腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）合成および分泌を調節するための、Ｔ細胞におけるＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルのモデュレーション、およびＴＮＦ−αの有害な高または低レベルを介しての人の疾患または傷害の治療
Ｔ細胞の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の遮断により、強健で、唯一的にＴＮＦ−αの産生が引き起こされ、それ故、Ｔ細胞の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の遮断を癌の根絶、感染病原体のより優れた根絶、特定の分子または細胞に対する血管および血液脳関門の透過性の増加、ならびに神経細胞の特色、再生の機能および発達の改善のために使用できる。Ｔ細胞の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の遮断は、強健で、唯一的なＴＮＦ−αの産生を引き起こす。同様に、遮断されたＫｖ１．１チャンネルの脱遮断またはＫｖ１．１チャンネルの開口は、Ｔ細胞のＴＮＦ−αの過剰量の産生および分泌を阻止し、従って関節リウマチのような病気およびＫｖ１．１チャンネルの損傷した機能および／または病理学上の遮断に伴う神経疾患の治療に有用であろう。該神経疾患にはＫｖ１抗体と関連したＰＮＨ；Ｋｖ１抗体に伴う脳炎；および突発性運動失調１型（ＥＡ−１）が挙げられ、それらの全てにおいて、Ｋｖ１．１チャンネルを遮断されたＴ細胞は、過剰のＴＮＦ−αを分泌し、それにより病態の一因になっている可能性がある。Ｋｖ１．１チャンネルの遮断は、インビボあるいはエクスビボにて、デンドロトキシン−ＫまたはＫｖ１．１チャンネルに対する選択的なモノクローン抗体のような選択的Ｋｖ１．１チャンネル遮断分子と接触させることによって達成させてもよい。Ｋｖ１．１遮断の阻止は、Ｋｖ１．１開口剤、またはＫｖ１．１チャンネルの閉鎖を阻止するような分子によって達成するであろう。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
３０年前に分離された腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、アポトーシスおよび細胞生存、ならびに炎症および免疫において主要な役割を果たす多機能なサイトカインである。その抗腫瘍性から名付けられたが、ＴＮＦは広範囲の他の疾患に関わるとされる。現在癌におけるＴＮＦの使用は、局所的に進行した軟組織肉腫、転移メラノーマおよび組織学的な他の切除不可能な腫瘍の局所的な治療において患肢の切断を避けるためのものである。ＴＮＦ−αは、分離患肢潅流の設定において、細胞増殖抑制剤と相乗的に作用することが示された。ＴＮＦ−αとＴＮＦの受容体１および２（ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２）の相互作用は、いくつかのシグナル伝達経路を活性化させ、ＴＮＦ−αの多様な機能を発揮させる。ＴＮＦＲ１のシグナル伝達分子は、非常に良く解明されているが、シグナル伝達の制御については不明である。これらの分子についての洞察のほかに、過去１０年間の研究室における実験は、腫瘍治療期間中のＴＮＦ−αの作用に光を当てた。出血性壊死を引き起こす、赤血球およびリンパ球の血管外遊出の他に、ＴＮＦ−αは、血管内壁の透過性増大および破壊を誘導することによって、腫瘍関連脈管構造（ＴＡＶ）を標的とする。この結果、腫瘍内での細胞増殖抑制剤の選択的蓄積の即効性、および腫瘍の脈管構造の破壊の遅発性効果が起こる。最近公表された総説（van Horssen等（２００６））は、ＴＮＦ−αについて分子から臨床までを記述し、ＴＮＦＲ−１シグナル伝達の分子的洞察およびＴＮＦ−αの抗腫瘍活性の細胞機構から始まり、臨床反応で終わる、癌におけるＴＮＦ−αの使用の概観を提供している。更に加えて、ＴＮＦ−αの活性をモデュレーションしている可能性のある因子についても議論している。
【０００２】
ＴＮＦ−αが、１９７５年バクテリアエンドトキシンで処理済のマウスの血清から「Coleyの毒素」の活性成分として分離され、マウスの腫瘍に出血性壊死を引き起こすことが示された。ニューヨークの外科医であったWilliam Coleyが、彼の調製した細菌濾液（「Coleyの混合毒素」）でいく人かの癌患者を治療した際に高熱と腫瘍の壊死を観察したのは、殆ど1世紀前であった。その分離の１０年後、ＴＮＦ−αは又「カケクチン」およびＴ細胞分化因子と位置づけられた。１９８４年ヒトＴＮＦ−α遺伝子がクローン化され、一連の臨床実験が設定され、分離潅流の設定における患肢を脅かすＳＴＳの治療のための、欧州医薬品審査庁からの認可を得た（上記に関してはvan Horssen等（２００６）、およびそこに引用した論文を参照）。
【０００３】
赤血球を除いて、実際ほとんどすべての細胞型に発現している２つの高親和性受容体、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）およびＴＮＦＲ２（ｐ７５）を活性化することにより、ＴＮＦ−αは、後天的免疫性および自然免疫性、ウィルスおよび細菌のような外来の侵入物と闘うために必要な炎症の誘導、腫瘍の根絶、オリゴデンドロサイトの再生と増殖の促進、神経の再ミエリン化その他多くのものを含め、めまぐるしく変化する病気において主要な役割を果たしている。
【０００４】
Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも呼ばれる）は、ＴＮＦ−αの主要な源である。Ｔ細胞からＴＮＦ−αの分泌を引き起こすことが知られている主要な刺激は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与であって、自己主要組織適合性複合体分子の構成において、抗原提示細胞によってＴ細胞に提示される抗原と、Ｔ細胞の出会いの時に起こるのと類似している。該「古典的な」ＴＣＲ活性化により、Ｔ細胞は強健なしかし非選択的なサイトカイン分泌（すなわちこれらの細胞によって分泌され得る全てのサイトカインの同時分泌）を引き起こす。
【０００５】
ＴＮＦ−αは、ヒトの生理および病理において二重の役割を果たす：一方ではＴＮＦ−αは、疾患と闘い治療するために決定的に必要とされる；他方過剰のＴＮＦ−αは、疾患および組織破壊を引き起こすため、有害である。
【０００６】
一般的に、先天的免疫反応の活性化におけるＴＮＦ−αの主要機能は、種々の型の外来侵入物から体を保護するために、および癌細胞を根絶するために、有益で重要であると一般的に考えられている。ＴＮＦ−αは又、種々の分子に対する血管および血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を大幅に増加させ、および組織への移動と侵入に必要とされる、白血球のローリングと付着を増大させる。したがって、ＴＮＦ−αの欠如または不足は、広範囲で病的な結果を招くことは明らかであり、その結果の中には、免疫能および、感染性生物と対抗し、癌等を根絶する能力の低下が含まれる。
【０００７】
ＴＮＦ−αが癌細胞を殺す能力に基づき、ＴＮＦ−αは、分離患肢潅流（ＩＬＰ）の現場において、軟組織肉腫（ＳＴＳ）、種々の組織学的切除不可能な腫瘍、および患肢に限定された移行転移メラノーマに対する癌治療に現在用いられている（van Horssen等（２００６）およびそこに引用した論文）。
【０００８】
van Horssen等（２００６）の表１に、高悪性度（Wallach等、１９９９；Mayan、２００２）ＳＴＳの治療のため、ＴＮＦ−αのＩＬＰでの適用に対し、１９９８年のＥＭＥＡによりＴＮＦ−αが承認されることになった、欧州での多施設臨床試験の概要が示されている。これらの多施設臨床試験においては、７６％の全奏功率および８２％の患肢救済中央値を観察した。さらにこの表には、多施設における経験を確認する、ＳＴＳの最大の単一施設での研究を載せている。衝撃的に一貫した、中央値７６％（レンジ、５８％〜９１％）主要な奏功率が、中央値８４％（レンジ、５８％〜９７％）の患肢救済率を伴って観察された。欧州においては、患肢救済のための国内照会形の３５の癌センターにおいて、ＴＮＦ−αに基づくＩＬＰが現在行われている。移行転移メラノーマに対するメルファラン単独ＩＬＰは、文献報告によれば、約５０％の完全奏功（ＣＲ）率および８０％の全奏功率を引き起こすと報告されている（van Horssen等（２００６））およびそれに引用している論文を参照）。この設定におけるＴＮＦ−αの導入は、ＣＲ率を７０％−９０％に、全奏功率を９５％〜１００％に増加させると報告された。これらの結果は、van Horssen等（２００６）における表２に要約してある。
【０００９】
一方、ヒトにおける不適切なＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αの過剰産生は、制御されない有害な炎症、組織破壊および器官の損傷を引き起こすこともまた明らかであり、多くの研究において報告されている。該ＴＮＦ−αの過剰産生は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症のような種々の自己免疫疾患、炎症性腸疾患のような炎症性疾患ならびに他の病的状態、そのうち例えば、強直性脊椎炎および脳卒中、において起こる。
【００１０】
中枢神経系（ＣＮＳ）に於いて、ＴＮＦ−αは又二重の役割を果たす：一方では、ＴＮＦ−αは有益であって、オリゴデンドロサイトの増殖と再生、神経細胞保護、神経再ミエリン化および種々の他の重要なプロセスに必要とされる。他方、過剰の内在ＴＮＦ−αは、神経細胞傷害および神経変性に寄与する。中枢神経系（ＣＮＳ）機能のモデュレーション時に炎症および免疫分子の役割により多くの注目が寄せられている。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、炎症促進性のサイトカインであり、その受容体はＣＮＳ全体の神経細胞およびグリア細胞上で発現している。その二つの受容体の作用を通じて、ＴＮＦ−αは、神経保護的または神経毒性の広範囲な作用を神経細胞に及ぼす。それは直接的および間接的に、アストロサイト上のグリアのグルタミン酸輸送体を阻害することにより、グルタミン酸の興奮毒性を促進する役割を果たす。さらに、ＴＮＦ−αは、例えばシナプス上のＡＭＰＡ受容体の発現を増加させ、グルタミン酸伝達に直接作用する。ＴＮＦ−αは又、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに依存するプロセスである、長期増強（ＬＴＰ）を阻害することによりシナプス可塑性の役割を果たす。
【００１１】
ＴＮＦ−αの欠如または不足、すなわち免疫能または他のＴＮＦ−αを介した有益な効果の欠如または不足、を特徴とする特定の病態において、他のいかなるサイトカインをも増大させることなくＴＮＦ−αの産生、発現および分泌だけを増加させる新規な方法を発見することは、治療価値を有することは、上記から明らかである。
【００１２】
以下に、ＴＮＦ−αの増強および標的細胞に及ぼすその後の作用が治療戦略と成りうる、病的状態の例を示す：
ａ．腫瘍を殺すまたは除去することができないため、死に至る癌（van Horssen等（２００６）、ＴＮＦ−αの抗腫瘍効果および臨床的有用性についての最近の総説のすべての内容は参照により本明細書に援用される）；
ｂ．死に導く可能性のある、ウィルスおよび細菌のような外来侵入物と闘うことができなくなる慢性または急性の免疫不全；および
ｃ．重要な神経機能がついには欠損し、生命を危険にする可能性のある、疾患または傷害に伴う神経細胞の再生の欠如または不足。
【００１３】
過剰な又有害なＴＮＦ−αを特徴とする特定の病態に於いて、ＴＮＦ−αの産生、発現および分泌を停止する新規な方法を発見することは、非常に治療価値を有することは、先の序論からも明らかである。
【００１４】
以下は、ＴＮＦ−αを停止または減少させおよびその後の標的細胞に及ぼすその影響が、以下の治療戦略になり得る病的状態の例である；リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、１型糖尿病、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、サルコイドーソスおよび頭部傷害後。
【００１５】
発明の要約
本特許出願の根拠としての機能を果たす研究において、本発明の発明者らは、Ｔ細胞中のＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルの選択的閉鎖は、ＴＮＦ−αの劇的な又独占的な合成および分泌を引き起こすために、単独で十分であって（すなわち任意の他の分子の存在無しに）、試験した他のサイトカインのいずれにも、すなわちインターフェロンガンマ、インターロイキン−４およびインターロイキン−１０にも影響を与えないことを発見した。
【００１６】
これらの発見に基づいて、Ｔ細胞内のＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルの閉鎖または遮断は、ＴＮＦ−αを介する効果が治療的価値を有するような状況において、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの急速、強健および選択的な合成および分泌を達成するであろうことが分かった。
【００１７】
Ｔ細胞におけるＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネル閉鎖は、デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）のような高度に選択的なＫｖ１．１チャンネル遮断剤、または特異的な抗−Ｋｖ１．１抗体、または下流経路の遮断によって、細胞外的にもしくは細胞内的に、T細胞のＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断を導く任意の他の方法によって本明細書中で達成される。
【００１８】
従って、本発明の一つの目的は、Ｔ細胞に大量のＴＮＦ−αを産生および分泌させ、疾患や傷害と闘うために、ＴＮＦ−αの欠乏と関連している病態を患っているヒトまたは動物被験体のＴ細胞内のＫｖ１．１チャンネルを遮断する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、選択的なＫｖ１．１イオンチャンネル遮断剤である方法を提供することである。
【００２０】
本発明の更なる目的は、Ｔ細胞に大量のＴＮＦ−αを産生および分泌させ、疾患や傷害と闘うために、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの増大した唯一の分泌により恩恵を受けることができるヒトまたは動物被験体のＴ細胞内のＫｖ１．１チャンネルを遮断する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、特異的な抗Ｋｖ１．１抗体であるような方法を提供することである。
【００２２】
本発明の更なる別の目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、Ｔ細胞内のＫｖ１．１チャンネルの下流経路を遮断できる分子であるような方法を提供することである。
【００２３】
本発明の又更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子を、エクスビボにてＴ細胞に投与後にヒトまたは動物患者の体内へ接種して戻すような方法を提供することである。
【００２４】
本発明の更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、体内に投与される、すなわちヒトまたは動物患者の体内に、静脈内、皮下、腹腔内、腫瘍内、くも膜下腔内または頭蓋内注入により、もしくは経口投与または経皮的に軟膏により投与されるような方法を提供することである。
【００２５】
本発明の又更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、ヒトまたは動物被験体の体内に植え込み式の薬剤送達ポンプを用いて投与されるような方法を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物被験体が癌に罹患しており、それら自身のＴ細胞を、体外または体内で、Ｔ細胞のＫｖ１．１チャンネルを遮断する分子に曝すことにより、ＴＮＦ−αの強健な合成または分泌を誘発し、ＴＮＦ−αによって癌を直接、死滅させる方法を提供することである。
【００２７】
好ましい一実施形態では、ヒトまたは動物被験体が癌に罹患しており、それら自身のＴ細胞を、体外または体内で、Ｔ細胞のＫｖ１．１チャンネルを遮断する分子に曝すことで、ＴＮＦ−αの強健な合成または分泌を誘発し、腫瘍を有する器官へのＴ細胞の侵入を増加させ、腫瘍破壊細胞の動員を向上させるための有益な炎症環境をつくることにより、癌のＴ細胞免疫療法を増強する。
【００２８】
好ましい別の実施形態では、ヒトまたは動物被験体は免疫不全に罹患している。
【００２９】
更に好ましい別の実施形態では、ヒトまたは動物患者は、神経細胞傷害または神経疾患の後、神経細胞再生の不全に罹患している。
【００３０】
本発明の好ましい別の実施形態では、ＴＮＦ−αの強健な合成および分泌を得るための手法は、静脈内、皮下、腹腔内、腫瘍内、くも膜下腔内または頭蓋内注入により、もしくは経口投与または経皮的に軟膏により、ＴＮＦ−αによる増強を動物患者の体の中に達成するのに役立つ。
【００３１】
疾患の第二の部類では、ＴＮＦ−αの有害な過剰は、本発明に従って、仮想の内在疾患関連Ｋｖ１．１遮断剤によって誘発されるＫｖ１．１チャンネルを閉鎖／遮断させない分子を用いて、Ｔ細胞からのＴＮＦ−αの産生と分泌を阻止することにより克服される。もし後者（つまり仮想の内在疾患関連Ｋｖ１．１遮断剤）がＴ細胞における慢性のＴＮＦ−α産生および分泌の原因であるならば、例えばＫｖ１．１チャンネル開口剤によってＫｖ１．１チャンネルの遮断をさせないようにすれば、強健なＴＮＦ−αの増加の誘発をもまた阻害するであろう。チャンネルを開口し、従ってＴＮＦ−αの産生を阻止する分子は、細胞外作用剤であっても良く、またはチャンネルの遮断のシグナルを送る細胞内電位感覚要素を損なう分子であってもよい。該細胞外作用剤の例としては、従来の方法で、Ｋｖ１．１分子に対して作製し、作用剤活性に対してスクリーニングを行ったモノクローン抗体が挙げられる。
【００３２】
好適な実施態様の詳細な説明
本発明は、正常ヒトＴ細胞におけるＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルの選択的遮断により、それのみで強健で、唯一ＴＮＦ−α蛋白の分泌およびｍＲＮＡが増加されるという発見に基づいている。劇的なＴＮＦ−αの分泌が、高度に選択的なＫｖ１．１遮断剤、デンドロトキシン−Ｋによって（しかし９つの他のＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ−遮断剤によっては誘導されない）；市販の抗−Ｋｖ１．１抗体によって；および、重要なことには、Ｋｖ１．１抗体を保持している末梢神経興奮性亢進症の患者からの血清によって誘導された。Ｋｖ１．１遮断は、ＴＮＦ−α分泌のみを誘発させ、一方「古典的」なＴＣＲ−活性化は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の分泌を、同時に、非唯一に増加させた。Ｋｖ１．１遮断は、またＮＦ−κＢの核転移を誘導する。
【００３３】
ヒトＴ細胞におけるＫｖ１．１タンパクおよびｍＲＮＡの発現は、本明細書ではＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって示した。デンドロトキシン−Ｋでエクスビボにて前処理をし、従ってＴＮＦ−αを過剰分泌しているヒトＴ細胞をＳＣＩＤマウスに注射すると、肝臓への宿主細胞のインビボ動員を引き起こすが、これは脳へＴＮＦ−αを注入後に報告されたことに類似している。今まで、これらの発見を予想できることは全く知られていなかった。Ｋｖ１．１遮断によって誘発されたＴＮＦ−αの増加は、それ故、ある疾患（例えば、癌および免疫不全）ではＴＮＦ−αを高め、他（例えばリウマチ性関節炎、クローン病および他の自己免疫／炎症性疾患）では抑止して、治療的に用いることができる可能性がある。
【００３４】
本発明により、ヒトＴ細胞における一種類のイオンチャンネルの選択的遮断が、一種類のサイトカイン、この場合はＴＮＦ−α、の唯一の産生と分泌を誘発できることが立証される。該機構は、全てのＴ細胞サイトカインの同時産生を促進することを特徴とする、種々の分裂促進因子（例えばホルボールエステル）による、「古典的」なＴＣＲ活性および非特異的なＴ細胞刺激の両者とは際立って対照的である。一つのサイトカインを唯一かつ強力に増加させ、一方では他のＴｈサイトカインのレベルを増加させない機構の発見は、特にサイトカインがＴＮＦ−αであることから（Dinarelo ら, 2002; Wallach ら, 1999）、重要な臨床的意味を有する。なぜならば、このサイトカインが多くの疾患の病理において重要であり、そのレベルが過剰であるかまたは不十分であるからである。
【００３５】
実際、一方ではＴＮＦ−αは、健康に基本的で有益な役割を果たす。それは自然免疫反応を活性化し、環境の攻撃から生体を保護する必須な炎症反応を引き起こす（Dinarelo ら, 2002）。更に加えて、ＴＮＦ−αは、腫瘍の壊死を起こさせ、白血球のローリングと接着の増強し、種々の分子に対する血管と血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を増加させ（Mayan 2002, van Horssen ら 2006）、オリゴデンドロサイトの増殖と再生を誘導し、神経の再ミエリン形成を促進し（Arnett ら, 2001; Finsen ら, 2002）、細胞を特定の組織へ動員し、ならびに多くの他の重要な機能を誘発する（Dinarelo ら, 2002; Wallach ら, 1999）。
【００３６】
他方、ＴＮＦ−αの過剰産生または無秩序な産生は、通常非常に有害であり、組織破壊に導く重篤な損傷を与える炎症を起こすことがあり、その後に種々の重篤な自己免疫疾患の原因となるが、その中にはリウマチ性関節炎および多発性硬化症、炎症性腸炎を含む炎症性疾患、ならびに外傷、強直性脊椎炎、脳卒中および過眠症のような多様な病理状態の種々なタイプが含まれる。興味あることには、ひとたびＴＮＦ−αが過剰になった場合には、抗−ＴＮＦ−αモノクロナール抗体および可溶性ＴＮＦ−α受容体のような、ＴＮＦ−αのシグナル伝達を遮断する治療法に対する適応症のリストはどんどん大きくなっている一方、ＴＮＦ−αの増加を阻止または遮断（すなわち過剰の有害レベルに達する前に）は、未だ達成されていない。更に、ヒトの疾患におけるＴＮＦ−αの慢性産生の原因となる機構については未だ不明なところが多く、他のサイトカインに影響せずに、選択的にＴＮＦ−αの増加を促進する機構も未だ解明されていない。
【００３７】
Ｔ細胞を含む種々の細胞タイプにおいて、特定のイオンチャンネルが主要な細胞反応に影響を与え、指示するという既知の特性（DeCoursey ら, 1984; Deutsch ら, 1986, Lewis ら, 1995; Lewis ら, 1988; Rader ら, 1996; Freedman ら, 1995; Koo ら , 1997; Lin ら, 1993; Ishida ら, 1993; Jansen ら, 1999; Kotturi ら, 2003; Phipps ら, 1996; Verheugen ら, 1997）、およびＫｖ１．３電位依存性カリウムチャンネルのゲーティングは、それ自身で主要Ｔ細胞機能を誘発できるという本発明者の研究室における以前の実証（Levite ら, 2000）によって促され、本発明は、正常ヒトＴ細胞における特定のカリウム（Ｋ＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）または塩素イオン（Ｃｌ−）チャンネルの単なる遮断が、選択的なサイトカイン分泌、特にＴＮＦ−αの分泌を誘発することができるかどうかの研究に基づいている。本結果は、正常のヒトT細胞内の電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの選択的な遮断が、強健的で、唯一かつ長期的なＴＮＦ−α分泌の増加に対する新規な機構を明示している。
【００３８】
本発見は、新規な予想外の機構を明らかにしたが、それは正常な末梢ヒトＴ細胞内の電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの選択的な遮断が、ＴＮＦ−α分泌およびｍＲＮＡレベルを著しく、唯一かつ長期的に増加させたことである。我々の知る限り、一般的に電位依存性Ｋ＋チャンネル、特にＫｖ１．１についてまたはＴＮＦ−αについて、Ｋｖ１．１とＴＮＦ−αの直接の機能的な関連に関する本発見を予想するようなことは全く知られていない。更に、本発見は、他のＴｈサイトカインを増加させることなく、ＴＮＦ−αの単独増加に対する新規の機構を明らかにしている。
【００３９】
次の段落において、考察がなされる：ａ）本発明の更なる詳細；ｂ）主としてＴ細胞中のＫｖ１．１電位依存性Ｋ＋チャンネルおよびＫｖファミリーの他のメンバー、ならびにＤＴＸ−Ｋの特殊な特徴；ｃ）ＰＮＨ，Ｋｖ１遮断に伴うヒトの神経疾患；およびｄ）様々なヒトの疾患においてＴＮＦ−αの促進する、または抑止する新規の臨床標的として、Ｔ細胞Ｋｖ１．１の使用。
【００４０】
本発明の更なる詳細
非常に選択的なＫｖ１．１遮断剤ＤＴＸ−Ｋ（Harvey, 2001）および特異的、市販抗−Ｋｖ１．１抗体の両者は、Ｔ細胞ＴＮＦ−αを劇的に増加させることを発見した。対照的に、Ｔ細胞中で発現しているＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−イオンチャンネルまたはグルタミン酸／ＡＭＰＡイオンチャンネル受容体（Ganor ら, 2003）に対する９つの他の遮断剤にＴ細胞を曝しても該効果は得られなかった。Ｋｖ１．１には特異的ではないが、電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットにいくらか影響することができる二つのＫｖ１．１遮断剤、ＫＴＸおよびＭｇＴＸもまたヒトＴ細胞からＴＮＦ−αを誘発したが、程度はずっと低く、Ｋｖ１．１チャンネルサブユニットに対するそれらの低い親和性と特異性に見合ったものであった。
【００４１】
