腫瘍壊死因子α関連状態のＲＮＡｉ媒介性の阻害
【課題】ドライアイおよび炎症のための更なる薬剤および治療方法、およびそのための代替療法を提供する。
【解決手段】腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）ｍＲＮＡ発現をサイレンシングするか、またはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）ｍＲＮＡ発現をサイレンシングすることによってＴＮＦαを阻害するためのＲＮＡ干渉が提供される。このようなＴＮＦα標的をサイレンシングすることは、特に、眼の状態であるドライアイ、アレルギー性結膜炎または眼の炎症など、または、皮膚炎、鼻炎または喘息など、のＴＮＦα関連状態を有するか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある患者を治療するのに有用である。
【解決手段】腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）ｍＲＮＡ発現をサイレンシングするか、またはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）ｍＲＮＡ発現をサイレンシングすることによってＴＮＦαを阻害するためのＲＮＡ干渉が提供される。このようなＴＮＦα標的をサイレンシングすることは、特に、眼の状態であるドライアイ、アレルギー性結膜炎または眼の炎症など、または、皮膚炎、鼻炎または喘息など、のＴＮＦα関連状態を有するか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある患者を治療するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００６年５月１９日に出願された、表題ＲＮＡｉ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＮＥＣＲＯＳＩＳ ＦＡＣＴＯＲ α−ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳの同時係属中の米国仮特許出願第６０／８０１，７８８号（この本文は、本明細書に参考として具体的に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）ｍＲＮＡまたはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）ｍＲＮＡをサイレンシングすることにより、ＴＮＦαをサイレンシングするための干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。このようなＴＮＦα標的をサイレンシングすることは、ＴＮＦα関連状態またはこのような状態を発現する危険性がある患者の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
炎症は、一般には、ステロイド薬および／または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）を含む標準的な抗炎症レジメンにより治療される。アレルギー性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎および喘息は、歴史的には、経口もしくは鼻内ステロイド薬に加えて、またはその代わりに、経口、鼻内もしくは局所抗ヒスタミン薬のレジメンにより治療されてきた。全身治療には、典型的には、必要な治療部位に到達するのに有効な濃度を与えるために、より高い濃度の薬剤化合物を投与することが必要である。抗ヒスタミン化合物は、中枢神経系の活性を有することが知られており、眠気および粘膜の乾燥は、抗ヒスタミン薬の使用による一般的な副作用である。ステロイド薬およびＮＳＡＩＤＳは、眼圧上昇、白内障、緑内障または角膜融解などの潜在的な副作用を有する。
【０００４】
乾性結膜炎または乾性角結膜炎としても知られているドライアイは、眼球前方の涙液膜の破損を伴い、結果として眼の露出した外側表面の脱水症を引き起こす一般的な眼科疾患である。今日まで、ドライアイは、人工涙液の局所投与により治療されてきた。これら涙液の中には、ムチン欠失患者のムチン層に一時的に取って代わるか、またはそれを補う粘液模倣（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃ）物質を含有するものがある。メチルプレドニゾロンの使用が、ドライアイの増悪を治療するための短期間の「パルス」治療において提案されている。提案された「パルス」療法は、眼圧上昇および白内障形成などの炎症状態に対する伝統的なステロイド療法に付随する合併症を回避するのに必要とされる。
【０００５】
サイトカインＴＮＦαは、ドライアイおよびブドウ膜炎の抗炎症療法のための標的である。涙腺炎症により誘発されたドライアイのウサギモデルにおいて、眼球表面のＴＮＦαレベルを特異的に調節することにより、角膜染色の阻害および涙液層破壊時間の回復が達成された。ドライアイ療法は、ＴＮＦα合成（ＲＤＰ５８）を阻害することによって、またはモノクローナル抗体（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））または可溶性レセプター（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））を使用してＴＮＦαを特異的に中和することによって行われた。これらＴＮＦαに対する治療の各々は、局所用の眼用抗炎症性ステロイド薬を用いて得られた有効性レベルをもたらした。
【０００６】
特許文献１（２００５年１０月１３日公開、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎら）は、ＲＮＡ干渉によるＴＮＦおよびＴＮＦレセプター遺伝子発現の阻害に関する。しかしながら、この公報は、本明細書に記載されるようなＲＮＡ干渉のための特定の標的配列についてはいずれも教示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２２７９３５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の実施形態は、ドライアイおよび炎症のための更なる薬剤および治療方法に対する当技術分野における希求に対処し、かつ、そのための代替療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、ステロイド薬またはＮＳＡＩＤＳに関連する副作用を起こさずに、ＴＮＦα関連状態を極めて強力かつ有効に治療する、予防するまたはそれに介入することに関する。１つの態様では、本発明の方法は、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡを投与し、これによってそれぞれ、ＴＮＦαに対する前駆体のタンパク質分解処理に干渉するか、または、その細胞表面レセプターに対するＴＮＦαの結合に干渉し、それにより、ＴＮＦαの活性を減衰させ、アポトーシスおよび炎症に関連する事象のカスケードを防止することにより、ＴＮＦα関連状態を有するか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある被験体を治療することを含む。
【００１０】
ＴＮＦα関連状態としては、ドライアイなどの状態およびＴＮＦα関連炎症状態が挙げられる。ＴＮＦαに関連する炎症状態としては、眼の炎症、アレルギー性結膜炎、皮膚炎、鼻炎および喘息などの状態が挙げられ、かつ、直接的または間接的にＴＮＦαに関連する炎症状態を引き起こすＴＮＦαの活性に起因する細胞変化が挙げられる。ＴＮＦα関連状態としては、特に、ドライアイ、アレルギー性結膜炎および眼の炎症などのＴＮＦαに関連する眼の状態が挙げられる。本明細書で提供される干渉ＲＮＡは、非特異的薬剤による望ましくない副作用を回避しつつ、ＴＮＦα標的であるＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡのサイレンシングを提供する。
【００１１】
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法が、本発明の実施形態である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域を含む。これにより、前記ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される。
【００１２】
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療する方法が、本発明の実施形態である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域を含む。これにより、前記ＴＮＦα関連状態が治療される。
【００１３】
本発明の更に別の実施形態において、被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現を減衰させることによって前記被験体のＴＮＦαの活性を減衰させる方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００１４】
【化８】
を含む部分にハイブリダイズするか、または、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００１５】
【化９】
から始まる部分にハイブリダイズする。ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現は、アンチセンス鎖が先に引用したような配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分にハイブリダイズするような実施形態において減衰される。ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現は、アンチセンス鎖が先に引用した配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分にハイブリダイズする実施形態において減衰される。
【００１６】
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための方法が本発明の実施形態であり、この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００１７】
【化１０】
を含む部分にハイブリダイズする。これにより、前記ＴＮＦα関連状態が治療される。
【００１８】
ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な被験体において治療するための方法が本発明の実施形態であり、この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号２に対応する、ヌクレオチド
【００１９】
【化１１】
を含むｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。これにより、前記ＴＮＦα関連状態が治療される。
【００２０】
更なる実施形態では、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する第二の干渉ＲＮＡを被験体に投与することもできる。第二の干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性の領域とを含み、前記第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、先に引用したヌクレオチドを含む一部分にハイブリダイズするか、または、このアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００２１】
【化１２】
から始まる部分にハイブリダイズする。
【００２２】
第一の干渉ＲＮＡが配列番号１を標的とするとき、第二の干渉ＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のいずれかを標的としてもよく、逆に、第一の干渉ＲＮＡが配列番号２を標的とするとき、第二の干渉ＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のいずれかを標的としてもよい。更なる実施形態では、第三、第四またはそれ以上の干渉ＲＮＡを投与してもよい。
【００２３】
本発明の更なる実施形態は、ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための方法であって、この方法は、ＲＮＡ干渉によりＴＡＣＥ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記ＴＡＣＥ遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉による前記ｍＲＮＡの切断を誘導する。
【００２４】
本発明の更なる実施形態は、ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な対象者において治療するための方法であり、この方法は、ＲＮＡ干渉によりＴＮＦＲ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記ＴＮＦＲ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉による前記ｍＲＮＡの切断を誘導する。
【００２５】
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための方法であって、有効量の一本鎖干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を前記被験体に投与することを含む方法が、更なる実施形態である。この一本鎖干渉ＲＮＡは、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００２６】
【化１３】
を含む部分にハイブリダイズし、前記干渉ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリダイズ部分と少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を有する。これにより、前記ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される。
【００２７】
本発明は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、更なる実施形態として包含する。
【００２８】
本発明は、配列番号５９〜配列番号６９、配列番号７１〜配列番号９２および配列番号９４〜配列番号１５４のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列から本質的になる干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、更なる実施形態として包含する。
【００２９】
ＴＮＦαの活性を減衰させ、これにより、本明細書中に記載されるようなＴＮＦα関連状態を治療する方法として、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現を減衰させる薬剤を調製する際に、本明細書に記載される実施形態のいずれかを使用することも、本発明の実施形態である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域を含み、
これにより、該ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目２）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのうちの１つである、項目１に記載の使用。
（項目３）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１に記載の使用。
（項目４）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１に記載の使用。
（項目５）
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域を含み、
これにより、該ＴＮＦα関連状態が治療される、使用。
（項目６）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのうちの１つである、項目５に記載の使用。
（項目７）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目５に記載の使用。
（項目８）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目５に記載の使用。
（項目９）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがドライアイを有するか、またはドライアイを発症する危険性がある、項目５に記載の使用。
（項目１０）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがＴＮＦαに関連する炎症状態を有するか、またはＴＮＦαに関連する炎症状態を発症する危険性がある、項目５に記載の使用。
（項目１１）
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化１】
を含む部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目１２）
被験体のＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化２】
から始まる部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目１３）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがドライアイを有するか、またはドライアイを発症する危険性がある、項目１２に記載の使用。
（項目１４）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがＴＮＦα関連状態を有するか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある、項目１２に記載の使用。
（項目１５）
上記センスヌクレオチド鎖および上記アンチセンスヌクレオチド鎖が、ループ状のヌクレオチド鎖によって接続されている、項目１２に記載の使用。
（項目１６）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１２に記載の使用。
（項目１７）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１２に記載の使用。
（項目１８）
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化３】
を含む部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＮＦα関連状態が治療される、使用。
（項目１９）
ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体の眼に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化４】
を含む部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＮＦαに関連する眼の状態が治療される、使用。
（項目２０）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがドライアイを有するか、またはドライアイを発症する危険性がある、項目１９に記載の使用。
（項目２１）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがアレルギー性結膜炎または眼の炎症を有するか、またはアレルギー性結膜炎または眼の炎症を発症する危険性がある、項目１９に記載の使用。
（項目２２）
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性の領域とを含む第二の干渉ＲＮＡを上記被験体に投与することを更に含み、
該第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化５】
を含む部分にハイブリダイズする、項目１８に記載の使用。
（項目２３）
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性の領域とを含む第二の干渉ＲＮＡを上記被験体の眼に投与することを更に含み、
該第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化６】
を含む部分にハイブリダイズする、項目１９に記載の使用。
（項目２４）
上記センスヌクレオチド鎖および上記アンチセンスヌクレオチド鎖が、ループ状のヌクレオチド鎖によって接続されている、項目１８に記載の使用。
（項目２５）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１８に記載の使用。
（項目２６）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１８に記載の使用。
（項目２７）
上記センスヌクレオチド鎖および上記アンチセンスヌクレオチド鎖が、ループ状のヌクレオチド鎖によって接続されている、項目１９に記載の使用。
（項目２８）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１９に記載の使用。
（項目２９）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１９に記載の使用。
（項目３０）
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
ＲＮＡ干渉によりＴＡＣＥ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、
該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、該ＴＡＣＥ遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉による該ｍＲＮＡの切断を誘導する、使用。
（項目３１）
ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
ＲＮＡ干渉によりＴＮＦＲ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、
該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、該ＴＮＦＲ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉による該ｍＲＮＡの切断を誘導する、使用。
（項目３２）
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該一本鎖干渉ＲＮＡが、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化７】
を含む部分にハイブリダイズし、
該干渉ＲＮＡが、配列番号１に対応するｍＲＮＡの該ハイブリダイズ部分と少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を有し、
これにより、該ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目３３）
上記被験体がヒトであり、かつ、該被験体がＴＮＦαに関連する眼の状態を有する、項目３１に記載の使用。
（項目３４）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目３１に記載の使用。
（項目３５）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目３１に記載の使用。
（項目３６）
上記干渉ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、項目３１に記載の使用。
（項目３７）
上記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さである、項目２９に記載の使用。
（項目３８）
