【課題】腫瘍に関与する複数の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子を提供する。
【解決手段】本発明は、例えばヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、ヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）およびカテプシンＢ（ＣＢ）をコードする配列をコードする複数の遺伝子を標的とする、２つ以上の自己相補的配列を含む多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトを提供する。このコンストラクトを用いて、腫瘍進行が阻害される。

【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
腫瘍進行は、細胞遊走の間の腫瘍細胞接着のモジュレーションおよび組織浸潤の間の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を伴う。プロテアーゼの複雑なバランス、それらの活性化因子およびそれらの阻害因子は、腫瘍浸潤の間に、これらの過程の両方を調節する。３つのクラスのＥＣＭ分解プロテイナーゼは、セリンプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼおよびシステインプロテイナーゼである。ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、ほとんどのマトリックスおよび基底膜構成要素を分解し、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を妨げ得る、プロテアーゼのカスケードを開始させる。細胞表面受容体であるウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合するｕＰＡは、プラスミノゲン活性化の数倍の増大によって示されるように、ＥＣＭ分解に関与する。ｕＰＡはまた、ＥＣＭ構成要素の分解の後に、いくつかの増殖因子を活性化する。ｕＰＡの、その受容体であるｕＰＡＲとの結合は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ならびに転写（開始）経路のシグナル伝達性転写因子（Ｓｔａｔ）経路を含む多数の経路を通じて下流のシグナリング分子を活性化する。
【０００２】
最近のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見によって、癌治療における新しい道が開かれた。ＲＮＡｉは、標的遺伝子の配列と相同な二本鎖ＲＮＡ分子を通じて影響を受ける、配列特異的転写後遺伝子サイレンシング機構である。
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシング機構であり、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって引き起こされ、ｄｓＲＮＡに相同な配列を有するｍＲＮＡの分解を引き起こす。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖が標的とする遺伝子の転写産物に相補的である、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の形成に依存する。配列特異的阻害ＲＮＡｉはまた、哺乳動物細胞中で誘導され得る。ＲＮＡｉのある実行において、哺乳動物細胞中の標的ｍＲＮＡの選択的分解は、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でのトランスフェクションによって達成され、標的の迅速で効率的な分解につながった。これらのｓｉＲＮＡは、文書によって十分立証された、哺乳動物細胞中のより長い二本鎖ＲＮＡによって引き起こされる非特異的効果を避けることが示された。
【０００４】
前立腺癌は、米国人男性で２番目に多い悪性腫瘍であり、２００４年には推定２３０，１１０人の新しい症例およびおよそ３０，０００件の死亡例があった。このように、前立腺癌は、米国および世界中で主要な公衆の健康問題を提起する。現在、転移性前立腺癌は不治であり、最終的には患者の生命を奪う。前立腺癌の相対的な重大さの要因は、転移を引き起こす、構成要素の腫瘍細胞の侵襲性である。腫瘍細胞の侵襲性の性質は、癌転移に特徴的である。腫瘍細胞浸潤および転移は、３つの顕著な段階である、細胞外マトリックスへの悪性（新生物）細胞の接着、マトリックスが分解されて原発腫瘤から細胞が放出されること、および腫瘍細胞が二次標的へ遊走することの、複雑な過程である。
【０００５】
多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、高度に抗療性の、高度に悪性の中枢神経系原発新生物である。神経膠芽腫を治療に対して抵抗性にしているある特性は、腫瘍細胞が正常な脳組織に侵潤する傾向である。正常な脳組織に影響する療法は、許容されない。したがって、侵襲性は、ヒト神経膠腫の悪性の性質の主要な決定要因である。びまん性単細胞浸潤は、組織学的グレードにかかわらず全ての神経膠腫瘍で起こり、宿主の細胞およびＥＣＭ障壁を通る、新生物細胞の移動と定義される。悪性神経膠腫は、正常な脳組織と比較してより高レベルのｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９を発現する。
【０００６】
ＭＭＰは、細胞外マトリックスタンパク質を分解し、運動性を促進するシグナル伝達カスケードを活性化し、ＧＢＭ運動性に関与するトランスホーミング増殖因子β等の増殖因子を活性化することによって、腫瘍細胞浸潤を促進する。ゼラチナーゼＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現は、神経膠腫を含む種々の癌の侵潤能力および転移能力と相関がある。ＭＭＰ−９レベルは、神経膠腫悪性腫瘍の組織学的グレードと高度に相関があった。ＭＭＰ−９は、インビトロで神経膠／内皮共培養物中の内皮細胞形態形成および毛細血管形成に関連性がある。ＭＭＰはまた、腫瘍新脈管形成を調節し、腫瘍新生血管形成の間に起こる「新脈管形成スイッチ」に必要かもしれない。
【０００７】
システインプロテアーゼであるカテプシンＢのタンパク質分解活性は、フィブロネクチン、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンおよびラミニンを含む、ＥＣＭタンパク質の直接の分解を伴う。カテプシンＢはまた、メタロプロテイナーゼならびに可溶性および受容体結合型の両方のウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）を含む、ＥＣＭ分解を媒介するタンパク質分解カスケードに関係する他の酵素を、間接的に活性化する。また、カテプシンＢは、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）を不活性化することによって、ＭＭＰ活性を増大させることが示唆されている。したがって、カテプシンＢは、プロ−ｕＰＡ／プラスミノゲンおよびプロ−ＭＭＰの活性化における、重要な上流の調節因子であり得る。カテプシンＢはまた、シトクロムｃ放出ならびにカスパーゼ９および３の活性化（アポトーシスのミトコンドリア経路における重要な現象）を引き起こすことによって、アポトーシスに寄与することが示されている。カテプシンＢ発現の増大およびその阻害因子レベルの減少は、種々の癌の腫瘍増殖、血管新生、浸潤および転移と関連付けられた。
【０００８】
腫瘍に関与する複数の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子が、治療組成物を開発するのに望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトは、例えばヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、ヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）およびカテプシンＢ（ＣＢ）をコードする配列をコードする複数の遺伝子を標的とする、２つ以上の自己相補的配列を含む。コンストラクトを用いて、腫瘍進行が阻害される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
腫瘍形成の阻害および予め形成された腫瘍の退行に使用される、少なくとも第一および第二の自己相補的配列を含む多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクト。
（項目２）
前記第一の自己相補的配列がヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）のヌクレオチド配列およびその相補物を含み、前記第二の自己相補的配列がヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）のヌクレオチド配列およびその相補物を含む、項目１に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目３）
前記ｕＰＡの自己相補的配列が
【化１】

であり、前記ｕＰＡＲの自己相補的配列が
【化２】

である、項目２に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目４）
前記ｕＰＡＲおよびｕＰＡの自己相補的配列が、約２２〜３５塩基対の長さの介在配列によって分離されている、項目３に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目５）
前記介在配列が
【化３】

である、項目４に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目６）
前記第一の自己相補的配列がウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）のヌクレオチド配列およびその相補物を含み、前記第二の自己相補的配列がマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）のヌクレオチド配列およびその相補物を含む、項目１に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目７）
前記ｕＰＡＲの自己相補的配列が
【化４】

であり、前記ＭＭＰ−９の自己相補的配列が
【化５】

である、項目６に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目８）
各ループが９個のヌクレオチドを含む、項目３または７に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目９）
各ループが
【化６】

である、項目８に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目１０）
前記自己相補的配列が、長さ約２２〜３５塩基対の介在配列によって分離されている、項目１に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目１１）
前記介在配列が
【化７】

である、項目１０に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目１２）
前記コンストラクトが環状核酸である、項目１に記載の多シストロン性コンストラクト。
（項目１３）
（ａ）項目１に記載の低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトを腫瘍に投与すること、
（ｂ）該腫瘍において発現されて低分子干渉ＲＮＡコンストラクトに標的とされる複数の遺伝子の発現を減少させて、それによって該腫瘍を阻害すること
を包含する、腫瘍形成の阻害または予め形成された腫瘍の退行の方法。
（項目１４）
前記低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトが、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）を標的とする、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトが
【化８】

を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
腫瘍細胞増殖、腫瘍細胞浸潤、腫瘍細胞遊走および新脈管形成の少なくとも１つを減少させることによって腫瘍が阻害される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記腫瘍が、前立腺癌、神経膠腫、乳癌、および黒色腫からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記コンストラクトが直接の送達によって投与される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトが、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を標的とする、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトが
【化９】

を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を標的とするＲＮＡ分子であって、該低分子干渉
ＲＮＡ分子が核酸配列
【化１０】

を含む、ＲＮＡ分子、ならびに
（ｂ）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）を標的とするＲＮＡ分子であって、該低分子干渉ＲＮＡ分子が核酸配列
【化１１】

を含む、ＲＮＡ分子
からなる群より選択される、低分子干渉ＲＮＡ分子。
（項目２２）
項目１に記載の多シストロン性コンストラクトで形質転換された、組換え細胞。
（項目２３）
項目１に記載の多シストロン性コンストラクトで形質転換された、組換えウイルス。
【００１０】
多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトは、少なくとも、腫瘍を阻害するのに用いられる第一および第二の自己相補的配列を含む。ある実施形態において、第一の自己相補物はヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）のヌクレオチド配列を含み、第二の自己相補的配列はヒトウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）のヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
ｕＰＡの自己相補的配列は、
【００１２】
【化１２】

であり、ｕＰＡＲの自己相補的配列は
【００１３】
【化１３】

である。ループは、ＧＣの欠乏した約９個のヌクレオチドを含む。適したループ配列ヌクレオチド配列は
【００１４】
【化１４】

であり、「適した」は、適切に作用することを意味する。ｕＰＡＲおよびｕＰＡの自己相補的配列は、一般に、長さ約２２〜３５塩基対の介在配列によって分離される。例えば、介在配列は
【００１５】
【化１５】

である。多シストロン性コンストラクト中のｕＰＡＲおよびｕＰＡの自己相補的配列は、プロモーター、通常は単一のものに、操作作可能に連結されている。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの多シストロン性コンストラクトは、環状核酸または線状核酸である。
【００１６】
多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトは、少なくとも、腫瘍を阻害するための第一および第二の自己相補的配列を含む。ある実施形態において、第一の自己相補的配列はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）のヌクレオチド配列を含み、第二の自己相補的配列はマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）のヌクレオチド配列を含む。ｕＰＡＲの自己相補的配列は
【００１７】
【化１６】

であり、ＭＭＰ−９の自己相補的配列は
【００１８】
【化１７】

であり、ループは、ＧＣの欠乏した約９個のヌクレオチドを含む。適したループ配列としては、ヌクレオチド配列
【００１９】
【化１８】

が挙げられる。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の自己相補的配列は、一般に、長さ約２２〜３５塩基対の介在配列によって分離される。介在配列は、
【００２０】
【化１９】

である。ｕＰＡＲ−ＭＭＰ−９コンストラクトは、環状または線状核酸である。
【００２１】
多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトは、少なくとも、腫瘍を阻害するのに用いられる、第一および第二の自己相補的配列を含む。ある実施形態において、第一の自己相補物は、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）のヌクレオチド配列を含み、第二の自己相補的配列はカテプシンＢ（ＣＢ）のヌクレオチド配列を含む。ｕＰＡＲの自己相補的配列は
【００２２】
【化２０】

であり、ＣＢの自己相補的配列は
【００２３】
【化２１】

であり、ループは、ＧＣの欠乏した約９個のヌクレオチドを含む。適したループ配列としては、ヌクレオチド配列
【００２４】
【化２２】

が挙げられる。ｕＰＡＲおよびＣＢの自己相補的配列は、一般に、長さ約２２〜６８塩基対の介在配列によって分離される。介在配列は、
【００２５】
【化２３】

である。ｕＰＡＲ−ＣＢコンストラクトは、環状または線状核酸である。
【００２６】
多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトは、少なくとも、腫瘍を阻害するための、第一、第二および第三の自己相補的配列を含む。第一の自己相補物はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）のヌクレオチド配列を含み、第二の自己相補物はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）のヌクレオチド配列を含み、第三の自己相補物はマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）のヌクレオチド配列を含む。ｕＰＡＲの自己相補的配列は
【００２７】
【化２４】

であり、ｕＰＡの自己相補的配列は
【００２８】
【化２５】

であり、ＭＭＰ−９の自己相補的配列は
【００２９】
【化２６】

である。ループは、ＧＣの欠乏した約９個のヌクレオチドを含む。ループ配列としては、ヌクレオチド配列
【００３０】
【化２７】

が挙げられる。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の自己相補的配列は、一般に、長さ約２２〜６８塩基対の介在配列によって分離される。介在配列は、
【００３１】
【化２８】

である。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ領域は、
【００３２】
【化２９】

のヌクレオチド配列を含む約２２〜３５塩基によって分離される。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ−ＭＭＰ−９コンストラクトは、線状または環状核酸である。
【００３３】
多シストロン性低分子干渉ＲＮＡコンストラクトは、少なくとも、腫瘍を阻害するための、第一および第二の自己相補的配列を含む。第一の自己相補的配列は、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）のヌクレオチド配列を含み、第二の自己相補的配列は、カテプシンＢ（ＣＢ）のヌクレオチド配列を含む。ＭＭＰ−９の自己相補的配列は
【００３４】
【化３０】

であり、ＣＢの自己相補的配列は
【００３５】
【化３１】

であり、ループは、ＧＣの欠乏した約９個のヌクレオチドを含む。ループ配列としては、ヌクレオチド配列
【００３６】
【化３２】

が挙げられる。ＭＭＰ−９およびＣＢの自己相補的配列は、一般に、長さ約２２〜３７塩基対の介在配列によって分離される。介在配列は、
【００３７】
【化３３】

である。ＭＭＰ−９−ＣＢコンストラクトは、環状または線状核酸である。
【００３８】
腫瘍を阻害する方法、方法は、
（ａ）低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトを投与する工程、および
（ｂ）腫瘍中で発現される複数の遺伝子の発現を減少させ、それによって腫瘍の形成または増殖を阻害し、すでに存在する腫瘍を退行させる工程
を含む。
【００３９】
例えばウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）を標的とし、それによってｕＰＡＲおよびｕＰＡの発現を減少させ、腫瘍を阻害する、低分子形成または干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトを使用する方法。低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトとしては、ヌクレオチド配列
【００４０】
【化３４】

が挙げられる。「介在配列」の別の用語は、「スペーサー」である。腫瘍細胞増殖、腫瘍細胞浸潤、腫瘍細胞遊走および新脈管形成の少なくとも１つを減少させることによって、腫瘍が阻害される。腫瘍としては、前立腺癌、神経膠腫、乳癌、および黒色腫が挙げられる。コンストラクトは、ウイルスベクターを通じて送達されるか、または直接の送達を通じて、もしくは当業者に公知の任意の適した方法によって、投与される。
【００４１】
低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトを使用する方法はまた、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を標的とし、それによってｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の発現を減少させ、腫瘍を阻害する。低分子干渉ＲＮＡ多シストロン性コンストラクトとしては、ヌクレオチド配列
【００４２】
【化３５】

が挙げられる。腫瘍細胞増殖、腫瘍細胞浸潤、腫瘍細胞遊走および新脈管形成の少なくとも１つを減少させることによって、腫瘍が阻害される。腫瘍としては、前立腺癌、神経膠腫、乳癌、および黒色腫が挙げられる。コンストラクトは、ウイルスベクターを通じて送達されるか、または直接の送達を通じて、もしくは当業者に公知の任意の適した方法によって、投与される。
【００４３】
腫瘍を阻害する方法は、
（ａ）ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９およびＣＢの少なくとも１つを標的とする多シストロン性コンストラクトを投与する工程、ならびに
（ｂ）ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９およびＣＢの少なくとも１つの発現を減少させ、それによって腫瘍を阻害する工程
を含む。
【００４４】
低分子干渉ＲＮＡ分子としては、
（ａ）核酸配列
【００４５】
【化３６】

を含む、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を標的とするＲＮＡ分子、
（ｂ）核酸配列
【００４６】
【化３７】

を含む、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）を標的とするＲＮＡ分子、
（ｃ）
【００４７】
【化３８】

の核酸配列を含む、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびカテプシンＢ（ＣＢ）を標的とするＲＮＡ分子、
（ｄ）
【００４８】
【化３９】

の核酸配列を含む、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を標的とするＲＮＡ分子、ならびに
（ｅ）
【００４９】
【化４０】

