腫瘍血管新生制御遺伝子
【課題】
腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を同定する方法を提供すること。
【解決手段】
試験物質を細胞と接触させ、細胞におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択することにより、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法が開示される。好ましくは、試験物質と細胞との接触は、ゼブラフィッシュに試験物質を投与することにより行う。この方法により同定された物質は、腫瘍血管新生の抑制剤の有効成分として有用である。
腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を同定する方法を提供すること。
【解決手段】
試験物質を細胞と接触させ、細胞におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択することにより、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法が開示される。好ましくは、試験物質と細胞との接触は、ゼブラフィッシュに試験物質を投与することにより行う。この方法により同定された物質は、腫瘍血管新生の抑制剤の有効成分として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍血管新生抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、悪性腫瘍の進行や転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後方線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼新血管新生症候群の疾患は、血管（特に末梢毛細血管）の異常増殖に起因することが知られている。そのため、これらの疾患に対する予防または治療薬として、血管新生促進性因子および抗血管新生因子を標的とした種々の血管新生抑制剤が開発されている。
【０００３】
現在の抗腫瘍血管新生治療は、腫瘍血管の新生を促進する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生因子の活性を拮抗作用することに主に焦点を当てられている。しかし、血管新生は多数の血管新生促進性因子および抗血管新生因子により調節される複雑な過程であり、血管新生因子である１遺伝子の活性のみを標的とする薬剤は、多くの状況において血管新生を予防するために十分ではない。そのため、複数の血管新生因子の活性を調節することにより血管新生を抑制することができる治療が望ましく、新たな抗血管新生遺伝子が必要である。
【０００４】
その発現を抑制することにより腫瘍血管新生を抑制することができるということが発見されている遺伝子としては、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）がある。また、腫瘍血管新生に関連した遺伝子として、ＰＤＧＦ、ＭＭＰ、ＦＧＦ、ＴＰ（Thymidine Phosphorylase; PD-ECGF, Platelet-derived Endothelial Cell
Growth Factor）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許公表２００１−５０１４７１
【特許文献２】特許公開２００８−０００００３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fossey SC, Kuroda S, PriceJA, Pendleton JK, Freedman BI, Bowden DW. Identification and characterizationof PRKCBP1, a candidate RACK-like protein. Mamm Genome., 11: 919-925, 2000.
【非特許文献２】Kiss-Toth E, Bagstaff SM,Sung HY, Jozsa V, Dempsey C, Caunt JC, Oxley KM, Wyllie DH, Polgar T, Harte M,O'neill LA, Qwarnstrom EE, Dower SK. Human tribbles, a protein familycontrolling mitogen-activated protein kinase cascades. J. Biol. Chem., 279: 42703-42708,2004.
【非特許文献３】Lin KR, Lee SF, Hung CM,Li CL, Yang-Yen HF, Yen JJ. Survival factor withdrawal-induced apoptosis of TF-1cells involves a TRB2-Mcl-1 axis-dependent pathway. J. Biol. Chem., 282 (30): 21962-72,2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腫瘍血管新生抑制剤開発におけるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腫瘍血管新生とＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現との間に相関があること、およびその発現機能を抑制することにより、腫瘍血管新生の重要な病態指標である腫瘍における血管新生を抑制することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、
試験物質を細胞と接触させ、細胞におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法を提供する。
【００１０】
別の観点においては、本発明は、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、癌移植ゼブラフィッシュに試験物質を投与し、ゼブラフィッシュ由来ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法を提供する。
【００１１】
