン分解の各サイクルで生成したＰＴＨ−アミノ酸を高速液体クロマトグラフィーで同定することにより分析した。
脱色用プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列はＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであった。
詳細は配列表に記載の通りである。
【実施例１３】
【００５８】
［脱色用プロテアーゼのプロテアーゼ活性について］
プロテアーゼ活性は、カゼインを基質とし、ｐＨ５．０にて酵素反応後にカゼインから遊離したペプチドをＦｏｌｉｎ法を用いて発色させ、６００ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて定量することにより測定した。
この結果、プロテアーゼ活性を有していることが確認できた。
脱色活性とプロテアーゼ活性には相関性があった。
最も脱色活性の高かったフラクションは、プロテアーゼ活性においても最も高い活性を示した。
結果を図１４に示す。
なお、これらの実施には次の文献を参照した。
・Folin,O.&Ciocalteau,V.：Tylosine and tryptophan determination in proteins.
J.Biol.Chem.73,627-650(1927)
・Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.&Randall,R.J.：Protein measurement with the Folin phenol reagent.
J.Biol.Chem.193,265-275(1951)
・参考文献：新・タンパク質精製法 理論と実際
（Springer シュプリンガー・フェアラーク東京）
【実施例１４】
【００５９】
［脱色用プロテアーゼが有するプロテアーゼ活性のｐＨ依存性］
基質にカゼイン、ヘモグロビン、ミオグロビンを用いて各基質に対するプロテアーゼ活性ｐＨ依存性について調べた。結果を図１５および図１６に示す。
カゼイン、ミオグロビンはｐＨ２、ヘモグロビンはｐＨ２．６のとき最も高い活性を示した。また、酸性側で活性がみられた。
【実施例１５】
【００６０】
［脱色用プロテアーゼが有するプロテアーゼ活性のｐＨ依存性］
脱色用プロテアーゼに酸性プロテアーゼ阻害剤を終濃度で１．０ｍＭとなるように添加しプロテアーゼ活性を測定した。基質はカゼイン（ｐＨ２．０）を用いた。
プロテアーゼ活性はPepstatinによって阻害された。また、Pepstatin存在下で脱色活性反応を行った結果、脱色活性は示さなかった。
結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【実施例１６】
【００６２】
［各種プロテアーゼの脱色作用の比較］
脱色用プロテアーゼの替わりに各種プロテアーゼを用いて脱色活性反応を行い、各種プロテアーゼが脱色作用を持つのか調べた。脱色活性は各プロテアーゼの最適ｐＨの条件下で測定した。
各種プロテアーゼは脱色活性を示したが、その相対活性は脱色用プロテアーゼに比べ極めて低かった。
サーモライシン、α−キモトリプシンはミオグロビンの上清の吸光度を減少させたが、沈殿は形成しなかった。ヘモグロビンは沈殿を形成した。
基質にカゼインを用いてプロテアーゼ活性を測定した結果を表５に示す。
【００６３】
【表５】
【００６４】
次に脱色反応液のｐＨ４、５に調製し脱色因子の変わりに各種プロテアーゼを添加した。
結果を表６に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
次にＢＳＡ、オボアルブミン、カゼイン、ヘモグロビンおよびミオグロビンに対する各種プロテアーゼのプロテアーゼ活性について測定した。基質は終濃度０．６％、ｐＨは各プロテアーゼの最適ｐＨに調製した。
結果を表７に示した。結果は相対活性で示した（Ｕ/ｍｇ）。
【００６７】
【表７】
【００６８】
脱色用プロテアーゼおよび各種プロテアーゼの、それぞれのプロテアーゼ活性および脱色活性を表８に示した。
【００６９】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により得られた脱色用プロテアーゼを用いることにより、鰹節を製造する際により鰹節の脱色を行う用途に適用できることから、色調のより白い鰹節を効率よく製造することが可能となる。色調のより白い鰹節を製造する際に、脱色のためのかび付け工程を省略することも可能となる。
加えてこれまで鰹節の生産には原料の鰹の血合部分を事前に除去することにより製造される鰹節の色調の改善が図られてきたが、本発明により得られる脱色用プロテアーゼを使用することにより、前記除去工程を省略することも可能となることから鰹節の生産工程を簡略化することができ、単位時間当たりの生産量を増加させることが可能となる。
また鰹、鮪等を原料とする缶詰の製造には血合部分を事前に除去する工程が必要となるが、本発明の脱色用プロテアーゼを用いることによりこの除去工程が不要となる。このため鰹、鮪等を原料とする缶詰の生産効率を向上させることができる。
また衣服や手足に付着した血液汚れを効率的に脱色させることが可能となることから、医療業務等や動物の解体作業等に従事する際に生じる血液汚れを落とす洗剤用途等にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】培養日数と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図２】ゲル濾過クロマトグラフィーのフラクション番号と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図３】（ａ）はディスクポリアクリルアミドゲルの電気泳動を示す図面代用写真であり、（ｂ）はスラブＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図面代用写真である。