の核酸配列を含む、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）およびカテプシンＢ（ＣＢ）を標的とするＲＮＡ分子
が挙げられる。
【００５０】
ｕＰＡ−ｕＰＡＲまたはｕＰＡＲ−ＭＭＰ−９またはｕＰＡＲ−ＣＢ、またはｕＰＡ−ｕＰＡＲ−ＭＭＰ−９またはＭＭＰ−９−ＣＢの多シストロン性コンストラクトで形質転換した組換え細胞が、本明細書中に開示される。
【００５１】
ｕＰＡ−ｕＰＡＲまたはｕＰＡＲ−ＭＭＰ−９またはｕＰＡＲ−ＣＢ、またはｕＰＡ−ｕＰＡＲ−ＭＭＰ−９またはＭＭＰ−９−ＣＢの多シストロン性コンストラクトで形質転換した組換えウイルスが、本明細書中に開示される。
略語
ｕＰＡはウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を意味する。ｕＰＡＲはウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体を意味する。ＭＭＰ−９はマトリックスメタロプロテイナーゼ９を意味する。ＣＢはカテプシンＢを意味する。ＣＭＶはサイトメガロウイルスを意味する。ＳＶ４０はシミアンウイルス４０型を意味する。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質を意味する。ＥＣＭは細胞外マトリックスを意味する。ｓｉＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡを意味する。ｓｈＲＮＡは低分子ヘアピンＲＮＡを意味する。ＲＮＡｉはＲＮＡ干渉を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現レベル、ならびにヒト前立腺癌細胞系の浸潤能力と相互関係のある、ｕＰＡ活性を示す。内在性ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現を、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３の前立腺癌細胞系から単離された全細胞タンパク質の免疫ブロット解析によって調べた。等しい量の、３つ全ての細胞系の細胞抽出物から単離されたタンパク質を、抗ｕＰＡ、抗ｕＰＡＲおよび抗ＧＡＰＤＨ抗体での免疫ブロットに供した。ＧＡＰＤＨをローディング対照（Ａ）として利用した。前立腺癌細胞系におけるｕＰＡ活性を、フィブリンザイモグラフィーによって評価した。等しい量の、血清を含まない培地中の前立腺癌細胞由来のタンパク質を、非還元性条件下で、フィブリノーゲンおよびプラスミノゲンを含有する１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００洗浄でＳＤＳを交換した後、ゲルをグリシンバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）中でインキュベートした。アミノブラック染色およびそれに続くメタノール−酢酸での脱染の後の明確な溶解バンドとして、フィブリン溶解活性を検出した（Ｂ）。前立腺癌細胞系のインビトロ浸潤能力の比較（Ｃ）。マトリゲルで被覆された１２μｍの孔を有するポリカーボネートフィルターを含む１２ウェルトランスウェルチャンバー中で浸潤アッセイを行った。フィルターの下面に通過した細胞を染色し、２００×倍率で、顕微鏡下で写真を撮った（Ｃ）。２００×倍率で、顕微鏡下、３つの無作為な視野で、マトリゲルを通して浸潤している細胞を計数した。各バーは３つの視野の平均値±ＳＤを表し、検出不可能なｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現を示した低または非転移ＬＮＣａＰ細胞からの有意な差をアスタリスク＊で現す（Ｐ＜０．０５）（Ｄ）。
【図２】図２は、前立腺癌細胞系ＰＣ３における、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のＲＮＡｉノックダウンを示す。ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲプラスミドコンストラクトの概略図（Ａ）。コンストラクトは、ヒトＣＭＶプロモーターならびにｕＰＡおよびｕＰＡＲを標的とする相同配列からなる。発現の後、強力なＣＭＶプロモーターが、ｕＰＡおよびｕＰＡＲに特異的な低分子ヘアピン分子の形成を駆動する。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩベースのＣＭＶプロモーター終止シグナルとする。Ｄｉｃｅｒ／Ｄｒｏｓｈａは、ｕＰＡおよびｕＰＡＲに特異的なｓｈＲＮＡをプロセシングし、得られるｓｉＲＮＡ分子は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの標的遺伝子と相互作用する。この相互作用によって、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ遺伝子発現の同時のノックダウンが生じる。ｓｈＲＮＡトランスフェクトＰＣ３細胞から抽出されたＲＮＡの半定量的逆転写ＰＣＲ（Ｂ）。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを対照として同時増幅した。ｓｈＲＮＡトランスフェクトＰＣ３細胞から抽出された全タンパク質溶解物の免疫ブロット（Ｃ）。ｍｏｃｋ、ＥＶおよびＳＶトランスフェクト細胞中にｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方のバンドが存在する。したがって、各遺伝子特異的ｓｈＲＮＡレーンは、適切なバンドの有意な減少を示す。ＧＡＰＤＨが、ローディング対照として含まれた。ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現レベルを、ＰＣ３細胞中での間接免疫蛍光法を用いても検出した。ＥＶ、ＳＶおよびｍｏｃｋ細胞でトランスフェクトしたＰＣ３細胞は、ｕＰＡ（ＦＩＴＣ）およびｕＰＡＲ（テキサスレッド）の免疫蛍光検出に陽性に染色した（Ｄ）。遺伝子特異的ｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞は、その後、ＥＶ／ＳＶトランスフェクトおよびｍｏｃｋ細胞と比較して、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの細胞染色プロフィールを変化させた。ＤＡＰＩで、核対比染色を得た。（結果は、少なくとも３つの別々の実験の代表である。）
【図３】図３は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のＲＮＡｉノックダウンがＰＣ３細胞の浸潤能力を阻害することを示す。ｍｏｃｋ細胞および示されたｓｈＲＮＡプラスミドでトランスフェクトされた細胞の浸潤能力を、マトリゲル浸潤アッセイで調べた（１つの実験の代表的な視野）（Ａ）。本明細書中に記載されるように行った浸潤アッセイ（図１Ｃ参照）。マトリゲルを通って浸潤している細胞の代表的な数を、顕微鏡下、３つの無作為な視野で、２００×で計数した（Ｂ）。各バーは、計数した３つの視野の平均値ＳＤを表す。対照（すなわち、ｍｏｃｋまたはスクランブルベクタートランスフェクト細胞）からの有意な差を、アスタリスク＊によって示す（Ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のＲＮＡｉノックダウンが細胞増殖を阻害し、ＰＣ３細胞におけるアポトーシスを誘導することを示す。遺伝子特異的ｓｈＲＮＡプラスミドまたは対照（ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞）のいずれかでトランスフェクトしたＰＣ３細胞の生存能を、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイによって明らかにした（Ａ）。各バーは、平均値ＳＤの三連の解析を表し、対照からの有意な差をアスタリスク＊で表す（Ｐ＜０．０５）。代表的な免疫ブロットは、ｕＰＡ−ｕＰＡＲノックダウンＰＣ３細胞におけるアポトーシス促進性遺伝子発現の変化を示す（Ｂ）。ＧＡＰＤＨを、ローディング対照として用いた。活性化したカスパーゼに結合する細胞透過性カスパーゼ阻害因子であるＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＡＫを用いた蛍光標識（下のパネル）で、カスパーゼ活性をインサイチューで検出した（Ｃ）。ＤＡＰＩで核染色を行った（上のパネル）。ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした相当な数の細胞が、緑色蛍光を示した。共焦点顕微鏡下の３つの無作為な視野からのＤＡＰＩ／ＦＭＫ−ＶＡＤ−ＦＡＫ標識細胞比の定量的データを示す棒の図表（Ｄ）。ＤＡＰＩ対ＦＭＫ−ＶＡＤ−ＦＡＫの比は、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞で有意に増大した。ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞からの有意な差を、アスタリスク＊で示す（Ｐ＜０．０５）。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした細胞およびアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ、０．２ｇ／ｍｌ）で処理した細胞で、ＤＮＡ標識が観察された（Ｅ）。エチジウムブロマイドでアガロースゲルを染色し、ＵＶ光下で写真を撮った。キロベースペアの参照として、２．０、１．５、１．０、０．７５および０．５ｋｂの標準バンドのＤＮＡマーカーを電気泳動した（レーンＭ）。
【図５】図５は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のＲＮＡｉノックダウンがＰＣ３細胞で下流のシグナリングを阻害することを示す。ｍｏｃｋおよびｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞における、全体的およびリン酸化形態の細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８およびＪＮＫの免疫ブロット解析（Ａ）。ｍｏｃｋ、ＥＶ、ＳＶ、ｓｈ−ｕＰＡ、ｓｈ−ｕＰＡＲおよびｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトしたＰＣ３細胞を７２時間後に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続く、全体的およびリン酸化形態のＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ抗体での免疫ブロットに供した。ＧＡＰＤＨ抗体を用いて、各レーンに同じ量のタンパク質がロードされたことを確かめた。ｍｏｃｋおよびｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞におけるＳｔａｔ３タンパク質の免疫ブロット解析（Ｂ）。等しい量のタンパク質をロードし、チロシン７０５に対するリン酸特異的Ｓｔａｔ３抗体および非リン酸化形態のＳｔａｔ３に対する抗体を用いて、免疫ブロットを行った。ＧＡＰＤＨが、ローディング対照として含まれた。ｍｏｃｋおよびｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞の電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｃ）。タンパク質−ＤＮＡ複合体を、６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、乾燥し、放射能写真を撮った。示されるｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞から調製された核抽出物の特異的ＤＮＡ結合活性を、上に示す。遊離プローブの位置を示す。
【図６】図６は、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ発現のＲＮＡｉノックダウンが同所マウス前立腺腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を排除することを示す。同所ＰＣ３腫瘍を有するマウスの各処理群からの代表的なインサイチューの写真（Ａ）。原発性前立腺腫瘍を破線の矢印で標識し、一色の矢印は転移の位置を示す。ＰＣ３細胞をヌードマウスに前立腺内移植し、ＰＣ３前立腺腫瘍を確立し、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびｕＰＡｕＰＡＲに特異的なｓｈＲＮＡで処理した。これらのコンストラクトの４週間の処理後、マウスを屠殺し、原発性前立腺腫瘍増殖および転移を視覚的に評価した。各ｓｈＲＮＡ処置群からの切開した前立腺腫瘍の比較（Ｂ）。各バーは、１つの群あたり６匹の動物の平均腫瘍重量ＳＤを表す。対照群（すなわち、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶ処理）からの有意な差を、アスタリスク＊で表す（Ｐ＜０．０５）。１つの群あたり６匹の動物のＰＣ３前立腺腫瘍から抽出したタンパク質試料を、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現レベルに関する免疫ブロットを用いて解析した（Ｃ）。ＧＡＰＤＨが、ローディング対照として含まれた。
【図７】図７は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のＲＮＡｉノックダウンが同所マウス前立腺腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を同時に排除することを示す。同所ＰＣ３腫瘍を有するマウスの各処理群からの代表的なインサイチューの写真（Ａ）。原発性前立腺腫瘍を破線の矢印で標識し、一色の矢印は転移の位置を示す。ＰＣ３細胞をヌードマウスに前立腺内移植し、ＰＣ３前立腺腫瘍を確立し、ｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲベクターの両方を同時注射した。これらのコンストラクトの４週間の処理後、マウスを屠殺し、原発性前立腺腫瘍増殖および転移を視覚的に評価した。各ｓｈＲＮＡ処置群からの切開した前立腺腫瘍の比較（Ｂ）。各バーは、１つの群あたり６匹の動物の平均腫瘍重量ＳＤを表す。対照群（すなわち、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶ処理）からの有意な差を、アスタリスク＊で表す（Ｐ＜０．０５）。１つの群あたり６匹の動物のＰＣ３前立腺腫瘍から抽出したタンパク質試料を、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現レベルに関する免疫ブロットを用いて解析した（Ｃ）。ＧＡＰＤＨが、ローディング対照として含まれた。同所ＰＣ３前立腺腫瘍の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン切片（Ｄ）。実験の終わりに、各処置群から原発性前立腺腫瘍を採取した。ホルマリン中で腫瘍を固定し、パラフィンに包埋した。組織切片（５ｍ）を調製し、組織病理学的解析のために、Ｈ＆Ｅで染色した。示される処置群からの確立した前立腺腫瘍からの顕微解剖したパラフィン切片のＤＮＡ ｆｒａｇＥＬ染色（Ｅ）。ＤＮＡ断片末端標識アッセイを行った。２００×倍率である四角を除いて、結果を４０×倍率で示す。１つの処置群あたり６つの無作為な視野からのＤＮＡ ｆｒａｇＥＬ標識細胞の定量的データを示す棒の図表（Ｆ）。対照群からの有意な差を、アスタリスク＊で示す（Ｐ＜０．０５）。
【図８】図８は、ｐＵＭベクターからのｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ発現の概略図を示す。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９に対するＣＭＶプロモーターによって駆動する２つの相補的逆方向反復を有するｐｃＤＮＡ３プラスミドコンストラクトを開発した。ＣＭＶプロモーターは、次に二本鎖ＲＮＡ認識酵素ＤＩＣＥＲによってプロセシングされて実行可能なｓｉＲＮＡ分子を形成する、二重のヘアピン構造の形成を駆動する。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリａシグナル配列によって駆動するポリＡ尾部を有するｍＲＮＡ分子によく似ている分子の二次構造のために、二重のヘアピン分子の安定性が確実になる。
【図９】図９は、長いヘアピン（ｈｐ）ＲＮＡがｓｉＲＮＡにプロセシングされ、分子がＳＮＢ１９細胞において対照／ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトされるかどうかを示し、細胞はまた、非ＧＦＰ細胞においてＧＦＰを標的とする関連のないコンストラクトによってもトランスフェクトして、適切なｓｉＲＮＡ分子のプロセシングを測定した。２％アガロースゲルで分画した低分子ＲＮＡ分子を、６×ＳＳＣ存在下で、適切なＤＩＧ標識センスオリゴでハイブリダイズさせた。得られたハイブリッド溶液を１５％ポリアクリルアミドゲルに流し、ナイロン膜にエレクトロブロットした。製造業者の使用説明書どおりに、膜を処理して、２１ｂｐ ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを可視化した。使用したプローブを数（表１参照）、１−ｓｕＰＡＲ、２−ｓＭＭＰ−９および３−ｓＧＦＰとして表す（図９Ａ）。当業者に公知の標準的なプロトコールどおりに、ＳＮＢ１９細胞を、対照／ＥＶ（レーンａ）、ＳＶ（レーンｂ）、ｐｕＰＡＲ（レーンｃ）、ｐＭＭＰ−９（レーンｄ）およびｐＵＭ（レーンｅ）でトランスフェクトした。７２時間後、全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン）を用いて、ファーストストランドｃＤＮＡを合成した（図９Ｂ）。ファーストストランドｃＤＮＡをｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の鋳型として用いて、ＰＣＲ反応を構成した。ＧＡＰＤＨのためのＰＣＲもまた構成し、ローディング対照とした（表１参照）。
【図１０】図１０は、ｕＰＡＲのウエスタンブロット解析およびＭＭＰ−９のゼラチンザイモグラフィーを特徴付ける。ＳＮＢ１９細胞を、ｍｏｃｋ、空の／スクランブルベクターならびにｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の単一または２シストロン性ｓｉＲＮＡをコードするベクター（ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９、ｐＵＭ）でトランスフェクトした。（Ａ）ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞からの細胞溶解物中のｕＰＡＲタンパク質発現のウエスタンブロット解析。ｕＰＡＲに特異的な抗体を用いて、ウエスタンブロット解析を行った。ＧＡＰＤＨを同時に免疫検出して、同じ量の細胞溶解物をロードしたことを確かめた。（Ｂ）ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭからのトランスフェクトした細胞からの等しい量のタンパク質（２０μｇ）を含有する馴化培地を、ラエムリ試料バッファーと混合し、０．１％ゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流して、ゼラチンザイモグラフィーによってＭＭＰ−９活性を測定した。
【図１１】図１１は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性ダウンレギュレーションがＳＮＢ１９神経膠腫細胞増殖を減少させることを示す。簡潔に述べると、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＣＭでトランスフェクトした５×１０^４個のＳＮＢ１９細胞を、血清を含まない条件下で、ＶＮコートした９６ウェルマイクロプレートに播種した。生存能のある細胞の数を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
【図１２】図１２は、免疫組織化学的解析および腫瘍誘導性新脈管形成によって示されるように、ＲＮＡｉがｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９レベルを減少させたことを示す。（Ａ）ＳＮＢ１９細胞を、ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした。対照または非トランスフェクト細胞もまた用いた。トランスフェクションの７２時間後、細胞を固定し、処理して、インビボのｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９発現を可視化した。ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて細胞をマウントして、核を可視化した。（Ｂ）ＳＮＢ１９細胞（２×１０^４）を８ウェルチャンバースライドに播種し、ｍｏｃｋ ＥＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を４×１０^４個のヒト微小血管皮膚内皮細胞とともに共培養した。７２時間後、内皮細胞を第ＶＩＩＩ因子抗原に対する抗体またはＨ＆Ｅ染色でプローブし、共焦点走査型レーザー顕微鏡下で調べた。（Ｃ）ｍｏｃｋ ＥＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭベクターまたはｐＵＭベクターでトランスフェクトした共培養物における新脈管形成の定量化。値は、３つの異なる実験からの平均値±Ｓ．Ｄ．である。マウス背側ウインドウアッセイによる、ｐＵＭベクターにおける腫瘍新脈管形成の阻害（Ｄ）。ＰＶ、既存の脈管構造、ＴＮ、腫瘍が脈管構造を誘導する。
【図１３】図１３は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡがＳＮＢ１９細胞の浸潤を阻害することを示す。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞（１×１０^６）をマトリゲルでコートされたトランスウェルインサート（８μｍの孔）を通して２４時間遊走させた。マトリゲルでコートしたインサートを通して浸潤した細胞を染色し、計数し、光学顕微鏡下、２０×倍率で写真を撮った。（Ａ）浸潤のパーセンテージを定量化した。値は、５つの異なる実験からの平均値±Ｓ．Ｄ．である（Ｐ＜０．００１）。直径１００〜２００μｍのＳＮＢ１９細胞スフェロイド（蛍光）を選択し、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトし、ラット胎仔脳凝集物（緑色蛍光）とともに共培養した。ラット胎仔脳凝集物の進行性の破壊およびＳＮＢ１９細胞の浸潤を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、７２時間にわたって観察した。（Ｃ）。２４、４８および７２時間の脳凝集物または腫瘍スフェロイドの残りの体積を、画像解析ソフトウエアを用いて定量化した（Ｄ）。
【図１４】図１４は、予め確立された大脳内の細胞増殖でのＲＮＡｉ媒介性退行を解析する。ＳＮＢ１９−ＧＦＰ神経膠芽腫細胞をヌードマウスに大脳内注射した（１０μｌのリン酸緩衝生理食塩水中２×１０^６個の細胞）。１０日後、ｍｏｃｋ ＥＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭ（Ａｌｚｅｔミニポンプを用いて、０．２５μｌ／時間の速度で１５０μｇの各ベクターを脳に注射した（各群中８匹のマウス））。腫瘍切片の顕微鏡写真を、ＧＦＰ蛍光（Ａ）に関して調べ、それに続いて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（Ｂ）。これらの細胞の大脳内注射の４〜６週間後のｍｏｃｋ ＥＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭベクター処置群における腫瘍体積の半定量化（Ｃ）。示されるデータは、各群からの８匹の動物からの±Ｓ．Ｄ．値である。他の組の実験において、ＳＮＢ１９ ＧＦＰ細胞の大脳内注射の１０日後に、ｐＵＭベクターを３日の間隔で２回腹腔内注射し、４ヵ月後に動物を屠殺した。
【図１５】図１５は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性ダウンレギュレーションがＥＲＫ、ＭＡＰＫおよびＡＫＴのリン酸化を減少させることを示す。全体的およびリン酸化形態のＭＡＰＫ、ＥＲＫおよびＡＫＴのウエスタンブロット解析。ＳＮＢ１９細胞を、血清を含まない馴化細胞下で、ＶＮコートしたプレート上で、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトし、７２時間後に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに全体的およびリン酸化形態のＭＡＰＫ、ＥＲＫおよびＡＫＴ抗体での免疫ブロットに供した。ＧＡＰＤＨ抗体を用いて、各レーンに同じ量のタンパク質がロードされたことを確かめた。
【図１６】図１６は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９ベクター（Ａ）ならびに細胞表面での細胞の現象（Ｂ）の該略図である。プラスミンへのプラスミノゲンの活性化の後、これは次にＭＭＰ、ＥＣＭの分解後のいくつかの増殖因子のｕＰＡ放出を活性化する。該略図は、いくつかのシグナリング経路分子におけるインテグリンの関与を示した。
【図１７】図１７は、カテプシンＢおよびｕＰＡＲの単一のＣＭＶ駆動二重逆方向反復コンストラクトからのｈｐＲＮＡ分子の形成を示す概略図である。ＣＭＶウイルスプロモーターは、カテプシンＢおよびｕＰＡＲの自己相補的逆方向反復を有するＲＮＡ分子の形成を駆動させる。
【図１８】図１８は、ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのウエスタンブロット解析を示す。ＳＮＢ１９細胞を、ｍｏｃｋ、空のベクターならびにカテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡをコードするベクター（ｐＣＵ）でトランスフェクトした。ｍｏｃｋ、空のベクターおよびｐＣＵでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞からの細胞溶解物中のカテプシンＢ（Ａ）ｕＰＡＲ（Ｃ）タンパク質レベルのウエスタンブロット解析を、カテプシンＢおよびｕＰＡＲに特異的な抗体を用いて行った。ローディング対照のために、β−アクチンを同時に免疫プローブした。カテプシンＢ（Ｂ）およびｕＰＡＲタンパク質（Ｄ）の定量化を、放射能写真を濃度計でスキャンすることによって得た。
【図１９】図１９は、ＲＮＡｉが腫瘍細胞誘導性毛細血管網形成を阻害することを示す。ＳＮＢ１９細胞を、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵで２４時間トランスフェクトした。次いで、細胞をヒト皮膚内皮細胞とともに４８時間共培養した。インキュベーションの後、細胞を固定し、２％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックし、内皮細胞を第ＶＩＩＩ因子抗原に対する抗体（第ＶＩＩＩ因子抗体、ＤＡＫＯコーポレーション、カリフォルニア州カーピンテリア）またはＨ＆Ｅ染色でプローブし、レーザー走査型共焦点顕微鏡下で調べた（Ａ）。ｍｏｃｋ、空のベクターまたはｐＣＵベクターで感染させた共培養物における新脈管形成の定量化（Ｂ）。マウス背側ウインドウアッセイによる、ｐＣＵベクターで感染させたＳＮＢ１９細胞における腫瘍新脈管形成の阻害（Ｃ）。ＰＶ−既存の脈管構造、ＴＮ−腫瘍誘導性脈管構造。
【図２０】図２０は、ＲＮＡｉが神経膠腫細胞遊走および浸潤を阻害することを示す。ＳＮＢ１９ ＧＦＰスフェロイドを、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵで感染させた。７２時間後、単一の神経膠腫スフェロイドを、９６ウェルプレート中、ビトロネクチンコートしたウェルの中央に入れ、４８時間培養した。遊走アッセイの終わりに、スフェロイドを固定し、写真を撮った（Ａ）。ステージおよび接眼マイクロメータで較正した顕微鏡を用いて、スフェロイドからの細胞の遊走を測定した（Ｂ）。示されるデータは、各群からの４つの独立した実験からの結果の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。ＳＮＢ１９細胞を、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵおよびｐｃＵでのトランスフェクションの７２時間後にトリプシン化し、ＰＢＳで洗浄し、血清を含まない培地に再懸濁した。マトリゲルでコートされた８μｍの孔を有するポリカーボネートフィルター上の１２ウェルトランスウェルユニット（コスター、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中、浸潤アッセイを行った。２４時間のインキュベーション期間の後、フィルターからウェル下部へ通過した細胞を染色し、計数し、光学顕微鏡下で写真を撮った（Ｃ）。浸潤のパーセンテージを定量化した（Ｄ）。値は、５つの異なる実験からの平均値±Ｓ．Ｄ．である（Ｐ＜０．００１）。ＳＮＢ１９細胞のスフェロイドを、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵおよびｐｃＵでトランスフェクトし、ＤｉＩで染色し、ＤｉＯ染色したラット胎仔脳凝集物とともに共培養した。腫瘍スフェロイドによる胎仔脳凝集物の進行性の破壊を観察した（Ｅ）。空のベクター、ｐＣ、ｐＵまたはｐＣＵベクターで感染させたＳＮＢ１９スフェロイドによる残りの胎仔脳凝集物の定量化（Ｆ）。
【図２１】図２１は、ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのＲＮＡｉ媒介性ダウンレギュレーションがＳＮＢ１９神経膠腫細胞増殖を減少させることを示す。増殖アッセイ。簡潔に述べると、ＰＢＳ、ＥＶ、ＳＶ、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵでトランスフェクトした５×１０^４個のＳＮＢ１９細胞を、血清を含まない条件下で、ＶＮコートした９６ウェルマイクロプレートに播種した。生存能のある細胞の数を、ＭＴＴアッセイによって評価した。３つの別々の実験からの平均値（±Ｓ．Ｄ．）値が示される。
【図２２】図２２は、ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのＲＮＡｉ媒介性ダウンレギュレーションがＥＲＫおよびＦＡＫのリン酸化を減少させることを示す。ｍｏｃｋ、ＥＶ、ＳＶ、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵコンストラクトでのＳＮＢ１９細胞のトランスフェクションの後の、特異的抗体を用いた、全体的およびホスホＥＲＫ、ＦＡＫ、タンパク質のウエスタンブロット解析。β−アクチンレベルをローディング対照とした。
【図２３】図２３は、予め確立された腫瘍増殖のＲＮＡｉ媒介性退行を示す。定位フレームの助けを借りて、ヌードマウスにＳＮＢ１９ ＧＦＰ腫瘍細胞を大脳内注射した。１週間後、空のベクター、またはカテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡを発現するベクター（ｐＣＵ）のいずれかを、またはｐＣもしくはｐＵによって別々に、Ａｌｚｅｔミニポンプを用いて脳に注射した。腫瘍切片の顕微鏡写真を、ＧＦＰ蛍光で観察し（Ａ）、それに続いてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（Ｂ）。５週間後のｍｏｃｋ／空のベクター、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵベクター処置群における腫瘍体積の半定量化。示される値は、各群からの６匹の動物の±Ｓ．Ｄ．値である（＊Ｐ＜０．００１）（Ｃ）。
【図２４】図２４は、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９の単一のＣＭＶ稼動三重逆方向反復コンストラクトからの、ｈｐＲＮＡ分子の形成の概略である。強力なＣＭＶウイルスプロモーターが、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の自己相補的逆方向反復を有するＲＮＡ分子の形成を駆動させる。
