腎不全治療薬をスクリーニングする方法
腎不全治療薬を得るためのスクリーニングツール及び簡便なスクリーニング方法、並びに腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法を開示する。前記スクリーニングツールはＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチドであるＧ蛋白質共役型受容体ＦＧＫ、その機能的等価改変体、又は相同ポリペプチドであるか、あるいは前記ポリペプチドを発現している細胞である。スクリーニング方法は、前記ポリペプチドの阻害を指標とする方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、オーファンＧＰＣＲを発現している細胞及び該細胞を使用する腎不全治療薬のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
腎疾患による慢性透析患者は年々増加している。これは医療経済的にも大きな問題であり、その進行の改善が強く望まれている。腎障害の原因は慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症など多岐に渡り、成因も免疫学的機序、高血圧等様々である。しかし原因に拠らず、ある段階から糸球体障害には共通の進展機序が考えられている。それはＢｒｅｎｎｅｒらによって提唱された過剰濾過（ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）説に基づく考え方である（非特許文献１）。以下に過剰濾過説を概説すると、まず糸球体障害による機能ネフロン減少、高血圧、高血糖、蛋白過剰摂取等により腎臓内の血行動態が変化して糸球体内圧の上昇が起こり、いわゆる糸球体内高血圧と呼ばれる状態になる。そしてこれが糸球体細胞障害を惹起する。その結果メサンギウム細胞の形質変換、細胞外基質の産生亢進を促し、更には糸球体硬化へと進展する。これにより機能ネフロンが減少すると残存する機能ネフロンの糸球体内圧は更に上昇する。当初は糸球体が代償的に肥大し、機能喪失したネフロンを補うが、最終的には物理的破綻をきたす。この悪循環によって糸球体硬化が加速度的に進行し、末期腎不全に陥る。この糸球体硬化及び尿細管間質における細胞外基質の産生亢進は総じて腎線維化（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）と呼ばれており、原疾患を問わず腎不全進行と一致する組織学的変化である（非特許文献２）。よって個々の原疾患に対する治療の重要性は言うまでもないが、共通の進行機序である線維化の抑制は有力な治療アプローチであると考えられる。
線維化には様々なサイトカインや成長因子の関与が知られているが、中でもＴＧＦ−βはファイブロネクチンやＩ型コラーゲンなどの細胞外基質構成蛋白質の産生を誘導すること（非特許文献３）、細胞外基質分解酵素の発現／機能を抑制すること（非特許文献４）等から最も重要な進展因子と考えられている。更にＴＧＦ−β中和抗体（非特許文献５）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（非特許文献６）、デコリン（非特許文献７），ＴＧＦ−βレセプター中和抗体（非特許文献８）を用いたＴＧＦ−βの発現／機能抑制が腎臓の細胞外基質の増加を抑制することが腎炎モデル動物で示されており、その有効性がすでに明らかになっている。この様にＴＧＦ−βシグナル阻害は腎線維化抑制を機序とする腎不全治療につながることが示されている。しかしＴＧＦ−βは線維化促進作用の他にも抗炎症作用や腫瘍増殖抑制作用を持つ重要なサイトカインであり、ＴＧＦ−βノックアウトマウスは自己免疫疾患で死亡する（非特許文献９）ことなどから、線維化抑制のためにはＴＧＦ−βを直接阻害するのではなく、ＴＧＦ−βの下流でその線維化促進作用を仲介する因子を阻害することがより望ましいと考えられた（非特許文献１０）。
近年ＴＧＦ−βにより発現が誘導される新しいサイトカインの結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）が発見され（非特許文献１１）、ＣＴＧＦ発現により細胞外基質の産生が誘導されること（非特許文献１２）、ＣＴＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドや抗ＣＴＧＦ抗体によりＴＧＦ−β誘導のコラーゲン発現が抑制されること（非特許文献１３）、ヒト腎線維化病理組織像においてＣＴＧＦの発現が上昇していること（非特許文献１４）、ラット病態モデル腎臓においてＣＴＧＦ発現がＴＧＦ−βと共に上昇すること（非特許文献１５）、更に肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）がＣＴＧＦ産生抑制を介してマウス病態モデル腎臓の線維化を抑制すること（非特許文献１６）などが報告されている。これらを総合すると、腎組織においてＴＧＦ−βがＣＴＧＦの発現を誘導し、更にＣＴＧＦがＴＧＦ−βと共に細胞外基質の産生を亢進させて線維化を促進させる機序が明らかになった（非特許文献１７）。すなわちＣＴＧＦが腎線維化においてＴＧＦ−βの下流に位置するサイトカインであることが明らかになり、新たな治療標的となることが示された（非特許文献１８）。またＴＧＦ−βやＣＴＧＦによって発現が誘導されるＩ型コラーゲンはヒト正常腎では発現が低く、病態腎の糸球体や尿細管上皮において発現が上昇していること（非特許文献１９）、培養マウスメサンギウム細胞での高糖負荷による内在性ＴＧＦ−β発現誘導によりＩ型コラーゲンの発現が上昇すること（非特許文献２０）など、病態との関与が指摘されている。一方、ＣＴＧＦは脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、骨格筋など幅広い組織で発現しており、発現に組織特異性は見られない（非特許文献２２）。
ＦＧＫ（Ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ ＧＰＣＲ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ）は２００１年に報告されたＧＰＲ９１と同一のオーファンＧＰＣＲである（非特許文献２１）。ヒトＧＰＲ９１、マウスＧＰＲ９１はそれぞれアミノ酸３３０個、３１７個から成るポリペプチドであり、膜貫通領域を７箇所持つ７回膜貫通型レセプターと考えられている。ヒト、マウスＧＰＲ９１は互いに約６８％の相同性を有している。ヒトＧＰＲ９１は腎臓にのみ発現が認められ、マウスＧＰＲ９１は腎臓のほかに肝臓にも若干の発現が見られる。アフリカツメガエル卵黄を用いた反応系において、ＵＴＰがヒトＧＰＲ９１のリガンドとして機能することが報告されている（特許文献１）が、ＧＰＲ９１に共役するＧタンパク質や生理機能は不明である。特許文献２〜９にはＦＧＫと相同性を有する配列が開示されているが、アデノシン受容体であること（特許文献９）、Ｐ２Ｕ２プリン受容体であること（特許文献８）の他には発現に関する情報が記載されているにすぎず、その生理機能は不明であった。
【特許文献１】 国際公開第９７／２００４５号パンフレット
【特許文献２】 国際公開第９７／２４９２９号パンフレット
【特許文献３】 国際公開第０１／９８３５１号パンフレット
【特許文献４】 国際公開第００／２２１３１号パンフレット
【特許文献５】 国際公開第０１／９０３０４号パンフレット
【特許文献６】 国際公開第００／３１２５８号パンフレット
【特許文献７】 国際公開第０２／００７１９号パンフレット
【特許文献８】 国際公開第０２／６１０８７号パンフレット
【特許文献９】 ＵＳ０２／１３７８８７号
【非特許文献１】 「ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、（米国）、１９８２年、第３０７巻、ｐ．６５２−６５９
【非特許文献２】 「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９６年、第７巻、ｐ．２４９５−２５０８
【非特許文献３】 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９８７年、第２６２巻、ｐ．６４４３−６４４６
【非特許文献４】 「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．７９０−７９５
【非特許文献５】 「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、１９９０年、第３４６巻、ｐ．３７１−３７４
【非特許文献６】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、１９９６年、第５０巻、ｐ．１４８−１５５
【非特許文献７】 「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、１９９２年、第３６０巻、ｐ．３６１−３６４
【非特許文献８】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、２００１年、第６０巻、ｐ．１７４５−１７５５
【非特許文献９】 「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、１９９２年、第３５９巻、ｐ．６９３−６９９
【非特許文献１０】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、１９９７年、第５１巻、ｐ．１３８８−１３９６
【非特許文献１１】 「モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」、（米国）、１９９３年、第４巻、ｐ．６３７−６４５
【非特許文献１２】 「ザ・ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９６年、第１０７巻、ｐ．４０４−４１１
【非特許文献１３】 「ジ・エフエーエスイービー・ジャーナル（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、（米国）、１９９９年、第１３巻、ｐ．１７７４−１７８６
【非特許文献１４】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、１９９８年、第５３巻、ｐ．８５３−８６１
【非特許文献１５】 「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・レナル・フィジオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ・ＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００２年、第２８２巻、ｐ．Ｆ９３３−Ｆ９４２
【非特許文献１６】 「ジ・エフエーエスイービー・ジャーナル（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、（米国）、２００３年、第１７巻、ｐ．２６８−２７０
【非特許文献１７】 「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００１年、第１２巻、ｐ．４７２−４８４
【非特許文献１８】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、２０００年、第５８巻、ｐ．１３８９−１３９９
【非特許文献１９】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、２００２年、第６２巻、ｐ．１３７−１４６
【非特許文献２０】 「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、（米国）、１９９４年、第９３巻、ｐ．５３６−５４２
【非特許文献２１】 「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（英国）、２００１年、第３０７巻、ｐ．７９９−８１３
【非特許文献２２】 「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」、（米国）、１９９７年、第９５巻、ｐ．８３１−８３９
【発明の開示】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、オーファンＧＰＣＲであるＦＧＫは腎臓特異的に発現しており、腎不全における創薬標的であるＣＴＧＦのプロモーターを活性化することを見出した。この知見をもとにして、ＦＧＫ阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、すなわちＦＧＫ阻害剤を選択することによるＣＴＧＦ発現抑制に基づく腎不全治療薬のスクリーニング方法を構築した。更に、ＦＧＫそれ自身単独でもその活性の変化を指標にして腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることができることを見出し、確かにＦＧＫのインバースアゴニストがＣＴＧＦ発現を抑制することを見出した。このことからＦＧＫインバースアゴニストを選択することによる腎不全治療薬をスクリーニングする方法を確立した。上述したようにＣＴＧＦは幅広い組織で発現しており、発現に組織特異性は見られないことから単にＣＴＧＦ遺伝子のプロモーター領域を用いてスクリーニングした場合、その結果物は腎臓のみならず全組織でＣＴＧＦの産生を抑制することになり、ＣＴＧＦの作用である細胞増殖や細胞外基質産生の阻害に基づく副作用が懸念される。一方、ＦＧＫがＣＴＧＦプロモーターを活性化するという本発明者らが見出した知見を元にして構築したＦＧＫ阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする系を用いた場合、ＦＧＫは腎臓特異的に発現することから、そのスクリーニング結果物によるＣＴＧＦ産生抑制は腎臓特異的であり、その他の組織での発現抑制は起こらないことが期待される。
これらの結果、本発明者らは、簡便な腎不全治療薬のスクリーニング方法、並びに腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法を提供し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチドである腎不全治療薬スクリーニングツール、
［２］［１］に記載のポリペプチドを発現している細胞である腎不全治療薬スクリーニングツール、
［３］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している［２］に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記細胞内における［１］記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物がインバースアゴニストであるか否かを検出する方法、
［４］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している［２］に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞内における［１］記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療薬をスクリーニングする方法、
［５］下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３のＤＮＡを発現している［２］に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とするＣＴＧＦの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法
［６］ＣＴＧＦの発現を抑制する物質が腎不全治療薬である［５］に記載のスクリーニングする方法、
［７］下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１４のＤＮＡを発現している請求項２に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする腎不全治療薬をスクリーニングする方法、
［８］［１］に記載のポリペプチドのインバースアゴニストを含有する腎不全治療用医薬組成物、
［９］［４］乃至［７］に記載の方法によって得られる物質を含有する腎不全治療用医薬組成物、
［１０］［４］乃至［７］に記載の方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療用医薬組成物の製造方法、
［１１］［１］に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は［４］乃至［７］に記載の方法によって得られる物質を腎不全治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、腎不全治療方法、
［１２］［１］に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は［４］乃至［７］に記載の方法によって得られる物質の、腎不全治療用医薬組成物を製造するための使用
に関する。
特許文献１には本発明のスクリーニングツールであるポリペプチドの一つであるＦＧＫと同一配列の受容体が記載されている。腎臓に発現していること、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、及びＵＤＰによって活性化されることが記載され、スクリーニングのツールとして有用であるとされているが、何の目的のスクリーニングのツールとして有用であるか、その具体的な用途に関する記載はない。特許文献２〜特許文献９にはＦＧＫと相同性のある分子が開示されている。特許文献６には当該分子が腎臓において発現していると示されているが具体的用途に関する記載はない。特許文献７には当該分子が関わるとして多数の疾患名を列挙している中に腎疾患及び腎不全が含まれているが、それを裏付ける記載は全くない。特許文献８にはＦＧＫと相同性の高い分子を含む多数のＧＰＣＲが開示され、多数のＧＰＣＲに対しそれらが関与するとして多数の疾患名を挙げておりその中に腎疾患が含まれるが具体的実施例の記載はおろか、それらの用途の実験的裏付けは全くない。特許文献９にはＦＧＫと相同性を有する受容体が開示されアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法が開示されている。これらのアゴニスト及びアンタゴニストは血管拡張、低血圧、慢性腎疾患、甲状腺疾患、喘息を含む免疫性疾患の治療に有用であることが記載されている。しかしながら慢性腎疾患の治療に有用であることの根拠は当該分子が腎臓を含む特定の組織に発現していることのみであり、当該分子とＣＴＧＦとの関連については何ら記載されていない。特許文献２〜５の何れの文献にもＦＧＫと相同性を有する分子と腎疾患との関係、該分子とＣＴＧＦとの関係は記載されていない。
従って、腎不全における創薬標的であるＣＴＧＦのプロモーターをＦＧＫが活性化することは本発明者らが見出した新規の知見であり、ＦＧＫ阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、及びＦＧＫインバースアゴニストを選択することによる腎不全治療薬をスクリーニングする方法、並びに腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法は本発明者らによって初めて提供された発明である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＥＫ２９３細胞にｐＣＴＧＦ−ｌｕｃ又はｐＣＯＬＩＡ２−ｌｕｃレポータープラスミドを導入したときのルシフェラーゼ活性及びその活性のＦＧＫ遺伝子導入による変化を示すグラフである。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性の相対値を示している。
図２は、ＨＥＫ２９３細胞にｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ及びｐＳＲＥ−ｌｕｃレポータープラスミドを同時に導入したときのルシフェラーゼ活性及びその活性のＦＧＫ遺伝子導入による変化を示すグラフである。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性の相対値を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「ＦＧＫ」は「ＦＧＫ蛋白質」を、「インバースアゴニスト」は本発明のスクリーニング用ポリペプチド（例えばＦＧＫ）の自発活性（すなわちＦＧＫリガンド又はアゴニスト非存在下において、ある平衡状態で存在する活性化ＦＧＫにより検出される活性）を抑制する物質を表す。あるポリペプチドが「ＣＴＧＦプロモーターを活性化する」か否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば実施例３に記載の条件下で用量依存的な該ポリペプチドによる転写活性化を示すか否かを確認することにより、判定することができる。「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達増幅因子として機能するＧ蛋白のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧ蛋白質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。「ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達増幅因子として機能するＧ蛋白質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧ蛋白質である。ホスホリパーゼＣの活性化が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質としては、例えば、Ｇｑを挙げることができる。