上記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さである、項目２９に記載の使用。
（項目３９）
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む、組成物。
（項目４０）
配列番号５９〜配列番号６９、配列番号７１〜配列番号９２および配列番号９４〜配列番号１５４のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列から本質的になる干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む、組成物。
（項目４１）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのうちの１つである、項目３９に記載の組成物。
（項目４２）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのうちの１つである、項目４０に記載の組成物。
【００３０】
本発明の上述の利点や目的および他の利点や目的を得るために、添付図面において例証されるその特定実施形態を参照して、上で簡単に述べた本発明をより具体的に説明する。これらの図面は、本発明の典型的な実施形態のみを示すものであり、故に、本発明の範囲を制限するものと考えるべきではないという理解のもと、添付図面を用いることにより、本発明を更に具体的かつ詳細に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書で引用される参考文献は、これらの文献が本明細書に記載される事項を補足する例示的手順または他の詳細事項を提供する限りにおいて、参照により本明細書に組み込まれている。
【００３２】
当業者は、本明細書の開示に照らし、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に開示される実施形態の明らかな変更を行うことができることを理解するであろう。本明細書に開示される実施形態は全て、本明細書の開示に照らして、過度の実験を行うことなく創出および実行することができる。本発明の全範囲は、本明細書の開示およびその同等な実施形態において明示される。本明細書は、本発明に与えられる保護範囲全体を不当に狭めるものと解釈すべきではない。
【００３３】
本明細書に示される詳細事項は、一例として、本発明の好ましい実施形態を例証するためだけのものであり、最も有用であると考えられているものを提供し、かつ本発明の多様
な実施形態の原理および概念的態様についての説明を容易に理解させるために提示されている。この点で、本発明の根本的な理解のために必要であるよりも詳細に本発明の構造を細部まで示そうとする試みはなされておらず、本説明を、図面および／または実施例と共に読めば、如何にして本発明の幾つかの形態を実施し得るかが、当業者にとって明らかとなる。
【００３４】
以下の定義および説明は、下記の実施例において明瞭かつ明確に変更されていない限り、または、意味の適用によっていずれかの構成が無意味にもしくは本質的に無意味になる場合を除き、下記の（ｆｕｔｕｒｅ）文章構成において統制されることを意味し、かつ意図する。用語の構成が無意味にもしくは本質的に無意味である場合には、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ第３版の定義を採用するものとする。
【００３５】
本明細書中で使用するとき、全ての百分率は、特記しない限り、重量による百分率である。
【００３６】
本明細書で使用するとき、特記しない限り、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１つの」、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を意味する。
【００３７】
「ドライアイ」という用語は、乾性結膜炎または乾性角結膜炎としても知られており、眼球前方の涙液膜の破損を伴い、結果として眼の露出した外側表面の脱水症を引き起こす一般的な眼科疾患である。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「眼の炎症」という用語には、例えば、虹彩炎、ブドウ膜炎、上強膜炎、強膜炎、角膜炎、眼内炎、眼瞼炎、および医原性炎症状態が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「アレルギー性結膜炎」という用語は、瞼の裏側を覆い、かつ、強膜の露出面を覆う敏感な膜である結膜の炎症を指す。「アレルギー性結膜炎」という用語には、例えば、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、枯草熱結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、および春季カタルが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「皮膚炎」という用語は、皮膚の炎症を指し、例えば、アレルギー性接触皮膚炎、じんま疹、皮脂欠乏性皮膚炎（下肢の乾皮症）、アトピー性皮膚炎、刺激性接触皮膚炎やウルシオール誘発性接触皮膚炎などの接触皮膚炎、湿疹、沈下性皮膚炎（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、貨幣状皮膚炎、外耳炎、口囲皮膚炎および脂漏性皮膚炎を含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「鼻炎」という用語は、鼻の粘膜の炎症を指し、例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー性鼻炎、刺激性鼻炎、好酸球性非アレルギー性鼻炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｎｏｎ−ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、薬物性鼻炎および好中球性副鼻腔炎（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ）を含む。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「喘息」という用語は、鼻および口から肺へ空気を輸送する気管狭窄を結果として引き起こす気道の炎症を指し、例えば、アレルギー性喘息、アトピー性喘息、アトピー性ＩｇＥ媒介型気管支喘息（ａｔｏｐｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ＩｇＥ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｓｔｈｍａ）、気管支喘息、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｙｔｉｓ）、気腫性喘息（ｅｍｐｈｙｓｅｍａｔｏｕｓ ａｓｔｈｍａ）、本態性喘息（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｓｔｈｍａ）、運動誘発性喘息、環境要因により引き起こされる外因性喘息、初期喘息、病態生理学的障害により引き起こされる内因性喘息、非アレルギー性喘息、非アトピー性喘息および喘鳴幼児症候群（ｗｈｅｅｚｙ ｉｎｆａｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を含む。
【００４３】
「（配列識別子）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域」という句は、１つのヌクレオチド置換を許容する。２つのヌクレオチド置換（すなわち、１１／１３＝８５％同一性／相補性）は、このような句には含まれない。
【００４４】
「パーセント（％）同一性」という用語は、第一の核酸分子内の連続するヌクレオチドが、第二の核酸分子内の同じ長さを有する連続するヌクレオチドの組におけるのと同一である割合を表す。「パーセント（％）相補性」という用語は、第一の核酸分子内の連続するヌクレオチドが、第二の核酸分子内の連続するヌクレオチドの組とワトソン−クリック型塩基対を形成し得る割合を表す。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的またはほぼ相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸同士が相互作用してハイブリッドと呼ばれる水素結合型複合体を形成するプロセスを意味し、言及している。ハイブリダイゼーション反応は、敏感かつ選択的である。インビトロでは、ハイブリダイゼーションの特異性（すなわち、ストリンジェンシー）は、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩またはホルムアミドの濃度およびハイブリダイゼーション温度により制御され、このような手順は当技術分野においてよく知られている。特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を低減するか、ホルムアミドの濃度を増加するか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増大される。
【００４６】
例えば、高ストリンジェンシー条件は、約５０％ホルムアミドで３７℃〜４２℃にて生じ得る。低ストリンジェンシー条件は、約３５％〜２５％ホルムアミドで３０℃〜３５℃にて生じ得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に提供されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる例としては、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後洗浄するか、または１×ＳＳＣ中７０℃または１×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、０．３×ＳＳＣ中７０℃で洗浄するか、または４×ＳＳＣ中７０℃または４×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、１×ＳＳＣ中６７℃で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低く、Ｔｍは、１９〜４９塩基対の長さを有するハイブリッドについては以下の計算式を用いて決定される：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）。
【００４７】
本明細書中で引用される核酸配列は、特記しない限り、５’→３’方向で書かれている。本明細書で使用するとき、「核酸」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）もしくはＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）中にプリンまたはピリミジン塩基が存在するその修飾型を指す。「Ｔ」塩基がＲＮＡ中には本来生じないとしても、本明細書中に提供される干渉ＲＮＡは、特に３’末端に「Ｔ」塩基を含んでいてもよい。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、一本鎖分子または二本鎖分子を言及している可能性がある。二本鎖分子は、ＡおよびＴ塩基、ＣおよびＧ塩基、ならびにＡおよびＵ塩基間のワトソン−クリック塩基対合により形成される。二本鎖分子の鎖は、互いに部分的な、実質的なまたは完全な相補性を有していてもよく、デュプレックスハイブリッドを形成し、その結合強度は、塩基配列の相補性の性質および程度に依存する。
【００４８】
ｍＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列の配列から容易に推定される。例えば、配列番号１は、ＴＡＣＥのｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列である。ｍＲＮＡ配列は、「Ｔ」塩基が「Ｕ」塩基に置換されたＤＮＡセンス鎖配列と同一である。故に、ＴＡＣＥのｍＲＮＡ配列は配列番号１から分かり、ＴＮＦＲ１のｍＲＮＡは配列番号２から分かる。
【００４９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して遺伝子発現をサイレンシングするプロセスである。理論に拘束されることを望まないが、ＲＮＡｉは、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーを用いて、より長いｄｓＲＮＡを切断して小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にすることから始まる。ｓｉＲＮＡは、通常、約１９〜２８ヌクレオチド、または２０〜２５ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドの長さを有し、かつ、２ヌクレオチド分の３’オーバーハング、５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を含有することが多いｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体に取り込まれる。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を使用して、取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を同定し、次いで、これら標的ｍＲＮＡを切断するか、またはそれらの翻訳を阻害する。故に、ＲＩＳＣに取り込まれるｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として知られている他方のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから排除され、標的ｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相同性である。当業者は、原則として、ｓｉＲＮＡのいずれかの鎖がＲＩＳＣに取り込まれ、ガイド鎖として機能し得ることを認識するであろう。しかしながら、ｓｉＲＮＡ設計（例えば、所望のガイド鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡデュプレックス安定性を低下させた）は、所望のガイド鎖のＲＩＳＣへの取り込みを好み得る。
【００５０】
ガイド鎖に対して少なくとも部分的に相補的である配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介型切断によって、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡにコードされる対応タンパク質の定常状態レベルが低下する。あるいは、ＲＩＳＣはまた、標的ｍＲＮＡを切断することなく、翻訳抑制により、対応するタンパク質の発現を低下させることができる。他のＲＮＡ分子およびＲＮＡ様分子もＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ＲＩＳＣと相互作用し得る他のＲＮＡ分子の例としては、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスが挙げられる。本明細書で使用するとき、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、特記しない限り、二本鎖干渉ＲＮＡを指す。ＲＩＳＣと相互作用し得るＲＮＡ様分子の例としては、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオチド、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、および／または１つまたは複数の非ホスホジエステル結合を含有するＲＮＡ分子が挙げられる。本明細書での検討のために、ＲＩＳＣと相互作用し、かつ遺伝子発現のＲＩＳＣ媒介型変化に関与し得る全てのＲＮＡまたはＲＮＡ様分子は、「干渉ＲＮＡ」と呼ばれる。ＳｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスは、故に、「干渉ＲＮＡ」のサブセットである。
【００５１】
本発明の実施形態の干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断するための触媒として作用するようであり、すなわち、干渉ＲＮＡは、半化学量論的な量の標的ｍＲＮＡの阻害を行うことができる。アンチセンス療法と比較すると、このような切断条件下で治療効果を付与するのに必要とされる干渉ＲＮＡは著しく少ない。
【００５２】
本発明は、ＴＮＦα細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）またはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、本明細書中では「ＴＡＣＥ」と称される）の発現を阻害するための、干渉ＲＮＡの使用に関し、その阻害により、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）活性が低減される。ＴＮＦαがその細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）に結合すると、アポトーシスおよび炎症などの様々な細胞応答に影響を及ぼすシグナリングカスケードが活性化される。ＴＮＦαそれ自体は、最初から、不活性な膜結合前駆体として発現されている。活性型のＴＮＦαが細胞表面から放出されるには、「ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ」（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバーであるＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）により前駆体のタンパク質分解処理を行うことが必要である。
【００５３】
本発明によれば、ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡ、またはＴＮＦＲ１およびＴＡＣＥ ｍＲＮＡの両方、の発現を阻害すると、ＴＮＦαの作用が効果的に低下する。更に、外因的に提供されるか、または内因的に発現される、本明細書中に記載されるような干渉ＲＮＡは、ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡまたはＴＡＣＥ ｍＲＮＡをサイレンシングする上で特に効果的である。
【００５４】
腫瘍壊死因子α変換酵素ｍＲＮＡ（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）：ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号１として与えられているアクセッション番号ＮＭ＿００３１８３としてのＴＡＣＥのＤＮＡ配列を記載している。配列番号１は、ＴＡＣＥをコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基を含まない）を示す。ＴＡＣＥのコード配列は、ヌクレオチド１８４〜２６５８から得られる。
【００５５】
先に引用されたＴＡＣＥ ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはそれらの同種物（ｃｏｇｎａｔｅ）である。同種物は、配列番号１に相同性である別の哺乳類種から得られた腫瘍壊死因子α変換酵素ｍＲＮＡ（すなわち、オルソログ）である。
【００５６】
腫瘍壊死因子レセプター１ ｍＲＮＡ（ＴＮＦＲ１）：ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号２として与えられているアクセッション番号ＮＭ＿００１０６５としてのＴＮＦＲ１のＤＮＡ配列を記載している。配列番号２は、ＴＮＦＲ１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基を含まない）を記載している。ＴＮＦＲ１のコード配列は、ヌクレオチド２８２〜１６４９から得られる。
【００５７】
先に引用されたＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはそれらの同種物である。同種物は、配列番号２に相同性である別の哺乳類種から得られた腫瘍壊死因子レセプター１ ｍＲＮＡ（すなわち、オルソログ）である。
【００５８】
ｍＲＮＡ発現の減衰：本明細書で使用するとき、「ｍＲＮＡの発現を減衰させる」という句は、ｍＲＮＡ切断によるか、または翻訳の直接阻害により、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減させるような量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与するか、または発現することを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現の低下は、一般的には「ノックダウン」と呼ばれ、非標的対照ＲＮＡ（例えば、非標的対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現の後に存在するレベルに対して報告される。５０％〜１００％（これらの数値を含む）の量の発現ノックダウンは、本明細書中の実施形態により考慮されている。しかしながら、このようなノックダウンレベルを達成することは、本発明のためには必要ではない。一実施形態において、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡを標的とする単一の干渉ＲＮＡが投与される。他の実施形態において、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡを標的とする２つ以上の干渉ＲＮＡが投与される。更なる実施形態において、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡおよびＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの各々を標的とする干渉ＲＮＡは、組み合わせて、または重複効果を発揮するような時間間隔で投与される。
【００５９】
ノックダウンは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅を用いてｍＲＮＡレベルを測定することにより、またはウェスタンブロットもしくは酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベルを測定することにより一般的に評価される。タンパク質レベルを分析することにより、両ｍＲＮＡの切断ならびに翻訳阻害の評価が行われる。ノックダウンを測定するための更なる技術としては、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、放射線免疫測定法および蛍光活性化細胞解析が挙げられる。
【００６０】
ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１の阻害はまた、以下に記載されるようなＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１用干渉ＲＮＡをトランスフェクトした後に、例えばヒトの角膜上皮細胞における標的ｍＲＮＡレベルまたは標的タンパク質レベルを評価することによってインビトロで測定してもよい。
【００６１】
ＴＡＣＥ ｍＲＮＡ発現またはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ発現の阻害に起因するＴＮＦα活性の阻害もまた、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎または喘息に関連する症状の改善などのＴＮＦα関連状態の症状の改善を観察することによって、ヒトまたは哺乳類において推測される。ドライアイの症状、浮腫、かゆみ、炎症または環境的困難に対する耐性のいずれかなどの改善は、ＴＮＦα活性の阻害を示している。
【００６２】