【図２５】図２５は、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９の、ウエスタンブロット、フィブリン／ゼラチンザイモグラフィーおよび免疫組織学的解析である。ＳＮＢ１９細胞を、ｍｏｃｋトランスフェクトするか、または空のベクター／スクランブルベクター（ＥＶ／ＳＶ）およびｓｉＲＮＡ ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）、ＭＭＰ−９（ｐＭＭＰ−９）および３つの組み合わせ（ｐＵ_２Ｍ）をコードするベクターでトランスフェクトした。３日間のインキュベーション期間の後、全細胞溶解物を抽出バッファー中で調製し、これらの試料からの５０μｇのタンパク質を、１２％非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ｕＰＡＲ抗体で免疫ブロットした（Ａ）。ローディング対照として、ＧＡＰＤＨを同時に免疫プローブした。これらの試料から馴化培地を回収し（２０μｇ）、ゼラチンおよびフィブリンザイモグラフィーを行って、ＭＭＰ−９（Ｂ）およびｕＰＡ活性（Ｃ）を検出した。（Ｄ）ＳＮＢ１９細胞（１×１０^４）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライド上に播種し、ｍｏｃｋトランスフェクトするか、またはＥＶ／ＳＶ、ならびにｓｉＲＮＡ ｐｕＰＡ、ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９を単独で、または組み合わせて（ｐＵ_２Ｍ）コードするベクターでトランスフェクトした。７２時間後、細胞を固定し、ブロッキングバッファーで１時間洗浄し、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９に対する特異的な抗体を用いて、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９発現に関して染色した。
【図２６】図２６は、ｓｉＲＮＡコンストラクトによる、神経膠腫新脈管形成および浸潤の阻害を示す。ＳＮＢ１９細胞（２×１０^４）を、８ウェルチャンバースライド上に播種し、ＥＶ／ＳＶ、ならびにｓｉＲＮＡ ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）、ＭＭＰ−９（ｐＭＭＰ−９）および３つの組み合わせ（ｐＵ_２Ｍ）をコードするベクターでトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション期間の後、培地を除去し、細胞を、４×１０^４個のヒト内皮細胞とともに共培養するか、または４×１０^４個のヒト内皮細胞のみを馴化培地の存在下で増殖させた。７２時間後、内皮細胞を、共培養物中の第ＶＩＩＩ因子抗原に関して染色した（緑色蛍光）。保存された馴化培地中で増殖した細胞をＨ＆Ｅ染色し、蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡下のいずれかで調べた（Ａ）。（Ｂ）ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍベクターに感染させた共培養物における新脈管形成の定量化。値は、４つの実験の平均値±ＳＤである。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでのトランスフェクションの７２時間後に、ＳＮＢ１９細胞をトリプシン化し、ＰＢＳで洗浄し、血清を含まない培地中に再懸濁した。（Ｃ）マトリゲル（０．７ｍｇ ｍｌ^−１）でコートされた８μｍの孔を有するポリカーボネートフィルター上の１２ウェルトランスウェルユニット中で、浸潤アッセイを行った。２４時間のインキュベーション期間の後、ウェル下部へフィルターを通過した細胞を染色し、計数し、明視野顕微鏡下で写真を撮った。（Ｄ）浸潤のパーセンテージを定量化した。
【図２７】図２７は、スフェロイドおよび大脳内アッセイによる、ｓｉＲＮＡによる侵襲性および腫瘍増殖の阻害および退行を示す。（Ａ）神経膠腫スフェロイドをラット胎仔脳凝集物とともに共培養することによって、神経膠腫スフェロイドの侵襲性を測定した。ＳＮＢ１９細胞のスフェロイドをＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトし、ＤｉＩで染色し、ＤｉＯ染色したラット胎仔脳凝集物とともに共培養した。示される時点で、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、共培養物の表面から中央までの、連続した厚さ１μｍの切片を得た。（Ｂ）ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトしたラット脳凝集物の残りの体積を測定した。値は、３つの実験の平均値±ＳＤである。（Ｃ、Ｄ）予め確立された腫瘍増殖の、ＲＮＡ媒介性退行。懸濁液中のＳＮＢ１９ＧＦＰ細胞（１０μｌの、血清を含まない培地中、２×１０^６個）を大脳内注射した。１週間後、Ａｌｚｅｔミニ浸透圧ポンプを用いて、マウスにＥＶ／ＳＶまたはｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍ）のいずれかを注射した（ＰＢＳ中１．５μｇ ｍｌ^−１に希釈したコンストラクトを、各群の６匹のマウスに０．２５μｇ時間^−１で注射した）。５週間の追跡期間の後、マウスを屠殺し、それらの脳を除去し、パラフィン包埋および切片化した。蛍光顕微鏡下で、ＧＦＰ発現細胞に関して切片を観察した。（Ｄ）対照、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍ処置群における腫瘍体積の半定量化を、５週間後に評価した。データを、各群からの６匹の動物の平均値±ＳＤで示す。
【図２８】図２８は、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性ダウンレギュレーションがＥＲＫのリン酸化を減少させることを示す。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍコンストラクトでの神経膠芽腫細胞のトランスフェクション後の全体的およびリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）タンパク質のウエスタンブロット解析。ＧＡＰＤＨレベルをローディング対照とした。
【図２９】図２９は、ｐＣＭベクターからのカテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ発現の概略図である。カテプシンＢおよびＭＭＰ−９に対するＣＭＶプロモーターによって駆動される２つの相補的な逆方向反復を有するｐＣＤＮＡ３プラスミドコンストラクトを開発した。ＣＭＶプロモーターは、二重のヘアピン構造の形成を駆動させ、これは次に、二本鎖ＲＮＡ認識酵素のＤＩＣＥＲによってプロセシングされて、実行可能なＳｉＲＮＡ分子を形成する。二重のヘアピン構造の安定性は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリａシグナル配列によって駆動するポリＡ尾部を有するｍＲＮＡ分子によく似ている分子の二次構造のために確実になった。
【図３０】図３０は、ＲＮＡ干渉がＳＮＢ１９細胞におけるカテプシンＢおよびＭＭＰ−９レベルを減少させることを確かめる。全細胞溶解物、および血清を含まない培地を、ｍｏｃｋ、空のベクターまたはＭＭＰ−９（ｐＭ）およびカテプシンＢ（ｐＣ）および組み合わせ（ｐＣＭ）のｓｉＲＮＡをコードするベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞から回収した。それに続いて、これらの試料からの３０μｇのタンパク質を、非還元性条件下、８％〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。カテプシンＢ（Ａ）およびＭＭＰ−９（Ｃ）に対する抗体ならびに適切な二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体）で膜をプローブし、製造業者（アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）の使用説明書どおりに展開した。β−アクチンを同時に免疫検出して、同じ量の細胞溶解物がロードしたことを確かめた。血清を含まない培地中で３日間空のベクター、ｐＣ、ｐＭまたはｐＣＭベクターを感染させたＳＮＢ１９細胞のＭＭＰ−９活性を、ゼラチンザイモグラフィーによって測定した（Ｂ）。
【図３１】図３１は、ＲＮＡｉが腫瘍細胞誘導性毛細血管網形成を阻害することを示す。ＳＮＢ１９細胞を、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＭ、ｐＣおよびｐＣＭで２４時間トランスフェクトした。次いで、細胞をヒト皮膚内皮細胞とともに４８時間共培養した。インキュベーション後、細胞を固定し、２％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックし、第ＶＩＩＩ因子抗原に対する抗体（第ＶＩＩＩ因子抗体、ＤＡＫＯコーポレーション、カリフォルニア州カーピンテリア）で内皮細胞をプローブし、適切なＦＩＴＣ複合二次抗体でプローブした後、蛍光顕微鏡下で調べた。ＳＮＢ１９（対照、空のベクター、ＰＭ、ｐＣ、またはｐＣＭトランスフェクト）馴化培地存在下で増殖した内皮細胞を、ＨおよびＥ染色し、写真を撮った（Ａ）。ｍｏｃｋ、空のベクターまたはｐＣＭベクターに感染させた共培養物における新脈管形成の定量化（Ｂ）。マウス皮下脂肪アッセイによる、ｐＣＭベクターに感染させたＳＮＢ１９細胞における腫瘍新脈管形成の阻害（Ｃ）。ＰＶ−既存の脈管構造、ＴＮ−腫瘍誘導性脈管構造。光学顕微鏡を用いて（上のパネル）、およびＦＩＴＣ蛍光に関して（下のパネル）写真を撮り、新しく発生した脈管構造の存在を測定した。
【図３２】図３２は、ＲＮＡｉが神経膠腫細胞遊走および浸潤を阻害することを示す。ＳＮＢ１９ ＧＦＰスフェロイドを、ｍｏｃｋ、空のベクター、ならびにカテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡをコードするベクター（ｐＣＭ）に感染させた。３日後、単一の神経膠腫スフェロイドを、９６ウェルプレート中のビトロネクチンコートしたウェルの中央に入れ、４８時間培養した。遊走アッセイの終わりに、スフェロイドを固定し、写真を撮った（Ａ）。ｍｏｃｋ、空のベクター、ならびにカテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡをコードするベクター（ｐＣＭ）でのトランスフェクションの３日後に、ＳＮＢ１９細胞をトリプシン化し、ＰＢＳで洗浄し、血清を含まない培地中に再懸濁した。マトリゲルでコートされた８μｍの孔を有するポリカーボネートフィルター上の１２ウェルトランスウェルユニット（コスター、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中で、浸潤アッセイを行った。２４時間のインキュベーション期間の後、ウェル下部へフィルターを通過した細胞を染色し、計数し、光学顕微鏡下で写真を撮った（Ｂ）。ＳＮＢ１９細胞のスフェロイドを、ｍｏｃｋ、空のベクター、ならびにカテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡをコードするベクター（ｐＣＭ）でトランスフェクトし、ＤｉＩで染色し、ＤｉＯ染色したラット胎仔脳凝集物とともに共培養した。腫瘍スフェロイドによる胎仔脳凝集物の進行性の破壊を観察した（Ｃ）。
【図３３】図３３は、予め確立された腫瘍増殖のＲＮＡｉ媒介性退行を示す。定位フレームの助けを借りて、ＳＮＢ１９ ＧＦＰ腫瘍細胞をヌードマウスに大脳内注射した。１週間後、空のベクター、またはカテプシンＢおよびＭＭＰ−９（ｐＣＭ）、カテプシンＢ（ｐＣ）もしくはＭＭＰ−９（ｐＭ）のｓｉＲＮＡを発現するベクターのいずれかを、アルゼットミニ浸透圧ポンプを用いて脳に注射した。ＧＦＰ蛍光に関して腫瘍切片の写真を観察し（Ａ）、それに続いて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（Ｂ）。５週間後の、ｍｏｃｋ／空のベクター、ｐＭ、ｐＣおよびｐＣＭベクター処置群における腫瘍体積の半定量化を行った。示されるデータは、各群からの６匹の動物からの±Ｓ．Ｄ．値を示す（^＊Ｐ＜０．００１）（Ｃ）。別の実験において、大脳内注射の１０日後に、ｐＣＭベクターを２回腹腔内注射し、４ヵ月後に動物を屠殺した（Ｄ）。
【図３４】図３４は、ＲＮＡｉの誘導のための、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）の概略図である。
【図３５】図３５は、ＲＮＡｉの誘導のための、ＲＮＡポリメラーゼベースのＩＩＩプロモーター（Ｕ６）の概略図である。
【図３６】図３６は、組換えアデノウイルス生成の概略図である。
【図３７】図３７は、ＧＲＰ、またはＧＲＰ発現を示すｍｏｃｋのＲＮＡｉでトランスフェクトした、ＳＮＢ１９ ＧＦＰ細胞を示す。
【図３８】図３８は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＣＭＶ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｕ６）によって駆動するＲＮＡｉベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞におけるＯＡＳ１発現を示す。ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲＴを対照とした。
【図３９】図３９は、Ｕ６またはＣＭＶ駆動プロモーターのいずれかでトランスフェクトした細胞からのＳＮＢ１９細胞溶解物のウエスタンブロット解析およびフィブリンザイモグラフィーによって測定した、ｕＰＡＲおよびｕＰＡのダウンレギュレーションを示す。スクランブルベクター（ＳＶ）のＲＮＡｉプラスミド、ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）およびｕＰＡＲ−ｕＰＡ２シストロン性コンストラクト（ｐＵ２）のＲＮＡｉ発現プラスミド。ローディング対照のために、ＧＡＰＤＨをプローブした。
【図４０】図４０は、細胞性免疫応答の誘導を測定するのに用いたｓｉＲＮＡ発現コンストラクトの概略図である。
【図４１】図４１は、ＲＴ−ＰＣＲによる、空のベクター（ＥＶ）、スクランブルベクター（ＳＶ）、ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）のｓｉＲＮＡ発現コンストラクトおよびｕＰＡＲおよびｕＰＡの２シストロン性コンストラクト（ｐＵ２）の環状（Ｃ）、線状（Ｌ）、またはポリＡシグナルを欠失した（ΔＡ）発現カセットでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞における２’５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ１）発現の測定を示す。ＲＴ−ＰＣＲをＧＡＰＤＨで標準化した。ＯＡＳ１発現を、示されるように定量化した。
【図４２】図４２は、実行可能なＲＮＡｉ誘発因子様構造を示さないＥＶおよびＳＶ転写産物の予想される二次構造、ならびにポリＡありまたはポリＡなし（ｐＵ２ΔＡ）の、予想されるｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＵ２転写産物の概略図である。
【図４３】図４３は、空間二次構造を示す、ｐＵ２転写産物の部分的二次構造の概略図である。空間二次構造は、ｍＲＮＡに対する類似性を有さない。
【図４４】図４４は、ｍＲＮＡレベルの、対照（Ｃ）、アンチセンスｕＰＡＲ（ｕＰＡＲとして）、アンチセンスｕＰＡ（ｕＰＡとして）、ならびにｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）、ｕＰＡＲ−ｕＰＡ（ｐＵ２）、ＧＦＰ（ｐＧＦＰ）のＲＮＡｉコンストラクト、空のベクター（ｐＥＶ）、ならびにｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＯＡＳ１のスクランブルベクター（ｐＳＶ）から単離された全ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲを示す。ＧＡＰＤＨを対照とした。
【図４５】図４５は、静脈内注射マウスにおけるＣＭＶプロモーターのインサイチューハイブリダイゼーションを示す。生理食塩水（Ｍｏｃｋ）、空のベクター（ＥＶ）、スクランブルベクター（ＳＶ）、ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）、およびｕＰＡＲ−ｕＰＡ２シストロン性コンストラクト（ｐＵ２）のＲＮＡｉ発現ベクターを腹腔内注射されたマウスの頭蓋切片を、プローブＤＮＡをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識することによって、ＣＭＶプロモーターを含むＤＮＡの存在に関してプローブした。ウエスタンブルーＡＰ基質（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）によって、ＡＰ活性を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
詳細な説明
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれ、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ等のヒト遺伝子を標的として、腫瘍成長、腫瘍浸潤、および腫瘍増殖を阻害する。ｓｉＲＮＡコンストラクトは、高度に転移性の前立腺癌細胞系ＰＣ３において、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルで、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現を有意に阻害した。ＰＣ３細胞におけるｕＰＡ−ｕＰＡＲノックダウンは、例えばマトリゲル浸潤アッセイによって示されるように、腫瘍細胞浸潤の有意な減少を生じた。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方のｓｈＲＮＡを発現する単一のプラスミドコンストラクトを用いた、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの遺伝子の同時のサイレンシングは、細胞生存能を有意に減少させ、同様に、アポトーシス性細胞死の誘導を生じた。ｕＰＡおよびｕＰＡＲのＲＮＡｉはまた、細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）およびシグナル伝達性転写因子３（Ｓｔａｔ３）等の下流の標的分子へのｕＰＡ−ｕＰＡＲシグナリングを排除した。ｕＰＡおよびｕＰＡＲのｓｈＲＮＡを発現するプラスミドコンストラクトの腫瘍内注射は、同所マウス前立腺癌モデルにおいて、確立された腫瘍増殖および生存を、有意に阻害した。前立腺癌細胞の腫瘍浸潤、腫瘍増殖および生存を活発に進行させるｕＰＡ−ｕＰＡＲの下流で機能するシグナリングネットワークの証拠が明らかである。ｕＰＡおよびｕＰＡＲのＲＮＡｉ誘導性標的化ならびに対応するｓｉＲＮＡは、前立腺癌を含む癌治療のための、新規の治療剤である。
【００５４】
ヒト神経膠腫細胞系における、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ媒介性標的ＲＮＡ分解は、腫瘍阻害を生じた。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９に対するＲＮＡｉは、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の特異的阻害を達成した。２シストロン性コンストラクト（ｐＵＭ）は、新脈管形成の、インビトロおよびインビボの両方のモデルにおいて、毛細血管様構造の形成を阻害した。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の発現をブロックすることは、マトリゲルおよびスフェロイド浸潤アッセイモデルにおいて、神経膠腫腫瘍浸潤の有意な阻害を生じた。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉは細胞増殖を阻害し、親および空のベクター／スクランブルベクター（ＥＶ／ＳＶ）トランスフェクトＳＮＢ１９細胞と比較して、ＭＡＰＫ、ＥＲＫおよびＡＫＴシグナリング経路のリン酸化形態のレベルを減少させた。さらに、２つのプロテアーゼ分子を同時に標的とするためのＲＮＡｉを用いること、およびアルゼットミニポンプを用いてこれらのコンストラクトをインビボで大脳内注射することもしくは腹腔内注射は、予め確立された大脳内腫瘍増殖の有意な退行を生じた。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のヘアピンｓｉＲＮＡ発現ベクターの使用によって、神経膠芽腫を含む癌治療のための効果的な治療手段が提供される。
【００５５】
別の実施形態において、ＲＮＡｉアプローチは、ｕＰＡＲおよびカテプシンＢ発現をサイレンシングした。ＲＮＡｉを用いて、腫瘍進行の特徴的な特性である細胞外マトリックス分解に関与するプロテアーゼの発現を阻害した。ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのＲＮＡｉは、インビトロおよびインビボモデルにおいて、神経膠腫細胞浸潤および新脈管形成を減少させた。ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのｈｐＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現するプラスミドベクターの腫瘍内注射は、予め確立された大脳内腫瘍の退行を生じた。ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのＲＮＡｉは、細胞増殖を阻害し、対照と比較して、ｐＥＲＫおよびｐＦＡＫのレベルを減少させた。ＲＮＡｉはヒト神経膠腫細胞中で機能し、神経膠芽腫を含む癌遺伝子治療の基礎を提供する。
【００５６】
ＲＮＡｉアプローチは、腫瘍細胞において、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９発現をサイレンシングした。単一の３シストロン性コンストラクト中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター駆動ＤＮＡ鋳型は、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）誘発性ＲＮＡｉを誘導し、単一のコンストラクトでｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９遺伝子発現を阻害した。ｕＰＡＲタンパク質レベルならびにｕＰＡおよびＭＭＰ−９の酵素活性は、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のヘアピンｓｉＲＮＡを発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞を有意に減少させることがわかった。ｐＵ２ＭトランスフェクトＳＮＢ１９細胞は、免疫組織学的解析によって測定したｍｏｃｋおよびＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞と比較して、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９発現を有意に減少させた。これらの分子の単一のコンストラクトは、免疫組織化学的解析によって示されるように、それらのそれぞれのタンパク質レベルの特異的な阻害を生じた。ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｄｓＲＮＡを発現するプラスミドベクターでのトランスフェクションの後、マトリゲル浸潤アッセイおよびスフェロイド浸潤アッセイによって示されたｍｏｃｋおよびＥＶ／ＳＶ処置群と比較して、神経膠腫細胞浸潤が遅らされた。ＲＮＡｉを用いたｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のダウンレギュレーションは、インビトロ（共培養）モデルにおいて、新脈管形成を阻害した。ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｈｐＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡの直接の腫瘍内注射はまた、ヌードマウスにおいて、予め確立された大脳内腫瘍を有意に退行させた。ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉで処理した細胞は、親およびＥＶ／ＳＶ処置ＳＮＢ１９細胞と比較して、減少したｐＥＲＫレベルを示した。ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９の同時抑制は、癌を治療するための治療手段である。
【００５７】
単一のコンストラクトからのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター駆動ＤＮＡヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＭＭＰ−９およびカテプシンＢ遺伝子発現をブロックした。ＭＭＰ−９およびカテプシンＢのｄｓＲＮＡを発現するプラスミドベクターのトランスフェクションは、ＭＭＰ−９およびカテプシンＢ発現を有意に阻害し、マトリゲルおよびスフェロイド浸潤モデルにおいて神経膠芽腫細胞系である、ＳＮＢ１９の侵襲性の性質を減少させた。ＳＮＢ１９細胞における、ＲＮＡｉを用いたＭＭＰ−９およびカテプシンＢのダウンレギュレーションもまた、ヒト微小血管内皮細胞の細胞−細胞相互作用を減少させ、インビトロおよびインビボの両方のモデルにおいて、毛細血管網形成の中断を生じた。ＭＭＰ−９およびカテプシンＢのｈｐＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡの直接の腫瘍内注射は、インビボの大脳内腫瘍において、確立された神経膠腫腫瘍増殖および浸潤を有意に阻害した。ＭＭＰ−９およびカテプシンＢのｈｐＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡの腹腔内（ｉｐ）注射は、相当な期間にわたって、予め確立された腫瘍を完全に退行させた。ＭＭＰ−９およびカテプシンＢの同時のＲＮＡｉ媒介性標的化は、ヒト神経膠腫のための、適した治療方法である。
【００５８】
ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９を標的とするプラスミドベースのＣＭＶプロモーター駆動ｈｐＲＮＡは、単独で、または同時に、ＳＮＢ１９ヒト神経膠腫細胞系において、ＲＮＡｉを誘導する。ＳＮＢ１９ヒト神経膠腫細胞における、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９の、同時のＲＮＡｉ媒介性ダウンレギュレーションは、
（１）インビトロでの浸潤および新脈管形成の阻害。
（２）インビボのヌードマウスにおける、予め確立された大脳内腫瘍の退行。
（３）ＥＲＫ１および２シグナリング分子のリン酸化の減少。
を引き起こした。
【００５９】
環状プラスミド（例えば、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９、およびカテプシンＢまたはそれらの任意の組み合わせ）から追い出されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡが、インビトロのＲＮＡ干渉を誘導するのに適している。ＯＡＳ１誘導によって示されるように、環状プラスミドからのｓｉＲＮＡが適しており、望ましくない免疫応答を誘導しない。ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９、およびカテプシンＢまたはそれらの任意の組み合わせの線状コンストラクトもまた、ＲＮＡｉを誘導するのに適している。
【００６０】
本明細書中に開示されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡは、本質的にｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９、カテプシンＢまたはそれらの組み合わせの自己相補的配列からなる核酸を含む。ループ領域およびスペーサー（介在領域）は、標的配列、コンストラクト、および治療上の使用に依存して、長さおよび配列の両方が変化し得る。本明細書中に開示される核酸分子を、核酸類似物、誘導体、または任意の適した修飾によって、適切に修飾して、ＲＮＡｉ誘導の安定性または有効性を向上させ得る。本明細書中に開示される核酸分子はまた、他の腫瘍特異的な免疫活性化因子、腫瘍標的化因子、および任意の適した薬学的に許容され得る担体もしくは佐剤と組み合わせて投与され得る。本明細書中に開示される核酸分子はまた、放射線治療または化学療法等の他の癌治療と関連して投与され得る。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は例示の目的のためだけであって、開示の範囲を限定するよう解釈されることを意図しない。
【００６２】
（実施例１）
内在性ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現はヒト前立腺癌細胞のインビトロの侵襲性に関連している。
【００６３】
ＰＣ３細胞は、高度に転移性であるが、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞はそれぞれ、中程度の転移性がある、および転移性が乏しい。ｕＰＡおよびその受容体ｕＰＡＲは、腫瘍浸潤および転移に関係する。転移能力の異なる３つのヒト前立腺癌細胞系におけるこれらのタンパク質のレベルを比較した。図１Ａに示されるように、ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質レベルは、望ましくないレベルのこれらのタンパク質を発現した転移性の乏しいＬＮＣａＰ細胞と比較して、ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞において有意に高かった。フィブリンザイモグラフィーによって評価したｕＰＡ活性で、同様の傾向が見られた（図１Ｂ）。したがって、ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質レベルならびにｕＰＡ活性は、それらの公知の転移能力と、正に相関があった。前立腺癌が、基底膜タンパク質で構成されるゲル層であるマトリゲルに浸潤する能力を、調べた。このアッセイは、腫瘍浸襲性を評価するためのインビトロモデルにおいて確立している。高度に転移性のある前立腺癌細胞系ＰＣ３が、最も高いレベルの侵襲性を示し、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞系がそれに続き、順序はそれらの公知の転移能力と一致した（図１Ｃ、および１Ｄ）。ＬＮＣａＰ細胞よりも、ＰＣ３細胞は１４倍多く侵襲性があり、ＤＵ１４５は９倍多く侵襲性があった。ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質レベルと転移能力の異なるヒト前立腺癌細胞系の浸潤能力との間の強力な相関関係の浸潤能力を実証した。ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞系は、ＬＮＣａＰ細胞よりも侵襲性があり、それらの公知の転移能力と一致した。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現パターンと使用した前立腺癌細胞系の浸潤能力の間に、強力な相関関係が存在する（図１）。前立腺癌細胞系における促進されたｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現は、増大した侵襲性および転移能力と関連がある。
【００６４】
（実施例２）
ＲＮＡｉを用いた、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞におけるｕＰＡおよびｕＰＡＲ遺伝子発現の効率的ノックダウン
低分子ヘアピンＲＮＡを用いて、ｕＰＡおよびｕＰＡＲならびに高い転移能力を発現するヒト前立腺癌細胞系ＰＣ３における内在性ｕＰＡおよびｕＰＡＲ遺伝子発現をノックダウンし、前立腺腫瘍進行におけるｕＰＡおよびｕＰＡＲの生物学的な役割を調査した。ｕＰＡまたはｕＰＡＲのいずれかに対応する１９または２１ｎｔ二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生じることのできる、低分子ヘアピンコンストラクトを含むｐｃＤＮＡ３−ＣＭＶベクターを開発した。また、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動してｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方を標的とする二重のヘアピンを生じる、単一の２シストロン性コンストラクトを構築して、２つの内在性遺伝子の発現を同時に阻害する効果を試験した（図２Ａ）。ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびｕＰＡ−ｕＰＡＲの組み合わせのｓｈＲＮＡを発現するベクターをＰＣ３細胞にトランスフェクトした。