ＫＴＸおよびＭｇＴＸは、Ｋｖ１．１チャンネルに対してＤＴＸ−Ｋほど特異的ではないが、本発明に従って使用するには十分特異的である。本発明は、ＰＭＡによって代表されるような、ホルボールエステルのような非特異的なＴ細胞活性化剤をすべて考慮に入れているわけではない。しかしながら、本明細書で用いる「選択的」という用語は、ＰＭＡのようなホルボールエステルの場合のように、Ｔ細胞サイトカインが無差別に産生するのではない限り、他のＫｖチャンネルにいくらかの活性を有する可能性のあるＫｖ１．１遮断剤を含むことを意図している。Ｋｖ１．１チャンネルに対する選択性が大きければ大きいほど、該分子に対する好ましさは大きい。従って、ＤＴＸ−Ｋは、現時点において最も好ましい該分子である。しかしながら、ＤＴＸ−ＫほどＴＮＦ−αを産生しないかも知れない、又ＤＴＸ−ＫほどＫｖ１．１に対する特異的選択性がないかも知れないが、ＫＴＸおよびＭｇＴＸもまた、本発明に従って用いることができる。従って、以下の十分に選択性を有する、および選択性がより低いＤｖ１．１電位依存性イオンチャンネル遮断剤は、Ｋｖ１．１チャンネルを遮断し、および少なくともＫｖチャンネルに対して実質的に選択的である、いかなる他の分子とも同じように、本発明に従って使用できる：
Ａ）デンドロトキシン類
１）トキシンＫ、デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）とも呼ばれる、は、ブラックマンバ、Dendroaspis polylepsisから由来し、Ｋｖ１．１チャンネルを優先的に遮断し、ピコモル濃度で活性を有する。
２）アルファーデンドロトキシンはグリーンマンバDendroaspis angusticepsから由来し、クローンされたＫｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６チャンネルを、低ナノモル範囲で遮断する。
３）トキシンＩ、デンドロトキシン−Ｉ（ＤＴＸ−Ｉ）とも呼ばれる、は、ブラックマンバ、Dendroaspis polylepsisから由来し、クローンされたＫｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６チャンネルを低ナノモル範囲で遮断する。
Ｂ）コノトキシン類：イモガイ、Conus virgoの毒素から、ＶｉＴｘ（virgo-toxin）と呼ばれるペプチドが分離され、Ｋｖ１．１およびＫｖ１．３のＫ＋−チャンネルを遮断するが、Ｋｖ１．２タイプは遮断しない（Kauferestein ら, 2003）。
Ｃ）マウロトキシン類：天然および合成のマウロトキシンは両方とも、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞で発現されたＫｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．３チャンネルを、殆ど同じ４０、０．８および１５０nMの半分有効量（ＩＣ５０）で遮断する（Rochat ら, 1998）。
Ｄ）アギトキシン類
１）rAgitoxin-2 Leiurus q. hebraeusはＫｖ１．１、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．６を５０pM〜１０nMで遮断する。（Alomone Labs web site; www.alomone.com/p_products）。
２）rAgitoxin-3 Leiurus q. hebraeusはＫｖ１．１、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．６を５０pM〜１０nMで遮断する。（Alomone Labs web site; www.alomone.com/p_products）。
Ｅ）r-Hongotoxin-1 Centruroides limbatusはＫｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３を０．１〜０．２pMで遮断する。
Ｆ）Ｐｉ４はさそりPandinus imperatorの毒液由来の３８アミノ酸長ペプチドであり、Shaker B Ｋ＋チャンネル（Ｋｖ１．１サブファミリータイプのチャンネル）を、１００nM濃度で完全にかつ可逆的に遮断する（Olamendi-Portugal 1998）。
Ｇ）Kaliotoxin（ＫＴＸ）：ＫＴＸはいくつかのＣａ２＋活性化および電位依存性Ｋ＋チャンネルを遮断する。Xenopus laevis卵母細胞へのＫＴＸのバス適用（bath application）は、組み換えＫｖ１．３およびＫｖ１．１チャンネルを強力に、又Ｋｖ１．２チャンネルをより低い強度で遮断し、それぞれのＫ（ｄ）値は、０．１、１．５および２．５nMであった（Mourre ら, 1999）。
Ｈ）ＢＴＫ−２：インドのさそりButhus tamulusから精製されたＫｖ１．１カリウムチャンネルの新阻害剤（Dhawan ら, 2003）。
Ｉ）新Ｋｖ１．１カリウムチャンネル遮断トキシン：Palamneus gravimanus （インド黒さそり）の毒液由来の新Ｋｖ１．１カリウムチャンネル遮断トキシン（More ら, 2005）。
Ｊ）rMargatoxin：ＭｇＴＸ Ｋ＋チャンネルは、主としてＫｖ１．３電位依存性Ｋ＋チャンネルを遮断するが、Ｋｖ１．１にも作用することができる。
Ｋ）Stichodactyla helianthusペプチド（ＳｈＫ）は、S. helianthusの毒液から分離された、Ｋｖ１．１およびＫｖ１．３チャンネルの既知の高親和性遮断剤である。
【００４２】
本実験で用いたＫｖ１．１に対する抗体は、市販されておりAlamone Labs Ltd., Jerusalem, Israel, product no. APC-009から得られる。Alomone.com/System/UpLoadFiles/DGallery/Docs/apc- 009_AN-05.pdfで得られるデータシートを参照。この抗体は、配列HRETE GEEQA QLLHV SSPNL ASDSD LSRRS SSTIS KSEYM EIEED MNNSI AHYRQ ANIRT GNCTT ADQNC VNKSK LLTDV（配列番号７）を有するＧＳＴ融合タンパクに対して産生させたウサギ抗体であって、マウスＫｖ１．１の残基４１６−４９５に相当する（GeneBank Accession P16388）。このエピトープの８０残基の内７６残基は、対応するヒトタンパクに保存されている。Ｋｖ１．１のエピトープ、好ましくはヒトＫｖ１．１に対して産生された他のいかなる抗体も、ポリクローンあるいはモノクローンであれ、それらがＫｖ１．１チャンネルを遮断する能力を有する限り、本発明の目的のために用いることができる。本明細書および請求項で用いる「抗体」という用語はポリクローンまたはモノクローン、ならびにヒト化抗体、単鎖抗体のような遺伝子改変の抗体、およびＣＤＲｓ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等のような抗原結合性断片を包含することを意図している。
【００４３】
Ｋｖ１．１チャンネルに対するモノクローン抗体を作製する際、それらはチャンネルを遮断する（拮抗する）または開口する（作用する）能力に関してスクリーニングをしてもよい。拮抗剤である抗体は、ＴＮＦ−αの産生の増加が望まれる病気を治療するために用いることができ、作用剤である抗体は、ＴＮＦ−αの過剰な産生を阻止する必要がある疾患を治療するために用いることができる。
【００４４】
ＴＮＦ−α転写におけるＣａ２＋の既知の役割（Lobo ら, 1999）と合致して、Ｋｖ１．１遮断によるＴＮＦ−αの誘導にはＣａ２＋流入を必要とすることが発見されたが、それはＴ細胞内におけるＣａ２＋チャンネルの高度の選択的遮断剤であるR-(+)-Bay K 8644（Kotturi ら, 2003）がこの効果を阻止したからである。驚くべきことには、Ｋｖ１．１チャンネルの遮断は、ＴＮＦ−αの急速な増加を引き起こす一方、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を増加させず、そのことは、これら全てのＴｈサイトカインは強健だが、非選択的に、又同時に結局増加することになる「古典的な」ＴＣＲ−活性化から著しく異なっていた。
【００４５】
ＴＮＦ−αを過剰発現するＤＴＸ−Ｋで処理した正常ヒトＴ細胞を、ＳＣＩＤマウスに注射すると、ＴＮＦ−αの脳内への注射後起こることが最近研究で示された結果（Campbell ら, 2005）に類似して、専ら肝臓に存在するマウス常在細胞数が倍増したことから、Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断によってヒトＴ細胞内に誘導されたＴＮＦ−αの増加は、インビボにて機能的な影響をもたらした。
【００４６】
Ｋｖ１．１電位依存性Ｋ＋チャンネルおよびそのファミリーの他のメンバー、ならびにＤＴＶ−Ｋの特異な特徴：Ｋｖ１．１チャンネルは電位依存性Ｋ＋チャンネルのファミリーに属しており、そのいくつかのメンバーはＴ細胞で発現しており、重要な機能的役割を果たしている（DeCourseyら, 1984; Deutsch ら, 1986; Lewis ら, 1995; Lewis ら , 1998; Freedman ら, 1995; Koo ら , 1997; Lin ら, 1993; Levite ら, 2000; Liuら, 2002; Beeton ら, 2001; Leonard ら, 1992; Levite 2001）。これらのチャンネルはＣ２＋活性化Ｋ＋チャンネルとは異なっており、これらチャンネルはＴ細胞により発現しており、Ｔ細胞機能として重要である（Rader ら, 1996; Jensen ら, 1999; Vreheugen ら, 1997）。様々な種類の電位依存性Ｋ＋チャンネルのグループ分けおよび独特な特性は、いくつかの研究で考察されている（Grissmer ら, 1994; Mathisら, 1998を参照）。一般的に、電位依存性Ｋ＋チャンネルの阻害は、脱分極を起こし（Leonard ら, 1992）（すなわち陰性度が低い膜電位へのシフト）、それが、種々の主要な細胞特性および細胞機能に影響を及ぼし、発揮させる（Levite ら, 2000; Leonard ら, 1992; Levite, 2001）。神経細胞においては、電位依存性チャンネルの一つの大きな役割は、膜の興奮性の制御である（Ruteckie, 1992; Smart ら, 1998）。これには活動電位および神経細胞の反復発火の期間を制限し、ならびに膜電位を安定化させることが含まれる。
【００４７】
Ｔ細胞内の特定の電位依存性Ｋ＋チャンネルは、β１インテグリン類を活性化し、その後フィブロネクチンと同様にＥＣＭ成分へのＴ細胞接着を誘発し（Levite ら, 2000）、膜電位（Levite ら, 2000）、カルシウム流入（Grinstein ら, 1990; Lin et al, 1993; Verheugen ら, 1997）、増殖（Freedman ら, 1992; Leonard ら, 1992）、ＩＬ−２産生（Liu ら, 2002, Freedman ら, 1992）、アポトーシス（Bortner ら 1999; maeno ら , 2000; Vu ら, 2001）、および細胞容積（Grinstein ら, 1990）を調節することが、先の研究で示された。
【００４８】
従って、全体として、Ｋｖチャンネルは、主要な生理的Ｔ細胞機能を調節し、それらの不適切な機能は、ＴＣＲ−活性化を阻害し、重要なＴ細胞を介しての免疫反応を阻止する。例えば、Liu ら(2002)は、電気生理学、薬理学およびＲＴ−ＰＣＲの方法を組み合わせて、未処理のマウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３およびＫｖ１．６電流を発していること、ならびにこれらのＫｖチャンネルが、該未処理の細胞によるＴＣＲ−誘導（抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８により）ＩＬ−２分泌を最大にするために必要となることを示した（Liu ら, 2002）。
【００４９】
対照的に、マウスＴＣＲ−活性化エフェクターＴ細胞は、Ｋｖ１．３電流（未処理細胞よりは±６倍高い）のみを発するが、Ｋ１．３も、他のいかなるＫｖも、これらの活性化されたＴ細胞のＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＰＮ−γの産生、カルシウムシグナル伝達または膜電位に対して有意に寄与はしていない（Liu ら, 2002）。この後者の研究で行った観察により、末梢マウスＣＤ４＋細胞において、分化状態、ＴＣＲ活性化の強さ、共刺激因子の存在あるいは非存在の表れとして、Ｋｖ電流が、質的にも又量的にも変化することを示された（Liu ら, 2002）。自然の電位依存性Ｋ＋チャンネルはヘテロ多量体であって、種々のＫｖサブタイプの組み合わせから構成されており、ヘテロ多量体チャンネルが異なれば、親チャンネルと比較して、劇的に異なったチャンネル機能を有することになる。ヘテロダイマーを含む異なったＫｖ１．１もまた異なった遮断剤に対して異なった感受性を有している。例えば、ヘテロダイマーを含むＫｖ１．１中にＫｖ１．２が存在すると、ＴＥＡに対する全アレイの感受性が低下する。先の研究では、ＤＴＸ−Ｋが、Ｋｖ１．１サブユニットとの強く高度に特異的な相互作用という点で、またそれが、これらのチャンネルとそのＮ−末端（Ｋ３、Ｋ６）およびβ−ターン（Ｋ２５、Ｋ２６）における残基を介して相互作用をするという点で、独特なものであることを示された（Wang ら）。ＤＴＸ−Ｋの非常に独特な作用機構により、ＤＴＸ−ＫによるＴＮＦ−αの増加を（いまだ未調査の機構で）説明できる可能性がある一方、特異性がより低いＫｖ１遮断剤の作用機構により、たとえあったとしても効果はあまり目立たなくなる。
【００５０】
ヒトおよびマウスＴ細胞におけるＫｖ１．１電流試験である別の研究で、異なった結論に達した（Freedman ら, 1995; Cahalan ら, 1985; Liu ら, 2002）。本結果は、特異的なＫｖ１．１ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって、正常末梢ヒトＴ細胞のかなりの割合は、Ｋｖ１．１ｍＲＮＡおよび膜タンパクを明瞭に発現していることを示し、このタンパクの新しい面を明らかにした。しかし、我々の発見は、正常静止状態の末梢ヒトＴ細胞において機能的な（すなわち電気生理学的に活性を有する）Ｋｖ１．１電流の存在を証明するものでは勿論ない。電位依存性Ｋ＋チャンネルファミリーの他のメンバー、主としてＫｖ１．３、がＴ細胞の活性化と機能において重要な役割を果たしている証拠が、多くの最近の研究によって示唆された(DeCoursy ら, 1984; Deutsch ら, 1986; Lewis ら, 1995; Lewis ら, 1988; Freedman ら, 1995; Koo ら, 1997; Lin ら, 1993; Leite ら, 2000; Liu ら, 2002; Beeton ら, 2001; Leonard ら, 1992; Rus ら, 2005)。更に、本発明者の研究室は、正常ヒトＴ細胞の電位依存性Ｋ＋チャンネルの一つのメンバー、Ｋｖ１．３、のゲート開閉は、それ自身のみでβ１インテグリン活性化とＴ細胞接着を誘発でき、Ｋｖ１．３チャンネルは、これらの細胞中で、実際β１インテグリンと物理的に又機能的にカップリングしていることを以前示した(Levite ら, 2000; Levite 2001)。注目すべき点は興味ある相違点である：我々が以前研究したＫｖ１．３チャンネルの場合には、Ｔ細胞機能を誘導するのはＫｖ１．３チャンネルを開口した時であり（すなわちＴ細胞接着を引き起こす）(Leviteら, 2000; Levite 2001)、一方本研究においては、そうする（すなわちＴＮＦ−αを増加させる）のはＫｖ１．１チャンネルの遮断である。
【００５１】
Ｋｖ１．１遮断に伴ういくつかのヒト神経疾患：一般的に神経の興奮性を増加させるＫｖ１．１チャンネルの遮断は少なくとも３つのヒト神経疾患を直接伴っている：
１）Ｋｖ１抗体と関連するＰＮＨ
２）Ｋｖ１抗体と関連する脳炎
３）ヒトＫｖ１．１チャンネルをコードする遺伝子の様々な突然変異に伴う、突発性運動失調１型（ＥＡ−１）（Vincent et al, 2004; Adelman et al 1995; Browne et al, 1994）。
【００５２】
ＰＮＨ：Ｋｖ１遮断に伴うヒトの神経疾患：マウスにおけるＫｖ１．１チャンネルの欠損は、癲癇、温度感受性振盪および痛覚過敏症を起こすが、これらは神経細胞の過剰興奮性と一致する特徴である(Smart ら, 1998; Zhou et al , 1998)。臨床医は、全般的なＰＮＨの筋肉運動の症状を記述するのに、神経性筋強直症、アイザックス症候群、ミオキミアおよび線維束性痙攣症候群を含む多くの用語を用いる（Hart et al, 2002）。ＰＮＨが通常自己免疫を介する（Newsom-Davis ら, 1993）という考えは、最近６０人のＰＮＨ患者の３５％は、１００pmol/lを越える血清Ｋｖ１抗体タイター有していたという知見によって確証された（Hart et al, 2002）。これらの抗体は病原性があり、Ｋｖ１チャンネルを遮断し、従って末梢およびお中枢神経系の両方に神経の過剰興奮性と広範囲の臨床症状を引き起こす。ここで、いく人かのＫｖ１抗体陽性ＰＮＨ患者の血清は（方法参照）、ヒトＴ細胞による相当な量のＴＮＦ−α分泌を刺激したが、一方ＩＦＮ−γを増加させなかった（ＤＴＸ−Ｋの結果と類似している）。この発見は、Ｔ細胞における抗体を介したサイトカイン誘導が、神経の過剰興奮性の病態およびＰＮＨの臨床的特徴ならびに多分自己免疫性脳炎の一因となる可能性を示唆している。本データは又疲労および筋肉痛のようなＰＮＨに伴う、より非特異的な症状は、少なくとも部分的にはＫｖ１抗体を介した血液循環中のＴＮＦ−αの増加によって引き起こされた可能性を示唆している。従って、本発明の他の特徴は、１）Ｋｖ１抗体に伴うＰＮＨ，２）Ｋｖ１抗体に伴う脳炎、３）突発性−運動失調１型（ＥＡ−１）を循環系におけるＴＮＦ−αの力価を減少させる任意の方法で治療する方法であって、ＴＢＰ−１およびＴＢＰ−２のようなＴＮＦ−α結合タンパク、抗-ＴＮＦ−α抗体、Ｋｖ１．１チャンネル非遮断剤等のような方法である。
【００５３】
Ｔ細胞のＫｖ１．１機能不全は、ＴＮＦ−α過剰に伴うヒトの疾患に寄与する可能性があるので、Ｔ細胞におけるＫｖ１．１は新規の治療標的である。ヒトＴＮＦ−αは生物活性を有する、２３３アミノ酸、２６kDaの膜結合性タンパクとして合成される。この膜結合性タンパクは、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、アダマリシンによって１５７アミノ酸、１７kDa可溶性タンパクに酵素的に切断され、容易にホモ三量体を形成する。ホモ三量体ＴＮＦ−α（細胞結合型または可溶性のいずれか）のその受容体（ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩ）への結合は、静止状態の細胞においてシグナル伝達に必要な受容体のオリゴマー形成を誘導する。
【００５４】
ＴＮＦ−αの不適切な産生または過剰産生は、その発病原因において炎症が関与する広範囲の病気において起こるが、その病気には、炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎および脳卒中が含まれる（Baugh ら, 2001）。本発見により、インビボでのＫｖ１．１抗体またはＫｖ１．１遮断剤を介してのＴ細胞Ｋｖ１．１遮断は、少なくとも部分的に、これらの障害での過剰のＴＮＦ−αに原因があり、それ故新規の治療標的である、という結論におそらく導かれるであろう。
【００５５】
他方、ＴＮＦ−αは、他の多くの目的のために非常に必要とされることから、ＴＮＦ−αを長期間過剰発現する自己ＤＴＸ−Ｋ処理Ｔ細胞のヒトにおける受動的な輸送は、非常に特定の状況においては、有益であろう。これらには、Ｔ細胞による癌細胞根絶の強化、ウイルスおよびバクテリアのＴ細胞攻撃を高めること（特に免疫不全の種々のタイプの場合）および必要に応じて宿主細胞の肝臓への動員の増加が挙げられる。
【００５６】
実施例１：
材料と方法
イオンチャンネル遮断剤：表１も参照。本明細書に用いる各イオンチャンネル遮断剤について特定されるものは、正式名、カッコ内に短縮名と製造者、有効濃度（それぞれの製造者のデータシートおよび／または文献から得られた）である。更なる詳細情報は、International Union of Pharmacology website (Gutman et al, 2003を参照)に見出すことができる。遮断剤としては以下のものが挙げられる：４−アミノピリジン（４−ＡＰ，Sigma，St. Louis, MO）、１０μM〜１mM；テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ，Sigma）、１００μM〜１０mM；キニーネ（Sigma）、１〜１０μM；クロトリマゾール（ＣＬＴ，Agis Industries, Bnei Brak, Israel）、１０nM〜１０μM；rカリブドトキシン (ＣＴＸ，Alomone labs, Jerusalem, Israel)、１０〜１００nM；カリオトキシン（ＫＴＸ，Alomone）、１〜１００nM；ｒマルガトキシン （ＭｇＴＸ，Alomone）、５０pM〜５０nM；デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ，Alomone）、１０〜１００nM；テトロドトキシン（ＴＴＸ，Alomone）、１００nM〜１μM；ＮＰＰＢ（Torcris Cookson, Avonmouth, UK）、１００〜２００μM；R-(+)Bay K8644（+Bay K, Tocris）、１０nM〜１μM；CNQX（Tocris）、１００nM−５０μM。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ヒトＴ細胞：正常ヒトＴ細胞は、(Levite ら, 2000; Ganor ら, 2003; Levite ら, 1998)に記載されているように健常提供者の末梢血から精製し、得た９０％以上のＴ細胞を含む細胞群を、１０％ＦＣＳ、１％Ｌグルタミンおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ培地（Biological Industries, Bet Haemek, Israel）に懸濁し、２ｘ１０６細胞／ml（３７℃／５％ＣＯ２）で維持した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の定量：新たに精製した正常静止ヒトＴ細胞（２ｘ１０６／ml）を２４穴プレート(Costar, Corning, NY)中でインキュベーションし、種々のチャンネル遮断剤を加えた。重要なことは、他の刺激分子（例えばホルボールエステル、抗原、抗−ＣＤ３・ＣＤ２８ｍＡｂ）を加えないことであった。サイトカインレベルは、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γについては２４時間後、ＩＬ−１０およびＩＬ−４については７２時間後、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡ法（R&D, Minneapolis, MN）で、製造者の指示に従い、上清を測定した。
【００６０】
ＴＮＦ−αおよびＫｖ１．１のＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡは、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔプロトコル（MRC, Cincinnati, OH）に従って調製した。第一鎖ｃＤＮＡは、Reverse Transcription System（Promega, Madison, WI）を用いて合成した。ＲＴ−ＰＣＲは、５０ngのｃＤＮＡ、５μlのｘ１０ Optibuffer (Bioline, London, UK)、３μlの５０mM ＭｇＣｌ２、２．５μlの１０mM ｄＮＴＰ混合液(Promega)、４ＵのＢｉｏ−Ｘ−ａｃｔＤＮＡポリメラーゼ(Bioline)を含む５０μlの反応混合液中で行った。ＴＮＦ−α／Ｓ１４同時増幅については、２μlの各ＴＮＦ−αプライマー（１０pmol／μl）および０．２５μlの各Ｓ１４プライマー（１０pmol／μl）を用いた。Ｋｖ１．１／Ｓ１４同時増幅については、５μlの各Ｋｖ１．１プライマー（１００pmol／μl）および２．５μlの各Ｓ１４プライマー（１０pmol／μl）を用いた。プライマー配列（５’−３’）および産物の長さは以下の通りである：
ＴＮＦ−αプライマーペア−上流プライマー
【表２】
下流プライマー
【表３】
４９４ｂｐ；Ｋｖ１．１プライマーペア−上流プライマー
【表４】
下流プライマー
【表５】
７０９ｂｐ；Ｓ１４プライマーペア−上流プライマー
【表６】
下流プライマー
【表７】
１６６ｂｐ。ＴＮＦ−αのＰＣＲ条件は：９４℃１分、６３℃４０秒および７２℃４０秒（２９サイクル）。Ｋｖ１．１のＰＣＲ条件は、９４℃３分（１サイクル）；９４℃１分、６０／５７／５４／５１／４８℃２分および７２℃３分（それぞれ３サイクル）；９４℃１分、５０℃２分および７２℃３分（２５サイクル）。ＴＮＦ−α／Ｓ１４ＲＴ−ＰＣＲ産物の濃度分析は、Adobe Photoshop 7.0 MEによって行った。ＴＮＦ−αバンドの相対強度は、Ｓ１４バンドの相対強度に対して規格化した。
【００６１】
核ＮＦ−κＢのＥＭＳＡ：正常ヒトＴ細胞から新たに分離した核画分は、Nuclear Extract Kit（Active Motif, Carlsbad, CA）用いて製造者の指示に従って採取した。核画分中のＮＦ−κＢレベルは、TransAM NF-kB Family Kit（Active Motif）を用いて製造者の指示に従って測定した。
【００６２】
