腫瘍発生を制御する方法および腫瘍発生のリスクを診断する方法
本発明は、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることを含む、腫瘍発生を制御する方法に関する。本発明は、転移性癌などの癌を含む、新生芽腫の治療、予防および診断の方法も提供する。１つの方法では、発癌性になる素因を有する１つまたは複数の細胞を同定する。該１つまたは複数の細胞において、Ｒａｂ結合タンパク質の量の変化、細胞内局在の変化、または活性の変化を検出する。少なくとも１つの発現レベルで新生物を発症するリスクを診断する方法では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性レベルおよび細胞内局在を決定する。Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成することが可能な化合物を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法では、各複合体を形成する構成要素を互いに接触させる。新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法では、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性の少なくとも１つを決定する。Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化または活性の変化は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許商標局に２００７年４月１３日に出願され、シリアル番号６０／９１１，５７３が割り当てられた「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ，ａｒｒｅｓｔｉｎｇ ｏｒ ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ａ ｒａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」の出願を参照し、かつその優先権を主張するものである。２００７年４月１３日に出願された前記出願の内容は、ＰＣＴの規則４．１８に準じて、本願明細書に含まれないＰＣＴの規則２０．５（ａ）で言及された記載事項、特許請求の範囲または図面の任意の要素または部分の援用を含め、すべての目的で本願明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、腫瘍発生を制御する方法および腫瘍発生のリスクを診断する方法に関する。これらの方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の量の変化および／または活性の変化を利用するものである。本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成することが可能な化合物、およびＲａｂ結合タンパク質の量、発現および／または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法にも関する。本発明は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
癌は世界的に主たる死因であり、先進国では２番目の主な死因であり、さらに例えばオーストラリア、日本、韓国、シンガポールにおいて、ならびに英国およびスペインの男性人口では、第１番目の死因である。毎年癌を発症する人の数は増大している。それにもかかわらず、癌療法は最近３０年間で癌死亡率を低下させることができていない。
【０００４】
組織浸潤および転移をもたらす自律的細胞増殖は、すべての悪性新生物の顕著な特徴である。癌は必ずしも加速的速度の細胞増殖の結果としてのみ生じるわけではなく、癌は、一方では細胞周期進行（細胞分裂）および細胞増殖（細胞増大）の速度と、他方ではプログラムされた細胞死（アポトーシス）の速度との間の不均衡の結果である。
【０００５】
腫瘍発生および転移増殖の発癌誘導因子の同一性を解明することは、癌の病理生物学を理解するためだけでなく、患者を治療するためにも重要である。というのは、このような遺伝子は、治療的有効性（ヘルセプチン、アバスチン、グリーベック）のためにますます活用されているからである。ヒトの癌では、ゲノム増幅、配列突然変異またはプロモーターの低メチル化から生じる異常な過剰発現によって癌遺伝子が活性化されることが多い。アンプリコンとして知られる、癌において増幅されることが多い染色体上の遺伝子座は、１つまたは複数の癌遺伝子によって誘導されると考えられ、多くの反復アンプリコンが観察されているが、それらの癌遺伝子決定因子は依然として大部分が知られていない。これらの遺伝子座は、コピー数増大の程度および頻度を評価する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの細胞遺伝学的技法によって伝統的に調べられており、この戦略は考慮対象の多くの遺伝子候補を与えるが、遺伝子リストが広範囲であり、かつ機能情報がわずかであるため、癌遺伝子の発見に対する進展は限られている。それよりも、大抵は異なる実験背景における遺伝子機能の累積的観察結果から導かれる仮説の生成によって決まるため、癌遺伝子の発見は緩慢で実験プロセスとなることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、腫瘍発生の予防を含めた腫瘍発生を制御する手段、および発癌性になる素因を有する細胞を同定する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることを含む、腫瘍発生を制御する方法を提供する。本発明は、転移性癌などの癌を含む、新生芽腫の治療、予防および診断の方法も提供する。
【０００８】
１つのこのような方法は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質（Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質）の量または活性を調節することを含む。
本発明のさらなる方法は、発癌性になる素因を有する１つまたは複数の細胞を同定することに関する。方法は、１つまたは複数の細胞において、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量の変化、細胞内局在の変化、または活性の変化を検出することを含む。
【０００９】
本発明は、新生物を発症するリスクを診断する方法も提供する。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現レベル、活性レベルおよび細胞内局在の少なくとも１つを決定することを含む。
【００１０】
本出願は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性を調節することができ、したがって例えば抗癌剤として作用することができる、適切な化合物の同定にも関する。
【００１１】
これに関し、本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質と複合体を形成することが可能な化合物を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。方法は、各複合体を形成する構成要素を互いに接触させることを含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでＲａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性を調節することが可能な化合物を同定するための方法を提供する。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質またはその機能断片を発現する微生物を提供することを含む。方法は、微生物に化合物を加えることをさらに含む。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の細胞表現型または活性の変化をモニターすることも含む。
【００１３】
他の態様において、本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法を提供する。
１つのこのような方法は、宿主生物を提供することを含む。宿主生物は、癌細胞を収容し増殖させることができる。方法は癌細胞を宿主生物に導入することも含む。さらに方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および／または活性を調節し得ると考えられる化合物を投与することを含む。方法は、宿主生物中の任意の腫瘍（複数の腫瘍を含む）の増殖をモニターすることをさらに含む。
【００１４】
さらなるこのような方法は、宿主生物を提供することも含む。宿主生物は癌細胞を収容し増殖させることができる。方法は癌細胞を宿主生物に導入することも含む。癌細胞は、Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節し得ると考えられる化合物を含む。方法は、宿主生物中の任意の腫瘍（複数の腫瘍を含む）の増殖をモニターすることをさらに含む。
【００１５】
他のさらなる態様において本発明は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法を提供する。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および／または活性を決定することを含む。Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す。
【００１６】
本発明は、限定されない実施例および添付の図面と併せて検討した場合、詳細な説明に関してさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＴＲＩＡＧＥ方法論の複数工程の略図。
【図２】統合されたマイクロアレイのデータセットを構築するために使用された乳癌コホートの臨床的特徴を示す表。
【図３】乳癌の癌ゲノムのＬＳＶＤ分析の図。固有値（ｙ軸）を、各染色体（ｘ軸）の長さに沿ってプロットする。最も高いスコアを得た主固有ピークのゲノムの位置を強調してある。
【図４Ａ】図４は、増殖サインおよび無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）を示す。図４Ａは、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）コホート（ｎ＝２５１）におけるＤＭＦＳ不良（Ｐ＜０．０５；尤度比検定）と相関した全プローブセット（ｎ＝２，３７７）が、階層的にクラスタ化されたことを示す図。優性遺伝子のクラスタは、増殖サインを反映する。増殖サインの中核遺伝子を、クラスタ化の順番に以下の実施例において名付ける。クラスタグラムの下に、転移した腫瘍（白マル）および転移しなかった腫瘍（黒マル）を時間の関数として示す。
【図４Ｂ】ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）コホート（ｎ＝２５１）におけるＤＭＦＳ不良（Ｐ＜０．０５；尤度比検定）と相関した全プローブセット（ｎ＝２，３７７）が、階層的にクラスタ化されたことを示す図。優性遺伝子のクラスタは、増殖サインを反映する。増殖サインの中核遺伝子を、クラスタ化の順番に以下の実施例において名付ける。クラスタグラムの下に、移した腫瘍（白マル）および転移しなかった腫瘍（黒マル）を時間の関数として示す。
【図４Ｃ】ＤＭＦＳ不良（ｎ＝２，３７７）に関連するプローブのセットを、Ｐ値に従ってビン分割し、＞０．４の増殖サインに相関するプローブセットの分画を白で示し、各ビンのパーセントを示す図。全ＤＭＦＳ関連プローブセットのおよそ３５％が、＞０．４の増殖サインと相関する。
【図５Ａ】図５は、１７ｑ１２および８ｐ１１のアンプリコンのＴＲＩＡＧＥ分析を示す。図５Ａは、１７ｑ１２における推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）の発現ヒートマップを示す図。腫瘍をカラムに配置し、ＬＳＶＤにより同定した遺伝子を列の中で体系化する（染色体に沿った順番で）。腫瘍を、固有重量の絶対値によりランク付けする（ヒートマップの下に記載）。平均発現より上を白で示す。ＴＲＩＡＧＥの第３工程において、生存率に有意に関連する遺伝子を右に示す（図１を参照）。白い文字で示された遺伝子（ＴＣＡＰおよびＥＲＢＢ２）は、ＴＲＩＡＧＥによる、最も有力な癌遺伝子候補を示す。
【図５Ｂ】８ｐ１１における推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）の発現ヒートマップを示す図。腫瘍をカラムに配置し、ＬＳＶＤにより同定した遺伝子を列の中で体系化する（染色体に沿った順番で）。腫瘍を、固有重量の絶対値によりランク付けする（ヒートマップの下に記載）。平均発現より上を白で示す。ＴＲＩＡＧＥの第３工程において、生存率に有意に関連する遺伝子を右に示す（図１を参照）。白い文字で示された遺伝子（ＲＡＢ１１ＦＩＰ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１）は、ＴＲＩＡＧＥにより、最も有力な癌遺伝子候補を示す。
【図５Ｃ】図５Ａと同じデータを、平均発現より下を白く示して表した図。
【図５Ｄ】図５Ｂと同じデータを、平均発現より下を白く示して表した図。
【図５Ｅ】得られたデータを要約した図。ＮＳは、「有意差なし」を示唆する。アスタリスクは、増殖サインとの相関が＞０．４であることを示す。パネルＡのヒートマップの上の黒色の垂直なバーは、免疫組織化学によるＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）陽性を表す。
【図６Ａ】図６は、ＭＣＦ１０Ａ細胞においてＲＣＰの過剰発現が癌表現型を誘導することを示す。図６Ａは、ＭＣＦ１０Ａおよび乳癌の細胞系において、ウェスタンブロットにより評価した内因性ＲＣＰのレベルを示す図。
【図６Ｂ】ＲＣＰ過剰発現の、細胞形態学における影響の図（スケールバー、１００μｍ）。
【図６Ｃ】免疫蛍光法による、細胞間接合部のＥ−カドヘリンの局在化（上）、Ｆ−アクチンの組織化（中）および血清飢餓下のフィブロネクチンの発現（下）の、ＲＣＰ過剰発現の影響の図（スケールバー、５０μｍ）。
【図６Ｄ】ＷＳＴアッセイによるＭＣＦ１０Ａ細胞の成長因子非依存性増殖に関するＲＣＰ過剰発現の影響の図（平均＋／−標準偏差）。
【図６Ｅ】軟寒天における、足場非依存性コロニー形成に関するＲＣＰ過剰発現の影響の図（倍率、×５）。
【図６Ｆ】創傷治癒（擦過傷）アッセイによる細胞遊走に関するＲＣＰ過剰発現の影響の図（スケールバー、１００μｍ）。
【図７Ａ】図７は、ＲＣＰの作用機序を示している。図７Ａは、フローサイトメトリーによる、血清飢餓ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞および対照細胞の細胞周期分析の図。
【図７Ｂ】ウェスタンブロットにより示された、ＲＣＰ過剰発現（ＭＣＦ１０Ａ細胞）に反応したＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化状態およびＲＣＰ（ＭＣＦ７細胞）のＲＮＡｉ仲介ノックダウンの図。
【図７Ｃ】ＭＡＰＫ阻害剤であるＵ０１２６によるＲＣＰ仲介Ｅｒｋリン酸化阻害の図（上のパネル）およびＲＣＰ増殖表現型のＵ０１２６仲介阻害の図（下のパネル、平均＋／−標準偏差）。
【図８Ａ】図８は、乳癌細胞系におけるＲＣＰの癌遺伝子表現型を示す。図８Ａは、ＷＳＴアッセイによる、細胞増殖に関する、ＲＣＰ過剰発現およびＲＣＰのＲＮＡｉ仲介ノックダウンの影響の図。左のパネル、形質移入６日後の結果。中のパネル、ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＲＣＰ過剰発現の増殖時間経過。右のパネル、２種の異なるＲＮＡｉ ＲＣＰ構築体および（スクランブル配列の）対照を使用する、ＭＣＦ７細胞におけるＲＣＰ阻害の増殖時間経過。
【図８Ｂ】軟寒天における、足場非依存性コロニー形成に関するＲＣＰの過剰発現および阻害の影響の図。
【図８Ｃ】マトリゲルを介した、細胞浸潤に関するＲＣＰの過剰発現および阻害の影響の図。
【図８Ｄ】細胞遊走に関するＲＣＰの過剰発現および阻害の影響の図。すべてのエラーバーは、平均＋／−標準偏差＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定（両側）から計算した。
【図９Ａ】図９は、ＲＣＰが、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を制御することを示している。図９Ａは、ＭＣＦ７細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。時間の関数としてプロットした、平均腫瘍容量を表す（平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図９Ｂ】ＭＣＦ７細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。５週（ＭＣＦ７）および７週（ＭＢ２３１）における重量をプロットした腫瘍を表す。平均重量は実線により示した。
【図９Ｃ】ＭＣＦ７細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。切除された全腫瘍を示す。
【図９Ｄ】ＭＢ２３１細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。時間の関数としてプロットした、平均腫瘍容量を表す（平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図９Ｅ】ＭＢ２３１細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。５週（ＭＣＦ７）および７週（ＭＢ２３１）における重量をプロットした腫瘍を表す。平均重量は実線により示した。
【図９Ｆ】ＭＢ２３１細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。切除された全腫瘍を示す。
【図９Ｇ】腫瘍試料中のＲＣＰの免疫組織化学的染色を表す図（スケールバー、１００μｍ）。
【図９Ｈ】ＴＵＮＥＬ染色による、血清飢餓ＭＢ２３１細胞のＲＣＰ阻害のアポトーシス効果を示す図（スケールバー、１００μｍ）。
【図１０】増殖サインの由来を表す図。細胞周期制御遺伝子（ヒーラ細胞において）として、ウィットフィールドら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．）（（２００２）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ、１３、１９７７−２０００）により同定された１，１３４ＩＭＡＧＥクローンを、２，１１３ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセット（Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂ）に対応させて、８８４の ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ（ｂｕｉｌｄ ＃１８７）にマッピングした。これらのプローブセットを使用して、ウプサラ腫瘍コホート（ｎ＝２５１）の発現プロフィールを、階層的にクラスタ化し（ピアソンの相関、平均連結法）、固有クラスタグラムのヒートマップにおいて視覚化した（左側）。図１０Ａにおける白いシグナルは、平均発現より上を示し、図１０Ｂにおける白いシグナルは、平均発現より下を表す。明るさのそれぞれの程度は、発現の大きさを反映している。（紙面に限りがあるため、遺伝子の系統樹は省略した）。暗いバーは、ヒト乳癌の増殖に関連するとして、ウィットフィールド（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ）およびペロー（Ｐｅｒｏｕ）によってすでに同定されたＧ２／Ｍにおいて大部分が発現する遺伝子のクラスタを示す。増殖クラスタの６７の遺伝子に対応する７８のプローブのセットは、＞０．８の平均相関（白いバーで示されている）を有し、正しい階層的クラスタ化が示されている。これらのプローブセット（右側）は、コア増殖サイン遺伝子として示されており、全プローブセットと、増殖サインとのピアソン相関を導くために平均した（すなわち、ＴＲＩＡＧＥの第６の工程）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質、および特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質（Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質）が、腫瘍、および特に癌を含む、新生物の形成を促進することができるという、驚くべき発見に基づく。
【００１９】
本発明者らは、反復増幅のゲノム部位の遺伝子の病態生理学的関与は、ゲノム位置、遺伝子発現および臨床データの統合および三角測量によって高い解明能力で推測することができ、三角測量は遺伝子発現と腫瘍攻撃性の臨床測定の間の統計学的関係を引き出すことができると仮定した。この目的のために、多段階のデータマイニング戦略を開発し、癌遺伝子としてのＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発見に至った。本発明の方法はこの発見に基づく。
【００２０】
本発明者らのこの発見は、ＲＡＢ１ｌＦＩＰのタンパク質をコードする遺伝子の局在と、癌の確率の増大との関係に関して報告されたデータの説明も示す。例えば、ヒトＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１５６６７５）は、第８染色体上、ｐ１２領域中、位置３７、８３５、６２８〜３７、８７６、１６１に見られる。同様に、マカクザルＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００３２１３）は、第８染色体上、位置３８、３０９、７５２〜３８、３４９、８２４に見られる。イヌＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＣＡＦＧ０００００００６１７６）は、第１６染色体上、位置３０、４５６、３８５〜３０、４８４、４４１に見られる。ニワトリＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００３１２９）は、第２２染色体上、位置２、２５８、７３８〜２、２６７、８３０に見られる。いくつかの分析済みの乳癌において、ヒト染色体領域８ｐ１２が増幅されることが以前に示されている（レテジアー、エーら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６、１〜１３ページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐｄｆ／１４７１−２４０７−６−２４５．ｐｄｆで入
手可能）。第８染色体の短いアームの消失、増大、増幅および再配列も、１組の乳、結腸および膵臓癌細胞系中で見られることが示されている（ポール、ジェイ シー エムら（Ｐｏｌｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２５、５６９３〜５７０６ページ）。外科的切除を施された患者における、ヒト染色体領域８ｐ１２の変化と肺癌の間の相関関係が観察されてきている（キム、ティー−エムら（Ｋｉｍ，Ｔ．−Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１、２３、８２３５〜８２４２ページ）。比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用して、遺伝子の遺伝子座における増幅および欠失が、膵臓および肺癌亜型において起こることも示された（トノン、ジーら（Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０２、２７、９６２５〜９６３０ページ）。同じ遺伝子座におけるコピー数の消失は、複数の患者から得た結腸癌試料においても観察された（ヤギヌマ、ワイら（Ｙａｇｉｎｕｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４、４、３９０〜３９６ページ）。
【００２１】
Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質（ＦＩＰ）タンパク質は、Ｃ末端またはその近辺に位置する相同的Ｒａｂ１１結合ドメインを共有する（例えば、ヘイルズ、シー エムら（Ｈａｌｅｓ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６、４２、３９０６７〜３９０７５ページを参照）。それらのドメイン構造に基づいて、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質は、クラスＩ（ＦＩＰ５／Ｒｉｐ１１、ＦＩＰ１およびＦＩＰ２）およびクラスＩＩ（ＦＩＰ３／エフェリン、およびＦＩＰ４）の２つのサブファミリーに分けられている。したがって、本明細書で使用する用語「Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質」は、Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質のファミリーの任意のメンバー、特にＲａｂ１１ＦＩＰ１、Ｒａｂ１１ＦＩＰ２、Ｒａｂ１１ＦＩＰ３（エフェリン）、Ｒａｂ１１ＦＩＰ４、Ｒａｂ１１ＦＩＰ５（Ｒｉｐ１１）、およびそれらのアイソフォームを指す。
【００２２】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ１タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０５Ａ５８（Ｑ０５Ａ５８＿マウス）、Ｑ８Ｋ０２８（Ｑ８Ｋ０２８＿マウス）、Ｑ６ＷＫＺ４（ＲＦＩＰ１＿ヒト）、Ｑ９Ｄ６２０（ＲＦＩＰ１＿マウス）、Ｑ３Ｂ７Ｔ９（ＲＦＩＰ１＿ラット）、Ｑ６ＫＡＮ５（Ｑ６ＫＡＮ５＿マウス）、Ｑ３０７Ｔ１（Ｑ３０７Ｔ１＿ヒト）、Ｑ２８ＢＬ８（Ｑ２８ＢＬ８＿ＸＥＮＴＲ）、（ニシツメガエル由来）、Ａ４ＩＨＬ６（Ａ４ＩＨＬ６＿ＸＥＮＴＲ）（ニシツメガエル由来）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１５６６７５（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３１４８８（マウス）、ＥＮＳＰＴＲＧ００００００２０１６４（チンパンジー）、ＥＮＳＰＰＹＧ００００００１８５１５（オランウータン）、ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００３２１３（アカゲザル）、ＥＮＳＣＡＦＧ０００００００６１７６（イヌ）、ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００３１２９（ニワトリ）、ＥＮＳＭＯＤＧ００００００１０８１３（ハイイロジネズミオポッサム）、ＥＮＳＭＬＵＧ０００００００７４７２（ホオヒゲコウモリ属）、ＥＮＳＭＩＣＧ００００００１０１７４（ハイイロショウネズミキツネザル）、ＥＮＳＯＣＵＧ０００００００４５０２（ウサギ）、ＥＮＳＣＰＯＧ０００００００８２９８（モルモット）、ＥＮＳＥＴＥＧ０００００００７０４４（マダガスカルモヘアハリネズミ）、ＥＮＳＥＣＡＧ００００００１６１３４（ウマ）、ＥＮＳＯＡＮＧ０００００００３０３０（カモノハシ）、ＥＮＳＯＰＲＧ００００００１０８６０（アメリカナキウサギ）、ＥＮＳＳＴＯＧ０００００００５５６５（ジュウサンセンジリス）、ＥＮＳＤＮＯＧ０００００００８２９９（ココノオビアルマジロ）、ＥＮＳＬＡＦＧ０００００００４２５０（アフリカサバンナゾウ）、ＥＮＳＯＧＡＧ０００００００５７３７（コビトガラゴ）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＤＱ２３６３４２（ヒト）、ＢＣ１２５４００（マウス）、ＢＣ１３２０９４（マウス）、ＢＣ０３４２０１（マウス）、ＢＣ０７７７２０（ヒト）、ＣＸ０７８６０７（アカゲザル）、Ｄ
Ｒ００５３３９（ヒト）、ＢＣ１３５５８０（ニシツメガエル）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ３４２０１（マウス）、ＡＡＩ２５４０１（マウス）、ＡＡＩ３２０９５（マウス）、ＡＢＢ４３１６１（ヒト）、ＡＡＨ７７７２０（ヒト）、ＥＡＷ６３３４９（ヒト）、ＥＡＷ６３３４７（ヒト）、ＥＡＷ６３３４８（ヒト）、ＡＡＩ３５５８１（ニシツメガエル）およびＣＡＪ８１４５９（ニシツメガエル）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２３】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ２タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＨＺＩ０（Ｑ５ＨＺＩ０＿マウス）、Ｑ７Ｌ８０４（ＲＦＩＰ２＿ヒト）、Ｑ３Ｕ３６６（Ｑ３Ｕ３６６＿マウス）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＭＵＳＧ００００００４００２２（マウス）、ＥＮＳＧ０００００１０７５６０（ヒト）、ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００９３０４（ニワトリ）、ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００２９８２（チンパンジー）、ＥＮＳＭＯＤＧ０００００００９３８５（ハイイロジネズミオポッサム）、ＥＮＳＸＥＴＧ０００００００９５４１（ニシツメガエル）、ＥＮＳＭＭＵＧ００００００２１８０５（アカゲザル）、ＥＮＳＣＡＦＧ００００００１１９９１（イヌ）、ＥＮＳＰＰＹＧ０００００００２６９２（オランウータン）、ＥＮＳＥＥＵＧ０００００００６６５１（ナミハリネズミ）、ＥＮＳＭＬＵＧ００００００１５２００（ホオヒゲコウモリ属）、ＥＮＳＭＩＣＧ０００００００１９７６（ハイイロショウネズミキツネザル）、ＥＮＳＯＣＵＧ０００００００９２４１（ウサギ）、ＥＮＳＣＰＯＧ００００００００４５３（モルモット）、ＥＮＳＥＴＥＧ００００００１９２９４（マダガスカルモヘアハリネズミ）、ＥＮＳＥＣＡＧ００００００１９７９１（ウマ）、ＥＮＳＳＡＲＧ０００００００１７９４（ヨーロッパトガリネズミ）、ＩＧＩ０００１４３７６（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）、ＩＧＩ０００３１１４５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）およびＩＧＩ０２６９９３０８（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ウシ）の遺伝子、および例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＢＣ０８９０１０（マウス）、ＢＣ０７５０７３（ヒト）、ＢＣ０７５０７４（ヒト）およびＤＮ９９４２５４（ヒト）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ８９０１０（マウス）、ＥＡＷ４９４２３（ヒト）、ＡＡＨ７５０７３（ヒト）およびＡＡＨ７５０７４（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２４】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ３タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ７５１５４（ＲＦＩＰ３＿ヒト）、Ｑ８ＪＺＴ３（Ｑ８ＪＺＴ３＿マウス）、Ａ２ＩＤＥ０（Ａ２ＩＤＥ０＿ヒト）、Ａ２Ａ２Ｇ１（Ａ２Ａ２Ｇ１＿ヒト）、Ａ２ＩＤＤ９（Ａ２ＩＤＤ９＿ヒト）、Ａ２Ａ２Ｇ０（Ａ２Ａ２Ｇ０＿ヒト）、およびＱ８ＣＨＤ８（Ｑ８ＣＨＤ８＿マウス）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＧ００００００９０５６５（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３７０９８（マウス）、ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００７５４３（チンパンジー）、ＥＮＳＭＭＵＧ００００００００６１３、ＩＧＩ０００１０３３２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）およびＩＧＩ０００８７０９２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ニワトリ）、ＩＧＩ０００２６４７２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＬ０４９５４２（ヒト）、Ｚ９８８８２（ヒト）、ＢＣ０２３３６４（マウス）、ＢＣ０３７１３２（マウス）、ＢＣ０５１３６０（ヒト）、およびＡＬ０２３８８１（ヒト）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ２３３６４（マウス）、ＡＡＨ３７１３２（マウス）、ＣＡＩ９５７８８（マウス）、ＣＡＩ９５５９１（ヒト）、ＣＡＩ９５５９３（ヒト）、ＣＡＭ２６３８２（ヒト）、ＣＡＭ２６３８３（ヒト）、ＣＡＱ０９６４３（ヒト）、ＣＡＱ１１００３（ヒト）、ＣＡＭ２８３７４（ヒト）、ＡＡＨ５１３６０（ヒト）、ＥＡＷ８５８０５（ヒト）、ＥＡＷ８５８０６（ヒト）、ＥＡＷ８５８０７（ヒト）、ＥＡＷ８５８０８（ヒト）、ＥＡＷ８５８０９（ヒト）、およびＥＡＷ８５８１０（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２５】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ４タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＤＧＩ２（Ｑ６ＤＧＩ２＿ＢＲＡＲＥ）、Ｑ８６ＹＳ３（ＲＦＩＰ４＿ヒト）、Ｑ８ＢＱＰ８（ＲＦＩＰ４＿マウス）、Ｑ５ＳＹＨ４（Ｑ５ＳＹＨ４＿マウス）、Ｑ３ＬＧＤ４（Ｑ３ＬＧＤ４＿ＢＲＡＲＥ）、Ｑ３Ｕ４Ｒ６（Ｑ３Ｕ４Ｒ６＿マウス）およびＱ３ＬＧＤ３（Ｑ３ＬＧＤ３＿ＢＲＡＲＥ）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＤＡＲＧ００００００５３８５５（ゼブラフィッシュ）、ＥＮＳＧ０００００１３１２４２（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００１７６３９（マウス）、ＥＮＳＭＯＤＧ００００００１９２０９（ハイイロジネズミオポッサム）、ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００８９７４（チンパンジー）、ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００８１２７（アカゲザル）、ＥＮＳＯＣＵＧ０００００００７４４３（ウサギ）、ＥＮＳＭＬＵＧ００００００１６４０７（ホオヒゲコウモリ属）、ＥＮＳＣＰＯＧ００００００１１６３４（モルモット）、ＩＧＩ０００１３０２５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）、ＩＧＩ０００２９７５０（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）、ＩＧＩ０２６９３０３５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ゼブラフィッシュ）およびＩＧＩ０００５１４１０（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ゼブラフィッシュ）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＢＣ０７６３６３（ゼブラフィッシュ）、ＢＣ０９３９１４（ヒト）、ＢＣ１０１５１７（ヒト）、ＡＬ５９１１７４（マウス）、ＢＣ１３５９８９（ニシツメガエル）およびＤＲ０００７０１（ヒト）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ７６３６３（ゼブラフィッシュ）、ＡＡＩ３５９９０（ニシツメガエル）、ＣＡＩ２４８３３（マウス）、ＣＡＩ２４８３６（マウス）、ＥＡＷ８０２６５（ヒト）、ＡＡＩ０１５１８（ヒト）およびＡＡＨ９３９１４（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２６】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ５タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＺＱ３３（Ｑ６ＺＱ３３＿マウス）、Ｑ９ＢＸＦ６（ＲＦＩＰ５＿ヒト）、Ｑ８Ｒ３６１（ＲＦＩＰ５＿マウス）およびＱ３ＵＭ８５＿マウスの、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３５６３１（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００５１３４３（マウス）、ＥＮＳＧＡＬＧ００００００１６０９２（ニワトリ）、ＥＮＳＢＴＡＧ０００００００６１６２（ウシ）、ＥＮＳＸＥＴＧ００００００１１７８１（ニシツメガエル）、ＥＮＳＯＣＵＧ００００００００８４０（ウサギ）、ＮＳＰＴＲＧ００００００１２０５７（チンパンジー）、ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００２３０１（アカゲザル）、ＥＮＳＯＧＡＧ０００００００９１５０（コビトガラゴ）、ＥＮＳＥＣＡＧ０００００００７０８４（ウマ）、ＩＧＩ０００３５６４２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）およびＩＧＩ００００６０７５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＤＱ８９０９９１（ヒトクローンの合成構築体）、ＤＱ８９４１６８（ヒトクローンの合成構築体）、ＢＣ０３５０１３（ヒト）、ＢＣ０２６４７３（マウス）、ＢＣ０４４８３３（マウス）、ＢＣ０５１０６３（マウス）、ＤＲ７７０９４２（ベンガルザル）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ２６４７３（マウス）、ＡＡＨ４４８３３（マウス）、ＡＡＨ５１０６３（マウス）、ＡＢＭ８１９１７（合成構築体）、ＡＢＭ８５０９４（合成構築体）、ＡＡＨ３５０１３（ヒト）、ＥＡＷ９９７５０（ヒト）、ＥＡＷ９９７４９（ヒト）およびＥＡＷ９９７５１（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２７】
Ｒａｂファミリーの低分子ＧＴＰアーゼタンパク質は、細胞内膜輸送、シグナル変換、受容体リサイクリングおよびエフェクタータンパク質の細胞膜への動員を含めた、細胞活性の制御において重要な役割を有することが知られている。したがって同様の役割が、Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質などのＲａｂファミリー相互作用タンパク質によるものと考えられている。Ｒａｂ１１−ＦＩＰ３は例えば、エンドソーム循環区画の機能
において重要な役割を果たすことが示されている（例えば、ホーガン、シー ピーら（Ｈｏｒｇａｎ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００７）、Ｔｒａｆｆｉｃ、８、４１４〜４３０ページを参照）。
【００２８】
Ｒａｂタンパク質は、細胞骨格編成および細胞形態、細胞質分裂、小胞輸送および分泌、細胞周期進行および細胞分化を含めた広範囲の基本的細胞機能を制御する、Ｒａｓ関連低分子Ｇタンパク質（Ｒｈｏ関連タンパク質を含む）のさらに大きなファミリーに属する。いくつかのこれらのタンパク質ならびにそれらのレギュレーターおよびエフェクターは、発癌現象および癌の進行に関与している。これらのうち、乳癌および卵巣癌において頻繁に増幅されるＲＡＢ２５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖およびアポトーシス耐性を高め、かつｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍形成を高めることが示されている。ＲＡＢファミリーのタンパク質は膜輸送およびオルガネラ区画化において中心的役割を果たし、ＲＡＢ１１、ＲＣＰの主な結合パートナーは、膜タンパク質のリサイクリングに特に関係している。ＲＡＢ１１は細胞移動に関与しており、ＲＡＢ１１経路の混乱は異なる細胞型において移動を害する（ジョーンズ、エム シーら（Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８、５４９〜５５７ページ；ポウェルカ、エー エムら（Ｐｏｗｅｌｋａ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｔｒａｆｆｉｃ ５、２０〜３６ページ；ユーン、エス オーら（Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、２７６１〜２７６９ページ）。さらに、ＲＡＢ１１機能の拮抗的阻害は乳癌細胞の低酸素誘導侵襲性を低下させ（ユーンら（Ｙｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）、インテグリンα６β４、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＲ２およびＰＫＣαなどの侵襲と関係がある膜受容体の輸送を変える（ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．）、２００６、上記）。ＲＡＢ遺伝子発現の異常調節は多くのヒト腫瘍の一般的要素として関与する。しかしながら、腫瘍進行中のＲａｂ相互作用タンパク質の役割は研究されていない。
【００２９】
本発明者らは、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の発現と関係がある広範囲の癌促進効果を確認している。非癌性乳房上皮細胞では、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の過剰発現は、悪性形質転換、ならびに増大した細胞死亡率および移動をもたらした。乳癌細胞系では、ＲＮＡ阻害による内因性Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の弱化は、増殖、足場非依存性増殖、侵襲およびアポトーシス耐性を低減し、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を低下させた。生理学上、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１は主にＲａｂ１１と相互作用して、管状エンドソームにおけるタンパク質の選別を制御すると考えられる（ピーデン、エー エーら（Ｐｅｄｅｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １５、３５３０〜３５４１ページ）。Ｒａｂ１１−Ｒａｂ１１ＦＩＰ１複合体は、トランスフェリン受容体をリソソーム（分解経路）からリサイクリングエンドソーム（リサイクリング経路）にチャンネル移動させ、それによって膜結合受容体のレベルの相対的増大を促進することが示されている（ピーデンら（Ｐｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。推測的ではあるが、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の形質転換効果はリサイクリング経路へのこの移動によって仲介され、癌遺伝子的役割を有するインテグリンまたは増殖因子受容体などの、特定の膜タンパク質の膜局在（したがって機能）を延長する可能性があることは妥当である。本発明者らが観察したＲａｂ１１ＦＩＰ１の発現とＥＲＫのリン酸化の間の強い相関関係はこの可能性を反映し得る。というのは、それは、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１（以下ではＲＣＰとも名付ける）と増殖因子受容体仲介ＭＡＰＫ活性化の間の特異的関係を示し得るからである。
【００３０】
理論によって縛られるわけではないが、本発明者らによって得られた免疫沈降データ（示さず）は、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１と低分子ＧＴＰアーゼＲａｓの間に直接的相互作用が存在することを示し、この２つのタンパク質間の複合体の形成を示す。Ｒａｓタンパク質は、アポトーシス、細胞増殖、および癌におけるそれらの中心的役割が当該技術分野で知られている低分子モノマータンパク質のファミリーである。少なくとも１１個の異なる機能
クラスのタンパク質が、Ｒａｓタンパク質のエフェクターであることが示されている。したがって、Ｒａｓタンパク質は複合体シグナル相互作用ネットワークの中心に位置し、その中でＲａｓタンパク質は、少なくとも３つの重複および共同タンパク質キナーゼカスケード、すなわちＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ、ＲａｌＧＴＰアーゼ、およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを活性化すると考えられる。１つのランダムに選択したさらなる例示例として、それらはＲｂ／Ｅ２ＦおよびＤｎｍｔ−１を介して作用し、それによって腫瘍細胞増殖を活性化するｐ１６の不活性化などのメチル化による後成的変化を引き起こす。次いでｒａｓタンパク質は複雑な制御機構に曝される。点突然変異したＲａｓ遺伝子は様々な腫瘍の３分の１で頻繁に発見され、Ｒａｓ遺伝子は癌遺伝子であることが知られている。
【００３１】
本発明によるいくつかの方法は、腫瘍発生を制御する方法である。これらの方法は、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる個々の方法を含む。腫瘍発生は例えば、悪性型の癌腫の形成を含めた発癌現象であってよい。したがって、例えば、本発明の方法は、癌などの増殖性疾患または障害の治療または予防に含まれ得る。
【００３２】
本発明の方法を使用して、例えば哺乳動物、魚類、両生類、鳥類または微生物を含めた任意の生物において、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることができる。いくつかの実施形態では、それぞれの微生物は細胞である。このような細胞は、直接採取またはそこからの単離を含めて、哺乳動物などの例えば前述の例の１つなどの生物から得ることができる。適切な哺乳動物の例には、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、オポッサム、イヌ、ネコ、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、オランウータン、ウシ（メウシ）、マーモセット、アメリカナキウサギ、ガラゴ（「コビトガラゴ」）、リス、ココノオビアルマジロ、ゾウおよびヒトがあるが、これらだけには限られない。細胞は、従来の細胞系、例えば癌細胞系の細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞を培養する。他の実施形態では、それぞれの細胞は、例えば前述の例の１つなどの生物の一部分に含まれ得る。
【００３３】
本発明による方法のいくつかの実施形態は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の量を調節することを含む。Ｒａｂ結合の量の調節は、細胞中、試験管などのｉｎ ｖｉｔｒｏ設定中、または生物中に存在するＲａｂ結合タンパク質分子の全数の一部分を分解状態にすることを含むことができる。Ｒａｂ結合タンパク質の分解は、例えば（カルシウム活性化プロテアーゼまたはカルパインとも呼ばれる）カルパインプロテアーゼなどのプロテアーゼによって実施することができる。例示例として、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１は、カルパインの標的として働きｉｎ ｖｉｖｏでカルパインによって切断される、３つのＰＥＳＴ（Ｐｒｏ、ＧｌｙおよびＳｅｒ／Ｔｈｒ多量）モチーフを含むことが開示されている（ニコラス、エムら（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８９、２２３〜２３１ページ）。Ｒａｂ結合タンパク質の量の調節は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現を調節することも含むことができる。これは例えば、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現を調節する化合物を投与することによって実施することができる。Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現は、増大させてもよいし低減させてもよい。例示例として、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現は、非コード核酸分子などの核酸分子によって低減することが可能である。
【００３４】
本明細書で使用する用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖またはそれらの組合せなどの、任意の考えられる形状の任意の核酸を指す。核酸は、例えばＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体の使用または核酸化学の使用によって作製したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびＰＮＡ（タンパク質核酸）を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡはゲノム起源または合成起源であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。本発明の方法では、典型的には、ただし必ずではないが、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を使用する。このような核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮ
Ａ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであってよい。それぞれの核酸は非天然ヌクレオチド類似体をさらに含むことができ、および／または親和性タグまたは標識と連結することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子を単離、濃縮、または精製することができる。核酸分子は、例えばｃＤＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離することができる。天然源は、ヒト、血液、精液、または組織などの哺乳動物由来であってよい。核酸は、例えばトリエステル法によって、または自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって合成することもできる。
【００３５】
多くのヌクレオチド類似体が知られており、本発明の方法中で使用する核酸およびオリゴヌクレオチドにおいて、それらを使用することができる。ヌクレオチド類似体は、例えば塩基、糖、またはホスフェート部分に修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分における修飾には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、異なるプリンまたはピリミジン塩基、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イルなど、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基の天然および合成修飾がある。他のヌクレオチド類似体は共通塩基として働く。共通塩基には３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールがある。共通塩基は、任意の他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基の修飾は、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖の修飾と頻繁に組合せて、例えば二本鎖安定性の増大などの特有の性質を得ることができる。
