腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤
【課題】腎炎に対する治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性が低減された腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤の提供。
【解決手段】炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤、更にリン脂質、ポリアルキレングリコールを含有する腎炎治療薬。
【解決手段】炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤、更にリン脂質、ポリアルキレングリコールを含有する腎炎治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤に関するものであり、詳細には、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有する腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カゼインキナーゼ２（Casein kinase II、以下「ＣＫ２」という。）は、広く組織に発現しているセリン／スレオニンキナーゼであり、活性サブユニット（ＣＫ２α、α’）と制御サブユニット（ＣＫ２β）からなる四量体で構成される。本発明者らは、ＣＫ２を阻害することにより腎炎の進行を顕著に阻害できることを世界で初めて見出した（非特許文献１参照）。活性サブユニットにはＣＫ２αおよびＣＫ２α’の２種類のアイソザイムが存在するが、腎炎の糸球体において著明に発現が上昇するのはＣＫ２αであり、ＣＫ２α’は精巣における精子形成に関与することが報告されている。天然物由来ＣＫ２阻害剤として知られているエモジン（Ｅｍｏｄｉｎ）は、アイソザイム選択性がなく、両方のアイソザイムを阻害するため、動物実験において腎炎症状の進行を抑制する一方、精巣のアポトーシスを増強するという副作用が観察された。
【０００３】
腎炎の有効な治療方法は未だ確立されていない。現在は、病状の進行が見られない場合には、生活管理および食事療法を中心として薬物を補助的に用い、病状の進行が見られる場合には、厳密な食事療法と薬物療法を組み合わせて用いる治療法が行われている。薬物投与は、タンパク尿に対してはジピリダモールを、ネフローゼ症候群を呈する場合は副腎皮質ステロイドを使用する。また、高血圧の場合はα−メチルドーパを、浮腫の強い場合はフロセミドなどの利尿剤を投与する。また、コルチコステロイド単独、あるいはシクロホスファミドとの併用によって炎症を抑制して、腎不全への進行を遅延させる。
【０００４】
しかし、上記の薬剤は、副作用やリバウンド現象などを引き起こす場合がある。さらに、ステロイド剤を含む一部薬剤は、投与された後に腎臓で濃縮され、かえって腎炎を悪化させる場合もある。腎炎の自然寛解はまれであり、治療が長期にわたるため患者に負担の少ない治療法の開発が望まれている。それゆえ、腎炎治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性の少ないＣＫ２阻害薬が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamada & Tsujimoto et al., PNAS.2005,102:7736-7741
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、腎炎に対する治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性が低減された腎臓内ＣＫ２阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
［２］炭素数が１８以下である前記［１］に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
［３］前記［１］または［２］に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤を含有する医薬組成物。
［４］さらに、リン脂質を含有する前記［３］に記載の医薬組成物。
［５］リン脂質がレシチンである前記［４］に記載の医薬組成物。
［６］さらに、ポリアルキレングリコールを含有する前記［３］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである前記［６］に記載の医薬組成物。
［８］腎炎治療薬である前記［３］〜［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、腎炎に対する治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性が低減された腎臓内ＣＫ２阻害剤を提供することができる。本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を含む医薬組成物は、腎炎治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の各実験群の腎臓内ＣＫ２発現量を比較した結果を示す図であり、（Ａ）はウエスタンブロットのバンドの画像を表し、（Ｂ）はウエスタンブロットのバンドの濃さを数値化した結果を表す。
【図２】実施例１の各実験群の腎臓内ＣＫ２の活性を比較した結果を示す図である。
【図３】実施例１の各実験群の腎臓内ＣＫ２のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲにより比較した結果を示す図である。
【図４】実施例１の各実験群の尿中タンパク質量の測定結果を示す図である。
【図５】実施例１の各実験群の血清クレアチニンの測定結果を示す図である。
【図６】実施例１の各実験群のＢＵＮの測定結果を示す図である。
【図７】実施例１の各実験群の腎臓の組織染色像を示す図である。
【図８】実施例１の各実験群の糸球体３０個あたりの半月体形成数を示す図である。
【図９】実施例１の各実験群の糸球体１個あたりの総糸球体細胞数を示す図である。
【図１０】実施例１の各実験群の糸球体１個あたりの抗Ｋｉ６７抗体染色陽性細胞数を示す図である。
【図１１】実施例１の各実験群の糸球体１個あたりの抗ＥＤ−１抗体染色陽性細胞数を示す図である。
【図１２】実施例１の各実験群のＬＤＨの測定結果を示す図である。
【図１３】実施例１の各実験群のＡＳＴの測定結果を示す図である。
【図１４】実施例１の各実験群のＡＬＴの測定結果を示す図である。
【図１５】実施例１の各実験群のＴＧの測定結果を示す図である。
【図１６】実施例１の各実験群の総コレステロールの測定結果を示す図である。
【図１７】実施例１の各実験群の精巣のＴＵＮＥＬ染色像を示す図である。
【図１８】実施例１の各実験群の精細管内のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を示す図である。
【図１９】実施例２の各実験群の尿中タンパク質量の測定結果を示す図である。
【図２０】実施例２の各実験群の血清クレアチニンの測定結果を示す図である。
