腎臓疾患評価用新規バイオマーカー
本発明は、腎臓疾患評価のための代謝バイオマーカーに関し、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを含む。さらに、本発明は哺乳類対象物の腎臓疾患評価の方法に関し、前記対象物から生物試料、好ましくは血液/尿試料を取得し、前記生物試料中の、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを測定することを含む。さらに本発明は前記方法を実施するためのキットを提供する。本発明の具体的なバイオマーカー及び方法を適用することで、より適切なかつ信頼性の高い腎臓疾患評価が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓における病理学的変化、特に前記疾患又は損傷の初期段階での変化により敏感な、腎臓疾患評価のための新規バイオマーカーに関する。さらに、本発明は、哺乳動物における腎臓疾患を診断するための方法及び前記方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボロミクスとは、中間代謝経路の全範囲を表す主要な代謝物を系統的にカバーする低分子量化合物の包括的な定量的測定を意味する。システム生物学的方法においては、これは遺伝子青写真、制御、タンパク質量及び変化及び環境への影響などにより決定される変化の機能的読み出しを与える。大量のメタボライトの分析が可能であるということは、顕在する生物的事象の真の機能的エンドポイントを反映する生物学的情報を抽出することを可能とするものである。これに対してトランスクリプトミクス及びプロテオミクスなどの他の機能的ゲノミクスは非常に有用ではあるが、表現型応答について潜在的な原因を示すに過ぎないものである。従ってこれらは、機能的評価が加えられない限り、前記表現型レべルで、薬物効果、毒性応答又は疾患状態を予期することは必ずしもできるものではない。
【０００３】
メタボロミクスは、特にかかる機能的情報を提示することで、この情報ギャップを橋渡しするものである。というのは生物体液及び組織におけるメタボライトの違いは、種々の表現型応答の最も緊密なリンクを与えるからである。言うまでもないが、適切な技術が費用効果的にこの情報を掘り出しかつ集積するならば、前記生化学的表現型変化は、医薬、バイオテクノロジー及び健康産業の分野における直接の関心事となるものである。
【０００４】
一般に、表現型は遺伝子型から予測できるとは限らない。遺伝子型と表現型とのギャップは、多くの生化学的反応、医薬、栄養及び環境因子などを含む種々の影響に依存して拡大される。
遺伝子から表現型へのこの生体分子の連鎖において、メタボライトは、表現型に最も緊密なリンクを持つ定量化可能な分子である。医薬への毒性応答や疾患罹患率などの多くの表現型及び遺伝子型の状態が、生物液及び組織内の機能的に関連するメタボライトの濃度における差により予想される。
【０００５】
慢性腎臓疾患（CKD)は、細管及び糸球体での進行性の腎臓機能喪失であり、通常非可逆性である。CKDは世界的公衆衛生問題であり、腎不全、心血管疾患及び早死などの合併症を持つ。CDKは異なる原因で生じ得るものであるが、１つの主原因は、糖尿病２型から合併症で、糖尿病性腎症(DN)と呼ばれている。欧州では、約2230万人の人が糖尿病に苦しみ、かつこれらの人々の94.9%が２型の糖尿病であり、これは欧州のほとんどの先進工業国において末期腎疾患(ESRD)の原因となっている（HaHetal.2008)。ESDRの３分の１の患者が糖尿病であり（WolfG.&RitzE.2003)、かつ最近のデータで、２型糖尿病の患者でESRDの疫学的増加が示されており、最もあり得る原因は高血圧及び冠状動脈性心臓病の治療がより進み、これにより多くの患者が腎症及びESRDを発症するに十分に生存することとなったからである(SampanisCh.2008)。アメリカ合衆国では、ESRD治療の年間コストは、1995年から2010年へ、118億USドルから283億USドルへ、2倍以上となると予想される。この経済的ファクタは欧州では詳しくは研究されていない(Massi-BenedettiM&CODE-2AdvisoryBoard2002)が、２型糖尿病の費用(CODE-2)研究では、糖尿病治療の費用への糖尿病合併症の大きさが評価された。この研究は、合併症のない患者は年間の治療費用が約1505EURであり、細小血管合併症を持つ患者は年間治療費が2563EURとなり、これは70%の増加を示す(WilliamsRetal.2002)。世界をリードする独立医学雑誌は最近、ほぼ50万人の大人を含む長期間研究において次のことを報告している。即ちほとんど全ての対象者は自分の疾患にCKDの後期段階になるまで気づかなかった、ということである。CDKは初期段階では処置可能であり予防され得るものである(WenCPetal.2008)と考えられていることから、より早い段階で検出して糖尿病２型の患者が合併症を起こさないようにすることが、公衆衛生システム及び患者個人の両方にとって、して医療費用を低減することとなるであろう。
【０００６】
腎臓は身体の適切な機能、例えば老廃生成物及び毒物を濾過して除き、ホメオスタシスを維持しかつホルモンを生産するなどの機能を維持する機能を持つ。この腎臓機能を正しく維持するために、血液が腎臓の糸球体膜でろ過される速度が制御されねばならない。高い糸球体濾過速度(GFR)が、水及び溶質の細胞外レベルを安定にかつ最適に維持するために必要である(BoronWF、&BoulpaepEL.2003)。このGFRは、血清クレアチニンクリアランス、年齢、民族及び性から計算され、５つの段階にCKDを分けて使用されている。ここで最後の２段階が最終腎臓疾患（ＥＳＲＤ）であり、透析又は移植が生存のためには必要とされる。
【０００７】
よく知られていることは、腎臓機能障害の診断及び治療が早いほど、残りのネフロンが維持され、それにより進行が抑制される可能性が大きくなる、ということである。
【０００８】
腎臓疾患診断の従来のマーカーにはGFR、クレアチニン及びアルブミンが含まれる。
【０００９】
GFRは、非常に初期段階で増加した後、症状が現れる前に減少する。GFRの測定に伴う欠点は、コストが高いこと及び通常の実験室でのモニターとは適合性ではないということである。血清クレアチニンは上記のようにGFRを計算するために最もよく使用されるマーカーであるが、しかしシスタチンCが、さらに緩やかなGFR減少を検出することができるより高感度のマーカーとして提案されてきた(Herget-RosenthalSetal.2007)。欠点は、シスタチンCについては標準方法も均一なキャリブレーション用材料も存在しないということであり、さらに、限界として、高グルココルチコイド投与の甲状腺機能障害と、潜在的な血管疾患の存在によりシスタチンCへの影響である。これらの単一マーカーの限界により、正確に医学的結論を導くために、GFR推定値に完全に依存することは示唆されていない。腎臓疾患の他、年齢がGFRに影響を与える２番目の最大ファクタである。従って、GFRの緩やかな減少は、必ずしも腎臓損傷によるのではなく、年齢のためであり得る。また、GFRの減少が、慢性腎臓疾患によるとは限らない。GFRも測定はまた不便であると考えられ、通常腎臓機能は血清クレアチニン濃度に基づいて求められる。
【００１０】
血清クレアチニンは、長い間、障害腎臓病を検出するため、及びGFRを計算するために使用されてきた(StarR.etal.2002)。クレアチニンは、筋肉代謝からのクレアチニンリン酸エステルの分解生成物であり(BarrDB.etal.2005)、その日毎の形成量は筋肉量に依存するが、血漿中濃度は個人について非常に一定している。血清クレアチニン濃度は、年齢、性、民族及び体格などのファクタに影響され、従ってクレアチニンクリアランスの測定が通常実施される。身体からクレアチニンのクリアランスは、腎臓の糸球体によるろ過で行われるが、クレアチニンは尿細管により血液から積極的に分泌される。この速度は遺伝及び生物的ファクタに依存し、例えば性別及び年齢などであり、これはGRFの15〜20％の過大評価となる。従って、クレアチニンは、特に子ども又は高齢者には非感受性マーカーと考えられている。またクレアチニンの他の欠点は、これは後段階の腎臓損傷のみ検出するということである。
【００１１】
アルブミンは最も豊富な血漿タンパク質であり(BasiS、etal.2008)、腎臓の構造的障害が尿中に分泌されるアルブミンの増加、30〜300mg/24時間に反映され得るものであり、これは微量アルブミン症と呼ばれる。微量アルブミン症は糖尿病の発症後数年で発症し15〜20年後の微量アルブミン症に進展し、尿中のアルブミン濃度が300mg/24時間を超えるものである。アルブミン症が見られることは、糖尿病性腎症の顕著な特徴であり、通常は試験紙法で測定される。腎臓障害のマーカーとしてのアルブミンは、いくつかの欠点がある。第１に数年前まで、近位尿細管で最吸収されない尿中アルブミンはその形で分泌されると信じられてきたが、しかし実際にはアルブミンはその形及びアルブミン誘導ペプチド（これは試験紙法では検出されない）の混合物として分泌され、かつ試験紙法では検出されない他の種類のアルブミンも分泌されるからである。
これは偽陰性試験結果を与える余地がある(ComperWD.&OsickaTM.2005)。第２にアルブミンは既存の腎症の証拠であって、予期のための優れたバイオマーカーではないということである。微量アルブミン症の現れる前に糖尿病性腎症が検出されるならば、治療としてはCKDを予防するか又は進行を防止する可能性があり得る。アルブミン症の測定は腎臓障害の全ての患者を同定することはできない。
【００１２】
２つのメチルアルギニン異性体であり、対称ジメチルアルギニン(SDMA)及び非対称ジメチルアルギニン(ADMA)について腎臓疾患に関して集中的に研究されてきた(FleckCetal.2001)。これらは、転写後にタンパクアルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)により変性されたアルギニン残基により形成され、通常は身体中で代謝されず、ADMAは酸化窒素合成酵素(NOS)の外部インヒビターとしての可能性のため生物学的に重要である。というのはADMA濃度の増加はNO合成の減少を起こし、従って障害性の内皮機能をもたらすことを意味するからである。ADMAの蓄積は、これまでずっと、高血圧、免疫不全及びCKDに関与する特徴に寄与すると信じられてきた。さらに動物実験では、実験的に誘導された慢性NOS抑制は、全身性の糸球体の高血圧、糸球体虚血、糸球体硬化症、尿細管間質性障害及びタンパク尿の原因となることが示されている(ZatzR&BaylisC、1998)。SDMAはADMAよりもむしろ多く、CKD患者で有意に増加することがまた見出されている。
【００１３】
さらに、アシルカルニチンはCKDと関連付け（リンク）されてきた(FougueDetal.2006)。遊離アシル化の増加がCKD患者の血清中に見出され、これは障害を受けた腎臓の分泌機能が低下したことからである。
【００１４】
さらに酸化ストレスは、長年腎臓疾患の進展に関係づけられてきた(LoughreyCM.etal.1994、HaHetal.1995)。いくつかの研究によると、高血糖症による酸化ストレスの増加は、糖尿病の微小血管及び大血管の両方の合併症の原因であることが述べられている(SakaneNetal.2008)。酸化ストレスはグルコース及び脂肪酸の過剰から始まり、これらの物質がミトコンドリアに代謝のために輸送される際に電子伝達系からの電子が外れ得る。メチオニンスルホキシドは、活性酸素種（ROS、MashimaRetal.2003)による酸化の最も直接的インジケーターの１つであるが、これまで腎臓疾患のバイオマーカーとして実施されてきたことはない。さらに腎不全でのクエン酸回路中間物の役割については、クエン酸、フマル酸及びマレイン酸がCKDを持つ患者中に有意に増加することについて研究されてきた。
【００１５】
CKDを持つ患者においては、腎性代謝の変化は全身及び腎性アミノ酸代謝に変化を及ぼすように見える。通常の状態ではわずかの限られた量のアミノ酸のみが尿と共に分泌される。フェニルアラニンからチロシンへの変換に障害があることは、これらの患者にフェニルアラニンの蓄積をもたらすことが観察されてきた。さらに、障害性腎臓はアルギニンの生成に影響を与え、臨床及び動物研究の両方において、腎性アルギニン合成における低下を伴うことが知られている。また進行したCKD患者で、シトルリンの腎性取り込みの減少及び、タウリン、オルニチン、アラニン、チロシン及びリジンの放出が見られた。さらにシトルリンからアルギニンへの変換が低下するように見える。
【００１６】
さらに、トリプトファン代謝がCKDの発症の関わっているとの示唆もされている。腎臓でのこの経路での速度限定酵素は、インドールアミン-２、３-ジオキシゲナーゼ(IDO)であり、これはトリプトファンをN-ホルミル-キヌレニンに変換し、これが代謝されてキヌレニン及びその後ヒドロキシキヌレニンへ異化される。IDOの活性増加は、トリプトファンの枯渇を説明するために以前の研究で観察されている。