【００３６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、核酸分子は、例えばアプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（ＷＯ０１／９２６５５中に記載）などの非コード核酸分子である。非コード核酸分子はｎｃ−ＲＮＡ分子であってもよい（例えば、天然ｎｃ−ＲＮＡ分子の導入に関するコスタ、エフエフ（Ｃｏｓｔａ，ＦＦ）、Ｇｅｎｅ（２００５）、３５７、８３〜９４ページを参照）。ｎｃ−ＲＮＡ分子の例には、アンチセンスＲＮＡ分子、Ｌ−ＲＮＡＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）、サイレンサーＲＮＡ分子（二本鎖ニューロン限定サイレンサーエレメントなど）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉタンパク質と相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）（簡単な概説に関しては、例えばリン、エイチ（Ｌｉｎ，Ｈ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６、３９７を参照）があるが、これらだけには限られない。適切なｓｈＲＮＡの例示例は、以下の実施例中に配列番号３および配列番号４として示す。
【００３７】
低分子干渉ＲＮＡの使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するためのツールとなっている。それは、転写後レベルで起こりｍＲＮＡ分解を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制を利用する。ＲＮＡ干渉はゲノムを保護する細胞機構となる。ｓｉＲＮＡ分子は、いわゆるＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成するためのｓｉＲＮＡと複合酵素複合体の結合によって、それらの相補的ＲＮＡの分解を仲介する。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣの一部分となり、相補的ＲＮＡ種を標的化し、それは次いで切断される。これはそれぞれの遺伝子の発現の消失をもたらす（簡単な概説に関しては、（ザモア、ピーディーおよびハーレー、ビー（Ｚａｍｏｒｅ，ＰＤ，＆ Ｈａｌｅｙ，Ｂ）（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９、１５１９〜１５２４ページを参照）。この技法は例えば、米国特許出願２００５／０１９１６１８中に開示されたＨＩＶ ＲＮＡの切断などの、寄生虫ＤＮＡ配列のサイレンシングに施されている。
【００３８】
本発明のこのようなｓｉＲＮＡの典型的実施形態は、１０〜３５ヌクレオチド、いくつかの実施形態では１５〜２５ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ合成分子を含む。それぞれのｓｉＲＮＡ分子は、（微生物および動物の一部分である細胞を含めた）対象の細胞内で直接合成することができる。ｓｉＲＮＡ分子をそれぞれの細胞に導
入する、および／またはそれぞれの細胞に送達することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏでの選択細胞へのｓｉＲＮＡ分子の送達の例示例は、重鎖抗体断片（Ｆａｂ）と核酸結合タンパク質プロタミンの融合タンパク質との、その非共有結合である（ソング、イーら（Ｓｏｎｇ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、（２００５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３、６、７０９〜７１７ページ）。本発明の１実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、Ｒａｂ結合タンパク質の（例えばｉｎ ｖｉｖｏ）合成と関係がある１つまたは複数の転写因子をコードするｍＲＮＡ分子の分解を誘導する。
【００３９】
本発明による本発明の方法のいくつかの実施形態は、Ｒａｂ結合タンパク質、例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性を調節することを含む。Ｒａｂ結合タンパク質の活性の調節は、Ｒａｂ結合タンパク質と化合物の間の複合体を形成することを含むことができる。これは例えば、Ｒａｂ結合タンパク質の活性を調節する化合物を投与することによって実施することができる。Ｒａｂ結合タンパク質（例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質）の活性は増大または低減することができる。
【００４０】
それぞれの化合物は任意の適切な手段によって投与することができる。宿主生物が哺乳動物である場合、化合物は例えば経口または非経口（経腸）投与することができる。哺乳動物への投与の典型的実施形態では、例えば化合物の調製物の経口、静脈内投与によって、または吸入によって、その施用は血液および肝臓への送達を確実にする。経口施用のための調製物の例は、錠剤、ピルまたは飲料溶液であり、静脈内投与のための調製物の例は注射または輸液であり、吸入による投与のための調製物の例はエアロゾル混合物またはスプレーである。宿主生物が組換え微生物である場合、投与の例は、微生物の環境への化合物の注射または添加である。微生物が単細胞である場合、微生物を改変する技法と組合せて、後者の形の投与をおそらく実施することができる。このような技法は、細胞膜のエレクトロポレーションまたは透過処理を含むことができる。
【００４１】
Ｒａｂ結合タンパク質、例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性の調節は、Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾のパターンの改変を含めた、Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾の改変を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾の改変は、Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾のパターンを改変する化合物の使用を含む。それぞれの翻訳後修飾の例示例は、リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、およびユビキチン化である。それぞれの翻訳後修飾、例えばリン酸化の結果として、Ｒａｂ結合タンパク質の活性が変わる。例示例として、Ｒａｂ１１−ＦＩＰ２機能はセリン２２７におけるリン酸化によって制御されることが示されている（デゥチャルメ、エヌ エーら（Ｄｕｃｈａｒｍｅ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２００６）７、８、３６２５〜３６３７ページ）。キナーゼＭＡＲＫ２／ＥＭＫ１／Ｐａｒ−１Ｂ（ＭＡＲＫ２）によってリン酸化されると、Ｒａｂ１１−ＦＩＰ２は上皮細胞の極性を確立する際に働く（上記）。
【００４２】
Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の活性、発現、量または細胞内局在を調節する化合物は、任意の化合物であってよい。例には、核酸（上記参照）、ペプチド、ペプトイド、無機分子および小有機分子があるが、これらだけには限られない。ペプトイドは、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、クウォン、ワイ ユーおよびコダデック、（２００７）ティー（Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，（２００７）Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９、１５０８〜１５０９ページ参照）。ペプチドは合成起源であってよく、または当該技術分野でよく知られている方法によって天然源から単離することができる。天然源はヒトなどの哺乳動物、血液、精液、または組織であってよい。ポリペプチドを含めたペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。ポリペプチドの例示例は、抗体、抗
体断片、および抗体様機能を有するタンパク質結合分子である。（組換え）抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディまたはドメイン抗体である（ホルト、エル ジェイら（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１、１１、４８４〜４９０ページ）。抗体様機能を有するタンパク質結合分子の１例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（ＷＯ０３／０２９４６２、ベステら（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、１８９８〜１９０３ページ）。ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄまたはグリコデリンなどのリポカリンは、それらがハプテンとして知られる選択した小さなタンパク質領域と結合するように修飾することができる天然リガンド結合部位を有する。他のタンパク質結合分子の例は、いわゆるグルボディ（ＷＯ９６／２３８７９参照）、アンキリン骨格（モザビ、エル ケイら（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３、６、１４３５〜１４４８ページ）または結晶骨格（ＷＯ０１／０４１４４）に基づくタンパク質、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）、（２０００）Ｊ．Ｍａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３、１６７〜１８７ページ中に記載されたタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン、およびアビマーである。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体において一連の多数のドメインとして存在する、いわゆるＡ−ドメインを含む（シルバーマン、ジェイら（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５５６〜１５６１ページ）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的との免疫グロブリン様結合用に工学処理することができる３個のループを含む（ギル、ディー エスおよびダムレ、エヌ ケイ（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．）、（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７、６５３〜６５８ページ）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、Ｃ型レクチンドメイン中に所望の結合用に工学処理することができるループ領域を同様に含む（上記）。タンパク質リガンドとして作用することができるペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素と結合している点でペプチドと異なる、オリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは典型的にはプロテアーゼおよび他の修飾酵素に耐性があり、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、クウォン、ワイ ユーおよびコダデック、（２００７）ティー（Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，（２００７）Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９、１５０８〜１５０９ページ参照）。所望の場合、任意のまたは特定の形、クラスなどの標的物質に対するそれぞれの部分の親和性をさらに増大させる修飾作用物質を使用してもよい。
【００４３】
それぞれの化合物は、（Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質などの）Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾を改変することもできる。化合物は、例えば、Ｒａｂ結合タンパク質を含めた細胞要素のリン酸化状態を変えることができる。それぞれの化合物は、Ｒａｂ結合タンパク質と異なるタンパク質を含めた細胞内タンパク質の、リン酸化の程度の調節物質であってもよい。このようなタンパク質は、したがってＲａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾を改変することができる。それぞれの化合物の例示例はチロシンキナーゼ阻害剤である。チロホスチン、キナゾリン、キノキサリン、キノリン、２−フェニルアミノピリミジン、フラボノイド、ベンゾキノイド、アミノサリチル酸またはスチルベン（これらは例えばＷＯ９６１８７３８、ＷＯ０３０３５６２１およびその中に引用された参照文献中に記載されており、例えばそれらの実験による同定の例に関しては、例えば米国特許第６，７４０，６６５号を参照）などの多数のチロシンキナーゼ阻害剤が市販されている。チロホスチンの例は、ＡＧ２１３、ＡＧ４９０、ＡＧ８７９、ＡＧ１２９５、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５１７、ＡＧＬ２０４３、チロホスチン４６およびメチル２，５−ジヒドロキシケイ皮酸である。キナゾリンは、例えばＰＤ１５３０３５、ＰＤ１５６２７３、ゲフィチニブまたはラパチニブであり、キノキサリンは、例えばＰＤ１５３０３５またはＺＤ１８３９である
。キノリンの１例は５−メチル−５Ｈ−インドール［２，３−β］キノリンであり、２−フェニルアミノピリミジンの１例はイマチニブであり、フラボノイドの例はゲニステインまたはクエルセチンであり、ベンゾキノイドの１例はハービマイシンＡであり、アミノサリチル酸の１例はラベンドウスチンＡであり、スチルベンの１例はピセアタノールである。他の適切な化合物は、チロホスチンエルブスタチンなどの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＷＨＩ−Ｐ９７またはチロホスチンＡＧ５９２などのＥＧＦＲ特異的受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アウリントリカルボン酸などのチロシンリン酸化刺激剤、または過バナジン酸ナトリウムまたはイソキサゾールカルボン酸などのチロシンホスファターゼ阻害剤を含むことができる。
【００４４】
タンパク質キナーゼの機能を阻害することが報告されている化合物のさらなる例には、ビス単環式、二環式または複素環式アリール化合物（国際特許出願ＷＯ９２／２０６４２）ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴＷＯ９４／１４８０８）、１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン（米国特許第５，３３０，９９２号）、スチリル化合物（米国特許第５，２１７，９９９号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第５，３０２，６０６号）、特定のキナゾリン誘導体（欧州特許出願Ｎｏ．０５６６２６６Ａ１）、セレオインドールおよびセレニド（国際特許出願ＷＯ９４／０３４２７）、三環式多価化合物（国際特許出願ＷＯ９２／２１６６０）、およびベンジル−ホスホン酸化合物（国際特許出願ＷＯ９１／１５４９５）があるが、これらだけには限られない。調節物質として使用することができるさらに他の化合物には、１９９６年８月２３日に出願された米国特許出願第０８／７０２，２３２号中に記載されたオキシンドリノン（ｏｘｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ）などのオキシンドリノンがある。
【００４５】
Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾を調節する化合物のさらなる例は、タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの制御を誘導することができる細胞表面分子に対するアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００４６】
Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の活性を調節する化合物の他の例は、例えばビタミンＤ３またはビタミンＤ４などのビタミンＤのメンバーである。ビタミンＤ３（コレカルシフェロール、カルシオールまたはアラキトールとも呼ばれ、ＩＵＰＡＣ名（１Ｓ，３Ｚ）−３−［（２Ｅ）−２−［（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ）−１−［（１Ｒ）−１，５−ジメチルヘキシル］オクタヒドロ−７ａ−メチル−４Ｈ−インデン−４−イリデン］エチリデン］−４−メチレン−シクロヘキサノール、（３β、５Ｚ、７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３−オールとも名付けられる）は、その活性形で、乳癌を含めた様々な起源の悪性細胞において、増殖停止、分化、および細胞死を誘導する能力を有する。この観察結果が、考えられる抗癌剤としてのビタミンＤ類似体の開発をもたらしている（例えば、バウデット、シーら（Ｂａｕｄｅｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．）（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１００、３〜１０ページ；ヒジー、ティー、およびウー、ジェイ エム（Ｈｓｉｅｈ，Ｔ．，＆ Ｗｕ，Ｊ．Ｍ．）、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３５、５３９〜５４４ページ；ジェームス、エス ワイら（Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２、１４３〜１５４ページ；マティアセン、アイ エスら（Ｍａｔｈｉａｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９、４８４８〜４８５６ページを参照）。化合物ＥＢ１０８９は１つのこのような類似体であり、現在癌の治療に関する第３相臨床試験中である（例えば、マティアセン、アイ エスら（Ｍａｔｈｉａｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９３）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６、３６５〜３７１ページ；コルストン、ケイ ダブリュら（Ｃｏｌｓｔｏｎ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４、２２７３〜２２８０ページ；ハンセン、シー エムら（Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２０００）Ｃｕ
ｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．６、８０３〜８２８ページを参照）。ビタミンＤ化合物の抗癌活性は細胞内遊離カルシウム（［Ｃａ２＋］）に対するその影響と直接関係がある。ビタミンＤ化合物で処理した細胞中の遊離Ｃａ２＋の上昇は、乳癌細胞におけるアポトーシスの誘導と相関関係があり（サージーブ、アイ エヌら（Ｓｅｒｇｅｅｖ，Ｉ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．）、（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ中（ノーマン、エー ダブリュ、ボイロン、アール、およびトーマセット、エム（Ｎｏｒｍａｎ，Ａ．Ｗ．，Ｂｏｕｉｌｌｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓｓｅｔ，Ｍ．）編）、３９９〜４０２ページ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ、ＣＡ；バンデバーレ、ビーら（Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１、８０６〜８１１２ページ；サージーブ、アイ エヌおよびローテン、ダブリュ ビー（Ｓｅｒｇｅｅｖ，Ｉ．Ｎ．，＆ Ｒｈｏｔｅｎ，Ｗ．Ｂ．）（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ９、３２１〜３２７ページ）、カルパインとしても知られるカルシウム依存性システインプロテアーゼの活性化における主な機構であることが示されている（ナカガワ、ティーおよびユーアン、ジェイ（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．，＆ Ｙｕａｎ，Ｊ．）、（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０、８８７〜８９４ページ；レイ、エス ケイら（Ｒａｙ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５２、３２６〜３３４ページ；イシハラ、アイら（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２７９、９７〜１００ページ）。
【００４７】
理論によって縛られることを望まないが、乳癌細胞における試験からの最近の証拠は、カルパインがビタミンＤ３およびＥＢ１０８９によって誘導されるアポトーシス死における主な実行プロテアーゼであり得ることを示唆している（マティアセン、アイ エスら（Ｍａｔｈｉａｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７７、３０７３８〜３０７４５ページ）。カルパインのプロテアーゼ（タンパク質分解）機能は、カルパインのタンパク質標的のペプチド配列中に存在するＰＥＳＴ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒ／Ｔｈｒ多量）アミノ酸モチーフに依存してる（ダイス、ジェイ エフ（Ｄｉｃｅ，Ｊ．Ｆ．）（１９８７）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１，３４９〜３５７ページ；トンパ、ピーら（Ｔｏｍｐａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２０７７５〜２０７８５ページ；レヒシュタイナー、エム、およびロジャース、エス ダブリュ（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．，＆ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｗ）（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１、２６７〜２７１ページ；シャムウェイ、エス ディーら（Ｓｈｕｍｗａｙ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３０８７４〜３０８８１ページ；フクダ、エムおよびイトー、ティー（Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，＆ Ｉｔｏｈ，Ｔ）（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２２３１４〜２２３２１ページ）。ＲＡＢ１１ＦＩＰ１は、例えばＣ２ドメインとＲＢＤ（Ｒａｂ結合ドメイン）の間に位置する３個のこのようなＰＥＳＴモチーフを含む。近年の試験において、マリーら（Ｍａｒｉｅ，ｅｔ．ａｌ．）は、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１中のＰＥＳＴモチーフは、カルパインによる制御型分解に関してそれを標的化するかどうか決定しようと努めた（マリー、エヌら（Ｍａｒｉｅ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．）（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８９、２２３〜２３１ページ）。マリーらは、高濃度のカルシウムを用いた細胞の処理はＲＡＢ１１ＦＩＰ１の分解を誘導し、この分解は特異的カルパイン阻害剤を加えることにより無効にすることができることを観察した。さらに、このカルシウム制御型分解におけるＰＥＳＴ配列の関与は、その中のＰＥＳＴ配列を除去したＲＡＢ１１ＦＩＰ１突然変異体を使用して立証した。したがってマリーらは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１のＰＥＳＴ配列は、おそらく細胞中の生理的代謝回転の機構として、カルパイン仲介型分解に関してタンパク質を標的化すると結論付けた。例えばＲＡＢ１１ＦＩＰ１がカルパイン作用に感受性である活性ＰＥＳＴドメインを含み、カルパインがビタミンＤ３およびＥＢ１０８９などのその化学療法剤類似体によってタンパク質分解活性
に関して活性化されることを考慮して、本発明の方法は、ビタミンＤ３およびＥＢ１０８９を含めたその関連類似体に基づく化学療法レジメン、および細胞内遊離カルシウムレベルを上昇させるため、またはカルパインを活性化するために生化学的に作用する任意の他の治療レジメンに関して患者を選択するためのバイオマーカーとして、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを使用することを可能にする。
【００４８】
前に記したように、細胞における腫瘍発生を制御する方法、例えば細胞における腫瘍発生を予防、停止または逆行させる方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質のレベル、発現および／または活性を分析する。細胞は、（例えば単離した）個々の細胞、癌組織を有し得る生物の細胞、癌組織を含む組織の細胞、または細胞培養物の細胞であってよい。癌細胞は、例えば神経、グリア、肺、肝臓、脳、乳房、膀胱、血液、白血病、結腸、子宮内膜、胃、皮膚、卵巣、脂肪、骨、頸部、食道、膵臓、前立腺、腎臓、または甲状腺細胞であってよい。いくつかの態様では、癌は、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮細胞癌、グリオーマ、グリア芽腫、胃癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、白血病、脂肪腫、メラノーマ、マントル細胞リンパ腫、粘液線維肉腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、前立腺癌、頭部または頸部の扁平細胞癌、甲状腺癌および尿路上皮癌を含むが、これらだけには限られない。
【００４９】
細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化または活性の変化は、ほぼ平均レベルまたは一般に見られるレベルに対応するレベルに調整することができる。細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化は、プロテアーゼの活性または発現の調節によって実施することができる。いくつかの実施形態では、このようなプロテアーゼはカルシウム依存性プロテアーゼ（カルパイン）、例えばカルパインＩまたはＩＩである。いくつかの実施形態では、カルパインプロテアーゼの活性および／または発現を、細胞内カルシウムレベル、例えば遊離細胞内カルシウムの変化によって調節する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、カルパインプロテアーゼの活性および／または発現を、それらの施用を含めた、ビタミンＤファミリーのメンバー、このようなビタミンＤファミリーのメンバーのプロドラッグまたはこのようなビタミンＤファミリーのメンバーの類似体の使用によって調節、例えば活性化する。それぞれのビタミンＤ、その類似体またはプロドラッグは、例えばそれぞれの細胞と接触させることが可能であり、またはそれぞれの対象を含めた、それぞれの生物に投与することができる。プロテアーゼの活性および／または発現は、シグナル伝達カスケードによって次いで調節されるプロテアーゼ調節物質などの、他の因子によって調節することもできる。多数のプロテアーゼが、それらの活性とそれらの発現の両方の点で制御を受けることは知られている（例えば、トゥルク、ビー（Ｔｕｒｋ，Ｂ．）、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、５、９、７８５〜７９９ページ参照）。アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１またはメタロプロテイナーゼの組織阻害剤は例示例として役立つ可能性がある。
【００５１】
ビタミンＤファミリーのメンバーまたはビタミンＤファミリーのメンバーの類似体の「プロドラッグ」は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば段階的または急速に）転換されて、酵素作用または一般的な酸または塩基加溶媒分解のいずれかによる、例えば血液中での加水分解または酸化による代謝を含めた、例えば宿主中での代謝によって親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体化合物を生成し、活性成分を形成する化合物であることは理解されている。典型的にはプロドラッグは、ｉｎ ｖｉｖｏで使用すると化学的または生理的工程によって元の化合物を放出する、親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体の誘導体である。プロドラッグは例えば、生理的ｐＨに達すると、（１つまたは複数の）自発性化学反応、（１つまたは複数の）酵素触媒化学反応、光分解、および／または（１つまたは複数の）代謝化学反応によって、親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体に変換され得る。一般的な例は、カルボン酸部
分を有する活性形を有するエステルおよびアミド形の化合物だけには限られないが、これらを含めた、親化合物の官能基部分に生物学的に不安定な保護基を有する化合物である。さらなる例には、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、エステル化、脱エステル化、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化、光分解、加水分解することが可能な化合物の部分、またはプロドラッグにおける化学結合の形成または破壊に関する他の官能基の変化または変換がある。それぞれのプロドラッグは、その治療活性または利用可能形にｉｎ ｖｉｖｏで変換されるまで、完全に活性状態または生理的に利用可能でないプロドラッグでよい。「プロドラッグ」は、それぞれの薬剤分子（この場合、親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体）と担体部分の間の共有結合または非共有結合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは生理的に形成される生成物も含み得る。特定の化合物は、溶媒和および非溶媒和形、例えば水和形で存在し得ることも理解されよう。溶媒和形は単に「溶媒和物」とも呼ばれる。
【００５２】
前で他に記したように、発癌性になる素因を有する細胞を同定する方法のいくつかの実施形態では、（例えば単離した）個々の細胞、生物の細胞または細胞培養物の細胞であってよい細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化または活性の変化を決定することができる。同様に、対象、例えば患者における新生物を発症するリスクを診断する方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化または活性の変化を決定することができる。このような場合、それぞれの変化の決定は、それぞれの新生物または腫瘍が対象の１つまたは複数の細胞におけるプロテアーゼの活性および／または量の変化に感受性であることを示す可能性がある。いくつかの実施形態では、このようなプロテアーゼは、カルパインプロテアーゼカルパインＩまたはＩＩ（カルシウム活性化中性プロテアーゼＩおよびＩＩとも呼ばれる）としても知られるカルシウム依存性プロテアーゼＣＤＰＩまたはＣＤＰＩＩなどの、カルシウム依存性プロテアーゼ（カルパイン）である。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性および／または発現の変化の決定は、それぞれの新生物または腫瘍が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す可能性がある。
【００５３】
この点において、各方法は、対象から試料を得ること、および試料から核酸を単離することをさらに含むことができる。核酸を増幅し、標識することができる。選択したタンパク質の量を決定する方法は、当該技術分野でよく知られている。各方法は、例えばプロテオミクス系の技法に依存することができる。それは、それぞれのＲａｂ結合タンパク質と結合する、抗体、抗体断片、または抗体様機能を有するタンパク質結合分子の使用を含むことができる。タンパク質の発現タンパク質を分析する方法は、当該技術分野で十分確立している。ｍＲＮＡの発現は、例えばノーザンブロッティングおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護アッセイおよびＰＣＲ系の方法を使用して定量化することができる。さらなる例として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含めた特異的二本鎖を認識することができる、抗体、抗体断片、またはタンパク質結合分子を利用することができる。塩基配列決定に基づく遺伝子発現分析の方法の例示例には、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、および超並列型サイン塩基配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析がある。
【００５４】
（組換え）抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（イリアデ、ピーら（Ｉｌｉａｄｅｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９９７）４０９、４３７〜４４１ページ）、デカボディ（ストーン、イーら（Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）３１８、８８〜９４ページ）、および他のドメイン抗体である（ホルト エル ジェイら（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、（２００３）２１、１１、４８４〜４９０ページ）である。単鎖Ｆｖ断片は、例えば免疫グロブリン分子の１本の重鎖と１本の軽鎖由来
の可変領域の融合体である。抗体様機能を有するタンパク質結合分子の１例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（ＷＯ２００３／０２９４６２；ＷＯ２００５／０１９２５４；ＷＯ２００５／０１９２５５；ＷＯ２００５／０１９２５６；ベステら（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）、９６、１８９８〜１９０３ページ）。ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄ、ヒト涙液リポカイン、またはグリコデリンなどのリポカリンは、それらがハプテンとして知られる選択した小さなタンパク質領域と結合するように修飾することができる天然リガンド結合部位を有する。さらなるタンパク質結合分子の他の非制限的な例は、いわゆるグルボディ（ＷＯ９６／２３８７９参照）、アンキリン骨格（モザビ、エル ケイら（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１３、６、１４３５〜１４４８ページ）または結晶骨格（ＷＯ２００１／０４１４４）に基づくタンパク質、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）（Ｊ．Ｍａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（２０００）１３、１６７〜１８７ページ）中に記載されたタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン、アビマー、およびペプトイドである。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体において一連の多数のドメインとして存在する、いわゆるＡ−ドメインを含む（シルバーマン、ジェイら（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３、１５５６〜１５６１ページ）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的との免疫グロブリン様結合用に工学処理することができる３個のループを含む（ギル、ディー エスおよびダムレ、エヌ ケイ（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）１７、６５３〜６５８ページ）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、Ｃ型レクチンドメイン中に所望の結合用に工学処理することができるループ領域を同様に含む（上記）。タンパク質リガンドとして作用することができるペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素と結合している点でペプチドと異なる、オリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは典型的にはプロテアーゼおよび他の修飾酵素に耐性があり、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、クウォン、ワイ ユーおよびコダデック、ティー（Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９、１５０８〜１５０９ページ参照）。所望の場合、任意のまたは特定の形、クラスなどの標的物質に対するそれぞれの部分の親和性をさらに増大させる修飾作用物質を使用することができる。
【００５５】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、細胞由来またはメラノーマ試料などの組織試料由来の転写産物を、増幅および検出するのに有用な標準的な技法である。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は例えば、それを使用して異なる試料（例えば、非転移性および転移性メラノーマ試料、または良性皮膚およびメラノーマ試料）中のｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現サインを調べることができる感度の良い定量法である。ＲＴ−ＰＣＲを実施するために、ｍＲＮＡを試料（例えば、ヒトメラノーマ試料から単離した全ＲＮＡ）から単離する。ｍＲＮＡは例えば、凍結または保存済みパラフィン包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。ＲＮＡ単離用の精製キットは市販されている。ＲＴ−ＰＣＲ技法は、二重標識蛍光プローブによってＰＣＲ産物の蓄積を測定する、リアルタイム定量ＰＣＲの実施形態中で使用することもできる。リアルタイムＰＣＲは、それぞれの標的配列用の内部競合剤を標準化に使用する定量競合的ＰＣＲと、試料内に含まれる標準化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を使用する定量比較ＰＣＲとの両方に適合する。さらなる例として、競合的ＰＣＲ設計は、おそらく自動、高スループットマトリクス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析検出法および核酸分子の定量化を含めた、遺伝子発現分析に使用することができる。遺伝子発現分析に適したＰＣＲ系の方法中に含めることができる技法のさらなる例は、ディファレンシャルディスプレイ、増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）法、Ｂｅａ
ｄＡｍｉｙ（商標）技術、遺伝子発現の検出用のＢｅａｄｓＡｒｖａｙ（ＢＡＤＧＥ）および広範囲の発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）分析だけには限られないが、これらを含むことができる。さらなる例として、組織試料の遺伝子発現の決定は、マイクロアレイを用いて実施することもできる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性および／または発現の変化、特にＲａｂ結合タンパク質の活性および／または発現の増大の決定は、それぞれの新生物または腫瘍がビタミンＤのメンバー、その類似体またはプロドラッグを用いた治療に感受性であることを示す可能性がある。この点において本発明は、（腫瘍、例えば癌を含めた）新生物がプロテアーゼの活性および／または量の変化に感受性であるかどうかを決定する方法も提供する。新生物中、特にその細胞中で発現されるプロテアーゼを含めて、プロテアーゼが存在してよい。いくつかの実施形態では、方法は、新生物がビタミンＤファミリーのメンバー、その類似体またはプロドラッグに感受性であるかどうかを決定する方法である。
【００５７】
本発明による方法に使用することができる、ビタミンＤ３類似体を含めた多数のビタミンＤ類似体が、当該技術分野で知られている（概説に関しては、例えば、クボデラ、エヌ（Ｋｕｂｏｄｅｒａ，Ｎ．）（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、２（３）、３０１〜３１５ページを参照されたい）。例えばカルシトリオール、マクサカルシトール、タカルシトール、セカルシフェロール、アルファカルシドールまたはセオカルシトール（ＥＢ１０８９）を含めた適切な例は、例えば国際特許出願ＷＯ２００７／０８２５４２中に挙げられている。セオカルシトールは、乳癌腫瘍細胞中の電離放射線に対する応答性を高めることが以前に示されており、これはＤＮＡ損傷の初期誘導の細胞シグナル伝達経路下流の変化の結果であることが示唆されている（デマスターズ、ジーら（ＤｅＭａｓｔｅｒｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、５、１１、２７８６〜２７９７ページ）。さらなる最近の例は、その形成がシミズら（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．）、（（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１６、３３２３〜３３２９ページおよびその中に挙げられた参照文献）によって記載されている、ＳＭＤ−４２９などの１６−エン−２２−オキサビタミンＤ３類似体、例えばリーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）、（（２００７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６７（２４）、１１８４０〜１１８４７ページ）によって記載された、１α，２５−ジヒドロキシ−２０Ｓ，２１（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−２３−イン−２６，２７−ヘキサフルオロコル−カルシフェロール、またはヨーンら（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．）、（（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２３、３８７〜３９６ページ）によって表された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類似体、１α−ヒドロキシ−５，６−トランス−ビタミンＤ３の１９官能性誘導体（ボジットキーレビッズ、エー（Ｗｏｊｔｋｉｅｌｅｗｉｃｚ，Ａ）、（２００７）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ、７２（６〜７）、５５２〜５５８ページ）、オノら（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．）、（（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９（４）、７１１〜７１６ページ）によって記載された延長側鎖を有する類似体、またはポスナーら（Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、（（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０３、２１３〜２２１ページ）によって記載されたジフルオロ類似体である。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態用に、ライブラリーの形で化合物を使用することができる。このようなライブラリーの例は、モデル化合物として化学的に合成した様々な有機小分子、または多数の配列変異体を含む核酸分子の集合である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば生物またはその組織もしくは細胞に
おける、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の発現、細胞内局在および／または活性を検出することを含む。例示例として、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を一定時間モニターすることができる。
【００６０】
本発明の方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を測定した結果と、対照測定（または「参照」測定）の結果を比較することをさらに含むことができる。対照測定は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を調節しない条件の使用を含むことができる。細胞内量、発現、および／または活性の比較において、検出レベルを例えば対照レベルと比較することができる。本明細書で使用する用語「対照レベル」は、例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の細胞、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルでの、それぞれのタンパク質の分子の数、および対照試料中のＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性レベルを指す。したがってこの用語は、正常対照レベルと癌の対照レベルの両方を含む（これも以下参照）。この用語は１つの参照測定値、または複数の参照測定値を指すことができる。いくつかの実施形態では、対照レベルは以前に実施した測定からの発現または活性値のデータベースであってよい。用語「通常レベル」は、正常、健康な個体中、または癌を含めた新生物に罹患していないことが知られている個体の集団中で検出される、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現のレベルまたはＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性レベルを指す。正常な個体は、それぞれの新生物の臨床症状がない個体である。
【００６１】
本発明によれば、例えば細胞中の、遺伝子発現レベルまたは活性レベルまたはタンパク質の量は、対照レベルと比較して遺伝子発現／活性／量が約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、またはそれより多く増大または低下するとき、「変化した」または「異なる」とみなされる。あるいは、発現レベルまたは活性レベルは、対照レベルと比較して遺伝子発現／または活性が少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約５、または少なくとも約１０またはそれより多くの倍数増大または低下するとき、「増大した」または「低下した」とみなされる。
【００６２】
本発明の方法は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性を変えることを含むことができる。いくつかの実施形態では、方法はＥＲＫの活性化を予防、阻害、停止または逆行させることを含む。典型的実施形態では、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の量または活性の調節は、ＥＲＫの活性の調節をもたらす可能性がある。
【００６３】
本発明のさらなる方法は、発癌現象を含めて発癌性になる素因を有する細胞を同定する方法である。方法は、細胞におけるＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量の変化、発現の変化、細胞内局在の変化または活性の変化を検出することを含む。関連法に関して前ですでに説明したように、方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を測定することを含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を測定した結果と、対照測定の結果を比較することも含むことができる（上記を参照）。
【００６４】
本発明は、対象において癌を含む腫瘍などの新生物を発症するリスクを診断する方法にも関する。それぞれの腫瘍は、例えば乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱の腫瘍または卵管（卵巣管とも呼ばれる）の腫瘍であってよい。同様に、それぞれの癌は、対応する癌腫の１つを含めた、例えば乳房癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱の癌または卵管（卵巣管とも呼ばれる）の癌であってよい。肺癌の癌腫の例示例は、非小細胞肺癌腫である。方法は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量、発現レベル、活性レベルおよび細胞内局在の少なくとも１つを決定することを含む。測定はいくつかの実施形態では、対象由来の組織試料または細胞試料などの試料において実施することができる。いくつかの実施形態では、方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を
測定した結果と、対照測定の結果を比較することも含むことができる（上記を参照）。それぞれの対照測定用に、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および／または活性が通常（「正常」）レベルである試料を使用することができる。典型的実施形態では、対照測定と比較したＲａｂ結合タンパク質の量、発現レベル、活性レベルまたは細胞内局在の変化は、対象が新生物に罹患しているかまたは新生物を発症するリスクがあることを示す。
【００６５】