【図２１】実施例２の各実験群のＢＵＮの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内ＣＫ２阻害剤を提供する。炭素数６以上の脂肪酸は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれであってもよく、直鎖状および分岐状のいずれであってもよい。具体的には、例えば、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ヘンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸などが挙げられる。脂肪酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。脂肪酸のエステルとしては、グリセリド等のアルコールエステル、糖エステルなどが挙げられる。
【００１１】
好ましくは炭素数１８以下、すなわち炭素数６〜１８の脂肪酸またはその塩またはそのエステルであり、より好ましくは炭素数６〜１２の脂肪酸またはその塩またはそのエステルである。さらに好ましくは炭素数６〜１２の脂肪酸のエステルである。
また、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤は、有効成分として炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの１種類のみを用いてもよく、２種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルは、公知の方法に従って製造することができる。また、市販品を入手することができる。
【００１２】
後段の実施例で示すように、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を腎炎モデルラットに投与することにより、腎臓内ＣＫ２の発現量を有意に減少させ、腎臓内ＣＫ２活性を低下させることができる。また、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を投与した腎炎モデルラットにおいては、腎炎に伴う尿タンパク質、血清クレアチニン、ＢＵＮ（血液尿素窒素）の上昇を有意に抑制し、腎組織における糸球体の肥大を抑制し、糸球体内総細胞数の増加および半月体形成を有意に抑制し、糸球体における細胞増殖およびマクロファージ浸潤を有意に抑制することが明らかになった。したがって、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を含む医薬組成物は、腎炎治療薬として有用である。
【００１３】
さらに、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を投与した腎炎モデルラットにおいては、肝臓に対する毒性を示さず、公知のＣＫ２阻害剤であるエモジンが精巣毒性を示すのに対して、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤は精巣毒性を示さないことが明らかとなった。したがって、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を含む医薬組成物は、低毒性の腎炎治療薬として極めて有用である。
【００１４】
治療対象の腎炎は特に限定されないが、例えば、急性糸球体腎炎、微小変化型腎炎、巣状糸球体硬化症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、ループス腎炎、尿細管間質性腎炎、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、痛風腎
などが挙げられる。なかでも、自己免疫性の腎炎が好適である。自己免疫性の腎炎としては、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎、グットパスチャー症候群、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症などが挙げられる。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、上記本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤に、薬学的に許容される担体、添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００１６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、上記本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤と、リン脂質およびポリアルキレングリコールの少なくともいずれかを組み合わせた製剤とすることが好ましい。リン脂質およびポリアルキレングリコールはいずれも医薬の添加剤として許容されている。より好ましくは、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤とリン脂質とポリアルキレングリコールを組み合わせた製剤であり、静脈内投与用脂肪乳剤とすることが特に好ましい。本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤とリン脂質とポリアルキレングリコールを組み合わせた静脈内投与用脂肪乳剤は、公知の脂肪乳剤の製造方法により製造することができる。例えば、後段の実施例に記載のトリカプリリン含有エマルションの調製方法を好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
リン脂質は特に限定されず、例えばレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリンなどが挙げられる。好ましくはレシチンであり、より好ましくは卵黄レシチンである。レシチンは、動物・植物より取り出された各種のリン脂質を主体とする混合物の総称であり、その主要成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸である。リン脂質は、市販品を好適に用いることができる。
【００１９】
ポリアルキレングリコールは、一般式 Ｈ（Ｏ[ＣＨ２]ｍ）ｎＯＨで示される化合物である（ｍおよびｎは１以上の整数）。具体的には、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリペンチレングリコール、ポリへキシレングリコール、ポリヘプチレングリコール、ポリオクチレングリコール、ポリノニレングリコール、ポリデシレングリコールなどが挙げられる。なかでも、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールの平均分子量は、２００〜２００００が好ましく、より好ましくは２００〜４０００、さらに好ましくは２００〜１０００である。
【００２０】
ポリアルキレングリコールには、異なるポリアルキレングリコールを２種以上混合したものでもよい。また、他の化合物をポリアルキレングリコールで修飾したポリアルキレングリコール誘導体も好適に用いることができる。ポリアルキレングリコール誘導体としては、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧなどが挙げられる。ポリアルキレングリコールは、市販品を好適に用いることができる。
【００２１】
