腫瘍壊死因子α阻害ペプチドおよびその使用方法
本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦアルファもしくはＴＮＦ−α）阻害ペプチドとその調製方法に係わる。本発明は、本発明のＴＮＦ−α阻害ペプチドを含有する医薬組成物、およびＴＮＦ−α媒介炎症性疾患の治療への該組成物の使用にも係わる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性ペプチドとその調製方法に係わる。本発明はさらに、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−αもしくはＴＮＦアルファ）阻害ペプチドとその調製方法に係わる。本発明は、上記のようなペプチド分子を含有する医薬組成物、並びに慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病および敗血症などの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−αもしくはＴＮＦアルファ）媒介炎症性疾患の治療への該組成物の使用にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、活性化された免疫細胞、すなわちＢ細胞、Ｔ細胞並びに単球およびマクロファージによって産生される一群のシグナルタンパク質である。サイトカインにはインターロイキンファミリー（ＩＬ−１〜２３）、インターフェロン（α、βおよびγ）、並びにＴＮＦ−αおよびβが含まれる（非特許文献１および２）。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは敗血症、ＲＡなどの自己免疫性状態、皮膚疾患、炎症性腸疾患といった疾病における炎症応答の主要メディエーターとして重要な役割を果たすことが示唆されている（非特許文献３〜７）。またサイトカイン調節研究により、ＴＮＦ−αが炎症性病態を惹起する最も重要なサイトカインであることも示唆されている（非特許文献８）。
【０００３】
ＴＮＦ−αは元来、マウスの腫瘍に出血性壊死を引き起こす分子として発見された（非特許文献９）。その後、「カケクチン」として知られ、悪液質状態の誘因と考えられた血清タンパク質についての一連の研究から、カケクチンはＴＮＦ−αと同じものであることが最終的に判明した（非特許文献１０）。ＴＮＦ−αは今や、広範な活性を有し、様々な臨床状態に関与する炎症メディエーターとして確立されている。
【０００４】
ＴＮＦ−αは、数種の細胞、特に活性化されたマクロファージによって産生される分子量１７ｋＤａのタンパク質である。ＴＮＦ−αは始め、安定な三量体に構成された膜貫通タンパク質として合成される。次いで、メタロプロテアーゼＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）により切断されてホモ三量体の可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）となり、遍在発現したそのコグネイト受容体（ＴＮＦ ＲＩ、ｐ５５、およびＴＮＦ ＲＩＩ、ｐ７５）に結合する。細胞特異的なエフェクターを伴ったＴＮＦ受容体の遍在発現は、ＴＮＦ−αに媒介される細胞応答がきわめて様々であることを説明するものであり、そのような応答の幾つかは有害で、命に関わる。単核細胞から離脱したＴＮＦ受容体は掃討作用によって、また天然の阻害剤として作用することによってＴＮＦ−α濃度を低下させる。
【０００５】
ＴＮＦ−αはきわめて様々な細胞応答を誘発し、その多くは有害な結果をもたらす。例えば、ＴＮＦ−αは、食欲不振に起因する不十分な摂食に伴う脂肪の減少および全身のタンパク質の枯渇から帰結する状態である悪液質を誘発する。悪液質は癌患者に普通に認められ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者でも観察されている。加えて、動物にＴＮＦ−αを大量に注射すると、敗血症性ショック症状の殆どが発現する。多発性硬化症および慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、過敏症、免疫複合体病および移植片対宿主病、並びに移植拒絶反応においてＴＮＦ−αが役割を有することも示されている。ＴＮＦ−αはマラリアおよび肺線維症とすら関連付けられている。従って、疾病状態におけるＴＮＦ−α産生の阻止を目差すことには多大の関心が寄せられており、その達成は治療上有益である。
【０００６】
ＴＮＦ関連疾患の治療
ＴＮＦ−αの副作用を打ち消す方法としては、抗ＴＮＦ抗体および可溶性ＲＮＦ−Ｒの使用が注目されている。動物モデルでは、ＴＮＦ−α関連炎症性疾患の治療にＴＮＦ−α特異的な抗体が有効であった（非特許文献１１〜１３）。抗ＴＮＦ抗体のキメラ形態がヒトでの臨床試験用に構築された（非特許文献１４〜１６）。さらに、可溶性ＴＮＦ受容体融合タンパク質がＴＮＦ拮抗薬としてヒトの患者に導入された（非特許文献１７〜１９）。
【０００７】
特許文献１は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子の結合ループから設計される環状ペプチドおよびペプチド類似体に係わり、それらのペプチドおよびペプチド類似体はＴＮＦ−αとＴＮＦ受容体との相互結合作用に干渉してｉｎ ｖｉｔｒｏ、並びにｉｎ ｖｉｖｏで阻害活性を示し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦの望ましくない生物活性に拮抗する。この文献に記載された発明では環化ペプチドが好ましく、なぜならタンパク質−タンパク質相互作用ではループおよびターンが機能上重要な役割を果たすからである。具体的な実施形態ではＴＮＦ−Ｒ ｐ５５の三つの結合ループから環状ペプチドが設計され、それらのペプチドはＴＮＦ−αと結合して、ＴＮＦ−αがその細胞受容体に結合するのを阻害する。最も好ましい実施形態において、ペプチドは少なくとも７個のアミノ酸を有し、より小形の直鎖状ペプチドがＴＮＦ−α阻害剤として有用であり得るとの示唆は無い。
【０００８】
特許文献２は、ＴＮＦ−αとＴＮＦ受容体との結合およびＴＮＦ−α機能を有効量の阻害ペプチドの投与によって阻害する方法に係わる。この特許は、ＴＮＦ受容体と結合し、それによってＴＮＦ−αの、細胞上のＴＮＦ−α受容体に結合してこれを活性化する能力を妨げるペプチドに係わる。特許された発明は特に、７個、および１２個のアミノ酸残基を有するペプチドをＴＮＦ−αとＴＮＦ受容体との結合およびＴＮＦ機能の阻害に使用する方法に係わる。特許文献２に記載された発明は、ＴＮＦ受容体に結合し得る小形ペプチドをスクリーニングすることを目的とする。同定された分子で最も小形のものは７アミノ酸長の配列を有する。より小形のペプチドがＴＮＦ−α阻害剤として有用であり得るとの示唆は無い。
【０００９】
特許文献３は尿由来のＴＮＦ阻害ペプチドに係わる。この特許は、ＴＮＦ−αに対して活性である精製形態のＴＮＦ阻害剤にも係わる。また、ＴＮＦに対して活性を示す医薬製剤として有用である精製形態のＴＮＦ阻害剤にも係わる。この特許はさらに、その精製形態において得られた３０ｋＤａタンパク質および４０ｋＤａタンパク質に係わる。開示されたこれらのタンパク質のアミノ酸配列は１５アミノ酸以上の長さを有し、より小形のペプチドがＴＮＦ−α阻害剤として有用であり得るとの示唆は無い。
【００１０】
特許文献４は、グリシン、アラニンおよびセリンから成る群から選択された少なくとも１種のアミノ酸またはその生理学的に許容される塩を、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）濃度が生理的恒常性および局所的炎症を媒介する濃度を上回る患者のＴＮＦ濃度を低下させる医薬または栄養製剤の調製に使用する方法に係わる。この特許は、ＴＮＦ濃度の低下がマクロファージ型細胞によるＴＮＦ産生、マクロファージ型細胞によるＴＮＦ放出、またはＴＮＦ受容体によるＴＮＦの結合を阻害もしくは低減することにより可能であることを開示している。この特許は、ＴＮＦ濃度を低下させる医薬または栄養製剤の調製にグリシン、アラニンおよびセリンのみを使用する方法に係わるものである。この特許は複数のアミノ酸の組み合わせやそのような組み合わせを含むペプチドを使用する方法は一切開示していない。
【００１１】
特許文献５は、ヒトＴＮＦ−αの複数の分子表面から成る群から選択された少なくとも一つのヒトＴＮＦ−α分子表面に実質的に類似する分子表面を有するＴＮＦ−α拮抗化合物に係わる。この文献に記載された発明の化合物は、両端に結合した連結部分と、スペーサー部分とを有する。発明化合物によって、２５個のアミノ酸並びに連結部分およびスペーサー部分を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドが開示されている。特許文献５に記載されたＴＮＦ−α拮抗化合物はＴＮＦ ｐ５５受容体および／またはＴＮＦ ｐ７５受容体に結合し、ＴＮＦ−αに媒介される細胞毒性を阻害する。特許文献５はスペーサー部分を有しない、より小形のペプチドを示唆してはいない。
【００１２】
当該技術分野で現在使用可能な治療薬は、可溶性ＴＮＦ受容体または抗ＴＮＦモノクローナル抗体の使用によってＴＮＦ−αを中和するべく設計されている（非特許文献２０および２１）。可溶性ＴＮＦ受容体や抗ＴＮＦモノクローナル抗体は循環するＴＮＦ−αと結合し、それによって、ＴＮＦ−αが細胞表面のＴＮＦ−Ｒへアクセスし、その後炎症経路を活性化するのを制限する。ＴＮＦ−α濃度の抑制に使用可能な治療薬は、（１）インフリキシマブ（レミケード）： マウス−ヒトキメラ型抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体、（２）ヒュミラ： 完全ヒト型抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、（３）エタネルセプト： ヒトＩｇＧのＦｃ領域と融合した可溶性ｐ７５ ｓＴＮＦ−ＲＩＩの二量体融合タンパク質である。これらの分子は様々な自己免疫疾患で効力を示すものの、幾つかの制約、すなわち低いバイオアベイラビリティーおよび安定性、重篤な免疫反応の誘発、並びに高いコストを伴う。ＴＮＦ−α活性の阻害には別の手段を講じることが妥当であろう。
【００１３】
抗ＴＮＦ抗体やＴＮＦ受容体の配列を利用して生物活性ペプチドフラグメントが合成されている（非特許文献２２〜２４）が、それらは大形で、難溶性である。このことは、恐らくは小形分子の形態を取る改良されたＴＮＦ−α阻害化合物の必要性を強調している。
【００１４】
１９９７年に為された上記のような合成の一研究においてＴａｋａｓａｋｉ等は、ＴＮＦ−ＲＩの三つの結合ループから設計されるペプチド類似体について検討した（非特許文献２５）。結合ループを構成するアミノ酸配列に基づいて複数のペプチドが作製された。それらのペプチド配列の中で、ＴＮＦ−ＲＩのドメイン３のループ１（残基１０７〜１１４）に基づく環状ＷＰ９（配列ＷＳＥＮＬ）がＴＮＦ−α阻害活性に関して最も有望であることが判明した。Ｔａｋａｓａｋｉ等はＷＰ９の配列ＷＳＥＮＬを鋳型として用いて、環状ペプチド模倣体ＷＰ９Ｑ、ＷＰ９ＥＬＹ、ＷＰ９ＹおよびＷＰ９ＱＹを設計した。ペプチド模倣体ＷＰ９ＱＹは治療上の有効性を示し、マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ）の重篤度を低下させた。しかしこの物質は、生理緩衝液に比較的溶解しにくいため、潜在的治療薬としてのヒトへの使用は制限される（非特許文献２５）。Ｔａｋａｓａｋｉ等の１９９７年の研究では、ペプチドの環化および芳香族化によって安定性およびバイオアベイラビリティーは向上したが、溶解性の向上または活性の向上への効果はほとんど、または全く認められなかった。Ｔａｋａｓａｋｉは、ＷＰ９ＱＹは今日までに開発された最小のペプチド模倣体であり、次世代の非ペプチド性阻害剤のためのリード化合物として用いられるかもしれないと述べている。このように、この文献は、当時公知の最小ペプチドに基づき非ペプチド性ＴＮＦ阻害剤の開発を試みることを当業者に示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６，２６５，５３５号
【特許文献２】米国特許第６，３４４，４４３号
【特許文献３】米国特許第６，１４３，８６６号
【特許文献４】米国特許第６，０４８，５４３号
【特許文献５】米国特許第６，１０７，２７３号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｇａｒｌａｎｄ， １９９９
【非特許文献２】Ｒｏｉｔｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｍｏｓｂｙ， ２００２
【非特許文献３】Ｌｏｃｋｓｌｅｙ， Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０４（４）： ４８７−５０１， ２００１
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４： ３９７−４４０， １９９６
【非特許文献５】Ｂｕｃｈａｎ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｏｌ． ７３： ４４９−４５５， １９８８
【非特許文献６】Ｃａｎｔｏ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１９（２）： １５６−１６５， ２００６
【非特許文献７】Ｆａｎｔｕｚｚｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ １２（９）： １０８５−１０９６， ２００８
【非特許文献８】Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． ５８： （Ｓｕｐｐｌ． １）１２７−１３１， １９９９
【非特許文献９】Ｃａｒｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７２： ３６６６， １９７５
【非特許文献１０】Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７： ６２５， １９８９
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ９７８４−９７８８， １９９２
【非特許文献１２】Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： ２０４０， １９９４
【非特許文献１３】Ｓｕｉｔｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９： ８４９， １９９４
【非特許文献１４】Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６： １６４６， １９９６
【非特許文献１５】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７４： ６３， １９９６
【非特許文献１６】Ｔａｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔ． ３９： １０７７， １９９６
【非特許文献１７】Ｐｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４： １４８３， １９９１
【非特許文献１８】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８４： ４３３， １９９５
【非特許文献１９】Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔ． ３９ （Ｓｕｐｐｌ．）： Ｓ７４， １９９６
【非特許文献２０】Ｐｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７７： ５１０−５１４， １９９２
【非特許文献２１】Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３６： １６８１−１６９０， １９９３
【非特許文献２２】Ｗｅｉｓｏｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： ６６０−６６６， ２００６
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ７： １１８１−１１８７， ２００３
【非特許文献２４】Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１６（６）： １５２５−１５３４， ２００６
【非特許文献２５】Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｎｏｖ． １５（１２）： １２６６−１２７０， １９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記背景技術の考察から、生理緩衝液に溶解しやすく、安定性およびバイオアベイラビリティーが高く、僅かな副作用しか有せず、かつ低コストであるペプチドの設計を目差して改良された次世代ＴＮＦ−α阻害剤を開発する必要性は明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体が提供され、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体が提供され、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２０】
本発明は、本発明の生物活性ペプチドをＴＮＦ−α関連疾病状態の治療に使用する方法にも係わる。本発明はまた、本発明の生物活性ペプチドを含有する医薬組成物にも係わる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ペプチドの抗ＴＮＦ−α活性をＬ９２９バイオアッセイを用いて示したグラフである。Ｘ軸上の数字１〜１０は配列番号１〜１０のペプチドを意味する。Ｙ軸はＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害パーセンテージを、各々二重に行なわれた３回の独立した実験の平均値±ＳＥとして表わす。Ｘ軸上の「＋ｖｅ」は陽性対照、すなわち公知のＴＮＦ−α阻害ペプチドである環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）を意味する。
【図２】図２は、配列番号２および６の直鎖状ペプチドと、配列番号９および１０の環状ペプチドと、陽性対照すなわち環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ペプチドとをＴＮＦ−αに誘発される細胞毒性の阻害について比較したグラフである。結果はＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害パーセンテージの、各々三重に行なわれた３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして示されている。
【図３】図３は、配列番号６のペプチドおよびエタネルセプト（Ｅｔ）によるＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害を比較したグラフである。結果はＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害パーセンテージの、各々三重に行なわれた２回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして示されている。
【図４】図４は、ペプチドとＴＮＦ−αとの結合のフローサイトメトリーによる定量を示すグラフである。配列番号２および６のペプチドの存在下でのＴＮＦ−αと細胞受容体との結合の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析結果を図４ａに示す。Ｙ軸はＴＮＦ−ＲＩ発現に関して陽性である細胞のパーセンテージを、３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして表わす。棒グラフ（図４ａ）のＸ軸上、およびフローサイトメトリーヒストグラム（図４ｂ）中の数字１〜５の意味は次のとおりである。 １＝二次抗体としての抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ２＝マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ３＝組み換えＴＮＦ−αで処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ４＝組み換えＴＮＦ−αと配列番号２との複合体で処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ５＝組み換えＴＮＦ−αと配列番号６のペプチドとの複合体で処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。
【図５】図５は、配列番号６のペプチドとＵ９３７細胞上に発現したＴＮＦ−Ｒ１との結合を示すグラフである。配列番号６のペプチドと、Ｕ９３７細胞上に発現したＴＮＦ−ＲＩとの結合の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析結果を図５に示す。Ｙ軸はＴＮＦ−ＲＩ発現に関して陽性である細胞のパーセンテージを、２回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして表わす。棒グラフのＸ軸上、および重畳表示されたフローサイトメトリーヒストグラム（図５）中の数字は以下の試料を意味する。 １： 未処理のＵ９３７細胞。 ２： Ｕ９３７細胞＋ＴＮＦ−α。 ３： Ｕ９３７細胞＋配列番号６のペプチド。
【図６】図６は、媒体（ＣＦＡ）マウス、対照（ＰＢＳ）マウス、およびコラーゲン免疫マウスの血清からの抗コラーゲンＩｇＧ濃度の推定を示すグラフである。
【図７】図７は、コラーゲン誘発関節炎のマウスモデルにおいて、異なる用量および投与スケジュールで用いられる配列番号６のペプチドでの処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた右足根骨部位での足の太さ（ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の平均値を示すグラフである。動物群はそれぞれ４匹または５匹の動物から成っていた。Ｙ軸上の値は、群毎に得られる足の太さの平均値±ＳＥである。Ｘ軸上のアルファベットは動物群を意味する。 Ａ： １．２５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週間に３回投与し、その後毎週１回の投与を３週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｂ： ２．５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週間に３回投与し、その後毎週１回の投与を３週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｃ： ５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週間に３回投与し、その後毎週１回の投与を３週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｄ： ７．５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、毎週１回の投与を４週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｅ： ７．５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週目に１回投与し、３週間後に２回目の投与を行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｆ： 対照としてのＰＢＳで処理した関節炎マウス群。 Ｇ： 対照動物群、すなわち健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの群。 処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図８ａ】図８ａは、配列番号６のペプチド、配列番号２のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）での処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた左足根骨および右足根骨部位での足の太さの平均値±ＳＥを示すグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされ、また図中「対照」とは健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウスのことである。処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、配列番号６のペプチド、配列番号２のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）で処理した動物における処理後の抗コラーゲンＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を比較したグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされ、また図中「対照」とは健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウスのことである。処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図９ａ】図９ａは、配列番号６のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）での処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた右足根骨および右関節部位での足の太さの平均値を示すグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされる。動物群はそれぞれ３匹の動物から成っていた。