干渉ＲＮＡ：本発明の一実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖とアンチセンス鎖とを有し、これらセンス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を含む。本発明の更なる実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖とアンチセンス鎖とを有し、このアンチセンス鎖は、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を含み、このセンス鎖は、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡそれぞれの標的配列に対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する同一性の領域を含む。本発明の更なる実施形態において、干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の対応する標的配列の３’末端から２番目より１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドのそれぞれに対して、配列相補性の割合を有するか、または配列同一性の割合を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域を含む。
【００６３】
干渉ＲＮＡの各鎖の長さは１９〜４９ヌクレオチドを含み、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さを含んでいてもよい。
【００６４】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、このアンチセンス鎖にＲＩＳＣに取り込まれ、これによりＲＩＳＣが、切断または翻訳抑制のためのアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的な相補性を有する標的ｍＲＮＡを同定することができるという点で、ｓｉＲＮＡの活性誘導剤である。
【００６５】
本発明の実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを用いて選択される。次いで、ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１標的配列に対応する干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションを行い、その後、上述のようなノックダウンの評価を行うことによって試験される。
【００６６】
ｓｉＲＮＡの標的配列を選択するための技術は、Ｔｕｓｃｈｌ， Ｔ．ら、「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」、（２００４年５月６日改訂、ロックフェラー大学のウェブサイトから入手）により；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃５０６、「ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ． （Ａｍｂｉｏｎ社のウェブサイト）により；および、他のウェブから得た設計ツール（例えば、ｔｈｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＰｒｏｌｉｇｏ社のウェブサイト）により提供されている。初期の検索パラメータとしては、３５％〜５５％のＧ／Ｃコンテンツおよび１９〜２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ長が挙げられる。標的配列は、コード領域またはｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域に位置していてもよい。
【００６７】
ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの１９ヌクレオチド長のＤＮＡ標的配列の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド２９７〜３１５
【００６８】
【化１４】
に存在している。２１ヌクレオチドの鎖と、２ヌクレオチド分の３’オーバーハングとを有する、配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６９】
【化１５】
である。各「Ｎ」残基は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）または修飾ヌクレオチドであり得る。３’末端は、１、２、３、４、５および６を含めた１〜６の数の「Ｎ」残基を有し得る。各鎖上の「Ｎ」残基は、同じ残基（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧまたはＴＴ）であり得るか、または異なる残基（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ、ＵＣまたはＵＧ）であり得る。３’オーバーハングは、同じであり得るか、または異なり得る。一実施形態において、両方の鎖は、３’ＵＵオーバーハングを有する。
【００７０】
各鎖上に２１ヌクレオチドの鎖と、３’ＵＵオーバーハングとを有する、配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは、
【００７１】
【化１６】
である。
【００７２】
干渉ＲＮＡはまた、ヌクレオチドの５’オーバーハングを有していてもよく、または、平滑末端を有していてもよい。１９ヌクレオチドの鎖と、平滑末端とを有する、配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは、
【００７３】
【化１７】
である。
【００７４】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、接続されてヘアピンまたはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成してもよい。配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とし、かつ、１９ｂｐの二本鎖ステム領域と、３’ＵＵオーバーハングとを有する本発明のｓｈＲＮＡは、
【００７５】
【化１８】
である。Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕまたは当業者に知られている修飾型である。ループ内のヌクレオチドＮの数は、３〜２３、または５〜１５、または７〜１３、または４〜９、または９〜１１（これらの数を含む）の数であるか、またはヌクレオチドＮの数は９である。ループ内のヌクレオチドの中には、ループ内の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得るものもある。ループ形成に使用できるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， Ｔ．Ｒ．ら（２００２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ， Ｄ．ら（２００２年）、ＲＮＡ ８：１４５４）が挙げられる。結果として生じた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループまたはヘアピン構造を形成することが、当業者により認識されるであろう。
【００７６】
先に同定されたｓｉＲＮＡ標的配列は、３’末端側で伸長して、２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスの設計を促進することができる。ＴＡＣＥ ＤＮＡ配列（配列番号１）において同定された１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列（配列番号３）を６ヌクレオチド分伸長させると、配列番号１のヌクレオチド２９７〜３２１に存在する２５ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列：
【００７７】
【化１９】
が生じる。配列番号１１の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明の２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスは
【００７８】
【化２０】
である。センス鎖の３’末端側の２つのヌクレオチド（すなわち、配列番号１２のＣＵヌクレオチド）は、処理を向上させるためにデオキシヌクレオチドであってもよい。本明細書に提供されるもののような１９〜２１ヌクレオチド標的配列から２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスを設計することは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）社のウェブサイトおよびＫｉｍ， Ｄ．−Ｈ．ら、（２００５年２月）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：２、２２２〜２２６頁により更に検討されている。
【００７９】
干渉ＲＮＡが化学的合成により産生されるとき、一方または両方の鎖（存在する場合）の５’末端側にあるヌクレオチドの５’位でのリン酸化は、結合されたＲＩＳＣ複合体のｓｉＲＮＡ有効性および特異性を向上することができるが、このリン酸化は細胞内で生じ得るので必要ではない。
【００８０】
表１は、本発明のｓｉＲＮＡが上述のように設計される配列番号１のＴＡＣＥ ＤＮＡ標的配列の例を列挙している。ＴＡＣＥは、先に述べたように、腫瘍壊死因子α変換酵素をコードする。
【００８１】
表１ ｓｉＲＮＡのＴＡＣＥ標的配列
【００８２】
【表１−１】
【００８３】
【表１−２】
【００８４】
【表１−３】
【００８５】
【表１−４】
表２は、本発明のｓｉＲＮＡが上述のように設計される配列番号２のＴＮＦＲ１ ＤＮＡ標的配列の例を列挙している。ＴＮＦＲ１は、先に述べたように、腫瘍壊死因子αレセプター１をコードする。
【００８６】
表２ ｓｉＲＮＡのＴＮＦＲ１標的配列
【００８７】
【表２−１】
【００８８】
【表２−２】
【００８９】
【表２−３】
【００９０】
【表２−４】
先の例において引用したように、当業者は、表１または表２に提供された標的配列情報を利用して、配列番号１または配列番号２における配列位置を参照し、配列番号１または配列番号２それぞれに対して相補的またはほぼ相補的であるヌクレオチドを付加するか、または欠失させることにより、表中に記載された配列よりも長さが短いまたは長い干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００９１】
ｓｉＲＮＡおよび干渉ＲＮＡの他の形態により誘導された標的ＲＮＡ切断反応は、非常に配列特異的である。一般に、標的ｍＲＮＡの一部分と配列が同一であるセンスヌクレオチド鎖と、標的ｍＲＮＡの一部分に対して正確に相補的であるアンチセンスヌクレオチド鎖とを含有するｓｉＲＮＡは、本明細書中に引用されるｍＲＮＡ阻害のためのｓｉＲＮＡ実施形態である。しかしながら、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と標的ｍＲＮＡとの、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖との１００％配列相補性は、本発明を実施する上では必要ない。故に、例えば、本発明は、遺伝的変異、系統多型（ｓｔｒａｉｎ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）または進化的分岐に起因して期待され得る配列変動を許容する。
【００９２】
本発明の一実施形態において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡに対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性を有する。本明細書で使用するとき、「ほぼ完全な」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分に対して「実質的に相補的であり」、かつ、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分に対して「実質的に同一である」ことを意味する。当業者によって知られているように、「同一性」は、配列同士のヌクレオチドの順序および同一性をマッチさせることによって決定されるような、ヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いである。一実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列に対して、８０％および８０％から最大１００％までの相補性、例えば、８５％、９０％または９５％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ほぼ完全な相補性を有していると考えられ、本発明で使用してもよい。「完全な」連続する相補性は、隣接する塩基対の標準的なワトソン−クリック塩基対合である。「少なくともほぼ完全な」連続する相補性は、本明細書で使用するときには「完全な」相補性を包含する。同一性または相補性を決定するためのコンピューター手法は、ヌクレオチド配列のマッチング度合いが最大であるものを識別するように設計される（例えば、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら（１９９０年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５、４０３〜４１０頁））。
【００９３】
標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの一方の鎖（センス鎖）との関係は、同一の関係である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、存在する場合にはパッセンジャー鎖とも呼ばれる。標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの他方の鎖（アンチセンス鎖）との関係は、相補的な関係である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００９４】
５’→３’方向に書かれた核酸配列中の末端から２番目の塩基は、最後の塩基の隣、すなわち、３’塩基の隣に位置する塩基である。５’→３’方向に書かれた核酸配列中の末端から２番目より１３塩基は、ある配列の３’塩基の隣から数えて１３塩基であり、３’塩基は含まない。同様に、５’→３’方向に書かれた核酸配列中の末端から２番目より１４、１５、１６、１７または１８塩基は、ある配列の３’塩基の隣から数えてそれぞれ１４、１５、１６、１７または１８塩基であり、３’塩基は含まない。
【００９５】
本発明の実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列識別子により識別された配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域である。
【００９６】
本発明の一実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列識別子により識別された配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続するヌクレオチドの領域である。このような句には、２つのヌクレオチド置換（すなわち、１２／１４＝８６％同一性／相補性）が含まれる。
【００９７】
本発明の更なる実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域である。このような句には、３つのヌクレオチド置換が含まれる。
【００９８】
配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡにおける標的配列は、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域ならびにｍＲＮＡのコード領域に位置していてもよい。
【００９９】
二本鎖干渉ＲＮＡの鎖の一方または両方は、１〜６ヌクレオチド分の３’オーバーハングを有していてもよく、これらヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの混合物であってもよい。オーバーハングのヌクレオチドは、塩基対合しない。本発明の一実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＴＴまたはＵＵの３’オーバーハングを含む。本発明の別の実施形態において、干渉ＲＮＡは、少なくとも１つの平滑末端を含む。末端は通常、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖は５’リン酸基を有し、センス鎖は５’ヒドロキシル基を有する。更に別の実施形態において、末端は、更に、他の分子または官能基の共有結合的付加（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）により修飾されている。
【０１００】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、上述のような２つの一本鎖の二重鎖形成であってもよく、または、相補的領域が塩基対合され、ヘアピンループによって共有結合されて一本鎖を形成する場合には単一分子であってもよい。ヘアピンが、ダイサーと呼ばれるタンパク質によって細胞内で切断され、２つの個々の塩基対合ＲＮＡ分子の干渉ＲＮＡを形成すると考えられている。
【０１０１】
干渉ＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって天然のＲＮＡとは異なっていてもよい。非ヌクレオチド材料は、５’末端、３’末端で、または内部で干渉ＲＮＡに結合されていてもよい。このような修飾は通常、干渉ＲＮＡのヌクレオチド耐性を増大させる、細胞取り込みを向上させる、細胞ターゲッティングを向上させる、干渉ＲＮＡのトレーシングを支援する、安定性を更に向上させる、または、インターフェロン経路を活性化させる潜在性を低減するべく設計される。例えば、干渉ＲＮＡは、オーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含んでいてもよい。ピロリジンリンカーによるｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へのコレステロールの共役結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などによってもｓｉＲＮＡの安定性が得られる。
【０１０２】
更なる修飾としては、３’末端ビオチン分子、細胞浸透特性を有することが知られているペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣薬、蛍光染料またはデンドリマーなどが挙げられる。
【０１０３】
本発明の実施形態において、ヌクレオチドは、それらの塩基部分上、それらの糖部分上または分子および官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のリン酸部分上で修飾されていてもよい。修飾としては、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ（ｄｅａｚａ）、ハロ、ヒドロキシル、チオール基、またはそれらの組合せなどによる置換が挙げられる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換するか、または２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基または２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン架橋などによって置換された２’ＯＨ基などの糖修飾を有するなど、安定性がより高い類似体で置換されてもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジン類似体の例としては、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシンならびにＯ−およびＮ−修飾ヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドのリン酸基は、このリン酸基の１つまたは複数の酸素を窒素または硫黄（ホスホロチオエート）で置換することによって修飾されてもよい。修飾は、例えば、機能を向上させる、安定性または浸透性を向上させる、または局在化もしくはターゲッティングを誘導するのに有用である。
【０１０４】
配列番号１または配列番号２の一部分に対して相補的ではないアンチセンス干渉ＲＮＡ鎖の領域が１つまたは複数あってもよい。非相補的領域は、１つの相補的領域の３’末端、５’末端もしくはその両末端に、または２つの相補的領域の間にあってもよい。
【０１０５】
干渉ＲＮＡを、化学的合成により、インビトロ転写により、またはダイサーもしくは同様の活性を有する別の適切なヌクレアーゼにより長い二本鎖ＲＮＡを切断することにより外因的に生成してもよい。従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて保護されたリボヌクレオチドホスホアミダイド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）から産生される化学的に合成された干渉ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）などの商業的な供給業者から入手してもよい。干渉ＲＮＡは、溶媒または樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せなどによって精製される。あるいは、干渉ＲＮＡは、サンプル処理による損失を避けるために、あったとしてもごく僅かだけ精製して使用してもよい。
【０１０６】
干渉ＲＮＡはまた、プラスミドもしくはウイルス発現ベクターから、または最小の発現カセット、例えば、１つまたは複数のプロモーターと、干渉ＲＮＡのための適切な１つまたは複数の鋳型とを含むＰＣＲ生成フラグメントから内因的に発現され得る。市販のｓｈＲＮＡ用プラスミド系発現ベクターの例としては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のメンバーが挙げられる。干渉ＲＮＡ発現用ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶ）およびヘルペスウイルスを含む様々なウイルス由来のものでもよい。市販のｓｈＲＮＡ発現用ウイルスベクターの例としては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ａｄｅｎｏ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。ウイルスベクター、ベクターから干渉ＲＮＡを発現するための方法およびウイルスベクターを送達する方法の選択は、当業者の技能の範囲内である。ＰＣＲ生成ｓｈＲＮＡ発現カセットを生成するためのキットの例としては、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる。第一の干渉ＲＮＡは、当該第一の干渉ＲＮＡを発現することができる第一の発現ベクターからのインビボ発現を経て投与されてもよく、第二の干渉ＲＮＡは、当該第二の干渉ＲＮＡを発現することができる第二の発現ベクターからのインビボ発現を経て投与されてもよく、または、両方の干渉ＲＮＡは、当該両方の干渉ＲＮＡを発現することができる単一の発現ベクターからのインビボ発現を経て投与されてもよい。
【０１０７】
干渉ＲＮＡは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６またはＨ１プロモーター）またはｐｏｌ ＩＩプロモーター（サイトメガロウイルスプロモーター）を含む、当業者に既知の様々な真核生物プロモーターから発現されてもよい。当業者は、これらプロモーターも干渉ＲＮＡの誘導発現を可能とするように構成され得ることを認識するであろう。
【０１０８】
生理学的条件下でのハイブリダイゼーション：本発明の幾つかの実施形態において、干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体の一部としてｍＲＮＡとインビボでハイブリダイズする。
【０１０９】