このようにして得られる製剤は低毒性であり、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。投与量は、患者の状態、症状、投与方法などにより異なるが、通常成人１日当り１０〜１００００ｍｇ、好ましくは１０〜５０００ｍｇである。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２２】
本発明は、さらに以下の発明を包含する。
哺乳動物に対して、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの有効量を投与することを特徴とする腎臓内ＣＫ２の阻害方法。
哺乳動物に対して、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの有効量を投与することを特徴とする腎炎の治療方法。
腎臓内ＣＫ２の阻害に使用するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステル。
腎炎の治療に使用するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステル。
腎臓内ＣＫ２阻害剤を製造するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの使用。
腎炎治療薬を製造するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの使用。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
〔実施例１：トリカプリリンによる腎臓内ＣＫ２阻害作用および腎炎治療効果〕
（１）抗基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎ラットの作製
１０週齢のＳＤラットの腎臓を摘出し、ステンレスメッシュによる篩法を用いて糸球体を分画した。この糸球体画分を抗原としてＮＺＷウサギを免疫し、ウサギ抗ＧＢＭ抗血清を作製した。得られたウサギ抗ＧＢＭ抗血清を７週齢のＷＫＹラットに尾静脈注射し、抗ＧＢＭ抗体腎炎モデルラットを作製した。
【００２５】
（２）トリカプリリン含有エマルションの調製
トリカプリリン（和光純薬）１０００ｍｇ、レシチン（L-alpha-Phosphatidylcholine、Avanti Polar Lipids）３５０ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（N-(Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol 2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、NOF）１４０ｍｇを含有するエマルション１０ｍＬ（粒子径１００〜１２０μｍ）を以下の手順で調製した。なお、粒子径はゼータサイザー（Malvern社製）を用いて動的光散乱法で測定した。
(a) トリカプリリン（和光純薬）に、クロロホルムに溶解したレシチンを加えて混和。
(b) エバポレーターおよびデシケーターを使ってクロロホルムを完全に除去。
(c) 残さに生理食塩水を約５ｍＬ添加。
(d) 得られた乳濁液に対して超音波処理（３０秒×６回）。
(e) ０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過。
(f) ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を約５ｍＬの生理食塩水で溶解し、７０℃の水浴中で３時間保温。
(g) 上記(e)および(f)を混合し、液量を１０ｍＬに調整して、７０℃で９０分間保温。
【００２６】
（３）実験群
以下の４群（６匹／群）を設けた。
(i) トリカプリリン含有エマルション投与群（０．５ｍＬ／匹／日、図中「Ｅｍｕｌｓｉｏｎ」）
(ii) エモジン投与群（２０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＫ２阻害薬、図中「Ｅｍｏｄｉｎ」）
(iii) 生理食塩水投与群（０．５ｍＬ／匹／日、腎炎モデル、図中「（−）」）
(iv) 無処置群（抗ＧＢＭ抗体非投与、図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）
【００２７】
（４）実験手順
７週齢のＷＫＹラットにウサギ抗ＧＢＭ抗血清を尾静脈注射した２４時間後から、被験物質または対照物質を１日１回２週間連続でラットに投与した。トリカプリリン含有エマルションおよび生理食塩水は静脈内投与、エモジンは腹腔内投与とした。最終投与後、尿を採取し、尿中タンパク質量を測定した。また、血液を採取し、血清クレアチニン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、総コレステロール、中性脂肪（ＴＧ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＡＳＴ、ＡＬＴを測定した。また、ラットを安楽死させて腎臓および精巣を摘出し、組織学的検討を行った。
【００２８】
一方、腎臓内のＣＫ２阻害実験は、以下のように行った。
すなわち、摘出した腎臓から皮質を得、ホモジナイズして１０００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離し、上清を得た。総タンパク質量４０μｇの上清をウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットは定法に従って行い、一次抗体には抗ＣＫ２α抗体（Santa Cruz Biotechnoligy）を、二次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnoligy）を用い、検出にはＥＣＬ法（Amersham Biosciences）を用いた。また、内部標準としてＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて検出し、ＧＡＰＤＨの発現量でＣＫ２αの発現量を標準化した。
総タンパク質量１５μｇの上記上清をＣＫ２活性の測定に供した。ＣＫ２活性の測定は、ＣＫ２アッセイキット（Upstate Biotechnology）を用いて行った。
上記皮質から定法に従ってトータルＲＮＡを抽出し、その１μｇをＲＴ−ＰＣＲに供した。以下のＣＫ２α用プライマーセットおよびＧＡＰＤＨ用プライマーセットを用いて、定法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供してＣＫ２αｍＲＮＡ量を確認した。
ＣＫ２αプライマーセット
フォワード 5’-acatcatcacacttgcagac-3’（配列番号１）
リバース 5’-gcaactcggacattatactc-3’（配列番号２）
ＧＡＰＤＨプライマーセット
フォワード 5’-tccgttgtggatctgacatg-3’（配列番号３）
リバース 5’-ggagttgctgttgaagtcac-3’（配列番号４）
【００２９】
（５）統計処理
得られたデータは平均値±標準誤差で示した。また、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いて統計処理を行った。結果を示す図において、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１をそれぞれ表す。
【００３０】
（６）結果
（6-1）腎臓内ＣＫ２阻害作用