【図９ｂ】図９ｂは、アジュバント誘発関節炎のラットモデルにおいて、配列番号６のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）での処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた臨床スコアを比較したグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされる。動物群はそれぞれ３匹の動物から成っていた。処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図１０】図１０は、配列番号６のペプチド、エタネルセプト（Ｅｔ）、および陰性対照としてのＰＢＳでの処理の前後に関節炎ラットにおいて撮影した足および関節の腫脹の代表的な写真を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸はTryを含む群から選択され得る。
【００２３】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２４】
本発明はまた、ＴＮＦ−α阻害剤として作用する生物活性ペプチドに係わる。本発明による生物活性ペプチドは、例えば下記のような機構により作用し得るが、これらに限定はされない。
ａ） 本発明のペプチドはＴＮＦ−αと結合して複合体を形成し、それによってＴＮＦ−αと受容体ＴＮＦ−Ｒ１との結合を防止することができる。
ｂ） 本発明のペプチドは直接受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合することができ、ＴＮＦ−αが受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合するのを防止することができる。
【００２５】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を含有する医薬組成物にも係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２６】
本発明はさらに、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２７】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００２８】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００２９】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を含有する医薬組成物に係わる。
【００３０】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法に係わる。
【００３１】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３２】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３３】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された単一のアミノ酸残基である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３４】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された単一のアミノ酸残基である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３５】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３６】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３７】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物に係わる。
【００３８】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法に係わる。
【００３９】
本発明はさらに、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００４０】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わる。
【００４１】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物にも係わる。
【００４２】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わる。
【００４３】
本発明はさらに、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００４４】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わる。
【００４５】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物にも係わる。
【００４６】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わる。
【００４７】
本発明はさらに、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００４８】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わる。
【００４９】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物にも係わる。
【００５０】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わる。
【００５１】
本明細書中に用いた「ペプチド」という語は、ペプチド結合で連結された複数の天然アミノ酸サブユニットから成る重合体を意味する。アミノ酸という語は、天然ペプチドに類する部分を有するが、非天然部分も有する成分を意味する場合も有る。すなわち、ペプチドは改変されたアミノ酸や結合を有し得る。生物活性ペプチドという語は、哺乳動物への投与時所与の種類／量の薬理学的または生物学的効果を発揮するペプチドを意味する。
【００５２】
本明細書中に用いた「アミノ酸／アミノ酸残基」という語は、遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、遺伝的にコードされない天然アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、もしくは前記いずれかのＤ−鏡像異性体、またはその製薬学的に許容される塩／誘導体を意味し得る。本明細書中、遺伝的にコードされる２０種のＬ−アミノ酸、およびコードされない一般的なアミノ酸の表記には次のような通常の略号が適用されている。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【００５５】
本発明の範囲内に含まれるペプチドは、指定されたクラスのアミノ酸残基に関して部分的に規定される。アミノ酸は、主にアミノ酸側鎖の特徴に依存して三つの主要なクラス、すなわち親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸に分類される。これらの主要クラスはさらにサブクラスに分割され得る。親水性アミノ酸には酸性、塩基性または極性側鎖を有するアミノ酸が含まれ、疎水性アミノ酸には芳香族側鎖または非極性側鎖を有するアミノ酸が含まれる。さらに、非極性アミノ酸には特に脂肪族アミノ酸が含まれる。
【００５６】
「疎水性アミノ酸」とは、その側鎖が生理的ｐＨにおいて非荷電であり、かつ水溶液によって反発されるアミノ酸のことである。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸の例にはＩｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌが含まれる。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸の例にはｔ−ＢｕＡが含まれる。
【００５７】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π電子系を有する環（芳香族基）を少なくとも１個含む側鎖を有する疎水性アミノ酸のことである。芳香族基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロおよびアミノ基などの置換基でさらに置換されていてもよい。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸の例にはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが含まれる。遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸で一般的なものとしては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンなどが挙げられる。
【００５８】
「非極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨにおいて通常非荷電であり、かつ極性を有しない側鎖を有する疎水性アミノ酸のことである。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸の例にはグリシン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。コードされない非極性アミノ酸の例にはＣｈａが含まれる。
【００５９】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和の直鎖状、分枝鎖状もしくは環状炭化水素側鎖を有する非極性アミノ酸のことである。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸の例にはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅが含まれる。コードされない脂肪族アミノ酸の例にはＮｌｅが含まれる。
【００６０】
「親水性アミノ酸」とは、その側鎖が水溶液によって誘引されるアミノ酸のことである。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸の例にはＳｅｒおよびＬｙｓが含まれる。コードされない親水性アミノ酸の例にはＣｉｔおよびｈＣｙｓが含まれる。
【００６１】
「酸性アミノ酸」とは側鎖ｐΚ値が７未満の親水性アミノ酸のことである。酸性アミノ酸は典型的には、生理的ｐＨにおいて水素イオンが失われることに起因して負に荷電される側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸の例にはアスパラギン酸（アスパルタート）およびグルタミン酸（グルタマート）が含まれる。
【００６２】
「塩基性アミノ酸」とは、側鎖ｐΚ値が７より大きい親水性アミノ酸のことである。塩基性アミノ酸は典型的には、生理的ｐＨにおいてヒドロニウムイオンとの会合に起因して正に荷電される側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸の例にはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸の例には非環状アミノ酸のオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、およびホモアルギニンが含まれる。
【００６３】
「極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨにおいて非荷電であるが、２個の原子に共有された電子対が一方の原子により近接して保持されている結合を含む側鎖を有する親水性アミノ酸のことである。遺伝的にコードされる極性アミノ酸の例にはアスパラギンおよびグルタミンが含まれる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例にはシトルリン、Ｎ−アセチルリジン、およびメチオニンスルホキシドが含まれる。
【００６４】
「システイン様アミノ酸」とは、その側鎖が別のアミノ酸残基の側鎖とジスルフィド結合などの共有結合を形成し得るアミノ酸のことである。システイン様アミノ酸は典型的には、少なくとも１個のチオール（ＳＨ）基を含む側鎖を有する。遺伝的にコードされるシステイン様アミノ酸の例にはシステインが含まれる。遺伝的にコードされないシステイン様アミノ酸の例にはホモシステインおよびペニシラミンが含まれる。
【００６５】
当業者には理解されようが、上述の分類は絶対的なものではない。アミノ酸によっては上記特徴のうちの二つ以上を具え、従って二つ以上のカテゴリーに包含され得る。例えば、チロシンは芳香環および極性ヒドロキシ基を両方とも有する。すなわち、チロシンは二重の特性を有しており、芳香族アミノ酸と極性アミノ酸との両カテゴリーに含まれ得る。同様に、システインはジスルフィド結合を形成し得るみのでなく、非極性でもある。厳密には疎水性もしくは非極性アミノ酸には分類されないものの、システインは多くの場合ペプチドに疎水性を付与するべく用いられ得る。
【００６６】
本発明のペプチドおよびペプチド類似体を構成し得る一般的なアミノ酸で遺伝的にコードされないものには、β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および他のω−アミノ酸、例えば３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など； α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）； ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）； δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）； Ｎ−メチルグリシンもしくはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）； オルニチン（Ｏｒｎ）； シトルリン（Ｃｉｔ）； ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）； ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）； Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）； フェニルグリシン（Ｐｈｇ）； シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）； ノルロイシン（Ｎｌｅ）； ２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）； ４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））； ２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））； ３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））； ４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））； ペニシラミン（Ｐｅｎ）； １，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）； β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）； メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）； ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）； Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）； ２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）； ２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）； ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））； Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）； ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、およびホモセリン（ｈＳｅｒ）が非限定的に含まれる。これらのアミノ酸も、先に定義したカテゴリーに適宜分類される。
【００６７】
上記遺伝的にコードされる、およびコードされないアミノ酸の分類を次の表２にまとめる。表２は単なる説明用であり、本明細書に開示されたペプチドおよびペプチド類似体を構成し得るアミノ酸残基の網羅的なリストではないと理解されるべきである。本明細書に開示されたペプチドおよびペプチド類似体の作製に有用である他のアミノ酸残基は、例えばＦａｓｍａｎ， ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８９とその引用文献中に見出され得る。本明細書で具体的に言及されていないアミノ酸は、公知の挙動に基づき、および／またはその化学的および／または物理的諸特性を具体的に同定されたアミノ酸と比較することにより上述のカテゴリーに適宜分類することができる。
【００６８】
【表３】
【００６９】
好ましくは、本発明の生物活性ペプチドには以下の配列が非限定的に含まれる。
配列番号１： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＷＳＱ）
配列番号２： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＷＳＬ）
配列番号３： Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＷＱＹ）
配列番号４： Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＳＱＹ）
配列番号５： Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＳＱＬ）
配列番号６： Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＳＮＹ）
配列番号７： Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（ＱＹＬ）
配列番号８： Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＱＮＹ）
配列番号９： 環状Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ ＣＹ（ｃｙ ＷＳＬ）
配列番号１０： 環状Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ ＣＹ（ｃｙ ＳＮＹ）
配列番号１１： Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＷＱＱ）
配列番号１２： Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ（ＷＮＱ）
配列番号１３： Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（ＷＹＱ）
配列番号１４： Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＷＱＬ）
配列番号１５： Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（ＷＮＬ）
配列番号１６： Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（ＷＹＬ）
配列番号１７： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（ＷＳＹ）
配列番号１８： Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＷＮＹ）
配列番号１９： Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＷＹＹ）
配列番号２０： Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＳＳＱ）
配列番号２１： Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＳＱＱ）
配列番号２２： Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ（ＳＮＱ）
配列番号２３： Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＳＳＬ）
配列番号２４： Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（ＳＮＬ）
配列番号２５： Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（ＳＹＬ）
配列番号２６： Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（ＳＳＹ）
配列番号２７： Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（ＳＹＱ）
配列番号２８： Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＳＹＹ）
配列番号２９： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＱＳＱ）
配列番号３０： Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＱＱＱ）
配列番号３１： Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ（ＱＮＱ）
配列番号３２： Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（ＱＹＱ）
配列番号３３： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＱＳＬ）