＜腎不全治療薬スクリーニングツール＞
本発明の腎不全治療薬スクリーニングツールには、ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールと、細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとが含まれる。本明細書において「スクリーニングツール」とは、スクリーニングのために用いる物（具体的にはスクリーニングのために用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）をいう。「腎不全治療薬スクリーニングツール」とは、腎不全治療薬をスクリーニングするために、本発明の腎不全治療薬をスクリーニングする方法において試験化合物を接触させる対象となるポリペプチド又は細胞である。前述の［１］に記載のポリペプチド、又は［２］に記載の細胞の、腎不全治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
（１）ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールには、
１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである腎不全治療薬スクリーニングツール；
２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）である腎不全治療薬スクリーニングツール；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）である腎不全治療薬スクリーニングツール；
が含まれる。
ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールのうち、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来のオーファンＧＰＣＲの一つであり、当該ポリペプチドをヒトＦＧＫと称する。
ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価改変体としては、、「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチド」が好ましい。
相同ポリペプチドのうち好ましいものは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、更に好ましくはＣＴＧＦプロモーターを活性化することができる蛋白質である。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍ（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、第７３巻、第２３７−２４４頁、１９９８年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第２２巻、第４６７３−４６８０頁、１９９４年）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ ｔｕｐｌｅ １
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ ３
Ｗｉｎｄｏｗ ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ Ｓａｖｅｄ ５
本発明のポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる各種ポリペプチド、すなわち、ヒトＦＧＫ、機能的等価改変体、及び相同蛋白質を、以下、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドには、ヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＦＧＫ又はその変異体が含まれる。更には、それらの天然蛋白質（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生物由来のＦＧＫ若しくはその変異体）又はヒトＦＧＫを元にして遺伝子工学的に人為的に改変した蛋白質などが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一蛋白質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同蛋白質にみられる差異を意味する。
ヒトＦＧＫのヒトにおける変異体、又はヒト以外の生物由来のＦＧＫ若しくはその変異体は、当業者であれば、ヒトＦＧＫ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
例えば、ヒトＦＧＫ遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、蛋白質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現した蛋白質が、例えば、実施例３に記載の方法により、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することを確認することにより、所望の蛋白質を取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変した蛋白質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、蛋白質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現した蛋白質が、例えば、実施例３に記載の方法により、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することを確認することにより、所望の蛋白質を取得することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的蛋白質をコードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する細胞又は形質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体蛋白質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的蛋白質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトＦＧＫを調製する場合には、それをコードする遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することにより取得することもできるし、あるいは、ヒトＦＧＫの産生能力を有する細胞又は組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計した適当なプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）により、取得することもできる。前記のヒトＦＧＫの産生能力を有する細胞又は組織としては、例えば、ヒト腎臓などを挙げることができる。また、前記プライマーセットとしては、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを挙げることができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドの調製において使用することのできる分離及び精製方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順で実施することができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、スクリーニングツール用ポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際には、所望に応じて、スクリーニングツール用ポリペプチドと適当なマーカー配列とをインフレームで融合して発現させることで、前記ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等を容易に行なうことができる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列とスクリーニングツール用ポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。
（２）細胞型腎不全治療薬スクリーニングツール
本発明の細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールには、
１）ヒトＦＧＫを発現している細胞である、腎不全治療薬スクリーニングツール；
２）機能的等価改変体を発現している細胞である、腎不全治療薬スクリーニングツール；及び
３）相同蛋白質を発現している細胞である、腎不全治療薬スクリーニングツールが含まれる。
本発明の細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）は、細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いる際に前記スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることもできるし、または、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株であることもできるが、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞が好ましい。
本発明の細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）を作成するために使用することのできる宿主細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることができる。
前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞を作成するために使用することのできる発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）等を挙げることができる。
より詳細には、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、カチオン性リポソーム試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）などを用いることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞表面にスクリーニングツール用ポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではない。スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドに加え、Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）であるＧ蛋白質を発現していることが好ましい。配列番号１６で表されるアミノ酸配列は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、以下、「Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１６で表されるアミノ酸配列であるＧ蛋白質」を「Ｃ末端Ｇｉ型Ｇ蛋白質」と称する。
前記Ｃ末端Ｇｉ型Ｇ蛋白質としては、例えば、（１）Ｇｉ、又は（２）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質（例えば、Ｇｑ）のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを挙げることができる。以下、ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを、Ｇｑｉと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（すなわち、配列番号１６で表されるアミノ酸配列）を認識して、Ｇｉと結合する。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドは、Ｇｉのみならず、Ｇｑｉとも結合することができる。スクリーニングツール用形質転換細胞において、スクリーニングツール用ポリペプチドとＣ末端Ｇｉ型Ｇ蛋白質とが発現されると、これらのポリペプチドは細胞内で結合することができる。
前記Ｇｑｉにおける「ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチド」は、Ｃ末端アミノ酸配列を含まず、しかも、ホスホリパーゼＣの活性を促進する活性を有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、Ｃ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を欠失したＧｑのＮ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
前記Ｇｑｉにおける「Ｇｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチド」は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、しかも、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有しない限り、特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるＧｉのＣ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
＜インバースアゴニスト検出方法＞
前記スクリーニングツール用ポリペプチド、又はスクリーニングツール用細胞を検出ツールに用いて、試験化合物が本発明のスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）のインバースアゴニストであるか否かを検出することができる。腎不全治療薬の標的となるＣＴＧＦのプロモーターを活性化するスクリーニング用ポリペプチド（例えばＦＧＫ）は、それ自身単独でも腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることができ、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）のインバースアゴニストは腎不全治療薬として有用な物質である。本発明の検出方法において、スクリーニング用ポリペプチド（例えばＦＧＫ）の活性の変化は、スクリーニングに用いる該蛋白質の生理学的な特性に応じた活性の指標を測定することにより行われる。指標とは、たとえばＣａ２＋濃度の変動やｃＡＭＰ量の変動である。具体的には、以下に述べるような検出方法を示すことができる。スクリーニング用ポチペプチドとしては、該受容体を発現させた細胞、該細胞の膜分画、又は該蛋白質精製標品などを用いることもできる。
本発明による、試験化合物がスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）のインバースアゴニストであるか否かを検出する方法には、
１）細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、Ｃａ２＋型検出方法）；
２）細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、ｃＡＭＰ型検出方法）；及び
３）ＧＴＰγＳ結合法を利用するスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出方法と称する）
が含まれる。これらの検出方法について、順次説明する。
１）Ｃａ２＋型検出方法
本発明のＣａ２＋型検出方法は、細胞として、（ｉ）スクリーニングツール用ポリペプチドと、（ｉｉ）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラ（例えば、Ｇｑｉ）とを共発現している細胞（以下、Ｃａ２＋型検出用細胞と称する）を使用する。本発明のＣａ２＋型検出方法においてインバースアゴニストであるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用細胞と試験化合物とを接触させ、前記Ｃａ２＋型検出用細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬（例えば、ｆｕｒａ２又はｆｌｕｏ３等）を用いて、直接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアクチベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできる。
Ｃａ２＋型検出用細胞と試験化合物とを接触させた場合に、Ｃａ２＋型検出用細胞内のＣａ２＋濃度が減少すれば、前記試験化合物は、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであると判定することができる。なお、コントロールとして、スクリーニングツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現しているＣａ２＋型検出用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されておらず、しかも、Ｇｑｉが発現しているコントロール用細胞、あるいは、形質転換前の宿主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記コントロール用細胞又は前記宿主細胞内のＣａ２＋濃度が減少しないことを確認することが好ましい。
より具体的には実施例４又は実施例５の方法を利用することにより実施できる。
これまで説明したように、本発明のＣａ２＋型検出方法においては、共役蛋白質としてＧｉをそのまま使用するのではなく、Ｇｑｉを使用するので、ｃＡＭＰ濃度ではなく、Ｃａ２＋濃度を分析することによりインバースアゴニストであるか否かの検出を実施することができる。通常、ｃＡＭＰ濃度に比べ、Ｃａ２＋濃度の方が、より簡易且つ迅速に測定することができる。
２）ｃＡＭＰ型検出方法
本発明のｃＡＭＰ型検出方法では、スクリーニングツール用細胞をｃＡＭＰ型検出用細胞として使用する。通常の宿主細胞ではＧｉが構成的に発現しているので、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株を用いるか、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ｃＡＭＰ型検出用細胞を得ることができる。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてインバースアゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用細胞と試験化合物とを接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット（アマシャム社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできる。
ｃＡＭＰ型検出用細胞と試験化合物とを接触させた場合に、ｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇すれば、前記試験化合物は、ＦＧＫに対するインバースアゴニストであると判定することができる。また、コントロールとして、スクリーニングツール用ポリペプチドとＧｉとを発現しているｃＡＭＰ型検出用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されていない細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。より具体的には、例えば、実施例４と同様の条件において、低用量の（例えば０．２μｇの）ＦＧＫを発現させた場合において試験化合物を接触させた場合に試験化合物を接触させない場合と比較してｃＡＭＰ濃度が上昇するか否かを検出することにより実施できる。
３）ＧＴＰγＳ結合型検出方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法は、スクリーニングツール用ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、前記ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及び
Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９３）を利用して、ＦＧＫに対するインバースアゴニストであるか否かを検出することができる。スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株を用いるか、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ＧＴＰγＳ結合型検出方法用の細胞又は細胞膜画分（ＧＴＰγＳ型検出用細胞）を得ることができる。
例えば、以下の手順により実施することができる。
すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏｌ／Ｌ）と混合する。試験化合物存在下と試験化合物不在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。試験化合物存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の低下を指標に、ＦＧＫに対するインバースアゴニストであるか否かを検出することができる。また、コントロールとして、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している細胞膜の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現していない細胞膜を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物存在下においてＧＴＰγＳ結合が低下しないことを確認することが好ましい。
＜ＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法＞
本発明にはスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性阻害を指標にしてＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法が包含される。該方法には、ＣＴＧＦ遺伝子のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイ系が使用できる。既に上述したように、ＣＴＧＦが腎線維化においてＴＧＦ−βの下流に位置するサイトカインであることが明らかになり、ＣＴＧＦが腎不全治療薬の創薬標的であることが示されている。本発明者らは後述の実施例３に示すようにＦＧＫが腎不全における創薬標的と考えられるＣＴＧＦのプロモーターを活性化することを見出し、更に、ＦＧＫの活性阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法を確立した。
本発明のＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法は、下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３のＤＮＡ（ＣＴＧＦプロモーター）を発現しているスクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴としてＣＴＧＦの発現を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
該方法で用いる細胞として、（ｉ）スクリーニングツール用ポリペプチドと、（ｉｉ）ＣＴＧＦプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子とを共発現している細胞（以下、ＣＴＧＦプロモーター型検出用細胞と称する）を使用することができる。なお、前記細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、腎臓由来の細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、前出のＨＥＫ２９３細胞を挙げることができる。
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、ＣＴＧＦプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＣＴＧＦの発現調節に対する試験化合物の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。配列番号１６で表される塩基配列からなるＣＴＧＦプロモーター領域と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、配列番号１６で表される塩基配列からなるＣＴＧＦのプロモーター領域と機能的に融合されていればよい。ＣＴＧＦプロモーター型検出用細胞に試験化合物を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験化合物依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。
コントロールとしてＣＴＧＦプロモーター型検出用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されておらず、しかもＣＴＧＦプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子を発現しているスクリーニングツール用細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記スクリーニングツール用細胞におけるレポーター活性が抑制されないことを確認することが好ましい。
上記工程を実施し、レポーター活性を抑制する物質を選択することにより、ＣＴＧＦの発現を抑制する物質のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例３に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。たとえば実施例３に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、実施例３の条件下でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、ＣＴＧＦ発現を抑制する活性を有する物質として選択することができる。より好ましくは実施例７の条件下で同様に実施することができる。
＜腎不全治療薬をスクリーニングする方法＞
本発明の腎不全治療薬スクリーニングツール（ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツール及び細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールの両方を含む）を用いると、腎不全治療薬をスクリーニングすることができる。
既に説明したように、ＣＴＧＦが腎線維化においてＴＧＦ−βの下流に位置するサイトカインであることが明らかになり、ＣＴＧＦが腎不全治療薬の創薬標的であることすなわちＣＴＧＦの発現を制御する物質は腎不全治療薬となることが示されている。また、ＦＧＫは腎臓に局在することが明らかとなっている。更に、本発明者らは実施例３に記載するようにＦＧＫがＣＴＧＦプロモーターを活性すること及びヒトＩ型コラーゲンアルファ２サブユニット（ＣＯＬＩＡ２）プロモーターを活性化することを見出している。これらの知見によれば、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニスト又はＦＧＫ活性阻害によりＣＴＧＦの発現を抑制する物質は腎不全治療薬として有用である。従って、これまで説明したスクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用細胞それ自体を、腎不全治療薬のスクリーニングにスクリーニングツールとして用いることができる。
本発明の腎不全治療薬スクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明の腎不全治療薬スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は検出方法により以下の３つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あるいはこれらを組み合わせることによって、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。以下、本発明のスクリーニング方法、
（１）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法
（２）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性阻害を指標としてＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法
（３）ＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法
について、順次説明する。
（１）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法には、
１）細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、インバースアゴニストをスクリーニングする方法（以下、Ｃａ２＋型スクリーニング方法と称する）；
２）細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、インバースアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び
３）ＧＴＰγＳ結合法を利用するインバースアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法と称する）
が含まれ、以下順次説明する。
１）Ｃａ２＋型スクリーニング方法
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法は、本発明のＣａ２＋型検出方法により、インバースアゴニストであるか否かを検出する工程、及びインバースアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
インバースアゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、試験化合物によるＣａ２＋型検出用細胞内のＣａ２＋濃度の減少を指標に、スクリーニングすることができる。
例えば試験化合物を一定時間作用させ、細胞内Ｃａ２＋濃度の減少を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、インバースアゴニストとして選択することができる。本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法でインバースアゴニストをスクリーニングすることにより、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
２）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法は、本発明のｃＡＭＰ型検出方法により、インバースアゴニストであるか否かを検出する工程、及びインバースアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
インバースアゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、試験化合物によるｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を指標に、スクリーニングすることができる。
細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇を指標に、そのＥＤ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、インバースアゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法でインバースアゴニストをスクリーニングすることにより、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
３）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法は、本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、インバースアゴニストであるか否かを検出する工程、及びインバースアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
インバースアゴニストは、前記ＧＴＰγＳ結合型検出方法における、試験化合物による特異的なＧＴＰγＳ結合の低下を指標にスクリーニングすることができる。
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法でインバースアゴニストをスクリーニングすることにより、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
（２）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）活性阻害を指標としてＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法
ＣＴＧＦの発現を制御する物質は腎不全治療薬となることが示されている。従って、本発明のＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、すなわち、下流にレポーター遺伝子を保持するＣＴＧＦプロモーターを発現しているスクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする方法により腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、実施例３又は実施例７に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。たとえば実施例３又は実施例７に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、実施例３又は実施例７の条件下でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、腎不全治療薬として有用な物質として選択することができる。
（３）ＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法
腎不全治療薬の標的となるＣＴＧＦのプロモーターを活性化するスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）は、それ自身単独でも腎不全治療薬スクリーニングツールとして有用である。本発明者らは後述の実施例３に示すように、ＦＧＫが、ＣＯＬＩＡ２のプロモーターを活性化することを見出し、ＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しＦＧＫ活性変化を指標とするスクリーニング方法を確立した。ＦＧＫの活性阻害をインビトロで検出する系の一つとして以下のＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用したレポーターアッセイ系が利用できる。
本発明のＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法は、下流にレポーター遺伝子を保持するＣＯＬＩＡ２プロモーターを発現しているスクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴する。当該スクリーニング方法は、前述のＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法においてＣＴＧＦプロモーターのかわりにＣＯＬＩＡ２プロモーターを用いることにより実施できる。上記工程を実施し、レポーター活性を抑制する物質を選択することにより、腎不全治療に有用な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、実施例３に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。たとえば実施例３に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、実施例３の条件下でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、腎不全治療薬として有用な物質として選択することができる。
＜腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法＞
本発明には、例えば、本発明のスクリーニング方法で選択することのできる、スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニスト［例えば、ＤＮＡ、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする医薬組成物が包含される。
また、腎不全治療用医薬組成物の品質規格の確認試験において、（１）（ｉ）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現しているスクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）前記細胞内におけるスクリーニンツール用ポリペプチドの活性の変化を分析する工程、あるいは（２）（ｉ）下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３又は１４のＤＮＡを発現しているスクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程からなる分析を行ない、次いで、分析した物質を製剤化することからなる、腎不全治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、腎不全治療用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明の医薬組成物における有効成分としては、スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニストを用いることができ、前記インバースアゴニストは、例えば、本発明のスクリーニング方法により選択することができる。スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニストとしては、例えば、本発明のスクリーニング方法で選択された化合物（後述の実施例５〜７、表１参照）を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法で得られた物質を有効成分とする医薬組成物に限定されず、スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニストを有効成分とする腎不全治療用医薬組成物であれば全て包含される。
なお、腎不全治療効果があることの確認は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる。腎不全治療効果は尿細管間質線維化の抑制、尿蛋白の抑制、血中クレアチニン量などを指標として検出することができる。例えば、尿細管間質線維化の抑制効果の確認は、非特許文献１５又は非特許文献Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００２年、第６１巻、ｐ．１６８４−１６９５記載のＵＵＯモデルマウスもしくはその変法により確認できる。より具体的には以下方法により確認できる。雄性ＩＣＲマウスにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を０．１ｍＬ／１０ｇの液量にて腹腔内投与（ｉ．ｐ．）して麻酔する。左腹部を切開し、左尿管を４−０絹糸にて二箇所で結紮し、その間を切断し、その後切開部を縫合することによりＵＵＯマウスを作製することができる。ＵＵＯマウスをコントロール群と試験化合物投与群とに分け、薬物をそのタイプに応じた方法で投与する。投与後（例えば１日１回の投与でＵＵＯマウス作製の５日後）、ペントバルビタール麻酔下にて採血後、左腎（病態腎）と右腎（対照腎）を摘出し、湿重量を測定する。腎を分割して、一部を病理評価（例えばマッソン・トリクロム染色（間質に蓄積したコラーゲン蛋白が青く染色される））することができる。また、一部からＲＮＡを抽出し、線維化のマーカー遺伝子（例えば、ＣＴＧＦ、コラーゲン又はファイブロネクチンなど）の発現を公知の方法（例えばノザンブロッティング又はＲＴ−ＰＣＲ）にて検出することができる。前記染色において、コントロール群に比較して試験化合物投与群の染色が減少していれば（コラーゲン蛋白量が低下していれば）試験化合物に腎不全治療効果があると判定することができる。また、コントロール群に比較して試験化合物投与群における線維化マーカーの発現量が減少していれば試験化合物に腎不全治療効果があると判定できる。
また、尿蛋白の抑制は、例えば、非特許文献Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第４７巻、ｐ．２４３−２５２記載の５／６腎摘ラットもしくはその変法により確認できる。
上記腎不全治療効果の確認方法のうち最も好ましいのは５／６腎摘ラットを用いる方法である。より具体的には以下の方法により確認できる。９週齢のＷｉｓｔａｒｒａｔをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）にて腹腔内投与（ｉ．ｐ．）して麻酔する。左腹部を切開し、左腎の２／３を摘出し、１週後右腎の全摘を行い、５／６腎摘出腎不全モデルラットを作製することが出来る。５／６腎摘出腎不全モデルラットをコントロール群と試験化合物投与群とに分け、薬物をそのタイプに応じた方法で投与する（例えば５／６腎摘出腎不全モデル作製の２週間後から１日１回の投与）。手術後１週ごとに、血圧の測定および個別代謝ケージを用い採尿実験を経時的に（例えば１週ごとに１０週間）行う。屠殺時に腹部大静脈から採血し、腎摘出を行う。尿サンプルはその量や蛋白濃度などを、血液サンプルはコレステロールや尿素窒素、又はクレアチニンなどの濃度を測定し、腎組織サンプルは病理組織変化などを検討する。コントロール群に比較して、例えば、尿中の蛋白量が低下していれば、もしくは血液中の尿素窒素量やクレアチニン量が低下していれば試験化合物に腎不全治療効果があると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質又はスクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニスト［例えば、ＤＮＡ、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ａｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施可能である。