【００１７】
糖尿病及びDN患者の血清中に、C-反応性タンパク質、インターロイキン６、インターロイキン18、腫瘍壊死因子(TNF)-αなどの炎症マーカーが増加し、またフェチュインが減少することが観測されている。これは、疾患の非常に初期の段階で生じ、アルブミン症の程度と関連する。
【００１８】
CKDＭ又はDNの診断のための知られたバイオマーカーには例えば、いくつかのポリペプチドマーカー(US2006286602Al、CA2473814A1、EP1972940Al、US2009081713Al)が含まれ、異なる分子質量及び移動時間を持つものであり、例として慢性腎不全遺伝子-1a(CRFG-1a)ポリペプチド(JP11069985A、JP11069984A)であり、同様にポリペプチドマーカー(JP2003235573A、JP2004187620A)である。
【００１９】
上記のシスタチンCは、ホロ-及びアポ-レチノール結合タンパク質(RBP)、タム-ホルスホール-タンパク質(THP、(DE10327773Al)の他に、腎臓疾患を診断するために使用される全てのマーカーの１つである(JP11064333A)。前記マーカーには、カルビンジンD-28k(大EF-ハンドファミリのｈ１つのカルシウム-結合タンパク質ファミリ)、腎臓障害分子-1(Kim-1、細胞外6-システイン免疫グロブリンドメイン、タイプ1膜タンパク質)、アルファ-2uグロブリン関連タンパク質(アルファ-2u、これはまた人リポカリン2(LCN2)又は好中球ジェラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)(好中球の顆に保存される）として知られている）、オステオポンチン(OPN、これはまた分泌性ホスホタンパク質1(SPP１、分泌性、高酸性及びグルコシル化ホスホタンパク質、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD)細胞接着モティーフを持つ)として知られている）、血管内皮細胞増殖因子(VEGF、血管生成、血管透過性を促進し、単球の走化性に寄与し、及び尿病、障害治癒炎症応答及び組織再生に役割を果たすものとして知られている(WO2008116867Al)）、N-アセチルムラモイル-L-アラニンアミダーゼ前駆体、アジポネクチン、AMBPタンパク質前駆体(アルファ-1-微小グロブリン)、C4b-結合タンパク質アルファ鎖前駆体、セルロプラスミン前駆体、相補C3前駆体、相補成分C9前駆体、相補因子D前駆体、アルファ-1B-グリコタンパク質、ベータ-2-グリコタンパク質I前駆体、ヘパリン補因子II前駆体、鎖C領域タンパク質、ロイシン豊富アルファ-2-グリコタンパク質前駆体、色素上皮誘導前駆体、血清レチノール結合タンパク質前駆体及び転写開始因子3サブユニット10(EP1905846A2)が挙げられる。
【００２０】
抗原、サイトトキシン及び細胞成長インヒビターがバイオマーカーとして使用され得る(WO2008101231A2)。線維芽細胞増殖因子23(FGF-23)及びアジポネクチンが、慢性腎臓疾患を予期するマーカーとして、それぞれ又は組み合わせて有望であることが見出された(WO2008089936A1)。腎臓疾患又はその素因を診断しモニターするための他の方法は、ヒッペルリンドウ腫サプレッサー(pVHL)、CXCケモカインレセプター4(CXCR4)、インテグリンβ-1、血小板由来増殖因子アルファペプチド(PDGF-A)、低酸素誘導因子1アルファ(HIF1アルファ)及び/又は対象者からの試中の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)が挙げられる(US2008/0038269A1)。
【００２１】
記載された他の方法は、腎臓線維症及び関連する腎臓障害、特に糖尿病、高血糖及び高血圧に関連する合併症の存在及び進展を決定するために、試料中の結合組織成長因子のレベルの測定である(US2004/0224360A1)。
【００２２】
ゲノミクスの分野では、腎臓疾患評価のためのいくつかのバイオマーカーがある。１つの発明は、臨床的又は科学的対象細胞中でのみ発現される遺伝子の同定が含まれ、例えば、糸球体上皮細胞又は近位尿細管などである(CN1863928A)。人白血球抗原(HLA)マーカーHLA-A11、HLA-DR9及びHLA-DQA1*0302は全て、糖尿病及び腎症の予期マーカーである(CN101294215A)。トロンボスポンジンタイプ１モチィーフ-4、アグレカネーズ-1(ADAMTS4)と共にディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼが、遺伝子カルビンディン-D28k、KIM-1、ＯＰＮ、EGF、クラステリン、VEGF、OAT-K1、アルドラーゼA、アルドラーゼB、ポドシン、アルファ-2u、C4(EP1925677A2)及びセラミドグルコシルトランスフェラーゼ(CGT)(WO03057874A1)と同様に、CKDの血液バイオマーカーとして有用であることが見出された(WO2009002451A2)。
【００２３】
RNAマーカーはまた腎臓疾マーカーとして使用される(EP2058402(A1)。例えば、腎臓RNAマーカーには、腎近位尿細管の上皮細胞に発現する腎臓特異的アンドロゲン制御タンパク質(KAP)、腎障害分子-1(KIM-1)、腎臓近位尿細管上皮細胞に発現する膜タンパク質、虚血性障害及び腎毒性処置後の腎臓に誘導発現されるヘパリン-結合性上皮成長因子(GB-EGF)、線維芽成長因子1(EGE-1)、腎毒性処理の後誘導されるケラチノサイト成長因子(FGF-7)及びFGF-7レセプターFGFR2IIIb、水チャンネルタンパク質アクアポリン1、2及び3（腎臓に多く発現される）、タム-ホルスファールグリコタンパク質（腎臓上皮細胞に発現され、ヘンレのループの厚い上昇部と腎臓の遠位包旋細管に局在し、最後には初期の成功応答遺伝子(Egr-1)を発現）、プロトオンコジーン(c-fos)及びストレス応答遺伝子(hsp70)（腎臓の虚血性障害後に活性化される）、が挙げられる。
【００２４】
腎臓疾患評価のために従来技術に記載される他の方法は、尿中のプロテアーゼ活性を２以上の物質について測定し、前記物質に対する前記プロテアーゼ活性のパターンを分析すること(WO2008001840A１)、又は人の触媒鉄の測定(US2007238760A1)を含む。
【００２５】
腎臓疾患評価のためのいくつかの示唆されるバイオマーカーがあるけれども、記載されたもの及び特に今日臨床で使用されているものは感度が十分ではなく疾患の最後の段階においてのみ検出され得るものである。従って現時点においてもなお、腎臓の病理学的変化、特に疾患または障害の式の段階での変化に敏感なマーカーへの要求が存在する。
【００２６】
アルブミンやクレアチンなどの上記マーカーは、糖尿病患者の腎症へのリスクを見出すために使用されてきたが、最重要課題は、新規なより敏感なバイオマーカーであって、糖尿病性腎症をより早い段階で予期又は検出ができ、予防治療を実施するか、又は最終的にはESDRとなる腎臓の障害の進展及びその関連する合併症を少なくとも遅くすることのできるバイオマーカーを見出すことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
従来技術に存在する上記問題点に鑑みて、本発明の課題は、腎臓疾患評価のための新規バイオマーカーを提供することであり、前記バイオマーカーは、腎臓の病理学的変化、特に疾患又は障害の初期段階での変化に対してより敏感なマーカーを提供することである。
【００２８】
最適には、前記マーカーは、血液及び/又は尿などの生物試料中で容易に検出され得るものであり、そのレベルが常に腎臓の障害に関連し、そのレベルが変化するものである。さらに、本発明の課題は、生物試料中の腎臓疾患評価のための方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の課題を解決するため、本発明者はメタボロミクスの研究に基づいた。これは腎臓の疾患の際に生じる生化学的変化についての知見を与え、いくつかのかつ強力なより優れたバイオマーカーを与える可能性のあるものである。事実、腎臓は特に代謝活性器官であり、メタボライト（代謝物）が身体のその機能に依存して分泌されたり、再び吸収されたりする。従って、腎臓疾患について代謝的バイオマーカーを持つことは重要な改良であると思われ、またこれにより腎臓機能およびそこでの生化学反応についてより情報を与えるものであると思われる。本発明発明者は次の知見を得た。すなわち、従来技術におけるような単一のマーカーを適用するよりは、腎臓疾患の進展につれ変化される１群のメタボライトを用いることで、全ての関与する経路及び反応機構のより全体的な理解が得られる、ということである。
【００３０】
従って本発明は、添付の特許請求の範囲に記載にされるように、腎臓の病理学的変化、特に疾患又は障害の初期段階での変化の評価のために適した新規なバイオマーカー（即ち、新規バイオマーカーセット）を提供する。さらに、本発明はまた、哺乳類対象体で腎臓疾患評価のための方法を提供し、同様に前記方法を実施するためのキットを提供する。
【００３１】
本明細書で以下の図１から14が参照される。これらの図は、進行中の腎臓疾患で本発明のメタボライトバイオマーカーの増加又は減少の例を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、糖尿病及び非糖尿病でのCKDの段階３〜５での、対称的ジメチルアルギニン(SDMA)比に関するものであり、段階５患者は、段階３及び段階４の患者に比較して、高度に有意(p<<0.01)な前記比を持つことを示し、これはSDMAがCKDの進展についての優れたバイオマーカーであることを示唆している。
【図２】図２は、CKDの段階３〜５でのSDMA比に関するものであり、段階５の患者は段階３及び段階４の患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることが分かる。
【図３】図３は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのSDMA/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３及び段階４の患者に比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、これは、SDMA/アルギニン比がCKDの優れたバイオマーカーであることを示唆する。前記比は、SDMA/アルギニンがタンパク質アルギニン-メチルトランスフェラーゼIIの増加活性の予期マーカーであることを示し、さらにそれを反映するものであることを示す。
【図４】図４は、CKD段階３〜５でのSDMA/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３及び段階４の患者に比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかる。SDMAは、タンパク質アルギニン-メチルトランスフェラーゼIIの増加活性の予期マーカーであることを示し、さらにそれを反映するものであることを示す。
【図５】図５は、糖尿病及び非糖尿病のCKDの段階３〜５でのアシルカルニチングルタルカルニチンのボックスプロットに関するものであり、グルタルカルニチンがCKDの最終段階で増加することを示す。
【図６】図６は、CKD段階３〜５でグルタルカルニチンのボックスプロットを示す。
【図７】図７は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのシトルリン/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３及び段階４の患者に比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、前記比は、尿サイクルでの酵素活性が変更されたことを示す。
【図８】図８は、CKD段階３〜５でのシトルリン/アルギニン比のボックスプロットに関する。
【図９】図９は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのオルニチン/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３の非糖尿病患者のみに比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、このバイオマーカーが、腎臓疾患の異なる種類間で異なる診断を行うために重要であることを示す。
【図１０】図１０は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのメチオニンスルホキシド/メチオニン比のボックスプロットに関するものであり、この酸化ストレスマーカーは、段階５の患者は段階３の患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかる。
