脳型有機アニオントランスポーターとその遺伝子
【課題】 本発明は、脳における有機アニオン性物質の取り込み排出の制御をする蛋白質として有用な脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３、それをコードする塩基配列を有する核酸、及び、それに対する抗体を提供する。
【解決手段】 本発明は、脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３、それをコードする塩基配列、及び、それに対する抗体に関する。本発明の脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３のアミノ酸配列及び塩基配列は、明細書中の配列表に示されている。
【解決手段】 本発明は、脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３、それをコードする塩基配列、及び、それに対する抗体に関する。本発明の脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３のアミノ酸配列及び塩基配列は、明細書中の配列表に示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有機陰イオン（有機アニオン）輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓および腎臓は、生体異物や薬物の代謝および体外排出に関して重要な役割を果たしている。尿細管細胞および肝細胞は極性を有する上皮細胞でありアニオン性の物質の一部は、輸送担体（トランスポーター）により側底膜を介して腎臓および肝臓中に取り込まれ、また細胞内で代謝により産生された有機アニオンもトランスポーターにより排出されることが推測される。
尿細管細胞や肝細胞の側底膜を介した有機アニオンの取り込みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。
【０００３】
しかし従来の手法では、側底膜を介した有機アニオン輸送について詳細に解析することは困難であり、トランスポーターそのものを単離して詳細に解析することが望まれてきた。
一方、脳においても有機アニオン輸送がおこなわれていることも複数の実験結果から推測されている。脳における有機アニオン輸送は、主に内因性および外来性の有機アニオンの脳外への排泄に働いているものと考えられる。
脳における有機アニオン輸送は、内因性アニオンおよび外来性異物の脳からの排除という重要な役割を担っていると予想されているにも関わらず、生理的実験が困難なことから、腎臓や肝臓以上にその輸送の詳細は不明である。
【０００４】
これらの背景をふまえ、有機アニオントランスポーターの分子実体の探索が１９９０年代に入り積極的に行われた。この結果、肝臓の側底膜の有機アニオントランスポーターが昨年までに二つ単離された。（Hagenbuch, B.らProc Natl Acad Sci USA 88巻、10629-33頁、1991年、Jacquemin, E.ら、Proc Natl Acad Sci USA、91巻、133-7頁、1994年）。
昨年、本発明者らは独自に、腎臓での有機アニオン輸送において最も重要な役割を果たしている有機アニオントランスポーターＯＡＴ１の単離に成功し（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997)、既に特許出願済みである。ＯＡＴ１は化学構造の異なる多くの有機アニオンを輸送することの出来るトランスポーターであり、種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。
【０００５】
ＯＡＴ１の発現は腎特異的で、腎以外では脳に極めてわずかな発現をみるのみである。
最近本発明者らはさらに、ＯＡＴ１とアミノ酸レベルで４０％台の弱い相同性を持つ肝特異的有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ２）を同定した（FEBS letter 429巻、179-182頁、1998年）（特願平１０−１６９１７４号）。
ＯＡＴ１およびＯＡＴ２の単離、同定は有機アニオントランスポーターがファミリーを形成することを示している。さらにＯＡＴ２が肝特異的に発現していることから、このファミリーが腎特異的ではなく、種々の臓器にも発現していることも示唆する。
【０００６】
既に述べたように脳には有機アニオン輸送系が存在するものと考えられるが、脳でのＯＡＴ１の発現は極めてわずかであり、又、ＯＡＴ２は存在しない。本発明者らは、これらの事実から脳における有機アニオン輸送を担う未知のトランスポーターの存在を予想した。
他方、肝臓の側底膜における有機アニオン輸送は複雑であり、特に肝細胞内で多量に産生される抱合体（その多くは有機アニオン）の血中への流出経路は未だ不明である。この肝臓での有機アニオン輸送についても、ＯＡＴ２を含む上記有機アニオントランスポーターのみでは説明しきれず、さらなる未知のトランスポーターの存在が予想される
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、脳および肝臓における有機アニオン輸送に関与する新規な有機アニオンントランスポーター遺伝子およびその遺伝子がコードするポリペプチドである有機アニオントランスポーターを同定し、提供することにある。その他の目的については以下の記載より明白である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腎臓での有機アニオン輸送において最も重要な役割を果たしている有機アニオントランスポーターＯＡＴ１を単離した（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997）。さらにＯＡＴ１との構造上の類似性から、肝特異的な有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ２）を同定した（Sekine, T.ら、FEBS letter 429巻、179-182頁、1998年）。さらにＯＡＴ１およびＯＡＴ２が、有機カチオントランスポーターＯＣＴ１（Grundemann, D.ら、Nature, 372巻, 549-52頁、1994）とも弱い相同性があることを既に報告している（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997)。
【０００９】
これらの事実をふまえ、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１に共通する配列を同定し、さらにその配列からデジェネレイトプライマー（degenerate primer）を作成した。このデジェネレイトプライマー（degenerate primer）を用い、ラット脳ｍＲＮＡからＲＴ（reverse transcript）−ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によって、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１と弱い相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片を同定した。このｃＤＮＡ断片を用いて、ラットｃＤＮＡライブラリーよりこれまでに報告のないｃＤＮＡを同定し、この蛋白質をＯＡＴファミリーの第三のメンバーとして脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３（Organic Anion Transporter 3）と命名した。
【００１０】
本発明は、有機アニオントランスポーターＯＡＴ３に関し、本発明の有機アニオントランスポーターＯＡＴ３は、異なる化学構造を持った有機アニオンに対してこれらを輸送する（取り込む能力を有する）、広い範囲の基質選択性を有するトランスポーターであるが、代表的な有機カチオンであるＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を輸送しなかった。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターＯＡＴ３は、有機アニオンに対する広い範囲の基質選択性を有するが、代表的な有機カチオンであるＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）に対する基質選択性は実質的に有さず、主として脳、肝臓などの器官に選択的に分布する有機アニオントランスポーターである。
本発明のタンパク質は、前記した有機アニオントランスポーターＯＡＴ３である配列番号２（ヒト）又は４（ラット）で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列と通常、６０〜８０％、好ましくは７０〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００１１】
また、本発明は、前記した有機アニオントランスポーターＯＡＴ３を含む本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡに関する。本発明の核酸は、本発明のタンパク質をコードするもののほか、さらに前記核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし得る核酸を包含する。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸の部分配列又は当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドに関する。
また、本発明は、本発明のタンパク質または、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドに対する抗体に関する。
【００１２】
本発明の有機アニオントランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の腎臓、脳などの臓器の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
遺伝子のスクリーニングおよび単離は、ホモロジースクリーニングおよびＰＣＲスクリーニングなどにより好適に実施できる。得られたｃＤＮＡは、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ちＯＡＴ３のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたｃＤＮＡが有機アニオントランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、即ちｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物が有機アニオントランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。即ち、得られたＯＡＴ３遺伝子から調製したｃＲＮＡを卵母細胞に導入して発現させ、有機アニオンを細胞内に輸送する（取り込む）能力を、適当な有機アニオンを基質とする通常の取り込み実験（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997）により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。
また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、ＯＡＴ３の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。
【００１３】
配列表の配列番号３にこのような方法により得られたラットの有機アニオントランスポーターＯＡＴ３のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号４にそのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
得られたＯＡＴ３遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
配列表の配列番号１にこのような方法により得られたヒトの有機アニオントランスポーターＯＡＴ３のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号２にそのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号１又は３）に示された塩基配列、もしくはその一部の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することが出来る。