例えば、高ストリンジェンシー条件は、約５０％ホルムアミドで３７℃〜４２℃にて生じ得る。低ストリンジェンシー条件は、約３５％〜２５％ホルムアミドで３０℃〜３５℃にて生じ得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に提供されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる例としては、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後洗浄するか、または１×ＳＳＣ中７０℃または１×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、０．３×ＳＳＣ中７０℃で洗浄するか、または４×ＳＳＣ中７０℃または４×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、１×ＳＳＣ中６７℃で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低く、Ｔｍは、１９〜４９の塩基対の長さを有するハイブリッドについては以下の計算式を用いて決定される：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）。
【０１１０】
上述のインビトロハイブリダイゼーションアッセイは、候補ｓｉＲＮＡと標的との結合が特異的であるかどうかを予測する方法になる。しかしながら、ＲＩＳＣ複合体との関連では、標的の特異的切断はまた、高ストリンジェンシーでのインビトロハイブリダイゼーションを示さないアンチセンス鎖でも生じ得る。
【０１１１】
一本鎖干渉ＲＮＡ：先に引用したように、干渉ＲＮＡは、最終的には一本鎖として機能する。一本鎖（ｓｓ）干渉ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡよりも効率はよくないが、ｍＲＮＡサイレンシングを行うことが見出されている。故に、本発明の実施形態はまた、生理学的条件下で、配列番号１または配列番号２の一部分にハイブリダイズし、かつ、配列番号１または配列番号２それぞれのハイブリダイゼーション部分と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を有するｓｓ干渉ＲＮＡの投与を提供する。表１または表２のｓｓ干渉ＲＮＡは、先に引用したｄｓ干渉ＲＮＡの場合と同様に、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する。ｓｓ干渉ＲＮＡは、５’リン酸を有するか、または、５’位がインサイチュまたはインビボでリン酸化されている。「５’リン酸化」という用語は、例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に、糖（例えば、リボース、デオキシリボースまたはこれらの類似体）のＣ５ヒドロキシルへのエステル結合を介してリン酸基が付着しているポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。
【０１１２】
ｓｓ干渉ＲＮＡは、ｄｓ干渉ＲＮＡの場合と同様に、化学的にもしくはインビトロ転写により合成されるか、または、ベクターまたは発現カセットから内因的に発現される。５’リン酸基は、キナーゼを介して付加されてもよく、または、５’リン酸は、ＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果であってもよい。送達は、ｄｓ干渉ＲＮＡと同様である。一実施形態において、保護された末端と、ヌクレアーゼ耐性修飾とを有するｓｓ干渉ＲＮＡは、サイレンシングのために投与される。ｓｓ干渉ＲＮＡは、保存用に乾燥されるか、または水溶液中に溶解されてもよい。この溶液は、アニーリングを阻害するため、または安定化のために、緩衝液または塩を含有していてもよい。
【０１１３】
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステム−ループまたはヘアピン構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）をなす干渉ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一分子（単一オリゴヌクレオチド鎖）である。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、短いスペーサーにより逆相補的アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合しているＤＮＡベクターから発現され得る。選択された発現ベクターに必要とされる場合、３’末端のＴおよびヌクレオチド形成制限部位が付加されてもよい。結果として生じたＲＮＡ転写物は、折り畳まれてステム−ループ構造を形成する。
【０１１４】
投与態様：干渉ＲＮＡは、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮投与などを介して送達されてもよい。
【０１１５】
投与は、眼周囲、結膜、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）、硝子体内、眼内、網膜下、角膜下、眼球後、小菅内または脈絡膜上投与などの眼組織投与により；注射により；カテーテル、または他の配置装置（例えば、網膜ペレット、眼内挿入物、座薬、または、多孔性、無孔性もしくはゼラチン状材料を含む移植片）を用いて眼へ直接適用することにより；局所用点眼薬または軟膏により；または、盲嚢内の、または強膜に近接するか（経強膜的）もしくは眼内に埋め込まれた徐放装置により、眼に直接行ってもよい。眼房内注入（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、角膜を通って前房内に入り、これにより薬剤が小柱網に到達し得る。小菅内注入は、シュレム管から排液させる静脈の採取チャネル内またはシュレム管内に行われてもよい。
【０１１６】
投与は、例えば、局所用点耳薬または軟膏、耳内の、または耳に近接して埋め込まれた徐放装置により、直接耳に行ってもよい。局部投与（ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）としては、耳筋肉内、中耳腔および蝸牛内注入投与経路が挙げられる。更に、中耳／内耳または近隣構造の窓膜に対して、干渉ＲＮＡを染み込ませたゲルフォームまたは同様の吸収性および接着性製品を配置することによって、薬剤を内耳に投与することができる。
【０１１７】
例えば、エアロゾル化調製物を介して、および、吸入器または噴霧器などによる吸入によって肺への直接投与を行ってもよい。
【０１１８】
更なる投与態様としては、錠剤、ピルおよびカプセルが挙げられ、これらはいずれも当業者が処方することができる。
【０１１９】
被験体：ＴＮＦα関連状態の治療を必要としているか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある被験体は、ＴＮＦαに関連する炎症状態を有するもしくはドライアイであるか、またはＴＮＦαに関連する炎症状態もしくはドライアイを発症する危険性があるヒトまたは他の哺乳類である。ＴＮＦαに関連する炎症状態としては、例えば、本明細書中で引用するようなＴＮＦαの望ましくない活性または不適切な活性に付随するアレルギー性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎または喘息が挙げられる。
【０１２０】
ＴＮＦα関連状態に関連する眼の構造としては、眼、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、眼房、硝子体腔、毛様体または眼球後区などが挙げられる。
【０１２１】
このような疾患に関連する耳構造としては、内耳、中耳、外耳、鼓室もしくは鼓膜、蝸牛または耳管などが挙げられる。
【０１２２】
このような疾患に関連する肺構造としては、鼻、口、咽頭、喉頭、気管支、気管、気管分岐部（左右主気管支の開口部を分ける稜線）および肺、特に下肺、例えば細気管支および肺胞などが挙げられる。
【０１２３】
被験体はまた、耳細胞、肺細胞、眼細胞、細胞培養物、器官もしくはエクスビボ器官、または組織であってもよい。
【０１２４】
処方および用量：医薬処方物は、水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理学的に許容可能な担体媒体と混合された最大９９重量％の本発明の干渉ＲＮＡまたはその塩を含む。
【０１２５】
本発明の干渉ＲＮＡは、溶液、懸濁液または乳液として投与される。以下は、本発明によって具現化された可能な処方物の例である。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
【表４】
一般に、本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの有効量は、結果として、１００ｐＭ〜１０００ｎＭ、または１ｎＭ〜４００ｎＭ、または５ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約１０ｎＭの標的細胞表面での細胞外濃度をもたらす。この局所濃度を達成するのに必要な用量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織との間の細胞層の数、送達が局所的であるか全身性であるか、などの要因数に応じて変わる。送達部位での濃度は、標的細胞または組織表面での濃度よりかなり高くてもよい。局所用組成物は、１日に１〜４回、標的器官の表面に送達されるか、または熟練の臨床医の常套判断に従って、毎日、毎週、２週間毎、毎月またはそれ以上などの長期間の送達スケジュールで送達される。処方物のｐＨは約ｐＨ４〜９、またはｐＨ４．５〜７．４である。
【０１２８】
ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによる患者の治療は、作用期間を増加させ、これにより投薬の頻度を低下させ、かつ患者のコンプライアンスを高めることにより、小分子治療よりも有利であると期待される。
【０１２９】
処方物の有効量は、例えば、被験体の年齢、人種および性別、ＴＮＦα関連状態の重篤度、標的遺伝子転写物／タンパク質代謝回転速度、干渉ＲＮＡの効力および干渉ＲＮＡの安定性などの要因に左右され得る。一実施形態において、干渉ＲＮＡは、標的器官に対して局所的に送達され、治療用量でＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ含有組織に到達し、これによりＴＮＦα関連プロセスが改善される。
【０１３０】
許容可能な担体：許容可能な担体は、多くてもごく僅かか、全く眼の刺激を引き起こさず、必要であれば好適な保存を付与し、かつ、均一な用量で本発明の１つまたは複数の干渉ＲＮＡを送達する担体を指す。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡを投与するための許容可能な担体としては、陽イオン性で脂質ベースのトランスフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニンまたはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）などの陽イオン性ペプチド；またはリポソームが挙げられる。リポソームは、標準の小胞形成脂質およびステロール、例えばコレステロールなどから形成され、内皮細胞表面抗原などに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体などのターゲッティング部分を含み得る。更に、リポソームはＰＥＧ化リポソームであり得る。
【０１３１】
干渉ＲＮＡは、溶液として、懸濁液として、または、生体内分解性もしくは非生体内分解性送達装置を使用して送達されてもよい。干渉ＲＮＡを、単独で、または規定の共有結合複合体（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の成分として送達することができる。干渉ＲＮＡはまた、陽イオン性脂質、陽イオン性ペプチドまたは陽イオン性ポリマーと共に複合体を形成する；核酸結合特性を有するタンパク質、融合タンパク質またはタンパク質ドメイン（例えば、プロタミン）と共に複合体を形成する；またはナノ粒子内に封入され得る。組織特異的または細胞特異的送達は、抗体または抗体フラグメントなどの適切なターゲッティング部分を包含させることによって達成することができる。
【０１３２】
眼、鼻または肺送達のために、干渉ＲＮＡを、眼科的に、光学的に、または肺が許容可能な防腐剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と併用して、水性殺菌懸濁液または溶液を形成してもよい。生理学的に許容可能な等張水性緩衝液中に干渉ＲＮＡを溶解させることによって、溶液処方物を調製してもよい。更に、溶液としては、阻害剤の溶解を支援する許容可能な界面活性剤が挙げられる。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を本発明の組成物に添加して化合物の保持力を向上させてもよい。
【０１３３】
滅菌軟膏処方物を調製するために、干渉ＲＮＡを、鉱油、液状ラノリンまたは白色ワセリンなどの適切な賦形剤中で防腐剤と併用する。滅菌ゲル処方物は、当技術分野で知られている方法に従って、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）などの組合せから調製した親水性塩基中に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製してもよい。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）を、例えば眼内注射のために使用してもよい。本発明の他の組成物は、干渉ＲＮＡが目的の器官または組織にあまり浸透していない場合、ＣｒｅｍｅｐｈｏｒおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））などの浸透促進剤を含有していてもよい。
【０１３４】
キット：本発明の実施形態は、本明細書において引用されるようなｍＲＮＡの、細胞内における発現を減衰させるための試薬を包含するキットを提供する。キットは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する。ｓｉＲＮＡおよび非ウイルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクターの場合、キットはまた、トランスフェクション試薬または他の好適な送達賦形剤を含有していてもよい。ウイルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクターの場合、キットは、ウイルスベクターおよび／またはウイルスベクター産生のために必要な成分（例えば、パッケージング細胞系、ならびに、ウイルスベクター鋳型と、パッケージング用の付加的なヘルパーベクターとを含むベクター）を含有していてもよい。キットはまた、陽性および陰性対照ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクター（例えば、非ターゲッティング対照ｓｉＲＮＡまたは非関連ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）を含有していてもよい。キットはまた、意図する標的遺伝子（例えば、ウェスタンブロット用の対応するタンパク質に対する標的ｍＲＮＡおよび／または抗体を検出するための定量ＰＣＲ用プライマーおよびプローブ）のノックダウンを評価するための試薬を含有していてもよい。あるいは、キットは、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列と、ｓｉＲＮＡをインビトロ転写により生成するため、またはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するために必要な説明書および材料とを含んでもよい。
【０１３５】
キット形態の医薬的な組合せが更に提供され、これには、容器手段を厳重に閉じ込めて受容するように構成された搬送容器手段と、干渉ＲＮＡ組成物および許容可能な担体を含む第一容器手段とが包装されて組み合わされたものが含まれる。当業者には直ちに明らかであるように、このようなキットは、更に、所望であれば、１つまたは複数の多様な従来の医薬キット構成要素、例えば、１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体を有する容器、追加の容器などを含むことができる。投与すべき成分の量を示す、挿入物またはラベルとしての印刷された説明書、投与のためのガイドラインおよび／または成分を混合するためのガイドラインもまた、キットに含めることができる。
【０１３６】
ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１用干渉ＲＮＡが、ヒトの角膜上皮細胞などにおける外因性ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１発現レベルをノックダウンさせる能力は、下記のようにインビトロで評価される。形質転換されたヒトの角膜上皮細胞、例えばＣＥＰＩ−１７細胞系（Ｏｆｆｏｒｄら（１９９９年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４０、１０９１〜１１０１頁）を、トランスフェクションの２４時間前に、ＫＧＭケラチノサイト培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）において平板培養する。トランスフェクションは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を使用して、製造業者の指示に従い、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１用干渉ＲＮＡ濃度で行われる。非ターゲッティング対照干渉ＲＮＡおよびラミンＡ／Ｃ干渉ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を対照として使用する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）順方向プライマーおよび逆方向プライマーならびに標的部位を包含するプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などを使用して、トランスフェクションから２４時間後にｑＰＣＲによって標的ｍＲＮＡレベルを評価する。トランスフェクションからおよそ７２時間後（実際の時間はタンパク質の代謝回転速度に応じる）に、ウェスタンブロットなどによって標的タンパク質レベルを評価してもよい。培養細胞からＲＮＡおよび／またはタンパク質を単離するための標準的な技術は、当業者によく知られている。非特異的なオフターゲット効果の可能性を低減するために、所望の標的遺伝子発現ノックダウンレベルを生じる可能な限りの最低濃度のＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１干渉ＲＮＡを使用する。
【０１３７】
当業者は、本明細書の開示に照らし、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に開示される実施形態の明らかな変更を行うことができることを理解するであろう。本明細書に開示される実施形態は全て、本明細書の開示に照らして、過度の実験を行うことなく創出および実行することができる。本発明の全範囲は、本明細書の開示およびその同等な実施形態において明示される。本明細書は、本発明に与えられる保護範囲全体を不当に狭めるものと解釈すべきではない。
【０１３８】
本発明の特定実施形態を示し、説明してきたが、当業者であれば、多数の変形および代替実施形態に想到するであろう。したがって、本発明は添付した特許請求の範囲に関してのみ制限されるものと意図される。
【０１３９】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定形態で実施されてもよい。記載された実施形態は、あらゆる点において、例示としてのみであり、制限的なものとして考えるべきではない。故に、本発明の範囲は、上記説明によってではなく、添付した特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲と同等な意味および範囲内で行う特許請求の範囲に対する変更はいずれもその範囲内に包含されるものとする。更に、本明細書に記載された公開文献、特許および出願はいずれも、その全体が提示されているかのごとく、参照として本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
ＧＴＭ−３細胞においてＴＮＦＲ１を特異的にサイレンシングするための干渉ＲＮＡ
本研究は、ＴＮＦＲ１干渉ＲＮＡが、培養したＧＴＭ−３細胞における外因性ＴＮＦＲ１タンパク質発現のレベルをノックダウンさせる能力を試験するものである。
【０１４１】
ＧＴＭ−３細胞（Ｐａｎｇ， Ｉ．Ｈ．ら、１９９４年、Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． １３、５１〜６３頁）のトランスフェクションを、標準のインビトロ濃度（０．１〜１０ｎＭ）のＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡ、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ 無ＲＩＳＣ ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＣＯＮＴＲＯＬ 非ターゲッティングｓｉＲＮＡ＃２（ＮＴＣ２）およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を用いて遂行した。全てのｓｉＲＮＡを、１×ｓｉＲＮＡ緩衝液、２０ｍＭ ＫＣｌの水溶液、６ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２に溶解させた。対照サンプルは、ｓｉＲＮＡの容量の代わりに、等量の１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（−ｓｉＲＮＡ）を使用した緩衝液対照を含んでいた。抗ＴＮＦＲ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いたウェスタンブロットを行い、ＴＮＦＲ１タンパク質発現を評価した。ＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡは、以下の標的に対して特異的な二本鎖干渉ＲＮＡである：ｓｉＴＮＦＲ１＃１は、配列番号９６が得られる配列
【０１４２】
【化２１】
を標的とし；ｓｉＴＮＦＲ１＃２は、配列番号９７が得られる配列
【０１４３】
【化２２】
を標的とし；ｓｉＴＮＦＲ１＃３は、配列番号９８が得られる配列
【０１４４】
【化２３】
を標的とし；ｓｉＴＮＦＲ１＃４は、配列番号９９が得られる配列
【０１４５】
【化２４】
を標的とする。図１のデータが示すように、ｓｉＴＮＦＲ１＃１、ｓｉＴＮＦＲ１＃２およびｓｉＴＮＦＲ１＃３ｓｉＲＮＡは、対照のｓｉＲＮＡと比較して、１０ｎＭおよび１ｎＭ濃度でＴＮＦＲ１タンパク質発現を著しく低下させたが、０．１ｎＭでの有効性は低下した。ｓｉＴＮＦＲ１＃２およびｓｉＴＮＦＲ１＃３ｓｉＲＮＡは、特に効果的であった。ｓｉＴＮＦＲ１＃４ｓｉＲＮＡもまた、期待したような、ＴＮＦＲ１タンパク質発現が濃度依存的に低下したことを示していた。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、ＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡ番号１、２、３および４ならびにＲＩＳＣを含まない対照ｓｉＲＮＡを各１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ；非ターゲッティング対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ２）を１０ｎＭ；および緩衝液対照（−ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトしたＧＴＭ−３細胞のＴＮＦＲ１ウェスタンブロットを示す図である。矢印は、５５ｋＤａ ＴＮＦＲ１および４２ｋＤａアクチンバンドの位置を示している。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００６年５月１９日に出願された、表題ＲＮＡｉ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＮＥＣＲＯＳＩＳ ＦＡＣＴＯＲ α−ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳの同時係属中の米国仮特許出願第６０／８０１，７８８号（この本文は、本明細書に参考として具体的に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）ｍＲＮＡまたはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）ｍＲＮＡをサイレンシングすることにより、ＴＮＦαをサイレンシングするための干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。このようなＴＮＦα標的をサイレンシングすることは、ＴＮＦα関連状態またはこのような状態を発現する危険性がある患者の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