さらに別の観点においては、本発明は、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するリボザイム、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する腫瘍血管新生抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のスクリーニング方法により選択された物質は、腫瘍血管新生の抑制を有する薬剤の候補物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】腫瘍血管新生誘導した癌移植ゼブラフィッシュにおけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現量を示す。縦軸はハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ，ＢＥＴＡの発現量と比較した際の各遺伝子（ＴＲＩＢ２・ＺＭＹＮＤ８）の相対的発現量である。
【図２】癌移植モデルゼブラフィッシュに対し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した時の画像を示す。
【図３】癌移植モデルゼブラフィッシュに対し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した時の、腫瘍血管新生の発生割合を示す。
【図４】通常の（癌移植をしていない）ゼブラフィッシュに対し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのみを投与した時の血管構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、ゼブラフィッシュに癌細胞の移植を行い腫瘍血管新生が認められた個体においてＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量が増加することが見いだされた。また、下記の実施例に示されるように、癌細胞移植したゼブラフィッシュにＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞と同時投与すると、腫瘍血管新生が抑制されることが見いだされた。これらの結果から、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子は腫瘍血管新生の治療標的となりうること、およびＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現の抑制を指標として、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を同定しうることが明らかとなった。なお、図４に示すように、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現の抑制は正常血管新生を阻害しない。
【００１５】
ＺＭＹＮＤ８（zinc finger, MYND-type
containing 8）は、ＲＡＣＫ７とも称され、Ｃ−キナーゼのための受容体タンパク質である。ヒトのＺＭＹＮＤ８の遺伝子および蛋白質の配列はＮＣＢＩ：ＮＭ_０１８３０４７．１に記載されている。この蛋白質は、プロテインキナーゼＣβIと結合する。このタンパク質はブロモドメインと２つのジンクフィンガーをもち、転写調節因子であると考えられている（非特許文献１）。
ＴＲＩＢ２（tribbles homolog 2 (Drosophila)）は、ＴＲＢ２とも称され、Ｔｒｉｂｂｌｅｓファミリーに属しているタンパク質である。Ｔｒｉｂｂｌｅｓはショウジョウバエにおいて単離されたキナーゼ様ドメインを持つ分子であり、哺乳類ＴｒｉｂｂｌｅｓオルソログとしてＴＲＢ１、ＴＲＢ２、ＴＲＢ３が同定されている。哺乳類では、ＴｒｉｂｂｌｅｓオルソログがＡｋｔやＭＡＰキナーゼ経路を制御することが報告されており、細胞内シグナル伝達系の調節因子としての機能が明らかになりつつある（非特許文献２）。ヒトのＴＲＩＢ２の遺伝子および蛋白質の配列はＮＣＢＩ：ＮＭ_０２１６４３．３に記載されている。この蛋白質は、相互作用して、いくつかの生理的で病理学的プロセスにおいてシグナル形質導入経路の活動を調整し、主に造血器官の細胞のアポトーシスを誘発することが報告されている（非特許文献３）。
これまで、ＴＲＩＢ２、ＺＭＹＮＤ８の両遺伝子またはこれら蛋白質の発現と腫瘍血管新生との関連性についての報告はない。
【００１６】
スクリーニング方法
１つの観点においては、本発明は、多様な試験物質から、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、試験物質が試験管内または細胞内でＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を抑制する能力を測定することにより評価することができる。試験物質がＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を抑制する能力は、試験物質をＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子を発現する細胞と接触させて、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子のｍＲＮＡ量または蛋白質量を測定することにより評価することができる。試験物質と接触させたときに、接触させないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されれば、その試験物質は腫瘍血管新生抑制剤の候補物質であると考えられる。
【００１７】
試験物質は、種々の合成または天然の化合物ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリー、ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また、細菌、真菌類、藻類、植物、動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。
【００１８】
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定するためには、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ増幅法、ＩＳＨ（in situ hybridization）法、ＩＳＰ（in situ PCR）法、レーザーマイクロダイセクション法、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法（ＬＣＭ）などの、当該技術分野においてよく知られる遺伝子発現分析法を用いることができる。また、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の蛋白質量は、抗ＴＲＩＢ２抗体または抗ＺＭＹＮＤ８抗体を用いるＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などにより測定することができる。ヒト、ラット、マウス、ゼブラフィッシュなどのＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子およびこれをコードする遺伝子の配列は公表されている。
【００１９】