図１に腎臓内ＣＫ２タンパク質のウエスタンブロットの結果を示し、図２に腎臓内ＣＫ２活性の結果を示し、図３に腎臓内ＣＫ２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果をそれぞれ示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルション投与群では、腎臓内ＣＫ２タンパク質の発現量が有意に減少し、腎臓内ＣＫ２活性の有意な低下が認められた。また、腎臓内ＣＫ２ｍＲＮＡの発現量も減少していた。
【００３１】
（6-2）腎炎治療効果
図４に尿中タンパク質量の結果を、図５に血清クレアチニンの結果を、図６にＢＵＮの結果をそれぞれ示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルション投与群では、腎炎に伴う尿中タンパク質量の増加、血清クレアチニン値の上昇、ＢＵＮ値の上昇の有意な抑制が認められた。
図７に各群のラットから摘出した腎臓の組織染色像を示した。上段がＰＡＳ染色、中段が抗Ｋｉ６７抗体による免疫染色像、下段が抗ＥＤ−１抗体による免疫染色像である。図中、中段の矢印はＫｉ６７陽性細胞（増殖中の細胞）を、下段の矢印はＥＤ−１陽性細胞（マクロファージ）をそれぞれ示す。また、図８に糸球体３０個あたりの半月体形成数を、図９に糸球体１個あたりの総糸球体細胞数を、図１０に糸球体１個あたりの抗Ｋｉ６７抗体染色陽性細胞数を、図１１に糸球体１個あたりの抗ＥＤ−１抗体染色陽性細胞数を示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルション投与群では、腎組織において糸球体の肥大が抑制され、生理食塩水投与群と比較して糸球体内総細胞数および半月体形成が有意に抑制された。さらに、糸球体における細胞増殖およびマクロファージ浸潤についても、生理食塩水投与群と比較して有意に抑制された。
【００３２】
（6-3）副作用
図１２にＬＤＨの結果を、図１３にＡＳＴの結果を、図１４にＡＬＴの結果を、図１５にＴＧの結果を、図１６に総コレステロールの結果をそれぞれ示した。これらの結果から、いずれの指標についても、トリカプリリン含有エマルション投与群は無処置群と比較して有意な変動が認められず、肝臓に対する毒性を示さないことが明らかとなった。
図１７に、各群のラットから摘出した精巣のＴＵＮＥＬ染色像を示した。図中、矢印はＴＵＮＥＬ染色陽性細胞（アポトーシス細胞）を示す。また、図１８に精細管内のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を示した。精細管内のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞は、精細管内の外周部分を精細管基底膜から２５μｍ内、内側はそれより内腔側にあるものと定義し、１標本あたり６０個の精細管についてＴＵＮＥＬ陽性細胞数をカウントし、１精細管あたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数として表した。図１７および図１８から明らかなように、エモジン投与群は精細管内のアポトーシス細胞の有意な増加が認められたのに対して、トリカプリリン含有エマルション投与群はアポトーシス細胞の増加が認められず、精巣に対する毒性を示さないことが明らかとなった。
【００３３】
〔実施例２：トリカプリリンおよびトリオレイン酸グリセリドによる腎炎治療効果〕
（１）実験群
実施例１と同様に抗ＧＢＭ抗体腎炎ラットを作製し、以下の８群（６匹／群）を設けて、腎炎治療効果を確認した。
(i) トリカプリリン投与群（５０ｍｇ／匹／日、図中「ＴＣ」）
(ii) トリカプリリン・レシチン混合物投与群（トリカプリリン５０ｍｇ・レシチン１７．５ｍｇ／匹／日、図中「ＴＣ＋ＥＧＧ」）
(iii) トリカプリリン・ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００混合物投与群（トリカプリリン５０ｍｇ・ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００ ７ｍｇ／匹／日、図中「ＴＣ＋ＰＥＧ」）
(iv) トリカプリリン含有エマルション投与群（０．５ｍＬ／匹／日、図中「ＴＣ＋ＥＧＧ＋ＰＥＧ」）
(v) トリオレイン酸グリセリド含有エマルション投与群（０．５ｍＬ／匹／日、図中「ＴＯ＋ＥＧＧ＋ＰＥＧ」）
(vi) エモジン投与群（２０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＫ２阻害薬、図中「Ｅｍｏｄｉｎ」）
(vii) 生理食塩水投与群（０．５ｍＬ／匹／日、腎炎モデル、図中「（−）」）
(viii) 無処置群（抗ＧＢＭ抗体非投与、図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）
【００３４】
（２）エマルションの調製
トリカプリリン含有エマルションは実施例１に記載の方法で調製した。トリオレイン酸グリセリド含有エマルションは、トリカプリリントリオレイン酸グリセリドに変更した以外は実施例１のトリカプリリン含有エマルションの調製方法と同様に調製した。トリカプリリン・レシチン混合物は、実施例１のトリカプリリン含有エマルションの調製方法に従い、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を混合していないエマルションとして調製した。
【００３５】
（３）実験手順
実施例１と同様に、７週齢のＷＫＹラットにウサギ抗ＧＢＭ抗血清を尾静脈注射した２４時間後から、被験物質または対照物質を１日１回２週間連続でラットに投与した。エモジンは腹腔内投与とし、その他は静脈内投与とした。最終投与後、尿を採取し、尿中タンパク質量を測定した。また、血液を採取し、血清クレアチニン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。
【００３６】
（４）結果
図１９に尿中タンパク質量の結果を、図２０に血清クレアチニンの結果を、図２１にＢＵＮの結果をそれぞれ示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルションのみでなく、トリオレイン酸グリセリド含有エマルション、トリカプリリン単独、トリカプリリンとレシチンとの混合物、トリカプリリンとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００との混合物についても、腎炎治療効果が認められた。
【００３７】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤に関するものであり、詳細には、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有する腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カゼインキナーゼ２（Casein kinase II、以下「ＣＫ２」という。）は、広く組織に発現しているセリン／スレオニンキナーゼであり、活性サブユニット（ＣＫ２α、α’）と制御サブユニット（ＣＫ２β）からなる四量体で構成される。本発明者らは、ＣＫ２を阻害することにより腎炎の進行を顕著に阻害できることを世界で初めて見出した（非特許文献１参照）。活性サブユニットにはＣＫ２αおよびＣＫ２α’の２種類のアイソザイムが存在するが、腎炎の糸球体において著明に発現が上昇するのはＣＫ２αであり、ＣＫ２α’は精巣における精子形成に関与することが報告されている。天然物由来ＣＫ２阻害剤として知られているエモジン（Ｅｍｏｄｉｎ）は、アイソザイム選択性がなく、両方のアイソザイムを阻害するため、動物実験において腎炎症状の進行を抑制する一方、精巣のアポトーシスを増強するという副作用が観察された。