【図４】実施例２に説明したゲル濾過法について、溶出量と分子量との関係を示したグラフである。
【図５】脱色用プロテアーゼの紫外線吸収スペクトルの波長と吸光度との関係を示したグラフである。
【図６】脱色用プロテアーゼのｐＨと脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図７】脱色用プロテアーゼの温度と脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図８】脱色用プロテアーゼのｐＨに対する安定性と脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図９】脱色用プロテアーゼの温度に対する安定性と脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図１０】脱色用プロテアーゼの塩濃度と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１１】脱色用プロテアーゼに対するヘモグロビンおよびミオグロビンの基質濃度ならびに脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１２】ｐＨ４におけるミオグロビンの基質濃度と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１３】ｐＨ４におけるヘモグロビンの基質濃度と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１４】ゲル濾過クロマトグラフィーのフラクション番号と脱色活性との関係ならびにカゼインを用いたプロテアーゼ活性との関係を示したグラフである。
【図１５】基質をカゼインとしたときの、ｐＨとプロテアーゼ活性の相対活性との関係を示したグラフである。
【図１６】基質をヘモグロビンおよびミオグロビンとしたときの、ｐＨとプロテアーゼ活性の相対活性との関係を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は脱色用プロテアーゼおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業活動の過程で排出される廃液の着色成分を脱色するためには硫酸アルミニウムや塩化第二鉄等の凝集剤を用いた沈殿法、オゾン等による分解法、活性炭等による吸着法等が使用されてきたが、これらの方法では経済性、操作性の面で大規模に実施することが容易ではなく、着色成分を除去できたとしても今度は使用済みの凝集剤や活性炭等の処理が問題となる。
この様な問題に対処するため、現在では微生物による脱色作用の応用が注目されていきている。
具体的には、リグニン、染料、フミンおよびメラノイジンの着色成分を効率よく脱色する優れたアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）による着色溶液の脱色方法が提案されている（特許文献１）。
このアスペルギルス・フミガタスによる脱色の際に前記アスペルギルス・フミガタス自体が着色してくることから、大部分は前記アスペルギルス・フミガタスの吸着による脱色作用であることが示唆されている（特許文献２）。
【特許文献１】特開平６−１５３９１３号公報
【特許文献２】特開平６−３９３９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら微生物は種類によっては人体に対する影響が未知のものも存在することから、人体に対して安全な微生物の用途拡大が期待されていた。
本発明の目的は人体に対する影響の少ない微生物を用いて、着色溶液等に含まれる着色成分を脱色する作用のある脱色用プロテアーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討した結果、鰹節かび菌を培養して得られるプロテアーゼが脱色作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
［１］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養して得られる脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［２］前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、上記［１］に記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［３］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養し、得られた培養液の不溶分を除去した溶液に含まれる、上記［１］または［２］に記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
［４］分子量が４５０００〜６６０００の範囲である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［５］Ｎ末端アミノ酸配列の末端の７個のアミノ酸がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの順に配列している、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを提供するものである。
また本発明は、
［６］アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養する工程と、得られた培養液の不溶分を除去する工程と、を含むことを特徴とする、脱色用プロテアーゼの生産方法を提供するものである。
また本発明は、
［７］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを用いることを特徴とする、着色成分の脱色方法を提供するものである。