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子を発現する細胞としては、各種の組織に由来する初代培養組織や培養細胞株などの任意のものを用いることができる。ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子を強制発現させるよう遺伝子組換えされた細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いてもよい。
【００２０】
１つの好ましい態様においては、試験物質をゼブラフィッシュに投与して、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を調べる。ゼブラフィッシュ（属名Danio，例えばDanio rerio）とはインド原産の小型の熱帯魚である。主要臓器・組織の発生・構造などがヒトと良く似ているうえ、身体が透明であるため各種臓器および血管の形態を肉眼で観察することができるため、モデル動物として新薬候補化合物のスクリーニングに用いるのに適している。
【００２１】
本発明の方法には、基本的に癌細胞を移植したゼブラフィッシュを用いるが、より大型のモデル動物や、遺伝子組換や化学物質による発癌モデル動物（含むゼブラフィッシュ）を用いてもよい。試験物質をゼブラフィッシュに投与する方法としては、候補物質が水溶性である場合には飼育水中に溶解すればよく、水不溶性である場合には適当な界面活性剤との複合体またはエマルジョンの形で飼育水中に懸濁すればよい。あるいは、ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与してもよく、注射などにより非経口投与してもよい。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法にゼブラフィッシュを用いることの利点は、試験物質がＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現に及ぼす影響を測定できると同時に、毒性試験も行うことができることである。さらに、体重の変化、血管形成の変化、心臓などの各種臓器の形態や機能の変化、各種マーカー遺伝子の発現量も測定することができる。
【００２３】
このようにして、本発明のスクリーニング方法により選択された物質は、腫瘍血管新生の抑制を有する薬剤の候補物質として有用である。
【００２４】
腫瘍血管新生抑制剤
別の観点においては、本発明は、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する腫瘍血管新生抑制剤を提供する。遺伝子の発現を抑制しうる抑制剤としては、例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）等の、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の抑制剤を挙げることができる。このような核酸は、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の既知のヌクレオチド配列情報に基づいて容易に設計し製造することができ、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子をコードするｍＲＮＡに結合しその発現を抑制することができる。アンチセンス、リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法、またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子をコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと特異的に結合し、転写および／または翻訳を抑制することにより蛋白質の発現を抑制する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく、トリプレックス形成によるものでもよい。
【００２６】
リボザイムとは、標的とする核酸配列を切断しうる触媒的特性を有するＲＮＡ分子を表す。リボザイムは、一般に、エンドヌクレアーゼ、リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム、例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
【００２７】
本発明の腫瘍血管新生抑制剤は、被験者にそのまま投与することも可能であるが、通常、医薬で用いられる担体を用いて製剤して投与する。製剤に用いる担体としては、製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ、例えば、滅菌水、生理食塩水、賦形剤、安定剤、酸化防止剤、緩衝剤、界面活性剤、結合剤等が好ましく用いられる。さらに、本発明の腫瘍血管新生抑制剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して、徐放性製剤としてもよい。本発明の腫瘍血管新生抑制剤の投与経路としては、経口投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与等が挙げられる。投与量は、腫瘍血管新生抑制剤の種類や投与経路、疾患の程度等に応じて適宜選択されるが、通常、０．１μｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ 腫瘍血管新生誘導ゼブラフィッシュにおけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現
ゼブラフィッシュ稚魚（ＡＢ系統、受精後２日齢）に、蛍光色素でラべルしたヒト癌細胞（前立腺癌：ＤＵ１４５）を移植し（腫瘍血管新生誘導）、２日後に回収した。回収した個体からＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ III（インビトロジェン社）を用いて、ｃＤＮＡを合成し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量を定量的ＰＣＲ法にて測定した。
【００３０】
ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオタイドの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０２１６４３．３（ＴＲＩＢ２）、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０１２４０８．３（ＺＭＹＮＤ８）を使用し、プライマーをデザインし、ＰＣＲ実験に使用した。
ＴＲＩＢ２プライマーの配列情報
フォワードプライマー：（配列番号１）ＧＡＣＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＴＧＡ
リバースプライマー：（配列番号２）ＧＴＧＴＴＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＡ
ＺＭＹＮＤ８プライマーの配列情報
フォワードプライマー：（配列番号３）ＴＴＴＣＧＣＡＣＧＣＣＣＴＡＣＡＣＡ
リバースプライマー：（配列番号４）ＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴ
【００３１】
結果を図１に示す。腫瘍血管新生誘導、および非誘導群におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ，ＢＥＴＡの発現量で正規化した相対値で示した。ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量は、腫瘍血管新生誘導群では、腫瘍血管新生誘導を行っていない群に比較し、ＴＲＩＢ２では約２倍、ＺＭＹＮＤ８では約３倍の有意な増加（Ｐ＜０．０１）を認めた。
【００３２】
以上の結果から、腫瘍血管新生を誘導した動物群では、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量は増加することが明らかとなった。
【００３３】
実施例２ ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制が腫瘍血管新生に及ぼす影響
血管内皮細胞が特異的に蛍光（ＥＧＦＰ）を発するゼブラフィッシュ稚魚（ＡＢ系統あるいはＮａｃｒｅ系統に、受精後２日齢）にヒト癌細胞（前立腺癌：ＤＵ１４５）を移植し４〜８ｎｇ量の、ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを同時投与した。
【００３４】
ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０２１６４３．３（ＴＲＩＢ２）、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０１２４０８．３（ＺＭＹＮＤ８）、ｍＲＮＡの転写開始点に結合する相補的配列とした。ＴＲＩＢ２モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとＺＭＹＮＤ８モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
ＴＲＩＢ２（配列番号５）ＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＴ
ＺＭＹＮＤ８（配列番号６）ＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＴＣＡＴ
【００３５】
ネガティブコントロール群として、ゼブラフィッシュには存在しない遺伝子（ヘモグロビン異常症であるサラセミアにおける赤血球β−グロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡ中７０５番目の部位のスプライシング異常により生じた配列）を標的としたコントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｔｄ ＭＯ）と、ポジティブコントロール群として、ＶＥＧＦ（ＬＯＣＵＳ ＮＭ_１３１４０８）のｍＲＮＡの転写開始点に結合する相補的配列としたＶＥＧＦモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞と同時投与した。コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとＶＥＧＦモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号７）
ＶＥＧＦモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＴＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＧ（配列番号８）
【００３６】
２日後、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制群（ＴＲＩＢ２ ＭＯ、ＺＭＹＮＤ８ ＭＯ）における腫瘍血管新生が、コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群（Ｓｔｄ ＭＯ）に比べて抑制された（図２）。
【００３７】
２日後の腫瘍血管新生の発生頻度を測定した結果、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制群（ＴＲＩＢ２ ＭＯ、ＺＭＹＮＤ８ ＭＯ）では、Ｓｔｄ ＭＯ投与群に比べて、有意に抑制された。なお、ポジティブコントロールであるＶＥＧＦ ＭＯ投与群は、腫瘍血管新生を有意に抑制した（図３、Ｐ＜０．０１）。
【００３８】
実施例３ 通常ゼブラフィッシュ（癌細胞移植なし）におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制
【００３９】
血管内皮細胞が特異的に蛍光（ＥＧＦＰ）を発するゼブラフィッシュ稚魚（ＡＢ系統あるいはＮａｃｒｅ系統に、受精後２日齢）に、４〜８ｎｇ量の、ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した。
【００４０】
２日後、ＴＲＩＢ２ 遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血管構造の異常は検出されなかった（図４）。
【００４１】
以上の結果から、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現抑制は、正常血管新生阻害は阻害せず、腫瘍血管新生を特異的に抑制することが明らかとなった。また、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現抑制は、血管新生以外の影響も認められず、毒性はクリアできているものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質のスクリーニングならびに腫瘍血管新生の治療に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍血管新生抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、悪性腫瘍の進行や転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後方線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼新血管新生症候群の疾患は、血管（特に末梢毛細血管）の異常増殖に起因することが知られている。そのため、これらの疾患に対する予防または治療薬として、血管新生促進性因子および抗血管新生因子を標的とした種々の血管新生抑制剤が開発されている。