【００６５】
図２Ｂに示されるように、半定量的逆転写ＰＣＲを通じたｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のためのｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞は、ＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞またはｍｏｃｋ細胞と比較して、各遺伝子のｍＲＮＡレベルの特定の減少を示した。しかしながら、ＲＮＡｉ効果は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲを同時に標的とするｓｈＲＮＡベクターで、より大きかった（図２Ｂ）。細胞抽出物の免疫ブロット解析を行って、観察されたような減少したｍＲＮＡ発現が、遺伝子産物の翻訳の減少と相関があるかどうかを決定した。免疫ブロットアッセイによっても、同様の傾向が観察された（図２Ｃ）。ｍＲＮＡレベルならびにタンパク質レベルで、特異性およびローディングの内部対照として使用されたＧＡＰＤＨの発現に対するＲＮＡｉの効果は観察されなかった。また、ＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞はまた、ＲＮＡｉ依存性ｕＰＡおよびｕＰＡＲノックダウンが特異的であることを示した（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【００６６】
また、抗ｕＰＡおよび抗ｕＰＡＲ抗体での二重免疫染色を用いて、ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現に対する遺伝子特異的ｓｈＲＮＡの効果が、ＰＣ３細胞において検出された。図２Ｄに示されるように、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ染色は、遺伝子特異的ｓｈＲＮＡによって、ＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞と比較して、劇的に減少した。ｕＰＡおよびｕＰＡＲ二重免疫染色は、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞において、完全に消失した（図２Ｄ）。対照的に、ＥＶおよびＳＶでトランスフェクトしたＰＣ３細胞は、ｍｏｃｋ細胞と同様な染色強度およびパターンを示した。これらの免疫蛍光研究によって、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットアッセイが確認された。
【００６７】
プラスミドベースのｓｉＲＮＡ系を用いた２つの遺伝子の同時の阻害は、有用な手段である。ＲＮＡｉは、前立腺癌細胞系ＰＣ３において、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ ｍＲＮＡならびにタンパク質発現を効果的にダウンレギュレーションした（図２Ｂおよび２Ｃ）。これらの遺伝子特異的ＲＮＡｉプラスミドは、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞と比較して、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現を実質的に減少させた。免疫組織化学的染色データから、ｍｏｃｋ、またはＥＶ／ＳＶでトランスフェクトした細胞がｕＰＡおよびｕＰＡＲに対する正の染色を現すが、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞はＤＡＰＩ核染色を除いてほとんど染色されないことが示され、ｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質発現のノックダウンが示唆された（図２Ｄ）。同様に、ｕＰＡおよびｕＰＡＲに対する免疫染色の強度は、遺伝子特異的ＲＮＡｉによって減少した。
【００６８】
（実施例３）
ＲＮＡｉによるｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のノックダウンは、ＰＣ３細胞のマトリゲル浸潤を阻害した。
【００６９】
ｕＰＡおよびｕＰＡＲの機能の１つは、腫瘍転移に必要な過程である、浸潤の促進である。ＰＣ３細胞浸潤に対するｕＰＡおよびｕＰＡＲノックダウンの影響を、ｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞を用いたマトリゲル浸潤アッセイによって評価した。ｍｏｃｋ細胞、またはＥＶ／ＳＶでトランスフェトした細胞と比較して、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクト細胞は、浸潤能力の実質的な減少を示した（図３Ａ）。ＰＣ３細胞の浸潤は、ｓｈ−ｕＰＡによって対照のものの（すなわち、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞）７５％まで減少し、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲによって９０％まで減少した（図３Ｂ）。ｕＰＡＲ単独のノックダウンは浸潤の有意な減少を示さなかったが、ｕＰＡならびにｕＰＡＲのノックダウンは、有意な効果を有し（図３Ａおよび３Ｂ）、マトリゲルへのＰＣ３細胞浸潤が、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの共同した機能によって実質的に制御されていることが示唆された。これらの結果から、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現が前立腺癌浸潤ならびに転移に必要とされることが示される。ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲ効果は細胞がマトリゲル膜を通ってほとんど浸潤できないほど有意であり、ＲＮＡｉが、タンパク質分解活性および細胞生存能を媒介するｕＰＡ−ｕＰＡＲ系に有意に干渉したことが示唆された。
【００７０】
（実施例４）
ＲＮＡｉによるｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のノックダウンは、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する。
【００７１】
細胞増殖および生存に対するＲＮＡｉ媒介性ｕＰＡおよびｕＰＡＲサイレンシングの効果を、ｕＰＡおよびｕＰＡＲに特異的なｓｈＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後に、ＭＴＴ解析によって調べた（図４Ａ）。ｕＰＡを標的とするＲＮＡｉは、ＰＣ３細胞の増殖能力に対して効果がなかったが、ｕＰＡＲに特異的なＲＮＡｉは、低い阻害効果を有した。対照的に、ｕＰＡおよびｕＰＡＲを同時に標的とするＲＮＡｉで、ＰＣ３細胞の増殖の劇的な減少が観察された（図４Ａ）。生存能のある細胞のパーセンテージはｕＰＡＲおよびｕＰＡ−ｕＰＡＲ ＲＮＡｉ存在下で、対照細胞と比較して、それぞれ平均しておよそ３０％および６０％減少した。これらの結果から、腫瘍細胞における増大したｕＰＡおよび／またはｕＰＡＲレベルが細胞に促進された増殖および生存能力を与え得ることが示唆される。このように、ｕＰＡおよびｕＰＡＲレベルを減少させることによって、癌細胞におけるアポトーシスが誘導され得る。
【００７２】
この可能性を調べるために、ＰＣ３細胞を、ｓｈ−ｕＰＡ、ｓｈ−ｕＰＡＲまたはｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲを発現するプラスミドでトランスフェクトした。ＰＣ３細胞タンパク質抽出物の分子解析から、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクションがＢａｘ、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｓ／Ｌ、カスパーゼ９を含むアポトーシス促進性遺伝子を誘導したことが明らかになった（図４Ｂ）。また、ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫでのｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクトＰＣ３細胞の蛍光色素染色から、ｍｏｃｋ細胞またはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞のいずれかでも検出されなかった、促進されたカスパーゼ活性が明らかになった（図４Ｃおよび４Ｄ）。ＤＮＡ断片化解析は、アポトーシス誘導のさらなる証拠を提供した。図４Ｅが示すように、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクトＰＣ３細胞は、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞のいずれかでは検出されなかった、アガロースゲル電気泳動での、アポトーシスの典型的な特徴であるＤＮＡ標識を示した。このＤＮＡ標識は、アクチノマイシンＤ処理によって誘導されるアポトーシスのものと同様であり（図４Ｅ）、それによって、観察された細胞死がアポトーシスの結果であることが確認された。また、ｓｈ−ｕＰＡまたはｓｈ−ｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞において、ＤＮＡ標識は観察されなかった。これらの結果はまた、ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫによって測定されるカスパーゼ９誘導および一般的な促進されたカスパーゼ活性と一致している。
【００７３】
（実施例５）
ＲＮＡｉによるｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のノックダウンは、その下流のシグナリングおよびヌードマウスにおける腫瘍形成を阻害する。
【００７４】
ｕＰＡおよびｕＰＡＲサイレンシングによる生物学的結果は、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ媒介性シグナリングおよびそれに続く下流の機能の変化の結果であり得る。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの増大した発現はＥＲＫ１／２シグナリングを活性化するので、ｕＰＡ−ｕＰＡＲノックダウン細胞におけるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼの状態を調べた。免疫ブロット解析から、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクト細胞においてＥＲＫ１／２リン酸化が完全に排除されたが対照細胞では排除されなかったことが示される（図５Ａ）。ＥＲＫリン酸化は、ｓｈ−ｕＰＡまたはｓｈ−ｕＰＡＲのいずれかでトランスフェクトした細胞を変化させなかった。Ｓｔａｔ３の、リン酸化を含む全体の活性は、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞において、対照細胞と比較して、実質的に抑制された（図５Ｂ）。さらに、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞からの核抽出物での電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）から、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現のノックダウンが、標識されたＳｔａｔ３結合部位への抽出物の結合を阻害したことが示された（図５Ｃ）。Ｓｔａｔ３活性化は抗アポトーシス経路の刺激に寄与するので、減少したレベルのホスホ−Ｓｔａｔ３ならびにＤＮＡ結合活性は、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクトＰＣ３細胞の、アポトーシス性細胞死に対する増大した感受性を説明し得る。あるいは、構成的ＥＲＫ活性化は、細胞生存に寄与し得る。
【００７５】
ｕＰＡ−ｕＰＡＲ ＲＮＡｉが、ヌードマウスにおける予め確立されたＰＣ３同所腫瘍の腫瘍形成も抑制するかどうかを調査した。ＰＣ３細胞を、前立腺の側葉に前立腺内接種した。移植後７および１４日後に、腫瘍に、ｓｈ−ｕＰＡ、ｓｈ−ｕＰＡＲまたはｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲを発現するプラスミドコンストラクトを注射した。次いで、対照群で形成された腫瘍の結果として生じた病的状態によって余儀なくされたように、ＲＮＡｉ処置の２回目の投与の１４〜１５日後にマウスを屠殺した。原発腫瘍および転移の部位の全体の形態を調べた（図６Ａ）。ｓｈ−ｕＰＡ、ｓｈ−ｕＰＡＲおよびｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲプラスミドで処置したマウスにおいて二次腫瘍を視覚的に観察したが、ＥＶ、ＳＶおよびｍｏｃｋで処置したマウスは、前立腺内に原発腫瘍に加えて二次腫瘍を示した（図６Ａ）。腫瘍を切開し、計量した（図６Ｂ）。原発ならびに二次腫瘍の９０〜１００％の発生率が、ｍｏｃｋ、ＥＶおよびＳＶ処置群で観察された。ｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲ処置は腫瘍増殖を完全には阻害しなかったが、これらの処置群からの形成された腫瘤の重量は、対照処置群からの腫瘍よりも小さかった（図６Ｂ）。ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲで処置したマウスにおいて、腫瘍重量の有意な減少が観察された。腫瘍試料中のタンパク質レベルの免疫ブロット解析から、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲで処置した腫瘍が有意に減少したｕＰＡおよびｕＰＡＲレベルを有したことが確認された（図６Ｃ）。さらなる１５０μｇのｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲは、予め確立された前立腺癌を完全に退行させた。
【００７６】
採取したパラフィン包埋腫瘍組織で免疫組織化学的解析を行い、ＰＣ３細胞のインビボの性質に対するｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲの効果を評価した。ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲ依存性ＲＮＡｉ発現は、前立腺の全般的な構造を変化させず、Ｈ＆Ｅ染色は大部分で正常な組織構造を示したが、染色は、対照群において腫瘍および宿主細胞の両方を明らかにした。ｕＰＡまたはｕＰＡＲのいずれかのみを標的とするＲＮＡｉは、対照群と比較して、腫瘍細胞をわずかに減少させた。おそらく、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ ＲＮＡｉ誘導性アポトーシスからのインビボの救済はない。これを試験するために、クレノウ−ＦｒａｇＥＬ ＤＮＡ断片化解析を用いて、全ての処置群からのパラフィン包埋腫瘍切片をアポトーシスマーカーで染色した。このアポトーシス細胞の末端標識は、処置群の間の有意な差を示す。ｍｏｃｋ、ＥＶおよびＳＶ処置群の腫瘍は、ＦｒａｇＥＬに対する、一般化された、低レベルの染色を示し、したがって、腫瘍細胞が健康であることを示した。対照的に、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲ処置ＰＣ３前立腺腫瘍の領域のほとんどは、クレノウ染色に対して陽性であった。
【００７７】
ｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲの腫瘍内同時注射はまた、予め確立された前立腺腫瘍増殖のほとんど完全な退行を生じたが、ｍｏｃｋ、ＥＶおよびＳＶの対照群は、再生性の、優位な腫瘍を示す（図７Ａおよび７Ｂ）。免疫ブロット解析は、ｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲコンストラクトで同時処置した腫瘍におけるｕＰＡおよびｕＰＡＲタンパク質レベルの選択的ノックダウンを示した（図７Ｃ）。この同時処置は、Ｈ＆Ｅ染色によって大部分が正常な組織構造を示したが、ｍｏｃｋ、ＥＶおよびＳＶ処置群の腫瘍は、前立腺の全般的な構造の観察可能な変化を示し、Ｈ＆Ｅ染色は、腫瘍および宿主細胞の両方を示した（図７Ｄ）。同時処置を通じたｕＰＡおよびｕＰＡＲのノックダウンはまた、正のクレノウ染色によって明らかであるように、アポトーシス性細胞死の有意な誘導を生じた（図７Ｅおよび７Ｆ）。図６Ａ〜Ｃおよび７Ａ〜Ｆに示されるデータと組み合わせると、これらの結果は、しかしながら、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでの処置が、確立された腫瘍サイズの有意な減少を引き起こすｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲでの同時処置と比較して、能力のあるＲＮＡｉ効果を有することを示す。
【００７８】
インビトロＤＮＡ標識解析およびインビボＤＮＡ断片末端標識アッセイの結果は、ｓｈＲＮＡベースのＲＮＡｉによるｕＰＡおよびｕＰＡＲの同時のノックダウンがアポトーシスを誘導することを示す。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ媒介性下流シグナリングは、ホルモン非依存性前立腺癌の治療のための優れた標的である。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ媒介性下流シグナリングは、前立腺癌細胞系ＰＣ３における細胞浸潤、生存および増殖に必要とされるようである。
【００７９】
（実施例６）
ｕＰＡおよびｕＰＡＲ機能的シグナリングおよび腫瘍形成におけるそれらの役割
ｕＰＡおよびｕＰＡＲの異常な発現は、前立腺癌の進行した段階における最も頻繁な変化の１つであることがわかった。ｕＰＡおよびｕＰＡＲが前立腺癌の進行した段階でのみ過剰発現されることから、ｕＰＡおよびｕＰＡＲが、増大した増殖および浸潤等の、進行した段階の癌の表現型の決定に関連のある機能経路に影響することが示唆される。細胞外マトリックスを通る浸潤は、腫瘍転移における特徴的な段階である。腫瘍形成を抑制するｕＰＡまたはｕＰＡＲ発現のいずれかの排除は、いくつかの異なるアプローチを用いて達成されてきた。ｕＰＡとｕＰＡＲのカップリングは、増殖、遊走、浸潤、新脈管形成および転移等のいくつかの異なる型の生物学的応答の独特のネットワークを形成する、いくつかの異なるシグナリング分子を組み合わせる。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ結合に対するこれらの生物学的応答は、細胞型、下流シグナリング分子の性質およびその発現のレベルに高度に特異的であるようである。ｕＰＡとｕＰＡＲの結合は、ＥＲＫ１および２を活性化し、この誘導されたＥＲＫ活性は、ｕＰＡ誘導性ＭＣＦ−７乳癌細胞遊走に必要である。ＦＡＫ、ＳｒｃおよびＳｈｃを含むシグナリングカスケードは、ｕＰＡ誘導性ＥＲＫ活性化および細胞遊走の原因である。対照的に、ｕＰＡ誘導性血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）遊走および増殖は、Ｓｔａｔ経路の活性化を必要とした。ヒト乳癌細胞において、ｕＰＡ誘導性分裂促進活性は、ＳｔａｔおよびＥＲＫ経路の両方の活性化を必要とする。アンチセンスｕＰＡは、神経膠芽腫細胞系ＳＮＢ１９において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナリングを阻害し、細胞をスタウロスポリンによるアポトーシスに対して感作した。ｕＰＡとｕＰＡＲの結合は、細胞遊走、浸潤、増殖および生存を調節するために、シグナリングカスケードを活性化するようである。
【００８０】
ＰＣ３細胞におけるｕＰＡ−ｕＰＡＲに対するＲＮＡｉは、浸潤および増殖の顕著な抑制ならびにアポトーシスの誘導を示した（図３〜４）。ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲトランスフェクトＰＣ３細胞において、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ系および下流のシグナリング分子（ＥＲＫおよびＳｔａｔ３）の抑制が観察されたが、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞では観察されなかった（図５）。このことから、これらの細胞における観察された表現型変化の全てはｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用およびその下流の分子のリン酸化状態を抑制することによって媒介されたと示唆される。ｕＰＡ−ｕＰＡＲシグナリングは、ＳｔａｔおよびＥＲＫ経路の両方を刺激し、癌細胞を死から保護する。いくつかの筋の証拠によって、ＥＲＫおよびＳｔａｔ３経路の両方が細胞をアポトーシス性細胞死から保護できることが示されている。ｓｈ−ｕＰＡまたはｓｈ−ｕＰＡＲのいずれかでのトランスフェクションは、ＰＣ３細胞においてアポトーシスを引き起こさなかった（図４）。これは、ｕＰＡまたはｕＰＡＲのいずれか単独のブロッキングは下流のシグナリング分子ＥＲＫおよびＳｔａｔ３に十分影響しないかもしれないためかもしれない。
【００８１】
ｕＰＡ−ｕＰＡＲシグナリングはＥＲＫおよびＳｔａｔ３発現を調節するので、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの同時の阻害は、これらの経路を損なって、増殖阻害およびアポトーシスの誘導につながり得る。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ系は、癌の２つの特徴である細胞増殖および生存を容易にすることによって、細胞生存の正の調節因子として機能するようである。したがって、癌において過剰発現されると、ｕＰＡおよびｕＰＡＲは、癌細胞に、増大した増殖性および／またはアポトーシスに対する増大した耐性を与える。対照的に、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ発現または機能のノックダウンは、癌細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導するべきである。ｕＰＡおよびｕＰＡＲのノックダウンを通じてｕＰＡ−ｕＰＡＲ媒介性シグナリングを遮断することによって、癌細胞増殖が同時に阻害され、アポトーシスが誘導された。注目すべきことに、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ ＲＮＡｉは、ホルモン耐性前立腺癌細胞系ＰＣ３中で機能した。このことから、ＲＮＡｉによるｕＰＡ−ｕＰＡＲ発現のノックダウンは、ホルモン耐性前立腺癌増殖および生存を阻害する戦略であることが示唆される。
【００８２】
ヌードマウスにおけるヒト癌細胞の同所移植は、特に転移の発達に関して、ヒトにおけるこれらの細胞の生物学的性質によりよく似ている。このことは、ヌードマウスに異所に移植された場合によりかなり低い効率で原発腫瘍および転移を形成するヒト前立腺癌細胞で特に正しいことがわかっている。ｓｈＲＮＡベースのＲＮＡｉプラスミド系は、免疫ブロット解析によって測定されたように、同所前立腺腫瘍におけるｕＰＡ−ｕＰＡＲ発現を効果的に抑制し得る戦略を代表する（図６Ｃ）。さらに、予め確立された同所腫瘍の、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲ依存性ＲＮＡｉでのインビボ処置は、腫瘍増殖のほとんど全体的な阻害を示したが、ｓｈ−ｕＰＡまたはｓｈ−ｕＰＡＲ ＲＮＡｉでは、部分的な減少しか観察されなかった（図６Ｂ）。また、予め確立された同所腫瘍の、ｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲでの同時処置もまた、腫瘍増殖をほとんど完全に阻害した（図７）。ＲＮＡｉ処置動物群において、ｍｏｃｋまたはＥＶ／ＳＶ処置群と比較して、有害な効果は注目されなかった。さらに、このアプローチは、様々な腫瘍型を標的とし、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ依存性悪性表現型をインビトロならびにインビボで阻害することができる。したがって、このＲＮＡｉ系は、強力な新しい治療手段を提供し、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ下流シグナリング経路を解析することは、同様に、臨床的妥当性を有する、癌介入の治療選択肢を提供する。さらに、ＲＮＡｉは、ｕＰＡ−ｕＰＡＲ発現に干渉し、癌生物学におけるそれらのシグナリングの生物学的重要性を研究する、新規の、簡便で選択的な方法を提供する。
【００８３】
ヒト癌の分子機構の理解の進歩にもかかわらず、ヒト悪性腫瘍の臨床的治療のための治療アプローチの開発は、主要な課題のままである。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ発現のノックダウンは、ＰＣ３細胞の増殖をインビトロならびにインビボで有意に阻害し、最終的には、アポトーシス性細胞死を生じた。異なる標的遺伝子（ＥＲＫおよびＳｔａｔ３）が、ｕＰＡ−ｕＰＡＲシグナルの下流で調節された。ＰＣ３細胞は、低いＳｔａｔ３リン酸化およびＥＲＫリン酸化を示し、ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲでトランスフェクトした場合、リン酸化は完全に廃された。ｕＰＡ−ｕＰＡＲのＲＮＡｉは、ＰＣ３細胞における細胞死をインビトロならびにインビボで誘導した。
【００８４】
（実施例７）
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９を標的とするプラスミドベースのＣＭＶプロモーター駆動２１ｂｐ逆方向反復は、ｓｉＲＮＡにプロセシングされる。
【００８５】
ＣＭＶプロモーター駆動転写産物（ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９標的化）がｓｉＲＮＡに正しくプロセシングされるかどうかを決定するために、ＳＮＢ１９細胞を対照／ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスファーした。図８は、コンストラクトの概略図を示す。細胞はまた、非ＧＦＰ細胞においてＧＦＰを標的とする、関連のないコンストラクトでもトランスフェクトし、ＲＮＡ転写産物の、ｓｉＲＮＡへのプロセシングを決定し、得られた結果が標的遺伝子の分解産物だけではなかったことを確認した。ｐＧＦＰでトランスフェクトした非ＧＦＰ ＳＮＢ１９細胞は、ＲＮＡ転写産物の、ｓｉＲＮＡへのプロセシングを生じた（図９Ａ）。同様に、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした細胞は、ＲＮＡ転写産物の、適切なｓｉＲＮＡへのプロセシングを生じた。ＥＶトランスフェクト細胞は、ｕＰＡＲまたはＭＭＰ−９を標的とするいかなるｓｉＲＮＡ様断片も生成せず、見られたｓｉＲＮＡ断片が、コンストラクトに組み込まれた逆方向反復ループからプロセシングされたことを示した。ＳＶトランスフェクト細胞はまた、ｕＰＡＲまたはＭＭＰ−９を標的とするいかなるｓｉＲＮＡ様断片も生成しなかった。ＳＶは、いかなる公知の遺伝子にも相同性を有さない、不完全な逆方向反復配列で構成された。ＳＶの２１ｂセンスオリゴでプローブすると、２１ｂｐＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは見られず、このコンストラクトがｓｉＲＮＡ様断片をプロセシングしなかったことが示された。
【００８６】
ｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９ ｍＲＮＡの両方のダウンレギュレーションを引き起こした。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９に相同性のある逆方向２１塩基対配列を含むプラスミドコンストラクトがＲＮＡｉを誘導するかどうかを決定するために、ＳＮＦ１９細胞を、対照／ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン）を用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。次いで、当業者に公知の標準的なプロトコールに従って、ｃＤＮＡをＰＣＲに供した。対照／ＥＶおよびＳＶでトランスフェクトした細胞においてｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９、およびＧＡＰＤＨに対する特異的プライマー（表１参照）を用いると、ｕＰＡＲまたはＭＭＰ−９のレベルの減少はなかったが、ｐｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞およびｕＰＡＲのレベルでは、ｍＲＮＡが有意に減少し、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡのレベルは変化しなかった。ｐＭＭＰ−９でトランスフェクトした細胞において、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡのレベルが減少したが、ｕＰＡＲ ｍＲＮＡレベルは変化せず、標的分子に対するベクターの特異性を示した。ｐＵＭでトランスフェクトした細胞は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９ ｍＲＮＡレベルの両方の減少を示した。ＧＡＰＤＨレベルは変化しなかった（図９Ｂ）。
【００８７】
（実施例８）
ＲＮＡ干渉による、ＭＭＰ活性およびｕＰＡＲタンパク質レベルの阻害
ＳＮＢ１９細胞を、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトし、次いで細胞溶解物中のｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９レベルをウエスタンブロッティングによって、および馴化培地中のｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９レベルをゼラチンザイモグラフィーによって、それぞれ測定した。ウエスタンブロッティングによって、ｐＵＭベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞は、親およびＥＶ／ＳＶ処置細胞と比較して、減少した量のｕＰＡＲタンパク質を発現した（図１０Ａ）。この阻害効果がｕＰＡＲに対して特異的かどうかを決定するために、同じブロットにおいて、β−アクチンレベルを評価した。β−アクチンレベルは、全てのレーンで同様であり、全てのレーンでの等しいローディングが確認された。ｐＵＭ感染ＳＮＢ１９細胞からの馴化培地は、ｍｏｃｋおよび空の／スクランブルベクタートランスフェクト細胞と比較して、有意に低いレベルのＭＭＰ−９活性を示した（図１０Ｂ）。ＭＭＰ−２レベルは変化せず、標的タンパク質の特異的な阻害が示された。濃度計によるｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９バンドの定量的解析から、親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞と比較して、ｐＵＭトランスフェクト細胞において、ｕＰＡＲタンパク質（１２〜１４倍）およびＭＭＰ−９活性（８〜１０倍）の有意な減少が明らかになった。ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９ベクターでトランスフェクトした細胞は、２シストロン性コンストラクトとほとんど同じようにｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のレベルを阻害した（図１０Ａおよび９Ｂ）が、標的分子のダウンレギュレーションは、単一のコンストラクトと比較して、２シストロン性コンストラクトで、より明白であった。
【００８８】
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のベクター媒介性発現は、インビトロおよびインビボで、神経膠腫細胞系において効果的で安定な遺伝子サイレンシングを達成し得る。ＲＮＡｉベースの遺伝子サイレンシングは、有意な治療能力で、神経膠腫で過剰発現しているタンパク質を標的とするよう適合され得る。合成ｓｉＲＮＡ分子もまた、内在性ＭＭＰ−９およびｕＰＡＲレベルの抑制において、同じ効果を有する。
【００８９】
（実施例９）