ＮＦ−κＢの免疫蛍光組織化学：ＤＴＸ−Ｋ（１００nM ７、１５、３０および６０分間）で前処理または未処理の新たに分離した正常ヒトＴ細胞を沈殿させ（１２００ｇ、１０分、４０℃）、ＰＢＳに１ｘ１０６細胞／mlで懸濁し、遠心し（１２００ｇ、１０分）、ガラススライド上にサイトスピン（２５０μl／スライド、１５００rpm、５分；Shandon Elliot, London, UK）で固定し、透過処理を行い（１００mlの９５％メタノールおよび３ml氷酢酸を含む溶液２００μl／スライド）、１０％正常ヤギ血清、２％ＢＳＡ、１％グリシンおよび０．５％のTriton X-100を含むブロッキング培地中で（２００μl／スライド）インキュベーションした。それから細胞をウサギ抗−ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０ポリクローン抗体（１：５０希釈した８０μlと３０分間室温；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）で染色した。この第一回の染色後、細胞をＦＩＴＣ−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：５０希釈で３０分間室温；Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）に曝し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、それから細胞核に取り込ませるHoechst 33342に曝した（１：２０００希釈で５分間室温；Molecular Probes, Eugene, OR）。染色した細胞を、蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse E600)で可視化し、ＡＣＴ−１ソフトウエアープログラムを用いて、ｘ１００倍で写真撮影を行った。
【００６３】
チャンネルを含有するＫｖ１．１サブユニットの検出のための免疫染色およびフローサイトメトリー：新たに精製した正常ヒトＴ細胞を、透過処理（７０％エタノール、１時間、２０℃で）した後、一次抗体としてウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体（Alomone）を用いて、６μｇ／ml／１ｘ１０６細胞／１００μl、３０分間氷上で、免疫蛍光染色を行った。アイソタイプのコントロールとして、細胞を同じ濃度の以下のように調製した正常ウサギＩｇＧで染色した：健常コントロールの白色ニュージーランド雄のウサギから得た血清に等量の飽和硫酸アンモニウムを滴下する；混合液を１時間４℃で攪拌し、３０００ｇ１５分、４℃で遠心した。沈殿物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、硫酸アンモニウムのいかなる痕跡をも除くために、同じ溶液に対して一夜３回透析した。ＩｇＧ濃度の推定はＯ．Ｄ２８０で定量した（１．４５Ｏ．Ｄ２８０は１mgＩｇＧ／mlとした）。それから細胞を、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧを二次抗体として（１：１００希釈した１００μl、Jackson）染色した。二次抗体のみで染色した細胞を追加の陰性コントロールとした。蛍光像をＦＡＣＳｏｒｔに記録した。
【００６４】
ＰＮＨ患者および健常者個人コントロール：血清は１２人のＰＮＨ患者から採取したが、すべての患者は筋電図検査によって、全身性後天性疾患を確認し、又多発神経障害の臨床的または電気生理的証拠は無かった。どの患者も、造影ＣＴ縦隔上に胸腺肥厚または胸腺腫は有しなかった。血清採取の少なくとも１年前までは、どの患者も免疫療法は受けていなかった。年齢、性および地理的に一致させた４人の健常者個人コントロールから血清の供与を受けた。全ての患者から書面で、この研究に対するインフォームドコンセントを得、この研究は、Sefton Research倫理委員会、リバプール、UKによって許可された。血清Ｋｖ１抗体力価は、標準（１２５）Ｉ−アルファーデンドロトキシン免疫沈降アッセイ（Hart et al, 1997）によって検出した。この方法はＫｖ１．１、１．２および１．６に対する抗体を検出する。陽性力価は、１００pM以上に設定してある。５０pM未満の力価は陰性と見なす。ここで試験した１２人のＰＮＨ患者のうち７人はＫｖ１抗体に関しては陰性であった。ＰＮＨ患者の関連した臨床特徴を下に要約する。
ＰＮＨ Ｋｖ１抗体陽性（ＰＮＨ＋）
ＰＮＨ＋（１）：女性、４０歳、ＰＮＨ（３６歳で発症）および甲状腺機能低下症、Ｋｖ１ ２３９pM。
ＰＮＨ＋（２）：女性、４９歳、ＰＮＨのみ（４７歳で発症）、Ｋｖ１ ３３５pM。
ＰＮＨ＋（３）：男性、５２歳、ＰＮＨ（４０歳で発症）およびＤＭタイプ１、Ｋｖ１ ２３５pM。
ＰＮＨ＋（４）：男性、５２歳、ＰＮＨのみ（４３歳で発症）、Ｋｖ１ ３８２pM。
ＰＮＨ＋（５）：男性、５１歳、ＰＮＨ（５１歳で発症）および軽度の乾癬、Ｋｖ１ ３４６pM。
ＰＮＨ＋（６）：男性、４４歳、ＰＮＨのみ（４３歳で発症）、Ｋｖ１ １６５pM。
ＰＮＨ＋（４）：男性、２３歳、ＰＮＨのみ（２２歳で発症）、Ｋｖ１ ２５５pM。
ＰＮＨ Ｋｖ１抗体陰性（ＰＮＨ−）
ＰＮＨ−（７）：女性、４８歳、ＰＮＨのみ（４１歳で発症）。
ＰＮＨ−（８）：女性、４５歳、ＰＮＨ（３７歳で発症）およびレイノー病。
ＰＮＨ−（１０）：男性、５３歳、ＰＮＨのみ（５０歳で発症）。
ＰＮＨ−（１１）：男性、４９歳、ＰＮＨのみ（４４歳で発症）。
ＰＮＨ−（１２）：女性、４１歳、ＰＮＨのみ（１５歳で発症）および湿疹。
【００６５】
市販Ｋｖ１．１抗体またはＰＮＨ患者の血清の、Ｋｖ１抗体の存在あるいは非存在下での、正常ヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌の誘発能力の試験：新たに精製した正常ヒトＴ細胞（２ｘ１０６細胞／ml）を２４穴プレート中でインキュベーションし、ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体（１：１０００希釈；alomone）に２４時間曝した。培地に分泌されたＴＮＦ−αのレベルは、上記のようにＥＬＩＳＡ法によって検査した。
【００６６】
代わりに、Ｔ細胞（２ｘ１０６細胞／ml）をＫｖ１抗体−陽性ＰＮＨ患者、Ｋｖ１抗体−陰性患者または健常者の血清（１：１００希釈）に曝した。Ｔ細胞を含まない培養を陰性コントロールとした。２４時間インキュベーションした後、上清中のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを上記のように検査した。培地に分泌されたＴＮＦ−αのレベルは、抗−Ｋｖ１．１抗体陰性ＰＮＨ患者の血清に曝されたＴ細胞によって分泌される平均ＴＮＦ−αレベルの±２＊ＳＤを越えるならば、増加したとした。
【００６７】
ＳＣＩＤマウスへの、ＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞のインビボ注射：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウス腹腔内へ（ｉｐ）、シクロホスファミド（Sigma、２０mg／ml ＰＢＳ溶液）２００μlを細胞注射する２４時間前に注射した。新たに精製した正常ヒトT細胞（１ｘ１０８細胞）をDTX-K（１００ｎM、２４時間）またはＰＢＳで前処理し、洗浄し、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレッシンアセトキシメチル（BCECF AM、Molecular Probes, Eugene, Oregon）で蛍光標識した。それからヒトＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、懸濁し、標識細胞の２００μl（１．５ｘ１０７細胞に相当）をそれぞれの動物のｉｐに注射した（各群ｎ＝５）。２４時間後、各動物から血液を採取し、肝臓、脾臓、腎臓、骨髄および脳を取り出した。脳を除く全ての臓器から単細胞懸濁液を調製した。それぞれの臓器における総細胞数ならびに常在ＳＣＩＤ細胞（非蛍光）のみまたは注入したヒトＴ細胞（蛍光）のみの数をFACSortによって計測した。
【００６８】
脳の免疫組織化学：脳を取り出し、ブアン固定液に４℃で一夜浸し、ＰＢＳで洗浄し、パラフィン包埋を行うまで７０％エタノールに貯蔵した。連続７μ厚の冠状切片を切り、脱パラフィン、脱水し、家庭用Samsung電子レンジを用いてマイクロウエーブ処理を行った。これは、１mM ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ＝８．０）に浸し、沸騰するまで最高出力で加熱し、更に１０分間２０％効率で加熱し、同じバッファー中で、室温で３０分間冷却することにより行った。
【００６９】
免疫組織化学については、切片をＰＢＳ／２０％ウマ血清（ＨＳ）（Vector Laboratories, Burlingame, CA）と４℃で一夜前インキュベーションを行った。それから切片を、ラット抗−ヒトＣＤ３モノクローン抗体（ＰＢＳ／２％ＨＳで１：５０希釈；Serotec, Oxford, UK）と４℃で９６時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をビオチン化抗−ラットＩｇＧ（ＰＢＳ／２％ＨＳで１：１０希釈；Vector）と室温で１．５時間インキュベーションし、再び洗浄後Ｃｙ３結合したストレプトアビジン（ＰＢＳで１：２００希釈；Jackson）とインキュベーションした。切片を蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse E600）で観察し、ＡＣＴ−１ソフトウエアープログラムを用いてｘ４０倍率で写真撮影を行った。
【００７０】
統計解析：統計的有意差をStudent's t-testによって解析した。患者の異なった群間の定量的な変動を比較するために、非パラメータKruskal-Wallis テストを用い；次いで対での比較は非パラメータMann-Whitney U-testによって行った。
【００７１】
実施例２：正常ヒトＴ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの選択的遮断は、著しい又単独のＴＮＦ−α分泌を誘発する。
新たに精製した正常ヒトＴ細胞（「静止」正常ヒト末梢Ｔ細胞）を、他の刺激分子が全く存在しない状態で１２の異なったチャンネル遮断剤（表１参照）に曝した。これらの１２の遮断剤は、Ｔ細胞に発現されるＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ−チャンネルの殆どのタイプを遮断するそれら報告された能力に基づいて選択された（Deutsch ら, 1986; Lewis ら, 1995; Lewis ら, 1988; Rader ら, 1996; Freedman ら, 1995; Koo ら, 1997; Lin ら, 1993; Ishida ら, 1993; Jensen ら, 1999; Kotturi ら, 2003; Phipps ら, 1996; Verheugen ら, 1997; Levite ら, 2000; Chandyら, 1984）。培地へ分泌されるＴＮＦαのレベルは、ＥＬＩＳＡ法により２４時間後に試験した。陽性コントロールとして、Ｔ細胞を非特異的な様式で活性化することが知られている、強力なホルボールエステル、ＰＭＡに曝した。結果は図１Ａに示してあり、２〜３回の独立した実験において試験したＴＮＦ−α分泌の倍増率±ＳＤを表す。各イオンチャンネル遮断剤は、少なくとも２回の独立した実験において、その有効適用範囲のいくつかの濃度で試験した（材料と方法を参照）。各遮断剤の隣の図の数字は用いた最高のモル濃度を表す。統計解析：ＭｇＴＸ、ＫＴＸ、ＤＴＸ−ＫおよびＰＭＡのそれぞれについて、未処理に対して＊Ｐ＝０．０００１、０．０００５、０．００１１および０．０００５（Student's t-test）。
【００７２】
図１Ａは、電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの、高度に選択的なＫｖ１．１遮断剤であるデンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）(Harvey et al , 2001)（又該物として多くの研究に使用され、その内のいくつかは(Harvey et al , 2001)に引用されている）による遮断が、それだけで、ＴＮＦ−αの分泌を引き起こすことを示している。推奨される至適有効濃度（すなわち多くの他の研究において通常用いられるような、１００nM）で使用したＤＴＸ−Ｋは、試験したヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌の３３．４倍増を誘導したが、これは本明細書で陽性コントロールとして用いた、強力な非特異的活性化剤、ホルボールエステル（ＰＭＡ、４１．３倍増）によって得られるものと同規模であった。ＴＮＦ−α分泌の有意な増加は、カリオトキシン（ＫＴＸ）およびｒマルガトキシン（ＭｇＴＸ）によってもまた起きた（それぞれ１５．１および６．５倍増、図１Ａ）：これらは、電位依存性Ｋ＋チャンネルの遮断剤であって、主としてＫｖ１．３チャンネルに影響するが、Ｋｖ１．１チャンネルにも又影響する可能性がある。ＤＴＸ−Ｋは、ＫＴＸおよびＭｇＴＸと比較すれば、Ｋｖ１．１に対するより高い親和性と選択性を有している（例えば、Ｋｖ１．１に対するＫｉは、ＤＴＸ−Ｋは１６pMでありＫＴＸの２０nMよりもはるかに高い(Gutman et al , 2003)）。
【００７３】
ＤＴＸ−Ｋ、ＫＴＸおよびＭｇＴＸとは対照的に、正常ヒトＴ細胞を９つの他のイオンチャンネル遮断剤のいくつかの有効濃度に曝した後も、どんな有意なＴＮＦ−αの上方調節も観察されなかった（表１）が、その中には更なるＫ＋チャンネルの遮断剤（Ｋｖ１．１に対しては選択性がより少ない）：４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、クロトリマゾ−ル（ＣＬＴ），テトレエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、ｒカリブドトキシン（ＣＴＸ）およびキニーネ；Ｎａ＋チャンネル遮断剤：テトロドトキシン（ＴＴＸ）；Ｃｌ−チャンネル遮断剤：ＮＰＰＢ；Ｃａ２＋チャンネル遮断剤：R-(+)-Bay K8644 (+Bay K)；およびイオンチャンネル（イオンチャンネル内蔵型）グルタミン酸／ＡＭＰＡ受容体（ヒトＴ細胞中に高レベルで存在することが最近同定された）（Ganor et al, 2003）：ＣＮＱＸ。
【００７４】
ＤＴＸ−Ｋの誘発効果は、図１Ｂに示したように用量依存性である。１０−９Ｍ〜１０−６ＭのＤＴＸ−Ｋに対して２４時間曝露した後のＴＮＦ−α分泌の倍増±ＳＤを示す。行われた三つの実験のうち代表的なものを示す。未処理に対して＊Ｐ＝０．０００１である（Student's t-test）。ＴＮＦ−α分泌は、１００nM ＤＴＸ−Ｋに対して８．７倍で、１μMＤＴＸ−Ｋに対しては３９．５倍であった（注：図１Ａおよび１Ｂに示す結果は、別の二人のヒトから精製したＴ細胞に関するものである、下を参照のこと）。
【００７５】
続く実験で、我々は更なる１０人の個体から新たに分離したＴ細胞を試験し、ＤＴＸ−Ｋの効果は、再現性があることが分かった。図１Ｃ〜Ｈは、これらの６人のヒト個体からのＴ細胞のＤＴＸ−Ｋに対する被曝後（２４時間、１００nM）培地に分泌されたＴＮＦ−αの実際の平均濃度をpg／ml±ＳＤで示したものである（ａおよびｂに描かれた倍増率ではなく）。統計解析：１、３、５〜６の個体それぞれについて、未処理に対して＊Ｐ＝０．００５４、０．００５２、０．００６３および０．０１９７（Student's t-test）。本明細書ではpg／mlで示す、個体４および２のＴ細胞から分泌されたＴＮＦ−αは又、倍増率にて上に示している(それぞれ図ＡおよびＢ)。図１Ｃ〜Ｈは、Ｔ細胞由来のＴＮＦ−αのバックグラウンドレベルが異なっているにもかかわらず、ＤＴＸ−Ｋ（２４時間、１００nM）は、全ての６人の個体のＴ細胞による著しいＴＮＦ−αの分泌を誘発し、それぞれ２２．３、８．７、４９．０、３４．４、２．４および２．０の倍増率の結果になったことを示す。ＤＴＸ−Ｋ誘導性ＴＮＦ−α増加の最高値は、３８pg／mlから１３０８pg／mlであって、３４．４倍増を示している（図１Ｆ，個体４）。
【００７６】
注：ＤＴＸ−ＫはこれらのヒトＴ細胞の細胞生存または増殖に、有意な影響は持たなかった（データは示さず）。
【００７７】
実施例３：チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットのＤＴＸ−Ｋによる遮断は、ＴＮＦ−αの唯一的な分泌を誘起するが、一方「古典的な」ＴＣＲの活性化は、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の強健であるが、非唯一的な分泌を誘導する。
図２Ａ〜Ｈにおいて、正常ヒトＴ細胞を、１００nM ＤＴＸ−Ｋ（図２Ａ〜Ｄ）または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂｓ(図２Ｅ〜Ｈ)を用いた「古典的な」ＴＣＲ活性化に曝した。その後２４〜７２時間内に培地に分泌されるＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４のレベルを、ＥＬＩＳＡによって試験した。少なくとも３回の独立して行った実験のうちの代表的な実験の一つからの、ＴＮＦ−α（図２Ａおよび２Ｅ、２４時間）、ＩＮＦ−γ（図２Ｂおよび２Ｆ、２４時間）、ＩＬ−１０（図２Ｃおよび２Ｇ、７２時間）およびＩＬ−４（図２Ｄおよび２Ｈ，７２時間）の分泌の倍増率±ＳＤを示す。統計解析：未処理に対して＊Ｐ＝０．００５６（Ａ）、０．００５０（Ｅ）、０．００５１（Ｆ）、０．００５０（Ｇ）および０．００５３（Ｈ）（Student's t-test）。
【００７８】
興味あることには、ＤＴＸ−ＫによるＫｖ１．１の遮断はＴＮＦ−αのみを増加させたが、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のレベルには影響しないことが分かった（図２Ａ〜Ｄ，結果を、全４サイトカインの分泌の倍増率で表す）。これとは著しく対照的に、抗−ＣＤ３および抗−Ｄ２８抗体によって達成したＴＣＲ活性化は、全４つのＴｈサイトカインの強健であるが、非選択的な分泌を誘起した（図２Ｅ〜２Ｈ）。予想したように、ＴＣＲ活性化後のＴＮＦ−α分泌の規模は、ＤＴＸ−Ｋ処理後に得られるものに比べて、ずっと大きかった（図２Ｅに対する図２Ａ）。ＴＣＲ活性化の間または後に、ＤＴＸ−ＫによってＴ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットを遮断しても、ＴＣＲ活性化のみによって達成された以上には、ＴＮＦ−αレベルの更なる増加は起こらなかった（データは示されない）。
【００７９】
実施例４：Ｔ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断により、長期間のＴＮＦ−αの増加が生じる
Ｔ細胞のＴＮＦ−α分泌は、ＴＣＲ活性化後、通常は２４時間でピークに達し、その後徐々に低下する。それ故、Ｔ細胞内のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断によって起きるＴＮＦ−α分泌を調査し、この時期にピークに達するかどうか、および分泌が一時的かあるいは長期なものかを検討した。図２Ｉおよび２Ｊにおいて、個体４（図２Ｉ）および個体５（図２Ｊ）（既に図１Ｆ、２Ｇに示した同じ二人の個体）からの正常Ｔ細胞を１００nM、ＤＴＸ−Ｋに曝し、その後異なった時点でＥＬＩＳＡ法により、培地をＴＮＦ−αについて検査した。それぞれの個体について、それぞれの時点でのＴＮＦ−α分泌の倍増率±ＳＤを示す。個体４のそれぞれ１６、２４、４８および７２時間において、未処理に対して＊Ｐ＝０．００５３、０．００５２、０．００５０および０．００５３であり；個体５のそれぞれ１６、２４、４８および７２時間において、未処理に対して＊Ｐ＝０．００５７、０．００６３、０．００７２および０．００３１６であった（Student's t-test）。
【００８０】
この実験により、ＤＴＸ−Ｋに誘導されたＴＮＦ−α分泌の動態が(図２Ｉ，２Ｊ)、それらのバックグラウンドおよびＤＴＸ−Ｋに誘導された、T細胞由来のＴＮＦαレベル(図１Ｆ、２Ｇ)と比較していく分異なっていることを明らかにする。これらの相違にもかかわらず以下の二つの特徴は共通している：１）有意に増加したＴＮＦ−αの分泌は、１６時間後において既に明らかである；２）ＴＮＦ−αの分泌は、ＤＴＸ−Ｋ処理の開始から７２時間後であっても有意に高い状態を維持した。
【００８１】
実施例５：ＤＴＸ−Ｋ誘導性ＴＮＦ−α分泌にはＴ細胞膜を通してＣａ２＋の流入が必要とされる。
Ｃａ２＋は、ＴＮＦ−αの転写に関与していることが知られている(Lobo et al, 1999)。これに基づいて、Ｔ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットを遮断することによって生じる著しいＴＮＦ−αの分泌には、「連続的な」Ｃａ２＋の流入が必要となるかどうかを検討した。Ｔ細胞内に発現されたＬ型Ｃａ２＋チャンネルの強力で非常に選択的な遮断剤を用いた：(R) - (+) - Bay K 8644であって、ＤＴＸ−Ｋ（１００nM）の添加の５分前に正常ヒトＴ細胞に加えた。選択的なＣａ２＋チャンネル遮断剤は、ＤＴＸ−ＫのＴＮＦ−αの分泌を引き起こす能力を完全に阻止したが、対照として加えたＣｌ−チャンネル遮断剤、ＮＰＰＢ(表１)は、該阻止能力を有しなかった(図２Ｋ)。この実験において、Ｋｖ１．１遮断（１００nM ＤＴＸ−Ｋ、２４時間）に対する反応におけるＴＮＦαの分泌は、Ｔ細胞を１００μM +Bay-K（高度の選択的な、Ｔ細胞中で発現されたＣａ２＋チャンネル遮断剤で、ＤＴＸ−Ｋの５分前に加えられた）で前処理した場合は、完全に阻止されたが、関係ないＣｌ−チャンネル遮断剤、ＮＰＰＢの１００μMで前処理を行った場合は阻止されなかった。結果は、実施した３回の実験の一つからのＴＮＦ−αの分泌の平均（pg／ml）±ＳＤを表している。統計解析：未処理に対して＊Ｐ＜０．０００１、ＤＴＸ−Ｋのみに対して＊＊Ｐ＜０．０００１（Student's t-test）。
【００８２】
実施例６：Ｔ細胞内のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断により、またＴＮＦ−α ｍＲＮＡレベルも増加する。
次に、Ｔ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断により、ＴＮＦ−αタンパクだけではなく、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡのレベルも増加するかについての問題を研究した。この問題を研究するために、ＤＴＸ−Ｋをヒト正常Ｔ細胞に２４時間加え、ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに転写し、ＴＮＦ−α特異的なプライマーを用いて、特異的なＴＮＦ−αＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写の効率のコントロールとして、内部標準（リボソームＳ１４タンパク）を用いた更なるＲＴ−ＰＣＲ反応を同時に行った（すなわち同じＰＣＲチューブにおいて）。さらに具体的に言うと、正常末梢ヒトＴ細胞を１００nMＤＴＸ−Ｋに２４時間曝した。それからｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦαおよび内部コントロール、すなわちリボソームＳ１４タンパク、に対する特異的なプライマーを用いて、同じＰＣＲチューブ内で同時に二つのＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅した。結果を図３Ａに示す。上段のバンド：ＴＮＦ−α（予想される産物のサイズ：４９４ｂｐ）；下段バンド：Ｓ１４（予想される産物のサイズ：１６６ｂｐ）。下の棒グラフは、ＴＮＦ−α／Ｓ１４の対応するＲＴ−ＰＣＲバンドの濃度解析および正規化の後に計算したＴＮＦ−αｍＲＮＡの倍増率を表す。ＮＣ＝陰性コントロール（ｃＤＮＡ無し）。
【００８３】
図３Ａは、チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットのＤＴＸ−Ｋによる遮断によって、実際、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡレベルが増加することを示している。
【００８４】
実施例７：チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断は、正常ヒトＴ細胞のＮＦ−
κＢの活性化を導く。
ＴＮＦ−αは（ＩＬ−１のような他の炎症促進性のサイトカインのように）ＮＦ−κＢを活性化させるだけではなく、ＮＦ−κＢによってもまた誘導される（Siebenlist et al, 1990）。ＴＮＦ−α遺伝子の場合は、ＴＮＦα遺伝子の発現に対して観察されたＮＦ−κＢの重要性は、細胞タイプと解析された、エンハンサー／プロモータの区域に依存するのかも知れない（Siebenlist et al, 1990）。これらに基づいて、正常ヒトＴ細胞（ここでもまた、いかなる他の刺激の完全に存在しない状態で）におけるＫｖ１．１チャンネルの遮断が、ＮＦ−κＢに影響を及ぼすことができるかを我々は検討した。これを二つの技術によって研究した：１）未処理およびＤＴＸ−Ｋ処理正常ヒトＴ細胞から核抽出物を調製し、市販の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって核ＮＦ−κＢ結合配列に結合したＮＦ−κＢの量を測定する；２）抗−ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０特異的抗体、ＦＩＴＣ結合抗−ヒトＩｇＧおよび細胞核を特異的に染色するHoechst 33342を用いて、免疫組織化学染色法によって、推定されるＮＦ−κＢの核への移行を可視化する。
【００８５】
核抽出物を数時間加えたが、そのうち７分のみを示す。ＯＤ±ＳＤで示した結果は、市販のＥＭＳＡによって定量された、核ＮＦ−κＢ結合配列に結合したＮＦ−κＢの量を反映している。別個に行った二つの実験の一つを図３Ｂに示す。統計解析：＊Ｐ＝０．００９２（Student's t-test）。
【００８６】
ＯＤ値が核ＮＦ−κＢ結合配列に結合しているＮＦ−κＢの量を表す、図３Ｂから見られるように、ＤＴＸ−Ｋ添加後７分で核抽出物に存在するＮＦ−κＢのレベルは有意に増加した。予想されたように、この増加は一時的なものであって、しばらく経つと試験した点はもはや検出されなかった（データは示していない）。ＥＭＳＡによって検出したこの結果は、図３Ｃに示す二重免疫蛍光写真と一致していた。図３Ｃに結果が示してある実験において、正常ヒトＴ細胞は、処理しないかまたはＤＴＸ−Ｋで７、１５、３０および６０分処理した（それぞれのカラムの上のＤＴＸ−Ｋ処理時間を参照）。免疫蛍光組織化学染色は、抗−ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０抗体、次いでＦＩＴＣ結合抗−ヒトＩｇＧを用いて行うか、あるいは細胞核に取り込まれるHoechst 33342を用いて行った。拡大率ｘ１００の代表的な写真は、ＮＦ−κＢ ｐ５０緑色蛍光（上段のパネル）、核の青色蛍光（中段パネル）両者を重ねたもの（下段パネル）を示す。研究したＴ細胞の外形サイズ（明視野）および核（Hoechst）は、左のカラムに示す。従って、図３Ｃは、ＤＴＸ−Ｋ添加後７分（左から３番目のカラム）で細胞核（Hoechst青色蛍光）は明瞭にＮＦ−κＢ ｐ５０陽性（緑色蛍光）であるが、未処理の細胞においてはそうではなく、又試験した後の三つの時点：１５，３０および６０分では（図３Ｃ，それぞれ三つの右のカラム）ＮＦ−κＢ ｐ５０の蛍光は見られなかった。注目すべき点は、ＤＴＸ−Ｋ処理後７分において、細胞質（Hoechst 陰性）は、ＮＦ−κＢ ｐ５０に対して陽性に染色されたが（図３Ｃ，左から３番目のカラム）、未だ明瞭でない理由により細胞質ＮＦ−κＢ ｐ５０は、未処理細胞においては観察されない。唯一の論理的なしかし推測でしかない、考えられる説明は、本明細書で用いる抗−ｐ５０抗体は立体構造にいくらか敏感であり、もしそうなら活性化およびＮＦ−κＢ阻害剤ＩκＢ(Siebenlist et al , 1990)の放出後、細胞質ｐ５０は、この抗体によって検出しやすくなる可能性がある。