本発明のさらなる方法は、それぞれの化合物を同定するｉｎ−ｖｉｖｏ法とｉｎ−ｖｉｔｒｏ法の両方の方法である。化合物は発癌現象を含めた腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることができる。化合物は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質と複合体を形成することができる。典型的にはこれらの方法は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏであれこの複合体の構成要素を互いに曝すことを含む。１つのこのような方法は、複合体を形成する、または複合体を形成すると考えられる構成要素を互いに接触させることを含むｉｎ−ｖｉｔｒｏ法である。例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質と、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質と複合体を形成すると考えられる薬剤候補分子を、互いに接触させることが可能である。いくつかの実施形態では、方法は、複合体の形成を検出することをさらに含む。
【００６６】
複合体の形成を検出する任意の適切な方法を使用することができる。検出法は、例えば電気泳動法、ＨＰＬＣ、フローサイトメトリー、蛍光相関分光法またはこれらの技法の改変型を含むことができる。他の技法は生物分子の結合自体の測定を含む。このような測定は、例えば分光的、光化学的、光度分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的手段、または細胞効果に基づくことができる。分光的検出法の１例は、蛍光相関分光法である（トンプソン、エヌ エルら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２）１２（５）、６３４〜６４１ページ）。光化学的方法は、例えば光化学的架橋である（スティーン、エイチ、ジェンセン、オー エヌ（Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｎ．）、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ．（２００２）２１、３、１６３〜１８２ページ）。それぞれ光活性、蛍光、放射性または酵素標識の使用（概説に関しては、：リッペ、アール エーら（Ｒｉｐｐｅ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）１６０、４５９〜４７９ページ参照）は、光度分析的、蛍光分析的、放射線学的および酵素的検出法の例である。熱力学的検出法の１例は、等温滴定型熱量計である（ＩＴＣ、概説に関しては、：ベラツクエツ−カンポイ、エーら（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｃａｍｐｏｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ（２００４）２６１、３５〜５４ページ参照）。細胞効果を使用する方法の１例は、その酵素的検出または細胞複製を含めた細胞増殖または細胞生存の測定である。
【００６７】
さらなる関連法は微生物を提供することを含むｉｎ ｖｉｖｏ法である。微生物はＲａｂ結合タンパク質を発現し、該Ｒａｂ結合タンパク質と共に化合物は複合体を形成し得ると考えられ、またはＲａｂ結合タンパク質の発現を化合物が変え得る（例えば、抑制し得る）と考えられる。いくつかの実施形態では、微生物はＲａｂ結合タンパク質を内生的に発現することができる。いくつかの実施形態では、微生物は組換え細胞またはトランスジェニック微生物である。いくつかの実施形態では、微生物は、乳癌細胞または肺癌細胞を含めた癌細胞などの単細胞である。いくつかの実施形態では、微生物は生物から得られる細胞である。それぞれの生物は、例えば哺乳動物、魚類、両生類または鳥類であってよい。細胞は典型的には、皮膚組織または乳房組織などの、それぞれの生物の組織に由来する。いくつかの実施形態では、微生物は、乳癌細胞系または肺癌細胞系を含めた、癌細胞系などの細胞系の細胞である。適切な乳癌細胞系の例には、ＨＭＥＣ細胞系、３Ｄ、Ｂｃａｐ−３７、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＢＴ４７４Ｍ１、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、ＪＩＭＴ−１、ＭＣＦ−７、Ｍ２３１、ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−３
６１ＤＹＴ２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡＭＢ−４３５ＨＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＢ２３１、ＭＷ１、ＰＭＣ４２、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＢＲ−７、ＳＵＭ１４９、ＳＵＭ１５９、ＳＵＭ１３１５、ＳＵＭ−５２ＰＥ、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５、ＺＲ−７５−１およびＺＲ−７５−３０があるが、これらだけには限られない。肺癌細胞系は、例えば腺癌細胞系、扁平上皮細胞癌細胞系または小細胞癌細胞系であってよい。適切な肺癌細胞系の例には、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−６、ＥＢＣ−１、Ｈ３２２、Ｈ４４６、Ｈ４６０、ＨＣＣ２２７９、ＨＴＢ−５６Ｒ、ＨＵＴ２９、ＩＭＥＣ−２、ＫＵ−Ｔ１、Ｌ９９８１、ＬＣＤ、ＬＣＯＫ、ＬＫ−２、ＬＣ−１／ｓｑ、Ｌｕ１３５、ＭＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＮＣＩ−Ｈ１７７０、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＮＣＩ−Ｎ２２６、ＮＣＩ−Ｎ２３１、ＰＣ１、ＰＣ３、ＰＣ７、ＰＣ９、ＰＣ１０、ＰＣ１４、ＰＬＡ−８０１Ｄ、ＱＧ５６、ＲＥＲＦ−ＬＣＡＩ、ＲＥＲＦ−ＬＣＭＳ、ＲＥＲＦ−ＬＣＫＪ、ＳＢＣ３、ＳＰＣ−Ａ１、ＳＱ５およびＹＴＬＭＣ−９０があるが、これらだけには限られない。多数の他の癌細胞系、例えばポールら（Ｐｏｌｅ ｅｔ ａｌ．）（２００６、上記）中で命名された追加的細胞系が当該技術分野で知られている。
【００６８】
いくつかの実施形態では、微生物は、結腸直腸癌細胞系、膀胱癌細胞系および卵管癌細胞系の細胞である。適切な結腸直腸癌細胞系の例には、Ｃｏｌｏ−３２０、ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９、Ｌ０、Ｌ０−２００、Ｌ０−５００、Ｌ０−１０００、ＬｏＶｏ、ＬＳ１０３４、ＬＳＴ−Ｒ１、ＲＫＯ、ＳＷ４８０、およびＷｉＤｒ、ならびにドウグラら（Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．）（（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４、１４、４８１７〜４８２５ページ）によって言及されたさらなる結腸直腸癌細胞系があるが、これらだけには限られない。適切な膀胱癌細胞系の例には、ＢＩＵ−８７、ＥＪ、ＫｏＴＣＣ−１、ＭＢＴ−２、ＲＴ４、ＳｃａＢＥＲ、Ｔ２４およびＵＭ−ＵＣ−２があるが、これらだけには限られない。卵管癌細胞系の２つの例示例は、ＦＴ−ＭＺ−１（ルンネバウム、アイ ビーら（Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ，Ｉ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３５３、１、２９〜３２ページ）およびＨＥＰＦＴ（イシワタ、アイら（Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００７）Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ、２０、１１９〜１３０ページを参照）である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、微生物は、Ｒａｂ１１ＦＩＰ、例えばＲａｂ１１ＦＩＰ１などのＲａｂ結合タンパク質を過剰発現する乳癌上皮細胞系ＭＣＦ１０Ａなどの非癌性組織細胞系を含めた、非腫瘍性の細胞である。同様に、任意の細胞−細胞系の細胞、個々の細胞、多細胞生物内の細胞、（直接入手および単離を含めて）多細胞生物から入手した細胞であろうと選択して、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１などのＲａｂ結合タンパク質を過剰発現させることによって癌細胞に形質転換することができる。以下の実施例および例えば図６は、細胞がどのようにして癌細胞に形質転換され得るかを然るべく例示する。この点において、本発明の方法は癌細胞を入手する方法も提供し、それは細胞中のＲａｂ結合タンパク質の発現を調節する、特に増大させる方法を含む。それによって細胞は癌細胞に形質転換される。それぞれのＲａｂ結合タンパク質は、例えばＲａｂ１１ＦＩＰ１などのＲａｂ１１結合タンパク質であってよい。Ｒａｂ結合タンパク質は、内因性または異種タンパク質、すなわち細胞中に本来存在するコード核酸配列を有するタンパク質、またはコード核酸配列がそれぞれの細胞中に導入される／導入されているタンパク質であってよい。本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの対応するＲａｂ結合タンパク質の発現を調節することが可能な化合物を同定するための、このような細胞の使用にも関する（以下参照）。
【００７０】
本発明の方法は、Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成し得ると考えられる化合物、またはその発現を変えると考えられる化合物を微生物に加えることを含む。各方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質、例えばＲａｂ１１ＦＩＰ結合タンパク質の発
現をモニターする。各方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性をモニターする。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の細胞表現型の変化をモニターする。いくつかの実施形態では、このような方法は対照測定を含む（上記も参照）。対照測定の結果は化合物を使用して得た結果と比較する。対照測定は、例えば、Ｒａｂ結合タンパク質の発現または活性に影響を与えないことが知られている化合物の使用を含むことができる。
【００７１】
さらに他の関連法は、宿主生物を提供することを含むｉｎ−ｖｉｖｏ法である。任意の望ましい宿主生物を、それが癌細胞を収容し増殖させることが可能である限り提供することができる。宿主生物の例には、哺乳動物、魚類、両生類、および鳥類があるが、これらだけには限られない。適切な哺乳動物の例には、ラット、ウサギ、モルモット、オポッサム、イヌ、およびネコがあるが、これらだけには限られない。
【００７２】
任意の望ましい癌細胞をこの目的で使用することができる（例えば上記を参照）。方法は、宿主生物に癌細胞を導入することをさらに含む。さらに方法は、先に記載した化合物、すなわちＲａｂ結合タンパク質と複合体を形成し得ると考えられる化合物、Ｒａｂ結合タンパク質の量を調節し得ると考えられる化合物、またはＲａｂ結合タンパク質の活性を調節し得ると考えられる化合物の使用を含む。いくつかの実施形態では、癌細胞は化合物を含む。したがって、宿主生物に癌細胞を導入する前に、化合物を癌細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、宿主生物への癌細胞の導入の前、後、または同時に、化合物を宿主生物に投与する。典型的には、方法の特定の段階で化合物を癌細胞に導入する。方法は、宿主生物中の腫瘍の増殖をモニターすることをさらに含む。
【００７３】
本発明を容易に理解し実務上の効果をもたらすことを可能にするために、個々の実施形態をここで以下の非制限的な実施例によって記載する。
【実施例】
【００７４】
本発明者らが開発したＴＲＩＡＧＥ法の、特に関連する態様および特徴は、以下のように要約できる（図１も参照されたい）。
【００７５】
【表１】
【００７６】
細胞および薬剤治療
マイクロアレイデータおよび腫瘍試料。４種の前述の乳癌マイクロアレイデータセットを、この研究に使用し、全発現プロフィールを、原典であるウプサラコホート（ミラー、エル ディーら（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２、１３５５０〜１３５５５）、ストックホルムコホート（パウィタン、ワイら（Ｐａｗｉｔａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７、（Ｒ９５３〜９６４）、ベルギーコホート（ルイ、エスら（Ｌｏｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５、１２３９〜１２４６）およびシンガポールコホート（イブシナ、エー ブイら（Ｉｖｓｈｉｎａ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、１０２９２〜１０３０１）に記載されているように、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＵ１３３ＡおよびＵ１３３
Ｂの遺伝子チップを使用して発生させた。全ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＣＥＬファイルを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）から検索し、グローバル平均法（ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）を使用して標準化し、プローブセットのシグナル強度を自然対数変換し、平均強度をｌｏｇ ５００の標的シグナル値に調整することによって尺度化した。コホート依存性アレイのバイアスを取り除くために、それぞれのコホート内のアレイを、それらを１つのデータセットに組み込む前に平均化した。すべての患者および腫瘍試料の臨床的特徴を、図２に要約した。
【００７７】
局所的特異値分解（ＬＳＶＤ）。マイクロアレイのプローブセットを、ＵＣＳＤ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒに従ってゲノム座標にマッピングした。候補ＰＥＡを、対応する腫瘍のサブセット中の遺伝子の、局在座標化された過剰発現として同定した。第１に、遺伝子を、試料中の遺伝子の発現が、全試料にわたったその発現中央値から調整された中央絶対偏差（ａＭＡＤ）の２．５倍を超えた場合に、試料中の過剰発現として定義した（図１、第１工程）。第２に、局所座標化された過剰発現を、５０のプローブのスライディングウィンドウに適用したＳＶＤにより得られた主固有値によって定量化した。同じ遺伝子に対応するプローブ（ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ、ｂｕｉｌｄ ＃１７７に対応する）を平均し、単一遺伝子の測定値を表した。候補ＰＥＡを、ベースライン閾値を上回る局所主固有値を有する連続した染色体領域として同定した。候補ＰＥＡにスコアを付け、主固有値のピークによりランク付けした。最も高いスコアを得た候補ＰＥＡを、ピーク構造をさらに解明するために（すなわち、複数のサブピークから１つを識別するために）、１０のプローブのウィンドウサイズを使用して、ＬＳＶＤの第２ラウンドに供した。最後に、最も高いスコアを得たサブピークを、個人の遺伝子および腫瘍に関する固有重量を導くために、その後ＳＶＤに供した。固有重量は、主固有ピークの大きさに対する、遺伝子および腫瘍の相対的寄与率を反映する。得られたピークに関して、非ゼロの固有重量を有する遺伝子は、ＰＥＡの成分であると考えられる。中央値＋２標準偏差を超える固有重量を有する腫瘍を、アンプリコン含有腫瘍として分類した。（ＴＲＩＡＧＥ、第４工程）。
【００７８】
再発性ゲノム増幅を同定するための局所特異値分解（ＬＳＶＤ）
腫瘍試料のコホートに由来する遺伝子発現プロフィールのＬＳＶＤ分析は、推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）の同定における鍵となる第１の工程であり、これにより、転移に寄与する癌遺伝子を、ＴＲＩＡＧＥ（Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓを介した癌遺伝子三角検証（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓ））方法論により発見できる。ＬＳＶＤは、再発性アンプリコンが、腫瘍試料のサブセット中にゲノム的に局在化された遺伝子の座標化された過剰発現として現れるという仮説に基づき、ＰＥＡを同定する。ＬＳＶＤは、特異値分解（ＳＶＤ）（ストラング、ジー（Ｓｔｒａｎｇ，Ｇ．）、（１９９８）「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｎｅａｒ Ａｌｇｅｂｒａ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．７．第３版、ウェルズリ−ケンブリッジプレス社（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ−Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｓｓ．）ＩＳＢＮ ０−９６１４０８８−５−５）を中心に構築されており、染色体ごとのＳＶＤの局所適用により得られる、局所主固有値（ＬＰＥＶ）のプロットである、座標化された局所過剰発現プロットのピークとしてＰＥＡを予測する。ＬＳＶＤは、ゲノム上の各ゲノムの位置に関する局所発現行列を導き、バイナリ連結行列に変換し、バイナリ行列にＳＶＤを適用することにより達成される。このような適用で得られた主固有値は、その遺伝子座における遺伝子の座標化された過剰発現の基準である（クルーガー、ワイら（Ｋｌｕｇｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、７０３〜７１６；クラインバーグ、ジェイ エム（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．）、（１９９９）ＡＣＭのＪｌ、４６、５、６０４〜６３２）。ＬＰＥＶ対ゲノム位置のプロット（ＬＰＥＶプロット）における特定のベース閾値を上回る、固有値の「ピーク」は、ＰＥＡの境界を定める。ＬＳＶＤの手順の詳細
な説明は、以下に提供する。
【００７９】
Ｅｃを、染色体Ｃｃの遺伝子発現行列とし、Ｅｃｉｊ（注：ＥｃｉｊはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）を、腫瘍Ｔｊの中の位置ｌｉにおける遺伝子の発現のｌｏｇ２とし、ｉ＝１、２、．．．、Ｎｃ、およびｊ＝１、２、．．．、Ｍである。Ｃｃ上の推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）は、ＬＳＶＤを使用してＥｃを分析することによって予測され、ＬＳＶＤは以下の順序の工程：（１）Ｅｃ（注：ＥｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）を、バイナリ連結行列Ａｃ（注：ＡｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）に変換する工程、（２）染色体局在化行列Ａｐｃ（注：ＡｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）を導く工程、（３）ＡｐｃにＳＶＤを適用する工程、および（４）ＰＥＡを同定する工程、を有する。
【００８０】
１．Ｅｃのバイナリ連結行列Ａｃへの変換：Ｅｃを、以下のようなブールの離散化定理を介して、バイナリ連結行列Ａｃへ変換する（注：Ｅｃ、ＡｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）。
【００８１】
Ｅｃｉｊ＞μｉ＋ｘ＊νｉの場合Ａｃｉｊ＝１
Ｅｃｉｊ≦μｉ＋ｘ＊νｉの場合Ａｃｉｊ＝０
μｉおよびνｉが中央値であり、調整中央絶対偏差（ａＭＡＤ）が、Ｅｃｉ＝｛Ｅｃｉ１、Ｅｃｉ２、．．．、ＥｃｉＭ｝である場合、ａＭＡＤはＭＡＤの１．４８２６倍である。ｘは、粗いマップの第１のパスに関しては２．５であり、第２のパスにおいて得られた、より詳細なマップに関しては２である。
【００８２】
２．局所行列Ａｐｃの導き（注：ＡｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）。
位置Ｌｐｃにおける局所行列Ａｐｃは、染色体Ｃｃ上の位置ｐ−ｗからｐ＋ｗまでの遺伝子を使用してＡｃから導き、ｗはウィンドウサイズであり、所定のパラメーターである。ｗは、第１のパスの粗いマップに関しては５０であり、第２のパスのより詳細なマップに関しては１０である。
【００８３】
３．特異値分解（ＳＶＤ）：ＳＶＤのＡｐｃへの適用は、ＰＥＡを予測するための重要な工程である。ＡｐｃのＳＶＤは、Ａｐｃを３つの行列、Ｕｐｃ、Σｐｃ、Ｖｐｃ（注：Ｕｐｃ、Σｐｃ、ＶｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）の積、すなわちＡｐｃ＝Ｕｐｃ×Σｐｃ×ＶｐｃＴに分解する。ＵｐｃおよびＶｐｃは、それぞれ、（２ｗ＋１）×（２ｗ＋１）およびＭ×Ｍの行列であり、一方Σｐｃは、（２ｗ＋１）×Ｍの対角行列である。ＵｐｃおよびＶｐｃの列ベクトルは、それぞれ、ＡｐｃＡｐｃＴおよびＡｐｃＴＡｐｃ（注：ＡｐｃＡｐｃＴおよびＡｐｃＴＡｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）の固有ベクトルであり、一方Σｐｃ（注：ΣｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）の対角成分は、各固有値である。最も高い固有値を、主固有値（λｐｃで表す）と呼び、各固有ベクトルを主固有ベクトルと呼ぶ。位置Ｌｐｃにおける腫瘍Ｔｊの固有重量はＴｐｃｊで表され、行列ＡｐｃＴＡｐｃの主固有ベクトルのｊｔｈ成分の絶対値として定義する。同様に、Ｇｐｃｊで表される、位置Ｌｐｃにおける遺伝子Ｇｉの固有重量は、行列ＡｐｃＡｐｃＴの主固有ベクトルのｊｔｈ成分の絶対値である。
【００８４】
真のＰＥＡシグナルとバックグラウンドとの差異を改善するために、本発明者らのＬＳＶＤの実施において、本発明者らは、ＳＶＤを、Ａｐｃについて使用する代わりに（ＡｐｃＡｐｃＴ）３について使用し、λｐｃを見出した。上記の定義に従って、腫瘍および遺伝子の固有重量が、それぞれ（ＡｐｃＴＡｐｃ）４および（ＡｐｃＡｐｃＴ）４の主固有ベクトルから得られた。ここで、λｐｃは、（ＡｐｃＡｐｃＴ）４対Ｍ４の主固有値４乗根との比であり、遺伝子および腫瘍の固有重量は、それぞれ、（ＡｐｃＡｐｃＴ）４／Ｍ
４および（ＡｐｃＴＡｐｃ）４／Ｍ４の主固有ベクトルの各成分の４乗根である（注：ＡｐｃおよびＡｐｃＴはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）。
【００８５】
４．ＰＥＡの予測：
λｐｃ対Ｌｐｃをプロットすることにより、ＬＰＥＶのプロットが得られ、これをＬＰＥＶプロットと呼ぶ。このプロットのピークは、ＰＥＡを示す。ピークにおけるλｐｃの値が高いほど、Ｌｐｃの周りのＰＥＡの信頼性が高い。最終的に、ＰＥＡは、λｐｃ＞Ｔλ＝２０を含む、連続した領域を対象とする範囲を有するピークおよびこのピークを中心として報告される。
【００８６】
ＴＲＩＡＧＥ遺伝子生存率分析。各プローブセットに関して、平均発現レベルを、所与のコホートに関してまず計算した。その後、患者を、平均より下の群と平均より上の群とに階層化し、コックス比例ハザード回帰モデルをこのデータに適合させ、無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）に基づくハザード比を計算した。帰無仮説は、２つの群は再発の危険性が同じであろうと言うものであり、尤度比検定のｐ値はこの仮説に対する証拠として計算した。コックスモデルの適合および統計的計算を、Ｒでサバイバルパッケージ（ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｃｋａｇｅ）を使用して実施した。同じ遺伝子にマッピングされた複数のプローブセットの場合、最も有意に関与するプローブセットの結果が報告された。ＤＭＦＳを、外科手術から最初の遠隔再発事象または最後の追跡調査の日までの時間間隔として定義した。両側および対側の癌を有するすべての患者ならびに再発したまたは診断後１０年を超えて疾患特異的な死を迎えた人を、事象に関して体系的に審査した。ウプサラコホートは最も長く、最も完全に患者を追跡調査したコホートに基づく、本発明者らの最も大きい集団であったので、それを使用し、ＴＲＩＡＧＥにおける生存率データを作成した。
【００８７】
増殖サインおよび遺伝子相関。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、ウィットフィールドら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ）は８５０を超える細胞周期調節遺伝子を、ヒーラ子宮頸癌細胞においてすでに同定していた（ウィットフィールド、エム エルら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、（２００２）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ、１３、１９７７〜２０００）。著者らは、乳房の腫瘍における高度に相関した発現を示し、ペローら（Ｐｅｒｏｕ ｅｔ ａｌ）の乳癌データセット（ペロー、シー エムら（Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０６、７４７〜７５２）の腫瘍細胞増殖に関与した、これらの遺伝子の分画を発見した。この増殖サインの近似値を求めるために、本発明者らは、細胞周期調節遺伝子（ウィットフィールド（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ）の研究における１，１３４ ＩＭＡＧＥクローンに対応する）を、Ｕｎｉ Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄ ＃１８７を介してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットにマッピングし、ウプサラコホートの腫瘍を階層的にクラスタ化した。増殖関連遺伝子を含む独特のクラスタが現れ（図１０を参照されたい）、組織学的悪性度、分裂指数およびＫＩ６７スコアを含むウプサラコホートにおける増殖のマーカーと高度に相関することが見出された（データ非掲載）。＞０．８の平均相関を有する、このクラスタの中心となるプローブセット（ｎ＝７８のプローブセットが６７の遺伝子に対応する（図１０を参照されたい））を、「コア増殖サイン」遺伝子に指定し、それらの平均発現を使用して、増殖サインと、ＴＲＩＡＧＥ分析の第７工程のための他のすべてのプローブセットとのピアソン相関を計算した。増殖と癌の再発との臨床的関連性次第では、特に、この工程は、他の癌型のＴＲＩＡＧＥ分析には必須ではないことがある。
【００８８】
ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）の選択およびクローン化。ＲＣＰの３種のスプライス変異体：変異体１（ＮＭ＿０２５１５１）、変異体２（ＮＭ＿００１００２２３３）および変異体３（ＮＭ＿００１００２８１４）を、ＧｅｎＢａｎｋで同定した。これらの中で、変異体１および３だけが、腫瘍試料および細胞系においてＲＴ−ＰＣＲにより一貫して検
出でき（データ非掲載）、変異体１だけが、ポリクロナールＲＣＰ抗体（ＧｅｎＷａｙ）を用いたウェスタンブロットにより観察できた。したがって、ＲＣＰの完全長変異体１は、正常なヒト血液からＲＴ−ＰＣＲにより増幅され（順方向プライマー：５’−ＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＧＧＴＣＴＣＧＧＣＴ−３’（配列番号１）、逆方向プライマー：５’−ＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴ−３’）（配列番号２））、配列を確認し、この研究においてＲＣＰの機能を調査するために使用した。
【００８９】
細胞系および一過性形質移入。ヒト乳房細胞系、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、３７℃、５％ＣＯ２で、ＡＴＣＣにより推奨されている成長培地で維持した。完全長ＲＣＰをｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨｌおよびＥｃｏＲ１部位に連結した。２種のＲＣＰ特異的ＲＮＡｉ構築体を、先に記載したように（レイノルズ、エーら（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２、３２６〜３３０）設計し、Ａｍｂｉｏｎにより作製した。ＭＣＦ７について、一過性プラスミドおよびＲＮＡｉの形質移入を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【００９０】
レンチウィルスに感染させることによる安定細胞系の作製。ｓｈＲＮＡを安定して過剰発現する細胞系を作成するために、標的配列（順方向：５’−ＴＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＡｇＡｇＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号３）および逆方向：５’−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＡ−３’）（配列番号４）をコードするオリゴヌクレオチドを、ＬｅｎｔｉＬｏｘ ｐＬＬ３．７ベクターにアニーリングし、クローン化した。対照ｓｈＲＮＡのために、非標的「スクランブル」配列を、ｐＬＬ３．７．（順方向：５’−ＴＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣｔｔｃａａｇａｇａＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号５）および逆方向：５’−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡ−３’）（配列番号６）内にクローン化した。レンチウィルスによるＲＣＰの過剰発現のために、ＲＣＰをまず、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｇａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ３Ｃにクローン化し、さらに、レンチウィルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に、製造業者のプロトコルに従ってＬＲ組換え反応により組換えた。レンチウィルスの作製のために、ｐＬＬ３．７またはｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴを、パッケージングベクターを用いて、２９３ＦＴ細胞に共形質移入し、４８時間後に上清を収穫した。ウィルスを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター内で、２５，０００ｒｐｍで２時間、超遠心分離器にかけて濃縮し、リン酸緩衝食塩水に再懸濁した。力価を、濃縮ウィルスの段階希釈液を用いて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に感染させることによって確定した。標準的な調製用に、力価は、ｐＬＬ３．７に関してはおよそ１〜５×１０８粒子であり、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターに関しては４−１０×１０７粒子であった。ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＭＢ２３１細胞の感染のために、２×１０５細胞を、１×１０７粒子および８μｇ／ｍｌポリブレンの懸濁液中で、３時間、３７℃においてインキュベートした。細胞をその後、再度播種し、前記のように培養した。ＲＣＰノックダウン安定細胞の純粋な集団を得るために、ＧＦＰ陽性細胞を、培養４日後に選り分けた。ＲＣＰ過剰発現安定系の作製のために、細胞を、ブラストサイジンを用いて感染２週間後に選択した。
【００９１】
ウェスタンブロット分析。すべての細胞溶解物を、ＲＩＰＡバッファーを使用して調製した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＦ メンブラン（ジーイーヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に転写した。ＲＣＰ
（ジェンウェイ社（Ｇｅｎｗａｙ）、カタログ番号（ＣＮ）：１５−２８８−２１５７４Ａ）、β−アクチン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ＣＮ：Ａ５４４１）、ホスホ−Ａｋｔ（セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＮ：９２７１）、Ａｋｔ（セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＮ：９２７２）、ホスホ−Ｅｒｋ（セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＮ：９１０１）およびＥｒｋ（セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、ＣＮ：９１０２）に対する抗体を使用して、メンブランを調査し、抗体−タンパク質複合体を、ＨＲＰ標識抗体およびＥＣＬ（アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））により検出した。
【００９２】
細胞増殖およびコロニー形成。細胞を、９６ウェルプレートに、５０００細胞／ウェルの濃度で播種し、細胞増殖を、ＷＳＴ−１（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用し、製造業者のプロトコルに従って４重に測定した（すなわち、条件当たり４ウェル）。ＭＡＰＫ阻害アッセイのために、９６ウェルプレートに再度播種する前に、細胞を、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、０．５％の血清を含む培地で一晩処理した。足場非依存性コロニー形成に関するＲＣＰの作用を試験するために、細胞を、２５％ＦＢＳを含む完全培地に溶解した０．３％寒天（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））２５０μｌに再懸濁し、５００μｌの０．６％寒天ベースであらかじめコーティングした２４ウェルプレートに４重（すなわち、条件当たり４ウェル）に播種した。コロニー形成の効率を、播種の２１日またはそれ以後に、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いて染色することによって検査した。コロニーの大きさが５０ｕｍを超えるコロニーをＬｅｉｃａ ＱＷｉｎソフトウェアを使用して計測した。
【００９３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの浸潤および遊走。トランスウェルの遊走および浸潤アッセイを、孔サイズ８μｍのＦａｌｃｏｎ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４マルチウェルインサート（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して実施した。浸潤アッセイのために、インサートを、８０μＬの、無血清成長培地中の、２０μｇのＭａｔｒｉｇｅｌ（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））でコーティングした。両方のアッセイのために、２００μＬ無血清成長培地中の５０００細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む７５０μＬ完全成長培地を、下方のチャンバーに入れた、各トランスウェルインサートに入れた。２４時間後、インサートの孔を介して遊走または浸潤した細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、２．５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて１５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用してＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ（セロミクス社（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ））上で計測した。フィールドサイズは１ｍｍ２であった。浸潤アッセイのために、実験を４〜５倍の複製を用いて実施し、実験ごとに１０〜１６個のフィールドをスキャンした。遊走アッセイのために、実験を３倍の複製を用いて実施し、実験ごとに１０〜１６個のフィールドをスキャンした。
【００９４】
細胞の免疫蛍光顕微鏡検査。細胞培養物を、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて透過処理し、その後１％ヤギ血清を用いてＰＢＳ中でブロッキングした。細胞を、抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ビーディーファルミンゲン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＮ：６１０４０４）および１：５００希釈のフィブロネクチン抗体（ビーディーファルミンゲン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＮ：６１００７７）を用いて染色し、その後、マウスおよびウサギのＩＧｇを検出する適切な２次抗体を、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４または４８８（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））に接合した。Ｆ−アクチンは、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いて標識した。ＤＡＰＩを、核の染色に使用した。画像を共焦点顕微鏡、（ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ、ツァイス社（Ｚｅｉｓｓ））を用いて獲得した。
【００９５】
細胞周期分析。ＭＣＦ１０Ａ細胞を、１％血清中で４８時間飢餓状態にした。細胞をその後、７５％エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ Ａ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を用いて処理し、ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍｌ）を用いて染色し、ＬＤＲ２フローサイトメーター（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析した。分類した細胞を、ＦＡＣＳ ＤｉＶａソフトウェア（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して分析した。
【００９６】
アポトーシスアッセイ。ＭＢ２３１細胞を、４８時間、完全培地で維持または１％血清を用いて飢餓状態にした。アポトーシス細胞を、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を用いて検出した。ＤＮＡ鎖の壊れた細胞を、ＴＭＲ（赤）を用いて、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）反応により標識し、蛍光顕微鏡検査およびフローサイトメトリーにより分析した。
【００９７】
ヌードマウスにおける腫瘍原性。メスのＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウス、６〜８週齢を、無菌条件下で、温度調節室において、１２／１２時間の明／暗スケジュールで、食餌および水は好きな時に取らせて飼育した。動物およびそれらの世話に関するすべての手順は、国内的および国際的規格に従った。ＭＣＦ−７腫瘍形成実験のために、１．７ｍｇの１７β−エストラジオールのペレット（９０日放出、イノベイティブリサーチオブアメリカ社（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ））を、腫瘍細胞の注入１週間前に各マウスに移植し、ＭＣＦ−７細胞のエストロゲン要求性を補った。実験群は、ＭＣＦ７−ＲＮＡｉ ＲＣＰ（安定ＲＣＰノックダウン）、ＭＣＦ７−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ（対照）、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ ＲＣＰ、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌであった。各実験群に関して、８匹のマウスの皮下（右および左の後脚上部）に２．０×１０６の細胞を注入した。皮下腫瘍を、デジタル計測器を用いて、週に１回測定した。腫瘍の堆積は、ａｂ２／２としてｍｍ３で計算し、ａおよびｂは、それぞれ直交する、腫瘍の最も長い径および最も短い径である。腫瘍重量は終了時に測定し、シンガポール動物飼育規則に従って死亡させた。
【００９８】
免疫組織化学。４μｍの厚さのパラフィン包埋腫瘍組織切片を、ＡＢＣ免疫組織化学試薬およびアビジン−ビオチンブロッッキング試薬（ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用して、製造業者のプロトコルに従って染色した。スライドを、１：５００希釈の抗ＲＣＰ抗体と共にインキュベートし、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００９９】
結果
上記のデータにより、ゲノム、転写および臨床的な情報の座標分析が、転移性再発および患者の死に寄与していると思われる癌の新規遺伝子の発見を良好に対象とでき、その結果、下流の機能研究のための遺伝子の理論的優先順位付けが容易になることが実証された。ヒト乳癌における、複数機能の頻繁に発生する癌遺伝子としてのＲＡＢ１１ＦＩＰ１の例示的検証は、治療標的としてのその重要性を強調し、発癌におけるエンドサイトーシス再循環経路の新たな役割に新しい洞察を提供する。
【０１００】
例示目的で、ヒト乳癌形成において複数の病理学的役割を有する新規な癌遺伝子として染色体８ｐ１１に位置する、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１の機能的検証を本明細書で提供する。ＲＡＢ１１ＦＩＰ１は、Ｒａｂ４およびＲａｂ１１の結合タンパク質としてすでに同定され
ており、Ｒａｂカップリングタンパク質（ＲＣＰ）とも呼ばれ、これはエンドソームの再循環および受容体の分類において機能する（リンゼイ、エー ジェイら（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７、１２１９０〜１２１９９；ペデン、エー エーら（Ｐｅｄｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １５、３５３０〜３５４１）。ＲＡＢ１１およびＲＡＢ２５の異常調節を介して、発現は、多くのヒトの腫瘍の一般的要素として示され（例えば、チェン、ケイ ダブリュら（Ｃｈｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０、１２５１〜１２５６；チェン、ケイ ダブリュら（Ｃｈｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４０３、２０２〜２１５；ゲブハルド、シーら（Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ａｍ ＪＰａｔｈｏｌ １６７、２４３〜２５３；ゴールデンリング、ジェイ アールら（Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｙａｌｅ ＪＢｉｏｌ Ｍｅｄ ７２、１１３〜１２０；ヨーン、エス オーら（Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、２７６１〜２７６９を参照されたい）、腫瘍進行におけるＲａｂ結合タンパク質の役割については記載されていない。本発明者らは、臨床的およびゲノム的交差を介して癌形成の関連癌遺伝子に三角検証を用いる、統合分析戦略を考案し、これは、発現の頻度、アンプリコンにおける共発現、患者の無病生存率との関連を考慮し、腫瘍増殖の偶発的関連は考慮に入れない。この多段階工程のデータ検索研究法である、略してＴＲＩＡＧＥ（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓ、以下を参照されたい）を使用して、本発明者らは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１を癌遺伝子として同定した。
【０１０１】
ＴＲＩＡＧＥによる癌遺伝子の推論
進行性乳癌に寄与する癌遺伝子を同定するために、このような遺伝子の特定のサブセットは、転写学的、ゲノム的および臨床的情報の三角検証を介して発見できるという仮説を立てた。特に、本発明者らは、１）再発性増幅の領域に位置し、２）遺伝子の異常調節により活性化し、３）癌の転移性播種に関連する癌遺伝子を明らかにするよう探求した。この目標のために、本発明者らは、ＴＲＩＡＧＥ（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓ）と呼ばれる、複数工程のデータ検索研究法を開発し、これは、発現マイクロアレイデータにおける再発性ゲノムアンプリコンの発現フットプリントを同定し、遺伝子発現を、転移性再発の危険性と関連付け、生存率相関および比較ｍＲＮＡ動学に基づく遺伝子の立候補を評価する（図１）。
【０１０２】
第１の工程において、７３７例の原発性乳房腫瘍のマイクロアレイ発現プロフィール（図２）を、局所特異値分解（Ｌｏｃａｌ Ｓｉｎｇｕｌａｒ Ｖａｌｕｅ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＬＳＶＤ）により分析し、再発性ゲノムアンプリコンの存在および位置を推測した。この研究は、再発性アンプリコンは、関連遺伝子の過剰発現を座標化することによって検出できるという前提に基づき（チン、ケーら（Ｃｈｉｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １０、５２９〜５４１；レアル、エフら（Ｒｅｙａｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、１３７６〜１３８３）、乳癌において高度に増幅した遺伝子の大部分が同時過剰発現であるという証拠に支持されている（ポラック、ジェイ アールら（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９、１２９６３〜１２９６８）。ＬＳＶＤは、遺伝子の過剰発現が濃縮されたゲノム座および「遺伝子座特異的」過剰発現を生じる腫瘍分画の同時同定を可能にする。アウトプットは、遺伝子座特異的過剰発現の程度および関連する腫瘍数の両方を反映する、主固有ピークとしてみなされる。全ゲノムＬＳＶＤにより発見された、最も高いスコアを得た主固有ピークは、再発性コピー数増加の公知の領域に対応する遺伝子座に優勢にマッピングされた（図３を参照されたい）。ＬＳＶＤによりすべてのピークが同定されたわけではないが、再発性ア
ンプリコン事象を表すことが期待され、公知の再発性アンプリコンと、非常に大きく、正確なゲノム重複を有するものを推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）と呼び、ＴＲＩＡＧＥ手順によりさらに調査した。
【０１０３】
対象となる癌遺伝子の発現レベルは、患者の予後不良に相関するだろうという指針に基づき、ＰＥＡ内の遺伝子を、遠隔再発関連の有意性に関して評価した。各遺伝子のために、腫瘍（および対応する患者）を、低発現群（平均より低い）または高発現群（平均より高い）に、２つに分け、コックス比例ハザード回帰により、無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）に関して分析した（図１、第２および第３工程）。得られたハザード比の有意性を反映する尤度比検定のＰ値を、ＰＥＡの遺伝子の発癌性の初期基準として使用した（図１、第３工程、任意抽出の生存率）。しかし、再発性ゲノムアンプリコンは、患者の生存率不良に相関し得るので、アンプリコン上に物理的には存在する良性の「パッセンジャー遺伝子」もまた、腫瘍の侵攻に機能的に寄与することなくＤＭＦＳ不良に相関でき、一方、ドライビング癌遺伝子（コピー数増加以外の機序により癌において活性化できる）は、アンプリコンを欠いた腫瘍においてＤＭＦＳ不良との相関を維持することが予想され、パッセンジャー遺伝子は予想されない。したがって、この分析から審査される、遺伝子発現と、含有アンプリコン腫瘍のＤＭＦＳとの相関を再検査した。（図１、第４工程、任意抽出）。この方法では、増幅事象に非依存性の、ＤＭＦＳ不良に確実に関連するそれらの候補癌遺伝子のみが分かってくるであろう。
【０１０４】
生存率分析の両方の工程において有意な候補癌遺伝子を、ｍＲＮＡ発現パターンの比較を介してさらに精査した（図１、第５および６工程）。ドライビング癌遺伝子は、アンプリコン含有腫瘍において比較的高度に一貫して発現されるはずであるという仮定に従って、ＰＥＡ内の遺伝子発現レベルを平均し、その次に遺伝子を平均発現によりランク付けした（ランク１が、最も高い平均発現レベルを表す）。この方法では、発現のランキングは、所与の遺伝子座における発癌性のさらなる相対的尺度として機能する。
【０１０５】
高増殖性乳房腫瘍は、再発する可能性が高く、増殖に関連する遺伝子は、多くの場合ＤＭＦＳ不良に相関している。このことは、細胞周期機能を濃縮する、何百の高度関連遺伝子からなる増殖サインにおいて実証され、これは多くの癌型の再発に正に相関することが見出された（ダイ、エイチら（Ｄａｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、４０５９〜４０６６；イブシナ、エー ブイら（Ｉｖｓｈｉｎａ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、１０２９２〜１０３０１；ペロー、シー エムら（Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ
４０６、７４７〜７５２；ローゼンウォルド、エーら（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．）（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３、１８５〜１９７；ウィットフィールド、エム エルら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １３、１９７７〜２０００；ウィットフィールド、エム エルら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ６、９９〜１０６）。この調査は、増殖との関連とは非依存性の、発癌に寄与する固有の遺伝子に関し、ＴＲＩＡＧＥの最終工程において、候補遺伝子の発現パターンを増殖サインとの相関について試験し、生存率との関連が腫瘍の増殖率により説明できる程度を検討した。ＤＭＦＳ不良に相関する、ウプサラ乳房腫瘍コホートのプローブセット（ｎ＝２５１腫瘍）を図４に表す。ＤＭＦＳ不良（ｐ＜０．０５）に有意に相関することが見出された、２，３７７のプローブセットの約３５％が、ピアソン相関が、＞０．４でこの増殖サインのメンバーであることが見出された（図４）。増殖サインの中核コア遺伝子は、クラスタ化の順に、Ｂ．２２２９５８＿ｓ＿（ＤＥＰＤＣ１）、Ａ．２０４１７０＿ｓ＿（ＣＫＳ２）、Ｂ．２２２６８０＿ｓ＿（ＤＴＬ）、Ａ．２０９６８０＿ｓ＿（ＫＩＦＣ１）、Ａ．２０２５０３＿ｓ＿（ＣＳＮＫＩＧ１）、Ａ．２０１２９１＿ｓ＿（ＴＯＰ２Ａ）、Ａ．２０１２９２＿（ＴＯＰ２Ａ）、Ａ．２０４０３３＿（ＴＲＩＰ１３）、Ｂ．