また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）ＦＧＫをコードする遺伝子の単離
本発明のＦＧＫをコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト腎臓ｃＤＮＡ（クロンテック社）をテンプレートとしてＰＣＲにより取得した。配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いた（それぞれの５’末端にはＸｂａｌ ｓｉｔｅが付加してある）。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、５％ＤＭＳＯ存在下で９８℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。その結果、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＸｂａｌで消化した後、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒプラスミド（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２）を用いてクローニングした。構築したプラスミドをｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＦＧＫと名付けた。得られたクローンの塩基配列をジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析したところ、配列番号１で表される塩基配列が得られた。同配列は９９３塩基のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持っている。ＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３３０アミノ酸）を配列番号２に示す。
（実施例２）ヒト結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）プロモーターを用いたレポータープラスミド及びヒトＩ型コラーゲンアルファ２サブユニット（ＣＯＬＩＡ２）プロモーターを用いたレポータープラスミドの取得
ヒトＣＴＧＦ及びヒトＣＯＬＩＡ２遺伝子のプロモーター領域の増幅には、ヒト全血由来のゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ＤＮＡに用いた。ＣＴＧＦプロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。またＣＯＬＩＡ２プロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ストラタジーン社）を用い、９４℃（２分）の後、９４℃（３０秒）／５８℃（３０秒））／７２℃（２分）のサイクルを３５回繰り返した。その結果、ＣＴＧＦプロモーターの場合は約１．２ｋｂｐ、ＣＯＬＩＡ２プロモーターの場合は約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。その後各増幅産物を１％アガロースゲルにて分離し、スピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；キアゲン社）にて精製後、これらを鋳型として再度ＰＣＲを行った。ＣＴＧＦプロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。またＣＯＬＩＡ２プロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。なおそれぞれのフォワードプライマーの５’末端にはＫｐｎｌ認識配列、またリバースプライマーの５’末端にはＢｇＩＩＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ストラタジーン社）を用い、９４℃（２分）の後、９４℃（３０秒）／５８℃（３０秒））／７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。その後各増幅産物を１％アガロースゲルにて分離し、スピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；キアゲン社）にて精製後、Ｋｐｎｌ及びＢｇＩＩＩにて消化し、レポーター発現用プラスミド（ピッカジーンベーシックベクター２；東洋インキ社）に挿入してクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）で解析し、既知ＣＴＧＦプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ３５４８６６）又はＣＯＬＩＡ２プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ００４８７７）と合致したクローンをそれぞれ選択した。以上により得られたレポータープラスミドはそれぞれヒトＣＴＧＦプロモーターの１１２９ｂｐから＋２４ｂｐ（配列番号１３）、又はヒトＣＯＬＩＡ２プロモーターの−３３７ｂｐから＋２２ｂｐ（配列番号１４）をルシフェラーゼ遺伝子の上流に含んでおり、それぞれｐＣＴＧＦ−ｌｕｃ，ｐＣＯＬＩＡ２−ｌｕｃと命名した。
（実施例３）ＣＴＧＦプロモーター及びＣＯＬＩＡ２プロモーターレポーターアッセイ系の構築とＦＧＫ導入による効果
２４ウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０５細胞で播種して３７℃で２４時間培養後、１ウェルあたり０．１μｇのレポータープラスミド及び最高で０．５μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミドの計０．６μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて添付の指示書に従い遺伝子導入を行った。なお全てのウェル当たりの導入遺伝子量は１ウェルあたり計０．６μｇとなる様にプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１；インビトロジェン社）を加えて調整した。ＦＧＫを含まずｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをレポータープラスミドと共に形質転換した細胞をコントロールとした。遺伝子導入２４時間後に培地を廃棄し、細胞溶解液を１ウェルあたり１００μｌ加えて溶解した。溶解液５０μｌにルシフェリン基質液１００μｌを加えて反応させた後、ルミノメーター（ＭＬ３０００；ダイナテックラボラトリーズ社）にて測定した。コントロールのルシフェラーゼ活性に対する相対活性（コントロールを１とする）を図１に示す。ＦＧＫの発現によりＣＴＧＦプロモーター及びＣＯＬＩＡ２プロモーターの活性化が観察された。またその活性化におけるＦＧＫの用量依存性も観察された。以上の事から、ＦＧＫはＣＴＧＦ及びＩ型コラーゲンの発現を誘導することが明らかになった。
本アッセイ系を利用することにより、ＣＴＧＦ発現を抑制する物質及び腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
（実施例４）ＦＧＫ活性変化を指標とするスクリーニング系の構築
本実施例で使用したＧｑとＧｉとのキメラ蛋白質を発現するための発現プラスミドは、Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｂ．Ｒ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２７６，１９９３）に従い、ＧｑのＣ末端側の５アミノ酸（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；配列番号１５で表されるアミノ酸配列）を、ＧｉのＣ末端側の５アミノ酸（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；配列番号１６で表されるアミノ酸配列）と置換して構築した遺伝子（以下、Ｇｑｉ遺伝子と称する）を、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒにクローニングして作製した。構築したプラスミドは、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと命名した。
具体的な方法としては、まず２４ウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０５細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり０．０５μｇのルシフェラーゼ遺伝子の上流に血清応答配列を挿入したレポータープラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔＴＭ ＳＲＥ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ストラタジーン社）、０．０５μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ及び最高で０．５μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミド計０．６μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて遺伝子導入を行った。ＦＧＫを含まずｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをレポータープラスミド及びｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと共に形質転換した細胞をコントロールとした。他の条件及びレポーター活性の測定は実地例３に従った。コントロールのルシフェラーゼ活性に対する相対活性（コントロールを１とする）を図２に示す。ＦＧＫの発現によりレポーター活性の上昇が観察された。またその活性化におけるＦＧＫの用量依存も観察された。以上の事から、本アッセイ系によってＦＧＫ活性を阻害する物質、すなわち腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることが可能となった。
（実施例５）ＦＧＫ活性を阻害する物質のスクリーニング
実施例４において構築したＦＧＫ活性変化を指標とするスクリーニング系を用いて試験物質のスクリーニングを行った。
９６ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０４細胞で播種して３７℃にて２４時間培養した。１ウェルあたり０．０１μｇのレポータープラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（実施例４）、０．０３μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ及び０．０２μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミド計０．０６μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて遺伝子導入を行った。導入後３７℃にて６時間培養した後、試験化合物のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度が３０μＭ，１０μＭ，３μＭ，１μＭ，０．３μＭ又は０．１μＭとなるように添加し、更に３７℃にて２４時間培養した。その後レポーター活性を測定し、試験化合物による５０％活性抑制濃度（ＩＣ５０）を決定した。化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合のレポーター活性を１００％とした。他の条件及びレポーター活性の測定は実地例４に従った。ＦＧＫを発現させた細胞においてＦＧＫ活性を阻害する物質（ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質）をＦＧＫのインバースアゴニストとして選択したところ７個の異なる化合物を取得することができた。これらの化合物の構造、活性及び入手先を表１に示す。
（実施例６）ＦＧＫ活性を阻害する物質によるＣＴＧＦ発現抑制の検出
１２ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にヒト近位尿細管上皮初代培養細胞（ＲＰＴＥＣ；アサヒテクノグラス社）を腎上皮細胞用増殖培地（ブレットキットＲＥＧＭ；アサヒテクノグラス社）にて１ウェルあたり２×１０５細胞で播種した。３７℃にて２４時間培養後、実施例５にて得た試験化合物（ＦＧＫ活性を阻害する物質、すなわちＦＧＫインバースアゴニスト）を最終濃度が１０μＭとなる様に培地に添加し、更に３７℃にて２４時間培養した。その後細胞を回収し、トータルＲＮＡをスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；キアゲン社）にて精製した。１．５μｇのトータルＲＮＡ及び逆転写酵素（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｒｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。それらを鋳型として、ＰＲＩＳＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法により、ＣＴＧＦ及びハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下Ｇ３ＰＤＨと略す）の発現量を測定した。ＰＣＲ反応にはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、５０°Ｃ（２分）、９５°Ｃ（１０分）の後、９５°Ｃ（１５秒）／６０°Ｃ（６０秒）のサイクルを４０回繰り返した。ＣＴＧＦの検出には配列番号１７で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号１８で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、またＧ３ＰＤＨの検出には配列番号１９で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号２０で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用した。ＰＣＲにより得られたＣＴＧＦの発現量をＧ３ＰＤＨの発現量で割った値を単位ＲＮＡ量あたりのＣＴＧＦ発現量と定義した。また化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合の単位ＲＮＡ量あたりのＣＴＧＦ発現量を１００％とした。このアッセイにより得られたＣＴＧＦ発現阻害活性（化合物濃度１０μＭにおける阻害活性）を表１に示す。ＦＧＫ活性阻害を指標に取得した物質が確かにＣＴＧＦ発現を抑制することが確認できた。
（実施例７）ＦＧＫによるＣＴＧＦプロモーター活性化を抑制する化合物のスクリーニング
実施例３において構築した、ＦＧＫによるＣＴＧＦプロモーター活性化の系により試験化合物をスクリーニングした。
９６ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０４細胞で播種した。３７℃にて２４時間培養後、１ウェルあたり０．０２μｇのｐＣＴＧＦ−ｌｕｃ（実施例２参照）及び０．０２μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミド計０．０４μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて遺伝子導入を行った。導入後３７℃にて６時間培養した後、試験化合物のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度が３０μＭ，１０μＭ，３μＭ，１μＭ，０．３μＭ又は０．１μＭとなるように添加し、更に３７℃にて２４時間培養した。その後レポーター活性を測定し、試験化合物による５０％活性抑制濃度（ＩＣ５０）を決定した。化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合のレポーター活性を１００％とした。他の条件及びレポーター活性の測定は実地例３に従った。ＦＧＫによるＣＴＧＦプロモーター活性化を阻害する物質を選択し、ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を表１に示した。本アッセイ系によってＣＴＧＦ発現を抑制する物質すなわち腎不全治療薬として有用な物質を確かにスクリーニングすることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
本発明のスクリーニングツールの一つであるＦＧＫがＣＴＧＦのプロモーターを活性化することを見出した。ＣＴＧＦは腎不全における創薬標的であることが知られており、従って、本発明のスクリーニングツールであるポリペプチドおよび／または前記ポリペプチドを発現している細胞を用いることによって、前記ポリペプチドの阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、すなわち前記ポリペプチドの阻害剤を選択することによるＣＴＧＦ発現抑制に基づく腎不全治療薬のスクリーニング方法及び前記ポリペプチドのインバースアゴニストを選択することによる腎不全治療薬をスクリーニングする方法を構築することができる。
また、本発明のスクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、腎不全治療用医薬組成物を製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３、４、９〜１２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、オーファンＧＰＣＲを発現している細胞及び該細胞を使用する腎不全治療薬のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
腎疾患による慢性透析患者は年々増加している。これは医療経済的にも大きな問題であり、その進行の改善が強く望まれている。腎障害の原因は慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症など多岐に渡り、成因も免疫学的機序、高血圧等様々である。しかし原因に拠らず、ある段階から糸球体障害には共通の進展機序が考えられている。それはＢｒｅｎｎｅｒらによって提唱された過剰濾過（ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）説に基づく考え方である（非特許文献１）。以下に過剰濾過説を概説すると、まず糸球体障害による機能ネフロン減少、高血圧、高血糖、蛋白過剰摂取等により腎臓内の血行動態が変化して糸球体内圧の上昇が起こり、いわゆる糸球体内高血圧と呼ばれる状態になる。そしてこれが糸球体細胞障害を惹起する。その結果メサンギウム細胞の形質変換、細胞外基質の産生亢進を促し、更には糸球体硬化へと進展する。これにより機能ネフロンが減少すると残存する機能ネフロンの糸球体内圧は更に上昇する。当初は糸球体が代償的に肥大し、機能喪失したネフロンを補うが、最終的には物理的破綻をきたす。この悪循環によって糸球体硬化が加速度的に進行し、末期腎不全に陥る。この糸球体硬化及び尿細管間質における細胞外基質の産生亢進は総じて腎線維化（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）と呼ばれており、原疾患を問わず腎不全進行と一致する組織学的変化である（非特許文献２）。よって個々の原疾患に対する治療の重要性は言うまでもないが、共通の進行機序である線維化の抑制は有力な治療アプローチであると考えられる。
線維化には様々なサイトカインや成長因子の関与が知られているが、中でもＴＧＦ−βはファイブロネクチンやＩ型コラーゲンなどの細胞外基質構成蛋白質の産生を誘導すること（非特許文献３）、細胞外基質分解酵素の発現／機能を抑制すること（非特許文献４）等から最も重要な進展因子と考えられている。更にＴＧＦ−β中和抗体（非特許文献５）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（非特許文献６）、デコリン（非特許文献７），ＴＧＦ−βレセプター中和抗体（非特許文献８）を用いたＴＧＦ−βの発現／機能抑制が腎臓の細胞外基質の増加を抑制することが腎炎モデル動物で示されており、その有効性がすでに明らかになっている。この様にＴＧＦ−βシグナル阻害は腎線維化抑制を機序とする腎不全治療につながることが示されている。しかしＴＧＦ−βは線維化促進作用の他にも抗炎症作用や腫瘍増殖抑制作用を持つ重要なサイトカインであり、ＴＧＦ−βノックアウトマウスは自己免疫疾患で死亡する（非特許文献９）ことなどから、線維化抑制のためにはＴＧＦ−βを直接阻害するのではなく、ＴＧＦ−βの下流でその線維化促進作用を仲介する因子を阻害することがより望ましいと考えられた（非特許文献１０）。