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは例えば、「Molecular Cloning；Sambrook, J., Fritsh, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。
【００１６】
本発明の有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）は、例えば、有機アニオントランスポーターをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術により生産することができる。例えば、有機アニオントランスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組み換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが望ましい。
【００１７】
例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現させる場合には、本発明の有機アニオントランスポーターをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換して、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞やプタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞株が挙げられる。
【００１８】
有機アニオントランスポーターＯＡＴ３をコードするｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号１又は３に示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることが出来るほか、前記のｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列をもつＤＮＡはＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位変異導入法（site specific mutagenesis）「Mark, D.F. ら、Proc Natl Acad Sci USA 第18巻、5662-5666頁、1984年」等により実施できる。
【００１９】
本発明の有機アニオントランスポーター遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）は、有機アニオントランスポーター遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、有機アニオントランスポーターの発現を変調させるために、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、デコイとして使用することもできる。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸の部分配列又は当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドに関する。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１又は３で示される塩基配列の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上あるいは３０塩基以上の配列を用いても良い。これらのヌクレオチドは、必要に応じて放射性元素や、蛍光性物質又は化学発光物質などを用いて標識化することもできる。
本発明の配列番号１又は３で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドは、本発明の有機アニオントランスポーターＯＡＴ３をコードする塩基配列中の特異的な塩基配列を有するものが好ましく、必要により標識化されていてもよい。
【００２０】
また、本発明の有機アニオントランスポーターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、有機アニオントランスポーター検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の有機アニオントランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（たとえば、ラットやウサギ）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。また、本発明の抗体は、常法によりキメラ型やヒト型抗体としたものであってもよい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００２２】
なお下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「Molecular Cloning：Sambrook, J., Fritsh, E.F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により行うか、または、市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００２３】
実施例１
多選択性有機アニオントランスポーター３（ＯＡＴ３）ｃＤＮＡの単離とその解析
（１）ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１の塩基配列情報を基にしたデジェネレイトプライマー（degenerate primer）の作成
既に本発明者らが単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２、および報告されているＯＣＴ１の塩基配列情報から、これら３つのトランスポーター間で共通するアミノ酸配列（ＯＡＴ１のアミノ酸配列の２６７−２７５および４４７−４５２に相当部分）より、デジェネレイトプライマー（degenerate primer）を作成した。
【００２４】
ラット脳よりＧＩＴＣ法により全ＲＮＡを抽出し、さらにオリゴｄＴ（oligo dT）カラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。このラット脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡより逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いてｃＤＮＡを作成し、これを鋳型として上記デジェネレイトプライマー（degenerate primer）によりＰＣＲを行った。この結果、約５５０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
このＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキット（インヴィトロゲン社製）を用いてクローン化し、そのいくつかの塩基配列を決定したところ、ＯＡＴ１とアミノ酸レベルで５０％台の相同性を有する新規ｃＤＮＡ（Ｂ１０）が得られた。
【００２５】
Ｂ１０ ｃＤＮＡを３２Ｐでラベルしたプローブを用いて、ラットの種々の臓器より抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡによるノーザンハイブリダイゼーション（Northern hybridization）をおこなったところ、肝臓、腎臓、脳および目に陽性のバンドを検出した。
【００２６】
既に本発明者らは、ラット腎の良好なｃＤＮＡライブラリーを持っていたため、このラット腎ｃＤＮＡライブラリーをＢ１０プローブ用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、３７℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミド、５×標準クエン酸Ｎａｃｌ溶液（standard saline citrate(SSC)）、３× デンハード液、０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％ＡｎｔｉｆｏａｍＢ（シグマ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。λＺｉｐＬｏｘ中に単離されたクローンは、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法によりプラスミドベクタ−ｐＺＬにさらにサブクローン化した。この結果、有機アニオン輸送活性を持つ新規クローン（ｒｋｌ４１１）が得られた（輸送機能解析については以下の実施例２参照）。
【００２７】
上記により得られたクローン（ｒｋｌ４１１）の塩基配列の決定は以下のようにして行った。まず、キロシークエンス用デリーションキット（タカラ社製）を用いて、ｒｋｌ４１１を片側より約３００ｂｐづつ削除した複数のプラスミドＤＮＡを得た。これらを自動シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いてその塩基配列を解析した。さらにｒｋｌ４１１に対する特異的オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、自動シークエンサーを用いて逆方向からもその塩基配列を解析し、最終的にｒｋｌ４１１の全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号３に記載する。また、このタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号４に記載する。
【００２８】
実施例２（ｒｋｌ４１１の機能の特定）
（１）上記により得られたクローン（ｒｋｌ４１１）を含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロでｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した（Sekine, T., et al. J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年参照）。
得られたｃＲＮＡを、既に報告されている方法に従い（Sekine, T., et al. J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年）、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結果、図１に示すようにｒｋｌ４１１を発現させた卵母細胞は１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）、３Ｈ−オクラトキシンＡ、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込みを示すことが判明した。これに対して代表的な有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を輸送しなかった。
【００２９】
ｒｋｌ４１１の有機アニオン輸送のミカエリス−メンテン動力学試験をおこなった。種々の濃度のＰＡＨ、エストロン硫酸、オクラトキシンＡのｒｋｌ４１１による取り込み量の変化を調べることにより、これらの基質のｒｋｌ４１１による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたＰＡＨ、エストロン硫酸、オクラトキシンＡの取り込み実験は、ｒｋｌ４１１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載の方法に準じて実施した。この結果（図２参照）、ＰＡＨ、エストロン硫酸、オクラトキシンＡのＫｍ値はそれぞれ４．７μＭ、２．３μＭおよび０．７４μＭであった。結果を次の表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