２２５６８７＿（ＦＡＭ８３Ｄ）、Ａ．２００８５３＿（Ｈ２ＡＦＺ）、Ａ．２１３９１１＿ｓ＿（Ｈ２ＡＦＺ）、Ａ．２０３３６２＿ｓ＿（ＭＡＤ２Ｌ１）、Ｂ．２２８７２９＿（ＣＣＮＢ１）、Ａ．２１４７１０＿ｓ＿（ＣＣＮＢ１）、Ａ．２０３７５５＿（ＢＵＢ１Ｂ）、Ｂ．２２８３２３＿（ＣＡＳＣ５）、Ａ．２０４８２５＿（ＭＥＬＫ）、Ａ．２０４８２２＿（ＴＴＫ）、Ａ．２０７８２８＿ｓ＿（未知）、Ａ．２０２８７０＿ｓ＿（ＣＤＣ２０）、Ａ．２２２０３９＿（ＬＯＣ１４６９０９）、Ａ．２０４９６２＿ｓ＿（ＣＥＮＰＡ）、Ｂ．２２８２７３＿（未知）、Ａ．２０９４０８＿（ＫＩＦ２Ｃ）、Ａ．２０２７０５＿（ＣＣＮＢ２）、Ａ．２２２０７７＿ｓ＿（ＲＡＣＧＡＰ１）、Ａ．２１８５４２＿（ＣＥＰ５５）、Ａ．２０３２１３＿（ＣＤＣ２）、Ａ．２０３２１４＿ｘ＿（ＣＤＣ２）、Ａ．２１０５５９＿ｓ＿（ＣＤＣ２）、Ａ．２１８０３９＿（ＮＵＳＡＰＩ）、Ａ．２１８００９＿ｓ＿（ＰＲＣ１）、Ａ．２０４４４４＿（ＫＩＦ１１）、Ａ．２１００５２＿ｓ＿（ＴＰＸ２）、Ａ．２１９９１８＿ｓ＿（未知）、Ａ．２０３７６４＿（ＤＬＧ７）、Ｂ．２２３３０７＿（ＣＤＣＡ３）、Ａ．２０２０９５＿ｓ＿（ＢＩＲＣ５）、Ａ．２０２９５４＿（ＵＢＥ２Ｃ）、Ａ．２０２５８０＿ｘ＿（ＦＯＸＭ１）、Ａ．２１８７２６＿（ＤＫＦＺｐ７６２Ｅ１３１２）、Ａ．２０３５５４＿ｘ＿（ＰＴＴＧＩ）、Ａ．２０９６４２＿（ＢＵＢ１）、Ａ．２０９７７３＿ｓ＿（ＲＲＭ２）、Ａ．２０１８９０＿（ＲＲＭ２）、Ａ．２０４６４１＿（ＮＥＫ２）、Ａ．２１８３５５＿（ＫＩＦ４Ａ）、Ａ．２０８０７９＿ｓ＿（未知）、Ａ．２０４０９２＿ｓ＿（ＡＵＲＫＡ）、Ａ．３８１５８＿（ＳＰ１）およびＡ．２１８７５５＿（ＫＩＦ２０Ａ）。乳癌において、ＤＭＦＳ不良に有意に相関することが見出されたプローブセットのおよそ１／３が、増殖サインのメンバーであることが同定されたので、生存率不良関連遺伝子のおよそ３つに１つが、非依存性発癌機序ではなく、増殖との関連により最もよく説明できる。したがって、発明者らは、選択過程において、生存率に有意に関連し、さらに（＞０．４の）増殖サインと相関する候補遺伝子の優先順位を下げた、または考慮に入れなかった。
【０１０６】
この分析研究の妥当性を試験するために、ＴＲＩＡＧＥを、全ゲノムのＬＳＶＤにより同定された最も大きな主固有ピークに用いた。これは、約３０の遺伝子を包含する染色体１７ｑ１２の１Ｍｂ領域に対応する。このＰＥＡの遺伝子成分を、ＥＧＦＲ−関連癌遺伝子ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）に収めた、乳癌の症例の約２０〜３０％に生じることが公知である、十分に特徴づけられた１７ｑ１２アンプリコンに正確にマッピングした。特に、このアンプリコンの発現フットプリントは、すでにマイクロアレイ研究において観察されており、アレイ−ＣＧＨにより判別されるように、物理的アンプリコンの境界とよく相関することが示されている（チンら（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．）、２００６、上記；ポラックら（Ｐｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．）、２００２、上記）。このＰＥＡを示す腫瘍において、本発明者らは、免疫組織化学によりＨＥＲ２陽性の強い濃縮を見出し（Ｐ＜１．０×１０−２６；カイ二乗検定）、このＰＥＡが物理的１７ｇｌ２アンプリコンに対応する証拠と一致する（図５Ａ、図５Ｃ、黒色の垂直のバー）。初期の（任意抽出の）遺伝子生存率分析により、ＤＭＦＳに有意に関連するこのＰＥＡの中の６つの遺伝子が同定された（図５Ａ）。ＰＥＡを有する腫瘍を有する患者の不在下での生存率（すなわち選択された生存率）の再分析では、ＤＭＦＳに有意に関連する２つの遺伝子：ＴＣＡＰおよびＥＲＢＢ２のみが残った。どちらも増殖サインと強く相関しないが、ＥＲＢＢ２は最も強い発現ランキングを有した（図５Ｅ）。したがって、ＴＲＩＡＧＥにより、ＥＲＢＢ２（受容体チロシン−タンパク質キナーゼ、ｅｒｂＢ−２の前駆体をコードする）を、転移促進癌遺伝子および乳癌における治療標的としてのその公知の役割とは無関係に、１７ｑ１２遺伝子座における発癌ドライバーの「トップ候補」として同定した。
【０１０７】
ＬＳＶＤにより同定された第２の大きな主固有ピークを、１．５Ｍｂにわたる領域で２２の遺伝子を包含する、第８染色体のｐ腕にマッピングした。このＰＥＡは、乳癌の１０〜２５％に発生することが公知の、すでに記載された８ｐ１１−１２アンプリコンと遺伝子レベルで正確に重複することが見出された。（ガルシア、エム ジェイら（Ｇａｒｃｉ
ａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４、５２３５〜５２４５；ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｍｏｌ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３、６５５〜６６７；ルテシア、エーら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ６、２４５；レイ、エム イーら（Ｒａｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４、４０〜４７）。このアンプリコンの発癌ドライバーは、十分に特徴づけられていない。ＴＲＩＡＧＥによって、本発明者らは、遠隔転移の危険性の増加に有意に関連するこのアンプリコン上の３つの遺伝子：ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ１およびＷＨＳＣ１ＬＩを特定した（図５Ｂ）。選択された遺伝子−生存率の相関の分析において、遠隔転移に有意に関連する、わずか２つの遺伝子、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１およびＷＨＳＣ１ＬＩ（ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼＮＳＤ３をコードする）が残り、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１は、遠隔再発との最も有意な関連および最も高い発現ランクを有した（図５Ｅ）。この発見に基づいて、本発明者らは、乳癌の発癌特性に関するＲＡＢ１１ＦＩＰ１の機能的影響を調査した。
【０１０８】
ＲＣＰ過剰発現は、ＭＣＦ１０Ａ細胞を形質転換させる
ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（本明細書ではＲＣＰとも称する）が、乳腺腫瘍においてタンパク質レベルで増幅するかどうかを確認するために、腫瘍進行の様々な悪性度の細胞系のパネルにおいて、市販の抗体を使用して、ウェスタンブロット分析を実施した。ＲＣＰは非腫瘍発生（正常な）乳腺上皮細胞系ＭＣＦ１０Ａにおいて最も低いが、乳癌細胞系、ＣＡＭＡ−１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄにおいて４〜１０倍高いレベルで発現した（図６Ａ）。
【０１０９】
次に、乳癌におけるＲＣＰ増幅の役割を、完全長ＲＣＰ（ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ＿０２５１５１）または対照ベクターを安定して過剰発現するＭＣＦ１０Ａ細胞系を確立することによって調査した。対照細胞は、平板な形態および正常な上皮の単層成長の特徴を示すが（図６Ｂ、左のパネル）、ＲＣＰ過剰発現体は、紡錘様の突起および所々に、形質転換線維芽細胞を連想させる病巣様構造がちりばめられ散在した成長パターンを含む劇的な形態の変化をもたらした（図６Ｂ、右のパネル）。一方、対照ＭＣＦ１０Ａ細胞は、平板な形態および正常な上皮においてより特徴的な上皮型島における単層成長を示した。さらに、コンフルエントで、ＭＣＦ１０ＡＲＣＰ過剰発現細胞は、接触阻止の損失を示し、連続的な多層成長を示した。細胞の免疫蛍光染色により、ＲＣＰ過剰発現が、細胞間の接合部におけるＥ−カドヘリンの欠失およびβアクチン破壊に関連したことが明らかになった。その上、血清飢餓状態において、対照細胞より、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞により多くのフィブロネクチンが観察された（図６Ｃ）。細胞間接触部位におけるＥ−カドヘリン（上皮マーカー）の欠失およびフィブロネクチン（間葉細胞マーカー）の発現増加は、両方ともＲＣＰ−依存性上皮間葉移行（ＥＭＴ）と一致する。
【０１１０】
ＲＣＰの作用をさらに評価するために、本発明者らは、血清および追加成長因子に対する、ＭＣＦ１０Ａ細胞の厳しい要求を活用し、それらの増殖を支えた。安定系を、成長因子の存在下および不在下の両方において維持した。対照細胞と比較して、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は両方の培養条件において増殖率の有意な増加を示した（図６Ｄおよび図８Ａ）。最も興味深いことに、追加成長因子（ＥＧＦ、インスリン）を含まない、１％ＦＢＳの最も厳しい培地において、対照系は６日以内に死亡したが、一方ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は、１カ月を超えて保持でき、成長因子依存性のＲＣＰ−仲介の欠失を示した（図６Ｄ）。ヨウ化プロピジウム染色による細胞周期分析により、血清および成長因子の飢餓の４８時間後、対照細胞の９３％がＧ１期で停止していたのに対してＧ２Ｍ期の細胞はわずか３％であったが、一方、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞において、細胞の約８０％がＧ１期にあり、細胞の約１２％はＧ２Ｍ期にあることが明らかになり、細胞周期進行の調節にお
けるＲＣＰの役割が確認された（図７Ａ）。
【０１１１】
次に、軟寒天でのコロニー形成アッセイにおいて、ＭＣＦ１０Ａ細胞の足場非依存性成長を推進するＲＣＰの能力を試験した。予想通り、対照細胞は、軟寒天においてコロニー形成ができなかった。しかし、それとは大いに異なり、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は４週間後に非常に多くのコロニーを形成し、ＲＣＰが形質転換表現型を誘導できることが実証された（図６Ｅおよび図８Ｂ）。その上、本発明者らは、創傷治癒アッセイ（図６Ｆ）およびトランスウェルアッセイ（図８Ｄ）により実証されるように、ＲＣＰの過剰発現がＭＣＦ１０Ａ細胞の遊走能力を増強していることを観察した。
【０１１２】
ＲＣＰがその癌表現型に影響を与える、１つまたは複数の機序を見抜くために、ＲＣＰの発現が、発癌性成長を制御する主要経路の２つであるＥＲＫまたはＡＫＴのどちらかを介して成長シグナル伝達を活性化できるかどうかを試験した。ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は、ＥＲＫの強い活性化を示したが、ＡＫＴの活性化は示さなかった（図７Ｂ）。ＲＣＰ誘導性Ｅｒｋ活性化がＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞の増殖の有利性と関連があることを試験するために、ＭＣＦ１０Ａ細胞を、活性および不活性の両方のＭＥＫ１／２の強力な阻害因子であるＵ０１２６で処理した。対照細胞は、Ｕ０１２６濃度の範囲にわたってＥＲＫのリン酸化が低いことを示したのに対して、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞におけるＥＲＫのリン酸化状態は、濃度依存性であった（図７Ｃ）。３０μＭのＵ０１２６により、ＥＲＫのＲＣＰ誘導性リン酸化は、ベースラインまで減少し（対照と同じレベル）、一方、ＲＣＰのレベルは変化なかった。重要なのは、３０ｕＭのＵ０１２６により、ＥＲＫのリン酸化が低減したＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞が、ＲＣＰの発現が高いにもかかわらず、対照レベルまで増殖の減少を示したことである（図７Ｄ）。ＲＣＰ増殖表現型がＥＲＫのリン酸化を介してＭＡＰＫ経路の活性化に依存していることが示唆される。
【０１１３】
ＲＣＰは、多数の乳癌細胞系における腫瘍原性を増強する。
ＭＣＦ７（エストロゲン受容体陽性、ｐ５３−野生型）乳癌細胞におけるＲＣＰの過剰発現は、細胞増殖率、軟寒天におけるコロニー形成活性、および浸潤能を中程度に増加させた（図８Ａ〜Ｃ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ２３１；エストロゲン受容体陰性、ｐ５３陰性）細胞では、ＲＣＰの過剰発現は、コロニー形成活性を増加させたが、細胞増殖率、浸潤および遊走能は増加させなかった（図８Ａ〜Ｄ）。さらに腫瘍原性の調節における内因性ＲＣＰの役割を検証するために、本発明らは、ＲＮＡｉ技術を用いて内因性ＲＣＰの発現を低減した。ＲＣＰを、ｓｉＲＮＡ構築体の一過性形質移入、またはＲＣＰを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウィルスベクターの安定形質導入のどちらかによって「ノックダウン」させた。スクランブル配列を有するＲＮＡｉ構築体を、対照として使用した。ＲＣＰを対象とする非依存性かつ非重複性の、２つのｓｉＲＮＡは、ＭＣＦ７細胞において、タンパク質レベルの４０〜８０％を減少させ、細胞増殖を有意に減少させた（図８Ａ、右のパネル）。ＭＣＦ７細胞におけるＲＣＰのノックダウンもまた、軟寒天におけるコロニー形成を有意に低下させた（図８Ｂ）。ＭＢ２３１細胞において、ＲＣＰは、コロニー形成の阻害を低下させたが、細胞増殖率は低下させなかった（図８Ａ、Ｂ）。両方の細胞系において、ＲＣＰノックダウンは、浸潤および遊走を著しく低減した（図８Ｃ、Ｄ）。さらに、ＭＣＦ１０Ａ細胞における観察と一致して、ＭＣＦ７細胞におけるＲＣＰの減少もまた、ＥＲＫの脱リン酸化をもたらす（図７Ｂ）。これらの結果を合わせると、腫瘍細胞における内因性ＲＣＰの発現が、増殖、遊走および浸潤の能力の維持にとって重要であり、ＲＣＰ機能の標的低減は、実行可能な治療戦力を表し得ることを示唆している。
【０１１４】
ＲＣＰのノックダウンはｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍形成を阻害する。
ｉｎ ｖｉｖｏでの癌細胞におけるＲＣＰ低減の作用を調査するために、本発明者らは、ＲＣＰ（ＲＮＡｉ ＲＣＰ）に対するｓｈＲＮＡを安定して発現するＭＣＦ７およびＭ
Ｂ２３１細胞の腫瘍形成能と、ヌードマウスにおける対照（ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ）の腫瘍形成能とを比較した。各細胞型を、８匹のマウスの左および右の後脚上部の皮下に埋め込んだ。ＭＣＦ７は、追加のエストロゲンの存在下で、ヌードマウスにおいて中程度の悪性腫瘍を形成する、エストロゲン依存性の細胞系である。ＭＣＦ７−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ（ｎ＝８）またはＭＣＦ７−ＲＮＡｉ ＲＣＰ（ｎ＝８）を埋め込んだすべてのエストロゲン追加マウスが明らかな腫瘍を発生したが、ＲＣＰ阻害細胞は、有意により小さいサイズの腫瘍を発生した（Ｐ＝０．００００７；スチューデントｔ検定）（図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ）。一方で、ＭＢ２３１は、ヌードマウスにおいて高度悪性かつ転移性の腫瘍を形成する、エストロゲン非依存性乳癌細胞系である。ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ細胞を注入されたすべてのマウスは、大型の腫瘍を発生したが、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ ＲＣＰ細胞を注入された８匹のマウスではそのうちわずか２匹しか腫瘍を発生しなかった。（すなわち、１匹のマウスに２つの腫瘍および別のマウスに１つの腫瘍）（図９Ｄ、図９Ｅ、図９Ｆ）。特に、これらの腫瘍は対照マウスの腫瘍より非常に小型であり、平均重量は、対照のわずか１％であった。これらの腫瘍におけるＲＣＰのノックダウンを、免疫組織化学により確認した（図９Ｇ）。
【０１１５】
ＭＢ２３１細胞におけるＲＣＰのノックダウンがｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に作用しないという事実は、ｉｎ ｖｉｖｏのＲＣＰの阻害に関して観察された強い抗腫瘍作用が、血清の喪失下での細胞死の誘導に関連し得ることを示唆しており、皮下に埋め込みの腫瘍の血管新生が現れるには数日かかることを示している。したがって、本発明者らは、ＭＢ２３１安定細胞系の細胞死およびアポトーシスへの感受性を、様々な培養条件下で調査した。完全培地において、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ ＲＣＰおよび対照系は、どちらの系においてもアポトーシス細胞がほとんどないことにより証明されたように、細胞死において差がないことを示した。しかし、血清飢餓条件下において、対照は、細胞死に対する耐性を維持していたが、ＲＮＡｉ ＲＣＰ細胞は維持していなかった。有意によりＲＣＰを低減した細胞は、血清飢餓の結果として死亡し、その中でもアポトーシスが約１３％検出できた（図９Ｈ）。このことは、ＲＣＰの減少が、栄養不良環境に対するＭＢ２３１細胞の脆弱性を増強することを示唆し、これによりｉｎ ｖｉｖｏのＲＣＰノックダウンの劇的な抗腫瘍作用が説明できる。興味深いことに、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏのＲＣＰ過剰発現に関連する腫瘍原性の増加を観察せず（データ非掲載）、おそらくＲＣＰの内因性レベルにより達成される腫瘍形成に関する最大の病理学的作用を反映する。全体的に見て、結果は、ＲＣＰの標的ノックダウンにより、エストロゲン依存性および非依存性の乳房腫瘍の両方のｉｎ ｖｉｖｏ成長が抑制され、ＲＣＰが、治療介入の有益な新規の標的候補として関係があることを示している。
【０１１６】
考察
原発性腫瘍のゲノムワイドマイクロアレイ分析により、遺伝子発現の固有のパターンにより定義された、新規な臨床的に意義のある腫瘍亜型の発見が可能となった。しかし、より最近、この概念の逆が、腫瘍発生において機能的役割を有する遺伝子亜型を同定しようとするボトムアップ分析戦略を介して調査された。これらの戦略は、遺伝子発現ならびに癌の臨床的特徴およびゲノムの特徴の間の条件関係を解析する。アドラー（Ａｄｌｅｒ）および仲間は、遺伝子連鎖研究（マイクロアレイサインのステップワイズ連鎖分析）を使用して、乳癌における予測的「創傷サイン」の発現を推進する転写機序を明らかにした（アドラー、エー エスおよびチャン、エイチ ワイ（Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．）、（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５、１１４８〜１１５１）。創傷サインに関して腫瘍陽性または腫瘍陰性に有意に関連した、コピー数および遺伝子発現の両方の変化を同定することにより、著者らは、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＣＳＮ５（８ｑ１３）が機能的に相互作用し、創傷応答遺伝子の転写を制御することを推論し、生化学的に確認した。本研究において、本発明者らは、データ統合および機能的発見上にこの概念を築き、癌進行における機序的役割を有する遺伝子を推定する、相関に基づく新規
な戦略を開発した。
【０１１７】
ＴＲＩＡＧＥと呼ばれる上記の研究は、遺伝子発現の特徴と位置情報（ゲノムの位置）、臨床データ（患者の無遠隔転移生存率）および予測腫瘍生物学（増殖能）とを組み合わせ、過剰発現し、生存率に相関する再発性増幅の遺伝子部位を突き止める。ＴＲＩＡＧＥは、設計により機能的癌遺伝子のすべての型を検出するものではないが、ヒト患者において遠隔転移に寄与する悪性過程を推進する、機能的癌遺伝子を解明する可能性を有する。ＴＲＩＡＧＥはまた、癌において高い頻度で活性化される癌遺伝子および日常の療法への耐性を伴う癌遺伝子の発見を最適化する。例えば、癌遺伝子に関する本発明者らの調査は、ＬＳＶＤ手順により同定された主固有ピークの大きさにより優先順位を付ける。この大きさは、増幅事象の頻度と正に関連するので、高頻度のアンプリコン（ピークの高さに対応する）は、高い優先順位が得られる。ＬＳＶＤは、腫瘍発現プロフィールの任意の包括的コレクションに、ＴＲＩＡＧＥのロバスト適用を可能にするが、留意すベき固有の限界を有する。ＬＳＶＤは、所与の増幅事象を有する腫瘍の近似値のみを提供し、実際のアンプリコンの境界の解明は十分ではない。高解像度のアレイ−ＣＧＨにより提供されるような、対応するコピー数のデータは、アンプリコン決定の精度および正確さを改善することによって、ＴＲＩＡＧＥの性能を実質的に増強できる。
【０１１８】
ＴＲＩＡＧＥの性能に影響を与える追加の因子には、コホートサイズ、患者の追跡の期間および治療の特徴が含まれ、これらのすべては、候補遺伝子の選択に影響を与える。本発明者らの遺伝子−生存率の関連は、本発明者らの最も大きな集団に基づくコホートであるウプサラコホート（ｎ＝２５１例の患者）を使用して計算され、これはさらに、最も長く、最も完全な患者の追跡データを有する。重要なことには、このコレクションの中の腫瘍は、侵攻型の範囲（図２）が、早期乳癌から（小型径、リンパ節陰性、未処理）後期乳癌（大型径、リンパ節陽性、侵攻的に処理された）までの範囲にわたる。したがって、このコホートは、おそらく様々な癌遺伝子により推進されている様々な癌病態生理学を反映している。しかし、患者の混合された治療バックグラウンドは、治療の型に非依存性の生存率関連遺伝子の同定を有利にする。したがって、治療に依存性または２機能の生存率関連癌遺伝子（アンドレ、エフら（Ａｎｄｒｅ，Ｆ ｅｔ ａｌ．）（２００７）Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３、２０６１〜２０６７）は、このコホートでは見分けられないが、他においては同定される可能性がある。
【０１１９】
本発明者らの統合乳房腫瘍データセットのＬＳＶＤ分析は、８ｐ１１−１２の頻繁に増幅される領域に位置する遺伝子群に集中する大きな固有ピークの発見をもたらした。この遺伝子座の増幅は、乳房腫瘍症例の約１０〜２５％において観察され（アドナン、ジェイら（Ａｄｎａｎｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６、６５９〜６６３；ガルシア、エム ジェイら（Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４、５２３５〜５２４５；ルテシアら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ
ａｌ．）２００６上記、テイレット、シーら（Ｔｈｅｉｌｌｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．）（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ７、２１９〜２２６）、多数の非依存性研究において、患者の生存率不良および遠隔転移の短い間隔に関連していた（チンら（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．）、２００６、上記、；キュニー、エムら（Ｃｕｎｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０、１０７７〜１０８３；ジェルシ−ボイヤー、ブイら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３、６５５〜６６７；ルテシアら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）２００６、上記）。近年、このアンプリコンは、原発性乳房腫瘍および細胞系に関する、いくつかの集中的な機能的ゲノム研究の焦点であった（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；レイら（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。染色体８ｐに特異的な高解析度ＢＡＣマイクロアレイを使用して、
ジェルシ−ボイヤー（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ）および仲間は（２００５、上記）、８ｐ１１−１２アンプリコンが、実際は境界の明確なＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４と呼ばれる重複が最小の４つのサブアンプリコンを決定した。この研究および他の研究の著者は、遺伝子増幅とｍＲＮＡの過剰発現との間の強い相関に基づき、この領域の数多くの候補癌遺伝子を提示してきた。（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；レイら（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。累積的に、これらの研究は、ＺＮＦ７０３（ＦＬＪ１４２９９）、ＥＲＬＩＮ２（ＳＰＦＨ２）、ＰＲＯＳＣ、ＢＲＦ２、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）およびＬＳＭ１を、増幅と過剰発現との間に最も強い相関を有するとして同定し、ＬＳＭ１以外のすべては、１−Ｍｂ「最小アンプリコン」に局在し（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）、Ａ１サブアンプリコンと正確に重複する（ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）。特に、本発明者らの研究においてＬＳＶＤにより同定された遺伝子は、特にＡｌおよびＡ２サブアンプリコンからなり、したがって、これら早期の研究により記載された、すべての「最も優れた候補」癌遺伝子を含む。
【０１２０】
ＴＲＩＡＧＥの８ｐ１１−１２への適用は、患者における播種性転移を潜在的に推進する、このアンプリコンにおける最も強い候補癌遺伝子として、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）の同定をもたらした。この領域内の他の候補癌遺伝子の中でも、乳房上皮細胞において、いくつかの形質転換特性を有することがすでに示されている。（シュトライヒャー、ケイ エルら（Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、（２００７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６、２１０４〜２１１４；ヤン、ゼット キューら（Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｑ．ｅｔ
ａｌ．）、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、１１６３２〜１１６４３）、ＬＳＭ１、ＢＡＧ４およびＣ８ｏｒｆ４（ＴＣＩ）はすべて、Ａ２およびＡ３のサブアンプリコン上に主に存在する（ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）。反対に、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）は、１−Ｍｂ最小アンプリコン上のＡ１アンプリコンのコアのより近くに位置し、（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ
ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）、癌遺伝子として機能的に特徴づけられたこの領域において第１である。
【０１２１】
それらの新規な研究を使用して、本発明者らはＲＣＰの発現に連結した広範囲の癌促進作用を発見した。非癌性の乳房上皮細胞において、ＲＣＰの過剰発現は、悪性の形質転換をもたらし、細胞の運動および遊走を増加させる。乳癌細胞系において、ＲＮＡ阻害による内因性ＲＣＰの低減は、増殖、足場非依存性成長、浸潤およびアポトーシス耐性を減少させ、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を減退させた。生理的に、ＲＣＰは、主にＲａｂ１１と相互作用し、管状エンドソームにおいてタンパク質選別を制御すると考えられている（ペデンら（Ｐｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。Ｒａｂ１１−ＲＣＰ複合体は、トランスフェリン受容体をリソソームから離し（分解経路）エンドソームの再循環（再循環経路）へ導き、その結果膜結合受容体のレベルの相対的増加を促進することが示されている（ペデンら（Ｐｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。推論ではあるが、ＲＣＰの形質転換作用が再循環経路へのこの推移により仲介され得、インテグリンなどの特定の膜タンパク質または癌遺伝子の役割を有する成長因子受容体の膜への局在（およびこのような機能）を引き延ばすことは妥当と思われる。ＲＣＰ発現とＥＲＫリン酸化の間の、本発明者らが観察した強い相関は、ＲＣＰと成長因子受容体仲介ＭＡＰＫ活性化との間の特定の連結を示し得るので、この可能性を反映し得る。上記のデータは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１が、８ｐ１１−１２アンプリコンの再発性の選択の陰の鍵となる推進力を表し得、この増幅領域およびＲＡＢ１１ＦＩＰ１それ自体の発現に関連する、乳癌の転移拡散に機能的に寄与し得ることを示している。このアンプリコンが、非小細胞肺癌（バルサラ、ビー アールら（Ｂａｌｓａｒａ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７、２１１６〜２１２０）、結腸直腸癌（ナカオ、ケーら（Ｎａｋａｏ
，Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２５、１３４５〜１３５７）および膀胱の腫瘍（サイモン、アールら（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１、４５１４〜４５１９）およびファローピウス管（スナイデルス、エー エムら（Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２、４２８１〜４２８６）を含む他の固体腫瘍に頻繁に観察されていることは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１が単独または近隣の癌遺伝子との相乗効果において作用する、癌の進行へのありふれた経路を表し得ることを示唆している。
【０１２２】
この明細書における、公知文献のリストまたは考察は、必ずしもかかる公知文献が技術水準の一部である、または一般的常識であると認めるものとしてとらえるべきではない。
本発明は、本明細書中に広範にかつ一般的に記載してある。包括的開示の範囲内に入る、より狭い種および亜属の分類もまた、それぞれ本発明を形成する。これは、削除された材料を本明細書中に具体的に列挙するかどうかにかかわらず、条件付き、または任意の対象を属から除去する否定的限定を伴う、本発明の包括的記載を含む。
【０１２３】
当業者は、本発明が、目標を達成すること、内在する目的および利点と同様に本明細書で言及した目的および利点を獲得するのに適していることを、容易に理解するであろう。さらに、様々な置き換えおよび変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示した発明に対して実施できることは、当業者には容易に理解されるであろう。本明細書に記載された分子複合体および方法、手順、処理、分子、本明細書に記載された特定の化合物は、好ましい実施形態を例示する目下の典型であり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。当業者は、特許請求の範囲により定義される本発明の精神に包含される、その変更および他の使用が思い浮かぶであろう。
【０１２４】
本明細書において適切に例示的に記載された発明は、任意の、１つまたは複数の要素、本明細書に具体的に開示されなかった、１つまたは複数の限定が存在しない状況下においても実施できる。したがって、例えば、本明細書における各事例において、「有する」、「本質的に〜からなる」および「からなる」などの任意の用語は、広い意味で、限定することなく理解すべきであり、直接参照される列挙された成分だけに限定されず、他の明記されていない成分および要素もまた含む。このように、それらは相互に交換することもできる。さらに、用いた用語および表現は説明の用語として使用し、限定するものではなく、示し、記載した特徴の任意の同等物またはそれらの一部を排除したような用語または表現の使用に意図はなく、しかし、様々な変形が本発明の特許請求の範囲内で可能であることが認識される。
【０１２５】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈ群に関して記載されている場合、当業者には、本発明がＭａｒｋｕｓｈ群の任意の個々のメンバーまたは該メンバーのサブグループに関しても記載されていることが理解されるであろう。
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許商標局に２００７年４月１３日に出願され、シリアル番号６０／９１１，５７３が割り当てられた「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ，ａｒｒｅｓｔｉｎｇ ｏｒ ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ａ ｒａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」の出願を参照し、かつその優先権を主張するものである。２００７年４月１３日に出願された前記出願の内容は、ＰＣＴの規則４．１８に準じて、本願明細書に含まれないＰＣＴの規則２０．５（ａ）で言及された記載事項、特許請求の範囲または図面の任意の要素または部分の援用を含め、すべての目的で本願明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、腫瘍発生を制御する方法および腫瘍発生のリスクを診断する方法に関する。これらの方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の量の変化および／または活性の変化を利用するものである。本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成することが可能な化合物、およびＲａｂ結合タンパク質の量、発現および／または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法にも関する。本発明は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
癌は世界的に主たる死因であり、先進国では２番目の主な死因であり、さらに例えばオーストラリア、日本、韓国、シンガポールにおいて、ならびに英国およびスペインの男性人口では、第１番目の死因である。毎年癌を発症する人の数は増大している。それにもかかわらず、癌療法は最近３０年間で癌死亡率を低下させることができていない。
【０００４】
組織浸潤および転移をもたらす自律的細胞増殖は、すべての悪性新生物の顕著な特徴である。癌は必ずしも加速的速度の細胞増殖の結果としてのみ生じるわけではなく、癌は、一方では細胞周期進行（細胞分裂）および細胞増殖（細胞増大）の速度と、他方ではプログラムされた細胞死（アポトーシス）の速度との間の不均衡の結果である。
【０００５】
腫瘍発生および転移増殖の発癌誘導因子の同一性を解明することは、癌の病理生物学を理解するためだけでなく、患者を治療するためにも重要である。というのは、このような遺伝子は、治療的有効性（ヘルセプチン、アバスチン、グリーベック）のためにますます活用されているからである。ヒトの癌では、ゲノム増幅、配列突然変異またはプロモーターの低メチル化から生じる異常な過剰発現によって癌遺伝子が活性化されることが多い。アンプリコンとして知られる、癌において増幅されることが多い染色体上の遺伝子座は、１つまたは複数の癌遺伝子によって誘導されると考えられ、多くの反復アンプリコンが観察されているが、それらの癌遺伝子決定因子は依然として大部分が知られていない。これらの遺伝子座は、コピー数増大の程度および頻度を評価する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの細胞遺伝学的技法によって伝統的に調べられており、この戦略は考慮対象の多くの遺伝子候補を与えるが、遺伝子リストが広範囲であり、かつ機能情報がわずかであるため、癌遺伝子の発見に対する進展は限られている。それよりも、大抵は異なる実験背景における遺伝子機能の累積的観察結果から導かれる仮説の生成によって決まるため、癌遺伝子の発見は緩慢で実験プロセスとなることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、腫瘍発生の予防を含めた腫瘍発生を制御する手段、および発癌性になる素因を有する細胞を同定する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることを含む、腫瘍発生を制御する方法を提供する。本発明は、転移性癌などの癌を含む、新生芽腫の治療、予防および診断の方法も提供する。
【０００８】
１つのこのような方法は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質（Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質）の量または活性を調節することを含む。
本発明のさらなる方法は、発癌性になる素因を有する１つまたは複数の細胞を同定することに関する。方法は、１つまたは複数の細胞において、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量の変化、細胞内局在の変化、または活性の変化を検出することを含む。
【０００９】
本発明は、新生物を発症するリスクを診断する方法も提供する。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現レベル、活性レベルおよび細胞内局在の少なくとも１つを決定することを含む。
【００１０】
本出願は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性を調節することができ、したがって例えば抗癌剤として作用することができる、適切な化合物の同定にも関する。
【００１１】
これに関し、本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質と複合体を形成することが可能な化合物を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。方法は、各複合体を形成する構成要素を互いに接触させることを含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでＲａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性を調節することが可能な化合物を同定するための方法を提供する。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質またはその機能断片を発現する微生物を提供することを含む。方法は、微生物に化合物を加えることをさらに含む。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の細胞表現型または活性の変化をモニターすることも含む。
【００１３】
他の態様において、本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質、特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法を提供する。
１つのこのような方法は、宿主生物を提供することを含む。宿主生物は、癌細胞を収容し増殖させることができる。方法は癌細胞を宿主生物に導入することも含む。さらに方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および／または活性を調節し得ると考えられる化合物を投与することを含む。方法は、宿主生物中の任意の腫瘍（複数の腫瘍を含む）の増殖をモニターすることをさらに含む。
【００１４】
さらなるこのような方法は、宿主生物を提供することも含む。宿主生物は癌細胞を収容し増殖させることができる。方法は癌細胞を宿主生物に導入することも含む。癌細胞は、Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節し得ると考えられる化合物を含む。方法は、宿主生物中の任意の腫瘍（複数の腫瘍を含む）の増殖をモニターすることをさらに含む。
【００１５】
他のさらなる態様において本発明は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法を提供する。方法は、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および／または活性を決定することを含む。Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大は、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す。
【００１６】
本発明は、限定されない実施例および添付の図面と併せて検討した場合、詳細な説明に関してさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＴＲＩＡＧＥ方法論の複数工程の略図。
【図２】統合されたマイクロアレイのデータセットを構築するために使用された乳癌コホートの臨床的特徴を示す表。
【図３】乳癌の癌ゲノムのＬＳＶＤ分析の図。固有値（ｙ軸）を、各染色体（ｘ軸）の長さに沿ってプロットする。最も高いスコアを得た主固有ピークのゲノムの位置を強調してある。
【図４Ａ】図４は、増殖サインおよび無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）を示す。図４Ａは、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）コホート（ｎ＝２５１）におけるＤＭＦＳ不良（Ｐ＜０．０５；尤度比検定）と相関した全プローブセット（ｎ＝２，３７７）が、階層的にクラスタ化されたことを示す図。優性遺伝子のクラスタは、増殖サインを反映する。増殖サインの中核遺伝子を、クラスタ化の順番に以下の実施例において名付ける。クラスタグラムの下に、転移した腫瘍（白マル）および転移しなかった腫瘍（黒マル）を時間の関数として示す。
【図４Ｂ】ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）コホート（ｎ＝２５１）におけるＤＭＦＳ不良（Ｐ＜０．０５；尤度比検定）と相関した全プローブセット（ｎ＝２，３７７）が、階層的にクラスタ化されたことを示す図。優性遺伝子のクラスタは、増殖サインを反映する。増殖サインの中核遺伝子を、クラスタ化の順番に以下の実施例において名付ける。クラスタグラムの下に、移した腫瘍（白マル）および転移しなかった腫瘍（黒マル）を時間の関数として示す。
【図４Ｃ】ＤＭＦＳ不良（ｎ＝２，３７７）に関連するプローブのセットを、Ｐ値に従ってビン分割し、＞０．４の増殖サインに相関するプローブセットの分画を白で示し、各ビンのパーセントを示す図。全ＤＭＦＳ関連プローブセットのおよそ３５％が、＞０．４の増殖サインと相関する。
【図５Ａ】図５は、１７ｑ１２および８ｐ１１のアンプリコンのＴＲＩＡＧＥ分析を示す。図５Ａは、１７ｑ１２における推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）の発現ヒートマップを示す図。腫瘍をカラムに配置し、ＬＳＶＤにより同定した遺伝子を列の中で体系化する（染色体に沿った順番で）。腫瘍を、固有重量の絶対値によりランク付けする（ヒートマップの下に記載）。平均発現より上を白で示す。ＴＲＩＡＧＥの第３工程において、生存率に有意に関連する遺伝子を右に示す（図１を参照）。白い文字で示された遺伝子（ＴＣＡＰおよびＥＲＢＢ２）は、ＴＲＩＡＧＥによる、最も有力な癌遺伝子候補を示す。
【図５Ｂ】８ｐ１１における推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）の発現ヒートマップを示す図。腫瘍をカラムに配置し、ＬＳＶＤにより同定した遺伝子を列の中で体系化する（染色体に沿った順番で）。腫瘍を、固有重量の絶対値によりランク付けする（ヒートマップの下に記載）。平均発現より上を白で示す。ＴＲＩＡＧＥの第３工程において、生存率に有意に関連する遺伝子を右に示す（図１を参照）。白い文字で示された遺伝子（ＲＡＢ１１ＦＩＰ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１）は、ＴＲＩＡＧＥにより、最も有力な癌遺伝子候補を示す。
【図５Ｃ】図５Ａと同じデータを、平均発現より下を白く示して表した図。
【図５Ｄ】図５Ｂと同じデータを、平均発現より下を白く示して表した図。
【図５Ｅ】得られたデータを要約した図。ＮＳは、「有意差なし」を示唆する。アスタリスクは、増殖サインとの相関が＞０．４であることを示す。パネルＡのヒートマップの上の黒色の垂直なバーは、免疫組織化学によるＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）陽性を表す。
【図６Ａ】図６は、ＭＣＦ１０Ａ細胞においてＲＣＰの過剰発現が癌表現型を誘導することを示す。図６Ａは、ＭＣＦ１０Ａおよび乳癌の細胞系において、ウェスタンブロットにより評価した内因性ＲＣＰのレベルを示す図。
【図６Ｂ】ＲＣＰ過剰発現の、細胞形態学における影響の図（スケールバー、１００μｍ）。
【図６Ｃ】免疫蛍光法による、細胞間接合部のＥ−カドヘリンの局在化（上）、Ｆ−アクチンの組織化（中）および血清飢餓下のフィブロネクチンの発現（下）の、ＲＣＰ過剰発現の影響の図（スケールバー、５０μｍ）。
【図６Ｄ】ＷＳＴアッセイによるＭＣＦ１０Ａ細胞の成長因子非依存性増殖に関するＲＣＰ過剰発現の影響の図（平均＋／−標準偏差）。
【図６Ｅ】軟寒天における、足場非依存性コロニー形成に関するＲＣＰ過剰発現の影響の図（倍率、×５）。
【図６Ｆ】創傷治癒（擦過傷）アッセイによる細胞遊走に関するＲＣＰ過剰発現の影響の図（スケールバー、１００μｍ）。
【図７Ａ】図７は、ＲＣＰの作用機序を示している。図７Ａは、フローサイトメトリーによる、血清飢餓ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞および対照細胞の細胞周期分析の図。
【図７Ｂ】ウェスタンブロットにより示された、ＲＣＰ過剰発現（ＭＣＦ１０Ａ細胞）に反応したＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化状態およびＲＣＰ（ＭＣＦ７細胞）のＲＮＡｉ仲介ノックダウンの図。
【図７Ｃ】ＭＡＰＫ阻害剤であるＵ０１２６によるＲＣＰ仲介Ｅｒｋリン酸化阻害の図（上のパネル）およびＲＣＰ増殖表現型のＵ０１２６仲介阻害の図（下のパネル、平均＋／−標準偏差）。
【図８Ａ】図８は、乳癌細胞系におけるＲＣＰの癌遺伝子表現型を示す。図８Ａは、ＷＳＴアッセイによる、細胞増殖に関する、ＲＣＰ過剰発現およびＲＣＰのＲＮＡｉ仲介ノックダウンの影響の図。左のパネル、形質移入６日後の結果。中のパネル、ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＲＣＰ過剰発現の増殖時間経過。右のパネル、２種の異なるＲＮＡｉ ＲＣＰ構築体および（スクランブル配列の）対照を使用する、ＭＣＦ７細胞におけるＲＣＰ阻害の増殖時間経過。
【図８Ｂ】軟寒天における、足場非依存性コロニー形成に関するＲＣＰの過剰発現および阻害の影響の図。
【図８Ｃ】マトリゲルを介した、細胞浸潤に関するＲＣＰの過剰発現および阻害の影響の図。
【図８Ｄ】細胞遊走に関するＲＣＰの過剰発現および阻害の影響の図。すべてのエラーバーは、平均＋／−標準偏差＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定（両側）から計算した。
【図９Ａ】図９は、ＲＣＰが、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を制御することを示している。図９Ａは、ＭＣＦ７細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。時間の関数としてプロットした、平均腫瘍容量を表す（平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図９Ｂ】ＭＣＦ７細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。５週（ＭＣＦ７）および７週（ＭＢ２３１）における重量をプロットした腫瘍を表す。平均重量は実線により示した。
【図９Ｃ】ＭＣＦ７細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。切除された全腫瘍を示す。
【図９Ｄ】ＭＢ２３１細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。時間の関数としてプロットした、平均腫瘍容量を表す（平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図９Ｅ】ＭＢ２３１細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。５週（ＭＣＦ７）および７週（ＭＢ２３１）における重量をプロットした腫瘍を表す。平均重量は実線により示した。
【図９Ｆ】ＭＢ２３１細胞を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に関するＲＣＰ阻害の影響の図。切除された全腫瘍を示す。
【図９Ｇ】腫瘍試料中のＲＣＰの免疫組織化学的染色を表す図（スケールバー、１００μｍ）。
【図９Ｈ】ＴＵＮＥＬ染色による、血清飢餓ＭＢ２３１細胞のＲＣＰ阻害のアポトーシス効果を示す図（スケールバー、１００μｍ）。
【図１０】増殖サインの由来を表す図。細胞周期制御遺伝子（ヒーラ細胞において）として、ウィットフィールドら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．）（（２００２）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ、１３、１９７７−２０００）により同定された１，１３４ＩＭＡＧＥクローンを、２，１１３ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセット（Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂ）に対応させて、８８４の ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ（ｂｕｉｌｄ ＃１８７）にマッピングした。これらのプローブセットを使用して、ウプサラ腫瘍コホート（ｎ＝２５１）の発現プロフィールを、階層的にクラスタ化し（ピアソンの相関、平均連結法）、固有クラスタグラムのヒートマップにおいて視覚化した（左側）。図１０Ａにおける白いシグナルは、平均発現より上を示し、図１０Ｂにおける白いシグナルは、平均発現より下を表す。明るさのそれぞれの程度は、発現の大きさを反映している。（紙面に限りがあるため、遺伝子の系統樹は省略した）。暗いバーは、ヒト乳癌の増殖に関連するとして、ウィットフィールド（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ）およびペロー（Ｐｅｒｏｕ）によってすでに同定されたＧ２／Ｍにおいて大部分が発現する遺伝子のクラスタを示す。増殖クラスタの６７の遺伝子に対応する７８のプローブのセットは、＞０．８の平均相関（白いバーで示されている）を有し、正しい階層的クラスタ化が示されている。これらのプローブセット（右側）は、コア増殖サイン遺伝子として示されており、全プローブセットと、増殖サインとのピアソン相関を導くために平均した（すなわち、ＴＲＩＡＧＥの第６の工程）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、Ｒａｂ結合タンパク質、および特にＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質（Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質）が、腫瘍、および特に癌を含む、新生物の形成を促進することができるという、驚くべき発見に基づく。
【００１９】