【０００３】
現在の抗腫瘍血管新生治療は、腫瘍血管の新生を促進する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生因子の活性を拮抗作用することに主に焦点を当てられている。しかし、血管新生は多数の血管新生促進性因子および抗血管新生因子により調節される複雑な過程であり、血管新生因子である１遺伝子の活性のみを標的とする薬剤は、多くの状況において血管新生を予防するために十分ではない。そのため、複数の血管新生因子の活性を調節することにより血管新生を抑制することができる治療が望ましく、新たな抗血管新生遺伝子が必要である。
【０００４】
その発現を抑制することにより腫瘍血管新生を抑制することができるということが発見されている遺伝子としては、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）がある。また、腫瘍血管新生に関連した遺伝子として、ＰＤＧＦ、ＭＭＰ、ＦＧＦ、ＴＰ（Thymidine Phosphorylase; PD-ECGF, Platelet-derived Endothelial Cell
Growth Factor）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許公表２００１−５０１４７１
【特許文献２】特許公開２００８−０００００３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fossey SC, Kuroda S, PriceJA, Pendleton JK, Freedman BI, Bowden DW. Identification and characterizationof PRKCBP1, a candidate RACK-like protein. Mamm Genome., 11: 919-925, 2000.
【非特許文献２】Kiss-Toth E, Bagstaff SM,Sung HY, Jozsa V, Dempsey C, Caunt JC, Oxley KM, Wyllie DH, Polgar T, Harte M,O'neill LA, Qwarnstrom EE, Dower SK. Human tribbles, a protein familycontrolling mitogen-activated protein kinase cascades. J. Biol. Chem., 279: 42703-42708,2004.
【非特許文献３】Lin KR, Lee SF, Hung CM,Li CL, Yang-Yen HF, Yen JJ. Survival factor withdrawal-induced apoptosis of TF-1cells involves a TRB2-Mcl-1 axis-dependent pathway. J. Biol. Chem., 282 (30): 21962-72,2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腫瘍血管新生抑制剤開発におけるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腫瘍血管新生とＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現との間に相関があること、およびその発現機能を抑制することにより、腫瘍血管新生の重要な病態指標である腫瘍における血管新生を抑制することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、
試験物質を細胞と接触させ、細胞におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法を提供する。
【００１０】
別の観点においては、本発明は、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、癌移植ゼブラフィッシュに試験物質を投与し、ゼブラフィッシュ由来ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法を提供する。
【００１１】
さらに別の観点においては、本発明は、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するリボザイム、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する腫瘍血管新生抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のスクリーニング方法により選択された物質は、腫瘍血管新生の抑制を有する薬剤の候補物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】腫瘍血管新生誘導した癌移植ゼブラフィッシュにおけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現量を示す。縦軸はハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ，ＢＥＴＡの発現量と比較した際の各遺伝子（ＴＲＩＢ２・ＺＭＹＮＤ８）の相対的発現量である。
【図２】癌移植モデルゼブラフィッシュに対し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した時の画像を示す。
【図３】癌移植モデルゼブラフィッシュに対し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した時の、腫瘍血管新生の発生割合を示す。
【図４】通常の（癌移植をしていない）ゼブラフィッシュに対し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのみを投与した時の血管構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、ゼブラフィッシュに癌細胞の移植を行い腫瘍血管新生が認められた個体においてＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量が増加することが見いだされた。また、下記の実施例に示されるように、癌細胞移植したゼブラフィッシュにＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞と同時投与すると、腫瘍血管新生が抑制されることが見いだされた。これらの結果から、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子は腫瘍血管新生の治療標的となりうること、およびＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現の抑制を指標として、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を同定しうることが明らかとなった。なお、図４に示すように、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現の抑制は正常血管新生を阻害しない。