（２）ｒｋｌ４１１の基質選択性をさらに検討するために、ｒｋｌ４１１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験系において、系へ各種アニオン性物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験は、ｒｋｌ４１１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。１ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下および非存在下で、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込みを測定した。その結果、種々のアニオン性物質（タウロコール酸、コール酸、ブロモサルフォフタレイン、プロベネシド、インドシアニングリーン、ブメタニド、セフォペラゾン、ピロキシカム、フロセミド、アジドチミジン、ベンジルペニシリンなど）はｒｋｌ４１１による３Ｈ−エストロン硫酸の輸送を有意に阻害した（図３参照）。一方、テトラエチルアンモニウム、グアニジン、キニジン、ベラパミルのようなカチオン性物質は阻害作用を示さなかった（図３参照）。以上の結果から、ｒｋｌ４１１は多選択性トランスポーターであり、又、主に有機アニオンを認識することから、ｒｋｌ４１１をＯＡＴファミリーの第三のメンバーとして、ＯＡＴ３（organic anion transporter 3）と命名した。
【００３２】
実施例３
ラットの各組織におけるＯＡＴ３遺伝子の発現（ノーザンブロッティング）の解析を行った。ＯＡＴ３ ｃＤＮＡの全長を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いてラットの種々の組織から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のように行った。３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動した後にニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＯＡＴ３ ｃＤＮＡ全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイブリダイセーションを行った。フィルターを６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロットの結果（図４参照）、腎臓、肝臓、脳において、２．４Ｋｂ付近に強いバンドが検出された。また目に弱い発現が観察された。
【００３３】
実施例４
ＯＡＴ３がＯＡＴファミリーのメンバーの中では最も強く脳に発現していたため、その脳での役割を推測する試みとして、神経伝達物質の種々の代謝物（主に有機アニオン）によるＯＡＴ３の輸送阻害実験を行った。図５に示すように、ノルアドレナリンやセロトニン代謝物はＯＡＴ３によるエストロン硫酸輸送を阻害し、それら自身がＯＡＴ３の基質となる可能性を示した。この事実は、ＯＡＴ３の脳型での役割のひとつとして神経伝達物質の代謝物の脳外排出作用を示唆するものである。
【００３４】
実施例５
ヒト型多選択性有機アニオントランスポーター３（ＯＡＴ３）ｃＤＮＡの単離とその解析
既に本発明者らが単離したラットＯＡＴ３のｃＤＮＡを用いてＥＳＴ（expressed sequence tag）データベースを検索したところ、ラットＯＡＴ３と高い相同性を有するヒトＥＳＴクローン（Ｈ２０３４５）を同定した。このクロ−−ンの塩基配列の一部（３３３ｂｐ）をＰＣＲ法を用いて合成した。このｃＤＮＡ断片を３２Ｐでラベルしたものをプローブとして用い、以下のようにスクリーニングを行った。
【００３５】
すでに本発明者らが保持していたヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーを、上記プローブを用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、３７℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（standard saline citrate）、３×デンハード液、０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ（シグマ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。λＺｉｐＬｏｘ中に単難されたクローンは、インビトロエキサイション（in vitro excision）法によりプラスミドベクタ−ｐＺＬにさらにサブクローン化した。この結果、有機アニオン輸送活性を持つｈＯＡＴ３（human organic anion transporter 3：ヒト型有機アニオントランスポーター３）が得られた。このものの輸送機能の解析については以下の実施例６で説明する。
【００３６】
ｈＯＡＴ３の塩基配列は以下の方法により決定した。ｈＯＡＴ３に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを順次合成し、自動シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’および３’側の両方向から塩基配列の解析を行い、最終的にｈＯＡＴ３の全塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列表の配列番号１に記載する。このｃＤＮＡ配列からｈＯＡＴ３をコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。
また、ｃＤＮＡの塩基配列を表２〜６に示し、そのアミノ酸配列を塩基配列と対応させて表３に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
【表６】
【００４２】
実施例６
ｈＯＡＴ３の機能の特定
上記により得られたｈＯＡＴ３を含むブラスミドから、Ｔ７ＲＮＡボリメラーセを用いて、インビトロでｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）をセキネらの方法（Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272, 18526-9 (1997)）に準じて調製した。
得られたｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを、既に報告されているセキネらの方法（Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272, 18526-9 (1997)）に従い、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび有機カチオンの取り込み実験を行った。コントロール卵母細胞（ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入していない卵母細胞）、およびｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、以下の放射能標識体を含む緩衝液中で１時間培養し、卵母細胞内への放射能標識体の取り込みを測定した。
この結果を図６〜図１８に示す。各図の白色（open column）の方はコントロール卵母細胞を用いた場合を示し、黒色（closed column）の方はｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用いた場合を示す。図６は１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）（１０μＭ）、図７は３Ｈ−エストロン硫酸（５０ｎＭ）、図８は３Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン硫酸（５０ｎＭ）、図９は３Ｈ−オクラトキシンＡ（１００ｎＭ）、図１０は３Ｈ−シメチジン（１５０ｎＭ）、図１１は３Ｈ−エストラジオールグルクロニド（５０ｎＭ）、図１２は３Ｈ−プロスタグランジンＥ２（１ｎＭ）、図１３は１４Ｃ−タウロコール酸（１μＭ）、図１４は１４Ｃ−グルタル酸（１０μＭ）、図１５は３Ｈ−メトトレキセート（１００ｎＭ）、図１６は１４Ｃ−サリチル酸（１μＭ）、図１７は１４Ｃ−インドメタシン（１０μＭ）、図１８は１４Ｃ−コール酸（１０μＭ）の場合をそれぞれ示す。
【００４３】
これらの図に示されるように、これらの放射能標識体において、ｈＯＡＴ３を発現した卵母細胞における値は、コントロール卵母細胞に比べ高く、これらの化合物をｈＯＡＴ３が輸送することが示された。
この結果、ｈＯＡＴ３を発現させた卵母細胞は、１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）、３Ｈ−エストロン硫酸、３Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン硫酸、３Ｈ−オクラトキシンＡ、３Ｈ−シメチジン、３Ｈ−エストラジオールグルクロニド、３Ｈ−プロスタグランジンＥ２、１４Ｃ−タウロコール酸、１４Ｃ−グルタル酸、３Ｈ−メトトレキセート、１４Ｃ−サリチル酸、１４Ｃ−インドメタシン、１４Ｃ−コール酸の取り込みを示すことが判明した。 これに対して、ｈＯＡＴ３は代表的な有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を輸送しなかった（図には示さず）。
【００４４】
次いで、ｈＯＡＴ３の有機アニオン輸送のミカエリスーメンテン動力学試験を行った。種々の濃度のエストロン硫酸およびメトトレキセートのｈＯＡＴ３による取り込み量の変化を調べることにより、これらの基質のｈＯＡＴ３による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたエストロン硫酸およびメトトレキセートの取り込み実験は、ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞およびコントロール卵母細胞（ｃＲＮＡを注入していないもの）を用い、前記に記載した方法に準じて実施した。この結果、エストロン硫酸およびメトトレキセートのＫｍ値はそれぞれ３．０８μＭおよび２．２２μＭであった。
【００４５】
ｈＯＡＴ３の基質選択性をさらに検討するために、ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験系において、系へ各種アニオン性物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。
３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験は、ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記に記載した方法に準じて実施した。
即ち、コントロール卵母細胞（ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入していない卵母細胞）、およびｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、５０ｎＭ３Ｈ−エストロン硫酸単独、又は５００μＭ若しくは図に表示されている濃度の放射能非標識化合物を含む緩衝液中で１時間培養し、３Ｈ−工スト口ン硫酸の取り込みを測定した。結果は、５０ｎＭ３Ｈ−エスト口ン硫酸単独を含む緩衝液中でのｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞の示す取り込みを１００％とし、阻害薬を含む緩衝液中での各々の値を％で表示した。
【００４６】
その結果を図１９に示す。図１９に示すように、これらの化合物は全てｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−エストロン硫酸の取り込みを阻害し、これらの化合物がｈＯＡＴ３と相互作用することが示された。この結果、種々のアニオン性物質（エストロン硫酸、ＰＡＨ、タウロコール酸、プロベネシド、フロセミド．ジドブジン、ペニシリンＧ、ＢＳＰ、グルタル酸、インドメタシン、メトトレキセート）は、ｈＯＡＴ３による３Ｈ−エストロン硫酸の輸送を有意に阻害することがわかった（図１９参照）。一方、代表的な有機カチオンであるテトラエチルアンモニウムは、阻害作用を示さなかった。以上の結果から、本発明のｈＯＡＴ３は多選択性有機アニオントランスボーターであることが明かとなった。
【００４７】
本発明は、有機アニオンに対して広い基質選択性を有し、脳や肝臓などに選択的に分布する新規な有機アニオントランスポーターを提供するものである。