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡによる細胞増殖の阻害
ＭＴＴアッセイを用いて、ビトロネクチンコートされたマイクロプレート上で培養された細胞の増殖に対する、ｓｉＲＮＡベクター（ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭ）の効果を評価した。３日間の感染の後、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭベクター感染ＳＮＢ１９細胞は、親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクトＳＮＢ１９細胞のものと比較して、増殖の減少を示した（図１１）。ｐＵＭベクター効果は、単一のｓｉＲＮＡコンストラクト（ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９）と比較して、ＳＮＢ１９増殖がかなり高かった。親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクトＳＮＢ１９細胞の間に、増殖の差はなかった。
【００９０】
（実施例１０）
ＲＮＡ干渉は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９免疫蛍光および腫瘍誘導性新脈管形成を阻害した。
【００９１】
ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９を感染させたＳＮＢ１９細胞は、免疫細胞化学によって測定すると、それぞれｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９タンパク質レベルのダウンレギュレーションを引き起こした。ｐＵＭでトランスフェクトした細胞は、免疫細胞化学によって測定すると、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９タンパク質レベルの両方のダウンレギュレーションを引き起こした（図１２Ａ）。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の両方のｓｉＲＮＡを発現する組み合わせたコンストラクトの効果を測定するために、ＳＮＢ１９細胞をｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした。細胞はまた、ＥＶおよびＳＶでトランスフェクトし、対照とした。結果から、ｐｕＰＡＲのみでトランスフェクトした細胞がｕＰＡＲタンパク質レベルのダウンレギュレーションを示したことは明らかである。ｐＭＭＰ−９でトランスフェクトした細胞は、ＭＭＰ−９のみのダウンレギュレーションを示したが、ｐＵＭでトランスフェクトした細胞は、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９タンパク質レベルの両方のダウンレギュレーションを引き起こし、二重のコンストラクトが標的タンパク質レベルのダウンレギュレーションで、同じくらい、あるいはそれ以上効率的であったことが示された。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡが腫瘍誘導性毛細血管形成も阻害し得るかどうかを試験するために、トランスフェクトおよび非トランスフェクトＳＮＢ１９神経膠腫細胞を、ヒト内皮細胞とともに共培養した。第ＶＩＩＩ因子抗原を用いて免疫組織化学的解析を行い、インビトロの共培養系における腫瘍誘導性血管形成、ならびにＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲまたはｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでのトランスフェクションの後のこれらの共培養物のＨ＆Ｅ染色を評価した。図１２Ｂは、ＳＮＢ１９細胞とともに培養した内皮細胞が、ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトした培養物において２４〜４８時間以内に明確な毛細血管様網を形成したことを示す。対照的に、ｐＵＭトランスフェクトＳＮＢ１９細胞は、内皮細胞において、毛細血管様網形成を誘導しなかった。分枝点および分枝の数の定量化は、親および空の／スクランブルベクターでトランスフェクトした共培養物と比較して、ｐＵＭトランスフェクト共培養において有意に減少した（図１２Ｃ）。さらに、効果は、毛細血管様構造形成に関して親ＥＶ／ＳＶ処置群と比較して、ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９ベクターにおいて５０％未満であり、ｐｕＰＡおよびｐＭＭＰベクターでトランスフェクトした共培養物において５０％未満であった。親ＥＶトランスフェクトＳＮＢ１９細胞を含むチャンバーの移植は、湾曲した細い構造および多くの小さな出血点を有する微小血管発生を生じた。対照的に、ｐＵＭベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の移植は、いかなるさらなる微小血管の発生も生じなかった（図１２Ｄ）。
【００９２】
（実施例１１）
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡは、ＳＮＢ１９細胞の浸潤を阻害する。
【００９３】
ｓｉＲＮＡ発現はｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９を阻害したので、その細胞浸潤を阻害する能力を評価した。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞を、マトリゲルコートされたフィルターを通して浸潤させた。図１３Ａは、ｐＵＭトランスフェクトＳＮＢ１９細胞の染色が親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞のものよりも有意に低かったことを示す。細胞の定量的解析から、親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞と比較して、８％のｐＵＭトランスフェクトのみが浸潤したことが示された（図１３Ｂ）。さらに、ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９ベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の浸潤の定量的解析は、親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクトＳＮＢ１９細胞と比較して、２５％および５０％浸潤した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ＲＮＡｉはまた、三次元スフェロイド浸潤モデルにおいてＳＮＢ１９細胞の浸潤を阻害した。図１３Ｃは、ｍｏｃｋおよび空の／スクランブルベクターでトランスフェクトした神経膠腫スフェロイドがラット脳凝集物に結合し、集合物に漸進的に浸潤したことを示す。しかしながら、ｐＵＭトランスフェクト神経膠腫スフェロイドとの共培養物はラット脳凝集物に結合できず、浸潤しなかった。定量的解析は、親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクトスフェロイドでは２〜４％のラット胎仔脳凝集物のみが残ったが、ｐＵＭトランスフェクトスフェロイドでは９０〜９５％のラット胎仔脳凝集物が残ったことを示した（図１３Ｄ）。７２時間目に、ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９トランスフェクト共培養物において、ラット脳凝集物はおよそ２５％および４５％の浸潤を現した。まとめて考えると、これらの発見から、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性サイレンシングが両方のインビトロモデルにおいて、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の単一のｓｉＲＮＡコンストラクトと比較して、神経膠腫細胞浸潤を大いに阻害するという強力な証拠が提供される。これらの結果から、ｕＰＡＲの単一のｓｉＲＮＡコンストラクトが、ＭＭＰ−９の単一のｓｉＲＮＡコンストラクトよりも効果的であったことが示された。
【００９４】
（実施例１２）
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡの治療効果
腫瘍進行におけるｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性干渉の効果を評価するために、ｐＵＭベクターを、定位ポンプを用いて、腫瘍を有するマウスに注射した。侵襲性腫瘍細胞の検出を容易にするために、ヒト神経膠芽腫細胞（ＳＮＢ１９）を、緑色蛍光タンパク質のｃＤＮＡで評価した（ＳＮＢ１９−ＧＦＰ）。脳切片の顕微鏡検査から、ＰＢＳまたは空のベクター（ＥＶ）のみを施した対照動物は、ＧＦＰ蛍光および同様の切片のＨ＆Ｅ染色で可視化すると、５週間の追跡期間の後、相当な腫瘍増殖を発生したことが明らかになった。対照的に、腫瘍増殖またはＧＦＰ蛍光もしくはＨ＆Ｅ染色は、同じ条件下でｐＵＭベクターを施した動物では検出されなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。処置に関して盲検化された神経病理学者によるヘマトキシリンおよびエオシン染色した脳切片またはＧＦＰ切片の定量化から、対照と空のベクター処置群との間に腫瘍サイズの差がないことが明らかになった。しかしながら、腫瘍の全体的退行が、ｐＵＭベクター処置群で現れた（図１４Ｃ）。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の単一のｓｉＲＮＡ処置コンストラクトの場合、予め確立された大脳内腫瘍増殖は、それぞれ７０％および４０％阻害された。ｐＵＭベクターの腹腔内注射は、６ヵ月もの長い間、予め確立された大脳内腫瘍増殖の完全な退行を生じた。これらの結果から、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性抑制が、予め確立された大脳内腫瘍増殖を劇的に阻害したことが示された。
【００９５】
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性阻害は、いくつかの独立した様式で腫瘍増殖を阻害し得る。ＤＮＡ断片化によって測定したアポトーシスは、アンチセンスｕＰＡＲ安定性クローンを注射した動物の脳において、親細胞系と比較して、より高かった。大脳内腫瘍モデルにおいて観察された抗腫瘍効果は、腫瘍細胞死の誘導のためかもしれなかった。
【００９６】
腫瘍細胞は、生存および増殖するのに新脈管形成に依存する。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性阻害は、インビトロ共培養系において、腫瘍誘導性を有意に阻害した。ｐＵＭベクターの抗新脈管形成効果は、腫瘍細胞が生存に必要な血管を補充する能力を抑制し、抗新脈管形成効果を腫瘍細胞自体に向けた。ｕＰＡＲのｓｉＲＮＡが腫瘍進行をブロックする能力はまた、ｕＰＡの抗アポトーシスおよび新脈管形成効果のブロッキングを含む。一般に、腫瘍が１００ｍｍに達した後に腫瘍負荷を減少させることのできる、前臨床モデルにおける単独療法として用いられる単一の抗新脈管形成剤（アンジオスタチンおよびエンドスタチンを含む）はない。ＰＩｇ、ｕＰＡ、またはｔＰＡがないことによって、実験的脈絡膜新生血管の発生が、野生型またはｕＰＡＲ欠損マウスと比較して、有意に減少したことが報告されている。この効果は、部分的にマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の調節によると示唆された。研究から合成ＭＭＰ阻害因子の抗新脈管形成効果が示されたが、これらの阻害因子の実質的に全ては、単一のＭＭＰに対する特異性を欠いている。例えば、ＭＭＰ−１、−３、および−９を阻害するＫＢ−Ｒ７７８５で処置したマウスの原発腫瘍および転移において、減少した血管密度および増大した腫瘍細胞アポトーシスが観察された。ＭＭＰＩは、進行した疾患を有する患者において単独療法として用いた場合、わずかな臨床的利益しか示さなかった。したがって、ＭＭＰ阻害と他のモダリティーとを組み合わせた使用もまた、癌治療の戦略である。
【００９７】
（実施例１３）
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９に対するｓｉＲＮＡは、リン酸化ＥＲＫ、ＭＡＰＫおよびＡＫＴのレベルを阻害する。
【００９８】
ＥＲＫ、ＭＡＰＫおよびＡＫＴ経路は、細胞増殖および生存において主要な役割を果たす。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでのＳＮＢ１９細胞のトランスフェクションの後に、これらの分子に特異的な特異的抗体を用いることによって、ウエスタンブロッティングを用いて、全体的およびリン酸化形態のＥＲＫ、ＭＡＰＫおよびＡＫＴのレベルを比較した。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭコンストラクトによって、全体的ＭＡＰＫ、ＥＲＫおよびＡＫＴの量に有意な差はなかった（図１５）。しかしながら、リン酸化形態のＭＡＰＫ、ＥＲＫおよびＡＫＴのレベルは、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲおよびｐｕＰＡトランスフェクトＳＮＢ１９細胞と比較して、ｐＵＭによって有意に減少した（図１５）。
【００９９】
ＭＣＦ−７細胞における、ｕＰＡの、ｕＰＡＲへの結合は、細胞移動性に必要な、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２を活性化する。前立腺癌細胞系（ＰＣ_３ＭＬＮ_４）において、ＭＡＰＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼシグナリング経路を通じて媒介され得るｕＰＡＲの発現をアップレギュレーションすることによって、低酸素によって腫瘍細胞浸潤が減少した。さらに、低酸素におけるＢｃｌ２によるｕＰＡＲ発現のアップレギュレーションは、ＥＲＫシグナリング経路を通じて、ＳＰ１ ＤＮＡ結合活性によって媒介された。ＥＧＦＲなしでは、代替的な経路がｕＰＡＲをＥＲＫに連結する。しかしながら、この経路はＥＧＦＲ発現によってサイレンシングされ、そのため、細胞移動性におけるｕＰＡＲの関与を示す。ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシン類似物）の安定したトランスフェクションによって、焦点接着キナーゼおよびＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナリングのヒアルロン酸誘導性リン酸化によって引き起こされるＭＭＰ−９分泌が減少した。ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ増幅を有する神経膠芽腫は、最も高いレベルのＭＭＰ−９を示した。ｍｔ ＥＲＫおよびｍｔ ＪＮＫでのＳＮＢ１９細胞の一時的トランスフェクションによってＭＭＰ−９プロモーターが抑制され、いずれかの経路に干渉することでＭＭＰ−９発現の阻害が生じることが示唆された。種々の刺激による、または異なる細胞条件でのＭＭＰ−９活性化の調節は、異なるシグナル伝達経路を伴い得る。ＭＥＫ特異的阻害因子によるＥＲＫの阻害は、乳癌細胞においてＭＭＰ−９発現をブロックし、ＭＭＰ−９生成を減少させ、頭部および頸部扁平上皮癌細胞におけるインビボの侵襲性を和らげた。ｍｔ−ＥＲＫ安定性トランスフェクト細胞は、侵襲性が低く、ＭＭＰ−９レベルが有意に減少していた。これらの２つのシグナリング経路（ＭＡＰＫおよびＥＲＫ１／２）は、ｕＰＡがｕＰＡＲ ｐＵＭコンストラクトに結合してこれらのシグナリング経路分子のリン酸化形態を阻害すると、活性化されることが報告されている（図１５〜１６）。
【０１００】
（実施例１４）
ＲＮＡｉ媒介性癌治療およびｓｉＲＮＡの送達
例えばｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９過剰発現等の、遺伝子のｓｉＲＮＡ阻害は、ヒト癌の治療のための利用可能な治療モダリティーのリストを拡張させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム技術を含むアンチセンスアプローチが利用可能であるが、それらの効率は十分ではない。ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性阻害は、ヌードマウスにおいて、予め確立された神経膠腫腫瘍増殖を完全に抑制した。したがって、ＲＮＡｉは、標的遺伝子発現を減少させることにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム技術等の他の遺伝学的手段の強力な代替手段である。ＲＮＡｉまたはＲＮＡｉ様効果は、標的遺伝子発現を減少させることにおいて、アンチセンス効果よりも能力があり、ＲＮＡｉの潜在的な適用性が示唆された。環状構造の腫瘍誘導アルギニン−グリシン−アスパラギン酸モチーフ、ＤＮＡ結合オリゴリシンおよびヒスチジル残基を含むペプチドベクターを用いて、細胞質への送達を容易にした。ペプチドベクターは、ｓｉＲＮＡの担体として機能することができる。ＲＮＡｉベースの遺伝子療法は、神経膠腫ならびに前立腺癌、乳癌、および黒色腫を含む他の転移性腫瘍の治療のための、新規のアプローチである。
【０１０１】
（実施例１５）
全細胞抽出物中のカテプシンＢおよびｕＰＡＲタンパク質レベルに対するｐＣＵベクターの効果
タンパク質分解性分解を標的とするＲＮＡｉは、癌細胞浸潤を妨げるための介入である（図１７）。カテプシンＢおよびｕＰＡＲは、ＥＣＭ分解において重要な役割を果たすことが示されている。カテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡを発現するベクター（ｐＣＵ）でのＳＮＢ１９細胞のトランスフェクションは、ｍｏｃｋおよび空のベクター（ＥＶ）対照と比較して、両方のタンパク質の発現を強力に阻害した（図１８ＡおよびＣ）。β−アクチンのレベルから、等しい量のタンパク質がゲルにロードされたことが決定された（図１８）。濃度計によるカテプシンＢおよびｕＰＡＲバンドの定量的解析から、ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、カテプシンＢ（１４〜１６倍）およびｕＰＡＲタンパク質（１０〜１２倍）およびｐＣＵトランスフェクト細胞における有意な（Ｐ＜０．００１）減少が明らかになった（図１８ＢおよびＤ）。ｐＵおよびｐＣベクターでトランスフェクトした細胞は、それぞれｕＰＡＲおよびカテプシンＢのレベルを阻害した（図１８ＡおよびＣ）。
【０１０２】
（実施例１６）
ｐＣＵベクターによる、腫瘍細胞誘導性毛細血管網形成の阻害
新生の腫瘍は、腫瘍増殖にエネルギーを供給する新しい血管の形成に依存する。カテプシンＢおよびｕＰＡＲは新脈管形成を調節すると報告されているので、腫瘍細胞誘導性新脈管形成に対するｐＣＵの効果を評価した。インビトロ共培養系における腫瘍誘導性血管形成を評価するための第ＶＩＩＩ因子抗原、およびｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵまたはｐＣＵでのトランスフェクション後のＳＮＢ１９細胞の馴化培地の存在下で増殖した内皮細胞のＨ＆Ｅ染色を用いて、免疫組織化学的解析を行った。結果から、ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトした細胞の存在下で内皮細胞が４８時間以内に毛細血管様構造を形成するが、ｐＣＵベクターは腫瘍細胞誘導性毛細血管様網形成を有意に阻害したことが示された（図１９Ａ）。分枝点および分枝の数の定量化は、ｍｏｃｋおよび空のベクターと比較して、ｐＣＵトランスフェクト共培養物において検出できなかった（図１９Ｂ）。さらに、効果は、毛細血管様構造に関して、ｐＣＵベクターと比較して、ｐＣまたはｐＵ処置した共培養物では５０％未満であった。インビトロ共培養実験を確かめるために、背側チャンバーモデルによって評価して、ｐＣＵベクターが腫瘍新脈管形成を阻害できるかどうかをインビボで調べた。ｍｏｃｋおよび空のベクター（ＥＶ）でトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞を含有する移植したチャンバーは、湾曲した細い構造および多くの小さな出血点を有する微小血管（矢印で示す）の発生を生じた。対照的に、ｐＣＵでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の、移植したチャンバーは、いかなるさらなる微小血管の発生も生じなかった（図１９Ｃ）。
【０１０３】
（実施例１７）
ｓｉＲＮＡによる、ＳＮＢ１９スフェロイドの遊走の阻害
カテプシンＢおよびｕＰＡＲ ｓｉＲＮＡ発現が腫瘍細胞遊走および増殖に影響を及ぼすことができるかどうかを決定するために、ＳＮＢ１９スフェロイドをｐＣＵベクターでトランスフェクトした。図２０Ａに示すように、ｍｏｃｋおよび空のベクター（ＥＶ）でトランスフェクトしたスフェロイドからの、かなり高い細胞遊走があり、単一のコンストラクトでトランスフェクトしたスフェロイドでは、遊走の５０％までの阻害が観察された。しかしながら、腫瘍スフェロイドからの細胞遊走は、ｐＣＵベクターでトランスフェクトしたスフェロイドにおいて、完全に阻害された。ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトしたスフェロイドの遊走は、スフェロイド外に遊走した細胞の数によって定量化すると、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵトランスフェクトスフェロイドと比較して、相当高かった（Ｐ＜０．００１）（図２０Ｂ）。スフェロイドからの細胞の遊走は、これらの分子の単一のＲＮＡｉコンストラクトと比較して、２シストロン性コンストラクトで阻害された。ｍｏｃｋおよび空のベクター対照のものと比較して、少ない細胞がｐＣＵトランスフェクトＳＮＢ１９スフェロイドから遊走したので、それによって、細胞遊走におけるカテプシンＢおよびｕＰＡＲの役割が示された。
【０１０４】
（実施例１８）
カテプシンＢおよびｕＰＡＲに対するｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞浸潤を阻害する。
【０１０５】
神経膠腫侵襲性に対するカテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡ媒介性阻害の影響を評価するために、２モデルの系を使用した。ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞は、細胞の強い染色によって観察すると、マトリゲルコートしたトランスウェルインサートに広範に浸潤した。対照的に、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵトランスフェクト培養物は、ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、再構成された基底膜を通る、より低い侵襲性を有した（図２０Ｃ）。浸潤の定量的測定によって、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞が、ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトした対照と比較して、それぞれ５５％、４０％および６％しか浸潤しなかったことが確認された（図２０Ｄ）。マトリゲル浸潤アッセイによって測定したこれらの細胞の侵襲性の性質の阻害は、単一のコンストラクトと比較して、２シストロン性コンストラクトトランスフェクト細胞においてかなり高かった。
【０１０６】
スフェロイド浸潤アッセイにおけるｐＣＵの効果の程度を試験した。スフェロイド共培養アッセイにおいて、対照神経膠腫スフェロイド、および空のベクターでトランスフェクトしたスフェロイドは、ラット胎仔脳凝集物に漸進的に浸潤し、ｐＣＵでトランスフェクトしたスフェロイドの、部分的〜ほとんど完全な阻害を生じた（図２０Ｅ）。ラット胎仔脳凝集物の定量化から、神経膠腫スフェロイドが、２４時間以内に２５％、４８時間以内に７０％未満、および７２時間以内に９０％未満、ラット胎仔脳凝集物を浸潤したことが明らかになった。対照的に、ｐＣＵベクターでトランスフェクトした腫瘍スフェロイドは、ラット胎仔脳凝集物を浸潤しなかった。７２時間目に、ラット脳凝集物は、ｍｏｃｋ空のベクター、ｐＣ、およびｐＵトランスフェクト共培養物においておよそ９０％、８５％、５５％および３５％の浸潤を現したが、ｐＣＵトランスフェクト共培養物では、２％〜３％の浸潤しか現さなかった（（図２０Ｆ）。まとめて考えると、これらの発見から、カテプシンＢおよびｕＰＡＲのＲＮＡｉ媒介性サイレンシングが神経膠腫細胞浸潤を両方のインビトロモデルで強力に阻害すること、および単一のコンストラクトと比較して、２シストロン性コンストラクトで効果がかなり高かったことの、強力な証拠が提供される。
【０１０７】
腫瘍細胞浸襲性の獲得は、腫瘍進行の側面の１つである。カテプシンＢおよびｕＰＡＲの発現が浸潤過程の必須の構成要素であることを示す、いくつかの報告がある。ｐＣＵベクターでのトランスフェクションによって、マトリゲル浸潤およびスフェロイド共培養アッセイにおいて、ＳＮＢ１９細胞およびスフェロイドの侵襲性が阻害された。カテプシンＢのマトリゲル浸潤の要件は、プロテアーゼのネットワークとのその相互作用によるかもしれない。カテプシンＢは、プロ−ストロメライシン等の、プロ−ｕＰＡおよびメタロプロテイナーゼ等の、セリンプロテイナーゼの前駆体をその活性形態に活性化することが示されている。形質転換ヒト乳房上皮細胞系の、マトリゲルを通る侵襲性は、カテプシンＢ発現と関連があり、システインプロテイナーゼ阻害因子によって阻害された。卵巣癌細胞において、細胞表面カテプシンＢの阻害はプロ−ｕＰＡの活性化を防ぎ、それに続いて、マトリゲルを通る癌腫細胞の浸潤を防いだ。ヒト結腸癌におけるカテプシンＢ活性は、癌細胞、内皮細胞および炎症細胞の侵襲性ならびにアポトーシス性および壊死性細胞死に関連がある。ｕＰＡおよびｕＰＡＲは、乳癌、卵巣癌、および胃癌を含む種々の悪性腫瘍において過剰発現されることが公知であり、侵襲性および転移性表現型の維持に必須であることが示されている。
【０１０８】
（実施例１９）
カテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションは、ＳＮＢ１９細胞の増殖を減少させる。
【０１０９】
標準的ＭＴＴアッセイを用いて、ビトロネクチンコートされたマイクロプレート上で培養した細胞の増殖に関して、ｓｉＲＮＡベクター（対照、ＥＶ、ＳＶ、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵ）の効果を評価した（図２１）。感染の７２時間後に、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵベクター感染ＳＮＢ１９細胞は、ＳＮＢ１９およびベクター対照のものと比較して、増殖の減少を示した。ｐＣＵトランスフェクト細胞は、７日間のトランスフェクションの後でも、測定できるいかなる増殖も示さなかった。７日間のアッセイの後でも、いずれのトランスフェクト細胞でも浮遊細胞または細胞残屑は見られず、アポトーシスがないことが示された。
【０１１０】
（実施例２０）
ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションが、ＥＲＫ１／２およびＦＡＫリン酸化を阻害する。
【０１１１】
シグナリング経路分子に対するｕＰＡＲおよびカテプシンＢのダウンレギュレーションの効果を測定するために、ともに腫瘍細胞生存、遊走および増殖に直接関係するＥＲＫおよびＦＡＫのリン酸化を、ウエスタンブロッティングによってアッセイした。図２２は、ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのＲＮＡｉ媒介性の同時のダウンレギュレーションによってＥＲＫ１／２およびＦＡＫのリン酸化が遅れ、単一のコンストラクトでは効果がかなり少なかったことを示す。
【０１１２】
結果から、ｕＰＡＲおよびカテプシンＢのダウンレギュレーションによって、細胞生存および増殖の直接の原因であるＥＲＫ１／２およびＦＡＫリン酸化のダウンレギュレーションが誘導されたことが示された。ＥＲＫ−ＦＡＫカスケードにおけるｕＰＡＲの関与は、ヒト癌腫細胞ＨＥｐ３において以前に報告されているが、カテプシンＢの役割は未だ不明である。ｕＰＡＲおよびカテプシンＢの組み合わせのダウンレギュレーションは、ＥＲＫ１／２およびＦＡＫのリン酸化の阻害に、より効果的である。
【０１１３】
（実施例２１）
カテプシンＢおよびｕＰＡＲ ＲＮＡｉは、大脳内腫瘍増殖を抑制する。
【０１１４】
大脳内腫瘍モデルを用いて、予め確立されたインビボの腫瘍増殖に対する、ＲＮＡｉ媒介性阻害の潜在的効果を評価した。未処置（ｍｏｃｋ）およびＥＶ処置対照群の脳切片は、５週間の追跡期間の後のＨ＆Ｅ染色および高いＧＦＰ蛍光による、大きな広がった腫瘍増殖によって特徴付けられた（図２３ＡおよびＢ）。しかしながら、ｐＣＵベクターで処置したマウスの脳切片で、ＧＦＰ蛍光は検出されなかった（図２３ＡおよびＢ）。処置に関して盲検化された神経病理学者によって点数付けされたＨ＆Ｅ染色脳切片のさらなる定量化から、ｍｏｃｋおよび空のベクター処置群の間の腫瘍サイズの差は明らかにならず、ｐＣおよびｐＵ処置群で、対照と比較して５５％および６５％の腫瘍増殖の有意な退行が明らかになった。しかしながら、ｐＣＵ処置群においては、予め確立された腫瘍の全体的退行が明らかになった（図２３）。これらの結果から、カテプシンＢおよびｕＰＡＲのＲＮＡｉ媒介性抑制によって大脳内腫瘍増殖が有意に阻害されたことが示された。
【０１１５】
ミニ浸透圧ポンプを用いたｐＣＵの局所的大脳内送達によって、ヒト悪性神経膠腫増殖が効果的に阻害された。ミニ浸透圧ポンプは、相当な時間にわたって明確で一貫したパターンの薬物曝露を維持し、脳への作用物質の送達にうまく用いられ得る。カテプシンＢおよびｕＰＡＲのダウンレギュレーションは、腫瘍誘導性新脈管形成の阻害を生じる。共培養アッセイをインビトロで用いて、新脈管形成に対するｐＣＵの効果を試験した。結果から、カテプシンＢおよびｕＰＡＲが新脈管形成の刺激において関連性のある役割を果たすことが示され、大脳内腫瘍モデルにおけるｐＣＵのインビボ抗腫瘍活性の作用の、可能性のある機構が示唆された。新生血管の内皮細胞にカテプシンＢの強い染色が存在するが、前立腺の既存の微小血管系には存在しない。同様に、ラット脳微小血管内皮細胞において、それらがインビトロで毛細血管を形成すると、カテプシンＢの強い免疫染色が観察された。カテプシンＢはＴＩＭＰの阻害因子であることが示されており、ＴＩＭＰは新脈管形成の阻害因子なので、カテプシンＢはまた、腫瘍の広がりにおいて関連性のある役割を有する新脈管形成を刺激し得る。おそらく新脈管形成および侵襲性が阻害されたために、カテプシンＢおよびｕＰＡＲのＲＮＡｉ媒介性標的化によって、予め確立された大脳内腫瘍増殖が抑制された。これらの結果はまた、標的遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションが脳微環境内で十分安定していることを支持する。
【０１１６】
（実施例２２）
ＳＮＢ１９神経膠芽腫細胞における、ｕＰＡＲタンパク質、ならびにｕＰＡおよびＭＭＰ−９酵素活性に対するｓｉＲＮＡコンストラクトの効果
３つの内在性遺伝子をヘアピンｓｉＲＮＡで同時に阻害するために、ＣＭＶプロモーター制御下でｕＰＡＲ（ＲＮＡでのヒトｕＰＡＲの７７〜９８塩基）、ｕＰＡ（ＲＮＡでのヒトｕＰＡの３４６〜３６７塩基）およびＭＭＰ−９（ＲＮＡでのヒトＭＭＰ−９の３６０〜３８１塩基）のｓｉＲＮＡを発現するベクター（ｐＵ_２Ｍ）を構築した（図２４）。塩基は、全長コード配列中の位置を示す。ウエスタンブロット解析を行って、ＳＮＢ１９細胞中のｕＰＡＲタンパク質濃度に対する、空のベクター／スクランブルベクター（ＥＶ／ＳＶ）、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍトランスフェクションの効果を調べた。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡおよびｐＭＭＰ−９でトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞にｕＰＡＲタンパク質バンドが存在したが、これはｐｕＰＡＲおよびｐＵ_２Ｍ処置細胞では有意に減少した（図２５Ａ）。３シストロン性コンストラクト（ｐＵ_２Ｍ）の効果は、ｐｕＰＡＲよりも大きかった（図２５Ａ）。ＧＡＰＤＨのレベルから、等しい量のタンパク質がゲルにロードされたことが決定された（図２５Ａ）。フィブリンザイモグラフィーを行って、ｕＰＡ酵素活性に対する、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍ処置ＳＮＢ１９細胞の効果を調べた。ゼラチンザイモグラフィーを行って、ＳＮＢ１９細胞中のＭＭＰ−９のレベルに対するこれらのコンストラクトの効果を測定した。ＭＭＰ−９レベルは、親、ＥＶ／ＳＶおよびｐｕＰＡ処置細胞と比較して、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍで処置したＳＮＢ１９細胞で有意に減少した（図２５Ｂ）。興味深いことに、ｐＵ_２Ｍ処置細胞において、ＭＭＰ−２レベルもまたダウンレギュレーションされた。等しい量のタンパク質がロードされるように、注意が払われた。（図２５Ｂ）。ｕＰＡ酵素活性（ＭＲ ５５ ０００）は、親、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９処置群と比較して、ｐｕＰＡおよびｐＵ_２Ｍ処置細胞で有意に減少した（図２５Ｃ）。