近年ＴＧＦ−βにより発現が誘導される新しいサイトカインの結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）が発見され（非特許文献１１）、ＣＴＧＦ発現により細胞外基質の産生が誘導されること（非特許文献１２）、ＣＴＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドや抗ＣＴＧＦ抗体によりＴＧＦ−β誘導のコラーゲン発現が抑制されること（非特許文献１３）、ヒト腎線維化病理組織像においてＣＴＧＦの発現が上昇していること（非特許文献１４）、ラット病態モデル腎臓においてＣＴＧＦ発現がＴＧＦ−βと共に上昇すること（非特許文献１５）、更に肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）がＣＴＧＦ産生抑制を介してマウス病態モデル腎臓の線維化を抑制すること（非特許文献１６）などが報告されている。これらを総合すると、腎組織においてＴＧＦ−βがＣＴＧＦの発現を誘導し、更にＣＴＧＦがＴＧＦ−βと共に細胞外基質の産生を亢進させて線維化を促進させる機序が明らかになった（非特許文献１７）。すなわちＣＴＧＦが腎線維化においてＴＧＦ−βの下流に位置するサイトカインであることが明らかになり、新たな治療標的となることが示された（非特許文献１８）。またＴＧＦ−βやＣＴＧＦによって発現が誘導されるＩ型コラーゲンはヒト正常腎では発現が低く、病態腎の糸球体や尿細管上皮において発現が上昇していること（非特許文献１９）、培養マウスメサンギウム細胞での高糖負荷による内在性ＴＧＦ−β発現誘導によりＩ型コラーゲンの発現が上昇すること（非特許文献２０）など、病態との関与が指摘されている。一方、ＣＴＧＦは脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、骨格筋など幅広い組織で発現しており、発現に組織特異性は見られない（非特許文献２２）。
ＦＧＫ（Ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ ＧＰＣＲ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ）は２００１年に報告されたＧＰＲ９１と同一のオーファンＧＰＣＲである（非特許文献２１）。ヒトＧＰＲ９１、マウスＧＰＲ９１はそれぞれアミノ酸３３０個、３１７個から成るポリペプチドであり、膜貫通領域を７箇所持つ７回膜貫通型レセプターと考えられている。ヒト、マウスＧＰＲ９１は互いに約６８％の相同性を有している。ヒトＧＰＲ９１は腎臓にのみ発現が認められ、マウスＧＰＲ９１は腎臓のほかに肝臓にも若干の発現が見られる。アフリカツメガエル卵黄を用いた反応系において、ＵＴＰがヒトＧＰＲ９１のリガンドとして機能することが報告されている（特許文献１）が、ＧＰＲ９１に共役するＧタンパク質や生理機能は不明である。特許文献２〜９にはＦＧＫと相同性を有する配列が開示されているが、アデノシン受容体であること（特許文献９）、Ｐ２Ｕ２プリン受容体であること（特許文献８）の他には発現に関する情報が記載されているにすぎず、その生理機能は不明であった。
【特許文献１】 国際公開第９７／２００４５号パンフレット
【特許文献２】 国際公開第９７／２４９２９号パンフレット
【特許文献３】 国際公開第０１／９８３５１号パンフレット
【特許文献４】 国際公開第００／２２１３１号パンフレット
【特許文献５】 国際公開第０１／９０３０４号パンフレット
【特許文献６】 国際公開第００／３１２５８号パンフレット
【特許文献７】 国際公開第０２／００７１９号パンフレット
【特許文献８】 国際公開第０２／６１０８７号パンフレット
【特許文献９】 ＵＳ０２／１３７８８７号
【非特許文献１】 「ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、（米国）、１９８２年、第３０７巻、ｐ．６５２−６５９
【非特許文献２】 「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９６年、第７巻、ｐ．２４９５−２５０８
【非特許文献３】 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９８７年、第２６２巻、ｐ．６４４３−６４４６
【非特許文献４】 「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．７９０−７９５
【非特許文献５】 「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、１９９０年、第３４６巻、ｐ．３７１−３７４
【非特許文献６】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、１９９６年、第５０巻、ｐ．１４８−１５５
【非特許文献７】 「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、１９９２年、第３６０巻、ｐ．３６１−３６４
【非特許文献８】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、２００１年、第６０巻、ｐ．１７４５−１７５５
【非特許文献９】 「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、１９９２年、第３５９巻、ｐ．６９３−６９９
【非特許文献１０】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、１９９７年、第５１巻、ｐ．１３８８−１３９６
【非特許文献１１】 「モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」、（米国）、１９９３年、第４巻、ｐ．６３７−６４５
【非特許文献１２】 「ザ・ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９６年、第１０７巻、ｐ．４０４−４１１
【非特許文献１３】 「ジ・エフエーエスイービー・ジャーナル（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、（米国）、１９９９年、第１３巻、ｐ．１７７４−１７８６
【非特許文献１４】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、１９９８年、第５３巻、ｐ．８５３−８６１
【非特許文献１５】 「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・レナル・フィジオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ・ＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００２年、第２８２巻、ｐ．Ｆ９３３−Ｆ９４２
【非特許文献１６】 「ジ・エフエーエスイービー・ジャーナル（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、（米国）、２００３年、第１７巻、ｐ．２６８−２７０
【非特許文献１７】 「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイアティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００１年、第１２巻、ｐ．４７２−４８４
【非特許文献１８】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、２０００年、第５８巻、ｐ．１３８９−１３９９
【非特許文献１９】 「キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（米国）、２００２年、第６２巻、ｐ．１３７−１４６
【非特許文献２０】 「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、（米国）、１９９４年、第９３巻、ｐ．５３６−５４２
【非特許文献２１】 「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（英国）、２００１年、第３０７巻、ｐ．７９９−８１３
【非特許文献２２】 「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」、（米国）、１９９７年、第９５巻、ｐ．８３１−８３９
【発明の開示】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、オーファンＧＰＣＲであるＦＧＫは腎臓特異的に発現しており、腎不全における創薬標的であるＣＴＧＦのプロモーターを活性化することを見出した。この知見をもとにして、ＦＧＫ阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、すなわちＦＧＫ阻害剤を選択することによるＣＴＧＦ発現抑制に基づく腎不全治療薬のスクリーニング方法を構築した。更に、ＦＧＫそれ自身単独でもその活性の変化を指標にして腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることができることを見出し、確かにＦＧＫのインバースアゴニストがＣＴＧＦ発現を抑制することを見出した。このことからＦＧＫインバースアゴニストを選択することによる腎不全治療薬をスクリーニングする方法を確立した。上述したようにＣＴＧＦは幅広い組織で発現しており、発現に組織特異性は見られないことから単にＣＴＧＦ遺伝子のプロモーター領域を用いてスクリーニングした場合、その結果物は腎臓のみならず全組織でＣＴＧＦの産生を抑制することになり、ＣＴＧＦの作用である細胞増殖や細胞外基質産生の阻害に基づく副作用が懸念される。一方、ＦＧＫがＣＴＧＦプロモーターを活性化するという本発明者らが見出した知見を元にして構築したＦＧＫ阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする系を用いた場合、ＦＧＫは腎臓特異的に発現することから、そのスクリーニング結果物によるＣＴＧＦ産生抑制は腎臓特異的であり、その他の組織での発現抑制は起こらないことが期待される。
これらの結果、本発明者らは、簡便な腎不全治療薬のスクリーニング方法、並びに腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法を提供し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチドである腎不全治療薬スクリーニングツール、
［２］［１］に記載のポリペプチドを発現している細胞である腎不全治療薬スクリーニングツール、
［３］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している［２］に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記細胞内における［１］記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物がインバースアゴニストであるか否かを検出する方法、
［４］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している［２］に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞内における［１］記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療薬をスクリーニングする方法、
［５］下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３のＤＮＡを発現している［２］に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とするＣＴＧＦの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法
［６］ＣＴＧＦの発現を抑制する物質が腎不全治療薬である［５］に記載のスクリーニングする方法、
［７］下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１４のＤＮＡを発現している請求項２に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする腎不全治療薬をスクリーニングする方法、
［８］［１］に記載のポリペプチドのインバースアゴニストを含有する腎不全治療用医薬組成物、
［９］［４］乃至［７］に記載の方法によって得られる物質を含有する腎不全治療用医薬組成物、
［１０］［４］乃至［７］に記載の方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療用医薬組成物の製造方法、
［１１］［１］に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は［４］乃至［７］に記載の方法によって得られる物質を腎不全治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、腎不全治療方法、
［１２］［１］に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は［４］乃至［７］に記載の方法によって得られる物質の、腎不全治療用医薬組成物を製造するための使用
に関する。
特許文献１には本発明のスクリーニングツールであるポリペプチドの一つであるＦＧＫと同一配列の受容体が記載されている。腎臓に発現していること、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、及びＵＤＰによって活性化されることが記載され、スクリーニングのツールとして有用であるとされているが、何の目的のスクリーニングのツールとして有用であるか、その具体的な用途に関する記載はない。特許文献２〜特許文献９にはＦＧＫと相同性のある分子が開示されている。特許文献６には当該分子が腎臓において発現していると示されているが具体的用途に関する記載はない。特許文献７には当該分子が関わるとして多数の疾患名を列挙している中に腎疾患及び腎不全が含まれているが、それを裏付ける記載は全くない。特許文献８にはＦＧＫと相同性の高い分子を含む多数のＧＰＣＲが開示され、多数のＧＰＣＲに対しそれらが関与するとして多数の疾患名を挙げておりその中に腎疾患が含まれるが具体的実施例の記載はおろか、それらの用途の実験的裏付けは全くない。特許文献９にはＦＧＫと相同性を有する受容体が開示されアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法が開示されている。これらのアゴニスト及びアンタゴニストは血管拡張、低血圧、慢性腎疾患、甲状腺疾患、喘息を含む免疫性疾患の治療に有用であることが記載されている。しかしながら慢性腎疾患の治療に有用であることの根拠は当該分子が腎臓を含む特定の組織に発現していることのみであり、当該分子とＣＴＧＦとの関連については何ら記載されていない。特許文献２〜５の何れの文献にもＦＧＫと相同性を有する分子と腎疾患との関係、該分子とＣＴＧＦとの関係は記載されていない。
従って、腎不全における創薬標的であるＣＴＧＦのプロモーターをＦＧＫが活性化することは本発明者らが見出した新規の知見であり、ＦＧＫ阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、及びＦＧＫインバースアゴニストを選択することによる腎不全治療薬をスクリーニングする方法、並びに腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法は本発明者らによって初めて提供された発明である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＥＫ２９３細胞にｐＣＴＧＦ−ｌｕｃ又はｐＣＯＬＩＡ２−ｌｕｃレポータープラスミドを導入したときのルシフェラーゼ活性及びその活性のＦＧＫ遺伝子導入による変化を示すグラフである。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性の相対値を示している。
図２は、ＨＥＫ２９３細胞にｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ及びｐＳＲＥ−ｌｕｃレポータープラスミドを同時に導入したときのルシフェラーゼ活性及びその活性のＦＧＫ遺伝子導入による変化を示すグラフである。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性の相対値を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「ＦＧＫ」は「ＦＧＫ蛋白質」を、「インバースアゴニスト」は本発明のスクリーニング用ポリペプチド（例えばＦＧＫ）の自発活性（すなわちＦＧＫリガンド又はアゴニスト非存在下において、ある平衡状態で存在する活性化ＦＧＫにより検出される活性）を抑制する物質を表す。あるポリペプチドが「ＣＴＧＦプロモーターを活性化する」か否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば実施例３に記載の条件下で用量依存的な該ポリペプチドによる転写活性化を示すか否かを確認することにより、判定することができる。「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達増幅因子として機能するＧ蛋白のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧ蛋白質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。「ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達増幅因子として機能するＧ蛋白質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧ蛋白質である。ホスホリパーゼＣの活性化が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質としては、例えば、Ｇｑを挙げることができる。
＜腎不全治療薬スクリーニングツール＞
本発明の腎不全治療薬スクリーニングツールには、ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールと、細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとが含まれる。本明細書において「スクリーニングツール」とは、スクリーニングのために用いる物（具体的にはスクリーニングのために用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）をいう。「腎不全治療薬スクリーニングツール」とは、腎不全治療薬をスクリーニングするために、本発明の腎不全治療薬をスクリーニングする方法において試験化合物を接触させる対象となるポリペプチド又は細胞である。前述の［１］に記載のポリペプチド、又は［２］に記載の細胞の、腎不全治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
（１）ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールには、
１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである腎不全治療薬スクリーニングツール；
２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）である腎不全治療薬スクリーニングツール；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）である腎不全治療薬スクリーニングツール；
が含まれる。
ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールのうち、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来のオーファンＧＰＣＲの一つであり、当該ポリペプチドをヒトＦＧＫと称する。
ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価改変体としては、、「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチド」が好ましい。
相同ポリペプチドのうち好ましいものは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、更に好ましくはＣＴＧＦプロモーターを活性化することができる蛋白質である。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍ（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、第７３巻、第２３７−２４４頁、１９９８年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第２２巻、第４６７３−４６８０頁、１９９４年）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ ｔｕｐｌｅ １
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ ３
Ｗｉｎｄｏｗ ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ Ｓａｖｅｄ ５