本発明の有機アニオントランスポーターは、種々の薬物の細胞への取り込みに関与しており、薬物の生体内での動態にも関与している。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターは、細胞の維持や活性化のみならず、薬物の動態をスクリーニングする際にも有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明のラットＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、有機アニオン取り込み活性を示すものである。
【図２】図２は、本発明のラットＯＡＴ３の卵母細胞を用いた、ＰＡＨ、エストロン硫酸及びオクラトキシンＡの輸送の動力学試験の結果を示すものである。
【図３】図３は、本発明のラットＯＡＴ３の有機アニオン輸送における、各種有機物質の阻害作用の試験の結果を示すものである。
【図４】図４は、本発明のラットＯＡＴ３遺伝子のノーザンブロッティング解析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、脳型神経伝達物質の種々の代謝物による、ラットＯＡＴ３の輸送阻害試験の結果を示すものである。
【図６】図６は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）の取り込み活性を示すものである。
【図７】図７は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み活性を示すものである。
【図８】図８は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン硫酸の取り込み活性を示すものである。
【図９】図９は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−オクラトキシンＡの取り込み活性を示すものである。
【図１０】図１０は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−シメチジンの取り込み活性を示すものである。
【図１１】図１１は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−エストラジオールグルクロニドの取り込み活性を示すものである。
【図１２】図１２は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−プロスタグランジンＥ２の取り込み活性を示すものである。
【図１３】図１３は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−タウロコール酸の取り込み活性を示すものである。
【図１４】図１４は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−グルタル酸の取り込み活性を示すものである。
【図１５】図１５は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−メトトレキセートの取り込み活性を示すものである。
【図１６】図１６は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−サリチル酸の取り込み活性を示すものである。
【図１７】図１７は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−インドメタシンの取り込み活性を示すものである。
【図１８】図１８は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−コール酸の取り込み活性を示すものである。
【図１９】図１９は、本発明のｈＯＡＴ３による３Ｈ−エストロン硫酸の輸送における、各種有機物質の阻害作用の試験の結果を示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は有機陰イオン（有機アニオン）輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓および腎臓は、生体異物や薬物の代謝および体外排出に関して重要な役割を果たしている。尿細管細胞および肝細胞は極性を有する上皮細胞でありアニオン性の物質の一部は、輸送担体（トランスポーター）により側底膜を介して腎臓および肝臓中に取り込まれ、また細胞内で代謝により産生された有機アニオンもトランスポーターにより排出されることが推測される。
尿細管細胞や肝細胞の側底膜を介した有機アニオンの取り込みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。
【０００３】
しかし従来の手法では、側底膜を介した有機アニオン輸送について詳細に解析することは困難であり、トランスポーターそのものを単離して詳細に解析することが望まれてきた。
一方、脳においても有機アニオン輸送がおこなわれていることも複数の実験結果から推測されている。脳における有機アニオン輸送は、主に内因性および外来性の有機アニオンの脳外への排泄に働いているものと考えられる。
脳における有機アニオン輸送は、内因性アニオンおよび外来性異物の脳からの排除という重要な役割を担っていると予想されているにも関わらず、生理的実験が困難なことから、腎臓や肝臓以上にその輸送の詳細は不明である。
【０００４】
これらの背景をふまえ、有機アニオントランスポーターの分子実体の探索が１９９０年代に入り積極的に行われた。この結果、肝臓の側底膜の有機アニオントランスポーターが昨年までに二つ単離された。（Hagenbuch, B.らProc Natl Acad Sci USA 88巻、10629-33頁、1991年、Jacquemin, E.ら、Proc Natl Acad Sci USA、91巻、133-7頁、1994年）。
昨年、本発明者らは独自に、腎臓での有機アニオン輸送において最も重要な役割を果たしている有機アニオントランスポーターＯＡＴ１の単離に成功し（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997)、既に特許出願済みである。ＯＡＴ１は化学構造の異なる多くの有機アニオンを輸送することの出来るトランスポーターであり、種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。
【０００５】
ＯＡＴ１の発現は腎特異的で、腎以外では脳に極めてわずかな発現をみるのみである。
最近本発明者らはさらに、ＯＡＴ１とアミノ酸レベルで４０％台の弱い相同性を持つ肝特異的有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ２）を同定した（FEBS letter 429巻、179-182頁、1998年）（特願平１０−１６９１７４号）。
ＯＡＴ１およびＯＡＴ２の単離、同定は有機アニオントランスポーターがファミリーを形成することを示している。さらにＯＡＴ２が肝特異的に発現していることから、このファミリーが腎特異的ではなく、種々の臓器にも発現していることも示唆する。
【０００６】
既に述べたように脳には有機アニオン輸送系が存在するものと考えられるが、脳でのＯＡＴ１の発現は極めてわずかであり、又、ＯＡＴ２は存在しない。本発明者らは、これらの事実から脳における有機アニオン輸送を担う未知のトランスポーターの存在を予想した。
他方、肝臓の側底膜における有機アニオン輸送は複雑であり、特に肝細胞内で多量に産生される抱合体（その多くは有機アニオン）の血中への流出経路は未だ不明である。この肝臓での有機アニオン輸送についても、ＯＡＴ２を含む上記有機アニオントランスポーターのみでは説明しきれず、さらなる未知のトランスポーターの存在が予想される
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、脳および肝臓における有機アニオン輸送に関与する新規な有機アニオンントランスポーター遺伝子およびその遺伝子がコードするポリペプチドである有機アニオントランスポーターを同定し、提供することにある。その他の目的については以下の記載より明白である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腎臓での有機アニオン輸送において最も重要な役割を果たしている有機アニオントランスポーターＯＡＴ１を単離した（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997）。さらにＯＡＴ１との構造上の類似性から、肝特異的な有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ２）を同定した（Sekine, T.ら、FEBS letter 429巻、179-182頁、1998年）。さらにＯＡＴ１およびＯＡＴ２が、有機カチオントランスポーターＯＣＴ１（Grundemann, D.ら、Nature, 372巻, 549-52頁、1994）とも弱い相同性があることを既に報告している（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997)。
【０００９】
これらの事実をふまえ、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１に共通する配列を同定し、さらにその配列からデジェネレイトプライマー（degenerate primer）を作成した。このデジェネレイトプライマー（degenerate primer）を用い、ラット脳ｍＲＮＡからＲＴ（reverse transcript）−ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によって、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１と弱い相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片を同定した。このｃＤＮＡ断片を用いて、ラットｃＤＮＡライブラリーよりこれまでに報告のないｃＤＮＡを同定し、この蛋白質をＯＡＴファミリーの第三のメンバーとして脳型有機アニオントランスポーターＯＡＴ３（Organic Anion Transporter 3）と命名した。
【００１０】
本発明は、有機アニオントランスポーターＯＡＴ３に関し、本発明の有機アニオントランスポーターＯＡＴ３は、異なる化学構造を持った有機アニオンに対してこれらを輸送する（取り込む能力を有する）、広い範囲の基質選択性を有するトランスポーターであるが、代表的な有機カチオンであるＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を輸送しなかった。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターＯＡＴ３は、有機アニオンに対する広い範囲の基質選択性を有するが、代表的な有機カチオンであるＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）に対する基質選択性は実質的に有さず、主として脳、肝臓などの器官に選択的に分布する有機アニオントランスポーターである。
本発明のタンパク質は、前記した有機アニオントランスポーターＯＡＴ３である配列番号２（ヒト）又は４（ラット）で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列と通常、６０〜８０％、好ましくは７０〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００１１】
また、本発明は、前記した有機アニオントランスポーターＯＡＴ３を含む本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡに関する。本発明の核酸は、本発明のタンパク質をコードするもののほか、さらに前記核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし得る核酸を包含する。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸の部分配列又は当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドに関する。
また、本発明は、本発明のタンパク質または、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドに対する抗体に関する。
【００１２】
本発明の有機アニオントランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の腎臓、脳などの臓器の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