配列番号３４： Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＱＱＬ）
配列番号３５： Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（ＱＮＬ）
配列番号３６： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（ＱＳＹ）
配列番号３７： Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＱＱＹ）
配列番号３８： Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＱＹＹ）
【００７０】
より好ましくは、本発明の生物活性ペプチドにはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＳＮＹ）すなわち配列番号６、およびＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＷＳＬ）すなわち配列番号２が非限定的に含まれる。
【００７１】
本発明のペプチドは直鎖状であっても環状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。
【００７２】
公知のＴＮＦ−α阻害活性を有するペプチド配列である環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ ＣＹ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究でのＴＮＦ−α拮抗活性評価に陽性対照として用いた。
【００７３】
本発明によるペプチドの表記において、アミノ酸残基Ｘｎ間の記号「−」は通常、骨格を成すアミノ酸同士の結合を表わす。従って、記号「−」は普通アミド結合（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）を表わす。しかし、具体的な実施形態として本明細書に開示されたペプチドのいずれにおいても、場合によっては１個以上のアミド結合を他の結合、好ましくは置換アミド結合、またはアミド結合の同配体に置き換えてもよいと理解されるべきである。
【００７４】
（本明細書中に用いた）「ＴＮＦアルファ」という語と「ＴＮＦ−α」という語とは同じもの、すなわちＴＮＦアルファもしくは腫瘍壊死因子αを意味する。
【００７５】
本発明のペプチドは、当該技術分野で公知のいずれの方法で合成してもよい。好ましい一法として、本発明の新規なペプチドを、１．００ ｍｍｏｌスケールにおいて自動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４３３Ａ型ペプチドシンセサイザ）上でＦｍｏｃ法を用いる固相法により合成した。ペプチドの構築はＣ末端からＮ末端へと行なった。Ｗａｎｇ樹脂を用いてペプチドを合成した。合成に用いた樹脂は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社から調達したＷａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ）であった（置換率１．２ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）。
【００７６】
合成の際、化学成分を用いてペプチドの反応性側鎖を保護した。Ｎ−末端アミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護した。ロイシンは側鎖を保護せずに用いた。トリプトファンの側鎖はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護した。アスパラギンおよびグルタミンの側鎖はトリチル（ｔｒｔ）で保護した。セリンおよびチロシンは、側鎖をｔ−ブチル（ｔＢｕ）で保護して用いた。システインはＳ−アセトアミドメチル（Ａｃｍ）で保護した。最初のアミノ酸をＷａｎｇ樹脂上に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて導入し、その後無水酢酸を用いてキャップ化を行なった。アミノ酸と樹脂とのカップリングに用いられる活性化試薬には、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＲＵ／ＨＯＢｔ）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）が含まれる。カップリング反応はＮＭＰ中で生起させた。ペプチド鎖の構築完了後、ペプチド−樹脂をメタノールで洗浄し、乾燥した。トリフルオロ酢酸、結晶性フェノール、チオアニソール、エタンジチオールおよび脱イオン水から成る切断用混合物での処理を室温で２〜３時間行なうことにより、ペプチドを樹脂から切り離した。冷乾燥エーテルで沈澱させて粗なペプチドを得た。次に、沈澱物を濾別して水に溶解させ、Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機で凍結乾燥した。このようにして得られた粗なペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２５０×２２．１）逆相カラムを用い、かつ所与の濃度勾配の０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水を用いる分取ＨＰＬＣによって精製した。溶出画分を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２５０×４．６）逆相カラムを用いるＨＰＬＣ分析システム（株式会社島津製作所（日本））で再分析した。アセトニトリルを蒸発させ、画分を凍結乾燥して精製ペプチドを得た。各ペプチドを質量スペクトルによって同定した。
【００７７】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のヨウ素を用いて、樹脂上のペプチドを環化した。樹脂を自動振盪機で穏やかに振盪しながらＤＭＦ中の６倍モル過剰のヨウ素で処理した。反応の進行をＨＰＬＣで監視した。反応完了後、樹脂をＤＭＦ中の０．４Ｍアスコルビン酸でクエンチした。次に、樹脂をＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、数分間真空乾燥した。最後に環化ペプチドを樹脂から切り離し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。粗なペプチドを分取ＨＰＬＣによって精製し、エレクトロスプレー質量分析法で特性解析を行なった。本発明のペプチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーといった、当該技術分野で公知の方法で精製したが、好ましいのはクロマトグラフィーによる方法であった。より好ましくは、本発明のペプチドは、ＲＰ Ｃ−１８カラムを用いる半分取型Ｓｈｉｍａｔｚｕ ＨＰＬＣシステムで精製される。実際に用いられる諸条件は、正味荷電、疎水性、および親水性などの要因に依存する。
【００７８】
本発明のペプチドは、質量分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電集束法、２Ｄ−電気泳動、クロマトグラフィー、ゲル濾過（大きさに基づく分離）、イオン交換（電荷に基づく分離）、配列決定、プロテアーゼ特異性測定、ＨＰＬＣ、Ｘ線結晶解析法といった、当該技術分野で公知の方法で分析され得る。好ましい一法として、本発明のペプチドを質量分析法で分析した。
【００７９】
ペプチドの純度は、当該技術分野で公知であるいずれの方法でも測定可能である。ペプチドの純度を逆相ＨＰＬＣで測定した。本発明のペプチドを純度について分析した。本発明のペプチドは比較的高い純度を有する。
【００８０】
本発明のペプチドは水や、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＤＭＳＯ含有ＰＢＳといった生理的緩衝液に可溶である。
【００８１】
本発明によるＴＮＦ−α阻害剤は、正常で健康な被検者における濃度を上回る濃度で存在するＴＮＦ−αに関連する病態もしくは状態の治療に有用である。そのような病態には、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および乾癬など、急性および慢性の免疫性および自己免疫性病態； 悪液質を含めた敗血症症候群； 急性または慢性細菌感染が原因の循環虚脱及びショック； 細菌感染、ウイルス感染、および真菌感染を含めた急性および慢性の寄生または感染プロセス； クローン病、およびＴＮＦ−α分泌腫瘍を伴う悪性病態が非限定的に含まれる。
【００８２】
製剤化および投与経路
本発明の化合物は被検者に対してそのまま投与しても、医薬組成物の形態で投与してもよい。本発明のペプチドを含有する医薬組成物は、通常の混合法、溶解法、顆粒化法、糖剤形成法、湿式粉砕法、乳化法、カプセル封入法、捕捉法、または凍結乾燥法によって製造され得る。医薬組成物は、活性なペプチドまたはペプチド類似体を医薬として用い得る製剤へと加工することを容易にする、生理学的に許容されるキャリヤー、稀釈剤、添加剤または補助剤を１種以上用いて通常のように製剤化され得る。適正な製剤化は選択された投与経路に依存する。
【００８３】
適当な製薬用キャリヤーは、当該技術分野での標準的な参考文献であるＡ．Ｏｓｏｌ編Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、活性物質が哺乳動物の体内においてその物質の作用部位に到達することを可能にするいずれの手段で投与されてもよい。本発明のペプチドは、当該技術分野で公知であるいずれの投与経路からも投与され得る。様々な経路からの投与には、局所投与、非経口投与、経粘膜投与、経口投与、口腔内投与、直腸内投与、吸入投与、鼻腔内投与、膣内投与、および舌下投与が非限定的に含まれる。
【００８５】
局所投与用としては、本発明のペプチドは当該技術分野で良く知られている溶液剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、懸濁剤などに製剤化され得るが、これらに限定はされない。
【００８６】
全身用製剤は、注射、例えば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射または腹腔内注射による投与用に設計された製剤、および経皮投与、経粘膜投与、経口投与または肺内投与用に設計された製剤を包含する。
【００８７】
注射用としては、本発明のペプチドは水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液といった生理学的に適合する緩衝液中に製剤化され得る。溶液は懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの剤形維持剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を含有してもよい。
【００８８】
あるいは他の場合には、ペプチドを用時適当な賦形剤、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成される散剤の形態としてもよい。
【００８９】
経粘膜投与用製剤には、透過するべき関門に適した浸透剤が用いられる。そのような浸透剤は通常、当該技術分野で公知である。
【００９０】
経口投与用製剤は、活性ペプチドを製薬学的に許容される、当該技術分野で公知のキャリヤーと配合することにより容易に製造できる。キャリヤーは本発明のペプチドを、治療される患者の経口摂取用に錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤化することを可能にする。
所望であれば、固形製剤を標準的な方法で被覆してもよい。
【００９１】
例えば懸濁剤、エリキシル剤および溶液剤などの経口液剤に好適なキャリヤー、添加剤または稀釈剤には、水、グリコール、油、アルコール等が含まれる。着香料、防腐剤、着色料などを添加することも可能である。
【００９２】
口腔内投与用には、ペプチドは通常のように製剤化されて錠剤、トローチ剤等の形態を取り得る。
【００９３】
吸入投与用に本発明により用いられるペプチドは、適当なプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いた加圧パッケージまたはネブライザーから噴霧エアゾール剤の形態で好適に送出される。加圧エアゾール剤の場合、単位用量は、バルブを設けて所定量を送出することにより決定され得る。化合物と、乳糖やデンプンといった適当な粉末状基剤とを混合した粉末混合物を収容した、例えばゼラチン製のカプセルやカートリッジを吸入器またはインサフレーター用に調製してもよい。
【００９４】
ペプチドを、例えばカカオ脂や他のグリセリドなど、通常の坐剤用基剤を含有する坐剤や停留浣腸剤などの直腸内または膣内投与用製剤とすることも可能である。
【００９５】
上述の諸製剤に加え、ペプチドをデポー剤に製剤化することも可能である。この持続性製剤は埋め込み（例えば皮下または筋肉内埋め込み）によってか、または筋肉内注射によって投与され得る。従ってペプチドは、例えば適当なポリマーまたは疎水性材料を用いて（例えば許容される油を分散媒とした乳剤に）製剤化しても、イオン交換樹脂を用いて製剤化しても、あるいはまたやや難溶の誘導体、例えばやや難溶の塩として製剤化してもよい。
【００９６】
上記以外の医薬送達系を採用することも可能である。本発明のペプチドおよびペプチド類似体の送達に用い得る送達媒体の良く知られた例に、リポソームおよび乳剤が有る。ジメチルスルホキシドなど、幾つかの有機溶媒も用い得るが、通常比較的高い毒性という不都合を伴う。ペプチドの送達には持続放出システムも用い得る。様々な持続放出性材料が確立されており、それらは当業者に良く知られている。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性次第では、タンパク質安定化のための付加的な方策を用いてもよい。
【００９７】
本発明によれば、製薬学的に許容される塩および誘導体とは、遊離塩基の生物活性を実質的に保有する塩および誘導体のことである。製薬学的に許容される塩および誘導体には、当業者によって製造され得る塩および誘導体が含まれる。
【００９８】
本発明のペプチドは通常、所期の目的の達成に有効な量で用いられる。ＴＮＦ関連疾患の治療または予防のための使用では、本発明のペプチドまたはその医薬組成物は治療有効量で投与または適用される。治療有効量とは、症状の改善もしくは予防、または治療される患者の延命に有効な量のことである。治療有効量は、特に本明細書の詳細な開示に照らせば当業者には容易に決定できる。
【００９９】
投与薬剤の用量は、当然ながら、特定薬剤の薬力学特性並びにその投与モードおよび投与経路； 被投与者の年齢、健康状態および体重； 症状の種類および程度、併用治療の種類、治療頻度、並びに所望の効果など、周知の要因に依存して変動する。
【０１００】
初期量は、当該技術分野で良く知られた方法を用いてｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいてヒトへの投与を最適化することは容易に可能である。
【０１０１】
投与量および投与間隔は、ペプチドの血漿中濃度を治療効果の維持に十分なものとするべく個別に調整され得る。注射による投与の場合、患者に対する用量は普通約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。典型的には、１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の量を１日につき複数回（６回）に分けて投与するか、１日１回隔日投与するか、または持続放出形態で投与することが所望の結果を得る上で有効である。病的状態の改善に有効な血漿中濃度を達成するべく投与量および投与間隔を個別に調整してもよい。治療上有効な血清中濃度は、投与を毎日複数回に分けて行なうことによって達成され得る。
【０１０２】
局所投与または選択的摂取の場合、有効な局所的ペプチド濃度は血漿中濃度と関わりが無いかもしれない。当業者であれば、甚だしい実験を行なわなくとも治療上有効な局所投与量を最適化することができる。
【０１０３】
当然ながら、投与されるペプチドの量は、治療される被検者、被検者の体重、疾病の重篤度、投与方法、および処方医師の判断に依存する。
【０１０４】
治療は症状が検出される間、さらには症状が検出されない場合にも断続的に反復され得る。治療は単独で行なっても、他の薬物を併用して行なってもよい。
【０１０５】
本出願明細書中各所で様々な刊行物および特許が引用され、特許はその番号、他の刊行物は著者名および発行年で特定されている。完全な引用文献リストを後段に示す。その結果、本発明の属する分野の技術水準をより十全に説明するべく、引用された刊行物および特許の開示はその全体が援用により本明細書に含まれる。
【０１０６】
本発明をここに詳述したが、用いられた用語は説明のためのものであり、限定のためのものではないと理解されるべきである。
【０１０７】
本発明の様々な改良および変形が上記教示に照らして可能であることは明らかである。従って、添付の請求項の範囲内であれば、本発明は具体的に記載された以外の形態でも実施され得ると理解されるべきである。
【０１０８】
方法概略および結果
【実施例１】
【０１０９】
配列番号６のペプチドの調製方法
実施例１（ａ）―配列番号６のペプチドの合成： ペプチド固相合成法を用い、自動または半自動ペプチド合成装置でＦｍｏｃ化学に則っり配列番号６のペプチドを合成した。Ｗａｎｇ樹脂を用いて合成を行なった。樹脂の置換率は０．６ｍｍｏｌ／ｇから１．２ｍｍｏｌ／ｇまでであった。チロシンおよびセリンの側鎖をｔ−ブチル基で保護し、アスパラギン側鎖をトリチル基で保護した。ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ（３〜５ｅｑ）およびＤＭＡＰ（１〜２ｅｑ）を室温で約５〜８時間用いて、最初のアミノ酸チロシンをＷａｎｇ樹脂上に導入した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを２０〜３０分間用い、Ｎ末端を保護するＦｍｏｃ基を除去して脱保護を行なった。１ｍｍｏｌの反応に１５〜２０ｍｌのＤＭＦを用いた。脱保護したチロシンにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（３〜５ｅｑ）を、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ（３〜５ｅｑ）を室温で約３〜４時間用いることによりカップリングさせた。反応の完了をＫａｉｓｅｒ試験で監視した。Ｋａｉｓｅｒ試験では、青色の消失によってカップリング反応の完了が示される。反応完了後、反応混合物をＤＭＦで３回洗浄した。Ｆｍｏｃ基を上記のように除去して脱保護を行ない、その後反応混合物をＤＭＦで３回洗浄した。上記と同様の操作で、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨをアスパラギンにカップリングさせ、脱保護した。固相上に構築されたペプチドの平均収率は９０〜９５％であった。
【０１１０】
樹脂からのペプチド切断：
ＴＦＡ：フェノール：ＴＩＳ：ＤＩＴ：水を８２．５：５．０：２．５：５．０：５．０の比率で含有する試薬混合物（１５０ｍｌ）を用いてペプチドを樹脂から切り離した。不断の攪拌下、配列番号６のペプチドを担持した樹脂を切断試薬中に氷冷環境下で１５分間維持し、次いでやはり不断の攪拌下に室温で２時間維持した。反応完了後、混合物を焼結漏斗で濾過し、濾液に冷ジエチルエーテルを添加することによってペプチドを沈澱させた。
沈澱したペプチドを焼結漏斗で濾過し、乾燥し、水に溶解させ、最後に凍結乾燥して粗なペプチドを得た。粗ペプチド収率は８５〜９０％であった。
【０１１１】
ペプチドの精製：
粗なペプチドを、溶離剤としてアセトニトリルおよび水を用いる分析用ＨＰＬＣで分析した。Ｃ−１８分取カラム（２５０×５０ｍｍ、１０μ）を用いるＨＰＬＣ ＬＣ−８Ａ装置（島津製作所）において粗ＢＲＣ６０５−１の精製を、流速８０〜１２０ｍｌ／分、検出波長２１０ｎｍで行なうアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）−水（０．１％ＴＦＡ）混合物での定組成溶離によって実施した。精製画分を分析用ＨＰＬＣで分析して所望の画分をプールし、凍結乾燥し、特性解析を行なった。この方法による総収率は７０％を越えることが判明した。
【０１１２】
ペプチドの特性解析：
ＭＳ分析―配列番号６のペプチドの全バッチについて、質量スペクトル分析による特性解析を行なった。各バッチの分子質量は３８３．５となる（陽性モード）。
ペプチド配列決定―配列番号６のペプチドの全バッチについて、ペプチド配列決定による特性解析を行なった。各バッチのペプチド配列は実際の配列を与える。
【実施例２】
【０１１３】
Ｌ９２９細胞のＴＮＦ−α媒介細胞毒性のペプチド配列による阻害
マウス線維芽細胞系Ｌ９２９を用いて、本発明のペプチドをＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害について分析した。Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ）にＴＮＦ−αを添加すると細胞毒性が誘発され、そのことは、生細胞をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール系）やクリスタルバイオレットといった生体用色素で染色し、その後色素をメタノールで抽出することによって推定できる。抽出した色素の吸光度は５９５ｎｍで測定し得る（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １１９： ２０３−２１０， １９８９）。アッセイは下記のように行なった。
【０１１４】
Ｌ９２９細胞（１０％ＦＣＳを補充したダルベッコ変法イーグル培地中に維持）をマイクロタイタープレートに２×１０５細胞／ｍｌの密度で播種し、濃度１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（ＡＣＴ−Ｄ）の存在下、３７℃および５％ＣＯ２において２時間インキュベートした。７５μＭのペプチド溶液と共に３７℃でプレインキュベートしたＴＮＦ−α（１００ｐｇ／ｍｌ）をＬ９２９細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。
【０１１５】
環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ペプチドを、ＴＮＦ関連細胞毒性の阻害を推定するための陽性対照として用いた。陽性対照ペプチド溶液（７５μＭ）と共に３７℃でプレインキュベートしたＴＮＦ−α（１００ｐｇ／ｍｌ）を別のウェル内のＬ９２９細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。
【０１１６】
試験プレートおよび陽性対照プレートの生細胞を１００μｌ／ウェルの０．０５％クリスタルバイオレットで染色し、室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、かつ室温で一晩乾燥した。クリスタルバイオレットを１００μｌ／ウェルのメタノールで細胞から抽出し、抽出したクリスタルバイオレット色素の吸光度を５９５ｎｍで測定した。細胞毒性の阻害パーセンテージを式：
［（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤＴＮＦ）／（ＯＤｃｔｒｌ−ＯＤＴＮＦ）］×１００
によって算出した。
ＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害の評価は、本発明のペプチドを７５μＭの濃度で用いて行なった。
【０１１７】
実施例２（ａ）：
配列番号１〜１０のペプチドをＴＮＦ−α誘発細胞毒性の阻害について分析した。配列番号１、２、６および８のペプチドはＴＮＦ−α誘発細胞毒性を陽性対照よりも強く阻害した。配列番号１、２、６および８のペプチドのＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害率（各々二重に行なわれた複数回の実験に基づき算出された阻害率（％）の平均値±ＳＥ）はそれぞれ６５±９．２％、４８±６％、６２±６．２％、および５１±２．３％であった。
【０１１８】
実施例２（ｂ）―配列番号２および６のペプチドの直鎖状および環状形態の、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力の比較：