【００８７】
実施例８：正常ヒトＴ細胞は電位依存性Ｋｖ１．１タンパク質およびｍＲＮＡを発現する。
先の研究は、機能的な（すなわち電気生理的に活性を有する）チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットは、主として脳、心臓、網膜、骨格筋および膵島で発現されていることを示した（Beckh et al , 1990; Klumpp et al , 1991; Matsubara et al, 1991; Roberds et al, 1991; Tsaur et al, 1992）。対照的にＴ細胞中のＫｖ１．１電流に関しては、先の研究から現れる像は不明瞭である。いくつかの研究では、パッチ−クランプ技法によってヒトＴ細胞がＫｖ１．１の特徴を発現するかを試験したが、該電流を同定することができなかった（例えば(Cahalan et al, 1985)）。しかしこれと対照的に、Freedman et alはマウスＣＤ４−ＣＤ８−胸腺細胞によるＫｖ１．１電流／発現を示し(Freedman et al, 1995)、Liu et alは、いくつかの方法の使用に基づいて、未処理のマウスＣＤ４＋リンパ球に発現している電流は、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．３およびＫｖ１．６と一致すると報告した(Liu et al, 2002)。本明細書においては、Ｋｖ１．１の全く新規な面を研究して、正常末梢ヒトＴ細胞においてＫｖ１．１タンパクおよび、ｍＲＮＡの発現を確認することを欲した（本研究の範囲を逸脱するＫｖ１．１電流について再び試験することなしに）。本方法は、Ｋｖ１．１特異的なプライマーを用いたＫｖ１．１特異的ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＫｖ１．１特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー（この目的のためには今まで使用されていなかった方法）を含む。
【００８８】
図４Ａは、ｃＤＮＡを正常末梢ヒトＴ細胞から調製し、Ｋｖ１．１特異的プライマーを用いてＫｖ１．１特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す（上段バンド；予想産物サイズ：７０９ｂｐ）。コントロールＰＣＲは、同時に同じＰＣＲチューブで、リボソームＳ１４プライマーを用いて行った（下段バンド；予想産物サイズ：１６６ｂｐ）。図４Ａは、Ｋｖ１．１特異的ｍＲＮＡが実際に正常ヒトＴ細胞のｃＤＮＡから増幅されることを示す。更に加えて、Ｋｖ１．１特異的な免疫蛍光染色を行った。Ｔ細胞は、ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体（図４Ｂ、実太線）あるいはアイソタイプコントロール非特異的染色として、正常ウサギＩｇＧ（図４Ｂ、破線）で染色し、それからＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧで染色した。Ｋｖ１．１発現は、FACSortによって評価した。五つの独立した実験（異なった個体のT細胞を用いた）の一つを示す。ここでヒトT細胞の４９．０％は、Ｋｖ１．１陽性であった。行われた他の四つの実験においては、Ｋｖ１．１陽性T細胞の百分率は４０−８０％の間で変異した。従って、図４Ｂは、フローサイトメトリー解析によって、Ｋｖ１．１タンパク質が正常末梢ヒトＴ細胞のかなり実質的な割合で細胞表面に明瞭に発現していることを示す。
【００８９】
実施例９：市販の抗−Ｋｖ１．１チャンネル抗体は顕著なＴＮＦ−αの分泌を誘発し、それにより選択的なＫｖ１．１遮断剤の効果を模倣する。
この実験において、抗−Ｋｖ１．１特異的抗体が、Ｋｖ１．１チャンネル遮断剤、ＤＴＸ−Ｋのように作用し、ＴＮＦ−αの分泌を増加させるかを、我々は検討した。３人の更なる個体(各個体７−９)からの正常ヒトＴ細胞を、市販のウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体とインキュベーションし（１：１０００倍希釈、２４時間）、培地中に分泌されたＴＮＦ−αのレベルをＥＬＩＳＡ法によって試験した。結果を図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅに示し、各個体のＴ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの平均±ＳＤを提示する。それぞれ未処理の個体７〜９に対して、＊Ｐ＝０．０００３、０．００５７、および０．００２１であった（Student's t-test）。
【００９０】
図４Ｃ〜４Ｅは、３人の異なった該被験体に由来する正常ヒトＴ細胞と２４時間インキュベーションした、市販の抗−Ｋｖ１．１抗体は、これらの細胞によって分泌されるＴＮＦ−αの量を、それぞれ７．２、１４．８および２３．２倍増を誘導したことを示す。ここで注意すべきことは、ここで用いた抗−Ｋｖ１．１抗体はＫｖ１．１チャンネルの細胞内エピトープに対して指向性を有していることである。この抗体は、Ｔ細胞内に侵入した後ＴＮＦ−αの分泌を誘導すると考えられているが、これは抗体の生体細胞内に侵入する能力を明瞭に示した先の報告に基づいている(Alarcon-Segovia et al , 1996; Ruiz-Arguelles et al, 2003)。事実、種々の自己免疫疾患において、病原となる抗体は細胞内エピトープに対して指向性を有しており（例えば、全身性エリテマトーデスにおける抗−ＤＮＡおよび抗−リボヌクレタンパク抗体）(Alarcon-Segovia et al , 1996; Ruiz-Arguelles et al, 2003)、細胞内に侵入後にのみそれらの有害な効果を発揮する。
【００９１】
実施例１０：Ｋｖ１抗体陽性末梢神経過剰興奮症（ＰＮＨ）血清は、正常ヒトＴ細胞
によるＴＮＦ−αの分泌を著しく促進する。
この実験は、ＰＮＨ患者の血清に存在する病原性のＫｖ１抗体（すなわち、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６抗体）(Hart et al, 2002)が、市販Ｋｖ１．１抗体およびＤＴＸ−Ｋの作用を再現するか、又ヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌を増加させるかを検討する。ＰＮＨの通常提示される臨床症状は、筋肉のれん縮、硬直、こわばりおよび脱力感であって、多汗症、偽性ミオトニー現象、偽性テタニーおよび感覚性の症状である（Newsom- Davis et al, 1993）。加えて、ＰＮＨ患者は、ＣＮＳ症状を有することもある（Vincent et al, 2004）。ＰＮＨの殆どの症例は自己免疫症であって、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６抗体の混合物である循環性のＫｖ１抗体（Hart et al, 002）によって起こる。
【００９２】
この仮説を試験するために、正常末梢ヒトＴ細胞を健常コントロール被験体（Ａ群）Ｋｖ１抗体陽性ＰＨＮ患者（Ｂ群）またはＫｖ１抗体陰性患者（Ｃ群）の任意の血清に（１：１００倍希釈）に曝した。全ての群は年齢、性および地理的に適合させた（方法を参照）。続く２４時間に培地に分泌されたＴＮＦ−α（図４Ｆ）またはＩＮＦ−γ（図４Ｇ）のレベルは、ＥＬＩＳＡ法によって試験した。結果は、行われた三つの独立した実験の平均である。図４Ｆにおいて、水平バーおよびそれぞれの数値は中央値を表す。ここでは下カットオフ（カットオフＡ）である破線は、コントロール群の血清に曝されたＴ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの平均＋２＊ＳＤを表し；ここでは上カットオフ（カットオフＣ）は、Ｋｖ１−陰性ＰＮＨ血清に曝されたＴ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの平均＋２＊ＳＤを表す。グラフに示されたそれぞれの数値は、分泌されたＴＮＦ−αの実際の平均量（pg／ml）を表す。３つのＫｖ１陽性ＰＮＨ患者（つまり、ＰＮＨ＋５，２および６）の血清は、明瞭にカットオフＣの上のＴＮＦ−αの分泌の増加を誘導した（しかしＩＮＦ−γは誘導されない）。統計解析：ＫＷ統計＝８．０００３、Ｐ＝０．０１８３，Kruskal-Wallis 検定。対比較はMann-Whitney Ｕ検定でおこなった：Ａ群対Ｂ群、Ｐ＝０．０１１７、Ａ群対Ｃ群、Ｐ＝０．００８７、Ｃ群対Ｂ群、Ｐ＝０．６２８２。
【００９３】
図４は、いく人かのＫｖ１抗体陽性ＰＮＨ患者の血清は、健常コントロール被験体または検出可能なＫｖ１抗体を有しないＰＮＨ患者からの血清によって誘導されるよりは有意に高い、著しいＴＮＦαの分泌を誘導することを示している。更に、ＴＮＦ−α誘発効果は、抗体力価と正の関係にあった（材料および方法参照）。ＰＮＨ患者からの血清の同体積および濃度を含むがＴ細胞を含まない、陰性コントロール実験培養には、ＴＮＦ−αレベルに影響は無かった。重要なことには、ＰＮＨ患者のＫｖ１抗体陽性血清は、ＴＮＦ−αの増加を誘導したが、ＤＴＸ−Ｋで観察された（図２）と同様に、ＩＮＦ−γの増加は誘導せず（図４Ｇ）、この効果の選択性を確認している。総合的に、この一連の実験は、増加したＫｖ１抗体力価を含むいくつかのＰＮＨ患者の血清は、正常ヒトＴ細胞による著しいＴＮＦα分泌を誘導し、それによって市販抗−Ｋｖ１．１抗体および選択的Ｋｖ１．１遮断剤、ＤＴＸ−Ｋの効果を模倣することを示した。
【００９４】
実施例１１：前処理Ｋｖ１．１遮断により上昇したＴＮＦ−αレベルを分泌する正常ヒトＴ細胞を、ＳＣＩＤマウスへ注射することで、肝臓へ宿主細胞を選択的に動員させる。
Ｋｖ１．１の選択的遮断に反応しているヒトＴ細胞によって分泌するＴＮＦ−αが、インビボにて機能的であるかを試験するために、我々は、最近の研究を想起したが、それは、脳内へＴＮＦ−αを投与に続いて一連の現象が起こり、その中には、特異的に肝臓に蓄積する宿主のＥＤ１−陽性細胞（すなわち常在および活性化クッパー細胞／動員された血中単球）の急速な２倍までに増加する、というものであった（Campbell et al, 2005）。我々は、ＤＴＸ−Ｋ処理済のヒトT細胞によって分泌された、増加したＴＮＦ−αも該効果を誘導するかを検討した。このことを試験するために、新たに精製した正常ヒトT細胞を、ＰＢＳまたは１００ｎM ＤＴＸ−Ｋに２４時間曝し、洗浄し、蛍光標識を付け、それから後者の細胞が増加したＴＮＦ−αを分泌していることを確認した後(データは示していない)、ＳＣＩＤマウス（すなわち自身のリンパ細胞を欠いている）に注射した（各群ｎ＝５）。肝臓、骨髄、脾臓、および腎臓の単細胞懸濁ならびに血液細胞に存在する、細胞の総数、ならびに常在ＳＣＩＤ細胞のみ（非蛍光）および注射されたヒトＴ細胞のみの数を、２４時間後FACSortによって計測した。肝臓に関しては、結果は非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の平均±ＳＥＭ数（図５Ａ）および蛍光標識ヒトＴ細胞の平均±ＳＥＭ数（図５Ｂ）で表される。他の臓器に関しては、非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の数のみを示す：骨髄（図５Ｃ）、血液（図５Ｄ）、脾臓（図５Ｅ）および腎臓（図５Ｆ）、未処理に対して＊Ｐ＜０．０００１（Student's t test）。図５Ｇは、注入されたヒトＴ細胞の検出のために、エクスビボにてＤＴＸ−Ｋと前インキュベーションしたヒトＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウスの脳切片の免疫組織化学像を示す。ＳＣＩＤマウスにＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞を注射後２４時間、ＣＤ３陽性細胞が脳皮質内に検出されることを示すｘ４０の拡大率の代表的な写真である。
【００９５】
図５ＡはＴＮＦ−αを分泌しているＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞の注入は、肝臓における細胞数を２倍にしたことを示す。我々が依拠した関連研究において(Campbell et al, 2005)、この効果は肝臓に限定されていて、骨髄、血液、脾臓、および腎臓における細胞総数は、有意には変化しなかった（それぞれ図５Ｃ〜５Ｆ）。更に、予想されるように、肝臓における細胞数の増加はマウス（ＳＣＩＤ）宿主細胞の動員に由来するもので(図５Ａ)、受動的に移したヒトＴ細胞がこの臓器に入ったことに由来するのではなかった(図５Ｂ)。技術的な制限によって、動員したマウス細胞の正確な同定は、行わなかった。最後に、脳の切片の免疫組織化学像は、注射されたＳＣＩＤマウスの皮質内に、注射されたＤＴＸ−Ｋ処理済のヒトＴ細胞の存在を明らかにした（図５Ｇ）これは、原則として、肝臓への宿主細胞の生体内動員は、脳内で作動しているＴＮＦ−α（すなわちＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞によって脳へ送達されたＴＮＦ−α）によって介される可能性を示唆しており、ＴＮＦαを脳内に注射後、宿主細胞が肝臓に動員された最近の報告に類似している(Campbell et al, 2005)。実際、ＴＮＦαのＢＢＢを混乱させる能力に基づけば(Mayhan 2002)、ＤＴＸ−Ｋ処理細胞が脳に侵入することができることは、驚くには当たらない。脳に到達した未処理およびＤＴＸ−Ｋ処理ヒト細胞の数の間の統計的に正当な比較は不可能である。最後の注意点として、肝臓に動員されたマウスＳＣＩＤ細胞が、ヒトＴＮＦ−α（ＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞によって分泌される）に反応できたことは、我々にとって驚くべきことではない。なぜならマウスＴＮＦ−α受容体１型は組み換えマウスおよびヒトＴＮＦ−αの両方に同様な親和性を有しているからである（Lewis et al, 1991）。更にヒトＴＮＦ−αを発現しているトランスジェニックマウスは、リウマチ性関節炎を有するヒトの患者の特徴である多くの徴候を発現し（Keffer et al, 1991; Li et al , 2003）、マウス起源の細胞がヒトＴＮＦ−αに応答することができることを示唆している。
【００９６】
具体的な実施形態の先の記述は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにしているので、他者は、現在の知識を応用することにより該具体的な実施形態を、必要以上の実験を行うこと無く、一般概念から逸脱すること無く、容易に改変しおよび／または種々の応用に適応することができ、それ故該適応および改変は、開示した実施形態と等価の意味と範囲内に包含することを意図すべきであり、また意図している。本明細書で用いられた言葉使いや用語は、記述するためであって、限定するもので無いことを理解されたい。種々の開示した機能を実施するための手段、材料および段階は、本発明から逸脱すること無く種々の代替型を取ってもよい。従って、上記の明細書および／または請求項に存在する可能性のある、「・・・に対する手段」および「・・・のための手段」あるいは機能的な記載に続くいかなる方法段階の用語は、あらゆる構造、物理的、化学的または電気的要素または構造、もしくは現在または将来存在する可能性のある、引用した機能を実施するいかなる方法段階をも包含することを意図している、すなわち同じ機能を実施するための他の手段または段階を用いることができ；該表現はその最も広義に解釈されることを意図している。
【００９７】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１Ａは、それぞれの試験されたイオンチャンネル遮断剤についての、ＴＮＦ−αの倍増率を示すグラフである。 図２Ｂは、用量の関数としてのＴＮＦ−αの倍増率を示すグラフである。 図１Ｃ〜Ｈは、６人の異なった該被験体についての、それぞれのＤＴＸ−Ｋ誘導ＴＮＦ−α分泌の量を示すグラフである。
【図２】図２Ａ〜Ｈは、ＤＴＸ−Ｋ（図２Ａ〜Ｄ）または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂ（図２Ｅ〜Ｈ）に曝された正常ヒトＴ細胞によって分泌された種々のサイトカインのレベルを示す。ＴＮＦ−α分泌の倍増率を図２Ａおよび２Ｅに、ＩＦＮγを図２ＢおよびＦに、ＩＬ−１０を図２ＣおよびＧに、ならびにＩＬ−４を図２ＤおよびＨに示す。 図２ＩおよびＪは、二人の異なった該被験体においてそれぞれのＴＮＦ−α分泌の倍増率を、時間の関数として示したグラフである。 図２Ｋは、未処理、ＤＴＸ−Ｋのみの処理、またはＢａｙ−ＫまたはＮＰＰＳのいずれかで最初に前処理済のＴ細胞についてのＴＮＦ−α分泌を示すグラフである。
【図３】図３Ａにおいては、正常末梢ヒトＴ細胞をＤＴＶ−Ｋに曝した後、上部のバンドはＴＮＦ−α（予想産物サイズ：４９４ｂｐ）および下部のバンドはＳ１４（予想産物サイズ：１６６ｂｐ）を示す。下の棒グラフは、濃度測定分析および対応するＴＮＦ−α／Ｓ１４のＲＴ−ＰＣＲバンドの規格化の後計算したＴＮＦ−αｍＲＮＡの倍増率を表す。ＮＣ＝陰性対照（ｃＤＮＡ存在せず）。 図３Ｂは、１００nMＤＴＸ−Ｋに先に曝された正常Ｔ細胞から調製した核抽出物における、核ＮＦ−κＢ−結合配列に結合したＮＦ−κＢの量を示す。 図３Ｃは、正常ヒトＴ細胞が未処理であるか、または１００nM ＤＴＸ−Ｋと７、１５、３０および６０分処理済の（上記ＤＴＸ−Ｋ処理時間についてはそれぞれのカラムを参照）、二重免疫蛍光写真を示す。拡大率ｘ１００の代表的な写真は、ＮＦ−κＢ ｐ５０ 緑蛍光（上段パネル）、核 青色蛍光（中段パネル）および両者を重ねたもの（下段パネル）を示す。試験したＴ細胞（明視野）および核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）の外形サイズを左のカラムに示す。
【図４】図４Ａは、Ｋｖ１．１特異的なプライマーを用いて行ったＫｖ１．１特異的なＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（上段バンド；予想産物サイズ；７０９ｂｐ）。コントロールＲＴ−ＰＣＲは、リボソームＳ１４プライマーを用いて同じＰＣＲチューブの中で同時に行った（下段バンド；予想産物サイズ；１６６ｂｐ）。 図４Ｂは、Ｔ細胞を、ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体で（図４Ｂ、太実線）、または、アイソタイプコントロール非特異的染色として、正常ウサギＩｇＧ（図４Ｂ、破線）で染色し、それからＦＩＴＣ結合抗−ウサギＩｇＧで染色した後の、ＦＡＣＳｏｒｔの結果を示す。 図４Ｃ〜Ｅは、３人の異なった該被験体のそれぞれ個人のＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌の平均値の結果を示したもので、それらのＴ細胞を市販ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体とインキュベーションした。 図４ＦおよびＧは、正常末梢ヒトＴ細胞を、健常コントロールの個人（Ａ群）、Ｋｖ１抗体−陽性ＰＨＮ患者（Ｂ群）またはＫｖ１抗体−陰性ＰＨＮ患者（Ｃ群）の血清に曝し、培地中に分泌されたＴＮＦ−α（図４Ｆ）またはＩＦＮ−γのレベルを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、新たに調製した正常ヒトＴ細胞を、ＰＢＳまたは１００nM ＤＴＸ−Ｋに２４時間曝し、洗浄し、蛍光標識を付け、それからＳＣＩＤマウスに注射した後の結果を示す。グラフは、肝臓、骨髄、脾臓および腎臓の単細胞懸濁液ならびに血液に存在する細胞の総数、ならびに常在のＳＣＩＤ細胞（非蛍光）のみの数および注射されたＴ細胞（蛍光）のみの数を示す。図５Ａは、肝臓における非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の平均±ＳＥＭ数を示し、又図５Ｂは、肝臓における蛍光標識されたヒトＴ細胞の平均±ＳＥＭを示す。他の器官については、非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の数だけを示す：骨髄（図５Ｃ）、血液（図５Ｄ）、脾臓（図５Ｅ）および腎臓（図５Ｆ）。 図５Ｇは、注入されたヒトＴ細胞の検出のために、ＤＴＸ−Ｋとエクスビボにて前インキュベーションしたヒトＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウスからの脳切片の免疫組織化学像を示す。ＳＣＩＤマウスにＤＴＸ−Ｋ処理したヒトＴ細胞を注射後２４時間、ヒトＣＤ３陽性細胞が皮質内に検出されることを示す、拡大率ｘ４０の代表的な写真を提示する。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
３０年前に分離された腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、アポトーシスおよび細胞生存、ならびに炎症および免疫において主要な役割を果たす多機能なサイトカインである。その抗腫瘍性から名付けられたが、ＴＮＦは広範囲の他の疾患に関わるとされる。現在癌におけるＴＮＦの使用は、局所的に進行した軟組織肉腫、転移メラノーマおよび組織学的な他の切除不可能な腫瘍の局所的な治療において患肢の切断を避けるためのものである。ＴＮＦ−αは、分離患肢潅流の設定において、細胞増殖抑制剤と相乗的に作用することが示された。ＴＮＦ−αとＴＮＦの受容体１および２（ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２）の相互作用は、いくつかのシグナル伝達経路を活性化させ、ＴＮＦ−αの多様な機能を発揮させる。ＴＮＦＲ１のシグナル伝達分子は、非常に良く解明されているが、シグナル伝達の制御については不明である。これらの分子についての洞察のほかに、過去１０年間の研究室における実験は、腫瘍治療期間中のＴＮＦ−αの作用に光を当てた。出血性壊死を引き起こす、赤血球およびリンパ球の血管外遊出の他に、ＴＮＦ−αは、血管内壁の透過性増大および破壊を誘導することによって、腫瘍関連脈管構造（ＴＡＶ）を標的とする。この結果、腫瘍内での細胞増殖抑制剤の選択的蓄積の即効性、および腫瘍の脈管構造の破壊の遅発性効果が起こる。最近公表された総説（van Horssen等（２００６））は、ＴＮＦ−αについて分子から臨床までを記述し、ＴＮＦＲ−１シグナル伝達の分子的洞察およびＴＮＦ−αの抗腫瘍活性の細胞機構から始まり、臨床反応で終わる、癌におけるＴＮＦ−αの使用の概観を提供している。更に加えて、ＴＮＦ−αの活性をモデュレーションしている可能性のある因子についても議論している。
【０００２】
ＴＮＦ−αが、１９７５年バクテリアエンドトキシンで処理済のマウスの血清から「Coleyの毒素」の活性成分として分離され、マウスの腫瘍に出血性壊死を引き起こすことが示された。ニューヨークの外科医であったWilliam Coleyが、彼の調製した細菌濾液（「Coleyの混合毒素」）でいく人かの癌患者を治療した際に高熱と腫瘍の壊死を観察したのは、殆ど1世紀前であった。その分離の１０年後、ＴＮＦ−αは又「カケクチン」およびＴ細胞分化因子と位置づけられた。１９８４年ヒトＴＮＦ−α遺伝子がクローン化され、一連の臨床実験が設定され、分離潅流の設定における患肢を脅かすＳＴＳの治療のための、欧州医薬品審査庁からの認可を得た（上記に関してはvan Horssen等（２００６）、およびそこに引用した論文を参照）。
【０００３】
赤血球を除いて、実際ほとんどすべての細胞型に発現している２つの高親和性受容体、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）およびＴＮＦＲ２（ｐ７５）を活性化することにより、ＴＮＦ−αは、後天的免疫性および自然免疫性、ウィルスおよび細菌のような外来の侵入物と闘うために必要な炎症の誘導、腫瘍の根絶、オリゴデンドロサイトの再生と増殖の促進、神経の再ミエリン化その他多くのものを含め、めまぐるしく変化する病気において主要な役割を果たしている。
【０００４】
Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも呼ばれる）は、ＴＮＦ−αの主要な源である。Ｔ細胞からＴＮＦ−αの分泌を引き起こすことが知られている主要な刺激は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与であって、自己主要組織適合性複合体分子の構成において、抗原提示細胞によってＴ細胞に提示される抗原と、Ｔ細胞の出会いの時に起こるのと類似している。該「古典的な」ＴＣＲ活性化により、Ｔ細胞は強健なしかし非選択的なサイトカイン分泌（すなわちこれらの細胞によって分泌され得る全てのサイトカインの同時分泌）を引き起こす。
【０００５】
ＴＮＦ−αは、ヒトの生理および病理において二重の役割を果たす：一方ではＴＮＦ−αは、疾患と闘い治療するために決定的に必要とされる；他方過剰のＴＮＦ−αは、疾患および組織破壊を引き起こすため、有害である。
【０００６】
一般的に、先天的免疫反応の活性化におけるＴＮＦ−αの主要機能は、種々の型の外来侵入物から体を保護するために、および癌細胞を根絶するために、有益で重要であると一般的に考えられている。ＴＮＦ−αは又、種々の分子に対する血管および血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を大幅に増加させ、および組織への移動と侵入に必要とされる、白血球のローリングと付着を増大させる。したがって、ＴＮＦ−αの欠如または不足は、広範囲で病的な結果を招くことは明らかであり、その結果の中には、免疫能および、感染性生物と対抗し、癌等を根絶する能力の低下が含まれる。