遺伝子のスクリーニングおよび単離は、ホモロジースクリーニングおよびＰＣＲスクリーニングなどにより好適に実施できる。得られたｃＤＮＡは、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ちＯＡＴ３のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたｃＤＮＡが有機アニオントランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、即ちｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物が有機アニオントランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。即ち、得られたＯＡＴ３遺伝子から調製したｃＲＮＡを卵母細胞に導入して発現させ、有機アニオンを細胞内に輸送する（取り込む）能力を、適当な有機アニオンを基質とする通常の取り込み実験（Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997）により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。
また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、ＯＡＴ３の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。
【００１３】
配列表の配列番号３にこのような方法により得られたラットの有機アニオントランスポーターＯＡＴ３のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号４にそのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
得られたＯＡＴ３遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
配列表の配列番号１にこのような方法により得られたヒトの有機アニオントランスポーターＯＡＴ３のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号２にそのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号１又は３）に示された塩基配列、もしくはその一部の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することが出来る。
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは例えば、「Molecular Cloning；Sambrook, J., Fritsh, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。
【００１６】
本発明の有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）は、例えば、有機アニオントランスポーターをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術により生産することができる。例えば、有機アニオントランスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組み換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが望ましい。
【００１７】
例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現させる場合には、本発明の有機アニオントランスポーターをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換して、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞やプタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞株が挙げられる。
【００１８】
有機アニオントランスポーターＯＡＴ３をコードするｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号１又は３に示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることが出来るほか、前記のｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列をもつＤＮＡはＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位変異導入法（site specific mutagenesis）「Mark, D.F. ら、Proc Natl Acad Sci USA 第18巻、5662-5666頁、1984年」等により実施できる。
【００１９】
本発明の有機アニオントランスポーター遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）は、有機アニオントランスポーター遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、有機アニオントランスポーターの発現を変調させるために、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、デコイとして使用することもできる。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸の部分配列又は当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドに関する。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１又は３で示される塩基配列の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上あるいは３０塩基以上の配列を用いても良い。これらのヌクレオチドは、必要に応じて放射性元素や、蛍光性物質又は化学発光物質などを用いて標識化することもできる。
本発明の配列番号１又は３で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドは、本発明の有機アニオントランスポーターＯＡＴ３をコードする塩基配列中の特異的な塩基配列を有するものが好ましく、必要により標識化されていてもよい。
【００２０】
また、本発明の有機アニオントランスポーターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、有機アニオントランスポーター検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の有機アニオントランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（たとえば、ラットやウサギ）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。また、本発明の抗体は、常法によりキメラ型やヒト型抗体としたものであってもよい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００２２】
なお下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「Molecular Cloning：Sambrook, J., Fritsh, E.F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により行うか、または、市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００２３】
実施例１
多選択性有機アニオントランスポーター３（ＯＡＴ３）ｃＤＮＡの単離とその解析
（１）ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＣＴ１の塩基配列情報を基にしたデジェネレイトプライマー（degenerate primer）の作成
既に本発明者らが単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２、および報告されているＯＣＴ１の塩基配列情報から、これら３つのトランスポーター間で共通するアミノ酸配列（ＯＡＴ１のアミノ酸配列の２６７−２７５および４４７−４５２に相当部分）より、デジェネレイトプライマー（degenerate primer）を作成した。
【００２４】
ラット脳よりＧＩＴＣ法により全ＲＮＡを抽出し、さらにオリゴｄＴ（oligo dT）カラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。このラット脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡより逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いてｃＤＮＡを作成し、これを鋳型として上記デジェネレイトプライマー（degenerate primer）によりＰＣＲを行った。この結果、約５５０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
このＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキット（インヴィトロゲン社製）を用いてクローン化し、そのいくつかの塩基配列を決定したところ、ＯＡＴ１とアミノ酸レベルで５０％台の相同性を有する新規ｃＤＮＡ（Ｂ１０）が得られた。
【００２５】
Ｂ１０ ｃＤＮＡを３２Ｐでラベルしたプローブを用いて、ラットの種々の臓器より抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡによるノーザンハイブリダイゼーション（Northern hybridization）をおこなったところ、肝臓、腎臓、脳および目に陽性のバンドを検出した。
【００２６】
既に本発明者らは、ラット腎の良好なｃＤＮＡライブラリーを持っていたため、このラット腎ｃＤＮＡライブラリーをＢ１０プローブ用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、３７℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミド、５×標準クエン酸Ｎａｃｌ溶液（standard saline citrate(SSC)）、３× デンハード液、０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％ＡｎｔｉｆｏａｍＢ（シグマ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。λＺｉｐＬｏｘ中に単離されたクローンは、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法によりプラスミドベクタ−ｐＺＬにさらにサブクローン化した。この結果、有機アニオン輸送活性を持つ新規クローン（ｒｋｌ４１１）が得られた（輸送機能解析については以下の実施例２参照）。
【００２７】
上記により得られたクローン（ｒｋｌ４１１）の塩基配列の決定は以下のようにして行った。まず、キロシークエンス用デリーションキット（タカラ社製）を用いて、ｒｋｌ４１１を片側より約３００ｂｐづつ削除した複数のプラスミドＤＮＡを得た。これらを自動シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いてその塩基配列を解析した。さらにｒｋｌ４１１に対する特異的オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、自動シークエンサーを用いて逆方向からもその塩基配列を解析し、最終的にｒｋｌ４１１の全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号３に記載する。また、このタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号４に記載する。
【００２８】
実施例２（ｒｋｌ４１１の機能の特定）
（１）上記により得られたクローン（ｒｋｌ４１１）を含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロでｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した（Sekine, T., et al. J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年参照）。