本発明のポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる各種ポリペプチド、すなわち、ヒトＦＧＫ、機能的等価改変体、及び相同蛋白質を、以下、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドには、ヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＦＧＫ又はその変異体が含まれる。更には、それらの天然蛋白質（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生物由来のＦＧＫ若しくはその変異体）又はヒトＦＧＫを元にして遺伝子工学的に人為的に改変した蛋白質などが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一蛋白質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同蛋白質にみられる差異を意味する。
ヒトＦＧＫのヒトにおける変異体、又はヒト以外の生物由来のＦＧＫ若しくはその変異体は、当業者であれば、ヒトＦＧＫ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
例えば、ヒトＦＧＫ遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、蛋白質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現した蛋白質が、例えば、実施例３に記載の方法により、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することを確認することにより、所望の蛋白質を取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変した蛋白質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、蛋白質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現した蛋白質が、例えば、実施例３に記載の方法により、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することを確認することにより、所望の蛋白質を取得することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的蛋白質をコードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する細胞又は形質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体蛋白質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的蛋白質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトＦＧＫを調製する場合には、それをコードする遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することにより取得することもできるし、あるいは、ヒトＦＧＫの産生能力を有する細胞又は組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計した適当なプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）により、取得することもできる。前記のヒトＦＧＫの産生能力を有する細胞又は組織としては、例えば、ヒト腎臓などを挙げることができる。また、前記プライマーセットとしては、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを挙げることができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドの調製において使用することのできる分離及び精製方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順で実施することができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、スクリーニングツール用ポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際には、所望に応じて、スクリーニングツール用ポリペプチドと適当なマーカー配列とをインフレームで融合して発現させることで、前記ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等を容易に行なうことができる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列とスクリーニングツール用ポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。
（２）細胞型腎不全治療薬スクリーニングツール
本発明の細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールには、
１）ヒトＦＧＫを発現している細胞である、腎不全治療薬スクリーニングツール；
２）機能的等価改変体を発現している細胞である、腎不全治療薬スクリーニングツール；及び
３）相同蛋白質を発現している細胞である、腎不全治療薬スクリーニングツールが含まれる。
本発明の細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）は、細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いる際に前記スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることもできるし、または、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株であることもできるが、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞が好ましい。
本発明の細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）を作成するために使用することのできる宿主細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることができる。
前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞を作成するために使用することのできる発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）等を挙げることができる。
より詳細には、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、カチオン性リポソーム試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）などを用いることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞表面にスクリーニングツール用ポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではない。スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドに加え、Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）であるＧ蛋白質を発現していることが好ましい。配列番号１６で表されるアミノ酸配列は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、以下、「Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１６で表されるアミノ酸配列であるＧ蛋白質」を「Ｃ末端Ｇｉ型Ｇ蛋白質」と称する。
前記Ｃ末端Ｇｉ型Ｇ蛋白質としては、例えば、（１）Ｇｉ、又は（２）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質（例えば、Ｇｑ）のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを挙げることができる。以下、ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを、Ｇｑｉと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（すなわち、配列番号１６で表されるアミノ酸配列）を認識して、Ｇｉと結合する。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドは、Ｇｉのみならず、Ｇｑｉとも結合することができる。スクリーニングツール用形質転換細胞において、スクリーニングツール用ポリペプチドとＣ末端Ｇｉ型Ｇ蛋白質とが発現されると、これらのポリペプチドは細胞内で結合することができる。
前記Ｇｑｉにおける「ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチド」は、Ｃ末端アミノ酸配列を含まず、しかも、ホスホリパーゼＣの活性を促進する活性を有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、Ｃ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を欠失したＧｑのＮ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
前記Ｇｑｉにおける「Ｇｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチド」は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、しかも、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有しない限り、特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるＧｉのＣ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
＜インバースアゴニスト検出方法＞
前記スクリーニングツール用ポリペプチド、又はスクリーニングツール用細胞を検出ツールに用いて、試験化合物が本発明のスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）のインバースアゴニストであるか否かを検出することができる。腎不全治療薬の標的となるＣＴＧＦのプロモーターを活性化するスクリーニング用ポリペプチド（例えばＦＧＫ）は、それ自身単独でも腎不全治療薬スクリーニングツールとして用いることができ、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）のインバースアゴニストは腎不全治療薬として有用な物質である。本発明の検出方法において、スクリーニング用ポリペプチド（例えばＦＧＫ）の活性の変化は、スクリーニングに用いる該蛋白質の生理学的な特性に応じた活性の指標を測定することにより行われる。指標とは、たとえばＣａ２＋濃度の変動やｃＡＭＰ量の変動である。具体的には、以下に述べるような検出方法を示すことができる。スクリーニング用ポチペプチドとしては、該受容体を発現させた細胞、該細胞の膜分画、又は該蛋白質精製標品などを用いることもできる。
本発明による、試験化合物がスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）のインバースアゴニストであるか否かを検出する方法には、
１）細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、Ｃａ２＋型検出方法）；
２）細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、ｃＡＭＰ型検出方法）；及び
３）ＧＴＰγＳ結合法を利用するスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出方法と称する）
が含まれる。これらの検出方法について、順次説明する。
１）Ｃａ２＋型検出方法
本発明のＣａ２＋型検出方法は、細胞として、（ｉ）スクリーニングツール用ポリペプチドと、（ｉｉ）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラ（例えば、Ｇｑｉ）とを共発現している細胞（以下、Ｃａ２＋型検出用細胞と称する）を使用する。本発明のＣａ２＋型検出方法においてインバースアゴニストであるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用細胞と試験化合物とを接触させ、前記Ｃａ２＋型検出用細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬（例えば、ｆｕｒａ２又はｆｌｕｏ３等）を用いて、直接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアクチベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできる。
Ｃａ２＋型検出用細胞と試験化合物とを接触させた場合に、Ｃａ２＋型検出用細胞内のＣａ２＋濃度が減少すれば、前記試験化合物は、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニストであると判定することができる。なお、コントロールとして、スクリーニングツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現しているＣａ２＋型検出用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されておらず、しかも、Ｇｑｉが発現しているコントロール用細胞、あるいは、形質転換前の宿主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記コントロール用細胞又は前記宿主細胞内のＣａ２＋濃度が減少しないことを確認することが好ましい。
より具体的には実施例４又は実施例５の方法を利用することにより実施できる。
これまで説明したように、本発明のＣａ２＋型検出方法においては、共役蛋白質としてＧｉをそのまま使用するのではなく、Ｇｑｉを使用するので、ｃＡＭＰ濃度ではなく、Ｃａ２＋濃度を分析することによりインバースアゴニストであるか否かの検出を実施することができる。通常、ｃＡＭＰ濃度に比べ、Ｃａ２＋濃度の方が、より簡易且つ迅速に測定することができる。
２）ｃＡＭＰ型検出方法
本発明のｃＡＭＰ型検出方法では、スクリーニングツール用細胞をｃＡＭＰ型検出用細胞として使用する。通常の宿主細胞ではＧｉが構成的に発現しているので、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株を用いるか、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ｃＡＭＰ型検出用細胞を得ることができる。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてインバースアゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用細胞と試験化合物とを接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット（アマシャム社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできる。
ｃＡＭＰ型検出用細胞と試験化合物とを接触させた場合に、ｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇すれば、前記試験化合物は、ＦＧＫに対するインバースアゴニストであると判定することができる。また、コントロールとして、スクリーニングツール用ポリペプチドとＧｉとを発現しているｃＡＭＰ型検出用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されていない細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。より具体的には、例えば、実施例４と同様の条件において、低用量の（例えば０．２μｇの）ＦＧＫを発現させた場合において試験化合物を接触させた場合に試験化合物を接触させない場合と比較してｃＡＭＰ濃度が上昇するか否かを検出することにより実施できる。
３）ＧＴＰγＳ結合型検出方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法は、スクリーニングツール用ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、前記ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及び
Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９３）を利用して、ＦＧＫに対するインバースアゴニストであるか否かを検出することができる。スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株を用いるか、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ＧＴＰγＳ結合型検出方法用の細胞又は細胞膜画分（ＧＴＰγＳ型検出用細胞）を得ることができる。
例えば、以下の手順により実施することができる。
すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏｌ／Ｌ）と混合する。試験化合物存在下と試験化合物不在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。試験化合物存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の低下を指標に、ＦＧＫに対するインバースアゴニストであるか否かを検出することができる。また、コントロールとして、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している細胞膜の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現していない細胞膜を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物存在下においてＧＴＰγＳ結合が低下しないことを確認することが好ましい。
＜ＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法＞
本発明にはスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性阻害を指標にしてＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法が包含される。該方法には、ＣＴＧＦ遺伝子のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイ系が使用できる。既に上述したように、ＣＴＧＦが腎線維化においてＴＧＦ−βの下流に位置するサイトカインであることが明らかになり、ＣＴＧＦが腎不全治療薬の創薬標的であることが示されている。本発明者らは後述の実施例３に示すようにＦＧＫが腎不全における創薬標的と考えられるＣＴＧＦのプロモーターを活性化することを見出し、更に、ＦＧＫの活性阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法を確立した。
本発明のＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法は、下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３のＤＮＡ（ＣＴＧＦプロモーター）を発現しているスクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴としてＣＴＧＦの発現を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
該方法で用いる細胞として、（ｉ）スクリーニングツール用ポリペプチドと、（ｉｉ）ＣＴＧＦプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子とを共発現している細胞（以下、ＣＴＧＦプロモーター型検出用細胞と称する）を使用することができる。なお、前記細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、腎臓由来の細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、前出のＨＥＫ２９３細胞を挙げることができる。
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、ＣＴＧＦプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＣＴＧＦの発現調節に対する試験化合物の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。配列番号１６で表される塩基配列からなるＣＴＧＦプロモーター領域と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、配列番号１６で表される塩基配列からなるＣＴＧＦのプロモーター領域と機能的に融合されていればよい。ＣＴＧＦプロモーター型検出用細胞に試験化合物を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験化合物依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。