【図１１】図１１は、CKD段階３〜５でのメチオニンスルホキシド(MetOS)/メチオニン(Met)比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は段階３の患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、MetSO/Met比がCKDの進展のための優れたバイオマーカーであることを示唆する。
【図１２】図１２は、CKDの段階３〜５でのフマル酸のボックスプロットに関するものであり、初期段階では全くフマル酸が存在せず、従ってフマル酸は定量マーカーとして作用することを示す。
【図１３】図１３は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのアルファケトグルタル酸のボックスプロットに関するものであり、段階５の糖尿病患者は段階３の糖尿病患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかる。
【図１４】図１４は、CKD段階３〜５でのアルファケトグルタル酸のボックスプロットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の特定の（セットの）バイオマーカー及び方法を適用することにより、より適切かつ信頼性のある腎臓疾患の評価が可能となる。本発明の「評価」とは、前記疾患の発症の診断及び進展のモニター、特に前記疾患の異なる段階での検出およびマーキングを意味する。本発明は、腎臓疾患をより改良された形でかつ前記疾患のより早い段階で予期し診断することを可能としさらに前記腎臓での病理学的変化をより敏感に検出することを可能とするものである。実際、本発明のバイオマーカーは、生物試料中、特に血液及び/又は尿試料中で容易に検出され、それらのレベルは一貫して腎臓疾患/障害の程度に関連し、そのレベルが変化するものである。
【００３４】
さらに、評価することにはまた、これらのマーカーが動物モデル又は第I相臨床試験での腎毒性評価にも適しているという事実を含むべきである。言い換えると、これらはまた、前臨床及び臨床腎毒性を評価するために適している。即ち、医薬開発の初期段階でのいわゆる動物モデル又は第１相臨床試験においてである。
【００３５】
一般にバイオマーカーは、２つ以上の生物的状態をお互いに区別可能とするための有用な道具であり、通常の生物的プロセス、病理学的プロセスのインジケーターとして、又は医薬処置への反応として作用するものである。メタボライトは低分子量化合物(<1kDa)であり、ほとんどのタンパク質、DNA及び他のマクロ分子よりも小さい。タンパク質の活性の僅かな変化が、生化学反応中で大きな変化となり、それらのメタボライト（＝代謝バイオマーカー、身体の代謝系）、その濃度、フラックス及び移動機構が、疾患及び薬物処置に敏感である。これにより、遺伝的因子及び栄養、生理活性、消化管ミクロバル(microbal)及び医薬などの環境的因子を反映する、生理学的及び病態生理学的物質の個々のプロフィールを得ることを可能とする。従って、代謝バイオマーカーは、バイオマーカーであるが代謝バイオマーカーではないタンパク質やホルモンなどよりもより包括的な情報を与える。
【００３６】
その観点で、用語「代謝バイオマーカー」とはここでは、腎臓疾患状態特にCKDを示すインジケーターとして、適する化合物を意味し、哺乳動物体内での代謝プロセスの際に生じるメタボライト（代謝物）又は代謝化合物を意味する。用語「代謝バイオマーカー」はまた、酵素反応に応じて生成物/基質比をまた含むことが意図されている。
【００３７】
本発明により測定される代謝バイオマーカーは次のクラスのメタボライト（即ち分析物）を含む：少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンである。これらのクラスの定義は当業者には知られているが、好ましい物については以下表１〜３にまとめられている。さらに、生物アミンとは、天然アミノ酸の酵素的脱カルボン酸により誘導される天然に存在する生物活性化合物として理解されるべきである。生物物質は、生命プロセスにより与えられる物質であり、前記生物アミンアミン基を含む。それらのほとんどは神経伝達物質として作用するが、例えば血圧及び体温調節に活性を有するものがある。
【００３８】
驚くべきことに、これらのクラスの１組のメタボライトを測定することで、初期の段階で改良された方法で腎臓疾患を予期し診断することを可能にする、ということを見出した。特に、腎臓の病理学的変化をより敏感に検出することができるということである。このグループの１つのクラスのメタボタイトが除外されるか、その数が低減されると、腎臓疾患評価はより敏感でなくなり信頼のないものとなろう。これは特に、この疾患の初期段階で適用され得るものであり、かかる段階では知られたバイオマーカーを用いて知られた方法によっては信頼性ある検出ができなかった。実際、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを同時に測定することは、腎臓疾患、特に段階１〜３また段階４及び５でのCKD及びDNのより信頼性にある診断を可能とする。かかる事実は従来技術においてはこれまで一切記載されていないものでる。
【００３９】
好ましくは前記バイオマーカーセットはさらに酵素反応についての生成物/基質の比を含み、より好ましくはSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比を含む（添付の図）。SDMA/アルギニン比は酵素タンパク質アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ(PRMT)に関連し、シトルリン/アルギニン比は酸化窒素シンターゼ(NOS)と関連し、オルニチン/アルギニン比はアルギネースに関連し、またメチオニンスルホキシド/メチオニン比は活性酸素種(ROS)による酸化に関連する。さらにこれらの比を測定することで、本発明のバイオマーカーセット及び方法の診断機能はさらに改良され得る。
【００４０】
より好ましくは、本発明のバイオマーカーセットはさらに、ポリアミン、ホスファチジルコリン、還元単糖及びオリゴ糖（糖）、スフィンゴミエリン、アイコサノイド、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物を含む群から選択される１以上のメタボライトを含む。これらのクラスの好ましい例は表４〜９に挙げられる。また、さらにこれらのクラスのメタボライトを測定することで、本発明によるバイオマーカーセット及び方法の診断性能はさらに改良され得る。
【００４１】
特に好ましくはバイオマーカーセットは、アミノ酸が、Cit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、GIn、Ser、Val、Glu及びProからの１つであり、アシルカルニチンは、C0、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:1及びC18:1から選択されるものであり、生物アミンは、MetSO、クレアチン、SDMA、ADMA、全DMA及びセレトニンから選択されるものであり、前記比は、SDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比から選択されるものである。
【００４２】
上記のように、評価される疾患は腎臓疾患である。好ましくは慢性腎臓疾患(CKD)、より好ましくは糖尿病性腎症(DN)である。生物試料は、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、ギニアピッグ、犬、ミニピッグ又はヒトである。生物試料は好ましくは血液又は尿試料であるが、全ての他の生物使用で当業者に知られたものであり、本発明による測定が可能であるものは適したものである。従って、本発明の方法は、インビトロ方法である。生物試料のメタボライト濃度の測定のために、クロマトグラフ、スペクトロスコピー及びマススペクトルなどの定量分析方法が適用され、特にマススペクトルの使用が好ましい。クロマトグラフには、GC、LC、HPLC及びUPLCが含まれ、スペクトロスコピーにはUV/VIS、IR及びNMRが含まれ、さらにマススペクトルにはESI-QqQ、ESI-QqTOF、MALDI-QqQ、MALDI-QqTOF及びMALDI-TOF-TOFが含まれる。好ましくは、FIA及びHPLCタンデムマススペクトルの使用である。これらの分析方法は一般的に当業者に知られている。
【００４３】
目標とされるメタボライト量の測定のために、メタボロミクスが生物試料中のメタボライトを定量化するために使用される。これには、アミノ酸、生物アミン、ポリアミン、アシルカルニチン、ホスファチジルコリン、還元単糖及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、アイコサノイド、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物の分析物クラスを含む。エネルギー代謝中間物には、ホスホリル化糖、１価、２価及び３価有機酸及び核酸が含まれることを理解されるべきである。しかし、本発明によれば、測定されるメタボライトにはとりわけ、アミノ酸、アシルカルニチン及び生物アミンが含まれる。定量化は、同位体ラベル化内部標準を用いて実施され上記方法で決定される。
本発明による測定されるべきメタボライトとして適するものが略語（BCコード）も含めて分析ブウtのリストが次の表に含まれる。
表１：アミノ酸（μM)
【００４４】
【表１】
表２：アシルカルニチン（μM)
【００４５】
【表２ａ】
【００４６】
【表２ｂ】
表３：生物アミン（μM)
【００４７】
【表３】
表４：ホスファチジルコリン（μM)
【００４８】
【表４ａ】
【００４９】
【表４ｂ】
【００５０】
【表４ｃ】
表５：スフィンゴミエリン（μM）
【００５１】
【表５】
表６：プロスタグランジン（ｎM)
【００５２】
【表６】
表７：糖（μM)
【００５３】
【表７ａ】
【００５４】
【表７ｂ】
【００５５】
【表７ｃ】
【００５６】
【表７ｄ】
表８：胆汁酸(nM)
【００５７】
【表８】
表９：エネルギー代謝からのメタボライト(μM)
【００５８】
【表９】
さらに、本発明はまた、本発明を実施するために適合されたキットを提供するものである。前記キットは、１以上のウェルと、１以上の内部標準を含む１以上のインサートを含む装置を含む。かかる装置はWO2007/003344及びWO2007/003343に記載されており、これらの内容は参照されて本明細書の一部となる。
【００５９】
以下の実施例はさらに本発明を詳細に説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
実施例
腎臓疾患の異なる段階における比較を行った。また糖尿病性腎症と他の慢性腎臓疾患との比較を行った。
【００６１】
一般的情報：
６コホート、CKD段階３〜５（前記公式段階１〜３はすべてここでは段階３として含む）であるCKDを持つ糖尿病とCKD段階３〜５であるCKDを持つ非糖尿病の尿(57)と血漿(76)試料をそれぞれMontpellier大学病院で収集した。標的メタボロミクスを用いて、血漿からの約320のメタボライト及び約300の尿からのメタボライトが定量化された。前記メタボライトには、次のクラス、即ちアミノ酸、生物アミン、ポリアミン、アシルカルニチン、フォスファチジルコリン、還元単及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、アイコサノイド、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物（上で定義された）を含み、これには同位体ラベル化された内部標準が含まれる。これらを、Sciex4000QTrapを電子スプレーイオン化と共に用いてFIA及びHPLCタンデム質量分析装置（多重反応モニター(MRM)付き）により決定した。
【００６２】
さらに、血漿中の160の脂肪酸をGC-MS/MSにより定量化した。かかるデータベースは教師なし主成分分析(PCA)及び教師付き部分細小二乗区別分析(PLS-DA)をMarkerViewsoftware(LifeTechnologies)を用いて行った。
【００６３】
分析P/U及びU：
分析は、血漿及び尿が利用可能（即ち57；「分析P/U」）及び血漿試料のみ使用（即ち76;「分析P」の両方の患者について行った。従ってマーカーは血漿及び尿の組み合わせとして作用し得るが、また血漿中でのみ測定され得ることをも示している。異なる比較がCKDのバイオマーカー評価のために行われた。しかしまた、糖尿病性腎症及び他の腎臓疾患との間の違いを区別され得るかを調べるためにも比較された。従って、かかる比較は、全ての患者についてCKDの初期段階及び遅い段階での間で行われた。さらにまた、糖尿病性及び非糖尿病性との間においても比較がなされた。
【００６４】
用語の定義：
(1) アップ、ダウンレギュレーション：アップレギュレーションは、メタボライトの濃度が増加することを意味する。例えば、この生化学反応が例えば酵素活性の変化により生じる速度の増加を意味する。ダウンレギュレーションは、その逆である。