配列番号２および６の直鎖状ペプチド並びに配列番号９および１０の環状ペプチドを分析して、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力を比較した（分析方法は上述したとおり）。配列番号９および１０の環状ペプチドより配列番号２および６の直鎖状ペプチドの方が能力の高いＴＮＦ−α誘発細胞毒性抑制物質であることが判明した。図２に示したように、配列番号９および１０の環状ペプチドによる阻害はごく低率であった。
【０１１９】
陽性対照ペプチドすなわち環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）についてもその直鎖状および環状形態を分析し、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力を比較した。興味深いことに逆のパターンが観察され、すなわち、陽性対照ペプチドの環状形態は比較的高いＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害率（６０±１０％）を示したが、陽性対照ペプチドの直鎖状形態はＴＮＦ−α誘発細胞毒性の阻害を有効に惹起しなかった（図２）。
【０１２０】
配列番号２および６の直鎖状ペプチドは、公知のＴＮＦ−α阻害ペプチドである陽性対照の環状形態と同等の高い阻害能力を有することが判明した。
【０１２１】
実施例２（ｃ）―配列番号６のペプチドおよびエタネルセプト（「エンブレル」として市販されている公知のＴＮＦ−α阻害剤）の、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力の比較：
配列番号６のペプチドおよびエタネルセプトを分析して、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力を比較した（分析方法は実施例２において上述したとおり）。配列番号６のペプチドはエタネルセプトに匹敵するＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害能力を有することが判明した（図３）。
【０１２２】
ペプチドの結合に関する研究
ペプチドとＴＮＦ−α、またはＵ９３７細胞（ＴＮＦ受容体発現ヒト白血病細胞系）上のＴＮＦ−Ｒ１との結合を、フローサイトメトリーアッセイ法を用いて調べた。ペプチドとＴＮＦ−αとの結合はＴＮＦ−αとＴＮＦ−Ｒ１との相互作用を妨げ、このことはフローサイトメトリーによって分析することができる。ペプチドが直接ＴＮＦ−Ｒ１に結合することによってＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージが低下することもフローサイトメトリーにより分析可能である。
【実施例３】
【０１２３】
ペプチドによるＴＮＦ−αと細胞上の受容体ＴＮＦ−Ｒ１との結合の阻害
ＴＮＦ−αはＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ）上のコグネイト受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合し、その結果ＴＮＦ−Ｒ１に関して陽性である細胞のパーセンテージは低下する。ＴＮＦ−α結合ペプチドはＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−ＲＩとの相互作用を妨害する。ＴＮＦ−Ｒ１に関して陽性である細胞のパーセンテージは、蛍光色素結合抗ＴＮＦ−ＲＩ抗体での染色によって定量できる。
【０１２４】
配列番号２および６のペプチドを、ＴＮＦ−αとＵ９３７細胞上の受容体ＴＮＦ−Ｒ１との結合の阻害について分析した。配列番号２または６のペプチドによるＴＮＦ−αとＵ９３７細胞上のＴＮＦ−ＲＩとの結合の阻害を蛍光活性化セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（米国）のＦＡＣＳ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を用いて推定した。
【０１２５】
０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．０５％ＮａＮ３（結合緩衝液）を含有するＰＢＳ中にＵ９３７細胞（１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））中に維持）を、緩衝液１００μｌ当たり１×１０５細胞の密度で懸濁させた。上記ペプチド（配列番号２および６）をそれぞれＰＢＳに加えた２種のペプチド溶液（５０μｌ）をＴＮＦ−α（５ｎｇ）と共に別々の試験管に入れ、３７℃で１時間プレインキュベートした。次いで、ペプチドとＴＮＦ−αとの複合体をＵ９３７細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。別の試験管にＵ９３７細胞（１×１０５個）をＴＮＦ−α（５ｎｇ）と共に入れ、４℃で１時間インキュベートした（並列実験）。その後、細胞を結合緩衝液で洗浄し、この細胞に５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のヒト抗マウスＴＮＦ受容体抗体（クローン番号ＨＴＲ−９； Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を４℃で１時間添加した。次に、細胞を結合緩衝液で洗浄し、暗中４℃で３０分間、１０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）のフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で染色した。結合緩衝液で２回洗浄後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。ゲートを生細胞集団に設定し、ペプチドによるＴＮＦ−α／細胞結合の阻害の程度をＴＮＦ−ＲＩ発現陽性細胞のパーセンテージに基づき推定した。
【０１２６】
未処理のＵ９３７細胞は約７８±１％がＴＮＦ−Ｒ１発現に関して陽性であることが判明した。Ｕ９３７細胞をＴＮＦ−αと共にプレインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１発現陽性細胞は３２±１０％に減少した（図４ａおよび４ｂ）。Ｕ９３７細胞を配列番号２のペプチドとＴＮＦ−αとの複合体と共にプレインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１発現陽性細胞の比率は３７±８．５％となった。Ｕ９３７細胞を配列番号６のペプチドとＴＮＦ−αとの複合体と共にプレインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１発現陽性細胞の比率は５７±８％となった（図４ａおよび４ｂ）。
【０１２７】
上記の結果から、配列番号２および６のペプチドがＴＮＦ−αと結合してＴＮＦ−αとＴＮＦ−Ｒ１との結合を防止し、受容体ＴＮＦ−Ｒ１に関して陽性である細胞の減少をＴＮＦ−αが未処理である場合と比較して抑制することは明らかである。
【実施例４】
【０１２８】
フローサイトメトリーによるペプチドとＵ９３７細胞上のＴＮＦ−Ｒ１との結合の評価
Ｕ９３７細胞を用いてペプチドとＴＮＦ−Ｒ１との結合を定量した。Ｕ９３７細胞に添加されたＴＮＦ−αはＵ９３７細胞上のコグネイト受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合し、その結果ＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージは低下する。本発明によるＴＮＦ−α阻害ペプチドはＴＮＦ−Ｒ１に結合し、Ｕ９３７細胞を該ペプチドと共にインキュベートするとＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞が減少する。
【０１２９】
配列番号６のペプチドをＵ９３７細胞上のＴＮＦ−Ｒ１への結合について、フローサイトメトリーを用いて分析した。Ｕ９３７細胞を配列番号６のペプチドと共にインキュベートして、配列番号６のペプチドが直接受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合することを実証した。配列番号６のペプチド（２５０μＭ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ）それぞれと共にインキュベートしたＵ９３７細胞を２回洗浄し、これを４℃で１時間、５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のヒト抗マウスＴＮＦ受容体抗体（クローン番号ＨＴＲ−９； Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で染色した。次に、細胞を結合緩衝液で洗浄し、暗中４℃で３０分間、１０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）のフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で染色した。結合緩衝液で２回洗浄後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。ゲートを生細胞集団に設定し、ＴＮＦ−Ｒ１への結合の程度をＴＮＦ−ＲＩ発現陽性細胞のパーセンテージに基づき推定した。
【０１３０】
８３％のＵ９３７細胞上にＴＮＦ−Ｒ１が発現していることが判明した。Ｕ９３７細胞を組み換えＴＮＦ−α（１０ｎｇ）と共にインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージは３１．６％に低下した。Ｕ９３７細胞を配列番号６のペプチドと共にインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージは３２％に低下した（図５）。ＴＮＦ−Ｒ１発現に関して陽性である細胞のパーセンテージの低下が配列番号６と共にインキュベートしたあととＴＮＦ−αと共にインキュベートしたあととで同等であることが判明したが、このことはペプチドがＴＮＦ−Ｒ１に結合することを明らかに示している。
【実施例５】
【０１３１】
慢性関節リウマチのマウスモデルにおけるペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力
実施例５（ａ）―関節炎マウスモデルの開発： Ｌａｌｒｕに所在するパナセア バイオテックの動物飼育施設から入手した雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて、慢性関節リウマチのマウスモデルを開発した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）中に乳濁させた１５０μｇのトリタイプＩＩコラーゲン（Ｓｉｇｍａ）の皮内注射によってマウスを免疫した。一次免疫後第１７日に、不完全フロイントアジュバントに加えた１００μｇのトリタイプＩＩコラーゲンでの追加免疫を動物に対して行なった（Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２： １５．０．１−１５．０．６； Ｉｎｇｌｉｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４： ６１２−６１８， ２００８）。対照（健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス）と比較しての足の太さ（ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の増加および抗コラーゲンＩｇＧ抗体の存在を、関節炎の発症を評価するパラメーターとした。動物の足の太さはデジタルノギスで測定し、抗コラーゲン抗体は免疫後第３５日にマウス血清中で測定した。
【０１３２】
実施例５（ｂ）―マウス血清中抗コラーゲンＩｇＧ濃度：
トリタイプＩＩコラーゲン（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳに１μｇ／ｍｌの量で加えたものをＥＬＩＳＡプレートに塗布し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、コラーゲン、媒体（ＣＦＡ）、およびＰＢＳ（対照）を注射したマウスから得た血清を別々のウェルに稀釈比１：１００で添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、ウサギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をウェルに稀釈比１：１００００で添加し、室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、基質のＯＰＤ（オルトフェニルジアミン）を添加し、発色を観察した。発色を２Ｎ ＨＣｌで停止させた。４９０ｎｍでの吸光度を記録した（Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２： １５．０．１−１５．０．６）。コラーゲン免疫マウスが示した抗コラーゲンＩｇＧの血清中濃度は媒体（ＣＦＡ）群および対照群（ＰＢＳ注射）と比較して高かった（図６）。
【０１３３】
実施例５（ｃ）―マウスモデルにおける用量および投与スケジュールの最適化：
コラーゲン誘発関節炎のマウスモデル（上述の方法で用意）において、配列番号６のペプチドの最適な用量および投与スケジュールを決定した。関節炎マウスを足の太さに従ってランダム化し、各々４匹または５匹から成る複数の群に分けて、配列番号６のペプチドの静脈内注射を行なった。各群に適用した用量および投与スケジュールを表３に示す。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
用量７．５ｍｇ／ｋｇで４週間毎週１回投与した配列番号６のペプチドは足の太さを、対照動物で観察されたものと比較して僅かに減少させた。また、５ｍｇ／ｋｇの用量、および１週間に３回、その後３週間毎週３回投与するスケジュールで投与した配列番号６のペプチドが足の太さを対照動物のものに比べて有意に減少させることが観察された。従って、用量５ｍｇ／ｋｇで１週間に３回、その後３週間毎週３回投与する投与計画が最適なものとして選択された（図７）。
【０１３６】
実施例５（ｄ）―マウスモデルにおける配列番号６および２のペプチド並びにエタネルセプトの効力の比較：
コラーゲン誘発関節炎のマウスモデル（上述の方法で用意）を用いて、配列番号６および２のペプチドの効力をエタネルセプト（商品名「エンブレル」の下に市販されている認可されたＴＮＦ−α阻害剤）のものと比較した。関節炎マウスに配列番号６および２のペプチド並びにエタネルセプトを用量５ｍｇ／ｋｇで第１週に３回、その後３週間毎週１回静脈内投与した。
【０１３７】
配列番号６のペプチドおよびエタネルセプトの投与は足の太さを、正常な対照動物（対照： 健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス）と同等の太さにまで有意に減少させることが観察された（ｐ＜０．０１）（図８ａ）。配列番号２のペプチドの投与も足の太さを有意に減少させた（ｐ＜０．０５）（図８ａ）。これらの結果は、配列番号２および６のペプチドがエタネルセプトに匹敵する効力を有することを明らかに示している。
【０１３８】
実施例５（ｅ）―配列番号２および６のペプチド並びにエタネルセプトで処理した動物において処理後のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を測定する比較研究：
コラーゲン誘発関節炎の発症には、Ｔｈ１応答もしくは炎症誘発応答の増大が伴う。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ濃度比を測定して、本発明のペプチドおよびエタネルセプトでの処理がマウスモデルにおいて臨床疾患をＴｈ１応答の低下により改善したかどうかを判断した。小さいＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比ほどＴｈ１応答もしくは炎症誘発応答のダウンレギュレーションを示唆することになろう。
【０１３９】
関節炎マウスに配列番号２および６のペプチド、エタネルセプト、並びにＰＢＳを用量５ｍｇ／ｋｇで第１週に３回、その後３週間毎週１回静脈内投与した。配列番号６のペプチドおよびエタネルセプトを投与した場合、処理後のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は未処理の関節炎動物（ＰＢＳ処理動物を未処理動物と見なす）と比較して小さくなった（図８ｂ）。未処理の関節炎動物（ＰＢＳ処理動物を未処理動物と見なす）のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は進行中の炎症に起因して大きかった。このことは、配列番号６のペプチドでの処理が関節炎マウスにおいてＴｈ１応答を低下させ、その結果ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を対照動物（対照： 健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス）のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比に匹敵するほど小さくして症状の寛解をもたらすことを示唆している。
【実施例６】
【０１４０】
アジュバント誘発関節炎のラットモデルにおける配列番号６のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力
配列番号６のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力を「アジュバント」誘発関節炎のラットモデルにおいて評価した。このモデルは抗炎症性薬物の開発及び試験で広く用いられている。ラットにおけるアジュバント関節炎（ＡＡ）はヒトの炎症性関節炎の諸特徴を模倣する（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １１２： ９５−１１０， １９５６）。１５０μｇの完全フロイントアジュバントで皮内免疫を行ない、その後第７日に不完全フロイントアジュバントで追加免疫を行なうことによって雄のＷｉｓｔａｒラットにＡＡを誘発した。動物の関節炎を臨床的スコアリングと、デジタルノギスを用いた足（ｐａｗ）および関節の太さの測定とにより評価した。臨床スコアは以下の基準に従って付与した。
０＝紅斑も腫脹も無し
１＝後肢または前肢の１本の指に僅かな紅斑または腫脹
２＝後肢または前肢の２本以上の指に紅斑および腫脹
３＝足関節または手関節に紅斑および腫脹
４＝後肢または前肢の指および足関節または手関節の全体に紅斑および腫脹が認められ、かつ足関節または手関節が屈曲不能
【０１４１】
関節炎ラットに配列番号６のペプチドを２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、第１週には６日間毎日１回投与し、第２週には１日おきに３回投与した。別の関節炎動物群にはエタネルセプト（Ｅｔ）を同様にして投与した。配列番号６のペプチドを投与した動物においても、エタネルセプトを投与した動物においても、未処理の関節炎ラット（ＰＢＳで処理したラットを未処理の関節炎ラットと見なす）に比べて足の太さが減少した（図９ａ）。配列番号６のペプチドまたはエタネルセプトで処理した場合には臨床スコアの有意な低下も認められた（ｐ＜０．０５）（図９ｂおよび１０）。総体的に、得られた結果は、配列番号６のペプチドが関節炎ラットにおける足の太さの減少や臨床スコアの低下に関してエタネルセプトに匹敵する効力を有することを示唆している（図９ａおよび９ｂ）。
【０１４２】
本明細書および添付の請求項中、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」を付した単数形は、文脈上明らかに別様に解されないかぎり複数形の意味を包含することに留意されたい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性ペプチドとその調製方法に係わる。本発明はさらに、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−αもしくはＴＮＦアルファ）阻害ペプチドとその調製方法に係わる。本発明は、上記のようなペプチド分子を含有する医薬組成物、並びに慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病および敗血症などの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−αもしくはＴＮＦアルファ）媒介炎症性疾患の治療への該組成物の使用にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、活性化された免疫細胞、すなわちＢ細胞、Ｔ細胞並びに単球およびマクロファージによって産生される一群のシグナルタンパク質である。サイトカインにはインターロイキンファミリー（ＩＬ−１〜２３）、インターフェロン（α、βおよびγ）、並びにＴＮＦ−αおよびβが含まれる（非特許文献１および２）。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは敗血症、ＲＡなどの自己免疫性状態、皮膚疾患、炎症性腸疾患といった疾病における炎症応答の主要メディエーターとして重要な役割を果たすことが示唆されている（非特許文献３〜７）。またサイトカイン調節研究により、ＴＮＦ−αが炎症性病態を惹起する最も重要なサイトカインであることも示唆されている（非特許文献８）。
【０００３】
ＴＮＦ−αは元来、マウスの腫瘍に出血性壊死を引き起こす分子として発見された（非特許文献９）。その後、「カケクチン」として知られ、悪液質状態の誘因と考えられた血清タンパク質についての一連の研究から、カケクチンはＴＮＦ−αと同じものであることが最終的に判明した（非特許文献１０）。ＴＮＦ−αは今や、広範な活性を有し、様々な臨床状態に関与する炎症メディエーターとして確立されている。
【０００４】
ＴＮＦ−αは、数種の細胞、特に活性化されたマクロファージによって産生される分子量１７ｋＤａのタンパク質である。ＴＮＦ−αは始め、安定な三量体に構成された膜貫通タンパク質として合成される。次いで、メタロプロテアーゼＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）により切断されてホモ三量体の可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）となり、遍在発現したそのコグネイト受容体（ＴＮＦ ＲＩ、ｐ５５、およびＴＮＦ ＲＩＩ、ｐ７５）に結合する。細胞特異的なエフェクターを伴ったＴＮＦ受容体の遍在発現は、ＴＮＦ−αに媒介される細胞応答がきわめて様々であることを説明するものであり、そのような応答の幾つかは有害で、命に関わる。単核細胞から離脱したＴＮＦ受容体は掃討作用によって、また天然の阻害剤として作用することによってＴＮＦ−α濃度を低下させる。
【０００５】
ＴＮＦ−αはきわめて様々な細胞応答を誘発し、その多くは有害な結果をもたらす。例えば、ＴＮＦ−αは、食欲不振に起因する不十分な摂食に伴う脂肪の減少および全身のタンパク質の枯渇から帰結する状態である悪液質を誘発する。悪液質は癌患者に普通に認められ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者でも観察されている。加えて、動物にＴＮＦ−αを大量に注射すると、敗血症性ショック症状の殆どが発現する。多発性硬化症および慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、乾癬、乾癬性関節炎、過敏症、免疫複合体病および移植片対宿主病、並びに移植拒絶反応においてＴＮＦ−αが役割を有することも示されている。ＴＮＦ−αはマラリアおよび肺線維症とすら関連付けられている。従って、疾病状態におけるＴＮＦ−α産生の阻止を目差すことには多大の関心が寄せられており、その達成は治療上有益である。
【０００６】
ＴＮＦ関連疾患の治療
ＴＮＦ−αの副作用を打ち消す方法としては、抗ＴＮＦ抗体および可溶性ＲＮＦ−Ｒの使用が注目されている。動物モデルでは、ＴＮＦ−α関連炎症性疾患の治療にＴＮＦ−α特異的な抗体が有効であった（非特許文献１１〜１３）。抗ＴＮＦ抗体のキメラ形態がヒトでの臨床試験用に構築された（非特許文献１４〜１６）。さらに、可溶性ＴＮＦ受容体融合タンパク質がＴＮＦ拮抗薬としてヒトの患者に導入された（非特許文献１７〜１９）。
【０００７】