コントロールとしてＣＴＧＦプロモーター型検出用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されておらず、しかもＣＴＧＦプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子を発現しているスクリーニングツール用細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記スクリーニングツール用細胞におけるレポーター活性が抑制されないことを確認することが好ましい。
上記工程を実施し、レポーター活性を抑制する物質を選択することにより、ＣＴＧＦの発現を抑制する物質のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例３に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。たとえば実施例３に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、実施例３の条件下でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、ＣＴＧＦ発現を抑制する活性を有する物質として選択することができる。より好ましくは実施例７の条件下で同様に実施することができる。
＜腎不全治療薬をスクリーニングする方法＞
本発明の腎不全治療薬スクリーニングツール（ポリペプチド型腎不全治療薬スクリーニングツール及び細胞型腎不全治療薬スクリーニングツールの両方を含む）を用いると、腎不全治療薬をスクリーニングすることができる。
既に説明したように、ＣＴＧＦが腎線維化においてＴＧＦ−βの下流に位置するサイトカインであることが明らかになり、ＣＴＧＦが腎不全治療薬の創薬標的であることすなわちＣＴＧＦの発現を制御する物質は腎不全治療薬となることが示されている。また、ＦＧＫは腎臓に局在することが明らかとなっている。更に、本発明者らは実施例３に記載するようにＦＧＫがＣＴＧＦプロモーターを活性すること及びヒトＩ型コラーゲンアルファ２サブユニット（ＣＯＬＩＡ２）プロモーターを活性化することを見出している。これらの知見によれば、スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）に対するインバースアゴニスト又はＦＧＫ活性阻害によりＣＴＧＦの発現を抑制する物質は腎不全治療薬として有用である。従って、これまで説明したスクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用細胞それ自体を、腎不全治療薬のスクリーニングにスクリーニングツールとして用いることができる。
本発明の腎不全治療薬スクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明の腎不全治療薬スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は検出方法により以下の３つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あるいはこれらを組み合わせることによって、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。以下、本発明のスクリーニング方法、
（１）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法
（２）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性阻害を指標としてＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法
（３）ＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法
について、順次説明する。
（１）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法には、
１）細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、インバースアゴニストをスクリーニングする方法（以下、Ｃａ２＋型スクリーニング方法と称する）；
２）細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、インバースアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び
３）ＧＴＰγＳ結合法を利用するインバースアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法と称する）
が含まれ、以下順次説明する。
１）Ｃａ２＋型スクリーニング方法
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法は、本発明のＣａ２＋型検出方法により、インバースアゴニストであるか否かを検出する工程、及びインバースアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
インバースアゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、試験化合物によるＣａ２＋型検出用細胞内のＣａ２＋濃度の減少を指標に、スクリーニングすることができる。
例えば試験化合物を一定時間作用させ、細胞内Ｃａ２＋濃度の減少を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、インバースアゴニストとして選択することができる。本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法でインバースアゴニストをスクリーニングすることにより、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
２）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法は、本発明のｃＡＭＰ型検出方法により、インバースアゴニストであるか否かを検出する工程、及びインバースアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
インバースアゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、試験化合物によるｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を指標に、スクリーニングすることができる。
細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇を指標に、そのＥＤ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、インバースアゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法でインバースアゴニストをスクリーニングすることにより、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
３）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法は、本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、インバースアゴニストであるか否かを検出する工程、及びインバースアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
インバースアゴニストは、前記ＧＴＰγＳ結合型検出方法における、試験化合物による特異的なＧＴＰγＳ結合の低下を指標にスクリーニングすることができる。
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法でインバースアゴニストをスクリーニングすることにより、腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
（２）スクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）活性阻害を指標としてＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法
ＣＴＧＦの発現を制御する物質は腎不全治療薬となることが示されている。従って、本発明のＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、すなわち、下流にレポーター遺伝子を保持するＣＴＧＦプロモーターを発現しているスクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする方法により腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、実施例３又は実施例７に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。たとえば実施例３又は実施例７に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、実施例３又は実施例７の条件下でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、腎不全治療薬として有用な物質として選択することができる。
（３）ＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法
腎不全治療薬の標的となるＣＴＧＦのプロモーターを活性化するスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）は、それ自身単独でも腎不全治療薬スクリーニングツールとして有用である。本発明者らは後述の実施例３に示すように、ＦＧＫが、ＣＯＬＩＡ２のプロモーターを活性化することを見出し、ＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しＦＧＫ活性変化を指標とするスクリーニング方法を確立した。ＦＧＫの活性阻害をインビトロで検出する系の一つとして以下のＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用したレポーターアッセイ系が利用できる。
本発明のＣＯＬＩＡ２プロモーターを利用しスクリーニング用ポリペプチド（好ましくはＦＧＫ）の活性変化を指標とするスクリーニング方法は、下流にレポーター遺伝子を保持するＣＯＬＩＡ２プロモーターを発現しているスクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴する。当該スクリーニング方法は、前述のＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法においてＣＴＧＦプロモーターのかわりにＣＯＬＩＡ２プロモーターを用いることにより実施できる。上記工程を実施し、レポーター活性を抑制する物質を選択することにより、腎不全治療に有用な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、実施例３に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。たとえば実施例３に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、実施例３の条件下でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質を、腎不全治療薬として有用な物質として選択することができる。
＜腎不全治療用医薬組成物及びその製造方法＞
本発明には、例えば、本発明のスクリーニング方法で選択することのできる、スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニスト［例えば、ＤＮＡ、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする医薬組成物が包含される。
また、腎不全治療用医薬組成物の品質規格の確認試験において、（１）（ｉ）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現しているスクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）前記細胞内におけるスクリーニンツール用ポリペプチドの活性の変化を分析する工程、あるいは（２）（ｉ）下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３又は１４のＤＮＡを発現しているスクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程からなる分析を行ない、次いで、分析した物質を製剤化することからなる、腎不全治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、腎不全治療用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明の医薬組成物における有効成分としては、スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニストを用いることができ、前記インバースアゴニストは、例えば、本発明のスクリーニング方法により選択することができる。スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニストとしては、例えば、本発明のスクリーニング方法で選択された化合物（後述の実施例５〜７、表１参照）を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法で得られた物質を有効成分とする医薬組成物に限定されず、スクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニストを有効成分とする腎不全治療用医薬組成物であれば全て包含される。
なお、腎不全治療効果があることの確認は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる。腎不全治療効果は尿細管間質線維化の抑制、尿蛋白の抑制、血中クレアチニン量などを指標として検出することができる。例えば、尿細管間質線維化の抑制効果の確認は、非特許文献１５又は非特許文献Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００２年、第６１巻、ｐ．１６８４−１６９５記載のＵＵＯモデルマウスもしくはその変法により確認できる。より具体的には以下方法により確認できる。雄性ＩＣＲマウスにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を０．１ｍＬ／１０ｇの液量にて腹腔内投与（ｉ．ｐ．）して麻酔する。左腹部を切開し、左尿管を４−０絹糸にて二箇所で結紮し、その間を切断し、その後切開部を縫合することによりＵＵＯマウスを作製することができる。ＵＵＯマウスをコントロール群と試験化合物投与群とに分け、薬物をそのタイプに応じた方法で投与する。投与後（例えば１日１回の投与でＵＵＯマウス作製の５日後）、ペントバルビタール麻酔下にて採血後、左腎（病態腎）と右腎（対照腎）を摘出し、湿重量を測定する。腎を分割して、一部を病理評価（例えばマッソン・トリクロム染色（間質に蓄積したコラーゲン蛋白が青く染色される））することができる。また、一部からＲＮＡを抽出し、線維化のマーカー遺伝子（例えば、ＣＴＧＦ、コラーゲン又はファイブロネクチンなど）の発現を公知の方法（例えばノザンブロッティング又はＲＴ−ＰＣＲ）にて検出することができる。前記染色において、コントロール群に比較して試験化合物投与群の染色が減少していれば（コラーゲン蛋白量が低下していれば）試験化合物に腎不全治療効果があると判定することができる。また、コントロール群に比較して試験化合物投与群における線維化マーカーの発現量が減少していれば試験化合物に腎不全治療効果があると判定できる。
また、尿蛋白の抑制は、例えば、非特許文献Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第４７巻、ｐ．２４３−２５２記載の５／６腎摘ラットもしくはその変法により確認できる。
上記腎不全治療効果の確認方法のうち最も好ましいのは５／６腎摘ラットを用いる方法である。より具体的には以下の方法により確認できる。９週齢のＷｉｓｔａｒｒａｔをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）にて腹腔内投与（ｉ．ｐ．）して麻酔する。左腹部を切開し、左腎の２／３を摘出し、１週後右腎の全摘を行い、５／６腎摘出腎不全モデルラットを作製することが出来る。５／６腎摘出腎不全モデルラットをコントロール群と試験化合物投与群とに分け、薬物をそのタイプに応じた方法で投与する（例えば５／６腎摘出腎不全モデル作製の２週間後から１日１回の投与）。手術後１週ごとに、血圧の測定および個別代謝ケージを用い採尿実験を経時的に（例えば１週ごとに１０週間）行う。屠殺時に腹部大静脈から採血し、腎摘出を行う。尿サンプルはその量や蛋白濃度などを、血液サンプルはコレステロールや尿素窒素、又はクレアチニンなどの濃度を測定し、腎組織サンプルは病理組織変化などを検討する。コントロール群に比較して、例えば、尿中の蛋白量が低下していれば、もしくは血液中の尿素窒素量やクレアチニン量が低下していれば試験化合物に腎不全治療効果があると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質又はスクリーニングツール用ポリペプチドのインバースアゴニスト［例えば、ＤＮＡ、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ａｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施可能である。
また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）ＦＧＫをコードする遺伝子の単離
本発明のＦＧＫをコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト腎臓ｃＤＮＡ（クロンテック社）をテンプレートとしてＰＣＲにより取得した。配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いた（それぞれの５’末端にはＸｂａｌ ｓｉｔｅが付加してある）。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、５％ＤＭＳＯ存在下で９８℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。その結果、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＸｂａｌで消化した後、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒプラスミド（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２）を用いてクローニングした。構築したプラスミドをｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＦＧＫと名付けた。得られたクローンの塩基配列をジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析したところ、配列番号１で表される塩基配列が得られた。同配列は９９３塩基のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持っている。ＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３３０アミノ酸）を配列番号２に示す。
（実施例２）ヒト結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）プロモーターを用いたレポータープラスミド及びヒトＩ型コラーゲンアルファ２サブユニット（ＣＯＬＩＡ２）プロモーターを用いたレポータープラスミドの取得
ヒトＣＴＧＦ及びヒトＣＯＬＩＡ２遺伝子のプロモーター領域の増幅には、ヒト全血由来のゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ＤＮＡに用いた。ＣＴＧＦプロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。またＣＯＬＩＡ２プロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ストラタジーン社）を用い、９４℃（２分）の後、９４℃（３０秒）／５８℃（３０秒））／７２℃（２分）のサイクルを３５回繰り返した。その結果、ＣＴＧＦプロモーターの場合は約１．２ｋｂｐ、ＣＯＬＩＡ２プロモーターの場合は約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。その後各増幅産物を１％アガロースゲルにて分離し、スピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；キアゲン社）にて精製後、これらを鋳型として再度ＰＣＲを行った。ＣＴＧＦプロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。またＣＯＬＩＡ２プロモーター領域の増幅にはフォワードプライマーとして、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。なおそれぞれのフォワードプライマーの５’末端にはＫｐｎｌ認識配列、またリバースプライマーの５’末端にはＢｇＩＩＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ストラタジーン社）を用い、９４℃（２分）の後、９４℃（３０秒）／５８℃（３０秒））／７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。その後各増幅産物を１％アガロースゲルにて分離し、スピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；キアゲン社）にて精製後、Ｋｐｎｌ及びＢｇＩＩＩにて消化し、レポーター発現用プラスミド（ピッカジーンベーシックベクター２；東洋インキ社）に挿入してクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）で解析し、既知ＣＴＧＦプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ３５４８６６）又はＣＯＬＩＡ２プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ００４８７７）と合致したクローンをそれぞれ選択した。以上により得られたレポータープラスミドはそれぞれヒトＣＴＧＦプロモーターの１１２９ｂｐから＋２４ｂｐ（配列番号１３）、又はヒトＣＯＬＩＡ２プロモーターの−３３７ｂｐから＋２２ｂｐ（配列番号１４）をルシフェラーゼ遺伝子の上流に含んでおり、それぞれｐＣＴＧＦ−ｌｕｃ，ｐＣＯＬＩＡ２−ｌｕｃと命名した。