炎症は、一般には、ステロイド薬および／または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）を含む標準的な抗炎症レジメンにより治療される。アレルギー性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎および喘息は、歴史的には、経口もしくは鼻内ステロイド薬に加えて、またはその代わりに、経口、鼻内もしくは局所抗ヒスタミン薬のレジメンにより治療されてきた。全身治療には、典型的には、必要な治療部位に到達するのに有効な濃度を与えるために、より高い濃度の薬剤化合物を投与することが必要である。抗ヒスタミン化合物は、中枢神経系の活性を有することが知られており、眠気および粘膜の乾燥は、抗ヒスタミン薬の使用による一般的な副作用である。ステロイド薬およびＮＳＡＩＤＳは、眼圧上昇、白内障、緑内障または角膜融解などの潜在的な副作用を有する。
【０００４】
乾性結膜炎または乾性角結膜炎としても知られているドライアイは、眼球前方の涙液膜の破損を伴い、結果として眼の露出した外側表面の脱水症を引き起こす一般的な眼科疾患である。今日まで、ドライアイは、人工涙液の局所投与により治療されてきた。これら涙液の中には、ムチン欠失患者のムチン層に一時的に取って代わるか、またはそれを補う粘液模倣（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃ）物質を含有するものがある。メチルプレドニゾロンの使用が、ドライアイの増悪を治療するための短期間の「パルス」治療において提案されている。提案された「パルス」療法は、眼圧上昇および白内障形成などの炎症状態に対する伝統的なステロイド療法に付随する合併症を回避するのに必要とされる。
【０００５】
サイトカインＴＮＦαは、ドライアイおよびブドウ膜炎の抗炎症療法のための標的である。涙腺炎症により誘発されたドライアイのウサギモデルにおいて、眼球表面のＴＮＦαレベルを特異的に調節することにより、角膜染色の阻害および涙液層破壊時間の回復が達成された。ドライアイ療法は、ＴＮＦα合成（ＲＤＰ５８）を阻害することによって、またはモノクローナル抗体（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））または可溶性レセプター（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））を使用してＴＮＦαを特異的に中和することによって行われた。これらＴＮＦαに対する治療の各々は、局所用の眼用抗炎症性ステロイド薬を用いて得られた有効性レベルをもたらした。
【０００６】
特許文献１（２００５年１０月１３日公開、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎら）は、ＲＮＡ干渉によるＴＮＦおよびＴＮＦレセプター遺伝子発現の阻害に関する。しかしながら、この公報は、本明細書に記載されるようなＲＮＡ干渉のための特定の標的配列についてはいずれも教示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２２７９３５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の実施形態は、ドライアイおよび炎症のための更なる薬剤および治療方法に対する当技術分野における希求に対処し、かつ、そのための代替療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、ステロイド薬またはＮＳＡＩＤＳに関連する副作用を起こさずに、ＴＮＦα関連状態を極めて強力かつ有効に治療する、予防するまたはそれに介入することに関する。１つの態様では、本発明の方法は、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡを投与し、これによってそれぞれ、ＴＮＦαに対する前駆体のタンパク質分解処理に干渉するか、または、その細胞表面レセプターに対するＴＮＦαの結合に干渉し、それにより、ＴＮＦαの活性を減衰させ、アポトーシスおよび炎症に関連する事象のカスケードを防止することにより、ＴＮＦα関連状態を有するか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある被験体を治療することを含む。
【００１０】
ＴＮＦα関連状態としては、ドライアイなどの状態およびＴＮＦα関連炎症状態が挙げられる。ＴＮＦαに関連する炎症状態としては、眼の炎症、アレルギー性結膜炎、皮膚炎、鼻炎および喘息などの状態が挙げられ、かつ、直接的または間接的にＴＮＦαに関連する炎症状態を引き起こすＴＮＦαの活性に起因する細胞変化が挙げられる。ＴＮＦα関連状態としては、特に、ドライアイ、アレルギー性結膜炎および眼の炎症などのＴＮＦαに関連する眼の状態が挙げられる。本明細書で提供される干渉ＲＮＡは、非特異的薬剤による望ましくない副作用を回避しつつ、ＴＮＦα標的であるＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡのサイレンシングを提供する。
【００１１】
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法が、本発明の実施形態である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域を含む。これにより、前記ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される。
【００１２】
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療する方法が、本発明の実施形態である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域を含む。これにより、前記ＴＮＦα関連状態が治療される。
【００１３】
本発明の更に別の実施形態において、被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現を減衰させることによって前記被験体のＴＮＦαの活性を減衰させる方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００１４】
【化８】
を含む部分にハイブリダイズするか、または、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００１５】
【化９】
から始まる部分にハイブリダイズする。ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現は、アンチセンス鎖が先に引用したような配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分にハイブリダイズするような実施形態において減衰される。ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現は、アンチセンス鎖が先に引用した配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分にハイブリダイズする実施形態において減衰される。
【００１６】
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための方法が本発明の実施形態であり、この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００１７】
【化１０】
を含む部分にハイブリダイズする。これにより、前記ＴＮＦα関連状態が治療される。
【００１８】
ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な被験体において治療するための方法が本発明の実施形態であり、この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号２に対応する、ヌクレオチド
【００１９】
【化１１】
を含むｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。これにより、前記ＴＮＦα関連状態が治療される。
【００２０】
更なる実施形態では、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する第二の干渉ＲＮＡを被験体に投与することもできる。第二の干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性の領域とを含み、前記第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、先に引用したヌクレオチドを含む一部分にハイブリダイズするか、または、このアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００２１】
【化１２】
から始まる部分にハイブリダイズする。
【００２２】
第一の干渉ＲＮＡが配列番号１を標的とするとき、第二の干渉ＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のいずれかを標的としてもよく、逆に、第一の干渉ＲＮＡが配列番号２を標的とするとき、第二の干渉ＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のいずれかを標的としてもよい。更なる実施形態では、第三、第四またはそれ以上の干渉ＲＮＡを投与してもよい。
【００２３】
本発明の更なる実施形態は、ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための方法であって、この方法は、ＲＮＡ干渉によりＴＡＣＥ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記ＴＡＣＥ遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉による前記ｍＲＮＡの切断を誘導する。
【００２４】
本発明の更なる実施形態は、ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な対象者において治療するための方法であり、この方法は、ＲＮＡ干渉によりＴＮＦＲ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、前記被験体に投与することを含み、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記ＴＮＦＲ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉による前記ｍＲＮＡの切断を誘導する。
【００２５】
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための方法であって、有効量の一本鎖干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を前記被験体に投与することを含む方法が、更なる実施形態である。この一本鎖干渉ＲＮＡは、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【００２６】
【化１３】
を含む部分にハイブリダイズし、前記干渉ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリダイズ部分と少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を有する。これにより、前記ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される。
【００２７】
本発明は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、更なる実施形態として包含する。
【００２８】
本発明は、配列番号５９〜配列番号６９、配列番号７１〜配列番号９２および配列番号９４〜配列番号１５４のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列から本質的になる干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、更なる実施形態として包含する。
【００２９】
ＴＮＦαの活性を減衰させ、これにより、本明細書中に記載されるようなＴＮＦα関連状態を治療する方法として、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現を減衰させる薬剤を調製する際に、本明細書に記載される実施形態のいずれかを使用することも、本発明の実施形態である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域を含み、
これにより、該ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目２）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのうちの１つである、項目１に記載の使用。
（項目３）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１に記載の使用。
（項目４）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１に記載の使用。
（項目５）
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域を含み、
これにより、該ＴＮＦα関連状態が治療される、使用。
（項目６）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのうちの１つである、項目５に記載の使用。
（項目７）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目５に記載の使用。
（項目８）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目５に記載の使用。
（項目９）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがドライアイを有するか、またはドライアイを発症する危険性がある、項目５に記載の使用。
（項目１０）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがＴＮＦαに関連する炎症状態を有するか、またはＴＮＦαに関連する炎症状態を発症する危険性がある、項目５に記載の使用。
（項目１１）
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化１】
を含む部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目１２）
被験体のＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化２】
から始まる部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目１３）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがドライアイを有するか、またはドライアイを発症する危険性がある、項目１２に記載の使用。
（項目１４）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがＴＮＦα関連状態を有するか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある、項目１２に記載の使用。
（項目１５）
上記センスヌクレオチド鎖および上記アンチセンスヌクレオチド鎖が、ループ状のヌクレオチド鎖によって接続されている、項目１２に記載の使用。
（項目１６）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１２に記載の使用。
（項目１７）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１２に記載の使用。
（項目１８）
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化３】
を含む部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＮＦα関連状態が治療される、使用。
（項目１９）
ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体の眼に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域とを含み、
該アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化４】
を含む部分にハイブリダイズし、
これにより、該ＴＮＦαに関連する眼の状態が治療される、使用。
（項目２０）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがドライアイを有するか、またはドライアイを発症する危険性がある、項目１９に記載の使用。
（項目２１）
上記被験体がヒトであり、該ヒトがアレルギー性結膜炎または眼の炎症を有するか、またはアレルギー性結膜炎または眼の炎症を発症する危険性がある、項目１９に記載の使用。
（項目２２）
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性の領域とを含む第二の干渉ＲＮＡを上記被験体に投与することを更に含み、
該第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号２に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化５】
を含む部分にハイブリダイズする、項目１８に記載の使用。
（項目２３）
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、センスヌクレオチド鎖と、アンチセンスヌクレオチド鎖と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性の領域とを含む第二の干渉ＲＮＡを上記被験体の眼に投与することを更に含み、
該第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化６】
を含む部分にハイブリダイズする、項目１９に記載の使用。
（項目２４）
上記センスヌクレオチド鎖および上記アンチセンスヌクレオチド鎖が、ループ状のヌクレオチド鎖によって接続されている、項目１８に記載の使用。
（項目２５）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１８に記載の使用。
（項目２６）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１８に記載の使用。
（項目２７）
上記センスヌクレオチド鎖および上記アンチセンスヌクレオチド鎖が、ループ状のヌクレオチド鎖によって接続されている、項目１９に記載の使用。
（項目２８）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目１９に記載の使用。
（項目２９）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目１９に記載の使用。
（項目３０）
ＴＮＦα関連状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
ＲＮＡ干渉によりＴＡＣＥ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、
該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、該ＴＡＣＥ遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉による該ｍＲＮＡの切断を誘導する、使用。
（項目３１）
ＴＮＦαに関連する眼の状態を、その治療が必要な被験体において治療するための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
ＲＮＡ干渉によりＴＮＦＲ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、
該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、該ＴＮＦＲ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉による該ｍＲＮＡの切断を誘導する、使用。
（項目３２）
被験体のＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現を減衰させるための薬剤を製造するための化合物の使用であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物を、該被験体に投与することを含み、
該一本鎖干渉ＲＮＡが、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの、ヌクレオチド
【化７】
を含む部分にハイブリダイズし、
該干渉ＲＮＡが、配列番号１に対応するｍＲＮＡの該ハイブリダイズ部分と少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を有し、
これにより、該ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの発現が減衰される、使用。
（項目３３）
上記被験体がヒトであり、かつ、該被験体がＴＮＦαに関連する眼の状態を有する、項目３１に記載の使用。
（項目３４）
上記組成物が、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮経路により投与される、項目３１に記載の使用。
（項目３５）
上記干渉ＲＮＡが、該干渉ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのインビボ発現により投与される、項目３１に記載の使用。
（項目３６）
上記干渉ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、項目３１に記載の使用。
（項目３７）
上記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さである、項目２９に記載の使用。
（項目３８）
上記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が、独立して、約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さである、項目２９に記載の使用。
（項目３９）
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ、配列番号３、配列番号１４〜配列番号５８および配列番号１５５〜配列番号２０１のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む、組成物。
（項目４０）
配列番号５９〜配列番号６９、配列番号７１〜配列番号９２および配列番号９４〜配列番号１５４のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補配列から本質的になる干渉ＲＮＡと、医薬的に許容可能な担体とを含む、組成物。