【０１１７】
３シストロン性コンストラクトの効果は、これらの分子の単一のｓｉＲＮＡコンストラクトのものよりも明白であった。免疫組織化学的解析によって測定すると、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍトランスフェクションによって、ＳＮＢ１９細胞中のｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９濃度が減少した。図２５Ｄは、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９に対する特異的抗体を用いた、親、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍ処置細胞中のｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のタンパク質レベルを示す。ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のそれぞれの強度は親細胞中およびＥＶ／ＳＶでトランスフェクトした細胞で高かった。対照的に、ｕＰＡＲ強度は、ｐｕＰＡＲおよびｐＵ_２ＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞で減少した。ｐｕＰＡおよびｐＵ_２Ｍトランスフェクションによって、親、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲおよびｐＭＭＰ−９トランスフェクト細胞と比較して、ｕＰＡタンパク質の強度が有意に減少した。さらに、ＭＭＰ−９タンパク質濃度は、親、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡおよびｐｕＰＡＲトランスフェクト細胞と比較して、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍトランスフェクト細胞で有意に減少した。これらの結果から、単一のコンストラクトの効果が分子特異的であること、および３シストロン性コンストラクトの効果が単一のコンストラクト単独のものよりかなり明白であることが示された。
【０１１８】
（実施例２３）
ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍは、腫瘍誘導性毛細血管網形成を阻害する。
【０１１９】
神経膠腫腫瘍の増殖は、腫瘤の発生を支持するのに必要な、新しい毛細血管の誘導に依存する。神経膠腫細胞からの馴化培地によって微小血管内皮細胞が誘導されて毛細血管様構造を形成する共培養系を用いて、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性抑制の効果を調べた。インビトロ共培養系における腫瘍誘導性血管形成を評価するための第ＶＩＩＩ因子抗原を用いた免疫組織化学的解析、および行ったＨ＆Ｅ染色。内皮細胞は、ＳＮＢ１９親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞からの馴化培地の存在下で、毛細血管様構造を形成する（図２６Ａ）。対照的に、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡを発現するベクターでのＳＮＢ１９細胞のトランスフェクションによって、個々に、または組み合わせてのいずれかで、腫瘍誘導性微小血管形成が部分的または完全に阻害された（図２６Ａ）。ＥＶ／ＳＶ処置細胞と比較して、ｐＵ_２Ｍ処置細胞では、新しい分枝点および／または分枝の数の増大は検出されなかった（図２６Ａ）。さらに、ＥＶ／ＳＶ処置細胞と比較して、毛細血管様構造の形成が、ｐｕＰＡＲ処置培養物において約５５％、ｐｕＰＡ処置培養物において約３６％、およびｐＭＭＰ−９処置細胞において約６０％阻害された（図２６Ｂ）。
【０１２０】
ｐＵ_２Ｍでトランスフェクトした神経膠芽腫細胞系からの馴化培地は、ｍｏｃｋまたは空のベクターと比較して、毛細血管様構造を阻害した（図２６Ａ〜Ｂ）。このことから、新脈管形成の誘導に必要な新脈管形成シグナルはｐＵ_２Ｍ処置細胞中に存在しなかったことが示される。ｐＵ_２ＭトランスフェクトＳＮＢ１９神経膠腫細胞に新脈管形成誘導がないことによって示されるように、ｈｐＲＮＡによるｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のダウンレギュレーションは、新脈管形成因子のダウンレギュレーションを引き起こした。ｕＰＡまたは組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）がないことによって、野生型（ＷＴ）またはｕＰＡＲ欠損マウス（ｕＰＡ−／−）と比較して、実験的脈絡膜新生血管の発生が有意に減少した。ｕＰＡ−／−およびプラスミノゲン活性化因子阻害因子−１欠損（ＰＡＩ−１−／−）マウスにおいて、ＷＴマウスと比較して有意に減少した原発腫瘍増殖が起こったことが報告されており、ｕＰＡ−／−およびＰＡＩ−／−マウスの腫瘍は、ＷＴマウスと比較して、より低い増殖性およびより高いアポトーシス指数を示し、異なる新血管形態も示した。バクテリオファージディスプレイによってｕＰＡ結合を阻害することが示されているいくつかのペプチドは、同系のマウスにおいて新脈管形成および原発腫瘍増殖を阻害する。
【０１２１】
（実施例２４）
ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍは、ＳＮＢ１９細胞における浸潤を阻害する。
【０１２２】
ＥＣＭ構成要素のタンパク質分解性分解は、腫瘍細胞浸潤に関連性がある。神経膠腫侵襲性に対するｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ媒介性阻害の影響を評価するために、２つのモデルを利用した。第一のモデルにおいて、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍを感染させたＳＮＢ１９細胞の浸潤能力を、ＥＶ／ＳＶベクターを感染させたものと比較した。ＥＶ／ＳＶでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞および親細胞は、細胞の強い染色によって示されるように、マトリゲルコートされたトランスウェルインサートを通る、広範な浸潤を示した。対照的に、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍトランスフェクト培養物は、対照と比較した染色強度によって示されるように、再構成された基底膜を通しての侵襲性が低かった（図２６Ｃ）。定量化によって、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍベクターでのトランスフェクションによって、ＳＮＢ１９細胞による浸潤が、親およびＥＶ／ＳＶトランスフェクト対照と比較して、それぞれ９％、４０％、１５％および２％に減少したことが確かめられた（図２６Ｄ）。浸潤の阻害は、単一のコンストラクトのみと比較して、３シストロン性コンストラクトでトランスフェクトした細胞でより高かった。
【０１２３】
スフェロイド浸潤アッセイを用いて、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍベクターの効果を調べた。神経膠腫スフェロイドを用いることの相当な潜在的利益は、三次元培養で増殖した腫瘍細胞がインビボの腫瘍のものとより密接に類似した特性を示すことである。スフェロイド共培養系において、対照スフェロイドおよびＥＶ／ＳＶベクターでトランスフェクトしたスフェロイドは、ラット胎仔脳凝集物に漸進的に浸潤したが、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトしたスフェロイドは、部分的〜ほとんど完全な浸潤の阻害を示した（図２７Ａ）。定量化によって、神経膠腫スフェロイドがラット胎仔脳凝集物に、１日以内に３０％、２日以内に５５％、および３日以内に９５％浸潤し、このとき腫瘍スフェロイドおよび脳凝集物は組み合わされて単一の実体になったことが明らかになった（図２７Ｂ）。ＥＶ／ＳＶベクターでトランスフェクトした神経膠腫スフェロイドで、同様の傾向が観察された。対照的に、ｐＵ_２Ｍベクターでトランスフェクトした腫瘍スフェロイドは、ラット胎仔脳凝集物に浸潤しなかった。３日目までに、ラット脳凝集物は、親、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐｕＰＡＲトランスフェクト共培養物において、およそ９６％、９５％、４５％、２５％および１５％浸潤され、ｐＵ_２Ｍトランスフェクト共培養物では１％浸潤された（図２７Ｂ）。これらの結果から、ｐＵ_２Ｍが両方のインビトロモデルで神経膠腫浸潤を強力に阻害することの強力な証拠が提供される。
【０１２４】
（実施例２５）
ｐＵ_２Ｍは、大脳内腫瘍増殖を完全に退行させる。
【０１２５】
単一または３シストロン性コンストラクトを用いて、ヌードマウスにおいて予め確立された大脳内腫瘍増殖の退行を引き起こすｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９レベルのダウンレギュレーションを調べた。対照およびＥＶ／ＳＶ処置群における全ての動物は、強いＧＦＰ蛍光によって特徴付けられる、インタクトな脳腫瘍を有した（図２７Ｃ）が、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＭＭＰ−９で処置したマウスの脳切片は、最小のＧＦＰ蛍光によって示される小さな腫瘍を有した。注目すべきことに、ｐＵ_２Ｍで処置したマウスの脳切片において、ＧＦＰ蛍光は検出されなかった（図２７Ｃ）。これらの切片のさらなる定量化（処置条件に対して盲検化された神経病理学者によって点数付けされた）から、親およびＥＶ／ＳＶ処置群の間の腫瘍サイズの差、ならびに、対照群と比較した、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＭＭＰ−９で処置した群における予め確立された腫瘍増殖の有意な退行は明らかにならなかった（それぞれ８０％、５５％、および６８％）（図２７Ｄ）。しかしながら、ｐＵ_２Ｍ処置群において、予め確立された大脳内腫瘍増殖の完全な退行が明らかになった。これらの結果から、３シストロン性コンストラクトを用いたｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性抑制が、ヌードマウスにおいて悪性神経膠腫増殖を完全に根絶したことが示される。
【０１２６】
（実施例２６）
ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害
シグナリング経路に対するｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションの効果をよりよく理解するために、腫瘍細胞生存、遊走および増殖に直接関係する、ＥＲＫ１／２の全体的およびリン酸化レベルをアッセイした。ウエスタンブロットから、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍトランスフェクト細胞と比較して、対照およびＥＶ／ＳＶトランスフェクト細胞における全ＥＲＫ１／２濃度に有意な差がなかったことが示された（図２８）。しかしながら、ホスホ−ＥＲＫ１／２の濃度は、対照、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＭＭＰ−９トランスフェクトＳＮＢ１９細胞と比較して、ｐＵ_２ＭベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞で有意に減少した。注目すべきことに、単一のコンストラクトのいずれかでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞において、ホスホ−ＥＲＫのレベルに対する効果はなかった。ＧＡＰＤＨレベルから、等しい量のタンパク質がゲルにロードされたことが示された（図２８）。
【０１２７】
（実施例２７）
遺伝子特異的ｓｉＲＮＡは、神経膠腫細胞系におけるＭＭＰ−９およびカテプシンＢタンパク質の発現を低下させる。
【０１２８】
２つの内在性遺伝子をヘアピンｓｉＲＮＡ発現ベクターで同時に阻害することの効果を試験するために、カテプシンＢ（ヒトカテプシンＢ ｍＲＮＡの７３２〜７５３塩基）およびＭＭＰ−９（ヒトＭＭＰ−９ ｍＲＮＡの３６０〜３８１塩基）のｓｉＲＮＡを発現するベクターを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に構築した（ｐＣＭ）（図２９）。塩基は、全長コード配列中の位置を示す。図３０Ａは、ｐＣおよびｐＣＭベクターでのトランスフェクションが、ｍｏｃｋ、空の、およびｐＭベクター対照と比較して、カテプシンＢレベルを特異的に阻害することを示す。同じブロットで評価したβ−アクチンレベルは、カテプシンＢの阻害が特異的であることを示し、等しい量の試料ローディングが確認された。トランスフェクト細胞の馴化培地中で、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９レベルを測定した。ｍｏｃｋおよび空のベクター（ＥＶ）トランスフェクト細胞から放出されたＭＭＰ−９の量は、同じであった。ｐＭおよびｐＣＭベクターでトランスフェクトした細胞は、ｍｏｃｋ、ＥＶ、およびｐＣ対照と比較して、低いレベルのＭＭＰ−９を発現した。ＭＭＰ−２の発現の変化はなく、ｐＭおよびｐＣＭベクターの配列特異的阻害が示された（図３０Ｂ）。ＭＭＰ−９活性の減少がタンパク質発現の減少のためであることを確かめるために、ＭＭＰ−９特異的抗体での免疫ブロットを用いて、馴化培地を解析した。ｐＭおよびｐＣＭベクターでトランスフェクトした細胞からの馴化培地の免疫ブロットによって、ＭＭＰ−９タンパク質バンドが劇的に減少したが、バンドは有意に、空のベクターまたはｐＣベクターを感染させた細胞からの馴化培地においてかなりより強かった（図３０Ｃ）。
【０１２９】
（実施例２８）
ＰＣＭベクターによる、腫瘍細胞誘導性毛細血管網形成の阻害
神経膠腫腫瘍の増殖は、発生する腫瘤を支持するのに必要なので、新しい毛細血管の誘導に依存する。カテプシンＢおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性抑制を調べるために、微小血管内皮細胞が神経膠腫細胞によって誘導されて毛細血管様構造を形成する、共培養系を用いた。ＳＮＢ１９細胞は、７２時間以内に、内皮細胞を誘導して、毛細血管様構造に分化した。対照的に、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡを発現するベクターでのＳＮＢ１９細胞のトランスフェクションによって、腫瘍細胞誘導性微小血管形態形成が完全に阻害された（図３１Ａ）。分枝点および分枝の数のさらなる定量化は、ｍｏｃｋおよび空のベクターと比較して、ｐＣＭトランスフェクト共培養物中で検出できなかった（図３１Ｂ）。さらに、効果は、毛細血管様構造に関して、ｐＣＭベクターと比較して、ｐＣまたはｐＭ処置共培養物でわずか５０％であった。インビトロ共培養実験を確かめるために、背側ウインドウモデルによって評価して、ｐＣＭベクターが腫瘍新脈管形成を阻害できるかどうかをインビボで調べた。ｍｏｃｋおよび空のベクター（ＥＶ）でトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞を含有するチャンバーの移植は、湾曲した細い構造および多くの小さな出血点を有する微小血管（矢印で示す）の発生を生じた。対照的に、ｐＣＭベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の移植は、いかなるさらなる微小血管の発生も生じなかった（図３１Ｃ）。
【０１３０】
悪性腫瘍の増殖維持は、腫瘍に栄養分を供給する血管網の発生と密接に関連している。ｐＣＭベクターで処置した細胞における、閉じた多角形および複雑なメッシュ様構造によって特徴付けられる血管ネットワークの形成は、観察されなかった。このネットワークは、典型的には、神経膠腫細胞が内皮細胞とともに共培養された場合に観察される。細胞外マトリックス構成要素のタンパク質分解によって、内皮細胞が遊走できるようになり、貯蔵された新脈管形成シグナリング分子が細胞外マトリックスから放出される。免疫組織化学的解析から、正常な脳組織と比較して、悪性未分化星状細胞腫および神経膠芽腫においてカテプシンＢが強く発現されたことが示された。
【０１３１】
これらの結果から、ＭＭＰが新脈管形成を促進し得ること、およびＭＭＰが完全にないと新しい血管形成が予防され得ることが示される。本開示における組み合わせの療法によって達成される腫瘍退行は、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９の相補的作用による。腫瘍細胞中のカテプシンＢおよびＭＭＰ−９の発現を標的とすることは、新脈管形成および腫瘍増殖を制御する効果的なアプローチである。
【０１３２】
（実施例２９）
神経膠腫遊走および浸潤に対するｐＣＭベクターの抑制効果
細胞遊走は、細胞−細胞結合、細胞−マトリックス結合およびマトリックスリモデリングの共同した調節を必要とする。細胞がスフェロイド遊走アッセイにおいてビトロネクチン上で遊走する能力に対する、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９を抑制することの効果を、研究した。アガロースでコートした６ウェルプレート中で、ＳＮＢ１９−ＧＦＰ細胞から多細胞神経膠腫スフェロイドを増殖させた。形態およびトリパンブルー排除を用いて生存能をチェックした後、同様の直径（１００〜２００μｍ）のスフェロイドを、ｍｏｃｋ、空のベクター（ＥＶ）、またはカテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡを発現するｐＣＭベクターでトランスフェクトした。３日後、単一のスフェロイドをビトロネクチンコートされたプレートに入れて遊走させた。図３２Ａは、対照スフェロイドおよび空のベクターを感染させたスフェロイドからの細胞が、ｐＣＭベクター感染細胞と比較して、細胞が遊走する有意に高い能力を示したことを示す。細胞外マトリックス構成要素のタンパク質分解性分解は、腫瘍細胞浸潤に関連性がある。カテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡの発現が神経膠腫侵襲性において役割を果たすかどうかを調査するために、ｍｏｃｋおよび空のベクターを感染させた細胞に対する、ｐＣＭベクターでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の浸潤能力を比較した。ｍｏｃｋおよび空のベクター（ＥＶ）でトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞は、マトリゲルを通って浸透したｐＣＭベクタートランスフェクト細胞と比較してより広範に、マトリゲルを通って浸潤した（図３２Ｂ）。
【０１３３】
スフェロイド浸潤アッセイにおけるｓｉＲＮＡの抑制効果の程度を調べた。神経膠腫スフェロイドを使用することの潜在的利点は、三次元培養で増殖した腫瘍細胞がインビボの腫瘍のものとより密接に類似した特性を示すことであると示されている。ｍｏｃｋおよび空のベクターでトランスフェクトしたスフェロイドは１日以内に正常な脳凝集物の２５％、２日以内で５０％が浸潤し、３日目までに、腫瘍スフェロイドの９５％が浸潤し、脳凝集物は組み合わされて単一の実体になった（図３２Ｃ）。対照的に、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡを発現するｐＣＭベクターでトランスフェクトした神経膠腫スフェロイドは、正常な脳凝集物から分離したままであった。
【０１３４】
本開示は、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９に対するｓｉＲＮＡ（ｐＣＭ）のＣＭＶプロモーター駆動発現が、ウエスタンブロッティングおよびゼラチンザイモグラフィーによって解析すると、ＳＮＢ１９神経膠腫細胞系において、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９発現をうまくサイレンシングし得ることを示す。結果から、ｐＣＭベクターで処置した神経膠腫細胞の浸潤能力が有意に阻害されることも示された。癌細胞は、遊走および浸潤するには近隣の細胞および細胞外マトリックス構成要素から分離しなければならない。マトリックスタンパク質分解は、接着部位の除去または結合部位の露出のいずれかによって細胞−マトリックス接着を直接調節し得、これが次に細胞遊走に影響し得る。カテプシンＢおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性阻害によって、スフェロイド遊走アッセイにおいて示されるように、ＳＮＢ１９神経膠腫細胞の遊走が有意にブロックされた。
【０１３５】
（実施例３０）
ＲＮＡｉは、ヌードマウスにおいて神経膠芽腫腫瘍の完全な退行を誘導する。
【０１３６】
ＭＭＰ−９およびカテプシンＢのｓｉＲＮＡが大脳内ＳＮＢ１９腫瘍の退行を阻害する能力を、ヌードマウスにおいて試験した。予め確立された神経膠腫増殖を有するマウスに、ＰＢＳ（ｍｏｃｋ）、空のベクター（ＥＶ）、ｐＣ、ｐＭおよびｐＣＭベクターを定位注射した。ｍｏｃｋおよびＥＶで処置したマウスの脳切片は、急速な腫瘍増殖を示したが、予め確立された腫瘍にミニ浸透圧ポンプを用いてｐＣＭベクターを注射したマウスは、５週間にわたって腫瘍増殖の完全な阻害を生じた（図３２Ａおよび３２Ｂ）。腫瘍サイズの定量化は、ｍｏｃｋまたは空のベクターと比較した、ｐＣＭベクター処置群における腫瘍の全体的退行を示した（図３３Ｃ）。ｐＣまたはｐＭベクター処置群で処置したマウスの脳切片は、対照群と比較して、約５０％の腫瘍退行を生じた。ベクターの腹腔内注射もまた、予め確立された大脳内腫瘍増殖の完全な退行を生じ、数ヵ月の長い期間にわたって腫瘍細胞を示さなかった（図３３Ｄ）。したがって、ＲＮＡｉは、このヌードマウスモデルにおいて、悪性神経膠腫腫瘍増殖を完全に根絶することができた。神経膠腫増殖の持続的抑制は、ｓｉＲＮＡ増幅のためであるかもしれない。カテプシンＢおよびＭＭＰ−９に対するｓｉＲＮＡは、神経膠腫増殖を、ＭＭＰ−９およびカテプシンＢのアンチセンスオリゴデオシヌクレオチドよりも、より効率的に抑制した。したがって、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９発現の両方の制御は、腫瘍進行の調節において、相当な重要性を有する。
【０１３７】
カテプシンＢおよびＭＭＰ−９のＲＮＡｉ媒介性阻害の抗癌効能が示された。哺乳動物細胞における、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび同じ標的に対するｓｉＲＮＡの抑制効果の比較から、ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値が、アンチセンスオリゴヌクレオチドのものよりも約１００倍低いことが明らかになった。ｓｉＲＮＡが配列特異的標的遺伝子をサイレンシングする能力、および遺伝子発現を阻害するのに必要なより低い濃度によって、ＲＮＡｉは遺伝子治療の強力な手段になる。
【０１３８】
（実施例３１）
環状プラスミドからのｓｉＲＮＡに対する減少した免疫原性応答
ｕＰＡおよびｕＰＡＲのヘアピンｓｉＲＮＡ分子を生成することのできるベクターを開発するために、哺乳動物発現プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３を用いた。図３４〜３５は、種々の形態のＵ６およびＣＭＶ駆動ＲＮＡｉコンストラクトの概略図を示す。ｕＰＡを（３４６〜３６７）およびｕＰＡＲ（７７〜８９）標的とする、９塩基のＧＣの欠乏した領域によって間隔が空けられた自己相補的逆方向反復配列を合成した。ｕＰＡのオリゴはＨｉｎｄＩＩＩ部位で終わり、ｕＰＡＲのオリゴはＢａｍＨＩで終わり、１００℃に５分間加熱することによって自己アニーリングし、６×ＳＳＣ中室温まで冷却し、それぞれの粘着制限酵素認識部位末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子の形成を生じた。これらのｄｓＤＮＡ分子を、ｐＣＤＮＡ３プラスミドベクターのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートし、ＣＭＶプロモーターの下流のｕＰＡおよびｕＰＡＲの逆方向反復を含み、ＢＧＨターミネーターによって終了するプラスミドの形成を生じた。得られたプラスミドはｐＵ２と名づけ、哺乳動物細胞にトランスフェクトすると、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方を標的とする二重のヘアピンｓｉＲＮＡ分子の生成を生じ、これはｄｓＲＮＡ認識酵素（ＤＩＣＥＲ）によってさらにプロセシングされて、ＲＮＡｉを誘導する個々のｓｉＲＮＡ分子を生成した。スクランブルベクターの構築において、ＧＦＰに相同性のある配列を用いた。完全なヘアピン構造を形成しない不完全な配列を用いて、スクランブルベクターを開発した。２つの自己相補的オリゴを合成およびアニーリングして、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するｄｓＤＮＡ分子を生じた。このｄｓＤＮＡ分子をｐＣＤＮＡ３プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位でライゲートさせた。得られたプラスミドをｐＳＶと呼んだ。得られたＣＭＶ駆動転写産物は、ヘアピン様構造を有さず、いかなる天然の遺伝子にも相同性を有さなかった。
【０１３９】
ｕＰＡおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡを発現する発現カセットを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのいずれかで駆動するΔＥ１領域で、Ａｄ５シャトルベクターにサブクローニングした。得られたプラスミドを、２９３個の複製許容性細胞にＡｄ５ゲノムプラスミド（ＰＪＭ１７等）でコトランスフェクトして、ｕＰＡおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡ発現カセットを含む、組換え複製欠損Ａｄ５ウイルス粒子を生じた（図３６）。ＧＦＰ ＲＮＡｉベクターを構築して、ＲＮＡｉを用いた標的化の特異性を決定した。ＧＦＰを発現する安定なＳＮＢ１９細胞を対照として用い、ＧＦＰに対するＲＮＡｉでトランスフェクトした。ＧＦＰ ＲＮＡｉでトランスフェクトした細胞はＧＦＰ発現を失った（図３７）が、ＲＴ−ＰＣＲ反応に見られるように、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現には変化がなかった（図４４）。
【０１４０】
Ｕ６（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ）またはＣＭＶ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）プロモーターのいずれかを有する環状プラスミドが細胞レベル免疫応答を誘導するかどうかを決定するために、Ｕ６またはＣＭＶプロモーターのいずれかを有する５つのコンストラクトを用いた。ＳＮＢ１９ヒト神経膠腫細胞を、Ｕ６またはＣＭＶプロモーターのいずれかを含む環状プラスミドでトランスフェクトし、以下のものを駆動した。空のベクター（ＥＶ）と呼ばれる、インサートなし、スクランブルベクター（ＳＶ）と呼ばれる、完全なヘアピン構造を形成しないＧＦＰ ＲＮＡｉインサート、ｕＰＡＲのＲＮＡｉヘアピンエクスプレッサー（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡのＲＮＡｉヘアピンエクスプレッサー（ｐｕＰＡ）、ならびにｕＰＡＲおよびｕＰＡの両方の二重のＲＮＡｉヘアピン発現（ｐＵ２）。ＲＴ−ＰＣＲを行って、ＯＡＳ１発現レベルを測定した。４８時間のトランスフェクション後にトランスフェクト細胞のそれぞれから全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを行って、全ＲＮＡ ５０ｎｇあたりのＯＡＳ１発現のレベルを測定した（ＲＴ−ＰＣＲは、製造業者の使用説明書（インビトロジェン）どおりに行った）。Ｕ６またはＣＭＶプロモーターのいずれかを含む環状プラスミドでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞において、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルまたはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに変化はなかった（図３８）。
【０１４１】
（実施例３２）
ＲＮＡｉの開始のためのプロモーターとしての、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＣＭＶ）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｕ６）の比較
ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの活性および効果を測定するために、ｐｃＤＮＡ３の場合のように、スクランブルベクター、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ−ｕＰＡの組み合わせのために、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミド（アンビオン、テキサス州オースティン）においてＲＮＡｉベクターを構築した。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒコンストラクトを、製造業者の使用説明書どおりに、テトラＴで終了させた。ＳＮＢ１９細胞を２組でトランスフェクトし、一方の組はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターＣＭＶを含み、第二の組はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６を含んだ（Ｃ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＵ２）。トランスフェクションの４８時間後、標準的なプロトコールどおりに細胞からタンパク質を抽出し、１２％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルにロードした（１０μｇ／レーン）。標準的なプロトコールどおりにウエスタンブロッティングおよびフィブリンザイモグラフィーを行い、ｕＰＡＲおよびｕＰＡに関してプローブし、ＧＡＰＤＨに関するプロービングによってローディング対照を測定した。図３９から、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターコンストラクトと比較して、標的分子のダウンレギュレーションにおいてＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターコンストラクトがより効率的であることが明らかであった。
【０１４２】
（実施例３３）
インターフェロン応答遺伝子ＯＡＳ１の決定
空のベクター（ＥＶ）、スクランブルベクター（ＳＶ）、ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）、ならびにｕＰＡＲおよびｕＰＡの２シストロン性コンストラクト（ｐＵ２）のプラスミドコンストラクトを用いて、ＳＮＢ１９ヒト神経膠腫細胞系におけるインターフェロン誘導のレベルを測定した。ＯＡＳ１遺伝子発現を、インターフェロン誘導の指標として用いた。環状プラスミド（Ｃ）、線状発現カセット（Ｌ）、およびＢＧＨポリＡシグナル配列欠失線状発現カセット（ΔＡ）を用いた。ＳＮＢ１９細胞を等しい量の上記のプラスミドまたは発現カセット（Ｃ、Ｌ、ΔＡ概略図）でトランスフェクトし、標準的なプロトコールを用いて、４８時間のトランスフェクションの後に全ＲＮＡを単離した。上記の試料に関してＲＴ−ＰＣＲを行い、アガロースゲル上でＯＡＳ１単位複製配列のレベルを測定した。ＯＡＳ１増幅に使用したプライマーは、
【０１４３】
【化４１】