特許文献１は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子の結合ループから設計される環状ペプチドおよびペプチド類似体に係わり、それらのペプチドおよびペプチド類似体はＴＮＦ−αとＴＮＦ受容体との相互結合作用に干渉してｉｎ ｖｉｔｒｏ、並びにｉｎ ｖｉｖｏで阻害活性を示し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦの望ましくない生物活性に拮抗する。この文献に記載された発明では環化ペプチドが好ましく、なぜならタンパク質−タンパク質相互作用ではループおよびターンが機能上重要な役割を果たすからである。具体的な実施形態ではＴＮＦ−Ｒ ｐ５５の三つの結合ループから環状ペプチドが設計され、それらのペプチドはＴＮＦ−αと結合して、ＴＮＦ−αがその細胞受容体に結合するのを阻害する。最も好ましい実施形態において、ペプチドは少なくとも７個のアミノ酸を有し、より小形の直鎖状ペプチドがＴＮＦ−α阻害剤として有用であり得るとの示唆は無い。
【０００８】
特許文献２は、ＴＮＦ−αとＴＮＦ受容体との結合およびＴＮＦ−α機能を有効量の阻害ペプチドの投与によって阻害する方法に係わる。この特許は、ＴＮＦ受容体と結合し、それによってＴＮＦ−αの、細胞上のＴＮＦ−α受容体に結合してこれを活性化する能力を妨げるペプチドに係わる。特許された発明は特に、７個、および１２個のアミノ酸残基を有するペプチドをＴＮＦ−αとＴＮＦ受容体との結合およびＴＮＦ機能の阻害に使用する方法に係わる。特許文献２に記載された発明は、ＴＮＦ受容体に結合し得る小形ペプチドをスクリーニングすることを目的とする。同定された分子で最も小形のものは７アミノ酸長の配列を有する。より小形のペプチドがＴＮＦ−α阻害剤として有用であり得るとの示唆は無い。
【０００９】
特許文献３は尿由来のＴＮＦ阻害ペプチドに係わる。この特許は、ＴＮＦ−αに対して活性である精製形態のＴＮＦ阻害剤にも係わる。また、ＴＮＦに対して活性を示す医薬製剤として有用である精製形態のＴＮＦ阻害剤にも係わる。この特許はさらに、その精製形態において得られた３０ｋＤａタンパク質および４０ｋＤａタンパク質に係わる。開示されたこれらのタンパク質のアミノ酸配列は１５アミノ酸以上の長さを有し、より小形のペプチドがＴＮＦ−α阻害剤として有用であり得るとの示唆は無い。
【００１０】
特許文献４は、グリシン、アラニンおよびセリンから成る群から選択された少なくとも１種のアミノ酸またはその生理学的に許容される塩を、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）濃度が生理的恒常性および局所的炎症を媒介する濃度を上回る患者のＴＮＦ濃度を低下させる医薬または栄養製剤の調製に使用する方法に係わる。この特許は、ＴＮＦ濃度の低下がマクロファージ型細胞によるＴＮＦ産生、マクロファージ型細胞によるＴＮＦ放出、またはＴＮＦ受容体によるＴＮＦの結合を阻害もしくは低減することにより可能であることを開示している。この特許は、ＴＮＦ濃度を低下させる医薬または栄養製剤の調製にグリシン、アラニンおよびセリンのみを使用する方法に係わるものである。この特許は複数のアミノ酸の組み合わせやそのような組み合わせを含むペプチドを使用する方法は一切開示していない。
【００１１】
特許文献５は、ヒトＴＮＦ−αの複数の分子表面から成る群から選択された少なくとも一つのヒトＴＮＦ−α分子表面に実質的に類似する分子表面を有するＴＮＦ−α拮抗化合物に係わる。この文献に記載された発明の化合物は、両端に結合した連結部分と、スペーサー部分とを有する。発明化合物によって、２５個のアミノ酸並びに連結部分およびスペーサー部分を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドが開示されている。特許文献５に記載されたＴＮＦ−α拮抗化合物はＴＮＦ ｐ５５受容体および／またはＴＮＦ ｐ７５受容体に結合し、ＴＮＦ−αに媒介される細胞毒性を阻害する。特許文献５はスペーサー部分を有しない、より小形のペプチドを示唆してはいない。
【００１２】
当該技術分野で現在使用可能な治療薬は、可溶性ＴＮＦ受容体または抗ＴＮＦモノクローナル抗体の使用によってＴＮＦ−αを中和するべく設計されている（非特許文献２０および２１）。可溶性ＴＮＦ受容体や抗ＴＮＦモノクローナル抗体は循環するＴＮＦ−αと結合し、それによって、ＴＮＦ−αが細胞表面のＴＮＦ−Ｒへアクセスし、その後炎症経路を活性化するのを制限する。ＴＮＦ−α濃度の抑制に使用可能な治療薬は、（１）インフリキシマブ（レミケード）： マウス−ヒトキメラ型抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体、（２）ヒュミラ： 完全ヒト型抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、（３）エタネルセプト： ヒトＩｇＧのＦｃ領域と融合した可溶性ｐ７５ ｓＴＮＦ−ＲＩＩの二量体融合タンパク質である。これらの分子は様々な自己免疫疾患で効力を示すものの、幾つかの制約、すなわち低いバイオアベイラビリティーおよび安定性、重篤な免疫反応の誘発、並びに高いコストを伴う。ＴＮＦ−α活性の阻害には別の手段を講じることが妥当であろう。
【００１３】
抗ＴＮＦ抗体やＴＮＦ受容体の配列を利用して生物活性ペプチドフラグメントが合成されている（非特許文献２２〜２４）が、それらは大形で、難溶性である。このことは、恐らくは小形分子の形態を取る改良されたＴＮＦ−α阻害化合物の必要性を強調している。
【００１４】
１９９７年に為された上記のような合成の一研究においてＴａｋａｓａｋｉ等は、ＴＮＦ−ＲＩの三つの結合ループから設計されるペプチド類似体について検討した（非特許文献２５）。結合ループを構成するアミノ酸配列に基づいて複数のペプチドが作製された。それらのペプチド配列の中で、ＴＮＦ−ＲＩのドメイン３のループ１（残基１０７〜１１４）に基づく環状ＷＰ９（配列ＷＳＥＮＬ）がＴＮＦ−α阻害活性に関して最も有望であることが判明した。Ｔａｋａｓａｋｉ等はＷＰ９の配列ＷＳＥＮＬを鋳型として用いて、環状ペプチド模倣体ＷＰ９Ｑ、ＷＰ９ＥＬＹ、ＷＰ９ＹおよびＷＰ９ＱＹを設計した。ペプチド模倣体ＷＰ９ＱＹは治療上の有効性を示し、マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ）の重篤度を低下させた。しかしこの物質は、生理緩衝液に比較的溶解しにくいため、潜在的治療薬としてのヒトへの使用は制限される（非特許文献２５）。Ｔａｋａｓａｋｉ等の１９９７年の研究では、ペプチドの環化および芳香族化によって安定性およびバイオアベイラビリティーは向上したが、溶解性の向上または活性の向上への効果はほとんど、または全く認められなかった。Ｔａｋａｓａｋｉは、ＷＰ９ＱＹは今日までに開発された最小のペプチド模倣体であり、次世代の非ペプチド性阻害剤のためのリード化合物として用いられるかもしれないと述べている。このように、この文献は、当時公知の最小ペプチドに基づき非ペプチド性ＴＮＦ阻害剤の開発を試みることを当業者に示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６，２６５，５３５号
【特許文献２】米国特許第６，３４４，４４３号
【特許文献３】米国特許第６，１４３，８６６号
【特許文献４】米国特許第６，０４８，５４３号
【特許文献５】米国特許第６，１０７，２７３号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｇａｒｌａｎｄ， １９９９
【非特許文献２】Ｒｏｉｔｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｍｏｓｂｙ， ２００２
【非特許文献３】Ｌｏｃｋｓｌｅｙ， Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０４（４）： ４８７−５０１， ２００１
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４： ３９７−４４０， １９９６
【非特許文献５】Ｂｕｃｈａｎ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｏｌ． ７３： ４４９−４５５， １９８８
【非特許文献６】Ｃａｎｔｏ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１９（２）： １５６−１６５， ２００６
【非特許文献７】Ｆａｎｔｕｚｚｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ １２（９）： １０８５−１０９６， ２００８
【非特許文献８】Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． ５８： （Ｓｕｐｐｌ． １）１２７−１３１， １９９９
【非特許文献９】Ｃａｒｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７２： ３６６６， １９７５
【非特許文献１０】Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７： ６２５， １９８９
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ９７８４−９７８８， １９９２
【非特許文献１２】Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： ２０４０， １９９４
【非特許文献１３】Ｓｕｉｔｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９： ８４９， １９９４
【非特許文献１４】Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６： １６４６， １９９６
【非特許文献１５】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７４： ６３， １９９６
【非特許文献１６】Ｔａｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔ． ３９： １０７７， １９９６
【非特許文献１７】Ｐｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４： １４８３， １９９１
【非特許文献１８】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８４： ４３３， １９９５
【非特許文献１９】Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔ． ３９ （Ｓｕｐｐｌ．）： Ｓ７４， １９９６
【非特許文献２０】Ｐｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７７： ５１０−５１４， １９９２
【非特許文献２１】Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３６： １６８１−１６９０， １９９３
【非特許文献２２】Ｗｅｉｓｏｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： ６６０−６６６， ２００６
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ７： １１８１−１１８７， ２００３
【非特許文献２４】Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１６（６）： １５２５−１５３４， ２００６
【非特許文献２５】Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｎｏｖ． １５（１２）： １２６６−１２７０， １９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記背景技術の考察から、生理緩衝液に溶解しやすく、安定性およびバイオアベイラビリティーが高く、僅かな副作用しか有せず、かつ低コストであるペプチドの設計を目差して改良された次世代ＴＮＦ−α阻害剤を開発する必要性は明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体が提供され、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体が提供され、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２０】
本発明は、本発明の生物活性ペプチドをＴＮＦ−α関連疾病状態の治療に使用する方法にも係わる。本発明はまた、本発明の生物活性ペプチドを含有する医薬組成物にも係わる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ペプチドの抗ＴＮＦ−α活性をＬ９２９バイオアッセイを用いて示したグラフである。Ｘ軸上の数字１〜１０は配列番号１〜１０のペプチドを意味する。Ｙ軸はＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害パーセンテージを、各々二重に行なわれた３回の独立した実験の平均値±ＳＥとして表わす。Ｘ軸上の「＋ｖｅ」は陽性対照、すなわち公知のＴＮＦ−α阻害ペプチドである環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）を意味する。
【図２】図２は、配列番号２および６の直鎖状ペプチドと、配列番号９および１０の環状ペプチドと、陽性対照すなわち環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ペプチドとをＴＮＦ−αに誘発される細胞毒性の阻害について比較したグラフである。結果はＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害パーセンテージの、各々三重に行なわれた３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして示されている。
【図３】図３は、配列番号６のペプチドおよびエタネルセプト（Ｅｔ）によるＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害を比較したグラフである。結果はＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害パーセンテージの、各々三重に行なわれた２回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして示されている。
【図４】図４は、ペプチドとＴＮＦ−αとの結合のフローサイトメトリーによる定量を示すグラフである。配列番号２および６のペプチドの存在下でのＴＮＦ−αと細胞受容体との結合の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析結果を図４ａに示す。Ｙ軸はＴＮＦ−ＲＩ発現に関して陽性である細胞のパーセンテージを、３回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして表わす。棒グラフ（図４ａ）のＸ軸上、およびフローサイトメトリーヒストグラム（図４ｂ）中の数字１〜５の意味は次のとおりである。 １＝二次抗体としての抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ２＝マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ３＝組み換えＴＮＦ−αで処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ４＝組み換えＴＮＦ−αと配列番号２との複合体で処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。 ５＝組み換えＴＮＦ−αと配列番号６のペプチドとの複合体で処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ受容体抗体および抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで染色したＵ９３７細胞。
【図５】図５は、配列番号６のペプチドとＵ９３７細胞上に発現したＴＮＦ−Ｒ１との結合を示すグラフである。配列番号６のペプチドと、Ｕ９３７細胞上に発現したＴＮＦ−ＲＩとの結合の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析結果を図５に示す。Ｙ軸はＴＮＦ−ＲＩ発現に関して陽性である細胞のパーセンテージを、２回の独立した実験から得られた平均値±ＳＥとして表わす。棒グラフのＸ軸上、および重畳表示されたフローサイトメトリーヒストグラム（図５）中の数字は以下の試料を意味する。 １： 未処理のＵ９３７細胞。 ２： Ｕ９３７細胞＋ＴＮＦ−α。 ３： Ｕ９３７細胞＋配列番号６のペプチド。
【図６】図６は、媒体（ＣＦＡ）マウス、対照（ＰＢＳ）マウス、およびコラーゲン免疫マウスの血清からの抗コラーゲンＩｇＧ濃度の推定を示すグラフである。
【図７】図７は、コラーゲン誘発関節炎のマウスモデルにおいて、異なる用量および投与スケジュールで用いられる配列番号６のペプチドでの処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた右足根骨部位での足の太さ（ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の平均値を示すグラフである。動物群はそれぞれ４匹または５匹の動物から成っていた。Ｙ軸上の値は、群毎に得られる足の太さの平均値±ＳＥである。Ｘ軸上のアルファベットは動物群を意味する。 Ａ： １．２５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週間に３回投与し、その後毎週１回の投与を３週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｂ： ２．５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週間に３回投与し、その後毎週１回の投与を３週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｃ： ５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週間に３回投与し、その後毎週１回の投与を３週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｄ： ７．５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、毎週１回の投与を４週間行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｅ： ７．５ｍｇ／ｋｇの配列番号６のペプチドを、１週目に１回投与し、３週間後に２回目の投与を行なうスケジュールで用いて処理した関節炎マウス群。 Ｆ： 対照としてのＰＢＳで処理した関節炎マウス群。 Ｇ： 対照動物群、すなわち健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの群。 処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図８ａ】図８ａは、配列番号６のペプチド、配列番号２のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）での処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた左足根骨および右足根骨部位での足の太さの平均値±ＳＥを示すグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされ、また図中「対照」とは健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウスのことである。処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、配列番号６のペプチド、配列番号２のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）で処理した動物における処理後の抗コラーゲンＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を比較したグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされ、また図中「対照」とは健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウスのことである。処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図９ａ】図９ａは、配列番号６のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）での処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた右足根骨および右関節部位での足の太さの平均値を示すグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされる。動物群はそれぞれ３匹の動物から成っていた。
【図９ｂ】図９ｂは、アジュバント誘発関節炎のラットモデルにおいて、配列番号６のペプチド、およびエタネルセプト（Ｅｔ）での処理の前（Ｐｒｅ Ｔｘ）および後（Ｐｏｓｔ Ｔｘ）に得られた臨床スコアを比較したグラフである。ＰＢＳ処理動物は未処理動物と見なされる。動物群はそれぞれ３匹の動物から成っていた。処理の前後にｐ値を算出した。図中「＊＊」はｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
【図１０】図１０は、配列番号６のペプチド、エタネルセプト（Ｅｔ）、および陰性対照としてのＰＢＳでの処理の前後に関節炎ラットにおいて撮影した足および関節の腫脹の代表的な写真を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸はTryを含む群から選択され得る。
【００２３】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２４】
本発明はまた、ＴＮＦ−α阻害剤として作用する生物活性ペプチドに係わる。本発明による生物活性ペプチドは、例えば下記のような機構により作用し得るが、これらに限定はされない。
ａ） 本発明のペプチドはＴＮＦ−αと結合して複合体を形成し、それによってＴＮＦ−αと受容体ＴＮＦ−Ｒ１との結合を防止することができる。
ｂ） 本発明のペプチドは直接受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合することができ、ＴＮＦ−αが受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合するのを防止することができる。
【００２５】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を含有する医薬組成物にも係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２６】
本発明はさらに、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わり、その際Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得る。
【００２７】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００２８】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００２９】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を含有する医薬組成物に係わる。
【００３０】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸は親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸を含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法に係わる。