【０００３】
腎炎の有効な治療方法は未だ確立されていない。現在は、病状の進行が見られない場合には、生活管理および食事療法を中心として薬物を補助的に用い、病状の進行が見られる場合には、厳密な食事療法と薬物療法を組み合わせて用いる治療法が行われている。薬物投与は、タンパク尿に対してはジピリダモールを、ネフローゼ症候群を呈する場合は副腎皮質ステロイドを使用する。また、高血圧の場合はα−メチルドーパを、浮腫の強い場合はフロセミドなどの利尿剤を投与する。また、コルチコステロイド単独、あるいはシクロホスファミドとの併用によって炎症を抑制して、腎不全への進行を遅延させる。
【０００４】
しかし、上記の薬剤は、副作用やリバウンド現象などを引き起こす場合がある。さらに、ステロイド剤を含む一部薬剤は、投与された後に腎臓で濃縮され、かえって腎炎を悪化させる場合もある。腎炎の自然寛解はまれであり、治療が長期にわたるため患者に負担の少ない治療法の開発が望まれている。それゆえ、腎炎治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性の少ないＣＫ２阻害薬が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamada & Tsujimoto et al., PNAS.2005,102:7736-7741
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、腎炎に対する治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性が低減された腎臓内ＣＫ２阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
［２］炭素数が１８以下である前記［１］に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
［３］前記［１］または［２］に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤を含有する医薬組成物。
［４］さらに、リン脂質を含有する前記［３］に記載の医薬組成物。
［５］リン脂質がレシチンである前記［４］に記載の医薬組成物。
［６］さらに、ポリアルキレングリコールを含有する前記［３］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである前記［６］に記載の医薬組成物。
［８］腎炎治療薬である前記［３］〜［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、腎炎に対する治療効果を有し、かつ精巣に対する毒性が低減された腎臓内ＣＫ２阻害剤を提供することができる。本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を含む医薬組成物は、腎炎治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の各実験群の腎臓内ＣＫ２発現量を比較した結果を示す図であり、（Ａ）はウエスタンブロットのバンドの画像を表し、（Ｂ）はウエスタンブロットのバンドの濃さを数値化した結果を表す。
【図２】実施例１の各実験群の腎臓内ＣＫ２の活性を比較した結果を示す図である。
【図３】実施例１の各実験群の腎臓内ＣＫ２のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲにより比較した結果を示す図である。
【図４】実施例１の各実験群の尿中タンパク質量の測定結果を示す図である。
【図５】実施例１の各実験群の血清クレアチニンの測定結果を示す図である。
【図６】実施例１の各実験群のＢＵＮの測定結果を示す図である。
【図７】実施例１の各実験群の腎臓の組織染色像を示す図である。
【図８】実施例１の各実験群の糸球体３０個あたりの半月体形成数を示す図である。
【図９】実施例１の各実験群の糸球体１個あたりの総糸球体細胞数を示す図である。
【図１０】実施例１の各実験群の糸球体１個あたりの抗Ｋｉ６７抗体染色陽性細胞数を示す図である。
【図１１】実施例１の各実験群の糸球体１個あたりの抗ＥＤ−１抗体染色陽性細胞数を示す図である。
【図１２】実施例１の各実験群のＬＤＨの測定結果を示す図である。
【図１３】実施例１の各実験群のＡＳＴの測定結果を示す図である。
【図１４】実施例１の各実験群のＡＬＴの測定結果を示す図である。
【図１５】実施例１の各実験群のＴＧの測定結果を示す図である。
【図１６】実施例１の各実験群の総コレステロールの測定結果を示す図である。
【図１７】実施例１の各実験群の精巣のＴＵＮＥＬ染色像を示す図である。
【図１８】実施例１の各実験群の精細管内のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を示す図である。
【図１９】実施例２の各実験群の尿中タンパク質量の測定結果を示す図である。
【図２０】実施例２の各実験群の血清クレアチニンの測定結果を示す図である。
【図２１】実施例２の各実験群のＢＵＮの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内ＣＫ２阻害剤を提供する。炭素数６以上の脂肪酸は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれであってもよく、直鎖状および分岐状のいずれであってもよい。具体的には、例えば、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ヘンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸などが挙げられる。脂肪酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。脂肪酸のエステルとしては、グリセリド等のアルコールエステル、糖エステルなどが挙げられる。
【００１１】
好ましくは炭素数１８以下、すなわち炭素数６〜１８の脂肪酸またはその塩またはそのエステルであり、より好ましくは炭素数６〜１２の脂肪酸またはその塩またはそのエステルである。さらに好ましくは炭素数６〜１２の脂肪酸のエステルである。
また、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤は、有効成分として炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの１種類のみを用いてもよく、２種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルは、公知の方法に従って製造することができる。また、市販品を入手することができる。
【００１２】