（実施例３）ＣＴＧＦプロモーター及びＣＯＬＩＡ２プロモーターレポーターアッセイ系の構築とＦＧＫ導入による効果
２４ウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０５細胞で播種して３７℃で２４時間培養後、１ウェルあたり０．１μｇのレポータープラスミド及び最高で０．５μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミドの計０．６μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて添付の指示書に従い遺伝子導入を行った。なお全てのウェル当たりの導入遺伝子量は１ウェルあたり計０．６μｇとなる様にプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１；インビトロジェン社）を加えて調整した。ＦＧＫを含まずｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをレポータープラスミドと共に形質転換した細胞をコントロールとした。遺伝子導入２４時間後に培地を廃棄し、細胞溶解液を１ウェルあたり１００μｌ加えて溶解した。溶解液５０μｌにルシフェリン基質液１００μｌを加えて反応させた後、ルミノメーター（ＭＬ３０００；ダイナテックラボラトリーズ社）にて測定した。コントロールのルシフェラーゼ活性に対する相対活性（コントロールを１とする）を図１に示す。ＦＧＫの発現によりＣＴＧＦプロモーター及びＣＯＬＩＡ２プロモーターの活性化が観察された。またその活性化におけるＦＧＫの用量依存性も観察された。以上の事から、ＦＧＫはＣＴＧＦ及びＩ型コラーゲンの発現を誘導することが明らかになった。
本アッセイ系を利用することにより、ＣＴＧＦ発現を抑制する物質及び腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
（実施例４）ＦＧＫ活性変化を指標とするスクリーニング系の構築
本実施例で使用したＧｑとＧｉとのキメラ蛋白質を発現するための発現プラスミドは、Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｂ．Ｒ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２７６，１９９３）に従い、ＧｑのＣ末端側の５アミノ酸（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；配列番号１５で表されるアミノ酸配列）を、ＧｉのＣ末端側の５アミノ酸（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；配列番号１６で表されるアミノ酸配列）と置換して構築した遺伝子（以下、Ｇｑｉ遺伝子と称する）を、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒにクローニングして作製した。構築したプラスミドは、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと命名した。
具体的な方法としては、まず２４ウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０５細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり０．０５μｇのルシフェラーゼ遺伝子の上流に血清応答配列を挿入したレポータープラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔＴＭ ＳＲＥ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ストラタジーン社）、０．０５μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ及び最高で０．５μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミド計０．６μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて遺伝子導入を行った。ＦＧＫを含まずｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをレポータープラスミド及びｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと共に形質転換した細胞をコントロールとした。他の条件及びレポーター活性の測定は実地例３に従った。コントロールのルシフェラーゼ活性に対する相対活性（コントロールを１とする）を図２に示す。ＦＧＫの発現によりレポーター活性の上昇が観察された。またその活性化におけるＦＧＫの用量依存も観察された。以上の事から、本アッセイ系によってＦＧＫ活性を阻害する物質、すなわち腎不全治療薬として有用な物質をスクリーニングすることが可能となった。
（実施例５）ＦＧＫ活性を阻害する物質のスクリーニング
実施例４において構築したＦＧＫ活性変化を指標とするスクリーニング系を用いて試験物質のスクリーニングを行った。
９６ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０４細胞で播種して３７℃にて２４時間培養した。１ウェルあたり０．０１μｇのレポータープラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（実施例４）、０．０３μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ及び０．０２μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミド計０．０６μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて遺伝子導入を行った。導入後３７℃にて６時間培養した後、試験化合物のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度が３０μＭ，１０μＭ，３μＭ，１μＭ，０．３μＭ又は０．１μＭとなるように添加し、更に３７℃にて２４時間培養した。その後レポーター活性を測定し、試験化合物による５０％活性抑制濃度（ＩＣ５０）を決定した。化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合のレポーター活性を１００％とした。他の条件及びレポーター活性の測定は実地例４に従った。ＦＧＫを発現させた細胞においてＦＧＫ活性を阻害する物質（ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質）をＦＧＫのインバースアゴニストとして選択したところ７個の異なる化合物を取得することができた。これらの化合物の構造、活性及び入手先を表１に示す。
（実施例６）ＦＧＫ活性を阻害する物質によるＣＴＧＦ発現抑制の検出
１２ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にヒト近位尿細管上皮初代培養細胞（ＲＰＴＥＣ；アサヒテクノグラス社）を腎上皮細胞用増殖培地（ブレットキットＲＥＧＭ；アサヒテクノグラス社）にて１ウェルあたり２×１０５細胞で播種した。３７℃にて２４時間培養後、実施例５にて得た試験化合物（ＦＧＫ活性を阻害する物質、すなわちＦＧＫインバースアゴニスト）を最終濃度が１０μＭとなる様に培地に添加し、更に３７℃にて２４時間培養した。その後細胞を回収し、トータルＲＮＡをスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；キアゲン社）にて精製した。１．５μｇのトータルＲＮＡ及び逆転写酵素（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｒｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。それらを鋳型として、ＰＲＩＳＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法により、ＣＴＧＦ及びハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下Ｇ３ＰＤＨと略す）の発現量を測定した。ＰＣＲ反応にはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、５０°Ｃ（２分）、９５°Ｃ（１０分）の後、９５°Ｃ（１５秒）／６０°Ｃ（６０秒）のサイクルを４０回繰り返した。ＣＴＧＦの検出には配列番号１７で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号１８で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、またＧ３ＰＤＨの検出には配列番号１９で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号２０で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用した。ＰＣＲにより得られたＣＴＧＦの発現量をＧ３ＰＤＨの発現量で割った値を単位ＲＮＡ量あたりのＣＴＧＦ発現量と定義した。また化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合の単位ＲＮＡ量あたりのＣＴＧＦ発現量を１００％とした。このアッセイにより得られたＣＴＧＦ発現阻害活性（化合物濃度１０μＭにおける阻害活性）を表１に示す。ＦＧＫ活性阻害を指標に取得した物質が確かにＣＴＧＦ発現を抑制することが確認できた。
（実施例７）ＦＧＫによるＣＴＧＦプロモーター活性化を抑制する化合物のスクリーニング
実施例３において構築した、ＦＧＫによるＣＴＧＦプロモーター活性化の系により試験化合物をスクリーニングした。
９６ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより入手）を１０％牛胎児血清入りダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて１ウェルあたり１×１０４細胞で播種した。３７℃にて２４時間培養後、１ウェルあたり０．０２μｇのｐＣＴＧＦ−ｌｕｃ（実施例２参照）及び０．０２μｇのヒトＦＧＫ発現プラスミド計０．０４μｇをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーロシェ社）を用いて遺伝子導入を行った。導入後３７℃にて６時間培養した後、試験化合物のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度が３０μＭ，１０μＭ，３μＭ，１μＭ，０．３μＭ又は０．１μＭとなるように添加し、更に３７℃にて２４時間培養した。その後レポーター活性を測定し、試験化合物による５０％活性抑制濃度（ＩＣ５０）を決定した。化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合のレポーター活性を１００％とした。他の条件及びレポーター活性の測定は実地例３に従った。ＦＧＫによるＣＴＧＦプロモーター活性化を阻害する物質を選択し、ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を表１に示した。本アッセイ系によってＣＴＧＦ発現を抑制する物質すなわち腎不全治療薬として有用な物質を確かにスクリーニングすることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
本発明のスクリーニングツールの一つであるＦＧＫがＣＴＧＦのプロモーターを活性化することを見出した。ＣＴＧＦは腎不全における創薬標的であることが知られており、従って、本発明のスクリーニングツールであるポリペプチドおよび／または前記ポリペプチドを発現している細胞を用いることによって、前記ポリペプチドの阻害を指標にＣＴＧＦ発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、すなわち前記ポリペプチドの阻害剤を選択することによるＣＴＧＦ発現抑制に基づく腎不全治療薬のスクリーニング方法及び前記ポリペプチドのインバースアゴニストを選択することによる腎不全治療薬をスクリーニングする方法を構築することができる。
また、本発明のスクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、腎不全治療用医薬組成物を製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３、４、９〜１２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチドである腎不全治療薬スクリーニングツール。
【請求項２】
請求の範囲１に記載のポリペプチドを発現している細胞である腎不全治療薬スクリーニングツール。
【請求項３】
Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している請求の範囲２に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記細胞内における請求項１記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験化合物がインバースアゴニストであるか否かを検出する方法。
【請求項４】
Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している請求の範囲２に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞内における請求の範囲１記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項５】
下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３のＤＮＡを発現している請求の範囲２に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とするＣＴＧＦの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項６】
ＣＴＧＦの発現を抑制する物質が腎不全治療薬である請求の範囲５に記載のスクリーニングする方法。
【請求項７】
下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１４のＤＮＡを発現している請求の範囲２に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする腎不全治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項８】
請求の範囲１に記載のポリペプチドのインバースアゴニストを含有する腎不全治療用医薬組成物。
【請求項９】
請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法によって得られる物質を含有する腎不全治療用医薬組成物。
【請求項１０】
請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲１に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法によって得られる物質を腎不全治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、腎不全治療方法。
【請求項１２】
請求の範囲１に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法によって得られる物質の、腎不全治療用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＴＧＦプロモーターを活性化することができるポリペプチドである腎不全治療薬スクリーニングツール。
【請求項２】
請求の範囲１に記載のポリペプチドを発現している細胞である腎不全治療薬スクリーニングツール。
【請求項３】
Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している請求の範囲２に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記細胞内における請求項１記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験化合物がインバースアゴニストであるか否かを検出する方法。
【請求項４】
Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇ蛋白質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ蛋白質キメラを共発現している請求の範囲２に記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞内における請求の範囲１記載のポリペプチドの活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項５】
下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１３のＤＮＡを発現している請求の範囲２に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とするＣＴＧＦの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項６】
ＣＴＧＦの発現を抑制する物質が腎不全治療薬である請求の範囲５に記載のスクリーニングする方法。
【請求項７】
下流にレポーター遺伝子を保持する配列番号１４のＤＮＡを発現している請求の範囲２に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程及び
前記細胞におけるレポーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする腎不全治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項８】
請求の範囲１に記載のポリペプチドのインバースアゴニストを含有する腎不全治療用医薬組成物。
【請求項９】
請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法によって得られる物質を含有する腎不全治療用医薬組成物。
【請求項１０】
請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、腎不全治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲１に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法によって得られる物質を腎不全治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、腎不全治療方法。
【請求項１２】
請求の範囲１に記載のポリペプチドのインバースアゴニスト及び／又は請求の範囲４乃至請求の範囲７に記載の方法によって得られる物質の、腎不全治療用医薬組成物を製造するための使用。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３３６８７
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【発行日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４２８５８（Ｐ２００４−５４２８５８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１２９６７
【国際出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【発行日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１２９６７
【国際出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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