(2)ｔ-テスト：ｔ−テストは、統計的仮設のテストであり、使用した１つは前記MarkerViewsoftwareに組み込まれており、前記表に含まれた全ての変数へ適用し、それぞれのグループの標準偏差及び試料数が与えられ有意の差があるかどうかを決定するものである。例えば、２つの異なるグループ間の平均（平均値）間に実際の相違があるかどうかを調べることである。
（３）p-値：ｐ-値とは、帰無仮説（相違なし又は効果なし）を仮定して、実際の観察されたものと少なくとも同じ極端となる結果が得られる確立である。p-値は常に正の値であり、変化が生じる確立が小さいほど、その値は小さくなる。p-値0.05未満では前記帰無仮説を5%レベルで棄却する。これは前記変化の時間のほんの5%のみが生じる可能性があるということを意味する。これがここでの表で設定されたレベルである。
(4) 対数倍変化：体数倍変化とは、それぞれの状態での平均の対数変換濃度間の違いとして定義される。これは、１つのグループと他のグループでの値がどの程度大きいか小さいかを記述する方法である。例えば、0.3の対数倍変化とは、コントロール（健康グループ）に比べてexp(0.3)=1.34倍の増変化に「等しい」。さらに、0.3の対数倍変化は、前記コントロールに比べてexp(-0.3)=0.74=（1/1.34)倍の変化に「等し」く、又は前記疾患に対して1.34の減少変化に等しいことになる。
【００６５】
結果：
前記記載の測定結果は以下の表10〜27にまとめた。
表10〜18は、「分析P/U」及び表19〜27は「分析P」に関する。この表で、ｐ-値はMarkerViewSofwareを用いて標準のｔ−テストを行って得られた値である。正の対数倍は、より高い段階でのメタボライトのアップレギュレーションを表し、逆もそうである。略語は：D、糖尿病性；ND、非糖尿病性；AC、アシルカルニチン；SU、糖；BN、生物アミン；SM、スフィンゴミエリン；TFA、合計脂肪酸；FFA、遊離脂肪酸；PC、フォスファチジルコリン；OA、有機酸；BN、生物アミンである。
【００６６】
「分析P/U」
表１０：CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００６７】
【表１０ａ】
【００６８】
【表１０ｂ】
表１１：CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００６９】
【表１１ａ】
【００７０】
【表１１ｂ】
表１２：CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７１】
【表１２ａ】
【００７２】
【表１２ｂ】
【００７３】
【表１２ｃ】
表１３：糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７４】
【表１３】
表１４：：糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７５】
【表１４】
表１５：糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７６】
【表１５ａ】
【００７７】
【表１５ｂ】
表１６：非糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７８】
【表１６ａ】
【００７９】
【表１６ｂ】
表１７：非糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８０】
【表１７ａ】
【００８１】
【表１７ｂ】
表１８：非糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８２】
【表１８ａ】
【００８３】
【表１８ｂ】
分析「P」
表１９：CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８４】
【表１９ａ】
【００８５】
【表１９ｂ】
表２０：CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８６】
【表２０ａ】
【００８７】
【表２０ｂ】
【００８８】
【表２０ｃ】
【００８９】
【表２０ｄ】
表２１：CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９０】
【表２１ａ】
【００９１】
【表２１ｂ】
【００９２】
【表２１ｃ】
表２２：糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９３】
【表２２】
表２３：糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９４】
【表２３ａ】
【００９５】
【表２３ｂ】
表２４：糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９６】
【表２４】
表２５：非糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９７】
【表２５ａ】
【００９８】
【表２５ｂ】
表２６：非糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９９】
【表２６ａ】
【０１００】
【表２６ｂ】
【０１０１】
【表２６ｃ】
【０１０２】
【表２６ｄ】
表２７：非糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【０１０３】
【表２７ａ】
【０１０４】
【表２７ｂ】
【０１０５】
【表２７ｃ】
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、改良された方法で、前記疾患の初期段階で腎臓疾患を予測しかつ診断することを可能にし、かつ前記腎臓での病理学的変化についてより敏感に検出することを可能とする。
事実、本発明のバイオマーカーは生物試料中、特に血液/尿中で容易に検出可能であり、かつそれらの濃度が、腎臓疾患/障害の程度に応じて常に関連し、それに応じて変化するものである。
さらに本発明のバイオマーカーは、動物モデル又は臨床試験第１相で、腎毒性を適切に評価することができるものである。
言い換えると、これらはまた、全臨床及び臨床腎毒性を評価する上で適するものである。即ち、医薬開発の初期段階、動物モデル実験段階又は臨床試験第１相段階である。
これらに基づき、腎臓疾患/障害、特にCKD及びDNの発症をより信頼性高く診断し、その進展をモニターするために適したキットを製造することが可能となる。
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓における病理学的変化、特に前記疾患又は損傷の初期段階での変化により敏感な、腎臓疾患評価のための新規バイオマーカーに関する。さらに、本発明は、哺乳動物における腎臓疾患を診断するための方法及び前記方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボロミクスとは、中間代謝経路の全範囲を表す主要な代謝物を系統的にカバーする低分子量化合物の包括的な定量的測定を意味する。システム生物学的方法においては、これは遺伝子青写真、制御、タンパク質量及び変化及び環境への影響などにより決定される変化の機能的読み出しを与える。大量のメタボライトの分析が可能であるということは、顕在する生物的事象の真の機能的エンドポイントを反映する生物学的情報を抽出することを可能とするものである。これに対してトランスクリプトミクス及びプロテオミクスなどの他の機能的ゲノミクスは非常に有用ではあるが、表現型応答について潜在的な原因を示すに過ぎないものである。従ってこれらは、機能的評価が加えられない限り、前記表現型レべルで、薬物効果、毒性応答又は疾患状態を予期することは必ずしもできるものではない。
【０００３】
メタボロミクスは、特にかかる機能的情報を提示することで、この情報ギャップを橋渡しするものである。というのは生物体液及び組織におけるメタボライトの違いは、種々の表現型応答の最も緊密なリンクを与えるからである。言うまでもないが、適切な技術が費用効果的にこの情報を掘り出しかつ集積するならば、前記生化学的表現型変化は、医薬、バイオテクノロジー及び健康産業の分野における直接の関心事となるものである。
【０００４】
一般に、表現型は遺伝子型から予測できるとは限らない。遺伝子型と表現型とのギャップは、多くの生化学的反応、医薬、栄養及び環境因子などを含む種々の影響に依存して拡大される。
遺伝子から表現型へのこの生体分子の連鎖において、メタボライトは、表現型に最も緊密なリンクを持つ定量化可能な分子である。医薬への毒性応答や疾患罹患率などの多くの表現型及び遺伝子型の状態が、生物液及び組織内の機能的に関連するメタボライトの濃度における差により予想される。
【０００５】
慢性腎臓疾患（CKD)は、細管及び糸球体での進行性の腎臓機能喪失であり、通常非可逆性である。CKDは世界的公衆衛生問題であり、腎不全、心血管疾患及び早死などの合併症を持つ。CDKは異なる原因で生じ得るものであるが、１つの主原因は、糖尿病２型から合併症で、糖尿病性腎症(DN)と呼ばれている。欧州では、約2230万人の人が糖尿病に苦しみ、かつこれらの人々の94.9%が２型の糖尿病であり、これは欧州のほとんどの先進工業国において末期腎疾患(ESRD)の原因となっている（HaHetal.2008)。ESDRの３分の１の患者が糖尿病であり（WolfG.&RitzE.2003)、かつ最近のデータで、２型糖尿病の患者でESRDの疫学的増加が示されており、最もあり得る原因は高血圧及び冠状動脈性心臓病の治療がより進み、これにより多くの患者が腎症及びESRDを発症するに十分に生存することとなったからである(SampanisCh.2008)。アメリカ合衆国では、ESRD治療の年間コストは、1995年から2010年へ、118億USドルから283億USドルへ、2倍以上となると予想される。この経済的ファクタは欧州では詳しくは研究されていない(Massi-BenedettiM&CODE-2AdvisoryBoard2002)が、２型糖尿病の費用(CODE-2)研究では、糖尿病治療の費用への糖尿病合併症の大きさが評価された。この研究は、合併症のない患者は年間の治療費用が約1505EURであり、細小血管合併症を持つ患者は年間治療費が2563EURとなり、これは70%の増加を示す(WilliamsRetal.2002)。世界をリードする独立医学雑誌は最近、ほぼ50万人の大人を含む長期間研究において次のことを報告している。即ちほとんど全ての対象者は自分の疾患にCKDの後期段階になるまで気づかなかった、ということである。CDKは初期段階では処置可能であり予防され得るものである(WenCPetal.2008)と考えられていることから、より早い段階で検出して糖尿病２型の患者が合併症を起こさないようにすることが、公衆衛生システム及び患者個人の両方にとって、して医療費用を低減することとなるであろう。
【０００６】
腎臓は身体の適切な機能、例えば老廃生成物及び毒物を濾過して除き、ホメオスタシスを維持しかつホルモンを生産するなどの機能を維持する機能を持つ。この腎臓機能を正しく維持するために、血液が腎臓の糸球体膜でろ過される速度が制御されねばならない。高い糸球体濾過速度(GFR)が、水及び溶質の細胞外レベルを安定にかつ最適に維持するために必要である(BoronWF、&BoulpaepEL.2003)。このGFRは、血清クレアチニンクリアランス、年齢、民族及び性から計算され、５つの段階にCKDを分けて使用されている。ここで最後の２段階が最終腎臓疾患（ＥＳＲＤ）であり、透析又は移植が生存のためには必要とされる。
【０００７】
よく知られていることは、腎臓機能障害の診断及び治療が早いほど、残りのネフロンが維持され、それにより進行が抑制される可能性が大きくなる、ということである。
【０００８】
腎臓疾患診断の従来のマーカーにはGFR、クレアチニン及びアルブミンが含まれる。
【０００９】
GFRは、非常に初期段階で増加した後、症状が現れる前に減少する。GFRの測定に伴う欠点は、コストが高いこと及び通常の実験室でのモニターとは適合性ではないということである。血清クレアチニンは上記のようにGFRを計算するために最もよく使用されるマーカーであるが、しかしシスタチンCが、さらに緩やかなGFR減少を検出することができるより高感度のマーカーとして提案されてきた(Herget-RosenthalSetal.2007)。欠点は、シスタチンCについては標準方法も均一なキャリブレーション用材料も存在しないということであり、さらに、限界として、高グルココルチコイド投与の甲状腺機能障害と、潜在的な血管疾患の存在によりシスタチンCへの影響である。これらの単一マーカーの限界により、正確に医学的結論を導くために、GFR推定値に完全に依存することは示唆されていない。腎臓疾患の他、年齢がGFRに影響を与える２番目の最大ファクタである。従って、GFRの緩やかな減少は、必ずしも腎臓損傷によるのではなく、年齢のためであり得る。また、GFRの減少が、慢性腎臓疾患によるとは限らない。GFRも測定はまた不便であると考えられ、通常腎臓機能は血清クレアチニン濃度に基づいて求められる。