【００１５】
ＺＭＹＮＤ８（zinc finger, MYND-type
containing 8）は、ＲＡＣＫ７とも称され、Ｃ−キナーゼのための受容体タンパク質である。ヒトのＺＭＹＮＤ８の遺伝子および蛋白質の配列はＮＣＢＩ：ＮＭ_０１８３０４７．１に記載されている。この蛋白質は、プロテインキナーゼＣβIと結合する。このタンパク質はブロモドメインと２つのジンクフィンガーをもち、転写調節因子であると考えられている（非特許文献１）。
ＴＲＩＢ２（tribbles homolog 2 (Drosophila)）は、ＴＲＢ２とも称され、Ｔｒｉｂｂｌｅｓファミリーに属しているタンパク質である。Ｔｒｉｂｂｌｅｓはショウジョウバエにおいて単離されたキナーゼ様ドメインを持つ分子であり、哺乳類ＴｒｉｂｂｌｅｓオルソログとしてＴＲＢ１、ＴＲＢ２、ＴＲＢ３が同定されている。哺乳類では、ＴｒｉｂｂｌｅｓオルソログがＡｋｔやＭＡＰキナーゼ経路を制御することが報告されており、細胞内シグナル伝達系の調節因子としての機能が明らかになりつつある（非特許文献２）。ヒトのＴＲＩＢ２の遺伝子および蛋白質の配列はＮＣＢＩ：ＮＭ_０２１６４３．３に記載されている。この蛋白質は、相互作用して、いくつかの生理的で病理学的プロセスにおいてシグナル形質導入経路の活動を調整し、主に造血器官の細胞のアポトーシスを誘発することが報告されている（非特許文献３）。
これまで、ＴＲＩＢ２、ＺＭＹＮＤ８の両遺伝子またはこれら蛋白質の発現と腫瘍血管新生との関連性についての報告はない。
【００１６】
スクリーニング方法
１つの観点においては、本発明は、多様な試験物質から、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、試験物質が試験管内または細胞内でＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を抑制する能力を測定することにより評価することができる。試験物質がＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を抑制する能力は、試験物質をＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子を発現する細胞と接触させて、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子のｍＲＮＡ量または蛋白質量を測定することにより評価することができる。試験物質と接触させたときに、接触させないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されれば、その試験物質は腫瘍血管新生抑制剤の候補物質であると考えられる。
【００１７】
試験物質は、種々の合成または天然の化合物ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリー、ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また、細菌、真菌類、藻類、植物、動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。
【００１８】
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定するためには、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ増幅法、ＩＳＨ（in situ hybridization）法、ＩＳＰ（in situ PCR）法、レーザーマイクロダイセクション法、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法（ＬＣＭ）などの、当該技術分野においてよく知られる遺伝子発現分析法を用いることができる。また、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の蛋白質量は、抗ＴＲＩＢ２抗体または抗ＺＭＹＮＤ８抗体を用いるＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などにより測定することができる。ヒト、ラット、マウス、ゼブラフィッシュなどのＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子およびこれをコードする遺伝子の配列は公表されている。
【００１９】
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子を発現する細胞としては、各種の組織に由来する初代培養組織や培養細胞株などの任意のものを用いることができる。ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子を強制発現させるよう遺伝子組換えされた細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いてもよい。
【００２０】
１つの好ましい態様においては、試験物質をゼブラフィッシュに投与して、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を調べる。ゼブラフィッシュ（属名Danio，例えばDanio rerio）とはインド原産の小型の熱帯魚である。主要臓器・組織の発生・構造などがヒトと良く似ているうえ、身体が透明であるため各種臓器および血管の形態を肉眼で観察することができるため、モデル動物として新薬候補化合物のスクリーニングに用いるのに適している。
【００２１】
本発明の方法には、基本的に癌細胞を移植したゼブラフィッシュを用いるが、より大型のモデル動物や、遺伝子組換や化学物質による発癌モデル動物（含むゼブラフィッシュ）を用いてもよい。試験物質をゼブラフィッシュに投与する方法としては、候補物質が水溶性である場合には飼育水中に溶解すればよく、水不溶性である場合には適当な界面活性剤との複合体またはエマルジョンの形で飼育水中に懸濁すればよい。あるいは、ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与してもよく、注射などにより非経口投与してもよい。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法にゼブラフィッシュを用いることの利点は、試験物質がＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現に及ぼす影響を測定できると同時に、毒性試験も行うことができることである。さらに、体重の変化、血管形成の変化、心臓などの各種臓器の形態や機能の変化、各種マーカー遺伝子の発現量も測定することができる。