本発明者らは、反復増幅のゲノム部位の遺伝子の病態生理学的関与は、ゲノム位置、遺伝子発現および臨床データの統合および三角測量によって高い解明能力で推測することができ、三角測量は遺伝子発現と腫瘍攻撃性の臨床測定の間の統計学的関係を引き出すことができると仮定した。この目的のために、多段階のデータマイニング戦略を開発し、癌遺伝子としてのＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発見に至った。本発明の方法はこの発見に基づく。
【００２０】
本発明者らのこの発見は、ＲＡＢ１ｌＦＩＰのタンパク質をコードする遺伝子の局在と、癌の確率の増大との関係に関して報告されたデータの説明も示す。例えば、ヒトＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１５６６７５）は、第８染色体上、ｐ１２領域中、位置３７、８３５、６２８〜３７、８７６、１６１に見られる。同様に、マカクザルＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００３２１３）は、第８染色体上、位置３８、３０９、７５２〜３８、３４９、８２４に見られる。イヌＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＣＡＦＧ０００００００６１７６）は、第１６染色体上、位置３０、４５６、３８５〜３０、４８４、４４１に見られる。ニワトリＲＡＢ１１ＦＩＰ１遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのアクセッション番号ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００３１２９）は、第２２染色体上、位置２、２５８、７３８〜２、２６７、８３０に見られる。いくつかの分析済みの乳癌において、ヒト染色体領域８ｐ１２が増幅されることが以前に示されている（レテジアー、エーら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６、１〜１３ページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐｄｆ／１４７１−２４０７−６−２４５．ｐｄｆで入
手可能）。第８染色体の短いアームの消失、増大、増幅および再配列も、１組の乳、結腸および膵臓癌細胞系中で見られることが示されている（ポール、ジェイ シー エムら（Ｐｏｌｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２５、５６９３〜５７０６ページ）。外科的切除を施された患者における、ヒト染色体領域８ｐ１２の変化と肺癌の間の相関関係が観察されてきている（キム、ティー−エムら（Ｋｉｍ，Ｔ．−Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１、２３、８２３５〜８２４２ページ）。比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用して、遺伝子の遺伝子座における増幅および欠失が、膵臓および肺癌亜型において起こることも示された（トノン、ジーら（Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０２、２７、９６２５〜９６３０ページ）。同じ遺伝子座におけるコピー数の消失は、複数の患者から得た結腸癌試料においても観察された（ヤギヌマ、ワイら（Ｙａｇｉｎｕｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４、４、３９０〜３９６ページ）。
【００２１】
Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質（ＦＩＰ）タンパク質は、Ｃ末端またはその近辺に位置する相同的Ｒａｂ１１結合ドメインを共有する（例えば、ヘイルズ、シー エムら（Ｈａｌｅｓ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６、４２、３９０６７〜３９０７５ページを参照）。それらのドメイン構造に基づいて、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質は、クラスＩ（ＦＩＰ５／Ｒｉｐ１１、ＦＩＰ１およびＦＩＰ２）およびクラスＩＩ（ＦＩＰ３／エフェリン、およびＦＩＰ４）の２つのサブファミリーに分けられている。したがって、本明細書で使用する用語「Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質」は、Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質のファミリーの任意のメンバー、特にＲａｂ１１ＦＩＰ１、Ｒａｂ１１ＦＩＰ２、Ｒａｂ１１ＦＩＰ３（エフェリン）、Ｒａｂ１１ＦＩＰ４、Ｒａｂ１１ＦＩＰ５（Ｒｉｐ１１）、およびそれらのアイソフォームを指す。
【００２２】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ１タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０５Ａ５８（Ｑ０５Ａ５８＿マウス）、Ｑ８Ｋ０２８（Ｑ８Ｋ０２８＿マウス）、Ｑ６ＷＫＺ４（ＲＦＩＰ１＿ヒト）、Ｑ９Ｄ６２０（ＲＦＩＰ１＿マウス）、Ｑ３Ｂ７Ｔ９（ＲＦＩＰ１＿ラット）、Ｑ６ＫＡＮ５（Ｑ６ＫＡＮ５＿マウス）、Ｑ３０７Ｔ１（Ｑ３０７Ｔ１＿ヒト）、Ｑ２８ＢＬ８（Ｑ２８ＢＬ８＿ＸＥＮＴＲ）、（ニシツメガエル由来）、Ａ４ＩＨＬ６（Ａ４ＩＨＬ６＿ＸＥＮＴＲ）（ニシツメガエル由来）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１５６６７５（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３１４８８（マウス）、ＥＮＳＰＴＲＧ００００００２０１６４（チンパンジー）、ＥＮＳＰＰＹＧ００００００１８５１５（オランウータン）、ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００３２１３（アカゲザル）、ＥＮＳＣＡＦＧ０００００００６１７６（イヌ）、ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００３１２９（ニワトリ）、ＥＮＳＭＯＤＧ００００００１０８１３（ハイイロジネズミオポッサム）、ＥＮＳＭＬＵＧ０００００００７４７２（ホオヒゲコウモリ属）、ＥＮＳＭＩＣＧ００００００１０１７４（ハイイロショウネズミキツネザル）、ＥＮＳＯＣＵＧ０００００００４５０２（ウサギ）、ＥＮＳＣＰＯＧ０００００００８２９８（モルモット）、ＥＮＳＥＴＥＧ０００００００７０４４（マダガスカルモヘアハリネズミ）、ＥＮＳＥＣＡＧ００００００１６１３４（ウマ）、ＥＮＳＯＡＮＧ０００００００３０３０（カモノハシ）、ＥＮＳＯＰＲＧ００００００１０８６０（アメリカナキウサギ）、ＥＮＳＳＴＯＧ０００００００５５６５（ジュウサンセンジリス）、ＥＮＳＤＮＯＧ０００００００８２９９（ココノオビアルマジロ）、ＥＮＳＬＡＦＧ０００００００４２５０（アフリカサバンナゾウ）、ＥＮＳＯＧＡＧ０００００００５７３７（コビトガラゴ）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＤＱ２３６３４２（ヒト）、ＢＣ１２５４００（マウス）、ＢＣ１３２０９４（マウス）、ＢＣ０３４２０１（マウス）、ＢＣ０７７７２０（ヒト）、ＣＸ０７８６０７（アカゲザル）、Ｄ
Ｒ００５３３９（ヒト）、ＢＣ１３５５８０（ニシツメガエル）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ３４２０１（マウス）、ＡＡＩ２５４０１（マウス）、ＡＡＩ３２０９５（マウス）、ＡＢＢ４３１６１（ヒト）、ＡＡＨ７７７２０（ヒト）、ＥＡＷ６３３４９（ヒト）、ＥＡＷ６３３４７（ヒト）、ＥＡＷ６３３４８（ヒト）、ＡＡＩ３５５８１（ニシツメガエル）およびＣＡＪ８１４５９（ニシツメガエル）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２３】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ２タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＨＺＩ０（Ｑ５ＨＺＩ０＿マウス）、Ｑ７Ｌ８０４（ＲＦＩＰ２＿ヒト）、Ｑ３Ｕ３６６（Ｑ３Ｕ３６６＿マウス）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＭＵＳＧ００００００４００２２（マウス）、ＥＮＳＧ０００００１０７５６０（ヒト）、ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００９３０４（ニワトリ）、ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００２９８２（チンパンジー）、ＥＮＳＭＯＤＧ０００００００９３８５（ハイイロジネズミオポッサム）、ＥＮＳＸＥＴＧ０００００００９５４１（ニシツメガエル）、ＥＮＳＭＭＵＧ００００００２１８０５（アカゲザル）、ＥＮＳＣＡＦＧ００００００１１９９１（イヌ）、ＥＮＳＰＰＹＧ０００００００２６９２（オランウータン）、ＥＮＳＥＥＵＧ０００００００６６５１（ナミハリネズミ）、ＥＮＳＭＬＵＧ００００００１５２００（ホオヒゲコウモリ属）、ＥＮＳＭＩＣＧ０００００００１９７６（ハイイロショウネズミキツネザル）、ＥＮＳＯＣＵＧ０００００００９２４１（ウサギ）、ＥＮＳＣＰＯＧ００００００００４５３（モルモット）、ＥＮＳＥＴＥＧ００００００１９２９４（マダガスカルモヘアハリネズミ）、ＥＮＳＥＣＡＧ００００００１９７９１（ウマ）、ＥＮＳＳＡＲＧ０００００００１７９４（ヨーロッパトガリネズミ）、ＩＧＩ０００１４３７６（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）、ＩＧＩ０００３１１４５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）およびＩＧＩ０２６９９３０８（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ウシ）の遺伝子、および例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＢＣ０８９０１０（マウス）、ＢＣ０７５０７３（ヒト）、ＢＣ０７５０７４（ヒト）およびＤＮ９９４２５４（ヒト）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ８９０１０（マウス）、ＥＡＷ４９４２３（ヒト）、ＡＡＨ７５０７３（ヒト）およびＡＡＨ７５０７４（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２４】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ３タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ７５１５４（ＲＦＩＰ３＿ヒト）、Ｑ８ＪＺＴ３（Ｑ８ＪＺＴ３＿マウス）、Ａ２ＩＤＥ０（Ａ２ＩＤＥ０＿ヒト）、Ａ２Ａ２Ｇ１（Ａ２Ａ２Ｇ１＿ヒト）、Ａ２ＩＤＤ９（Ａ２ＩＤＤ９＿ヒト）、Ａ２Ａ２Ｇ０（Ａ２Ａ２Ｇ０＿ヒト）、およびＱ８ＣＨＤ８（Ｑ８ＣＨＤ８＿マウス）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＧ００００００９０５６５（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３７０９８（マウス）、ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００７５４３（チンパンジー）、ＥＮＳＭＭＵＧ００００００００６１３、ＩＧＩ０００１０３３２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）およびＩＧＩ０００８７０９２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ニワトリ）、ＩＧＩ０００２６４７２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＬ０４９５４２（ヒト）、Ｚ９８８８２（ヒト）、ＢＣ０２３３６４（マウス）、ＢＣ０３７１３２（マウス）、ＢＣ０５１３６０（ヒト）、およびＡＬ０２３８８１（ヒト）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ２３３６４（マウス）、ＡＡＨ３７１３２（マウス）、ＣＡＩ９５７８８（マウス）、ＣＡＩ９５５９１（ヒト）、ＣＡＩ９５５９３（ヒト）、ＣＡＭ２６３８２（ヒト）、ＣＡＭ２６３８３（ヒト）、ＣＡＱ０９６４３（ヒト）、ＣＡＱ１１００３（ヒト）、ＣＡＭ２８３７４（ヒト）、ＡＡＨ５１３６０（ヒト）、ＥＡＷ８５８０５（ヒト）、ＥＡＷ８５８０６（ヒト）、ＥＡＷ８５８０７（ヒト）、ＥＡＷ８５８０８（ヒト）、ＥＡＷ８５８０９（ヒト）、およびＥＡＷ８５８１０（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２５】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ４タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＤＧＩ２（Ｑ６ＤＧＩ２＿ＢＲＡＲＥ）、Ｑ８６ＹＳ３（ＲＦＩＰ４＿ヒト）、Ｑ８ＢＱＰ８（ＲＦＩＰ４＿マウス）、Ｑ５ＳＹＨ４（Ｑ５ＳＹＨ４＿マウス）、Ｑ３ＬＧＤ４（Ｑ３ＬＧＤ４＿ＢＲＡＲＥ）、Ｑ３Ｕ４Ｒ６（Ｑ３Ｕ４Ｒ６＿マウス）およびＱ３ＬＧＤ３（Ｑ３ＬＧＤ３＿ＢＲＡＲＥ）の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＤＡＲＧ００００００５３８５５（ゼブラフィッシュ）、ＥＮＳＧ０００００１３１２４２（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００１７６３９（マウス）、ＥＮＳＭＯＤＧ００００００１９２０９（ハイイロジネズミオポッサム）、ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００８９７４（チンパンジー）、ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００８１２７（アカゲザル）、ＥＮＳＯＣＵＧ０００００００７４４３（ウサギ）、ＥＮＳＭＬＵＧ００００００１６４０７（ホオヒゲコウモリ属）、ＥＮＳＣＰＯＧ００００００１１６３４（モルモット）、ＩＧＩ０００１３０２５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）、ＩＧＩ０００２９７５０（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）、ＩＧＩ０２６９３０３５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ゼブラフィッシュ）およびＩＧＩ０００５１４１０（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ゼブラフィッシュ）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＢＣ０７６３６３（ゼブラフィッシュ）、ＢＣ０９３９１４（ヒト）、ＢＣ１０１５１７（ヒト）、ＡＬ５９１１７４（マウス）、ＢＣ１３５９８９（ニシツメガエル）およびＤＲ０００７０１（ヒト）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ７６３６３（ゼブラフィッシュ）、ＡＡＩ３５９９０（ニシツメガエル）、ＣＡＩ２４８３３（マウス）、ＣＡＩ２４８３６（マウス）、ＥＡＷ８０２６５（ヒト）、ＡＡＩ０１５１８（ヒト）およびＡＡＨ９３９１４（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２６】
Ｒａｂ１１ＦＩＰ５タンパク質の例には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＺＱ３３（Ｑ６ＺＱ３３＿マウス）、Ｑ９ＢＸＦ６（ＲＦＩＰ５＿ヒト）、Ｑ８Ｒ３６１（ＲＦＩＰ５＿マウス）およびＱ３ＵＭ８５＿マウスの、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３５６３１（ヒト）、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００５１３４３（マウス）、ＥＮＳＧＡＬＧ００００００１６０９２（ニワトリ）、ＥＮＳＢＴＡＧ０００００００６１６２（ウシ）、ＥＮＳＸＥＴＧ００００００１１７８１（ニシツメガエル）、ＥＮＳＯＣＵＧ００００００００８４０（ウサギ）、ＮＳＰＴＲＧ００００００１２０５７（チンパンジー）、ＥＮＳＭＭＵＧ０００００００２３０１（アカゲザル）、ＥＮＳＯＧＡＧ０００００００９１５０（コビトガラゴ）、ＥＮＳＥＣＡＧ０００００００７０８４（ウマ）、ＩＧＩ０００３５６４２（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、マウス）およびＩＧＩ００００６０７５（Ｉｎｔｅｇｒ８データベース、ヒト）の遺伝子、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＤＱ８９０９９１（ヒトクローンの合成構築体）、ＤＱ８９４１６８（ヒトクローンの合成構築体）、ＢＣ０３５０１３（ヒト）、ＢＣ０２６４７３（マウス）、ＢＣ０４４８３３（マウス）、ＢＣ０５１０６３（マウス）、ＤＲ７７０９４２（ベンガルザル）の核酸配列を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ＡＡＨ２６４７３（マウス）、ＡＡＨ４４８３３（マウス）、ＡＡＨ５１０６３（マウス）、ＡＢＭ８１９１７（合成構築体）、ＡＢＭ８５０９４（合成構築体）、ＡＡＨ３５０１３（ヒト）、ＥＡＷ９９７５０（ヒト）、ＥＡＷ９９７４９（ヒト）およびＥＡＷ９９７５１（ヒト）のコード配列を含むタンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００２７】
Ｒａｂファミリーの低分子ＧＴＰアーゼタンパク質は、細胞内膜輸送、シグナル変換、受容体リサイクリングおよびエフェクタータンパク質の細胞膜への動員を含めた、細胞活性の制御において重要な役割を有することが知られている。したがって同様の役割が、Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質などのＲａｂファミリー相互作用タンパク質によるものと考えられている。Ｒａｂ１１−ＦＩＰ３は例えば、エンドソーム循環区画の機能
において重要な役割を果たすことが示されている（例えば、ホーガン、シー ピーら（Ｈｏｒｇａｎ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００７）、Ｔｒａｆｆｉｃ、８、４１４〜４３０ページを参照）。
【００２８】
Ｒａｂタンパク質は、細胞骨格編成および細胞形態、細胞質分裂、小胞輸送および分泌、細胞周期進行および細胞分化を含めた広範囲の基本的細胞機能を制御する、Ｒａｓ関連低分子Ｇタンパク質（Ｒｈｏ関連タンパク質を含む）のさらに大きなファミリーに属する。いくつかのこれらのタンパク質ならびにそれらのレギュレーターおよびエフェクターは、発癌現象および癌の進行に関与している。これらのうち、乳癌および卵巣癌において頻繁に増幅されるＲＡＢ２５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖およびアポトーシス耐性を高め、かつｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍形成を高めることが示されている。ＲＡＢファミリーのタンパク質は膜輸送およびオルガネラ区画化において中心的役割を果たし、ＲＡＢ１１、ＲＣＰの主な結合パートナーは、膜タンパク質のリサイクリングに特に関係している。ＲＡＢ１１は細胞移動に関与しており、ＲＡＢ１１経路の混乱は異なる細胞型において移動を害する（ジョーンズ、エム シーら（Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８、５４９〜５５７ページ；ポウェルカ、エー エムら（Ｐｏｗｅｌｋａ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｔｒａｆｆｉｃ ５、２０〜３６ページ；ユーン、エス オーら（Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、２７６１〜２７６９ページ）。さらに、ＲＡＢ１１機能の拮抗的阻害は乳癌細胞の低酸素誘導侵襲性を低下させ（ユーンら（Ｙｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）、インテグリンα６β４、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＲ２およびＰＫＣαなどの侵襲と関係がある膜受容体の輸送を変える（ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．）、２００６、上記）。ＲＡＢ遺伝子発現の異常調節は多くのヒト腫瘍の一般的要素として関与する。しかしながら、腫瘍進行中のＲａｂ相互作用タンパク質の役割は研究されていない。
【００２９】
本発明者らは、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の発現と関係がある広範囲の癌促進効果を確認している。非癌性乳房上皮細胞では、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の過剰発現は、悪性形質転換、ならびに増大した細胞死亡率および移動をもたらした。乳癌細胞系では、ＲＮＡ阻害による内因性Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の弱化は、増殖、足場非依存性増殖、侵襲およびアポトーシス耐性を低減し、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を低下させた。生理学上、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１は主にＲａｂ１１と相互作用して、管状エンドソームにおけるタンパク質の選別を制御すると考えられる（ピーデン、エー エーら（Ｐｅｄｅｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １５、３５３０〜３５４１ページ）。Ｒａｂ１１−Ｒａｂ１１ＦＩＰ１複合体は、トランスフェリン受容体をリソソーム（分解経路）からリサイクリングエンドソーム（リサイクリング経路）にチャンネル移動させ、それによって膜結合受容体のレベルの相対的増大を促進することが示されている（ピーデンら（Ｐｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。推測的ではあるが、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１の形質転換効果はリサイクリング経路へのこの移動によって仲介され、癌遺伝子的役割を有するインテグリンまたは増殖因子受容体などの、特定の膜タンパク質の膜局在（したがって機能）を延長する可能性があることは妥当である。本発明者らが観察したＲａｂ１１ＦＩＰ１の発現とＥＲＫのリン酸化の間の強い相関関係はこの可能性を反映し得る。というのは、それは、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１（以下ではＲＣＰとも名付ける）と増殖因子受容体仲介ＭＡＰＫ活性化の間の特異的関係を示し得るからである。
【００３０】
理論によって縛られるわけではないが、本発明者らによって得られた免疫沈降データ（示さず）は、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１と低分子ＧＴＰアーゼＲａｓの間に直接的相互作用が存在することを示し、この２つのタンパク質間の複合体の形成を示す。Ｒａｓタンパク質は、アポトーシス、細胞増殖、および癌におけるそれらの中心的役割が当該技術分野で知られている低分子モノマータンパク質のファミリーである。少なくとも１１個の異なる機能
クラスのタンパク質が、Ｒａｓタンパク質のエフェクターであることが示されている。したがって、Ｒａｓタンパク質は複合体シグナル相互作用ネットワークの中心に位置し、その中でＲａｓタンパク質は、少なくとも３つの重複および共同タンパク質キナーゼカスケード、すなわちＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ、ＲａｌＧＴＰアーゼ、およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを活性化すると考えられる。１つのランダムに選択したさらなる例示例として、それらはＲｂ／Ｅ２ＦおよびＤｎｍｔ−１を介して作用し、それによって腫瘍細胞増殖を活性化するｐ１６の不活性化などのメチル化による後成的変化を引き起こす。次いでｒａｓタンパク質は複雑な制御機構に曝される。点突然変異したＲａｓ遺伝子は様々な腫瘍の３分の１で頻繁に発見され、Ｒａｓ遺伝子は癌遺伝子であることが知られている。
【００３１】
本発明によるいくつかの方法は、腫瘍発生を制御する方法である。これらの方法は、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる個々の方法を含む。腫瘍発生は例えば、悪性型の癌腫の形成を含めた発癌現象であってよい。したがって、例えば、本発明の方法は、癌などの増殖性疾患または障害の治療または予防に含まれ得る。
【００３２】
本発明の方法を使用して、例えば哺乳動物、魚類、両生類、鳥類または微生物を含めた任意の生物において、腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることができる。いくつかの実施形態では、それぞれの微生物は細胞である。このような細胞は、直接採取またはそこからの単離を含めて、哺乳動物などの例えば前述の例の１つなどの生物から得ることができる。適切な哺乳動物の例には、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、オポッサム、イヌ、ネコ、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、オランウータン、ウシ（メウシ）、マーモセット、アメリカナキウサギ、ガラゴ（「コビトガラゴ」）、リス、ココノオビアルマジロ、ゾウおよびヒトがあるが、これらだけには限られない。細胞は、従来の細胞系、例えば癌細胞系の細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞を培養する。他の実施形態では、それぞれの細胞は、例えば前述の例の１つなどの生物の一部分に含まれ得る。
【００３３】
本発明による方法のいくつかの実施形態は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の量を調節することを含む。Ｒａｂ結合の量の調節は、細胞中、試験管などのｉｎ ｖｉｔｒｏ設定中、または生物中に存在するＲａｂ結合タンパク質分子の全数の一部分を分解状態にすることを含むことができる。Ｒａｂ結合タンパク質の分解は、例えば（カルシウム活性化プロテアーゼまたはカルパインとも呼ばれる）カルパインプロテアーゼなどのプロテアーゼによって実施することができる。例示例として、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１は、カルパインの標的として働きｉｎ ｖｉｖｏでカルパインによって切断される、３つのＰＥＳＴ（Ｐｒｏ、ＧｌｙおよびＳｅｒ／Ｔｈｒ多量）モチーフを含むことが開示されている（ニコラス、エムら（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８９、２２３〜２３１ページ）。Ｒａｂ結合タンパク質の量の調節は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現を調節することも含むことができる。これは例えば、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現を調節する化合物を投与することによって実施することができる。Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現は、増大させてもよいし低減させてもよい。例示例として、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現は、非コード核酸分子などの核酸分子によって低減することが可能である。
【００３４】
本明細書で使用する用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖またはそれらの組合せなどの、任意の考えられる形状の任意の核酸を指す。核酸は、例えばＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体の使用または核酸化学の使用によって作製したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびＰＮＡ（タンパク質核酸）を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡはゲノム起源または合成起源であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。本発明の方法では、典型的には、ただし必ずではないが、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を使用する。このような核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮ
Ａ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであってよい。それぞれの核酸は非天然ヌクレオチド類似体をさらに含むことができ、および／または親和性タグまたは標識と連結することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子を単離、濃縮、または精製することができる。核酸分子は、例えばｃＤＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離することができる。天然源は、ヒト、血液、精液、または組織などの哺乳動物由来であってよい。核酸は、例えばトリエステル法によって、または自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって合成することもできる。
【００３５】
多くのヌクレオチド類似体が知られており、本発明の方法中で使用する核酸およびオリゴヌクレオチドにおいて、それらを使用することができる。ヌクレオチド類似体は、例えば塩基、糖、またはホスフェート部分に修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分における修飾には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、異なるプリンまたはピリミジン塩基、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イルなど、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基の天然および合成修飾がある。他のヌクレオチド類似体は共通塩基として働く。共通塩基には３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールがある。共通塩基は、任意の他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基の修飾は、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖の修飾と頻繁に組合せて、例えば二本鎖安定性の増大などの特有の性質を得ることができる。
【００３６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、核酸分子は、例えばアプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（ＷＯ０１／９２６５５中に記載）などの非コード核酸分子である。非コード核酸分子はｎｃ−ＲＮＡ分子であってもよい（例えば、天然ｎｃ−ＲＮＡ分子の導入に関するコスタ、エフエフ（Ｃｏｓｔａ，ＦＦ）、Ｇｅｎｅ（２００５）、３５７、８３〜９４ページを参照）。ｎｃ−ＲＮＡ分子の例には、アンチセンスＲＮＡ分子、Ｌ−ＲＮＡＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）、サイレンサーＲＮＡ分子（二本鎖ニューロン限定サイレンサーエレメントなど）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉタンパク質と相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）（簡単な概説に関しては、例えばリン、エイチ（Ｌｉｎ，Ｈ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６、３９７を参照）があるが、これらだけには限られない。適切なｓｈＲＮＡの例示例は、以下の実施例中に配列番号３および配列番号４として示す。
【００３７】
低分子干渉ＲＮＡの使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するためのツールとなっている。それは、転写後レベルで起こりｍＲＮＡ分解を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制を利用する。ＲＮＡ干渉はゲノムを保護する細胞機構となる。ｓｉＲＮＡ分子は、いわゆるＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成するためのｓｉＲＮＡと複合酵素複合体の結合によって、それらの相補的ＲＮＡの分解を仲介する。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣの一部分となり、相補的ＲＮＡ種を標的化し、それは次いで切断される。これはそれぞれの遺伝子の発現の消失をもたらす（簡単な概説に関しては、（ザモア、ピーディーおよびハーレー、ビー（Ｚａｍｏｒｅ，ＰＤ，＆ Ｈａｌｅｙ，Ｂ）（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９、１５１９〜１５２４ページを参照）。この技法は例えば、米国特許出願２００５／０１９１６１８中に開示されたＨＩＶ ＲＮＡの切断などの、寄生虫ＤＮＡ配列のサイレンシングに施されている。
【００３８】
本発明のこのようなｓｉＲＮＡの典型的実施形態は、１０〜３５ヌクレオチド、いくつかの実施形態では１５〜２５ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ合成分子を含む。それぞれのｓｉＲＮＡ分子は、（微生物および動物の一部分である細胞を含めた）対象の細胞内で直接合成することができる。ｓｉＲＮＡ分子をそれぞれの細胞に導
入する、および／またはそれぞれの細胞に送達することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏでの選択細胞へのｓｉＲＮＡ分子の送達の例示例は、重鎖抗体断片（Ｆａｂ）と核酸結合タンパク質プロタミンの融合タンパク質との、その非共有結合である（ソング、イーら（Ｓｏｎｇ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、（２００５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３、６、７０９〜７１７ページ）。本発明の１実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、Ｒａｂ結合タンパク質の（例えばｉｎ ｖｉｖｏ）合成と関係がある１つまたは複数の転写因子をコードするｍＲＮＡ分子の分解を誘導する。
【００３９】
本発明による本発明の方法のいくつかの実施形態は、Ｒａｂ結合タンパク質、例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性を調節することを含む。Ｒａｂ結合タンパク質の活性の調節は、Ｒａｂ結合タンパク質と化合物の間の複合体を形成することを含むことができる。これは例えば、Ｒａｂ結合タンパク質の活性を調節する化合物を投与することによって実施することができる。Ｒａｂ結合タンパク質（例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質）の活性は増大または低減することができる。
【００４０】
それぞれの化合物は任意の適切な手段によって投与することができる。宿主生物が哺乳動物である場合、化合物は例えば経口または非経口（経腸）投与することができる。哺乳動物への投与の典型的実施形態では、例えば化合物の調製物の経口、静脈内投与によって、または吸入によって、その施用は血液および肝臓への送達を確実にする。経口施用のための調製物の例は、錠剤、ピルまたは飲料溶液であり、静脈内投与のための調製物の例は注射または輸液であり、吸入による投与のための調製物の例はエアロゾル混合物またはスプレーである。宿主生物が組換え微生物である場合、投与の例は、微生物の環境への化合物の注射または添加である。微生物が単細胞である場合、微生物を改変する技法と組合せて、後者の形の投与をおそらく実施することができる。このような技法は、細胞膜のエレクトロポレーションまたは透過処理を含むことができる。
【００４１】
Ｒａｂ結合タンパク質、例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性の調節は、Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾のパターンの改変を含めた、Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾の改変を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾の改変は、Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾のパターンを改変する化合物の使用を含む。それぞれの翻訳後修飾の例示例は、リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、およびユビキチン化である。それぞれの翻訳後修飾、例えばリン酸化の結果として、Ｒａｂ結合タンパク質の活性が変わる。例示例として、Ｒａｂ１１−ＦＩＰ２機能はセリン２２７におけるリン酸化によって制御されることが示されている（デゥチャルメ、エヌ エーら（Ｄｕｃｈａｒｍｅ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２００６）７、８、３６２５〜３６３７ページ）。キナーゼＭＡＲＫ２／ＥＭＫ１／Ｐａｒ−１Ｂ（ＭＡＲＫ２）によってリン酸化されると、Ｒａｂ１１−ＦＩＰ２は上皮細胞の極性を確立する際に働く（上記）。
【００４２】
Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の活性、発現、量または細胞内局在を調節する化合物は、任意の化合物であってよい。例には、核酸（上記参照）、ペプチド、ペプトイド、無機分子および小有機分子があるが、これらだけには限られない。ペプトイドは、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、クウォン、ワイ ユーおよびコダデック、（２００７）ティー（Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，（２００７）Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９、１５０８〜１５０９ページ参照）。ペプチドは合成起源であってよく、または当該技術分野でよく知られている方法によって天然源から単離することができる。天然源はヒトなどの哺乳動物、血液、精液、または組織であってよい。ポリペプチドを含めたペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。ポリペプチドの例示例は、抗体、抗
体断片、および抗体様機能を有するタンパク質結合分子である。（組換え）抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディまたはドメイン抗体である（ホルト、エル ジェイら（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１、１１、４８４〜４９０ページ）。抗体様機能を有するタンパク質結合分子の１例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（ＷＯ０３／０２９４６２、ベステら（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、１８９８〜１９０３ページ）。ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄまたはグリコデリンなどのリポカリンは、それらがハプテンとして知られる選択した小さなタンパク質領域と結合するように修飾することができる天然リガンド結合部位を有する。他のタンパク質結合分子の例は、いわゆるグルボディ（ＷＯ９６／２３８７９参照）、アンキリン骨格（モザビ、エル ケイら（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３、６、１４３５〜１４４８ページ）または結晶骨格（ＷＯ０１／０４１４４）に基づくタンパク質、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）、（２０００）Ｊ．Ｍａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３、１６７〜１８７ページ中に記載されたタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン、およびアビマーである。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体において一連の多数のドメインとして存在する、いわゆるＡ−ドメインを含む（シルバーマン、ジェイら（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５５６〜１５６１ページ）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的との免疫グロブリン様結合用に工学処理することができる３個のループを含む（ギル、ディー エスおよびダムレ、エヌ ケイ（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．）、（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７、６５３〜６５８ページ）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、Ｃ型レクチンドメイン中に所望の結合用に工学処理することができるループ領域を同様に含む（上記）。タンパク質リガンドとして作用することができるペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素と結合している点でペプチドと異なる、オリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは典型的にはプロテアーゼおよび他の修飾酵素に耐性があり、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、クウォン、ワイ ユーおよびコダデック、（２００７）ティー（Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，（２００７）Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９、１５０８〜１５０９ページ参照）。所望の場合、任意のまたは特定の形、クラスなどの標的物質に対するそれぞれの部分の親和性をさらに増大させる修飾作用物質を使用してもよい。
【００４３】
それぞれの化合物は、（Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質などの）Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾を改変することもできる。化合物は、例えば、Ｒａｂ結合タンパク質を含めた細胞要素のリン酸化状態を変えることができる。それぞれの化合物は、Ｒａｂ結合タンパク質と異なるタンパク質を含めた細胞内タンパク質の、リン酸化の程度の調節物質であってもよい。このようなタンパク質は、したがってＲａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾を改変することができる。それぞれの化合物の例示例はチロシンキナーゼ阻害剤である。チロホスチン、キナゾリン、キノキサリン、キノリン、２−フェニルアミノピリミジン、フラボノイド、ベンゾキノイド、アミノサリチル酸またはスチルベン（これらは例えばＷＯ９６１８７３８、ＷＯ０３０３５６２１およびその中に引用された参照文献中に記載されており、例えばそれらの実験による同定の例に関しては、例えば米国特許第６，７４０，６６５号を参照）などの多数のチロシンキナーゼ阻害剤が市販されている。チロホスチンの例は、ＡＧ２１３、ＡＧ４９０、ＡＧ８７９、ＡＧ１２９５、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５１７、ＡＧＬ２０４３、チロホスチン４６およびメチル２，５−ジヒドロキシケイ皮酸である。キナゾリンは、例えばＰＤ１５３０３５、ＰＤ１５６２７３、ゲフィチニブまたはラパチニブであり、キノキサリンは、例えばＰＤ１５３０３５またはＺＤ１８３９である
。キノリンの１例は５−メチル−５Ｈ−インドール［２，３−β］キノリンであり、２−フェニルアミノピリミジンの１例はイマチニブであり、フラボノイドの例はゲニステインまたはクエルセチンであり、ベンゾキノイドの１例はハービマイシンＡであり、アミノサリチル酸の１例はラベンドウスチンＡであり、スチルベンの１例はピセアタノールである。他の適切な化合物は、チロホスチンエルブスタチンなどの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＷＨＩ−Ｐ９７またはチロホスチンＡＧ５９２などのＥＧＦＲ特異的受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アウリントリカルボン酸などのチロシンリン酸化刺激剤、または過バナジン酸ナトリウムまたはイソキサゾールカルボン酸などのチロシンホスファターゼ阻害剤を含むことができる。
【００４４】
タンパク質キナーゼの機能を阻害することが報告されている化合物のさらなる例には、ビス単環式、二環式または複素環式アリール化合物（国際特許出願ＷＯ９２／２０６４２）ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴＷＯ９４／１４８０８）、１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン（米国特許第５，３３０，９９２号）、スチリル化合物（米国特許第５，２１７，９９９号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第５，３０２，６０６号）、特定のキナゾリン誘導体（欧州特許出願Ｎｏ．０５６６２６６Ａ１）、セレオインドールおよびセレニド（国際特許出願ＷＯ９４／０３４２７）、三環式多価化合物（国際特許出願ＷＯ９２／２１６６０）、およびベンジル−ホスホン酸化合物（国際特許出願ＷＯ９１／１５４９５）があるが、これらだけには限られない。調節物質として使用することができるさらに他の化合物には、１９９６年８月２３日に出願された米国特許出願第０８／７０２，２３２号中に記載されたオキシンドリノン（ｏｘｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ）などのオキシンドリノンがある。
【００４５】
Ｒａｂ結合タンパク質の翻訳後修飾を調節する化合物のさらなる例は、タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの制御を誘導することができる細胞表面分子に対するアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００４６】
Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質の活性を調節する化合物の他の例は、例えばビタミンＤ３またはビタミンＤ４などのビタミンＤのメンバーである。ビタミンＤ３（コレカルシフェロール、カルシオールまたはアラキトールとも呼ばれ、ＩＵＰＡＣ名（１Ｓ，３Ｚ）−３−［（２Ｅ）−２−［（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ）−１−［（１Ｒ）−１，５−ジメチルヘキシル］オクタヒドロ−７ａ−メチル−４Ｈ−インデン−４−イリデン］エチリデン］−４−メチレン−シクロヘキサノール、（３β、５Ｚ、７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３−オールとも名付けられる）は、その活性形で、乳癌を含めた様々な起源の悪性細胞において、増殖停止、分化、および細胞死を誘導する能力を有する。この観察結果が、考えられる抗癌剤としてのビタミンＤ類似体の開発をもたらしている（例えば、バウデット、シーら（Ｂａｕｄｅｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．）（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１００、３〜１０ページ；ヒジー、ティー、およびウー、ジェイ エム（Ｈｓｉｅｈ，Ｔ．，＆ Ｗｕ，Ｊ．Ｍ．）、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３５、５３９〜５４４ページ；ジェームス、エス ワイら（Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２、１４３〜１５４ページ；マティアセン、アイ エスら（Ｍａｔｈｉａｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９、４８４８〜４８５６ページを参照）。化合物ＥＢ１０８９は１つのこのような類似体であり、現在癌の治療に関する第３相臨床試験中である（例えば、マティアセン、アイ エスら（Ｍａｔｈｉａｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９３）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６、３６５〜３７１ページ；コルストン、ケイ ダブリュら（Ｃｏｌｓｔｏｎ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４、２２７３〜２２８０ページ；ハンセン、シー エムら（Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、（２０００）Ｃｕ
ｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．６、８０３〜８２８ページを参照）。ビタミンＤ化合物の抗癌活性は細胞内遊離カルシウム（［Ｃａ２＋］）に対するその影響と直接関係がある。ビタミンＤ化合物で処理した細胞中の遊離Ｃａ２＋の上昇は、乳癌細胞におけるアポトーシスの誘導と相関関係があり（サージーブ、アイ エヌら（Ｓｅｒｇｅｅｖ，Ｉ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．）、（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ中（ノーマン、エー ダブリュ、ボイロン、アール、およびトーマセット、エム（Ｎｏｒｍａｎ，Ａ．Ｗ．，Ｂｏｕｉｌｌｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓｓｅｔ，Ｍ．）編）、３９９〜４０２ページ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ、ＣＡ；バンデバーレ、ビーら（Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１、８０６〜８１１２ページ；サージーブ、アイ エヌおよびローテン、ダブリュ ビー（Ｓｅｒｇｅｅｖ，Ｉ．Ｎ．，＆ Ｒｈｏｔｅｎ，Ｗ．Ｂ．）（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ９、３２１〜３２７ページ）、カルパインとしても知られるカルシウム依存性システインプロテアーゼの活性化における主な機構であることが示されている（ナカガワ、ティーおよびユーアン、ジェイ（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．，＆ Ｙｕａｎ，Ｊ．）、（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０、８８７〜８９４ページ；レイ、エス ケイら（Ｒａｙ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５２、３２６〜３３４ページ；イシハラ、アイら（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２７９、９７〜１００ページ）。