【００１０】
血清クレアチニンは、長い間、障害腎臓病を検出するため、及びGFRを計算するために使用されてきた(StarR.etal.2002)。クレアチニンは、筋肉代謝からのクレアチニンリン酸エステルの分解生成物であり(BarrDB.etal.2005)、その日毎の形成量は筋肉量に依存するが、血漿中濃度は個人について非常に一定している。血清クレアチニン濃度は、年齢、性、民族及び体格などのファクタに影響され、従ってクレアチニンクリアランスの測定が通常実施される。身体からクレアチニンのクリアランスは、腎臓の糸球体によるろ過で行われるが、クレアチニンは尿細管により血液から積極的に分泌される。この速度は遺伝及び生物的ファクタに依存し、例えば性別及び年齢などであり、これはGRFの15〜20％の過大評価となる。従って、クレアチニンは、特に子ども又は高齢者には非感受性マーカーと考えられている。またクレアチニンの他の欠点は、これは後段階の腎臓損傷のみ検出するということである。
【００１１】
アルブミンは最も豊富な血漿タンパク質であり(BasiS、etal.2008)、腎臓の構造的障害が尿中に分泌されるアルブミンの増加、30〜300mg/24時間に反映され得るものであり、これは微量アルブミン症と呼ばれる。微量アルブミン症は糖尿病の発症後数年で発症し15〜20年後の微量アルブミン症に進展し、尿中のアルブミン濃度が300mg/24時間を超えるものである。アルブミン症が見られることは、糖尿病性腎症の顕著な特徴であり、通常は試験紙法で測定される。腎臓障害のマーカーとしてのアルブミンは、いくつかの欠点がある。第１に数年前まで、近位尿細管で最吸収されない尿中アルブミンはその形で分泌されると信じられてきたが、しかし実際にはアルブミンはその形及びアルブミン誘導ペプチド（これは試験紙法では検出されない）の混合物として分泌され、かつ試験紙法では検出されない他の種類のアルブミンも分泌されるからである。
これは偽陰性試験結果を与える余地がある(ComperWD.&OsickaTM.2005)。第２にアルブミンは既存の腎症の証拠であって、予期のための優れたバイオマーカーではないということである。微量アルブミン症の現れる前に糖尿病性腎症が検出されるならば、治療としてはCKDを予防するか又は進行を防止する可能性があり得る。アルブミン症の測定は腎臓障害の全ての患者を同定することはできない。
【００１２】
２つのメチルアルギニン異性体であり、対称ジメチルアルギニン(SDMA)及び非対称ジメチルアルギニン(ADMA)について腎臓疾患に関して集中的に研究されてきた(FleckCetal.2001)。これらは、転写後にタンパクアルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)により変性されたアルギニン残基により形成され、通常は身体中で代謝されず、ADMAは酸化窒素合成酵素(NOS)の外部インヒビターとしての可能性のため生物学的に重要である。というのはADMA濃度の増加はNO合成の減少を起こし、従って障害性の内皮機能をもたらすことを意味するからである。ADMAの蓄積は、これまでずっと、高血圧、免疫不全及びCKDに関与する特徴に寄与すると信じられてきた。さらに動物実験では、実験的に誘導された慢性NOS抑制は、全身性の糸球体の高血圧、糸球体虚血、糸球体硬化症、尿細管間質性障害及びタンパク尿の原因となることが示されている(ZatzR&BaylisC、1998)。SDMAはADMAよりもむしろ多く、CKD患者で有意に増加することがまた見出されている。
【００１３】
さらに、アシルカルニチンはCKDと関連付け（リンク）されてきた(FougueDetal.2006)。遊離アシル化の増加がCKD患者の血清中に見出され、これは障害を受けた腎臓の分泌機能が低下したことからである。
【００１４】
さらに酸化ストレスは、長年腎臓疾患の進展に関係づけられてきた(LoughreyCM.etal.1994、HaHetal.1995)。いくつかの研究によると、高血糖症による酸化ストレスの増加は、糖尿病の微小血管及び大血管の両方の合併症の原因であることが述べられている(SakaneNetal.2008)。酸化ストレスはグルコース及び脂肪酸の過剰から始まり、これらの物質がミトコンドリアに代謝のために輸送される際に電子伝達系からの電子が外れ得る。メチオニンスルホキシドは、活性酸素種（ROS、MashimaRetal.2003)による酸化の最も直接的インジケーターの１つであるが、これまで腎臓疾患のバイオマーカーとして実施されてきたことはない。さらに腎不全でのクエン酸回路中間物の役割については、クエン酸、フマル酸及びマレイン酸がCKDを持つ患者中に有意に増加することについて研究されてきた。
【００１５】
CKDを持つ患者においては、腎性代謝の変化は全身及び腎性アミノ酸代謝に変化を及ぼすように見える。通常の状態ではわずかの限られた量のアミノ酸のみが尿と共に分泌される。フェニルアラニンからチロシンへの変換に障害があることは、これらの患者にフェニルアラニンの蓄積をもたらすことが観察されてきた。さらに、障害性腎臓はアルギニンの生成に影響を与え、臨床及び動物研究の両方において、腎性アルギニン合成における低下を伴うことが知られている。また進行したCKD患者で、シトルリンの腎性取り込みの減少及び、タウリン、オルニチン、アラニン、チロシン及びリジンの放出が見られた。さらにシトルリンからアルギニンへの変換が低下するように見える。
【００１６】
さらに、トリプトファン代謝がCKDの発症の関わっているとの示唆もされている。腎臓でのこの経路での速度限定酵素は、インドールアミン-２、３-ジオキシゲナーゼ(IDO)であり、これはトリプトファンをN-ホルミル-キヌレニンに変換し、これが代謝されてキヌレニン及びその後ヒドロキシキヌレニンへ異化される。IDOの活性増加は、トリプトファンの枯渇を説明するために以前の研究で観察されている。
【００１７】
糖尿病及びDN患者の血清中に、C-反応性タンパク質、インターロイキン６、インターロイキン18、腫瘍壊死因子(TNF)-αなどの炎症マーカーが増加し、またフェチュインが減少することが観測されている。これは、疾患の非常に初期の段階で生じ、アルブミン症の程度と関連する。
【００１８】
CKDＭ又はDNの診断のための知られたバイオマーカーには例えば、いくつかのポリペプチドマーカー(US2006286602Al、CA2473814A1、EP1972940Al、US2009081713Al)が含まれ、異なる分子質量及び移動時間を持つものであり、例として慢性腎不全遺伝子-1a(CRFG-1a)ポリペプチド(JP11069985A、JP11069984A)であり、同様にポリペプチドマーカー(JP2003235573A、JP2004187620A)である。
【００１９】
上記のシスタチンCは、ホロ-及びアポ-レチノール結合タンパク質(RBP)、タム-ホルスホール-タンパク質(THP、(DE10327773Al)の他に、腎臓疾患を診断するために使用される全てのマーカーの１つである(JP11064333A)。前記マーカーには、カルビンジンD-28k(大EF-ハンドファミリのｈ１つのカルシウム-結合タンパク質ファミリ)、腎臓障害分子-1(Kim-1、細胞外6-システイン免疫グロブリンドメイン、タイプ1膜タンパク質)、アルファ-2uグロブリン関連タンパク質(アルファ-2u、これはまた人リポカリン2(LCN2)又は好中球ジェラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)(好中球の顆に保存される）として知られている）、オステオポンチン(OPN、これはまた分泌性ホスホタンパク質1(SPP１、分泌性、高酸性及びグルコシル化ホスホタンパク質、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD)細胞接着モティーフを持つ)として知られている）、血管内皮細胞増殖因子(VEGF、血管生成、血管透過性を促進し、単球の走化性に寄与し、及び尿病、障害治癒炎症応答及び組織再生に役割を果たすものとして知られている(WO2008116867Al)）、N-アセチルムラモイル-L-アラニンアミダーゼ前駆体、アジポネクチン、AMBPタンパク質前駆体(アルファ-1-微小グロブリン)、C4b-結合タンパク質アルファ鎖前駆体、セルロプラスミン前駆体、相補C3前駆体、相補成分C9前駆体、相補因子D前駆体、アルファ-1B-グリコタンパク質、ベータ-2-グリコタンパク質I前駆体、ヘパリン補因子II前駆体、鎖C領域タンパク質、ロイシン豊富アルファ-2-グリコタンパク質前駆体、色素上皮誘導前駆体、血清レチノール結合タンパク質前駆体及び転写開始因子3サブユニット10(EP1905846A2)が挙げられる。
【００２０】
抗原、サイトトキシン及び細胞成長インヒビターがバイオマーカーとして使用され得る(WO2008101231A2)。線維芽細胞増殖因子23(FGF-23)及びアジポネクチンが、慢性腎臓疾患を予期するマーカーとして、それぞれ又は組み合わせて有望であることが見出された(WO2008089936A1)。腎臓疾患又はその素因を診断しモニターするための他の方法は、ヒッペルリンドウ腫サプレッサー(pVHL)、CXCケモカインレセプター4(CXCR4)、インテグリンβ-1、血小板由来増殖因子アルファペプチド(PDGF-A)、低酸素誘導因子1アルファ(HIF1アルファ)及び/又は対象者からの試中の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)が挙げられる(US2008/0038269A1)。
【００２１】
記載された他の方法は、腎臓線維症及び関連する腎臓障害、特に糖尿病、高血糖及び高血圧に関連する合併症の存在及び進展を決定するために、試料中の結合組織成長因子のレベルの測定である(US2004/0224360A1)。
【００２２】
ゲノミクスの分野では、腎臓疾患評価のためのいくつかのバイオマーカーがある。１つの発明は、臨床的又は科学的対象細胞中でのみ発現される遺伝子の同定が含まれ、例えば、糸球体上皮細胞又は近位尿細管などである(CN1863928A)。人白血球抗原(HLA)マーカーHLA-A11、HLA-DR9及びHLA-DQA1*0302は全て、糖尿病及び腎症の予期マーカーである(CN101294215A)。トロンボスポンジンタイプ１モチィーフ-4、アグレカネーズ-1(ADAMTS4)と共にディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼが、遺伝子カルビンディン-D28k、KIM-1、ＯＰＮ、EGF、クラステリン、VEGF、OAT-K1、アルドラーゼA、アルドラーゼB、ポドシン、アルファ-2u、C4(EP1925677A2)及びセラミドグルコシルトランスフェラーゼ(CGT)(WO03057874A1)と同様に、CKDの血液バイオマーカーとして有用であることが見出された(WO2009002451A2)。
【００２３】
RNAマーカーはまた腎臓疾マーカーとして使用される(EP2058402(A1)。例えば、腎臓RNAマーカーには、腎近位尿細管の上皮細胞に発現する腎臓特異的アンドロゲン制御タンパク質(KAP)、腎障害分子-1(KIM-1)、腎臓近位尿細管上皮細胞に発現する膜タンパク質、虚血性障害及び腎毒性処置後の腎臓に誘導発現されるヘパリン-結合性上皮成長因子(GB-EGF)、線維芽成長因子1(EGE-1)、腎毒性処理の後誘導されるケラチノサイト成長因子(FGF-7)及びFGF-7レセプターFGFR2IIIb、水チャンネルタンパク質アクアポリン1、2及び3（腎臓に多く発現される）、タム-ホルスファールグリコタンパク質（腎臓上皮細胞に発現され、ヘンレのループの厚い上昇部と腎臓の遠位包旋細管に局在し、最後には初期の成功応答遺伝子(Egr-1)を発現）、プロトオンコジーン(c-fos)及びストレス応答遺伝子(hsp70)（腎臓の虚血性障害後に活性化される）、が挙げられる。
【００２４】
腎臓疾患評価のために従来技術に記載される他の方法は、尿中のプロテアーゼ活性を２以上の物質について測定し、前記物質に対する前記プロテアーゼ活性のパターンを分析すること(WO2008001840A１)、又は人の触媒鉄の測定(US2007238760A1)を含む。
【００２５】
腎臓疾患評価のためのいくつかの示唆されるバイオマーカーがあるけれども、記載されたもの及び特に今日臨床で使用されているものは感度が十分ではなく疾患の最後の段階においてのみ検出され得るものである。従って現時点においてもなお、腎臓の病理学的変化、特に疾患または障害の式の段階での変化に敏感なマーカーへの要求が存在する。
【００２６】
アルブミンやクレアチンなどの上記マーカーは、糖尿病患者の腎症へのリスクを見出すために使用されてきたが、最重要課題は、新規なより敏感なバイオマーカーであって、糖尿病性腎症をより早い段階で予期又は検出ができ、予防治療を実施するか、又は最終的にはESDRとなる腎臓の障害の進展及びその関連する合併症を少なくとも遅くすることのできるバイオマーカーを見出すことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