【００３１】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３２】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基であり、アミノ酸はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択され得、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３３】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された単一のアミノ酸残基である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３４】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された単一のアミノ酸残基である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３５】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３６】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００３７】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物に係わる。
【００３８】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法に係わる。
【００３９】
本発明はさらに、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００４０】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わる。
【００４１】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物にも係わる。
【００４２】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わる。
【００４３】
本発明はさらに、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００４４】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わる。
【００４５】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物にも係わる。
【００４６】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わる。
【００４７】
本発明はさらに、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体に係わる。
【００４８】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体にも係わる。
【００４９】
本発明は、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体と、製薬学的に許容されるキャリヤーとを含有する医薬組成物にも係わる。
【００５０】
本発明は、ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１はＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである〕を有する生物活性ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体を投与することを含む方法にも係わる。
【００５１】
本明細書中に用いた「ペプチド」という語は、ペプチド結合で連結された複数の天然アミノ酸サブユニットから成る重合体を意味する。アミノ酸という語は、天然ペプチドに類する部分を有するが、非天然部分も有する成分を意味する場合も有る。すなわち、ペプチドは改変されたアミノ酸や結合を有し得る。生物活性ペプチドという語は、哺乳動物への投与時所与の種類／量の薬理学的または生物学的効果を発揮するペプチドを意味する。
【００５２】
本明細書中に用いた「アミノ酸／アミノ酸残基」という語は、遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、遺伝的にコードされない天然アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、もしくは前記いずれかのＤ−鏡像異性体、またはその製薬学的に許容される塩／誘導体を意味し得る。本明細書中、遺伝的にコードされる２０種のＬ−アミノ酸、およびコードされない一般的なアミノ酸の表記には次のような通常の略号が適用されている。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【００５５】
本発明の範囲内に含まれるペプチドは、指定されたクラスのアミノ酸残基に関して部分的に規定される。アミノ酸は、主にアミノ酸側鎖の特徴に依存して三つの主要なクラス、すなわち親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸に分類される。これらの主要クラスはさらにサブクラスに分割され得る。親水性アミノ酸には酸性、塩基性または極性側鎖を有するアミノ酸が含まれ、疎水性アミノ酸には芳香族側鎖または非極性側鎖を有するアミノ酸が含まれる。さらに、非極性アミノ酸には特に脂肪族アミノ酸が含まれる。
【００５６】
「疎水性アミノ酸」とは、その側鎖が生理的ｐＨにおいて非荷電であり、かつ水溶液によって反発されるアミノ酸のことである。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸の例にはＩｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌが含まれる。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸の例にはｔ−ＢｕＡが含まれる。
【００５７】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π電子系を有する環（芳香族基）を少なくとも１個含む側鎖を有する疎水性アミノ酸のことである。芳香族基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロおよびアミノ基などの置換基でさらに置換されていてもよい。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸の例にはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが含まれる。遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸で一般的なものとしては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンなどが挙げられる。
【００５８】
「非極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨにおいて通常非荷電であり、かつ極性を有しない側鎖を有する疎水性アミノ酸のことである。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸の例にはグリシン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。コードされない非極性アミノ酸の例にはＣｈａが含まれる。
【００５９】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和の直鎖状、分枝鎖状もしくは環状炭化水素側鎖を有する非極性アミノ酸のことである。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸の例にはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅが含まれる。コードされない脂肪族アミノ酸の例にはＮｌｅが含まれる。
【００６０】
「親水性アミノ酸」とは、その側鎖が水溶液によって誘引されるアミノ酸のことである。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸の例にはＳｅｒおよびＬｙｓが含まれる。コードされない親水性アミノ酸の例にはＣｉｔおよびｈＣｙｓが含まれる。
【００６１】
「酸性アミノ酸」とは側鎖ｐΚ値が７未満の親水性アミノ酸のことである。酸性アミノ酸は典型的には、生理的ｐＨにおいて水素イオンが失われることに起因して負に荷電される側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸の例にはアスパラギン酸（アスパルタート）およびグルタミン酸（グルタマート）が含まれる。
【００６２】
「塩基性アミノ酸」とは、側鎖ｐΚ値が７より大きい親水性アミノ酸のことである。塩基性アミノ酸は典型的には、生理的ｐＨにおいてヒドロニウムイオンとの会合に起因して正に荷電される側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸の例にはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸の例には非環状アミノ酸のオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、およびホモアルギニンが含まれる。
【００６３】
「極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨにおいて非荷電であるが、２個の原子に共有された電子対が一方の原子により近接して保持されている結合を含む側鎖を有する親水性アミノ酸のことである。遺伝的にコードされる極性アミノ酸の例にはアスパラギンおよびグルタミンが含まれる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例にはシトルリン、Ｎ−アセチルリジン、およびメチオニンスルホキシドが含まれる。
【００６４】
「システイン様アミノ酸」とは、その側鎖が別のアミノ酸残基の側鎖とジスルフィド結合などの共有結合を形成し得るアミノ酸のことである。システイン様アミノ酸は典型的には、少なくとも１個のチオール（ＳＨ）基を含む側鎖を有する。遺伝的にコードされるシステイン様アミノ酸の例にはシステインが含まれる。遺伝的にコードされないシステイン様アミノ酸の例にはホモシステインおよびペニシラミンが含まれる。
【００６５】
当業者には理解されようが、上述の分類は絶対的なものではない。アミノ酸によっては上記特徴のうちの二つ以上を具え、従って二つ以上のカテゴリーに包含され得る。例えば、チロシンは芳香環および極性ヒドロキシ基を両方とも有する。すなわち、チロシンは二重の特性を有しており、芳香族アミノ酸と極性アミノ酸との両カテゴリーに含まれ得る。同様に、システインはジスルフィド結合を形成し得るみのでなく、非極性でもある。厳密には疎水性もしくは非極性アミノ酸には分類されないものの、システインは多くの場合ペプチドに疎水性を付与するべく用いられ得る。
【００６６】
本発明のペプチドおよびペプチド類似体を構成し得る一般的なアミノ酸で遺伝的にコードされないものには、β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および他のω−アミノ酸、例えば３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など； α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）； ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）； δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）； Ｎ−メチルグリシンもしくはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）； オルニチン（Ｏｒｎ）； シトルリン（Ｃｉｔ）； ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）； ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）； Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）； フェニルグリシン（Ｐｈｇ）； シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）； ノルロイシン（Ｎｌｅ）； ２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）； ４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））； ２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））； ３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））； ４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））； ペニシラミン（Ｐｅｎ）； １，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）； β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）； メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）； ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）； Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）； ２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）； ２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）； ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））； Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）； ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、およびホモセリン（ｈＳｅｒ）が非限定的に含まれる。これらのアミノ酸も、先に定義したカテゴリーに適宜分類される。
【００６７】
上記遺伝的にコードされる、およびコードされないアミノ酸の分類を次の表２にまとめる。表２は単なる説明用であり、本明細書に開示されたペプチドおよびペプチド類似体を構成し得るアミノ酸残基の網羅的なリストではないと理解されるべきである。本明細書に開示されたペプチドおよびペプチド類似体の作製に有用である他のアミノ酸残基は、例えばＦａｓｍａｎ， ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８９とその引用文献中に見出され得る。本明細書で具体的に言及されていないアミノ酸は、公知の挙動に基づき、および／またはその化学的および／または物理的諸特性を具体的に同定されたアミノ酸と比較することにより上述のカテゴリーに適宜分類することができる。
【００６８】
【表３】
【００６９】
好ましくは、本発明の生物活性ペプチドには以下の配列が非限定的に含まれる。
配列番号１： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＷＳＱ）
配列番号２： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＷＳＬ）
配列番号３： Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＷＱＹ）
配列番号４： Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＳＱＹ）
配列番号５： Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＳＱＬ）
配列番号６： Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＳＮＹ）
配列番号７： Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（ＱＹＬ）
配列番号８： Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＱＮＹ）
配列番号９： 環状Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ ＣＹ（ｃｙ ＷＳＬ）
配列番号１０： 環状Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ ＣＹ（ｃｙ ＳＮＹ）
配列番号１１： Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＷＱＱ）
配列番号１２： Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ（ＷＮＱ）
配列番号１３： Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（ＷＹＱ）
配列番号１４： Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＷＱＬ）
配列番号１５： Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（ＷＮＬ）
配列番号１６： Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（ＷＹＬ）
配列番号１７： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（ＷＳＹ）
配列番号１８： Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＷＮＹ）
配列番号１９： Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＷＹＹ）
配列番号２０： Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＳＳＱ）
配列番号２１： Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＳＱＱ）
配列番号２２： Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ（ＳＮＱ）
配列番号２３： Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＳＳＬ）
配列番号２４： Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（ＳＮＬ）
配列番号２５： Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（ＳＹＬ）
配列番号２６： Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（ＳＳＹ）
配列番号２７： Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（ＳＹＱ）
配列番号２８： Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＳＹＹ）
配列番号２９： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＱＳＱ）
配列番号３０： Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＱＱＱ）
配列番号３１： Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ（ＱＮＱ）
配列番号３２： Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（ＱＹＱ）
配列番号３３： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＱＳＬ）
配列番号３４： Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＱＱＬ）
配列番号３５： Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（ＱＮＬ）
配列番号３６： Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（ＱＳＹ）
配列番号３７： Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＱＱＹ）
配列番号３８： Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＱＹＹ）
【００７０】
より好ましくは、本発明の生物活性ペプチドにはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ＳＮＹ）すなわち配列番号６、およびＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（ＷＳＬ）すなわち配列番号２が非限定的に含まれる。
【００７１】
本発明のペプチドは直鎖状であっても環状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。
【００７２】
公知のＴＮＦ−α阻害活性を有するペプチド配列である環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ ＣＹ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究でのＴＮＦ−α拮抗活性評価に陽性対照として用いた。
【００７３】
本発明によるペプチドの表記において、アミノ酸残基Ｘｎ間の記号「−」は通常、骨格を成すアミノ酸同士の結合を表わす。従って、記号「−」は普通アミド結合（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）を表わす。しかし、具体的な実施形態として本明細書に開示されたペプチドのいずれにおいても、場合によっては１個以上のアミド結合を他の結合、好ましくは置換アミド結合、またはアミド結合の同配体に置き換えてもよいと理解されるべきである。
【００７４】
（本明細書中に用いた）「ＴＮＦアルファ」という語と「ＴＮＦ−α」という語とは同じもの、すなわちＴＮＦアルファもしくは腫瘍壊死因子αを意味する。
【００７５】
本発明のペプチドは、当該技術分野で公知のいずれの方法で合成してもよい。好ましい一法として、本発明の新規なペプチドを、１．００ ｍｍｏｌスケールにおいて自動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４３３Ａ型ペプチドシンセサイザ）上でＦｍｏｃ法を用いる固相法により合成した。ペプチドの構築はＣ末端からＮ末端へと行なった。Ｗａｎｇ樹脂を用いてペプチドを合成した。合成に用いた樹脂は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社から調達したＷａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ）であった（置換率１．２ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）。
【００７６】