（項目４１）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのうちの１つである、項目３９に記載の組成物。
（項目４２）
上記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのうちの１つである、項目４０に記載の組成物。
【００３０】
本発明の上述の利点や目的および他の利点や目的を得るために、添付図面において例証されるその特定実施形態を参照して、上で簡単に述べた本発明をより具体的に説明する。これらの図面は、本発明の典型的な実施形態のみを示すものであり、故に、本発明の範囲を制限するものと考えるべきではないという理解のもと、添付図面を用いることにより、本発明を更に具体的かつ詳細に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書で引用される参考文献は、これらの文献が本明細書に記載される事項を補足する例示的手順または他の詳細事項を提供する限りにおいて、参照により本明細書に組み込まれている。
【００３２】
当業者は、本明細書の開示に照らし、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に開示される実施形態の明らかな変更を行うことができることを理解するであろう。本明細書に開示される実施形態は全て、本明細書の開示に照らして、過度の実験を行うことなく創出および実行することができる。本発明の全範囲は、本明細書の開示およびその同等な実施形態において明示される。本明細書は、本発明に与えられる保護範囲全体を不当に狭めるものと解釈すべきではない。
【００３３】
本明細書に示される詳細事項は、一例として、本発明の好ましい実施形態を例証するためだけのものであり、最も有用であると考えられているものを提供し、かつ本発明の多様
な実施形態の原理および概念的態様についての説明を容易に理解させるために提示されている。この点で、本発明の根本的な理解のために必要であるよりも詳細に本発明の構造を細部まで示そうとする試みはなされておらず、本説明を、図面および／または実施例と共に読めば、如何にして本発明の幾つかの形態を実施し得るかが、当業者にとって明らかとなる。
【００３４】
以下の定義および説明は、下記の実施例において明瞭かつ明確に変更されていない限り、または、意味の適用によっていずれかの構成が無意味にもしくは本質的に無意味になる場合を除き、下記の（ｆｕｔｕｒｅ）文章構成において統制されることを意味し、かつ意図する。用語の構成が無意味にもしくは本質的に無意味である場合には、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ第３版の定義を採用するものとする。
【００３５】
本明細書中で使用するとき、全ての百分率は、特記しない限り、重量による百分率である。
【００３６】
本明細書で使用するとき、特記しない限り、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１つの」、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を意味する。
【００３７】
「ドライアイ」という用語は、乾性結膜炎または乾性角結膜炎としても知られており、眼球前方の涙液膜の破損を伴い、結果として眼の露出した外側表面の脱水症を引き起こす一般的な眼科疾患である。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「眼の炎症」という用語には、例えば、虹彩炎、ブドウ膜炎、上強膜炎、強膜炎、角膜炎、眼内炎、眼瞼炎、および医原性炎症状態が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「アレルギー性結膜炎」という用語は、瞼の裏側を覆い、かつ、強膜の露出面を覆う敏感な膜である結膜の炎症を指す。「アレルギー性結膜炎」という用語には、例えば、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、枯草熱結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、および春季カタルが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「皮膚炎」という用語は、皮膚の炎症を指し、例えば、アレルギー性接触皮膚炎、じんま疹、皮脂欠乏性皮膚炎（下肢の乾皮症）、アトピー性皮膚炎、刺激性接触皮膚炎やウルシオール誘発性接触皮膚炎などの接触皮膚炎、湿疹、沈下性皮膚炎（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、貨幣状皮膚炎、外耳炎、口囲皮膚炎および脂漏性皮膚炎を含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「鼻炎」という用語は、鼻の粘膜の炎症を指し、例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー性鼻炎、刺激性鼻炎、好酸球性非アレルギー性鼻炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｎｏｎ−ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、薬物性鼻炎および好中球性副鼻腔炎（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ）を含む。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「喘息」という用語は、鼻および口から肺へ空気を輸送する気管狭窄を結果として引き起こす気道の炎症を指し、例えば、アレルギー性喘息、アトピー性喘息、アトピー性ＩｇＥ媒介型気管支喘息（ａｔｏｐｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ＩｇＥ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｓｔｈｍａ）、気管支喘息、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｙｔｉｓ）、気腫性喘息（ｅｍｐｈｙｓｅｍａｔｏｕｓ ａｓｔｈｍａ）、本態性喘息（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｓｔｈｍａ）、運動誘発性喘息、環境要因により引き起こされる外因性喘息、初期喘息、病態生理学的障害により引き起こされる内因性喘息、非アレルギー性喘息、非アトピー性喘息および喘鳴幼児症候群（ｗｈｅｅｚｙ ｉｎｆａｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を含む。
【００４３】
「（配列識別子）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域」という句は、１つのヌクレオチド置換を許容する。２つのヌクレオチド置換（すなわち、１１／１３＝８５％同一性／相補性）は、このような句には含まれない。
【００４４】
「パーセント（％）同一性」という用語は、第一の核酸分子内の連続するヌクレオチドが、第二の核酸分子内の同じ長さを有する連続するヌクレオチドの組におけるのと同一である割合を表す。「パーセント（％）相補性」という用語は、第一の核酸分子内の連続するヌクレオチドが、第二の核酸分子内の連続するヌクレオチドの組とワトソン−クリック型塩基対を形成し得る割合を表す。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的またはほぼ相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸同士が相互作用してハイブリッドと呼ばれる水素結合型複合体を形成するプロセスを意味し、言及している。ハイブリダイゼーション反応は、敏感かつ選択的である。インビトロでは、ハイブリダイゼーションの特異性（すなわち、ストリンジェンシー）は、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩またはホルムアミドの濃度およびハイブリダイゼーション温度により制御され、このような手順は当技術分野においてよく知られている。特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を低減するか、ホルムアミドの濃度を増加するか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増大される。
【００４６】
例えば、高ストリンジェンシー条件は、約５０％ホルムアミドで３７℃〜４２℃にて生じ得る。低ストリンジェンシー条件は、約３５％〜２５％ホルムアミドで３０℃〜３５℃にて生じ得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に提供されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる例としては、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後洗浄するか、または１×ＳＳＣ中７０℃または１×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、０．３×ＳＳＣ中７０℃で洗浄するか、または４×ＳＳＣ中７０℃または４×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、１×ＳＳＣ中６７℃で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低く、Ｔｍは、１９〜４９塩基対の長さを有するハイブリッドについては以下の計算式を用いて決定される：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）。
【００４７】
本明細書中で引用される核酸配列は、特記しない限り、５’→３’方向で書かれている。本明細書で使用するとき、「核酸」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）もしくはＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）中にプリンまたはピリミジン塩基が存在するその修飾型を指す。「Ｔ」塩基がＲＮＡ中には本来生じないとしても、本明細書中に提供される干渉ＲＮＡは、特に３’末端に「Ｔ」塩基を含んでいてもよい。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、一本鎖分子または二本鎖分子を言及している可能性がある。二本鎖分子は、ＡおよびＴ塩基、ＣおよびＧ塩基、ならびにＡおよびＵ塩基間のワトソン−クリック塩基対合により形成される。二本鎖分子の鎖は、互いに部分的な、実質的なまたは完全な相補性を有していてもよく、デュプレックスハイブリッドを形成し、その結合強度は、塩基配列の相補性の性質および程度に依存する。
【００４８】
ｍＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列の配列から容易に推定される。例えば、配列番号１は、ＴＡＣＥのｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列である。ｍＲＮＡ配列は、「Ｔ」塩基が「Ｕ」塩基に置換されたＤＮＡセンス鎖配列と同一である。故に、ＴＡＣＥのｍＲＮＡ配列は配列番号１から分かり、ＴＮＦＲ１のｍＲＮＡは配列番号２から分かる。
【００４９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して遺伝子発現をサイレンシングするプロセスである。理論に拘束されることを望まないが、ＲＮＡｉは、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーを用いて、より長いｄｓＲＮＡを切断して小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にすることから始まる。ｓｉＲＮＡは、通常、約１９〜２８ヌクレオチド、または２０〜２５ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドの長さを有し、かつ、２ヌクレオチド分の３’オーバーハング、５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を含有することが多いｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体に取り込まれる。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を使用して、取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を同定し、次いで、これら標的ｍＲＮＡを切断するか、またはそれらの翻訳を阻害する。故に、ＲＩＳＣに取り込まれるｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として知られている他方のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから排除され、標的ｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相同性である。当業者は、原則として、ｓｉＲＮＡのいずれかの鎖がＲＩＳＣに取り込まれ、ガイド鎖として機能し得ることを認識するであろう。しかしながら、ｓｉＲＮＡ設計（例えば、所望のガイド鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡデュプレックス安定性を低下させた）は、所望のガイド鎖のＲＩＳＣへの取り込みを好み得る。
【００５０】
ガイド鎖に対して少なくとも部分的に相補的である配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介型切断によって、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡにコードされる対応タンパク質の定常状態レベルが低下する。あるいは、ＲＩＳＣはまた、標的ｍＲＮＡを切断することなく、翻訳抑制により、対応するタンパク質の発現を低下させることができる。他のＲＮＡ分子およびＲＮＡ様分子もＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ＲＩＳＣと相互作用し得る他のＲＮＡ分子の例としては、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスが挙げられる。本明細書で使用するとき、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、特記しない限り、二本鎖干渉ＲＮＡを指す。ＲＩＳＣと相互作用し得るＲＮＡ様分子の例としては、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオチド、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、および／または１つまたは複数の非ホスホジエステル結合を含有するＲＮＡ分子が挙げられる。本明細書での検討のために、ＲＩＳＣと相互作用し、かつ遺伝子発現のＲＩＳＣ媒介型変化に関与し得る全てのＲＮＡまたはＲＮＡ様分子は、「干渉ＲＮＡ」と呼ばれる。ＳｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスは、故に、「干渉ＲＮＡ」のサブセットである。
【００５１】
本発明の実施形態の干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断するための触媒として作用するようであり、すなわち、干渉ＲＮＡは、半化学量論的な量の標的ｍＲＮＡの阻害を行うことができる。アンチセンス療法と比較すると、このような切断条件下で治療効果を付与するのに必要とされる干渉ＲＮＡは著しく少ない。
【００５２】
本発明は、ＴＮＦα細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）またはＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、本明細書中では「ＴＡＣＥ」と称される）の発現を阻害するための、干渉ＲＮＡの使用に関し、その阻害により、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）活性が低減される。ＴＮＦαがその細胞表面レセプターであるＴＮＦレセプター１（ＴＮＦＲ１）に結合すると、アポトーシスおよび炎症などの様々な細胞応答に影響を及ぼすシグナリングカスケードが活性化される。ＴＮＦαそれ自体は、最初から、不活性な膜結合前駆体として発現されている。活性型のＴＮＦαが細胞表面から放出されるには、「ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ」（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバーであるＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）により前駆体のタンパク質分解処理を行うことが必要である。
【００５３】
本発明によれば、ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡ、またはＴＮＦＲ１およびＴＡＣＥ ｍＲＮＡの両方、の発現を阻害すると、ＴＮＦαの作用が効果的に低下する。更に、外因的に提供されるか、または内因的に発現される、本明細書中に記載されるような干渉ＲＮＡは、ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡまたはＴＡＣＥ ｍＲＮＡをサイレンシングする上で特に効果的である。
【００５４】
腫瘍壊死因子α変換酵素ｍＲＮＡ（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）：ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号１として与えられているアクセッション番号ＮＭ＿００３１８３としてのＴＡＣＥのＤＮＡ配列を記載している。配列番号１は、ＴＡＣＥをコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基を含まない）を示す。ＴＡＣＥのコード配列は、ヌクレオチド１８４〜２６５８から得られる。
【００５５】
先に引用されたＴＡＣＥ ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはそれらの同種物（ｃｏｇｎａｔｅ）である。同種物は、配列番号１に相同性である別の哺乳類種から得られた腫瘍壊死因子α変換酵素ｍＲＮＡ（すなわち、オルソログ）である。
【００５６】
腫瘍壊死因子レセプター１ ｍＲＮＡ（ＴＮＦＲ１）：ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号２として与えられているアクセッション番号ＮＭ＿００１０６５としてのＴＮＦＲ１のＤＮＡ配列を記載している。配列番号２は、ＴＮＦＲ１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基を含まない）を記載している。ＴＮＦＲ１のコード配列は、ヌクレオチド２８２〜１６４９から得られる。
【００５７】
先に引用されたＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはそれらの同種物である。同種物は、配列番号２に相同性である別の哺乳類種から得られた腫瘍壊死因子レセプター１ ｍＲＮＡ（すなわち、オルソログ）である。
【００５８】
ｍＲＮＡ発現の減衰：本明細書で使用するとき、「ｍＲＮＡの発現を減衰させる」という句は、ｍＲＮＡ切断によるか、または翻訳の直接阻害により、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減させるような量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与するか、または発現することを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現の低下は、一般的には「ノックダウン」と呼ばれ、非標的対照ＲＮＡ（例えば、非標的対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現の後に存在するレベルに対して報告される。５０％〜１００％（これらの数値を含む）の量の発現ノックダウンは、本明細書中の実施形態により考慮されている。しかしながら、このようなノックダウンレベルを達成することは、本発明のためには必要ではない。一実施形態において、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡを標的とする単一の干渉ＲＮＡが投与される。他の実施形態において、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡを標的とする２つ以上の干渉ＲＮＡが投与される。更なる実施形態において、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡおよびＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの各々を標的とする干渉ＲＮＡは、組み合わせて、または重複効果を発揮するような時間間隔で投与される。
【００５９】
ノックダウンは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅を用いてｍＲＮＡレベルを測定することにより、またはウェスタンブロットもしくは酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベルを測定することにより一般的に評価される。タンパク質レベルを分析することにより、両ｍＲＮＡの切断ならびに翻訳阻害の評価が行われる。ノックダウンを測定するための更なる技術としては、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、放射線免疫測定法および蛍光活性化細胞解析が挙げられる。
【００６０】
ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１の阻害はまた、以下に記載されるようなＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１用干渉ＲＮＡをトランスフェクトした後に、例えばヒトの角膜上皮細胞における標的ｍＲＮＡレベルまたは標的タンパク質レベルを評価することによってインビトロで測定してもよい。
【００６１】
ＴＡＣＥ ｍＲＮＡ発現またはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ発現の阻害に起因するＴＮＦα活性の阻害もまた、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎または喘息に関連する症状の改善などのＴＮＦα関連状態の症状の改善を観察することによって、ヒトまたは哺乳類において推測される。ドライアイの症状、浮腫、かゆみ、炎症または環境的困難に対する耐性のいずれかなどの改善は、ＴＮＦα活性の阻害を示している。
【００６２】
干渉ＲＮＡ：本発明の一実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖とアンチセンス鎖とを有し、これらセンス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を含む。本発明の更なる実施形態において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖とアンチセンス鎖とを有し、このアンチセンス鎖は、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を含み、このセンス鎖は、ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡそれぞれの標的配列に対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する同一性の領域を含む。本発明の更なる実施形態において、干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の対応する標的配列の３’末端から２番目より１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドのそれぞれに対して、配列相補性の割合を有するか、または配列同一性の割合を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域を含む。