【０００７】
ＴＮＦ−αが癌細胞を殺す能力に基づき、ＴＮＦ−αは、分離患肢潅流（ＩＬＰ）の現場において、軟組織肉腫（ＳＴＳ）、種々の組織学的切除不可能な腫瘍、および患肢に限定された移行転移メラノーマに対する癌治療に現在用いられている（van Horssen等（２００６）およびそこに引用した論文）。
【０００８】
van Horssen等（２００６）の表１に、高悪性度（Wallach等、１９９９；Mayan、２００２）ＳＴＳの治療のため、ＴＮＦ−αのＩＬＰでの適用に対し、１９９８年のＥＭＥＡによりＴＮＦ−αが承認されることになった、欧州での多施設臨床試験の概要が示されている。これらの多施設臨床試験においては、７６％の全奏功率および８２％の患肢救済中央値を観察した。さらにこの表には、多施設における経験を確認する、ＳＴＳの最大の単一施設での研究を載せている。衝撃的に一貫した、中央値７６％（レンジ、５８％〜９１％）主要な奏功率が、中央値８４％（レンジ、５８％〜９７％）の患肢救済率を伴って観察された。欧州においては、患肢救済のための国内照会形の３５の癌センターにおいて、ＴＮＦ−αに基づくＩＬＰが現在行われている。移行転移メラノーマに対するメルファラン単独ＩＬＰは、文献報告によれば、約５０％の完全奏功（ＣＲ）率および８０％の全奏功率を引き起こすと報告されている（van Horssen等（２００６））およびそれに引用している論文を参照）。この設定におけるＴＮＦ−αの導入は、ＣＲ率を７０％−９０％に、全奏功率を９５％〜１００％に増加させると報告された。これらの結果は、van Horssen等（２００６）における表２に要約してある。
【０００９】
一方、ヒトにおける不適切なＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αの過剰産生は、制御されない有害な炎症、組織破壊および器官の損傷を引き起こすこともまた明らかであり、多くの研究において報告されている。該ＴＮＦ−αの過剰産生は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症のような種々の自己免疫疾患、炎症性腸疾患のような炎症性疾患ならびに他の病的状態、そのうち例えば、強直性脊椎炎および脳卒中、において起こる。
【００１０】
中枢神経系（ＣＮＳ）に於いて、ＴＮＦ−αは又二重の役割を果たす：一方では、ＴＮＦ−αは有益であって、オリゴデンドロサイトの増殖と再生、神経細胞保護、神経再ミエリン化および種々の他の重要なプロセスに必要とされる。他方、過剰の内在ＴＮＦ−αは、神経細胞傷害および神経変性に寄与する。中枢神経系（ＣＮＳ）機能のモデュレーション時に炎症および免疫分子の役割により多くの注目が寄せられている。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、炎症促進性のサイトカインであり、その受容体はＣＮＳ全体の神経細胞およびグリア細胞上で発現している。その二つの受容体の作用を通じて、ＴＮＦ−αは、神経保護的または神経毒性の広範囲な作用を神経細胞に及ぼす。それは直接的および間接的に、アストロサイト上のグリアのグルタミン酸輸送体を阻害することにより、グルタミン酸の興奮毒性を促進する役割を果たす。さらに、ＴＮＦ−αは、例えばシナプス上のＡＭＰＡ受容体の発現を増加させ、グルタミン酸伝達に直接作用する。ＴＮＦ−αは又、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに依存するプロセスである、長期増強（ＬＴＰ）を阻害することによりシナプス可塑性の役割を果たす。
【００１１】
ＴＮＦ−αの欠如または不足、すなわち免疫能または他のＴＮＦ−αを介した有益な効果の欠如または不足、を特徴とする特定の病態において、他のいかなるサイトカインをも増大させることなくＴＮＦ−αの産生、発現および分泌だけを増加させる新規な方法を発見することは、治療価値を有することは、上記から明らかである。
【００１２】
以下に、ＴＮＦ−αの増強および標的細胞に及ぼすその後の作用が治療戦略と成りうる、病的状態の例を示す：
ａ．腫瘍を殺すまたは除去することができないため、死に至る癌（van Horssen等（２００６）、ＴＮＦ−αの抗腫瘍効果および臨床的有用性についての最近の総説のすべての内容は参照により本明細書に援用される）；
ｂ．死に導く可能性のある、ウィルスおよび細菌のような外来侵入物と闘うことができなくなる慢性または急性の免疫不全；および
ｃ．重要な神経機能がついには欠損し、生命を危険にする可能性のある、疾患または傷害に伴う神経細胞の再生の欠如または不足。
【００１３】
過剰な又有害なＴＮＦ−αを特徴とする特定の病態に於いて、ＴＮＦ−αの産生、発現および分泌を停止する新規な方法を発見することは、非常に治療価値を有することは、先の序論からも明らかである。
【００１４】
以下は、ＴＮＦ−αを停止または減少させおよびその後の標的細胞に及ぼすその影響が、以下の治療戦略になり得る病的状態の例である；リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、１型糖尿病、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、サルコイドーソスおよび頭部傷害後。
【００１５】
発明の要約
本特許出願の根拠としての機能を果たす研究において、本発明の発明者らは、Ｔ細胞中のＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルの選択的閉鎖は、ＴＮＦ−αの劇的な又独占的な合成および分泌を引き起こすために、単独で十分であって（すなわち任意の他の分子の存在無しに）、試験した他のサイトカインのいずれにも、すなわちインターフェロンガンマ、インターロイキン−４およびインターロイキン−１０にも影響を与えないことを発見した。
【００１６】
これらの発見に基づいて、Ｔ細胞内のＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルの閉鎖または遮断は、ＴＮＦ−αを介する効果が治療的価値を有するような状況において、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの急速、強健および選択的な合成および分泌を達成するであろうことが分かった。
【００１７】
Ｔ細胞におけるＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネル閉鎖は、デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）のような高度に選択的なＫｖ１．１チャンネル遮断剤、または特異的な抗−Ｋｖ１．１抗体、または下流経路の遮断によって、細胞外的にもしくは細胞内的に、T細胞のＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断を導く任意の他の方法によって本明細書中で達成される。
【００１８】
従って、本発明の一つの目的は、Ｔ細胞に大量のＴＮＦ−αを産生および分泌させ、疾患や傷害と闘うために、ＴＮＦ−αの欠乏と関連している病態を患っているヒトまたは動物被験体のＴ細胞内のＫｖ１．１チャンネルを遮断する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、選択的なＫｖ１．１イオンチャンネル遮断剤である方法を提供することである。
【００２０】
本発明の更なる目的は、Ｔ細胞に大量のＴＮＦ−αを産生および分泌させ、疾患や傷害と闘うために、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの増大した唯一の分泌により恩恵を受けることができるヒトまたは動物被験体のＴ細胞内のＫｖ１．１チャンネルを遮断する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、特異的な抗Ｋｖ１．１抗体であるような方法を提供することである。
【００２２】
本発明の更なる別の目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、Ｔ細胞内のＫｖ１．１チャンネルの下流経路を遮断できる分子であるような方法を提供することである。
【００２３】
本発明の又更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子を、エクスビボにてＴ細胞に投与後にヒトまたは動物患者の体内へ接種して戻すような方法を提供することである。
【００２４】
本発明の更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、体内に投与される、すなわちヒトまたは動物患者の体内に、静脈内、皮下、腹腔内、腫瘍内、くも膜下腔内または頭蓋内注入により、もしくは経口投与または経皮的に軟膏により投与されるような方法を提供することである。
【００２５】
本発明の又更なる目的は、Ｔ細胞内の電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１を遮断するために用いる分子が、ヒトまたは動物被験体の体内に植え込み式の薬剤送達ポンプを用いて投与されるような方法を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物被験体が癌に罹患しており、それら自身のＴ細胞を、体外または体内で、Ｔ細胞のＫｖ１．１チャンネルを遮断する分子に曝すことにより、ＴＮＦ−αの強健な合成または分泌を誘発し、ＴＮＦ−αによって癌を直接、死滅させる方法を提供することである。
【００２７】
好ましい一実施形態では、ヒトまたは動物被験体が癌に罹患しており、それら自身のＴ細胞を、体外または体内で、Ｔ細胞のＫｖ１．１チャンネルを遮断する分子に曝すことで、ＴＮＦ−αの強健な合成または分泌を誘発し、腫瘍を有する器官へのＴ細胞の侵入を増加させ、腫瘍破壊細胞の動員を向上させるための有益な炎症環境をつくることにより、癌のＴ細胞免疫療法を増強する。
【００２８】
好ましい別の実施形態では、ヒトまたは動物被験体は免疫不全に罹患している。
【００２９】
更に好ましい別の実施形態では、ヒトまたは動物患者は、神経細胞傷害または神経疾患の後、神経細胞再生の不全に罹患している。
【００３０】
本発明の好ましい別の実施形態では、ＴＮＦ−αの強健な合成および分泌を得るための手法は、静脈内、皮下、腹腔内、腫瘍内、くも膜下腔内または頭蓋内注入により、もしくは経口投与または経皮的に軟膏により、ＴＮＦ−αによる増強を動物患者の体の中に達成するのに役立つ。
【００３１】
疾患の第二の部類では、ＴＮＦ−αの有害な過剰は、本発明に従って、仮想の内在疾患関連Ｋｖ１．１遮断剤によって誘発されるＫｖ１．１チャンネルを閉鎖／遮断させない分子を用いて、Ｔ細胞からのＴＮＦ−αの産生と分泌を阻止することにより克服される。もし後者（つまり仮想の内在疾患関連Ｋｖ１．１遮断剤）がＴ細胞における慢性のＴＮＦ−α産生および分泌の原因であるならば、例えばＫｖ１．１チャンネル開口剤によってＫｖ１．１チャンネルの遮断をさせないようにすれば、強健なＴＮＦ−αの増加の誘発をもまた阻害するであろう。チャンネルを開口し、従ってＴＮＦ−αの産生を阻止する分子は、細胞外作用剤であっても良く、またはチャンネルの遮断のシグナルを送る細胞内電位感覚要素を損なう分子であってもよい。該細胞外作用剤の例としては、従来の方法で、Ｋｖ１．１分子に対して作製し、作用剤活性に対してスクリーニングを行ったモノクローン抗体が挙げられる。
【００３２】
好適な実施態様の詳細な説明
本発明は、正常ヒトＴ細胞におけるＫｖ１．１電位依存性カリウムチャンネルの選択的遮断により、それのみで強健で、唯一ＴＮＦ−α蛋白の分泌およびｍＲＮＡが増加されるという発見に基づいている。劇的なＴＮＦ−αの分泌が、高度に選択的なＫｖ１．１遮断剤、デンドロトキシン−Ｋによって（しかし９つの他のＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ−遮断剤によっては誘導されない）；市販の抗−Ｋｖ１．１抗体によって；および、重要なことには、Ｋｖ１．１抗体を保持している末梢神経興奮性亢進症の患者からの血清によって誘導された。Ｋｖ１．１遮断は、ＴＮＦ−α分泌のみを誘発させ、一方「古典的」なＴＣＲ−活性化は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の分泌を、同時に、非唯一に増加させた。Ｋｖ１．１遮断は、またＮＦ−κＢの核転移を誘導する。
【００３３】
ヒトＴ細胞におけるＫｖ１．１タンパクおよびｍＲＮＡの発現は、本明細書ではＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって示した。デンドロトキシン−Ｋでエクスビボにて前処理をし、従ってＴＮＦ−αを過剰分泌しているヒトＴ細胞をＳＣＩＤマウスに注射すると、肝臓への宿主細胞のインビボ動員を引き起こすが、これは脳へＴＮＦ−αを注入後に報告されたことに類似している。今まで、これらの発見を予想できることは全く知られていなかった。Ｋｖ１．１遮断によって誘発されたＴＮＦ−αの増加は、それ故、ある疾患（例えば、癌および免疫不全）ではＴＮＦ−αを高め、他（例えばリウマチ性関節炎、クローン病および他の自己免疫／炎症性疾患）では抑止して、治療的に用いることができる可能性がある。
【００３４】
本発明により、ヒトＴ細胞における一種類のイオンチャンネルの選択的遮断が、一種類のサイトカイン、この場合はＴＮＦ−α、の唯一の産生と分泌を誘発できることが立証される。該機構は、全てのＴ細胞サイトカインの同時産生を促進することを特徴とする、種々の分裂促進因子（例えばホルボールエステル）による、「古典的」なＴＣＲ活性および非特異的なＴ細胞刺激の両者とは際立って対照的である。一つのサイトカインを唯一かつ強力に増加させ、一方では他のＴｈサイトカインのレベルを増加させない機構の発見は、特にサイトカインがＴＮＦ−αであることから（Dinarelo ら, 2002; Wallach ら, 1999）、重要な臨床的意味を有する。なぜならば、このサイトカインが多くの疾患の病理において重要であり、そのレベルが過剰であるかまたは不十分であるからである。
【００３５】
実際、一方ではＴＮＦ−αは、健康に基本的で有益な役割を果たす。それは自然免疫反応を活性化し、環境の攻撃から生体を保護する必須な炎症反応を引き起こす（Dinarelo ら, 2002）。更に加えて、ＴＮＦ−αは、腫瘍の壊死を起こさせ、白血球のローリングと接着の増強し、種々の分子に対する血管と血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を増加させ（Mayan 2002, van Horssen ら 2006）、オリゴデンドロサイトの増殖と再生を誘導し、神経の再ミエリン形成を促進し（Arnett ら, 2001; Finsen ら, 2002）、細胞を特定の組織へ動員し、ならびに多くの他の重要な機能を誘発する（Dinarelo ら, 2002; Wallach ら, 1999）。
【００３６】
他方、ＴＮＦ−αの過剰産生または無秩序な産生は、通常非常に有害であり、組織破壊に導く重篤な損傷を与える炎症を起こすことがあり、その後に種々の重篤な自己免疫疾患の原因となるが、その中にはリウマチ性関節炎および多発性硬化症、炎症性腸炎を含む炎症性疾患、ならびに外傷、強直性脊椎炎、脳卒中および過眠症のような多様な病理状態の種々なタイプが含まれる。興味あることには、ひとたびＴＮＦ−αが過剰になった場合には、抗−ＴＮＦ−αモノクロナール抗体および可溶性ＴＮＦ−α受容体のような、ＴＮＦ−αのシグナル伝達を遮断する治療法に対する適応症のリストはどんどん大きくなっている一方、ＴＮＦ−αの増加を阻止または遮断（すなわち過剰の有害レベルに達する前に）は、未だ達成されていない。更に、ヒトの疾患におけるＴＮＦ−αの慢性産生の原因となる機構については未だ不明なところが多く、他のサイトカインに影響せずに、選択的にＴＮＦ−αの増加を促進する機構も未だ解明されていない。
【００３７】
Ｔ細胞を含む種々の細胞タイプにおいて、特定のイオンチャンネルが主要な細胞反応に影響を与え、指示するという既知の特性（DeCoursey ら, 1984; Deutsch ら, 1986, Lewis ら, 1995; Lewis ら, 1988; Rader ら, 1996; Freedman ら, 1995; Koo ら , 1997; Lin ら, 1993; Ishida ら, 1993; Jansen ら, 1999; Kotturi ら, 2003; Phipps ら, 1996; Verheugen ら, 1997）、およびＫｖ１．３電位依存性カリウムチャンネルのゲーティングは、それ自身で主要Ｔ細胞機能を誘発できるという本発明者の研究室における以前の実証（Levite ら, 2000）によって促され、本発明は、正常ヒトＴ細胞における特定のカリウム（Ｋ＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）または塩素イオン（Ｃｌ−）チャンネルの単なる遮断が、選択的なサイトカイン分泌、特にＴＮＦ−αの分泌を誘発することができるかどうかの研究に基づいている。本結果は、正常のヒトT細胞内の電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの選択的な遮断が、強健的で、唯一かつ長期的なＴＮＦ−α分泌の増加に対する新規な機構を明示している。
【００３８】
本発見は、新規な予想外の機構を明らかにしたが、それは正常な末梢ヒトＴ細胞内の電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの選択的な遮断が、ＴＮＦ−α分泌およびｍＲＮＡレベルを著しく、唯一かつ長期的に増加させたことである。我々の知る限り、一般的に電位依存性Ｋ＋チャンネル、特にＫｖ１．１についてまたはＴＮＦ−αについて、Ｋｖ１．１とＴＮＦ−αの直接の機能的な関連に関する本発見を予想するようなことは全く知られていない。更に、本発見は、他のＴｈサイトカインを増加させることなく、ＴＮＦ−αの単独増加に対する新規の機構を明らかにしている。
【００３９】
次の段落において、考察がなされる：ａ）本発明の更なる詳細；ｂ）主としてＴ細胞中のＫｖ１．１電位依存性Ｋ＋チャンネルおよびＫｖファミリーの他のメンバー、ならびにＤＴＸ−Ｋの特殊な特徴；ｃ）ＰＮＨ，Ｋｖ１遮断に伴うヒトの神経疾患；およびｄ）様々なヒトの疾患においてＴＮＦ−αの促進する、または抑止する新規の臨床標的として、Ｔ細胞Ｋｖ１．１の使用。
【００４０】
本発明の更なる詳細
非常に選択的なＫｖ１．１遮断剤ＤＴＸ−Ｋ（Harvey, 2001）および特異的、市販抗−Ｋｖ１．１抗体の両者は、Ｔ細胞ＴＮＦ−αを劇的に増加させることを発見した。対照的に、Ｔ細胞中で発現しているＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−イオンチャンネルまたはグルタミン酸／ＡＭＰＡイオンチャンネル受容体（Ganor ら, 2003）に対する９つの他の遮断剤にＴ細胞を曝しても該効果は得られなかった。Ｋｖ１．１には特異的ではないが、電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットにいくらか影響することができる二つのＫｖ１．１遮断剤、ＫＴＸおよびＭｇＴＸもまたヒトＴ細胞からＴＮＦ−αを誘発したが、程度はずっと低く、Ｋｖ１．１チャンネルサブユニットに対するそれらの低い親和性と特異性に見合ったものであった。
【００４１】
ＫＴＸおよびＭｇＴＸは、Ｋｖ１．１チャンネルに対してＤＴＸ−Ｋほど特異的ではないが、本発明に従って使用するには十分特異的である。本発明は、ＰＭＡによって代表されるような、ホルボールエステルのような非特異的なＴ細胞活性化剤をすべて考慮に入れているわけではない。しかしながら、本明細書で用いる「選択的」という用語は、ＰＭＡのようなホルボールエステルの場合のように、Ｔ細胞サイトカインが無差別に産生するのではない限り、他のＫｖチャンネルにいくらかの活性を有する可能性のあるＫｖ１．１遮断剤を含むことを意図している。Ｋｖ１．１チャンネルに対する選択性が大きければ大きいほど、該分子に対する好ましさは大きい。従って、ＤＴＸ−Ｋは、現時点において最も好ましい該分子である。しかしながら、ＤＴＸ−ＫほどＴＮＦ−αを産生しないかも知れない、又ＤＴＸ−ＫほどＫｖ１．１に対する特異的選択性がないかも知れないが、ＫＴＸおよびＭｇＴＸもまた、本発明に従って用いることができる。従って、以下の十分に選択性を有する、および選択性がより低いＤｖ１．１電位依存性イオンチャンネル遮断剤は、Ｋｖ１．１チャンネルを遮断し、および少なくともＫｖチャンネルに対して実質的に選択的である、いかなる他の分子とも同じように、本発明に従って使用できる：
Ａ）デンドロトキシン類
１）トキシンＫ、デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）とも呼ばれる、は、ブラックマンバ、Dendroaspis polylepsisから由来し、Ｋｖ１．１チャンネルを優先的に遮断し、ピコモル濃度で活性を有する。
２）アルファーデンドロトキシンはグリーンマンバDendroaspis angusticepsから由来し、クローンされたＫｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６チャンネルを、低ナノモル範囲で遮断する。
３）トキシンＩ、デンドロトキシン−Ｉ（ＤＴＸ−Ｉ）とも呼ばれる、は、ブラックマンバ、Dendroaspis polylepsisから由来し、クローンされたＫｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６チャンネルを低ナノモル範囲で遮断する。
Ｂ）コノトキシン類：イモガイ、Conus virgoの毒素から、ＶｉＴｘ（virgo-toxin）と呼ばれるペプチドが分離され、Ｋｖ１．１およびＫｖ１．３のＫ＋−チャンネルを遮断するが、Ｋｖ１．２タイプは遮断しない（Kauferestein ら, 2003）。
Ｃ）マウロトキシン類：天然および合成のマウロトキシンは両方とも、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞で発現されたＫｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．３チャンネルを、殆ど同じ４０、０．８および１５０nMの半分有効量（ＩＣ５０）で遮断する（Rochat ら, 1998）。
Ｄ）アギトキシン類
１）rAgitoxin-2 Leiurus q. hebraeusはＫｖ１．１、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．６を５０pM〜１０nMで遮断する。（Alomone Labs web site; www.alomone.com/p_products）。
２）rAgitoxin-3 Leiurus q. hebraeusはＫｖ１．１、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．６を５０pM〜１０nMで遮断する。（Alomone Labs web site; www.alomone.com/p_products）。
Ｅ）r-Hongotoxin-1 Centruroides limbatusはＫｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３を０．１〜０．２pMで遮断する。
Ｆ）Ｐｉ４はさそりPandinus imperatorの毒液由来の３８アミノ酸長ペプチドであり、Shaker B Ｋ＋チャンネル（Ｋｖ１．１サブファミリータイプのチャンネル）を、１００nM濃度で完全にかつ可逆的に遮断する（Olamendi-Portugal 1998）。
Ｇ）Kaliotoxin（ＫＴＸ）：ＫＴＸはいくつかのＣａ２＋活性化および電位依存性Ｋ＋チャンネルを遮断する。Xenopus laevis卵母細胞へのＫＴＸのバス適用（bath application）は、組み換えＫｖ１．３およびＫｖ１．１チャンネルを強力に、又Ｋｖ１．２チャンネルをより低い強度で遮断し、それぞれのＫ（ｄ）値は、０．１、１．５および２．５nMであった（Mourre ら, 1999）。
Ｈ）ＢＴＫ−２：インドのさそりButhus tamulusから精製されたＫｖ１．１カリウムチャンネルの新阻害剤（Dhawan ら, 2003）。
Ｉ）新Ｋｖ１．１カリウムチャンネル遮断トキシン：Palamneus gravimanus （インド黒さそり）の毒液由来の新Ｋｖ１．１カリウムチャンネル遮断トキシン（More ら, 2005）。
Ｊ）rMargatoxin：ＭｇＴＸ Ｋ＋チャンネルは、主としてＫｖ１．３電位依存性Ｋ＋チャンネルを遮断するが、Ｋｖ１．１にも作用することができる。
Ｋ）Stichodactyla helianthusペプチド（ＳｈＫ）は、S. helianthusの毒液から分離された、Ｋｖ１．１およびＫｖ１．３チャンネルの既知の高親和性遮断剤である。
【００４２】
本実験で用いたＫｖ１．１に対する抗体は、市販されておりAlamone Labs Ltd., Jerusalem, Israel, product no. APC-009から得られる。Alomone.com/System/UpLoadFiles/DGallery/Docs/apc- 009_AN-05.pdfで得られるデータシートを参照。この抗体は、配列HRETE GEEQA QLLHV SSPNL ASDSD LSRRS SSTIS KSEYM EIEED MNNSI AHYRQ ANIRT GNCTT ADQNC VNKSK LLTDV（配列番号７）を有するＧＳＴ融合タンパクに対して産生させたウサギ抗体であって、マウスＫｖ１．１の残基４１６−４９５に相当する（GeneBank Accession P16388）。このエピトープの８０残基の内７６残基は、対応するヒトタンパクに保存されている。Ｋｖ１．１のエピトープ、好ましくはヒトＫｖ１．１に対して産生された他のいかなる抗体も、ポリクローンあるいはモノクローンであれ、それらがＫｖ１．１チャンネルを遮断する能力を有する限り、本発明の目的のために用いることができる。本明細書および請求項で用いる「抗体」という用語はポリクローンまたはモノクローン、ならびにヒト化抗体、単鎖抗体のような遺伝子改変の抗体、およびＣＤＲｓ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等のような抗原結合性断片を包含することを意図している。
【００４３】
Ｋｖ１．１チャンネルに対するモノクローン抗体を作製する際、それらはチャンネルを遮断する（拮抗する）または開口する（作用する）能力に関してスクリーニングをしてもよい。拮抗剤である抗体は、ＴＮＦ−αの産生の増加が望まれる病気を治療するために用いることができ、作用剤である抗体は、ＴＮＦ−αの過剰な産生を阻止する必要がある疾患を治療するために用いることができる。