合成の際、化学成分を用いてペプチドの反応性側鎖を保護した。Ｎ−末端アミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護した。ロイシンは側鎖を保護せずに用いた。トリプトファンの側鎖はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護した。アスパラギンおよびグルタミンの側鎖はトリチル（ｔｒｔ）で保護した。セリンおよびチロシンは、側鎖をｔ−ブチル（ｔＢｕ）で保護して用いた。システインはＳ−アセトアミドメチル（Ａｃｍ）で保護した。最初のアミノ酸をＷａｎｇ樹脂上に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて導入し、その後無水酢酸を用いてキャップ化を行なった。アミノ酸と樹脂とのカップリングに用いられる活性化試薬には、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＲＵ／ＨＯＢｔ）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）が含まれる。カップリング反応はＮＭＰ中で生起させた。ペプチド鎖の構築完了後、ペプチド−樹脂をメタノールで洗浄し、乾燥した。トリフルオロ酢酸、結晶性フェノール、チオアニソール、エタンジチオールおよび脱イオン水から成る切断用混合物での処理を室温で２〜３時間行なうことにより、ペプチドを樹脂から切り離した。冷乾燥エーテルで沈澱させて粗なペプチドを得た。次に、沈澱物を濾別して水に溶解させ、Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機で凍結乾燥した。このようにして得られた粗なペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２５０×２２．１）逆相カラムを用い、かつ所与の濃度勾配の０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水を用いる分取ＨＰＬＣによって精製した。溶出画分を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２５０×４．６）逆相カラムを用いるＨＰＬＣ分析システム（株式会社島津製作所（日本））で再分析した。アセトニトリルを蒸発させ、画分を凍結乾燥して精製ペプチドを得た。各ペプチドを質量スペクトルによって同定した。
【００７７】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のヨウ素を用いて、樹脂上のペプチドを環化した。樹脂を自動振盪機で穏やかに振盪しながらＤＭＦ中の６倍モル過剰のヨウ素で処理した。反応の進行をＨＰＬＣで監視した。反応完了後、樹脂をＤＭＦ中の０．４Ｍアスコルビン酸でクエンチした。次に、樹脂をＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、数分間真空乾燥した。最後に環化ペプチドを樹脂から切り離し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。粗なペプチドを分取ＨＰＬＣによって精製し、エレクトロスプレー質量分析法で特性解析を行なった。本発明のペプチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーといった、当該技術分野で公知の方法で精製したが、好ましいのはクロマトグラフィーによる方法であった。より好ましくは、本発明のペプチドは、ＲＰ Ｃ−１８カラムを用いる半分取型Ｓｈｉｍａｔｚｕ ＨＰＬＣシステムで精製される。実際に用いられる諸条件は、正味荷電、疎水性、および親水性などの要因に依存する。
【００７８】
本発明のペプチドは、質量分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電集束法、２Ｄ−電気泳動、クロマトグラフィー、ゲル濾過（大きさに基づく分離）、イオン交換（電荷に基づく分離）、配列決定、プロテアーゼ特異性測定、ＨＰＬＣ、Ｘ線結晶解析法といった、当該技術分野で公知の方法で分析され得る。好ましい一法として、本発明のペプチドを質量分析法で分析した。
【００７９】
ペプチドの純度は、当該技術分野で公知であるいずれの方法でも測定可能である。ペプチドの純度を逆相ＨＰＬＣで測定した。本発明のペプチドを純度について分析した。本発明のペプチドは比較的高い純度を有する。
【００８０】
本発明のペプチドは水や、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＤＭＳＯ含有ＰＢＳといった生理的緩衝液に可溶である。
【００８１】
本発明によるＴＮＦ−α阻害剤は、正常で健康な被検者における濃度を上回る濃度で存在するＴＮＦ−αに関連する病態もしくは状態の治療に有用である。そのような病態には、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および乾癬など、急性および慢性の免疫性および自己免疫性病態； 悪液質を含めた敗血症症候群； 急性または慢性細菌感染が原因の循環虚脱及びショック； 細菌感染、ウイルス感染、および真菌感染を含めた急性および慢性の寄生または感染プロセス； クローン病、およびＴＮＦ−α分泌腫瘍を伴う悪性病態が非限定的に含まれる。
【００８２】
製剤化および投与経路
本発明の化合物は被検者に対してそのまま投与しても、医薬組成物の形態で投与してもよい。本発明のペプチドを含有する医薬組成物は、通常の混合法、溶解法、顆粒化法、糖剤形成法、湿式粉砕法、乳化法、カプセル封入法、捕捉法、または凍結乾燥法によって製造され得る。医薬組成物は、活性なペプチドまたはペプチド類似体を医薬として用い得る製剤へと加工することを容易にする、生理学的に許容されるキャリヤー、稀釈剤、添加剤または補助剤を１種以上用いて通常のように製剤化され得る。適正な製剤化は選択された投与経路に依存する。
【００８３】
適当な製薬用キャリヤーは、当該技術分野での標準的な参考文献であるＡ．Ｏｓｏｌ編Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、活性物質が哺乳動物の体内においてその物質の作用部位に到達することを可能にするいずれの手段で投与されてもよい。本発明のペプチドは、当該技術分野で公知であるいずれの投与経路からも投与され得る。様々な経路からの投与には、局所投与、非経口投与、経粘膜投与、経口投与、口腔内投与、直腸内投与、吸入投与、鼻腔内投与、膣内投与、および舌下投与が非限定的に含まれる。
【００８５】
局所投与用としては、本発明のペプチドは当該技術分野で良く知られている溶液剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、懸濁剤などに製剤化され得るが、これらに限定はされない。
【００８６】
全身用製剤は、注射、例えば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射または腹腔内注射による投与用に設計された製剤、および経皮投与、経粘膜投与、経口投与または肺内投与用に設計された製剤を包含する。
【００８７】
注射用としては、本発明のペプチドは水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液といった生理学的に適合する緩衝液中に製剤化され得る。溶液は懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの剤形維持剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を含有してもよい。
【００８８】
あるいは他の場合には、ペプチドを用時適当な賦形剤、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成される散剤の形態としてもよい。
【００８９】
経粘膜投与用製剤には、透過するべき関門に適した浸透剤が用いられる。そのような浸透剤は通常、当該技術分野で公知である。
【００９０】
経口投与用製剤は、活性ペプチドを製薬学的に許容される、当該技術分野で公知のキャリヤーと配合することにより容易に製造できる。キャリヤーは本発明のペプチドを、治療される患者の経口摂取用に錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤化することを可能にする。
所望であれば、固形製剤を標準的な方法で被覆してもよい。
【００９１】
例えば懸濁剤、エリキシル剤および溶液剤などの経口液剤に好適なキャリヤー、添加剤または稀釈剤には、水、グリコール、油、アルコール等が含まれる。着香料、防腐剤、着色料などを添加することも可能である。
【００９２】
口腔内投与用には、ペプチドは通常のように製剤化されて錠剤、トローチ剤等の形態を取り得る。
【００９３】
吸入投与用に本発明により用いられるペプチドは、適当なプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いた加圧パッケージまたはネブライザーから噴霧エアゾール剤の形態で好適に送出される。加圧エアゾール剤の場合、単位用量は、バルブを設けて所定量を送出することにより決定され得る。化合物と、乳糖やデンプンといった適当な粉末状基剤とを混合した粉末混合物を収容した、例えばゼラチン製のカプセルやカートリッジを吸入器またはインサフレーター用に調製してもよい。
【００９４】
ペプチドを、例えばカカオ脂や他のグリセリドなど、通常の坐剤用基剤を含有する坐剤や停留浣腸剤などの直腸内または膣内投与用製剤とすることも可能である。
【００９５】
上述の諸製剤に加え、ペプチドをデポー剤に製剤化することも可能である。この持続性製剤は埋め込み（例えば皮下または筋肉内埋め込み）によってか、または筋肉内注射によって投与され得る。従ってペプチドは、例えば適当なポリマーまたは疎水性材料を用いて（例えば許容される油を分散媒とした乳剤に）製剤化しても、イオン交換樹脂を用いて製剤化しても、あるいはまたやや難溶の誘導体、例えばやや難溶の塩として製剤化してもよい。
【００９６】
上記以外の医薬送達系を採用することも可能である。本発明のペプチドおよびペプチド類似体の送達に用い得る送達媒体の良く知られた例に、リポソームおよび乳剤が有る。ジメチルスルホキシドなど、幾つかの有機溶媒も用い得るが、通常比較的高い毒性という不都合を伴う。ペプチドの送達には持続放出システムも用い得る。様々な持続放出性材料が確立されており、それらは当業者に良く知られている。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性次第では、タンパク質安定化のための付加的な方策を用いてもよい。
【００９７】
本発明によれば、製薬学的に許容される塩および誘導体とは、遊離塩基の生物活性を実質的に保有する塩および誘導体のことである。製薬学的に許容される塩および誘導体には、当業者によって製造され得る塩および誘導体が含まれる。
【００９８】
本発明のペプチドは通常、所期の目的の達成に有効な量で用いられる。ＴＮＦ関連疾患の治療または予防のための使用では、本発明のペプチドまたはその医薬組成物は治療有効量で投与または適用される。治療有効量とは、症状の改善もしくは予防、または治療される患者の延命に有効な量のことである。治療有効量は、特に本明細書の詳細な開示に照らせば当業者には容易に決定できる。
【００９９】
投与薬剤の用量は、当然ながら、特定薬剤の薬力学特性並びにその投与モードおよび投与経路； 被投与者の年齢、健康状態および体重； 症状の種類および程度、併用治療の種類、治療頻度、並びに所望の効果など、周知の要因に依存して変動する。
【０１００】
初期量は、当該技術分野で良く知られた方法を用いてｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいてヒトへの投与を最適化することは容易に可能である。
【０１０１】
投与量および投与間隔は、ペプチドの血漿中濃度を治療効果の維持に十分なものとするべく個別に調整され得る。注射による投与の場合、患者に対する用量は普通約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。典型的には、１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の量を１日につき複数回（６回）に分けて投与するか、１日１回隔日投与するか、または持続放出形態で投与することが所望の結果を得る上で有効である。病的状態の改善に有効な血漿中濃度を達成するべく投与量および投与間隔を個別に調整してもよい。治療上有効な血清中濃度は、投与を毎日複数回に分けて行なうことによって達成され得る。
【０１０２】
局所投与または選択的摂取の場合、有効な局所的ペプチド濃度は血漿中濃度と関わりが無いかもしれない。当業者であれば、甚だしい実験を行なわなくとも治療上有効な局所投与量を最適化することができる。
【０１０３】
当然ながら、投与されるペプチドの量は、治療される被検者、被検者の体重、疾病の重篤度、投与方法、および処方医師の判断に依存する。
【０１０４】
治療は症状が検出される間、さらには症状が検出されない場合にも断続的に反復され得る。治療は単独で行なっても、他の薬物を併用して行なってもよい。
【０１０５】
本出願明細書中各所で様々な刊行物および特許が引用され、特許はその番号、他の刊行物は著者名および発行年で特定されている。完全な引用文献リストを後段に示す。その結果、本発明の属する分野の技術水準をより十全に説明するべく、引用された刊行物および特許の開示はその全体が援用により本明細書に含まれる。
【０１０６】
本発明をここに詳述したが、用いられた用語は説明のためのものであり、限定のためのものではないと理解されるべきである。
【０１０７】
本発明の様々な改良および変形が上記教示に照らして可能であることは明らかである。従って、添付の請求項の範囲内であれば、本発明は具体的に記載された以外の形態でも実施され得ると理解されるべきである。
【０１０８】
方法概略および結果
【実施例１】
【０１０９】
配列番号６のペプチドの調製方法
実施例１（ａ）―配列番号６のペプチドの合成： ペプチド固相合成法を用い、自動または半自動ペプチド合成装置でＦｍｏｃ化学に則っり配列番号６のペプチドを合成した。Ｗａｎｇ樹脂を用いて合成を行なった。樹脂の置換率は０．６ｍｍｏｌ／ｇから１．２ｍｍｏｌ／ｇまでであった。チロシンおよびセリンの側鎖をｔ−ブチル基で保護し、アスパラギン側鎖をトリチル基で保護した。ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ（３〜５ｅｑ）およびＤＭＡＰ（１〜２ｅｑ）を室温で約５〜８時間用いて、最初のアミノ酸チロシンをＷａｎｇ樹脂上に導入した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを２０〜３０分間用い、Ｎ末端を保護するＦｍｏｃ基を除去して脱保護を行なった。１ｍｍｏｌの反応に１５〜２０ｍｌのＤＭＦを用いた。脱保護したチロシンにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（３〜５ｅｑ）を、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ（３〜５ｅｑ）を室温で約３〜４時間用いることによりカップリングさせた。反応の完了をＫａｉｓｅｒ試験で監視した。Ｋａｉｓｅｒ試験では、青色の消失によってカップリング反応の完了が示される。反応完了後、反応混合物をＤＭＦで３回洗浄した。Ｆｍｏｃ基を上記のように除去して脱保護を行ない、その後反応混合物をＤＭＦで３回洗浄した。上記と同様の操作で、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨをアスパラギンにカップリングさせ、脱保護した。固相上に構築されたペプチドの平均収率は９０〜９５％であった。
【０１１０】
樹脂からのペプチド切断：
ＴＦＡ：フェノール：ＴＩＳ：ＤＩＴ：水を８２．５：５．０：２．５：５．０：５．０の比率で含有する試薬混合物（１５０ｍｌ）を用いてペプチドを樹脂から切り離した。不断の攪拌下、配列番号６のペプチドを担持した樹脂を切断試薬中に氷冷環境下で１５分間維持し、次いでやはり不断の攪拌下に室温で２時間維持した。反応完了後、混合物を焼結漏斗で濾過し、濾液に冷ジエチルエーテルを添加することによってペプチドを沈澱させた。
沈澱したペプチドを焼結漏斗で濾過し、乾燥し、水に溶解させ、最後に凍結乾燥して粗なペプチドを得た。粗ペプチド収率は８５〜９０％であった。
【０１１１】
ペプチドの精製：
粗なペプチドを、溶離剤としてアセトニトリルおよび水を用いる分析用ＨＰＬＣで分析した。Ｃ−１８分取カラム（２５０×５０ｍｍ、１０μ）を用いるＨＰＬＣ ＬＣ−８Ａ装置（島津製作所）において粗ＢＲＣ６０５−１の精製を、流速８０〜１２０ｍｌ／分、検出波長２１０ｎｍで行なうアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）−水（０．１％ＴＦＡ）混合物での定組成溶離によって実施した。精製画分を分析用ＨＰＬＣで分析して所望の画分をプールし、凍結乾燥し、特性解析を行なった。この方法による総収率は７０％を越えることが判明した。
【０１１２】
ペプチドの特性解析：
ＭＳ分析―配列番号６のペプチドの全バッチについて、質量スペクトル分析による特性解析を行なった。各バッチの分子質量は３８３．５となる（陽性モード）。
ペプチド配列決定―配列番号６のペプチドの全バッチについて、ペプチド配列決定による特性解析を行なった。各バッチのペプチド配列は実際の配列を与える。
【実施例２】
【０１１３】
Ｌ９２９細胞のＴＮＦ−α媒介細胞毒性のペプチド配列による阻害
マウス線維芽細胞系Ｌ９２９を用いて、本発明のペプチドをＴＮＦ−α媒介細胞毒性の阻害について分析した。Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ）にＴＮＦ−αを添加すると細胞毒性が誘発され、そのことは、生細胞をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール系）やクリスタルバイオレットといった生体用色素で染色し、その後色素をメタノールで抽出することによって推定できる。抽出した色素の吸光度は５９５ｎｍで測定し得る（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １１９： ２０３−２１０， １９８９）。アッセイは下記のように行なった。
【０１１４】
Ｌ９２９細胞（１０％ＦＣＳを補充したダルベッコ変法イーグル培地中に維持）をマイクロタイタープレートに２×１０５細胞／ｍｌの密度で播種し、濃度１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（ＡＣＴ−Ｄ）の存在下、３７℃および５％ＣＯ２において２時間インキュベートした。７５μＭのペプチド溶液と共に３７℃でプレインキュベートしたＴＮＦ−α（１００ｐｇ／ｍｌ）をＬ９２９細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。
【０１１５】
環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ペプチドを、ＴＮＦ関連細胞毒性の阻害を推定するための陽性対照として用いた。陽性対照ペプチド溶液（７５μＭ）と共に３７℃でプレインキュベートしたＴＮＦ−α（１００ｐｇ／ｍｌ）を別のウェル内のＬ９２９細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。
【０１１６】
試験プレートおよび陽性対照プレートの生細胞を１００μｌ／ウェルの０．０５％クリスタルバイオレットで染色し、室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、かつ室温で一晩乾燥した。クリスタルバイオレットを１００μｌ／ウェルのメタノールで細胞から抽出し、抽出したクリスタルバイオレット色素の吸光度を５９５ｎｍで測定した。細胞毒性の阻害パーセンテージを式：
［（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤＴＮＦ）／（ＯＤｃｔｒｌ−ＯＤＴＮＦ）］×１００
によって算出した。
ＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害の評価は、本発明のペプチドを７５μＭの濃度で用いて行なった。
【０１１７】
実施例２（ａ）：
配列番号１〜１０のペプチドをＴＮＦ−α誘発細胞毒性の阻害について分析した。配列番号１、２、６および８のペプチドはＴＮＦ−α誘発細胞毒性を陽性対照よりも強く阻害した。配列番号１、２、６および８のペプチドのＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害率（各々二重に行なわれた複数回の実験に基づき算出された阻害率（％）の平均値±ＳＥ）はそれぞれ６５±９．２％、４８±６％、６２±６．２％、および５１±２．３％であった。
【０１１８】
実施例２（ｂ）―配列番号２および６のペプチドの直鎖状および環状形態の、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力の比較：
配列番号２および６の直鎖状ペプチド並びに配列番号９および１０の環状ペプチドを分析して、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力を比較した（分析方法は上述したとおり）。配列番号９および１０の環状ペプチドより配列番号２および６の直鎖状ペプチドの方が能力の高いＴＮＦ−α誘発細胞毒性抑制物質であることが判明した。図２に示したように、配列番号９および１０の環状ペプチドによる阻害はごく低率であった。
【０１１９】
陽性対照ペプチドすなわち環状ＷＳＱＹＬ（ｃｙ Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）についてもその直鎖状および環状形態を分析し、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力を比較した。興味深いことに逆のパターンが観察され、すなわち、陽性対照ペプチドの環状形態は比較的高いＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害率（６０±１０％）を示したが、陽性対照ペプチドの直鎖状形態はＴＮＦ−α誘発細胞毒性の阻害を有効に惹起しなかった（図２）。
【０１２０】
配列番号２および６の直鎖状ペプチドは、公知のＴＮＦ−α阻害ペプチドである陽性対照の環状形態と同等の高い阻害能力を有することが判明した。
【０１２１】
実施例２（ｃ）―配列番号６のペプチドおよびエタネルセプト（「エンブレル」として市販されている公知のＴＮＦ−α阻害剤）の、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力の比較：
配列番号６のペプチドおよびエタネルセプトを分析して、ＴＮＦ−α誘発細胞毒性を阻害する能力を比較した（分析方法は実施例２において上述したとおり）。配列番号６のペプチドはエタネルセプトに匹敵するＴＮＦ−α誘発細胞毒性阻害能力を有することが判明した（図３）。
【０１２２】
ペプチドの結合に関する研究
ペプチドとＴＮＦ−α、またはＵ９３７細胞（ＴＮＦ受容体発現ヒト白血病細胞系）上のＴＮＦ−Ｒ１との結合を、フローサイトメトリーアッセイ法を用いて調べた。ペプチドとＴＮＦ−αとの結合はＴＮＦ−αとＴＮＦ−Ｒ１との相互作用を妨げ、このことはフローサイトメトリーによって分析することができる。ペプチドが直接ＴＮＦ−Ｒ１に結合することによってＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージが低下することもフローサイトメトリーにより分析可能である。
【実施例３】
【０１２３】
ペプチドによるＴＮＦ−αと細胞上の受容体ＴＮＦ−Ｒ１との結合の阻害
ＴＮＦ−αはＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ）上のコグネイト受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合し、その結果ＴＮＦ−Ｒ１に関して陽性である細胞のパーセンテージは低下する。ＴＮＦ−α結合ペプチドはＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−ＲＩとの相互作用を妨害する。ＴＮＦ−Ｒ１に関して陽性である細胞のパーセンテージは、蛍光色素結合抗ＴＮＦ−ＲＩ抗体での染色によって定量できる。
【０１２４】
配列番号２および６のペプチドを、ＴＮＦ−αとＵ９３７細胞上の受容体ＴＮＦ−Ｒ１との結合の阻害について分析した。配列番号２または６のペプチドによるＴＮＦ−αとＵ９３７細胞上のＴＮＦ−ＲＩとの結合の阻害を蛍光活性化セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（米国）のＦＡＣＳ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を用いて推定した。
【０１２５】