後段の実施例で示すように、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を腎炎モデルラットに投与することにより、腎臓内ＣＫ２の発現量を有意に減少させ、腎臓内ＣＫ２活性を低下させることができる。また、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を投与した腎炎モデルラットにおいては、腎炎に伴う尿タンパク質、血清クレアチニン、ＢＵＮ（血液尿素窒素）の上昇を有意に抑制し、腎組織における糸球体の肥大を抑制し、糸球体内総細胞数の増加および半月体形成を有意に抑制し、糸球体における細胞増殖およびマクロファージ浸潤を有意に抑制することが明らかになった。したがって、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を含む医薬組成物は、腎炎治療薬として有用である。
【００１３】
さらに、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を投与した腎炎モデルラットにおいては、肝臓に対する毒性を示さず、公知のＣＫ２阻害剤であるエモジンが精巣毒性を示すのに対して、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤は精巣毒性を示さないことが明らかとなった。したがって、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤を含む医薬組成物は、低毒性の腎炎治療薬として極めて有用である。
【００１４】
治療対象の腎炎は特に限定されないが、例えば、急性糸球体腎炎、微小変化型腎炎、巣状糸球体硬化症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、ループス腎炎、尿細管間質性腎炎、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、痛風腎
などが挙げられる。なかでも、自己免疫性の腎炎が好適である。自己免疫性の腎炎としては、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎、グットパスチャー症候群、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症などが挙げられる。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、上記本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤に、薬学的に許容される担体、添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００１６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、上記本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤と、リン脂質およびポリアルキレングリコールの少なくともいずれかを組み合わせた製剤とすることが好ましい。リン脂質およびポリアルキレングリコールはいずれも医薬の添加剤として許容されている。より好ましくは、本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤とリン脂質とポリアルキレングリコールを組み合わせた製剤であり、静脈内投与用脂肪乳剤とすることが特に好ましい。本発明の腎臓内ＣＫ２阻害剤とリン脂質とポリアルキレングリコールを組み合わせた静脈内投与用脂肪乳剤は、公知の脂肪乳剤の製造方法により製造することができる。例えば、後段の実施例に記載のトリカプリリン含有エマルションの調製方法を好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
リン脂質は特に限定されず、例えばレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリンなどが挙げられる。好ましくはレシチンであり、より好ましくは卵黄レシチンである。レシチンは、動物・植物より取り出された各種のリン脂質を主体とする混合物の総称であり、その主要成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸である。リン脂質は、市販品を好適に用いることができる。
【００１９】
ポリアルキレングリコールは、一般式 Ｈ（Ｏ[ＣＨ２]ｍ）ｎＯＨで示される化合物である（ｍおよびｎは１以上の整数）。具体的には、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリペンチレングリコール、ポリへキシレングリコール、ポリヘプチレングリコール、ポリオクチレングリコール、ポリノニレングリコール、ポリデシレングリコールなどが挙げられる。なかでも、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールの平均分子量は、２００〜２００００が好ましく、より好ましくは２００〜４０００、さらに好ましくは２００〜１０００である。
【００２０】
ポリアルキレングリコールには、異なるポリアルキレングリコールを２種以上混合したものでもよい。また、他の化合物をポリアルキレングリコールで修飾したポリアルキレングリコール誘導体も好適に用いることができる。ポリアルキレングリコール誘導体としては、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧなどが挙げられる。ポリアルキレングリコールは、市販品を好適に用いることができる。
【００２１】
このようにして得られる製剤は低毒性であり、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。投与量は、患者の状態、症状、投与方法などにより異なるが、通常成人１日当り１０〜１００００ｍｇ、好ましくは１０〜５０００ｍｇである。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２２】
本発明は、さらに以下の発明を包含する。
哺乳動物に対して、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの有効量を投与することを特徴とする腎臓内ＣＫ２の阻害方法。
哺乳動物に対して、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの有効量を投与することを特徴とする腎炎の治療方法。
腎臓内ＣＫ２の阻害に使用するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステル。
腎炎の治療に使用するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステル。
腎臓内ＣＫ２阻害剤を製造するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの使用。
腎炎治療薬を製造するための、炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルの使用。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
〔実施例１：トリカプリリンによる腎臓内ＣＫ２阻害作用および腎炎治療効果〕
（１）抗基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎ラットの作製
１０週齢のＳＤラットの腎臓を摘出し、ステンレスメッシュによる篩法を用いて糸球体を分画した。この糸球体画分を抗原としてＮＺＷウサギを免疫し、ウサギ抗ＧＢＭ抗血清を作製した。得られたウサギ抗ＧＢＭ抗血清を７週齢のＷＫＹラットに尾静脈注射し、抗ＧＢＭ抗体腎炎モデルラットを作製した。