および
【０１４４】
【化４２】

であった。上記のプラスミド（ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＵ２）由来の発現カセットを増幅するのに使用したプライマーは、フォワードプライマー
【０１４５】
【化４３】

およびリバースプライマー
【０１４６】
【化４４】

であった（図４０）。
【０１４７】
ＯＡＳ１（２’５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ）ｍＲＮＡ誘導のＲＴ−ＰＣＲを行って、ポリＡシグナル配列の関連性を決定した。環状、線状（発現カセット単独）、およびポリＡシグナル配列を欠失した発現カセットを用いた（それぞれＣ、ＬおよびΔＡ）。ＥＶおよびＳＶの場合、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡの誘導は検出されなかった（図４１）。ＥＶの場合、図に見られるように、ポリＡ尾部ありまたはなしで、転写産物の全体の長さは１ｋｂよりも大きいとは期待されず、転写産物の予想される構造は、免疫応答を誘導する有意なｄｓＲＮＡ構造を有さなかった（ＳＶも同様）（図４４）。対照的に、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡおよびｐＵ２では、予想される二次構造はｄｓＲＮＡ構造を有したが、ポリＡ尾部ありでは、依然として免疫応答の誘導は検出されなかった（ＯＡＳ１発現）。ポリＡシグナル配列が存在するがトランスフェクトコンストラクトが線状である発現カセット単独の場合、これは免疫応答を誘導した。このことから、環状分子の存在が実行可能なポリＡ尾部を生成したことが示された。また、線状コンストラクトはポリＡシグナル配列の直後で終了したので、生存能のあるポリＡ尾部の開始は始められなかったか、または不完全だった。ポリＡシグナル配列が欠失した線状コンストラクトの場合、免疫応答が開始し、免疫応答の予防および転写ＲＮＡ分子の安定性にポリＡ尾部の存在が必要であり得ることが示された（図４１〜４２）。
【０１４８】
２シストロン性コンストラクトからの予想されるｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに類似性を有さず、ｕＰＡＲおよびｕＰＡ配列の両方の、完璧なヘアピンループ構造を有した。２４塩基の部分的ｄｓＲＮＡを形成する４８塩基の配列を、ｕＰＡＲとｕＰＡ配列との間に導入し、両方のｓｉＲＮＡ分子の効率的な転写を可能にした。２シストロン性配列は、ＢＧＨポリ−ΔＡシグナル配列によってコードされるポリＡ配列で終わった（図４３）。
【０１４９】
典型的な抗ウイルス応答遺伝子であるＯＡＳ１遺伝子のＲＴ−ＰＣＲから、トランスフェクトした対照細胞およびＥＶ／ＳＶのように、免疫応答がなかったことが示された。アンチセンスおよびＲＮＡｉトランスフェクト細胞におけるｕＰＡおよびｕＰＡＲ転写産物にもＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲによって測定すると、アンチセンストランスフェクト細胞ではｕＰＡＲまたはｕＰＡ ｍＲＮＡ転写産物の変化は見られなかったが、ＲＮＡｉトランスフェクト細胞ではｕＰＡＲまたはｕＰＡのｍＲＮＡレベルが減少し、それぞれのｍＲＮＡの破壊が示された（２４時間）。ＲＮＡｉの機構は、標的ｍＲＮＡ分子の破壊を伴う。ＯＡＳ１発現は、対照群（ｐＧＦＰ、ｐＥＶおよびｐＳＶ）と同様であり、細胞レベルの免疫応答がないことが示された（図４４）。
【０１５０】
（実施例３４）
ＲＮＡｉ発現ベクターのインサイチュー局在化
ヌクレアーゼを含まない条件下で、標準的なプロトコールどおりに、パラフィン包埋切片を脱パラフィンおよび再水和した。これらの切片をプロテイナーゼＫで処理して、タンパク質に結合しているＤＮＡを明らかにした。標準的なプロトコールどおりにＤＮＡを変性した。ｐｃＤＮＡ３プラスミドを採取し、ＣＭＶプロモーターを含む発現カセット（ＮｒｕＩ ＨｉｎｄＩＩＩ消化）を熱安定性アルカリホスファターゼ（アマシャム・バイオサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で標識し、処置切片にハイブリダイズした。製造業者の使用説明書どおりに、ハイブリダイゼーションを行った。ｍｏｃｋ注射マウスは、アルカリホスファターゼのいかなる活性も示さなかったが、ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡまたはｐＵ２の腹腔内注射で処置したマウスはアルカリホスファターゼの活性を示し、ＣＭＶプロモーターの存在が示された。アルカリホスファターゼの活性は、ほとんどの場合、血管の周辺に局在し、脈管構造の四方に広がるパターンを示し、ＣＭＶを有するプラスミドベクターが血液脳関門を横切ったことを示した（図４５）。
【０１５１】
（実施例３５）
ｕＰＡＲ−カテプシンＢ環状プラスミドのインターフェロン応答遺伝子ＯＡＳ１の決定
空のベクター（ＥＶ）、スクランブルベクター（ＳＶ）、ｕＰＡＲ（ｐＵ）、カテプシンＢ（ｐＣ）、ならびにｕＰＡＲおよびカテプシンＢの２シストロン性コンストラクト（ｐＣＵ）のプラスミドコンストラクトを用いて、ＳＮＢ１９ヒト神経膠腫細胞系におけるインターフェロン誘導のレベルを測定した。ＯＡＳ１遺伝子発現を、インターフェロン誘導の指標として用いた。環状プラスミド（Ｃ）、線状発現カセット（Ｌ）、およびＢＧＨポリＡシグナル配列欠失発現カセット（−Ａ）を用いた。等しい量の上記のプラスミドまたは発現カセットでＳＮＢ１９細胞をトランスフェクトし、４８時間のトランスフェクションの後に、標準的なプロトコールを用いて全ＲＮＡを単離した。上記の試料に関してＲＴ ＰＣＲを行い、アガロースゲルでＯＡＳ１単位複製配列のレベルを測定した。ＯＡＳ１増幅に使用したプライマーは、
【０１５２】
【化４５】

および
【０１５３】
【化４６】

であった。上記のプラスミド（ＥＶ、ＳＶ、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵ）由来の発現カセットを増幅するのに用いたプライマーは、フォワードプライマー
【０１５４】
【化４７】

およびリバースプライマー
【０１５５】
【化４８】

であった。
【０１５６】
ＯＡＳ１（２’５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ）ｍＲＮＡ誘導のＲＴ−ＰＣＲを行って、ポリＡシグナル配列の関連性を決定した。環状、線状（発現カセット単独）、およびポリＡシグナル配列を欠失した発現カセットを用いた（それぞれＣ、Ｌ、および−Ａ）。ＥＶおよびＳＶの場合、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡの過剰な誘導は検出されなかった。ＥＶの場合、図に見られるように、ポリＡ尾部ありまたはなしで、転写産物の全体の長さは１ｋｂよりも大きいとは期待されず、転写産物の予想される構造は、免疫応答を誘導する有意なｄｓＲＮＡ構造を有さなかった（ＳＶも同様）。対照的に、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵでは、予想される二次構造はｄｓＲＮＡ構造を有したが、ポリＡ尾部ありでは、依然として免疫応答の誘導は検出されなかった（ＯＡＳ１発現）。ポリＡシグナル配列が存在するがトランスフェクトコンストラクトが線状である発現カセット単独の場合、これは免疫応答を誘導した。このことから、環状分子の存在が実行可能なポリＡ尾部を生成したことが示された。また、線状コンストラクトはポリＡシグナル配列の直後で終了したので、実行可能なポリＡ尾部の開始は始められなかったか、または不完全であった。ポリＡシグナル配列が欠失した線状コンストラクトの場合、免疫応答が開始し、免疫応答の予防および転写されたＲＮＡ分子の安定性にポリＡ尾部の存在が必要であり得ることが示された。
【０１５７】
ＥＶ、ＳＶ、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵで処置した大脳内異種移植腫瘍において、ＯＡＳ１の誘導を調べた。インターフェロンα（３μｇ／マウス）で大脳内処置した正常なマウスが含まれ、５時間後に屠殺した。正常な対照組織として脾臓および肝臓を用いて、ＯＡＳ１発現の存在が通常の条件下で存在する場合の抗体の特異性を実証した。免疫組織化学に加えて、センス
【０１５８】
【化４９】

オリゴを用いてこれらの組織においてインサイチューハイブリダイゼーションを行い、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを測定した。大脳内腫瘍を有するマウス脳またはｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵで処置したマウスの脳では、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の極めて少ない発現のみ。注目すべきことに、ｐＣＵ処置群ではＯＡＳ１の誘導がなかった。
【０１５９】
材料および方法
低分子ヘアピンＲＮＡ発現プラスミドの構築
ｕＰＡ−ｕＰＡＲ：３４６〜３６７塩基のｕＰＡ
【０１６０】
【化５０】

および７７〜９８塩基のｕＰＡＲ
【０１６１】
【化５１】

に特異的な低分子干渉オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングした。アニーリングしたＤＮＡオリゴヌクレオチドの対を、ｕＰＡに特異的なものをＨｉｎｄＩＩＩ部位で、およびｕＰＡＲに特異的なものをＢａｍＨＩ部位で、ｐｃＤＮＡ３ベクターに段階的に挿入することによって、ヒトＣＭＶプロモーター制御下でｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方のｓｈＲＮＡを発現するｕＰＡ−ｕＰＡＲ ＲＮＡｉプラスミドベクターを構築した（ｓｈ−ｕＰＡｕＰＡＲ）。また、ｕＰＡ（ｓｈ−ｕＰＡ）およびｕＰＡＲ（ｓｈ−ｕＰＡＲ）のｓｈＲＮＡ発現ベクターを、別々に構築した。完全なヘアピン構造を形成しない、不完全な配列を有するｐｃＤＮＡ３スクランブルベクターを用いて、対照として用いるためのスクランブルベクターを開発した。空のベクター（ＥＶ）およびスクランブルベクター（ＳＶ）対照を複数の細胞系において試験したが、トランスフェクション後のＭＴＴアッセイで示されるように、細胞に対するいかなる毒性も示さず、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨおよびy−アクチンの発現に対する効果を有さなかった。
【０１６２】
ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流でｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の両方のｓｉＲＮＡを発現するベクターの構築のために、ｐｃＤＮＡ３を用いた（概略１）。＋７７〜＋９８のｕＰＡＲ配列を標的配列として用い、便宜上、自己相補的オリゴを用いた。９塩基のループ領域およびＢａｍＨＩ部位を有する長さ２１塩基のｕＰＡＲ配列を、末端に組み込んだ
【０１６３】
【化５２】

。標準的なプロトコールを用いて６×ＳＳＣ中でオリゴを自己アニーリングさせ、ｐｃＤＮＡ３ベクタープラスミド中のＢａｍＨＩ部位にライゲートした。同様に、末端にＥｃｏＲＩ部位が組み込まれた＋３６０〜＋３８１のＭＭＰ−９相補配列
【０１６４】
【化５３】

を、ｕＰＡＲのｓｉＲＮＡ配列を含むベクターのＥｃｏＲＩ部位にライゲートした。これは、最終的に、３５ｂｐの分離を有する、ｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ発現プラスミドを生じた。オリゴは自己相補的で左右対称性を有するので、いずれのインサートの配向も重要ではなかった。ＳＶ４０ターミネーターを、ＲＮＡ合成の停止シグナルとした。
【０１６５】
カテプシンＢおよびｕＰＡ：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流でカテプシンＢおよびｕＰＡＲの両方のｓｉＲＮＡを発現するベクターの構築のために、ｐｃＤＮＡ３を用いた（図１７）。＋７７〜＋９８のｕＰＡＲ配列を標的配列として用い、便宜上、自己相補的オリゴを用いた。９塩基のループ領域を有し、ＢａｍＨＩ部位が末端に組み込まれた長さ２１塩基のｕＰＡＲ配列
【０１６６】
【化５４】

を用いた。標準的なプロトコールを用いて６×ＳＳＣ中でオリゴを自己アニーリングさせ、ｐｃＤＮＡ−３ベクタープラスミド中のＢａｍＨＩ部位にライゲートした。同様に、末端にＸｈｏＩ部位が組み込まれた＋７３２〜＋７５３のカテプシンＢ相補配列
【０１６７】
【化５５】

を、ｕＰＡＲのｓｉＲＮＡ配列を含むベクターのＸｈｏＩ部位にライゲートした。これは、最終的に、ｐＣＵと呼ばれる、カテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡ発現プラスミドを生じた。ｕＰＡＲ（ｐＵ）およびカテプシンＢ（ｐＣ）の単一のｓｉＲＮＡ発現ベクターもまた構築した。オリゴは自己相補的で左右対称性を有したので、単一または２シストロン中のいずれのインサートの配向も重要ではなかった。ＢＧＨポリＡターミネーターを、３つ全てのコンストラクトのＲＮＡ合成の停止シグナルとした。
【０１６８】
ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流でｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９の両方のｓｉＲＮＡを発現するベクターの構築のために、ｐｃＤＮＡ３を用いた。＋７７〜＋９８のｕＰＡＲ配列を標的配列として用い、便宜上、自己相補的オリゴを用いた。９塩基のループ領域を有し、ＢａｍＨＩ部位が末端に組み込まれた長さ２１塩基のｕＰＡＲ配列
【０１６９】
【化５６】

を用いた。標準的なプロトコールを用いて６×ＳＳＣ中でオリゴを自己アニーリングさせ、ｐｃＤＮＡ３ベクタープラスミド中のＢａｍＨＩ部位にライゲートした。同様に、末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位が組み込まれた＋３４６〜＋３６７のｕＰＡ相補配列
【０１７０】
【化５７】

をＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートし、＋３６０〜＋３８１のＭＭＰ−９
【０１７１】
【化５８】

を、ｕＰＡＲおよびｕＰＡのｓｉＲＮＡ配列を含むベクターのＥｃｏＲＩ部位にライゲートした。これは、最終的に、ｐＵ_２Ｍと呼ばれる、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡ発現プラスミドを生じた。ｕＰＡＲ（ｐｕＰＡＲ）、ｕＰＡ（ｐｕＰＡ）およびＭＭＰ−９（ｐＭＭＰ−９）の単一のｓｉＲＮＡ発現ベクターもまた構築した。オリゴは自己相補的で左右対称性を有したので、単一または３シストロン性コンストラクト中のいずれのインサートの配向も要因ではなかった。ＢＧＨポリＡターミネーターを、４つ全てのコンストラクトのＲＮＡ合成の停止シグナルとした。
【０１７２】
カテプシンＢおよびＭＭＰ−９：カテプシンＢ（７３２〜７５３）およびＭＭＰ−９（３６０〜３８１）を標的とする、ＧＣの欠乏した９塩基の領域によって間隔を空けられた自己相補的逆方向反復配列を合成した。カテプシンＢのオリゴはＸｈｏＩ部位で終わり、ＭＭＰ−９のオリゴはＥｃｏＲＩで終わり、５分間１００℃に加熱することによって自己アニーリングさせ、６×ＳＳＣ中で室温まで冷却して、それぞれの粘着制限酵素認識部位末端を有する、二本鎖ＤＮＡ分子の形成を生じた。これらのｄｓＤＮＡ分子をｐＣＤＮＡプラスミドベクターのＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にライゲートして、ＣＭＶプロモーターの下流にカテプシンＢおよびＭＭＰ−９の逆方向反復を含み、ＳＶ４０ターミネーターによって終了するプラスミドの構築を生じた。哺乳動物細胞にトランスフェクトした、ｐＣＭと呼ばれる得られたプラスミドは、カテプシンＢおよびＭＭＰ−９の両方を標的とする二重ヘアピンｓｉＲＮＡ分子の生成を生じ、これはｄｓＲＮＡ認識酵素（ＤＩＣＥＲ）によってさらにプロセシングされて、ＲＮＡｉを誘導する個々のｓｉＲＮＡ分子を生成する（概略１）。
【０１７３】
細胞培養およびトランスフェクション条件：
前立腺癌細胞：ヒト前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナッサス）から得た。ＬＮＣａＰ細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ培地（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）中で増殖させた。ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞を最小必須培地中で増殖させた。両方の培地は、１０％ウシ血清アルブミン（ギブコＢＲＬ、テキサス州ルイスビル）および５％ペニシリン／ストレプトマイシンを含み、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で、３７^０Ｃのインキュベーター中で維持した。製造業者の使用説明書どおりにリポフェクタミン（商標）２０００試薬（ライフ・テクノロジー、メリーランド州ロックビル）を用いて、トランスフェクションを行った。７２時間のトランスフェクションの後、細胞増殖アッセイ、免疫ブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、マトリゲル浸潤アッセイ、ＤＮＡ断片化アッセイ、ＥＭＳＡアッセイおよびカスパーゼ活性アッセイに細胞を用いた。ＤＡＰＩおよび二重免疫染色のために、Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライド（ナルジェ・ヌンク・インターナショナル、イリノイ州ネーパービル）中でトランスフェクションを行った。
【０１７４】
神経膠芽腫細胞：ヒト神経膠芽腫細胞系ＳＮＢ１９を、１０％ＦＣＳ、１００−μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００−単位／ｍｌペニシリン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）を補充したＤＭＥＭ Ｆ−１２（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリ州セントルイス）中、３７℃、加湿した５％ＣＯ_２雰囲気下で維持した。製造業者の使用説明書どおりにリポフェクタミン試薬（インビトロジェン、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて、ｓｉＲＮＡを発現するｐＣ ｐＵまたはｐＣＵプラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、血清を含まない培地中で４８時間細胞をインキュベートした。
【０１７５】
フィブリンザイモグラフィー：電気泳動で分離された形態のｕＰＡの酵素活性および分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３の馴化培地中で測定した。簡潔に述べると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、重合前に、精製されたプラスミノゲンおよびフィブリノーゲンが基質である、アクリルアミドを含有する。重合後、試料中の等しい量のタンパク質を電気泳動し、ゲルを洗浄および染色した。ＥＶ／ＳＶ ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２ＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞もまた、本明細書中に記載されるように行った。
【０１７６】
ゼラチンザイモグラフィー：ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした細胞から、馴化培地を回収し、遠心分離して細胞残屑を除去した。ゼラチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを用いて、得られた試料の２０μｇを、ゼラチナーゼ活性に関してアッセイした。アミドブラック（シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）でゲルを染色し、ゲル中の明確なバンドの面積として、ゼラチナーゼ活性を可視化した。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２ＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞もまた、本明細書中に記載されるように行った。
【０１７７】
逆転写−ＰＣＲ解析：
ｕＰＡ−ｕＰＡＲ：キアジェンＲＮｅａｓｙキットを用いて細胞ＲＮＡを単離し、１ｇのＲＮＡをＤＮａｓｅ処理（１０単位／ＲＮＡ １ｇ、１時間）し、逆転写反応（ＲＴ、２０ｌ）の鋳型として用いた。ＲＴ反応ミックス（インビトロジェン）は、１ｌ（１０ｐｍ）のプライマーを含んだ。次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ反応において用いて、ゲル電気泳動によって解析した。以下のプライマーを用いた。
ｕＰＡ−センス：
【０１７８】
【化５９】