【００４７】
理論によって縛られることを望まないが、乳癌細胞における試験からの最近の証拠は、カルパインがビタミンＤ３およびＥＢ１０８９によって誘導されるアポトーシス死における主な実行プロテアーゼであり得ることを示唆している（マティアセン、アイ エスら（Ｍａｔｈｉａｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７７、３０７３８〜３０７４５ページ）。カルパインのプロテアーゼ（タンパク質分解）機能は、カルパインのタンパク質標的のペプチド配列中に存在するＰＥＳＴ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒ／Ｔｈｒ多量）アミノ酸モチーフに依存してる（ダイス、ジェイ エフ（Ｄｉｃｅ，Ｊ．Ｆ．）（１９８７）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１，３４９〜３５７ページ；トンパ、ピーら（Ｔｏｍｐａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２０７７５〜２０７８５ページ；レヒシュタイナー、エム、およびロジャース、エス ダブリュ（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．，＆ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｗ）（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１、２６７〜２７１ページ；シャムウェイ、エス ディーら（Ｓｈｕｍｗａｙ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３０８７４〜３０８８１ページ；フクダ、エムおよびイトー、ティー（Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，＆ Ｉｔｏｈ，Ｔ）（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２２３１４〜２２３２１ページ）。ＲＡＢ１１ＦＩＰ１は、例えばＣ２ドメインとＲＢＤ（Ｒａｂ結合ドメイン）の間に位置する３個のこのようなＰＥＳＴモチーフを含む。近年の試験において、マリーら（Ｍａｒｉｅ，ｅｔ．ａｌ．）は、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１中のＰＥＳＴモチーフは、カルパインによる制御型分解に関してそれを標的化するかどうか決定しようと努めた（マリー、エヌら（Ｍａｒｉｅ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．）（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８９、２２３〜２３１ページ）。マリーらは、高濃度のカルシウムを用いた細胞の処理はＲＡＢ１１ＦＩＰ１の分解を誘導し、この分解は特異的カルパイン阻害剤を加えることにより無効にすることができることを観察した。さらに、このカルシウム制御型分解におけるＰＥＳＴ配列の関与は、その中のＰＥＳＴ配列を除去したＲＡＢ１１ＦＩＰ１突然変異体を使用して立証した。したがってマリーらは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１のＰＥＳＴ配列は、おそらく細胞中の生理的代謝回転の機構として、カルパイン仲介型分解に関してタンパク質を標的化すると結論付けた。例えばＲＡＢ１１ＦＩＰ１がカルパイン作用に感受性である活性ＰＥＳＴドメインを含み、カルパインがビタミンＤ３およびＥＢ１０８９などのその化学療法剤類似体によってタンパク質分解活性
に関して活性化されることを考慮して、本発明の方法は、ビタミンＤ３およびＥＢ１０８９を含めたその関連類似体に基づく化学療法レジメン、および細胞内遊離カルシウムレベルを上昇させるため、またはカルパインを活性化するために生化学的に作用する任意の他の治療レジメンに関して患者を選択するためのバイオマーカーとして、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを使用することを可能にする。
【００４８】
前に記したように、細胞における腫瘍発生を制御する方法、例えば細胞における腫瘍発生を予防、停止または逆行させる方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質のレベル、発現および／または活性を分析する。細胞は、（例えば単離した）個々の細胞、癌組織を有し得る生物の細胞、癌組織を含む組織の細胞、または細胞培養物の細胞であってよい。癌細胞は、例えば神経、グリア、肺、肝臓、脳、乳房、膀胱、血液、白血病、結腸、子宮内膜、胃、皮膚、卵巣、脂肪、骨、頸部、食道、膵臓、前立腺、腎臓、または甲状腺細胞であってよい。いくつかの態様では、癌は、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮細胞癌、グリオーマ、グリア芽腫、胃癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、白血病、脂肪腫、メラノーマ、マントル細胞リンパ腫、粘液線維肉腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、前立腺癌、頭部または頸部の扁平細胞癌、甲状腺癌および尿路上皮癌を含むが、これらだけには限られない。
【００４９】
細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化または活性の変化は、ほぼ平均レベルまたは一般に見られるレベルに対応するレベルに調整することができる。細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化は、プロテアーゼの活性または発現の調節によって実施することができる。いくつかの実施形態では、このようなプロテアーゼはカルシウム依存性プロテアーゼ（カルパイン）、例えばカルパインＩまたはＩＩである。いくつかの実施形態では、カルパインプロテアーゼの活性および／または発現を、細胞内カルシウムレベル、例えば遊離細胞内カルシウムの変化によって調節する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、カルパインプロテアーゼの活性および／または発現を、それらの施用を含めた、ビタミンＤファミリーのメンバー、このようなビタミンＤファミリーのメンバーのプロドラッグまたはこのようなビタミンＤファミリーのメンバーの類似体の使用によって調節、例えば活性化する。それぞれのビタミンＤ、その類似体またはプロドラッグは、例えばそれぞれの細胞と接触させることが可能であり、またはそれぞれの対象を含めた、それぞれの生物に投与することができる。プロテアーゼの活性および／または発現は、シグナル伝達カスケードによって次いで調節されるプロテアーゼ調節物質などの、他の因子によって調節することもできる。多数のプロテアーゼが、それらの活性とそれらの発現の両方の点で制御を受けることは知られている（例えば、トゥルク、ビー（Ｔｕｒｋ，Ｂ．）、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、５、９、７８５〜７９９ページ参照）。アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１またはメタロプロテイナーゼの組織阻害剤は例示例として役立つ可能性がある。
【００５１】
ビタミンＤファミリーのメンバーまたはビタミンＤファミリーのメンバーの類似体の「プロドラッグ」は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば段階的または急速に）転換されて、酵素作用または一般的な酸または塩基加溶媒分解のいずれかによる、例えば血液中での加水分解または酸化による代謝を含めた、例えば宿主中での代謝によって親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体化合物を生成し、活性成分を形成する化合物であることは理解されている。典型的にはプロドラッグは、ｉｎ ｖｉｖｏで使用すると化学的または生理的工程によって元の化合物を放出する、親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体の誘導体である。プロドラッグは例えば、生理的ｐＨに達すると、（１つまたは複数の）自発性化学反応、（１つまたは複数の）酵素触媒化学反応、光分解、および／または（１つまたは複数の）代謝化学反応によって、親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体に変換され得る。一般的な例は、カルボン酸部
分を有する活性形を有するエステルおよびアミド形の化合物だけには限られないが、これらを含めた、親化合物の官能基部分に生物学的に不安定な保護基を有する化合物である。さらなる例には、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、エステル化、脱エステル化、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化、光分解、加水分解することが可能な化合物の部分、またはプロドラッグにおける化学結合の形成または破壊に関する他の官能基の変化または変換がある。それぞれのプロドラッグは、その治療活性または利用可能形にｉｎ ｖｉｖｏで変換されるまで、完全に活性状態または生理的に利用可能でないプロドラッグでよい。「プロドラッグ」は、それぞれの薬剤分子（この場合、親ビタミンＤ／ビタミンＤ類似体）と担体部分の間の共有結合または非共有結合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは生理的に形成される生成物も含み得る。特定の化合物は、溶媒和および非溶媒和形、例えば水和形で存在し得ることも理解されよう。溶媒和形は単に「溶媒和物」とも呼ばれる。
【００５２】
前で他に記したように、発癌性になる素因を有する細胞を同定する方法のいくつかの実施形態では、（例えば単離した）個々の細胞、生物の細胞または細胞培養物の細胞であってよい細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化または活性の変化を決定することができる。同様に、対象、例えば患者における新生物を発症するリスクを診断する方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化または活性の変化を決定することができる。このような場合、それぞれの変化の決定は、それぞれの新生物または腫瘍が対象の１つまたは複数の細胞におけるプロテアーゼの活性および／または量の変化に感受性であることを示す可能性がある。いくつかの実施形態では、このようなプロテアーゼは、カルパインプロテアーゼカルパインＩまたはＩＩ（カルシウム活性化中性プロテアーゼＩおよびＩＩとも呼ばれる）としても知られるカルシウム依存性プロテアーゼＣＤＰＩまたはＣＤＰＩＩなどの、カルシウム依存性プロテアーゼ（カルパイン）である。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性および／または発現の変化の決定は、それぞれの新生物または腫瘍が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す可能性がある。
【００５３】
この点において、各方法は、対象から試料を得ること、および試料から核酸を単離することをさらに含むことができる。核酸を増幅し、標識することができる。選択したタンパク質の量を決定する方法は、当該技術分野でよく知られている。各方法は、例えばプロテオミクス系の技法に依存することができる。それは、それぞれのＲａｂ結合タンパク質と結合する、抗体、抗体断片、または抗体様機能を有するタンパク質結合分子の使用を含むことができる。タンパク質の発現タンパク質を分析する方法は、当該技術分野で十分確立している。ｍＲＮＡの発現は、例えばノーザンブロッティングおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護アッセイおよびＰＣＲ系の方法を使用して定量化することができる。さらなる例として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含めた特異的二本鎖を認識することができる、抗体、抗体断片、またはタンパク質結合分子を利用することができる。塩基配列決定に基づく遺伝子発現分析の方法の例示例には、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、および超並列型サイン塩基配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析がある。
【００５４】
（組換え）抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（イリアデ、ピーら（Ｉｌｉａｄｅｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９９７）４０９、４３７〜４４１ページ）、デカボディ（ストーン、イーら（Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）３１８、８８〜９４ページ）、および他のドメイン抗体である（ホルト エル ジェイら（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、（２００３）２１、１１、４８４〜４９０ページ）である。単鎖Ｆｖ断片は、例えば免疫グロブリン分子の１本の重鎖と１本の軽鎖由来
の可変領域の融合体である。抗体様機能を有するタンパク質結合分子の１例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（ＷＯ２００３／０２９４６２；ＷＯ２００５／０１９２５４；ＷＯ２００５／０１９２５５；ＷＯ２００５／０１９２５６；ベステら（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）、９６、１８９８〜１９０３ページ）。ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄ、ヒト涙液リポカイン、またはグリコデリンなどのリポカリンは、それらがハプテンとして知られる選択した小さなタンパク質領域と結合するように修飾することができる天然リガンド結合部位を有する。さらなるタンパク質結合分子の他の非制限的な例は、いわゆるグルボディ（ＷＯ９６／２３８７９参照）、アンキリン骨格（モザビ、エル ケイら（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１３、６、１４３５〜１４４８ページ）または結晶骨格（ＷＯ２００１／０４１４４）に基づくタンパク質、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）（Ｊ．Ｍａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（２０００）１３、１６７〜１８７ページ）中に記載されたタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン、アビマー、およびペプトイドである。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体において一連の多数のドメインとして存在する、いわゆるＡ−ドメインを含む（シルバーマン、ジェイら（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３、１５５６〜１５６１ページ）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的との免疫グロブリン様結合用に工学処理することができる３個のループを含む（ギル、ディー エスおよびダムレ、エヌ ケイ（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）１７、６５３〜６５８ページ）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、Ｃ型レクチンドメイン中に所望の結合用に工学処理することができるループ領域を同様に含む（上記）。タンパク質リガンドとして作用することができるペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素と結合している点でペプチドと異なる、オリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは典型的にはプロテアーゼおよび他の修飾酵素に耐性があり、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有し得る（例えば、クウォン、ワイ ユーおよびコダデック、ティー（Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９、１５０８〜１５０９ページ参照）。所望の場合、任意のまたは特定の形、クラスなどの標的物質に対するそれぞれの部分の親和性をさらに増大させる修飾作用物質を使用することができる。
【００５５】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、細胞由来またはメラノーマ試料などの組織試料由来の転写産物を、増幅および検出するのに有用な標準的な技法である。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は例えば、それを使用して異なる試料（例えば、非転移性および転移性メラノーマ試料、または良性皮膚およびメラノーマ試料）中のｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現サインを調べることができる感度の良い定量法である。ＲＴ−ＰＣＲを実施するために、ｍＲＮＡを試料（例えば、ヒトメラノーマ試料から単離した全ＲＮＡ）から単離する。ｍＲＮＡは例えば、凍結または保存済みパラフィン包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。ＲＮＡ単離用の精製キットは市販されている。ＲＴ−ＰＣＲ技法は、二重標識蛍光プローブによってＰＣＲ産物の蓄積を測定する、リアルタイム定量ＰＣＲの実施形態中で使用することもできる。リアルタイムＰＣＲは、それぞれの標的配列用の内部競合剤を標準化に使用する定量競合的ＰＣＲと、試料内に含まれる標準化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を使用する定量比較ＰＣＲとの両方に適合する。さらなる例として、競合的ＰＣＲ設計は、おそらく自動、高スループットマトリクス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析検出法および核酸分子の定量化を含めた、遺伝子発現分析に使用することができる。遺伝子発現分析に適したＰＣＲ系の方法中に含めることができる技法のさらなる例は、ディファレンシャルディスプレイ、増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）法、Ｂｅａ
ｄＡｍｉｙ（商標）技術、遺伝子発現の検出用のＢｅａｄｓＡｒｖａｙ（ＢＡＤＧＥ）および広範囲の発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）分析だけには限られないが、これらを含むことができる。さらなる例として、組織試料の遺伝子発現の決定は、マイクロアレイを用いて実施することもできる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性および／または発現の変化、特にＲａｂ結合タンパク質の活性および／または発現の増大の決定は、それぞれの新生物または腫瘍がビタミンＤのメンバー、その類似体またはプロドラッグを用いた治療に感受性であることを示す可能性がある。この点において本発明は、（腫瘍、例えば癌を含めた）新生物がプロテアーゼの活性および／または量の変化に感受性であるかどうかを決定する方法も提供する。新生物中、特にその細胞中で発現されるプロテアーゼを含めて、プロテアーゼが存在してよい。いくつかの実施形態では、方法は、新生物がビタミンＤファミリーのメンバー、その類似体またはプロドラッグに感受性であるかどうかを決定する方法である。
【００５７】
本発明による方法に使用することができる、ビタミンＤ３類似体を含めた多数のビタミンＤ類似体が、当該技術分野で知られている（概説に関しては、例えば、クボデラ、エヌ（Ｋｕｂｏｄｅｒａ，Ｎ．）（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、２（３）、３０１〜３１５ページを参照されたい）。例えばカルシトリオール、マクサカルシトール、タカルシトール、セカルシフェロール、アルファカルシドールまたはセオカルシトール（ＥＢ１０８９）を含めた適切な例は、例えば国際特許出願ＷＯ２００７／０８２５４２中に挙げられている。セオカルシトールは、乳癌腫瘍細胞中の電離放射線に対する応答性を高めることが以前に示されており、これはＤＮＡ損傷の初期誘導の細胞シグナル伝達経路下流の変化の結果であることが示唆されている（デマスターズ、ジーら（ＤｅＭａｓｔｅｒｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、５、１１、２７８６〜２７９７ページ）。さらなる最近の例は、その形成がシミズら（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．）、（（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１６、３３２３〜３３２９ページおよびその中に挙げられた参照文献）によって記載されている、ＳＭＤ−４２９などの１６−エン−２２−オキサビタミンＤ３類似体、例えばリーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）、（（２００７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６７（２４）、１１８４０〜１１８４７ページ）によって記載された、１α，２５−ジヒドロキシ−２０Ｓ，２１（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−２３−イン−２６，２７−ヘキサフルオロコル−カルシフェロール、またはヨーンら（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．）、（（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２３、３８７〜３９６ページ）によって表された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類似体、１α−ヒドロキシ−５，６−トランス−ビタミンＤ３の１９官能性誘導体（ボジットキーレビッズ、エー（Ｗｏｊｔｋｉｅｌｅｗｉｃｚ，Ａ）、（２００７）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ、７２（６〜７）、５５２〜５５８ページ）、オノら（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．）、（（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９（４）、７１１〜７１６ページ）によって記載された延長側鎖を有する類似体、またはポスナーら（Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、（（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０３、２１３〜２２１ページ）によって記載されたジフルオロ類似体である。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態用に、ライブラリーの形で化合物を使用することができる。このようなライブラリーの例は、モデル化合物として化学的に合成した様々な有機小分子、または多数の配列変異体を含む核酸分子の集合である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば生物またはその組織もしくは細胞に
おける、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の発現、細胞内局在および／または活性を検出することを含む。例示例として、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を一定時間モニターすることができる。
【００６０】
本発明の方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を測定した結果と、対照測定（または「参照」測定）の結果を比較することをさらに含むことができる。対照測定は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を調節しない条件の使用を含むことができる。細胞内量、発現、および／または活性の比較において、検出レベルを例えば対照レベルと比較することができる。本明細書で使用する用語「対照レベル」は、例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の細胞、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルでの、それぞれのタンパク質の分子の数、および対照試料中のＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性レベルを指す。したがってこの用語は、正常対照レベルと癌の対照レベルの両方を含む（これも以下参照）。この用語は１つの参照測定値、または複数の参照測定値を指すことができる。いくつかの実施形態では、対照レベルは以前に実施した測定からの発現または活性値のデータベースであってよい。用語「通常レベル」は、正常、健康な個体中、または癌を含めた新生物に罹患していないことが知られている個体の集団中で検出される、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現のレベルまたはＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の活性レベルを指す。正常な個体は、それぞれの新生物の臨床症状がない個体である。
【００６１】
本発明によれば、例えば細胞中の、遺伝子発現レベルまたは活性レベルまたはタンパク質の量は、対照レベルと比較して遺伝子発現／活性／量が約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、またはそれより多く増大または低下するとき、「変化した」または「異なる」とみなされる。あるいは、発現レベルまたは活性レベルは、対照レベルと比較して遺伝子発現／または活性が少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約５、または少なくとも約１０またはそれより多くの倍数増大または低下するとき、「増大した」または「低下した」とみなされる。
【００６２】
本発明の方法は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性を変えることを含むことができる。いくつかの実施形態では、方法はＥＲＫの活性化を予防、阻害、停止または逆行させることを含む。典型的実施形態では、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の量または活性の調節は、ＥＲＫの活性の調節をもたらす可能性がある。
【００６３】
本発明のさらなる方法は、発癌現象を含めて発癌性になる素因を有する細胞を同定する方法である。方法は、細胞におけるＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量の変化、発現の変化、細胞内局在の変化または活性の変化を検出することを含む。関連法に関して前ですでに説明したように、方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を測定することを含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を測定した結果と、対照測定の結果を比較することも含むことができる（上記を参照）。
【００６４】
本発明は、対象において癌を含む腫瘍などの新生物を発症するリスクを診断する方法にも関する。それぞれの腫瘍は、例えば乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱の腫瘍または卵管（卵巣管とも呼ばれる）の腫瘍であってよい。同様に、それぞれの癌は、対応する癌腫の１つを含めた、例えば乳房癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱の癌または卵管（卵巣管とも呼ばれる）の癌であってよい。肺癌の癌腫の例示例は、非小細胞肺癌腫である。方法は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の量、発現レベル、活性レベルおよび細胞内局在の少なくとも１つを決定することを含む。測定はいくつかの実施形態では、対象由来の組織試料または細胞試料などの試料において実施することができる。いくつかの実施形態では、方法は、Ｒａｂ１１−ＦＩＰタンパク質の細胞内量、発現、細胞内局在および／または活性を
測定した結果と、対照測定の結果を比較することも含むことができる（上記を参照）。それぞれの対照測定用に、Ｒａｂ結合タンパク質の発現および／または活性が通常（「正常」）レベルである試料を使用することができる。典型的実施形態では、対照測定と比較したＲａｂ結合タンパク質の量、発現レベル、活性レベルまたは細胞内局在の変化は、対象が新生物に罹患しているかまたは新生物を発症するリスクがあることを示す。
【００６５】
本発明のさらなる方法は、それぞれの化合物を同定するｉｎ−ｖｉｖｏ法とｉｎ−ｖｉｔｒｏ法の両方の方法である。化合物は発癌現象を含めた腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることができる。化合物は、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質などのＲａｂ結合タンパク質と複合体を形成することができる。典型的にはこれらの方法は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏであれこの複合体の構成要素を互いに曝すことを含む。１つのこのような方法は、複合体を形成する、または複合体を形成すると考えられる構成要素を互いに接触させることを含むｉｎ−ｖｉｔｒｏ法である。例えばＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質と、Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質と複合体を形成すると考えられる薬剤候補分子を、互いに接触させることが可能である。いくつかの実施形態では、方法は、複合体の形成を検出することをさらに含む。
【００６６】
複合体の形成を検出する任意の適切な方法を使用することができる。検出法は、例えば電気泳動法、ＨＰＬＣ、フローサイトメトリー、蛍光相関分光法またはこれらの技法の改変型を含むことができる。他の技法は生物分子の結合自体の測定を含む。このような測定は、例えば分光的、光化学的、光度分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的手段、または細胞効果に基づくことができる。分光的検出法の１例は、蛍光相関分光法である（トンプソン、エヌ エルら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２）１２（５）、６３４〜６４１ページ）。光化学的方法は、例えば光化学的架橋である（スティーン、エイチ、ジェンセン、オー エヌ（Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｎ．）、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ．（２００２）２１、３、１６３〜１８２ページ）。それぞれ光活性、蛍光、放射性または酵素標識の使用（概説に関しては、：リッペ、アール エーら（Ｒｉｐｐｅ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）１６０、４５９〜４７９ページ参照）は、光度分析的、蛍光分析的、放射線学的および酵素的検出法の例である。熱力学的検出法の１例は、等温滴定型熱量計である（ＩＴＣ、概説に関しては、：ベラツクエツ−カンポイ、エーら（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｃａｍｐｏｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ（２００４）２６１、３５〜５４ページ参照）。細胞効果を使用する方法の１例は、その酵素的検出または細胞複製を含めた細胞増殖または細胞生存の測定である。
【００６７】
さらなる関連法は微生物を提供することを含むｉｎ ｖｉｖｏ法である。微生物はＲａｂ結合タンパク質を発現し、該Ｒａｂ結合タンパク質と共に化合物は複合体を形成し得ると考えられ、またはＲａｂ結合タンパク質の発現を化合物が変え得る（例えば、抑制し得る）と考えられる。いくつかの実施形態では、微生物はＲａｂ結合タンパク質を内生的に発現することができる。いくつかの実施形態では、微生物は組換え細胞またはトランスジェニック微生物である。いくつかの実施形態では、微生物は、乳癌細胞または肺癌細胞を含めた癌細胞などの単細胞である。いくつかの実施形態では、微生物は生物から得られる細胞である。それぞれの生物は、例えば哺乳動物、魚類、両生類または鳥類であってよい。細胞は典型的には、皮膚組織または乳房組織などの、それぞれの生物の組織に由来する。いくつかの実施形態では、微生物は、乳癌細胞系または肺癌細胞系を含めた、癌細胞系などの細胞系の細胞である。適切な乳癌細胞系の例には、ＨＭＥＣ細胞系、３Ｄ、Ｂｃａｐ−３７、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＢＴ４７４Ｍ１、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、ＪＩＭＴ−１、ＭＣＦ−７、Ｍ２３１、ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−３
６１ＤＹＴ２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡＭＢ−４３５ＨＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＢ２３１、ＭＷ１、ＰＭＣ４２、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＢＲ−７、ＳＵＭ１４９、ＳＵＭ１５９、ＳＵＭ１３１５、ＳＵＭ−５２ＰＥ、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５、ＺＲ−７５−１およびＺＲ−７５−３０があるが、これらだけには限られない。肺癌細胞系は、例えば腺癌細胞系、扁平上皮細胞癌細胞系または小細胞癌細胞系であってよい。適切な肺癌細胞系の例には、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−６、ＥＢＣ−１、Ｈ３２２、Ｈ４４６、Ｈ４６０、ＨＣＣ２２７９、ＨＴＢ−５６Ｒ、ＨＵＴ２９、ＩＭＥＣ−２、ＫＵ−Ｔ１、Ｌ９９８１、ＬＣＤ、ＬＣＯＫ、ＬＫ−２、ＬＣ−１／ｓｑ、Ｌｕ１３５、ＭＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＮＣＩ−Ｈ１７７０、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＮＣＩ−Ｎ２２６、ＮＣＩ−Ｎ２３１、ＰＣ１、ＰＣ３、ＰＣ７、ＰＣ９、ＰＣ１０、ＰＣ１４、ＰＬＡ−８０１Ｄ、ＱＧ５６、ＲＥＲＦ−ＬＣＡＩ、ＲＥＲＦ−ＬＣＭＳ、ＲＥＲＦ−ＬＣＫＪ、ＳＢＣ３、ＳＰＣ−Ａ１、ＳＱ５およびＹＴＬＭＣ−９０があるが、これらだけには限られない。多数の他の癌細胞系、例えばポールら（Ｐｏｌｅ ｅｔ ａｌ．）（２００６、上記）中で命名された追加的細胞系が当該技術分野で知られている。
【００６８】
いくつかの実施形態では、微生物は、結腸直腸癌細胞系、膀胱癌細胞系および卵管癌細胞系の細胞である。適切な結腸直腸癌細胞系の例には、Ｃｏｌｏ−３２０、ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９、Ｌ０、Ｌ０−２００、Ｌ０−５００、Ｌ０−１０００、ＬｏＶｏ、ＬＳ１０３４、ＬＳＴ−Ｒ１、ＲＫＯ、ＳＷ４８０、およびＷｉＤｒ、ならびにドウグラら（Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．）（（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４、１４、４８１７〜４８２５ページ）によって言及されたさらなる結腸直腸癌細胞系があるが、これらだけには限られない。適切な膀胱癌細胞系の例には、ＢＩＵ−８７、ＥＪ、ＫｏＴＣＣ−１、ＭＢＴ−２、ＲＴ４、ＳｃａＢＥＲ、Ｔ２４およびＵＭ−ＵＣ−２があるが、これらだけには限られない。卵管癌細胞系の２つの例示例は、ＦＴ−ＭＺ−１（ルンネバウム、アイ ビーら（Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ，Ｉ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．）、（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３５３、１、２９〜３２ページ）およびＨＥＰＦＴ（イシワタ、アイら（Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．）、（２００７）Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ、２０、１１９〜１３０ページを参照）である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、微生物は、Ｒａｂ１１ＦＩＰ、例えばＲａｂ１１ＦＩＰ１などのＲａｂ結合タンパク質を過剰発現する乳癌上皮細胞系ＭＣＦ１０Ａなどの非癌性組織細胞系を含めた、非腫瘍性の細胞である。同様に、任意の細胞−細胞系の細胞、個々の細胞、多細胞生物内の細胞、（直接入手および単離を含めて）多細胞生物から入手した細胞であろうと選択して、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１などのＲａｂ結合タンパク質を過剰発現させることによって癌細胞に形質転換することができる。以下の実施例および例えば図６は、細胞がどのようにして癌細胞に形質転換され得るかを然るべく例示する。この点において、本発明の方法は癌細胞を入手する方法も提供し、それは細胞中のＲａｂ結合タンパク質の発現を調節する、特に増大させる方法を含む。それによって細胞は癌細胞に形質転換される。それぞれのＲａｂ結合タンパク質は、例えばＲａｂ１１ＦＩＰ１などのＲａｂ１１結合タンパク質であってよい。Ｒａｂ結合タンパク質は、内因性または異種タンパク質、すなわち細胞中に本来存在するコード核酸配列を有するタンパク質、またはコード核酸配列がそれぞれの細胞中に導入される／導入されているタンパク質であってよい。本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの対応するＲａｂ結合タンパク質の発現を調節することが可能な化合物を同定するための、このような細胞の使用にも関する（以下参照）。
【００７０】
本発明の方法は、Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成し得ると考えられる化合物、またはその発現を変えると考えられる化合物を微生物に加えることを含む。各方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質、例えばＲａｂ１１ＦＩＰ結合タンパク質の発
現をモニターする。各方法のいくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の活性をモニターする。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ結合タンパク質の細胞表現型の変化をモニターする。いくつかの実施形態では、このような方法は対照測定を含む（上記も参照）。対照測定の結果は化合物を使用して得た結果と比較する。対照測定は、例えば、Ｒａｂ結合タンパク質の発現または活性に影響を与えないことが知られている化合物の使用を含むことができる。
【００７１】
さらに他の関連法は、宿主生物を提供することを含むｉｎ−ｖｉｖｏ法である。任意の望ましい宿主生物を、それが癌細胞を収容し増殖させることが可能である限り提供することができる。宿主生物の例には、哺乳動物、魚類、両生類、および鳥類があるが、これらだけには限られない。適切な哺乳動物の例には、ラット、ウサギ、モルモット、オポッサム、イヌ、およびネコがあるが、これらだけには限られない。
【００７２】
任意の望ましい癌細胞をこの目的で使用することができる（例えば上記を参照）。方法は、宿主生物に癌細胞を導入することをさらに含む。さらに方法は、先に記載した化合物、すなわちＲａｂ結合タンパク質と複合体を形成し得ると考えられる化合物、Ｒａｂ結合タンパク質の量を調節し得ると考えられる化合物、またはＲａｂ結合タンパク質の活性を調節し得ると考えられる化合物の使用を含む。いくつかの実施形態では、癌細胞は化合物を含む。したがって、宿主生物に癌細胞を導入する前に、化合物を癌細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、宿主生物への癌細胞の導入の前、後、または同時に、化合物を宿主生物に投与する。典型的には、方法の特定の段階で化合物を癌細胞に導入する。方法は、宿主生物中の腫瘍の増殖をモニターすることをさらに含む。
【００７３】
本発明を容易に理解し実務上の効果をもたらすことを可能にするために、個々の実施形態をここで以下の非制限的な実施例によって記載する。
【実施例】
【００７４】
本発明者らが開発したＴＲＩＡＧＥ法の、特に関連する態様および特徴は、以下のように要約できる（図１も参照されたい）。
【００７５】
【表１】
【００７６】
細胞および薬剤治療
マイクロアレイデータおよび腫瘍試料。４種の前述の乳癌マイクロアレイデータセットを、この研究に使用し、全発現プロフィールを、原典であるウプサラコホート（ミラー、エル ディーら（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２、１３５５０〜１３５５５）、ストックホルムコホート（パウィタン、ワイら（Ｐａｗｉｔａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７、（Ｒ９５３〜９６４）、ベルギーコホート（ルイ、エスら（Ｌｏｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５、１２３９〜１２４６）およびシンガポールコホート（イブシナ、エー ブイら（Ｉｖｓｈｉｎａ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、１０２９２〜１０３０１）に記載されているように、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＵ１３３ＡおよびＵ１３３
Ｂの遺伝子チップを使用して発生させた。全ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＣＥＬファイルを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）から検索し、グローバル平均法（ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）を使用して標準化し、プローブセットのシグナル強度を自然対数変換し、平均強度をｌｏｇ ５００の標的シグナル値に調整することによって尺度化した。コホート依存性アレイのバイアスを取り除くために、それぞれのコホート内のアレイを、それらを１つのデータセットに組み込む前に平均化した。すべての患者および腫瘍試料の臨床的特徴を、図２に要約した。
【００７７】
局所的特異値分解（ＬＳＶＤ）。マイクロアレイのプローブセットを、ＵＣＳＤ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒに従ってゲノム座標にマッピングした。候補ＰＥＡを、対応する腫瘍のサブセット中の遺伝子の、局在座標化された過剰発現として同定した。第１に、遺伝子を、試料中の遺伝子の発現が、全試料にわたったその発現中央値から調整された中央絶対偏差（ａＭＡＤ）の２．５倍を超えた場合に、試料中の過剰発現として定義した（図１、第１工程）。第２に、局所座標化された過剰発現を、５０のプローブのスライディングウィンドウに適用したＳＶＤにより得られた主固有値によって定量化した。同じ遺伝子に対応するプローブ（ＵｎｉＧｅｎｅ ＩＤ、ｂｕｉｌｄ ＃１７７に対応する）を平均し、単一遺伝子の測定値を表した。候補ＰＥＡを、ベースライン閾値を上回る局所主固有値を有する連続した染色体領域として同定した。候補ＰＥＡにスコアを付け、主固有値のピークによりランク付けした。最も高いスコアを得た候補ＰＥＡを、ピーク構造をさらに解明するために（すなわち、複数のサブピークから１つを識別するために）、１０のプローブのウィンドウサイズを使用して、ＬＳＶＤの第２ラウンドに供した。最後に、最も高いスコアを得たサブピークを、個人の遺伝子および腫瘍に関する固有重量を導くために、その後ＳＶＤに供した。固有重量は、主固有ピークの大きさに対する、遺伝子および腫瘍の相対的寄与率を反映する。得られたピークに関して、非ゼロの固有重量を有する遺伝子は、ＰＥＡの成分であると考えられる。中央値＋２標準偏差を超える固有重量を有する腫瘍を、アンプリコン含有腫瘍として分類した。（ＴＲＩＡＧＥ、第４工程）。
【００７８】
再発性ゲノム増幅を同定するための局所特異値分解（ＬＳＶＤ）
腫瘍試料のコホートに由来する遺伝子発現プロフィールのＬＳＶＤ分析は、推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）の同定における鍵となる第１の工程であり、これにより、転移に寄与する癌遺伝子を、ＴＲＩＡＧＥ（Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓを介した癌遺伝子三角検証（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓ））方法論により発見できる。ＬＳＶＤは、再発性アンプリコンが、腫瘍試料のサブセット中にゲノム的に局在化された遺伝子の座標化された過剰発現として現れるという仮説に基づき、ＰＥＡを同定する。ＬＳＶＤは、特異値分解（ＳＶＤ）（ストラング、ジー（Ｓｔｒａｎｇ，Ｇ．）、（１９９８）「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｎｅａｒ Ａｌｇｅｂｒａ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．７．第３版、ウェルズリ−ケンブリッジプレス社（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ−Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｓｓ．）ＩＳＢＮ ０−９６１４０８８−５−５）を中心に構築されており、染色体ごとのＳＶＤの局所適用により得られる、局所主固有値（ＬＰＥＶ）のプロットである、座標化された局所過剰発現プロットのピークとしてＰＥＡを予測する。ＬＳＶＤは、ゲノム上の各ゲノムの位置に関する局所発現行列を導き、バイナリ連結行列に変換し、バイナリ行列にＳＶＤを適用することにより達成される。このような適用で得られた主固有値は、その遺伝子座における遺伝子の座標化された過剰発現の基準である（クルーガー、ワイら（Ｋｌｕｇｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、７０３〜７１６；クラインバーグ、ジェイ エム（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．）、（１９９９）ＡＣＭのＪｌ、４６、５、６０４〜６３２）。ＬＰＥＶ対ゲノム位置のプロット（ＬＰＥＶプロット）における特定のベース閾値を上回る、固有値の「ピーク」は、ＰＥＡの境界を定める。ＬＳＶＤの手順の詳細
な説明は、以下に提供する。
【００７９】
Ｅｃを、染色体Ｃｃの遺伝子発現行列とし、Ｅｃｉｊ（注：ＥｃｉｊはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）を、腫瘍Ｔｊの中の位置ｌｉにおける遺伝子の発現のｌｏｇ２とし、ｉ＝１、２、．．．、Ｎｃ、およびｊ＝１、２、．．．、Ｍである。Ｃｃ上の推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）は、ＬＳＶＤを使用してＥｃを分析することによって予測され、ＬＳＶＤは以下の順序の工程：（１）Ｅｃ（注：ＥｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）を、バイナリ連結行列Ａｃ（注：ＡｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）に変換する工程、（２）染色体局在化行列Ａｐｃ（注：ＡｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）を導く工程、（３）ＡｐｃにＳＶＤを適用する工程、および（４）ＰＥＡを同定する工程、を有する。
【００８０】
１．Ｅｃのバイナリ連結行列Ａｃへの変換：Ｅｃを、以下のようなブールの離散化定理を介して、バイナリ連結行列Ａｃへ変換する（注：Ｅｃ、ＡｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）。
【００８１】
Ｅｃｉｊ＞μｉ＋ｘ＊νｉの場合Ａｃｉｊ＝１
Ｅｃｉｊ≦μｉ＋ｘ＊νｉの場合Ａｃｉｊ＝０
μｉおよびνｉが中央値であり、調整中央絶対偏差（ａＭＡＤ）が、Ｅｃｉ＝｛Ｅｃｉ１、Ｅｃｉ２、．．．、ＥｃｉＭ｝である場合、ａＭＡＤはＭＡＤの１．４８２６倍である。ｘは、粗いマップの第１のパスに関しては２．５であり、第２のパスにおいて得られた、より詳細なマップに関しては２である。
【００８２】
２．局所行列Ａｐｃの導き（注：ＡｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）。
位置Ｌｐｃにおける局所行列Ａｐｃは、染色体Ｃｃ上の位置ｐ−ｗからｐ＋ｗまでの遺伝子を使用してＡｃから導き、ｗはウィンドウサイズであり、所定のパラメーターである。ｗは、第１のパスの粗いマップに関しては５０であり、第２のパスのより詳細なマップに関しては１０である。
【００８３】