また本発明は、
［８］前記着色成分が、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方である、上記［７］に記載の脱色方法を提供するものである。
また本発明は、
［９］独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の脱色用プロテアーゼは、ミオグロビン、ヘモグロビン等の着色成分を有効に脱色することができる。
また前記脱色用プロテアーゼは鰹節かび菌を培地で培養することにより簡便に得られることから量産性、経済性に優れる。
さらに前記脱色用プロテアーゼは食品用途に応用されている鰹節かび菌により得られることから比較的人体に対する影響が少ないプロセスにより得ることができ、特に食品、化粧品分野等の脱色用途に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の脱色用プロテアーゼは鰹節かび菌であるアスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養することにより得られる。
前記アスペルギルス レペンスの培養には、鰹節かび菌の培養に用いられている公知の培地用成分を使用することができる。
【０００８】
例えば、培養に使用する炭素源としては、グルコース、マンノース、フラクトース、マンノース、リボース、キシロース等のアルドース類、グルコン酸、マンノン酸等のアルドン酸類、グルカル酸、マンナル酸等のアルダル酸類、ソルビトール、マンニトール等のアルジトール類、グルクロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸類等、
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
また培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。
【０００９】
前記炭素源、窒素源、リン源、カリウム源等は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００１０】
前記培地用成分として、必要に応じてｐＨを調整するための緩衝成分、ポリアクリル酸誘導体等のゲル化成分等を配合することができる。
【００１１】
前記アスペルギルス レペンスを培養するときの条件は以下の通りである。
【００１２】
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときの温度は、１５〜５５℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２５〜４５℃の範囲である。
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときの時間は、１２時間〜１２日の範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜１１日の範囲であり、さらに好ましくは３〜１０日の範囲である。
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときのｐＨは、２〜８の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは３〜７の範囲であり、さらに好ましくは４〜６の範囲である。
【００１３】
前記アスペルギルス レペンスの培養の際に使用する水に特に限定はなく、イオン交換水、蒸留水、水道水、通常の水道水から塩素を除去した工業用水等が使用される。
【００１４】
前記アスペルギルス レペンスの培養後、前記培地のうち水に溶けない成分を遠心分離、濾過等の操作により除去することにより、前記脱色用プロテアーゼを含む溶液を得ることができる。
この様にして得られた脱色用プロテアーゼを、ミオグロビン、ヘモグロビン等の着色成分と接触させることにより、前記着色成分を脱色させることができる。
前記着色成分の脱色は、前記脱色用プロテアーゼと前記着色成分とを水溶液中で接触させる方法等により行うことができる。
【００１５】
次に本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
本実施例に使用したアスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されているものである。
前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２の微生物学上の特徴は次の通りである。
【００１７】
（１）生育温度
２５〜３０℃の範囲で良好に生育する。
（２）生育ｐＨ
ｐＨ３．０〜ｐＨ８．０の範囲で生育が可能である。
（３）培地選択性
寒天培地上で、ツァペック・ドッグス培地、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天培地）、ＭＹ２０培地（ぶどう糖２００ｇ、ペプトン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、酵母エキス３ｇおよび蒸留水１リットルの組成）、サブロー培地で生育が可能であったが、コーンミール培地で生育させることはできなかった。
（４）顕微鏡を使用した形態観察結果
ホウキ状に配列した梗子をもち、その先端に分生子の数珠上の連鎖を生じる形態が観察された。
（５）ＭＹ２０寒天培地上でのコロニーの様子
観察開始初期には白色の毛足の長いコロニーを形成した。その後、次第に黒褐色の毛足の短いコロニーへと変化することが確認された。
【００１８】
［アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２の培養］
（１−１）前培養の工程
表１に示す液体培地７．０ｍｌを培養チューブに入れ、アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）ＭＫ８２を白金耳により一回植菌し、３０℃の温度で２日間振盪培養した。この際の振盪速度は２１０ｒｐｍとした。