０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．０５％ＮａＮ３（結合緩衝液）を含有するＰＢＳ中にＵ９３７細胞（１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））中に維持）を、緩衝液１００μｌ当たり１×１０５細胞の密度で懸濁させた。上記ペプチド（配列番号２および６）をそれぞれＰＢＳに加えた２種のペプチド溶液（５０μｌ）をＴＮＦ−α（５ｎｇ）と共に別々の試験管に入れ、３７℃で１時間プレインキュベートした。次いで、ペプチドとＴＮＦ−αとの複合体をＵ９３７細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。別の試験管にＵ９３７細胞（１×１０５個）をＴＮＦ−α（５ｎｇ）と共に入れ、４℃で１時間インキュベートした（並列実験）。その後、細胞を結合緩衝液で洗浄し、この細胞に５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のヒト抗マウスＴＮＦ受容体抗体（クローン番号ＨＴＲ−９； Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を４℃で１時間添加した。次に、細胞を結合緩衝液で洗浄し、暗中４℃で３０分間、１０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）のフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で染色した。結合緩衝液で２回洗浄後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。ゲートを生細胞集団に設定し、ペプチドによるＴＮＦ−α／細胞結合の阻害の程度をＴＮＦ−ＲＩ発現陽性細胞のパーセンテージに基づき推定した。
【０１２６】
未処理のＵ９３７細胞は約７８±１％がＴＮＦ−Ｒ１発現に関して陽性であることが判明した。Ｕ９３７細胞をＴＮＦ−αと共にプレインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１発現陽性細胞は３２±１０％に減少した（図４ａおよび４ｂ）。Ｕ９３７細胞を配列番号２のペプチドとＴＮＦ−αとの複合体と共にプレインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１発現陽性細胞の比率は３７±８．５％となった。Ｕ９３７細胞を配列番号６のペプチドとＴＮＦ−αとの複合体と共にプレインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１発現陽性細胞の比率は５７±８％となった（図４ａおよび４ｂ）。
【０１２７】
上記の結果から、配列番号２および６のペプチドがＴＮＦ−αと結合してＴＮＦ−αとＴＮＦ−Ｒ１との結合を防止し、受容体ＴＮＦ−Ｒ１に関して陽性である細胞の減少をＴＮＦ−αが未処理である場合と比較して抑制することは明らかである。
【実施例４】
【０１２８】
フローサイトメトリーによるペプチドとＵ９３７細胞上のＴＮＦ−Ｒ１との結合の評価
Ｕ９３７細胞を用いてペプチドとＴＮＦ−Ｒ１との結合を定量した。Ｕ９３７細胞に添加されたＴＮＦ−αはＵ９３７細胞上のコグネイト受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合し、その結果ＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージは低下する。本発明によるＴＮＦ−α阻害ペプチドはＴＮＦ−Ｒ１に結合し、Ｕ９３７細胞を該ペプチドと共にインキュベートするとＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞が減少する。
【０１２９】
配列番号６のペプチドをＵ９３７細胞上のＴＮＦ−Ｒ１への結合について、フローサイトメトリーを用いて分析した。Ｕ９３７細胞を配列番号６のペプチドと共にインキュベートして、配列番号６のペプチドが直接受容体ＴＮＦ−Ｒ１に結合することを実証した。配列番号６のペプチド（２５０μＭ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ）それぞれと共にインキュベートしたＵ９３７細胞を２回洗浄し、これを４℃で１時間、５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のヒト抗マウスＴＮＦ受容体抗体（クローン番号ＨＴＲ−９； Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で染色した。次に、細胞を結合緩衝液で洗浄し、暗中４℃で３０分間、１０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）のフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で染色した。結合緩衝液で２回洗浄後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。ゲートを生細胞集団に設定し、ＴＮＦ−Ｒ１への結合の程度をＴＮＦ−ＲＩ発現陽性細胞のパーセンテージに基づき推定した。
【０１３０】
８３％のＵ９３７細胞上にＴＮＦ−Ｒ１が発現していることが判明した。Ｕ９３７細胞を組み換えＴＮＦ−α（１０ｎｇ）と共にインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージは３１．６％に低下した。Ｕ９３７細胞を配列番号６のペプチドと共にインキュベートすると、ＴＮＦ−Ｒ１陽性細胞のパーセンテージは３２％に低下した（図５）。ＴＮＦ−Ｒ１発現に関して陽性である細胞のパーセンテージの低下が配列番号６と共にインキュベートしたあととＴＮＦ−αと共にインキュベートしたあととで同等であることが判明したが、このことはペプチドがＴＮＦ−Ｒ１に結合することを明らかに示している。
【実施例５】
【０１３１】
慢性関節リウマチのマウスモデルにおけるペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力
実施例５（ａ）―関節炎マウスモデルの開発： Ｌａｌｒｕに所在するパナセア バイオテックの動物飼育施設から入手した雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて、慢性関節リウマチのマウスモデルを開発した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）中に乳濁させた１５０μｇのトリタイプＩＩコラーゲン（Ｓｉｇｍａ）の皮内注射によってマウスを免疫した。一次免疫後第１７日に、不完全フロイントアジュバントに加えた１００μｇのトリタイプＩＩコラーゲンでの追加免疫を動物に対して行なった（Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２： １５．０．１−１５．０．６； Ｉｎｇｌｉｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４： ６１２−６１８， ２００８）。対照（健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス）と比較しての足の太さ（ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の増加および抗コラーゲンＩｇＧ抗体の存在を、関節炎の発症を評価するパラメーターとした。動物の足の太さはデジタルノギスで測定し、抗コラーゲン抗体は免疫後第３５日にマウス血清中で測定した。
【０１３２】
実施例５（ｂ）―マウス血清中抗コラーゲンＩｇＧ濃度：
トリタイプＩＩコラーゲン（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳに１μｇ／ｍｌの量で加えたものをＥＬＩＳＡプレートに塗布し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、コラーゲン、媒体（ＣＦＡ）、およびＰＢＳ（対照）を注射したマウスから得た血清を別々のウェルに稀釈比１：１００で添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、ウサギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をウェルに稀釈比１：１００００で添加し、室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、基質のＯＰＤ（オルトフェニルジアミン）を添加し、発色を観察した。発色を２Ｎ ＨＣｌで停止させた。４９０ｎｍでの吸光度を記録した（Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２： １５．０．１−１５．０．６）。コラーゲン免疫マウスが示した抗コラーゲンＩｇＧの血清中濃度は媒体（ＣＦＡ）群および対照群（ＰＢＳ注射）と比較して高かった（図６）。
【０１３３】
実施例５（ｃ）―マウスモデルにおける用量および投与スケジュールの最適化：
コラーゲン誘発関節炎のマウスモデル（上述の方法で用意）において、配列番号６のペプチドの最適な用量および投与スケジュールを決定した。関節炎マウスを足の太さに従ってランダム化し、各々４匹または５匹から成る複数の群に分けて、配列番号６のペプチドの静脈内注射を行なった。各群に適用した用量および投与スケジュールを表３に示す。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
用量７．５ｍｇ／ｋｇで４週間毎週１回投与した配列番号６のペプチドは足の太さを、対照動物で観察されたものと比較して僅かに減少させた。また、５ｍｇ／ｋｇの用量、および１週間に３回、その後３週間毎週３回投与するスケジュールで投与した配列番号６のペプチドが足の太さを対照動物のものに比べて有意に減少させることが観察された。従って、用量５ｍｇ／ｋｇで１週間に３回、その後３週間毎週３回投与する投与計画が最適なものとして選択された（図７）。
【０１３６】
実施例５（ｄ）―マウスモデルにおける配列番号６および２のペプチド並びにエタネルセプトの効力の比較：
コラーゲン誘発関節炎のマウスモデル（上述の方法で用意）を用いて、配列番号６および２のペプチドの効力をエタネルセプト（商品名「エンブレル」の下に市販されている認可されたＴＮＦ−α阻害剤）のものと比較した。関節炎マウスに配列番号６および２のペプチド並びにエタネルセプトを用量５ｍｇ／ｋｇで第１週に３回、その後３週間毎週１回静脈内投与した。
【０１３７】
配列番号６のペプチドおよびエタネルセプトの投与は足の太さを、正常な対照動物（対照： 健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス）と同等の太さにまで有意に減少させることが観察された（ｐ＜０．０１）（図８ａ）。配列番号２のペプチドの投与も足の太さを有意に減少させた（ｐ＜０．０５）（図８ａ）。これらの結果は、配列番号２および６のペプチドがエタネルセプトに匹敵する効力を有することを明らかに示している。
【０１３８】
実施例５（ｅ）―配列番号２および６のペプチド並びにエタネルセプトで処理した動物において処理後のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を測定する比較研究：
コラーゲン誘発関節炎の発症には、Ｔｈ１応答もしくは炎症誘発応答の増大が伴う。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ濃度比を測定して、本発明のペプチドおよびエタネルセプトでの処理がマウスモデルにおいて臨床疾患をＴｈ１応答の低下により改善したかどうかを判断した。小さいＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比ほどＴｈ１応答もしくは炎症誘発応答のダウンレギュレーションを示唆することになろう。
【０１３９】
関節炎マウスに配列番号２および６のペプチド、エタネルセプト、並びにＰＢＳを用量５ｍｇ／ｋｇで第１週に３回、その後３週間毎週１回静脈内投与した。配列番号６のペプチドおよびエタネルセプトを投与した場合、処理後のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は未処理の関節炎動物（ＰＢＳ処理動物を未処理動物と見なす）と比較して小さくなった（図８ｂ）。未処理の関節炎動物（ＰＢＳ処理動物を未処理動物と見なす）のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は進行中の炎症に起因して大きかった。このことは、配列番号６のペプチドでの処理が関節炎マウスにおいてＴｈ１応答を低下させ、その結果ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を対照動物（対照： 健康な雄のＣ５７ＢＬ／６マウス）のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比に匹敵するほど小さくして症状の寛解をもたらすことを示唆している。
【実施例６】
【０１４０】
アジュバント誘発関節炎のラットモデルにおける配列番号６のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力
配列番号６のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力を「アジュバント」誘発関節炎のラットモデルにおいて評価した。このモデルは抗炎症性薬物の開発及び試験で広く用いられている。ラットにおけるアジュバント関節炎（ＡＡ）はヒトの炎症性関節炎の諸特徴を模倣する（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １１２： ９５−１１０， １９５６）。１５０μｇの完全フロイントアジュバントで皮内免疫を行ない、その後第７日に不完全フロイントアジュバントで追加免疫を行なうことによって雄のＷｉｓｔａｒラットにＡＡを誘発した。動物の関節炎を臨床的スコアリングと、デジタルノギスを用いた足（ｐａｗ）および関節の太さの測定とにより評価した。臨床スコアは以下の基準に従って付与した。
０＝紅斑も腫脹も無し
１＝後肢または前肢の１本の指に僅かな紅斑または腫脹
２＝後肢または前肢の２本以上の指に紅斑および腫脹
３＝足関節または手関節に紅斑および腫脹
４＝後肢または前肢の指および足関節または手関節の全体に紅斑および腫脹が認められ、かつ足関節または手関節が屈曲不能
【０１４１】
関節炎ラットに配列番号６のペプチドを２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、第１週には６日間毎日１回投与し、第２週には１日おきに３回投与した。別の関節炎動物群にはエタネルセプト（Ｅｔ）を同様にして投与した。配列番号６のペプチドを投与した動物においても、エタネルセプトを投与した動物においても、未処理の関節炎ラット（ＰＢＳで処理したラットを未処理の関節炎ラットと見なす）に比べて足の太さが減少した（図９ａ）。配列番号６のペプチドまたはエタネルセプトで処理した場合には臨床スコアの有意な低下も認められた（ｐ＜０．０５）（図９ｂおよび１０）。総体的に、得られた結果は、配列番号６のペプチドが関節炎ラットにおける足の太さの減少や臨床スコアの低下に関してエタネルセプトに匹敵する効力を有することを示唆している（図９ａおよび９ｂ）。
【０１４２】
本明細書および添付の請求項中、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」を付した単数形は、文脈上明らかに別様に解されないかぎり複数形の意味を包含することに留意されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸であり、それらのアミノ酸はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｙｒおよびＡｓｎから成る群から選択され、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕから成る群から選択された１個または２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基で、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕから成る群から選択される、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項３】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された１個または２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された１個または２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基である、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項５】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項６】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項７】
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された単一のアミノ酸残基である、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項８】
配列番号１〜３８から成る群から選択される、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項９】
直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチドを調製する方法であって、前記ペプチドを固相合成法で調製する方法。
【請求項１１】
請求項１または８に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド、および製薬学的に許容されるキャリヤーを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、請求項１または８に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１３】
局所投与、非経口投与、経粘膜投与、経口投与、口腔内投与、直腸内投与、吸入投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、または舌下投与可能である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１】
式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
〔式中Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に０〜２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸であり、それらのアミノ酸はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｙｒおよびＡｓｎから成る群から選択され、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のアミノ酸は合計で２個以上である〕を有するＴＮＦ−α阻害ペプチドまたはその製薬学的に許容される塩および誘導体。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕから成る群から選択された１個または２個のアミノ酸であり、Ｘ３は単一のアミノ酸残基で、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕから成る群から選択される、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項３】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択された１個または２個のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択された１個または２個のアミノ酸であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基である、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＴｒｐである場合Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｎである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項５】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＳｅｒである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項６】
Ｘ１がＴｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｎを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、Ｘ３はＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒを含む群から選択されたアミノ酸残基であり、ただしＸ１がＧｌｎである場合Ｘ２はＡｓｎまたはＴｙｒである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項７】
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がそれぞれ独立に、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｅｕを含む群から選択された単一のアミノ酸残基である、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項８】
配列番号１〜３８から成る群から選択される、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項９】
直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチドを調製する方法であって、前記ペプチドを固相合成法で調製する方法。
【請求項１１】
請求項１または８に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチド、および製薬学的に許容されるキャリヤーを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
ＴＮＦ−α関連疾病状態を治療する方法であって、請求項１または８に記載のＴＮＦ−α阻害ペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１３】
局所投与、非経口投与、経粘膜投与、経口投与、口腔内投与、直腸内投与、吸入投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、または舌下投与可能である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図７】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図７】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５０９３１２（Ｐ２０１２−５０９３１２Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７０１２（Ｐ２０１１−５３７０１２）
【出願日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００９／０００６２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５８４１９
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５００４４５６３１）パナセア バイオテック リミテッド (29)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００９／０００６２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５８４１９
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５００４４５６３１）パナセア バイオテック リミテッド (29)
【Ｆターム（参考）】
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