得られたｃＲＮＡを、既に報告されている方法に従い（Sekine, T., et al. J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年）、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結果、図１に示すようにｒｋｌ４１１を発現させた卵母細胞は１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）、３Ｈ−オクラトキシンＡ、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込みを示すことが判明した。これに対して代表的な有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を輸送しなかった。
【００２９】
ｒｋｌ４１１の有機アニオン輸送のミカエリス−メンテン動力学試験をおこなった。種々の濃度のＰＡＨ、エストロン硫酸、オクラトキシンＡのｒｋｌ４１１による取り込み量の変化を調べることにより、これらの基質のｒｋｌ４１１による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたＰＡＨ、エストロン硫酸、オクラトキシンＡの取り込み実験は、ｒｋｌ４１１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載の方法に準じて実施した。この結果（図２参照）、ＰＡＨ、エストロン硫酸、オクラトキシンＡのＫｍ値はそれぞれ４．７μＭ、２．３μＭおよび０．７４μＭであった。結果を次の表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
（２）ｒｋｌ４１１の基質選択性をさらに検討するために、ｒｋｌ４１１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験系において、系へ各種アニオン性物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験は、ｒｋｌ４１１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。１ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下および非存在下で、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込みを測定した。その結果、種々のアニオン性物質（タウロコール酸、コール酸、ブロモサルフォフタレイン、プロベネシド、インドシアニングリーン、ブメタニド、セフォペラゾン、ピロキシカム、フロセミド、アジドチミジン、ベンジルペニシリンなど）はｒｋｌ４１１による３Ｈ−エストロン硫酸の輸送を有意に阻害した（図３参照）。一方、テトラエチルアンモニウム、グアニジン、キニジン、ベラパミルのようなカチオン性物質は阻害作用を示さなかった（図３参照）。以上の結果から、ｒｋｌ４１１は多選択性トランスポーターであり、又、主に有機アニオンを認識することから、ｒｋｌ４１１をＯＡＴファミリーの第三のメンバーとして、ＯＡＴ３（organic anion transporter 3）と命名した。
【００３２】
実施例３
ラットの各組織におけるＯＡＴ３遺伝子の発現（ノーザンブロッティング）の解析を行った。ＯＡＴ３ ｃＤＮＡの全長を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いてラットの種々の組織から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のように行った。３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動した後にニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＯＡＴ３ ｃＤＮＡ全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイブリダイセーションを行った。フィルターを６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロットの結果（図４参照）、腎臓、肝臓、脳において、２．４Ｋｂ付近に強いバンドが検出された。また目に弱い発現が観察された。
【００３３】
実施例４
ＯＡＴ３がＯＡＴファミリーのメンバーの中では最も強く脳に発現していたため、その脳での役割を推測する試みとして、神経伝達物質の種々の代謝物（主に有機アニオン）によるＯＡＴ３の輸送阻害実験を行った。図５に示すように、ノルアドレナリンやセロトニン代謝物はＯＡＴ３によるエストロン硫酸輸送を阻害し、それら自身がＯＡＴ３の基質となる可能性を示した。この事実は、ＯＡＴ３の脳型での役割のひとつとして神経伝達物質の代謝物の脳外排出作用を示唆するものである。
【００３４】
実施例５
ヒト型多選択性有機アニオントランスポーター３（ＯＡＴ３）ｃＤＮＡの単離とその解析
既に本発明者らが単離したラットＯＡＴ３のｃＤＮＡを用いてＥＳＴ（expressed sequence tag）データベースを検索したところ、ラットＯＡＴ３と高い相同性を有するヒトＥＳＴクローン（Ｈ２０３４５）を同定した。このクロ−−ンの塩基配列の一部（３３３ｂｐ）をＰＣＲ法を用いて合成した。このｃＤＮＡ断片を３２Ｐでラベルしたものをプローブとして用い、以下のようにスクリーニングを行った。
【００３５】
すでに本発明者らが保持していたヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーを、上記プローブを用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、３７℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（standard saline citrate）、３×デンハード液、０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ（シグマ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。λＺｉｐＬｏｘ中に単難されたクローンは、インビトロエキサイション（in vitro excision）法によりプラスミドベクタ−ｐＺＬにさらにサブクローン化した。この結果、有機アニオン輸送活性を持つｈＯＡＴ３（human organic anion transporter 3：ヒト型有機アニオントランスポーター３）が得られた。このものの輸送機能の解析については以下の実施例６で説明する。
【００３６】
ｈＯＡＴ３の塩基配列は以下の方法により決定した。ｈＯＡＴ３に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを順次合成し、自動シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’および３’側の両方向から塩基配列の解析を行い、最終的にｈＯＡＴ３の全塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列表の配列番号１に記載する。このｃＤＮＡ配列からｈＯＡＴ３をコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。
また、ｃＤＮＡの塩基配列を表２〜６に示し、そのアミノ酸配列を塩基配列と対応させて表３に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
【表６】
【００４２】
実施例６
ｈＯＡＴ３の機能の特定
上記により得られたｈＯＡＴ３を含むブラスミドから、Ｔ７ＲＮＡボリメラーセを用いて、インビトロでｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）をセキネらの方法（Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272, 18526-9 (1997)）に準じて調製した。
得られたｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを、既に報告されているセキネらの方法（Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272, 18526-9 (1997)）に従い、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび有機カチオンの取り込み実験を行った。コントロール卵母細胞（ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入していない卵母細胞）、およびｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、以下の放射能標識体を含む緩衝液中で１時間培養し、卵母細胞内への放射能標識体の取り込みを測定した。
この結果を図６〜図１８に示す。各図の白色（open column）の方はコントロール卵母細胞を用いた場合を示し、黒色（closed column）の方はｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用いた場合を示す。図６は１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）（１０μＭ）、図７は３Ｈ−エストロン硫酸（５０ｎＭ）、図８は３Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン硫酸（５０ｎＭ）、図９は３Ｈ−オクラトキシンＡ（１００ｎＭ）、図１０は３Ｈ−シメチジン（１５０ｎＭ）、図１１は３Ｈ−エストラジオールグルクロニド（５０ｎＭ）、図１２は３Ｈ−プロスタグランジンＥ２（１ｎＭ）、図１３は１４Ｃ−タウロコール酸（１μＭ）、図１４は１４Ｃ−グルタル酸（１０μＭ）、図１５は３Ｈ−メトトレキセート（１００ｎＭ）、図１６は１４Ｃ−サリチル酸（１μＭ）、図１７は１４Ｃ−インドメタシン（１０μＭ）、図１８は１４Ｃ−コール酸（１０μＭ）の場合をそれぞれ示す。
【００４３】
これらの図に示されるように、これらの放射能標識体において、ｈＯＡＴ３を発現した卵母細胞における値は、コントロール卵母細胞に比べ高く、これらの化合物をｈＯＡＴ３が輸送することが示された。
この結果、ｈＯＡＴ３を発現させた卵母細胞は、１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）、３Ｈ−エストロン硫酸、３Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン硫酸、３Ｈ−オクラトキシンＡ、３Ｈ−シメチジン、３Ｈ−エストラジオールグルクロニド、３Ｈ−プロスタグランジンＥ２、１４Ｃ−タウロコール酸、１４Ｃ−グルタル酸、３Ｈ−メトトレキセート、１４Ｃ−サリチル酸、１４Ｃ−インドメタシン、１４Ｃ−コール酸の取り込みを示すことが判明した。 これに対して、ｈＯＡＴ３は代表的な有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）を輸送しなかった（図には示さず）。
【００４４】
次いで、ｈＯＡＴ３の有機アニオン輸送のミカエリスーメンテン動力学試験を行った。種々の濃度のエストロン硫酸およびメトトレキセートのｈＯＡＴ３による取り込み量の変化を調べることにより、これらの基質のｈＯＡＴ３による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたエストロン硫酸およびメトトレキセートの取り込み実験は、ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞およびコントロール卵母細胞（ｃＲＮＡを注入していないもの）を用い、前記に記載した方法に準じて実施した。この結果、エストロン硫酸およびメトトレキセートのＫｍ値はそれぞれ３．０８μＭおよび２．２２μＭであった。
【００４５】
ｈＯＡＴ３の基質選択性をさらに検討するために、ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験系において、系へ各種アニオン性物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。