【００１９】
（１−２）本培養の工程
前培養により得られた前記培養チューブ３本を、表１に示す液体培地４００ｍｌを含む３リットルフラスコに添加し３０℃で振盪培養した。この際の振盪速度は１４０ｒｐｍとした。培養後、培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）して不溶分を除去し、得られた上清を脱色用プロテアーゼ溶液として以後使用した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
［脱色測定法］
ミオグロビン溶液（１．２ｍｇ / ｍｌ）、ヘモグロビン溶液（１．２ｍｇ/ｍｌ）０．７５ｍｌに、前記脱色用プロテアーゼ溶液０．１１ｍｌを添加し撹拌した。２４時間後、反応溶液を遠心分離（１３０００×g、１０分）し、上澄み液を希釈して吸光度を測定した。ミオグロビンの場合は４０８ｎｍで、ヘモグロビンの場合は４０４ｎｍにおいて吸光度を測定した。脱色反応は２５℃、２４時間反応させた。
【００２２】
比較基準（コントロール）として、前記脱色用プロテアーゼ溶液のかわりに無菌の表１に示す液体培地を添加し２４時間反応させた。
【００２３】
２４時間後の反応溶液の上澄み液の吸光度が低いほど、反応溶液は脱色し沈殿が出来たことを示す。
【００２４】
脱色用プロテアーゼ１ｕｎｉｔは、２４時間で反応溶液の上澄み液の吸光度を１．０減少させる量と定義した。
１ｕｎｉｔ ＝ （Ｋ‐Ｓ）× 希釈倍率×１／０．１１
Ｋ：コントロールの吸光度
Ｓ：培養液を添加した反応溶液の吸光度
【００２５】
［培養経過］
前培養により得られた前記培養チューブ３本を、表１に示す液体培地４００ｍｌを含む３リットルフラスコで培養し、培養液を経時的に無菌でサンプリングし、１３０００ｒｐｍ、４℃、１０分の条件で遠心した。
前記遠心分離の際の速度は６０００〜２００００ｒｐｍの範囲が好ましく、８０００〜１６０００ｒｐｍの範囲であればより好ましい。
得られた上清を脱色活性測定に用いた。結果を図１に示す。
【００２６】
脱色用プロテアーゼは３日目から菌体外に出てきた。８日目以降は上清中の脱色用プロテアーゼの活性に変化は見られなかった。
【実施例２】
【００２７】
［脱色用プロテアーゼの精製］ゲル濾過クロマトグラフィー
（２−１）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
脱色用プロテアーゼ溶液を濃縮してからゲル濾過クロマトグラフィーを行い、前記脱色用プロテアーゼを精製した。
まず脱色用プロテアーゼ溶液をエバポレーターにより減圧下に濃縮し、濃縮液を０．２Ｍ ＮａＣｌを含む酢酸緩衝液（ｐＨ５、２０ｍＭ、以下「buffer A」という。）により平衡化した商品名TOYOPEARL HW−55F（東ソー社製）を充填したカラム（４．０×３３ｃｍ）により分離した。
前記buffer Aを用いて流速２０ｍｌ／ｈで前記脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション（２．５ ｍｌ／ｔｕｂｅ）の前記脱色用プロテアーゼの活性を測定し，高活性画分（ピーク時の活性の５０％以上の活性を持つ画分）を集めた。これをフラクション１とする。
【００２８】
前記フラクション１を遠心ろ過で濃縮し、同じく商品名TOYOPEARL HW−55F を充填したカラム（２．０×９５ｃｍ）により分離した。前記buffer Aを用いて流速２０ ｍｌ／ｈで前記脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション（２ ｍｌ／ｔｕｂｅ）の前記脱色用プロテアーゼの活性を測定し、高活性画分を集めた。これをフラクション２とする。
【００２９】
（２−２）ＤＥ−５２ celluloseカラムクロマトグラフィー
前記フラクション２を前記buffer A １リットルに対して１回目は３時間、２回目は１２時間透析した。前記buffer Aで平衡化したＤＥ−５２ cellulose（Whatman Chemical Separation社製、商品名Clifton、米国）を充填したカラム（１．６×１２．５ｃｍ）により分離した。buffer Aでカラムを洗浄した後、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含むbuffer Aを用いてリニアグラジエント法により、流速４０ ｍｌ／ｈで脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション（３．０ ｍｌ／ｔｕｂｅ）の脱色活性活性を測定した。結果を図２に示す。
【００３０】
ゲルろ過クロマトグラフィーおよびＤＥ−５２ celluloseカラムクロマトグラフィーにより脱色用プロテアーゼを単一に精製することができた。
【００３１】
［比較例１］硫安分画
脱色用プロテアーゼ溶液に、３０％、５０％、８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。各段階で得られた沈殿を酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２０ｍＭ）で溶解し、透析した後脱色測定を行った。その結果、脱色用プロテアーゼの活性は見られなかった。
【００３２】
［比較例２］ＤＥ−５２ カラムクロマトグラフィー
脱色用プロテアーゼ溶液を透析したのち、ＤＥ−５２ カラムクロマトグラフィーに供することによって脱色用プロテアーゼの活性の精製を行った。その結果、脱色用プロテアーゼの活性はＤＥ−５２に吸着し、ＮａＣｌを含む酢酸緩衝液で溶出されたが、活性は非常に低い値となった。
【００３３】
［比較例３］溶媒抽出
脱色用プロテアーゼの活性が、低分子有機化合物でアミン類、またはカルボン酸類、フェノール類・中性物質に由来するものであるかどうかを検討するために溶媒抽出を行った。