従来技術に存在する上記問題点に鑑みて、本発明の課題は、腎臓疾患評価のための新規バイオマーカーを提供することであり、前記バイオマーカーは、腎臓の病理学的変化、特に疾患又は障害の初期段階での変化に対してより敏感なマーカーを提供することである。
【００２８】
最適には、前記マーカーは、血液及び/又は尿などの生物試料中で容易に検出され得るものであり、そのレベルが常に腎臓の障害に関連し、そのレベルが変化するものである。さらに、本発明の課題は、生物試料中の腎臓疾患評価のための方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の課題を解決するため、本発明者はメタボロミクスの研究に基づいた。これは腎臓の疾患の際に生じる生化学的変化についての知見を与え、いくつかのかつ強力なより優れたバイオマーカーを与える可能性のあるものである。事実、腎臓は特に代謝活性器官であり、メタボライト（代謝物）が身体のその機能に依存して分泌されたり、再び吸収されたりする。従って、腎臓疾患について代謝的バイオマーカーを持つことは重要な改良であると思われ、またこれにより腎臓機能およびそこでの生化学反応についてより情報を与えるものであると思われる。本発明発明者は次の知見を得た。すなわち、従来技術におけるような単一のマーカーを適用するよりは、腎臓疾患の進展につれ変化される１群のメタボライトを用いることで、全ての関与する経路及び反応機構のより全体的な理解が得られる、ということである。
【００３０】
従って本発明は、添付の特許請求の範囲に記載にされるように、腎臓の病理学的変化、特に疾患又は障害の初期段階での変化の評価のために適した新規なバイオマーカー（即ち、新規バイオマーカーセット）を提供する。さらに、本発明はまた、哺乳類対象体で腎臓疾患評価のための方法を提供し、同様に前記方法を実施するためのキットを提供する。
【００３１】
本明細書で以下の図１から14が参照される。これらの図は、進行中の腎臓疾患で本発明のメタボライトバイオマーカーの増加又は減少の例を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、糖尿病及び非糖尿病でのCKDの段階３〜５での、対称的ジメチルアルギニン(SDMA)比に関するものであり、段階５患者は、段階３及び段階４の患者に比較して、高度に有意(p<<0.01)な前記比を持つことを示し、これはSDMAがCKDの進展についての優れたバイオマーカーであることを示唆している。
【図２】図２は、CKDの段階３〜５でのSDMA比に関するものであり、段階５の患者は段階３及び段階４の患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることが分かる。
【図３】図３は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのSDMA/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３及び段階４の患者に比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、これは、SDMA/アルギニン比がCKDの優れたバイオマーカーであることを示唆する。前記比は、SDMA/アルギニンがタンパク質アルギニン-メチルトランスフェラーゼIIの増加活性の予期マーカーであることを示し、さらにそれを反映するものであることを示す。
【図４】図４は、CKD段階３〜５でのSDMA/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３及び段階４の患者に比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかる。SDMAは、タンパク質アルギニン-メチルトランスフェラーゼIIの増加活性の予期マーカーであることを示し、さらにそれを反映するものであることを示す。
【図５】図５は、糖尿病及び非糖尿病のCKDの段階３〜５でのアシルカルニチングルタルカルニチンのボックスプロットに関するものであり、グルタルカルニチンがCKDの最終段階で増加することを示す。
【図６】図６は、CKD段階３〜５でグルタルカルニチンのボックスプロットを示す。
【図７】図７は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのシトルリン/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３及び段階４の患者に比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、前記比は、尿サイクルでの酵素活性が変更されたことを示す。
【図８】図８は、CKD段階３〜５でのシトルリン/アルギニン比のボックスプロットに関する。
【図９】図９は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのオルニチン/アルギニン比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は、段階３の非糖尿病患者のみに比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、このバイオマーカーが、腎臓疾患の異なる種類間で異なる診断を行うために重要であることを示す。
【図１０】図１０は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのメチオニンスルホキシド/メチオニン比のボックスプロットに関するものであり、この酸化ストレスマーカーは、段階５の患者は段階３の患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかる。
【図１１】図１１は、CKD段階３〜５でのメチオニンスルホキシド(MetOS)/メチオニン(Met)比のボックスプロットに関するものであり、段階５の患者は段階３の患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかり、MetSO/Met比がCKDの進展のための優れたバイオマーカーであることを示唆する。
【図１２】図１２は、CKDの段階３〜５でのフマル酸のボックスプロットに関するものであり、初期段階では全くフマル酸が存在せず、従ってフマル酸は定量マーカーとして作用することを示す。
【図１３】図１３は、糖尿病及び非糖尿病でのCKD段階３〜５でのアルファケトグルタル酸のボックスプロットに関するものであり、段階５の糖尿病患者は段階３の糖尿病患者と比較して高度に有意(p<<0.01)に比が増加していることがわかる。
【図１４】図１４は、CKD段階３〜５でのアルファケトグルタル酸のボックスプロットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の特定の（セットの）バイオマーカー及び方法を適用することにより、より適切かつ信頼性のある腎臓疾患の評価が可能となる。本発明の「評価」とは、前記疾患の発症の診断及び進展のモニター、特に前記疾患の異なる段階での検出およびマーキングを意味する。本発明は、腎臓疾患をより改良された形でかつ前記疾患のより早い段階で予期し診断することを可能としさらに前記腎臓での病理学的変化をより敏感に検出することを可能とするものである。実際、本発明のバイオマーカーは、生物試料中、特に血液及び/又は尿試料中で容易に検出され、それらのレベルは一貫して腎臓疾患/障害の程度に関連し、そのレベルが変化するものである。
【００３４】
さらに、評価することにはまた、これらのマーカーが動物モデル又は第I相臨床試験での腎毒性評価にも適しているという事実を含むべきである。言い換えると、これらはまた、前臨床及び臨床腎毒性を評価するために適している。即ち、医薬開発の初期段階でのいわゆる動物モデル又は第１相臨床試験においてである。
【００３５】
一般にバイオマーカーは、２つ以上の生物的状態をお互いに区別可能とするための有用な道具であり、通常の生物的プロセス、病理学的プロセスのインジケーターとして、又は医薬処置への反応として作用するものである。メタボライトは低分子量化合物(<1kDa)であり、ほとんどのタンパク質、DNA及び他のマクロ分子よりも小さい。タンパク質の活性の僅かな変化が、生化学反応中で大きな変化となり、それらのメタボライト（＝代謝バイオマーカー、身体の代謝系）、その濃度、フラックス及び移動機構が、疾患及び薬物処置に敏感である。これにより、遺伝的因子及び栄養、生理活性、消化管ミクロバル(microbal)及び医薬などの環境的因子を反映する、生理学的及び病態生理学的物質の個々のプロフィールを得ることを可能とする。従って、代謝バイオマーカーは、バイオマーカーであるが代謝バイオマーカーではないタンパク質やホルモンなどよりもより包括的な情報を与える。
【００３６】
その観点で、用語「代謝バイオマーカー」とはここでは、腎臓疾患状態特にCKDを示すインジケーターとして、適する化合物を意味し、哺乳動物体内での代謝プロセスの際に生じるメタボライト（代謝物）又は代謝化合物を意味する。用語「代謝バイオマーカー」はまた、酵素反応に応じて生成物/基質比をまた含むことが意図されている。
【００３７】
本発明により測定される代謝バイオマーカーは次のクラスのメタボライト（即ち分析物）を含む：少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンである。これらのクラスの定義は当業者には知られているが、好ましい物については以下表１〜３にまとめられている。さらに、生物アミンとは、天然アミノ酸の酵素的脱カルボン酸により誘導される天然に存在する生物活性化合物として理解されるべきである。生物物質は、生命プロセスにより与えられる物質であり、前記生物アミンアミン基を含む。それらのほとんどは神経伝達物質として作用するが、例えば血圧及び体温調節に活性を有するものがある。
【００３８】
驚くべきことに、これらのクラスの１組のメタボライトを測定することで、初期の段階で改良された方法で腎臓疾患を予期し診断することを可能にする、ということを見出した。特に、腎臓の病理学的変化をより敏感に検出することができるということである。このグループの１つのクラスのメタボタイトが除外されるか、その数が低減されると、腎臓疾患評価はより敏感でなくなり信頼のないものとなろう。これは特に、この疾患の初期段階で適用され得るものであり、かかる段階では知られたバイオマーカーを用いて知られた方法によっては信頼性ある検出ができなかった。実際、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを同時に測定することは、腎臓疾患、特に段階１〜３また段階４及び５でのCKD及びDNのより信頼性にある診断を可能とする。かかる事実は従来技術においてはこれまで一切記載されていないものでる。
【００３９】
好ましくは前記バイオマーカーセットはさらに酵素反応についての生成物/基質の比を含み、より好ましくはSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比を含む（添付の図）。SDMA/アルギニン比は酵素タンパク質アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ(PRMT)に関連し、シトルリン/アルギニン比は酸化窒素シンターゼ(NOS)と関連し、オルニチン/アルギニン比はアルギネースに関連し、またメチオニンスルホキシド/メチオニン比は活性酸素種(ROS)による酸化に関連する。さらにこれらの比を測定することで、本発明のバイオマーカーセット及び方法の診断機能はさらに改良され得る。
【００４０】
より好ましくは、本発明のバイオマーカーセットはさらに、ポリアミン、ホスファチジルコリン、還元単糖及びオリゴ糖（糖）、スフィンゴミエリン、アイコサノイド、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物を含む群から選択される１以上のメタボライトを含む。これらのクラスの好ましい例は表４〜９に挙げられる。また、さらにこれらのクラスのメタボライトを測定することで、本発明によるバイオマーカーセット及び方法の診断性能はさらに改良され得る。
【００４１】
特に好ましくはバイオマーカーセットは、アミノ酸が、Cit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、GIn、Ser、Val、Glu及びProからの１つであり、アシルカルニチンは、C0、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:1及びC18:1から選択されるものであり、生物アミンは、MetSO、クレアチン、SDMA、ADMA、全DMA及びセレトニンから選択されるものであり、前記比は、SDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比から選択されるものである。
【００４２】