【００２３】
このようにして、本発明のスクリーニング方法により選択された物質は、腫瘍血管新生の抑制を有する薬剤の候補物質として有用である。
【００２４】
腫瘍血管新生抑制剤
別の観点においては、本発明は、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する腫瘍血管新生抑制剤を提供する。遺伝子の発現を抑制しうる抑制剤としては、例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）等の、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の抑制剤を挙げることができる。このような核酸は、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の既知のヌクレオチド配列情報に基づいて容易に設計し製造することができ、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子をコードするｍＲＮＡに結合しその発現を抑制することができる。アンチセンス、リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法、またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子をコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと特異的に結合し、転写および／または翻訳を抑制することにより蛋白質の発現を抑制する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく、トリプレックス形成によるものでもよい。
【００２６】
リボザイムとは、標的とする核酸配列を切断しうる触媒的特性を有するＲＮＡ分子を表す。リボザイムは、一般に、エンドヌクレアーゼ、リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム、例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
【００２７】
本発明の腫瘍血管新生抑制剤は、被験者にそのまま投与することも可能であるが、通常、医薬で用いられる担体を用いて製剤して投与する。製剤に用いる担体としては、製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ、例えば、滅菌水、生理食塩水、賦形剤、安定剤、酸化防止剤、緩衝剤、界面活性剤、結合剤等が好ましく用いられる。さらに、本発明の腫瘍血管新生抑制剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して、徐放性製剤としてもよい。本発明の腫瘍血管新生抑制剤の投与経路としては、経口投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与等が挙げられる。投与量は、腫瘍血管新生抑制剤の種類や投与経路、疾患の程度等に応じて適宜選択されるが、通常、０．１μｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ 腫瘍血管新生誘導ゼブラフィッシュにおけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現
ゼブラフィッシュ稚魚（ＡＢ系統、受精後２日齢）に、蛍光色素でラべルしたヒト癌細胞（前立腺癌：ＤＵ１４５）を移植し（腫瘍血管新生誘導）、２日後に回収した。回収した個体からＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ III（インビトロジェン社）を用いて、ｃＤＮＡを合成し、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量を定量的ＰＣＲ法にて測定した。
【００３０】
ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオタイドの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０２１６４３．３（ＴＲＩＢ２）、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０１２４０８．３（ＺＭＹＮＤ８）を使用し、プライマーをデザインし、ＰＣＲ実験に使用した。
ＴＲＩＢ２プライマーの配列情報
フォワードプライマー：（配列番号１）ＧＡＣＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＴＧＡ
リバースプライマー：（配列番号２）ＧＴＧＴＴＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＡ
ＺＭＹＮＤ８プライマーの配列情報
フォワードプライマー：（配列番号３）ＴＴＴＣＧＣＡＣＧＣＣＣＴＡＣＡＣＡ
リバースプライマー：（配列番号４）ＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴ
【００３１】
結果を図１に示す。腫瘍血管新生誘導、および非誘導群におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ，ＢＥＴＡの発現量で正規化した相対値で示した。ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量は、腫瘍血管新生誘導群では、腫瘍血管新生誘導を行っていない群に比較し、ＴＲＩＢ２では約２倍、ＺＭＹＮＤ８では約３倍の有意な増加（Ｐ＜０．０１）を認めた。
【００３２】
以上の結果から、腫瘍血管新生を誘導した動物群では、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現量は増加することが明らかとなった。
【００３３】
実施例２ ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制が腫瘍血管新生に及ぼす影響
血管内皮細胞が特異的に蛍光（ＥＧＦＰ）を発するゼブラフィッシュ稚魚（ＡＢ系統あるいはＮａｃｒｅ系統に、受精後２日齢）にヒト癌細胞（前立腺癌：ＤＵ１４５）を移植し４〜８ｎｇ量の、ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを同時投与した。
【００３４】
ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０２１６４３．３（ＴＲＩＢ２）、ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿０１２４０８．３（ＺＭＹＮＤ８）、ｍＲＮＡの転写開始点に結合する相補的配列とした。ＴＲＩＢ２モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとＺＭＹＮＤ８モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
ＴＲＩＢ２（配列番号５）ＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＴ
ＺＭＹＮＤ８（配列番号６）ＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＴＣＡＴ
【００３５】
ネガティブコントロール群として、ゼブラフィッシュには存在しない遺伝子（ヘモグロビン異常症であるサラセミアにおける赤血球β−グロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡ中７０５番目の部位のスプライシング異常により生じた配列）を標的としたコントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｔｄ ＭＯ）と、ポジティブコントロール群として、ＶＥＧＦ（ＬＯＣＵＳ ＮＭ_１３１４０８）のｍＲＮＡの転写開始点に結合する相補的配列としたＶＥＧＦモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞と同時投与した。コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとＶＥＧＦモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号７）
ＶＥＧＦモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＴＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＧ（配列番号８）
【００３６】
２日後、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制群（ＴＲＩＢ２ ＭＯ、ＺＭＹＮＤ８ ＭＯ）における腫瘍血管新生が、コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群（Ｓｔｄ ＭＯ）に比べて抑制された（図２）。
【００３７】
２日後の腫瘍血管新生の発生頻度を測定した結果、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制群（ＴＲＩＢ２ ＭＯ、ＺＭＹＮＤ８ ＭＯ）では、Ｓｔｄ ＭＯ投与群に比べて、有意に抑制された。なお、ポジティブコントロールであるＶＥＧＦ ＭＯ投与群は、腫瘍血管新生を有意に抑制した（図３、Ｐ＜０．０１）。
【００３８】
実施例３ 通常ゼブラフィッシュ（癌細胞移植なし）におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子発現抑制
【００３９】
血管内皮細胞が特異的に蛍光（ＥＧＦＰ）を発するゼブラフィッシュ稚魚（ＡＢ系統あるいはＮａｃｒｅ系統に、受精後２日齢）に、４〜８ｎｇ量の、ゼブラフィッシュＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した。
【００４０】
２日後、ＴＲＩＢ２ 遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血管構造の異常は検出されなかった（図４）。
【００４１】
以上の結果から、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現抑制は、正常血管新生阻害は阻害せず、腫瘍血管新生を特異的に抑制することが明らかとなった。また、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現抑制は、血管新生以外の影響も認められず、毒性はクリアできているものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、腫瘍血管新生抑制剤の候補物質のスクリーニングならびに腫瘍血管新生の治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、
試験物質を細胞と接触させ、
細胞におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、
試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、
ゼブラフィッシュに試験物質を投与し、
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法。
【請求項３】
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するリボザイム、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する腫瘍血管新生抑制剤。
【請求項１】
腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、
試験物質を細胞と接触させ、
細胞におけるＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、
試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
腫瘍血管新生抑制剤の候補物質を選択する方法であって、
ゼブラフィッシュに試験物質を投与し、
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現を測定し、そして、
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子の発現が抑制されている場合に、その試験物質を腫瘍血管新生抑制剤の候補物質として選択する、
の各工程を含む方法。
【請求項３】
ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するリボザイム、ＴＲＩＢ２遺伝子またはＺＭＹＮＤ８遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する腫瘍血管新生抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１２５１９４（Ｐ２０１２−１２５１９４Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８００３７（Ｐ２０１０−２８００３７）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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