脱色用プロテアーゼ溶液をジエチルエーテルにより抽出し、このエーテル抽出液を用いて公知の方法によりアミン類、カルボン酸類、フェノール類・中性物質へと分類する操作を行った。
【００３４】
各物質について脱色測定を行った結果、エーテル抽出液から得られた化合物は脱色しなかった。よって、脱色用プロテアーゼはアミン類、カルボン酸類およびフェノール類・中性物質のいずれでもないことが確認された。
【００３５】
［比較例４］培養液の透析
脱色用プロテアーゼ溶液を透析して脱色活性を測定した結果、残存活性は５０％であった。
【実施例３】
【００３６】
［脱色用プロテアーゼの単一性の確認］
（３−１）ディスクポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
Ｄａｖｉｓらの方法（B. J.Davis：Disk electrophoresis. ll. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci.,404-427（1964））により、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８．０）、Tris−glycine（ｐＨ８．３）の泳動用緩衝液を用いて、２．５ｍＡ／ｔｕｂｅの条件で３．０時間泳動した。タンパク質の染色は０．２５％（ｗ／ｖ）Coomassie brilliant blue Ｒ−２５０／エタノール−酢酸−水（９：２：９）溶液で１時間行い、エタノール−酢酸−水（２５：８：６５）溶液に３時間浸漬して脱色後、エタノール−酢酸−水（１０：１５：１７５）溶液中に保存した。
結果を図３（ａ）に示す。単一なタンパク質のバンドが得られた。
【００３７】
（３−２）スラブＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
脱色用プロテアーゼを１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−Tris−glycine（ｐＨ８．３）の泳動用bufferを用いて、２００Ｖの条件で４０分間泳動した。分子量マーカーとして、Low Molecular Weight [LMW] Calibration kit（Amarsham Pharmacia Biotech、Uppsala）を使用した。すなわち、α‐ラクトアルブミン（分子量14,400）、トリプシンインヒビター（分子量20,100）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量30,000）、オブアルブミン（分子量45,000）、ウシ血清アルブミン（分子量66,000）、ホスホリラーゼb（分子量97,000）である。染色および脱色は、B. J.Davis：Disk electrophoresis. ll. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci.,404-427（1964）、生化学実験講座１ タンパク質の化学１（東京化学同人）に記載の方法に従った。
結果を図３（ｂ）に示す。分子量45,000〜66,000の範囲内にある単一なタンパク質のバンドが得られた。
【実施例４】
【００３８】
［脱色用プロテアーゼの分子量］
実施例２のゲル濾過法の結果を図４に示す。脱色用プロテアーゼの分子量は45,000であった。
また実施例３のスラブＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果、分子量は54,000であった。
以上より、前記脱色用プロテアーゼの分子量は好ましくは45,000〜54,000の範囲内にああることが判明した。
【実施例５】
【００３９】
［脱色用プロテアーゼの吸収スペクトルの測定］
紫外線吸光度測定装置 HITACHI U−2800A spectrophtometerにより脱色用プロテアーゼ２４８μｇ／ｍｌの吸収スペクトルを測定したところ、２７６ｎｍで極大吸収がみられた。結果を図５に示す。
【実施例６】
【００４０】
［脱色用プロテアーゼの性質］
（６−１）脱色用プロテアーゼに与えるｐＨの影響
５０ｍＭ酒石酸−酒石酸カリウム・ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５〜３．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）および５０ｍＭリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）を用いて、ミオグロビン、ヘモグロビンのｐＨを調製し、２４時間脱色活性反応を行なった。結果を図６に示す。
なお脱色用プロテアーゼのタンパク質量は０．３８μｇである。
脱色用プロテアーゼはｐＨ２．０〜４．０において最も高い脱色活性を示した。
【００４１】
（６−２）脱色用プロテアーゼに与える温度の影響
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて，２０〜９０℃の各温度で１５時間脱色活性反応を行なった。結果を図７に示す。
なお脱色用プロテアーゼのタンパク質量は０．６５μｇである。
５０℃において最大活性を示した。また９０℃以上においては活性を示さなかった。
【００４２】
（６−３）ｐＨ安定性
脱色用プロテアーゼをそれぞれ５０ ｍＭ酒石酸−酒石酸カリウム・ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０〜３．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）および５０ｍＭリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）で、４℃、２４時間透析処理後、処理前のｐＨに戻して残存する脱色活性をｐＨ５．０で測定した。結果を図８に示す。