３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験は、ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記に記載した方法に準じて実施した。
即ち、コントロール卵母細胞（ｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入していない卵母細胞）、およびｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、５０ｎＭ３Ｈ−エストロン硫酸単独、又は５００μＭ若しくは図に表示されている濃度の放射能非標識化合物を含む緩衝液中で１時間培養し、３Ｈ−工スト口ン硫酸の取り込みを測定した。結果は、５０ｎＭ３Ｈ−エスト口ン硫酸単独を含む緩衝液中でのｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞の示す取り込みを１００％とし、阻害薬を含む緩衝液中での各々の値を％で表示した。
【００４６】
その結果を図１９に示す。図１９に示すように、これらの化合物は全てｈＯＡＴ３ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３Ｈ−エストロン硫酸の取り込みを阻害し、これらの化合物がｈＯＡＴ３と相互作用することが示された。この結果、種々のアニオン性物質（エストロン硫酸、ＰＡＨ、タウロコール酸、プロベネシド、フロセミド．ジドブジン、ペニシリンＧ、ＢＳＰ、グルタル酸、インドメタシン、メトトレキセート）は、ｈＯＡＴ３による３Ｈ−エストロン硫酸の輸送を有意に阻害することがわかった（図１９参照）。一方、代表的な有機カチオンであるテトラエチルアンモニウムは、阻害作用を示さなかった。以上の結果から、本発明のｈＯＡＴ３は多選択性有機アニオントランスボーターであることが明かとなった。
【００４７】
本発明は、有機アニオンに対して広い基質選択性を有し、脳や肝臓などに選択的に分布する新規な有機アニオントランスポーターを提供するものである。
本発明の有機アニオントランスポーターは、種々の薬物の細胞への取り込みに関与しており、薬物の生体内での動態にも関与している。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターは、細胞の維持や活性化のみならず、薬物の動態をスクリーニングする際にも有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明のラットＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、有機アニオン取り込み活性を示すものである。
【図２】図２は、本発明のラットＯＡＴ３の卵母細胞を用いた、ＰＡＨ、エストロン硫酸及びオクラトキシンＡの輸送の動力学試験の結果を示すものである。
【図３】図３は、本発明のラットＯＡＴ３の有機アニオン輸送における、各種有機物質の阻害作用の試験の結果を示すものである。
【図４】図４は、本発明のラットＯＡＴ３遺伝子のノーザンブロッティング解析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、脳型神経伝達物質の種々の代謝物による、ラットＯＡＴ３の輸送阻害試験の結果を示すものである。
【図６】図６は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）の取り込み活性を示すものである。
【図７】図７は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み活性を示すものである。
【図８】図８は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン硫酸の取り込み活性を示すものである。
【図９】図９は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−オクラトキシンＡの取り込み活性を示すものである。
【図１０】図１０は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−シメチジンの取り込み活性を示すものである。
【図１１】図１１は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−エストラジオールグルクロニドの取り込み活性を示すものである。
【図１２】図１２は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−プロスタグランジンＥ２の取り込み活性を示すものである。
【図１３】図１３は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−タウロコール酸の取り込み活性を示すものである。
【図１４】図１４は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−グルタル酸の取り込み活性を示すものである。
【図１５】図１５は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、３Ｈ−メトトレキセートの取り込み活性を示すものである。
【図１６】図１６は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−サリチル酸の取り込み活性を示すものである。
【図１７】図１７は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−インドメタシンの取り込み活性を示すものである。
【図１８】図１８は、本発明のｈＯＡＴ３をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた時の、１４Ｃ−コール酸の取り込み活性を示すものである。
【図１９】図１９は、本発明のｈＯＡＴ３による３Ｈ−エストロン硫酸の輸送における、各種有機物質の阻害作用の試験の結果を示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞と、被検有機アニオン化合物とを溶液中で培養することを特徴とする、被検有機アニオン化合物に対するＯＡＴ３を介した細胞内への取込能の測定方法。
【請求項２】
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオン化合物を工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該細胞内への有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（３）工程（２）で得られた測定値がコントロール細胞を用いて同様の操作を行った場合の測定値と比較して有意な差を示した化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオントランスポーターＯＡＴ３によって前記組み換え細胞内に取り込まれることが確認された有機アニオン化合物を少なくとも２種以上選択し、それぞれを単独で、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、前記組み換え細胞への各有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）工程（２）で選択した２種以上の有機アニオン化合物を組み合わせて、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、前記組み換え細胞内へのそれぞれの有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値を工程（２）で得られた測定値と比較することで、選択された２種以上の有機アニオン化合物同士の相互作用を観察する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被検有機アニオン化合物に対するＯＡＴ３を介した細胞内への取込能が、ＯＡＴ３を介した脳細胞内への取り込み能であることを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の方法に用いるための測定用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、有機アニオン化合物に対するＯＡＴ３を介した細胞内への取込能測定用試薬。
【請求項６】
脳細胞内に取り込まれることが既知の２種以上の有機アニオン化合物同士の相互作用に基づくＯＡＴ３を介した脳細胞への取り込み能の測定方法であって、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で選択的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物を少なくとも２種以上選択し、それぞれを単独で、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、前記組み換え細胞への各有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）工程（２）で選択した２種以上の化合物を組み合わせて、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、前記組み換え細胞内へのそれぞれの有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値を工程（２）で得られた測定値と比較することで、選択された２種以上の脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物同士の相互作用を観察する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法に用いるための測定用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、脳細胞内に取り込まれることが既知の２種以上の有機アニオン化合物同士の相互作用に基づくＯＡＴ３を介した脳細胞への取り込み能測定用試薬。
【請求項８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞と、被検有機アニオン化合物とを溶液中で培養することを特徴とする、ＯＡＴ３を介して細胞内に取り込まれる有機アニオン化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオン化合物を工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該細胞内への有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（３）工程（２）で得られた測定値がコントロール細胞を用いて同様の操作を行った場合の測定値と比較して有意な差を示した化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクリーニング方法が、ＯＡＴ３を介して脳細胞内に取り込まれる有機アニオン化合物のスクリーニング方法である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０いずれかに記載の方法に用いるためのスクリーニング用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、ＯＡＴ３を介して細胞内に取り込まれる有機アニオン化合物のスクリーニング用試薬。
【請求項１２】
少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳類由来の腎臓、脳及び肝臓で選択的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオントランスポーターＯＡＴ３によって前記組み換え細胞内に取り込まれることが確認された有機アニオン化合物を、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該組み換え細胞内への当該確認された有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）試験化合物を工程（２）で用いたと同一の確認された有機アニオン化合物と共に工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、当該組み換え細胞内への前記確認された有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値が工程（２）で得られた測定値と比較して有意な差を示した場合の試験化合物を選択する工程、