３．特異値分解（ＳＶＤ）：ＳＶＤのＡｐｃへの適用は、ＰＥＡを予測するための重要な工程である。ＡｐｃのＳＶＤは、Ａｐｃを３つの行列、Ｕｐｃ、Σｐｃ、Ｖｐｃ（注：Ｕｐｃ、Σｐｃ、ＶｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）の積、すなわちＡｐｃ＝Ｕｐｃ×Σｐｃ×ＶｐｃＴに分解する。ＵｐｃおよびＶｐｃは、それぞれ、（２ｗ＋１）×（２ｗ＋１）およびＭ×Ｍの行列であり、一方Σｐｃは、（２ｗ＋１）×Ｍの対角行列である。ＵｐｃおよびＶｐｃの列ベクトルは、それぞれ、ＡｐｃＡｐｃＴおよびＡｐｃＴＡｐｃ（注：ＡｐｃＡｐｃＴおよびＡｐｃＴＡｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）の固有ベクトルであり、一方Σｐｃ（注：ΣｐｃはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）の対角成分は、各固有値である。最も高い固有値を、主固有値（λｐｃで表す）と呼び、各固有ベクトルを主固有ベクトルと呼ぶ。位置Ｌｐｃにおける腫瘍Ｔｊの固有重量はＴｐｃｊで表され、行列ＡｐｃＴＡｐｃの主固有ベクトルのｊｔｈ成分の絶対値として定義する。同様に、Ｇｐｃｊで表される、位置Ｌｐｃにおける遺伝子Ｇｉの固有重量は、行列ＡｐｃＡｐｃＴの主固有ベクトルのｊｔｈ成分の絶対値である。
【００８４】
真のＰＥＡシグナルとバックグラウンドとの差異を改善するために、本発明者らのＬＳＶＤの実施において、本発明者らは、ＳＶＤを、Ａｐｃについて使用する代わりに（ＡｐｃＡｐｃＴ）３について使用し、λｐｃを見出した。上記の定義に従って、腫瘍および遺伝子の固有重量が、それぞれ（ＡｐｃＴＡｐｃ）４および（ＡｐｃＡｐｃＴ）４の主固有ベクトルから得られた。ここで、λｐｃは、（ＡｐｃＡｐｃＴ）４対Ｍ４の主固有値４乗根との比であり、遺伝子および腫瘍の固有重量は、それぞれ、（ＡｐｃＡｐｃＴ）４／Ｍ
４および（ＡｐｃＴＡｐｃ）４／Ｍ４の主固有ベクトルの各成分の４乗根である（注：ＡｐｃおよびＡｐｃＴはＰＣＴ出願時英文ではベクトルのため太字）。
【００８５】
４．ＰＥＡの予測：
λｐｃ対Ｌｐｃをプロットすることにより、ＬＰＥＶのプロットが得られ、これをＬＰＥＶプロットと呼ぶ。このプロットのピークは、ＰＥＡを示す。ピークにおけるλｐｃの値が高いほど、Ｌｐｃの周りのＰＥＡの信頼性が高い。最終的に、ＰＥＡは、λｐｃ＞Ｔλ＝２０を含む、連続した領域を対象とする範囲を有するピークおよびこのピークを中心として報告される。
【００８６】
ＴＲＩＡＧＥ遺伝子生存率分析。各プローブセットに関して、平均発現レベルを、所与のコホートに関してまず計算した。その後、患者を、平均より下の群と平均より上の群とに階層化し、コックス比例ハザード回帰モデルをこのデータに適合させ、無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）に基づくハザード比を計算した。帰無仮説は、２つの群は再発の危険性が同じであろうと言うものであり、尤度比検定のｐ値はこの仮説に対する証拠として計算した。コックスモデルの適合および統計的計算を、Ｒでサバイバルパッケージ（ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｃｋａｇｅ）を使用して実施した。同じ遺伝子にマッピングされた複数のプローブセットの場合、最も有意に関与するプローブセットの結果が報告された。ＤＭＦＳを、外科手術から最初の遠隔再発事象または最後の追跡調査の日までの時間間隔として定義した。両側および対側の癌を有するすべての患者ならびに再発したまたは診断後１０年を超えて疾患特異的な死を迎えた人を、事象に関して体系的に審査した。ウプサラコホートは最も長く、最も完全に患者を追跡調査したコホートに基づく、本発明者らの最も大きい集団であったので、それを使用し、ＴＲＩＡＧＥにおける生存率データを作成した。
【００８７】
増殖サインおよび遺伝子相関。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、ウィットフィールドら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ）は８５０を超える細胞周期調節遺伝子を、ヒーラ子宮頸癌細胞においてすでに同定していた（ウィットフィールド、エム エルら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、（２００２）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ、１３、１９７７〜２０００）。著者らは、乳房の腫瘍における高度に相関した発現を示し、ペローら（Ｐｅｒｏｕ ｅｔ ａｌ）の乳癌データセット（ペロー、シー エムら（Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０６、７４７〜７５２）の腫瘍細胞増殖に関与した、これらの遺伝子の分画を発見した。この増殖サインの近似値を求めるために、本発明者らは、細胞周期調節遺伝子（ウィットフィールド（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ）の研究における１，１３４ ＩＭＡＧＥクローンに対応する）を、Ｕｎｉ Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄ ＃１８７を介してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットにマッピングし、ウプサラコホートの腫瘍を階層的にクラスタ化した。増殖関連遺伝子を含む独特のクラスタが現れ（図１０を参照されたい）、組織学的悪性度、分裂指数およびＫＩ６７スコアを含むウプサラコホートにおける増殖のマーカーと高度に相関することが見出された（データ非掲載）。＞０．８の平均相関を有する、このクラスタの中心となるプローブセット（ｎ＝７８のプローブセットが６７の遺伝子に対応する（図１０を参照されたい））を、「コア増殖サイン」遺伝子に指定し、それらの平均発現を使用して、増殖サインと、ＴＲＩＡＧＥ分析の第７工程のための他のすべてのプローブセットとのピアソン相関を計算した。増殖と癌の再発との臨床的関連性次第では、特に、この工程は、他の癌型のＴＲＩＡＧＥ分析には必須ではないことがある。
【００８８】
ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）の選択およびクローン化。ＲＣＰの３種のスプライス変異体：変異体１（ＮＭ＿０２５１５１）、変異体２（ＮＭ＿００１００２２３３）および変異体３（ＮＭ＿００１００２８１４）を、ＧｅｎＢａｎｋで同定した。これらの中で、変異体１および３だけが、腫瘍試料および細胞系においてＲＴ−ＰＣＲにより一貫して検
出でき（データ非掲載）、変異体１だけが、ポリクロナールＲＣＰ抗体（ＧｅｎＷａｙ）を用いたウェスタンブロットにより観察できた。したがって、ＲＣＰの完全長変異体１は、正常なヒト血液からＲＴ−ＰＣＲにより増幅され（順方向プライマー：５’−ＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＧＧＴＣＴＣＧＧＣＴ−３’（配列番号１）、逆方向プライマー：５’−ＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴ−３’）（配列番号２））、配列を確認し、この研究においてＲＣＰの機能を調査するために使用した。
【００８９】
細胞系および一過性形質移入。ヒト乳房細胞系、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、３７℃、５％ＣＯ２で、ＡＴＣＣにより推奨されている成長培地で維持した。完全長ＲＣＰをｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨｌおよびＥｃｏＲ１部位に連結した。２種のＲＣＰ特異的ＲＮＡｉ構築体を、先に記載したように（レイノルズ、エーら（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２、３２６〜３３０）設計し、Ａｍｂｉｏｎにより作製した。ＭＣＦ７について、一過性プラスミドおよびＲＮＡｉの形質移入を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【００９０】
レンチウィルスに感染させることによる安定細胞系の作製。ｓｈＲＮＡを安定して過剰発現する細胞系を作成するために、標的配列（順方向：５’−ＴＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＡｇＡｇＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号３）および逆方向：５’−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＡ−３’）（配列番号４）をコードするオリゴヌクレオチドを、ＬｅｎｔｉＬｏｘ ｐＬＬ３．７ベクターにアニーリングし、クローン化した。対照ｓｈＲＮＡのために、非標的「スクランブル」配列を、ｐＬＬ３．７．（順方向：５’−ＴＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣｔｔｃａａｇａｇａＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号５）および逆方向：５’−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡ−３’）（配列番号６）内にクローン化した。レンチウィルスによるＲＣＰの過剰発現のために、ＲＣＰをまず、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｇａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ３Ｃにクローン化し、さらに、レンチウィルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に、製造業者のプロトコルに従ってＬＲ組換え反応により組換えた。レンチウィルスの作製のために、ｐＬＬ３．７またはｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴを、パッケージングベクターを用いて、２９３ＦＴ細胞に共形質移入し、４８時間後に上清を収穫した。ウィルスを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター内で、２５，０００ｒｐｍで２時間、超遠心分離器にかけて濃縮し、リン酸緩衝食塩水に再懸濁した。力価を、濃縮ウィルスの段階希釈液を用いて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に感染させることによって確定した。標準的な調製用に、力価は、ｐＬＬ３．７に関してはおよそ１〜５×１０８粒子であり、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターに関しては４−１０×１０７粒子であった。ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＭＢ２３１細胞の感染のために、２×１０５細胞を、１×１０７粒子および８μｇ／ｍｌポリブレンの懸濁液中で、３時間、３７℃においてインキュベートした。細胞をその後、再度播種し、前記のように培養した。ＲＣＰノックダウン安定細胞の純粋な集団を得るために、ＧＦＰ陽性細胞を、培養４日後に選り分けた。ＲＣＰ過剰発現安定系の作製のために、細胞を、ブラストサイジンを用いて感染２週間後に選択した。
【００９１】
ウェスタンブロット分析。すべての細胞溶解物を、ＲＩＰＡバッファーを使用して調製した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＦ メンブラン（ジーイーヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に転写した。ＲＣＰ
（ジェンウェイ社（Ｇｅｎｗａｙ）、カタログ番号（ＣＮ）：１５−２８８−２１５７４Ａ）、β−アクチン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ＣＮ：Ａ５４４１）、ホスホ−Ａｋｔ（セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＮ：９２７１）、Ａｋｔ（セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＮ：９２７２）、ホスホ−Ｅｒｋ（セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＮ：９１０１）およびＥｒｋ（セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、ＣＮ：９１０２）に対する抗体を使用して、メンブランを調査し、抗体−タンパク質複合体を、ＨＲＰ標識抗体およびＥＣＬ（アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））により検出した。
【００９２】
細胞増殖およびコロニー形成。細胞を、９６ウェルプレートに、５０００細胞／ウェルの濃度で播種し、細胞増殖を、ＷＳＴ−１（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用し、製造業者のプロトコルに従って４重に測定した（すなわち、条件当たり４ウェル）。ＭＡＰＫ阻害アッセイのために、９６ウェルプレートに再度播種する前に、細胞を、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、０．５％の血清を含む培地で一晩処理した。足場非依存性コロニー形成に関するＲＣＰの作用を試験するために、細胞を、２５％ＦＢＳを含む完全培地に溶解した０．３％寒天（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））２５０μｌに再懸濁し、５００μｌの０．６％寒天ベースであらかじめコーティングした２４ウェルプレートに４重（すなわち、条件当たり４ウェル）に播種した。コロニー形成の効率を、播種の２１日またはそれ以後に、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いて染色することによって検査した。コロニーの大きさが５０ｕｍを超えるコロニーをＬｅｉｃａ ＱＷｉｎソフトウェアを使用して計測した。
【００９３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの浸潤および遊走。トランスウェルの遊走および浸潤アッセイを、孔サイズ８μｍのＦａｌｃｏｎ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４マルチウェルインサート（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して実施した。浸潤アッセイのために、インサートを、８０μＬの、無血清成長培地中の、２０μｇのＭａｔｒｉｇｅｌ（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））でコーティングした。両方のアッセイのために、２００μＬ無血清成長培地中の５０００細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む７５０μＬ完全成長培地を、下方のチャンバーに入れた、各トランスウェルインサートに入れた。２４時間後、インサートの孔を介して遊走または浸潤した細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、２．５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて１５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用してＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ（セロミクス社（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ））上で計測した。フィールドサイズは１ｍｍ２であった。浸潤アッセイのために、実験を４〜５倍の複製を用いて実施し、実験ごとに１０〜１６個のフィールドをスキャンした。遊走アッセイのために、実験を３倍の複製を用いて実施し、実験ごとに１０〜１６個のフィールドをスキャンした。
【００９４】
細胞の免疫蛍光顕微鏡検査。細胞培養物を、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて透過処理し、その後１％ヤギ血清を用いてＰＢＳ中でブロッキングした。細胞を、抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ビーディーファルミンゲン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＮ：６１０４０４）および１：５００希釈のフィブロネクチン抗体（ビーディーファルミンゲン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＮ：６１００７７）を用いて染色し、その後、マウスおよびウサギのＩＧｇを検出する適切な２次抗体を、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４または４８８（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））に接合した。Ｆ−アクチンは、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いて標識した。ＤＡＰＩを、核の染色に使用した。画像を共焦点顕微鏡、（ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ、ツァイス社（Ｚｅｉｓｓ））を用いて獲得した。
【００９５】
細胞周期分析。ＭＣＦ１０Ａ細胞を、１％血清中で４８時間飢餓状態にした。細胞をその後、７５％エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ Ａ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を用いて処理し、ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍｌ）を用いて染色し、ＬＤＲ２フローサイトメーター（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析した。分類した細胞を、ＦＡＣＳ ＤｉＶａソフトウェア（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して分析した。
【００９６】
アポトーシスアッセイ。ＭＢ２３１細胞を、４８時間、完全培地で維持または１％血清を用いて飢餓状態にした。アポトーシス細胞を、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を用いて検出した。ＤＮＡ鎖の壊れた細胞を、ＴＭＲ（赤）を用いて、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）反応により標識し、蛍光顕微鏡検査およびフローサイトメトリーにより分析した。
【００９７】
ヌードマウスにおける腫瘍原性。メスのＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウス、６〜８週齢を、無菌条件下で、温度調節室において、１２／１２時間の明／暗スケジュールで、食餌および水は好きな時に取らせて飼育した。動物およびそれらの世話に関するすべての手順は、国内的および国際的規格に従った。ＭＣＦ−７腫瘍形成実験のために、１．７ｍｇの１７β−エストラジオールのペレット（９０日放出、イノベイティブリサーチオブアメリカ社（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ））を、腫瘍細胞の注入１週間前に各マウスに移植し、ＭＣＦ−７細胞のエストロゲン要求性を補った。実験群は、ＭＣＦ７−ＲＮＡｉ ＲＣＰ（安定ＲＣＰノックダウン）、ＭＣＦ７−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ（対照）、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ ＲＣＰ、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌであった。各実験群に関して、８匹のマウスの皮下（右および左の後脚上部）に２．０×１０６の細胞を注入した。皮下腫瘍を、デジタル計測器を用いて、週に１回測定した。腫瘍の堆積は、ａｂ２／２としてｍｍ３で計算し、ａおよびｂは、それぞれ直交する、腫瘍の最も長い径および最も短い径である。腫瘍重量は終了時に測定し、シンガポール動物飼育規則に従って死亡させた。
【００９８】
免疫組織化学。４μｍの厚さのパラフィン包埋腫瘍組織切片を、ＡＢＣ免疫組織化学試薬およびアビジン−ビオチンブロッッキング試薬（ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用して、製造業者のプロトコルに従って染色した。スライドを、１：５００希釈の抗ＲＣＰ抗体と共にインキュベートし、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００９９】
結果
上記のデータにより、ゲノム、転写および臨床的な情報の座標分析が、転移性再発および患者の死に寄与していると思われる癌の新規遺伝子の発見を良好に対象とでき、その結果、下流の機能研究のための遺伝子の理論的優先順位付けが容易になることが実証された。ヒト乳癌における、複数機能の頻繁に発生する癌遺伝子としてのＲＡＢ１１ＦＩＰ１の例示的検証は、治療標的としてのその重要性を強調し、発癌におけるエンドサイトーシス再循環経路の新たな役割に新しい洞察を提供する。
【０１００】
例示目的で、ヒト乳癌形成において複数の病理学的役割を有する新規な癌遺伝子として染色体８ｐ１１に位置する、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１の機能的検証を本明細書で提供する。ＲＡＢ１１ＦＩＰ１は、Ｒａｂ４およびＲａｂ１１の結合タンパク質としてすでに同定され
ており、Ｒａｂカップリングタンパク質（ＲＣＰ）とも呼ばれ、これはエンドソームの再循環および受容体の分類において機能する（リンゼイ、エー ジェイら（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７、１２１９０〜１２１９９；ペデン、エー エーら（Ｐｅｄｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １５、３５３０〜３５４１）。ＲＡＢ１１およびＲＡＢ２５の異常調節を介して、発現は、多くのヒトの腫瘍の一般的要素として示され（例えば、チェン、ケイ ダブリュら（Ｃｈｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０、１２５１〜１２５６；チェン、ケイ ダブリュら（Ｃｈｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４０３、２０２〜２１５；ゲブハルド、シーら（Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ａｍ ＪＰａｔｈｏｌ １６７、２４３〜２５３；ゴールデンリング、ジェイ アールら（Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｙａｌｅ ＪＢｉｏｌ Ｍｅｄ ７２、１１３〜１２０；ヨーン、エス オーら（Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、２７６１〜２７６９を参照されたい）、腫瘍進行におけるＲａｂ結合タンパク質の役割については記載されていない。本発明者らは、臨床的およびゲノム的交差を介して癌形成の関連癌遺伝子に三角検証を用いる、統合分析戦略を考案し、これは、発現の頻度、アンプリコンにおける共発現、患者の無病生存率との関連を考慮し、腫瘍増殖の偶発的関連は考慮に入れない。この多段階工程のデータ検索研究法である、略してＴＲＩＡＧＥ（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓ、以下を参照されたい）を使用して、本発明者らは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１を癌遺伝子として同定した。
【０１０１】
ＴＲＩＡＧＥによる癌遺伝子の推論
進行性乳癌に寄与する癌遺伝子を同定するために、このような遺伝子の特定のサブセットは、転写学的、ゲノム的および臨床的情報の三角検証を介して発見できるという仮説を立てた。特に、本発明者らは、１）再発性増幅の領域に位置し、２）遺伝子の異常調節により活性化し、３）癌の転移性播種に関連する癌遺伝子を明らかにするよう探求した。この目標のために、本発明者らは、ＴＲＩＡＧＥ（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｓ）と呼ばれる、複数工程のデータ検索研究法を開発し、これは、発現マイクロアレイデータにおける再発性ゲノムアンプリコンの発現フットプリントを同定し、遺伝子発現を、転移性再発の危険性と関連付け、生存率相関および比較ｍＲＮＡ動学に基づく遺伝子の立候補を評価する（図１）。
【０１０２】
第１の工程において、７３７例の原発性乳房腫瘍のマイクロアレイ発現プロフィール（図２）を、局所特異値分解（Ｌｏｃａｌ Ｓｉｎｇｕｌａｒ Ｖａｌｕｅ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＬＳＶＤ）により分析し、再発性ゲノムアンプリコンの存在および位置を推測した。この研究は、再発性アンプリコンは、関連遺伝子の過剰発現を座標化することによって検出できるという前提に基づき（チン、ケーら（Ｃｈｉｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １０、５２９〜５４１；レアル、エフら（Ｒｅｙａｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、１３７６〜１３８３）、乳癌において高度に増幅した遺伝子の大部分が同時過剰発現であるという証拠に支持されている（ポラック、ジェイ アールら（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９、１２９６３〜１２９６８）。ＬＳＶＤは、遺伝子の過剰発現が濃縮されたゲノム座および「遺伝子座特異的」過剰発現を生じる腫瘍分画の同時同定を可能にする。アウトプットは、遺伝子座特異的過剰発現の程度および関連する腫瘍数の両方を反映する、主固有ピークとしてみなされる。全ゲノムＬＳＶＤにより発見された、最も高いスコアを得た主固有ピークは、再発性コピー数増加の公知の領域に対応する遺伝子座に優勢にマッピングされた（図３を参照されたい）。ＬＳＶＤによりすべてのピークが同定されたわけではないが、再発性ア
ンプリコン事象を表すことが期待され、公知の再発性アンプリコンと、非常に大きく、正確なゲノム重複を有するものを推定発現アンプリコン（ＰＥＡ）と呼び、ＴＲＩＡＧＥ手順によりさらに調査した。
【０１０３】
対象となる癌遺伝子の発現レベルは、患者の予後不良に相関するだろうという指針に基づき、ＰＥＡ内の遺伝子を、遠隔再発関連の有意性に関して評価した。各遺伝子のために、腫瘍（および対応する患者）を、低発現群（平均より低い）または高発現群（平均より高い）に、２つに分け、コックス比例ハザード回帰により、無遠隔転移生存率（ＤＭＦＳ）に関して分析した（図１、第２および第３工程）。得られたハザード比の有意性を反映する尤度比検定のＰ値を、ＰＥＡの遺伝子の発癌性の初期基準として使用した（図１、第３工程、任意抽出の生存率）。しかし、再発性ゲノムアンプリコンは、患者の生存率不良に相関し得るので、アンプリコン上に物理的には存在する良性の「パッセンジャー遺伝子」もまた、腫瘍の侵攻に機能的に寄与することなくＤＭＦＳ不良に相関でき、一方、ドライビング癌遺伝子（コピー数増加以外の機序により癌において活性化できる）は、アンプリコンを欠いた腫瘍においてＤＭＦＳ不良との相関を維持することが予想され、パッセンジャー遺伝子は予想されない。したがって、この分析から審査される、遺伝子発現と、含有アンプリコン腫瘍のＤＭＦＳとの相関を再検査した。（図１、第４工程、任意抽出）。この方法では、増幅事象に非依存性の、ＤＭＦＳ不良に確実に関連するそれらの候補癌遺伝子のみが分かってくるであろう。
【０１０４】
生存率分析の両方の工程において有意な候補癌遺伝子を、ｍＲＮＡ発現パターンの比較を介してさらに精査した（図１、第５および６工程）。ドライビング癌遺伝子は、アンプリコン含有腫瘍において比較的高度に一貫して発現されるはずであるという仮定に従って、ＰＥＡ内の遺伝子発現レベルを平均し、その次に遺伝子を平均発現によりランク付けした（ランク１が、最も高い平均発現レベルを表す）。この方法では、発現のランキングは、所与の遺伝子座における発癌性のさらなる相対的尺度として機能する。
【０１０５】
高増殖性乳房腫瘍は、再発する可能性が高く、増殖に関連する遺伝子は、多くの場合ＤＭＦＳ不良に相関している。このことは、細胞周期機能を濃縮する、何百の高度関連遺伝子からなる増殖サインにおいて実証され、これは多くの癌型の再発に正に相関することが見出された（ダイ、エイチら（Ｄａｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、４０５９〜４０６６；イブシナ、エー ブイら（Ｉｖｓｈｉｎａ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、１０２９２〜１０３０１；ペロー、シー エムら（Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ
４０６、７４７〜７５２；ローゼンウォルド、エーら（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．）（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３、１８５〜１９７；ウィットフィールド、エム エルら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（２００２）Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １３、１９７７〜２０００；ウィットフィールド、エム エルら（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ６、９９〜１０６）。この調査は、増殖との関連とは非依存性の、発癌に寄与する固有の遺伝子に関し、ＴＲＩＡＧＥの最終工程において、候補遺伝子の発現パターンを増殖サインとの相関について試験し、生存率との関連が腫瘍の増殖率により説明できる程度を検討した。ＤＭＦＳ不良に相関する、ウプサラ乳房腫瘍コホートのプローブセット（ｎ＝２５１腫瘍）を図４に表す。ＤＭＦＳ不良（ｐ＜０．０５）に有意に相関することが見出された、２，３７７のプローブセットの約３５％が、ピアソン相関が、＞０．４でこの増殖サインのメンバーであることが見出された（図４）。増殖サインの中核コア遺伝子は、クラスタ化の順に、Ｂ．２２２９５８＿ｓ＿（ＤＥＰＤＣ１）、Ａ．２０４１７０＿ｓ＿（ＣＫＳ２）、Ｂ．２２２６８０＿ｓ＿（ＤＴＬ）、Ａ．２０９６８０＿ｓ＿（ＫＩＦＣ１）、Ａ．２０２５０３＿ｓ＿（ＣＳＮＫＩＧ１）、Ａ．２０１２９１＿ｓ＿（ＴＯＰ２Ａ）、Ａ．２０１２９２＿（ＴＯＰ２Ａ）、Ａ．２０４０３３＿（ＴＲＩＰ１３）、Ｂ．
２２５６８７＿（ＦＡＭ８３Ｄ）、Ａ．２００８５３＿（Ｈ２ＡＦＺ）、Ａ．２１３９１１＿ｓ＿（Ｈ２ＡＦＺ）、Ａ．２０３３６２＿ｓ＿（ＭＡＤ２Ｌ１）、Ｂ．２２８７２９＿（ＣＣＮＢ１）、Ａ．２１４７１０＿ｓ＿（ＣＣＮＢ１）、Ａ．２０３７５５＿（ＢＵＢ１Ｂ）、Ｂ．２２８３２３＿（ＣＡＳＣ５）、Ａ．２０４８２５＿（ＭＥＬＫ）、Ａ．２０４８２２＿（ＴＴＫ）、Ａ．２０７８２８＿ｓ＿（未知）、Ａ．２０２８７０＿ｓ＿（ＣＤＣ２０）、Ａ．２２２０３９＿（ＬＯＣ１４６９０９）、Ａ．２０４９６２＿ｓ＿（ＣＥＮＰＡ）、Ｂ．２２８２７３＿（未知）、Ａ．２０９４０８＿（ＫＩＦ２Ｃ）、Ａ．２０２７０５＿（ＣＣＮＢ２）、Ａ．２２２０７７＿ｓ＿（ＲＡＣＧＡＰ１）、Ａ．２１８５４２＿（ＣＥＰ５５）、Ａ．２０３２１３＿（ＣＤＣ２）、Ａ．２０３２１４＿ｘ＿（ＣＤＣ２）、Ａ．２１０５５９＿ｓ＿（ＣＤＣ２）、Ａ．２１８０３９＿（ＮＵＳＡＰＩ）、Ａ．２１８００９＿ｓ＿（ＰＲＣ１）、Ａ．２０４４４４＿（ＫＩＦ１１）、Ａ．２１００５２＿ｓ＿（ＴＰＸ２）、Ａ．２１９９１８＿ｓ＿（未知）、Ａ．２０３７６４＿（ＤＬＧ７）、Ｂ．２２３３０７＿（ＣＤＣＡ３）、Ａ．２０２０９５＿ｓ＿（ＢＩＲＣ５）、Ａ．２０２９５４＿（ＵＢＥ２Ｃ）、Ａ．２０２５８０＿ｘ＿（ＦＯＸＭ１）、Ａ．２１８７２６＿（ＤＫＦＺｐ７６２Ｅ１３１２）、Ａ．２０３５５４＿ｘ＿（ＰＴＴＧＩ）、Ａ．２０９６４２＿（ＢＵＢ１）、Ａ．２０９７７３＿ｓ＿（ＲＲＭ２）、Ａ．２０１８９０＿（ＲＲＭ２）、Ａ．２０４６４１＿（ＮＥＫ２）、Ａ．２１８３５５＿（ＫＩＦ４Ａ）、Ａ．２０８０７９＿ｓ＿（未知）、Ａ．２０４０９２＿ｓ＿（ＡＵＲＫＡ）、Ａ．３８１５８＿（ＳＰ１）およびＡ．２１８７５５＿（ＫＩＦ２０Ａ）。乳癌において、ＤＭＦＳ不良に有意に相関することが見出されたプローブセットのおよそ１／３が、増殖サインのメンバーであることが同定されたので、生存率不良関連遺伝子のおよそ３つに１つが、非依存性発癌機序ではなく、増殖との関連により最もよく説明できる。したがって、発明者らは、選択過程において、生存率に有意に関連し、さらに（＞０．４の）増殖サインと相関する候補遺伝子の優先順位を下げた、または考慮に入れなかった。
【０１０６】
この分析研究の妥当性を試験するために、ＴＲＩＡＧＥを、全ゲノムのＬＳＶＤにより同定された最も大きな主固有ピークに用いた。これは、約３０の遺伝子を包含する染色体１７ｑ１２の１Ｍｂ領域に対応する。このＰＥＡの遺伝子成分を、ＥＧＦＲ−関連癌遺伝子ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）に収めた、乳癌の症例の約２０〜３０％に生じることが公知である、十分に特徴づけられた１７ｑ１２アンプリコンに正確にマッピングした。特に、このアンプリコンの発現フットプリントは、すでにマイクロアレイ研究において観察されており、アレイ−ＣＧＨにより判別されるように、物理的アンプリコンの境界とよく相関することが示されている（チンら（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．）、２００６、上記；ポラックら（Ｐｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．）、２００２、上記）。このＰＥＡを示す腫瘍において、本発明者らは、免疫組織化学によりＨＥＲ２陽性の強い濃縮を見出し（Ｐ＜１．０×１０−２６；カイ二乗検定）、このＰＥＡが物理的１７ｇｌ２アンプリコンに対応する証拠と一致する（図５Ａ、図５Ｃ、黒色の垂直のバー）。初期の（任意抽出の）遺伝子生存率分析により、ＤＭＦＳに有意に関連するこのＰＥＡの中の６つの遺伝子が同定された（図５Ａ）。ＰＥＡを有する腫瘍を有する患者の不在下での生存率（すなわち選択された生存率）の再分析では、ＤＭＦＳに有意に関連する２つの遺伝子：ＴＣＡＰおよびＥＲＢＢ２のみが残った。どちらも増殖サインと強く相関しないが、ＥＲＢＢ２は最も強い発現ランキングを有した（図５Ｅ）。したがって、ＴＲＩＡＧＥにより、ＥＲＢＢ２（受容体チロシン−タンパク質キナーゼ、ｅｒｂＢ−２の前駆体をコードする）を、転移促進癌遺伝子および乳癌における治療標的としてのその公知の役割とは無関係に、１７ｑ１２遺伝子座における発癌ドライバーの「トップ候補」として同定した。
【０１０７】
ＬＳＶＤにより同定された第２の大きな主固有ピークを、１．５Ｍｂにわたる領域で２２の遺伝子を包含する、第８染色体のｐ腕にマッピングした。このＰＥＡは、乳癌の１０〜２５％に発生することが公知の、すでに記載された８ｐ１１−１２アンプリコンと遺伝子レベルで正確に重複することが見出された。（ガルシア、エム ジェイら（Ｇａｒｃｉ
ａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４、５２３５〜５２４５；ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、（２００５）Ｍｏｌ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３、６５５〜６６７；ルテシア、エーら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２００６）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ６、２４５；レイ、エム イーら（Ｒａｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．）（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４、４０〜４７）。このアンプリコンの発癌ドライバーは、十分に特徴づけられていない。ＴＲＩＡＧＥによって、本発明者らは、遠隔転移の危険性の増加に有意に関連するこのアンプリコン上の３つの遺伝子：ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ１およびＷＨＳＣ１ＬＩを特定した（図５Ｂ）。選択された遺伝子−生存率の相関の分析において、遠隔転移に有意に関連する、わずか２つの遺伝子、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１およびＷＨＳＣ１ＬＩ（ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼＮＳＤ３をコードする）が残り、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１は、遠隔再発との最も有意な関連および最も高い発現ランクを有した（図５Ｅ）。この発見に基づいて、本発明者らは、乳癌の発癌特性に関するＲＡＢ１１ＦＩＰ１の機能的影響を調査した。
【０１０８】
ＲＣＰ過剰発現は、ＭＣＦ１０Ａ細胞を形質転換させる
ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（本明細書ではＲＣＰとも称する）が、乳腺腫瘍においてタンパク質レベルで増幅するかどうかを確認するために、腫瘍進行の様々な悪性度の細胞系のパネルにおいて、市販の抗体を使用して、ウェスタンブロット分析を実施した。ＲＣＰは非腫瘍発生（正常な）乳腺上皮細胞系ＭＣＦ１０Ａにおいて最も低いが、乳癌細胞系、ＣＡＭＡ−１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄにおいて４〜１０倍高いレベルで発現した（図６Ａ）。
【０１０９】
次に、乳癌におけるＲＣＰ増幅の役割を、完全長ＲＣＰ（ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ＿０２５１５１）または対照ベクターを安定して過剰発現するＭＣＦ１０Ａ細胞系を確立することによって調査した。対照細胞は、平板な形態および正常な上皮の単層成長の特徴を示すが（図６Ｂ、左のパネル）、ＲＣＰ過剰発現体は、紡錘様の突起および所々に、形質転換線維芽細胞を連想させる病巣様構造がちりばめられ散在した成長パターンを含む劇的な形態の変化をもたらした（図６Ｂ、右のパネル）。一方、対照ＭＣＦ１０Ａ細胞は、平板な形態および正常な上皮においてより特徴的な上皮型島における単層成長を示した。さらに、コンフルエントで、ＭＣＦ１０ＡＲＣＰ過剰発現細胞は、接触阻止の損失を示し、連続的な多層成長を示した。細胞の免疫蛍光染色により、ＲＣＰ過剰発現が、細胞間の接合部におけるＥ−カドヘリンの欠失およびβアクチン破壊に関連したことが明らかになった。その上、血清飢餓状態において、対照細胞より、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞により多くのフィブロネクチンが観察された（図６Ｃ）。細胞間接触部位におけるＥ−カドヘリン（上皮マーカー）の欠失およびフィブロネクチン（間葉細胞マーカー）の発現増加は、両方ともＲＣＰ−依存性上皮間葉移行（ＥＭＴ）と一致する。
【０１１０】
ＲＣＰの作用をさらに評価するために、本発明者らは、血清および追加成長因子に対する、ＭＣＦ１０Ａ細胞の厳しい要求を活用し、それらの増殖を支えた。安定系を、成長因子の存在下および不在下の両方において維持した。対照細胞と比較して、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は両方の培養条件において増殖率の有意な増加を示した（図６Ｄおよび図８Ａ）。最も興味深いことに、追加成長因子（ＥＧＦ、インスリン）を含まない、１％ＦＢＳの最も厳しい培地において、対照系は６日以内に死亡したが、一方ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は、１カ月を超えて保持でき、成長因子依存性のＲＣＰ−仲介の欠失を示した（図６Ｄ）。ヨウ化プロピジウム染色による細胞周期分析により、血清および成長因子の飢餓の４８時間後、対照細胞の９３％がＧ１期で停止していたのに対してＧ２Ｍ期の細胞はわずか３％であったが、一方、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞において、細胞の約８０％がＧ１期にあり、細胞の約１２％はＧ２Ｍ期にあることが明らかになり、細胞周期進行の調節にお
けるＲＣＰの役割が確認された（図７Ａ）。
【０１１１】
次に、軟寒天でのコロニー形成アッセイにおいて、ＭＣＦ１０Ａ細胞の足場非依存性成長を推進するＲＣＰの能力を試験した。予想通り、対照細胞は、軟寒天においてコロニー形成ができなかった。しかし、それとは大いに異なり、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は４週間後に非常に多くのコロニーを形成し、ＲＣＰが形質転換表現型を誘導できることが実証された（図６Ｅおよび図８Ｂ）。その上、本発明者らは、創傷治癒アッセイ（図６Ｆ）およびトランスウェルアッセイ（図８Ｄ）により実証されるように、ＲＣＰの過剰発現がＭＣＦ１０Ａ細胞の遊走能力を増強していることを観察した。
【０１１２】
ＲＣＰがその癌表現型に影響を与える、１つまたは複数の機序を見抜くために、ＲＣＰの発現が、発癌性成長を制御する主要経路の２つであるＥＲＫまたはＡＫＴのどちらかを介して成長シグナル伝達を活性化できるかどうかを試験した。ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞は、ＥＲＫの強い活性化を示したが、ＡＫＴの活性化は示さなかった（図７Ｂ）。ＲＣＰ誘導性Ｅｒｋ活性化がＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞の増殖の有利性と関連があることを試験するために、ＭＣＦ１０Ａ細胞を、活性および不活性の両方のＭＥＫ１／２の強力な阻害因子であるＵ０１２６で処理した。対照細胞は、Ｕ０１２６濃度の範囲にわたってＥＲＫのリン酸化が低いことを示したのに対して、ＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞におけるＥＲＫのリン酸化状態は、濃度依存性であった（図７Ｃ）。３０μＭのＵ０１２６により、ＥＲＫのＲＣＰ誘導性リン酸化は、ベースラインまで減少し（対照と同じレベル）、一方、ＲＣＰのレベルは変化なかった。重要なのは、３０ｕＭのＵ０１２６により、ＥＲＫのリン酸化が低減したＭＣＦ１０Ａ−ＲＣＰ細胞が、ＲＣＰの発現が高いにもかかわらず、対照レベルまで増殖の減少を示したことである（図７Ｄ）。ＲＣＰ増殖表現型がＥＲＫのリン酸化を介してＭＡＰＫ経路の活性化に依存していることが示唆される。
【０１１３】
ＲＣＰは、多数の乳癌細胞系における腫瘍原性を増強する。
ＭＣＦ７（エストロゲン受容体陽性、ｐ５３−野生型）乳癌細胞におけるＲＣＰの過剰発現は、細胞増殖率、軟寒天におけるコロニー形成活性、および浸潤能を中程度に増加させた（図８Ａ〜Ｃ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ２３１；エストロゲン受容体陰性、ｐ５３陰性）細胞では、ＲＣＰの過剰発現は、コロニー形成活性を増加させたが、細胞増殖率、浸潤および遊走能は増加させなかった（図８Ａ〜Ｄ）。さらに腫瘍原性の調節における内因性ＲＣＰの役割を検証するために、本発明らは、ＲＮＡｉ技術を用いて内因性ＲＣＰの発現を低減した。ＲＣＰを、ｓｉＲＮＡ構築体の一過性形質移入、またはＲＣＰを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウィルスベクターの安定形質導入のどちらかによって「ノックダウン」させた。スクランブル配列を有するＲＮＡｉ構築体を、対照として使用した。ＲＣＰを対象とする非依存性かつ非重複性の、２つのｓｉＲＮＡは、ＭＣＦ７細胞において、タンパク質レベルの４０〜８０％を減少させ、細胞増殖を有意に減少させた（図８Ａ、右のパネル）。ＭＣＦ７細胞におけるＲＣＰのノックダウンもまた、軟寒天におけるコロニー形成を有意に低下させた（図８Ｂ）。ＭＢ２３１細胞において、ＲＣＰは、コロニー形成の阻害を低下させたが、細胞増殖率は低下させなかった（図８Ａ、Ｂ）。両方の細胞系において、ＲＣＰノックダウンは、浸潤および遊走を著しく低減した（図８Ｃ、Ｄ）。さらに、ＭＣＦ１０Ａ細胞における観察と一致して、ＭＣＦ７細胞におけるＲＣＰの減少もまた、ＥＲＫの脱リン酸化をもたらす（図７Ｂ）。これらの結果を合わせると、腫瘍細胞における内因性ＲＣＰの発現が、増殖、遊走および浸潤の能力の維持にとって重要であり、ＲＣＰ機能の標的低減は、実行可能な治療戦力を表し得ることを示唆している。
【０１１４】
ＲＣＰのノックダウンはｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍形成を阻害する。
ｉｎ ｖｉｖｏでの癌細胞におけるＲＣＰ低減の作用を調査するために、本発明者らは、ＲＣＰ（ＲＮＡｉ ＲＣＰ）に対するｓｈＲＮＡを安定して発現するＭＣＦ７およびＭ
Ｂ２３１細胞の腫瘍形成能と、ヌードマウスにおける対照（ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ）の腫瘍形成能とを比較した。各細胞型を、８匹のマウスの左および右の後脚上部の皮下に埋め込んだ。ＭＣＦ７は、追加のエストロゲンの存在下で、ヌードマウスにおいて中程度の悪性腫瘍を形成する、エストロゲン依存性の細胞系である。ＭＣＦ７−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ（ｎ＝８）またはＭＣＦ７−ＲＮＡｉ ＲＣＰ（ｎ＝８）を埋め込んだすべてのエストロゲン追加マウスが明らかな腫瘍を発生したが、ＲＣＰ阻害細胞は、有意により小さいサイズの腫瘍を発生した（Ｐ＝０．００００７；スチューデントｔ検定）（図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ）。一方で、ＭＢ２３１は、ヌードマウスにおいて高度悪性かつ転移性の腫瘍を形成する、エストロゲン非依存性乳癌細胞系である。ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ Ｃｔｒｌ細胞を注入されたすべてのマウスは、大型の腫瘍を発生したが、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ ＲＣＰ細胞を注入された８匹のマウスではそのうちわずか２匹しか腫瘍を発生しなかった。（すなわち、１匹のマウスに２つの腫瘍および別のマウスに１つの腫瘍）（図９Ｄ、図９Ｅ、図９Ｆ）。特に、これらの腫瘍は対照マウスの腫瘍より非常に小型であり、平均重量は、対照のわずか１％であった。これらの腫瘍におけるＲＣＰのノックダウンを、免疫組織化学により確認した（図９Ｇ）。
【０１１５】
ＭＢ２３１細胞におけるＲＣＰのノックダウンがｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に作用しないという事実は、ｉｎ ｖｉｖｏのＲＣＰの阻害に関して観察された強い抗腫瘍作用が、血清の喪失下での細胞死の誘導に関連し得ることを示唆しており、皮下に埋め込みの腫瘍の血管新生が現れるには数日かかることを示している。したがって、本発明者らは、ＭＢ２３１安定細胞系の細胞死およびアポトーシスへの感受性を、様々な培養条件下で調査した。完全培地において、ＭＢ２３１−ＲＮＡｉ ＲＣＰおよび対照系は、どちらの系においてもアポトーシス細胞がほとんどないことにより証明されたように、細胞死において差がないことを示した。しかし、血清飢餓条件下において、対照は、細胞死に対する耐性を維持していたが、ＲＮＡｉ ＲＣＰ細胞は維持していなかった。有意によりＲＣＰを低減した細胞は、血清飢餓の結果として死亡し、その中でもアポトーシスが約１３％検出できた（図９Ｈ）。このことは、ＲＣＰの減少が、栄養不良環境に対するＭＢ２３１細胞の脆弱性を増強することを示唆し、これによりｉｎ ｖｉｖｏのＲＣＰノックダウンの劇的な抗腫瘍作用が説明できる。興味深いことに、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏのＲＣＰ過剰発現に関連する腫瘍原性の増加を観察せず（データ非掲載）、おそらくＲＣＰの内因性レベルにより達成される腫瘍形成に関する最大の病理学的作用を反映する。全体的に見て、結果は、ＲＣＰの標的ノックダウンにより、エストロゲン依存性および非依存性の乳房腫瘍の両方のｉｎ ｖｉｖｏ成長が抑制され、ＲＣＰが、治療介入の有益な新規の標的候補として関係があることを示している。
【０１１６】
考察
原発性腫瘍のゲノムワイドマイクロアレイ分析により、遺伝子発現の固有のパターンにより定義された、新規な臨床的に意義のある腫瘍亜型の発見が可能となった。しかし、より最近、この概念の逆が、腫瘍発生において機能的役割を有する遺伝子亜型を同定しようとするボトムアップ分析戦略を介して調査された。これらの戦略は、遺伝子発現ならびに癌の臨床的特徴およびゲノムの特徴の間の条件関係を解析する。アドラー（Ａｄｌｅｒ）および仲間は、遺伝子連鎖研究（マイクロアレイサインのステップワイズ連鎖分析）を使用して、乳癌における予測的「創傷サイン」の発現を推進する転写機序を明らかにした（アドラー、エー エスおよびチャン、エイチ ワイ（Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．）、（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５、１１４８〜１１５１）。創傷サインに関して腫瘍陽性または腫瘍陰性に有意に関連した、コピー数および遺伝子発現の両方の変化を同定することにより、著者らは、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＣＳＮ５（８ｑ１３）が機能的に相互作用し、創傷応答遺伝子の転写を制御することを推論し、生化学的に確認した。本研究において、本発明者らは、データ統合および機能的発見上にこの概念を築き、癌進行における機序的役割を有する遺伝子を推定する、相関に基づく新規
な戦略を開発した。
【０１１７】
ＴＲＩＡＧＥと呼ばれる上記の研究は、遺伝子発現の特徴と位置情報（ゲノムの位置）、臨床データ（患者の無遠隔転移生存率）および予測腫瘍生物学（増殖能）とを組み合わせ、過剰発現し、生存率に相関する再発性増幅の遺伝子部位を突き止める。ＴＲＩＡＧＥは、設計により機能的癌遺伝子のすべての型を検出するものではないが、ヒト患者において遠隔転移に寄与する悪性過程を推進する、機能的癌遺伝子を解明する可能性を有する。ＴＲＩＡＧＥはまた、癌において高い頻度で活性化される癌遺伝子および日常の療法への耐性を伴う癌遺伝子の発見を最適化する。例えば、癌遺伝子に関する本発明者らの調査は、ＬＳＶＤ手順により同定された主固有ピークの大きさにより優先順位を付ける。この大きさは、増幅事象の頻度と正に関連するので、高頻度のアンプリコン（ピークの高さに対応する）は、高い優先順位が得られる。ＬＳＶＤは、腫瘍発現プロフィールの任意の包括的コレクションに、ＴＲＩＡＧＥのロバスト適用を可能にするが、留意すベき固有の限界を有する。ＬＳＶＤは、所与の増幅事象を有する腫瘍の近似値のみを提供し、実際のアンプリコンの境界の解明は十分ではない。高解像度のアレイ−ＣＧＨにより提供されるような、対応するコピー数のデータは、アンプリコン決定の精度および正確さを改善することによって、ＴＲＩＡＧＥの性能を実質的に増強できる。
【０１１８】
ＴＲＩＡＧＥの性能に影響を与える追加の因子には、コホートサイズ、患者の追跡の期間および治療の特徴が含まれ、これらのすべては、候補遺伝子の選択に影響を与える。本発明者らの遺伝子−生存率の関連は、本発明者らの最も大きな集団に基づくコホートであるウプサラコホート（ｎ＝２５１例の患者）を使用して計算され、これはさらに、最も長く、最も完全な患者の追跡データを有する。重要なことには、このコレクションの中の腫瘍は、侵攻型の範囲（図２）が、早期乳癌から（小型径、リンパ節陰性、未処理）後期乳癌（大型径、リンパ節陽性、侵攻的に処理された）までの範囲にわたる。したがって、このコホートは、おそらく様々な癌遺伝子により推進されている様々な癌病態生理学を反映している。しかし、患者の混合された治療バックグラウンドは、治療の型に非依存性の生存率関連遺伝子の同定を有利にする。したがって、治療に依存性または２機能の生存率関連癌遺伝子（アンドレ、エフら（Ａｎｄｒｅ，Ｆ ｅｔ ａｌ．）（２００７）Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３、２０６１〜２０６７）は、このコホートでは見分けられないが、他においては同定される可能性がある。