脱色用プロテアーゼはｐＨ２．０〜５．０では、４℃で２４時間処理しても高い残存活性を示した。またｐＨ３．０〜５．０の処理において最も安定であった。脱色用プロテアーゼはｐＨ８．０で完全に失活した。
【００４３】
（６−４）熱安定性
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、脱色用プロテアーゼを２０〜７５℃の各温度で２０分間加熱処理した後、２４時間脱色活性反応を行い残存する活性を測定した。結果を図９に示す。
【００４４】
脱色用プロテアーゼは６０℃までの熱処理では８０%以上の活性を維持した。しかし、それ以上の温度では急速に不安定となり、７５℃の熱処理で完全に失活した。
【実施例７】
【００４５】
［脱色用プロテアーゼに与える各種試薬の影響］
脱色用プロテアーゼに与える金属イオン、システインプロテアーゼ阻害試薬、金属プロテアーゼ阻害試薬、セリンプロテアーゼ阻害試薬および酸性プロテアーゼ阻害試薬の影響を調べた。脱色用プロテアーゼに終濃度が１．０ｍＭとなるように各種試薬溶液を添加して２５℃で２４時間反応させ、これら各種試薬存在下で脱色活性を測定した。
脱色用プロテアーゼの脱色活性はＨｇ２＋によって促進された。Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋およびＣｕ２＋は脱色用プロテアーゼの脱色活性を阻害した。また、Papstatinも脱色用プロテアーゼの脱色活性を阻害した。
結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【実施例８】
【００４７】
［脱色用プロテアーゼの基質特異性］
ＢＳＡ、卵白アルブミン、チトクロームｃ、ペルオキシダーゼ、フェリチンに対する凝集（脱色）活性測定を行なった。ＢＳＡ、卵白アルブミンは反応後０時間と２４時間後の上清の２７８ｎｍにおける吸光度とタンパク質濃度を測定した。
【００４８】
チトクロームｃ、ペルオキシダーゼ、フェリチンはミオグロビンおよびヘモグロビンの場合と同様に極大吸収における吸光度を測定した。
【００４９】
脱色用プロテアーゼはＢＳＡ、卵白アルブミン、チトクロームｃ、ペルオキシダーゼ、フェリチンに対して、凝集作用（沈殿形成なし）を示さなかった。
【実施例９】
【００５０】
［脱色用プロテアーゼの各種ヘモグロビンに対する脱色活性］
上記実施例１〜７により使用したヘモグロビンはウシ由来である。ブタ由来、ヒト由来のヘモグロビンに対する脱色活性について調べた。
【００５１】
脱色用プロテアーゼはブタ由来、ヒト由来のヘモグロビンに対しての方がウシ由来より高い脱色活性を示した。
結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【実施例１０】
【００５３】
［脱色用プロテアーゼに与える塩濃度の影響］
脱色用プロテアーゼ溶液を各塩濃度に調製し脱色活性を測定した。
【００５４】
脱色用プロテアーゼはヘモグロビンに対しては塩濃度１５０ｍＭのとき最も高い活性を示した。ミオグロビンに対しては１５０ｍＭまで活性は安定であった。
【００５５】
なお蒸留水で脱色用プロテアーゼを透析したところ、脱色活性を示さなかった。透析前と同じ塩濃度となるように脱色用プロテアーゼにＮａＣｌを添加して脱色活性を測定したが活性を示さなかった。失活したと考えられる。
結果を図１０に示す。
【実施例１１】
【００５６】
［基質濃度と脱色用プロテアーゼの脱色活性の関係］
異なる基質濃度で脱色用プロテアーゼの脱色活性を測定した。基質濃度の単位はｍｇ/ｍｌである。反応液のｐＨ５．０で、ミオグロビン、ヘモグロビンとも基質濃度０．８ｍｇ/ｍｌ以上では活性に変化が見られなかった。結果を図１１〜図１３に示す。
【実施例１２】
【００５７】
［脱色用プロテアーゼのN末端アミノ酸配列の分析］
脱色用プロテアーゼ２９μｇを、プロティアンミニ II（商品名Bio−Rad、Richmond社製）を用いたスラブゲル‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、BIO−RADミニトランスブロット（Bio−Rad社製）を用いて、スラブゲルから脱色用プロテアーゼをポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（商品名GVHP304FO、ミリポア社製）に転移した。
ＰＶＤＦ膜を、０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーR−250を含む５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液で染色した後、メタノール−酢酸−水（５：１：４）の溶液で脱色した。ＰＶＤＦ膜上で染色した脱色用プロテアーゼを膜ごと切り出し、N末端配列の分析に用いた。Ｎ末端アミノ酸配列は、プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（嶋津社製）を用い、自動エドマン分解の各サイクルで生成したＰＴＨ−アミノ酸を高速液体クロマトグラフィーで同定することにより分析した。
脱色用プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列はＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであった。
詳細は配列表に記載の通りである。
【実施例１３】
【００５８】
［脱色用プロテアーゼのプロテアーゼ活性について］
プロテアーゼ活性は、カゼインを基質とし、ｐＨ５．０にて酵素反応後にカゼインから遊離したペプチドをＦｏｌｉｎ法を用いて発色させ、６００ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて定量することにより測定した。
この結果、プロテアーゼ活性を有していることが確認できた。
脱色活性とプロテアーゼ活性には相関性があった。