【００４４】
ＴＮＦ−α転写におけるＣａ２＋の既知の役割（Lobo ら, 1999）と合致して、Ｋｖ１．１遮断によるＴＮＦ−αの誘導にはＣａ２＋流入を必要とすることが発見されたが、それはＴ細胞内におけるＣａ２＋チャンネルの高度の選択的遮断剤であるR-(+)-Bay K 8644（Kotturi ら, 2003）がこの効果を阻止したからである。驚くべきことには、Ｋｖ１．１チャンネルの遮断は、ＴＮＦ−αの急速な増加を引き起こす一方、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を増加させず、そのことは、これら全てのＴｈサイトカインは強健だが、非選択的に、又同時に結局増加することになる「古典的な」ＴＣＲ−活性化から著しく異なっていた。
【００４５】
ＴＮＦ−αを過剰発現するＤＴＸ−Ｋで処理した正常ヒトＴ細胞を、ＳＣＩＤマウスに注射すると、ＴＮＦ−αの脳内への注射後起こることが最近研究で示された結果（Campbell ら, 2005）に類似して、専ら肝臓に存在するマウス常在細胞数が倍増したことから、Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断によってヒトＴ細胞内に誘導されたＴＮＦ−αの増加は、インビボにて機能的な影響をもたらした。
【００４６】
Ｋｖ１．１電位依存性Ｋ＋チャンネルおよびそのファミリーの他のメンバー、ならびにＤＴＶ−Ｋの特異な特徴：Ｋｖ１．１チャンネルは電位依存性Ｋ＋チャンネルのファミリーに属しており、そのいくつかのメンバーはＴ細胞で発現しており、重要な機能的役割を果たしている（DeCourseyら, 1984; Deutsch ら, 1986; Lewis ら, 1995; Lewis ら , 1998; Freedman ら, 1995; Koo ら , 1997; Lin ら, 1993; Levite ら, 2000; Liuら, 2002; Beeton ら, 2001; Leonard ら, 1992; Levite 2001）。これらのチャンネルはＣ２＋活性化Ｋ＋チャンネルとは異なっており、これらチャンネルはＴ細胞により発現しており、Ｔ細胞機能として重要である（Rader ら, 1996; Jensen ら, 1999; Vreheugen ら, 1997）。様々な種類の電位依存性Ｋ＋チャンネルのグループ分けおよび独特な特性は、いくつかの研究で考察されている（Grissmer ら, 1994; Mathisら, 1998を参照）。一般的に、電位依存性Ｋ＋チャンネルの阻害は、脱分極を起こし（Leonard ら, 1992）（すなわち陰性度が低い膜電位へのシフト）、それが、種々の主要な細胞特性および細胞機能に影響を及ぼし、発揮させる（Levite ら, 2000; Leonard ら, 1992; Levite, 2001）。神経細胞においては、電位依存性チャンネルの一つの大きな役割は、膜の興奮性の制御である（Ruteckie, 1992; Smart ら, 1998）。これには活動電位および神経細胞の反復発火の期間を制限し、ならびに膜電位を安定化させることが含まれる。
【００４７】
Ｔ細胞内の特定の電位依存性Ｋ＋チャンネルは、β１インテグリン類を活性化し、その後フィブロネクチンと同様にＥＣＭ成分へのＴ細胞接着を誘発し（Levite ら, 2000）、膜電位（Levite ら, 2000）、カルシウム流入（Grinstein ら, 1990; Lin et al, 1993; Verheugen ら, 1997）、増殖（Freedman ら, 1992; Leonard ら, 1992）、ＩＬ−２産生（Liu ら, 2002, Freedman ら, 1992）、アポトーシス（Bortner ら 1999; maeno ら , 2000; Vu ら, 2001）、および細胞容積（Grinstein ら, 1990）を調節することが、先の研究で示された。
【００４８】
従って、全体として、Ｋｖチャンネルは、主要な生理的Ｔ細胞機能を調節し、それらの不適切な機能は、ＴＣＲ−活性化を阻害し、重要なＴ細胞を介しての免疫反応を阻止する。例えば、Liu ら(2002)は、電気生理学、薬理学およびＲＴ−ＰＣＲの方法を組み合わせて、未処理のマウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３およびＫｖ１．６電流を発していること、ならびにこれらのＫｖチャンネルが、該未処理の細胞によるＴＣＲ−誘導（抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８により）ＩＬ−２分泌を最大にするために必要となることを示した（Liu ら, 2002）。
【００４９】
対照的に、マウスＴＣＲ−活性化エフェクターＴ細胞は、Ｋｖ１．３電流（未処理細胞よりは±６倍高い）のみを発するが、Ｋ１．３も、他のいかなるＫｖも、これらの活性化されたＴ細胞のＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＰＮ−γの産生、カルシウムシグナル伝達または膜電位に対して有意に寄与はしていない（Liu ら, 2002）。この後者の研究で行った観察により、末梢マウスＣＤ４＋細胞において、分化状態、ＴＣＲ活性化の強さ、共刺激因子の存在あるいは非存在の表れとして、Ｋｖ電流が、質的にも又量的にも変化することを示された（Liu ら, 2002）。自然の電位依存性Ｋ＋チャンネルはヘテロ多量体であって、種々のＫｖサブタイプの組み合わせから構成されており、ヘテロ多量体チャンネルが異なれば、親チャンネルと比較して、劇的に異なったチャンネル機能を有することになる。ヘテロダイマーを含む異なったＫｖ１．１もまた異なった遮断剤に対して異なった感受性を有している。例えば、ヘテロダイマーを含むＫｖ１．１中にＫｖ１．２が存在すると、ＴＥＡに対する全アレイの感受性が低下する。先の研究では、ＤＴＸ−Ｋが、Ｋｖ１．１サブユニットとの強く高度に特異的な相互作用という点で、またそれが、これらのチャンネルとそのＮ−末端（Ｋ３、Ｋ６）およびβ−ターン（Ｋ２５、Ｋ２６）における残基を介して相互作用をするという点で、独特なものであることを示された（Wang ら）。ＤＴＸ−Ｋの非常に独特な作用機構により、ＤＴＸ−ＫによるＴＮＦ−αの増加を（いまだ未調査の機構で）説明できる可能性がある一方、特異性がより低いＫｖ１遮断剤の作用機構により、たとえあったとしても効果はあまり目立たなくなる。
【００５０】
ヒトおよびマウスＴ細胞におけるＫｖ１．１電流試験である別の研究で、異なった結論に達した（Freedman ら, 1995; Cahalan ら, 1985; Liu ら, 2002）。本結果は、特異的なＫｖ１．１ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって、正常末梢ヒトＴ細胞のかなりの割合は、Ｋｖ１．１ｍＲＮＡおよび膜タンパクを明瞭に発現していることを示し、このタンパクの新しい面を明らかにした。しかし、我々の発見は、正常静止状態の末梢ヒトＴ細胞において機能的な（すなわち電気生理学的に活性を有する）Ｋｖ１．１電流の存在を証明するものでは勿論ない。電位依存性Ｋ＋チャンネルファミリーの他のメンバー、主としてＫｖ１．３、がＴ細胞の活性化と機能において重要な役割を果たしている証拠が、多くの最近の研究によって示唆された(DeCoursy ら, 1984; Deutsch ら, 1986; Lewis ら, 1995; Lewis ら, 1988; Freedman ら, 1995; Koo ら, 1997; Lin ら, 1993; Leite ら, 2000; Liu ら, 2002; Beeton ら, 2001; Leonard ら, 1992; Rus ら, 2005)。更に、本発明者の研究室は、正常ヒトＴ細胞の電位依存性Ｋ＋チャンネルの一つのメンバー、Ｋｖ１．３、のゲート開閉は、それ自身のみでβ１インテグリン活性化とＴ細胞接着を誘発でき、Ｋｖ１．３チャンネルは、これらの細胞中で、実際β１インテグリンと物理的に又機能的にカップリングしていることを以前示した(Levite ら, 2000; Levite 2001)。注目すべき点は興味ある相違点である：我々が以前研究したＫｖ１．３チャンネルの場合には、Ｔ細胞機能を誘導するのはＫｖ１．３チャンネルを開口した時であり（すなわちＴ細胞接着を引き起こす）(Leviteら, 2000; Levite 2001)、一方本研究においては、そうする（すなわちＴＮＦ−αを増加させる）のはＫｖ１．１チャンネルの遮断である。
【００５１】
Ｋｖ１．１遮断に伴ういくつかのヒト神経疾患：一般的に神経の興奮性を増加させるＫｖ１．１チャンネルの遮断は少なくとも３つのヒト神経疾患を直接伴っている：
１）Ｋｖ１抗体と関連するＰＮＨ
２）Ｋｖ１抗体と関連する脳炎
３）ヒトＫｖ１．１チャンネルをコードする遺伝子の様々な突然変異に伴う、突発性運動失調１型（ＥＡ−１）（Vincent et al, 2004; Adelman et al 1995; Browne et al, 1994）。
【００５２】
ＰＮＨ：Ｋｖ１遮断に伴うヒトの神経疾患：マウスにおけるＫｖ１．１チャンネルの欠損は、癲癇、温度感受性振盪および痛覚過敏症を起こすが、これらは神経細胞の過剰興奮性と一致する特徴である(Smart ら, 1998; Zhou et al , 1998)。臨床医は、全般的なＰＮＨの筋肉運動の症状を記述するのに、神経性筋強直症、アイザックス症候群、ミオキミアおよび線維束性痙攣症候群を含む多くの用語を用いる（Hart et al, 2002）。ＰＮＨが通常自己免疫を介する（Newsom-Davis ら, 1993）という考えは、最近６０人のＰＮＨ患者の３５％は、１００pmol/lを越える血清Ｋｖ１抗体タイター有していたという知見によって確証された（Hart et al, 2002）。これらの抗体は病原性があり、Ｋｖ１チャンネルを遮断し、従って末梢およびお中枢神経系の両方に神経の過剰興奮性と広範囲の臨床症状を引き起こす。ここで、いく人かのＫｖ１抗体陽性ＰＮＨ患者の血清は（方法参照）、ヒトＴ細胞による相当な量のＴＮＦ−α分泌を刺激したが、一方ＩＦＮ−γを増加させなかった（ＤＴＸ−Ｋの結果と類似している）。この発見は、Ｔ細胞における抗体を介したサイトカイン誘導が、神経の過剰興奮性の病態およびＰＮＨの臨床的特徴ならびに多分自己免疫性脳炎の一因となる可能性を示唆している。本データは又疲労および筋肉痛のようなＰＮＨに伴う、より非特異的な症状は、少なくとも部分的にはＫｖ１抗体を介した血液循環中のＴＮＦ−αの増加によって引き起こされた可能性を示唆している。従って、本発明の他の特徴は、１）Ｋｖ１抗体に伴うＰＮＨ，２）Ｋｖ１抗体に伴う脳炎、３）突発性−運動失調１型（ＥＡ−１）を循環系におけるＴＮＦ−αの力価を減少させる任意の方法で治療する方法であって、ＴＢＰ−１およびＴＢＰ−２のようなＴＮＦ−α結合タンパク、抗-ＴＮＦ−α抗体、Ｋｖ１．１チャンネル非遮断剤等のような方法である。
【００５３】
Ｔ細胞のＫｖ１．１機能不全は、ＴＮＦ−α過剰に伴うヒトの疾患に寄与する可能性があるので、Ｔ細胞におけるＫｖ１．１は新規の治療標的である。ヒトＴＮＦ−αは生物活性を有する、２３３アミノ酸、２６kDaの膜結合性タンパクとして合成される。この膜結合性タンパクは、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、アダマリシンによって１５７アミノ酸、１７kDa可溶性タンパクに酵素的に切断され、容易にホモ三量体を形成する。ホモ三量体ＴＮＦ−α（細胞結合型または可溶性のいずれか）のその受容体（ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩ）への結合は、静止状態の細胞においてシグナル伝達に必要な受容体のオリゴマー形成を誘導する。
【００５４】
ＴＮＦ−αの不適切な産生または過剰産生は、その発病原因において炎症が関与する広範囲の病気において起こるが、その病気には、炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎および脳卒中が含まれる（Baugh ら, 2001）。本発見により、インビボでのＫｖ１．１抗体またはＫｖ１．１遮断剤を介してのＴ細胞Ｋｖ１．１遮断は、少なくとも部分的に、これらの障害での過剰のＴＮＦ−αに原因があり、それ故新規の治療標的である、という結論におそらく導かれるであろう。
【００５５】
他方、ＴＮＦ−αは、他の多くの目的のために非常に必要とされることから、ＴＮＦ−αを長期間過剰発現する自己ＤＴＸ−Ｋ処理Ｔ細胞のヒトにおける受動的な輸送は、非常に特定の状況においては、有益であろう。これらには、Ｔ細胞による癌細胞根絶の強化、ウイルスおよびバクテリアのＴ細胞攻撃を高めること（特に免疫不全の種々のタイプの場合）および必要に応じて宿主細胞の肝臓への動員の増加が挙げられる。
【００５６】
実施例１：
材料と方法
イオンチャンネル遮断剤：表１も参照。本明細書に用いる各イオンチャンネル遮断剤について特定されるものは、正式名、カッコ内に短縮名と製造者、有効濃度（それぞれの製造者のデータシートおよび／または文献から得られた）である。更なる詳細情報は、International Union of Pharmacology website (Gutman et al, 2003を参照)に見出すことができる。遮断剤としては以下のものが挙げられる：４−アミノピリジン（４−ＡＰ，Sigma，St. Louis, MO）、１０μM〜１mM；テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ，Sigma）、１００μM〜１０mM；キニーネ（Sigma）、１〜１０μM；クロトリマゾール（ＣＬＴ，Agis Industries, Bnei Brak, Israel）、１０nM〜１０μM；rカリブドトキシン (ＣＴＸ，Alomone labs, Jerusalem, Israel)、１０〜１００nM；カリオトキシン（ＫＴＸ，Alomone）、１〜１００nM；ｒマルガトキシン （ＭｇＴＸ，Alomone）、５０pM〜５０nM；デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ，Alomone）、１０〜１００nM；テトロドトキシン（ＴＴＸ，Alomone）、１００nM〜１μM；ＮＰＰＢ（Torcris Cookson, Avonmouth, UK）、１００〜２００μM；R-(+)Bay K8644（+Bay K, Tocris）、１０nM〜１μM；CNQX（Tocris）、１００nM−５０μM。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ヒトＴ細胞：正常ヒトＴ細胞は、(Levite ら, 2000; Ganor ら, 2003; Levite ら, 1998)に記載されているように健常提供者の末梢血から精製し、得た９０％以上のＴ細胞を含む細胞群を、１０％ＦＣＳ、１％Ｌグルタミンおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ培地（Biological Industries, Bet Haemek, Israel）に懸濁し、２ｘ１０６細胞／ml（３７℃／５％ＣＯ２）で維持した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の定量：新たに精製した正常静止ヒトＴ細胞（２ｘ１０６／ml）を２４穴プレート(Costar, Corning, NY)中でインキュベーションし、種々のチャンネル遮断剤を加えた。重要なことは、他の刺激分子（例えばホルボールエステル、抗原、抗−ＣＤ３・ＣＤ２８ｍＡｂ）を加えないことであった。サイトカインレベルは、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γについては２４時間後、ＩＬ−１０およびＩＬ−４については７２時間後、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡ法（R&D, Minneapolis, MN）で、製造者の指示に従い、上清を測定した。
【００６０】
ＴＮＦ−αおよびＫｖ１．１のＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡは、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔプロトコル（MRC, Cincinnati, OH）に従って調製した。第一鎖ｃＤＮＡは、Reverse Transcription System（Promega, Madison, WI）を用いて合成した。ＲＴ−ＰＣＲは、５０ngのｃＤＮＡ、５μlのｘ１０ Optibuffer (Bioline, London, UK)、３μlの５０mM ＭｇＣｌ２、２．５μlの１０mM ｄＮＴＰ混合液(Promega)、４ＵのＢｉｏ−Ｘ−ａｃｔＤＮＡポリメラーゼ(Bioline)を含む５０μlの反応混合液中で行った。ＴＮＦ−α／Ｓ１４同時増幅については、２μlの各ＴＮＦ−αプライマー（１０pmol／μl）および０．２５μlの各Ｓ１４プライマー（１０pmol／μl）を用いた。Ｋｖ１．１／Ｓ１４同時増幅については、５μlの各Ｋｖ１．１プライマー（１００pmol／μl）および２．５μlの各Ｓ１４プライマー（１０pmol／μl）を用いた。プライマー配列（５’−３’）および産物の長さは以下の通りである：
ＴＮＦ−αプライマーペア−上流プライマー
【表２】
下流プライマー
【表３】
４９４ｂｐ；Ｋｖ１．１プライマーペア−上流プライマー
【表４】
下流プライマー
【表５】
７０９ｂｐ；Ｓ１４プライマーペア−上流プライマー
【表６】
下流プライマー
【表７】
１６６ｂｐ。ＴＮＦ−αのＰＣＲ条件は：９４℃１分、６３℃４０秒および７２℃４０秒（２９サイクル）。Ｋｖ１．１のＰＣＲ条件は、９４℃３分（１サイクル）；９４℃１分、６０／５７／５４／５１／４８℃２分および７２℃３分（それぞれ３サイクル）；９４℃１分、５０℃２分および７２℃３分（２５サイクル）。ＴＮＦ−α／Ｓ１４ＲＴ−ＰＣＲ産物の濃度分析は、Adobe Photoshop 7.0 MEによって行った。ＴＮＦ−αバンドの相対強度は、Ｓ１４バンドの相対強度に対して規格化した。
【００６１】
核ＮＦ−κＢのＥＭＳＡ：正常ヒトＴ細胞から新たに分離した核画分は、Nuclear Extract Kit（Active Motif, Carlsbad, CA）用いて製造者の指示に従って採取した。核画分中のＮＦ−κＢレベルは、TransAM NF-kB Family Kit（Active Motif）を用いて製造者の指示に従って測定した。
【００６２】
ＮＦ−κＢの免疫蛍光組織化学：ＤＴＸ−Ｋ（１００nM ７、１５、３０および６０分間）で前処理または未処理の新たに分離した正常ヒトＴ細胞を沈殿させ（１２００ｇ、１０分、４０℃）、ＰＢＳに１ｘ１０６細胞／mlで懸濁し、遠心し（１２００ｇ、１０分）、ガラススライド上にサイトスピン（２５０μl／スライド、１５００rpm、５分；Shandon Elliot, London, UK）で固定し、透過処理を行い（１００mlの９５％メタノールおよび３ml氷酢酸を含む溶液２００μl／スライド）、１０％正常ヤギ血清、２％ＢＳＡ、１％グリシンおよび０．５％のTriton X-100を含むブロッキング培地中で（２００μl／スライド）インキュベーションした。それから細胞をウサギ抗−ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０ポリクローン抗体（１：５０希釈した８０μlと３０分間室温；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）で染色した。この第一回の染色後、細胞をＦＩＴＣ−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：５０希釈で３０分間室温；Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）に曝し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、それから細胞核に取り込ませるHoechst 33342に曝した（１：２０００希釈で５分間室温；Molecular Probes, Eugene, OR）。染色した細胞を、蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse E600)で可視化し、ＡＣＴ−１ソフトウエアープログラムを用いて、ｘ１００倍で写真撮影を行った。
【００６３】
チャンネルを含有するＫｖ１．１サブユニットの検出のための免疫染色およびフローサイトメトリー：新たに精製した正常ヒトＴ細胞を、透過処理（７０％エタノール、１時間、２０℃で）した後、一次抗体としてウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体（Alomone）を用いて、６μｇ／ml／１ｘ１０６細胞／１００μl、３０分間氷上で、免疫蛍光染色を行った。アイソタイプのコントロールとして、細胞を同じ濃度の以下のように調製した正常ウサギＩｇＧで染色した：健常コントロールの白色ニュージーランド雄のウサギから得た血清に等量の飽和硫酸アンモニウムを滴下する；混合液を１時間４℃で攪拌し、３０００ｇ１５分、４℃で遠心した。沈殿物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、硫酸アンモニウムのいかなる痕跡をも除くために、同じ溶液に対して一夜３回透析した。ＩｇＧ濃度の推定はＯ．Ｄ２８０で定量した（１．４５Ｏ．Ｄ２８０は１mgＩｇＧ／mlとした）。それから細胞を、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧを二次抗体として（１：１００希釈した１００μl、Jackson）染色した。二次抗体のみで染色した細胞を追加の陰性コントロールとした。蛍光像をＦＡＣＳｏｒｔに記録した。
【００６４】
ＰＮＨ患者および健常者個人コントロール：血清は１２人のＰＮＨ患者から採取したが、すべての患者は筋電図検査によって、全身性後天性疾患を確認し、又多発神経障害の臨床的または電気生理的証拠は無かった。どの患者も、造影ＣＴ縦隔上に胸腺肥厚または胸腺腫は有しなかった。血清採取の少なくとも１年前までは、どの患者も免疫療法は受けていなかった。年齢、性および地理的に一致させた４人の健常者個人コントロールから血清の供与を受けた。全ての患者から書面で、この研究に対するインフォームドコンセントを得、この研究は、Sefton Research倫理委員会、リバプール、UKによって許可された。血清Ｋｖ１抗体力価は、標準（１２５）Ｉ−アルファーデンドロトキシン免疫沈降アッセイ（Hart et al, 1997）によって検出した。この方法はＫｖ１．１、１．２および１．６に対する抗体を検出する。陽性力価は、１００pM以上に設定してある。５０pM未満の力価は陰性と見なす。ここで試験した１２人のＰＮＨ患者のうち７人はＫｖ１抗体に関しては陰性であった。ＰＮＨ患者の関連した臨床特徴を下に要約する。
ＰＮＨ Ｋｖ１抗体陽性（ＰＮＨ＋）
ＰＮＨ＋（１）：女性、４０歳、ＰＮＨ（３６歳で発症）および甲状腺機能低下症、Ｋｖ１ ２３９pM。
ＰＮＨ＋（２）：女性、４９歳、ＰＮＨのみ（４７歳で発症）、Ｋｖ１ ３３５pM。
ＰＮＨ＋（３）：男性、５２歳、ＰＮＨ（４０歳で発症）およびＤＭタイプ１、Ｋｖ１ ２３５pM。
ＰＮＨ＋（４）：男性、５２歳、ＰＮＨのみ（４３歳で発症）、Ｋｖ１ ３８２pM。
ＰＮＨ＋（５）：男性、５１歳、ＰＮＨ（５１歳で発症）および軽度の乾癬、Ｋｖ１ ３４６pM。
ＰＮＨ＋（６）：男性、４４歳、ＰＮＨのみ（４３歳で発症）、Ｋｖ１ １６５pM。
ＰＮＨ＋（４）：男性、２３歳、ＰＮＨのみ（２２歳で発症）、Ｋｖ１ ２５５pM。
ＰＮＨ Ｋｖ１抗体陰性（ＰＮＨ−）
ＰＮＨ−（７）：女性、４８歳、ＰＮＨのみ（４１歳で発症）。
ＰＮＨ−（８）：女性、４５歳、ＰＮＨ（３７歳で発症）およびレイノー病。
ＰＮＨ−（１０）：男性、５３歳、ＰＮＨのみ（５０歳で発症）。
ＰＮＨ−（１１）：男性、４９歳、ＰＮＨのみ（４４歳で発症）。
ＰＮＨ−（１２）：女性、４１歳、ＰＮＨのみ（１５歳で発症）および湿疹。
【００６５】
市販Ｋｖ１．１抗体またはＰＮＨ患者の血清の、Ｋｖ１抗体の存在あるいは非存在下での、正常ヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌の誘発能力の試験：新たに精製した正常ヒトＴ細胞（２ｘ１０６細胞／ml）を２４穴プレート中でインキュベーションし、ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体（１：１０００希釈；alomone）に２４時間曝した。培地に分泌されたＴＮＦ−αのレベルは、上記のようにＥＬＩＳＡ法によって検査した。
【００６６】
代わりに、Ｔ細胞（２ｘ１０６細胞／ml）をＫｖ１抗体−陽性ＰＮＨ患者、Ｋｖ１抗体−陰性患者または健常者の血清（１：１００希釈）に曝した。Ｔ細胞を含まない培養を陰性コントロールとした。２４時間インキュベーションした後、上清中のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを上記のように検査した。培地に分泌されたＴＮＦ−αのレベルは、抗−Ｋｖ１．１抗体陰性ＰＮＨ患者の血清に曝されたＴ細胞によって分泌される平均ＴＮＦ−αレベルの±２＊ＳＤを越えるならば、増加したとした。
【００６７】
ＳＣＩＤマウスへの、ＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞のインビボ注射：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウス腹腔内へ（ｉｐ）、シクロホスファミド（Sigma、２０mg／ml ＰＢＳ溶液）２００μlを細胞注射する２４時間前に注射した。新たに精製した正常ヒトT細胞（１ｘ１０８細胞）をDTX-K（１００ｎM、２４時間）またはＰＢＳで前処理し、洗浄し、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレッシンアセトキシメチル（BCECF AM、Molecular Probes, Eugene, Oregon）で蛍光標識した。それからヒトＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、懸濁し、標識細胞の２００μl（１．５ｘ１０７細胞に相当）をそれぞれの動物のｉｐに注射した（各群ｎ＝５）。２４時間後、各動物から血液を採取し、肝臓、脾臓、腎臓、骨髄および脳を取り出した。脳を除く全ての臓器から単細胞懸濁液を調製した。それぞれの臓器における総細胞数ならびに常在ＳＣＩＤ細胞（非蛍光）のみまたは注入したヒトＴ細胞（蛍光）のみの数をFACSortによって計測した。