ｕＰＡ−アンチセンス：
【０１７９】
【化６０】

ｕＰＡＲ−センス：
【０１８０】
【化６１】

ｕＰＡＲ−アンチセンス：
【０１８１】
【化６２】

ＧＡＰＤＨ−センス：
【０１８２】
【化６３】

ＧＡＰＤＨ−アンチセンス：
【０１８３】
【化６４】

【０１８４】
【表１】

本明細書中に記載されるように、対照／ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【０１８５】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった。９５℃で５分間、その後９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を３５サイクル。最後の伸長は７２℃で５分間であった。アニーリング温度は、種々のコンストラクトの配列に依存して変化し、標準的な手順に従って行った。
【０１８６】
ＰＣ３免疫蛍光検出：種々のｓｈＲＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＰＣ３細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ｕＰＡ（１：５００、バイオメダ、カリフォルニア州フォスターシティ）および／または抗ｕＰＡＲ（１：５００、アメリカン・ダイアグノスティクス・インク、コネチカット州グリニッジ）とともにインキュベートした。洗浄後、蛍光二次抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルス）を１：５００希釈で加えた。再度細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色した。顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルヴィル）に接続された電荷結合素子ＲＴスライダースポットカメラ（ダイアグノスティック・インストゥルメンツ・インク、ミシガン州バローズ・スターリング・ハイツ）を用いて、蛍光像を得、スポットＲＴソフトウエアバージョン３．５（ダイアグノスティック・インストゥルメンツ・インク、ミシガン州バローズ・スターリング・ハイツ）を備えたコンピュータによって管理した。
【０１８７】
ＰＣ３細胞マトリゲル浸潤アッセイ：トランスフェクション後、細胞を分離し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。５×１０^５個の細胞を、マトリゲル（０．７ｍｇ／ｍｌ）（コラボラティブ・リサーチ・インク、マサチューセッツ州ボストン）でコートしたトランスウェルインサート（１２μＭ孔）の上の方のチャンバーに播種した。下の方のチャンバーに４００ｌのＲＰＭＩ培地を充填した。２４時間のインキュベーション期間の後、上の方のチャンバーの遊走しなかった細胞を穏やかにこすり落とし、インサートの下面に存在する接着細胞をＨｅｍａ−３で染色し、写真を撮った。
【０１８８】
製造業者の使用説明書どおりにインサイチューカスパーゼ活性アッセイ：ポリカスパーゼ検出キット（イムノケミストリー・テクノロジース、イリノイ州ブルーミントン）を用いて、カスパーゼ活性を検出した。このアッセイにおいて、細胞透過性で非細胞障害性の、カスパーゼの蛍光色素インヒビター（ＦＬＩＣＡ）が活性のあるカスパーゼヘテロ二量体の大きいサブユニット上の反応性システイン残基に共有結合し、それによってさらなる酵素活性を阻害する。このキットは、ほとんどのカスパーゼの検出のための一般的なプローブであって、緑色蛍光を発光する、多くのカスパーゼ（カスパーゼ１、−３、−４、−５、−６、−７、−８および−９、ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）のカルボキシフルオレセイン標識フルオロメチルケトンペプチド阻害因子を使用する。緑色蛍光シグナルは、試薬を加えた時点での細胞中の活性のあるカスパーゼの量の直接の尺度である。７２時間のトランスフェクションの後、細胞をＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ色素（インサイチューマーカー）で染色することによって、カスパーゼ活性を検出した。結合したマーカーを、共焦点顕微鏡で観察される蛍光検出によって局在化した。核染色にＤＡＰＩを用いた。
【０１８９】
ＤＮＡ標識アッセイ：トランスフェクションの後、細胞を採取し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞ペレットを、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（インビトロジェン）を含有する溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に再懸濁し、次いで３７℃で２時間インキュベートした。遠心分離によって溶解物からＤＮＡを取り除き、次いで等しい量のフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、−８０℃で２時間無水エタノールおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えることによって沈殿させた。ＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、３７℃で１時間ＲＮａｓｅＡで処理し、次いで、エチジウムブロマイド（０．５ｇ／ｍｌ）で染色した１．５％アガロースゲルで分離させた。
【０１９０】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：トランスフェクションの後、製造業者の使用説明書どおりにタンパク質抽出キット（アンビオン、テキサス州オースティン）を用いて、核タンパク質を抽出した。ビシンコニン酸手順（ピアス・バイオケミカル・カンパニー、イリノイ州ロックフォード）を用いて、希釈した試料で核タンパク質の濃度を測定した。パノミクス（カリフォルニア州レッドウッドシティ）の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）キットを用いて、タンパク質抽出物中のＳｔａｔ３とＤＮＡプローブとの間の相互作用を調査した。
【０１９１】
ＤＮＡ断片末端標識アッセイ：ｓｈＲＮＡ処置または対照前立腺腫瘍組織切片（厚さ５Ｍ）を脱パラフィンおよび再水和した。次に、標本全体をプロテイナーゼＫ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中２０ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、ｐＨ８）で覆うことによって、組織切片を透過化し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、組織切片をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（１×ＴＢＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。組織切片を、メタノール中に希釈した３％過酸化水素に室温で５分間浸漬することによって、内在性ペルオキシダーゼの不活性化を達成した。次いでスライドガラスをクレノウ平衡バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に３０分間入れた。次いで、製造業者の使用説明書（クレノウ−ＦｒａｇＥＬ
ＤＮＡ断片化検出キット、オンコジーン・リサーチ・プロダクツ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に従って、３７℃で９０分間、加湿チャンバー中で、組織切片を、クレノウでのＤＮＡ断片末端標識に最適な比で標識および非標識デオキシヌクレオチドの混合物を含有する６０ｌの溶液とともにインキュベートした。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８）との室温で５分間のインキュベーションによって、酵素反応を停止した。次いでスライドをＴＢＳで洗浄し、ブロッキングバッファーに１０分間浸漬し（ＰＢＳ中４％のＢＳＡ）、その後ペルオキシダーゼストレプトアビジンを含有する１００ｌの溶液とともに３０分間、加湿チャンバー中室温でインキュベートした。次いで、組織切片をＴＢＳ中で洗浄し、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、０．７ｍｇ／ｍｌ）、過酸化水素および尿素（０．６ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液で覆った。次に、スライドを蒸留水で洗浄し、メチルグリーン（０．３％）で３０秒間対比染色し、オリンパス蛍光顕微鏡下で調べた。スポットＲＴソフトウエアバージョン３．５（ダイアグノスティック・インストゥルメンツ、ミシガン州）を用いて、陽性のＤＮＡ断片末端標識染色を、６つの無作為に捕捉した像／試料から点数付けした。
【０１９２】
同所マウス前立腺処置モデル：無胸腺症雄ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、６〜８週齢）を、ハーラン・スプラグ−ドーレイ（インディアナ州インディアナポリス）から得た。動物取り扱いおよび実験手順は、イリノイ医科大学動物実験委員会によって承認された。これまでに記載されているように、同所移植を行った。簡潔に述べると、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）での全身麻酔の後、下腹部で下正中切開を行った。３０μｌのＰＢＳ中のＰＣ３細胞の懸濁液（１×１０^６）を前立腺の側葉に注射し、外科用金属クリップで傷を閉じた。この細胞濃度は、７日間の移植の間に一貫した局所的腫瘍増殖を達成するのに必要であった。マウスを、１つの処置群あたり６匹のマウスの、５つの処置群に分割した。移植後７および１４日目に、下正中切開を行い、腫瘍に、ｓｈ−ｕＰＡ、ｓｈ−ｕＰＡＲ、ｓｈ−ｕＰＡ−ｕＰＡＲまたはＥＶ／ＳＶ対照（それぞれ７５μｇ／１５０μｇ）を発現するプラスミドコンストラクトを注射した。別の組の実験において、７および１４日目に、同所に移植したマウスに、ｓｈ−ｕＰＡおよびｓｈ−ｕＰＡＲプラスミドを腫瘍内に同時注射した（それぞれ１５０μｇ）。最後のｓｈＲＮＡプラスミド注射の１４〜１５日後にマウスを屠殺し、目視検査によって原発腫瘍増殖および転移の部位を決定し、写真を撮った。次いで原発腫瘍を切除し、測定および計量した。Ｈ＆Ｅ染色のために、ホルマリン中で標本を固定し、パラフィンに包埋した。また、組織の一部を免疫ブロットのために直ちに瞬間凍結した。
【０１９３】
ウエスタンブロッティング。ＳＮＢ１９細胞をｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵまたはｐＣＵでトランスフェクトし、４８時間インキュベートした。インキュベートの終わりに、細胞を採取し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害因子を含有するバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、ＰＨ７．４）中で溶解した。上清または細胞由来の等しい量のタンパク質（３０μｇ／レーン）を非還元性条件下、１０％アクリルアミドゲルで電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜（バイオ−ラッド）に移した。非特異的結合をブロックするために、５％無脂肪スキムミルクを含む、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ［Ｔ−ＰＢＳ］中で膜を２時間インキュベートした。その後、それぞれ、Ｔ−ＰＢＳ＋５％無脂肪乳中のカテプシンＢ、ｕＰＡＲ、ＥＲＫ、ｐＥＲＫ、ＦＡＫまたはｐＦＡＫに対する抗体とともに、膜を２時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳ中での洗浄の後、製造業者の使用説明書どおりにペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を有するＥＣＬ（商標）検出キット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、英国アマシャム）を用いて、膜上のタンパク質を可視化した。ローディング対照のために、膜を細長い形に切り、標準的なプロトコールどおりに、β−アクチンに対するモノクローナル抗体でプローブした。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２ＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の免疫ブロット解析もまた、本明細書中に記載されるように行った。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ免疫ブロット解析に、以下の抗体を用いた。抗ｕＰＡ（バイオメダ、カリフォルニア州フォスターシティ）、抗ｕＰＡＲ（アメリカン・ダイアグノスティクス・インク、コネチカット州グリニッジ）、抗Ｂａｘ（サンタクルス・バイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルス）、抗Ｂｃｌ−Ｘ_Ｓ／Ｌ（サンタクルス・バイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルス）、抗カスパーゼ９（セル・シグナリング・テクノロジー・インク、マサチューセッツ州ベヴァリー）、および抗ＧＡＰＤＨ（アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ）。全体的およびリン酸形態のＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８およびＳｔａｔ３に対する抗体を、サンタクルス・バイオテクノロジー（カリフォルニア州サンタクルス）から得た。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２ＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞のウエスタンブロッティングもまた、本明細書中に記載されるように行った。
【０１９４】
免疫組織化学的解析。ＳＮＢ１９細胞（１×１０^４）を、ビトロネクチンコートした８ウェルチャンバースライドに播種し、２４時間インキュベートし、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトした。さらに７２時間後、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミンとともに室温で１時間、ブロッキングのためにインキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄した後、ＩｇＧ抗ｕＰＡＲ（ウサギ）またはＩｇＧ抗ＭＭＰ−９（マウス）のいずれかを、１：２００の濃度で加えた。スライドを４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄して、過剰な一次抗体を除去した。次いで細胞を抗マウスＦＩＴＣ複合体または抗ＦＩＴＣ複合体ＩｇＧ（１：５００希釈）とともに、室温で１時間インキュベートした。次いで、スライドを３回洗浄し、ガラスカバースリップで覆い、蛍光顕微鏡写真を得た。合成合併像を得て、対照／ＥＶ、ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭトランスフェクト細胞におけるｕＰＡＲおよびＭＭＰ−９の発現を可視化した。
【０１９５】
ＳＮＢ１９細胞増殖アッセイ。ＭＴＳアッセイによって細胞増殖を評価した。インビトロでのＳＮＢ１９細胞の増殖に対するこれらのコンストラクトの効果を検出するために、セルタイター（商標）比色アッセイを用いて、生存能のある細胞質量を測定した。５×１０^３個の神経膠芽腫細胞を三連で９６または２４ウェルプレートに播種し、２４時間増殖させた後、培地のみ（ｍｏｃｋ）、ＥＶ、ＳＶ、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵベクターで４８時間トランスフェクトした。次いで、これらの細胞、血清含有培地に換え、種々の時間間隔を割り当てた。各時点の前に、ＭＴＳ試薬を加えて、さらに２時間インキュベーションを継続して発色させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、各ウェルでＡ４９０を測定した。短期間対長期間の細胞培養の吸光度読み取りを比較し、これらのコンストラクトの効果を、対応する未処置／処置群の増殖に関して解釈した。ｓｉＲＮＡコンストラクトによる増殖のパーセント阻害を、これらのコンストラクトを除いた同じ培地中での同じ細胞の増殖速度に関して計算した。
【０１９６】
ＰＣ３細胞増殖アッセイ：トランスフェクションの７２時間後の細胞の生存能を、ＭＴＴアッセイを用いて評価した。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］（シグマ）を、５００ｇ／ｍｌの濃度で各ウェル中の培地に加え、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。酸−イソプロパノール（０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノール）を全てのウェルに直ちに加え、暗青色の結晶が効果的に溶解するように、勢いよく混合した。５７０ｎｍで吸光度を測定した（ベンチマーク、バイオラッド、カリフォルニア州ハーキュリーズ）。
【０１９７】
ＳＮＢ１９インビトロ新脈管形成アッセイ。ＳＮＢ１９細胞（２×１０^４）を８ウェルチャンバースライドに播種し、標準的なプロトコールどおりに、ｍｏｃｋ、ＥＶ、ｐＵ、ｐＣおよびｐＣＵでトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション期間の後、培地を除去し、４×１０^４個のヒト皮膚内皮細胞を播種し、７２時間共培養させた。３．７％ホルムアルデヒド中での固定の後、第ＶＩＩＩ因子抗原に関して内皮細胞を免疫プローブした。第ＶＩＩＩ因子抗体は、ＤＡＫＯコーポレーション（カリフォルニア州カーピンテリア）から購入した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ複合二次抗体とともに１時間インキュベートし、次いで洗浄し、蛍光顕微鏡下で調べた。ＳＮＢ１９ ｍｏｃｋ、ＥＶ、ｐＵ、ｐＣまたはｐＣＵトランスフェクト細胞からの馴化培地存在下で増殖した内皮細胞の同様のスライドをＨ＆Ｅで染色して、ネットワーク形成を可視化した。新脈管形成の定量化にイメージプロソフトウエアを使用し、以下の方法によって新脈管形成の程度を測定した。分枝点の数および点あたりの分枝の総数を無作為に数え（１０視野あたり）、新脈管形成の程度を示す生成物を対照と比較した。８ウェルチャンバースライドに播種してｍｏｃｋ／ＥＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞（２×１０^４）のインビトロ新脈管形成アッセイを、本明細書中に記載されるように行った。８ウェルチャンバースライドに播種し、２４時間インキュベートし、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２ＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞（１×１０^４ウェル^−１）の新脈管形成アッセイを、本明細書中に記載されるように行った。
【０１９８】
背側皮下脂肪チャンバーモデル：無胸腺症ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、１８匹の雄／雌、２８〜３２ｇ）を、特定の病原体、微生物を含まない環境内で飼育および維持した。背側皮下脂肪チャンバーモデルの移植技術。無菌の小動物外科技術は以下の通りであった。マウスをケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）ザイラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。一旦動物を完全に麻酔すると、１０ｍｌの空気を注射することによって、マウスに背側空気嚢を作製した。密閉剤で「Ｏ」リング（フィッシャー）の縁の両側に０．４５ミクロンのミリポア膜（フィッシャー）を一直線に並べることによって、拡散チャンバー（フィッシャー）を用意した。一旦チャンバーを乾燥させる（２〜３分）、２０分間のＵＶ照射によってそれらを滅菌した。２０μｌのＰＢＳを用いて、膜を濡らした。１００〜１５０μｌの無菌ＰＢＳに懸濁した２×１０^６個のＳＮＢ１９細胞（ｍｏｃｋ、空のベクターまたはｐＣＵトランスフェクト）を、「Ｏ」リングの開口部を通してチャンバーに注射した。少量の骨ろうで開口部を密閉した。背側空気嚢の縁に沿って水平に１^１／_２〜２ｃｍの表面切除を行い、空気嚢を開いた。鉗子の助けを借りて、チャンバーを皮膚の下に入れ、注意深く縫合した。１０日後に動物をケタミン／キシラジンで麻酔し、生理食塩水（１０ｍｌ）と、ついで１０ｍｌの１０％ホルマリン／０．１Ｍリン酸溶液およびそれに続くＰＢＳ中０．００１％ＦＩＴＣ溶液の心臓内還流によって屠殺した。動物の、移植したチャンバーの周りの皮を注意深くはぎ、移植したチャンバーを皮下空気筋膜から除去した。可視光下で、およびＦＩＴＣ蛍光に関して、チャンバーを覆っている皮下脂肪の写真を撮った。空気嚢筋膜の領域のチャンバー中の血管の数を計数し、それらの長さを測定した。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞もまた、本明細書中に記載されるように、背側皮下脂肪チャンバーモデルに使用した。
【０１９９】
ＳＮＢ１９細胞遊走アッセイ：ＳＮＢ１９細胞のＧＦＰ発現バリアントの、ダルベッコ改変イーグル培地中の２×１０^６個の細胞の懸濁液を、超低接着１００ｍｍ組織培養プレート上に播種し、スフェロイド凝集物が形成されるまで培養した。直径が約１５０μｍのスフェロイド（約４×１０^４個の細胞／スフェロイド）を選択し、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵでトランスフェクトして、４８時間培養した。トランスフェクションの７２時間後、単一の神経膠腫スフェロイドを、ビトロネクチンコートされた（５０μｇ／ｍＬ）９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに入れ、２００μｌの、血清を含まない培地とともに培養した。スフェロイドを３７℃で２４時間インキュベートし、その後スフェロイドを固定し、Ｈｅｍａ−３で染色し、写真を撮った。ステージおよび接眼マイクロメータで較正した顕微鏡を用いて、スフェロイドから単層への細胞の遊走を測定し、細胞遊走の指数とした。神経膠芽腫細胞を三連で９６または２４ウェルプレートに播種し、２４時間増殖させた後、本明細書中に記載されるように、培地のみ（ｍｏｃｋ）、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトした。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞の細胞遊走アッセイを、本明細書中に記載されるように行った。ＳＮＢ１９細胞（１×１０^４ウェル^−１）のアッセイを８ウェルチャンバースライドに播種し、２４時間インキュベートし、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトし、本明細書中に記載されるように行った。
【０２００】
ＳＮＢ１９細胞ボイデンチャンバー浸潤アッセイ：改変ボイデンチャンバーアッセイを用いて、カテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡを発現するベクター存在下でのＳＮＢ１９細胞のインビトロ侵襲性を評価した。ＳＮＢ１９細胞を、カテプシンＢおよびｕＰＡＲのｓｉＲＮＡを単独で、またはともに発現するｍｏｃｋ、ＥＶ、ｐＵ、ｐＣまたはｐＣＵベクターで４８時間トランスフェクトした。１×１０^６個の細胞を、０．２％ＢＳＡを補充した６００μｌの、血清を含まない培地中に懸濁し、マトリゲル（０．７ｍｇ／ｍｌ）でコートされたトランスウェルチャンバー（コーニング・コスター・フィッシャー・サイエンティフック カタログ番号０７−２００−１５８、ペンシルバニア州ピッツバーグ）の上の区画に入れた。チャンバーの下の区画を、２００μｌの、血清を含まない培地で充填し、細胞を２４時間遊走させた。インキュベーションの後、細胞を固定し、Ｈｅｍａ−３で染色し、写真を撮った。浸潤アッセイの定量化を行った。ＳＮＢ１９細胞（１×１０^４ウェル^−１）のアッセイを、８ウェルチャンバーに播種し、２４時間インキュベートし、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトし、本明細書中に記載されるように行った。
【０２０１】
ＳＮＢ１９スフェロイドアッセイ：ＳＮＢ１９神経膠芽腫細胞（３×１０^６）を、ＤＭＥＭ中で調製した０．７５％アガーで予めコートした１００ｍｍ組織培養プレート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）に播種し、スフェロイド凝集物が形成されるまで培養した。直径１００〜２００μｍのスフェロイドを選択し、ｍｏｃｋ、空のベクター、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵで４８時間トランスフェクトした。感染の３日後、ＳＮＢ１９スフェロイドを蛍光色素ＤｉＩで染色し、ＤｉＯで染色したラット脳凝集物と接触させて置いた。これまでに記載されたように、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いてラット脳凝集物の進行性の破壊およびＳＮＢ１９細胞の浸潤を観察し、写真を撮った。共培養の間の脳凝集物または腫瘍スフェロイドの残りの体積を、これまでに記載されたように測定した。ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵＭでトランスフェクトしたＳＮＢ１９細胞のスフェロイドアッセイを、本明細書中に記載されるように行った。ＳＮＢ１９細胞（１×１０^４ウェル^−１）のアッセイを８ウェルチャンバースライドに播種し、２４時間インキュベートし、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトし、本明細書中に記載されるように行った。
【０２０２】
神経膠腫解析のマウス実験。定位フレームを用いて、ＳＮＢ１９ ＧＦＰ細胞（２×１０^６）をヌードマウスの脳に注射した。８〜１０日後、マウスをｍｏｃｋ、空のベクターＥＶ／ＳＶ、ｐＣ、ｐＵおよびｐＣＵで処理した。０．２５μｌ／時間の速度で、アルゼット（ダイレクトコーポレーション、カリフォルニア州キュパージョン）ミニ浸透圧ポンプを用いて、ベクターのインビボ大脳内送達を行い、１５０μｇベクターＤＮＡのｍｏｃｋ（ＰＢＳ）、１５０μｇ ｐＣ、１５０μｇ ｐＵ、１５０μｇ ｐＣＵまたはｐｕＰＡＲベクター（１５０μｇ）、ｐＭＭＰ−９ベクター（１５０μｇ）およびｐＵＭベクター（１５０μｇ）を脳に注射した（マウス１匹あたり１００ｕＬ）。全ての実験は、ピオリアのイリノイ医科大学での実験を承認するインスティチューショナル・アニマル・コントロール・ユーザーズ・コミッティーによって設定された、機関のガイドラインを遵守して行った。５週間後、または対照マウスが症状を示し始めたときに、ホルムアルデヒドの心臓還流によってマウスを麻酔した。次いで、標準的なプロトコールどおりに、脳を除去し、パラフィン包埋した。切片を調製し、ＧＦＰ発現に関して観察するか、またはＨ＆Ｅで染色した。切片は、各例における腫瘍サイズに関して半定量的に、盲検化して検討および点数付けされた。１切片あたりの平均腫瘍面積を用いて腫瘍体積を計算し、対照と処置群との間で比較した。ＳＮＢ１９細胞（１×１０^４ウェル^−１）の実験を８ウェルチャンバースライドに播種し、２４時間インキュベートし、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍでトランスフェクトし、本明細書中に記載されるように行った。
【０２０３】
統計的解析：グラフパッド・プリズムソフトウエア（カリフォルニア州サンディエゴ）を用い、異なる値の間の有意性の解析のためのＡＮＯＶＡを用いて、統計的比較を行った。値を、少なくとも３つの別々の実験からの平均値ＳＤとして表し、Ｐ値が０．０５未満で、差を有意であると見なした。
【０２０４】
大脳内腫瘍増殖阻害。大脳内腫瘍モデルのために、２×１０^６個のＳＮＢ１９細胞をヌードマウスに大脳内注射した。腫瘍を１０日間増殖させた。このとき、動物を７つの群に無作為化し、ＥＶ／ＳＶ、ｐｕＰＡＲ、ｐｕＰＡ、ｐＭＭＰ−９およびｐＵ_２Ｍ（０．２５μｌ時間^−１の速度でアルゼットミニポンプを用いて、１５０μｇの各コンストラクトを脳に注射した（各群あたり６匹のマウス）。腫瘍接種の５週間後、ＰＢＳ中３．５％ホルムアルデヒドの心臓還流によって、各群からの６匹のマウスを屠殺した。それらの脳を除去し、２４時間４％パラホルムアルデヒドに入れ、パラフィン包埋および切片化した。蛍光顕微鏡下でＧＦＰ蛍光に関して切片をスクリーニングし、腫瘍増殖を調べた。切片を盲検化して検討し、腫瘍サイズに関して半定量的に点数付けした。各切片中の平均腫瘍面積を用いて腫瘍体積を計算し、対照と処置群との間で比較した。
【０２０５】
マトリゲル浸潤アッセイ。空のベクター（ＥＶ）、またはカテプシンＢおよびＭＭＰ−９のｓｉＲＮＡを発現するベクター（ｐＣＭ）のいずれかでのトランスフェクションの後、ボイデンチャンバー浸潤アッセイを用いて、トランスフェクトＳＮＢ１９細胞の侵襲性をインビトロで試験した。簡潔に述べると、８μｍの孔を有するトランスウェルインサートをマトリゲル（０．７ｍｇ／ｍｌ）（コラボラティブ・リサーチ，インク、マサチューセッツ州ボストン）でコートした。ＳＮＢ１９細胞をトリプシン化し、５００μｌの細胞懸濁液（１×１０^６個の細胞／ｍｌ）を三連でウェルに加えた。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、ウェル下部へフィルターを通過した細胞を定量化し、ウェル上部および下部の細胞の合計のパーセンテージとして表した。膜の下側の細胞を固定し、Ｈｅｍａ−３で染色し、写真を撮った。記載される他のコンストラクトのアッセイもまた、本明細書中に記載されている手順に従って行った。
【０２０６】
核酸の送達：例えば親油性薬剤、アデノ、アデノ関連またはレンチを含むウイルスまたは修飾されたウイルス等の任意の型の方法を用いて、核酸の送達を達成する。二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または一方の鎖がＤＮＡで他方がＲＮＡであるか、またはリボースもしくはデオキシリボースバックボーンを同じ鎖上に有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとしての、平滑または粘着末端を有する、環状または線状であるむき出しのプラスミドコンストラクトもまた、使用する。タンパク質もしくは炭化水素またはそれらの組み合わせでコートされた、またはホルモンもしくはホルモン誘導体と関連して使用される、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド。化学的に修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドもまた、ｕＰＡＲ、ｕＰＡ、ＭＭＰ−９およびカテプシンＢを標的とするＲＮＡｉを誘導する治療分子として、任意の組み合わせで使用され得る。意図される使用は、真核生物または細胞系、好ましくはヒトおよびヒト細胞系である。
【０２０７】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達のための当業者に公知の方法および治療組成物は、本開示の範囲内である。例えば、本明細書中に開示されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび他の核酸は、ウイルスベクター送達、リポフェクション、電気化学的および生化学的方法等の技術を通じて、哺乳動物細胞に送達され得る。ウイルスベースの送達は、目的の核酸を含む組換えアデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスの、または任意の適したベクターを作製すること、および当業者に公知の技術を用いてウイルスベクターを送達することを含む。リポソームベースの送達系としては、リポフェクションおよびカルジオリピンベースの組成物が挙げられる。むき出しの核酸の直接の、および化学的または生化学的佐剤と組み合わせた送達は、本開示の範囲内である。例えばｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ−９、およびカテプシンＢ等の標的配列に対する、例えばｓｉＲＮＡを含む環状プラスミドは、直接注射もしくは腫瘍内送達されるか、または腹腔内注射され得る。同様に、合成または化学的に調製された核酸はまた、腫瘍内または腹腔内で送達され得る。また、ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを発現する核酸の選択的または特異的送達は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくは抗体または任意の適した標的化因子等の別の作用物質との適切なカップリングを通じても達成され得る。上述の技術および方法は、細胞間、細胞内、インビトロ細胞培養物、インビボ、器官内部で、血液脳関門を横切っての、前立腺癌、神経膠腫、乳癌、および結腸癌への核酸配列の送達に適しており、適用可能である。
【０２０８】
配列：種々のｓｉＲＮＡコンストラクトの配列（部分的配列）を本明細書中に開示する。下線を引いた部分は、自己相補的逆方向反復を示す。太字は介在ループ配列を示す。
【０２０９】
ＵＰＡＲ−ｕＰＡ
【０２１０】
【化６５】

ＵＰＡＲ−ＭＭＰ−９
【０２１１】
【化６６】

ＵＰＡＲ ＣＢ
【０２１２】
【化６７】

ＭＭＰ９−ＣＢ
【０２１３】
【化６８】

ＵＰＡＲ、ｕＰＡおよびカテプシンＢ
【０２１４】
【化６９】

引用した文書
これらの文書は、本開示における材料および方法に関連する範囲にのみ含められる。
【０２１５】
【化７０】

【０２１６】
【化７１】

【０２１７】
【化７２】

【０２１８】
【化７３】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【公開番号】特開２０１３−２７４０５（Ｐ２０１３−２７４０５Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２３７６２７（Ｐ２０１２−２３７６２７）
【出願日】平成２４年１０月２９日（２０１２．１０．２９）
【分割の表示】特願２００７−５４３２４５（Ｐ２００７−５４３２４５）の分割
【原出願日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０３０６０５２５）ザ　ボード　オブ　トラスティーズ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　イリノイ (25)
【Ｆターム（参考）】