最も脱色活性の高かったフラクションは、プロテアーゼ活性においても最も高い活性を示した。
結果を図１４に示す。
なお、これらの実施には次の文献を参照した。
・Folin,O.&Ciocalteau,V.：Tylosine and tryptophan determination in proteins.
J.Biol.Chem.73,627-650(1927)
・Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.&Randall,R.J.：Protein measurement with the Folin phenol reagent.
J.Biol.Chem.193,265-275(1951)
・参考文献：新・タンパク質精製法 理論と実際
（Springer シュプリンガー・フェアラーク東京）
【実施例１４】
【００５９】
［脱色用プロテアーゼが有するプロテアーゼ活性のｐＨ依存性］
基質にカゼイン、ヘモグロビン、ミオグロビンを用いて各基質に対するプロテアーゼ活性ｐＨ依存性について調べた。結果を図１５および図１６に示す。
カゼイン、ミオグロビンはｐＨ２、ヘモグロビンはｐＨ２．６のとき最も高い活性を示した。また、酸性側で活性がみられた。
【実施例１５】
【００６０】
［脱色用プロテアーゼが有するプロテアーゼ活性のｐＨ依存性］
脱色用プロテアーゼに酸性プロテアーゼ阻害剤を終濃度で１．０ｍＭとなるように添加しプロテアーゼ活性を測定した。基質はカゼイン（ｐＨ２．０）を用いた。
プロテアーゼ活性はPepstatinによって阻害された。また、Pepstatin存在下で脱色活性反応を行った結果、脱色活性は示さなかった。
結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【実施例１６】
【００６２】
［各種プロテアーゼの脱色作用の比較］
脱色用プロテアーゼの替わりに各種プロテアーゼを用いて脱色活性反応を行い、各種プロテアーゼが脱色作用を持つのか調べた。脱色活性は各プロテアーゼの最適ｐＨの条件下で測定した。
各種プロテアーゼは脱色活性を示したが、その相対活性は脱色用プロテアーゼに比べ極めて低かった。
サーモライシン、α−キモトリプシンはミオグロビンの上清の吸光度を減少させたが、沈殿は形成しなかった。ヘモグロビンは沈殿を形成した。
基質にカゼインを用いてプロテアーゼ活性を測定した結果を表５に示す。
【００６３】
【表５】
【００６４】
次に脱色反応液のｐＨ４、５に調製し脱色因子の変わりに各種プロテアーゼを添加した。
結果を表６に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
次にＢＳＡ、オボアルブミン、カゼイン、ヘモグロビンおよびミオグロビンに対する各種プロテアーゼのプロテアーゼ活性について測定した。基質は終濃度０．６％、ｐＨは各プロテアーゼの最適ｐＨに調製した。
結果を表７に示した。結果は相対活性で示した（Ｕ/ｍｇ）。
【００６７】
【表７】
【００６８】
脱色用プロテアーゼおよび各種プロテアーゼの、それぞれのプロテアーゼ活性および脱色活性を表８に示した。
【００６９】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により得られた脱色用プロテアーゼを用いることにより、鰹節を製造する際により鰹節の脱色を行う用途に適用できることから、色調のより白い鰹節を効率よく製造することが可能となる。色調のより白い鰹節を製造する際に、脱色のためのかび付け工程を省略することも可能となる。
加えてこれまで鰹節の生産には原料の鰹の血合部分を事前に除去することにより製造される鰹節の色調の改善が図られてきたが、本発明により得られる脱色用プロテアーゼを使用することにより、前記除去工程を省略することも可能となることから鰹節の生産工程を簡略化することができ、単位時間当たりの生産量を増加させることが可能となる。
また鰹、鮪等を原料とする缶詰の製造には血合部分を事前に除去する工程が必要となるが、本発明の脱色用プロテアーゼを用いることによりこの除去工程が不要となる。このため鰹、鮪等を原料とする缶詰の生産効率を向上させることができる。
また衣服や手足に付着した血液汚れを効率的に脱色させることが可能となることから、医療業務等や動物の解体作業等に従事する際に生じる血液汚れを落とす洗剤用途等にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】培養日数と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図２】ゲル濾過クロマトグラフィーのフラクション番号と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図３】（ａ）はディスクポリアクリルアミドゲルの電気泳動を示す図面代用写真であり、（ｂ）はスラブＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図面代用写真である。
【図４】実施例２に説明したゲル濾過法について、溶出量と分子量との関係を示したグラフである。
【図５】脱色用プロテアーゼの紫外線吸収スペクトルの波長と吸光度との関係を示したグラフである。
【図６】脱色用プロテアーゼのｐＨと脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図７】脱色用プロテアーゼの温度と脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図８】脱色用プロテアーゼのｐＨに対する安定性と脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図９】脱色用プロテアーゼの温度に対する安定性と脱色に関する相対活性との関係を示したグラフである。