上記のように、評価される疾患は腎臓疾患である。好ましくは慢性腎臓疾患(CKD)、より好ましくは糖尿病性腎症(DN)である。生物試料は、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、ギニアピッグ、犬、ミニピッグ又はヒトである。生物試料は好ましくは血液又は尿試料であるが、全ての他の生物使用で当業者に知られたものであり、本発明による測定が可能であるものは適したものである。従って、本発明の方法は、インビトロ方法である。生物試料のメタボライト濃度の測定のために、クロマトグラフ、スペクトロスコピー及びマススペクトルなどの定量分析方法が適用され、特にマススペクトルの使用が好ましい。クロマトグラフには、GC、LC、HPLC及びUPLCが含まれ、スペクトロスコピーにはUV/VIS、IR及びNMRが含まれ、さらにマススペクトルにはESI-QqQ、ESI-QqTOF、MALDI-QqQ、MALDI-QqTOF及びMALDI-TOF-TOFが含まれる。好ましくは、FIA及びHPLCタンデムマススペクトルの使用である。これらの分析方法は一般的に当業者に知られている。
【００４３】
目標とされるメタボライト量の測定のために、メタボロミクスが生物試料中のメタボライトを定量化するために使用される。これには、アミノ酸、生物アミン、ポリアミン、アシルカルニチン、ホスファチジルコリン、還元単糖及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、アイコサノイド、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物の分析物クラスを含む。エネルギー代謝中間物には、ホスホリル化糖、１価、２価及び３価有機酸及び核酸が含まれることを理解されるべきである。しかし、本発明によれば、測定されるメタボライトにはとりわけ、アミノ酸、アシルカルニチン及び生物アミンが含まれる。定量化は、同位体ラベル化内部標準を用いて実施され上記方法で決定される。
本発明による測定されるべきメタボライトとして適するものが略語（BCコード）も含めて分析ブウtのリストが次の表に含まれる。
表１：アミノ酸（μM)
【００４４】
【表１】
表２：アシルカルニチン（μM)
【００４５】
【表２ａ】
【００４６】
【表２ｂ】
表３：生物アミン（μM)
【００４７】
【表３】
表４：ホスファチジルコリン（μM)
【００４８】
【表４ａ】
【００４９】
【表４ｂ】
【００５０】
【表４ｃ】
表５：スフィンゴミエリン（μM）
【００５１】
【表５】
表６：プロスタグランジン（ｎM)
【００５２】
【表６】
表７：糖（μM)
【００５３】
【表７ａ】
【００５４】
【表７ｂ】
【００５５】
【表７ｃ】
【００５６】
【表７ｄ】
表８：胆汁酸(nM)
【００５７】
【表８】
表９：エネルギー代謝からのメタボライト(μM)
【００５８】
【表９】
さらに、本発明はまた、本発明を実施するために適合されたキットを提供するものである。前記キットは、１以上のウェルと、１以上の内部標準を含む１以上のインサートを含む装置を含む。かかる装置はWO2007/003344及びWO2007/003343に記載されており、これらの内容は参照されて本明細書の一部となる。
【００５９】
以下の実施例はさらに本発明を詳細に説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
実施例
腎臓疾患の異なる段階における比較を行った。また糖尿病性腎症と他の慢性腎臓疾患との比較を行った。
【００６１】
一般的情報：
６コホート、CKD段階３〜５（前記公式段階１〜３はすべてここでは段階３として含む）であるCKDを持つ糖尿病とCKD段階３〜５であるCKDを持つ非糖尿病の尿(57)と血漿(76)試料をそれぞれMontpellier大学病院で収集した。標的メタボロミクスを用いて、血漿からの約320のメタボライト及び約300の尿からのメタボライトが定量化された。前記メタボライトには、次のクラス、即ちアミノ酸、生物アミン、ポリアミン、アシルカルニチン、フォスファチジルコリン、還元単及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、アイコサノイド、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物（上で定義された）を含み、これには同位体ラベル化された内部標準が含まれる。これらを、Sciex4000QTrapを電子スプレーイオン化と共に用いてFIA及びHPLCタンデム質量分析装置（多重反応モニター(MRM)付き）により決定した。
【００６２】
さらに、血漿中の160の脂肪酸をGC-MS/MSにより定量化した。かかるデータベースは教師なし主成分分析(PCA)及び教師付き部分細小二乗区別分析(PLS-DA)をMarkerViewsoftware(LifeTechnologies)を用いて行った。
【００６３】
分析P/U及びU：
分析は、血漿及び尿が利用可能（即ち57；「分析P/U」）及び血漿試料のみ使用（即ち76;「分析P」の両方の患者について行った。従ってマーカーは血漿及び尿の組み合わせとして作用し得るが、また血漿中でのみ測定され得ることをも示している。異なる比較がCKDのバイオマーカー評価のために行われた。しかしまた、糖尿病性腎症及び他の腎臓疾患との間の違いを区別され得るかを調べるためにも比較された。従って、かかる比較は、全ての患者についてCKDの初期段階及び遅い段階での間で行われた。さらにまた、糖尿病性及び非糖尿病性との間においても比較がなされた。
【００６４】
用語の定義：
(1) アップ、ダウンレギュレーション：アップレギュレーションは、メタボライトの濃度が増加することを意味する。例えば、この生化学反応が例えば酵素活性の変化により生じる速度の増加を意味する。ダウンレギュレーションは、その逆である。
(2)ｔ-テスト：ｔ−テストは、統計的仮設のテストであり、使用した１つは前記MarkerViewsoftwareに組み込まれており、前記表に含まれた全ての変数へ適用し、それぞれのグループの標準偏差及び試料数が与えられ有意の差があるかどうかを決定するものである。例えば、２つの異なるグループ間の平均（平均値）間に実際の相違があるかどうかを調べることである。
（３）p-値：ｐ-値とは、帰無仮説（相違なし又は効果なし）を仮定して、実際の観察されたものと少なくとも同じ極端となる結果が得られる確立である。p-値は常に正の値であり、変化が生じる確立が小さいほど、その値は小さくなる。p-値0.05未満では前記帰無仮説を5%レベルで棄却する。これは前記変化の時間のほんの5%のみが生じる可能性があるということを意味する。これがここでの表で設定されたレベルである。
(4) 対数倍変化：体数倍変化とは、それぞれの状態での平均の対数変換濃度間の違いとして定義される。これは、１つのグループと他のグループでの値がどの程度大きいか小さいかを記述する方法である。例えば、0.3の対数倍変化とは、コントロール（健康グループ）に比べてexp(0.3)=1.34倍の増変化に「等しい」。さらに、0.3の対数倍変化は、前記コントロールに比べてexp(-0.3)=0.74=（1/1.34)倍の変化に「等し」く、又は前記疾患に対して1.34の減少変化に等しいことになる。
【００６５】
結果：
前記記載の測定結果は以下の表10〜27にまとめた。
表10〜18は、「分析P/U」及び表19〜27は「分析P」に関する。この表で、ｐ-値はMarkerViewSofwareを用いて標準のｔ−テストを行って得られた値である。正の対数倍は、より高い段階でのメタボライトのアップレギュレーションを表し、逆もそうである。略語は：D、糖尿病性；ND、非糖尿病性；AC、アシルカルニチン；SU、糖；BN、生物アミン；SM、スフィンゴミエリン；TFA、合計脂肪酸；FFA、遊離脂肪酸；PC、フォスファチジルコリン；OA、有機酸；BN、生物アミンである。
【００６６】
「分析P/U」
表１０：CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００６７】
【表１０ａ】
【００６８】
【表１０ｂ】
表１１：CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００６９】
【表１１ａ】
【００７０】
【表１１ｂ】
表１２：CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７１】
【表１２ａ】
【００７２】
【表１２ｂ】
【００７３】
【表１２ｃ】
表１３：糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７４】
【表１３】
表１４：：糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７５】
【表１４】
表１５：糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７６】
【表１５ａ】
【００７７】
【表１５ｂ】
表１６：非糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００７８】
【表１６ａ】
【００７９】
【表１６ｂ】
表１７：非糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８０】
【表１７ａ】
【００８１】
【表１７ｂ】
表１８：非糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８２】
【表１８ａ】
【００８３】
【表１８ｂ】
分析「P」
表１９：CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８４】
【表１９ａ】
【００８５】
【表１９ｂ】
表２０：CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００８６】
【表２０ａ】
【００８７】
【表２０ｂ】
【００８８】
【表２０ｃ】
【００８９】
【表２０ｄ】
表２１：CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９０】
【表２１ａ】
【００９１】
【表２１ｂ】
【００９２】
【表２１ｃ】
表２２：糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９３】
【表２２】
表２３：糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９４】
【表２３ａ】
【００９５】
【表２３ｂ】
表２４：糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９６】
【表２４】
表２５：非糖尿病性CKDの段階４及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９７】
【表２５ａ】
【００９８】
【表２５ｂ】
表２６：非糖尿病性CKDの段階５及び４で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【００９９】
【表２６ａ】
【０１００】
【表２６ｂ】
【０１０１】
【表２６ｃ】
【０１０２】
【表２６ｄ】
表２７：非糖尿病性CKDの段階５及び３で比較した、高度に有意および有意の、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションされたメタボライト。
【０１０３】
【表２７ａ】
【０１０４】
【表２７ｂ】
【０１０５】
【表２７ｃ】
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、改良された方法で、前記疾患の初期段階で腎臓疾患を予測しかつ診断することを可能にし、かつ前記腎臓での病理学的変化についてより敏感に検出することを可能とする。
事実、本発明のバイオマーカーは生物試料中、特に血液/尿中で容易に検出可能であり、かつそれらの濃度が、腎臓疾患/障害の程度に応じて常に関連し、それに応じて変化するものである。
さらに本発明のバイオマーカーは、動物モデル又は臨床試験第１相で、腎毒性を適切に評価することができるものである。
言い換えると、これらはまた、全臨床及び臨床腎毒性を評価する上で適するものである。即ち、医薬開発の初期段階、動物モデル実験段階又は臨床試験第１相段階である。