【００２５】
（２）トリカプリリン含有エマルションの調製
トリカプリリン（和光純薬）１０００ｍｇ、レシチン（L-alpha-Phosphatidylcholine、Avanti Polar Lipids）３５０ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（N-(Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol 2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、NOF）１４０ｍｇを含有するエマルション１０ｍＬ（粒子径１００〜１２０μｍ）を以下の手順で調製した。なお、粒子径はゼータサイザー（Malvern社製）を用いて動的光散乱法で測定した。
(a) トリカプリリン（和光純薬）に、クロロホルムに溶解したレシチンを加えて混和。
(b) エバポレーターおよびデシケーターを使ってクロロホルムを完全に除去。
(c) 残さに生理食塩水を約５ｍＬ添加。
(d) 得られた乳濁液に対して超音波処理（３０秒×６回）。
(e) ０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過。
(f) ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を約５ｍＬの生理食塩水で溶解し、７０℃の水浴中で３時間保温。
(g) 上記(e)および(f)を混合し、液量を１０ｍＬに調整して、７０℃で９０分間保温。
【００２６】
（３）実験群
以下の４群（６匹／群）を設けた。
(i) トリカプリリン含有エマルション投与群（０．５ｍＬ／匹／日、図中「Ｅｍｕｌｓｉｏｎ」）
(ii) エモジン投与群（２０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＫ２阻害薬、図中「Ｅｍｏｄｉｎ」）
(iii) 生理食塩水投与群（０．５ｍＬ／匹／日、腎炎モデル、図中「（−）」）
(iv) 無処置群（抗ＧＢＭ抗体非投与、図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）
【００２７】
（４）実験手順
７週齢のＷＫＹラットにウサギ抗ＧＢＭ抗血清を尾静脈注射した２４時間後から、被験物質または対照物質を１日１回２週間連続でラットに投与した。トリカプリリン含有エマルションおよび生理食塩水は静脈内投与、エモジンは腹腔内投与とした。最終投与後、尿を採取し、尿中タンパク質量を測定した。また、血液を採取し、血清クレアチニン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、総コレステロール、中性脂肪（ＴＧ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＡＳＴ、ＡＬＴを測定した。また、ラットを安楽死させて腎臓および精巣を摘出し、組織学的検討を行った。
【００２８】
一方、腎臓内のＣＫ２阻害実験は、以下のように行った。
すなわち、摘出した腎臓から皮質を得、ホモジナイズして１０００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離し、上清を得た。総タンパク質量４０μｇの上清をウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットは定法に従って行い、一次抗体には抗ＣＫ２α抗体（Santa Cruz Biotechnoligy）を、二次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnoligy）を用い、検出にはＥＣＬ法（Amersham Biosciences）を用いた。また、内部標準としてＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて検出し、ＧＡＰＤＨの発現量でＣＫ２αの発現量を標準化した。
総タンパク質量１５μｇの上記上清をＣＫ２活性の測定に供した。ＣＫ２活性の測定は、ＣＫ２アッセイキット（Upstate Biotechnology）を用いて行った。
上記皮質から定法に従ってトータルＲＮＡを抽出し、その１μｇをＲＴ−ＰＣＲに供した。以下のＣＫ２α用プライマーセットおよびＧＡＰＤＨ用プライマーセットを用いて、定法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供してＣＫ２αｍＲＮＡ量を確認した。
ＣＫ２αプライマーセット
フォワード 5’-acatcatcacacttgcagac-3’（配列番号１）
リバース 5’-gcaactcggacattatactc-3’（配列番号２）
ＧＡＰＤＨプライマーセット
フォワード 5’-tccgttgtggatctgacatg-3’（配列番号３）
リバース 5’-ggagttgctgttgaagtcac-3’（配列番号４）
【００２９】
（５）統計処理
得られたデータは平均値±標準誤差で示した。また、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いて統計処理を行った。結果を示す図において、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１をそれぞれ表す。
【００３０】
（６）結果
（6-1）腎臓内ＣＫ２阻害作用
図１に腎臓内ＣＫ２タンパク質のウエスタンブロットの結果を示し、図２に腎臓内ＣＫ２活性の結果を示し、図３に腎臓内ＣＫ２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果をそれぞれ示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルション投与群では、腎臓内ＣＫ２タンパク質の発現量が有意に減少し、腎臓内ＣＫ２活性の有意な低下が認められた。また、腎臓内ＣＫ２ｍＲＮＡの発現量も減少していた。
【００３１】
（6-2）腎炎治療効果
図４に尿中タンパク質量の結果を、図５に血清クレアチニンの結果を、図６にＢＵＮの結果をそれぞれ示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルション投与群では、腎炎に伴う尿中タンパク質量の増加、血清クレアチニン値の上昇、ＢＵＮ値の上昇の有意な抑制が認められた。
図７に各群のラットから摘出した腎臓の組織染色像を示した。上段がＰＡＳ染色、中段が抗Ｋｉ６７抗体による免疫染色像、下段が抗ＥＤ−１抗体による免疫染色像である。図中、中段の矢印はＫｉ６７陽性細胞（増殖中の細胞）を、下段の矢印はＥＤ−１陽性細胞（マクロファージ）をそれぞれ示す。また、図８に糸球体３０個あたりの半月体形成数を、図９に糸球体１個あたりの総糸球体細胞数を、図１０に糸球体１個あたりの抗Ｋｉ６７抗体染色陽性細胞数を、図１１に糸球体１個あたりの抗ＥＤ−１抗体染色陽性細胞数を示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルション投与群では、腎組織において糸球体の肥大が抑制され、生理食塩水投与群と比較して糸球体内総細胞数および半月体形成が有意に抑制された。さらに、糸球体における細胞増殖およびマクロファージ浸潤についても、生理食塩水投与群と比較して有意に抑制された。
【００３２】
（6-3）副作用