【００６３】
干渉ＲＮＡの各鎖の長さは１９〜４９ヌクレオチドを含み、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さを含んでいてもよい。
【００６４】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、このアンチセンス鎖にＲＩＳＣに取り込まれ、これによりＲＩＳＣが、切断または翻訳抑制のためのアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的な相補性を有する標的ｍＲＮＡを同定することができるという点で、ｓｉＲＮＡの活性誘導剤である。
【００６５】
本発明の実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを用いて選択される。次いで、ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１標的配列に対応する干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションを行い、その後、上述のようなノックダウンの評価を行うことによって試験される。
【００６６】
ｓｉＲＮＡの標的配列を選択するための技術は、Ｔｕｓｃｈｌ， Ｔ．ら、「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」、（２００４年５月６日改訂、ロックフェラー大学のウェブサイトから入手）により；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃５０６、「ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ． （Ａｍｂｉｏｎ社のウェブサイト）により；および、他のウェブから得た設計ツール（例えば、ｔｈｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＰｒｏｌｉｇｏ社のウェブサイト）により提供されている。初期の検索パラメータとしては、３５％〜５５％のＧ／Ｃコンテンツおよび１９〜２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ長が挙げられる。標的配列は、コード領域またはｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域に位置していてもよい。
【００６７】
ＴＡＣＥ ｍＲＮＡの１９ヌクレオチド長のＤＮＡ標的配列の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド２９７〜３１５
【００６８】
【化１４】
に存在している。２１ヌクレオチドの鎖と、２ヌクレオチド分の３’オーバーハングとを有する、配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは、
【００６９】
【化１５】
である。各「Ｎ」残基は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）または修飾ヌクレオチドであり得る。３’末端は、１、２、３、４、５および６を含めた１〜６の数の「Ｎ」残基を有し得る。各鎖上の「Ｎ」残基は、同じ残基（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧまたはＴＴ）であり得るか、または異なる残基（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ、ＵＣまたはＵＧ）であり得る。３’オーバーハングは、同じであり得るか、または異なり得る。一実施形態において、両方の鎖は、３’ＵＵオーバーハングを有する。
【００７０】
各鎖上に２１ヌクレオチドの鎖と、３’ＵＵオーバーハングとを有する、配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは、
【００７１】
【化１６】
である。
【００７２】
干渉ＲＮＡはまた、ヌクレオチドの５’オーバーハングを有していてもよく、または、平滑末端を有していてもよい。１９ヌクレオチドの鎖と、平滑末端とを有する、配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは、
【００７３】
【化１７】
である。
【００７４】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、接続されてヘアピンまたはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成してもよい。配列番号３の対応するｍＲＮＡ配列を標的とし、かつ、１９ｂｐの二本鎖ステム領域と、３’ＵＵオーバーハングとを有する本発明のｓｈＲＮＡは、
【００７５】
【化１８】
である。Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕまたは当業者に知られている修飾型である。ループ内のヌクレオチドＮの数は、３〜２３、または５〜１５、または７〜１３、または４〜９、または９〜１１（これらの数を含む）の数であるか、またはヌクレオチドＮの数は９である。ループ内のヌクレオチドの中には、ループ内の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得るものもある。ループ形成に使用できるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， Ｔ．Ｒ．ら（２００２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ， Ｄ．ら（２００２年）、ＲＮＡ ８：１４５４）が挙げられる。結果として生じた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループまたはヘアピン構造を形成することが、当業者により認識されるであろう。
【００７６】
先に同定されたｓｉＲＮＡ標的配列は、３’末端側で伸長して、２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスの設計を促進することができる。ＴＡＣＥ ＤＮＡ配列（配列番号１）において同定された１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列（配列番号３）を６ヌクレオチド分伸長させると、配列番号１のヌクレオチド２９７〜３２１に存在する２５ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列：
【００７７】
【化１９】
が生じる。配列番号１１の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明の２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスは
【００７８】
【化２０】
である。センス鎖の３’末端側の２つのヌクレオチド（すなわち、配列番号１２のＣＵヌクレオチド）は、処理を向上させるためにデオキシヌクレオチドであってもよい。本明細書に提供されるもののような１９〜２１ヌクレオチド標的配列から２７ｍｅｒのダイサー−基質デュプレックスを設計することは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）社のウェブサイトおよびＫｉｍ， Ｄ．−Ｈ．ら、（２００５年２月）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：２、２２２〜２２６頁により更に検討されている。
【００７９】
干渉ＲＮＡが化学的合成により産生されるとき、一方または両方の鎖（存在する場合）の５’末端側にあるヌクレオチドの５’位でのリン酸化は、結合されたＲＩＳＣ複合体のｓｉＲＮＡ有効性および特異性を向上することができるが、このリン酸化は細胞内で生じ得るので必要ではない。
【００８０】
表１は、本発明のｓｉＲＮＡが上述のように設計される配列番号１のＴＡＣＥ ＤＮＡ標的配列の例を列挙している。ＴＡＣＥは、先に述べたように、腫瘍壊死因子α変換酵素をコードする。
【００８１】
表１ ｓｉＲＮＡのＴＡＣＥ標的配列
【００８２】
【表１−１】
【００８３】
【表１−２】
【００８４】
【表１−３】
【００８５】
【表１−４】
表２は、本発明のｓｉＲＮＡが上述のように設計される配列番号２のＴＮＦＲ１ ＤＮＡ標的配列の例を列挙している。ＴＮＦＲ１は、先に述べたように、腫瘍壊死因子αレセプター１をコードする。
【００８６】
表２ ｓｉＲＮＡのＴＮＦＲ１標的配列
【００８７】
【表２−１】
【００８８】
【表２−２】
【００８９】
【表２−３】
【００９０】
【表２−４】
先の例において引用したように、当業者は、表１または表２に提供された標的配列情報を利用して、配列番号１または配列番号２における配列位置を参照し、配列番号１または配列番号２それぞれに対して相補的またはほぼ相補的であるヌクレオチドを付加するか、または欠失させることにより、表中に記載された配列よりも長さが短いまたは長い干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００９１】
ｓｉＲＮＡおよび干渉ＲＮＡの他の形態により誘導された標的ＲＮＡ切断反応は、非常に配列特異的である。一般に、標的ｍＲＮＡの一部分と配列が同一であるセンスヌクレオチド鎖と、標的ｍＲＮＡの一部分に対して正確に相補的であるアンチセンスヌクレオチド鎖とを含有するｓｉＲＮＡは、本明細書中に引用されるｍＲＮＡ阻害のためのｓｉＲＮＡ実施形態である。しかしながら、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と標的ｍＲＮＡとの、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖との１００％配列相補性は、本発明を実施する上では必要ない。故に、例えば、本発明は、遺伝的変異、系統多型（ｓｔｒａｉｎ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）または進化的分岐に起因して期待され得る配列変動を許容する。
【００９２】
本発明の一実施形態において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡに対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性を有する。本明細書で使用するとき、「ほぼ完全な」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分に対して「実質的に相補的であり」、かつ、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分に対して「実質的に同一である」ことを意味する。当業者によって知られているように、「同一性」は、配列同士のヌクレオチドの順序および同一性をマッチさせることによって決定されるような、ヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いである。一実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列に対して、８０％および８０％から最大１００％までの相補性、例えば、８５％、９０％または９５％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ほぼ完全な相補性を有していると考えられ、本発明で使用してもよい。「完全な」連続する相補性は、隣接する塩基対の標準的なワトソン−クリック塩基対合である。「少なくともほぼ完全な」連続する相補性は、本明細書で使用するときには「完全な」相補性を包含する。同一性または相補性を決定するためのコンピューター手法は、ヌクレオチド配列のマッチング度合いが最大であるものを識別するように設計される（例えば、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら（１９９０年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５、４０３〜４１０頁））。
【００９３】
標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの一方の鎖（センス鎖）との関係は、同一の関係である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、存在する場合にはパッセンジャー鎖とも呼ばれる。標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの他方の鎖（アンチセンス鎖）との関係は、相補的な関係である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００９４】
５’→３’方向に書かれた核酸配列中の末端から２番目の塩基は、最後の塩基の隣、すなわち、３’塩基の隣に位置する塩基である。５’→３’方向に書かれた核酸配列中の末端から２番目より１３塩基は、ある配列の３’塩基の隣から数えて１３塩基であり、３’塩基は含まない。同様に、５’→３’方向に書かれた核酸配列中の末端から２番目より１４、１５、１６、１７または１８塩基は、ある配列の３’塩基の隣から数えてそれぞれ１４、１５、１６、１７または１８塩基であり、３’塩基は含まない。
【００９５】
本発明の実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列識別子により識別された配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域である。
【００９６】
本発明の一実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列識別子により識別された配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続するヌクレオチドの領域である。このような句には、２つのヌクレオチド置換（すなわち、１２／１４＝８６％同一性／相補性）が含まれる。
【００９７】
本発明の更なる実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目より１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８の連続するヌクレオチドの領域である。このような句には、３つのヌクレオチド置換が含まれる。
【００９８】
配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡにおける標的配列は、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域ならびにｍＲＮＡのコード領域に位置していてもよい。
【００９９】
二本鎖干渉ＲＮＡの鎖の一方または両方は、１〜６ヌクレオチド分の３’オーバーハングを有していてもよく、これらヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの混合物であってもよい。オーバーハングのヌクレオチドは、塩基対合しない。本発明の一実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＴＴまたはＵＵの３’オーバーハングを含む。本発明の別の実施形態において、干渉ＲＮＡは、少なくとも１つの平滑末端を含む。末端は通常、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖は５’リン酸基を有し、センス鎖は５’ヒドロキシル基を有する。更に別の実施形態において、末端は、更に、他の分子または官能基の共有結合的付加（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）により修飾されている。
【０１００】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、上述のような２つの一本鎖の二重鎖形成であってもよく、または、相補的領域が塩基対合され、ヘアピンループによって共有結合されて一本鎖を形成する場合には単一分子であってもよい。ヘアピンが、ダイサーと呼ばれるタンパク質によって細胞内で切断され、２つの個々の塩基対合ＲＮＡ分子の干渉ＲＮＡを形成すると考えられている。
【０１０１】
干渉ＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって天然のＲＮＡとは異なっていてもよい。非ヌクレオチド材料は、５’末端、３’末端で、または内部で干渉ＲＮＡに結合されていてもよい。このような修飾は通常、干渉ＲＮＡのヌクレオチド耐性を増大させる、細胞取り込みを向上させる、細胞ターゲッティングを向上させる、干渉ＲＮＡのトレーシングを支援する、安定性を更に向上させる、または、インターフェロン経路を活性化させる潜在性を低減するべく設計される。例えば、干渉ＲＮＡは、オーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含んでいてもよい。ピロリジンリンカーによるｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へのコレステロールの共役結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などによってもｓｉＲＮＡの安定性が得られる。
【０１０２】
更なる修飾としては、３’末端ビオチン分子、細胞浸透特性を有することが知られているペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣薬、蛍光染料またはデンドリマーなどが挙げられる。
【０１０３】
本発明の実施形態において、ヌクレオチドは、それらの塩基部分上、それらの糖部分上または分子および官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のリン酸部分上で修飾されていてもよい。修飾としては、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ（ｄｅａｚａ）、ハロ、ヒドロキシル、チオール基、またはそれらの組合せなどによる置換が挙げられる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換するか、または２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基または２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン架橋などによって置換された２’ＯＨ基などの糖修飾を有するなど、安定性がより高い類似体で置換されてもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジン類似体の例としては、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシンならびにＯ−およびＮ−修飾ヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドのリン酸基は、このリン酸基の１つまたは複数の酸素を窒素または硫黄（ホスホロチオエート）で置換することによって修飾されてもよい。修飾は、例えば、機能を向上させる、安定性または浸透性を向上させる、または局在化もしくはターゲッティングを誘導するのに有用である。
【０１０４】
配列番号１または配列番号２の一部分に対して相補的ではないアンチセンス干渉ＲＮＡ鎖の領域が１つまたは複数あってもよい。非相補的領域は、１つの相補的領域の３’末端、５’末端もしくはその両末端に、または２つの相補的領域の間にあってもよい。
【０１０５】
干渉ＲＮＡを、化学的合成により、インビトロ転写により、またはダイサーもしくは同様の活性を有する別の適切なヌクレアーゼにより長い二本鎖ＲＮＡを切断することにより外因的に生成してもよい。従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて保護されたリボヌクレオチドホスホアミダイド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）から産生される化学的に合成された干渉ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）などの商業的な供給業者から入手してもよい。干渉ＲＮＡは、溶媒または樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せなどによって精製される。あるいは、干渉ＲＮＡは、サンプル処理による損失を避けるために、あったとしてもごく僅かだけ精製して使用してもよい。
【０１０６】
干渉ＲＮＡはまた、プラスミドもしくはウイルス発現ベクターから、または最小の発現カセット、例えば、１つまたは複数のプロモーターと、干渉ＲＮＡのための適切な１つまたは複数の鋳型とを含むＰＣＲ生成フラグメントから内因的に発現され得る。市販のｓｈＲＮＡ用プラスミド系発現ベクターの例としては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のメンバーが挙げられる。干渉ＲＮＡ発現用ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶ）およびヘルペスウイルスを含む様々なウイルス由来のものでもよい。市販のｓｈＲＮＡ発現用ウイルスベクターの例としては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ａｄｅｎｏ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。ウイルスベクター、ベクターから干渉ＲＮＡを発現するための方法およびウイルスベクターを送達する方法の選択は、当業者の技能の範囲内である。ＰＣＲ生成ｓｈＲＮＡ発現カセットを生成するためのキットの例としては、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる。第一の干渉ＲＮＡは、当該第一の干渉ＲＮＡを発現することができる第一の発現ベクターからのインビボ発現を経て投与されてもよく、第二の干渉ＲＮＡは、当該第二の干渉ＲＮＡを発現することができる第二の発現ベクターからのインビボ発現を経て投与されてもよく、または、両方の干渉ＲＮＡは、当該両方の干渉ＲＮＡを発現することができる単一の発現ベクターからのインビボ発現を経て投与されてもよい。
【０１０７】
干渉ＲＮＡは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６またはＨ１プロモーター）またはｐｏｌ ＩＩプロモーター（サイトメガロウイルスプロモーター）を含む、当業者に既知の様々な真核生物プロモーターから発現されてもよい。当業者は、これらプロモーターも干渉ＲＮＡの誘導発現を可能とするように構成され得ることを認識するであろう。
【０１０８】
生理学的条件下でのハイブリダイゼーション：本発明の幾つかの実施形態において、干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体の一部としてｍＲＮＡとインビボでハイブリダイズする。
【０１０９】
例えば、高ストリンジェンシー条件は、約５０％ホルムアミドで３７℃〜４２℃にて生じ得る。低ストリンジェンシー条件は、約３５％〜２５％ホルムアミドで３０℃〜３５℃にて生じ得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に提供されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる例としては、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後洗浄するか、または１×ＳＳＣ中７０℃または１×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、０．３×ＳＳＣ中７０℃で洗浄するか、または４×ＳＳＣ中７０℃または４×ＳＳＣ中５０℃にて５０％ホルムアミドでハイブリダイズし、その後、１×ＳＳＣ中６７℃で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低く、Ｔｍは、１９〜４９の塩基対の長さを有するハイブリッドについては以下の計算式を用いて決定される：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）。