これらに基づき、腎臓疾患/障害、特にCKD及びDNの発症をより信頼性高く診断し、その進展をモニターするために適したキットを製造することが可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓疾患評価のための代謝バイオマーカーであり、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを含む。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオマーカーであり、さらに、酵素反応において生成物/基質の比、好ましくはSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比を含む、バイオマーカー。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載のバイオマーカーであり、前記アミノ酸が明細書の表１から選択され、前記アシルカルニチンが表２から選択され、及び前記生物アミンが表３からそれぞれ選択される、バイオマーカー。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のバイオマーカーであり、さらに、ポリアミン、フォスファチジルコリン、還元単及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、胆汁酸及びフォスフォリル化糖、１、２、３価の有機酸及びヌクレオチドを含む群から選択される、１以上のメタボライトを含む、バイオマーカー。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のバイオマーカーであり、前記アミノ酸がCit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、GIn、Ser、VaI、GIu及びProから選択され、前記アシルカルニチンがCO、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:1及びC18:1から選択され、前記生物アミンがMetSO、クレアチニン、SDMA、ADMA、合計DMA及びセロトニンから選択され、前記比がSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比から選択される、バイオマーカー。
【請求項６】
腎臓疾患評価のためのバイオマーカーセットとしての、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを含むメタボライトの組み合わせを用いる方法。
【請求項７】
哺乳類対象物の腎臓疾患評価のための方法であり、生物試料、好ましくは血液及び/又は尿試料を前記対象物から得て、前記生物試料中の、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを測定することを含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であり、さらに、前記生物試料中の、酵素反応に関して生成物/基質の比、好ましくはSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比を測定することを含む、方法。
【請求項９】
請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法であり、前記アミノ酸が明細書の表１から選択され、前記アシルカルニチンが表２から選択され、及び前記生物アミンが表３からそれぞれ選択される、方法。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法であり、さらに前記生物試料中の、ポリアミン、フォスファチジルコリン、還元単及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物から選択される、１以上のメタボライトの量を測定することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の方法であり、前記アミノ酸がCit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、GIn、Ser、Val、Glu及びProから選択され、前記アシルカルニチンがCO、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:1及びC18:1から選択され、前記生物アミンがMetSO、クレアチニン、SDMA、ADMA、合計DMA及びセロトニンから選択され、前記比がSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項７乃至１１のいずれか１項に記載の方法であり、前記測定が定量的分析方法、好ましくはクロマトグラフ、スペクトロスコピー及び/又はマススペクトルに基づくものである、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であり、前記クロマトグラフがGC、LC、HPLC又はUPLCのいずれかであり、前記スペクトロスコピーがUV/VIS、IR又はNMRのいずれかであり、前記マススペクトルがESI-QqQ、EI-QqTOF、MALDI-QqQ、MALDI-QqTOF又はMALDI-TOF-TOFのいずれかである、方法。
【請求項１４】
請求項７乃至１３のいずれか１項に記載の方法であり、前記腎臓疾患が慢性腎臓疾患（CKD)、好ましくは糖尿病性腎症(DN)である、方法。
【請求項１５】
請求項７乃至１４のいずれか１項に記載の方法を実施するために適合されたキットであり、装置を含み、前記装置が１以上のウェル及び１以上の、少なくとも１つの内部標準を含むインサートを含む、キット。
【請求項１】
腎臓疾患評価のための代謝バイオマーカーであり、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを含む。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオマーカーであり、さらに、酵素反応において生成物/基質の比、好ましくはSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比を含む、バイオマーカー。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載のバイオマーカーであり、前記アミノ酸が明細書の表１から選択され、前記アシルカルニチンが表２から選択され、及び前記生物アミンが表３からそれぞれ選択される、バイオマーカー。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のバイオマーカーであり、さらに、ポリアミン、フォスファチジルコリン、還元単及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、胆汁酸及びフォスフォリル化糖、１、２、３価の有機酸及びヌクレオチドを含む群から選択される、１以上のメタボライトを含む、バイオマーカー。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のバイオマーカーであり、前記アミノ酸がCit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、GIn、Ser、VaI、GIu及びProから選択され、前記アシルカルニチンがCO、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:1及びC18:1から選択され、前記生物アミンがMetSO、クレアチニン、SDMA、ADMA、合計DMA及びセロトニンから選択され、前記比がSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比から選択される、バイオマーカー。
【請求項６】
腎臓疾患評価のためのバイオマーカーセットとしての、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを含むメタボライトの組み合わせを用いる方法。
【請求項７】
哺乳類対象物の腎臓疾患評価のための方法であり、生物試料、好ましくは血液及び/又は尿試料を前記対象物から得て、前記生物試料中の、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも２つのアシルカルニチン及び少なくとも２つの生物アミンを測定することを含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であり、さらに、前記生物試料中の、酵素反応に関して生成物/基質の比、好ましくはSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比を測定することを含む、方法。
【請求項９】
請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法であり、前記アミノ酸が明細書の表１から選択され、前記アシルカルニチンが表２から選択され、及び前記生物アミンが表３からそれぞれ選択される、方法。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法であり、さらに前記生物試料中の、ポリアミン、フォスファチジルコリン、還元単及びオリゴ糖、スフィンゴミエリン、胆汁酸及びエネルギー代謝中間物から選択される、１以上のメタボライトの量を測定することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の方法であり、前記アミノ酸がCit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、GIn、Ser、Val、Glu及びProから選択され、前記アシルカルニチンがCO、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:1及びC18:1から選択され、前記生物アミンがMetSO、クレアチニン、SDMA、ADMA、合計DMA及びセロトニンから選択され、前記比がSDMA/アルギニン比、シトルリン/アルギニン比、オルニチン/アルギニン比及び/又はメチオニンスルホキシド/メチオニン比から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項７乃至１１のいずれか１項に記載の方法であり、前記測定が定量的分析方法、好ましくはクロマトグラフ、スペクトロスコピー及び/又はマススペクトルに基づくものである、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であり、前記クロマトグラフがGC、LC、HPLC又はUPLCのいずれかであり、前記スペクトロスコピーがUV/VIS、IR又はNMRのいずれかであり、前記マススペクトルがESI-QqQ、EI-QqTOF、MALDI-QqQ、MALDI-QqTOF又はMALDI-TOF-TOFのいずれかである、方法。
【請求項１４】
請求項７乃至１３のいずれか１項に記載の方法であり、前記腎臓疾患が慢性腎臓疾患（CKD)、好ましくは糖尿病性腎症(DN)である、方法。
【請求項１５】
請求項７乃至１４のいずれか１項に記載の方法を実施するために適合されたキットであり、装置を含み、前記装置が１以上のウェル及び１以上の、少なくとも１つの内部標準を含むインサートを含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５２９０１５（Ｐ２０１２−５２９０１５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１３４７３（Ｐ２０１２−５１３４７３）
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３９２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３９３４１
【国際公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【出願人】（５１１２９２１３８）バイオクラテス ライフ サイエンシーズ アーゲー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＲＡＴＥＳ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｉｎｎｒａｉｎ ６６， Ａ−６０２０ Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ， Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３９２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３９３４１
【国際公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【出願人】（５１１２９２１３８）バイオクラテス ライフ サイエンシーズ アーゲー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＲＡＴＥＳ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｉｎｎｒａｉｎ ６６， Ａ−６０２０ Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ， Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
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