図１２にＬＤＨの結果を、図１３にＡＳＴの結果を、図１４にＡＬＴの結果を、図１５にＴＧの結果を、図１６に総コレステロールの結果をそれぞれ示した。これらの結果から、いずれの指標についても、トリカプリリン含有エマルション投与群は無処置群と比較して有意な変動が認められず、肝臓に対する毒性を示さないことが明らかとなった。
図１７に、各群のラットから摘出した精巣のＴＵＮＥＬ染色像を示した。図中、矢印はＴＵＮＥＬ染色陽性細胞（アポトーシス細胞）を示す。また、図１８に精細管内のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を示した。精細管内のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞は、精細管内の外周部分を精細管基底膜から２５μｍ内、内側はそれより内腔側にあるものと定義し、１標本あたり６０個の精細管についてＴＵＮＥＬ陽性細胞数をカウントし、１精細管あたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数として表した。図１７および図１８から明らかなように、エモジン投与群は精細管内のアポトーシス細胞の有意な増加が認められたのに対して、トリカプリリン含有エマルション投与群はアポトーシス細胞の増加が認められず、精巣に対する毒性を示さないことが明らかとなった。
【００３３】
〔実施例２：トリカプリリンおよびトリオレイン酸グリセリドによる腎炎治療効果〕
（１）実験群
実施例１と同様に抗ＧＢＭ抗体腎炎ラットを作製し、以下の８群（６匹／群）を設けて、腎炎治療効果を確認した。
(i) トリカプリリン投与群（５０ｍｇ／匹／日、図中「ＴＣ」）
(ii) トリカプリリン・レシチン混合物投与群（トリカプリリン５０ｍｇ・レシチン１７．５ｍｇ／匹／日、図中「ＴＣ＋ＥＧＧ」）
(iii) トリカプリリン・ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００混合物投与群（トリカプリリン５０ｍｇ・ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００ ７ｍｇ／匹／日、図中「ＴＣ＋ＰＥＧ」）
(iv) トリカプリリン含有エマルション投与群（０．５ｍＬ／匹／日、図中「ＴＣ＋ＥＧＧ＋ＰＥＧ」）
(v) トリオレイン酸グリセリド含有エマルション投与群（０．５ｍＬ／匹／日、図中「ＴＯ＋ＥＧＧ＋ＰＥＧ」）
(vi) エモジン投与群（２０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＫ２阻害薬、図中「Ｅｍｏｄｉｎ」）
(vii) 生理食塩水投与群（０．５ｍＬ／匹／日、腎炎モデル、図中「（−）」）
(viii) 無処置群（抗ＧＢＭ抗体非投与、図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）
【００３４】
（２）エマルションの調製
トリカプリリン含有エマルションは実施例１に記載の方法で調製した。トリオレイン酸グリセリド含有エマルションは、トリカプリリントリオレイン酸グリセリドに変更した以外は実施例１のトリカプリリン含有エマルションの調製方法と同様に調製した。トリカプリリン・レシチン混合物は、実施例１のトリカプリリン含有エマルションの調製方法に従い、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を混合していないエマルションとして調製した。
【００３５】
（３）実験手順
実施例１と同様に、７週齢のＷＫＹラットにウサギ抗ＧＢＭ抗血清を尾静脈注射した２４時間後から、被験物質または対照物質を１日１回２週間連続でラットに投与した。エモジンは腹腔内投与とし、その他は静脈内投与とした。最終投与後、尿を採取し、尿中タンパク質量を測定した。また、血液を採取し、血清クレアチニン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。
【００３６】
（４）結果
図１９に尿中タンパク質量の結果を、図２０に血清クレアチニンの結果を、図２１にＢＵＮの結果をそれぞれ示した。これらの結果から明らかなように、トリカプリリン含有エマルションのみでなく、トリオレイン酸グリセリド含有エマルション、トリカプリリン単独、トリカプリリンとレシチンとの混合物、トリカプリリンとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００との混合物についても、腎炎治療効果が認められた。
【００３７】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
【請求項２】
炭素数が１８以下である請求項１に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤を含有する医薬組成物。
【請求項４】
さらに、リン脂質を含有する請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
リン脂質がレシチンである請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
さらに、ポリアルキレングリコールを含有する請求項３〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腎炎治療薬である請求項３〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１】
炭素数６以上の脂肪酸またはその塩またはそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
【請求項２】
炭素数が１８以下である請求項１に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の腎臓内カゼインキナーゼ２阻害剤を含有する医薬組成物。
【請求項４】
さらに、リン脂質を含有する請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
リン脂質がレシチンである請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
さらに、ポリアルキレングリコールを含有する請求項３〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腎炎治療薬である請求項３〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１２−１９７２３９（Ｐ２０１２−１９７２３９Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６１６７９（Ｐ２０１１−６１６７９）
【出願日】平成２３年３月１８日（２０１１．３．１８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人医薬基盤研究所、基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１８日（２０１１．３．１８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人医薬基盤研究所、基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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