【００６８】
脳の免疫組織化学：脳を取り出し、ブアン固定液に４℃で一夜浸し、ＰＢＳで洗浄し、パラフィン包埋を行うまで７０％エタノールに貯蔵した。連続７μ厚の冠状切片を切り、脱パラフィン、脱水し、家庭用Samsung電子レンジを用いてマイクロウエーブ処理を行った。これは、１mM ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ＝８．０）に浸し、沸騰するまで最高出力で加熱し、更に１０分間２０％効率で加熱し、同じバッファー中で、室温で３０分間冷却することにより行った。
【００６９】
免疫組織化学については、切片をＰＢＳ／２０％ウマ血清（ＨＳ）（Vector Laboratories, Burlingame, CA）と４℃で一夜前インキュベーションを行った。それから切片を、ラット抗−ヒトＣＤ３モノクローン抗体（ＰＢＳ／２％ＨＳで１：５０希釈；Serotec, Oxford, UK）と４℃で９６時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をビオチン化抗−ラットＩｇＧ（ＰＢＳ／２％ＨＳで１：１０希釈；Vector）と室温で１．５時間インキュベーションし、再び洗浄後Ｃｙ３結合したストレプトアビジン（ＰＢＳで１：２００希釈；Jackson）とインキュベーションした。切片を蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse E600）で観察し、ＡＣＴ−１ソフトウエアープログラムを用いてｘ４０倍率で写真撮影を行った。
【００７０】
統計解析：統計的有意差をStudent's t-testによって解析した。患者の異なった群間の定量的な変動を比較するために、非パラメータKruskal-Wallis テストを用い；次いで対での比較は非パラメータMann-Whitney U-testによって行った。
【００７１】
実施例２：正常ヒトＴ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの選択的遮断は、著しい又単独のＴＮＦ−α分泌を誘発する。
新たに精製した正常ヒトＴ細胞（「静止」正常ヒト末梢Ｔ細胞）を、他の刺激分子が全く存在しない状態で１２の異なったチャンネル遮断剤（表１参照）に曝した。これらの１２の遮断剤は、Ｔ細胞に発現されるＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ−チャンネルの殆どのタイプを遮断するそれら報告された能力に基づいて選択された（Deutsch ら, 1986; Lewis ら, 1995; Lewis ら, 1988; Rader ら, 1996; Freedman ら, 1995; Koo ら, 1997; Lin ら, 1993; Ishida ら, 1993; Jensen ら, 1999; Kotturi ら, 2003; Phipps ら, 1996; Verheugen ら, 1997; Levite ら, 2000; Chandyら, 1984）。培地へ分泌されるＴＮＦαのレベルは、ＥＬＩＳＡ法により２４時間後に試験した。陽性コントロールとして、Ｔ細胞を非特異的な様式で活性化することが知られている、強力なホルボールエステル、ＰＭＡに曝した。結果は図１Ａに示してあり、２〜３回の独立した実験において試験したＴＮＦ−α分泌の倍増率±ＳＤを表す。各イオンチャンネル遮断剤は、少なくとも２回の独立した実験において、その有効適用範囲のいくつかの濃度で試験した（材料と方法を参照）。各遮断剤の隣の図の数字は用いた最高のモル濃度を表す。統計解析：ＭｇＴＸ、ＫＴＸ、ＤＴＸ−ＫおよびＰＭＡのそれぞれについて、未処理に対して＊Ｐ＝０．０００１、０．０００５、０．００１１および０．０００５（Student's t-test）。
【００７２】
図１Ａは、電位依存性Ｋ＋チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの、高度に選択的なＫｖ１．１遮断剤であるデンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）(Harvey et al , 2001)（又該物として多くの研究に使用され、その内のいくつかは(Harvey et al , 2001)に引用されている）による遮断が、それだけで、ＴＮＦ−αの分泌を引き起こすことを示している。推奨される至適有効濃度（すなわち多くの他の研究において通常用いられるような、１００nM）で使用したＤＴＸ−Ｋは、試験したヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌の３３．４倍増を誘導したが、これは本明細書で陽性コントロールとして用いた、強力な非特異的活性化剤、ホルボールエステル（ＰＭＡ、４１．３倍増）によって得られるものと同規模であった。ＴＮＦ−α分泌の有意な増加は、カリオトキシン（ＫＴＸ）およびｒマルガトキシン（ＭｇＴＸ）によってもまた起きた（それぞれ１５．１および６．５倍増、図１Ａ）：これらは、電位依存性Ｋ＋チャンネルの遮断剤であって、主としてＫｖ１．３チャンネルに影響するが、Ｋｖ１．１チャンネルにも又影響する可能性がある。ＤＴＸ−Ｋは、ＫＴＸおよびＭｇＴＸと比較すれば、Ｋｖ１．１に対するより高い親和性と選択性を有している（例えば、Ｋｖ１．１に対するＫｉは、ＤＴＸ−Ｋは１６pMでありＫＴＸの２０nMよりもはるかに高い(Gutman et al , 2003)）。
【００７３】
ＤＴＸ−Ｋ、ＫＴＸおよびＭｇＴＸとは対照的に、正常ヒトＴ細胞を９つの他のイオンチャンネル遮断剤のいくつかの有効濃度に曝した後も、どんな有意なＴＮＦ−αの上方調節も観察されなかった（表１）が、その中には更なるＫ＋チャンネルの遮断剤（Ｋｖ１．１に対しては選択性がより少ない）：４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、クロトリマゾ−ル（ＣＬＴ），テトレエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、ｒカリブドトキシン（ＣＴＸ）およびキニーネ；Ｎａ＋チャンネル遮断剤：テトロドトキシン（ＴＴＸ）；Ｃｌ−チャンネル遮断剤：ＮＰＰＢ；Ｃａ２＋チャンネル遮断剤：R-(+)-Bay K8644 (+Bay K)；およびイオンチャンネル（イオンチャンネル内蔵型）グルタミン酸／ＡＭＰＡ受容体（ヒトＴ細胞中に高レベルで存在することが最近同定された）（Ganor et al, 2003）：ＣＮＱＸ。
【００７４】
ＤＴＸ−Ｋの誘発効果は、図１Ｂに示したように用量依存性である。１０−９Ｍ〜１０−６ＭのＤＴＸ−Ｋに対して２４時間曝露した後のＴＮＦ−α分泌の倍増±ＳＤを示す。行われた三つの実験のうち代表的なものを示す。未処理に対して＊Ｐ＝０．０００１である（Student's t-test）。ＴＮＦ−α分泌は、１００nM ＤＴＸ−Ｋに対して８．７倍で、１μMＤＴＸ−Ｋに対しては３９．５倍であった（注：図１Ａおよび１Ｂに示す結果は、別の二人のヒトから精製したＴ細胞に関するものである、下を参照のこと）。
【００７５】
続く実験で、我々は更なる１０人の個体から新たに分離したＴ細胞を試験し、ＤＴＸ−Ｋの効果は、再現性があることが分かった。図１Ｃ〜Ｈは、これらの６人のヒト個体からのＴ細胞のＤＴＸ−Ｋに対する被曝後（２４時間、１００nM）培地に分泌されたＴＮＦ−αの実際の平均濃度をpg／ml±ＳＤで示したものである（ａおよびｂに描かれた倍増率ではなく）。統計解析：１、３、５〜６の個体それぞれについて、未処理に対して＊Ｐ＝０．００５４、０．００５２、０．００６３および０．０１９７（Student's t-test）。本明細書ではpg／mlで示す、個体４および２のＴ細胞から分泌されたＴＮＦ−αは又、倍増率にて上に示している(それぞれ図ＡおよびＢ)。図１Ｃ〜Ｈは、Ｔ細胞由来のＴＮＦ−αのバックグラウンドレベルが異なっているにもかかわらず、ＤＴＸ−Ｋ（２４時間、１００nM）は、全ての６人の個体のＴ細胞による著しいＴＮＦ−αの分泌を誘発し、それぞれ２２．３、８．７、４９．０、３４．４、２．４および２．０の倍増率の結果になったことを示す。ＤＴＸ−Ｋ誘導性ＴＮＦ−α増加の最高値は、３８pg／mlから１３０８pg／mlであって、３４．４倍増を示している（図１Ｆ，個体４）。
【００７６】
注：ＤＴＸ−ＫはこれらのヒトＴ細胞の細胞生存または増殖に、有意な影響は持たなかった（データは示さず）。
【００７７】
実施例３：チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットのＤＴＸ−Ｋによる遮断は、ＴＮＦ−αの唯一的な分泌を誘起するが、一方「古典的な」ＴＣＲの活性化は、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の強健であるが、非唯一的な分泌を誘導する。
図２Ａ〜Ｈにおいて、正常ヒトＴ細胞を、１００nM ＤＴＸ−Ｋ（図２Ａ〜Ｄ）または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂｓ(図２Ｅ〜Ｈ)を用いた「古典的な」ＴＣＲ活性化に曝した。その後２４〜７２時間内に培地に分泌されるＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４のレベルを、ＥＬＩＳＡによって試験した。少なくとも３回の独立して行った実験のうちの代表的な実験の一つからの、ＴＮＦ−α（図２Ａおよび２Ｅ、２４時間）、ＩＮＦ−γ（図２Ｂおよび２Ｆ、２４時間）、ＩＬ−１０（図２Ｃおよび２Ｇ、７２時間）およびＩＬ−４（図２Ｄおよび２Ｈ，７２時間）の分泌の倍増率±ＳＤを示す。統計解析：未処理に対して＊Ｐ＝０．００５６（Ａ）、０．００５０（Ｅ）、０．００５１（Ｆ）、０．００５０（Ｇ）および０．００５３（Ｈ）（Student's t-test）。
【００７８】
興味あることには、ＤＴＸ−ＫによるＫｖ１．１の遮断はＴＮＦ−αのみを増加させたが、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のレベルには影響しないことが分かった（図２Ａ〜Ｄ，結果を、全４サイトカインの分泌の倍増率で表す）。これとは著しく対照的に、抗−ＣＤ３および抗−Ｄ２８抗体によって達成したＴＣＲ活性化は、全４つのＴｈサイトカインの強健であるが、非選択的な分泌を誘起した（図２Ｅ〜２Ｈ）。予想したように、ＴＣＲ活性化後のＴＮＦ−α分泌の規模は、ＤＴＸ−Ｋ処理後に得られるものに比べて、ずっと大きかった（図２Ｅに対する図２Ａ）。ＴＣＲ活性化の間または後に、ＤＴＸ−ＫによってＴ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットを遮断しても、ＴＣＲ活性化のみによって達成された以上には、ＴＮＦ−αレベルの更なる増加は起こらなかった（データは示されない）。
【００７９】
実施例４：Ｔ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断により、長期間のＴＮＦ−αの増加が生じる
Ｔ細胞のＴＮＦ−α分泌は、ＴＣＲ活性化後、通常は２４時間でピークに達し、その後徐々に低下する。それ故、Ｔ細胞内のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断によって起きるＴＮＦ−α分泌を調査し、この時期にピークに達するかどうか、および分泌が一時的かあるいは長期なものかを検討した。図２Ｉおよび２Ｊにおいて、個体４（図２Ｉ）および個体５（図２Ｊ）（既に図１Ｆ、２Ｇに示した同じ二人の個体）からの正常Ｔ細胞を１００nM、ＤＴＸ−Ｋに曝し、その後異なった時点でＥＬＩＳＡ法により、培地をＴＮＦ−αについて検査した。それぞれの個体について、それぞれの時点でのＴＮＦ−α分泌の倍増率±ＳＤを示す。個体４のそれぞれ１６、２４、４８および７２時間において、未処理に対して＊Ｐ＝０．００５３、０．００５２、０．００５０および０．００５３であり；個体５のそれぞれ１６、２４、４８および７２時間において、未処理に対して＊Ｐ＝０．００５７、０．００６３、０．００７２および０．００３１６であった（Student's t-test）。
【００８０】
この実験により、ＤＴＸ−Ｋに誘導されたＴＮＦ−α分泌の動態が(図２Ｉ，２Ｊ)、それらのバックグラウンドおよびＤＴＸ−Ｋに誘導された、T細胞由来のＴＮＦαレベル(図１Ｆ、２Ｇ)と比較していく分異なっていることを明らかにする。これらの相違にもかかわらず以下の二つの特徴は共通している：１）有意に増加したＴＮＦ−αの分泌は、１６時間後において既に明らかである；２）ＴＮＦ−αの分泌は、ＤＴＸ−Ｋ処理の開始から７２時間後であっても有意に高い状態を維持した。
【００８１】
実施例５：ＤＴＸ−Ｋ誘導性ＴＮＦ−α分泌にはＴ細胞膜を通してＣａ２＋の流入が必要とされる。
Ｃａ２＋は、ＴＮＦ−αの転写に関与していることが知られている(Lobo et al, 1999)。これに基づいて、Ｔ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットを遮断することによって生じる著しいＴＮＦ−αの分泌には、「連続的な」Ｃａ２＋の流入が必要となるかどうかを検討した。Ｔ細胞内に発現されたＬ型Ｃａ２＋チャンネルの強力で非常に選択的な遮断剤を用いた：(R) - (+) - Bay K 8644であって、ＤＴＸ−Ｋ（１００nM）の添加の５分前に正常ヒトＴ細胞に加えた。選択的なＣａ２＋チャンネル遮断剤は、ＤＴＸ−ＫのＴＮＦ−αの分泌を引き起こす能力を完全に阻止したが、対照として加えたＣｌ−チャンネル遮断剤、ＮＰＰＢ(表１)は、該阻止能力を有しなかった(図２Ｋ)。この実験において、Ｋｖ１．１遮断（１００nM ＤＴＸ−Ｋ、２４時間）に対する反応におけるＴＮＦαの分泌は、Ｔ細胞を１００μM +Bay-K（高度の選択的な、Ｔ細胞中で発現されたＣａ２＋チャンネル遮断剤で、ＤＴＸ−Ｋの５分前に加えられた）で前処理した場合は、完全に阻止されたが、関係ないＣｌ−チャンネル遮断剤、ＮＰＰＢの１００μMで前処理を行った場合は阻止されなかった。結果は、実施した３回の実験の一つからのＴＮＦ−αの分泌の平均（pg／ml）±ＳＤを表している。統計解析：未処理に対して＊Ｐ＜０．０００１、ＤＴＸ−Ｋのみに対して＊＊Ｐ＜０．０００１（Student's t-test）。
【００８２】
実施例６：Ｔ細胞内のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断により、またＴＮＦ−α ｍＲＮＡレベルも増加する。
次に、Ｔ細胞のチャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断により、ＴＮＦ−αタンパクだけではなく、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡのレベルも増加するかについての問題を研究した。この問題を研究するために、ＤＴＸ−Ｋをヒト正常Ｔ細胞に２４時間加え、ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに転写し、ＴＮＦ−α特異的なプライマーを用いて、特異的なＴＮＦ−αＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写の効率のコントロールとして、内部標準（リボソームＳ１４タンパク）を用いた更なるＲＴ−ＰＣＲ反応を同時に行った（すなわち同じＰＣＲチューブにおいて）。さらに具体的に言うと、正常末梢ヒトＴ細胞を１００nMＤＴＸ−Ｋに２４時間曝した。それからｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦαおよび内部コントロール、すなわちリボソームＳ１４タンパク、に対する特異的なプライマーを用いて、同じＰＣＲチューブ内で同時に二つのＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅した。結果を図３Ａに示す。上段のバンド：ＴＮＦ−α（予想される産物のサイズ：４９４ｂｐ）；下段バンド：Ｓ１４（予想される産物のサイズ：１６６ｂｐ）。下の棒グラフは、ＴＮＦ−α／Ｓ１４の対応するＲＴ−ＰＣＲバンドの濃度解析および正規化の後に計算したＴＮＦ−αｍＲＮＡの倍増率を表す。ＮＣ＝陰性コントロール（ｃＤＮＡ無し）。
【００８３】
図３Ａは、チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットのＤＴＸ−Ｋによる遮断によって、実際、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡレベルが増加することを示している。
【００８４】
実施例７：チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットの遮断は、正常ヒトＴ細胞のＮＦ−
κＢの活性化を導く。
ＴＮＦ−αは（ＩＬ−１のような他の炎症促進性のサイトカインのように）ＮＦ−κＢを活性化させるだけではなく、ＮＦ−κＢによってもまた誘導される（Siebenlist et al, 1990）。ＴＮＦ−α遺伝子の場合は、ＴＮＦα遺伝子の発現に対して観察されたＮＦ−κＢの重要性は、細胞タイプと解析された、エンハンサー／プロモータの区域に依存するのかも知れない（Siebenlist et al, 1990）。これらに基づいて、正常ヒトＴ細胞（ここでもまた、いかなる他の刺激の完全に存在しない状態で）におけるＫｖ１．１チャンネルの遮断が、ＮＦ−κＢに影響を及ぼすことができるかを我々は検討した。これを二つの技術によって研究した：１）未処理およびＤＴＸ−Ｋ処理正常ヒトＴ細胞から核抽出物を調製し、市販の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって核ＮＦ−κＢ結合配列に結合したＮＦ−κＢの量を測定する；２）抗−ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０特異的抗体、ＦＩＴＣ結合抗−ヒトＩｇＧおよび細胞核を特異的に染色するHoechst 33342を用いて、免疫組織化学染色法によって、推定されるＮＦ−κＢの核への移行を可視化する。
【００８５】
核抽出物を数時間加えたが、そのうち７分のみを示す。ＯＤ±ＳＤで示した結果は、市販のＥＭＳＡによって定量された、核ＮＦ−κＢ結合配列に結合したＮＦ−κＢの量を反映している。別個に行った二つの実験の一つを図３Ｂに示す。統計解析：＊Ｐ＝０．００９２（Student's t-test）。
【００８６】
ＯＤ値が核ＮＦ−κＢ結合配列に結合しているＮＦ−κＢの量を表す、図３Ｂから見られるように、ＤＴＸ−Ｋ添加後７分で核抽出物に存在するＮＦ−κＢのレベルは有意に増加した。予想されたように、この増加は一時的なものであって、しばらく経つと試験した点はもはや検出されなかった（データは示していない）。ＥＭＳＡによって検出したこの結果は、図３Ｃに示す二重免疫蛍光写真と一致していた。図３Ｃに結果が示してある実験において、正常ヒトＴ細胞は、処理しないかまたはＤＴＸ−Ｋで７、１５、３０および６０分処理した（それぞれのカラムの上のＤＴＸ−Ｋ処理時間を参照）。免疫蛍光組織化学染色は、抗−ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０抗体、次いでＦＩＴＣ結合抗−ヒトＩｇＧを用いて行うか、あるいは細胞核に取り込まれるHoechst 33342を用いて行った。拡大率ｘ１００の代表的な写真は、ＮＦ−κＢ ｐ５０緑色蛍光（上段のパネル）、核の青色蛍光（中段パネル）両者を重ねたもの（下段パネル）を示す。研究したＴ細胞の外形サイズ（明視野）および核（Hoechst）は、左のカラムに示す。従って、図３Ｃは、ＤＴＸ−Ｋ添加後７分（左から３番目のカラム）で細胞核（Hoechst青色蛍光）は明瞭にＮＦ−κＢ ｐ５０陽性（緑色蛍光）であるが、未処理の細胞においてはそうではなく、又試験した後の三つの時点：１５，３０および６０分では（図３Ｃ，それぞれ三つの右のカラム）ＮＦ−κＢ ｐ５０の蛍光は見られなかった。注目すべき点は、ＤＴＸ−Ｋ処理後７分において、細胞質（Hoechst 陰性）は、ＮＦ−κＢ ｐ５０に対して陽性に染色されたが（図３Ｃ，左から３番目のカラム）、未だ明瞭でない理由により細胞質ＮＦ−κＢ ｐ５０は、未処理細胞においては観察されない。唯一の論理的なしかし推測でしかない、考えられる説明は、本明細書で用いる抗−ｐ５０抗体は立体構造にいくらか敏感であり、もしそうなら活性化およびＮＦ−κＢ阻害剤ＩκＢ(Siebenlist et al , 1990)の放出後、細胞質ｐ５０は、この抗体によって検出しやすくなる可能性がある。
【００８７】
実施例８：正常ヒトＴ細胞は電位依存性Ｋｖ１．１タンパク質およびｍＲＮＡを発現する。
先の研究は、機能的な（すなわち電気生理的に活性を有する）チャンネルを含むＫｖ１．１サブユニットは、主として脳、心臓、網膜、骨格筋および膵島で発現されていることを示した（Beckh et al , 1990; Klumpp et al , 1991; Matsubara et al, 1991; Roberds et al, 1991; Tsaur et al, 1992）。対照的にＴ細胞中のＫｖ１．１電流に関しては、先の研究から現れる像は不明瞭である。いくつかの研究では、パッチ−クランプ技法によってヒトＴ細胞がＫｖ１．１の特徴を発現するかを試験したが、該電流を同定することができなかった（例えば(Cahalan et al, 1985)）。しかしこれと対照的に、Freedman et alはマウスＣＤ４−ＣＤ８−胸腺細胞によるＫｖ１．１電流／発現を示し(Freedman et al, 1995)、Liu et alは、いくつかの方法の使用に基づいて、未処理のマウスＣＤ４＋リンパ球に発現している電流は、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．３およびＫｖ１．６と一致すると報告した(Liu et al, 2002)。本明細書においては、Ｋｖ１．１の全く新規な面を研究して、正常末梢ヒトＴ細胞においてＫｖ１．１タンパクおよび、ｍＲＮＡの発現を確認することを欲した（本研究の範囲を逸脱するＫｖ１．１電流について再び試験することなしに）。本方法は、Ｋｖ１．１特異的なプライマーを用いたＫｖ１．１特異的ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＫｖ１．１特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー（この目的のためには今まで使用されていなかった方法）を含む。
【００８８】
図４Ａは、ｃＤＮＡを正常末梢ヒトＴ細胞から調製し、Ｋｖ１．１特異的プライマーを用いてＫｖ１．１特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す（上段バンド；予想産物サイズ：７０９ｂｐ）。コントロールＰＣＲは、同時に同じＰＣＲチューブで、リボソームＳ１４プライマーを用いて行った（下段バンド；予想産物サイズ：１６６ｂｐ）。図４Ａは、Ｋｖ１．１特異的ｍＲＮＡが実際に正常ヒトＴ細胞のｃＤＮＡから増幅されることを示す。更に加えて、Ｋｖ１．１特異的な免疫蛍光染色を行った。Ｔ細胞は、ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体（図４Ｂ、実太線）あるいはアイソタイプコントロール非特異的染色として、正常ウサギＩｇＧ（図４Ｂ、破線）で染色し、それからＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧで染色した。Ｋｖ１．１発現は、FACSortによって評価した。五つの独立した実験（異なった個体のT細胞を用いた）の一つを示す。ここでヒトT細胞の４９．０％は、Ｋｖ１．１陽性であった。行われた他の四つの実験においては、Ｋｖ１．１陽性T細胞の百分率は４０−８０％の間で変異した。従って、図４Ｂは、フローサイトメトリー解析によって、Ｋｖ１．１タンパク質が正常末梢ヒトＴ細胞のかなり実質的な割合で細胞表面に明瞭に発現していることを示す。
【００８９】
実施例９：市販の抗−Ｋｖ１．１チャンネル抗体は顕著なＴＮＦ−αの分泌を誘発し、それにより選択的なＫｖ１．１遮断剤の効果を模倣する。
この実験において、抗−Ｋｖ１．１特異的抗体が、Ｋｖ１．１チャンネル遮断剤、ＤＴＸ−Ｋのように作用し、ＴＮＦ−αの分泌を増加させるかを、我々は検討した。３人の更なる個体(各個体７−９)からの正常ヒトＴ細胞を、市販のウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体とインキュベーションし（１：１０００倍希釈、２４時間）、培地中に分泌されたＴＮＦ−αのレベルをＥＬＩＳＡ法によって試験した。結果を図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅに示し、各個体のＴ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの平均±ＳＤを提示する。それぞれ未処理の個体７〜９に対して、＊Ｐ＝０．０００３、０．００５７、および０．００２１であった（Student's t-test）。
【００９０】
図４Ｃ〜４Ｅは、３人の異なった該被験体に由来する正常ヒトＴ細胞と２４時間インキュベーションした、市販の抗−Ｋｖ１．１抗体は、これらの細胞によって分泌されるＴＮＦ−αの量を、それぞれ７．２、１４．８および２３．２倍増を誘導したことを示す。ここで注意すべきことは、ここで用いた抗−Ｋｖ１．１抗体はＫｖ１．１チャンネルの細胞内エピトープに対して指向性を有していることである。この抗体は、Ｔ細胞内に侵入した後ＴＮＦ−αの分泌を誘導すると考えられているが、これは抗体の生体細胞内に侵入する能力を明瞭に示した先の報告に基づいている(Alarcon-Segovia et al , 1996; Ruiz-Arguelles et al, 2003)。事実、種々の自己免疫疾患において、病原となる抗体は細胞内エピトープに対して指向性を有しており（例えば、全身性エリテマトーデスにおける抗−ＤＮＡおよび抗−リボヌクレタンパク抗体）(Alarcon-Segovia et al , 1996; Ruiz-Arguelles et al, 2003)、細胞内に侵入後にのみそれらの有害な効果を発揮する。
【００９１】
実施例１０：Ｋｖ１抗体陽性末梢神経過剰興奮症（ＰＮＨ）血清は、正常ヒトＴ細胞
によるＴＮＦ−αの分泌を著しく促進する。