【０１１９】
本発明者らの統合乳房腫瘍データセットのＬＳＶＤ分析は、８ｐ１１−１２の頻繁に増幅される領域に位置する遺伝子群に集中する大きな固有ピークの発見をもたらした。この遺伝子座の増幅は、乳房腫瘍症例の約１０〜２５％において観察され（アドナン、ジェイら（Ａｄｎａｎｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６、６５９〜６６３；ガルシア、エム ジェイら（Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４、５２３５〜５２４５；ルテシアら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ
ａｌ．）２００６上記、テイレット、シーら（Ｔｈｅｉｌｌｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．）（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ７、２１９〜２２６）、多数の非依存性研究において、患者の生存率不良および遠隔転移の短い間隔に関連していた（チンら（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．）、２００６、上記、；キュニー、エムら（Ｃｕｎｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０、１０７７〜１０８３；ジェルシ−ボイヤー、ブイら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３、６５５〜６６７；ルテシアら（Ｌｅｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）２００６、上記）。近年、このアンプリコンは、原発性乳房腫瘍および細胞系に関する、いくつかの集中的な機能的ゲノム研究の焦点であった（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；レイら（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。染色体８ｐに特異的な高解析度ＢＡＣマイクロアレイを使用して、
ジェルシ−ボイヤー（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ）および仲間は（２００５、上記）、８ｐ１１−１２アンプリコンが、実際は境界の明確なＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４と呼ばれる重複が最小の４つのサブアンプリコンを決定した。この研究および他の研究の著者は、遺伝子増幅とｍＲＮＡの過剰発現との間の強い相関に基づき、この領域の数多くの候補癌遺伝子を提示してきた。（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記；レイら（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。累積的に、これらの研究は、ＺＮＦ７０３（ＦＬＪ１４２９９）、ＥＲＬＩＮ２（ＳＰＦＨ２）、ＰＲＯＳＣ、ＢＲＦ２、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）およびＬＳＭ１を、増幅と過剰発現との間に最も強い相関を有するとして同定し、ＬＳＭ１以外のすべては、１−Ｍｂ「最小アンプリコン」に局在し（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）、Ａ１サブアンプリコンと正確に重複する（ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）。特に、本発明者らの研究においてＬＳＶＤにより同定された遺伝子は、特にＡｌおよびＡ２サブアンプリコンからなり、したがって、これら早期の研究により記載された、すべての「最も優れた候補」癌遺伝子を含む。
【０１２０】
ＴＲＩＡＧＥの８ｐ１１−１２への適用は、患者における播種性転移を潜在的に推進する、このアンプリコンにおける最も強い候補癌遺伝子として、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）の同定をもたらした。この領域内の他の候補癌遺伝子の中でも、乳房上皮細胞において、いくつかの形質転換特性を有することがすでに示されている。（シュトライヒャー、ケイ エルら（Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、（２００７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６、２１０４〜２１１４；ヤン、ゼット キューら（Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｑ．ｅｔ
ａｌ．）、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、１１６３２〜１１６４３）、ＬＳＭ１、ＢＡＧ４およびＣ８ｏｒｆ４（ＴＣＩ）はすべて、Ａ２およびＡ３のサブアンプリコン上に主に存在する（ジェルシ−ボイヤーら（Ｇｅｌｓｉ−Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）。反対に、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１（ＲＣＰ）は、１−Ｍｂ最小アンプリコン上のＡ１アンプリコンのコアのより近くに位置し、（ガルシアら（Ｇａｒｃｉａ
ｅｔ ａｌ．）、２００５、上記）、癌遺伝子として機能的に特徴づけられたこの領域において第１である。
【０１２１】
それらの新規な研究を使用して、本発明者らはＲＣＰの発現に連結した広範囲の癌促進作用を発見した。非癌性の乳房上皮細胞において、ＲＣＰの過剰発現は、悪性の形質転換をもたらし、細胞の運動および遊走を増加させる。乳癌細胞系において、ＲＮＡ阻害による内因性ＲＣＰの低減は、増殖、足場非依存性成長、浸潤およびアポトーシス耐性を減少させ、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を減退させた。生理的に、ＲＣＰは、主にＲａｂ１１と相互作用し、管状エンドソームにおいてタンパク質選別を制御すると考えられている（ペデンら（Ｐｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。Ｒａｂ１１−ＲＣＰ複合体は、トランスフェリン受容体をリソソームから離し（分解経路）エンドソームの再循環（再循環経路）へ導き、その結果膜結合受容体のレベルの相対的増加を促進することが示されている（ペデンら（Ｐｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．）、２００４、上記）。推論ではあるが、ＲＣＰの形質転換作用が再循環経路へのこの推移により仲介され得、インテグリンなどの特定の膜タンパク質または癌遺伝子の役割を有する成長因子受容体の膜への局在（およびこのような機能）を引き延ばすことは妥当と思われる。ＲＣＰ発現とＥＲＫリン酸化の間の、本発明者らが観察した強い相関は、ＲＣＰと成長因子受容体仲介ＭＡＰＫ活性化との間の特定の連結を示し得るので、この可能性を反映し得る。上記のデータは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１が、８ｐ１１−１２アンプリコンの再発性の選択の陰の鍵となる推進力を表し得、この増幅領域およびＲＡＢ１１ＦＩＰ１それ自体の発現に関連する、乳癌の転移拡散に機能的に寄与し得ることを示している。このアンプリコンが、非小細胞肺癌（バルサラ、ビー アールら（Ｂａｌｓａｒａ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７、２１１６〜２１２０）、結腸直腸癌（ナカオ、ケーら（Ｎａｋａｏ
，Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、（２００４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２５、１３４５〜１３５７）および膀胱の腫瘍（サイモン、アールら（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１、４５１４〜４５１９）およびファローピウス管（スナイデルス、エー エムら（Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２、４２８１〜４２８６）を含む他の固体腫瘍に頻繁に観察されていることは、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１が単独または近隣の癌遺伝子との相乗効果において作用する、癌の進行へのありふれた経路を表し得ることを示唆している。
【０１２２】
この明細書における、公知文献のリストまたは考察は、必ずしもかかる公知文献が技術水準の一部である、または一般的常識であると認めるものとしてとらえるべきではない。
本発明は、本明細書中に広範にかつ一般的に記載してある。包括的開示の範囲内に入る、より狭い種および亜属の分類もまた、それぞれ本発明を形成する。これは、削除された材料を本明細書中に具体的に列挙するかどうかにかかわらず、条件付き、または任意の対象を属から除去する否定的限定を伴う、本発明の包括的記載を含む。
【０１２３】
当業者は、本発明が、目標を達成すること、内在する目的および利点と同様に本明細書で言及した目的および利点を獲得するのに適していることを、容易に理解するであろう。さらに、様々な置き換えおよび変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示した発明に対して実施できることは、当業者には容易に理解されるであろう。本明細書に記載された分子複合体および方法、手順、処理、分子、本明細書に記載された特定の化合物は、好ましい実施形態を例示する目下の典型であり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。当業者は、特許請求の範囲により定義される本発明の精神に包含される、その変更および他の使用が思い浮かぶであろう。
【０１２４】
本明細書において適切に例示的に記載された発明は、任意の、１つまたは複数の要素、本明細書に具体的に開示されなかった、１つまたは複数の限定が存在しない状況下においても実施できる。したがって、例えば、本明細書における各事例において、「有する」、「本質的に〜からなる」および「からなる」などの任意の用語は、広い意味で、限定することなく理解すべきであり、直接参照される列挙された成分だけに限定されず、他の明記されていない成分および要素もまた含む。このように、それらは相互に交換することもできる。さらに、用いた用語および表現は説明の用語として使用し、限定するものではなく、示し、記載した特徴の任意の同等物またはそれらの一部を排除したような用語または表現の使用に意図はなく、しかし、様々な変形が本発明の特許請求の範囲内で可能であることが認識される。
【０１２５】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈ群に関して記載されている場合、当業者には、本発明がＭａｒｋｕｓｈ群の任意の個々のメンバーまたは該メンバーのサブグループに関しても記載されていることが理解されるであろう。
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節する工程からなる、細胞における腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる方法。
【請求項２】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質（Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞における前記Ｒａｂ結合タンパク質の量を調節する工程が、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現を調節することからなる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞における前記Ｒａｂ結合タンパク質の量を調節する工程が、前記Ｒａｂ結合タンパク質を分解することからなる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞における前記Ｒａｂ結合タンパク質の活性を調節する工程が、前記Ｒａｂ結合タンパク質と化合物との複合体を形成することからなる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法の方法。
【請求項７】
前記化合物が、ペプチド、ペプトイド、無機分子および小有機分子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｒａｂ結合タンパク質の分解がカルパインプロテアーゼによって実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍発生が発癌である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
増殖性疾患または障害の治療または予防に含まれる、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
治療される前記増殖性疾患または障害が癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節する化合物を投与する工程を含む、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｒａｂ結合タンパク質が、自身の量または活性を調節することが可能なＲａｂ結合タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現を核酸分子によって低減する、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子が非コード核酸分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子が、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ分子、サイレンサーＲＮＡ分子、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、および反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物、魚類、両生類および鳥類からなる群から選択される生物に含まれる細胞における腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる方法である、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物、魚類、両生類および鳥類からなる群から選択される生物から得られた細胞における腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる方法である、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物が、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、オポッサム、リス、ココノオビアルマジロ、イヌ、ネコ、ゾウ、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、オランウータン、ウシ（メウシ）、マーモセット、アメリカナキウサギ、ガラゴ、およびヒトからなる群から選択される、請求項１８乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を予防、阻害、停止または逆行させる工程を含む、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を検出する工程をさらに含む、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現および活性のうちの少なくとも一方を検出する工程が、該発現および活性のうちの少なくとも一方を一定時間測定することからなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対照測定がＲａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない条件の使用からなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化、細胞内局在の変化、または活性の変化を検出する工程からなる、発癌性になる素因を有する細胞を同定する方法。
【請求項２８】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化および活性の変化の少なくとも１つが決定され、該Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大が、各腫瘍が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す、請求項２７乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞内カルシウムレベルの増大が、ビタミンＤのメンバー、該ビタミンＤのメンバーのプロドラッグおよび該ビタミンＤのメンバーの類似体の使用によって達成可能である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ビタミンＤのメンバーがビタミンＤ３である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現レベル、活性レベル、および細胞内局在の少なくとも１つを決定する工程からなる、対象において新生物を発症するリスクを診断する方法。
【請求項３４】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記新生物が腫瘍である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱の腫瘍および卵管の腫瘍の１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍が癌である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現レベル、活性レベル、および細胞内局在の少なくとも１つを決定する工程を前記対象から得た試料において実施する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方が通常レベルである試料の使用からなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対照測定と比較したＲａｂ結合タンパク質の発現レベル、活性レベル、または細胞内局在の変化が、前記対象が新生物に罹患しているかまたは新生物を発症するリスクがあることを示す、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化および活性の変化の少なくとも１つが決定され、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大が、各新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す、請求項３３乃至４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞内カルシウムレベルの増大が、ビタミンＤのメンバー、該ビタミンＤのメンバーのプロドラッグおよび該ビタミンＤのメンバーの類似体の使用によって達成可能である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ビタミンＤのメンバーがビタミンＤ３である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｒａｂ結合タンパク質が、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１、Ｒａｂ１１ＦＩＰ２、Ｒａｂ１１ＦＩＰ３（エフェリン）、Ｒａｂ１１ＦＩＰ４、Ｒａｂ１１ＦＩＰ５（Ｒｉｐ１１）、およびそれらのアイソフォームからなる群から選択されるＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項１乃至４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
複合体を形成する構成要素を互いに接触させる工程からなる、Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成することが可能な化合物を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項４８】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）試験管中に前記Ｒａｂ結合タンパク質を提供する工程、
（ｂ）前記Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成可能であると考えられる化合物を該試験管に加える工程、および
（ｃ）該複合体形成を検出する工程を含む、請求項４７乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出工程が、適切な分光的、光化学的、光度分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的方法によって実施されるか、または細胞効果に基づいている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることができる化合物を同定する方法である、請求項４９乃至５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの該Ｒａｂ結合タンパク質の活性を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）Ｒａｂ結合タンパク質またはその機能断片を発現する微生物を提供する工程、
（ｂ）該微生物に化合物を加える工程、および
（ｃ）Ｒａｂ結合タンパク質の細胞表現型または活性の変化をモニターする工程
からなる方法。
【請求項５４】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項５３乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない化合物の使用からなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ｉｎ ｖｉｖｏでの該Ｒａｂ結合タンパク質の発現を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質またはその機能断片を発現する微生物を提供する工程、
（ｂ）該微生物に化合物を加える工程、および
（ｃ）該Ｒａｂ結合タンパク質の発現をモニターする工程
からなる方法。
【請求項５９】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項５８乃至６０のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現を調節しない化合物の使用からなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記微生物が癌細胞である、請求項５３乃至６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌細胞が、乳房癌細胞、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、膀胱の癌細胞および卵管の癌細胞の１つである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記微生物が、乳房組織、肺組織、結腸直腸組織、膀胱組織および卵管の組織の１つに由来する細胞である、請求項５３乃至６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が、ＨＭＥＣ細胞系、３Ｄ、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、Ｂｃａｐ−３７、ＢＩＵ−８７、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＢＴ４７４Ｍ１、Ｃａｌｕ−６、ＥＢＣ−１、Ｃｏｌｏ−３２０、ＥＪ、ＦＴ−ＭＺ−１、Ｈ３２２、Ｈ４４６、Ｈ４６０、ＨＣＣ２２７９、ＨＣＴ１１６、ＨＥＰＦＴ、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、ＨＴ−２９、ＨＴＢ−５６Ｒ、ＨＵＴ２９、ＩＭＥＣ−２、ＪＩＭＴ−１、ＫｏＴＣＣ−１、ＫＵ−Ｔ１、Ｌ０、Ｌ０−２００、Ｌ０−５００、Ｌ０−１０００、Ｌ９９８１、ＬＣ−１／ｓｑ、ＬＣＤ、ＬＣＯＫ、ＬＫ−２、ＬｏＶｏ、ＬＳ１０３４、ＬＳＴ−Ｒ１、Ｌｕ１３５、ＭＢＴ−２、ＭＣＦ−７、Ｍ２３１、ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１ＤＹＴ２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＨＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＢ２３１、ＭＳ−１、ＭＷ１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＮＣＩ−Ｈ１７７０、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＮＣＩ−Ｎ２２６、ＮＣＩ−Ｎ２３１、ＰＣ１、ＰＣ３、ＰＣ７、ＰＣ９、ＰＣ１０、ＰＣ１４、ＰＭＣ４２、ＰＬＡ−８０１Ｄ、ＱＧ５６、ＲＥＲＦ−ＬＣＡＩ、ＲＥＲＦ−ＬＣＭＳ、ＲＥＲＦ−ＬＣＫＪ、ＲＫＯ、ＲＴ４、ＳＢＣ３、ＳｃａＢＥＲ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＢＲ−７、ＳＰＣ−Ａ１、ＳＱ５、ＳＵＭ１４９、ＳＵＭ１５９、ＳＵＭ１３１５、ＳＵＭ−５２ＰＥ、ＳＷ４８０、Ｔ２４、Ｔ−４７Ｄ、ＵＭ−ＵＣ−２、ＷｉＤｒ、ＹＴＬＭＣ−９０、ＺＲ−７５、ＺＲ−７５−１、およびＺＲ−７５−３０からなる群から選択される細胞系の細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が、Ｒａｂ結合タンパク質を過剰発現させることによって非癌性細胞から得られるものである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞がＲＡＢ１１ＦＩＰ１を過剰発現している、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記微生物が組換え細胞またはトランスジェニック微生物である、請求項５５乃至６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）癌細胞を収容し増殖させることができる宿主生物を提供する工程、
（ｂ）癌細胞を該宿主生物に導入する工程、
（ｃ）Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節し得ると考えられる化合物を投与する工程、および
（ｃ）該宿主生物中の腫瘍の増殖をモニターする工程
からなる方法。
【請求項７１】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項７０乃至７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない化合物の使用からなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）癌細胞を収容し増殖させることができる宿主生物を提供する工程、
（ｂ）Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節し得ると考えられる化合物からなる癌細胞を該宿主生物に導入する工程、および
（ｃ）該宿主生物中の腫瘍の増殖をモニターする工程
からなる方法。
【請求項７６】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項７５乃至７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない化合物の使用からなる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記宿主生物が、マウス、ラット、ゾウ、ウサギ、モルモット、オポッサム、リス、ココノオビアルマジロ、イヌ、ネコ、アメリカナキウサギ、ガラゴ、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、オランウータン、ウシ（メウシ）およびマーモセットからなる群から選択される、請求項７０乃至７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性の少なくとも１つを決定する工程からなり、該Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化または活性の変化が、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す、該新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法。
【請求項８２】
前記新生物が哺乳動物中に含まれる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記新生物が腫瘍である、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱の腫瘍および卵管の腫瘍の１つである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍が癌である、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞内カルシウムレベルの変化が遊離細胞内カルシウムの増大である、請求項８１乃至８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記遊離細胞内カルシウムの増大が、ビタミンＤファミリーのメンバー、該ビタミンＤのメンバーのプロドラッグおよび該ビタミンＤのメンバーの類似体の１つの使用によって達成可能であり、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大が、前記新生物が該ビタミンＤのメンバー、そのプロドラッグまたは類似体を用いた治療に感受性であることを示す、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ビタミンＤのメンバーがビタミンＤ３である、請求項８７に記載の方法。
【請求項１】
Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節する工程からなる、細胞における腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる方法。
【請求項２】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質（Ｒａｂ１１ファミリー相互作用タンパク質）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞における前記Ｒａｂ結合タンパク質の量を調節する工程が、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現を調節することからなる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞における前記Ｒａｂ結合タンパク質の量を調節する工程が、前記Ｒａｂ結合タンパク質を分解することからなる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞における前記Ｒａｂ結合タンパク質の活性を調節する工程が、前記Ｒａｂ結合タンパク質と化合物との複合体を形成することからなる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法の方法。
【請求項７】
前記化合物が、ペプチド、ペプトイド、無機分子および小有機分子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｒａｂ結合タンパク質の分解がカルパインプロテアーゼによって実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍発生が発癌である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
増殖性疾患または障害の治療または予防に含まれる、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
治療される前記増殖性疾患または障害が癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節する化合物を投与する工程を含む、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｒａｂ結合タンパク質が、自身の量または活性を調節することが可能なＲａｂ結合タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現を核酸分子によって低減する、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子が非コード核酸分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子が、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ分子、サイレンサーＲＮＡ分子、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、および反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物、魚類、両生類および鳥類からなる群から選択される生物に含まれる細胞における腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる方法である、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物、魚類、両生類および鳥類からなる群から選択される生物から得られた細胞における腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させる方法である、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物が、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、オポッサム、リス、ココノオビアルマジロ、イヌ、ネコ、ゾウ、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、オランウータン、ウシ（メウシ）、マーモセット、アメリカナキウサギ、ガラゴ、およびヒトからなる群から選択される、請求項１８乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を予防、阻害、停止または逆行させる工程を含む、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を検出する工程をさらに含む、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現および活性のうちの少なくとも一方を検出する工程が、該発現および活性のうちの少なくとも一方を一定時間測定することからなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対照測定がＲａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない条件の使用からなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞におけるＲａｂ結合タンパク質の量の変化、発現の変化、細胞内局在の変化、または活性の変化を検出する工程からなる、発癌性になる素因を有する細胞を同定する方法。
【請求項２８】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化および活性の変化の少なくとも１つが決定され、該Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大が、各腫瘍が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す、請求項２７乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞内カルシウムレベルの増大が、ビタミンＤのメンバー、該ビタミンＤのメンバーのプロドラッグおよび該ビタミンＤのメンバーの類似体の使用によって達成可能である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ビタミンＤのメンバーがビタミンＤ３である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現レベル、活性レベル、および細胞内局在の少なくとも１つを決定する工程からなる、対象において新生物を発症するリスクを診断する方法。
【請求項３４】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記新生物が腫瘍である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱の腫瘍および卵管の腫瘍の１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍が癌である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現レベル、活性レベル、および細胞内局在の少なくとも１つを決定する工程を前記対象から得た試料において実施する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方が通常レベルである試料の使用からなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対照測定と比較したＲａｂ結合タンパク質の発現レベル、活性レベル、または細胞内局在の変化が、前記対象が新生物に罹患しているかまたは新生物を発症するリスクがあることを示す、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化および活性の変化の少なくとも１つが決定され、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大が、各新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す、請求項３３乃至４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞内カルシウムレベルの増大が、ビタミンＤのメンバー、該ビタミンＤのメンバーのプロドラッグおよび該ビタミンＤのメンバーの類似体の使用によって達成可能である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ビタミンＤのメンバーがビタミンＤ３である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｒａｂ結合タンパク質が、Ｒａｂ１１ＦＩＰ１、Ｒａｂ１１ＦＩＰ２、Ｒａｂ１１ＦＩＰ３（エフェリン）、Ｒａｂ１１ＦＩＰ４、Ｒａｂ１１ＦＩＰ５（Ｒｉｐ１１）、およびそれらのアイソフォームからなる群から選択されるＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項１乃至４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
複合体を形成する構成要素を互いに接触させる工程からなる、Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成することが可能な化合物を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項４８】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）試験管中に前記Ｒａｂ結合タンパク質を提供する工程、
（ｂ）前記Ｒａｂ結合タンパク質と複合体を形成可能であると考えられる化合物を該試験管に加える工程、および
（ｃ）該複合体形成を検出する工程を含む、請求項４７乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出工程が、適切な分光的、光化学的、光度分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的方法によって実施されるか、または細胞効果に基づいている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍発生を予防、阻害、停止または逆行させることができる化合物を同定する方法である、請求項４９乃至５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの該Ｒａｂ結合タンパク質の活性を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）Ｒａｂ結合タンパク質またはその機能断片を発現する微生物を提供する工程、
（ｂ）該微生物に化合物を加える工程、および
（ｃ）Ｒａｂ結合タンパク質の細胞表現型または活性の変化をモニターする工程
からなる方法。
【請求項５４】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項５３乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない化合物の使用からなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ｉｎ ｖｉｖｏでの該Ｒａｂ結合タンパク質の発現を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質またはその機能断片を発現する微生物を提供する工程、
（ｂ）該微生物に化合物を加える工程、および
（ｃ）該Ｒａｂ結合タンパク質の発現をモニターする工程
からなる方法。
【請求項５９】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項５８乃至６０のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現を調節しない化合物の使用からなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記微生物が癌細胞である、請求項５３乃至６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌細胞が、乳房癌細胞、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、膀胱の癌細胞および卵管の癌細胞の１つである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記微生物が、乳房組織、肺組織、結腸直腸組織、膀胱組織および卵管の組織の１つに由来する細胞である、請求項５３乃至６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が、ＨＭＥＣ細胞系、３Ｄ、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、Ｂｃａｐ−３７、ＢＩＵ−８７、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＢＴ４７４Ｍ１、Ｃａｌｕ−６、ＥＢＣ−１、Ｃｏｌｏ−３２０、ＥＪ、ＦＴ−ＭＺ−１、Ｈ３２２、Ｈ４４６、Ｈ４６０、ＨＣＣ２２７９、ＨＣＴ１１６、ＨＥＰＦＴ、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、ＨＴ−２９、ＨＴＢ−５６Ｒ、ＨＵＴ２９、ＩＭＥＣ−２、ＪＩＭＴ−１、ＫｏＴＣＣ−１、ＫＵ−Ｔ１、Ｌ０、Ｌ０−２００、Ｌ０−５００、Ｌ０−１０００、Ｌ９９８１、ＬＣ−１／ｓｑ、ＬＣＤ、ＬＣＯＫ、ＬＫ−２、ＬｏＶｏ、ＬＳ１０３４、ＬＳＴ−Ｒ１、Ｌｕ１３５、ＭＢＴ−２、ＭＣＦ−７、Ｍ２３１、ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１ＤＹＴ２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＨＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＢ２３１、ＭＳ−１、ＭＷ１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＮＣＩ−Ｈ１７７０、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＮＣＩ−Ｎ２２６、ＮＣＩ−Ｎ２３１、ＰＣ１、ＰＣ３、ＰＣ７、ＰＣ９、ＰＣ１０、ＰＣ１４、ＰＭＣ４２、ＰＬＡ−８０１Ｄ、ＱＧ５６、ＲＥＲＦ−ＬＣＡＩ、ＲＥＲＦ−ＬＣＭＳ、ＲＥＲＦ−ＬＣＫＪ、ＲＫＯ、ＲＴ４、ＳＢＣ３、ＳｃａＢＥＲ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＢＲ−７、ＳＰＣ−Ａ１、ＳＱ５、ＳＵＭ１４９、ＳＵＭ１５９、ＳＵＭ１３１５、ＳＵＭ−５２ＰＥ、ＳＷ４８０、Ｔ２４、Ｔ−４７Ｄ、ＵＭ−ＵＣ−２、ＷｉＤｒ、ＹＴＬＭＣ−９０、ＺＲ−７５、ＺＲ−７５−１、およびＺＲ−７５−３０からなる群から選択される細胞系の細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が、Ｒａｂ結合タンパク質を過剰発現させることによって非癌性細胞から得られるものである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞がＲＡＢ１１ＦＩＰ１を過剰発現している、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記微生物が組換え細胞またはトランスジェニック微生物である、請求項５５乃至６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）癌細胞を収容し増殖させることができる宿主生物を提供する工程、
（ｂ）癌細胞を該宿主生物に導入する工程、
（ｃ）Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節し得ると考えられる化合物を投与する工程、および
（ｃ）該宿主生物中の腫瘍の増殖をモニターする工程
からなる方法。
【請求項７１】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項７０乃至７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない化合物の使用からなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）癌細胞を収容し増殖させることができる宿主生物を提供する工程、
（ｂ）Ｒａｂ結合タンパク質の量または活性を調節し得ると考えられる化合物からなる癌細胞を該宿主生物に導入する工程、および
（ｃ）該宿主生物中の腫瘍の増殖をモニターする工程
からなる方法。
【請求項７６】
前記Ｒａｂ結合タンパク質がＲａｂ１１結合タンパク質である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｒａｂ１１結合タンパク質がＲａｂ１１ＦＩＰタンパク質である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
得られた結果を対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項７５乃至７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対照測定が、前記Ｒａｂ１１ＦＩＰタンパク質の発現および活性のうちの少なくとも一方を調節しない化合物の使用からなる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記宿主生物が、マウス、ラット、ゾウ、ウサギ、モルモット、オポッサム、リス、ココノオビアルマジロ、イヌ、ネコ、アメリカナキウサギ、ガラゴ、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、オランウータン、ウシ（メウシ）およびマーモセットからなる群から選択される、請求項７０乃至７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
Ｒａｂ結合タンパク質の発現および活性の少なくとも１つを決定する工程からなり、該Ｒａｂ結合タンパク質の発現の変化または活性の変化が、新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であることを示す、該新生物が細胞内カルシウムレベルの変化に感受性であるかどうかを決定する方法。
【請求項８２】
前記新生物が哺乳動物中に含まれる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記新生物が腫瘍である、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱の腫瘍および卵管の腫瘍の１つである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍が癌である、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞内カルシウムレベルの変化が遊離細胞内カルシウムの増大である、請求項８１乃至８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記遊離細胞内カルシウムの増大が、ビタミンＤファミリーのメンバー、該ビタミンＤのメンバーのプロドラッグおよび該ビタミンＤのメンバーの類似体の１つの使用によって達成可能であり、前記Ｒａｂ結合タンパク質の発現の増大または活性の増大が、前記新生物が該ビタミンＤのメンバー、そのプロドラッグまたは類似体を用いた治療に感受性であることを示す、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ビタミンＤのメンバーがビタミンＤ３である、請求項８７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【公表番号】特表２０１０−５２３６５２（Ｐ２０１０−５２３６５２Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２９７８（Ｐ２０１０−５０２９７８）
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００８／０００１１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２７１９９
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００８／０００１１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２７１９９
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
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