【図１０】脱色用プロテアーゼの塩濃度と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１１】脱色用プロテアーゼに対するヘモグロビンおよびミオグロビンの基質濃度ならびに脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１２】ｐＨ４におけるミオグロビンの基質濃度と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１３】ｐＨ４におけるヘモグロビンの基質濃度と脱色活性との関係を示したグラフである。
【図１４】ゲル濾過クロマトグラフィーのフラクション番号と脱色活性との関係ならびにカゼインを用いたプロテアーゼ活性との関係を示したグラフである。
【図１５】基質をカゼインとしたときの、ｐＨとプロテアーゼ活性の相対活性との関係を示したグラフである。
【図１６】基質をヘモグロビンおよびミオグロビンとしたときの、ｐＨとプロテアーゼ活性の相対活性との関係を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養して得られる脱色用プロテアーゼ。
【請求項２】
前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、請求項１に記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項３】
アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養し、得られた培養液の不溶分を除去した溶液に含まれる、請求項１または２に記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項４】
分子量が４５０００〜６６０００の範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項５】
Ｎ末端アミノ酸配列の末端の７個のアミノ酸がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの順に配列している、請求項１〜４のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項６】
アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養する工程と、得られた培養液の不溶分を除去する工程と、を含むことを特徴とする、脱色用プロテアーゼの生産方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを用いることを特徴とする、着色成分の脱色方法。
【請求項８】
前記着色成分は、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方である、請求項７に記載の脱色方法。
【請求項９】
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）。
【請求項１】
アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を培養して得られる脱色用プロテアーゼ。
【請求項２】
前記アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、請求項１に記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項３】
アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養し、得られた培養液の不溶分を除去した溶液に含まれる、請求項１または２に記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項４】
分子量が４５０００〜６６０００の範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項５】
Ｎ末端アミノ酸配列の末端の７個のアミノ酸がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの順に配列している、請求項１〜４のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼ。
【請求項６】
アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）を、水を含む培地により１５〜５５℃の範囲で１２時間〜１２日の間培養する工程と、得られた培養液の不溶分を除去する工程と、を含むことを特徴とする、脱色用プロテアーゼの生産方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の脱色用プロテアーゼを用いることを特徴とする、着色成分の脱色方法。
【請求項８】
前記着色成分は、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方である、請求項７に記載の脱色方法。
【請求項９】
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている、アスペルギルス レペンス（Aspergillus repens）。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２１９４８３（Ｐ２００９−２１９４８３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３２０６７（Ｐ２００９−３２０６７）
【出願日】平成２１年２月１３日（２００９．２．１３）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１３日（２００９．２．１３）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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