を含む、ＯＡＴ３を介した有機アニオン取り込み能を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法に用いるためのスクリーニング用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、ＯＡＴ３を介した有機アニオン取り込み能を促進又は阻害する化合物のスクリーニング用試薬。
【請求項１４】
少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳類由来の腎臓、脳及び肝臓で選択的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物を工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該組み換え細胞内への当該既知の有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）試験化合物を、工程（２）で用いたと同一の化合物と共に、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、当該組み換え細胞内への前記確認された有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値が工程（２）で得られた測定値と比較して有意な差を示した場合の試験化合物を選択する工程、
を含む、脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物に対する脳細胞への取り込み能を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法に用いるためのスクリーニング用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物に対する脳細胞への取り込み能を促進又は阻害する物質のスクリーニング用試薬。
【請求項１】
配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞と、被検有機アニオン化合物とを溶液中で培養することを特徴とする、被検有機アニオン化合物に対するＯＡＴ３を介した細胞内への取込能の測定方法。
【請求項２】
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオン化合物を工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該細胞内への有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（３）工程（２）で得られた測定値がコントロール細胞を用いて同様の操作を行った場合の測定値と比較して有意な差を示した化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオントランスポーターＯＡＴ３によって前記組み換え細胞内に取り込まれることが確認された有機アニオン化合物を少なくとも２種以上選択し、それぞれを単独で、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、前記組み換え細胞への各有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）工程（２）で選択した２種以上の有機アニオン化合物を組み合わせて、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、前記組み換え細胞内へのそれぞれの有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値を工程（２）で得られた測定値と比較することで、選択された２種以上の有機アニオン化合物同士の相互作用を観察する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被検有機アニオン化合物に対するＯＡＴ３を介した細胞内への取込能が、ＯＡＴ３を介した脳細胞内への取り込み能であることを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の方法に用いるための測定用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、有機アニオン化合物に対するＯＡＴ３を介した細胞内への取込能測定用試薬。
【請求項６】
脳細胞内に取り込まれることが既知の２種以上の有機アニオン化合物同士の相互作用に基づくＯＡＴ３を介した脳細胞への取り込み能の測定方法であって、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で選択的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物を少なくとも２種以上選択し、それぞれを単独で、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、前記組み換え細胞への各有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）工程（２）で選択した２種以上の化合物を組み合わせて、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、前記組み換え細胞内へのそれぞれの有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値を工程（２）で得られた測定値と比較することで、選択された２種以上の脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物同士の相互作用を観察する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法に用いるための測定用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、脳細胞内に取り込まれることが既知の２種以上の有機アニオン化合物同士の相互作用に基づくＯＡＴ３を介した脳細胞への取り込み能測定用試薬。
【請求項８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞と、被検有機アニオン化合物とを溶液中で培養することを特徴とする、ＯＡＴ３を介して細胞内に取り込まれる有機アニオン化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオン化合物を工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該細胞内への有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（３）工程（２）で得られた測定値がコントロール細胞を用いて同様の操作を行った場合の測定値と比較して有意な差を示した化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクリーニング方法が、ＯＡＴ３を介して脳細胞内に取り込まれる有機アニオン化合物のスクリーニング方法である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０いずれかに記載の方法に用いるためのスクリーニング用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、ＯＡＴ３を介して細胞内に取り込まれる有機アニオン化合物のスクリーニング用試薬。
【請求項１２】
少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳類由来の腎臓、脳及び肝臓で選択的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）有機アニオントランスポーターＯＡＴ３によって前記組み換え細胞内に取り込まれることが確認された有機アニオン化合物を、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該組み換え細胞内への当該確認された有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）試験化合物を工程（２）で用いたと同一の確認された有機アニオン化合物と共に工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、当該組み換え細胞内への前記確認された有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値が工程（２）で得られた測定値と比較して有意な差を示した場合の試験化合物を選択する工程、
を含む、ＯＡＴ３を介した有機アニオン取り込み能を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法に用いるためのスクリーニング用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、ＯＡＴ３を介した有機アニオン取り込み能を促進又は阻害する化合物のスクリーニング用試薬。
【請求項１４】
少なくとも以下の（１）〜（４）の工程；
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳類由来の腎臓、脳及び肝臓で選択的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸を導入した組み換え細胞を得る工程、
（２）脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物を工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該組み換え細胞内への当該既知の有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、
（３）試験化合物を、工程（２）で用いたと同一の化合物と共に、工程（１）で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程（２）と同一条件下で同一時間培養後、当該組み換え細胞内への前記確認された有機アニオン化合物の取り込み量を測定する工程、及び
（４）工程（３）で得られた測定値が工程（２）で得られた測定値と比較して有意な差を示した場合の試験化合物を選択する工程、
を含む、脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物に対する脳細胞への取り込み能を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法に用いるためのスクリーニング用試薬であって、
該試薬が、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を用いて、哺乳類由来の腎臓、脳、もしくは肝臓のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーから、ホモロジースクリーニングもしくはＰＣＲスクリーニングによって単離することができる核酸であって、かつ哺乳動物由来の腎臓、脳及び肝臓で特異的に発現する多選択性有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ３）をコードする核酸、を有効成分として含むことを特徴とする、脳細胞内に取り込まれることが既知の有機アニオン化合物に対する脳細胞への取り込み能を促進又は阻害する物質のスクリーニング用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２５４１００（Ｐ２０１２−２５４１００Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２１７３３（Ｐ２０１２−２２１７３３）
【出願日】平成２４年１０月３日（２０１２．１０．３）
【分割の表示】特願２００８−２３７３４１（Ｐ２００８−２３７３４１）の分割
【原出願日】平成１１年９月２０日（１９９９．９．２０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月３日（２０１２．１０．３）
【分割の表示】特願２００８−２３７３４１（Ｐ２００８−２３７３４１）の分割
【原出願日】平成１１年９月２０日（１９９９．９．２０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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