この実験は、ＰＮＨ患者の血清に存在する病原性のＫｖ１抗体（すなわち、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６抗体）(Hart et al, 2002)が、市販Ｋｖ１．１抗体およびＤＴＸ−Ｋの作用を再現するか、又ヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌を増加させるかを検討する。ＰＮＨの通常提示される臨床症状は、筋肉のれん縮、硬直、こわばりおよび脱力感であって、多汗症、偽性ミオトニー現象、偽性テタニーおよび感覚性の症状である（Newsom- Davis et al, 1993）。加えて、ＰＮＨ患者は、ＣＮＳ症状を有することもある（Vincent et al, 2004）。ＰＮＨの殆どの症例は自己免疫症であって、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２およびＫｖ１．６抗体の混合物である循環性のＫｖ１抗体（Hart et al, 002）によって起こる。
【００９２】
この仮説を試験するために、正常末梢ヒトＴ細胞を健常コントロール被験体（Ａ群）Ｋｖ１抗体陽性ＰＨＮ患者（Ｂ群）またはＫｖ１抗体陰性患者（Ｃ群）の任意の血清に（１：１００倍希釈）に曝した。全ての群は年齢、性および地理的に適合させた（方法を参照）。続く２４時間に培地に分泌されたＴＮＦ−α（図４Ｆ）またはＩＮＦ−γ（図４Ｇ）のレベルは、ＥＬＩＳＡ法によって試験した。結果は、行われた三つの独立した実験の平均である。図４Ｆにおいて、水平バーおよびそれぞれの数値は中央値を表す。ここでは下カットオフ（カットオフＡ）である破線は、コントロール群の血清に曝されたＴ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの平均＋２＊ＳＤを表し；ここでは上カットオフ（カットオフＣ）は、Ｋｖ１−陰性ＰＮＨ血清に曝されたＴ細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの平均＋２＊ＳＤを表す。グラフに示されたそれぞれの数値は、分泌されたＴＮＦ−αの実際の平均量（pg／ml）を表す。３つのＫｖ１陽性ＰＮＨ患者（つまり、ＰＮＨ＋５，２および６）の血清は、明瞭にカットオフＣの上のＴＮＦ−αの分泌の増加を誘導した（しかしＩＮＦ−γは誘導されない）。統計解析：ＫＷ統計＝８．０００３、Ｐ＝０．０１８３，Kruskal-Wallis 検定。対比較はMann-Whitney Ｕ検定でおこなった：Ａ群対Ｂ群、Ｐ＝０．０１１７、Ａ群対Ｃ群、Ｐ＝０．００８７、Ｃ群対Ｂ群、Ｐ＝０．６２８２。
【００９３】
図４は、いく人かのＫｖ１抗体陽性ＰＮＨ患者の血清は、健常コントロール被験体または検出可能なＫｖ１抗体を有しないＰＮＨ患者からの血清によって誘導されるよりは有意に高い、著しいＴＮＦαの分泌を誘導することを示している。更に、ＴＮＦ−α誘発効果は、抗体力価と正の関係にあった（材料および方法参照）。ＰＮＨ患者からの血清の同体積および濃度を含むがＴ細胞を含まない、陰性コントロール実験培養には、ＴＮＦ−αレベルに影響は無かった。重要なことには、ＰＮＨ患者のＫｖ１抗体陽性血清は、ＴＮＦ−αの増加を誘導したが、ＤＴＸ−Ｋで観察された（図２）と同様に、ＩＮＦ−γの増加は誘導せず（図４Ｇ）、この効果の選択性を確認している。総合的に、この一連の実験は、増加したＫｖ１抗体力価を含むいくつかのＰＮＨ患者の血清は、正常ヒトＴ細胞による著しいＴＮＦα分泌を誘導し、それによって市販抗−Ｋｖ１．１抗体および選択的Ｋｖ１．１遮断剤、ＤＴＸ−Ｋの効果を模倣することを示した。
【００９４】
実施例１１：前処理Ｋｖ１．１遮断により上昇したＴＮＦ−αレベルを分泌する正常ヒトＴ細胞を、ＳＣＩＤマウスへ注射することで、肝臓へ宿主細胞を選択的に動員させる。
Ｋｖ１．１の選択的遮断に反応しているヒトＴ細胞によって分泌するＴＮＦ−αが、インビボにて機能的であるかを試験するために、我々は、最近の研究を想起したが、それは、脳内へＴＮＦ−αを投与に続いて一連の現象が起こり、その中には、特異的に肝臓に蓄積する宿主のＥＤ１−陽性細胞（すなわち常在および活性化クッパー細胞／動員された血中単球）の急速な２倍までに増加する、というものであった（Campbell et al, 2005）。我々は、ＤＴＸ−Ｋ処理済のヒトT細胞によって分泌された、増加したＴＮＦ−αも該効果を誘導するかを検討した。このことを試験するために、新たに精製した正常ヒトT細胞を、ＰＢＳまたは１００ｎM ＤＴＸ−Ｋに２４時間曝し、洗浄し、蛍光標識を付け、それから後者の細胞が増加したＴＮＦ−αを分泌していることを確認した後(データは示していない)、ＳＣＩＤマウス（すなわち自身のリンパ細胞を欠いている）に注射した（各群ｎ＝５）。肝臓、骨髄、脾臓、および腎臓の単細胞懸濁ならびに血液細胞に存在する、細胞の総数、ならびに常在ＳＣＩＤ細胞のみ（非蛍光）および注射されたヒトＴ細胞のみの数を、２４時間後FACSortによって計測した。肝臓に関しては、結果は非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の平均±ＳＥＭ数（図５Ａ）および蛍光標識ヒトＴ細胞の平均±ＳＥＭ数（図５Ｂ）で表される。他の臓器に関しては、非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の数のみを示す：骨髄（図５Ｃ）、血液（図５Ｄ）、脾臓（図５Ｅ）および腎臓（図５Ｆ）、未処理に対して＊Ｐ＜０．０００１（Student's t test）。図５Ｇは、注入されたヒトＴ細胞の検出のために、エクスビボにてＤＴＸ−Ｋと前インキュベーションしたヒトＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウスの脳切片の免疫組織化学像を示す。ＳＣＩＤマウスにＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞を注射後２４時間、ＣＤ３陽性細胞が脳皮質内に検出されることを示すｘ４０の拡大率の代表的な写真である。
【００９５】
図５ＡはＴＮＦ−αを分泌しているＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞の注入は、肝臓における細胞数を２倍にしたことを示す。我々が依拠した関連研究において(Campbell et al, 2005)、この効果は肝臓に限定されていて、骨髄、血液、脾臓、および腎臓における細胞総数は、有意には変化しなかった（それぞれ図５Ｃ〜５Ｆ）。更に、予想されるように、肝臓における細胞数の増加はマウス（ＳＣＩＤ）宿主細胞の動員に由来するもので(図５Ａ)、受動的に移したヒトＴ細胞がこの臓器に入ったことに由来するのではなかった(図５Ｂ)。技術的な制限によって、動員したマウス細胞の正確な同定は、行わなかった。最後に、脳の切片の免疫組織化学像は、注射されたＳＣＩＤマウスの皮質内に、注射されたＤＴＸ−Ｋ処理済のヒトＴ細胞の存在を明らかにした（図５Ｇ）これは、原則として、肝臓への宿主細胞の生体内動員は、脳内で作動しているＴＮＦ−α（すなわちＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞によって脳へ送達されたＴＮＦ−α）によって介される可能性を示唆しており、ＴＮＦαを脳内に注射後、宿主細胞が肝臓に動員された最近の報告に類似している(Campbell et al, 2005)。実際、ＴＮＦαのＢＢＢを混乱させる能力に基づけば(Mayhan 2002)、ＤＴＸ−Ｋ処理細胞が脳に侵入することができることは、驚くには当たらない。脳に到達した未処理およびＤＴＸ−Ｋ処理ヒト細胞の数の間の統計的に正当な比較は不可能である。最後の注意点として、肝臓に動員されたマウスＳＣＩＤ細胞が、ヒトＴＮＦ−α（ＤＴＸ−Ｋ処理ヒトＴ細胞によって分泌される）に反応できたことは、我々にとって驚くべきことではない。なぜならマウスＴＮＦ−α受容体１型は組み換えマウスおよびヒトＴＮＦ−αの両方に同様な親和性を有しているからである（Lewis et al, 1991）。更にヒトＴＮＦ−αを発現しているトランスジェニックマウスは、リウマチ性関節炎を有するヒトの患者の特徴である多くの徴候を発現し（Keffer et al, 1991; Li et al , 2003）、マウス起源の細胞がヒトＴＮＦ−αに応答することができることを示唆している。
【００９６】
具体的な実施形態の先の記述は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにしているので、他者は、現在の知識を応用することにより該具体的な実施形態を、必要以上の実験を行うこと無く、一般概念から逸脱すること無く、容易に改変しおよび／または種々の応用に適応することができ、それ故該適応および改変は、開示した実施形態と等価の意味と範囲内に包含することを意図すべきであり、また意図している。本明細書で用いられた言葉使いや用語は、記述するためであって、限定するもので無いことを理解されたい。種々の開示した機能を実施するための手段、材料および段階は、本発明から逸脱すること無く種々の代替型を取ってもよい。従って、上記の明細書および／または請求項に存在する可能性のある、「・・・に対する手段」および「・・・のための手段」あるいは機能的な記載に続くいかなる方法段階の用語は、あらゆる構造、物理的、化学的または電気的要素または構造、もしくは現在または将来存在する可能性のある、引用した機能を実施するいかなる方法段階をも包含することを意図している、すなわち同じ機能を実施するための他の手段または段階を用いることができ；該表現はその最も広義に解釈されることを意図している。
【００９７】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１Ａは、それぞれの試験されたイオンチャンネル遮断剤についての、ＴＮＦ−αの倍増率を示すグラフである。 図２Ｂは、用量の関数としてのＴＮＦ−αの倍増率を示すグラフである。 図１Ｃ〜Ｈは、６人の異なった該被験体についての、それぞれのＤＴＸ−Ｋ誘導ＴＮＦ−α分泌の量を示すグラフである。
【図２】図２Ａ〜Ｈは、ＤＴＸ−Ｋ（図２Ａ〜Ｄ）または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂ（図２Ｅ〜Ｈ）に曝された正常ヒトＴ細胞によって分泌された種々のサイトカインのレベルを示す。ＴＮＦ−α分泌の倍増率を図２Ａおよび２Ｅに、ＩＦＮγを図２ＢおよびＦに、ＩＬ−１０を図２ＣおよびＧに、ならびにＩＬ−４を図２ＤおよびＨに示す。 図２ＩおよびＪは、二人の異なった該被験体においてそれぞれのＴＮＦ−α分泌の倍増率を、時間の関数として示したグラフである。 図２Ｋは、未処理、ＤＴＸ−Ｋのみの処理、またはＢａｙ−ＫまたはＮＰＰＳのいずれかで最初に前処理済のＴ細胞についてのＴＮＦ−α分泌を示すグラフである。
【図３】図３Ａにおいては、正常末梢ヒトＴ細胞をＤＴＶ−Ｋに曝した後、上部のバンドはＴＮＦ−α（予想産物サイズ：４９４ｂｐ）および下部のバンドはＳ１４（予想産物サイズ：１６６ｂｐ）を示す。下の棒グラフは、濃度測定分析および対応するＴＮＦ−α／Ｓ１４のＲＴ−ＰＣＲバンドの規格化の後計算したＴＮＦ−αｍＲＮＡの倍増率を表す。ＮＣ＝陰性対照（ｃＤＮＡ存在せず）。 図３Ｂは、１００nMＤＴＸ−Ｋに先に曝された正常Ｔ細胞から調製した核抽出物における、核ＮＦ−κＢ−結合配列に結合したＮＦ−κＢの量を示す。 図３Ｃは、正常ヒトＴ細胞が未処理であるか、または１００nM ＤＴＸ−Ｋと７、１５、３０および６０分処理済の（上記ＤＴＸ−Ｋ処理時間についてはそれぞれのカラムを参照）、二重免疫蛍光写真を示す。拡大率ｘ１００の代表的な写真は、ＮＦ−κＢ ｐ５０ 緑蛍光（上段パネル）、核 青色蛍光（中段パネル）および両者を重ねたもの（下段パネル）を示す。試験したＴ細胞（明視野）および核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）の外形サイズを左のカラムに示す。
【図４】図４Ａは、Ｋｖ１．１特異的なプライマーを用いて行ったＫｖ１．１特異的なＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（上段バンド；予想産物サイズ；７０９ｂｐ）。コントロールＲＴ−ＰＣＲは、リボソームＳ１４プライマーを用いて同じＰＣＲチューブの中で同時に行った（下段バンド；予想産物サイズ；１６６ｂｐ）。 図４Ｂは、Ｔ細胞を、ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体で（図４Ｂ、太実線）、または、アイソタイプコントロール非特異的染色として、正常ウサギＩｇＧ（図４Ｂ、破線）で染色し、それからＦＩＴＣ結合抗−ウサギＩｇＧで染色した後の、ＦＡＣＳｏｒｔの結果を示す。 図４Ｃ〜Ｅは、３人の異なった該被験体のそれぞれ個人のＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌の平均値の結果を示したもので、それらのＴ細胞を市販ウサギ抗−Ｋｖ１．１ポリクローン抗体とインキュベーションした。 図４ＦおよびＧは、正常末梢ヒトＴ細胞を、健常コントロールの個人（Ａ群）、Ｋｖ１抗体−陽性ＰＨＮ患者（Ｂ群）またはＫｖ１抗体−陰性ＰＨＮ患者（Ｃ群）の血清に曝し、培地中に分泌されたＴＮＦ−α（図４Ｆ）またはＩＦＮ−γのレベルを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、新たに調製した正常ヒトＴ細胞を、ＰＢＳまたは１００nM ＤＴＸ−Ｋに２４時間曝し、洗浄し、蛍光標識を付け、それからＳＣＩＤマウスに注射した後の結果を示す。グラフは、肝臓、骨髄、脾臓および腎臓の単細胞懸濁液ならびに血液に存在する細胞の総数、ならびに常在のＳＣＩＤ細胞（非蛍光）のみの数および注射されたＴ細胞（蛍光）のみの数を示す。図５Ａは、肝臓における非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の平均±ＳＥＭ数を示し、又図５Ｂは、肝臓における蛍光標識されたヒトＴ細胞の平均±ＳＥＭを示す。他の器官については、非蛍光ＳＣＩＤ宿主細胞の数だけを示す：骨髄（図５Ｃ）、血液（図５Ｄ）、脾臓（図５Ｅ）および腎臓（図５Ｆ）。 図５Ｇは、注入されたヒトＴ細胞の検出のために、ＤＴＸ−Ｋとエクスビボにて前インキュベーションしたヒトＴ細胞を注射したＳＣＩＤマウスからの脳切片の免疫組織化学像を示す。ＳＣＩＤマウスにＤＴＸ−Ｋ処理したヒトＴ細胞を注射後２４時間、ヒトＣＤ３陽性細胞が皮質内に検出されることを示す、拡大率ｘ４０の代表的な写真を提示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞での電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の選択的遮断の原因となることを含む、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの合成および分泌を起こさせる方法。
【請求項２】
前記原因となるステップが、該Ｔ細胞をＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトまたは他の動物被験体において、ＴＮＦ−αのインビボ分泌を増加させることにより治療可能な疾患を治療する方法であって、電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の選択的遮断を有するＴ細胞を、該被験体内に存在させることを含む方法。
【請求項４】
該被験体が、癌、免疫不全もしくは神経細胞傷害後または神経疾患後の神経細胞の再生欠損に罹患している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該被験体が、局所的に進行した軟組織肉腫、転移メラノーマまたは他の切除不可能な組織学的腫瘍に罹患しており、患肢の切断を回避すべきである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記原因となるステップが、Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子を、該被験体に投与することを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記原因となるステップが、自己Ｔ細胞を該被験体から取り出し、自己Ｔ細胞をＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子とエクスビボで接触させ、該処理済の自己Ｔ細胞を該被験体の体内へ投与して戻すことを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該被験体が、局所的に進行した軟組織肉腫、転移メラノーマまたは他の切除不可能な組織学的腫瘍に罹患しており、患肢の切断を回避すべきであり、前記処理済の自己Ｔ細胞を分離患肢潅流設定によって投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該被験体が、肝癌に罹患しており、種々の免疫細胞の肝臓への動員が増強され、Ｔ細胞攻撃による肝癌の直接攻撃が起こり、該処理済のＴ細胞によるＴＮＦαの分泌により肝癌の直接根絶が起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
それを必要とするヒトまたは他の動物被験体内の血液脳関門および末梢内皮の透過性を増大させる方法であって、電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の選択的遮断を有するＴ細胞が、該被験体内に存在する原因となることを含む方法。
【請求項１１】
前記原因ステップが、Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子を、該被験体に投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記原因ステップが、自己Ｔ細胞を該被験体から取り出し、自己Ｔ細胞をＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子とエクスビボで接触させ、処理済の自己Ｔ細胞を該被験体の体内へ投与して戻すことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる前記分子がデンドロトキシン−Ｋである、請求項２、６〜９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる前記分子が特異的抗−Ｋｖ１．１抗体である、請求項２、６〜９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる前記分子がＫｖ１．１チャンネルの下流経路を選択的に遮断できる分子である、請求項２、６〜９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｋｖ１．１チャンネルを開くか、またはＫｖ１．１チャンネルの遮断を克服することを含む、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの合成および分泌を阻害する方法。
【請求項１７】
ヒトまたは他の動物被験体において、ＴＮＦ−αのインビボ分泌を減少させることによって治療可能な疾患または病気を治療する方法であって、該被験体のＴ細胞上のＫｖ１．１チャンネルを開くか、または該被験体のＴ細胞上のＫｖ１．１チャンネルの遮断を克服することを含む方法。
【請求項１８】
該被験体がリウマチ性関節炎または外傷後病気に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該疾患または病気が、Ｋｖ１抗体に関連するＰＮＨであり；Ｋｖ１抗体に関連する脳炎であり；およびヒトＫｖ１．１チャンネルをコードする遺伝子の様々な突然変異を伴う１型突発性運動失調（ＥＡ−１）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
Ｔ細胞での電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の選択的遮断の原因となることを含む、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの合成および分泌を起こさせる方法。
【請求項２】
前記原因となるステップが、該Ｔ細胞をＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトまたは他の動物被験体において、ＴＮＦ−αのインビボ分泌を増加させることにより治療可能な疾患を治療する方法であって、電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の選択的遮断を有するＴ細胞を、該被験体内に存在させることを含む方法。
【請求項４】
該被験体が、癌、免疫不全もしくは神経細胞傷害後または神経疾患後の神経細胞の再生欠損に罹患している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該被験体が、局所的に進行した軟組織肉腫、転移メラノーマまたは他の切除不可能な組織学的腫瘍に罹患しており、患肢の切断を回避すべきである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記原因となるステップが、Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子を、該被験体に投与することを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記原因となるステップが、自己Ｔ細胞を該被験体から取り出し、自己Ｔ細胞をＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子とエクスビボで接触させ、該処理済の自己Ｔ細胞を該被験体の体内へ投与して戻すことを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該被験体が、局所的に進行した軟組織肉腫、転移メラノーマまたは他の切除不可能な組織学的腫瘍に罹患しており、患肢の切断を回避すべきであり、前記処理済の自己Ｔ細胞を分離患肢潅流設定によって投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該被験体が、肝癌に罹患しており、種々の免疫細胞の肝臓への動員が増強され、Ｔ細胞攻撃による肝癌の直接攻撃が起こり、該処理済のＴ細胞によるＴＮＦαの分泌により肝癌の直接根絶が起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
それを必要とするヒトまたは他の動物被験体内の血液脳関門および末梢内皮の透過性を増大させる方法であって、電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．１の選択的遮断を有するＴ細胞が、該被験体内に存在する原因となることを含む方法。
【請求項１１】
前記原因ステップが、Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子を、該被験体に投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記原因ステップが、自己Ｔ細胞を該被験体から取り出し、自己Ｔ細胞をＫｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる分子とエクスビボで接触させ、処理済の自己Ｔ細胞を該被験体の体内へ投与して戻すことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる前記分子がデンドロトキシン−Ｋである、請求項２、６〜９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる前記分子が特異的抗−Ｋｖ１．１抗体である、請求項２、６〜９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｋｖ１．１チャンネルの選択的遮断の原因となる前記分子がＫｖ１．１チャンネルの下流経路を選択的に遮断できる分子である、請求項２、６〜９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｋｖ１．１チャンネルを開くか、またはＫｖ１．１チャンネルの遮断を克服することを含む、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの合成および分泌を阻害する方法。
【請求項１７】
ヒトまたは他の動物被験体において、ＴＮＦ−αのインビボ分泌を減少させることによって治療可能な疾患または病気を治療する方法であって、該被験体のＴ細胞上のＫｖ１．１チャンネルを開くか、または該被験体のＴ細胞上のＫｖ１．１チャンネルの遮断を克服することを含む方法。
【請求項１８】
該被験体がリウマチ性関節炎または外傷後病気に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該疾患または病気が、Ｋｖ１抗体に関連するＰＮＨであり；Ｋｖ１抗体に関連する脳炎であり；およびヒトＫｖ１．１チャンネルをコードする遺伝子の様々な突然変異を伴う１型突発性運動失調（ＥＡ−１）である、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５０２２０６（Ｐ２００９−５０２２０６Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２５２０８（Ｐ２００８−５２５２０８）
【出願日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０３６１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１９２６７
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５０８０３６５６９）ミニュー・セラピューティクス・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＭｉＮＥＵＥＴ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３０３６１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１９２６７
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５０８０３６５６９）ミニュー・セラピューティクス・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＭｉＮＥＵＥＴ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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