【０１１０】
上述のインビトロハイブリダイゼーションアッセイは、候補ｓｉＲＮＡと標的との結合が特異的であるかどうかを予測する方法になる。しかしながら、ＲＩＳＣ複合体との関連では、標的の特異的切断はまた、高ストリンジェンシーでのインビトロハイブリダイゼーションを示さないアンチセンス鎖でも生じ得る。
【０１１１】
一本鎖干渉ＲＮＡ：先に引用したように、干渉ＲＮＡは、最終的には一本鎖として機能する。一本鎖（ｓｓ）干渉ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡよりも効率はよくないが、ｍＲＮＡサイレンシングを行うことが見出されている。故に、本発明の実施形態はまた、生理学的条件下で、配列番号１または配列番号２の一部分にハイブリダイズし、かつ、配列番号１または配列番号２それぞれのハイブリダイゼーション部分と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続する相補性の領域を有するｓｓ干渉ＲＮＡの投与を提供する。表１または表２のｓｓ干渉ＲＮＡは、先に引用したｄｓ干渉ＲＮＡの場合と同様に、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する。ｓｓ干渉ＲＮＡは、５’リン酸を有するか、または、５’位がインサイチュまたはインビボでリン酸化されている。「５’リン酸化」という用語は、例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に、糖（例えば、リボース、デオキシリボースまたはこれらの類似体）のＣ５ヒドロキシルへのエステル結合を介してリン酸基が付着しているポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。
【０１１２】
ｓｓ干渉ＲＮＡは、ｄｓ干渉ＲＮＡの場合と同様に、化学的にもしくはインビトロ転写により合成されるか、または、ベクターまたは発現カセットから内因的に発現される。５’リン酸基は、キナーゼを介して付加されてもよく、または、５’リン酸は、ＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果であってもよい。送達は、ｄｓ干渉ＲＮＡと同様である。一実施形態において、保護された末端と、ヌクレアーゼ耐性修飾とを有するｓｓ干渉ＲＮＡは、サイレンシングのために投与される。ｓｓ干渉ＲＮＡは、保存用に乾燥されるか、または水溶液中に溶解されてもよい。この溶液は、アニーリングを阻害するため、または安定化のために、緩衝液または塩を含有していてもよい。
【０１１３】
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステム−ループまたはヘアピン構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）をなす干渉ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一分子（単一オリゴヌクレオチド鎖）である。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、短いスペーサーにより逆相補的アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合しているＤＮＡベクターから発現され得る。選択された発現ベクターに必要とされる場合、３’末端のＴおよびヌクレオチド形成制限部位が付加されてもよい。結果として生じたＲＮＡ転写物は、折り畳まれてステム−ループ構造を形成する。
【０１１４】
投与態様：干渉ＲＮＡは、エアロゾル、頬、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮投与などを介して送達されてもよい。
【０１１５】
投与は、眼周囲、結膜、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）、硝子体内、眼内、網膜下、角膜下、眼球後、小菅内または脈絡膜上投与などの眼組織投与により；注射により；カテーテル、または他の配置装置（例えば、網膜ペレット、眼内挿入物、座薬、または、多孔性、無孔性もしくはゼラチン状材料を含む移植片）を用いて眼へ直接適用することにより；局所用点眼薬または軟膏により；または、盲嚢内の、または強膜に近接するか（経強膜的）もしくは眼内に埋め込まれた徐放装置により、眼に直接行ってもよい。眼房内注入（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、角膜を通って前房内に入り、これにより薬剤が小柱網に到達し得る。小菅内注入は、シュレム管から排液させる静脈の採取チャネル内またはシュレム管内に行われてもよい。
【０１１６】
投与は、例えば、局所用点耳薬または軟膏、耳内の、または耳に近接して埋め込まれた徐放装置により、直接耳に行ってもよい。局部投与（ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）としては、耳筋肉内、中耳腔および蝸牛内注入投与経路が挙げられる。更に、中耳／内耳または近隣構造の窓膜に対して、干渉ＲＮＡを染み込ませたゲルフォームまたは同様の吸収性および接着性製品を配置することによって、薬剤を内耳に投与することができる。
【０１１７】
例えば、エアロゾル化調製物を介して、および、吸入器または噴霧器などによる吸入によって肺への直接投与を行ってもよい。
【０１１８】
更なる投与態様としては、錠剤、ピルおよびカプセルが挙げられ、これらはいずれも当業者が処方することができる。
【０１１９】
被験体：ＴＮＦα関連状態の治療を必要としているか、またはＴＮＦα関連状態を発症する危険性がある被験体は、ＴＮＦαに関連する炎症状態を有するもしくはドライアイであるか、またはＴＮＦαに関連する炎症状態もしくはドライアイを発症する危険性があるヒトまたは他の哺乳類である。ＴＮＦαに関連する炎症状態としては、例えば、本明細書中で引用するようなＴＮＦαの望ましくない活性または不適切な活性に付随するアレルギー性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎または喘息が挙げられる。
【０１２０】
ＴＮＦα関連状態に関連する眼の構造としては、眼、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、眼房、硝子体腔、毛様体または眼球後区などが挙げられる。
【０１２１】
このような疾患に関連する耳構造としては、内耳、中耳、外耳、鼓室もしくは鼓膜、蝸牛または耳管などが挙げられる。
【０１２２】
このような疾患に関連する肺構造としては、鼻、口、咽頭、喉頭、気管支、気管、気管分岐部（左右主気管支の開口部を分ける稜線）および肺、特に下肺、例えば細気管支および肺胞などが挙げられる。
【０１２３】
被験体はまた、耳細胞、肺細胞、眼細胞、細胞培養物、器官もしくはエクスビボ器官、または組織であってもよい。
【０１２４】
処方および用量：医薬処方物は、水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理学的に許容可能な担体媒体と混合された最大９９重量％の本発明の干渉ＲＮＡまたはその塩を含む。
【０１２５】
本発明の干渉ＲＮＡは、溶液、懸濁液または乳液として投与される。以下は、本発明によって具現化された可能な処方物の例である。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
【表４】
一般に、本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの有効量は、結果として、１００ｐＭ〜１０００ｎＭ、または１ｎＭ〜４００ｎＭ、または５ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約１０ｎＭの標的細胞表面での細胞外濃度をもたらす。この局所濃度を達成するのに必要な用量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織との間の細胞層の数、送達が局所的であるか全身性であるか、などの要因数に応じて変わる。送達部位での濃度は、標的細胞または組織表面での濃度よりかなり高くてもよい。局所用組成物は、１日に１〜４回、標的器官の表面に送達されるか、または熟練の臨床医の常套判断に従って、毎日、毎週、２週間毎、毎月またはそれ以上などの長期間の送達スケジュールで送達される。処方物のｐＨは約ｐＨ４〜９、またはｐＨ４．５〜７．４である。
【０１２８】
ＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによる患者の治療は、作用期間を増加させ、これにより投薬の頻度を低下させ、かつ患者のコンプライアンスを高めることにより、小分子治療よりも有利であると期待される。
【０１２９】
処方物の有効量は、例えば、被験体の年齢、人種および性別、ＴＮＦα関連状態の重篤度、標的遺伝子転写物／タンパク質代謝回転速度、干渉ＲＮＡの効力および干渉ＲＮＡの安定性などの要因に左右され得る。一実施形態において、干渉ＲＮＡは、標的器官に対して局所的に送達され、治療用量でＴＡＣＥ ｍＲＮＡまたはＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡ含有組織に到達し、これによりＴＮＦα関連プロセスが改善される。
【０１３０】
許容可能な担体：許容可能な担体は、多くてもごく僅かか、全く眼の刺激を引き起こさず、必要であれば好適な保存を付与し、かつ、均一な用量で本発明の１つまたは複数の干渉ＲＮＡを送達する担体を指す。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡを投与するための許容可能な担体としては、陽イオン性で脂質ベースのトランスフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニンまたはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）などの陽イオン性ペプチド；またはリポソームが挙げられる。リポソームは、標準の小胞形成脂質およびステロール、例えばコレステロールなどから形成され、内皮細胞表面抗原などに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体などのターゲッティング部分を含み得る。更に、リポソームはＰＥＧ化リポソームであり得る。
【０１３１】
干渉ＲＮＡは、溶液として、懸濁液として、または、生体内分解性もしくは非生体内分解性送達装置を使用して送達されてもよい。干渉ＲＮＡを、単独で、または規定の共有結合複合体（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の成分として送達することができる。干渉ＲＮＡはまた、陽イオン性脂質、陽イオン性ペプチドまたは陽イオン性ポリマーと共に複合体を形成する；核酸結合特性を有するタンパク質、融合タンパク質またはタンパク質ドメイン（例えば、プロタミン）と共に複合体を形成する；またはナノ粒子内に封入され得る。組織特異的または細胞特異的送達は、抗体または抗体フラグメントなどの適切なターゲッティング部分を包含させることによって達成することができる。
【０１３２】
眼、鼻または肺送達のために、干渉ＲＮＡを、眼科的に、光学的に、または肺が許容可能な防腐剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と併用して、水性殺菌懸濁液または溶液を形成してもよい。生理学的に許容可能な等張水性緩衝液中に干渉ＲＮＡを溶解させることによって、溶液処方物を調製してもよい。更に、溶液としては、阻害剤の溶解を支援する許容可能な界面活性剤が挙げられる。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を本発明の組成物に添加して化合物の保持力を向上させてもよい。
【０１３３】
滅菌軟膏処方物を調製するために、干渉ＲＮＡを、鉱油、液状ラノリンまたは白色ワセリンなどの適切な賦形剤中で防腐剤と併用する。滅菌ゲル処方物は、当技術分野で知られている方法に従って、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）などの組合せから調製した親水性塩基中に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製してもよい。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）を、例えば眼内注射のために使用してもよい。本発明の他の組成物は、干渉ＲＮＡが目的の器官または組織にあまり浸透していない場合、ＣｒｅｍｅｐｈｏｒおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））などの浸透促進剤を含有していてもよい。
【０１３４】
キット：本発明の実施形態は、本明細書において引用されるようなｍＲＮＡの、細胞内における発現を減衰させるための試薬を包含するキットを提供する。キットは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する。ｓｉＲＮＡおよび非ウイルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクターの場合、キットはまた、トランスフェクション試薬または他の好適な送達賦形剤を含有していてもよい。ウイルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクターの場合、キットは、ウイルスベクターおよび／またはウイルスベクター産生のために必要な成分（例えば、パッケージング細胞系、ならびに、ウイルスベクター鋳型と、パッケージング用の付加的なヘルパーベクターとを含むベクター）を含有していてもよい。キットはまた、陽性および陰性対照ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクター（例えば、非ターゲッティング対照ｓｉＲＮＡまたは非関連ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）を含有していてもよい。キットはまた、意図する標的遺伝子（例えば、ウェスタンブロット用の対応するタンパク質に対する標的ｍＲＮＡおよび／または抗体を検出するための定量ＰＣＲ用プライマーおよびプローブ）のノックダウンを評価するための試薬を含有していてもよい。あるいは、キットは、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列と、ｓｉＲＮＡをインビトロ転写により生成するため、またはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するために必要な説明書および材料とを含んでもよい。
【０１３５】
キット形態の医薬的な組合せが更に提供され、これには、容器手段を厳重に閉じ込めて受容するように構成された搬送容器手段と、干渉ＲＮＡ組成物および許容可能な担体を含む第一容器手段とが包装されて組み合わされたものが含まれる。当業者には直ちに明らかであるように、このようなキットは、更に、所望であれば、１つまたは複数の多様な従来の医薬キット構成要素、例えば、１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体を有する容器、追加の容器などを含むことができる。投与すべき成分の量を示す、挿入物またはラベルとしての印刷された説明書、投与のためのガイドラインおよび／または成分を混合するためのガイドラインもまた、キットに含めることができる。
【０１３６】
ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１用干渉ＲＮＡが、ヒトの角膜上皮細胞などにおける外因性ＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１発現レベルをノックダウンさせる能力は、下記のようにインビトロで評価される。形質転換されたヒトの角膜上皮細胞、例えばＣＥＰＩ−１７細胞系（Ｏｆｆｏｒｄら（１９９９年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４０、１０９１〜１１０１頁）を、トランスフェクションの２４時間前に、ＫＧＭケラチノサイト培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）において平板培養する。トランスフェクションは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を使用して、製造業者の指示に従い、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１用干渉ＲＮＡ濃度で行われる。非ターゲッティング対照干渉ＲＮＡおよびラミンＡ／Ｃ干渉ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を対照として使用する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）順方向プライマーおよび逆方向プライマーならびに標的部位を包含するプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などを使用して、トランスフェクションから２４時間後にｑＰＣＲによって標的ｍＲＮＡレベルを評価する。トランスフェクションからおよそ７２時間後（実際の時間はタンパク質の代謝回転速度に応じる）に、ウェスタンブロットなどによって標的タンパク質レベルを評価してもよい。培養細胞からＲＮＡおよび／またはタンパク質を単離するための標準的な技術は、当業者によく知られている。非特異的なオフターゲット効果の可能性を低減するために、所望の標的遺伝子発現ノックダウンレベルを生じる可能な限りの最低濃度のＴＡＣＥまたはＴＮＦＲ１干渉ＲＮＡを使用する。
【０１３７】
当業者は、本明細書の開示に照らし、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に開示される実施形態の明らかな変更を行うことができることを理解するであろう。本明細書に開示される実施形態は全て、本明細書の開示に照らして、過度の実験を行うことなく創出および実行することができる。本発明の全範囲は、本明細書の開示およびその同等な実施形態において明示される。本明細書は、本発明に与えられる保護範囲全体を不当に狭めるものと解釈すべきではない。
【０１３８】
本発明の特定実施形態を示し、説明してきたが、当業者であれば、多数の変形および代替実施形態に想到するであろう。したがって、本発明は添付した特許請求の範囲に関してのみ制限されるものと意図される。
【０１３９】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定形態で実施されてもよい。記載された実施形態は、あらゆる点において、例示としてのみであり、制限的なものとして考えるべきではない。故に、本発明の範囲は、上記説明によってではなく、添付した特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲と同等な意味および範囲内で行う特許請求の範囲に対する変更はいずれもその範囲内に包含されるものとする。更に、本明細書に記載された公開文献、特許および出願はいずれも、その全体が提示されているかのごとく、参照として本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
ＧＴＭ−３細胞においてＴＮＦＲ１を特異的にサイレンシングするための干渉ＲＮＡ
本研究は、ＴＮＦＲ１干渉ＲＮＡが、培養したＧＴＭ−３細胞における外因性ＴＮＦＲ１タンパク質発現のレベルをノックダウンさせる能力を試験するものである。
【０１４１】
ＧＴＭ−３細胞（Ｐａｎｇ， Ｉ．Ｈ．ら、１９９４年、Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． １３、５１〜６３頁）のトランスフェクションを、標準のインビトロ濃度（０．１〜１０ｎＭ）のＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡ、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ 無ＲＩＳＣ ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＣＯＮＴＲＯＬ 非ターゲッティングｓｉＲＮＡ＃２（ＮＴＣ２）およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を用いて遂行した。全てのｓｉＲＮＡを、１×ｓｉＲＮＡ緩衝液、２０ｍＭ ＫＣｌの水溶液、６ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２に溶解させた。対照サンプルは、ｓｉＲＮＡの容量の代わりに、等量の１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（−ｓｉＲＮＡ）を使用した緩衝液対照を含んでいた。抗ＴＮＦＲ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いたウェスタンブロットを行い、ＴＮＦＲ１タンパク質発現を評価した。ＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡは、以下の標的に対して特異的な二本鎖干渉ＲＮＡである：ｓｉＴＮＦＲ１＃１は、配列番号９６が得られる配列
【０１４２】
【化２１】
を標的とし；ｓｉＴＮＦＲ１＃２は、配列番号９７が得られる配列
【０１４３】
【化２２】
を標的とし；ｓｉＴＮＦＲ１＃３は、配列番号９８が得られる配列
【０１４４】
【化２３】
を標的とし；ｓｉＴＮＦＲ１＃４は、配列番号９９が得られる配列
【０１４５】
【化２４】
を標的とする。図１のデータが示すように、ｓｉＴＮＦＲ１＃１、ｓｉＴＮＦＲ１＃２およびｓｉＴＮＦＲ１＃３ｓｉＲＮＡは、対照のｓｉＲＮＡと比較して、１０ｎＭおよび１ｎＭ濃度でＴＮＦＲ１タンパク質発現を著しく低下させたが、０．１ｎＭでの有効性は低下した。ｓｉＴＮＦＲ１＃２およびｓｉＴＮＦＲ１＃３ｓｉＲＮＡは、特に効果的であった。ｓｉＴＮＦＲ１＃４ｓｉＲＮＡもまた、期待したような、ＴＮＦＲ１タンパク質発現が濃度依存的に低下したことを示していた。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、ＴＮＦＲ１ ｓｉＲＮＡ番号１、２、３および４ならびにＲＩＳＣを含まない対照ｓｉＲＮＡを各１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ；非ターゲッティング対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ２）を１０ｎＭ；および緩衝液対照（−ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトしたＧＴＭ−３細胞のＴＮＦＲ１ウェスタンブロットを示す図である。矢印は、５５ｋＤａ ＴＮＦＲ１および４２ｋＤａアクチンバンドの位置を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−４９７２８（Ｐ２０１３−４９７２８Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２７０３４８（Ｐ２０１２−２７０３４８）
【出願日】平成２４年１２月１１日（２０１２．１２．１１）
【分割の表示】特願２００９−５１１２３７（Ｐ２００９−５１１２３７）の分割
【原出願日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【出願人】（５０８１８５０７４）アルコン リサーチ， リミテッド (160)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２７０３４８（Ｐ２０１２−２７０３４８）
【出願日】平成２４年１２月１１日（２０１２．１２．１１）
【分割の表示】特願２００９−５１１２３７（Ｐ２００９−５１１２３７）の分割
【原出願日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【出願人】（５０８１８５０７４）アルコン リサーチ， リミテッド (160)
【Ｆターム（参考）】
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